EliSpot - BCA
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Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] EliSpot in der Borreliose-Diagnostik 27.02.2016 Update Lyme Disease for Practitioners BCA-clinic Augsburg [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Infektion - Infektionserkrankung Invasion und Vermehrung von Mikroorganismen im menschlichen Organismus Durch Mikroorganismen hervorgerufene Störung der Lebensvorgänge Diagnostik bei Infektionserkrankungen: • Beschreibung des Krankheitsbildes und seinen Verlauf • Identifizierung des Erregers • Nachweis der Immunologischen Reaktion Serologischer Nachweis durch Antikörper Nachweis der zellulären Immunreaktion [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Funktionen der T-Lymphozyten T - Helferzellen (CD4+) sind die Schaltzellen des Immunsystems Erkennen Antigene die von antigenpräsentierenden Zellen dargeboten werden reagieren mit Poliferation und Freisetzung von Zytokinen Th1 verstärkt die zellulären Immunantwort, Th2 stimuliert die Antikörperproduktion Zytotoxische T - Zellen (CD8+) setzen u.a. Substanzen frei die veränderte / infizierte Zellen absterben lassen Regulatorische T – Zellen (CD4 und CD25 bzw. FoxP3) regulieren die Immunantwort [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Zytokine der T-Zell Subpopulationen CD8+-T-Zellen Th 1- Zellen produzieren: IFN-g, IL-2, IL-3, Lymphotoxin und TNF-a [email protected] CD4+-T-Zellen Th 2- Zellen produzieren: IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 und IL-10 Th 17 - Zellen produzieren: IL -17, IL-21, IL-22 und IL-26 Regulatorische T-zellen (T reg) produzieren: IL-10 und TGF-b www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Zell-vermittelte Immunreaktion Signifikante T-zelluläre Reaktivität auf Borrelien Proteine ist bekannt und belegt, sie korreliert mit der klinischen Manifestation. Durchflusszytometrie Messung der Lichtstreuung wenn Zellen den rechtwinklig zum Probenfluss angeordneten Laserstrahl passieren. Immunologische, DNA- und Zellfunktions- Datenanalyse LTT Messung der Proliferation von T-Zellen nach Stimulation mit Antigen über 5 Tage. EliSpot Der EliSpot misst direkt die Anzahl der aktivierten T- Zellen aufgrund ihrer Zytokinausschüttung. [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Blutentnahme Röhrchen sollten immer ganz gefüllt sein Blut sollte nicht älter als 48 h sein Blutproben bei RT lagern Nicht stark schütteln / zentrifugieren [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Y Y Y Y Y Y Y Y Y Mikrotiterplatte mit Membranboden, beschichtet mit Antikörper gegen nachzuweisendes Zytokin (z. B. IFN) Isolation der Lymphozyten (FICOLL) Zellsuspension wird mit Antigen / Mitogen 18 – 24 h bei 37 °C inkubiert Zuvor aktivierte T-Zellen setzen Zytokine frei, die durch die Antikörper an die Membran gebunden werden. Negativkontrolle [email protected] Probe www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Nach erfolgter Inkubation werden die Zellen von der Platte entfernt. Darauf folgt die Zugabe von enzymmarkierten Antikörpern und eine weitere Inkubation. Zugabe des Substrates zur Visualisierung der Spots. Y Spots IFN-γ [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Standardisierung über externe Qualitätskontrolle 1. Qualitätszirkel EliSpot Probenversandt halbjährlich 2. QC Kit PBMC Pool - Versand auf Anfrage [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Leerwert Positivkontrolle Antigen 1 Antigen 2 Reaktiv Nicht Reaktiv Nicht auswertbar Nicht auswertbar [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Zur Interpretation der Ergebnisse wird ein Stimulationsindex: Spot Anzahl Antigen mix ___________________________ = Stimulation index (SI) Spot Anzahl Medium-Kontrolle Beispiel Lymespot (IFN): Probe ist reaktiv SI >3 Probe ist negativ SI < 2 Probe ist grenzwertig SI zwischen 2 und 3 [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Interpretation der EliSpot Ergebnisse • Reaktive T-Zellen (IFN- positiv) weisen auf einen Kontakt mit Borrelien hin. • Immer im Zusammenhang mit klinischem Bild zu beurteilen. • Verlaufskontrolle Problematik: Wann ist eine Borreliose behandlungsbedürftig? Stehen die Symptome im Zusammenhang mit der Infektion? Kann die Weiterentwicklung des EliSpots zur Klärung beitragen? [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Giuseppe Pantaleo and Alexandre Harari NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY, vol 6 417-23, 2006 [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Polyfunktionale / Multifunktionale T-Zellen Levels of disease activity and viral replication correlate with distinct functional signatures of T-cell responses (e.g. IFN/IL-2) Beispiel: • HIV • HCV • CMV, EBV • und andere Giuseppe Pantaleo and Alexandre Harari NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY, vol 6 417-23, 2006 Effector T-cells : IFNγ Memory T-cells: IFNγ and IL-2 [email protected] Distinguish between active and latent disease ? www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Von EliSpot zu FluoroSpot EliSpot FluoroSpot 1983: Enzym basierter Assay zum Nachweis eines Zytokins 2009: Fluoreszenz basierter Assay zum Nachweis von zwei Zytokinen 2011: Fluoreszenz basierter Assay zum Nachweis von drei Zytokinen z. B. IFN- z. B. IFN-/IL-2 z. B. IFN-/IL-2/IL-17 [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Anwendung in der TB Diagnostik: S. Bittel „…Examination of dominant IL-2 functional T-cell substes by fluorescence-based EliSpot assay“ [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] iSpot – LymeSpot revised [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Nahezu gleiche Anzahl an IFN und IL-2 produzierenden Zellen, spricht für eine latente Infektion Kein Nachweis von IFN produzierenden Effektorzellen, bei gleichzeitigem Nachweis von IL-2 produzierenden Memoryzellen, spricht für eine abgelaufene Infektionserkrankung [email protected] www.elispot.com Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D-72479 Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/9364-0 [email protected] Gerne beantworte ich Ihre Fragen und bedanke mich für Ihre Aufmerksamkeit! 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