modulation der effektor-t-zellproliferation durch ccr6+-t

AUS DEM LEHRSTUHL
FÜR IMMUNOLOGIE
PROF. DR. RER. NAT. DANIELA MÄNNEL
DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN
DER UNIVERSITÄT REGENSBURG
MODULATION DER EFFEKTOR-T-ZELLPROLIFERATION
DURCH CCR6+-T-HELFERZELLEN IM KONTEXT MIT
REGULATORISCHEN T-ZELLEN
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der
Fakultät für Medizin
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Annette Ingrid Hofstetter
2013
http://d-nb.info/1042716137
Inhalt:
1. Einleitung
10
1.1
Das Immunsystem - eine Übersicht
1.2
Subpopulationen der CD4+-T-Lymphozyten - Differenzierung,
Aufgaben und Wirkungsweise
10
11
1.2.1
Regulatorische T-Zellen
14
1.2.2
Th17-Zellen
17
1.3
Chemokine, Chemokinrezeptoren und deren Expression
1.3.1
1.4
Chemokinrezeptoren als Charakteristika von T-Zellen
Zielsetzung der Arbeit
2. Material und Methoden
2.1
Material
19
21
22
23
23
2.1.1
Versuchstiere
23
2.1.2
Verbrauchsmaterialien und Geräte
23
2.1.3
Zellkulturreagenzien
25
2.1.4
Puffer und Medien
25
2.1.5
Antikörper und Färbereagenzien
26
2.1.6
Kits
28
2.2
Methoden
2.2.1
Tierexperimentelle Methoden
29
29
2.2.1.1
Tierhaltung
29
2.2.1.2
Organentnahme
29
2.2.2
Zellbiologische Methoden
30
2.2.2.1
Zellkultur
30
2.2.2.2
Collagenaseverdau
30
2.2.2.3
Gewinnung von Einzelzellen
30
2.2.2.4
Erythrozytenlyse
31
2.2.2.5
Bestimmung der Lebendzellzahl
31
2.2.2.6
Zellseparierung mittels FACSAria
32
2.2.2.7
Zellseparierung mittels MACS
33
2.2.2.8
Zellseparierung mittels MagCellect
33
2.2.2.9
Gewinnung von APC
34
2.2.2.10
CFSE-Markierung
35
Analytische Methoden
36
2.2.3
2.2.3.1
Bestimmung der Wachstumsbedingungen von
Treg-Zellen
36
2.2.3.2
Generierung in vitro-expandierter Treg-Zellen
37
2.2.3.3
Suppressionstitration
38
2.2.3.4
Proliferationskinetik
39
2.2.3.5
Kokultur-Assay
40
2.2.4
Durchflusszytometrie
2.2.4.1
Oberflächenmarkierung von Lymphozyten
42
2.2.4.2
Intrazelluläre Markierung von Lymphozyten
43
2.2.5
Multiplex Zytokin Analyse
3. Ergebnisse
3.1
42
43
45
Herstellung und Charakterisierungin vitro-expandierter
Treg-Zellen
45
3.1.1
Etablierung eines Protokolls zur in vitro-Expansion
45
3.1.2
Charakterisierung und Überprüfung
48
3.1.2.1
Einfluss auf die Teff-Zellproliferation
48
3.1.2.2
Titration regulatorischer T-Zellen
50
52
3.2
Etablierung eines bidynamischen Kokultur-Assays
3.3
Einfluss von CCR6+-Th-Zellen auf die Teff-Zellproliferation im
3.4
Einfluss von CCR6+-Th-Zellen auf die Teff-Zellproliferation in
Gegenwart von Treg-Zellen
59
3.5
Messung der Zytokinproduktion
63
Vergleich zu Treg-Zellen
3.5.1
Vergleich der Produktion von lnterleukin-17 und
3.5.2
Produktion weiterer Zytokine in der Übersicht
lnterleukin-10
55
64
65
4. Diskussion
67
4.1
Plastizität als wichtige Eigenschaft auch von T-Lymphozyten
68
4.2
CCR6 als Gemeinsamkeit pro- und antiinflammatorischer Zellen
70
4.3
Mechanismus der Teff-Zellsuppression
70
4.3.1
Suppression durch Treg-Zellen
71
4.3.2
Suppression durch CCR6+-Th-Zellen
72
4.3.3
Modell der Th17-Zelle als Teff-Suppressorzelle
73
4.4
Ausblick und neue Therapieansätze von Autoimmunerkrankungen .76
4.4.1
Inhibitoren der Leukozytenmigration, CCR6/CCL20-System
4.4.2
Antagonisten von Zytokinen und Zytokinrezeptoren,
p40-Antikörper
4.4.3
Kritische Gedanken zu neuen Therapieansätzen
77
78
79
5. Zusammenfassung
81
6. Anhang
83
6.1
Abkürzungsverzeichnis
83
6.2
Abbildungsverzeichnis
86
6.3
Literaturverzeichnis
87
6.4
Veröffentlichungen
96
6.5
Erklärung zum Promotionsverfahren
97
6.6
Lebenslauf
6.7
Dank
99
100