Serum Vitamin D : Spiegel und regulatorische T

Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Alexander Kreuter
Dienstort: HELIOS St. Elisabeth Klinik Oberhausen
Abteilung für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
Serum Vitamin D – Spiegel und regulatorische T-Zellen
bei Patienten mit Malignem Melanom
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Michel Pascal Bindsteiner
aus Hagen
2013
Dekan:
Prof. Dr. med. K. Überla
Referent:
Prof. Dr. med. A. Kreuter
Korreferent: PD Dr. med. F. G. Bechara
Tag der Mündlichen Prüfung: 24. Juni 2014
Abstract
Bindsteiner
Michel
Serum Vitamin D – Spiegel und regulatorische T-Zellen bei Patienten mit Malignem Melanom
Problem: Das Maligne Melanom ist ein hochaggressiver, zur frühen Metastasierung neigender Tumor der
Melanozyten. Zusammenhänge zur Vitamin D-Versorgung bei der Entstehung, Prognose und der Progredienz der Erkrankung wurden in kleineren Untersuchungen beschrieben. Als „immunogener“ Tumor entzieht
sich das Melanom schnell dem Immunsystem, doch Fortschritte bei den Therapien zeigen Möglichkeiten, in
das Immunsystem modulierend und stärkend einzugreifen. Ein weiterer Angriffspunkt könnten hierbei regulatorische T-Zellen darstellen, die in der unmittelbaren Nähe des Melanoms oder seinen Metastasen gefunden
werden konnten.
Gegenstand der vorliegenden Studie war der Nachweis von Korrelationen zwischen der Vitamin DVersorgung bzw. den Tregs bei Patienten mit Malignem Melanom und den Tumorstadien nach AJCC 2002
oder möglichen gegenseitigen Zusammenhängen.
Methoden: Klinische und histopathologische Charakteristika wurden bei 764 (Vitamin D) bzw. 192 (Vitamin D / Tregs) Patienten bestimmt. Durch direkten, kompetitiven Chemilumineszenz Immunoassay wurden
die Serumwerte des Vitamin D und mittels Durchflusszytometrie die Tregs gemessen. Durch statistische
Berechnungen u.a. mittels linearer und multipler Regression sollten mögliche Korrelationen aufgezeigt werden. Werte für p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse: Erniedrigte Vitamin D-Serumwerte waren signifikant mit größeren Tumordicken nach Breslow
(β = -1,45; p = 0,028) und auch mit höheren Tumorstadien nach AJCC 2002 verbunden (β = -0,79; p =
0,036). Ebenso korrelierten erhöht gemessene CD4+CD25++CD127-- Tregs mit den Stadien III und IV nach
AJCC2002 (p = 0,0011; OR: 1,3; 95%KI: 1,11 bis 1,51). Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Vitamin D-Serumwerten und den peripher zirkulierenden Tregs nachgewiesen werden (für
CD4+CD25++CD127--: p = 0,36; für CD4 +CD39+: p = 0,30).
Diskussion: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Patienten mit insuffizienter oder defizienter Vitamin DVersorgung von einer möglichen Substitution profitieren könnten, da suffizientere Werte mit dünneren Tumoren, niedrigeren Tumorstadien und langsamerem Progress verbunden waren. Vitamin D könnte also eine
Rolle in der Kontrolle der Erkrankung hinsichtlich Progress und Gesamtmortalität spielen. Die Ergebnisse
der Tregs-Messungen zeigen, dass diese einen unabhängigen positiven Prädiktor für die fortgeschrittene
Erkrankung – ab Stadium III – darstellen. Dies belegt, dass Tregs eine Rolle nicht nur im fernmetastasierten
Stadium, sondern auch schon vorher spielen könnten. Daher könnten sie ein möglicher Angriffspunkt für
zukünftige Forschungen hinsichtlich Antikörpertherapien oder Tumorimmunisierung bzw. -vakzinierung
sein.
Für meine Eltern
und
für Britta
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ......................................................................................................... 7
1.1
Das Maligne Melanom ................................................................................ 8
1.1.1
Definition ............................................................................................. 8
1.1.2
Epidemiologie ...................................................................................... 8
1.1.3
Ätiologie .............................................................................................. 8
1.1.4
Klinik ................................................................................................... 9
1.1.5
Genetik ............................................................................................... 12
1.1.6
Stadieneinteilung und Prognose......................................................... 13
1.1.7
Therapie ............................................................................................. 18
1.1.8
Nachsorge .......................................................................................... 21
1.2
Vitamin D .................................................................................................. 22
1.2.1
Kurzer Ausflug in die Chemie ........................................................... 22
1.2.2
Synthetisierung und Transport ........................................................... 23
1.2.3
Extrarenale Synthetisierung von Calcitriol ........................................ 24
1.2.4
Wirkweise des Calcitriols .................................................................. 25
1.2.5
Wirkungen in den „klassischen“ Zielgeweben .................................. 25
1.2.6
Wirkungen in der Haut und auf Immunzellen ................................... 25
1.2.7
Einflüsse auf die Vitamin D Versorgung ........................................... 27
1.3
Immunsystem ............................................................................................ 28
1.3.1
Natürliche Killerzellen ....................................................................... 28
1.3.2
T-Zell-Entwicklung ........................................................................... 29
1.3.3
T-Zell-Reihe....................................................................................... 30
1.3.3.1
CD4+-T-Helferzellen
30
1.3.3.2
CD8+-zytotoxische T-Zellen
30
1.3.3.3
CD4+CD25++ CD127- regulatorische T-Zellen (Tregs)
31
2
Zielsetzung...................................................................................................... 34
3
Patienten, Material und Methoden .............................................................. 35
3.1
Patienten ................................................................................................... 35
1
3.1.1
Ein- und Auschlusskriterien.............................................................. 35
3.1.2
Aufgenommene Messwerte .............................................................. 36
3.2
Material .................................................................................................... 36
3.2.1
3.3
Probengewinnung ............................................................................. 36
Methoden.................................................................................................. 36
3.3.1
Bestimmung der 25OHD-Konzentration im Serum ......................... 36
3.3.2
Messung der Lymphozyten-Populationen ........................................ 37
3.3.2.1
3.3.3
4
5
Messung mit dem Durchflusszytometer
37
Statistische Methoden ....................................................................... 37
Ergebnisse ...................................................................................................... 38
4.1
Anteil Vitamin D ...................................................................................... 38
4.2
Anteil Lymphozytenpopulationen ............................................................ 42
Diskussion ....................................................................................................... 46
5.1
Melanom und Vitamin D ......................................................................... 46
5.2
Melanom und Immunsystem .................................................................... 48
5.3
Vitamin D und regulatorische T-Zellen ................................................... 50
6
Zusammenfassung ......................................................................................... 51
7
Literaturverzeichnis ...................................................................................... 52
Danksagung
Lebenslauf
2
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Bedeutung
25OHD
25-Hydroxy-Vitamin D
7-DHC
7-Dehydrocholesterol
95%KI
95% Konfidenzintervall
ADO
Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie
AIDS
Acquired Immune Deficiency Syndrome
AJCC
American Joint Committee on Cancer
APC
Antigen präsentierende Zelle
ATP
Adenosintriphosphat
AWMF
Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften
BCC
Basalzellkarzinom
BMI
Body mass Index
CD
Cluster of Differentiation
CDKN2A
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CLIA
chemiluminescent immunoassay
CTL
zytotoxische T-Zelle
CTLA-4
Cytotoxic T-lymphocyte Antigen – 4
DBP
Vitamin D binding protein
DKG
Deutsche Krebsgesellschaft
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EGFR
epidermal growth factor receptor
FACS®
Fluorescence activated cell sorting (Becton, Dickinson and Company; BD Biosciences)
FoxP3
Forkhead Box Preotein 3
GKU
Ganzkörperuntersuchung
HIV
Humanes Immundefizienz Virus
HLA
human leucocyte antigen
IL
Interleukin
INF
Interferon
IPEX
Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked
ITAM
immunoreceptor tyrosine activation motif
3
JÜR
Jahres-Überlebensrate
LDH
Laktatdehydrogenase
LK
Lymphknoten
LND
Lymphknotendissektion
LSF
Lichtschutzfaktor
MAA
Melanoma associated antigenes
MM
Malignes Melanom
MHC
Major histocompatibality complex
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NK
Natürliche Killerzelle
OR
Odds Ratio
PD1
programmed cell death receptor 1
RLU
Relative Lichteinheit
SE
Standardfehler
SLE
systemischer Lupus erythematodes
TCR
T-Zell Rezeptor
TGF
Tumor Growth Factor
TNF
Tumor Nekrose Faktor
Tregs
regulatorische T-Zellen
TRP1
Tyrosinase related protein 1
UV
Ultraviolette Strahlung
VDR
Vitamin D Rezeptor
WLKB
Wächterlymphknotenbiospie
4
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1
Superfiziell spreitendes Melanom
10
Abb. 2
Noduläres Melanom
10
Abb. 3
Lentigo Maligna Melanom
10
Abb. 4
Akrolentiginöses Melanom
11
Abb. 5
amelanotisches MM
11
Abb. 6
Auflichtmikroskopisches Bild eines MM
14
Abb. 7
Tumoreindringtiefe nach Breslow in mm und Clark-Level I-V
15
Abb. 8
Vertreter der D-Vitamine: von der Vorstufe (7-DHC), über das Vitamin D3 und dem
Calcidiol zur biologisch aktivem Form, dem Calcitriol (1,25(OH)-D3)
22
Abb. 9
Metabolismus, Regulation und Funktion des Vitamin D und seiner Derivate
24
Abb. 10
Vitamin D und Breslow-Dicke / Tumorstadien Die Säulendiagramme zeigen den inversen
Zusammenhang zwischen Vitamin-D-Versorgung (25OHD-Klassen: I = <20 ng/dl, II = 2030 ng/dl, III = >30 ng/dl) und der Tumordicke, sowie dem Stadium nach AJCC 2002
41
Abb. 11
Box-Whisker-Plot: nTregs zugeteilt zu den Stadien nach AJCC 2002. Die prozentuale
Anzahl der zirkulierenden nTregs war in fortgeschrittenen Stadien III und IV höher als in
den Stadien I und II (III vs. I und II, IV vs. I, P < 0,05)
44
Abb. 12
Scatterdiagramm mit Regressiongerade: signifikanter linearer Zusammenhang zwischen
CD4+CD39+ und CD4+CD25++CD127- Tregs
45
5
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1
Melanom-Subtypen und Häufigkeit (Garbe et al., 2005)
9
Tab. 2
T-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2009; Balch et al., 2001)
16
Tab. 3
N-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2001)
17
Tab. 4
M-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2001)
17
Tab. 5
AJCC-Stadien mit 10-JÜR (modifiziert nach Balch et al., 2009; Garbe et al., 2002; Balch
et al., 2001; Soong et al., 1998)
17
Tab. 6
Nachsorgeschema inkl. empfohlenen Untersuchungen (Quelle: S3-Leitlinie
AWMF/ADO/DKG 2012)
21
Tab. 7
stratifizierte Parameter, mittlere Vitamin D Messwerte und ihre Range, sowie die
Statistikergebnisse
39
Tab. 8
Die Parameter nTregs CD4+CD25++CD127-,Tumordicke, Ulceration und S100 als
unabhängige positive Prädiktoren des fortgeschrittenen Melanoms
43
6
1
Einleitung
Das Maligne Melanom (MM) hat in Europa mit ca. 15 Neuerkrankungen pro 100.000
Einwohner pro Jahr eine hohe Inzidenz mit weltweit weiter steigender Tendenz. Es ist ein
hochgradig aggressiv wachsender Tumor der pigmentproduzierenden Melanozyten, der zur
schnellen Metastasierung neigt. Obwohl es nur 4% aller Hautkrebserkrankungen ausmacht,
ist es für ca. 90% der Mortalität verantwortlich (Garbe et al., 2001). Dabei ist die Ätiologie
der Erkrankung weiterhin nicht ganz geklärt. Sowohl genetische Disposition, zahlreiche
melanozytäre Nävi am gesamten Körper, als auch vermehrte Sonnenexposition vor allem
in der Kindheit mit vielen Sonnenbränden werden diskutiert. Dafür spricht auch die hohe
Inzidenz bei Bevölkerungen mit hellen Hauttypen (Hauttypen I und II nach Fitzpatrick) in
Gebieten mit hoher, intermittierender Sonneneinstrahlung. Die UV-Exposition erklärt jedoch nicht abschließend, warum Melanome auch an nicht sonnenexponierten Stellen sowie
auf Schleimhäuten entstehen. Wie in Studien gezeigt wurde, könnte bei der Entstehung und
beim Verlauf des MM dem 25OH-Vitamin D eine entscheidende Rolle zukommen. Sowohl in vitro als auch in vivo Untersuchungen haben gezeigt, dass Vitamin D Proliferation,
Differenzierung und Apoptose von Zellen beeinflussen kann, immunmodulierend wirkt
und antitumoröses Potential besitzt (Lehmann et al., 2004; Adorini et al., 2003; Cordero et
al., 2002). Dies gilt für verschiedene Krebserkrankungen, wie Colon-, Mamma- oder Prostatakarzinome. Aber auch für das Maligne Melanom konnte gezeigt werden, dass eine gute
Versorgung mit 25OHD die Entstehung und den Verlauf des MM beeinflusst und eine Vitamin D - Defizienz oder -Insuffizienz mit höheren Stadien und geringerem Gesamtüberleben verknüpft ist (Newton-Bishop et al., 2009).
Des Weiteren tritt das Maligne Melanom auch häufiger bei Immunsuppression auf, wie
z.B. bei AIDS oder transplantierten Patienten, als bei immunkompetenten Personen (Kubica et al., 2012). Dass das Immunsystem eine wichtige Rolle beim MM spielt, zeigt alleine
die erfolgreiche Behandlung von höheren Tumorstadien mit Interferon, Interleukin 2 oder
Ipilimumab. Auf zellulärer Ebene könnten dabei auch Lymphozyten wie zytotoxische TZellen, natürliche Killerzellen (NK) und auch regulatorische T-Zellen (Tregs) wichtig sein.
Diese Arbeit soll in zwei Teilen die Bedeutung von Vitamin D und regulatorischen TZellen beim Malignen Melanom darstellen.
