Modulation der T-Helferzell Immunantwort durch Signale von Toll
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Modulation der T-Helferzell Immunantwort durch Signale von Toll-like Rezeptoren und Mastzellmediatoren auf Dendritische Zellen Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Gabriele Beate Theiner aus Erlangen Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 02.06.2005 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler Zweitberichterstatter: PD Dr. M. Lutz Diese Doktorarbeit ist Herrn HD Dr. Michael Dahl gewidmet, der leider viel zu früh verstorben ist. -Inhaltsverzeichnis- 1 Einleitung ................................................................................................... 1 1.1 1.1.1 Das angeborene Immunsystem ............................................................... 1 1.1.2 Das erworbene (adaptive) Immunsystem ................................................ 2 1.2 Dendritische Zellen (DZ)................................................................................... 4 1.2.1 Herkunft und Lokalisation ........................................................................ 4 1.2.2 DZ-Subgruppen ....................................................................................... 4 1.2.3 Antigenpräsentation ................................................................................. 6 1.2.4 Aktivierung und Polarisierung von T-Zellen ............................................. 8 1.3 Toll-like Rezeptoren (TLR).............................................................................. 12 1.3.1 TLR und ihre Liganden .......................................................................... 12 1.3.2 Signalwege ............................................................................................ 15 1.3.3 Expression auf DZ ................................................................................. 16 1.3.4 Kooperation und gegenseitige Inhibition verschiedener TLR ................ 17 1.4 2 Immunsystem ................................................................................................... 1 Mastzellen (MZ) .............................................................................................. 18 1.4.1 Herkunft, Lokalisation und Funktion....................................................... 18 1.4.2 Einfluß von MZ und deren Mediatoren auf DZ....................................... 20 Problemstellung....................................................................................... 22 2.1 Einfluss verschiedener TLR-Agonisten auf Dendritische Zellen und die daraus resultierende Polarisierung von Th1-Zellen ........................................ 22 2.2 Einfluss von Mastzellen und deren Mediatoren auf Dendritische Zellen und die daraus resultierende Polarisierung von Th2-Zellen .................................. 23 3 Material und Methoden............................................................................ 25 3.1 Standardlösungen, Puffer und Medien ........................................................... 25 3.2 Spezielle Reagenzien ..................................................................................... 27 3.2.1 Stimulantien und Zytokine...................................................................... 27 3.2.2 Oligonukleotide ...................................................................................... 28 3.2.3 Antigene................................................................................................. 29 3.3 Antikörper ....................................................................................................... 29 3.4 Verwendete Mausstämme .............................................................................. 31 3.5 Zellkulturmethoden ......................................................................................... 32 3.5.1 Allgemeine Arbeitstechniken mit Zellen ................................................. 32 3.5.1.1 Handhabung der Zellen.................................................................. 32 3.5.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen................................................ 32 3.5.1.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung............................................ 32 3.5.1.4 Gewinnung von murinem GM-CSF Kulturüberstand...................... 33 3.5.2 Spezielle Arbeitstechniken mit Zellen .................................................... 34 3.5.2.1 Knochenmarkspräparation ............................................................. 34 3.5.2.2 Generierung dendritischer Zellen (DZ)........................................... 34 3.5.2.3 In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen mittels PGD2-stimulierten DZ.................................................................... 35 3.5.2.4 Generierung von Mastzellen (MZ).................................................. 36 3.5.2.5 In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch Mastzell- bzw. Mastzellüberstand-stimulierten DZ........................ 37 3.5.2.6 Lymphknotenpräparation als Quelle für T-Zellen ........................... 38 3.5.2.7 Peptidspezifische Restimulation in vivo stimulierter Lymphknotenzellen ....................................................................... 39 3.6 3.6.1 T-Zell-Proliferationstest durch [3H]-Thymidineinbau .............................. 40 3.6.2 „Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay“ (ELISA) ................................. 40 3.6.3 Histamin-ELISA...................................................................................... 41 3.6.4 Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie (FACS) ............................. 42 3.7 4 Immunologische Methoden............................................................................. 40 3.6.4.1 Extrazelluläre FACS-Färbung ........................................................ 42 3.6.4.2 Intrazelluläre FACS-Färbung ......................................................... 43 3.6.4.3 Apoptose-Färbung ......................................................................... 44 May-Grünwald-Giemsa-Färbung zur Validierung von DZ und MZ ................. 44 Ergebnisse ............................................................................................... 46 4.1 Generierung und Charakterisierung von DZ aus murinem Knochenmark (KM-DZ) .......................................................................................................... 46 4.2 Einfluss von TLR-Agonisten auf KM-DZ und wiederum deren Auswirkung auf die Polarisierung von Th1-Zellen .............................................................. 47 4.2.1 Reifung und IL-12p40 Produktion von DZ durch Zugabe verschiedener TLR-Agonisten ............................................................... 47 4.2.2 Intrazelluläre Lokalisation von CpG-FITC .............................................. 49 4.2.3 Zeitabhängiger, synergistischer Effekt durch CpG-Vorstimulation auf LPS-induzierte IL-12p70 und IL-12p40 Produktion von KM-DZ............. 50 4.2.4 MyD88-abhängiger synergistischer Effekt der LPS-induzierten IL12p70 und IL-12p40 Produktion von KM-DZ nach CpG-Vorstimulation 53 4.2.5 Der synergistische Effekt der IL-12 Produktion ist unabhängig von der Modifizierung des Oligonukleotid-Rückgrates........................................ 55 4.2.6 CpG-abhängiger Anstieg der IL-12 Produktion basiert nicht auf Endotoxinkontamination der CpG-Oligonukleotide (ODN)..................... 57 4.2.7 „Nukleosomen Umbau“ spielt keine Rolle bei der Zunahme der durch CpG-induzierten IL-12 Produktion ......................................................... 59 4.2.8 4.3 CpG induziert eine zeitabhängige Expression von TLR4 ...................... 59 Generierung von Mastzellen aus murinem Knochenmark.............................. 61 4.3.1 Ausdifferenzierte MZ zeigen keine MHC-II Expression und können nicht in DZ umgewandelt werden........................................................... 63 4.3.2 Aktivierung der Mastzellen über IgE-Kreuzvernetzung.......................... 64 4.3.3 Aktivierung von ruhenden KM-MZ über TLR und FcεRI ........................ 65 4.4 Einfluss von Mastzellmediatoren auf DZ ........................................................ 67 4.4.1 4.5 Heparin bindet bereits produziertes IL-12p70 im Gegensatz zu PGD2 .. 71 Einfluss von PGD2 auf KM-DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von Th-Zellen.................................................................................................. 73 4.5.1 Marginale Beeinflussung der DZ-Reifung durch PGD2 ist nicht auf Apoptose zurückzuführen ...................................................................... 73 4.5.2 Konzentrationsabhängiger Rückgang der IL-12p70 und p40 Produktion von KM-DZ durch PGD2-Vorstimulation............................... 75 4.5.3 Einfluss von PGD2 stimulierten Zellen auf die Th-Polarisierung ............ 76 4.5.4 Abnahme IL-12 Produktion von KM-DZ durch PGD2 ist abhängig von der Dauer der Vorstimulation ................................................................. 80 4.5.5 4.6 Polarisierung von Th2-Zellen nach PGD2 Stimulation von KM-DZ ........ 81 Einfluss von Mastzellen und deren Mediatoren auf KM-DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von Th-Zellen .................................................... 83 5 Diskussion................................................................................................ 86 5.1 Kooperation von TLR9 und TLR4 muriner KM-DZ ......................................... 86 5.2 PGD2-vermittelte Zunahme der Th2-Polarisierung durch DZ ......................... 92 5.3 Beeinflussung der Th1-und Th2-Polarisierung durch DZ ............................... 96 6 Zusammenfassung .................................................................................. 98 7 Summary ................................................................................................ 100 8 Persönliche Veröffentlichungen........................................................... 102 9 8.1 Wissenschaftliche Originalveröffentlichungen .............................................. 102 8.2 Kurzveröffentlichungen ................................................................................. 102 8.3 Posterpräsentationen.................................................................................... 103 8.4 Vorträge ........................................................................................................ 103 Literaturverzeichnis............................................................................... 104 10 Abkürzungsverzeichnis......................................................................... 120 11 Lebenslauf.............................................................................................. 123 -Einleitung- 1 1.1 Einleitung Immunsystem Das Immunsystem ist ein hochkomplexes System, welches aus einer Vielzahl von Zellen und Molekülen besteht, die unter anderem auf die Abwehr von Infektionen spezialisiert sind. Alle Zellen des Immunsystems stammen von den pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks ab. Die zur Abwehr dienenden Zellen sind vor allem in den lymphatischen Organen lokalisiert, zum Teil zirkulieren sie im Blut und gelangen so in alle Gewebe einschließlich der Schleimhäute. Aufgrund der unterschiedlichen Aufgaben und Funktionen wird das Immunsystem in die angeborene und erworbene Immunantwort unterteilt. 1.1.1 Das angeborene Immunsystem Die angeborenen Abwehrmaßnahmen werden auch als unspezifisch bezeichnet, da sie unabhängig vom jeweils eindringenden Erreger aktiv werden. Hierzu zählen unter anderem der Säuremantel der Haut sowie die intakte Epidermis, das Komplementsystem, antimikrobielle Enzymsysteme sowie unspezifische Mediatoren wie Interferone und Interleukine. Zu den Zellen des unspezifischen Abwehrsystems gehören Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und dendritische Zellen (DZ), welche aufgrund ihrer Fähigkeit eingedrungene Fremdantigene durch Phagozytose aufzunehmen, auch als Phagozyten bezeichnet werden. Zusätzlich sind Mastzellen (MZ) und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) zu nennen, wobei MZ hauptsächlich für die Auslösung allergischen Reaktionen verantwortlich sind, während NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunität gegen Viren und andere intrazelluläre Krankheitserreger spielen, sowie an der antikörperabhängigen zellvermittelten Cytotoxizität (ADDC, „antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity“) beteiligt sind [1]. 1 -Einleitung- Die Zellen des angeborenen Immunsystems spielen bei der Auslösung und der anschließenden Steuerung der adaptiven Immunreaktion eine entscheidende Rolle. Aus diesem Grund nehmen einige Zelltypen, wie beispielsweise DZ, eine Zwischenstellung zwischen diesen beiden Immunsystemen ein. 1.1.2 Das erworbene (adaptive) Immunsystem Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem ist das erworbene Abwehrsystem darauf programmiert, körperfremde Moleküle spezifisch zu erkennen und zu entfernen. Aus diesem Grund wird es auch als spezifisches Immunsystem bezeichnet. Nach dem Erstkontakt mit dem Antigen werden so genannte Gedächtniszellen gebildet. Dieses immunologische Gedächtnis führt dazu, dass bei einem Zweitkontakt mit dem jeweiligen Antigen die Immunantwort schneller und effektiver erfolgen kann. Die maßgeblichen Zellen der spezifischen Immunantwort sind B- und T-Lymphozyten. Obwohl beide Zelltypen von pluripotenten Stammzellen aus dem Knochenmark (KM) abstammen, erfolgt die Differenzierung und Vermehrung in zwei unterschiedlichen primären lymphatischen Organen. Die Entwicklung der BLymphozyten erfolgt im Knochenmark, während T-Lymphozyten im Thymus selektioniert werden. Während dieser verschiedenen Entwicklungsphasen lernen die Lymphozyten, zwischen körperfremden und körpereigenen Antigenen zu unterscheiden („klonale Selektion“). Dies geschieht zum einem durch Interaktion des B- bzw. T-Zellrezeptors mit HaupthistokompatibilitätskomplexMolekülen (MHC, “major histocompatibility complex”) bzw. durch Präsentation von Fremdpeptiden durch diese MHC-Moleküle. Erkennen unreife Lymphozyten körpereigene Antigene, werden diese sofort eliminiert („klonale Deletion“). Nach Ausreifung der Zellen gelangen diese über die Blutbahn und die Lymphe zu den sekundären lymphatischen Organen, wo sie in den so genannten B- bzw. TZellarealen akkumulieren. Solange sie mit keinem Antigen in Kontakt kommen, werden sie als naive Lymphozyten bezeichnet. 2 -Einleitung- Die Aufgabe der B-Zellen besteht darin, körperfremde Antigene zu erkennen und Antikörper (Ak, Immunglobuline) dagegen zu produzieren. Bislang sind fünf Klassen von Immunglobulinen (Ig) beschrieben worden, die mit IgG, IgM, IgA, IgD und IgE bezeichnet und in mehrere Subklassen unterteilt werden können. Aufgrund ihrer variablen Struktur erkennen sie spezifisch eine Vielzahl von Antigenen und lösen jeweils eine entsprechende Immunreaktion aus. Diese Art der B-Zell-induzierten Immunabwehr wird auch als humorale Immunität bezeichnet. Im Unterschied dazu induzieren T-Zellen eine Immunantwort, welche auch als zelluläre Immunantwort bekannt ist. Für die Auslösung dieser Reaktion und der damit verbundenen Aktivierung der T-Zellen sind allerdings Zellen des angeborenen Immunsystems notwendig, wie zum Beispiel Makrophagen oder DZ. Mittels des T-Zellrezeptors (TZR) erkennen T-Lymphozyten spezifische Peptidantigene, welche ihnen auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Hierbei unterscheidet man zwischen MHC-Molekülen der Klasse I (MHC-I-Moleküle), welche sich auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zelle befinden, und MHCMolekülen der Klasse II (MHC-II-Moleküle), die fast ausschließlich von professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APZ) exprimiert werden. Zu den professionellen APZ gehören Makrophagen, B-Zellen und DZ. Die Einteilung der T-Lymphozyten erfolgt je nach Restriktion für MHC-Moleküle der Klasse I bzw. der Klasse II in CD4+ T-Helfer-Zellen (Th-Zellen) bzw. in CD8+ zytotoxische TZellen. Die Präsentation endogener Antigene infizierter oder entarteter Zellen über MHC-I-Moleküle führt zur Aktivierung zytotoxischer T-Zellen, wodurch es zur Eliminierung dieser Zellen kommt. Im Gegensatz dazu nehmen APZ exogene Fremdproteine auf, prozessieren sie und präsentieren sie über MHC-II-Moleküle den Th-Zellen. Abhängig von weiteren Faktoren, auf die im Abschnitt 1.2.4 noch näher eingegangen wird, kommt es zur Proliferation und zur Differenzierung der naiven Th-Zellen in Th1- bzw. Th2-Zellen. Diese spielen unter anderem bei der Aktivierung von B-Zellen und der daraus folgenden Differenzierung zu Akproduzierenden Plasmazellen eine entscheidende Rolle. 3 -Einleitung- 1.2 Dendritische Zellen (DZ) 1.2.1 Herkunft und Lokalisation Dendritische Zellen (DZ) spielen, wie bereits erwähnt, eine zentrale Rolle im angeborenen und erworbenen Immunsystem. Die hoch spezialisierten, antigenpräsentierenden Zellen zirkulieren im Blut und in der Lymphe und gelangen somit in das periphere Gewebe bzw. in die sekundären lymphoiden Organe, wo sie primär lokalisiert sind. Im unreifen Zustand agieren sie dort als Wächterzellen und sind entscheidend bei der adaptiven Immunabwehr. 1.2.2 DZ-Subgruppen Die Einteilung der DZ erfolgt in verschiedene Subtypen, welche sich in Funktion und Expression von Oberfächenmarkern unterscheiden. Durch Lokalisation der verschiedenen DZ-Typen in denen für sie spezifischen Organen bzw. Geweben und durch Expression eines unterschiedlichen Repertoires an Toll-like Rezeptoren (TLR), auf die unter 1.3 noch genauer eingegangen wird, ist es ihnen möglich, auf eindringende Pathogene gezielt zu reagieren und dadurch eine Immunreaktion zu induzieren. Erstmals wurden DZ im Jahre 1973 beschrieben [2], als Steinman und Cohn aus der Milz von Mäusen Zellen isolierten und sie aufgrund ihrer lang gestreckten Fortsätze als „dendritische Zellen“ bezeichneten. Doch bereits 100 Jahre zuvor, entdeckte der Medizinstudent Paul Langerhans Zellen in der Epidermis, so genannte „Langerhanszellen“ (LZ) [3], welche später ebenfalls als eine Subpopulation der DZ charakterisiert wurden [4, 5]. Allen DZ-Subtypen gemein ist, dass sie von einer CD34+ Knochenmarksstammzelle abstammen (Abb.1) [6]. In Abhängigkeit von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Zytokinen erfolgt aus dieser hämatopoetischen Stammzelle die Differenzierung der verschiedenen DZ-Subpopulationen. Ursprünglich wurden sie in myeloide und lymphoide DZ eingeteilt. Neueste Erkenntnisse zeigen jedoch, dass lymphoide Vorläuferzellen auch zu myeloiden DZ differenzieren können und umgekehrt [7, 4 -Einleitung- 8]. Aus diesem Grund werden sie momentan als klassische bzw. konventionelle DZ bezeichnet. Eine weitere Subpopulation sind die in der Epidermis lokalisierten Langerhans Zellen (LZ), welche vor allem durch Birbeck-Granula und E-Cadherin-Expression charakterisiert werden. Ein weiteres Charakteristikum dieser Zellen ist deren Abhängigkeit von TGFβ, bezogen auf ihre Differenzierung [9-11]. Hämatopoetische Stammzelle Vorläuferzelle 1 (myeloid) CD34 +CLA+ Vorläuferzelle 2 (lymphoid) CD34 +CLAPlasmazytoid IPZ / pDZ2 ? Langerhans DZ Monozyt / pDZ1 klassische DZ aktivierte reife Langerhans DZ aktivierte reife klassische DZ DZ1 DZ2 Abb.1: Entwicklung verschiedener Subtypen aus CD34+ Stammzellen des Knochenmarks (CLA: cutanes lymphozytenassoziiertes Antigen; IPZ: IFN-produzierende Zelle; pDZ: DZ-Vorläuferzelle; modifiziert nach Shortman und Liu [6]) Sowohl klassische DZ als auch LZ sind im unreifen Zustand in der Peripherie lokalisiert und übernehmen dort eine entscheidende Funktion in der Immunabwehr (siehe 1.2.3) [12]. Eine Ausnahme zu den bisher beschriebenen DZ-Subtypen bilden die kürzlich charakterisierten plasmazytoiden DZ. Sie stammen von Vorläuferzellen aus dem Blut ab [13] und exprimieren Marker aus verschiedenen Zellreihen, wie beispielsweise B-Zellen (B220) oder Granulozyten (Gr-1) [14, 15]. Ihre Hauptaufgabe besteht vor allem in der Abwehr viraler 5 -Einleitung- Infektionen [16]. Anhand aktueller Daten konnte allerdings gezeigt werden, dass auch plasmazytoide DZ in klassische DZ differenzieren können [17]. Die Generierung von humanen oder murinen klassischen DZ in vitro erfolgt durch Kultivierung von peripheren Blutmonozyten oder Knochenmark unter Zugabe des Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktors (GMCSF, „granulocyte-macrophage colony stimulating factor“) plus bzw. minus IL-4. [18-20]. 1.2.3 Antigenpräsentation Da die Orte der Antigenaufnahme und der Antigenpräsentation meist in zwei unterschiedlichen Kompartimenten stattfinden, müssen die Antigene vom Ort des Eindringens hin zum Ort der initialen Immunantwort transportiert werden. Diese Aufgabe wird von DZ übernommen. In den Geweben lokalisierte unreife DZ besitzen effiziente Mechanismen zur Antigenaufnahme [12]. Dabei kann es sich sowohl um gelöste Proteine handeln, als auch um größere Partikel bis hin zu ganzen Mikroorganismen. Nach Aufnahme der Antigene mittels Phagozytose, Makropinozytose oder rezeptorvermittelter Endozytose werden sie zu Peptiden degradiert [21]. Ausgelöst durch pathogenes Material, welches vor allem über TLR gebunden wird, wandern DZ innerhalb der lymphatischen Gefäße zu den drainierenden lymphoiden Organen. Während dieser Migration reifen sie heran, wodurch sich ihre Morphologie und Funktion entscheidend verändert (Abb.2). Unter anderem verlieren sie ihre Fähigkeit Antigene zu phagozytieren [22]. Nach Induktion der Reifung werden die aufgenommenen Antigene prozessiert [23] und die zur Antigenpräsentation notwendigen MHC-IIPeptidkomplexe gebildet [24]. Neben der verstärkten Expression von MHC-IIMolekülen kommt es ebenfalls zur Zunahme der Expression von kostimulatorischen Molekülen, wie B7-1(CD80) und B7-2 (CD86) (Abb.2) [25]. Während Rezeptoren für inflammatorische Zytokine herunter reguliert werden, wird der Chemokine-Rezeptor CCR7 verstärkt exprimiert (Abb.2). Durch Bindung von CCR7 an seine Liganden SLC und ELC, welche von lymphatischen 6 -Einleitung- Endothelzellen produziert werden [26], gelangen die DZ in die Lymphknoten [27]. All diese Modifikationen führen dazu, dass DZ sehr effizient in der Präsentation von Antigenen sind. Zusätzlich zu diesen phänotypischen Veränderungen kommt es auch zu morphologischen, durch Ausbildung langer zytoplasmatischer Fortsätze, welche als „Dendriten“ bezeichnet werden (Abb.2). unreife DZ (Periphere Organe) reife DZ (Lymphatisches Gewebe) Migration und Reifung • verstärkte Antigenaufnahme • Verlust der Phagozytosefähigkeit • wenige MHC-II-Moleküle • kaum kostimulatorische Moleküle • viele MHC-II-Moleküle • viele kostimulatorische Moleküle • kaum CCR7 Moleküle • verstärkte CCR7 Expression Abb.2: Veränderung der Morphologie und des Phänotyps bei der DZ-Reifung Ebenso wie andere Zellen, können auch DZ endogene Antigene über MHCMoleküle der Klasse I präsentieren. Nach Aktivierung der DZ werden die notwendigen Untereinheiten der Immunoproteasomen exprimiert, welche für die Prozessierung der Antigene notwendig sind [28] und MHC-I Moleküle hochreguliert [29]. Neben dieser Fähigkeit sind DZ auch in der Lage, exogen aufgenommene Antigene über MHC-I-Moleküle zu präsentieren [30]. Diese Art der Präsentation wird als „Kreuz-Präsentation“ oder „Kreuz-Priming“ der DZ bezeichnet. Auf diese Weise wird die Ausführung einer zytotoxischen TZellantwort auch gegen extrazelluläre Antigene ermöglicht [21]. 