Praktikumsvorschrift Die Immunantwort

Praktikumsvorschrift
ELISA
(ENZYME LINKED IMMUNO-STIMULATED ASSAY)
Die Immunologie ist die Wissenschaft vom Immunsystem. Ursprünglich handelte es sich um
denjenigen Zweig der Medizin, der sich mit der Abwehr oder der Resistenz gegen Infektionen
befasste. In den letzten vierzig Jahren ist der Bedeutungsumfang des Begriffs jedoch ständig
gewachsen; er umfasst heute alle Prozesse und Mechanismen, die zwischen Selbst – also den
körpereigenen angeborenen Mechanismen, Molekülen, Zellen, Geweben und allen
dazugehörigen Strukturen – und Nicht-Selbst, alles, was von außerhalb des Körpers kommt und
damit körperfremd ist – unterscheiden. Zum Nicht-Selbst gehören u. a. infektiöse
Mikroorganismen (Protozoen, Pilze, Bakterien, Mycoplasmen und Viren), Parasiten, Toxine,
Tumoren und Geschwulstzellen, Transplantate und transfundierte Zellen oder Moleküle von
genetisch nicht identischen tierischen Lebewesen.
Die Immunantwort
Die meisten tierischen Lebewesen können auf körperfremde Substanzen mit Abwehr reagieren;
man bezeichnet das als Immunantwort. Die Mechanismen der Immunantwort und ihre
natürliche Entwicklung sind das zentrale Untersuchungsgebiet der Immunologie und der
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immunologischen Forschung. Immunantworten können angeboren sein und treten dann ohne
vorherigen Kontakt mit dem fremden Stoff, Organismus oder Gewebe auf, oder sie sind
erworben und erfordern in diesem Fall zunächst einen Kontakt mit der körperfremden
Substanz.
Angeborene Immunität
Tierische Lebewesen haben natürliche Barrieren und Stoffe, die Infektionen durch
Mikroorganismen oder Parasiten verhindern. Die Haut und schleimhaltige Sekrete wirken als
Barrieren, proteolytische Enzyme (Verdauungsenzyme, die Proteine spalten können) in den
Körperflüssigkeiten können einige der eindringenden Organismen zerstören. Darüber hinaus
reagieren Zellen mit spezifischen angeborenen Immunfunktionen rasch auf eindringende
Organismen und zerstören sie. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um zwei Zelltypen:
Monozyten und Granulozyten. Beide Typen können in einem als Endocytose bezeichneten
Vorgang Mikroorganismen in sich aufnehmen und zerstören. Darüber hinaus bilden sie viele
Substanzen, die gegen Infektionen schützen und die Entwicklung der Immunantwort fördern,
darunter Zytokine und Enzyme.
Granulozyten zirkulieren im Blut, können jedoch sehr schnell in die Gewebe wechseln, sobald
fremde Organismen oder Stoffe bestimmte Reize verursachen. Auch zirkulierende Monozyten
bewegen sich aus dem Blut in Gewebe hinein, wo sie ihre Gestalt ändern und Makrophagen
genannt werden.
Das so genannte Komplementsystem, bei dem eine Vielzahl von im Blut vorhandenen Proteinen
eine Rolle spielt, ist beim Schutz gegen einige Mikroorganismen ebenfalls wichtig.
Die angeborene Immunität ist relativ unspezifisch, unterscheidet jedoch normalerweise
eindeutig zwischen Selbst und Nicht-Selbst. Sie reagiert rasch und stellt eine schnelle erste
Abwehr gegen unerwünschtes Eindringen körperfremder Stoffe, Gewebe oder
Organismen zur Verfügung.
Erworbene bzw. spezifischen Immunität
Antigene sind körperfremde Stoffe, die eine Gefahr für den Körper darstellen. Kommt ein
höher entwickelter Organismus mit ihnen in Kontakt, kann er die Fähigkeit erwerben,
spezifisch auf sie zu reagieren. Wirbellose Tiere können, wenn überhaupt, nur in geringem
Ausmaß wirklich spezifisch reagieren; erworbene Immunität ist bei Säugern und Vögel am
höchsten entwickelt.
Die erworbene Immunität basiert auf der Aktivität zweier Systeme: der humoralen und der
zellulären Immunität.