7
1.1
Das Maligne Melanom
1.1.1
Definition
Das MM ist ein von den Melanozyten, den pigmentbildenden Zellen, ausgehender, aggressiv wachsender Tumor, welcher sich größtenteils auf die Haut beschränkt, aber auch
Schleimhäute oder das Auge befallen kann. Es neigt dabei überaus schnell zur Metastasierung, weshalb es vor allem in fortgeschrittenen Stadien eine ungünstige Prognose besitzt
(Garbe et al., 2005).
1.1.2
Epidemiologie
Die Inzidenz des Melanoms zeigt eine weltweit steigende Tendenz. Vor allem betroffen
sind die hellhäutigen Bevölkerungen (Garbe et al., 2001; Armstrong and Kricker, 1994). In
Mitteleuropa erkranken pro Jahr etwa 10-12 pro 100.000 Einwohner neu. Neueste Zahlen
aus Deutschland vom Robert-Koch-Institut von 2007 bis 2008 zeigten sogar 18 bis 22
Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner pro Jahr, mit weiter steigenden Prognosen für
2012. Ältere Männer (60-85+) und jüngere Frauen (20-55) sind dabei tendenziell am häufigsten betroffen. Bei Männern liegt das MM an Platz 8 der häufigsten Malignome, bei
Frauen auf Rang 5 (Kaatsch et al., 2012). In den USA wird von etwa 12-25 Fällen, in Australien sogar von bis zu 60 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohnern berichtet (Garbe et
al., 2001). In Deutschland gibt es pro Jahr etwa 2500 Todesfälle, die auf stabilem Niveau
liegen (Kaatsch et al., 2012). Die Diskrepanz der weiter steigenden Inzidenzraten, aber
gleich bleibender Mortalität lässt sich durch die verbesserte Frühdiagnostik erklären. Es
werden zwar vermehrt MM diagnostiziert, diese aber in prognostisch sehr günstigen, frühen Stadien.
1.1.3
Ätiologie
Ein zentraler Faktor, an einem MM zu erkranken, nimmt chronisch hohe oder intermittierend starke UV-Belastung (Wiecker et al., 2003) ein. UV-Strahlung führt nicht nur zur
Pigmentierung der Haut als „Positiveffekt“, sondern schädigt durch oxidativen Stress (UVA) oder molekulare Änderungen (UV-B) die DNA und führt so zu Apoptose oder Mutationen in (Proto-) Onkogenen und Tumorsuppressorgenen. Vor allem in der Kindheit sind
Sonnenbrände unbedingt zu vermeiden, da diese einen Risikofaktor für später auftretende
Melanome darstellen (Dennis et al., 2008; Westerdahl et al., 1994). Darüber hinaus sind
besonders Personen mit zahlreichen Nävi oder Melanomvorstufen („dysplastische Nävi“)
8
gefährdet (Garbe et al., 1994; MacKie et al., 1989). Erbliche Disposition führt ebenfalls in
5-10% der Fälle zu Melanomentstehung (Greene et al., 1985). Es ist aber anzumerken, dass
nur etwa 20% aller Melanome aus bestehenden Nävi und 80% de novo auf vorher scheinbar gesunder Haut entstehen (Bauer and Garbe, 2003). Einige Phämomene zeigen beispielhaft die Bedeutung des Immunsystems bzw. immunologischer Faktoren bei der Entstehung
und Progression des Melanoms. Nennenswert sind hierbei einerseits Spontanremissionen
(Printz, 2001), andererseits die erfolgreiche Erkennung und Bekämpfung des Melanoms
durch das Immunsystem (Houghton et al., 2001; Boon et al., 1996). Bei Immunsuppression, wie z.B. einer HIV-Infektion, kommt es häufiger zur Entstehung von Malignomen, wie
dem MM, oder die Progredienz der Erkrankung ist erheblicher (Kubica et al., 2012; Qasmi
et al., 2010).
1.1.4
Klinik
Klinisch sowie histologisch lassen sich derzeitig fünf Subtypen des MM unterscheiden. Es
gibt aber auch Melanome, die sich nicht in diese Kategorien einteilen lassen (s. Tab.1)
Tab. 1: Melanom-Subtypen und Häufigkeit (Garbe et al., 2005)
Melanom - Subtyp
Superfiziell spreitendes Melanom
(SSM)
Noduläres Melanom
(NM)
Lentigo Maligna Melanom
(LMM)
Akral-lentiginöses Melanom
(ALM)
Unklassifizierbares Melanom
(UCM)
Sonstige
Häufigkeit
57,4 %
21,4 %
8,8 %
4,0 %
3,5 %
4,9 %
9
Das SSM zeigt initial eine intraepidermale, hauptsächlich horizontale
Ausbreitung, wächst dann invasiv und
flach erhaben. Charakteristisch ist das
asymmetrische Wachstum mit Ausziehungen.
In
späteren
Wachs-
tumsstadien können sich, wie hier,
neben farblicher Vielfalt und AufhelAbb. 1 Superfiziell spreitendes Melanom
lungen sekundär knotige Anteile entwickeln (Duncan, 2009; Garbe et al.,
2005).
Das NM wächst exophytisch mit knotigen Anteilen. Seine Farbe ist meist
schwarz-braun. Horizontales Wachstum fehlt oft. Häufig zeigen sich erosive Anteile (Duncan, 2009; Garbe et
al., 2005).
Abb. 2 Noduläres Melanom
Das LMM entsteht meist im späteren
Lebensalter im Gesichtsbereich aus
vorbestehenden Läsionen, die oft insitu-Karzinomen entsprechen. Dabei
dauert es meist viele Jahre, bis es zur
Ausbildung des LMM kommt (Duncan, 2009; Garbe et al., 2005).
Abb. 3 Lentigo Maligna Melanom
10
Das ALM findet sich meist palmo-plantar
an den Händen und Füßen, kann aber
auch als sub- oder periungualer Tumor
auffällig werden. Es zeigen sich unscharf
begrenzte
Pigmentierungen,
aber
es
kommen auch pigmentfreie Areale oder
Ulzerationen vor (Duncan, 2009; Garbe
Abb. 4 Akrolentiginöses Melanom
et al., 2005).
Das insgesamt sehr seltene amelanotische
Melanom wird oft sehr spät erkannt und
zeigt wenig typische Anzeichen eines
Melanoms. Es wird daher oft mit einem
BCC verwechselt oder aber gar nicht erkannt, bis der Patient mit Metastasierungen auffällig wird (Duncan, 2009; Garbe
Abb. 5 amelanotisches MM
et al., 2005).
Die mit Abstand am häufigsten auftretenden histologischen Subtypen des Melanoms stellen mit knapp 80% das SSM und das NM dar (Garbe et al., 2005), wobei das SSM mit etwa 58% der Fälle weitaus öfter auftritt. Danach folgen die selteneren LMM (8,8%), das
ALM (4,0%) und die UCM (3,5%). Etwa 5% aller Melanome stellen dann die amelanotischen und nicht-kutanen MM dar – z.B. die der Aderhaut des Auges oder Schleimhautmelanome wie der Mund- oder Nasenschleimhaut oder auch an intestinalen Schleimhäuten.
Allgemein tritt das MM bei Frauen dabei am häufigsten an den Unterschenkeln auf (etwa
45%), danach folgt der Rumpf (etwa 25%). Der Rest entfällt auf die anderen Körperpartien. Bei Männern steht dagegen der Befall des Rumpfes, insbesondere des Rückens, im
Vordergrund (etwa 35%), während die restlichen Körperpartien zu gleichen Teilen betroffen sind (Lehnert et al., 2005). Als möglicher Grund sei hier zum Beispiel die unterschiedliche Kleidungsgewohnheit der Geschlechter zu erwähnen.
11
1.1.5
Genetik
Zu einem nicht geringen Anteil bei metastasierten Melanomen kommen Mutationen in den
Protoonkogenen c-Kit und BRAF vor, die eine entscheidende Rolle bei Zellteilung, Differenzierung, sowie Wachstum inne haben. Aktuelle Studien gehen davon aus, dass bis zu
50% aller Melanompatienen eine BRAF-Mutation vorweisen (Amanuel et al., 2012). Eine
BRAF-Mutation führt in den meisten Fällen durch Basentausch von Thymin zu Adenin bei
Nukleotid 1799 zum Austausch einer Aminosäure (Tan et al., 2008). Die am häufigsten
vorkommenden Mutationen zeigen den Austausch von Valin durch Glutamat beim Codon
600 (sog. „V600E“). Desweiteren sind der Austausch durch Lysin („V600K“) und Arginin
(„V600R“) bekannt (Willmore-Payne et al., 2005). Neben dem vermehrten Auftreten beim
MM (Maldonado et al., 2003), kommt eine BRAF-Mutation auch bei kolorektalen Karzinomen (Li et al., 2006), papillären Schilddrüsenkarzinomen (Puxxedu et al., 2004) und den
nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (Huang and Wu, 2012) vor.
Eine Mutation im KIT-Gen führt zur Überexpression des c-kit (oder auch CD117), einer
Rezeptor-Tyrosinkinase. Eine Aktivierung des Rezeptors bewirkt durch Phosphoryllierungen den Anstoß von Signaltransduktionswegen. Diese wiederum spielen eine wichtige Rolle bei der Angiogenese und Proliferation von Geweben, sowie der Pigmentierung der Haut
(Edling and Hallberg, 2007). Dies zieht, wie bei BRAF, vor allem einen Progress des MM
in Form eines Rezidivs, einer Metastasierung oder neue MM nach sich (Carvajal et al.,
2011). Eine aktuelle Studie von Bourillon et al. zeigt sogar, dass eine c-kit-Mutation nicht
erst im Verlaufe der Erkrankung auftreten kann, sondern auch, gerade bei familiär gehäuftem Auftreten des MM, eine Prädisposition darstellen könnte.
Bezüglich einer familiären Vorbelastung ist zusätzlich eine Mutation im Cyclin-dependent
kinase inhibitor 2A (CDKN2A oder auch p16)-Gen zu nennen (Nobori et al., 1994). Als
Tumor-Suppressor-Gen, ähnlich zu p53, reguliert es den Zellzyklus und verhindert ungehemmtes Wachstum (Stone et al., 1995). Patienten mit einer Mutation im Sinne eines
Funktionsverlustes von p16 scheinen etwa 15 Jahre früher MM zu entwickeln als vergleichbare Gruppen ohne diese Mutation. Die 5-Jahres-Inzidenz liegt bei etwa 23%, während sie bei der Vergleichsgruppe bei 2% liegt. Ebenfalls kommt es häufiger zu Zweitmelanomen (van der Rhee et al., 2011).
12
1.1.6
Stadieneinteilung und Prognose
Der wichtigste Faktor zu einer guten Prognose ist weiterhin die Früherkennung des Melanoms. Wichtig ist hierbei die Schulung der Menschen und Sensibilisierung gegenüber den
zentralen Kriterien. Da 80% aller Melanome SSM oder NM darstellen, lassen sich die
meisten Pigmentveränderungen der Haut mittels der ABCD(E)-Regel gut von einem beginnenden MM abgrenzen (Rigel et al., 2010; Nachbar et al., 1994). Studien zufolge liegen
die Genauigkeiten bei etwa 85% (Isasi et al., 2011).
Die Regel besagt im Einzelnen:
A = Asymmetrie:
Ausziehungen oder unregelmäßig geformte Flecken
B= Begrenzung:
Unscharfe Abgrenzung zur unpigmentierten Haut
C = Colorit:
Mehrfarbigkeit, blasse und sehr dunkle Partien nebeneinander
D = Durchmesser:
Nävi größer als 5mm
E = Elevation
Exophytisches Wachstum
Ist ein Nävus aufgrund dieser Kriterien auffällig, sollte eine Dermatoskopie folgen, um ihn
näher u.a. nach o.g. Kriterien zu betrachten (Stolz et al., 1994), aber auch um nach Melanom-spezifischen dermatoskopischen Veränderungen zu fahnden: Pseudopodien, radial
streaming, grau-blaue Areale oder irreguläre Pigmentnetzwerkstrukturen (s. Abb. 6) (Menzies et al., 1996; Soyer et al., 1995). Dies macht einerseits eine exaktere Betrachtung mit
einer Steigerung der Sensitivität und Spezifität im Vergleich zum Blickbefund möglich
(Vestergaard et al., 2008; Kittler et al., 2002), andererseits kann man dadurch auch die Anzahl unnötig exzidierter Nävi senken (Herschorn, 2012).
13
Abb. 6 Auflichtmikroskopisches Bild eines MM
deutlich zu erkennen sind das radial streaming und die Pseudopodien im Randbereich des
MM, sowie grau-blauen Areale innerhalb der Läsion
Die wichtigsten zu nennenden Prognosekriterien stellen dar (Garbe et al., 2002; Garbe et
al., 1995):
- Tumoreindringtiefe nach Breslow in der Histologie:
< 1,0 mm: 88 - 95 % 10-Jahres-Überlebensrate; 1,01 – 2,0 mm: ca. 79 - 84 % 10JÜR; 2,01 - 4,0 mm ca. 64 - 73 % 10-JÜR; > 4,0 mm: ca. 52 - 54% 10-JÜR - und
das Invasionslevel nach Clark (s. Abb.7)
- Ausschluss / Bestätigung einer histologisch erkennbaren Ulceration (das Vorhandensein einer Ulceration führt zu einer Aufstufung in der Stadieneinteilung nach
AJCC 2002) oder der Nachweis einer Mitoserate >1 / mm³ (Balch et al., 2009)
- Ausschluss / Bestätigung einer Mikrometastasierung des lokoregionären Lymphablussgebietes mittels Sentinel-Lymphknotenbiopsie
- der histologische Subtyp des Melanoms (günstiger für SSM, ungünstiger für NM
und ALM)
- die Tumorlokalisation (ungünstiger für behaarten Kopf, Hals, Oberarme, oberer
Rumpf)
- das Geschlecht (ungünstiger für Männer)
14
Abb. 7 Tumoreindringtiefe nach Breslow in mm und Clark-Level I-V
modifiziert nach: New Zealand Melanoma Unit - Pathologie
Aufgrund dieser Kriterien und den zusätzlichen Angaben zum Staging (Lymphknotenbefall, Fernmetastasierung) wurde vom American Joint Center on Cancer (AJCC) 2002 eine
TNM-Klassifikation für das MM mit Prognoseangaben für die 10-JÜR erstellt, die auch in
entsprechende Stadien gegliedert und zuletzt 2009 aktualisiert wurde (Balch et al., 2009;
Balch et al., 2001).