7 -Einleitung- Weiterhin existiert der so genannte CD1-Prozessierungsweg, der für die Aufnahme und Verarbeitung von Lipiden von Bedeutung ist. Bislang wurden fünf humane (CD1a-e) und zwei murine (CD1.1 und CD1.2) CD1-Moleküle charakterisiert, wobei nur CD1d homolog zu CD1.1 und CD1.2 der Maus ist [31, 32]. CD1-Moleküle werden hauptsächlich von Thymozyten und professionellen APZ exprimiert [33]. Hinsichtlich ihrer Struktur ähneln sie dem MHC-I-Molekül, werden allerdings in endosomalen Zellkompartimenten beladen wie MHC-IIMoleküle [34-36]. Somit werden auch exogene Lipid-Antigene über CD1Moleküle verschiedenen T-Zellpopulationen präsentiert [33, 37, 38]. Die Erkennung von Lipid-Antigenen, welche über CD1d präsentiert werden, erfolgt hingegen durch Natürliche Killer (NK) T-Zellen, welche sich unter anderem durch invariante TZR-Ketten, wie Vα14 im murinen bzw. Vα24 im humanen System und ein restringiertes Vβ-Repertoire, auszeichnen [39, 40]. Da DZ als einziger bekannter Zelltyp die Fähigkeit besitzen, allein durch Antigenpräsentation naive T-Zellen zur Proliferation anzuregen, werden sie auch als „Natürliches Adjuvans“ bezeichnet [41, 42]. 1.2.4 Aktivierung und Polarisierung von T-Zellen Nachdem DZ im Lymphknoten angelangt sind, aktivieren sie nicht nur TLymphozyten, sondern sind auch für die Differenzierung dieser in Effektorzellen entscheidend [43]. In den T-Zellarealen des regionären Lymphknotens präsentieren DZ die antigenen Strukturen auf MHC-II-Molekülen zur Erkennung durch T- Zellrezeptoren von naiven T-Zellen. Diese DZ- und T-Zellinteraktion stellt das erste Signal der T-Zellaktivierung dar (Abb.3) [12]. Für die Induktion der Immunantwort sind allerdings noch weitere Signale notwendig. Durch die Interaktion von kostimulatorischen Molekülen, wie B7-1 bzw. B7-2 mit CD28, welches konstitutiv auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, kommt es zur Induktion der IL-2 Synthese. IL-2 ist essentiell für die klonale Expansion von T-Zellen und wird nach Aktivierung von ihnen selbst produziert. Aus diesem 8 -Einleitung- Grund ist die Interaktion zwischen B7-1 bzw. B7-2 mit CD28 ein weiteres Signal, welches für die Proliferation und Differenzierung von naiven T-Zellen essentiell ist (Abb.3) [43]. Induziert durch die Aktivierung der T-Zellen, wird auf deren Oberfläche ein Molekül exprimiert, welches als CD154 bezeichnet wird und der Ligand für das CD40 Antigen von DZ ist. Durch Interaktion von CD154 mit CD40 nimmt die Expression von kostimulatorischen Molekülen weiter zu, wodurch wiederum die Aktivierung naiver T-Zellen verstärkt wird (Abb.3) [1]. DZ MHC-II CD40 Antigen CD4 IL-12 B7-1/2 CD28 TZR CD154 IL-12R IL-2 IFNγ T- Zelle 1.Signal 2.Signal 3.Signal Ag-Präsentation Kostimulation Th1-Polarisierung Abb.3: Polarisierung von Th1-Effektorzellen Für die Differenzierung von CD4+ Th-Zellen in Th1- und Th2-Effektorzellen sind weitere Signale notwendig, wie beispielsweise die Sekretion von immunmodulatorischen Zytokinen. Essentiell für die Polarisierung von Th1Effektorzellen ist IL-12, welches von aktivierten DZ in den T-Zellarealen sezerniert wird (Abb.3) [44, 45]. Hierbei handelt es sich um das bioaktive IL12p70, ein Heterodimer, bestehend aus einer p40 und einer p35 Untereinheit [46]. TLR, welche auf der Oberfläche von DZ exprimiert werden und auf die 9 -Einleitung- später noch genauer eingegangen wird (siehe 1.3), spielen durch die Erkennung spezifischer pathogener Strukturen eine entscheidende Rolle bei der Sekretion von IL-12. Neuere Erkenntnisse belegen auch, dass weitere Mitglieder der IL-12 Familie, wie IL-23 oder IL-27 eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Th1-Zellen spielen [47]. Ein weiteres Th1-polarisierendes Zytokin ist IFNγ. Die Stimulation von naiven Th-Zellen durch IL-12 führt zur vermehrten IFNγ Produktion, wodurch es zu einer verstärkten Th1-Polarisierung kommt [48]. Im Unterschied zur Th1-Polarisierung ist der genaue Mechanismus der Th2Polarisierung noch nicht eindeutig geklärt. Anfänglich ging man davon aus, dass alleine die Abwesenheit von IL-12 ausreicht, um Th2-Immunantworten zu induzieren [49, 50]. Zusätzlich weisen immer mehr Daten darauf hin, dass das für die Th2-Polarisierung notwendige Zytokin IL-4 vermutlich ausschließlich von T-Zellen selbst produziert wird [51]. IFNγ IL-2 TNFα TNFβ inflammatorische Prozesse virale Infektionen Th1 naive Th parasitäre Infektionen Allergien Th2 Abb.4: Th1- und Th2-Immunantwort 10 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13 -Einleitung- Th1-Immunantworten dominieren vor allem bei klassischen inflammatorischen Prozessen oder bei viralen Infektionen [52]. Typische Zytokine, welche von Th1Zellen produziert werden, sind Interferon gamma (IFNγ), IL-2 und die TumorNekrose Faktoren alpha (TNFα) und beta (TNFβ) (Abb.4). Im Gegensatz dazu findet man Th2-Immunantworten hauptsächlich im Rahmen von Allergien und Parasiteninfektionen [53-55]. Als typische Zytokine, welche von Th2-Zellen sezerniert werden, wären IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 zu nennen (Abb.4). Bislang sind unterschiedliche Modelle für die Polarisierung von naiven Th-Zellen in Th1- bzw. Th2-Zellen beschrieben worden (Abb. 5). Eines der Modelle besagt, dass unterschiedliche DZ-Subtypen ausschlaggebend für die Polarisierung von Th-Zellen sind (Abb. 5A) [56, 57]. Ein weiteres Modell wiederum geht davon aus, dass unabhängig vom DZ-Typ, verschiedene Antigene der Grund für die Differenzierung von Th1- bzw. Th2-Effektorzellen sind (Abb. 5B) [44, 58]. Zusätzlich wurde kürzlich beschrieben, dass die Dosis des Antigens entscheidend sein kann [59]. A) IL-12 DZ1 Th1 ? DZ2 Th2 B) Th1 Antigen I IL-12 DZ Antigen II IL-4 Th2 Abb.5: Verschiedene Modelle für die Polarisierung von Th-Effektorzellen A) DZ-Typen abhängiges Modell (modifiziert nach [56]) B) Antigen-Typen abhängiges Modell 11 -Einleitung- 1.3 Toll-like Rezeptoren (TLR) Wie bereits erwähnt, exprimieren DZ neben anderen Rezeptoren auch Toll-like Rezeptoren (TLR) auf ihrer Oberfläche. Diese sind genetisch determiniert und gehören zur Familie der „Pattern Recognition Receptors“ (PRR), welche gezielt zwischen körperfremden und körpereigenen Antigenen unterscheiden. Durch Erkennen konservierter, spezifischer pathogener Strukturen, so genannter „Erreger-assoziierter molekularer Muster“ („pathogen-associated molecular patterns”, PAMP), kommt es zur Aktivierung von DZ und somit zur Induktion der erworbenen Immunität [60-63]. Ihren Namen erhielten diese Rezeptoren aufgrund ihrer Homologie mit dem Toll-Gen der Fruchtfliege Drosophila [64, 65]. 1.3.1 TLR und ihre Liganden Bislang wurden elf Mitglieder der TLR-Familie (TLR1-11) in Säugern genauer charakterisiert (Abb.6), wobei TLR10 bisher nur im humanen System nachgewiesen werden konnte [66] und TLR11 nur im murinen [67]. Jeder dieser TLR bindet spezifisch konservierte Strukturen verschiedenster Pathogene. [60, 68]. TLR2, TLR1 und TLR6 TLR2 interagiert hauptsächlich mit Bestandteilen Gram positiver Bakterien, wie beispielsweise Peptidoglykane und OspA (Oberfächenprotein von Borrelia burgdorferi) [69]. Des Weiteren bildet er Heterodimere mit TLR1 und TLR6 [70]. Es konnte gezeigt werden, dass eine einseitige Blockade von TLR2 oder TLR6 die Aktivierung muriner Makrophagen durch Zymosan, einem Bestandteil der Hefen, verhindert [71]. TLR3 TLR3 ist spezifisch für doppelsträngige (ds) RNA, welche während viralen Infektionen produziert wird. Zusätzlich erkennt es Poly I:C, ein synthetisches Analog ds RNA [72, 73]. 12 -Einleitung- Flagellin Zymosan LP S Pam3Cys OspA TLR4 Lipoprotein TLR5 uropathogene E.coli TLR6 TLR2 TLR2 TLR11 TLR1 TLR2 PolyI:C Imiquimod R-848 CpG R-848 TLR3 TLR7 TLR8 TLR9 Abb.6: TLR und ihre Liganden im murinen System TLR4 Der Hauptligand von TLR4 ist Lipopolysaccharid (LPS), ein Bestandteil der Zellmembran Gram negativer Bakterien [74, 75]. Allerdings bindet LPS nicht direkt an TLR4. Als Homodimere bildet der Rezeptor einen Komplex mit dem extrazellulären Adaptorprotein MD-2 und dem Oberflächenmolekül CD14. Liegt freies LPS im Serum vor, wird es von einem Lipopolysaccharid bindenden Protein (LBP) gebunden und dadurch von CD14 erkannt [76-78]. Da CD14 keine intrazytoplasmatische Domäne besitzt, wird erst durch die Interaktion mit TLR4 die Aktivierung des Signalweges ermöglicht [74]. Wie CD14 besitzt MD-2 keine Transmembranregion, kann aber die Sensitivität von TLR4 bezüglich der Erkennung von LPS erhöhen [79]. TLR5 Bakterielles Flagellin ist der derzeit einzige bekannte Ligand von TLR5. Durch Bildung eines Homodimers wird die Aktivierung der Zellen ermöglicht [80] 13 -Einleitung- TLR7 und TLR8 Ebenso wie TLR3, spielen TLR7 und TLR8 eine entscheidende Rolle bei der Erkennung viraler Erreger. Zellen, welche diese Rezeptoren exprimieren, können mittels Imidazoquinolinen (z.B. Imiquimod, R-848 = Resquimod) aktiviert werden [81]. Imidazoquinolinen werden zur Therapie viraler Infektionen und von Hautkrebs eingesetzt. Neuere Daten zeigen, dass diese beiden TLR einzelsträngige virale RNA, wie z.B. von Influenzaviren, erkennen und dadurch eine anti-virale Immunantwort hervorrufen [82, 83]. TLR9 Über TLR9 erfolgt die Erkennung bakterieller genomischer und viraler DNA. Diese Sequenzen werden als nicht methylierte CpG-Motive bezeichnet. CpGMotive kommen in Bakterien 20-mal häufiger vor als in Säugetieren. Zusätzlich ist die DNA von Säugern methyliert. Diese morphologischen Unterschiede gewährleisten, dass nur pathogene DNA-Motive zur Zellaktivierung und somit zu einer Immunantwort führen. Auch synthetische Oligodinukleotide (ODN), die nicht methyliert sind und dieses Motiv enthalten, besitzen eine ähnliche Aktivität [84, 85]. TLR10 Bislang wurde für diesen Rezeptor noch kein natürlicher Ligand beschrieben. TLR11 Der erst kürzlich identifizierte TLR11 ist spezifisch für uropathogene E.coli Bakterien. Aus diesem Grund nimmt man an, dass er eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen der inneren Organen und des Urogenitaltraktes spielt [67]. Während TLR3, TLR7, TLR8 und TLR9 intrazellulär, in endosomalen Kompartimenten lokalisiert sind, werden Zelloberfläche exprimiert (Abb.6) [86-89]. 14 die restlichen TLR an der -Einleitung- 1.3.2 Signalwege TLR sind Transmembranmoleküle, bestehend aus einer extrazellulären, Leucinreichen Domäne und einem zytoplasmatischen Teil, der homolog zu dem des IL-1 Rezeptors ist und aus diesem Grund als „Toll/IL-1 Rezeptor“ (TIR) Domäne bezeichnet wird. Es erfolgt stets eine Dimerisierung der TLR-Moleküle zu Homobzw. Heterodimere. Abb.7: TLR-Signaltransduktionsweg [90] Das zentrale Adaptorprotein der meisten TLR ist der „myeloid differentiation factor“ (MyD88). Dieses lösliche Adaptorprotein besitzt ebenfalls eine TIR Domäne, die mit der intrazellulären TIR Domäne des TLR assoziiert. Während TLR5, TLR7 und TLR9 alleine über MyD88 reguliert werden (Abb.7), wurden für die anderen TLR weitere Adaptormoleküle identifiziert. Hierbei handelt es sich zum einem um das „TIR Domänen enthaltende Adaptorprotein / MyD88-adaptorlike“ (TIRAP/Mal), welches bei der TLR2 und TLR4 MyD88-abhängigen Signaltransduktion eine entscheidende Rolle spielt (Abb.7). Nach Rekrutierung 15 -Einleitung- von MyD88 bzw. TIRAP/Mal kommt es durch mehrere Proteinkinasekaskaden zur Phosphorylierung von IκB-α, wodurch sich dieser Inhibitor von NF-κB löst und die Translokation in den Zellkern ermöglicht (Abb.7) Die Aktivierung von DZ über MyD88-abhängige Signaltransduktionswege führt zu einer verstärkten Expression von MHC-II, kostimulatorischen Molekülen und zur Sekretion von inflammatorischen Zytokinen [91]. Als ein weiteres TIR Domänen enthaltendes Adaptormolekül wurde „TIR domain-containing adaptor inducing IFNβ/TIR domain-containing adaptor molecule“ (TRIF/TICAM1) identifiziert (Abb.7). TRIF/TICAM1 ist ein wesentliches Signalmolekül für die über TLR3 und TLR4 vermittelten MyD88-unabhängigen Transduktionswege. Die Aktivierung dieser Signalkaskade führt zur Phosphorylierung von IRF-3 und somit zur IFNβ Produktion (Abb.7) [92, 93]. Die diversen Signaltransduktionswege der einzelnen TLR führen somit zur unterschiedlichen Genexpression, wodurch es zur Induktion verschiedener biologischer Reaktionen kommt. Kürzlich wurden neben MyD88, TIRAP und TRIF noch zwei weitere TIR Domänen-enthaltende Adaptorproteine beschrieben. Es handelt sich hierbei um TIRP und SARM, doch bei beiden ist die funktionelle Rolle in der TLRvermittelten Signaltransduktion noch unklar [93-95] 1.3.3 Expression auf DZ Um eine bessere Spezialisierung zu gewährleisten, weisen Gewebszellen oder immunkompetente Zellen eine unterschiedliche Expression an TLR auf [63]. Es konnte gezeigt werden, dass myeloide DZ, welche aus humanem Blut generiert wurden, neben anderen TLR eine hohe Expression an TLR4 aufweisen, jedoch keine TLR9 Expression [96, 97]. Ob humanen myeloiden DZ TLR7 exprimieren wird noch kontrovers diskutiert [96, 98]. Im Gegensatz dazu, exprimieren plasmazytoide DZ fast ausschließlich TLR7 und TLR9 [96]. Auch zwischen humanen und murinen DZ bestehen Unterschiede. So weisen plasmazytoide DZ, welche aus der murinen Milz gewonnen wurden, neben TLR7 und TLR9 16 -Einleitung- auch eine geringe Expression an TLR4 auf. Murine myeloide DZ hingegen exprimieren alle TLR, mit Ausnahme TLR8 [62, 81]. Interessanterweise exprimieren murine KM-DZ das gesamte Repertoire an TLR [99-101]. Aus diesem Grund waren sie ein geeignetes Hilfsmittel für die hier durchgeführten Experimente. 1.3.4 Kooperation und gegenseitige Inhibition verschiedener TLR Aufgrund der Tatsachen, dass es ein weites Spektrum an TLR-Liganden gibt, aber nur eine begrenzte Anzahl an TLR, können einige Rezeptoren miteinander kooperieren, wodurch ihre Spezifität erweitert wird. Es wurde bereits erwähnt, dass TLR2 Heterodimere mit TLR1 oder TLR6 bildet [102]. Erst nach Bildung funktioneller Paare der zytoplasmatischen Domänen von TLR2 und TLR6 kann eine Aktivierung durch Zymosan erfolgen [71]. Im Gegensatz dazu können TLR7 und TLR8 unabhängig auf das Imidazoquinolin R-848 reagieren, was auf eine mögliche Redundanz zwischen diesen beiden Rezeptoren schließen lässt [82]. Sowohl für DZ als auch für Makrophagen ist ein Effekt beschrieben worden, welcher als „LPS-Toleranz“ bezeichnet wurde. Dies bedeutet, dass die Zellen nach einer LPS-Vorbehandlung nicht mehr auf weitere LPS-Stimulationen reagieren können [75, 103]. Nomura und seine Mitarbeiter haben gefunden, dass dieser Effekt auf einen Rückgang der Oberflächenexpression von TLR4 zurückzuführen ist [104]. Zusätzlich wurde für die murine Makrophagenzelllinie RAW264.7 beschrieben, dass durch CpG-Vorbehandlung der Zellen teilweise die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung inhibiert werden konnte [105]. 17 -Einleitung- 1.4 Mastzellen (MZ) 1.4.1 Herkunft, Lokalisation und Funktion Mastzellen (MZ) stammen ebenso wie die anderen Zellen des Immunsystems von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark ab. Ihre weitere Entwicklung erfolgt über myeloide Vorläuferzellen im Blut. Von dort aus wandern sie in das Gewebe ein, wo sie unter dem Einfluss von Wachstumsfaktoren reifen und sehr lange, wahrscheinlich mehrere Monate überleben [106-108]. Entdeckt wurden diese Bindegewebszellen bereits 1878 von Paul Ehrlich [109]. Morphologisch kann man die MZ als relativ große (15-25µm), runde, glatt begrenze Zellen charakterisieren, die über den ganzen Körper verteilt vorkommen. Vorwiegend sind sie in hohen Konzentrationen in der Nähe von Blutgefäßen und Nerven im Bindegewebe und in den Schleimhäuten lokalisiert. Zusätzlich weisen sie eine Vielzahl an Vesikeln in ihrem Zytoplasma auf, in denen unterschiedliche Mediatoren gespeichert sind (Abb.8). Zu diesen zählen unter anderem Amine (Histamin, Serotonin), Glykosaminoglykane (Heparin, Chondroitinsulfat) oder Arachidonsäuren (Prostaglandine, Leukotriene). Des Weiteren sind in diesen Vesikeln Interleukine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-8), TNFα, sowie Chemokine gespeichert, welche unter anderem zur Anlockung von Phagozyten führen [110]. Die Ausschüttung dieser verschiedenen Mastzellmediatoren führt zu einer unmittelbaren lokalen oder systemischen Überempfindlichkeitsreaktion. Aus diesem Grund spielen MZ eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen vom Soforttyp (Typ I). Letztere gehören zu den Th2-Immunantworten. Aktivierung und die daraus resultierende Degranulierung können beispielsweise über IgE-Kreuzvernetzung erfolgen (Abb.8B). MZ exprimieren auf ihrer Oberfläche unter anderem hochaffine Fcε-Rezeptoren vom Typ I (FcεRI). Nach Erstkontakt mit dem jeweiligen Antigen kommt es zur Bildung spezifischer Immunglobulin E (IgE) Antikörper durch Plasmazellen. Diese binden mittels ihres Fc-Teils an die FcεRI der MZ. Bei Zweitkontakt mit dem jeweiligen Antigen bindet es an die 18 -Einleitung- gebundenen IgE-Monomere, wodurch es zur MZ-Aktivierung kommt. Wichtig ist allerdings, dass dieses Antigen an mindestens zwei IgE-Monomere gleichzeitig bindet, wodurch auch die Bezeichnung „IgE-Kreuzvernetzung“ herrührt (Abb.8B). Induziert durch die Aktivierung verschmelzen die intrazellulären Vesikel zum Teil innerhalb von Sekundenbruchteilen mit der Zellmembran und setzten somit ihre Inhaltsstoffe frei (Abb.8A). Vor allem durch Mastzellmediatoren wie Histamin, welches zur Gefäßerweiterung führt oder Heparin, das die Blutgerinnung hemmt, kommt es zur Induktion typischer Allergiesymptome. Wenn die Ausschüttung von Mediatoren über einen längeren Zeitraum anhält, kommt es zur Rekrutierung und Einwanderung von Leukozyten und damit zu einer lokalen Entzündungsreaktion [111]. A) B) FcεRI I gE Antigen ruhende Mastzelle FcεRI I gE Antigen aktivierte Mastzelle Chemokine Histamin Se rotonin TNFα P GD 2 LTC 4 1. dunkel gefärbte V esikel 2. Zellker n 3. Nukl eolus IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 Heparin Chondroitinsulfat Abb.8: Mastzellaktivierung und -degranulation A) Elektronenmikroskopisches Bild einer Mastzelle. Am oberen rechten Rand beginnt sie zu degranulieren (von: http://www.unifr.ch) B) Mastzelldegranulation und Zytokinproduktion durch IgE-Kreuzvernetzung 19 -Einleitung- Hinsichtlich ihrer Lokalisation im Gewebe und den Inhalt ihrer Vesikel in vivo, werden MZ in Bindegewebsmastzellen mit hohem Histamingehalt und in Schleimhautmastzellen mit niedrigem Histamingehalt unterschieden. Die Generierung von Bindegewebsmastzellen in vitro erfolgt durch Kultivierung von murinem Knochenmark mit IL-3 und IL-4 [112]. Im Gegensatz dazu führt die Kultivierung von Knochenmarkszellen alleine mit IL-3 zur Differenzierung von Schleimhautmastzellen [113]. Allen MZ gemein ist, dass sie verstärkt c-kit (CD117) auf ihrer Oberfläche exprimieren. Hierbei handelt es sich um einen Tyrosinkinase-Rezeptor vom TypIII, welcher durch das Protoonkogen c-kit kodiert ist. Der Ligand für c-kit ist der Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF), welcher auch als „steel factor“ oder Mastzellwachstumsfaktor bezeichnet wird [114]. Außer von MZ wird dieser Rezeptor vorwiegend von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark und Melanozyten exprimiert [115, 116]. Die Rolle und Funktion von MZ im Immunsystem ist bis heute in vielen Bereichen noch ungeklärt. Bislang weiß man, dass sie durch Freisetzung einer großen Anzahl proinflammatorischer Mediatoren an einer Vielzahl chronischer und akuter entzündlicher Vorgänge beteiligt sind und aus diesem Grund bei der Th2-Immunantwort Allergie eine entscheidende Rolle spielen [117, 118]. Neuste Erkenntnisse zeigen allerdings, dass MZ das körpereigene Gift „Endothelin-1“ (ET-1), welches bei den meisten Entzündungsreaktionen im Körper produziert wird, wieder abbauen. Somit üben sie zusätzlich eine lebensrettende Funktion für den Organismus aus [119]. Weiterführende Untersuchungen müssen nun zeigen, ob MZ bzw. deren Derivate in Zukunft bei der Therapie von Infektionen oder anderen Entzündungserkrankungen eingesetzt werden können. 1.4.2 Einfluß von MZ und deren Mediatoren auf DZ MZ sind in verschiedenen Geweben lokalisiert, wo sie im engen Kontakt zu DZ stehen [120, 121]. Ebenso wie diese üben sie dort Wächterfunktionen aus und spielen somit eine entscheidende Rolle im Immunsystem [118, 122]. 20 -Einleitung- Bislang wurden verschiedene Auswirkungen einiger Mastzellmediatoren auf DZ beschrieben. So führt beispielsweise Histamin bei humanen DZ zu einer verringerten IL-12 Expression, wodurch es zu einer verstärkten Th2Polarisierung kommt [123, 124]. Kalinski und seine Mitarbeiter beschrieben denselben Effekt für das Prostaglandin PGE2 [125, 126]. Obwohl PGE2 von verschiedenen Zelltypen produziert wird, wie beispielsweise von Monozyten oder Makrophagen, ist noch nicht eindeutig geklärt, ob Mastzellen PGE2 sezernieren können [118, 127, 128]. Jedoch konnte für PGD2, ein Prostaglandin, welches verstärkt von Mastzellen synthetisiert wird, gezeigt werden, dass es ebenfalls die durch CD40-Ligand oder LPS induzierte IL-12 Produktion hemmt [129-131]. Zusätzlich wurde beschrieben, dass PGD2 im Gegensatz zu PGE2 die Migration der DZ in den Lymphknoten hemmt [129, 130]. Im Unterschied dazu fördert das Leukotrien C4 (LTC4) die Migration der DZ in den Lymphknoten [132]. Für Heparin konnte gezeigt werden, dass es ein Vielzahl an Zytokinen und Wachstumsfaktoren bindet und somit einen Einfluss auf die Reifung von DZ und der daraus resultierenden Th-Polarisierung ausübt [133-135]. 21 -Problemstellung- 2 2.1 Problemstellung Einfluss verschiedener TLR-Agonisten auf Dendritische Zellen und die daraus resultierende Polarisierung von Th1-Zellen Vor Beginn dieser Arbeit war bereits bekannt, dass TLR eine entscheidende Rolle in der Aktivierung von DZ spielen. Induziert durch die Reifung der DZ mittels verschiedener TLR-Agonisten kommt es zur verstärkten Expression von Oberflächenmarker wie MHC-II und kostimulatorischen Molekülen, sowie zur Zunahme der Produktion proinflammatorischer Zytokine [60-63]. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass einige TLR die Fähigkeit besitzen, miteinander zu kooperieren. Mittels dieser Eigenschaft ist es den Zellen des Immunsystems möglich, auf das breite Spektrum vorkommender Pathogene gezielt zu reagieren und eine spezifische Immunantwort zu induzieren [71, 102, 105]. Haut: Lymphknoten: I L-2, IFNγ, TNFα Th1 Antigen I L-12 Dendritische Zelle I L-12 MH C-II TLR T ZR naive T-Zelle TLR B7- 1 B7- 2 TLR C D28 I L-4 Th2 I L-4, IL-5, I L-6, IL-10, I L-13 Abb.9: Einfluss verschiedener TLR Antagonisten auf Dendritische Zellen und deren Auswirkung auf die Polarisierung von Th1-Zellen 22 -Problemstellung- Da bisher derartige kooperative Effekte vorwiegend für Makrophagen beschrieben wurden, sollte anhand dieser Arbeit untersucht werden, ob nicht auch einige TLR der DZ miteinander kooperieren, wodurch die Zellen immunogener werden und somit möglicherweise eine Zunahme der Th1Immunantwort induziert wird (Abb.9). 