Genetisch modifizierte dendritische Zellen fiir die
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Genetisch modifizierte dendritische Zellen fiir die Immunisierung Einfluss einer Hitzeschockprotein-Bindedomane in einem Hamagglutininspezifischen Mausmodell Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Univefsitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Wilhelm Heinrich Meyring Meppen Inhaltsverzeichnis . II Inhaltsverzeichnis Vorveroffentlichungen der Dissertation Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 1.1 I II IX XIII 1 Dendritische Zellen 1 1.1.1 Systematik der dendritischen Zellen 2 1.1.2 Reifung dendritischer Zellen 4 1.1.3 Antigenaufnahme und -presentation durch dendritische Zellen 5 1.1.4 In vitro Generierung dendritischer Zellen 8 1.1.5 Stimulation von T-Zellen durch DC 9 1.1.6 Immunregulation durch T-Zellen 1.2 11 Mogliche Anwendungen gentechnisch modifizierter DC bei der 1.3 Genimmuntherapie von Krebserkrankungen 12 Genetische Modifikation dendritischer Zellen durch adenovirale Vektoren 15 1.3.1 Vektoren fur den Gentransfer 15 1.3.2 Eigenschaften von Adenoviren 16 1.3.3 Vorteile adenoviraler Vektoren in der Gentherapie 18 1.3.4 Herstellung adenoviraler Vektoren 19 1.4 Anwendung genetisch modifizierter DC imMausmodell 1.4.1 Modellantigen Hamagglutinin 1.4.2 Optimierung der Antigenprasentation durch die Hitzeschockprotein- 20 20 Bindedomane cT272 21 T-Zell Rezeptor-(TCR-)transgene Mausmodelle 23 2 1.4.4 HA als Selbstantigen im Diabetesmodell - InsHA Mause Zielsetzung 25 27 3 Material und Methoden 29 1.4.3 3.1 Materialien 29 3.1.1 Gerate 29 3.1.2 Software 30 3.1.3 Verbrauchsmaterialien 30 Inhaltsverzeichnis III 3.1.4 Oligonukleotide 30 3.1.5 Antikorper 31 3.2 Medien, Puffer und Losungen 33 3.2.1 Puffer und Losungen 33 3.2.2 Medien fur die Kultur prokaryotischer Zellen 35 3.2.3 Medien fur die Kultur eukaryotischer Zellen 35 3.3 Molekularbiologische Methoden 36 3.3.1 Verwendete £.co/j-Stamme 36 3.3.2 Plasmide 36 3.3.3 DNA-Minipraparation 36 3.3.4 DNA-Maxipraparation 37 3.3.5 DNA-Restriktionsspaltung 38 3.3.6 Glyzerolkulturen 38 3.3.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten 38 3.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel 39 3.3.9 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 39 3.3.10 Phenol/Chloroform Extraktion und alkoholische DNA-Fallung 40 3.3.11 DNA-Ligation 40 3.3.12 Transformation 41 3.3.12.1 Chemisch kompetente E.coli-Zellen 41 3.3.12.2 Elektrokompetente E.coli-Zellen 41 3.3.13 Cosmid-Verpackung in Lambda-Bakteriophagenpartikel 42 3.3.14 Polymerasekettenreaktion 43 3.3.15 TOPO TA Cloning® PCR Klonierungssystem 44 3.3.16 DNA-Sequenzierung 44 3.3.17 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration 44 3.4 Kultur eukaryotischer Zellen 45 3.4.1 Verwendete Zelllinien 45 3.4.2 Kultur der Zelllinien 45 3.4.3 Zellzahlbestimmung 45 3.4.4 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen 45 3.4.5 Transfektion (Kalziumphosphat-Koprazipitation) 46 3.4.6 Infektion von Zelllinien 46 3.4.7 Isolierung muriner Stammzellen aus Knochenmark 47 Inhaltsverzeichnis IV 3.4.8 Generierung und Infektion muriner dendritischer