Liegt die 10-JÜR bei geringen Stadien und dünnen Primärtumoren noch bei etwa 88 –
95%, so sinkt diese schon bei vorhandenen Lymphknotenmetastasen auf 20 – 55%. Sind
schon Fernmetastasen aufgetreten beträgt die Überlebenszeit je nach befallenem Organ
noch zwischen 6 und 9 Monaten bei insgesamt nur 5% 5-JÜR (Balch et al., 2001; Soong et
al., 1998).
Zunächst liegt der Stadieneinteilung die histologische Beurteilung zugrunde. Wichtig sind
im Präparat die Eindringtiefe nach Breslow, das Tumorlevel nach Clark, Beurteilung einer
möglichen Ulceration oder Regression, die Mitoserate in der Epidermis, der Subtyp des
Melanoms, mögliche Einbrüche in Blut-, oder Lymphgefäße und Nerven und eine mögli15
che Mikrofilialisierung im Präparat. Die Metastasierung erfolgt beim MM sowohl hämatogen als auch lymphogen, wobei in ca 70% der Fälle zunächst Lymphknotenmetastasen
auftreten. Unterschieden werden muss zwischen lokalen Rezidiven (durch unzureichenden
Sicherheitsabstand bei der Exzision), Satellitenmetastasen (bis 2cm um den Primarius) und
in-transit-Metastasen, die sich entlang der Lymphgefäße zeigen können.
Ein Staging kann allgemein bei jeder Tumordicke durchgeführt werden, sollte aber ab einer Breslow-Dicke von 1 mm erfolgen oder auch bei Tumoren > 0,75 mm, falls zusätzlich
eine Ulceration oder gesteigerte Mitoserate vorliegt (S3-Leitlinie Malignes Melanom,
AWMF, ADO, DKG, 2013). Das Staging umfasst dann mindestens eine Wächterlymphknotenbiopsie (WLKB) und eine Sonographie der lokoregionären Lymphknoten. Bei fortgeschrittenen T-Stadien empfehlen sich zusätzlich eine Computertomographie oder MRTAufnahmen von Thorax, Abdomen und Schädel. Über eine Abnahme des Tumormarkers
S100 kann jederzeit nachgedacht werden (Garbe et al., 2005).
Zusammengefasst setzt sich also die Stadieneinteilung aus der Tumordicke inkl. Beurteilung einer Ulceration (pT) oder einer gesteigerten Mitoserate (>1 / mm³), nachgewiesenen
Lymphknotenmetastasen (N) und möglichen Fernmetastasen (M) zusammen:
Tab. 2 T-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2009; Balch et al., 2001)
T-Klassifikation
Tis
Tx
T1
Tumordicke
in situ Karzinom
nicht bestimmbar
≤ 1,0 mm
T2
1,01 – 2,0 mm
T3
2,01 – 4,0 mm
T4
> 4,0mm
Zusätze
a: ohne Ulceration
b: mit Ulceration oder
Mitoserate >1/mm³
a: ohne Ulceration
b: mit Ulceration
a: ohne Ulceration
b: mit Ulceration
a: ohne Ulceration
b: mit Ulceration
16
Tab. 3 N-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2001)
N-Klassifikation
N1
Zahl befallener Lymphknoten
1
N2
2-3
N3
≥4, Satelliten-, oder intransit-Metastasen plus
Lymphknotenbefall
Zusätze
a: Mikrometastase
b: Makrometastase
a: Mikrometastasen
b: Makrometastasen
c: Satelliten-, oder intransit-Metastasen
Tab. 4 M-Klassifikation beim MM (Balch et al., 2001)
M-Klassifikation
M1a
Art der Fernmetastase
Haut, Subkutis, Lymphknoten
LDH
normal
M1b
Lunge
normal
M1c
alle weiteren Organmetastasen
normal
jede Fernmetastase
erhöht
Tab. 5 AJCC-Stadien mit 10-JÜR (modifiziert nach Balch et al., 2009; Garbe et al.,
2002; Balch et al., 2001; Soong et al., 1998)
Stadium
0
Ia
Ib
IIa
IIb
IIc
IIIa
IIIb
T
Tis
T1a
T1b, T2a
T2b, T3a
T3b, T4a
T4b
jedes T a
jedes T b
N
N1a, N2a
N1a, N2a
M
-
10-JÜR
100%
88%
79-83%
64%
51-54%
32%
57-63%
36-38%
jedes T a
N1b, N2b
-
39-48%
IIIc
jedes T
jedes T b
N2c
N1b, N2b
-
15-24%
IV
jedes T
jedes T
N3
jedes N
M1a
18%
16%
M1b
3%
M1c
6%
17
1.1.7
Therapie
Beim MM ist der erste Schritt der genauen Diagnostik gleichzeitig der wichtigste der Therapie – die Exzision. Wird bei einem Melanom-Verdacht eine Exzision erwogen, so wird
ein Sicherheitsabstand von etwa 2mm und eine Exzisionstiefe bis zum Fettgewebe empfohlen (Tran et al., 2008). Nach Begutachtung der Histologie und einer möglichen Bestätigung des MM, wird als kurative Maßnahme eine Nachexzision durchgeführt, deren definitiver Sicherheitsabstand von der Tumordicke nach Breslow abhängt. Liegt ein in-situKarzinom vor, so wird derzeit eine Nachexzision mit seitlichem Sicherheitsabstand von 5
mm durchgeführt. Bei pT1 und pT2 wird mit einem 1cm großem, bei pT3 und pT4 Tumoren mit einem 2cm großem Sicherheitsabstand nachexzidiert. Größere Sicherheitsabstände
haben in kontrollierten Studien keinen Vorteil gegenüber den hier empfohlenen gezeigt
(Sladden et al., 2011). Ausnahmen stellen dabei das LMM oder ALM dar: mithilfe mikrographisch kontrollierter Chirurgie ist hier ein geringerer Sicherheitsabstand möglich, um
größere Narben und Entstellungen im Gesicht, sowie Amputationen von Zehen oder Fingerteilen zu vermeiden, ohne eine größere Mortalität in Kauf nehmen zu müssen (Lichte et
al., 2009; Moehrle et al., 2006; Moehrle et al., 2003). In den meisten Fällen ist eine Defektheilung mittels Hautnaht möglich, bei größeren Exzisionen oder schwierigen Körperpartien kommen auch Lappenplastiken oder sehr selten Spalt-, oder Vollhautransplantate
infrage (Kaufmann, 2000).
Wie schon oben erwähnt, sollte ab einer Melanomdicke von >1 mm oder bei Vorliegen
einer zusätzlichen Ulceration, einer Mitoserate >1 / mm³ oder bei jüngeren Patienten schon
bei dünneren Melanomen ab 0,75 mm Tumordicke eine Wächterlymphknotenbiopsie
(WLKB) erfolgen. Zunächst gilt diese Untersuchung als Stagingmaßnahme. Nur bei positivem WLK-Befall wird empfohlen, eine radikale Lymphknotendissektion (LND) durchzuführen. Eine prophylaktische LND ohne Hinweis auf eine Lymphknotenmetastasierung
bringt keinen Vorteil gegenüber der therapeutischen und ist daher obsolet (Lens et al.,
2002). Sollten nach einer LND in der pathologischen Untersuchung ein Kapseldurchbruch,
mehr als 3 befallene Lymphknoten oder Makrometastasen über 3cm Größe auffallen, so
kann über eine adjuvante Strahlentherapie nachgedacht werden (Burmeister et al., 2012).
Adjuvante Chemotherapien, z.B. mit Dacarbacin (DTIC) oder Vindesine haben in Studien
keinen Vorteil im rezidivfreien oder Gesamtüberleben gezeigt (Eigentler et al., 2008; Hill
et al., 1981)
Der adjuvante Einsatz von (pegyliertem) Interferon alpha ([peg]INFα) kann individuell mit
Patienten ab einem Tumorstadium IIb besprochen werden. INFα wirkt antiproliferativ an
den Tumorzellen selbst und aktiviert Natürliche Killerzellen (NK) im Kampf gegen die
18
Melanomzellen. Die Wahl einer Niedrig- oder Hochdosistherapie sollte in Abwägung mit
dem Nebenwirkungsprofil (Fieber, Müdigkeit, Depression) und dem Tumorstadium mit
dem Patienten abgesprochen werden. In Studien konnte gezeigt werden, dass eine INFαTherapie das rezidiv-, und/oder progressionsfreie Überleben steigert. Für das Gesamtüberleben konnte dies bislang nicht eindeutig gezeigt werden (Eggermont, 2012; di Trolio et
al., 2012).
In den Stadien IIIb und IIIc, also bei lokoregionären, also Satelliten-, oder in-transitMetastasen, sollte, soweit möglich, operativ mit kurativem Ansatz eine komplette Resektion (R0) erfolgen. Übersteigt die Anzahl jedoch 5-10 solitäre Metastasen, ist eine rein operative Resektion schwierig. In diesen Fällen kann z.B. eine lokale Radiotherapie angewendet werden (Overgaard et al., 2009). Desweiteren kann man bei diesen Patienten auch Behandlungen mit topischen Medikamenten, wie Imiquimod den Kontaktallergenen Dinitrochlorobenzol (DNCB) oder Diphencyprone (DPC), oder intratumorale Injektionen mit Interleukin 2 (IL-2) in Betracht ziehen (Boyd et al., 2012; Schadendorf et al., 2012; Nida and
Quirk, 2003). Schon in diesen Stadien der sog. Hochrisikopatienten sollte auf Mutationen
von Onkogenen getestet werden. Am bedeutendsten sind hier die BRAF-Mutation mit ca.
50% Mutationsrate in allen MM und die c-kit-Mutation, die etwa 5% Mutationsrate aller
ALM und Schleimhautmelanome aufweist (Carvajal et al., 2011; Guo et al., 2011; Goel et
al., 2006).
Bei Patienten mit metastasiertem MM (Stadium IV) haben die Therapieschemata allenfalls
palliativen Charakter. Sollten R0-Resektionen der Metastasen ohne erheblichen Funktionsverlust möglich sein, kann eine Metastasekomie angezeigt sein. Liegen entsprechende Mutationen (s.o) vor, so sollte eine Therapie mit einem BRAF-, oder c-kit-Inhibitor durchgeführt werden. Bei BRAF-Mutationen werden erfolgreich Vemurafenib oder Dabrafenib
eingesetzt (Patrawala and Puzanov, 2012; Young et al., 2012; Chapman et al., 2011), bei ckit-Mutationen kann Imatinib zum Einsatz kommen (Brown and Casasola, 2012; Carvajal
et al., 2011). Neueste Studien gehen derzeit zusätzlich in die Richtung der Kombinationstherapien. Hier sei u.a eine Kombination des BRAF-Inhibitors Dabrafenib mit dem MEKInhibitor Trametenib zu erwähnen (Flaherty et al., 2012). Der MEK-Inhibitor Trametenib
greift in den mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signalweg ein, der bei vielen Tumoren, wie auch dem MM, überaktiviert ist, indem es die Enzyme MEK1 und MEK2
hemmt und dadurch zu einem geringeren Tumorwachstum beiträgt.
Eine weitere Option im späten Stadium der Erkrankung mit geringer Tumorlast scheint
eine Immuntherapie mit Ipilimumab darzustellen. Ipilimumab ist ein spezifischer Antikörper gegen das zytotoxische T-Lymphozyten Antigen (CTLA-4). Dieses reguliert T-Zellen
19
in ihrer Immunantwort herab. Wird es durch Ipilimumab geblockt, so tritt eine verstärkte
Antitumorreaktion durch T-Zellen gegen das Melanom auf. Eine Therapie mit diesem monoklonalen Antikörper bewirkt eine Verlängerung des Gesamtüberlebens (Robert and Mateus, 2011; Hodi et al., 2010). Eine Phase II-Studie untersucht momentan eine Kombinationstherapie mit dem Granulozyten-stimulierenden Faktor GM-CSF, welches zu synergistischen Effekten führen soll (Hodi, 2013). Ein weiterer Ansatz, aktivierte T-Zellen vor ihrer
Herabregulierung zu schützen, ist eine medikamentöse Blockade des programmed cell
death 1 (PD1)-Rezeptors, der ähnliche Wirkungen vermittelt wie CTLA-4. Ein jüngst vorgestellter und in Studien untersuchter Antikörper gegen PD1 ist z.B. Nivolumab (Lipson,
2013). Während eine Monotherapie sich schon als wirksam hat, scheint eine Kombination
mit Ipilimumab ebenfalls gute Therapieergebnisse zu erzielen (Wolchok et al., 2013).
Die palliative Mono- oder Polychemotherapie ist eine weitere Möglichkeit, das Gesamtüberleben leicht zu steigern. Als Monochemotherapie werden Dacarbacin, Fotemustin oder
Temozolamid eingesetzt, wobei der Einsatz von Dacarbacin (DTIC) momentan als Goldstandard zu werten ist. Bei der Polychemotherapie kommen einige verschiedene Therapieschemata zum Einsatz, die natürlich auch entsprechende allgemeine Nebenwirkungen
von Chemotherapien zeigen. Ein häufig verwendetes Schema ist heute CarboTaxel (Carboplatin + Paclitaxel), das in neuesten Studien die besten Ergebnisse im Hinblick auf das
Gesamtüberleben erzielte (Hauschild et al., 2009). Außerdem besteht vor allem bei Knochenmetastasen zusätzlich die Möglichkeit der Strahlentherapie und Gabe von Bisphosphonaten.