2.2 Einfluss von Mastzellen und deren Mediatoren auf Dendritische Zellen und die daraus resultierende Polarisierung von Th2-Zellen Sowohl DZ als auch MZ sind in engem Kontakt in der Haut lokalisiert [120, 121]. Beide Zelltypen besitzen eine Vielzahl an Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, wodurch sie gezielt auf eindringende Pathogene reagieren und dadurch eine spezifische Immunantwort induzieren können [122, 136-138]. Haut: Lymphknoten: Fc εRI I L-2, IFNγ, TNFα Antigen Th1 ruhende Mastzelle I L-12 Dendritische Zelle Fc εRI MH C-II aktivierte Mastzelle T ZR IL-4 naive T-Zelle B7- 1 B7- 2 Histamin Se rotonin C D28 I L-4 P GD 2 LTC 4 Heparin Chondroitinsulfat Th2 I L-4, IL-5, I L-6, IL-10, I L-13 Abb.10:Einfluss von Mastzellen und deren Mediatoren auf Dendritische Zellen und deren Auswirkung auf die Polarisierung von Th2-Zellen 23 -Problemstellung- MZ spielen vor allem bei der Auslösung von Allergien eine entscheidende Rolle [117, 118]. Aus diesem Grund wurden sie bisher fast ausschließlich mit Th2Immunantwort assoziiert. Zusätzlich war im Vorfeld dieser Arbeit bekannt, dass der Mastzellmediator Histamin zu einer verringerten IL-12 Produktion von humanen DZ führt [123, 124]. Aus diesem Grund sollte in dem zweiten Teil dieser Arbeit untersucht werden, inwieweit MZ oder deren Mediatoren murine KM-DZ beeinflussen und ob diese Stimulation der DZ zu einer Zunahme der Th2-Polarisierung führt (Abb.10). 24 -Material und Methoden- 3 Material und Methoden Sämtliche Chemikalien und Reagenzien wurden von den aufgeführten Firmen bezogen. Dabei entsprachen alle Chemikalien mindestens dem Reinheitsgrad „reinst“. Es wurde stets Reinstwasser aus einer Deionisationsanlage Milli-Q Plus PF (Millipore, Eschborn) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2MΩ/cm3 für die Herstellung aller Lösungen, Puffer und Verdünnungen verwendet. 3.1 Standardlösungen, Puffer und Medien Carbonatpuffer (pH9,5) 8,4g NaHCO3 (Merck, Darmstadt) 3,56g Na2CO3 (Merck, Darmstadt) → auf 1000ml mit H2O auffüllen → Einstellen des pH-Wertes auf 9,5 Einfriermedium (für 50ml): 45ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FKS) (PAA Laboratories, Parsching, Österreich) 5ml DMSO (Sigma, Deisenhofen) ELISA-Waschpuffer: 100ml 10x PBS 1ml (0,05%) Tween-20 (Sigma, Deisenhofen) 900ml H2O FACS-Puffer (für 1000ml): 100ml 10x PBS 50ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes FKS 10ml 10% Natriumazid (Merck, Darmstadt) 840ml H2O 25 -Material und Methoden- 2% ige Formaldehydlösung 5,4ml 37% Formaldehyd (Roth, Karlsruhe) 96,6ml 1x PBS HL-1-Medium (komplett): 500ml HL-1-Medium (BioWhittaker, Verviers, Belgien) 100U/ml Penicillin (Sigma, Deisenhofen) 100µg/ml Streptomycin (Sigma, Deisenhofen) 2mM L-Glutamin (Sigma, Deisenhofen) 50µM 2-Mercaptoethanol (Sigma, Deisenhofen) 10x PBS: 1,37M NaCl (Merck, Darmstadt) 27mM KCl (Roth, Karlsruhe) 43mM Na2HPO4 (Sigma, Deisenhofen) 14mM KH2PO4 (Sigma, Deisenhofen) → Einstellen des pH-Wertes auf 7,4 Natrium-Phosphatpuffer (pH6,5) 11,8g Na2HPO4 16,1g NaH2PO4 (Merck, Darmstadt) → auf 1000ml mit H2O auffüllen → Einstellen des pH-Wertes auf 6,5 Zellkulturmedium (R10-Medium): 500ml RPMI1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgien) 50ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes FKS 100U/ml Penicillin 100µg/ml Streptomycin 2mM L-Glutamin 50µM 2-Mercaptoethanol 26 -Material und Methoden- 3.2 Spezielle Reagenzien 3.2.1 Stimulantien und Zytokine Stimulantien eingesetzte Konzentration Bezugsquelle IL-3 100U/ml PeproTech IL-4 100U/ml PeproTech TNFα 500U/ml PeproTech IFNα 100U/ml NatuTech LPS (E.coli 0127:B8) 1µg/ml Sigma IgE 1µg/ml Sigma HSA-DNP 100ng/ml Sigma Tab.1: DZ und MZ Stimulantien (PeproTech/TEBU, Cölbe; NatuTech, Frankfurt; Sigma, Deisenhofen) Stimulantien eingesetzte Konzentration Bezugsquelle Chondroitinsulfat 1-100µg/ml Sigma Heparin (Liquemin® N5000) 1-1000U/ml Roche Histamin 0,01-250µg/ml Sigma LTC4 0,05-2,5µg/ml Sigma PGD2 0,05-10µM Sigma, Calbiochem PGE2 0,05-10µM Sigma Serotonin 1-250µg/ml Sigma Tab.2: Mastzellmediatoren (Sigma, Deisenhofen; Roche, Grenzach-Wyhlen; Calbiochem/Merck, Darmstadt) 27 -Material und Methoden- TLR Antagonist TLR eingesetzte Konzentration Bezugsquelle OspA TLR2 10µg/ml Smith-Kline Beecham Poly I:C TLR3 50µg/ml Pharmacia E.coli 0127:B8 LPS TLR4 1µg/ml Sigma E.coli 011:B4 LPS TLR4 1µg/ml Sigma E.coli 066:B6 TLR4 1µg/ml Sigma S.abortus LPS TLR4 1µg/ml Sigma S.typhimurium LPS TLR4 1µg/ml Sigma P.aeruginosa LPS TLR4 1µg/ml Sigma K.pneumoniae LPS TLR4 1µg/ml Sigma Zymosan TLR2/6 100µg/ml Sigma Imiquimod TLR7 10µg/ml 3M Pharmaceuticals CpG 1668 TLR9 5nmol/ml MWG, TIB Molbiol CpG 1668 FITC TLR9 1µM = 1nmol/ml IBA Tab.3: TLR-Agonisten (Smith-Kline Beecham, Herrenberg; Pharmacia, Karlsruhe; Sigma, Deisenhofen, 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, USA; MWG, Ebersberg, TIB Molbiol, Berlin; IBA, Göttingen) 3.2.2 Oligonukleotide ODN Sequenzen Bezugsquelle CpG1668 TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT MWG, TIB Molbiol GpC1668 TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT MWG, TIB Molbiol GpC1720 TCC ATG AGC TTC CTG ATC CT MWG, TIB Molbiol Tab.4: Oligodinukleotide (ODN) [139-141] (MWG, Ebersberg; TIB Molbiol, Berlin) 28 -Material und Methoden- 3.2.3 Antigene Antigen eingesetzte Konzentration Bezugsquelle OVA 1mg/ml Sigma KLH 50µg/ml Calbiochem Tab.5: Antigene für peptidspezifische Immunisierung (Sigma, Deisenhofen; Calbiochem/Merck, Darmstadt) 3.3 Antikörper Antigen Klon Konjugat Isotyp Konzentration Bezugsquelle CD4 RM4-5 FITC rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen CD11c HL-3 FITC ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD80 (B7-1) 16-10A1 FITC ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD86 (B7-2) GL-1 FITC rat IgG2b 1:100 BD Pharmingen MHC-II M5-114 PE rat IgG2b 1:250 BD Pharmingen CD23 (FcεRI) B3B4 FITC rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen CD117 (c-kit) 2B8 PE rat IgG2b 1:300 BD Pharmingen TLR4 MTS510 Bio rat IgG2a 1:100 Bioscience Tab.6: Antikörper gegen murine Zelloberflächenantigene (FITC = Fluoreszein-Isothiocyanat, PE = Phycoerythrin, BIO = Biotin) (BD Pharmingen, Heidelberg; Bioscience, San Diego, CA, USA) Antigen Steptavidin Klon - Konjugat Tricolor Isotyp - Tab.7: Sekundärantikörper (CALTAG, Hamburg) 29 Konzentration 1:100 Bezugsquelle CALTAG -Material und Methoden- Antigen Klon Konjugat Isotyp Konzentration Bezugsquelle IL-4 11B11 PE rat IgG1 1:40 BD Pharmingen IL-12p40 C15.6 PE rat IgG1 1:40 BD Pharmingen IFNγ XMG1.2 PE rat IgG1 1:40 BD Pharmingen TNFα MP6-XT22 PE rat IgG1 1:40 BD Pharmingen Tab.8: Antikörper für intrazelluläre Färbung (BD Pharmingen, Heidelberg) Isotyp Klon Konjugat Konzentration Bezugsquelle rat IgG1 R3-34 PE 1:100 BD Pharmingen rat IgG2b A95-1 PE 1:100 BD Pharmingen ham IgG C235-2356 PE 1:100 BD Pharmingen rat IgG2a R35-95 FITC 1:100 BD Pharmingen rat IgG2b A95-1 FITC 1:100 BD Pharmingen ham IgG C235-2356 FITC 1:100 BD Pharmingen rat IgG2a R35-95 Bio 1:100 BD Pharmingen Tab.9: Isotypkontroll-Antikörper (BD Pharmingen, Heidelberg) Antigen Konjugat Konzentration Annexin V FITC 1:40 Bender MedSystems Propidiumjodid PE 1:20 Bender MedSystems Tab.10: Apoptose-Färbung (Benders MedSystems, Wien, Österreich) 30 Bezugsquelle -Material und Methoden- 3.4 Verwendete Mausstämme Die für die Experimente benötigten C57Bl/6 und Balb/c Mäuse wurden entweder von Charles River (Sulzfeld) bezogen oder aus eigener Zucht verwendet. Vorwiegend wurden für diese Versuche weibliche Tiere im Alter von 6-12 Wochen eingesetzt. MyD88 Wildtyp (MyD88+/+) und MyD88 defiziente (MyD88-/-) Mäuse wurden uns freundlicher Weise von Prof. Dr. Dr. A. Gessner (Erlangen) zur Verfügung gestellt und basieren auf den genetischen Hintergrund von C3H/HeN Mäusen. Ursprünglich wurden sie von Dr. S. Akira (Osaka, Japan) generiert [142]. In den beschriebenen Experimenten wurden vorwiegend 6-12 Wochen alte Männchen verwendet. MyD88/TLR4 wt (MyD88/TLR4+/+) und MyD88/TLR4 defiziente (MyD88-/-) Mäuse wurden ebenfalls von Prof. Dr. Dr. A. Gessner zur Verfügung gestellt und basieren auf den genetischen Hintergrund von C3H/HeJ Mäusen. Auch für diese Experimente wurden vorwiegend Männchen im Alter von 6-12 Wochen verwendet. Genehmigung der Tierversuche: Die zum Zwecke immunologischer Untersuchungen am Tier vorgenommenen Immunisierungen und Organentnahmen wurden bei der Gesundheitsbehörde der Stadt Erlangen entsprechend dem Tierschutzgesetz angezeigt. Die Durchführung der genehmigungspflichtigen Versuche Mittelfranken bewilligt. 31 wurde vom Regierungspräsidium -Material und Methoden- 3.5 Zellkulturmethoden 3.5.1 Allgemeine Arbeitstechniken mit Zellen 3.5.1.1 Handhabung der Zellen Sämtliche Arbeiten mit Zellkulturen wurden stets unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die verwendeten Zellen wurden unter Normalbedingungen, d.h. bei 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre und 37°C kultiviert. Die Aufbewahrung lebender Zellen während der Versuchsdurchführung erfolgte immer bei 4°C auf Eis. Die Zentrifugationsschritte wurden ebenfalls immer bei 4°C für 5min bei 1200rpm durchgeführt. (Megafuge 2.0R, Heraeus, Hanau) 3.5.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen Zum Einfrieren der Zellen wurden diese auf eine Dichte von etwa 1,5x107 Zellen/ml eingestellt und in eiskaltem Einfriermedium aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen langsam auf -80°C abgekühlt und nach etwa 24h in flüssigem Stickstoff transferiert. Zum Auftauen der Zellen wurden diese in einem auf 37°C vorgewärmtem Wasserbad zügig angetaut und rasch in ein ebenfalls auf 37°C warmes Kulturmedium überführt. Um das DMSO zu entfernen, wurden die Zellen abzentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen zur Regeneration über Nacht in den Brutschrank gestellt. 3.5.1.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung Um die genaue Zellzahl zu bestimmen, wurden 25µl der Zellsuspension mit 25µl Trypanblaulösung vermengt und mit Hilfe einer Neubauerzählkammer unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Der Farbstoff durchdringt die durchlässig gewordene 32 -Material und Methoden- Membran sterbender und toter Zellen, wodurch diese sich selektiv blau anfärben und somit bei der Zählung außer Acht gelassen werden können. Zellzahl x 2 x 104 = Zellen/ml 3.5.1.4 Gewinnung von murinem GM-CSF Kulturüberstand Um GM-CSF angereicherten Kulturüberstand zu erhalten, wurde eine mit dem GMCSF Gen transfizierte Plasmozytom-X63-Ag8-Zelllinie verwendet. Diese wurde freundlicher Weise von Prof. Dr. D. Gray und Prof. Dr. B. Stockinger (London, Großbritannien) zur Verfügung gestellt [143]. Nach Auftauen der Zellen wurden diese in 20ml R10-Medium für ca. 2-4 Tage in Zellkulturschalen kultiviert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, in ca. 100ml frischem R10-Medium aufgenommen und auf Zellkulturflaschen verteilt. Nach etwa 3-4 Tagen, wenn das Medium aufgrund des pH-Wertes einen orange-gelben Farbton angenommen hatte, wurden 80ml der Zellsuspension bei 3000rpm und 4°C für 15min abzentrifugiert und der Überstand in sterile Gefäße überführt. Die restlichen 20ml der Zellsuspension wurden wieder auf 100ml mit frischem R10-Medium eingestellt und für weitere 3-4 Tage kultiviert. Die weitere Durchführung erfolgte wie zuvor beschrieben. Insgesamt wurde diese Prozedur etwa 3-4-mal wiederholt. Vor Verwendung zur Generierung von Knochenmarks DZ wurde der GM-CSF Kulturüberstand sterilfiltriert. Die Zellen wurden entsprechend den Vorschriften der Gentechnik-Verordnung (GVO) entsorgt. Zehn Prozent von diesem GM-CSF Kulturüberstand induzieren optimales Wachstum der DZ. 33 -Material und Methoden- 3.5.2 Spezielle Arbeitstechniken mit Zellen 3.5.2.1 Knochenmarkspräparation Nachdem die Mäuse durch Begasung mit CO2 getötet wurden, wurden Femur (Oberschenkel) und Tibia (Unterschenkel) der Hinterläufe unter sterilen Bedingungen freipräpariert und entnommen. Am Knochen anliegendes Gewebe wurde mittels Papiertüchern unsteril entfernt. Im Anschluss wurden die gesäuberten Knochen mit 70% Ethanol in einer Zellkulturschale desinfiziert, um eine anschließende Kontamination der Knochenmarkskultur durch vereinzelte, noch außen am Knochen anhaftende Gewebszellen zu vermeiden. Nach einer Desinfektionszeit von ca. 2min wurden die Knochen aus der Flüssigkeit entnommen und der restliche Alkohol an der Luft verdampft. Anschließend wurden die Knochen an beiden Enden mit einer sterilen Schere geöffnet. Das Knochenmark wurde mit PBS unter der Verwendung einer Kanüle (0,4 x 19mm Nr.20, BD Pharmingen, Heidelberg) aus dem Knochen gespült. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in R-10 Medium aufgenommen und gezählt. Die Zellausbeute lag bei etwa 4-6 x 107 Knochenmarkszellen pro Maus, wobei Erythrozyten nicht mitgezählt wurden. 3.5.2.2 Generierung dendritischer Zellen (DZ) Die Gewinnung von DZ aus murinem Knochenmark wurde erstmals von Inaba und Mitarbeitern beschrieben [18]. Die praktische Durchführung erfolgte nach der von Lutz und Mitarbeitern modifizierten Methode [20]. Die isolierten Knochenmarkszellen wurden in einer Dichte von 2x106 Zellen pro Zellkulturschale (Nr. 351005, Falcon, Heidelberg) ausgesät und in einem Volumen von 10ml R10 Medium aufgenommen. Um aus den Knochenmarksvorläuferzellen DZ zu generieren, wurde das Kulturmedium zusätzlich mit 10% GM-CMF Kulturüberstand versetzt. Am dritten Tag wurden weitere 10ml R10-Medium, welches 10% GM-CSF Kulturüberstand enthielt, zugegeben. Am Tag sechs und 34 -Material und Methoden- acht wurden jeweils 10ml der Zellsuspension abgenommen und abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in frischem 10ml R10-Medium plus 10% GM-CSF Kulturüberstand resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen wieder in die ursprüngliche Zellkulturschale überführt. Die DZ wurden je nach Experiment am Tag 8 oder 9 verwendet. Mittels dieser Methode konnte eine Reinheit der DZ von 50-90% (niedrige MHC-II Expression: 40-60%, hohe MHC-II Expression: 10-30%) erzielt werden. Bei den restlichen Zellen dieser Mischpopulation handelte es sich vorwiegend um adhärente Makrophagen, Zellen mit einer negativen MHC-II Expression und Granulozyten (ca. 10%), B-Zellen (5-8%) und T-Zellen (ca.1%). 3.5.2.3 In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen mittels PGD2stimulierten DZ Die Immunisierung der Mäuse erfolgte mit DZ, welche für neun Tage generiert worden sind. Je nach Stimulationsdauer wurden die Zellen zuvor geerntet und in einer Dichte von 3x106 Zellen in 6-Loch Platten (Nr. 351146, Falcon, Heidelberg) ausgesät. Das Endvolumen betrug 6ml plus 10% GM-CSF. Für die Durchführung der verschiedenen Experimente wurden die in Abb.11 beschriebenen Protokolle verwendet. Nach der Stimulation wurden die DZ zweimal mit PBS (BioWhittaker, Velviers, Belgien) gewaschen und anschließend auf eine Dichte von 2x105Zellen pro 50µl PBS eingestellt. Als Kontrolle dienten PGD2-unstimulierte DZ. Für jeden Versuchsansatz wurden jeweils drei Mäuse verwendet. Die Injektion der DZ erfolgte subkutan in die Fußsohlen der beiden Hinterläufe, wobei in jede Fußsohle 50µl der Zellsuspension injiziert wurden. 35 -Material und Methoden- A) C) B) DZ DZ DZ PGD2 PGD2 + OVA V 2h PGD2 + KLH 2h 15h PGD2 + KLH KLH 1h LPS 2h TNFα 1h 2h TNFα 2h C57/Bl6 Balb/c Balb/c Abb.11:In vivo Aktivierung und Polarisierung durch PGD2-stimulierte DZ 3.5.2.4 Generierung von Mastzellen (MZ) Mastzellen wurden ebenfalls aus dem Knochenmark von Mäusen generiert [144]. Im Unterschied zu der Generation von DZ, wurden hier 4x106 Zellen pro Zellkulturschale (Nr. 351005, Falcon, Heidelberg) ausgesät und in 10ml R10Medium aufgenommen. Um aus den Knochenmarksvorläuferzellen Mastzellen zu generieren, wurde das Medium zuvor mit 100U/ml rekombinanten IL-3 (PeproTech, Cölbe) versetzt. Am Tag 3 wurden weitere 10ml R10-Medium plus IL-3 den Zellen zugegeben. Für die folgenden zwei Wochen wurden alle 2-3 Tage 10ml der Knochenmarkskultur abgenommen, abzentrifugiert, in 10ml R-10 Medium plus IL-3 resuspendiert und wieder in die Zellkulturschale überführt. Um am Ende eine möglichst reine Mastzellpopulation zu erhalten, wurde nach ca. 2 Wochen die gesamte Zellsuspension vorsichtig abgenommen. Wichtig hierbei war es, dass adhärente Zellen möglichst nicht mit abgespült wurden. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert und in 10ml R10-Medium plus IL-3 aufgenommen. 36 -Material und Methoden- Zwei Tage später wurde das Volumen durch Zugabe von 10ml R10-Medium plus IL-3 wieder auf 20ml eingestellt. Wiederum drei Tage später wurde die gesamte Zellsuspension erneut vorsichtig abgenommen, abzentrifugiert und 10ml R10Medium plus IL-3 für zwei Tage kultiviert. Die weitere Handhabung erfolgte nach dem zuvor beschriebenen Prinzip. Nachdem die Zellen 4-5 Wochen kultiviert und mehrmals passagiert wurden, erhielt man eine fast 100% reine Mastzellkultur. 3.5.2.5 In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch Mastzell- bzw. Mastzellüberstand-stimulierten DZ Die Immunisierung der Mäuse erfolgte auch hier mit DZ, welche für neun Tage generiert worden sind. Wie bereits beschrieben (siehe 3.6.2.3) wurden die Zellen je nach Stimulationsdauer zuvor geerntet. Für die Stimulation mit dem Mastzellüberstand (Abb.12A) wurden die DZ in einer Dichte von 1,5x106 Zellen/ml in eine 24-Loch Transwell-Platte (3413, Costar/Corning, NY, USA) ausgesät. Das Endvolumen betrug 1ml plus 10% GM-CSF. Die für 4-5 Wochen kultivierten MZ wurden auf eine Dichte von 1x107 Zellen/ml eingestellt, in eine 24-Loch Platte (Nr. 351147, Falcon, Heidelberg) ausgesät und für 4h mit 1µg/ml anti-IgE (Sigma, Deisenhofen), 100ng/ml HSA-DNP (Sigma, Deisenhofen) und 100U/ml IL-3 (PeproTech, Cölbe) aktiviert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen resuspendiert und jeweils 2x106 Zellen in jeden Transwelleinsatz pipettiert. Es folgte eine Inkubationszeit von 16h. Anschließend wurden die Transwelleinsätze entfernt und die DZ durch Zugabe von 50µg/ml KLH und 500U/ml TNFα für 4h aktiviert. Für den zweiten Versuchsansatz (Abb.12B) wurden die MZ in einer Dichte von 3,5x106 Zellen/ml in eine 6-Loch Platte (Nr. 351146, Falcon, Heidelberg) ausgesät. Das Endvolumen betrug 5ml plus 10% GM-CSF. Nach einer 10 minütigen Aktivierung der Zellen wurden sie in unterschiedlichen Verhältnissen zu den DZ gegeben. Abschließend wurden die Zellen beider Versuchsansätze zweimal mit PBS gewaschen und auf eine Dichte von 2x105 DZ pro 50µl PBS eingestellt. Als 37 -Material und Methoden- Kontrolle wurden DZ nur mit KLH und TNFα behandelt. Pro Ansatz wurden drei Mäuse verwendet. Die Injektion der DZ erfolgte subkutan in die Fußsohlen der beiden Hinterläufe, wobei in jede Fußsohle 50µl der Zellsuspension injiziert wurden. A) DZ DZ B) IgE aktivierte MZ DZ Mastzellüberstand KLH / TNFα 16h 4h IgE aktivierte Mastzellen KLH / TNFα 4h Balb/c Balb/c Abb.12: In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch Mastzell- bzw. Mastzellüberstand-stimulierter DZ 3.5.2.6 Lymphknotenpräparation als Quelle für T-Zellen Nach Tötung der Mäuse durch CO2 Begasung wurden die Lymphknoten unter sterilen Bedingungen entnommen und in eiskaltem PBS aufbewahrt. Um die Lymphozyten zu isolieren, wurden die Lymphknoten mittels der rauen Seite zweier Objektträger zerrieben. Die Zellsuspension wurde anschließend durch mehrmaliges Pipettieren weiter zerkleinert und anschließend durch ein Zellsieb (∅ 70µm) gegeben, um größere Gewebeteile von den Lymphozyten zu trennen. Nach zwei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen in HL-1 Medium aufgenommen und gezählt. 38 -Material und Methoden- 3.5.2.7 Peptidspezifische Restimulation in vivo stimulierter Lymphknotenzellen Zwölf Tage nach der Immunisierung der Mäuse durch subkutane DZ-Injektion wurden die inguinalen und die poplitealen Lymphknoten entnommen. Wie bereits beschrieben (siehe 3.6.2.4) wurden die Lymphozyten isoliert und auf eine Dichte von 4x105 Zellen pro 100ml HL-1 Medium eingestellt. Als nächster Schritt erfolgte die Titration des spezifischen Antigens in einer 96Loch Flachbodenplatte (Nr. 353072, Falcon, Heidelberg). In der obersten Reihe wurde der doppelte Wert der höchsten Konzentration des Antigens verwendet und je nach Verdünnungsreihe auf 110µl bzw. auf 150µl HL-1 Medium eingestellt. In die unteren Reihen wurden jeweils 100µl HL-1 Medium vorgelegt. Im folgenden Schritt wurden 10µl bzw. 50µl aus der ersten Reihe entnommen und unter mehrmaligem Pipetieren gründlich durchmischt. Nach diesem Prinzip wurde die Verdünnungsreihe weiter bis zur niedrigsten Verdünnung fortgeführt. Als Kontrolle erfolgte die Kultivierung der Zellen ohne Antigen. Am Ende wurden jeweils 100µl der Zellsuspension in jede Vertiefung gegeben. Pro Versuchsansatz wurden zwei Platten mit jeweils Triplikaten angesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 72h wurden die Überstände von einer Platte abgenommen und im Verhältnis 1:1 mit R10-Medium verdünnt. Anschließend erfolgte die Analyse der Zytokinproduktion der restimulierten Lymphozyten mittels ELISA (siehe 3.6.2). Die zweite Platte wurde zur 3 Beurteilung des Proliferationsverhaltens der Zellen durch Zugabe von [ H]-markiertem Thymidin (Amersham, Feiburg) verwendet (siehe 3.6.1). 39 -Material und Methoden- 3.6 Immunologische Methoden 3.6.1 T-Zell-Proliferationstest durch [3H]-Thymidineinbau Die Proliferation der restimulierten Lymphozyten kann in vitro über den Einbau von radioaktiv markiertem [3H]-Thymidin in die DNA der sich teilenden Zellen gemessen werden. Nach der bereits erwähnten 72-stündigen Inkubationsdauer wurde jeweils 1µCi Methyl-[3H]-Thymidin pro Vertiefung zu der Zellsuspension gegeben, die Zellen für weitere 18h inkubiert und anschließend die Kulturen mit einem ICH-110 Erntegerät (Inotech, Dottikon, Schweiz) auf Glasfaserfilter übertragen. Nach dem Trocknen und Einbetten der Filter in Wachs, welches Szintillationsflüssigkeit enthielt, wurden sie unter Verwendung eines 1450 Mikroplattenzähler (Wallac, Turku, Finnland) eingemessen. Aus den jeweiligen Triplikaten wurden die Mittelwerte und die einfache Standardabweichung der Radioaktivitäten in „counts per minute“ (cpm) ermittelt, wodurch eine graphische Darstellung in Abhängigkeit zur eingesetzten Antigenkonzentration möglich war. 3.6.2 „Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay“ (ELISA) Für die Analyse der Zytokinkonzentration von Zellkulturüberständen wurden kommerziell erhältliche ELISA-Testsysteme (OptEIATM, BD Parmingen, Heidelberg) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Für jeden Zytokinnachweis wurde eine Referenzstandardreihe erstellt (Tab.11). Sowohl die Standards als auch die einzelnen Proben wurden als Duplikate angefertigt. Für die einzelnen Waschschritte wurde ein „ColumbusWasher“ (TECAN, Salzburg, Österreich) benutzt. 