Zellen 47 3.4.9 Ernte muriner dendritischer Zellen 48 3.4.10 Rasterelektronenmikroskopie 48 3.4.11 Einzelzellsuspension von Milzzellen 49 3.4.12 Zellsortierung (MACS) 49 3.5 Herstellung replikationsdefizienter adenoviraler Vektoren (AdV) 49 3.5.1 Bereitgestellter replikationsdefizienter AdV 49 3.5.2 Herstellung primarer Adenovirusstocks 50 3.5.3 Herstellung sekundarer Adenovirusstocks 50 3.5.4 Herstellung groBer Mengen adenoviraler Vektoren 51 3.5.5 CsCl-Aufreinigung von adenoviralen Vektoren 51 3.5.6 Titerung der adenoviraler Vektoren 52 3.5.7 Preparation adenoviraler DNA 53 3.6 Nachweis der Transgenexpression 54 3.6.1 Blockade des proteasomalen Abbaus 54 3.6.2 Herstellung von Zelllysaten und Nachweis von Proteinen 54 3.6.2.1 Denaturierte Zelllysate 55 3.6.2.2 Native Zelllysate 55 3.6.3 Ko-Immunprazipitation 55 3.6.4 SDS-Gelelektrophorese 56 3.6.5 Westernblot 57 3.6.6 Fluoreszenzmikroskopie 57 3.6.7 Durchflusszytometrie 58 3.6.7.1 Immunologische Farbung von Oberflachenantigenen 59 3.6.7.2 Immunologische Farbung intrazellularer Antigene 60 3.6.7.3 Markierung von Proteinen oder Antikorpern 60 3.7 Untersuchung der Immunantwort 61 3.7.1 IFNy-Elispot 62 3.7.2 BrdU-Proliferationsassay 63 3.7.3 Serumgewinnung 64 3.7.4 Immunisierung mit dendritischen Zellen 64 3.7.5 Immunisierung mit Plasmid-DNA 65 3.7.6 Messung des Blutzuckergehaltes 65 3.7.7 CFSE-Markierung 65 Inhaltsverzeichnis 3.7.8 Adoptiver Transfer spezifischer T-Zellen und DC 66 3.7.9 Zytokinanalyse in Kulturiiberstanden 66 3.7.10 Zellspezifische Messung der IFNy- und IL-2-Produktion 68 3.7.11 Histologie 69 Ergebnisse 4.1 70 Herstellung und Charakterisierung rekombinanter adenoviraler Vektoren 70 4.1.1 Herstellung der Hamagglutinin-Varianten 71 4.1.2 Konstruktion der Expressionsplasmide 72 4.1.3 Sequenzierung der Expressionsplasmide 75 4.1.4 Konstruktion der Adenocosmide und adenoviralen Vektoren 76 4.1.5 Charakterisierung der viralen DNA 80 4.1.6 Antigenexpression 82 4.1.6.1 Nachweis der Expression der adenoviral kodierten Gene 82 4.1.6.2 Hsp-Bindung durch cT272 85 4.1.6.3 Zellspezifischer Nachweis der Antigenexpression 87 4.2 Generierung und Modifikation dendritischer Zellen 4.2.1 90 Einfluss der IL-4 Zugabe auf Reifung und Infizierbarkeit der dendritischen Zellen 91 4.2.2 Optimierung des adenoviralen Gentransfers 93 4.2.3 Charakterisierung der mit unterschiedlichen Vektoren modifizierten dendritischer Zellen 99 4.2.3.1 Morphologie 99 4.2.3.2 Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die DC-Ausbeute 101 4.2.3.3 Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Ausreifung der DC 101 4.2.3.4 Einfluss der verschiedenen adenoviralen Vektoren auf die Zytokinsekretion 4.3 105 Analyse der Hamagglutinin-spezifischen Immunantwort in vitro 4.3.1 + Stimulation HA-spezifischer TCR-transgener CD4 T-Zellen 106 107 4.3.1.1 IFNy-Sekretion stimulierter T-Zellen 107 4.3.1.2 Proliferation DC-stimulierter CD4+ T-Zellen 109 4.3.1.3 Zytokinsekretion DC-stimulierter CD4+T-Zellen 110 4.3.2 Stimulation HA-spezifischer TCR-transgener CD8+ T-Zellen 112 4.3.2.1 IFNy-Sekretion stimulierter CD8+T-Zellen 112 4.3.2.2 Proliferation DC-stimulierter