20
1.1.8
Nachsorge
Allgemein wird eine Nachsorge von 10 Jahren empfohlen. Die meisten Rezidive oder Metastasen treten in den ersten drei Jahren nach Erstdiagnose auf (bis 80%), weshalb hier die
Intervalle zwischen den Untersuchungen eng gehalten werden – vor allem in höheren Tumorstadien (Francken et al., 2007). Je nach Stadium werden auch unterschiedliche Verfahren der Nachsorge angewendet – von Ganzkörperuntersuchung (GKU) und Lymphknotensonographie, über Blutentnahme und Messung des Tumormarkers S-100, bis hin zu
Schnittbildverfahren. Tabelle 6 zeigt exemplarisch das zur Zeit empfohlene Nachsorgeschema:
Tab. 6 Nachsorgeschema inkl. empfohlenen Untersuchungen
mit den Untersuchungsintervallen in Monaten (nach: S3-Leitlinie AWMF/ADO/DKG 2013)
Jahr
1-3
St. IA
St. IB-IIB
St. IIC-IV
6
3
3
GKU
4+5 6-10
12
6
3
12
6/12
6
LK-Sonographie
1-3 4+5 6-10
6
3
6
1-3
3
3
S-100
4+5 6-10
6
Bildgebung
1-3 4+5 6-10
6
21
1.2
Vitamin D
1.2.1
Kurzer Ausflug in die Chemie
Das Vitamin D3 (Cholecalciferol) gehört chemisch zu den Secosteroiden, einer Untergruppe der Steroide, und wird grob eingeordnet bei den fettlöslichen Vitaminen. Chemisch ähnelt es dem Cholesterin, aus dem auch eine Vorstufe des Vitamin D3, das 7Dehydrocholesterol, entsteht. Die biologisch aktive Form des Vitamin D, das Calcitriol,
und seine Vorstufe, das Calcidiol, werden heute als Hormone bezeichnet, da sie vom Körper unter ständiger endokriner Kontrolle selbst synthetisiert werden können, über den Bluttransport zu Zielzellen gelangen und dort durch Änderung der Transkription ihre Funktion
ausüben. Abbildung 8 zeigt die chemischen Formeln der wichtigsten Vertreter.
Abb. 8 Vertreter der D-Vitamine: von der Vorstufe (7-DHC), über das Vitamin D3
und dem Calcidiol zur biologisch aktivem Form, dem Calcitriol (1,25(OH)-D3)
modifiziert nach: The Medical Biochemistry Page, Bilder online verfügbar unter:
http://themedicalbiochemistrypage.org/vitamins
22
1.2.2
Synthetisierung und Transport
Dem Körper stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung an Vitamin D3 zu gelangen: einerseits über den Darm nach entsprechender Nahrungsaufnahme, andererseits besteht die
Möglichkeit, dass in der Haut aus einer Vorstufe Vitamin D3 synthetisiert wird (Bikle and
Pillai, 1993).
In der Haut, nämlich im Stratum basale und im Stratum spinosum, befindet sich das 7Dehydrocholesterol (7-DHC). Dieses wird seinerseits in der Leber durch die Cholesteroldehydrogenase aus Cholesterin hergestellt und danach an Transportproteine gebunden im
Blut zu den Keratinozyten transportiert. Aus dem 7-DHC wird durch UV-B-Strahlung das
Prävitamin D3: die Photoenergie führt zur Brechung der Bindung der Kohlenstoffatome 9
und 10 im B-Ring des 7-DHC (Holick, 1981; Holick et al., 1980; Esvelt et al., 1978). Unter
dem Einfluss der Hauttemperatur kommt es schließlich durch Verschiebung der Doppelbindung zur Isomerisierung des Prävitamin-D3 zum Cholecalciferol (Vitamin D3). Bei
diesem Schritt gibt es den limitierenden Faktor der Ausfuhr des Vitamin D3: es kann nur
so viel Cholecalciferol nachgebildet werden, wie aus den Keratinozyten heraus transportiert wird. Damit das Prävitamin D3 keine toxischen Konzentrationen erreicht, kann es
durch weitere UV-B-Strahlung zu den inaktiven Tachysterol und Lumisterol isomerisiert
werden (Holick et al., 1987). Cholecalciferol wird dann, nach Transport durch die Darmzelle oder nach Synthetisierung in der Haut, an das Vitamin-D-bindende-Protein (DBP)
gebunden und durch die Blutbahn befördert. Die DBP sind alpha-Globuline, die in hoher
Zahl im Serum vorhanden sind und in der Leber hergestellt werden (Coppenhaver et al.,
1981; Bouillon et al., 1978; Imawari et al., 1976). Über den Blutweg gelangt das an das
DBP gebundene Cholecalciferol nun in die Leber, in der der erste Schritt der Metabolisierung in die aktive Form abläuft: in den Hepatozyten wird es durch die 25-Hydroxylase am
Kohlenstoffatom 25 hydroxyliert und wird so zum 25(OH)-Vitamin-D3, dem Calcidiol
(Dueland et al., 1981). Nach einem weiteren Transport über die Blutbahn zu den Nieren
geschieht hier der endgültige Schritt zum hormonell aktiven Calcitriol. Die in den Nierenzellen vorhandene 1α-Hydroxlase hydroxyliert das Calcidiol am Kohlenstoffatom 1 (Stanbury, 1981). Als Regulationmechanismen fungieren hierbei die Parathormon-, Calciumund Phosphat-Konzentration, sowie die Konzentration des Calcitriols selber, damit keine
übermäßige Produktion des 1,25(OH)-Vitamin-D geschieht (Willvonseder, 1983; Birge et
al., 1981).
23
Abb. 9 Metabolismus, Regulation und Funktion des Vitamin D und seiner Derivate
modifiziert nach: Deeb, Kristin K., Trump, Donald L., Johnson, Candace S. (2007). Vitamin D signalling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics. Nature Reviews
Cancer 7 (9), 684-700
1.2.3
Extrarenale Synthetisierung von Calcitriol
In den letzten Jahren gelang zunehmend der Nachweis, dass nicht nur auf dem „normalen“
Weg über Leber und Niere die biologisch aktive Form des Vitamin D3 metabolisiert wird,
sondern auch manche Gewebe durch Vorhandensein einer 1α-Hydroxlase in der Lage sind,
Calcitriol zu synthetisieren. Die systemische Wirkung dabei ist dabei jedoch eher zu vernachlässigen, weshalb man davon ausgeht, dass die lokale Herstellung von Calcitriol eher
dem eigenen Gewebe als auto-, bzw. parakrine Hormonwirkung zu Gute kommt. Zu diesen
Organen oder Zellen gehören nach aktuellem Kenntnisstand Prostata, Colon, Brust, βZellen des Pankreas und Monozyten (Hewison et al., 2004). Insbesondere für die Haut
wurde dies auch in in-vitro-Studien, sowie in in-vivo-Untersuchungen gezeigt (Lehmann et
al., 2003; Lehmann et al., 2001).
24
1.2.4
Wirkweise des Calcitriols
Nachdem das Calcitriol zu den Zielzellen gelangt ist, diffundiert es durch die Zellwand und
wird dann an den Vitamin-D-Rezeptor (VDR) gebunden. Der VDR ist ein Hormonrezeptor, der Calcitriol mit hoher Affinität bindet, und seine Wirkung hauptsächlich über Bindung an DNA-Abschnitte und damit der Transkription bestimmter Gene entfaltet. Neben
den klassischen Zielgeweben des Vitamin D (Knochen, Niere, Darm), wurde auch in anderen Organen und Zellen der VDR gefunden – u.a. Haut, Brust, Gehirn, Muskeln und auch
in Immunzellen, wie Monozyten oder B-und T-Lymphozyten (Reichel and Norman, 1989;
Minghetti and Norman, 1988).
1.2.5
Wirkungen in den „klassischen“ Zielgeweben
Zu den „klassischen“ Zielgeweben von Calcitriol gehören insbesondere der (Dünn-)Darm
und die Nieren. In ihnen wurde der VDR in größeren Mengen vorliegend entdeckt und
seine Wirkungen nachvollzogen (Haussler, 1986). Der weitläufig bekannteste Effekt der
D-Vitamine ist die Calcium-Bereitstellung. Hauptsächlich geschieht dies durch vermehrte
Resorption im Darm oder durch das ausgewogene Zusammenspiel von Sekretion und
Rückresorption in den Nierentubuli (Fleet and Joch, 2010; Friedman and Gesek, 1995).
Beim Menschen liegt der Serum-Calcium-Spiegel bei etwa 2,5 mmol/l, davon etwa 4550% ionisiert. Es spielt dann vor allem beim Knochenstoffwechsel eine große Rolle. Der
Knochen ist einerseits in der Lage, das bereitgestellte Calcium für die Neumineralisation
zu gebrauchen, andererseits kann der Knochen dem Körper durch die abbauende Wirkung
der Osteoklasten Calcium für den Gesamtstoffwechsel bereitstellen. Dass letztendlich auch
Vitamin D selbst einen direkten Effekt auf den Knochenstoffwechsel hat und nicht nur
indirekt über die Bereitstellung von Calcium wirkt, zeigt das Vorhandensein einer 1αReduktase in Osteoklasten, –blasten und –zyten und die damit einhergehende Möglichkeit
der auto- und parakrinen Versorgung des Knochens (Morris et al., 2010).
1.2.6
Wirkungen in der Haut und auf Immunzellen
Zusätzlich zu den bekannten Syntheseorten des Calcitriols, ist man nach und nach dazu
gekommen, in den Keratinozyten eine 1α-, sowie eine 25-Hydroxylase nachzuweisen (Bikle and Daniel, 2011; Bikle et al., 1986). Daher sind die Keratinozyten prinzipiell in der
Lage, autonom Calcitriol herzustellen. Da Matsumoto et al. zeigen konnten, dass das über
den „klassischen“ Syntheseweg hergestellte Calcitriol nicht ausreicht, um in der Haut Vi25
tamin D-induzierte Gene zu aktivieren (Matsumoto et al., 1991), ist dies auch eine wichtige
Erkenntnis: In folgenden in-vitro Untersuchungen zeigten Keratinozyten die Fähigkeit,
eine große Menge Calcitriol zu synthetisieren. Jedoch scheint diese Möglichkeit eher für
auto- und parakrine Zwecke in den Keratinozyten selbst, als für die systemische Vitamin
D-Versorgung genutzt zu werden, da in diesen und nachfolgenden Studien nicht gezeigt
werden konnte, dass das Serum-Calcitriol signifikant dadurch ansteigt (Bikle et al., 1994).
Da die Keratinozyten über einen VDR-Rezeptor verfügen und einige Gene besitzen, die
Calcitriol-vermittelt aktiviert werden, kann Vitamin D in den Hautzellen zu Zelldifferenzierung, Apoptose und Wachstum beitragen (Lehmann et al., 2004; Regnier and Darmon,
1991; Smith et al., 1986). Wie genau diese Mechanismen funktioneren, ist bis dato nicht
geklärt. Vermutet wird allerdings eine genomische Beteiligung, da bei Psoriatikern, welche
mit topischen Vitamin-D-Analoga behandelt wurden und darauf eine enorme Besserung
der Symptomatik zeigten, eine erhöhte VDR-mRNA in den Keratinozyten nachgewiesen
werden konnte (Chen et al., 1996). Speziell auf Tumorzellen bezogen, die eine Überexpression des Tumor Growth Factors (TGF) und/oder des Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) aufweisen, konnte ein deutlich hemmender Einfluss des Vitamin D nachgewiesen werden (Cordero et al., 2002). Dadurch lässt sich auch die Wirkung von topischen
Vitamin D-Analoga auf die Psoriasis erklären, da psoriatische Keratinozyten TGF-α stark
vermehrt synthetisieren.
Interessant dürften die Forschungen hinsichtlich immunmodulatorischer Effekte des Vitamin D sein. Zum Beispiel konnten Adorini et al. zeigen, dass Vitamin D zur Hemmung der
T-Zell Aktivierung führt und in bestimmten Situationen die Proliferation von CD4+CD25++
regulatorischen T-Zellen (Tregs) fördert (Adorini et al., 2003). Desweiteren zeigten dendritische Zellen nach Gabe von Calcitriol durch Hemmung ihrer Ausreifung vermehrt eine
Toleranzentwicklung gegenüber gebotenen Antigenen (Griffin et al., 2001). Dies belegt
auch die positive Wirkung des Vitamin D auf verschiedene Autoimmunerkrankungen, wie
zum Beispiel Multiple Sklerose (Cantorna et al., 1996), rheumatoide Arthritis (Cantorna et
al., 1998), Diabetes mellitus Typ I (Gregori et al., 2002) oder auch dem systemischen Lupus erythematodes (SLE) (Amital et al., 2010). So konnte auch gezeigt werden, dass Patienten mit atopischer Dermatitis signifikant weniger Vitamin D zu sich nahmen bzw. geringere Serumwerte aufwiesen (Solvoll et al., 2000).
26
1.2.7
Einflüsse auf die Vitamin D Versorgung
Abgesehen von alimentärem Mangel, also dem dietätischen Fehlen oder der Minderversorgung von fetthaltigen Vitaminen, gibt es eine Reihe exogener und endogener Einflüsse auf
die Höhe des Vitamin D Spiegels.
Zum einen seien hier die UV-Strahlung an sich und ihre saisonalen Unterschiede erwähnt.
Wie in Studien gezeigt wurde, hängt die exogene Vitamin D Produktion durch die UV Bestrahlung der Keratinozyten von der geographischen Breite des Aufenthaltsortes und von
seinen klimatischen Bedingungen ab. So ist die Calcitriol-Versorgung bei hellhäutigen
Personen optimaler, je besser das Wetter ist und je näher der Ort in Richtung des Äquators
liegt. Gerade die jahreszeitlichen Einflüsse auf die Sonneneinstrahlung machen hier einen
enormen Unterschied. Je näher man zu den Polarkreisen kommt, desto mehr machen sich
diese jahreszeitlichen Unterschiede bemerkbar: liegen manche Vitamin D Werte in den
Sommermonaten noch im meist normalen bis niedrig-normalen Bereich, so erreichen die
Werte in den Wintermonaten teilweise nicht einmal die untere Bestimmungsgrenze und
liegen oft im defizienten Bereich (Hintzpeter et al., 2008; Engelsen et al., 2005; Holick,
1995). Nach diesen Daten sei es also für die Keratinozyten nicht möglich
- oberhalb des 52. Breitengrades (z.B. Düsseldorf/Berlin) über 6 Monate von Oktober bis März
- oberhalb des 42. Breitengrades (z.B. Rom/Barcelona) über 4 Monate von November bis Februar
genügend Vitamin D zu synthetisieren. Erst ab dem 37. Breitengrad und südlicher (z.B.
Los Angeles/Sizilien) sei dies auch in den Wintermonaten gegeben.