40 -Material und Methoden- Zytokine niedrigste Konzentration höchste Konzentration IL-4 31,2pg/ml 2000pg/ml IL-6 31,2pg/ml 2000 pg/ml IL-10 31,2pg/ml 2000 pg/ml IL-12p70 125pg/ml 8000pg/ml IL-12p40 31,2pg/ml 2000 pg/ml IFNγ 62,5pg/ml 4000pg/ml TNFα 31,2pg/ml 2000 pg/ml Tab.11: Referenzstandards Das Prinzip des ELISA beruht darauf, dass der Zellkulturüberstand in die Vertiefungen einer 96-Loch Platte (EIA/RIA, Nr.3690, Corning/Costar, NY, USA) gegeben wird, deren Boden zuvor mit einem für das jeweilige Zytokin spezifischen Antikörper („capture Ak“) überzogen worden ist. Ist das Zytokin im Überstand vorhanden, bindet es an diesen Antikörper. Als nächstes wurde das Zytokin mit einem spezifischen biotinylierten Sekundärantikörper markiert. An das Biotin wurde zusätzlich zur Signalverstärkung Streptavidin-gekoppelte „horse-raddish- peroxidase“ (HRP) gebunden. Durch Zugabe des HRP-Reaktionssubstrats kommt es durch enzymatischen Umbau zu einer Farbreaktion. Die Analyse erfolgte bei einer Wellenlänge von 450nm durch ein Photo-Spektrometer (Multiskan® Plus, Labsystems, Frankfurt). Durch Vergleich mit den Referenzstandards konnte die Zytokinkonzentration mittels linearer Regressionanalyse der Messung bestimmt werden. Aus den Duplikaten wurden die Mittelwerte und die einfache Standardabweichung ermittelt, wodurch eine graphische Darstellung möglich war. 3.6.3 Histamin-ELISA Die Analyse der Histamin-Freisetzung von Mastzellen wurde mit Hilfe eines kommerziell erworbenen Histamin-ELISA (IBL, Hamburg) durchgeführt. Auch hier erfolgte die Durchführung nach Angaben des Herstellers. Für jeden Versuchsansatz wurde parallel eine Referenzstandardreihe erstellt (Tab.12). Der Test basiert auf dem Prinzip der kompetitiven Bindung. Nach Acylierung der 41 -Material und Methoden- Proben wurden die Zellkulturüberstände mit einer definierten Menge enzymmarkiertem Antigen versetzt und in die Vertiefungen der mit Antikörper beschichteten Mikrotiterstreifen pipettiert. Während der Inkubation konkurrierte Histamin mit dem Antigen aus den Proben um die limitierten Bindungsstellen der Antikörper. Nach der Inkubationszeit wurde die Substratlösung hinzugegeben und die Farbentwicklung nach einer definierten Zeit gestoppt. Die Intensität der gebildeten Farbe ist umgekehrt proportional zur Histamin-Konzentration. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 450nm durch ein Photo-Spektrometer (Multiskan® Plus, Labsystems, Frankfurt) gemessen. Anschließend wurde die Histamin-Konzentration anhand der erstellten Referenzstandardkurve errechnet. Die graphische Darstellung erfolgte auch hier durch Ermittlung der Mittelwerte und der einfachen Standardabweichung. Standard A B C D E F ng/ml 0 2,7 8,1 24,3 73 219 Tab.12: Histamin-Referenzstandard 3.6.4 Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie (FACS) Mit Hilfe der „Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie“ ist es möglich, Zellen genauer zu charakterisieren und deren Zytokinexpression zu analysieren. Die „side scatter“ Achse (SSC) zeigt die Granularität der Zellen an und die „forward scatter“ Achse (FSC) die Zellgröße und Fluoreszenz von markierten Antikörpern. 3.6.4.1 Extrazelluläre FACS-Färbung Zur phänotypischen Charakterisierung der Zellen wurde die Methode der Durchflusszytometrie angewandt. Die Messung erfolgte mit Hilfe eines Durchflusszytometer (FACScanTM, BD Pharmingen, Heidelberg) unter Verwendung der Lysis IITM-Software und wurde mittels einer „CellQuestTM-Software“ (BD Pharmingen, Heidelberg) analysiert. Die Grundlage dieser Methode ist eine 42 -Material und Methoden- Antigen-Antikörper-Reaktion, die unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff markierter Antikörper durchgeführt wird. Je Färbung wurden zwischen 1x105 bis 5x105 Zellen eingesetzt. Diese wurden in einem Volumen von 50µl FACS-Puffer (siehe 3.2) mit den jeweiligen Antikörpern für 30min inkubiert. Um eine photochemische Inaktivierung der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden, wurde die Inkubation im Dunkeln und auf Eis durchgeführt. Die nicht direkt markierten monoklonalen Antikörper wurden in einem zweiten Schritt durch Fluoreszenzfarbstoff markierte Sekundärantikörper nachgewiesen (Inkubationsbedingungen wie bei Primärantikörpern). Pro Färbung erfolgte die Aufnahme 1x104 morphologisch intakter Zellen. Zur Kontrolle der Hintergrundsfärbung und Kompensation wurden parallel zu jedem Ansatz entsprechende Isotypenkontrollantikörper mitgeführt. Die Fixierung der Zellen erfolgte für 15min bei Raumtemperatur durch Verwendung einer 2%-igen Formaldehydlösung, welche im Verhältnis 1:1 mit FACS-Puffer eingesetzt wurde. 3.6.4.2 Intrazelluläre FACS-Färbung Die intrazelluläre Analyse der Zytokinexpression wurde unter Verwendung des „Cytofix/Cytoperm PlusTM (mit GolgiStopTM)“ von BD Pharmingen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Im Gegensatz zur extrazellulären FACS-Analyse, wurden hier pro Ansatz 1x106 Zellen verwendet. Die Messung erfolgte wie bereits im Punkt 3.6.4.1 beschrieben, außer dass hierfür 2x104 morphologisch intakte Zellen aufgenommen wurden. Durch die Zugabe von GolgiStopTM, welches Monensin enthält, wurden intrazelluläre Transportprozesse blockiert, wodurch es zu einer Anreicherung der exprimierten Zytokine im Golgikomplex kam (Inkubationszeit für DZ: 16h, Inkubationszeit für T-Zellen: 6h). Je nach Versuchsansatz wurde vor der intrazellulären Zytokinfärbung erst eine Oberflächenfärbung durchgeführt (siehe 3.6.4.1), um die zytokinproduzierenden Zellen genauer zu charakterisieren. Nach diesem Schritt wurden die Zellen fixiert und die Zellmembran permeabilisiert, um ein Eindringen der Antikörper zu ermöglichen. Die Inkubationszeit erfolgte im 43 -Material und Methoden- Dunkeln für 30-60min auf Eis. Abschließend wurden die Zellen mit einer 2%-igen Formaldehydlösung fixiert. 3.6.4.3 Apoptose-Färbung Apoptose, welche auch als programmierter Zelltod bezeichnet wird, ist im Unterschied zur Nekrose ein genetisch regulierter Vorgang und somit ein genau kontrolliertes Ereignis, bei dem die Zelle entfernt werden soll. Nachdem es zuerst zur Verklumpung des Chromatins und zu einem Zusammenschrumpfen der Zelle kommt, bilden sich im nächsten Schritt (nach etwa 4-6h) Ausstülpungen der Zellmembran („blebbing“). Durch dieses Umstülpen der Zellmembran gelangt Phosphatidylserin nach außen und kann somit mittels Annexin V, welches mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) konjugiert ist, detektiert werden. Für die Apoptose-Färbung wurde der „Annexin V/FITC Kit“ von Bender MedSystems (Wien, Österreich) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Um die apoptotischen Zellen von den nekrotischen zu unterscheiden, wurde gleichzeitig eine Propidium-Jodid-Färbung durchgeführt. Da im Gegensatz zu apoptotischen Zellen die Zellmembran bei nekrotischen Zellen durchlässig ist, kann Propidium-Jodid (PJ), welches mit Phycoerythrin (PE) konjugiert ist, in die Zelle eindringen und sich in die DNA einlagern. Die Messung erfolgte wie bereits beschrieben (siehe 3.6.4.1). 3.7 May-Grünwald-Giemsa-Färbung zur Validierung von DZ und MZ Um die Zellen morphologisch zu charakterisieren, wurden als erstes ZytospinPräparate von Tag 8 DZ und von für vier Wochen generierten MZ angefertigt. Hierfür wurden die Zellen auf eine Dichte von 1x105 Zellen/ml R-10 Medium eingestellt und davon 200µl auf die vorbereiteten Objektträger gegeben. Anschließend wurden die Zellen bei 500rpm für 3min abzentrifugiert (Cytospin 3, Shandon, Frankfurt) und für 2-3min an der Luft getrocknet. Die Färbung wurde mit einer Mischung aus basischen (May-Grünwald-Lösung) und sauren (Giemsa-Lösung) Farbstoffen 44 durchgeführt, um dadurch -Material und Methoden- komplementäre Substanzen, wie zum Beispiel saure Nukleinsäuren und basische Granulationen, besser darstellen zu können. Zuerst wurden die luftgetrockneten Zellen für 3min mit May-Grünwald-Lösung (Eosin-Methylenblau) überschichtet. Anschließend wurde das gleiche Volumen an destilliertem Wasser zugegeben und für weitere 3min inkubiert. Nach dieser Zeit wurde der verdünnte Farbstoff abgegossen und mit Wasser vorsichtig abgespült. In einem zweiten Färbeschritt wurden die Zellen mit Giemsa-Lösung (Azur-Eosin) für 15min beschichtet, welche zuvor im Verhältnis 1:1 mit Wasser verdünnt worden ist. Am Ende wurde der Farbstoff wieder vorsichtig mit Wasser abgespült und die Zellen an der Luft getrocknet. Die Analyse erfolgte mittels eines Lichtmikroskops bei 400- bzw. 1000facher Vergrößerung. 45 -Ergebnisse- Ergebnisse 4 4.1 Generierung und Charakterisierung von DZ aus murinem Knochenmark (KM-DZ) Die Generation der DZ erfolgte aus murinem Knochenmark (KM) nach der von Lutz und Mitarbeitern beschriebenen Methode [20]. Nach Generierung der Knochenmarkszellen für acht Tage mit GM-CSF wurden die Zellen für 16h mit LPS stimuliert (Abb. 13A) [145]. A) Knochenmark 8d GM-CSF DZ 16 h Aktivierung: LPS - LPS C) B) + LPS 30% 32% MHC-II CD11c 20% 69% B7 -2 400x 7% 65% CD40 Abb.13: Generierung und Charakterisierung von murinen KM-DZ (A) Nach Entnahme der Knochenmarkszellen wurden diese für 8d mit GM-CSF generiert. Die Aktivierung der Zellen erfolgte durch Zugabe von LPS für 16h. (B) Mittels Phasenkontrastaufnahmen von reifen DZ unter Verwendung eines Lichtmikroskops bei 400-facher Vergrößerung kann man sehr gut die Ausbildung langer dendritischer Fortsätze erkennen (übernommen von Dr. M. Lutz). (C) Zur phänotypischen Charakterisierung wurde eine Oberflächenfärbung für CD11c, B7-2 und CD40 gegen MHC-II durchgeführt. Anhand der Durchflusszytometriedaten kann man deutlich erkennen, dass nach achttägiger Generierung von KM-Zellen 30% doppelt positiv für MHC-II und CD11c sind. Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass die Aktivierung der DZ durch LPS zu einem Anstieg der MHC-II, B7-2 und CD40 Expression führte. 46 -Ergebnisse- Induziert durch die Aktivierung der DZ mittels LPS, kommt es zur Reifung der DZ und somit zur Ausbildung langer dendritischer Fortsätze, welche anhand von Phasenkontrastaufnahmen unter Verwendung eines Lichtmikroskops sehr gut erkennbar sind (Abb.13B). Die phänotypische Charakterisierung der Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Hierfür wurde eine FACS-Färbung für den typischen DZ-Oberflächenmarker CD11c, sowie den Reifungsmarkern B7-2 bzw. CD40 gegen MHC-II durchgeführt (Abb.13C). Die Analyse der Daten demonstrierte, dass unter Verwendung dieser Methode etwa 30% CD11c+ Zellen generiert wurden, welche zusätzlich positiv für MHC-II waren. Hervorgerufen durch die Aktivierung der Zellen konnte neben der Zunahme der MHC-II Expression ein Anstieg von B7-2 und CD40-Molekülen detektiert werden. Mittels dieser Daten konnte somit eindeutig demonstriert werden, dass die Generierung muriner KM-Vorläuferzellen zur Differenzierung von CD11c+ DZ führte, welche durch Zugabe von LPS aktiviert wurden. 4.2 Einfluss von TLR-Agonisten auf KM-DZ und wiederum deren Auswirkung auf die Polarisierung von Th1-Zellen 4.2.1 Reifung und IL-12p40 Produktion von DZ durch Zugabe verschiedener TLR-Agonisten Es wurde bereits beschrieben, dass die Aktivierung von DZ über TLR zur Reifung und Zytokinproduktion der Zellen führt [136, 146]. Aus diesem Grund wurde als erstes untersucht, inwieweit die oben beschriebenen KM-DZ über verschiedenen TLR stimuliert und aktiviert werden können. Die Isolierung des Knochenmarks erfolgte zum einem aus Wildtyp-Mäusen (MyD88+/+) oder Mäusen, denen das Adaptormolekül MyD88 aufgrund einer Genmanipulation fehlte (MyD88-/-). Nachdem die Knochenmarkszellen für acht Tage mit GM-CSF kultiviert wurden, erfolgte die Stimulation der Zellen mit den verschiedenen TLR- 47 -Ergebnisse- Stimuli LPS, Poly I:C, CpG, OspA und Imiquimod für 16h (Abb.14). Als Positivkontrolle wurde TNFα verwendet, da diese Stimulation über die beiden TNF-Rezeptoren erfolgt und somit unabhängig von MyD88 ist [147]. DZ, welche aus dem Knochenmark von MyD88+/+ Mäusen generiert wurden, konnten durch jedes dieser Stimulantien aktiviert werden, wie man an der deutlichen Hochregulation von MHC-II und kostimulatorischen Molekülen erkennen konnte (Abb.14A). Im Unterschied dazu erfolgte die Aktivierung von MyD88-/- DZ nur nach Stimulation von TNFα, LPS oder Poly I:C (Abb.14A). A) B) MyD88 MyD88+ /+ -/- TLR 2 OspA 9 CpG 3 Poly I:C 4 LPS CpG 10 I miquimod 59 Poly I:C 22 TNFα 27 Kontr olle LPS 8 57 OspA 55 B7-2 Kontr olle I miquimod B7-2 7 I miquimod 11 CpG 14 Poly I:C 24 LPS 24 OspA 6 Kontr olle 0 MyD88+/+ MyD88-/- 20 40 60 80 % reife DZ (MHC-II++, B7-2++) intr azelluläres IL-12p40 Abb.14: Induzierte Reifung und IL-12p40 Produktion von KM-DZ durch verschiedene TLRAgonisten in Abhängigkeit von MyD88 MyD88+/+ und MyD88-/- KM-DZ wurden nach Generierung für 8d mit TNFα als Kontrolle und verschiedenen TLR-Agonisten für 24h stimuliert. (A) Nach dieser Inkubationszeit wurde eine Oberflächenfärbung für MHC-II gegen B7-2 durchgeführt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Während MyD88+/+ DZ durch Zugabe aller Stimulantien aktiviert wurden, führte nur die Stimulation mit TNFα, LPS und Poly I:C zu einem Anstieg der Reifungsmarker bei MyD88-/DZ. (B) Die IL-12p40 Produktion wurde mittels einer intrazellulären FACS-Färbung fixierter Zellen gemessen. Wie zuvor, produzierten MyD88+/+ DZ IL-12p40 nach Aktivierung mit allen TLR-Agonisten, während MyD88-/- DZ nur nach Stimulation mit LPS und Poly I:C geringe Mengen an IL-12p40 exprimierten. 48 -Ergebnisse- Es ist beschrieben, dass TLR4, welcher spezifisch LPS erkennt, zusätzlich über MyD88-unabhängige Signaltransduktionswege aktiviert werden kann [148]. Auch für den intrazellulären TLR3 konnte erst kürzlich gezeigt werden, dass die Aktivierung mittels Poly I:C über einen MyD88-unabhängigen Signalweg erfolgt [90]. Parallel zu diesem Versuchsansatz wurden die DZ hinsichtlich ihrer IL12p40 Expression untersucht (Abb.14B). Anhand der Analyse der intrazellulären FACS-Färbung konnte demonstriert werden, dass MyD88+/+ DZ IL-12p40 nach Stimulation mit den verschiedenen TLR-Agonisten produzierten, während MyD88-/- DZ erneut nur auf LPS und Poly I:C reagierten. Zusammenfassend wurde mittels dieser Ergebnisse gezeigt, dass die generierten KM-DZ durch Zugabe verschiedener TLR-Stimulantien aktiviert wurden. Bei Abwesenheit von MyD88 erfolgte allerdings nur nach Stimulation von TLR4 und TLR3 eine Hochregulation der Reifungsmarker. Zusätzlich wurde im Gegensatz zu bisher publizierten Daten [142, 145, 146] demonstriert, dass LPS und Poly I:C auch in Abwesenheit von MyD88 zu einer geringen IL-12p40 Expression führen. 4.2.2 Intrazelluläre Lokalisation von CpG-FITC Kürzlich wurde gezeigt, dass TLR9 intrazellulär in endosomalen Kompartimenten lokalisiert ist [86]. Da Wagner und seine Mitarbeiter hierfür die Makrophagenzellinie RAW264.7 verwendeten, war es interessant zu untersuchen, wie es sich bei KM-DZ verhält. Aus diesem Grund wurden für das folgende Experiment C57Bl/6 DZ für 0h, 2h, 4h und 24h mit FITC konjugiertem CpG (CpG-FITC) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Zytospin auf Objektträger zentrifugiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert (Abb.15). Verglichen zu der Kontrollaufnahme bei 0h, konnte man bereits nach 2h eine vesikuläre Anreicherung von FITC markiertem CpG erkennen. Bei Betrachtung der Zellen, welche für 4h bzw. 24h mit CpG-FITC behandelt wurden sah man, dass es sich hierbei um klar begrenzte Bereiche handelte. 49 -Ergebnisse- Mittels dieses Experiments konnte somit gezeigt werden, dass bereits nach 2h CpG-DNA von KM-DZ aufgenommen wurde und sich vermutlich in intrazellulären Kompartimenten angereichert hat. 0h 2h 4h 24h CpG-FITC Stimulation Abb.15: Intrazelluläre Lokalisation von CpG-FITC C57Bl/6 KM-DZ wurden am d8 der Generierung mit FITC markiertem CpG für 0h, 2h, 4h und 24h stimuliert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mittels eines Fluoreszenzmikroskops bei 400facher Vergrößerung analysiert. Bereits nach 2h konnte CpG-FITC vesikulär nachgewiesen werden. Die CpG-Behandlung der Zellen für 4h bzw. 24h führte zu einer deutlichen Anreicherung des ODN in begrenzten Kompartimenten 4.2.3 Zeitabhängiger, synergistischer Effekt durch CpG-Vorstimulation auf LPSinduzierte IL-12p70 und IL-12p40 Produktion von KM-DZ Da einige TLR miteinander kooperieren und somit ihre Spezifität erweitern können, wurden als nächstes die fünf bereits erwähnten TLR-Agonisten in jeder möglichen Konstellation miteinander kombiniert (Daten nicht gezeigt). Die einzige Kombination allerdings, welche einen reproduzierbaren und signifikanten Effekt zeigte, war die Kombination von CpG mit LPS. Für das folgende 50 -Ergebnisse- Experiment wurden DZ, welche aus dem Knochenmark von C57Bl/6 Mäusen generiert wurden, für verschiedene Zeitbereiche (2h, 4h, 6h, 12h, und 24h) mit CpG oder LPS vorbehandelt (Abb.16). Anschließend erfolgte die Inkubation der Zellen mit dem jeweils anderen TLR-Stimulus für weitere 16h. Als Kontrolle wurden Zellen mit LPS, CpG oder beiden zusammen für ebenfalls 16h stimuliert. Unbehandelte Zellen dienten als Negativkontrolle. Unmittelbar nach Ablauf der jeweiligen Versuche wurde die Freisetzung proinflammatorischer Zytokinen mittels ELISA analysiert. Im Vergleich zu den Kontrollen, für die die Zellen allein mit LPS oder CpG stimuliert wurden, konnte maximal ein additiver Effekt beobachtet werden, wenn beide Stimulantien gleichzeitig zugegeben wurden. Auch bei der Vorstimulation mit LPS wurde kein signifikantes Resultat gefunden. Es konnte für fast alle Zytokine maximal ein additiver Effekt im Gegensatz zu der Einzelstimulation nachgewiesen werde. Die einzige Ausnahme bildete TNFα, hier führt die LPS-Vorstimulation zu einem marginalen Rückgang der Zytokinproduktion. Die Vorstimulation der Zellen mit CpG, verglichen mit der gleichzeitigen Zugabe beider TLR-Agonisten, führte ebenfalls zu keinem messbaren Ergebnis der LPS-induzierten IL-6 Freisetzung. Im Gegensatz hierzu konnte für IL-10 und TNFα ein klarer Rückgang der Zytokinproduktion beobachtet werden. Interessanterweise wurde jedoch ein deutlicher Unterschied bei der Messung von IL-12p70 und p40 festgestellt. Beide Zytokine zeigten einen deutlichen Anstieg der LPS-induzierten Zytokinproduktion nach CpGVorstimulation. Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass dieser Effekt zeitabhängig ist. Die Daten zeigen ein deutliches Intervalloptimum bei der vierstündigen Vorbehandlung der Zellen mit CpG. Im Vergleich zu der simultanen Zugabe beider TLR-Agonisten konnte hier nahezu eine Verdreifachung der Zytokinproduktion gemessen werden. Die Vorstimulation der Zellen für zwei bzw. sechs Stunden führt zu mindestens einer Verdopplung der Zytokinfreisetzung. 51 -Ergebnisse- I L-12p70 CpG LPS 24h 16h 12h 16h 6h 16h 4h 16h 2h 16h LPS CpG 24h 16h 12h 16h 6h 16h 4h 16h 2h 16h I L-12p40 I L-6 I L-10 TNFα LPS + CpG 16h CpG LPS Kontrolle 0 2 4 0 400 0 80 0 1 2 0 1 2 3 ng/ ml Abb.16: Synergistischer Effekt durch CpG Vorstimulation auf die LPS induzierte IL-12p70 und IL12p40 Produktion von KM-DZ mit einem Intervalloptimum bei 4h C57Bl/6 KM-DZ wurden am d8 der Kultivierung für 2h, 4, 6h, 12h und 24h mit LPS oder CpG vorbehandelt und anschließend für weitere 16h mit dem zweiten Stimulus inkubiert. Als Kontrolle wurden die Zellen für ebenfalls 16h mit LPS, CPG oder beiden gleichzeitig stimuliert. Unbehandelte DZ dienten als Negativkontrolle. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellkulturüberstände hinsichtlich ihres Gehalts an IL-12p70, IL-12p40, IL-6, IL-10 oder TNFα mittels ELISA untersucht. Die Analyse von der IL-6, IL-10 und TNFα wies keinen nennenswerten Effekt auf. Auch die Vorstimulation der Zellen mit LPS zeigte keinen Einfluss. Im Gegensatz dazu führte die CpG-Vorinkubation zu einem deutlichen Anstieg der IL-12p70 und p40 Produktion, deren Maximum bei 4h lag. Anhand dieses Experiments konnte gezeigt werden, dass nur nach CpGVorstimulation ein verstärkter Anstieg der IL-12p70 und p40 Produktion induziert wurde. Im Unterschied dazu zeigt LPS-Vorstimulation keinen zunehmenden Effekt auf die Zytokinfreisetzung. Auch die Untersuchung der proin- flammatorischen Zytokine IL-6, IL-10 oder TNFα zeigte keinen nennenswerten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollen. 52 -Ergebnisse- 4.2.4 MyD88-abhängiger synergistischer Effekt der LPS-induzierten IL-12p70 und IL-12p40 Produktion von KM-DZ nach CpG-Vorstimulation Um zu untersuchen, ob der beschriebene synergistische Effekt der LPSinduzierten IL-12p70 und p40 Produktion nach CpG-Vorstimulation von dem Adaptormolekül MyD88 abhängig ist, wurden für den ersten Versuchsansatz DZ aus dem Knochenmark von MyD88+/+ und MyD88-/- Mäusen generiert. Es wurde dasselbe Protokoll wie in dem vorherigen Experiment verwendet. Wie erwartet, konnte der derselbe Effekt für die Zytokinproduktion von MyD88+/+ DZ beobachtet werden, welcher zuvor für C57Bl/6 DZ beschrieben wurde (Abb.17A). Im Gegensatz zur LPS-Vorstimulation konnte durch CpG- Vorbehandlung der Zellen eine deutliche zeitabhängige Zunahme der LPSinduzierten IL-12p70 und p40 Produktion beobachtet werden. Obwohl MyD88+/+ DZ verglichen zu C57Bl/6 DZ wesentlich weniger IL-12p70 produzieren, führt die vierstündige Vorbehandlung mit CpG zu einer klaren Zunahme der Zytokinfreisetzung. Die Analyse der Daten für IL-12p40 zeigte jedoch, dass es sich bei dem Intervalloptimum von sechs Stunden um eine Vervierfachung der Zytokinproduktion handelte. Wie bereits auch von anderen beschrieben, konnte keine IL-12p70 Produktion in der Abwesenheit von MyD88 gemessen werden [145, 146, 149]. Obwohl MyD88-/- DZ etwa hundertmal weniger IL-12p40 verglichen zu MyD88+/+ DZ produzierten, konnte dennoch im Gegensatz zu bereits publizierten Daten [142, 145, 149] demonstriert werden, dass immer noch geringe Mengen an IL-12p40 sezerniert wurden (Abb.17A*, Abb.17B). In einem weiteren Experiment wurden DZ aus MyD88-/- und MyD88-/-TLR4-/Mäusen generiert, für 4h bzw. 20h mit CpG vorbehandelt und anschließend durch LPS aktiviert. Auch hier konnte gezeigt werden, dass verglichen zur simultanen Stimulation der DZ mit LPS bzw. CpG, die vierstündige Vorinkubation von MyD88-/- DZ mit CpG zu einem synergistischen Anstieg der LPS-induzierten IL-12p40 Produktion führte (Abb.17B). Im Unterschied hierzu wurde durch die CpG-Vorbehandlung von DZ, welche doppelt-defizient für 53 -Ergebnisse- MyD88 und TLR4 waren, keine Zunahme der IL-12p40 Produktion nachgewiesen (Abb.17B). A) CpG LPS 24h 16h 12h 16h 8h 16h 6h 16h 4h 16h 2h 16h LPS B) CpG CpG 24h 16h 12h 16h 8h 16h 6h 16h 4h 16h 2h 16h LPS 20h 16h 4h 16h CpG LPS MyD88-/- Kontrolle MyD88+/+ MyD88-/- MyD88-/- TLR4-/0 0,5 1 1,5 2 LPS + CpG 16h I L-12p40 (ng/ ml) CpG LPS * * Kontrolle 0 200 400 600 I L-12p70 (pg/ ml) 0 200 MyD88-/- DC 500-1000pg/ml 400 600 I L-12p40 (ng/ ml) Abb.17: Zunahme der durch CpG-Vorbehandlung induzierten IL-12 Produktion ist abhängig von MyD88 und TLR4 MyD88+/+, MyD88-/- und MyD88-/-TLR4-/- wurden für 8d generiert und nach dem Protokoll von Abb.16 stimuliert. Anschließend erfolgte die Analyse der Zytokinproduktion mittels ELISA. A) Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass das Adaptormolekül MyD88 für den CpG-induzierten Anstieg von IL-12p70 und p40 essentiell ist. Während MyD88-/- DZ kein IL-12p70 und nur sehr niedrige Mengen an IL-12p40 produzieren (*500-1000pg/ml), verhielten sich MyD88+/+ DZ wie C57Bl/6 DZ im vorherigen Experiment (Abb.16). Vor allem durch die CpG-Vorbehandlung der Zellen für 4h bis 6h, konnte ein deutlicher Anstieg der IL-12p70 und p40 Produktion gemessen werden. B) In einem weiteren Versuchsansatz wurde der Einfluss der CpG-Vorbehandlung auf die LPSinduzierte IL-12p40 Produktion von MyD88-/- und MyD88-/-TLR4-/- DZ untersucht. Wie bereits zuvor wurde durch die vierstündige Vorinkubation von MyD88-/- DZ mit CpG ein deutlicher Anstieg der IL-12p40 Produktion induziert. Im Gegensatz dazu führte die CpG-Vorstimulation von MyD88-/-TLR4-/- DZ zu keinem Einfluss auf die Zytokinproduktion. Obwohl bei Abwesenheit des Adaptormoleküls MyD88 geringe Mengen an IL12p40 detektiert werden konnten, konnte anhand dieser Experimente eindeutig demonstriert werden, dass MyD88, vor allem aber TLR4 essentiell für den synergistischen Effekt der LPS-induzierten IL-12p70 und p40 Produktion nach CpG-Vorstimulation sind (Abb.14, Abb17). 