Funktionelle Bedeutung der Infektion von T

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I
Inhalt
Abkürzungen ......................................................................................................................... 1
Zusammenfassung ............................................................................................................... 4
Summary ................................................................................................................................ 6
1.Einleitung ............................................................................................................................ 8
1.1 Die verschiedenen Funktionen von T-Zellen bei der Immunantwort ................. 8
1.2 Das TH1-/TH2-Konzept und Interleukin-10 ............................................................... 9
1.3 Respiratorisches Syncytial Virus ............................................................................... 10
1.3.1 Taxonomie und struktureller Aufbau von RSV ....................................................... 11
1.3.2 Infektion verschiedener Zelltypen durch RSV ......................................................... 12
1.3.3 Die spezifische T-Zellantwort auf eine RSV-Infektion............................................ 14
1.4 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung ................................................................... 15
1.5 Zielsetzung......................................................................................................................... 19
2. Material und Methoden .............................................................................................. 21
2.1 Material............................................................................................................................ 21
2.1.1 Spenderblut............................................................................................................... 21
2.1.2 Virusmaterial ............................................................................................................ 21
2.1.3 Medien und Lösungen .............................................................................................. 21
2.1.4 Antikörper ................................................................................................................ 23
2.1.5 Reagenzien ............................................................................................................... 24
2.2 Methoden ......................................................................................................................... 25
2.2.1 Zellpräparation ......................................................................................................... 25
2.2.1.1 Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes ............................. 25
2.2.1.2 Magnetische Zellsortierung.......................................................................... 25
2.2.1.3 Gewinnung von Alveolarmakrophagen ....................................................... 27
2.2.1.4 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung ........................................................ 28
INHALT
II
2.2.2 Virusanzucht............................................................................................................. 28
2.2.3 Kultivierung und Stimulation der Zellen.................................................................. 29
2.2.4 Quantitative Zytokinbestimmungen in Kulturüberständen ...................................... 30
2.2.5 Immunfluoreszenzmarkierungen und durchflusszytometrische Zellanalyse ........... 31
2.2.6 Zellanalyse im konfokalen Laser-Rastermikroskop................................................. 33
2.2.7 Isolierung von zellulärer und viraler RNA............................................................... 34
2.2.8 Reverse Transkription der RNA............................................................................... 35
2.2.9 Etablierung einer quantitativen real-time PCR für humanes Interleukin-10............ 36
2.2.9.1 Prinzip der quantitativen real-time PCR ...................................................... 36
2.2.9.2 Festlegung der Primer- und Sonden-Sequenzen .......................................... 36
2.2.9.3 Reaktionsansätze der quantitativen real-time PCR für humanes
Interleukin-10............................................................................................... 38
2.2.9.4 Relative Quantifizierung der IL-10 mRNA Expression .............................. 39
2.2.9.5 Analyse der PCR-Produkte .......................................................................... 40
2.2.9.6 Klonierung der PCR-Produkte ..................................................................... 40
2.2.9.7 Sequenzierung der PCR-Produkte ............................................................... 42
2.2.9.8 Absolute Quantifizierung der IL-10 Kopienzahl ......................................... 43
2.2.10 RSV-Nachweis mittels quantitativer real-time PCR .............................................. 44
2.2.11 Statistische Auswertungen...................................................................................... 44
3. Ergebnisse ........................................................................................................................ 45
3.1 Ergebnisse der einstufigen und zweistufigen magnetischen Zellsortierung..... 45
3.1.1 Reinheit der Zellfraktionen nach magnetischer Sortierung...................................... 45
3.1.2 Zellausbeute bei der magnetischen Zellsortierung ................................................... 48
3.2 Phänotypische Charakterisierung der Interaktion zwischen RSV und
T-Zellen ........................................................................................................................... 49
3.2.1 Analyse der Interaktion zwischen RSV und T-Zellen im Durchflusszytometer...... 49
3.2.1.1 Anteil RSV-positiver T-Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen ... 49
3.2.1.2 Expression von ICAM-1 auf RSV-stimulierten T-Zellen............................ 52
3.2.1.3 Expression von CD69 auf RSV-stimulierten T-Zellen ................................ 53
3.2.2 Analyse der Interaktion zwischen RSV und T-Zellen im konfokalen LaserRastermikroskop ...................................................................................................... 53
3.2.3 Nachweis von RSV-RNA in RSV-exponierten T-Zellkulturen ............................... 56
INHALT
III
3.3 Nachweis von humanem Interleukin-10 mittels quantitativer real-time
PCR .................................................................................................................................. 58
3.3.1 Auswahl der Primer und Amplifikation der Zielsequenz......................................... 58
3.3.2 Spezifität der quantitativen real-time PCR für humanes Interleukin-10 .................. 60
3.3.3 Sensitivität und Variabilität der quantitativen real-time PCR für humanes
Interleukin-10........................................................................................................... 62
3.4 Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der Interaktion zwischen
RSV und T-Zellen in vitro ........................................................................................... 64
3.4.1 Vitalität der virusstimulierten T-Zell-Kulturen ........................................................ 64
3.4.2 IL-10 mRNA-Expression in RSV-stimulierten T-Zellkulturen ............................... 64
3.4.3 IL-10 mRNA-Expression in T-Zellkulturen mit anderen Stimuli............................ 67
3.4.4 IL-10 mRNA-Expression in RSV-stimulierten Monozytenkulturen ....................... 68
3.4.5 IL-10 Proteinkonzentration im Überstand RSV-stimulierter T-Zellkulturen
und Monozytenkulturen ........................................................................................... 69
3.4.6 IL-10 mRNA Expression in Kokulturen aus T-Zellen und Monozyten................... 71
3.4.7 IL-10 Proteinkonzentration im Überstand RSV-stimulierter Kokulturen aus
T-Zellen und Monozyten ......................................................................................... 74
3.4.8 IL-10 Proteinkonzentration im Überstand RSV-stimulierter Kokulturen aus
Alveolarmakrophagen und T-Zellen........................................................................ 76
3.4.9 IFN-γ Proteinkonzentration im Überstand RSV-stimulierter Kokulturen................ 77
3.4.10 Verhältnis von IL-10 und IFN-γ Produktion in RSV-stimulierter Kokulturen ...... 79
4. Diskussion ........................................................................................................................ 82
4.1 Gewinnung hochreiner T-Zellen aus peripherem Blut............................................ 82
4.2 Phänotypische Charakterisierung RSV-stimulierter T-Zellen ................................ 82
4.3 Nachweis einer funktionellen Bedeutung der Interaktion von RSV und T-Zellen
in vitro ..................................................................................................................... 87
4.4 Die Rolle RSV-stimulierter T-Zellen in verschiedenen Kokulturmodellen............ 93
4.5 Möglicher Einfluß RSV-stimulierter T-Zellen auf die virusinduzierte
Immunantwort bei COPD ....................................................................................... 96
5. Literatur ........................................................................................................................... 99