Als zweiter Punkt sei der Pigmentierungsgrad, also der Hauttyp erwähnt. Einerseits schützt
das in die Keratinozyten eingelagerte Melanin vor der DNA-schädlichen UV-Strahlung,
andererseits verhindert es so aber auch die Effektivität der Isomerisierung der Vorstufen
des Calcitriols. So benötigt ein dunkelhäutiger bei gleicher Sonneneinstrahlung etwa die 10
bis 50-fache Dosis, um mit der gleichen Menge Calcitriol versorgt zu sein wie ein hellhäutiger Mensch (Clemens et al., 1982). Dazu ähnlich ist der Einfluss der Sonnenschutzmittel
auf die UV-Bestrahlung der Keratinozyten: eine Sonnenmilch mit dem Lichtschutzfaktor
(LSF) 8 verringert die Effektivität der Synthese um 95%, ein Schutzmittel mit dem LSF 15
sogar bis 98%, so dass insgesamt sehr wenig Vitamin D synthetisiert wird (Springbett et
al., 2010; Misra et al., 2008).
Zwei weitere schon bekannte Einflussfaktoren stellen einerseits der beeinflussbare BMI,
andererseits das nicht beeinflussbare Alter des Menschen dar. Ein sehr niedriger, wahr27
scheinlich bedingt durch dietätisches Fehlen von Vitamin D, sowie ein stark erhöhter BMI
sind mit niedrigen Vitamin D Serumspiegel vergesellschaftet. Die Vermutungen bezüglich
der inversen Beziehung zwischen hohem BMI und niedrigen Calcitriol-Werten gehen weit
auseinander. Einerseits scheinen soziale Gründe eine Rolle zu spielen, da fettleibige Menschen eher die Sonne meiden (Compston et al., 1981), andererseits scheinen Übergewichtige langsamer die D-Vitamine aus dem Körperfett zu mobilisieren (Need et al., 1993).
Zu den altersbedingten Gründen zählt zum einen eine erniedrigte Aktivität der 1αHydroxlase in der Niere (Slovik et al., 1981) und die verminderte Fähigkeit die Vitamin-DVorstufen aus dem Darm zu resorbieren (Clemens et al., 1986), zum anderen wurde auch
weniger 7-DHC in den Keratinozyten von älteren Menschen gefunden, was schließlich
ebenfalls zur verminderten endogenen Synthese von Cholecalciferol beiträgt (MacLaughlin
et al., 1991; MacLaughlin and Holick, 1985).
1.3
Immunsystem
Das Immunsystem lässt sich in mehrere Bereiche untergliedern: einerseits in den entwicklingsgeschichtlich älteren angeborenen oder auch unspezifischen Anteil, der hauptsächlich
durch das Komplementsystem repräsentiert wird, und andererseits in den spezifischen oder
adaptiven Anteil. Letzterer setzt sich aus den zwei Untergruppen humorale, also hauptsächlich B-Zell- und Antikörper-vermittelte, und der zellulären, also T-Zell-vermittelten
Abwehr zusammen. Die T-Zell-vermittelte Abwehr kann intrazelluläre Pathogene, sowie
entartete Zellen erkennen und eliminieren, weshalb gerade dieser Arm des Immunsystems
zusammen mit anderen Immunzellen, wie zum Beispiel den Natürlichen Killerzellen (NK),
für die Tumorabwehr verantworlich ist.
1.3.1
Natürliche Killerzellen
Die NK gehören als einzige lymphozytäre Vertreter zur unspezifischen Abwehr. Mit Hilfe
von TNF und im Zytoplasma enthaltenen zytotoxischen Granula, sind sie in der Lage,
Körperzellen und Viren, die keinen MHC exprimieren, zu zerstören. Zellen, die keinen
MHC an ihrer Oberfläche tragen, sind etweder maligne verändert oder von Viren befallen
und versuchen so, dem spezifischen Teil des Immunsystems (CD8+ T-Zellen) zu entkommen, indem sie der vorher gesunden Zelle den MHC I „entfernen“ (Seino et al., 2006;
Zeng et al., 1999).
28
1.3.2
T-Zell-Entwicklung
T-Zellen entstehen im Thymus aus in diesen eingewanderten T-Vorläuferzellen, die aus
dem Knochenmark stammen. Hier reifen sie zu immunkompententen Zellen heran, die mit
Hilfe ihres T-Zell-Rezeptors (TCR) von den Körperzellen über Major histocompatibility
complex (MHC) / Human leucocyte antigen (HLA)-Moleküle präsentierte Antigene erkennen und bekämpfen können. Im Thymus finden bei den T-Zellen zunächst eine positive
und dann eine negative Selektion statt. Bei der positiven Selektion werden den naiven TZellen von den Thymuszellen des Kortex HLA-Moleküle präsentiert. Hier überleben nur
jene T-Zellen, die mit ihrem TCR körpereigene HLA erkennen, die restlichen gehen durch
Apoptose zugrunde. Bei der darauf folgenden negativen Selektion präsentieren die
medullären Zellen des Thymus Autoantigene über HLA-Moleküle. Bei einer zu starken
Bindung der T-Zellen an diese kommt es erneut zur Einleitung der Apoptose dieser Zellen.
Letztendlich werden also nur immunkompetente, zentral tolerante T-Zellen in die Lymphorgane aus dem Thymus entlassen (Bommhardt et al., 2004; Stockinger, 1999; Blackman et
al., 1990; Kappler et al., 1987).
T-Zellen exprimieren in ihrem Reifungsprozess unterschiedliche zusätzliche OberflächenKorezeptoren, anhand derer sie u.a. klassifiziert und in Gruppen eingeteilt werden können.
Diese sind die sogenannten Cluster of Differentiation (CD). Die Wichtigsten zu nennenden
sind zunächst CD3, CD4, CD8 und CD25. Anhand dieser unterscheidet man u.a. Suppressor (CD8+) von Helferzellen (CD4+) (Miceli and Parnes, 1991; Lustgarten et al., 1991).
CD4 bindet dabei als Kofaktor zum TCR an HLA Klasse II-Moleküle, die mit viralen oder
bakteriellen Antigenen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie dendritische Zellen
oder Makrophagen, beladen sind. Im Gegensatz dazu dient CD8 als Bindungs-Kofaktor
zum HLA Klasse I. Dieser wird von nahezu allen körpereigenen Zellen exprimiert und
präsentiert fortwährend intrazelluläre Proteine. Dies ist insbesondere zur Abwehr von viral
befallenen oder (maligne) entarteten Körperzellen wichtig (Teh et al., 1988).
Alle T-Zellen exprimieren außerdem CD3 (Oettgen et al., 1984; Kung et al., 1974). Die
CD3 Familie, die aus vier Untereinheiten – den γ-, ε-, ζ- und δ-Ketten – besteht, liegt in
unmittelbarer Nähe zum TCR intrazellulär und funktioniert zusammen mit ihm als TCRCD3-Komplex. Der intrazellulär gelegene CD3-Komplex besteht aus drei verschiedenen
Dimeren (εγ,εδ,ζζ) und führt über Phosphorylierung von immunoreceptor tyrosine activation motifs (ITAMs), die sich auf den Dimeren befinden, zur Aktivierung von weiteren Signalwegen, die schließlich zur Aktivierung der T-Zelle führen (Smith-Garvin et al., 2009).
Ebenfalls wird von allen T-Zellen CD25 exprimiert (Godfrey et al., 1993). CD25 ist als αUntereinheit Bestandteil des heterotrimeren IL-2-Rezeptors und ist für die Bindung des
29
Interleukin 2 zuständig, während die intrazellulär liegenden β- und γ-Untereinheiten zusammen mit den Janus-Kinasen 1 und 3 u.a. die MAPK- und JAK-STAT-Signalwege induzieren. Diese rufen dann eine T-Zell-Proliferation und weitere IL-2-Ausschüttung durch
die T-Zellen hervor (Nelson et al., 1994; Russell et al., 1994). Da jedoch auch auf Tregs
CD25 exprimiert wird, werden diese ebenfalls durch IL-2 aktiviert und führen einerseits
über den Abbau und die Inhibierung der Produktion von IL-2 und andererseits über Expression von FoxP3-Genen zu einer verminderten Immunantwort (Thornton and Shevach,
1998; Sakaguchi et al., 1995).
Im Folgenden soll nun auf die wichtigsten Vertreter der T-Zell-Reihe eingegangen werden:
CD4+ T-Helferzellen, CD8+ zytotoxische T-Zellen und CD25++ FoxP3 regulatorische TZellen.
1.3.3
T-Zell-Reihe
1.3.3.1
CD4+-T-Helferzellen
Die Hauptfunktion der CD4+ T-Zellen liegt in der Steuerung der Immunantwort durch die
Sekretion von verschiedenen Zytokinen. Im Laufe der Zeit wurden bestimmte ZytokinMuster entdeckt, weshalb man die CD4+-Zellen auch in Effektor-Untergruppen einteilen
kann. Dazu gehören u.a. die schon länger bekannten Th1 und Th2-Effektorzellen. Während
Th1-Zellen durch Sekretion von IFNγ eher die zelluläre Immunantwort unterstützen – über
eine Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen –, fördern Th2Effektorzellen die humorale Immunantwort, indem sie IL-4, IL-5, sowie IL-13 sezernieren
und somit Hilfe bei der B-Zell vermittelten Produktion von Antikörpern leisten (McGhee,
2005; Mosmann et al., 1986).
Relativ neu entdeckt wurden IL-17 sezernierende Th17-Zellen, welche im Rahmen von
Autoimmunreaktionen beschrieben wurden (Mangan et al., 2006; Lohr et al., 2006). Eine
weitere Subpopulation der T-Zellen, die eine Unterdrückung der Immunreaktion vermitteln
können, sind die sogenannten regulatorischen T-Zellen (Treg) – auf diese wird in Kapitel
1.3.3.3 näher eingegangen.
1.3.3.2
CD8+-zytotoxische T-Zellen
Die zytotoxischen T-Zellen, oder auch CTL (cytotoxic T-lymphocytes), spielen die entscheidende Rolle in der spezifischen, zellulären Abwehr gegen Tumore und virusbefallene
Zellen.
30
Durch ihre Aktivierung sezernieren sie TNFα sowie IFNγ und führen somit zu einer vermehrten Expression von MHC auf allen Zellen (Becker, 1985). Das gibt ihnen die Möglichkeit, die präsentierten Antigene zu erkennen und mögliche befallene Zellen zu eliminieren, indem sie eine Apoptose der Zielzelle auslösen.
Dies geschieht über zwei verschiedene Wege:
Zum Einen schüttet die CTL Perforine und Granzyme enthaltene Granula aus. Zunächst
sorgen die Perforine für eine „Durchlöcherung“ der Zellwand, wonach die Granzyme
durch diese neu entstandenen Poren eindringen und die Apoptose induzieren (Fan and
Zhang, 2005; Hishii et al., 1999).
Zum Anderen bindet die CTL mit ihrem Fas-Liganden (FasL) an Fas der Zielzelle und
sorgt so für eine Aktivierung der Caspase, was schließlich zur Apoptose der Zelle führt
(Waring and Müllbacher, 1999; Hishii et al., 1999).
1.3.3.3
CD4+CD25++ CD127- regulatorische T-Zellen (Tregs)
Tregs können eine Immunantwort unterdrücken, indem sie die Aktivität von Immunzellen
senken. Dies spielt sowohl bei physiologischen, wie auch pathologischen Immunmechanismen eine Rolle (Sakaguchi, 2000). Erstmals wurden Hinweise für die Existenz von
Tregs in tierexperimentellen Studien erbracht, bei denen neugeborene Nagetiere in den
ersten Lebenstagen thymektomiert worden waren. In der Folge kam es zu einer Abstoßungsreaktion gegenüber den Ovarien oder der Schilddrüse (Sakaguchi et al., 1982; Penhale et al., 1973; Nishizuka and Sakakura, 1969). Weitergehende Ergebnisse in diesen Studien zeigten, dass die T-Zell-Rezeptoren der Tregs eine hohe Affinität für Autoantigene
besitzen (Hsieh et al., 2004). Da bekannt ist, dass Tumorantigene häufig auch Autoantigene sind, liegt der Schluss nahe, dass Tregs eine besondere Rolle in der Tumorabwehr spielen könnten. Für das Maligne Melanom im Speziellen konnte gezeigt werden, dass u.a. die
Tumorantigene gp100 und TRP1 (Tyrosinase-related protein 1) von Tregs erkannt werden
(Vence et al., 2007).
Für natürlich vorkommende Tregs (nTregs) wurden lange Zeit spezifische Oberflächenmarker gesucht. Es fiel zunächst auf, dass sie sogar – und damit gegenteilig zu den anderen
T-Zellen – im ruhenden Zustand eine hohe Expression des CD25 aufweisen. Der bekannteste und für Tregs essentielle Marker stellt das sogenannte Forkhead box protein 3
(FoxP3) dar. Die zentrale Bedeutung für Tregs zeigen beim Menschen das IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy and entheropathy, X‐linked syndrome) (Bennett et
al., 2001) und die scurfy-Mutation des foxp3-Gens bei Mäusen (Brunkow et al., 2001), die
31
jeweils schwere Autoimmunerkrankungen nach sich ziehen. Hartigan-O’Connor et al.
zeigten, dass menschliche Tregs eine verminderte Anzahl an CD127 an ihrer Oberfläche
exprimieren und die meiste Korrelation mit FoxP3+ und CTLA4+ Zellen aufwiesen, weshalb Tregs bei quantitativen Messungen häufig als CD4+CD25++CD127- charakterisiert
werden (Hartigan-O’Connor et al., 2007). Relativ neu sind die Forschungen bezüglich einer weiteren Subpopulation der Tregs, die anscheinend zwar mit einem großen Teil der
CD4+CD25++FoxP3+ Zellen überlappen, jedoch als eigene Untergruppe klassifiziert werden. Diese Tregs exprimieren die Ektonukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase (Ektonukleosidase), welche auch als CD39 bezeichnet wird, und zeigen eine ebenso starke Immunsuppression wie die bisher bekannten CD4+CD25++CD127- Tregs (Schuler et al., 2011;
Huang et al., 2010; Mandapathil et al., 2009), weshalb CD39 als relevanter weiterer Marker für humane Tregs akzeptiert wurde.