CD8+T-Zellen 113 Inhaltsverzeichnis Zytokinsekretion DC-stimulierter CD8+T-Zellen 115 Analyse der Hamagglutinin-spezifischen Immunantwort in vivo 116 Immunisierung durch modifizierte DC oder Plasmid-DNA 117 4.3.2.3 4.4 VJ 4.4.1 4.4.1.1 Einfluss der Vakzinierungsmethode auf die Zellzahl/Milz 4.4.1.2 Einfluss der Vakzinierungsmethode auf regulatorische T-Zellen der Milz 120 4.4.1.3 Diabetes in InsHA Mausen 122 4.4.1.4 Aktivierung HA-spezifischer Milzzellen 124 4.4.1.5 Immunantwort gegen FCS-Bestandteile 130 4.4.2 Immunisierung durch modifizierte DC nach dem adoptivem Transfer spezifischer T-Zellen 4.4.2.1 Einfluss der Vakzinierung auf die Zellzahl/Milz 4.4.2.2 Analyse der Immunantwort in BALB/c Mausen nach adoptiven T-Zell Transfer 4.4.2.3 Diskussion 5.1 132 134 134 Analyse der Immunantwort in InsHA Mausen nach adoptivem T-Zell Transfer 5 118 140 149 Antigenexpression in humanen Zelllinien 151 5.1.1 Expression des cT272 152 5.1.2 Expression des HA und des cTHA 152 5.1.3 Expression der verkiirzten HA-Varianten TCRCL4, cTTCRCL4 und TCR, cTTCR 154 Faktoren die die Stabilitat der Antigene beeinflussen konnten 156 5.1.4 5.2 Optimierung der Generierung und Modifikation dendritischer Zellen 5.2.1 Protokolle fur die in vitro Generierung muriner DC 5.2.2 Optimiertes Protokoll fur die in vitro Generierung adenoviral modifizierter DC 157 158 158 5.2.2.1 Kultivierungsdauer 159 5.2.2.2 Verwendung der Zytokine GM-CSF und IL-4 159 5.2.2.3 Infektion dendritischer Zellen durch adenovirale Vektoren 160 5.2.2.4 Expression der Transgene in murinen dendritischen Zellen 161 5.2.2.5 Ausreifung der DC durch LPS 163 5.2.2.6 Reinheit und Ausreifung adenoviral modifizierter DC 164 5.3 5.3.1 Stimulation spezifischer T-Zellen durch adenoviral modifizierte DC in vitro Stimulation spezifischer CD8-positiver T-Zellen 165 166 Inhaltsverzeichnis VII 5.3.2 Stimulation spezifischer CD4-positiver T-Zellen 167 5.3.3 Modell der Antigenprozessierung und -presentation 169 5.4 Immunisierung HA-reaktiver und -toleranter Mause 170 5.4.1 Aktivierung HA-reaktiver zytotoxischer T-Zellen in BALB/c Mausen 171 5.4.2 Aktivierung HA reaktiver zytotoxischer T-Zellen in InsHA Mausen 173 5.4.3 Periphere Toleranz in InsHA Mausen 173 5.4.4 Zentrale Toleranz in InsHA Mausen 174 5.4.5 Aktivierung CD4+ T-Helferzellen 175 5.4.6 HA-unabhangige Aktivierung der Milzzellen durch in vitro generierteDC 5.4.6.1 FCS-spezifische Aktivierung der Milzzellen durch in vitro generierteDC 5.5 Immunisierung nach adoptivem Transfer 5.5.1 176 177 178 Immunantwort DC-immunisierter BALB/c Mause nach dem adoptiven transfer HA-spezifischer T-Zellen 5.5.2 179 Immunantwort DC-immunisierter InsHA-Mause nach dem adoptiven transfer HA-spezifischer T-Zellen 181 5.5.2.1 Aktivierung adoptiv transferierter HA-spezifischer T-Zellen 182 5.5.2.2 Pankreas-Histologie und Diabetes 183 5.5.2.3 Durchbrechung der HA-spezifischen Toleranz im InsHA Modell 184 5.5.3 Ausblick 185 6 Zusammenfassung 187 7 Literaturverzeichnis 190 8 Anhang 213 8.1 Abkiirzungsverzeichnis 8.2 Phanotypische Oberflachenmarker zur Charakterisierung verschiedener 8.3 213 Zelltypen 219 Symbole fur Aminosauren 220 Danksagung 221