54 -Ergebnisse- 4.2.5 Der synergistische Effekt der IL-12 Produktion ist unabhängig von der Modifizierung des Oligonukleotid-Rückgrates Aufgrund ihrer Modifizierung werden Oligonukleotide (ODN) in verschiedene Klassen unterteilt. Bislang wurden zwei Klassen von CpG-ODN genauer identifiziert. Hierbei handelt es sich zum einem um ODN mit einem Phosphodiester (PO)-Rückgrat, welche als Klasse A bezeichnet werden. Im Unterschied dazu sind Klasse B ODN durch ein Phosphothioat (PTO)-Rückgrat charakterisiert [150, 151]. Anhand einer Vielzahl von Studien konnte demonstriert werden, dass die zelluläre Aufnahme von ODN zwar unabhängig von den jeweiligen CpG-Motiven stattfindet, jedoch stark durch die Modifizierung des DNA-Rückgrates beeinflusst wird [152]. Im Unterschied zu PO-ODN erfolgt die Aufnahme von PTO-ODN wesentlich schneller und effizienter [153]. Des Weiteren wurde gezeigt, dass im Gegensatz zu PO-ODN, welche rasch durch Nukleasen degradiert werden, PTO-modifizierte ODN erheblich stabiler und somit langlebiger sind [154, 155]. Zusätzlich haben Dalpke und seine Mitarbeiter gefunden, dass alleine durch PTO-Modifizierung dramatische Effekte in Mäusen induziert werden können [156]. Aufgrund dieser Daten wurde in dem folgenden Experiment untersucht, ob die CpG-abhängige Zunahme der IL-12 Produktion womöglich auf die Modifizierung des DNA-Rückgrates zurückzuführen ist. Für diese Versuche wurden DZ aus MyD88+/+ und MyD88-/- Mäusen generiert und mit Klasse A (PO) bzw. B (PTO) CpG-ODN stimuliert. Wie in den vorherigen Experimenten wurden die Zellen zuerst für verschiedene Zeitpunkte (2h, 4h, 6h und 12h) mit dem jeweiligen CpG-ODN vorbehandelt und anschließend für weitere 16h mit LPS inkubiert (Abb.17). Abschließend wurde die IL-12p70 und p40 Produktion mittels ELISA analysiert. Als Kontrollen wurden jeweils ODN verwendet, welche zwar dieselbe Modifizierung des Rückgrates, aber nicht das stimulierende CpG-Motiv aufwiesen. 55 -Ergebnisse- CpG-1668-PO G pC-1720-PO CpG-1668-PTO G pC-1668-PTO 12h 6h 4h 2h LPS + CpG CpG LPS MyD88+/+ Kontrolle MyD88-/0 400 800 0 400 800 0 400 800 0 400 800 I L-12p70 (pg/ ml) 12h 6h 4h 2h LPS + CpG CpG LPS Kontrolle 0 200 400 600 0 200 400 600 0 200 400 600 0 200 400 600 I L-12p40 (ng/ ml) Abb.18: Zunahme der durch CpG-Vorbehandlung induzierten IL-12 Produktion von KM-DZ ist unabhängig vom „DNA-Rückgrat“ Tag acht MyD88+/+ DZ und MyD88-/- DZ wurden mit LPS, verschiedenen Arten von Oligonukleotiden (ODN) oder Kombinationen dieser Reagenzien behandelt. Wie in den Experimenten zuvor (Abb.16, Abb.17) erfolgte die Vorinkubation der Zellen mit den verschiedenen ODN für 2h, 4h, 6h und 12h. Anschließend wurde die Zytokinproduktion durch LPS-Zugabe für weitere 16h induziert. Die Analyse der ELISA-Daten zeigte, dass sowohl CpGODN mit einem Phosphothioat- (PTO) als auch mit einem Phosphodiester-Rückgrat (PO) eine deutliche Zunahme der IL-12p70 und p40 Produktion induzierten. Die Vorbehandlung der Zellen für 4h führte abermals zu dem signifikantesten Effekt. Die Stimulation der DZ mit den KontrollODN, GpC1668-PTO und GpC1720-PO hingegen zeigte keinen Einfluss auf die IL-12p70 und p40 Produktion. Während durch beide Kontroll-ODN kein Effekt auf die Zytokinproduktion ausgeübt wird, kann anhand der Daten eindeutig gezeigt werden, dass beide Klassen von CpG-ODN erneut zu einer zeitabhängigen Zunahme der IL-12p70 und p40 Freisetzung führen. Auch wenn die Stimulation der Zellen mit dem PTO-modifizierten CpG-ODN zu einer fast doppelt so starken Zytokinproduktion führt, konnte trotzdem eindeutig demonstriert werden, dass beide Klassen von CpG-ODN mit LPS kooperieren und die Modifizierung des DNA-Rückgrates keinen Einfluss auf die gesteigerte IL-12Produktion ausübt. 56 -Ergebnisse- 4.2.6 CpG-abhängiger Anstieg der IL-12 Produktion basiert nicht auf Endotoxinkontamination der CpG-Oligonukleotide (ODN) Obwohl die ODN synthetisch hergestellt wurden, konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die beschriebenen synergistischen Effekte auf eine Endotoxinverunreinigung zurückzuführen sind. Es wurde zwar beschrieben, dass eine zweimalige Stimulation mit dem gleichem Endotoxin zur LPS-Toleranz führt [104], trotzdem konnte nicht ausgeschlossen werden, dass durch die Aktivierung von DZ mit zwei verschiedene LPS-Arten eine Zunahme der Zytokinproduktion induziert wurde. Um dies zu überprüfen, wurden C57Bl/6 KMDZ mit einem breiten Spektrum verschiedener LPS behandelt. Parallel zu der alleinigen oder simultanen Stimulation der Zellen, wurden die DZ für 4h bzw. 10h mit den unterschiedlichen Endotoxinen, bzw. CpG vorbehandelt. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Aktivierung der Zellen für weitere 16h mit dem bisher verwendeten LPS (Abb.19). Als Negativkontrolle wurden unbehandelte oder mittels TNFα aktivierte Zellen verwendet. Die Analyse der Zellkulturüberstände hinsichtlich ihres IL-12p70 bzw. IL-12p40 Gehalts zeigte im Vergleich zu der alleinigen Stimulation der DZ mit den verschiedenen Endotoxinen, dass durch die simultane Zugabe der Stimulatien kein Unterschied in der Zytokinproduktion erzielt wurde. Im Gegensatz hierzu konnte durch die gleichzeitige Stimulation der Zellen mit CpG und LPS eine Verdopplung der IL12p70 Produktion und nahezu eine Vervierfachung der IL-12p40 Freisetzung erreicht werden. Die Vorstimulation der Zellen mit den verschiedenen Endotoxinen führte jedoch zu einem deutlichen Rückgang der Zytokinproduktion. Verstärkt wurde dieser Effekt durch die Dauer der Behandlung. Während KM-DZ, welche für 4h vorbehandelt wurden, durch eine weitere Zugabe von LPS aktiviert werden konnten, führte die Vorbehandlung der Zellen für 10h zur Hemmung der IL-12p70 Produktion und zur starken Reduktion von IL-12p40. Demzufolge wurde auch durch zweimalige Stimulation mit verschiedenen Endotoxinen LPS-Toleranz induziert. Im Unterschied hierzu konnte selbst nach zehnstündiger Vorinkubation mit CpG ein mehr als additiver 57 -Ergebnisse- Effekt der LPS-induzierten IL-12p70 und p40 Expression erzielt werden. Zusammenfassend konnte anhand dieser Daten demonstriert werden, dass der durch CpG-Vorbehandlung induzierte synergistische Effekt der IL-12p70 und p40 Produktion von KM-DZ nicht auf Endotoxinverunreinigungen der CpG-ODN zurückzuführen ist. 0h / 4h / 10h 16h CpG LPS LPS S. abortus LPS LPS S. typhimurium LPS LPS P. aeruginosa LPS LPS K. pneumoniae LPS LPS E.coli 0111:B4 LPS LPS E.coli 055:B5 LPS LPS LPS CpG LPS S. abortus LPS S. typhimurium LPS P. aeruginosa LPS K. pneumoniae LPS E.coli 0111:B4 LPS E.coli 055:B5 10 h 4h 0h LPS TNFα Kontrolle 0 1 2 IL-12p70 (ng/ml) 3 0 100 200 300 400 500 IL-12p40 (ng/ml) Abb.19: Synergistischer Effekt der IL-12 Produktion basiert nicht auf Endotoxinkontamination C57Bl/6 DZ wurden für 8d generiert und anschließend mit CpG und einem breiten Spektrum verschiedener Endotoxine behandelt. Die Vorbehandlung der Zellen erfolgte für 0h, 4h und 10h. Nach drei Waschschritten wurde die zweite Stimulation wie in den Experimenten zuvor, durch Zugabe des bisher verwendeten LPS für 16h induziert. Als Kontrollen dienten unstimulierte und mit TNFα behandelte Zellen. Abschließend wurde der Zellkulturüberstand auf seinen Gehalt an IL-12p70 und p40 mittels ELISA untersucht. Während im Vergleich zu der alleinigen Stimulation der Zellen, die simultane Behandlung mit zwei verschiedenen LPS-Arten zu keiner Steigerung der Zytokinproduktion führt, wurde mit zunehmender Inkubationsdauer ein Rückgang von IL12p70 und p40 beobachtet. Im Gegensatz hierzu konnte abermals ein durch CpGVorbehandlung induzierter, synergistischer Effekt der IL-12 Produktion demonstriert werden. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen wurde von Dr. C. Hermann (Konstanz) ein Vollblut-Endotoxintest mit den verschiedenen CpG-ODN durchgeführt. Anhand der dadurch gewonnenen Daten konnte ebenfalls eindeutig gezeigt werden, 58 -Ergebnisse- dass die in diesen Experimenten verwendeten CpG-ODN frei von Endotoxinkontaminationen sind (Daten nicht gezeigt). 4.2.7 „Nukleosomen Umbau“ spielt keine Rolle bei der Zunahme der durch CpG-induzierten IL-12 Produktion Erst kürzlich wurde beschrieben, dass durch CpG induzierter „Nukleosomen Umbau“ zur Öffnung des IL-12 Genortes führt [157]. Aufgrund dieser Daten stellte sich die Frage, ob vielleicht dieser Mechanismus für den durch CpGVorstimulation induzierten synergistischen Effekt verantwortlich ist. Um dies zu untersuchen wurden DZ aus C57Bl/6 Mäusen generiert und für 0h, 4h und 16h mit CpG oder LPS behandelt. Zusätzlich wurden einige Zellen für 4h mit CpG vorstimuliert und anschließend für weitere 16h mit LPS inkubiert. Nach Ablauf der verschiedenen Zeitpunkte wurden die Zellkerne isoliert und hinsichtlich ihrer Zugänglichkeit für Restriktionsenzyme, wie von Weinmann und Mitarbeitern beschrieben, untersucht [158]. Die Durchführung dieses Experiments erfolgte durch Dr. A. Dalpke (Marburg), wobei allerdings kein „Nukleosomen Umbau“ nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund muss ein anderer Mechanismus der synergistischen IL-12 Produktion zugrunde liegen. 4.2.8 CpG induziert eine zeitabhängige Expression von TLR4 Um den Mechanismus, welcher zur erhöhten IL-12 Produktion nach CpGVorbehandlung führt weiter zu untersuchen, wurden C57Bl/6 und MyD88-/- DZ für 0h, 2h, 4h, 6h und 24h mit CpG stimuliert. Nach Ablauf der verschiedenen Inkubationszeiten wurde die TLR4 Expression der DZ mittels Durchflusszytometrie untersucht (Abb.20). Um speziell die Expression auf CpGaktivierten Zellen zu analysieren, wurde gleichzeitig eine Färbung gegen MHC-II durchgeführt. Dies ermöglichte eine Differenzierung zwischen reifen und unreifen DZ. Während reife MyD88-/- DZ keinen signifikanten Unterschied in der 59 -Ergebnisse- TLR4 Expression aufwiesen, konnte bereits nach zweistündiger Inkubation der C57Bl/6 DZ mit CpG ein deutlicher Anstieg der Expression beobachtet werden. MyD88-/- C57Bl/6 283 191 504 273 853 204 931 160 679 148 0h CpG Stimulation 2h 4h 6h 24h TLR4 Abb.20: CpG-Behandlung führt zu einem Anstieg der TLR4 Expression auf reifen DZ in Abhängigkeit von MyD88 Stimulation von d8 C57Bl/6 und MyD88-/- KM-DZ für 0h, 2h, 4h, 6h und 24h mit CpG. Die Analyse der Oberflächenfärbung für TLR4 und MHC-II zeigt, dass CpG zu einer deutlichen Zunahme der TLR4 Expression auf reifen C57Bl/6 KM-DZ führt. Im Gegensatz dazu konnte in Abwesenheit von MyD88 kein Einfluss von CpG auf die TLR4 Expression der KM-DZ nachgewiesen werden. Die Isotypenkontrolle wurde anhand der gepunkteten Linie dargestellt, während die durchgezogene Linie die die TLR4 Expression zeigt. Das schwarze Histogramm stellt die Subtraktion der TLR4 Färbung minus der Isotypenkontrolle dar. Die angegebenen Zahlen demonstrieren die Werte des Mittelwertes der Fluoreszenz (MFI) des schwarzen Histogramms. Interessanterweise führte die Stimulation der Zellen für 4h bzw. 6h zu einer weiteren drastischen Zunahme der TLR4 Expression, deren Maximum bei 6h lag. Verglichen zu dem Mittelwert der Fluoreszenz („mean fluorescence intensity“, MFI) bei 0h, wurde durch die sechsstündige CpG-Behandlung der Zellen mehr als eine Verdreifachung der MFI beobachtet, während die Inkubation der Zellen für 24h allerdings wieder zu einer deutlichen Abnahme der TLR4-Expression führte. Mittels dieser Daten konnte demonstriert werden, dass 60 -Ergebnisse- durch die CpG-Behandlung für 4-6h eine Zunahme der TLR4-Expression erfolgte. Möglicherweise könnte dies ein Hinweis auf den Mechanismus sein, der zur LPS-induzierten Zunahme der IL12 Produktion von KM-DZ nach CpGVorbehandlung führt. Zusammenfassend konnte somit im ersten Teil der Arbeit gezeigt werden, dass mit Ausnahme von TLR3 und TLR4 das Adaptormolekül MyD88 essentiell für die durch TLR-Agonisten induzierte Reifung und Zytokinproduktion von KM-DZ ist. Zusätzlich wurde demonstriert, dass durch CpG-Vorbehandlung eine zeitabhängige Zunahme der IL-12p70 und p40 Produktion induziert wurde, dessen Intervalloptimum bei 4-6h lag. Der Mechanismus dieses MyD88abhängigen Effekts beruht möglicherweise auf der durch CpG-induzierten Verstärkung der TLR4-Expression 4.3 Generierung von Mastzellen aus murinem Knochenmark Die Generierung der Mastzellen (MZ) erfolgte ebenfalls aus murinem Knochenmark nach der von Huff und Mitarbeitern publizierten Methode [144]. Nach Kultivierung Wachstumsfaktor der IL-3 Knochenmarkzellen wurden sie für 4-6 morphologisch Wochen und mit dem phänotypisch charakterisiert (Abb.21A). Für die morphologische Charakterisierung wurden durch IgE-Kreuzvernetzung aktivierte MZ mittels Zytospin auf Objektträger zentrifugiert und eine May-Grünwald-Giemsa Färbung durchgeführt (Abb.21B). Anschließend wurden sie unter Verwendung eines Lichtmikroskops bei 1000facher Vergrößerung analysiert. Anhand der Abbildung kann man sehr deutlich die runde, glatt begrenzte Form der MZ erkennen. In ihrem Zytoplasma befindet sich eine Vielzahl an Vesikeln, in denen die Mastzellmediatoren gespeichert sind. Induziert durch die Aktivierung der MZ kommt es zur Degranulation, wie man anhand der Ausstülpungen der Zellen sehr gut erkennen kann. Die phänotypische Charakterisierung von KM-MZ erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Die FACS-Färbung ruhender KM-MZ für typische DZOberfächenmarker demonstrierte, dass es sich bei den generierten Zellen um 61 -Ergebnisse- eine CD11c und MHC-II negative Zellpopulation handelt (Abb.21C). Die Analyse der Durchflusszytometrie für die Oberflächenrezeptoren c-kit (CD117) [116] und FcεR vom Typ I [1] ergab, dass nahezu 100% der Zellen positiv für c-kit und 37% positiv für FcεRI sind (Abb.21C). A) Knochenmark 4-6w IL-3 MZ 4h B) Aktivierung: IgE-Kreuzvernetzung C) DZ-Marker MZ-Marker 62 % 37 % c-kit MHC II 1% 10 00x CD11c FcεRI Abb.21: Generierung und Charakterisierung von murinen KM-MZ (A) Nach Entnahme der Knochenmarkszellen wurden diese für 4-6 Wochen mit IL-3 kultiviert. Die Reifung ruhender MZ erfolgte durch IgE-Kreuzvernetzung, indem die Zellen für 4h mit IgE und HSA-DNP inkubiert wurden. (B) Die morphologische Charakterisierung für 4 Wochen generierte, aktivierte MZ erfolgte mittels May-Grünwald Färbung bei 1000-facher Vergrößerung eines Lichtmikroskops. MZ sind runde, glatt begrenzte Zellen. In ihrem Zytoplasma befindet sich eine Vielzahl an Vesikel, in denen die Mastzellmediatoren gespeichert sind. Induziert durch IgEKreuzvernetzung, kommt es zur sofortigen Degranulierung der Zellen. (C) Zur phänotypischen Charakterisierung 4 Wochen kultivierter, ruhender MZ wurde eine Oberflächenfärbung für MHCII gegen CD11c bzw. c-kit gegen FcεRI durchgeführt. Nachdem somit gezeigt werden konnte, dass es sich bei den hier generierten Zellen um MZ handelt, wurden sie für die nachfolgenden Experimente verwendet. 62 -Ergebnisse- 4.3.1 Ausdifferenzierte MZ zeigen keine MHC-II Expression und können nicht in DZ umgewandelt werden Von uns wurde bereits beschrieben, dass in einer d8 IL-3 Kultur ebenfalls ein verhältnismäßig hoher Anteil an DZ vorhanden ist [159]. Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass keine Konvertierung dieser IL-3/DZ in MZ möglich war. Aus diesem Grund stellte sich die Frage, ob im Gegensatz dazu ausdifferenzierte MZ in DZ umgewandelt werden können. Für den folgenden Versuchsansatz wurde Knochenmark aus C57Bl/6 Mäusen isoliert und für 6 Wochen mit IL-3 kultiviert. Anschließend wurden die hierdurch generierten KMMZ für zwei bzw. elf Tage mit IL-3, GM-CSF oder GM-CSF in Kombination mit IL-4 inkubiert. IL-3 GM-CSF GM-CSF + IL-4 % positiver Zellen 80 60 % MHC II+ /CD11+ % Annexin V+ 40 20 0 2 11 2 11 2 11 Tage Abb.22: Ausdifferenzierte MZ zeigen keine MHC-II Expression und können nicht in DZ umgewandelt werden [159] C57Bl/6 KM-MZ wurden für 6 Wochen generiert und anschließend für weitere 2 bzw. 11 Tage mit IL-3, GM-CSF oder GM-CSF plus IL4 inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen für MHCII gegen CD11c und Annexin V gefärbt. Die Analyse der FACS-Daten demonstrierte, dass bereits ausdifferenzierte MZ nicht mehr in DZ konvertiert werden konnten. Vor allem die Stimulation für 11d mit GM-CSF führte zur drastischen Zunahme apoptotischer Zellen. 63 -Ergebnisse- Um zu überprüfen, ob die zugegebenen Wachstumsfaktoren die Differenzierung der KM-MZ beeinflussen, wurde FACS-Färbung für typische DZ- Oberflächenmarker, wie beispielsweise CD11c gegen MHC-II durchgeführt (Abb.22). Anhand der Daten erkennt man, dass die Zellen unabhängig von der Art der Stimulation und der Stimulationsdauer nur marginal positiv für beide Oberflächenmarker sind (maximal 2%). Zusätzlich zeigte die parallel durchgeführte Annexin V-Färbung, dass in Abwesenheit von IL-3 ein starker Anstieg von apoptotischen Zellen nach elf Tagen zu beobachten ist. Vor allem die alleinige Kultivierung der Zellen mit GM-CSF führt zu einer nahezu 80%-igen Induktion der Apoptose. Anhand dieser Daten konnte demonstriert werden, dass bereits ausdifferenzierte KM-MZ nicht mehr in DZ konvertiert werden können. 4.3.2 Aktivierung der Mastzellen über IgE-Kreuzvernetzung Um zu überprüfen, inwieweit die im Punkt 4.3 charakterisierten C57Bl/6 KM-MZ durch FcεRI über IgE-Kreuzvernetzung aktiviert werden können, wurden die Zellen für 4h mit IgE und „Humanem Serum Albumin-Dinitrophenyl“ (HSA-DNP) inkubiert (Abb.21A). HSA-DNP diente in diesem Fall als Antigen. Anschließend wurde eine intrazelluläre FACS-Färbung für IL-12p40, IL-4 und TNFα durchgeführt (Abb.23). Im Vergleich zu den ruhenden MZ konnte nur eine unwesentliche Zunahme der IL-4 und IL-12p40 Produktion beobachtet werden. Im Gegensatz dazu war nach Aktivierung der Zellen über IgE-Kreuzvernetzung ein starker Anstieg der TNFα Expression zu erkennen. Anhand dieser Ergebnisse konnte somit eindeutig nachgewiesen werden, dass eine Aktivierung der generierten und charakterisierten KM-MZ durch IgE-Kreuzvernetzung möglich ist. 64 -Ergebnisse- IL-3 + IgE IL-3 71 2 8 2 7 IL-12 p40 IL-4 TNF-α 2 FSC Abb.23: KM-MZ produzieren TNF-α und kleine Mengen von IL-4 und IL-12 p40 nach Aktivierung über IgE-Kreuzvernetzung C57Bl/6 MZ wurden für 6 Wochen generiert. Die Aktivierung der Zellen über IgEKreuzvernetzung erfolgte durch Inkubation für 4h mit IgE und HSA-DNP. Als Kontrolle wurden ruhende, nicht aktivierte MZ verwendet. Anschließend wurde eine intrazelluläre FACS-Färbung der fixierten Zellen für IL-12p40, IL-4 und TNFα durchgeführt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie demonstrierten, dass im Vergleich zu den ruhenden MZ, die Aktivierung der Zellen über IgE-Kreuzvernetzung zu einem deutlichen Anstieg der TNFα Expression führte. Die Analyse der IL-4 und IL-12p40 Produktion zeigte nur eine marginale Zunahme beider Zytokine. 4.3.3 Aktivierung von ruhenden KM-MZ über TLR und FcεRI In einem zusätzlichen Experiment wurde die Aktivierung von C57Bl/6 KM-MZ durch IgE-Kreuzvernetzung und durch TLR-Agonisten miteinander verglichen. Wie in dem vorherigen Versuch wurden die MZ für 4h mit IgE und HSA-DNP behandelt. Parallel hierzu wurde ein Teil der Zellen für die gleiche Zeit mit den TLR-Agonisten LPS, Zymosan, Poly I:C und CpG inkubiert (Abb.24). Nach 2h, 4h, 16h und 48h erfolgte die Analyse der Überstände hinsichtlich ihres Gehalts an Histamin, IL-6 und TNFα mittels ELISA. Anhand dieser Daten wurde 65 -Ergebnisse- demonstriert, dass durch die Aktivierung von MZ durch IgE-Kreuzvernetzung eine sofortige Degranulation der Zellen induziert wurde. Keine Degranulation erfolgte jedoch nach Stimulation der MZ über verschiedene TLR. Histamin IL-6 25 0 12 00 10 00 pg/ml ng/ml 20 0 15 0 10 0 80 0 60 0 40 0 50 20 0 0 0 2h 6h 16 h 2h 48 h 6h 16 h 48 h TNFα 80 0 MZ-Stimulation: pg/ml 60 0 Kontrolle IgE/HSA-DNP LP S 40 0 Zymosan Poly I:C 20 0 CpG 0 2h 6h 16 h 48 h Abb.24: Aktivierung über Toll-like Rezeptoren führt nicht zur sofortigen MZ-Degranulation Wie in dem vorherigen Experiment (Abb.23) wurden für 6 Wochen kultivierte C57Bl/6 MZ über IgE-Kreuzvernetzung aktiviert. Zusätzlich erfolgte eine Stimulation der Zellen für ebenfalls 4h mit verschiedenen TLR-Agonisten. Nach 2h, 6h, 16h und 48h wurden die Zellkulturüberstände hinsichtlich ihres Gehalts an Histamin, IL-6 und TNFα mittels ELISA analysiert. Während durch IgE-Kreuzvernetzung eine sofortige Degranulierung der Zellen induziert wurde, führte die Stimulation durch TLR erst nach 6h, bzw. 16h zu messbaren Ergebnissen. Die genauere Analyse dieser Daten zeigte, dass die Aktivierung der Zellen mittels LPS nach 6h zu einem Anstieg der TNFα Produktion und vor allem von IL-6 führte. Histamin konnte allerdings erst nach 16h im Überstand nachgewiesen werden. Durch Stimulation der Zellen mit Zymosan und Poly I:C, konnte nach 6h TNFα und nach 16h Histamin und IL-6 gemessen werden. Der schwächste Effekt allerdings wurde durch CpG induziert. Die Aktivierung der Zellen mit diesem Stimulus führte erst nach 48h zur Freisetzung geringer Mengen Histamin und IL-6. TNFα wurde nicht sezerniert. 66 -Ergebnisse- Zusammenfassend konnte somit gezeigt werden, dass im Gegensatz zur sofortigen Degranulierung der Zellen durch IgE-Kreuzvernetzung, die Aktivierung über TLR erst zu einer geringeren und zeitabhängigen Freisetzung der verschiedenen Mediatoren führt. Aus diesem Grund erfolgte in den folgenden Experimenten die Aktivierung der MZ durch IgE-Kreuzvernetzung über FcεRI. 