Regulatorische T-Zellen reifen, wie alle andere T-Zellen auch, im Thymus. Man geht davon aus, dass sie entstehen, indem Ihnen durch die Thymozyten gebotene MHC II Moleküle durch ihren TCR als „Selbst“ erkannt werden, das Signal des TCR aber unter einer bestimmten Signalgrenze liegt, die ansonsten zur Negativselektion der T-Zelle führen würde
(Aschenbrenner et al., 2007; Apostolou et al., 2001; Jordan et al., 2001). Zur Ausbildung
des FoxP3 kommt es dann nur bei einer zusätzlichen Stimulation mit IL-2. Dieses bindet
an den CD25 (IL-2-Rezeptor) und führt so zu einer Aktivierung eines Signaltransduktionsweges über den Transkriptionsfaktor STAT5, welches den foxp3-Promotor aktiviert
und somit eine Expression der FoxP3-Gene nach sich zieht (Burchill et al., 2008; Burchill
et al., 2007; Burchill et al., 2007).
Ihre periphere, lokal immunsupprimierende Wirkung entfalten Tregs u.a. über die Ausschüttung von IL-10, TGF-β und IL-35, welche eine Proliferation und Induktion von Helferzellen unterdrücken können (Rubtsov et al., 2008; Collison et al., 2007; Fahlen et al.,
2005). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Tregs über sezernierte Granzyme oder
direkte Zell-Zell-Kontakte eine Apoptose der T-Helferzellen auslösen können (Sakaguchi
et al., 2009; Grossmann et al., 2004).
Die Tregs können jedoch auch schon eher als bei den Effektorzellen, nämlich bei den Antigenpräsentierenden Zellen, inhibitorisch wirken. Möglich wird dies durch das auf den
Tregs exprimierte CTLA-4, welches u.a. mit den CD80 und CD86 auf Dendritischen Zellen (DC) interagiert und dadurch zu einer Minderexpression dieser CD führt. Konsekutiv
kommt es schließlich zu einer verminderten Kostimulation von Effektorzellen (Onishi et
al., 2008; Shevach, 2009). Die CD39+ Subpopulation vermag es, über die Ektonukleosidase Adenosintri- und diphosphat, welches v.a. bei entzündlichen Prozessen aus den zu32
grunde gehenden Zellen anfällt, zu Adenosinmonophosphat zu spalten und somit eine antiinflammatorische Wirkung zu erzielen, da ATP als ein Stimulator vermehrter CD80/86
Expression auf DCs gilt (Borsellino et al., 2007).
33
2
Zielsetzung
Gegenstand dieser Studie war es, Einflussfaktoren auf die Entstehung oder den Progress
des Malignen Melanoms herauszustellen.
Im Einzelnen wurden zum Einen durch peripher-venös punktiertes Blut die Serum-Vitamin
D-Werte der Melanompatienten bestimmt, zum Anderen der absolute und prozentuale Anteil der regulatorischen T-Zellen im EDTA-Blut mittels Durchflusszytometrie. Neben der
Untersuchung auf Korrelation mit klinischen oder histopathologischen Charakteristika, war
es ein Hauptziel, einen Zusammenhang zwischen Vitamin D-Versorgung bzw. den regulatorischen T-Zellen und den Stadien nach AJCC 2002 herauszufinden.
Es ergaben sich dadurch folgende Fragestellungen:
1. Zeigt sich ein Zusammenhang zwischen den Tumorstadien nach AJCC 2002 und/oder
der Tumordicke nach Breslow und den Serum-Vitamin D-Werten der Patienten und wenn
ja, in welcher Korrelation stehen sie zueinander? Welche Erklärungen gibt es und was für
eine Konsequenz könnte sich aus den Ergebnissen ergeben?
2. Zeigt sich ein Zusammenhang zwischen den Tumorstadien nach AJCC 2002 und den
regulatorischen T-Zellen im peripheren Blut der Patienten und wenn ja, in welcher Korrelation stehen sie zueinander? Welche Konsequenzen könnten sich auch hier aus den Ergebnissen ergeben?
3. Gibt es ebenfalls einen Zusammenhang zwischen den peripher gemessenen regulatorischen T-Zellen und der Vitamin D-Versorgung bei Patienten mit Malignem Melanom?
34
3
Patienten, Material und Methoden
3.1
Patienten
Der folgenden prospektiven Studie liegen die Daten von 764 Patienten mit einem Malignen
Melanom zugrunde, die im Zeitraum von Dezember 2009 bis Juni 2012 in der Klinik für
Dermatologie und Allergologie im St. Josef Hospital, Universitätsklinikum der RuhrUniversität Bochum, in Behandlung waren. Bei 192 Probanden wurde zusätzlich die Lymphozytenpopulation mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
Es wurden nur Patienten berücksichtigt, bei denen Alter und Geschlecht, klinische, histopathologische, laborchemische, sowie anamnestische Daten eindeutig dokumentiert wurden.
3.1.1
Ein- und Auschlusskriterien
Die Diagnose Malignes Melanom wird aufgrund klinischer sowie histopathologischer Kriterien gestellt.
Einschlusskriterien waren:
-
die Diagnose „Malignes Melanom“ wurde eindeutig gestellt und histopathologisch
gesichert
-
das Ausmaß der Tumorerkrankung wurde bestimmt (Staging)
-
Serum-Vitamin D- und Tumormarker S100-Bestimmung, sowie eine Bestimmung
der Lymphozytenpopulation mittels Durchflusszytometrie wurden routinemäßig
durchgeführt
Ausschlusskriterien waren:
-
Supplementation mit Vitamin D-Präparaten
-
maligne hämatologische Erkrankungen
-
(kutane) T- oder B-Zell-Lymphome
-
Atopien / Allergien
-
Autoimmunerkrankungen
-
Erkrankungen, deren Ätiologie nicht abschließend geklärt wurde, jedoch eine Beteiligung von T-Zellen vermutet wird (u.a. Psoriasis vulgaris, Encephalomyelitis
disseminata)
35
3.1.2
Aufgenommene Messwerte
Von den Patienten wurden Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index (BMI) und Hauttyp nach
Fitzpatrick bestimmt.
Als klinische und histopathologische Daten wurden der MM-Subtyp, die Lokalisation auf
dem Integument, Tumordicke nach Breslow in mm, Ulzeration, Tumorstadium nach AJCC
2002, sowie die Metastasierungsform, wenn vorhanden, aufgenommen.
Als laborchemische Parameter wurden die 25OH-Vitamin D-Konzentration im Serum,
Tumormarker S100, LDH, für den Tregs-Anteil die Lymphozyten-Populationen und die
Jahreszeit der Blutentnahme festgehalten.
3.2
Material
3.2.1
Probengewinnung
Für die nachfolgend beschriebenen Messungen wurde den Patienten während Ihres stationären Aufenthaltes bzw. während der ambulanten Vorstellung oder in der Nachkontrolle
peripheres, venöses Blut in herkömmlichen 4ml-EDTA- und 8ml-Serum-Röhrchen der
Firma KABE-Labortechnik (KABEVETTE® G) entnommen.
3.3
Methoden
3.3.1
Bestimmung der 25OHD-Konzentration im Serum
Um die 25OHD-Konzentration quantitativ zu bestimmen, wurde ein 25OHD-Kit der Firma
DiaSorin (LIAISON®) verwendet. Bei dem Bestimmungsverfahren handelt es sich um
einen direkten, kompetitiven Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA). Es werden spezifische Antikörper gegen Vitamin D zur Beschichtung von Magnetpartikeln eingesetzt. Zur
Bindung des Vitamin D wird ein Derivat des Isoluminols benutzt. Durch Inkubation wird
das 25OHD von seinem Bindungsprotein im Serum gelöst und konkurriert mit dem markierten Vitamin D um die Bindungsstelle des Antikörpers. Darauf wird das ungebundene
Material durch einen Waschzyklus entfernt. Schließlich folgt mittels Zugabe von Startreagenzien die Chemilumineszenz-Reaktion. Das Lichtsignal wird von einem Photomultiplier
in relativen Lichteinheiten (RLU) gemessen und ist zur Konzentration des 25OH - Vitamin
D umgekehrt proportional.
36
3.3.2
Messung der Lymphozyten-Populationen
Es wurden die Lymphozyten-Populationen in totalen Zahlen, sowie prozentual mittels
Durchflusszytometrie gemessen. Aufgeschlüsselt wurden T-Lymphozyten (CD3+), BLymphozyten (CD19+), T-Helfer-Zellen (CD3+CD4+), zytotoxische T-Zellen (CD3+CD8+),
natürliche Killerzellen (NK) (CD3-CD16+CD56+), und regulatorische T-Zellen (Tregs)
(CD4+CD25++CD127--, sowie CD4+CD39+).
3.3.2.1
Messung mit dem Durchflusszytometer
Es wurde der FACSCanto IITM Zytometer der Firma BD Biosciences (San Jose, CA, USA)
im Dermatologischen und Neurologischen Labor am St. Josef Hospital Bochum, Universitätsklinikum der Ruhr-Universität Bochum, verwendet. Zur quantitativen Auswertung der
T-Zell-Populationen wurde die Software FACSDiva™ von BD herangezogen.
3.3.3
Statistische Methoden
Die Analysen wurden mit dem Statistikpaket MedCalc Software (Mariakerke, Belgien)
durchgeführt. Die Daten wurden mit dem d’Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung
überprüft. Nicht normal verteilte Daten wurden als Mittelwerte, sowie Minima und Maxima (Range) ausgedrückt.
Die Daten wurden dann mittels Kruskal-Wallis-Test (Varianzanalyse), welcher den Conover post hoc Test enthielt, dem Wilcoxon-Test, dem Mann-Whitney-U-Test, dem Chi²Test, zusätzlich mittels linearer Regression und multipler Regression inklusive Regressionskoeffizient (β), Standardfehler (SE), Odds Ratio (OR) und 95% Konfidenzintervall
(95% KI) ausgewertet. Als statistisch signifikant wurden dabei P-Werte <0,05 angesehen.
37
4
Ergebnisse
4.1
Anteil Vitamin D
Im ersten Teil dieser Studie wurden 764 Patienten eingeschlossen. Davon lag der Anteil
der Frauen bei 404 (52,9%), der der Männer bei 359 (47,1%). Das Durchschnittsalter lag
bei 56,3 Jahren (Range von 9 bis 93). Dabei waren 138 Patienten unter 40, 280 zwischen
40 und 60, sowie 345 über 60 Jahre alt.
Der Body-Mass-Index (BMI) ergab im Mittel einen Wert von 26,7 kg/m² (Range von 17,4
bis 49,7 kg/m²). Für die statistischen Berechnungen wurden Gruppen eingeteilt in <18 (n =
5),18-25 (n = 240) und >25 kg/m² (n = 349). 735 (96,3%) Patienten hatten einen Hauttyp I
oder II, 28 (3,7%) Patienten Hauttyp III oder IV nach Fitzpatrick.
Durchschnittlich wurden Tumore von 1,68mm Dicke exzidiert (Range von 0 bis 26mm).
Auch hier teilten wir Gruppen in <1,1-4 und >4mm. Laut Stadieneinteilung nach AJCC
2002 konnten 61 Patienten in Stadium 0 (8,1%), 387 Patienten in Stadium I (51,3%), 113
in Stadium II (15%), 126 in Stadium III (16,7%) und 67 Patienten in Stadium IV (8,9%)
untersucht werden.
Insgesamt wurde ein medianer Vitamin D-Wert von 12,3 ng/ml gemessen. Minimal konnten Werte von 4 ng/ml gemessen werden, da dies die Untergrenze der Messgenauigkeit
darstellt. Maximal wurde ein Wert von 56,4 ng/ml aufgenommen. 564 Patienten (73,8%)
hatten insgesamt eine Vitamin D-Defizienz (<20 ng/ml), 145 (18,8%) eine Vit.DInsuffizienz (20 - 30 ng/ml) und nur 55 (7,2%) eine ausreichende Vitamin D-Versorgung
(> 30 ng/ml). Es zeigten sich signifikante Unterschiede bei der 25OHD-Versorgung in den
Sommer- im Vergleich zu den Wintermonaten (p < 0,0001). So hatten 353 von 550 bzw.
64,2% der Patienten in Frühling/Sommer eine Vit-D-Defizienz, während diese Zahlen zum
Herbst/Winter hin deutlich anstiegen (477 von 569; 83,8%).
Die aufgenommenen Daten der Patienten bezüglich ihres Geschlechts und Hauttyps, einer
möglichen Ulceration des MM, des Tumormarkers S100, sowie der LDH zeigten nach unseren Berechnungen mittels einer multiplen Regression keinen signifikanten Zusammenhang zur Vitamin D-Versorgung (p > 0,05). Wie in Tabelle 7 ersichtlich, konnte dieses
jedoch für alle weiteren Daten gezeigt werden:
Niedrige, also defiziente oder insuffiziente, Vitamin D-Serumwerte korrelieren mit höherem Alter (Regressionskoeffizient: -0,09; p < 0,0001), höherem Body-Mass-Index (β = 0,25; p = 0,0007), sowie der dunklen Jahreszeit (Herbst/Winter; β = -6,06; p < 0,0001).
Dies gilt auch für die Tumordicke nach Breslow und die AJCC 2002 Stadien (siehe auch
Abb. 10): erniedrigte 25(OH)-Vitamin D-Werte sind mit dickeren Tumoren (Abb.10 A; β
38
= -1,45; p = 0,028) und auch mit höheren Tumorstadien verbunden (Abb. 9 B; β = -0,79;
p= 0,036).