Die spezifische, humorale Immunität entsteht mittels löslicher Proteine, der so genannten
Immunglobuline oder Antikörper. Säuger produzieren fünf Klassen von Immunglobulinen, die
als Immunglobulin G, M, A, D und E bezeichnet werden. Diese relativ großen, kugelförmigen
Proteine bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Molekülketten. Während ein Teil
(Fab1) eines Antikörpers an das Antigen bindet, reagiert der andere Teil (Fc2) mit anderen
Elementen des Immunsystems, z.B. mit Molekülen des Komplementsystems oder
Makrophagen.
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ab steht für antigen bindend
c steht für cristallizing
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Alle Immunglobulinklassen sind im Blut vorhanden, wobei Immunglobulin G (IgG)
mengenmäßig vorherrscht. Außerdem dient es der Aktivierung des Komplementsytems und ist
plazentagängig. IgM-Antikörper werden zu Beginn der Immunreaktion im Blut gebildet; IgA
wird im Magen- und Bronchialsekret und in Schweiß und Speichel gebildet. IgE bewirkt
anaphylaktische (Histamin freisetzende) und allergische Reaktionen und kann zum Schutz
gegen Parasiten wichtig sein. Die Funktion des zirkulierenden IgD ist ungeklärt.
Immunglobuline werden von B-Lymphozyten produziert.
Antikörper gehen jeweils spezifische Verbindungen mit körperfremden Organismen und
Substanzen ein; damit können häufig unerwünschte Eigenschaften der eindringenden
Substanzen und Organismen inaktiviert werden. Antigen-Antikörper-Komplexe werden mit
Hilfe verschiedener Prozesse aus dem Körper entfernt; Mikroorganismen, auf denen sich
Antikörper festgesetzt haben, werden häufig von Makrophagen und anderen Zellen
endocytotisch aufgenommen und verdaut.
Die spezifischen, zelluläre Immunität wird durch T-Lymphozyten bewirkt. Es werden jeweils
antigenspezifische T-Zellen produziert, die mit den Antigenen über einen spezifischen Rezeptor
interagieren. Zytotoxische T-Zellen (Killerzellen) können Mikroorganismen oder Zellen
spezifisch vernichten (siehe unten). Andere T-Zellen beeinflussen die Immunreaktion,indem sie
helfend oder unterdrückend einwirken (T-Helfer-, T-Supressorzellen). Solche T-Zellen bilden
Zytokine und andere biologisch wirksame Moleküle aus, welche die Aktivierung und Reifung
der B-Lymphozyten verstärken oder hemmen. Zytokine umfassen u. a. Interleukine, γInterferon und den Wachstumsfaktor TGF.
Immunologische Diversität
Das erworbene Immunsystem kann Antikörper und T-Zellen produzieren, die eine sehr große
Zahl verschiedener Moleküle bemerkenswert spezifisch zu erkennen vermögen. Schätzungen
zufolge können Säugetiere weit über einer Million verschiedener Antikörper bilden.
Heute weiß man, dass Immunglobuline durch die Neuanordnung und neue Verbindung
mehrerer Gene entstehen und dass bei der Entstehung der erworbenen Immunität eine
somatische Rekombination des genetischen Materials auftritt. Zur Entwicklung der humoralen
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Immunität gehört die Interaktion von Antigenen mit IgM- oder IgD-Molekülen, die als
Rezeptoren auf der Oberfläche von B-Zellen fungieren. Dies löst eine Aktivierung der B-Zellen
aus – wenn dann von T-Zellen und anderen Systemen genügend Unterstützung kommt,
entwickelt sich die Immunantwort, und die passenden Antikörper werden verstärkt gebildet,
wobei der entsprechende B-Zellklon proliferiert und zur Plasmazelle diffenziert. Diese
Vorstellung wurde Jahrzehnte vor ihrem experimentellen Nachweis von Paul Ehrlich, dem
deutschen Pionier der Immunologie, entwickelt.
Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst
Die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst ist in der Immunologie grundlegend.
Klone von Zellen, die körpereigene Antigene erkennen können, werden schon früh in der
Entwicklung eines tierischen Lebewesens eliminiert, in der Regel kurz nach der Geburt. Diese
Zerstörung findet infolge von Prozessen statt, die den „programmierten Zelltod“ (Apoptose)
einschließen. Bricht die Immuntoleranz gegenüber dem Selbst zusammen, können sich
Autoimmunkrankheiten entwickeln. In dieser Situation kann das System gesunde Zellen und
Substanzen zerstören oder verletzen, was zu klinisch auffälligen Krankheiten führt. Eine
Allergie ist die Überreaktion des Immunsystems auf fremde Stoffe.