4.4 Einfluss von Mastzellmediatoren auf DZ Bislang konnten mehrere Effekte von MZ-Mediatoren sowohl auf humane als auch auf murine DZ gezeigt werden [123, 131-133]. Aus diesem Grund wurde im ersten Teil dieser Experimente der Einfluss eines breiten Spektrums an Mediatoren auf KM-DZ untersucht. Nach Generation der Zellen aus C57Bl/6 und Balb/c Mäusen, wurden sie zuerst für 4h mit verschiedenen Konzentrationen an Serotonin, Histamin, Chondroitinsulfat A, Heparin, LTC4, PGD2 oder PGE2 inkubiert und anschließend zur Induktion der Zytokinproduktion für weitere 16h mit LPS aktiviert (Abb.25 und 26). Wichtig ist hierbei anzumerken, dass noch nicht eindeutig geklärt wurde, ob es sich bei PGE2 um einen Mastzellmediator handelt [118, 127, 128]. Da allerdings mehrfach gezeigt werden konnte, dass dieses Mitglied der Prostaglandin-Familie zu einem starken Rückgang der IL-12 Produktion von DZ führt, diente es in diesem und anderen Experimenten als relevante Positivkontrolle [125, 126]. Um den Einfluss auf die Zytokinproduktion bestimmen zu können, wurden als Kontrollwert die Zellen für die gleiche Zeit mit LPS alleine stimuliert. Nach Inkubation der KM-DZ mit den verschiedenen MZMediatoren bzw. LPS wurde die IL-12p70 und IL-10 Produktion mittels ELISA bestimmt. Wie bereits anhand des Leishmanien-Modells gezeigt werden konnte, produzieren Balb/c DZ wesentlich geringere Mengen IL-12p70 im Gegensatz zu C57Bl/6 DZ [160-162] (Abb.25). Unabhängig davon konnten dieselben Effekte nach Stimulation mit den verschiedenen Mastzellmediatoren auf beide DZTypen beobachtet werden. Während Serotonin, verglichen zu der Kontrolle, keine Auswirkung auf die Zytokinfreisetzung der DZ zeigt, führt die Stimulation 67 -Ergebnisse- der Zellen mit hohen Konzentrationen Histamin zu einem Rückgang der IL12p70 Produktion (Abb. 25, Abb.26A). Allerdings konnte keine Auswirkung auf die Freisetzung von IL-10 gemessen werden (Abb.26A). Se rotonin (µg/ml) 25 0 Histamin (µg/ml) 25 0 5 1 P GE2 (µM) 0,5 0,1 0,05 5 1 P GD 2 (µM) 0,5 0,1 Ba lb/c 0,05 C57Bl/6 1 LTC 4 (µg/ml) 0,3 0,1 Kontrolle 0 10 00 20 00 30 00 40 00 50 00 60 00 70 00 IL-12p70 (pg/ml) Abb.25: Konzentrationsabhängige Reduktion der IL-12p70 Produktion von C57Bl/6 und Balb/c KMDZ durch PGD2-Vorbehandlung C57Bl/6 und Balb/c KM-DZ wurden am Tag 8 ihrer Generierung mit verschiedenen Mastzellmediatoren und PGE2, das in diesem Experiment als Positivkontrolle diente, für 4h vorstimuliert. Zur Induktion der Zytokinproduktion wurden die Zellen für weitere 16h mit LPS aktiviert. Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, welche nur mit LPS stimuliert wurden. Anschließend erfolgte die Analyse der IL-12p70 Produktion der Zellen mittels ELISA. Obwohl Balb/c DZ, verglichen zu C57Bl/6 DZ, wesentlich geringere Mengen an IL-12p70 sezernieren, führte die Vorbehandlung der Zellen mit den verschiedenen Stimulantien zu denselben Effekten. Während LTC4 und Serotonin keinen Einfluss auf die Zytokinproduktion ausübten, wurde durch Histamin ein leichter Rückgang von IL-12p70 induziert. Sowohl PGE2 als auch PGD2 führten allerdings mit steigenden Konzentrationen zu einem deutlichen Rückgang der IL-12p70 Produktion. Ebenfalls keinen Einfluss auf die IL-10 Produktion zeigte die Stimulation der DZ mit LTC4 (Abb. 26B). Die Untersuchung der IL-12p70 Freisetzung ergab, dass hohe Konzentrationen die Zytokinproduktion hemmen, sehr geringe Mengen an LTC4 dagegen zu einem Anstieg führen (Abb.25, Abb.26B). 68 -Ergebnisse- Abb.26: Konzentrationsabhängige Reduktion der IL-12p70 und IL-10 Produktion von C57Bl/6 KMDZ durch Heparin bzw. PGD2-Vorbehandlung Die Stimulation von d8 C57Bl/6 KM-DZ erfolgte wie in dem vorherigen Experiment (Abb.25). Anschließend wurde der Zellkulturüberstand auf seinen Gehalt an IL-12p70 und IL-10 untersucht. Um den Einfluss der verschiedenen Mediatoren zu analysieren, wurden die Zellen nur mit LPS inkubiert. (A) Die Vorbehandlung der Zellen mit Histamin führt in Abhängigkeit der Konzentrationen zu einem Rückgang der IL-12p70 Produktion, zeigt jedoch keinen Einfluss auf die Freisetzung von IL-10. (B) Während geringe Konzentrationen LTC4 einen Anstieg von IL12p70 induzieren, konnte durch Vorbehandlung der Zellen mit der höchsten LTC4-Konzentration eine leichte Abnahme beobachtet werden. (C) Obwohl der durch PGD2 induzierte Effekt verglichen zu PGE2 etwas schwächer ist, führten beide Stimulantien mit ansteigenden Konzentrationen zu einem deutlichen Rückgang beider Zytokine. (D) Im Gegensatz zu Chondroitinsufalt A wurde durch Heparin Zugabe ebenfalls eine signifikante Reduktion der IL12p70 und IL-10 Produktion induziert. 69 -Ergebnisse- Die stärksten Effekte jedoch wurden durch Heparin und den Prostaglandinen PGD2 und PGE2 hervorgerufen. Wie beschrieben, führten selbst geringe Konzentrationen von PGE2 zu einem extremen Rückgang beider Zytokine. Obwohl der Effekt von PGD2 etwas schwächer war, konnte anhand dieser Daten eindeutig gezeigt werden, dass in Abhängigkeit von der Konzentration sowohl IL-12p70 als auch IL-10 ebenfalls stark reduziert wurden. Für beide Prostaglandine konnte bei einer Konzentration von 5µM kein IL-12p70 mehr nachgewiesen werden (Abb.25, Abb.26C). Während die Zugabe ansteigender Konzentrationen Heparin ebenfalls zu einem signifikanten Rückgang beider Zytokine führte, zeigte das Glykosaminglykan Chondroitinsulfat A keinen Einfluss auf die Zytokinproduktion (Abb.26D). Tab.13: Zusammenfassung der Ergebnisse Zusammenfassend konnte demzufolge gezeigt werden, dass weder Serotonin noch Chondroitinsulfat A einen Einfluss auf die IL-12p70 und IL-10 Produktion von KM-DZ ausüben. Die Stimulation der Zellen mit LTC4 führte ebenfalls zu keinem signifikanten Effekt. Während sehr hohe Konzentrationen benötigt werden, um einen Rückgang der IL-12 Produktion zu induzieren, konnte bei sehr geringen Konzentrationen ein Anstieg diese Zytokins beobachtet werden. 70 -Ergebnisse- Sowohl für PGD2 als auch für Heparin wurde gezeigt, dass mit steigenden Konzentrationen es zu einem drastischen Rückgang beider untersuchter Zytokine kommt (Tab.13). Aufgrund dieser Beobachtung wurde in den folgenden Experimenten der Einfluss dieser beiden Mastzellmediatoren auf KM-DZ genauer untersucht. 4.4.1 Heparin bindet bereits produziertes IL-12p70 im Gegensatz zu PGD2 Als nächstes stellte sich die Frage, welcher Mechanismus für die Reduktion der Zytokine, speziell IL-12, durch Heparin und PGD2 verantwortlich ist. Um dies zu untersuchen wurden zwei parallele Versuchsansätze durchgeführt. Im ersten wurden C57Bl/6 KM-DZ zur Induktion der Zytokinproduktion für 4h mit LPS vorbehandelt und anschließend für weitere 16h mit verschieden Konzentrationen Heparin, Chondroitinsulfat A, PGD2 oder PGE2 stimuliert. Im zweiten Versuchsansatz erfolgte zuerst die Behandlung der Zellen für 4h mit den verschiedenen Mediatoren und erst danach wurde die Zytokinproduktion durch Zugabe von LPS induziert. Von beiden Ansätzen wurden nach 20h die Überstande genommen und hinsichtlich ihres IL-12p70 Gehaltes mittels ELISA untersucht. Auch in diesem Experiment wurde eine Kontrolle mitgeführt, in der die Zellen für die gleiche Zeit nur mit LPS behandelt wurden (Abb.27). Während Chondroitinsulfat verglichen zu dieser Kontrolle keinen Einfluss auf die Zytokinproduktion ausübt, führt die Zugabe von steigenden Konzentrationen Heparin in beiden Experimenten zu einem klaren Rückgang von IL-12p70. Ebenfalls eine eindeutige Reduktion der Zytokinproduktion konnte im zweiten Versuchsansatz nach Stimulation der Zellen mit PGD2 bzw. PGE2 beobachtet werden. Interessant ist jedoch, dass die Zugabe beider Prostaglandine im ersten Ansatz keinerlei Einfluss auf die Zytokinfreisetzung ausübt. Diese Daten demonstrieren demzufolge, dass sowohl PGD2 als auch PGE2 offensichtlich in den Syntheseweg von IL-12 eingreifen und somit die Zytokinproduktion hemmen. Denn nur nach vorheriger Inkubation der Zellen mit diesen beiden Stimulatien ist ein Einfluss auf die Zytokinfreisetzung zu erkennen. Im 71 -Ergebnisse- Gegensatz dazu führt die Zugabe von Heparin in beiden Experimenten zu einem deutlichen Rückgang von IL-12p70, wodurch gezeigt werden konnte, dass Heparin bereits synthetisiertes IL-12 bindet und es somit nicht mehr detektiert werden kann. LP S → 4h → versch. Mediatoren → 16h versch. Mediatoren → 4h → LPS → 16h 10 Heparin (U/ ml) 100 1000 1 Chondroitinsulfat A ( µg/ ml) 10 100 P GD 2 (µM) 1 P GE2 ( µM) 1 Kontrolle 0 4000 8000 0 4000 8000 IL-12p70 (pg/ml) Abb.27: Verschiedene Mechanismen sind verantwortlich für den durch Heparin oder PGD2 induzierten Rückgang der IL-12p70 Produktion von KM-DZ Die Behandlung von d8 C57Bl/6 DZ erfolgte nach zwei unterschiedlichen Protokollen. Im ersten Versuchsansatz wurde zuerst die Zytokinproduktion durch LPS-Stimulation für 4h induziert und anschließend die verschiedenen Mediatoren für weitere 16h zugegeben. Der zweite Versuchsansatz erfolgte nach demselben Protokoll wie in den vorherigen Experimenten. Für die Kontrolle wurden die Zellen alleine mit LPS aktiviert. Die Analyse der IL-12p70 Produktion durch einen ELISA zeigte, dass während steigende Konzentrationen von Heparin zu einer Abnahme der Zytokinproduktion führten, nur ein geringer Effekt sowohl durch PGD2, als auch durch PGE2 erzielt wurde. Im Gegensatz hierzu wurde durch die Verwendung des Protokolls der vorherigen Experimente ein deutlicher Rückgang der IL-12p70 Produktion nach Heparin-, PGD2- und PGE2Stimulation induziert. Das Heparin außer IL-12 eine Vielzahl anderer Zytokine und Wachstumsfaktoren bindet, wurde bereits mehrfach beschrieben [133-135]. Aus diesem Grund und da der Einsatz von Heparin in in vivo Experimenten aufgrund seiner blutverdünnenden Eigenschaft problematisch erschien, wurde in den folgenden 72 -Ergebnisse- Experimenten verstärkt der Einfluss von PGD2 auf KM-DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von Th-Zellen untersucht. 4.5 Einfluss von PGD2 auf KM-DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von Th-Zellen 4.5.1 Marginale Beeinflussung der DZ-Reifung durch PGD2 ist nicht auf Apoptose zurückzuführen Bevor PGD2 in den folgenden Experimenten eingesetzt wurde, sollte zuerst genauer untersucht werden, welchen Einfluss die verwendeten Konzentrationen dieses Mastzellmediators auf die Reifung von KM-DZ ausüben. Hierfür wurden DZ aus C57Bl/6 Mäusen generiert, für 4h mit verschiedenen Konzentrationen PGD2 vorbehandelt und anschließend für weitere 16h mit LPS stimuliert. Als Kontrolle wurden die Zellen nur mit LPS aktiviert. Nach der Inkubationszeit wurde eine FACS-Färbung für typische DZ-Reifungsmarker wie MHC-II gegen B7-1, B7-2 oder CD40 durchgeführt (Abb.28A). Anhand der Kontrolle kann man sehr gut erkennen, dass bei Verwendung der höchsten Konzentration an PGD2 nur ein marginaler Rückgang der Reifung zu beobachten ist. Die niedrige Konzentration zeigt nahezu keinen Unterschied. Um auszuschließen, dass dieser geringe Reifungsrückgang nicht auf die Induktion der Apoptose zurückzuführen ist, wurde zusätzlich eine Annexin VPropidiumjodid-Färbung mit den Zellen durchgeführt (Abb.28B). Die Analyse der Daten zeigte, dass die verwendeten Konzentrationen PGD2 nicht zur Apoptose der Zellen führten. Aus diesem Grund und da der Einfluss von PGD2 auf die Reifung sehr gering war, konnten die hier getesteten Konzentrationen bedenkenlos in den folgenden Experimenten eingesetzt werden. 73 -Ergebnisse- Abb.28: Marginale Einfluss der DZ-Reifung durch PGD2 ist nicht auf Apoptose zurückzuführen C57Bl/6 KM-DZ wurden am Tag 8 ihrer Generierung für 4h mit PGD2 stimuliert und anschließend für 16h durch LPS aktiviert. Um den Einfluss von PGD2 zu untersuchen, wurden die Zellen zusätzlich nur mit LPS stimuliert (A) Nach dieser Zeit erfolgte eine Färbung der Zellen für MHC-II gegen B7-1, B7-2 und CD40. Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass steigende Konzentrationen PGD2 zu einem leichten Rückgang der DZ-Reifung führten. (B) Anhand einer zusätzlich durchgeführten Annexin-Propidiumjodid-Färbung konnte jedoch demonstriert werden, dass durch PGD2 keine Apoptose induziert wurde. 74 -Ergebnisse- 4.5.2 Konzentrationsabhängiger Rückgang der IL-12p70 und p40 Produktion von KM-DZ durch PGD2-Vorstimulation Im folgenden Experiment wurde noch einmal eingehender der Einfluss von PGD2 und von PGE2 auf die Zytokinproduktion auf C57Bl/6, bzw. Balb/c KM-DZ untersucht. Die Stimulation erfolgte wie in den Versuchen zuvor. Nach vierstündiger Vorstimulation mit PGD2 bzw. PGE2 wurden die Zellen für 16h mit LPS inkubiert (Abb.29). 1 0,5 P GE2 (µM) Ba lb/c C57Bl/6 0,1 0,05 1 0,5 P GD 2 (µM) 0,1 0,05 LP S 0 1 2 3 4 5 6 IL-12p70 (ng/ml) 0 40 80 12 0 16 0 IL-12p40 (ng/ml) Abb.29: Dosisabhängige Rückgang von IL-12p70 und IL-12p40 durch PGD2-Vorstimulation Nach Generierung der C57Bl/6 und Balb/c KM-DZ für 8 Tage, wurden die Zellen für 4h mit PGD2 und PGE2 stimuliert und anschließend für weitere 16h mit LPS behandelt. Als Kontrolle dienten wieder Zellen, welche nur mit LPS behandelt wurden. Nach der gesamten Inkubationszeit wurde die IL-12p70 und p40 Produktion der Zellen mit Hilfe eines ELISA untersucht. Wie bereits in Abb.25 gezeigt werden konnte, führte sowohl PGD2, als auch PGE2 bei beiden Zelltypen mit steigender Konzentration zu einer deutlichen Reduktion IL-12p70. Während die Analyse der IL12p40 Produktion zeigte, dass durch die Vorbehandlung der Zellen mit PGD2 ein deutlicher Rückgang induziert wurde, konnte für PGE2 kein signifikanter Effekt nachgewiesen werden. 75 -Ergebnisse- Die Analyse der Zytokinproduktion mittels ELISA zeigte deutlich, dass im Vergleich zu der alleinigen Stimulation mit LPS, für beide DZ-Typen eine signifikante, dosisabhängige Reduktion von IL-12p70 sowohl nach PGD2, als auch nach PGE2 Stimulation zu beobachten ist. Während die Vorstimulation der Zellen mit steigenden Konzentrationen an PGD2 ebenfalls zu einem Rückgang der IL-12p40 Freisetzung führte, wurde durch die verschiedenen Konzentrationen von PGE2 kein Einfluss festgestellt. Anhand dieser Daten konnte noch einmal eindeutig gezeigt werden, dass die Stimulation der Zellen mit PGD2, im Gegensatz zur PGE2 Vorstimulation, zu einem klaren dosisabhängigen Rückgang von IL-12p70 und p40 führte. Da bereits beschrieben wurde, dass IL-12 essentiell für die Polarisierung von Th1-Zellen ist [163], wurde in den nachfolgenden in vivo Experimenten untersucht, ob die Stimulation von DZ mit dem Mastzellmediator PGD2 möglicherweise zu einer verstärkten Th2-Polarisierung führt. 4.5.3 Einfluss von PGD2 stimulierten Zellen auf die Th-Polarisierung Wie bereits gezeigt werden konnte (Abb.25) produzieren C57Bl/6 DZ wesentlich höhere Mengen IL-12 als Balb/c DZ und neigen deshalb eher dazu, Th1Immunantworten zu induzieren [160, 162]. Aus diesem Grund stellte sich hier zuerst die Frage, inwieweit sich diese Eigenschaft im folgenden in vivo Modell auswirkt (Abb.30). Zur Verstärkung einer Th1-Immunantwort wurden C57Bl/6 KM-DZ nach einer zweistündigen Behandlung mit Ovalbumin (OVA) und verschiedenen Konzentrationen PGD2 für weitere 2h mit LPS inkubiert (Abb.11A). Im Unterschied dazu wurden KM-DZ, welche aus Balb/c Mäusen generiert wurden, für 2h mit dem Hämozyanin (KLH, “keyhole limpet hemocyanin”) der Riesenschlüsselloch-Napfschnecke (Megathura crenulata) und PGD2 stimuliert und anschließend für weitere 2h mit TNFα aktiviert (Abb.11B). Als Kontrolle erfolgte dieselbe Behandlung der Zellen, aber ohne PGD2. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen subkutan in die Fußsohlen der Hinterläufe von C57Bl/6 bzw. Balb/c Mäusen injiziert. Die Entnahme und 76 -Ergebnisse- Restimulation der drainierenden Lymphknoten (LN) erfolgte nach zwölf Tagen. Neben der Proliferation wurde vor allem die IFNγ und IL-4 Produktion der LNZellen bestimmt. C57Bl/6 Balb/c mehr IL-12 weniger IL-12 verstärkte Th1-Immunantwort verstärkte Th2-Immunantwort P GD 2 P GD 2 Abnahme der Th1-Immunantwort? Zunahme der Th2-Immunantwort? Abb.30: Unterschiede zwischen C57Bl/6 und Balb/c Mäuse Die Analyse der C57Bl/6 LN-Zellen zeigte einen leichten Rückgang der Proliferation nach Injektion von PGD2 stimulierten DZ (Abb.31). Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass die Behandlung der Zellen mit 1µM PGD2 zu einer etwas stärkeren Abnahme der [3H]-Thymidin-Inkorporation führten. Deutlicher konnte der Einfluss der verschiedenen PGD2 Konzentrationen bei der Messung der IFNγ Produktion demonstriert werden. Hier erfolgte im Vergleich zu der Kontrolle eine klare dosisabhängige Reduktion des Th1-Zytokins. Da durch die Aktivierung der DZ mit LPS eine Th1-Immunantwort induziert wurde, konnte kein IL-4 nachgewiesen werden. Dennoch wurde anhand dieser Daten eindeutig gezeigt, dass die Injektion PGD2 stimulierter KM-DZ zu einer Abnahme der IFNγ und somit zu einem Rückgang der Th1-Immunantwort führt. 77 -Ergebnisse- Thymidineinbau IFNγ IL-4 70000 50 60000 Kontrolle 0,1µM PGD2 1µM PGD2 600 40 40000 pg/ml pg/ml CPM 50000 400 30000 30 20 20000 200 10 10000 0 0 3000 1000 300 100 30 10 3 0 0 3000 1000 300 100 30 10 0 3000 1000 300 100 30 10 0 O VA V (µg/ml) Abb.31: In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch PGD2 und LPS stimulierten DZ führt zur Runterregulation von IFNγ in C57Bl/6 Mäusen C57Bl/6 KM-DZ wurden nach Generierung für 9 Tage für 2h mit Ovalbumin (OVA) und PGD2 inkubiert. Anschließend erfolgte die Aktivierung der Zellen durch Zugabe von LPS für weitere 2h. PGD2-unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle. Zwölf Tage nach subkutaner Injektion der Zellen in C57Bl/6 Mäuse wurden die Lymphknoten (LN) entnommen und durch verschiedene Konzentrationen OVA restimuliert. Nach 3 Tagen wurden zum einem die Zellkulturüberstände entnommen und hinsichtlich der IFNγ und IL-4 Freisetzung durch ELISA untersucht. Ein Teil der Zellen wurde zur Bestimmung der Proliferation für weitere 18h mit [3H]-Thymidin inkubiert. Die Analyse der [3H]-Thymidin-Inkorporation zeigte einen Rückgang der Proliferation in Abhängigkeit von PGD2. Zusätzlich wurde durch PGD2 eine Abnahme der IFNγ Produktion induziert. IL-4 konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum C57Bl/6 in vivo Modell wurde durch die Aktivierung von Balb/c LN-Zellen durch die Injektion PGD2 stimulierter Zellen ein Anstieg der Proliferation induziert (Abb.32). Die Analyse der IFNγ und IL-4 Produktion zeigte ebenfalls, dass im Vergleich zu der Kontrolle beide Zytokine nach Injektion PGD2 behandelter DZ verstärkt exprimiert wurden. Die Stimulation der Zellen mit 0,1µM PGD2 führte im Vergleich zu der 1µM Konzentration zu einer deutlicheren Zunahme der Proliferation und der Zytokinproduktion. Da diese Daten weder eine Abnahme der Th1-Polarisierung zeigten, noch darauf hinwiesen, dass die Injektion PGD2 stimulierter DZ zu einer verstärkten Th278 -Ergebnisse- Immunantwort führen, waren weitere Versuche notwendig, um den Einfluss von PGD2 auf die Th-Polarisierung genauer zu untersuchen. Obwohl anhand des C57Bl/6 Modells demonstriert werden konnte, dass PGD2 zu einer Abnahme der Th1-Polarisierung führt, war es dennoch nicht möglich eine Zunahme der Polarisierung von Th2-Zellen nachzuweisen. Eine mögliche Ursache hierfür könnte sein, dass C57Bl/6 Mäuse eher dazu neigen, eine Th1-Immunantwort zu induzieren [164-166]. Da aber vorwiegend die Induktion von Th2-Zellen untersucht werden sollte, wurde für die nachfolgenden in vivo Experimente das Balb/c Modell gewählt, da diese Mäuse für die Untersuchung von Th2Immunantworten geeigneter erschienen [161, 164]. Thymidineinbau IFNγ IL-4 160000 800 140000 Kontrolle 800 0,1µM PGD2 1µM PGD2 120000 pg/ml CPM pg/ml 600 100000 80000 600 400 400 200 200 60000 40000 20000 0 0 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 ,001 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 ,001 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 ,001 0 KLH (µg/ml) Abb.32: In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch PGD2 und TNFα stimulierten DZ führt zur Hochregulation von IL-4 und IFNγ in Balb/c Mäusen Die Stimulation d9 Balb/c KM-DZ erfolgte für 2h mit “keyhole limpet hemocyanin” (KLH) und PGD2. Anschließend wurden die Zellen für weitere 2h mit TNFα aktiviert. Als Kontrolle wurden PGD2-unbehandelte Zellen verwendet. Die Entnahme der LN und deren Restimulation mit KLH erfolgte 12 Tage nach Injektion der DZ in Balb/c Mäuse. Die Analyse der Proliferation und der Zytokinfreisetzung wurde nach demselben Protokoll wie in Abb.31 durchgeführt. Die Stimulation der DZ mit PGD2 führte sowohl zu einer verstärkten [3H]-Thymidin-Inkorporation als auch zu einer Zunahme der IFNγ und IL-4 Produktion. 79 -Ergebnisse- 4.5.4 Abnahme IL-12 Produktion von KM-DZ durch PGD2 ist abhängig von der Dauer der Vorstimulation Während der Durchführung dieser Versuche wurde publiziert, dass PGD2 die IL12 Produktion muriner DZ hemmt [167]. Im Gegensatz zu den hier beschriebenen Experimenten demonstrierte Trottein und seine Mitarbeiter, dass bereits eine 15 minütige Vorbehandlung der Zellen mit PGD2 zu einem deutlichen Rückgang der IL-12 Freisetzung führte. Aus diesem Grund wurde im folgenden Versuch der Einfluss der Dauer der Vorstimulation auf die Zytokinproduktion genauer untersucht. Vorstimulation 16 h PGD2 LPS ELISA Zeit (h) 48 24 16 8 1µM 4 1 0,5 0,25 0 48 24 16 8 0,1µM 4 1 0,5 0,25 0 Kontrolle 0 20 00 40 00 0 IL-12p70 (pg/ml) 10 0 20 0 30 0 IL-12p40 (ng/ml) Abb.33: Dosisabhängiger Rückgang von IL-12p70 und IL-12p40 durch PGD2 ist abhängig von der Dauer der Vorstimulation Nach PGD2-Vorbehandlung von d8 C57Bl/6 KM-DZ für die angegebenen Zeiträume, erfolgte die Aktivierung der Zellen durch Zugabe von LPS für 16h. Als Kontrolle dienten wieder Zellen, welche nur mit LPS stimuliert worden sind. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurden die Zellkulturüberstände auf ihren Gehalt an IL-12p70 und p40 mittels ELISA untersucht. Während die PGD2-Vorbehandlung der Zellen für 1-4h zum geringsten Effekt führte, konnte durch Vorinkubation für 16h ein drastischer Rückgang für IL-12p70 und p40 gemessen werden. 80 -Ergebnisse- Die Vorbehandlung von C57Bl/6 Mäusen DZ erfolgte für 15min, 30min, 1h, 4h, 8h, 16h, 24h und 48h mit verschiedenen Konzentrationen PGD2, anschließend wurde die Zytokinproduktion durch Zugabe von LPS für 16h induziert (Abb.33). Als Kontrolle wurden die Zellen nur mit LPS oder durch simultane Zugabe von PGD2 stimuliert. Anhand dieser Daten kann man sehr deutlich erkennen, dass der geringste Effekt auf die Zytokinproduktion durch eine ein- bis vierstündige PGD2-Vorbehandlung erzielt wurde. Sowohl für IL-12p70 als auch für IL-12p40 ist für diese Zeitpunkte ein deutliches Maximum nach Inkubation der Zellen mit beiden PGD2 Konzentrationen zu erkennen. Der stärkste Rückgang der IL-12 Produktion wurde nach einer sechs-zehnstündigen Stimulation erzielt. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden die KM-DZ in den folgenden Versuchen sowohl für 1h als auch für 16h mit verschiedenen Konzentrationen PGD2 vorbehandelt (Abb.11C). 4.5.5 Polarisierung von Th2-Zellen nach PGD2 Stimulation von KM-DZ Um den Einfluss der unterschiedlichen Vorstimulationsdauer auf die Polarisierung von Th-Zellen zu untersuchen, wurden KM-DZ aus Balb/c Mäusen generiert. Zuerst erfolgte die Inkubation einiger Zellen mit verschiedenen Konzentrationen PGD2 für 15h. Anschließend wurde zu diesen Zellen für eine weitere Stunde KLH gegeben. Parallel hierzu erfolgte die Stimulation weiterer Balb/c DZ für ebenfalls 1h durch gleichzeitige Zugabe von PGD2 und KLH. Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, welche ebenfalls für 1h mit KLH, aber ohne PGD2 behandelt wurden. Abschließend wurden die Zellen für weitere 2h mit TNFα aktiviert und nach Ablauf dieser Zeit subkutan in die Fußsohlen der Hinterläufe von Balb/c Mäusen injiziert (Abb.11C). Nach zwölf Tagen wurden die drainierenden LN entnommen und restimuliert. Die Analyse der Proliferation ergab im Vergleich zu der Kontrolle, dass alle vier Versuchsansätze zu einem Anstieg führten (Abb.34). Die Messung der Zytokinproduktion zeigte, dass die einstündige Vorbehandlung der Zellen mit PGD2 sowohl zu einem Anstieg der IFNγ als auch der IL-4 Freisetzung führte. Wie bereits zuvor wurde im Vergleich 81 -Ergebnisse- zu der 1µM Konzentration (Abb.32), ein wesentlich stärkerer Effekt für die Proliferation und Zytokinproduktion nach einstündiger Stimulation der Zellen mit 0,1µM PGD2 erzielt. Interessanterweise zeigte die Vorinkubation der DZ für 16h mit 0,1µM PGD2 keinen Einfluss auf die IFNγ Produktion, führte aber zu einem deutlichen Anstieg von IL-4. Bei Zugabe von 1µM PGD2 konnte ebenfalls eine Zunahme der IL-4 Expression beobachtet werden. Zusätzlich wurde durch diese Konzentration ein deutlicher Rückgang der IFNγ Freisetzung induziert. Thymidineinbau IFNγ 120000 IL-4 500 600 100000 pg/ml pg/ml CPM 80000 60000 Kontrolle 1h 0,1µM PGD2 1h 1µM PGD2 16h 0,1µM PGD2 16h 1µM PGD2 500 400 300 400 300 200 40000 200 100 20000 0 100 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 KLH (µg/ml) Abb.34: In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch DZ, welche für 16h mit PGD2 vorbehandelt wurden, führt zur Abnahme von IFNγ und zur Hochregulation von IL-4 in Balb/c Mäusen Balb/c KM-DZ wurden am Tag 8 ihrer Generierung für 16h bzw. 1h mit PGD2 vorinkubiert und in der letzten Stunde zusätzlich mit KLH stimuliert. Anschließend wurden alle Versuchsansätze für 2h durch Zugabe von TNFα aktiviert. Die weitere Versuchsdurchführung erfolgte entsprechend Abb.32. Verglichen zur PGD2-unbehandelten Kontrolle, führte die Stimulation der DZ mit PGD2 zu einer Zunahme der Proliferation. Während die einstündige Inkubation der DZ zu einem Anstieg beider Zytokine führte, wurde durch die sechszehnstündige PGD2-Behandlung der Zellen eine Abnahme von IFNγ und ein Anstieg der IL-4 Produktion analysiert. 82 -Ergebnisse- Insgesamt wurden sieben Experimente unter Verwendung desselben Protokolls durchgeführt. Bei sechs dieser Versuchsansätze konnte ein deutlicher Anstieg der IL-4 Produktion nachgewiesen werden, während eine Abnahme der IFNγ Produktion in vier dieser Experimente erfolgte. Tendenziell konnte somit gezeigt werden, dass die Vorbehandlung der Zellen für 16h mit PGD2 zu einer deutlichen Zunahme von IL-4 führte. Des Weiteren konnte bei Verwendung von 1µM PGD2 eine Reduktion der IFNγ Produktion beobachtet werden. Aus diesem Grund weisen diese Daten interessanterweise darauf hin, dass der Mastzellmediator PGD2 zu einem Rückgang der Polarisierung von Th1-Zellen führt und gleichzeitig die Polarisierung von Th2-Zellen zunimmt. 4.6 Einfluss von Mastzellen und deren Mediatoren auf KM-DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von Th-Zellen Abschließend wurde der direkte Einfluss von MZ und deren Mediatoren auf die Th-Polarisierung untersucht. Die Generation der Mastzellen und KM-DZ erfolgte aus Balb/c Mäusen. Zur Stimulation der DZ mit den Mastzellmediatoren wurde das Transwellsystem verwendet. Bevor die MZ in einer Dichte von 2x106 in den Transwelleinsatz pipettiert wurden, erfolgte die Aktivierung der Zellen für 4h über IgE-Kreuzvernetzung (Abb.12A). Nach einer Inkubationszeit von 16h wurde der Einsatz entfernt und die DZ für weitere 4h mit KLH und TNFα stimuliert. Anschließend wurden die Zellen subkutan in die Fußsohlen der Hinterläufe von Balb/c Mäusen injiziert. In einem zweiten, parallel dazu durchgeführten Versuchsansatz wurden die DZ zuerst für 4h mit KLH und TNFα inkubiert und anschließend mit aktivierten MZ koinjiziert (Abb.12B). Hierbei wurden die DZ in einem Verhältnis von 1:0,5 und 1:2 zu den MZ eingestellt (Abb.35). Als Kontrolle wurden DZ injiziert, welche zuvor für 4h mit KLH und TNFα aktiviert wurden. Zwölf Tage nach der Injektion erfolgte die Entnahme der LN und deren Restimulation. In allen drei Versuchsansätzen wurde ein Anstieg der Proliferation im Vergleich zu der Kontrolle nachgewiesen. Während die 83 -Ergebnisse- Stimulation der DZ durch die Mastzellmediatoren zu einer verstärkten Expression von beiden Zytokinen führte, wurde durch die Koinjektion von DZ und MZ ein Rückgang der IFNγ Produktion und ein Anstieg von der IL-4 Expression erzielt. Die Injektion von DZ und MZ, welche im Verhältnis 1:2 eingestellt wurden, führte zu einem etwas stärkeren Effekt bezogen auf die Zytokinfreisetzung verglichen zu dem Verhältnis 1:0,5. IFN γ Thymidineinbau 70000 IL-4 160 100 Kontrolle 60000 M Z-Media toren 80 40000 pg/ml DZ :MZ (1:2) pg/ml CPM DZ :MZ (1:0 ,5) 120 50000 80 30000 60 40 20000 40 20 10000 0 0 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 10 1 0 ,1 0 ,01 0 KLH (µg/ml) Abb.35: In vivo Aktivierung und Polarisierung von Th-Zellen durch Koinjektion von DZ und MZ führt zur Abnahme von IFNγ und zur Hochregulation von IL-4 in Balb/c Mäusen Für 6 Wochen generierte Balb/c KM-MZ wurden für 4h mit IgE und HSA-DNP aktiviert. Anschließend wurden die aktivierten MZ in einem Transwelleinsatz zu d8 Balb/c KM-DZ gegeben und für 16h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde der Transwelleinsatz mit den MZ entfernt und die DZ für weitere 4h mit KLH und TNFα stimuliert. Parallel hierzu wurden d8 Balb/c KM-DZ ebenfalls für 4h mit KLH und TNFα behandelt und anschließend mit MZ, welche für 15min durch IgE-Kreuzvernetzung aktiviert wurden, in einem Verhältnis von 1:0,5 und 1:2 (DZ:MZ) eingestellt. Als Kontrolle wurden DZ verwendet, welche ausschließlich für 4h mit KLH und TNFα inkubiert wurden. Zwölf Tage nach subkutaner Injektion der Zellen wurden die LN entfernt und mit KLH restimuliert. Die Analyse der Proliferation und Zytokinproduktion erfolgte wie in den vorherigen Experimenten. Die Stimulation der DZ mit den Mastzellmediatoren führte sowohl zu einer Zunahme der [3H]-Thymidin-Inkorporation als auch zu einem Anstieg der IFNγ und IL-4 Produktion. Durch Koinjektion von DZ und MZ wurde ebenfalls eine Verstärkung der Proliferation induziert, zusätzlich jedoch zeigte die Analyse der ELISA-Daten, dass IFNγ reduziert wurde und gleichzeitig die IL-4 Produktion zunahm. 84 -Ergebnisse- Anhand dieser Daten konnte demonstriert werden, dass auch der Mastzellkontakt bei der Aktivierung von DZ essentiell ist. Da sich dieses Ergebnis allerdings in nur zwei von drei Experimenten reproduzieren ließen, wären weitere Versuche notwendig, um zu verifizieren, dass durch die simultane Injektion von DZ und MZ ein Rückgang der Polarisierung von Th1-Zellen und gleichzeitig ein Anstieg der Th2-Polarisierung induziert wird. Durch die Stimulation DZ mit den Mastzellmediatoren alleine, erfolgte kein messbarer Effekt. In dem zweiten Teil dieser Arbeit konnte demzufolge demonstriert werden, dass einige Mastzellmediatoren, insbesondere Heparin und PGD2, zu einem drastischen Effekt der Zytokinproduktion, insbesondere der IL-12 Produktion, von KM-DZ führen. Weitere Versuche mit PGD2 verdeutlichten, dass der Rückgang der IL-12 Produktion zu einer Abnahme der Th1-Polarisierung und gleichzeitig zu einer Zunahme der Polarisierung von Th2-Zellen führte. Durch die Koinjektion von DZ mit MZ wurde ebenfalls eine Zunahme der Th2Immunantwort induziert. 85 -Diskussion- 5 Diskussion Dendritische Zellen fungieren in der Immunologie als wichtige Schaltstellen für die Induktion der T-Zell-vermittelten Immunantwort. Aufgrund ihrer herausragenden Fähigkeit, Antigene aufzunehmen und zu präsentieren, spielen sie eine entscheidende Rolle in der Polarisierung von Th1- bzw. Th2-Zellen. Da ein breites Spektrum verschiedenster Stimulantien existiert, ist allerdings eine Vielzahl an Experimenten notwendig, um die biologische Funktion der DZ besser zu charakterisieren. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit werden erstmalig Daten präsentiert, die eine Kooperation von TLR9 und TLR4 belegen, wodurch eine synergistische Zunahme der IL-12 Produktion von DZ beobachtet wurde. In dem zweiten Teil dieser Doktorarbeit konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Beeinflussung DZ durch Mastzellmediatoren, im speziellen PGD2, zu einer Zunahme der Th2-Polarisierung führte. 5.1 Kooperation von TLR9 und TLR4 muriner KM-DZ Bereits im Vorfeld dieser Arbeit war bekannt, dass DZ mittels verschiedener TLR-Agonisten aktiviert werden können. Die dadurch induzierte Reifung der Zellen zeichnet sich vor allem durch eine verstärkte Expression von Oberflächenmarkern, wie MHC-II und kostimulatorischen Molekülen, sowie durch die Zunahme der Produktion proinflammatorischer Zytokine aus [60-63]. Zusätzlich wurde beschrieben, dass verschiedene DZ-Subtypen unterschiedliche Repertoires an TLR auf ihrer Oberfläche exprimieren, wodurch eine höhere Spezifität der Zellen hinsichtlich ihrer Lokalisation im Organismus erreicht wird [62, 63, 81, 96]. Die in dieser Arbeit durchgeführte Stimulation muriner KM-DZ mit den TLR-Agonisten OspA, Poly I:C, LPS, Imiquimod und CpG führte zur Aktivierung der DZ. Somit konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die aus murinem Knochenmark generierten DZ neben TLR2 auch TLR3, TLR4, TLR7 und TLR9 exprimieren. Diese Ergebnisse stimmen mit denen anderer Publikationen überein [99, 100]. 86 -Diskussion- Anhand der Zunahme der MHC-II und B7-2 Expression und der vermehrten Produktion von IL-12p40 konnte entsprechend der bereits publizierten Daten [60-63] demonstriert werden, dass über Aktivierung dieser TLR-Agonisten Reifung von DZ induziert wurde. Die Signaltransduktionswege der verschiedenen TLR werden fast ausschließlich über das Adaptormolekül MyD88 reguliert [90, 91]. Bei Zellen, denen dieses Molekül fehlte, konnte weder durch OspA, noch durch Imiquimod oder CpG Reifung erzielt werden. Diese Ergebnisse bestätigen somit, dass sowohl TLR2 als auch TLR7 und TLR9 abhängig von MyD88 sind [90]. Die Stimulation DZ mit Poly I:C bzw. LPS führte allerdings auch bei Abwesenheit von MyD88 zur Zunahme der Expression von Oberflächenmarker. Eine mögliche Erklärung dafür wäre die Existenz eines weiteren, MyD88-unabhängigen Signaltransduktionsweges. Für TLR3 konnte erst kürzlich gezeigt werden, dass dieser Rezeptor ausschließlich über das Signalmolekül TRIF (TRIF/TICAM1) reguliert wird und demzufolge unabhängig von MyD88 ist [90, 148]. Auch für TLR4 wurde neben dem MyD88-abhängigen Transduktionsweg ein weiterer Signalweg identifiziert, welcher ebenfalls abhängig von TRIF ist [90, 168]. Bisher wurde jedoch nur gezeigt, dass die Aktivierung durch TLR4 in Abhängigkeit von TRIF zum Anstieg der Oberflächenexpression von MHC-II und kostimulatorischen Molekülen führt, dagegen nicht zur Induktion der Produktion proinflammatorischer Zytokine [145, 149]. Anhand dieser Arbeit konnte jedoch erstmals demonstriert werden, dass zwei voneinander unabhängige Signalwege für LPS-induzierte IL-12p40 Produktion existieren. Während der MyD88-abhängige zu hohen Konzentrationen IL-12p40 führt (100-150ng/ml), wurde in Abwesenheit von MyD88 IL-12p40 in etwa 100fach geringeren Mengen induziert (0,5-1ng/ml). Dies wiederum korreliert mit den neuesten Erkenntnissen, dass TLR4 sowohl den MyD88-abhängigen als auch den MyD88-unabhängigen/TRIF-abhängigen Signaltransduktionsweg zur Expression proinflammatorischer Zytokine benötigt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass TRIF der Hauptregulator für die TLR4 vermittelte Aktivierung DZ und der daraus resultierenden Th1-Immunantwort ist [168]. 87 -Diskussion- Wie bereits in der Einleitung beschrieben wurde, besitzen einige TLR die Fähigkeit, miteinander zu kooperieren, wodurch eine gezielte Reaktion gegen eingedrungene Erreger ermöglicht wird. Zur Induktion einer effizienteren und dadurch spezifischeren Immunantwort gegen ein bestimmtes Pathogen konnten zusätzlich synergistische bzw. inhibitorische Effekte durch Kostimulation einiger TLR gezeigt werden. Anhand von Makrophagen wurde beobachtet, dass durch die simultane Stimulation von TLR2 und TLR4 ein deutlichen Anstieg der TNFα Produktion induziert wurde [69]. Zusätzlich konnte jedoch für DZ demonstriert werden, dass die Kostimulation von TLR2 und TLR4 bzw. TLR3 zur Blockade der LPS bzw. Poly I:C vermittelten Induktion von IL-12p35, IFNγ und IP10 führt. Die Ursache dieses inhibitorischen Effekts lag in der raschen IL-10 Freisetzung nach Aktivierung von TLR2 [169]. Mittels dieser beiden Beispiele kann sehr gut veranschaulicht werden, dass die Aktivierung verschiedener Zelltypen mit demselben Pathogen durchaus zu unterschiedlichen Reaktionen führen kann. Hierdurch wird zusätzlich eine höhere Spezifität des Immunsystems gewährleistet. Während somit durch Vorbehandlung von Makrophagen mit dem TLR9Liganden CpG ein deutlichen Rückgang der LPS-induzierten Zytokinfreisetzung beobachtet wurde [170, 171], konnte anhand dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die Kooperation von TLR9 und TLR4 bei DZ zu einem signifikanten Anstieg der LPS-vermittelten IL-12 Produktion führte. Durch Vorbehandlung der Zellen mit CpG wurde eine signifikante Zunahme der LPSinduzierten IL-12p70 und p40 Freisetzung gemessen. Im Gegensatz dazu konnte durch LPS-Vorbehandlung kein steigernder Effekt erzielt werden. Zusätzlich wurde mittels eines Zeitkinetikexperimentes demonstriert, dass der durch CpG induzierte synergistische Effekt abhängig von der Dauer der Vorstimulation ist. Es konnte ein deutliches Maximum der IL-12p70 und p40 Produktion bei vier- bis sechsstündiger Vorinkubation der Zellen mit CpG analysiert werden. Dass die Länge der CpG-Vorbehandlung eine entscheidende Rolle auf die Proteinexpression ausübt, wurde ebenfalls von anderen Arbeitgruppen beschrieben. Untersuchungen 88 an Makrophagen ergaben -Diskussion- beispielsweise, dass bei einer CpG-Vorbehandlungsdauer von 1-3h ein klarer Anstieg der LPS-induzierten TNFα Produktion gemessen wurde, während die Vorinkubation der Zellen für 6-9h zum deutlichen Rückgang von TNFα führte [171]. Interessanterweise konnte etwa zur gleichen Zeit von einer anderen Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass nach zwei- bis achtstündiger CpGVorbehandlung von Makrophagen, durch die anschließende simultane Stimulation der Zellen mit CpG und LPS eine Reduktion von TNFα induziert wurde. Die Vorinkubation der Zellen für 24h mit CpG hingegen führte zu einem klaren Anstieg der CpG/LPS-vermittelten TNFα Freisetzung [172]. Als Ursache für die hier beschriebenen synergistischen und inhibitorischen Effekte wurden bislang verschiedene Mechanismen diskutiert [171, 172]. Mittels durchgeführter Experimente wurde in dieser Arbeit allerdings eindeutig demonstriert, dass der kooperative Effekt von TLR9 und TLR4 bei DZ abhängig von dem Adaptormolekül MyD88 ist. Wie bereits auch von anderen beschrieben wurde, konnte keine IL-12p70 Produktion bei Abwesenheit von MyD88 nachgewiesen werden [145, 146]. Im Gegensatz zu bereits publizierten Daten wurde erstmals in dieser Arbeit ein leichter Anstieg der LPS-induzierten IL12p40 Freisetzung nach CpG-Vorbehandlung beschrieben [142, 145]. Da dieses Ergebnis bei zusätzlicher Abwesenheit von TLR4 nicht mehr reproduziert werden konnte ist dieser Effekt möglicherweise auf den MyD88-unabhängigen Signaltransduktionsweg von TLR4 zurückzuführen, welcher über das Adaptormolekül TRIF reguliert wird [90, 168], Bereits im Vorfeld dieser Arbeit konnte mehrfach gezeigt werden, dass die Modifizierung von CpG-ODN hinsichtlich ihres DNA-Rückgrates die Eigenschaften des TLR9-Agonisten entscheidend verändert. Obwohl diese Daten eindeutig auf die unterschiedliche Wirksamkeit der verschiedenen CpGODN-Klassen hinweisen, konnte in dieser Arbeit eindeutig ausgeschlossen werden, dass die CpG-abhängige Zunahme der LPS-induzierten IL-12 Produktion nicht auf der Modifizierung des DNA-Rückgrates basiert. Durch weitere Experimente wurde außerdem demonstriert, dass der hier beschriebene synergistische Effekt nicht auf eine Endotoxinkontamination der 89 -Diskussion- synthetisch hergestellten CpG-ODN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurden diese Daten mittels eines Vollblut-Endotoxintest bestätigt, da bei dessen Durchführung keine messbaren Kontaminationen nachgewiesen werden konnten. Der VollblutEndotoxintest gilt als allgemein gängiges Verfahren, um mögliche Endotoxinverunreinigungen aufzuzeigen. Wie bereits beschrieben, führte die CpGVorbehandlung von MyD88-/- DZ immer noch zur geringen Freisetzung von IL12p40, während durch die zusätzliche Absence von TLR4 keine IL-12p40 Produktion mehr nachgewiesen werden konnte. Obwohl gezeigt werden konnte, dass der synergistische Effekt nicht auf Endotoxinverunreinigungen zurückzuführen ist, besteht hinsichtlich dieser Daten immer noch eine geringe Möglichkeit, dass durch die CpG-Vorbehandlung die DZ sensibler werden und somit auch sehr geringe Konzentrationen an Verunreinigungen detektieren können. Sollte dies der Fall sein, was allerdings noch genauer untersucht werden müsste, dann würde es sich hier um einen Endotoxinnachweis handeln, der um einiges sensitiver als die bisher kommerziell erhältlichen Nachweisverfahren wäre. Während der Durchführung dieser Arbeit wurde beschrieben, dass durch CpG bzw. LPS induzierter „Nukleosomen Umbau“ zur Öffnung des IL-12 Genortes bei DZ führt [157, 173]. Untersuchungen, ob der Anstieg der IL-12p70 und p40 Freisetzung nach CpG-Vorbehandlung möglicherweise auf diesen Wirkungsmechanismus zurückzuführen ist, erwiesen sich jedoch als negativ. Durch die Analyse der Zellkerne von DZ, welche mit CpG vorbehandelt und anschließend durch LPS aktiviert wurden, konnte eindeutig ausgeschlossen werden, dass es sich bei dem Mechanismus des CpG-abhängigen synergistischen Effekts um „Nukleosomen Umbau“ handelt. Interessanterweise konnte jedoch anhand dieser Arbeit ein Anstieg der TLR4 Expression nach Aktivierung der DZ über TLR9 gezeigt werden. Wie bereits zuvor wurde auch hier durch vier- bis sechsstündiger CpG-Behandlung ein deutliches Maximum der TLR4 Expression erreicht. Gegebenenfalls handelt es sich hierbei um den Mechanismus, der zur signifikanten Zunahme der LPSinduzierten IL-12 Produktion nach CpG-Vorbehandlung führt. Durch die 90 -Diskussion- verstärkte Expression von TLR4 nach 4-6h wird möglicherweise die Reaktion der Zellen auf LPS gesteigert, wodurch vermehrt IL-12 sezerniert wird. Dass die Stimulation eines TLR zur verstärkten Expression anderer TLR führen kann, wurde bereits auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben. Sowohl für DZ als auch für Makrophagen konnte beispielsweise gezeigt werden, dass mittels LPSAktivierung der Zellen eine deutliche Zunahme der TLR9 Expression induziert wurde [174, 175]. Die Stimulation von Makrophagen mit den TLR-Agonisten LPS, Poly I:C, R848 und CpG hingegen führte zu einer vermehrten Expression von TLR2 [176]. Obwohl die Mechanismen der hier beschriebenen Zunahme der TLR Expression noch nicht eindeutig charakterisiert sind, scheint die Ursache dieses Effekts in der effizienteren Reaktion der Zellen auf eindringende Pathogene zu bestehen. Zusammenfassend konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass die Kooperation von TLR9 und TLR4 bei DZ zu einem signifikanten Anstieg der IL12 Produktion führt, welche vermutlich auf die CpG-vermittelte Zunahme der TLR4 Expression basiert. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit war bekannt, dass durch die Aktivierung von TLR vorwiegend Th1-Immunantworten induziert wurden [136, 177]. Essentiell für die Polarisierung von Th1-Zellen ist die Sekretion von IL-12 durch DZ [47, 178]. Sowohl die Stimulation DZ mit LPS als auch mit CpG führt zur Freisetzung von IL-12 [84, 85, 168, 179]. Anhand dieser Arbeit konnte zusätzlich demonstriert werden, dass aus der Vorbehandlung der Zellen mit CpG ein deutlicher Anstieg der LPS-induzierten IL-12 Produktion resultierte. Demzufolge scheint die Kooperation von TLR9 und TLR4 zu bewirken, dass die DZ immunogener werden und es dadurch zu einer Zunahme der Th1-Polarisierung kommt. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass TLR9 intrazellulär, in endosomalen Kompartimenten lokalisiert ist, während TLR4 auf der Zelloberfläche exprimiert wird [86]. Aufgrund dieser Daten und vom Ablauf der Phagozytose hätte man eigentlich einen umgekehrten Synergismus erwartet. Anhand der bereits beschriebenen Ergebnisse konnte jedoch eindeutig demonstriert werden, dass alleine durch CpG dieser synergistische Effekt induziert wurde. Möglicherweise 91 -Diskussion- dient also gerade die Aufnahme und Lyse der Bakterien dazu, weitere eindringende Pathogene gezielt zu erkennen, spezifisch darauf zu reagieren und die Immunität dagegen zu erhöhen. 5.2 PGD2-vermittelte Zunahme der Th2-Polarisierung durch DZ Neben dem engen Kontakt von MZ zu DZ [120, 121], wurden bereits einige Auswirkungen verschiedener Mastzellmediatoren auf die Aktivierung, das Migrationsverhalten und die Zytokinproduktion von DZ beschrieben. Die Stimulation DZ mit Histamin führt beispielsweise zur Zunahme der Oberflächenexpression von MHC-II und kostimulatorischen Molekülen [183]. Zusätzlich konnte verifiziert werden, dass Histamin die IL-12 Produktion humaner DZ hemmt, wodurch es zu einer Zunahme der Polarisierung von Th2Effektorzellen kam [123, 124]. Ergänzend konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, dass Histamin zu einem deutlichen Rückgang der LPS-induzierten IL12 Produktion bei murinen DZ führte. Im Gegensatz hierzu wurde durch LTC4 kein signifikanter Effekt auf die Zytokinproduktion nachgewiesen. Sowohl Histamin als auch LTC4 begünstigen allerdings die Migration DZ zu den drainierenden Lymphknoten [132, 184]. Die lokale Freisetzung von PGD2 in peripheren Geweben hingegen hemmt die Migration DZ zu den Lymphknoten und beeinflusst somit nachhaltig die Immunantwort [129, 130]. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass steigende Konzentrationen PGD2 zu einer deutlichen Abnahme der LPS-induzierten IL-12 Produktion führen. Inzwischen wurden diese Daten für murine und auch für humane DZ von anderen Arbeitsgruppen bestätigt [131, 167]. Sowohl anhand dieser Arbeit als auch von anderen Arbeitsgruppen konnte zusätzlich demonstriert werden, dass PGE2 ebenfalls zu einem signifikanten Rückgang der IL-12 Produktion in Abhängigkeit der Konzentration führt [185-187]. Bislang wurde jedoch noch nicht eindeutig geklärt, ob PGE2 von MZ sezerniert wird [118, 127, 128]. Da es sich hierbei jedoch um das derzeit am besten untersuchte Prostaglandin handelt, 92 -Diskussion- wurde es in den meisten Experimenten als Kontrolle mitgeführt. Während die Vorbehandlung der DZ mit PGD2 zu einem deutlichen Rückgang der LPSinduzierten IL-12p70 und p40 Produktion führte, wurde durch PGE2, im Gegensatz zu bereits publizierten Daten [126], nur die LPS-induzierte IL-12p70 Produktion gehemmt. Dieses Ergebnis korreliert wiederum mit den neuesten Erkenntnissen, die belegen, dass PGE2 die IL-23 Produktion muriner DZ induziert [188]. Im Gegensatz zu IL-12p70, welches aus einer p35 und p40 Untereinheit besteht, ist IL-23 ein Heterodimer aus den Proteinen p40 und p19 [189]. Möglicherweise wird demzufolge durch PGE2 ein Rückgang der p35 Expression induziert, wodurch es zur Dimerisierung der Proteine p40 und p19 kommt und somit den Anstieg der IL-23 Freisetzung zur Folge hat. Die Stimulation der Zellen mit dem Mastzellmediator Heparin führte ebenfalls zu einer drastischen Reduktion von IL-12. Während PGD2 und PGE2 durch verschiedene Mechanismen direkt die Synthese von IL-12 blockieren und somit die Zytokinfreisetzung hemmen, bindet Heparin bereits synthetisiertes IL-12 [131, 135, 167, 187]. Eine mögliche Erklärung für diese Eigenschaft von Heparin wäre, dass es hierdurch zu einer Anreicherung von IL-12 in der Nähe des Sekretionsortes im Gewebe kommt und somit die Immunreaktion entscheidend beeinflusst wird [135]. Neben IL-12 wurde die Bindung von Heparin auch für eine Vielzahl von anderen Zytokinen und Wachstumsfaktoren beschrieben [134, 190, 191]. Obwohl Heparin zur deutlichen Reduktion von IL-12 führte und somit möglicherweise auch Einfluss auf die Polarisierung von Th-Zellen nimmt, wurden in dieser Arbeit keine weiteren Experimente mit diesem Mastzellmediator durchgeführt. Neben der Bindungseigenschaft vieler Zytokine, erschien der Einsatz von Heparin in in vitro Experimenten hinsichtlich der blutverdünnenden Eigenschaften problematisch. Da im Gegensatz zu PGE2 eindeutig demonstriert werden konnte, dass PGD2 von MZ sezerniert wird [192], wurde im zweiten Teil dieser Arbeit vor allem der Einfluss dieses Mastzellmediators auf DZ und der daraus resultierenden Polarisierung von ThZellen untersucht. 93 -Diskussion- Anhand von publizierten Daten konnte gezeigt werden, dass die Vorbehandlung humaner DZ mit PGD2 die LPS-induzierte Reifung der Zellen beeinflusst. Obwohl kein Effekt auf die MHC-II (HLA-DR) Expression nachgewiesen wurde, veränderte sich das Verhältnis der kostimulatorischen Moleküle zueinander. Während die PGD2-Stimulation der Zellen zu einem deutlichen Anstieg von B7-1 (CD80) führte, konnte gleichzeitig eine Reduktion von B7-2 (CD86) beobachtetet werden [131]. Im Unterschied hierzu wurde durch PGD2-Vorbehandlung muriner DZ in dieser Arbeit ein marginaler Rückgang der Expression von Reifungsmarkern analysiert. Da allerdings zusätzlich gezeigt werden konnte, dass dieses Ergebnis nicht auf Apoptose der Zellen basiert, konnte dieser minimale Effekt vernachlässigt werden. Weil in beiden der hier beschriebenen Experimente die gleichen Konzentrationen PGD2 bzw. LPS verwendet wurden, ist der Unterschied dieser Ergebnisse möglicherweise auf die unterschiedliche Dauer der PGD2-Vorbehandlung oder auf die Generierung von DZ aus verschiedenen Mausstämmen zurückzuführen. Untersuchungen am Leishmanien-Modell ergaben bereits, dass C57Bl/6 Mäuse verstärkt Th1-Immunantworten ausbilden, während Balb/c Mäuse eher Th2Immunantworten induzieren [160-162, 193]. Die Ursache hierfür liegt unter anderem in der Fähigkeit der DZ IL-12 zu produzieren. So zeigten DZ, welche aus C57Bl/6 Mäusen generiert wurden, eine wesentlich höhere IL-12 Produktion nach LPS-Aktivierung verglichen zu Balb/c DZ. Aus diesem Grund führte die Injektion von PGD2-vorbehandelten und LPS-aktivierten C57Bl/6 DZ zwar zu einer Reduktion des typischen Th1-Zytokins IFNγ, jedoch konnte aufgrund der LPS-vermittelten Induktion einer Th1-Immunantwort kein IL-4 nachgewiesen werden, welches möglicherweise auf eine Zunahme der Th2-Polarisierung hingedeutet hätte. Um den Einfluss von PGD2-behandelten DZ auf die Polarisierung von Th-Zellen genauer zu untersuchen, wurden aus diesem Grund für weitere in vivo Experimente Balb/c Mäuse verwendet. Dieselbe Versuchsdurchführung in Balb/c Mäusen führte zwar zu einer Zunahme der IL-4 Produktion, aber auch von IFNγ. Möglicherweise liegt die Ursache hierfür in der Dauer der PGD2-Vorstimulation. Während 94 die in diesem Experiment -Diskussion- angewandte Stimulationsdauer von 4h einen geringeren Effekt auf die LPSinduzierte IL-12p70 und p40 Produktion ausübte, wurde nach sechszehnstündiger PGD2-Vorinkubation die deutlichste Reduktion von IL-12p70 und p40 erzielt. Und in der Tat konnte erstmalig in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die subkutane Injektion DZ, welche für 16h mit PGD2 vorinkubiert wurden, zu einem deutlicher Anstieg von IL-4 führten und gleichzeitig ein Rückgang von IFNγ gemessen wurde. Mittels mehrerer Experimente konnte eindeutig demonstriert werden, dass PGD2 einen statistisch signifikanten Anstieg der Th2-Polarisierung in vivo induziert. Dieses Ergebnis stimmt mit bereits veröffentlichten in vitro Daten humaner DZ überein [131]. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass durch die Reifung humaner DZ mit PGE2 ebenfalls eine Polarisierung von Th2-Zellen induziert wird [125, 185]. Verglichen mit den zu PGE2 publizierten Daten, scheinen die hier beschriebenen Ergebnisse mit PGD2 zu einer geringeren Th2-Polarisierung zu führen. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte unter anderem in der stärkeren Abnahme der IL-12p70 Produktion durch PGE2 liegen. Allerdings würde sich dann die Frage stellen, warum PGE2 zwar die Zunahme der Polarisierung von Th2-Zellen induziert, jedoch parallel hierzu eine verstärkte Expression des Th1-Zytokins IL-23 beobachtet wurde [188]. Um diese Frage wissenschaftlich fundiert zu beantworten, wären allerdings weitere Experimente notwendig. Anhand vorläufiger Daten konnte zusätzlich in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Koinjektion von MZ und DZ ebenfalls zu einer Zunahme der Th2Polarisierung führte. Die Stimulation DZ mittels Mastzellmediatoren degranulierter MZ induzierte jedoch keinen messbarern Effekt. Somit scheint zusätzlich der Zell-Zell-Kontakt für die Induktion einer Th2-Immunantwort notwendig zu sein, was wiederum den engen Kontakt von MZ zu DZ in den peripheren Organen erklären würde [120, 121]. 95 -Diskussion- 5.3 Beeinflussung der Th1-und Th2-Polarisierung durch DZ Bislang werden verschiedene Modelle für die Polarisierung von naiven Th-Zellen in Th1- bzw. Th2-Zellen kontrovers diskutiert. Während ein Modell darauf basiert, dass verschiedene DZ-Typen für die Polarisierung von Th-Effektorzellen verantwortlich sind [56, 57], besagt ein weiteres Modell, dass die Art des Antigens und zusätzlich dessen Konzentration entscheidend für die Differenzierung von Th1- bzw. Th2-Zellen ist [49, 59, 194]. Allen Modellen gemein ist jedoch, dass IL-12, welches von DZ sezerniert wird, essentiell für die Induktion einer Th1-Immunantwort ist [47]. Anhand dieser Arbeit konnte unter anderem gezeigt werden, dass durch die Kooperation von TLR9 und TLR4 bei KM-DZ verstärkt IL-12 produziert und dadurch wahrscheinlich eine Zunahme der Th1-Polarisierung induziert wird. Obwohl man auf Grund bisheriger Ergebnisse davon ausging, dass die Aktivierung DZ über TLR primär zur Induktion von Th1Immunantworten führt [84, 195, 196], zeigen neuere Daten, dass TLR möglicherweise auch eine Rolle bei der Polarisierung von Th2-Zellen spielen [197, 198]. So wurde beispielsweise beschrieben, dass die Abwesenheit des Adaptormoleküls MyD88 bei Mäusen zur Induktion von Th2-Immunantworten führt [55, 199, 200]. Mittels neuerer Daten konnte jedoch zusätzlich demonstriert werden, dass einige TLR-Agonisten auch in Abhängigkeit von MyD88 Th2Immunantworten induzieren [201-203]. Neben den Signalwegen der TLR scheint allerdings auch die Konzentration des Antigens für die Polarisierung von ThEffektorzellen eine Rolle zu spielen. So konnte für LPS gezeigt werden, dass durch hohe Konzentrationen dieses TLR4-Agonisten Th1-Zellen polarisiert werden, während niedrige Konzentrationen zur Differenzierung von Th2-Zellen führen [204]. Hierbei ist allerdings anzumerken, dass durch die intranasale Verabreichung des Antigens DZ aktiviert wurden, welche in der Lunge lokalisiert sind. Da bereits mehrfach gezeigt wurde, dass DZ in der Lunge aufgrund des sie umgebenden Milieus eher dazu neigen, Th2-Immunantworten zu induzieren [205], könnte die durch niedrige Antigendosen hervorgerufene Th2-Polarisierung 96 -Diskussion- möglicherweise auch darauf basieren. Anhand dieser Arbeit konnte ebenfalls der Einfluss des Milieus, welches DZ umgibt, auf die Differenzierung von ThEffektorzellen nachgewiesen werden. Die Stimulation DZ mit den Mastzellmediator PGD2 führte zur Reduktion der IL-12 Produktion und somit zur Induktion einer Th2-Immunantwort. Zusätzlich wurde dieser Effekt auch für andere Mediatoren residenter Zelltypen gezeigt [123, 125, 206]. Wie bereits beschrieben, exprimieren verschiedene DZ-Subtypen unterschiedliche Repertoires an TLR auf ihrer Oberfläche, wodurch eine höhere Spezifität der Zellen hinsichtlich ihrer Lokalisation im Organismus erzielt wird [62, 63, 81, 96]. So führte beispielsweise die Stimulation von klassischen DZ mittels eines TLR7-Agonisten zur IL-12 Freisetzung, während Aktivierung plasmazytoider DZ mit demselben Stimulus zur IFNα Produktion führte [98]. Obwohl somit durch beide Zelltypen eine Th1-Immunantwort induziert wurde, konnte dennoch demonstriert werden, dass unterschiedliche DZ-Subtypen mittels verschiedener Zytokinprofile die Polarisierung von Th-Effektorzellen beeinflussen können. Anhand dieser Daten konnte somit gezeigt werden, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren für die Differenzierung von Th-Effektorzellen verantwortlich ist. Neben der Art des Antigens und möglicherweise auch dessen Konzentration, spielt ebenso das umgebende Milieu, sowie auch die Expression verschiedener Rezeptoren auf der Oberfläche von DZ eine entscheidende Rolle bei der Induktion von Th1- bzw. Th2-Zellen. Während die Funktion von DZ für die Induktion einer Th1-Immunantwort weitgehend geklärt wurde, ist der Einfluss DZ bei der Polarisierung von Th2-Effektorzellen noch nicht eindeutig verifiziert. Möglicherweise spielen neben TLR andere „Pattern Recognition Receptors“, wie beispielsweise Mannose-Rezeptoren oder Lektine vom Typ C, hierbei eine entscheidende Rolle [197]. Eine Vielzahl weiterer Untersuchungen wird allerdings notwendig sein, um Klärung herbeizuführen. 97 -Zusammenfassung- 6 Zusammenfassung Dendritische Zellen (DZ) spielen eine zentrale Rolle im angeborenen und erworbenen Immunsystem. Aufgrund ihrer Lokalisation in den peripheren Organen und der Expression einer Vielzahl von Oberflächenrezeptoren ist es ihnen möglich, eindringende Pathogene gezielt zu erkennen und durch Polarisierung von T-Helfer (Th)-Effektorzellen eine spezifische Immunantwort dagegen zu induzieren. Nach Antigenaufnahme erfolgt in den T-Zellarealen des regionären Lymphknotens die Aktivierung naiver T-Zellen durch DZ über MHC-II präsentierte Antigene und kostimulatorische Moleküle. Zur Induktion einer Th1bzw. Th2-Immunatwort sind allerdings weitere Signale notwendig. So ist beispielsweise IL-12, welches von DZ produziert wird, entscheidend für die Polarisierung von Th1-Zellen. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung DZ über TLR, welche spezifische pathogene Strukturen erkennen, eine entscheidende Rolle hierbei spielt. Da zusätzlich einige kooperative Effekte für TLR beschrieben wurden, sollte anhand dieser Arbeit untersucht werden, ob einige TLR muriner Knochenmarks-DZ (KM-DZ) miteinander kooperieren, wodurch die Zellen immunogener werden und somit möglicherweise eine Zunahme der Th1-Immunantwort induziert wird. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmals die Kooperation von TLR9 und TLR4 demonstriert werden. Die Vorbehandlung der Zellen mit dem TLR9Agonisten CpG führte zu einem zeitabhängigen synergistischen Anstieg der LPS-induzierten IL-12 Produktion in Abhängigkeit von dem Adaptormolekül MyD88, während durch LPS-Vorbehandlung kein signifikanter Effekt induziert wurde. Die hier gezeigten Experimente legen nahe, dass der Mechanismus, welcher diesem Synergismus zugrunde liegt, auf den CpG-induzierten Anstieg der TLR4-Expression zurückzuführen ist. Mastzellen (MZ) sind in engem Kontakt zu DZ in der Haut lokalisiert und spielen vor allem bei der Auslösung von Allergien eine entscheidende Rolle. Da es sich hierbei um typische Th2Immunantworten handelt, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit der Einfluss von 98 -Zusammenfassung- Mastzellen und deren Mediatoren auf murine KM-DZ untersucht werden und ob diese Stimulation der DZ möglicherweise zu einer Zunahme der Th2Polarisierung führt. Die Verwendung mehrerer Mastzellmediatoren ergab, dass vor allem PGD2 zu einer deutlichen Abnahme der IL-12 Produktion von KM-DZ führte. Zusätzlich konnte anhand dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass durch PGD2 eine Abnahme der Th1-Polarisierung induziert wird und parallel hierzu ein Anstieg der Polarisierung von Th2-Zellen erfolgt. Zusammenfassend konnte somit gezeigt werden, dass eine Modulation der T-Helferzell Immunantwort durch Kooperation von TLR9 und TLR4 bzw. durch den Mastzellmediator PGD2 induziert wird. 99 -Summary- 7 Summary Dendritic cells (DC) play a central role in the innate and adaptive immune system. Due to its localization in the peripheral organs and their expression of a wide range of surface receptors, they can recognize invading pathogens and induce a specific immune response against them. After antigenuptake, DC migrate to the T cell areas of the draining lymph node where they interact with naïve T cells by presentation of their antigens on MHC-II and costimulatory molecules. For induction of polarized Th1 or Th2 immune responses, there are other additional factors necessary. IL-12, which is produced by DC, is essential for the polarization of Th1 cells. Others have shown that the activation of DC by Toll-like receptors (TLR), which recognize specific molecular pathogen structures, plays an important role for the IL-12 production. In this study was investigated, whether TLR of murine bone marrow DC (BM-DC) are able to cooperate with each other and if this cooperation might lead to an increased release of IL-12. Interestingly, the cooperation of TLR9 and TLR4 could be demonstrated for the first time in this work. Pretreatment of DC with CpGoligonucleotides such as TLR9 agonists led to a time-dependent synergistic rise of the LPS induced IL-12 production dependent on the adaptor molecule MyD88, while reversely by LPS pretreatment no significant effect was induced. The mechanism, which is the basis for this synergism, is possibly due to the CpG induced rise of the TLR4 Expression. Mast cells (MC) are located in close contact to DC in the skin and play a crucial role in the induction of allergies. As allergies are typical Th2 immune responses, the influence of mast cells and their mediators on murine BM-DC, and if this stimulation leads to an increased Th2 polarization, was investigated in the second part of this work. After testing of many different mast cell mediators it was found, that above all PGD2 induces a clear downregulation of the IL-12 production by BM-DC. Additionally it could be demonstrated, that PGD2 reduces Th1 polarisation in parallel a rise of Th2 polarisation took place. In summary it could be shown that a modulation of the 100 -Summary- Th1/2 immune responses was induced by co-operation of TLR9 and TLR4 versus increased Th1 immunity or by the mast cell mediator PGD2 versus a Th2 response. 101 -Persönliche Veröffentlichungen- 8 8.1 Persönliche Veröffentlichungen Wissenschaftliche Originalveröffentlichungen Baumeister T, Rossner S, Pech G, de Bruijn MF, Leenen PJ, Schuler G, Lutz MB: Interleukin-3Ralpha+ myeloid dendritic cells and mast cells develop simultaneously from different bone marrow precursors in cultures with interleukin-3; J Invest Dermatol. 2003 Aug;121(2):280-8 Voigtländer C, Rößner S, Cierpka E, Theiner G, Wiethe C, Menges M, Schuler G, Lutz MB: TNF induces partial DC maturation enabling further maturation on microbial signals and after subcutaneous injection; (zur Publikation eingereicht) Theiner G, Rößner S, Gessner A, Dalpke A, Schmitz F, Wagner H, Berger T, Lutz MB: TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells; (in Vorbereitung) Theiner G, Gessner A, Lutz MB: The mast cell mediator PGD2 suppresses IL-12 release by dendritic cells leading to Th2 polarized immune responses; (in Vorbereitung) 8.2 Kurzveröffentlichungen Pech G, Lutz MB: Synergistic effect of CpG pretreatment with LPS on IL-12p40 production by dendritic cells in the absence of MyD88. EMDS (2003), No.65 Pech G: CpG signalling in the absence of MyD88 enhances IL-12p40 production by dendritic cells. Immunobiology (2003), 208 (1-3):157. Pech G, Berger T, Gessner A, Lutz MB: TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells. Immunobiology (2004), 209 (4-6):397. 102 -Persönliche Veröffentlichungen- 8.3 Posterpräsentationen Pech G, Lutz MB: Synergistic effect of CpG pretreatment with LPS on IL-12p40 production by dendritic cells in the absence of MyD88; 17th EMDS-Meeting in Leicester (2003) Pech G, Berger T, Gessner A, Lutz MB: TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-2 release by murine dendritic cells; IZKF Erlangen (2004) Pech G, Berger T, Gessner A, Lutz MB: TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-2 release by murine dendritic cells; Herbsttagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Maastricht (2004) 8.4 Vorträge Pech G: CpG signalling in the absence of MyD88 enhances IL-12p40 production by dendritic cells; Herbsttagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Berlin (2003) 103 -Literaturverzeichnis- 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Literaturverzeichnis Janeway, C. A. T., P., Immunologie, second Edn. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg-Berlin-Oxford: 1997. Steinman, R. M. and Cohn, Z. 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Abbildung Ak Antikörper Ag Antigen APZ antigenpräsentierenden Zelle BSA Bovines Serumalbumin CCR “CC chemokine receptor” cDNA kompementäre DNA Ci Curie cpm “counts per minute” (Zahl der Zerfälle pro Minute) CpG unmethylierte Nukleotidstränge mit Cytosin-Guanin-Motiven DMSO Dimethylsufoxid DNA “desoxyribonucleic acid” (Desoxyribonukleinsäure) DNP Dinitrophenyl ds “double stranded” (doppelsträngig) DTT 1,4-Dithiothreitol DZ Dendritische Zelle ELC „EBI1-ligand chemokine“ ELISA “enzyme-linked-immunoabsorbent-assay” E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N, N, N’, N’-tetraacetat FACS “fluorescence-activated cell sorting” FITC Fluoreszein-Isothiocyanat FKS fötales Kälberserum FSC “forward scatter” GM-CSF “granulocyte-macrophage colony stimulating factor” (Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) HSA-DNP Humanes Serum Albumin - Dinitrophenyl HRP „horse-raddish-peroxidase“ (Sterptavidin-gekoppelte Meerretichperoxidase) 120 -Abkürzungsverzeichnis- Ig Immunglobulin IL Interleukin IFN Interferon i.v. intravenös KLH “keyhole limpet hemocyanin” von Megathura crenulata LPS Lipopolysaccharide M Mol = mol/Liter ME Mercaptoethanol MFI “mean fluorescence intensity” MHC “major histocompatibility complex” (Haupthistokompatibilitätskomplex) MyD88 “myeloid differentiation factor 88” MZ Mastzelle NTP Nukleotid-Triphosphat OD optische Dichte ODN “oligodinucleotide” (Oligodinukleotid) OspA “outer surface protein A” (Oberflächenprotein A von Borrelia burgdorferi) OVA Ovalbumin PAMPs “pathogen-associated molecular patterns” PBS “phosphate buffer saline” (Phosphatpuffer) PCR “polymerase chain reaction” (Polymerasekettenreaktion) PE Phycoerythrin PGD2 Prostaglandin D2 PGE2 Prostaglandin E2 pH “potentia Hydrogeni” negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PMA Phorbolmyristatacetat PO Phosphodiester PolyI:C synthetisches Analog von dsRNA PRRs “pathogen recognition receptors” 121 -Abkürzungsverzeichnis- PTO Phosphothioat RNA “ribonucleinacid” (Ribonukleinsäure) RNase Ribunuklease RT Reverse Transkription RT Raumtemperatur rpm “rounds per minute” (Umdrehungen pro minute) s.c. subkutan SLC „secondary lymphoid tissue chemokine“ ss “single stranded” (einzelstängig) SSC “side scatter” Tab. Tabelle Th1 T-Helfer 1 Th2 T-Helfer 2 TLR Toll-like Rezeptor TNFα Tumornekrosefaktor α Tween20 Poly(oxyethylen)n-Sorbitant-Monolaurat TZR T-Zell-Rezeptor U Unit (Enzymeinheit) ü.n. über Nacht v/v “volume per volume” WT Wildtyp w/v “weight per volume” V Volt 122 -Lebenslauf- 11 Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Gabriele Beate Theiner Geburtstag: 02.01.1973 Geburtsort: Erlangen Wohnort: Erlangen, Wilhelmstraße 4 Familienstand: geschieden Staatsangehörigkeit: deutsch Schulbildung: 1979 – 1983: Grundschule Büchenbach-Nord in Erlangen 1983 – 1984: Christian-Ernst-Gymnasium in Erlangen 1984 – 1994: Albert-Schweitzer-Gymnasium in Erlangen 1994 Abschluss der allgemeinen Hochschulreife Studium: 11/1994 – 11/2000: Dipolombiologie an der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg 11/1996 Diplomvorprüfung 11/2000 Diplomhauptprüfung 02/2000 – 11/2000 Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joachim Hauber am Lehrstuhl für Virologie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Thema: Kartierung cis-aktiver Sequenzelemente der Interleukin-2 mRNA 123 -Lebenslauf- Promotion: 02/2001 – 12/2004: Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Manfred Lutz am Lehrstuhl für Experimentelle Dermatologie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Thema: Modulation der T-Helferzell Immunantwort durch Signale von Toll-like Rezeptoren und Mastzellmediatoren auf Dendritische Zellen Stipendium: 02/2001 – 05/2003: Stipendium der Deutschen Forschungsgesellschaft im Rahmen des Graduiertenkollegs 592 („Lymphozyten“) 124 -Danksagung- Ich danke Herrn Prof. Dr. T. Winkler für die freundliche Betreuung dieser Arbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät und für seine spontane Bereitschaft, diese Aufgabe nach dem plötzlichen Tod von Herrn HD Dr. M. Dahl zu übernehmen. Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. A. Steinkasserer für die Übernahme des Zweitgutachtens und für seine sehr nützlichen Ratschläge bedanken. Herrn Prof. Dr. Dr. André Gessner danke ich für die Bereitstellung von Reagenzien und Mäusen, aber vor allem für seine überaus hilfreichen Anregungen und Diskussionen. Bei Herrn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck möchte ich mich dafür bedanken, dass ich am Graduiertenkolleg teilnehmen konnte, was ich als enorme Bereicherung empfand. Besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn PD Dr. Manfred Lutz. Während der Durchführung dieser Arbeit war er jederzeit für mich da, hat mich immer unterstützt und mir durch seine Kompetenz und sein Wissen viel gelehrt. Weiterhin möchte ich mich bei meiner Arbeitsgruppe für ihre Unterstützung und dem gesamten „Diogenes-Container“ für die angenehme Arbeitsatmosphäre bedanken. Nicht zuletzt danke ich aber meinen Eltern von ganzem Herzen für die Selbstverständlichkeit, mit der sie mir so vieles im Leben ermöglicht haben und dass sie immer für mich da gewesen sind. Am Ende möchte ich mich noch bei dem Menschen bedanken, der mich vor allem in der letzten Zeit durch seine Liebe und sein Verständnis sehr unterstützt hat. Vielen lieben Dank! 125