Tab. 7 stratifizierte Parameter, mittlere Vitamin D Messwerte und ihre Range, sowie
die Statistikergebnisse
Parametera
25OHD [ng/ml]
Median (Range)
Statistik (* = signifikant)
12,3
(4 – 56,4)
AJCC 2002 - Gruppen
(A) Stadium 0 (n=61)
(B) Stadium I (n=387)
(C) Stadium II (n=113)
(D) Stadium III (n=126)
(E) Stadium IV (n=67)
16
14,3
10,7
10,3
8,5
(5,6 – 37,8)
(4 – 56,4)
(4 – 49,7)
(4 – 37,2)
(4 – 28,9)
P < 0,05*
A vs. B-E
B vs. A,C-E
D vs. E
lineare Regression:
P < 0,0001*
Multiple Regression:
β = -0,79, P = 0,036*
Tumordicke nach Breslow
(A) <1 mm
(B) 1 – 4 mm
(C) >4 mm
15,1
10,7
9,4
(4 – 56,4)
(4 – 49,7)
(4 – 37,2)
P < 0,05*
A vs. B
A vs. C
lineare Regression:
P < 0,001*
Multiple Regression:
β = -1,45, P = 0,028*
Geschlecht
- Männer (n = 359)
- Frauen (n = 404)
11,6
13,2
(4 – 49,7)
(4 – 56,4)
P = 0,24
lineare Regression:
P = 0,22
Alter
(A) < 40 Jahre (n = 138)
(B) 40 – 60 Jahre (n = 280)
(C) > 60 Jahre (n = 345)
15,2
12
11,9
(4 – 56,4)
(4 – 49,1)
(4 – 38,6)
P < 0,05*
A vs. C
lineare Regression:
P < 0,001*
Multiple Regression:
β = -0,09, P < 0,0001*
BMI
(A) < 18 (n = 5)
(B) 18 – 25 (n = 240)
(C) > 25 (n = 349)
6,4
14,1
11,6
(4 – 45,9)
(4 – 56,4)
(4 – 49,1)
P < 0,05*
B vs. C
lineare Regression:
P < 0,001*
Multiple Regression:
β = -0,25, P = 0,0007*
Studienpopulation
(n = 764)
39
Hauttypen
- I/II
- III/IV
12,4
11,6
(4 – 56,4)
(4 – 33,6)
Jahreszeit
- Frühling / Sommer
- Herbst / Winter
15,8
10,3
(4 – 50,9)
(4 – 56,4)
P = 0,72
lineare Regression:
P = 0,54
P < 0,001*
B vs. C
lineare Regression:
P < 0,001*
Multiple Regression:
β = -6,06, P < 0,0001*
a
manche Daten waren nicht in Gänze verfügbar, daher differieren die Summen
40
Abb. 10 Vitamin D und Breslow-Dicke / Tumorstadien Die Säulendiagramme zeigen
den inversen Zusammenhang zwischen Vitamin-D-Versorgung (25OHD-Klassen: I = <20
ng/dl, II = 20-30 ng/dl, III = >30 ng/dl) und der Tumordicke, sowie dem Stadium nach
AJCC 2002
41
4.2
Anteil Lymphozytenpopulationen
Aufgrund teilweise unschlüssiger oder fehlender Daten, konnten letztlich von 192 aufgenommenen Patienten 189 in den zweiten Teil der Studie eingeschlossen werden. Der Anteil der Männer lag bei 100 (52,1%), der Anteil der Frauen bei 92 (47,9%). Das mediane
Alter lag bei 60 Jahren, mit einer Range von 9 bis 91. Die mediane gemessene Tumordicke
lag bei 1,3mm (Range: 0,13 – 20,2mm).
Die Stadieneinteilung nach AJCC 2002 ergab 109 Patienten in den Stadien 0, I und II
(57,7%), sowie 80 in den fortgeschrittenen Stadien III und IV (42,3%).
Zunächst wurde eine univariate Analyse mit allen aufgeführten Daten durchgeführt. Diese
ergab für einige Parameter signifikante Werte, die sich aber in der multivariaten Analyse
als nicht mehr signifikant im Sinne eines negativen unabhängigen Prädiktors für fortgeschrittene Melanomstadien erwiesen. Dies galt für den LDH-Spiegel (univariate Analyse: p
= 0,0049; Odds Ratio 0,3; 95% Konfidenzintervall 0,11 bis 0,7; multivariate Analyse: p >
0,05), absolute Zahl der Natürlichen Killerzellen (univariate Analyse: p = 0,0052; OR 0,9;
95%KI 0,9939 bis 0,9989; multivariate Analyse: p > 0,05), absolute Zahl der T-Zellen
(univariate Analyse: p = 0,0008; OR 0,998; 95%KI 0,9981 bis 0,9995; multivariate Analyse: p > 0,05), absolute Zahl der Helferzellen (univariate Analyse: p = 0,0008; OR 0,9983;
95%KI 0,997 bis 0,999; multivariate Analyse: p > 0,05) und für suffiziente Vitamin DWerte (univariate Analyse: p= 0,0021; OR 0,47; 95%KI 0,25 bis 0,89; multivariate Analyse: p > 0,05).
Wie auch in Tabelle 8 zu sehen, wurde für vier Parameter sowohl durch univariate, als
auch in der multivariaten Analyse gezeigt, dass diese positive unabhängige Prädiktoren für
den fortgeschrittenen schwarzen Hautkrebs darstellen:
42
Tab. 8 Die Parameter nTregs CD4+CD25++CD127-,Tumordicke, Ulceration und S100
als unabhängige positive Prädiktoren des fortgeschrittenen Melanoms
die Parameter, zugeteilt zu den Stadien nach AJCC 2002 und die Statistikergebnisse
Parameter
Stadien nach
AJCC 2002
109
(57.7%)
Patienten
in
Stadium
0, I, II
80
(42.3%)
Patienten
in
Stadium
III oder IV
nTregs
CD4+CD25++
CD127[%]
Median
(Range)
6
(1,3-15,7)
7.8
(1,9-14,5)
Tumordicke
nach Breslow
[mm]
Median
(Range)
0.8
(0,13-7)
2.4
(0,3-20,2)
Ulceration
vorhanden/
nicht vorhanden
21/83
36/21
Statistik
Mann-Whitney:
Lineare Regression:
Logistische Regression:
Mann-Whitney:
P = 0,0003
β = 0,26
(SE: 0,08)
P = 0,0011
OR: 1,3
95%CI 1,11 bis 1,51
P < 0,0001
Lineare Regression:
Logistische Regression:
Chi²:
P < 0,0001
β = 0,46
(SE: 0,16)
P = 0,0048
OR: 1,6
95%CI 1,2 bis 2,2
P < 0,0001
Lineare Regression:
Logistische Regression:
Chi²:
erhöhtes S100
vorhanden/
nicht vorhanden
P = 0,0001
5/104
P < 0,0001
β = 1,4
(SE: 0,45)
P = 0,0022
OR: 4
95%CI 1,7 bis 9,5
P = 0,0020
16/64
Lineare Regression:
Logistische Regression:
P < 0,0021
β = 1,7
(SE: 0,67)
P = 0,013
OR: 5,2
95%CI 1,4 bis 19,5
43
Im Einzelnen konnte dies für erhöhte S-100-Werte (P = 0,0020; OR: 5,2; 95%KI 1,4 bis
19,5), eine vorhandene Ulceration (P < 0,0001; OR: 4; 95%KI 1,7 bis 9,5), für die Tumordicke nach Breslow (P < 0,0001; OR: 1,6; 95%KI 1,2 bis 2,2) und schließlich auch für den
mittels
Durchflusszytometrie
gemessenen,
prozentualen
Anteil
an
nTregs
CD4+CD25++CD127- (P = 0,0011; OR: 1,3; 95%KI 1,11 bis 1,51) nachgewiesen werden
(siehe auch Abb. 11).
Abb. 11 Box-Whisker-Plot: nTregs zugeteilt zu den Stadien nach AJCC 2002. Die
prozentuale Anzahl der zirkulierenden nTregs war in fortgeschrittenen Stadien III und IV
höher als in den Stadien I und II (III vs. I und II, IV vs. I, P < 0,05)
Nach erneuter Regressionsanalyse fiel zusätzlich auf, dass die Tumordicke signifikant mit
der prozentualen Anzahl der nTregs CD4+CD25++CD127- korrelierte (r = 0,25; P =
0,0007). Dies galt jedoch nicht für eine vorhandene Ulceration (r = 0,03; P = 0,6). Ebenfalls signifikant war der lineare Zusammenhang zwischen den CD4+CD25++CD127- regulatorischen Zellen und CD4+CD39+ - Zellen (siehe Abb. 12, r = 0,56, P < 0,0001). Diese
jedoch waren selber nicht signifikant zusammenhängend mit den Stadien nach AJCC 2002
(P = 0,15; P = 0,28)
44
Abb. 12 Scatterdiagramm mit Regressiongerade: signifikanter linearer Zusammenhang
zwischen CD4+CD39+ und CD4+CD25++CD127- Tregs
In diesem zweiten Teil der Studie hatten von den 192 untersuchten Patienten 100 (57,3%)
eine Vitamin D-Defizienz (< 20 ng/ml) und 92 (42,7%) eine Vitamin D-Insuffizienz oder
Suffizienz (> 20 ng/ml). Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Vitamin D-Versorgung und dem Auftreten von regulatorischen T-Zellen gezeigt werden
(CD4+CD25++CD127-: P = 0,36; CD4+CD39+: P = 0,30).
45
5
Diskussion
5.1
Melanom und Vitamin D
Die Zahlen dieser Arbeit deuten in Übereinstimmung mit weiteren Studien darauf hin, dass
Patienten mit einem diagnostizierten MM zu einem großen Teil deutliche Vitamin DInsuffizienzen oder -Defizienzen aufweisen. So zum Beispiel zeigten Newton-Bishop et al.
für eine Studiengruppe von 872 Patienten eine geringere Tumordicke nach Breslow, je
höher bzw. suffizienter die Vitamin D Versorgung war. Diese Patienten hatten dann auch
ein besseres Gesamtüberleben, auch wenn die Tumore eine größere Dicke aufwiesen
(Newton-Bishop et al., 2009). Eine über 10 Jahre andauernde Studie mit 205 Patienten von
Nürnberg et al. ergab - zusätzlich zu der o.g. Erkenntnis, dass Patienten mit höheren
25OHD-Werten geringere Tumordicken aufweisen - höhere Wahrscheinlichkeiten für das
Auftreten von Metastasen eines MM bei gleichzeitiger Vitamin D-Minderversorung
(Nürnberg et al., 2009). In einer großen Untersuchung der Vitamin D Versorgung der deutschen Bevölkerung mit 4030 Probanden (1763 Männer und 2267 Frauen) konnte bei Männern eine mediane 25OHD-Versorgung von 18,1 ng/ml (25% Quartil: 12,1 ng/ml, 75%
Quartil: 27,4 ng/ml) und für Frauen von 17,9 ng/ml (25%-Quartil: 12,3 ng/ml, 75% Quartil: 28,9 ng/ml) nachgewiesen werden, was für eine allgemeine Minderversorgung mit Vitamin D auch in der gesunden Bevölkerung spricht (Hintzpeter et al., 2008).
Die Zahlen der aktuellen Arbeit gehen einen Schritt weiter, auch i.S. der o.g. Studien bzgl.
der 25OHD-Versorgung bei MM-Patienten: neben einer allgemein insuffizienten oder defizienten Versorgungslage, liegen die Serum-Vitamin D-Werte bei den hier untersuchten
Melanompatienten auch im Vergleich zur gesunden deutschen Bevölkerung merklich niedriger – median bei 12,3 ng/ml (25% Quartil: 7,3 ng/ml, 75% Quartil: 20,2 ng/ml). Jedoch
muss man beachten, dass die Einteilung der Vitamin D-Serumwerte nicht einheitlich ist:
während in dieser Arbeit von <20 ng/ml für eine Defizienz, bei ≥20 - <30 ng/dl von einer
Insuffizienz und nur bei ≥30 ng/dl 25OHD im Serum von einer suffizienten Versorgung
ausgegangen wurde, arbeiten andere Studien teilweise mit viel geringeren Cut-Offs für die
Suffizienz (bspw. ≥ 24 ng/ml).
In Anlehnung zu Newton-Bishop et al. war jedoch nicht nur die Tumordicke signifikant
geringer, die Patienten zeigten auch weniger Progredienz der Erkrankung und wiesen niedrigere Stadien nach AJCC 2002 auf. Möglicherweise scheint dies einen Hinweis darauf zu
geben, dass Vitamin D eine Rolle bei der Krankheitskontrolle spielen könnte.
Es konnte darüber hinaus bestätigt werden, dass auch bei Patienten mit MM, wie auch in
weiteren Studien schon in der gesunden Bevölkerung gezeigt werden konnte (Hintzpeter et
46
al., 2008; Engelsen et al., 2005; Holick, 1995), höhere Vitamin D-Serumwerte in den
Sommermonaten im Vergleich zur dunklen Jahreszeit aufwiesen (Defizienz-Anteil im
Sommer: 64,2% vs. Winter: 83,8% - im Vergleich zu Hintzpeter et al., 2008: DefizientAnteil im Sommer 54,8%). Ein Faktor für den großen Anteil, vor allem auch in den Sommermonaten bei den MM-Patienten, könnte ein erhöhter Sonnenschutz und vermehrtes
Aufhalten im Schatten darstellen, wie Idorn et al., 2011 sowie Freiman et al., 2004 gezeigt
haben. Demnach komme es insbesondere durch die Diagnose des Malignen Melanoms zu
einem gesteigerten Selbstschutz vor UV-Strahlung. Jedoch konnten andere Arbeiten ebenso zeigen, dass entweder gar keine Änderung im Sonnenschutz-Verhalten oder sogar eine
vermehrte Exposition die Folge sein können (Failla et al., 2012).
Ebenfalls konnte die BMI-abhängige Versorgung mit 25OHD verifiziert werden. So zeigten Body-Mass-Indizes < 18 kg/m2 und > 25 kg/m2 signifikant schlechtere Serum Vitamin
D-Werte, wobei ein BMI < 18 kg/m2 wohl eher auf ein dietätisches Fehlen von fettlöslichen Vitaminen hinweist. Analog zu Compston et al. und Need et al. könnten bei Patienten
mit BMI > 25 kg/m2 psychosoziale Faktoren i.S. einer geringeren Sonnenexposition eine
wesentliche Rolle spielen (Need et al., 1993; Compston et al., 1981). Ebenso waren jüngere Patienten (< 40a) signifikant besser versorgt als Patienten, die älter als 60 Jahre waren.
Dies ist möglicherweise ebenfalls u.a. auf soziale Faktoren – größere Sonnenexposition bei
jüngeren Menschen – zurückzuführen.
