Analyse differenzieller Membranproteine in regulatorischen CD4+

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Die funktionellen Eigenschaften von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen sind
derzeit gut charakterisiert. Der vom Zellkontakt abhängige Suppressionsmechanismus, der vermutlich über Zelloberflächenproteine vermittelt wird, ist allerdings
weitgehend unverstanden. Ebenso sind die Merkmale dieser Zellen auf molekularer Ebene und besonders für Membranproteine bisher nur in Ansätzen beschrieben. Durch ihre Fähigkeit, Immunantworten zu supprimieren, sind regulatorische
T-Zellen wichtige Kandidaten für klinische Therapien. Die gezielte Aktivierung bzw.
Deaktivierung oder Depletion von regulatorischen T-Zellen könnte eine entscheidende Rolle bei künftigen Therapieformen von Autoimmunerkrankungen, der
Vermeidung von Transplantatabstoßungen sowie der Bekämpfung von Tumorzellen spielen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Methoden zur Analyse des MembranProteoms von T-Zellen zu entwickeln, das Membran-Proteom CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen durch den Vergleich mit dem T-Zellsubtyp der konventionellen
CD4+ T-Zellen zu charakterisieren und bei beiden Zelltypen ruhende und die durch
Stimulation funktionell aktivierten Zustände zu erfassen.
Probleme der Anreicherung von Membranproteinkomplexen wurden durch die
Verwendung des nichtionischen Detergenz Triton X-114 gelöst. Als Anpassung an
die geringen Zellmengen, die zur Verfügung standen, wurde eine neue, hochsensitive und leistungsfähige Methode entwickelt, die eine differenzielle Proteomanalyse der Membranproteine erlaubte. Dazu wurden die angereicherten
Membranproteine mit den Fluoreszenzfarbstoffen CyTM3 bzw. CyTM5 an den
Thiolgruppen von Cysteinen markiert. Dies ermöglichte nach der Auftrennung über
zwei unterschiedliche zweidimensionale gelelektrophoretische Methoden die sehr
sensitive Detektion von Proteinen. Zur Auftrennung hydrophiler Komponenten des
Membran-Proteoms eignete sich die hochauflösende Kombination aus isoelektrischer Fokussierung und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese
(2D-IEF/SDS-PAGE). Die Regulationen hydrophober Membranproteine konnte
erstmals durch die in der vorliegenden Arbeit neu entwickelte, gut reproduzierbare
und hochauflösende Kombination aus Cetyltrimethylammoniumbromid-PAGE und
SDS-PAGE (2D-CTAB/SDS-PAGE) ermittelt werden.
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Durch die Kombination der beiden Techniken mit der Matrix-unterstützten
Laserdesorptions/Ionisations Massenspektrometrie wurden beim Vergleich der
Zellsubtypen und ihrer Aktivierungszustände signifikante Unterschiede des
Membran-Proteoms identifiziert, insgesamt 107 nicht redundante Proteine aus
differenziell regulierten Protein-Spots.
Durch Zuordnung der subzellulären Lokalisation dieser Proteine wurden die in
der Fachliteratur beschriebenen funktionellen Eigenschaften regulatorischer TZellen mit Veränderungen auf molekularer Ebene verknüpft. So korrelierte die
stark gehemmte Proliferation aktivierter CD4+CD25+ T-Zellen mit der Reduktion
von Proteinen der Proteinbiosynthese. Andererseits belegten abundantere
Proteine des Elektronentransfer-ATP-Synthase-Komplexes eine gesteigerte ATP
Produktion. Der höhere Energiebedarf regulatorischer T-Zellen erklärt weitere
Unterschiede, die belegt werden konnten, wie die vermutlich gesteigerte
Östrogenbiosynthese, die zur Induktion des Phänotyps regulatorischer T-Zellen
benötigt wird.
In der vorliegenden Arbeit konnten aber auch Proteine ermittelt werden, die bei
der Vermittlung der suppressiven Eigenschaften regulatorischer CD4+CD25+ TZellen von entscheidender Bedeutung sein könnten. Im Vergleich mit konventionellen T-Zellen fanden sich veränderte zytoskelettale Strukturelemente, die in
Kombination mit stärker regulierten, ATP-gesteuerten Myosin-Motorproteinen auf
eine flexiblere Translokation von Rezeptoren in regulatorischen T-Zellen hinweisen. Zudem weist die in regulatorischen T-Zellen stärker gebildete kleine GTPase
Rap1 auf eine starke Aktivierung von Integrin-Zelladhäsionsproteinen hin. Diese
für konventionelle CD4+ T-Zellen gut beschriebene Interaktion muss für regulatorische T-Zellen in weiterführenden Experimenten genauer charakterisiert werden.
Eine bei regulatorischen T-Zellen durch Rap1 vermittelte hoch affine Zellinteraktion mit konventionellen T-Zellen könnte eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung der Suppression haben.