Ist die Immunreaktion auf der einen Seite für den Menschen von lebensrettender Bedeutung, so
kann sie andererseits dem Versuch, Menschenleben durch Organtransplantationen zu retten, im
Weg stehen. Normalerweise erkennt das Immunsystem Zellen eines anderen Organismus als
fremd und versucht, diese Zellen abzutöten. Nach der Transplantation z. B. einer Niere, Leber
oder von Knochenmark muss man daher die Aktivität des Immunsystems mit Medikamenten wie
Cyklosporin unterdrücken.
Antigen-Präsentation und die Proteine des Histokompatibilitätskomplexes (MHC3)
Die meisten Zellen tierischer Lebewesen (außer den Erythrozyten der Säugetiere) exprimieren
auf ihrer Oberfläche Moleküle, die von anderen, genetisch nicht identischen Lebewesen als
Nicht-Selbst erkannt werden. Diese MHC-Proteine der Klasse I spielen eine bedeutende Rolle
bei der Abstoßung von Transplantaten und bei einigen Reaktionen auf Transfusionen.
Zytotoxische T-Zellen sind in der Lage zwischen körpereigenen und körperfremden Molekülen
dieser Klasse zu unterscheiden. Außerdem erkennen sie, ob die MHC-Proteine fremde
Peptiden „präsentieren“ und eliminieren Zellen, die solche Marker tragen. Diese assoziierten
Peptide stammen aus zytoplasmatischem Proteinverdau und dienen dazu, Mikroorganismen
oder Viren, die intrazellulär lokalisiert sind, ausfindig zu machen.
Antigen-präsentierende Zellen wie die Makrophagen und B-Lymphozyten verarbeiten
Antigene, die durch Endocytose internalisiert wurden. Die durch Spaltung erhaltenen AntigenPeptide werden den entsprechenden T-Helferzellen in Furchen auf Molekülen der MHCKlasse II vorgezeigt.
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MHC steht für major histocompatibility complex
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Methoden der Immunologie:
Radioimmunoassay (RIA)
Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird sowohl im RIA als auch im ELISA zur Quantifizierung
bestimmter Substanzen genutzt. Die empfindlichste Methode repräsentiert der RIA, wobei
Antigenkonzentrationen von 0,5 pg/ml noch bestimmt werden können. Plasmabestandteile mit
extrem niedriger Konzentration wie Proteohormone, Steroidhormone, Interleukine, aber auch
Pharmaka oder Drogen können mittels dieser Methode untersucht werden. Rosalyn Yalow
bekam 1977 für die Entwicklung der Radioimmunoassaytechnik den Nobelpreis.
Als Beispiel für einen Radioimmunoassay sei hier die Bestimmung von Prolactin aus dem
Serum eines Patienten genannt. Im Versuch werden in Teströhrchen gleiche bekannte Mengen
radioaktiv markiertes Prolactin (Markierung mit 131Jod) mit gleichen Mengen Anti-Prolactin zu
gegeben. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden steigende Mengen an Serum (mit
unbekannter Prolactinkonzentration) zupipettiert. Was passiert?
Mit Zugabe eines 2. Antikörpers gegen Anti-Prolactin wird die Präzipitation eingeleitet und das
erhaltene Präzipitat auf seine Radioaktivität vermessen. Wenn man nun die Radioaktivität
(gemessen in counts per minutes: cpm) gegen die Konzentration des Serums aufträgt, erhält
man eine sogenannte Verdrängungskurve.
Wie muss der Kurvenverlauf aussehen?
Was sind die Nachteile dieses Assays?
Enzyme-linked Immunoabsorbent Asssay (ELISA)
Die Technik des ELISA wurde 1971 durch Engvall und Perlman entwickelt. Alle Reaktionen des
ELISA finden mit einem immobilisierten Partner statt, was die Trennung von gebundenem und
nicht gebundenen Reagenzien erheblich erleichtert. Das Antigen wird an einer Plastikoberfläche
unter bestimmten Bedingungen zwar nicht kovalent, aber mit erstaunlicher Festigkeit gebunden.
In einem zweiten Schritt wird der entsprechende Antikörper in verschiedenen Konzentrationen
zugegeben. Warum wird eine Verdünnungsreihe des Antikörpers angelegt? Überschüssige
Antikörper werden durch Waschen entfernt. Nach einer gewissen Inkubationszeit gibt man den
zweiten Antikörper, der (in dem vorliegenden Versuch) an eine alkalische Phosphatase gekoppelt
ist, dazu. Der zweite Antikörper erkennt den konstanten Teil des ersten Antikörpers. Auch hier
wird ein Überschuss durch Waschen beseitigt. Die alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das eine
Chromogenumwandlung katalysiert. Das farblose Chromogen wird zu einem Farbstoff umgesetzt
und vermessen. Die Menge an freigesetztem Farbstoff korreliert mit der Menge der gesuchten
Substanz, in diesem Fall mit der Menge des ersten Antikörpers.
Wie muss der Kurvenverlauf aussehen (Extinktion gegen Titer)?
Für alle beschriebenen immunologischen Tests gilt, dass die Bindungen von Antigen und
Antikörper nicht einem einfachen Massenwirkungsgesetz entsprechen. Vielmehr müssen
die Methoden, um Konzentrationsangaben machen zu können, geeicht werden. Zur
Titerbestimmung ist das nicht nötig. Denn der Titer ist die Verdünnung des Serums (bzw.
der negative Logarithmus der Verdünnung), bei der man den Antikörper oder die
untersuchte Substanz nicht mehr feststellen kann.
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VERSUCHSDURCHFÜHRUNG
Im vorliegenden Versuch wird die ELISA-Technik zur Bestimmung einer unbekannten Menge an
Antikörper in einem Serum (Titerbestimmung) gegen Rinderserumalbumin (BSA) benutzt.
Es werden folgende Pufferlösungen benötigt:
Puffer 1:
100 ml
0,1 M Natriumcarbonat
pH 9,6
Puffer 2:
450 ml
0,9 % w/v Natriumchlorid
0,015 % v/v Tween 20
10 mM NaH2PO4
pH 7,0
Puffer 3:
100 ml
50 mM Glycin, 0,5 mM MgCl2
pH 10,0
→ 1mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 40 ml Puffer 3 frisch ansetzen
1. Beschichtung der Küvetten mit Antigen
Der Versuch wird in zwei Messreihen durchgeführt. Für jede Messreihe werden 16 Küvetten
verwendet, wobei eine Küvette in jeder Reihe zur Kontrolle dient. 10 mg BSA werden in 100 ml
Puffer 1 gelöst und je 1 ml dieser Lösung wird in die 32 Küvetten pipettiert. Nach drei Stunden
bei Raumtemperatur werden diese Küvetten über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach werden sie
durch Absaugen entleert und dreimal mit jeweils 1 ml des Puffers 2 gewaschen.
2. Zugabe des zu prüfenden Antiserums
Von dem Antiserum gegen BSA (aus Kaninchen) werden mit dem Puffer 2 folgende
Verdünnungen hergestellt: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 und 10-7. Von jeder Verdünnung werden
zwei Proben à 1 ml in die gewaschenen Küvetten gegeben. In die zwei restlichen Küvetten
werden zur Kontrolle nur der Puffer 2 eingefüllt. Die Ansätze werden über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert.
3. Zugabe des enzymgekoppelten Anti-Antikörpers
Antikörper gegen Anti-BSA wurden mit alkalischer Phosphatase gekoppelt. Dieses Konjugat
wird 30000fach mit Puffer 2 verdünnt. Jeweils 1 ml dieser Verdünnung wird in die Küvetten
pipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wird wieder dreimal mit Puffer 2
gewaschen.
4. Messung der immobilisierten Phophatase-Aktivität
In jede Küvette wird 1 ml der frisch angesetzten p-Nitrophenylphosphatlösung pipettiert. Nach 1
Stunde Inkubation wird die Extinktion der einzelnen Messpunkte bei einer Wellenlänge von
405 nm gegen die beiden Kontrollen gemessen.
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Auswertung
Für jede Verdünnung des Probenserums werden die Mittelwerte der Extinktionen berechnet. Die
so erhaltenen Extinktionen werden gegen den Logarithmus des Verdünnungsfaktors aufgetragen.
Wie hoch ist der Titer?
In welcher Größenordnung (in g oder mol) liegen die gegen BSA gerichteten Antikörper im
eingesetzten Serum vor? Es gilt die Erfassungsgrenze der Methode abzuschätzen.
Hierzu dienen folgende Angaben:
Extinktion: E = c ⋅ d ⋅ ε
Der Extinktionskoeffizient ε für p-Nitrophenol bei 405 nm beträgt 18,5 cm2/mmol
Spezifische Aktivität : U =
Substratumsatz ⎡ mmol ⎤
Zeit ⋅ Enzymmenge ⎢⎣ min⋅ mg ⎥⎦
Die spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase beträgt 300 U.
Die alkalische Phosphatase hat ein Molekulargewicht von 140.000 g/mol.
IgG hat ein Molekulargewicht von 150.000 g/mol.
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