Welche Rolle genau die Vitamin D-Versorgung beim Malignen Melanom spielt, ist jedoch
weiterhin Gegenstand der Diskussion. Diese und andere Studien könnten einen protektiven
Effekt auf die Entstehung, das Ausmaß und den Progress des MM zeigen, während im
Umkehrschluss gefragt werden muss, inwiefern stark erhöhte Vitamin D-Werte auf das
Auftreten von malignen Hauttumoren hinweisen könnten. So konnten Afzal et al. bei
10060 prospektiv über 26 Jahre untersuchten Patienten darlegen, dass eine verstärkte UVBestrahlung der Haut zu höheren 25OHD-Serumwerten (mit Werten >30 ng/ml auch im
Winter) führt und diese ein höheres Risiko für weißen und auch für schwarzen Hautkrebs
aufwiesen (bis 1,5% größeres Risiko) (Afzal et al., 2012). Allerdings spricht vieles dafür,
dass ein Malignes Melanom eher bei intermittierender, starker Sonnenexposition über einen kurzen Zeitraum, bspw. in einem Sommerurlaub in südlicheren Ländern, auftritt, als
bei kontinuierlicher Exposition. Letzteres erhöht zwar die Wahrscheinlichkeit in großem
Maße, einen weißen Hautkrebs zu entwickeln (Afzal et al., 2012), scheint aber eher protektiv im Bezug auf Maligne Melanome zu wirken (Godar et al., 2012; Walter et al., 1999).
Insgesamt muss man sich fragen, inwiefern und wann genau Vitamin D als Leitwert genutzt werden sollte. In den meisten Studien, wie auch in der vorliegenden Arbeit, wurde
47
das 25OHD eher verwendet, um eine mögliche Prognose, weniger, um ein allgemeines
Erkrankungsrisiko abzuschätzen.
Als Quintessenz könnte dies bedeuten, dass bei allen Melanompatienten routinemäßig der
Vitamin D Status erhoben werden sollte und bei möglichen insuffizienten oder defizienten
Werten eine Subsitution mit entsprechenden Präparaten erfolgen sollte, da mittlerweile
einige Studien dafür sprechen, dass MM-Patienten von suffizienten Vitamin D Serumwerten ≥ 30 ng/ml profitieren könnten, da eine bessere Versorgung mit einem geringeren Risiko für Progress und Gesamtmortalität des Melanoms einher zu gehen scheint (NewtonBishop et al., 2009).
5.2
Melanom und Immunsystem
Das MM gilt allgemein als ein „immunogener“ Tumor. Es exprimiert viele Tumorantigene
und -proteine (MAA), die vom Immunsystem des Menschen erkannt werden und über eine
T-Zell-Reaktion bekämpft werden können (Zeuthen et al., 1998). So konnte man in direkter Umgebung des Primärtumors oder seiner möglicherweise schon vorhandenen Metastasen einerseits zytotoxische T-Zellen finden, die spezifisch Tumorantigene erkennen und zu
lokaler Regression des Melanoms führen können (Kawakami et al., 1996), andererseits
aber auch T-Helferzellen (v.a. Th1-Effektorzellen, welche die zelluläre Immunatwort über
CTL unterstützen), die Antigenbestandteile von APC präsentiert bekommen haben und so
in größerer Zahl in den Tumor eingewandert sind (Knutsen and Disis, 2005).
Das Melanom schafft es jedoch trotzdem, sich dem Immunsystem durch verschiedene Mechanismen zu entziehen (Tumor-escape-Phänomene): Zum einen sind hier der kontinuierliche Verlust von Tumorantigenen und geringere Expression von MHC-Molekülen an der
Zelloberfläche zu nennen (Olson and McNeill, 2012), zum anderen aber auch eine mögliche Sezernierung von löslichen Faktoren in der Mikroumgebung des Tumors, wie z.B.
lösliche MHC-Moleküle, die die schon ansässigen T-Zellen inaktivieren und zur Apoptose
führen können (Poggi and Zocchi, 2006). Einen großen Anteil an der Immuntoleranz des
Melanoms haben aber auch die regulatorischen T-Zellen des Immunsystems. Sie konnten
ebenfalls in einer großen Zahl in der Tumorumgebung gefunden werden, vor allem aber
auch in der Umgebung von Metastasen des MM (Jacobs et al., 2012; Facciabene et al.,
2012). Diese sorgen lokal und wahrscheinlich auch systemisch für eine Toleranz gegenüber dem Tumor und begünstigen dadurch möglicherweise die Entwicklung und Progression des Malignen Melanoms. Nicht nur die alleinige Anzahl, sondern auch eine Dysregulation der Tregs scheint hierbei auch eine Rolle zu spielen (Speeckaert et al., 2011). Einige
48
Studien konnten in kleinem Rahmen mit etwa 40-45 Patienten mit MM darlegen, dass bei
diesen die Anzahl der CD25++CD127- Tregs vor allem im Stadium IV, also im Stadium der
Fernmetastasen, im Vergleich mit gesunden Probanden erhöht ist (Correll et al., 2010;
McCarter et al., 2007). Das MM scheint durch noch bis dato ungeklärte Art und Weise eine
Proliferation von FoxP3+ Zellen zu fördern (Baumgartner et al., 2007). Dies konnte auch in
dieser Arbeit in einer bislang größten Studienpopulation zum Thema gezeigt werden. Mit
fortgeschrittenen Stadien (III/IV) als abhängige Variable konnten neben den bisher schon
bekannten positiven Prädiktoren S100, Ulceration und die Tumordicke die regulatorischen
T-Zellen als ein weiterer möglicher positiver Prädiktor für das MM belegt werden. Bislang
wurde dies in den kleineren Studienpopulationen jedoch nur für das Fernmetastasenstadium IV gezeigt, was eher für das Vorkommen von Tregs in Metastasen sprach. Hier konnte
nun gezeigt werden, dass dies aber auch schon für das Stadium III gelten könnte – bei Patienten, deren Tumorleiden zwar fortgeschritten, aber nicht so groß ist wie bei fernmetastasiertem MM. Daher könnte ein möglicher Angriffspunkt der onkologischen Therapie des
MM in der Tumorimmunisierung liegen. Bjoern et al. nutzen diese Erkenntnisse und studierten die Wirkungen von einer Impfung durch mit Melanomzellen gefütterten dendritischen Zellen in Verbindung mit einer low-dose INFα und IL-2-Therapie. Nach einem anfänglichen Anstieg der Anzahl der Tregs auf 22% bis zur vierten Impfung, sank deren prozentualer Anteil signifikant auf Werte von 9,5% nach der sechsten Impfung. Im Vergleich
dazu lag der Anteil bei unbehandelten Patienten bei 14,5%(Bjoern et al., 2011). Ähnliches
konnten auch Klages et al. zeigen, die die Impfung mit Tumorantigenen mit dem selektiven Abbau von Tregs durch CD25 Antikörpern bei Mäusen kombinierten und so eine
Regression von Melanomen hervorriefen (Klages et al., 2010)
In der aktuellen Arbeit konnte dargelegt werden, dass CD25++CD127- Tregs in einem linearen Zusammenhang mit CD39+ Tregs zu stehen scheinen, letztere jedoch keine Korrelation zu den Krankheitsstadien zeigten. Dies bestätigt die bislang dargestellten Ergebnisse,
dass CD39+ Tregs und CD25++CD127- Tregs keine homogene Subpopulation mit den gleichen Funktionen zu sein scheinen. Schuler et al. berichteten, nachdem sie CD39+ Zellen
durchflusszytometrisch besser differenzierten, dass etwa die Hälfte der CD39+ Tregs
CD25+FoxP3+ Zellen mit ähnlich supprimierender Funktion sind, während die andere Hälfte CD25-CDFoxP3- Tregs darstellt mit viel geringerer bis gar keiner Supressionswirkung
(Schuler at al., 2009). Dies könnte die Ergebnisse dieser Studie möglichweise erklären,
dass die CD39+ Tregs zwar linear mit den CD25+CD127- Zellen korrelieren, jedoch im
Gegensatz zu diesen selber keinen Zusammenhang zu den Stadien nach AJCC 2002 zeigen.
49
Die wichtigste Aussage der Ergebnisse dieses Teils ist, dass CD25++CD127- Tregs ein unabhängiger positiver Prädiktor für das fortgeschrittene Melanom ab Stadium III sind und
dass diese Erkenntis den möglichen Angriffpunkt für eine Immuntherapie über Antikörper
oder Tumorvakzine bestätigt und weiterhin Teil klinischer Forschungen für das Management des Malignen Melanoms darstellen sollte.
5.3
Vitamin D und regulatorische T-Zellen
Ein weiteres Ziel dieser Studie war es, herauszufinden, ob bei den Patienten mit MM ein
Zusammenhang zwischen den 25OHD Serumwerten und der Anzahl an regulatorischen TZellen besteht. Da in Immunzellen, wie z.B. den T-Zellen ein VDR vorhanden ist, besteht
zunächst auch die theoretische Überlegung, dass im Serum vorhandenes Vitamin D eine
Wirkung auf diese ausüben könnte.
Die aktive Form des Vitamin D, das 1,25-OHD3, scheint laut einiger Studien die Funktion
von regulatorischen T-Zellen zu verstärken, indem diese vermehrt FoxP3 exprimieren
(Bakdash et al., 2013; Morales-Tirado et al., 2009). Smolders et al. konnten die Funktion
von Tregs unter Einfluss von Vitamin D zeigen, dass diese eine T-Zell-Proliferation bei
Patienten mit Multipler Sklerose hemmen können. Einflüsse des 25OHD auf die Anzahl
der Tregs im peripheren Blut konnten sie dabei nicht feststellen (Smolders et al., 2009).
Analog dazu fielen die Ergebnisse dieser Arbeit aus, da kein signifikanter Zusammenhang
zwischen den Vitamin D-Serumwerten und der Anzahl der regulatorischen T-Zellen – weder CD25++CD127-, noch CD39+ – im peripheren Blut von Patienten mit Malignem Melanom gezeigt werden konnte. Dies bestätigt die Überlegung, dass Vitamin D zwar einen
Einfluss auf die Funktion der regulatorischen T-Zellen über vermehrte Expression von
FoxP3 hat, aber nicht auf die zahlenmäßige Proliferation.
50
6
Zusammenfassung
Das Maligne Melanom ist ein hochaggressiver Hauttumor mit der frühen Tendenz zur Metastasierung. Seine Inzidenz ist in Mitteleuropa weiter steigend und liegt derzeit bei etwa
15 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner in Deutschland. Viele Melanome werden
heute in sehr frühen Stadien durch die allgemeine Tumorvorsorge erkannt. Jedoch ist die
Entstehung von Melanomen mit schnellem Progress in höhere Tumorstadien weiterhin
hoch. Ebenso sind viele jüngere Patienten betroffen. Die Entstehung des Malignen Melanoms liegt weniger in der kumulativen Dosis an UV-Strahlung, was eher für einen weißen
Hautkrebs, wie z.B. das Basalzellkarzinom oder die aktinische Keratose, die in ein Plattenepithelkarzinom übergehen kann, prädestiniert, sondern vielmehr in der intermittierend
starken Einstrahlung und zusätzlicher Lichtschädigung mit Sonnenbränden in der Kindheit.
In den letzten Jahren wurde zunehmend deutlich, wie sehr das MM einen Zusammenhang
mit der Vitamin D-Versorgung und welche Immunogenität es besitzt. Während man für
das Vitamin D protektive Faktoren hinsichtlich der Tumordicke herausgefunden hat, zeigen Forschungen gerade im Hinblick auf die Immuntherapie weitere Möglichkeiten.
Diese Arbeit sollte die Bedeutung von Vitamin D und regulatorischer T-Zellen beim Malignen Melanom in einer großen Studienpopulation aufzeigen. Es konnte dargestellt werden, dass Vitamin D nicht nur eine Bedeutung für die Tumordicke zu haben scheint, sondern auch im weiteren Verlauf des Melanoms einen möglichen Progress verhindern kann.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass bei Patienten mit diagnostiziertem
Malignem Melanom auch während der Nachsorge kontinuierlich der Vitamin D Status
erhoben werden sollte und eine mögliche Minderversorgung mit entsprechenden Präparaten ausgeglichen werden sollte, da auch im Verlauf höhere Vitamin D Serumwerte einen
protektiven Effekt auf den Progress der Erkrankung zu haben scheinen. Zwar konnte im
Laufe dieser Arbeit kein quantitativer Zusammenhang zwischen der Vitamin D Versorgung und den regulatorischen T-Zellen nachgewiesen werden, jedoch zeigten letztere einen
signifikanten Anstieg besonders in den höheren Tumorstadien III und IV. Während bislang
davon ausgegangen wurde, dass regulatorische T-Zellen vor allem im fernmetastasierten
Stadium IV quantitativ im Serum ansteigen, konnten die Zahlen dieser Arbeit darlegen,
dass auch schon zum Stadium III hin, in dem viele Patienten noch kein so großes Tumorleiden haben wie in Stadium IV, regulatorische T-Zellen im peripheren Blut erhöht sind.
Das könnte im Umkehrschluss bedeuten, dass schon früher mit spezifischen Immuntherapien begonnen werden könnte und weitere Forschungen hinsichtlich Antikörperbehandlungen und/oder Tumorvakzinisierung folgen sollten, um weitere erfolgreiche Therapieregimes für das Maligne Melanom zur Verfügung zu haben.
51
7
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Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei meinem Doktovater Prof. Dr. med. A. Kreuter für die
Überlassung dieses ausgesprochen interessanten Themas meiner Dissertation, seine hervorragende Betreuuung und sein Engagement vom Beginn bis zur Fertigstellung der Arbeit
bedanken.
Herrn PD Dr. med. T. Gambichler danke ich für die herausragende Hilfestellung beim statistischen Teil der Arbeit und die aufschlussreichen Diskussionen über die Ergebnisse.
Bei Herrn Dipl.-Biol. S. Höxtermann und beim gesamten Team des Dermatologischen und
Neurologischen Labors des St. Josef Hospitals bedanke ich mich für die tolle Einführung,
Darstellung der apparativen Arbeit und Erklärungen hinsichtlich der genauen Funktion der
durchgeführten Methoden.
Mein persönlicher Dank geht abschließend an meine Eltern für die Unterstützung bei meinem bisherigen Lebensweg und die Ermöglichung meines gesamten Studiums bis zum
Abschluss dieser Arbeit, an Herrn Sebastian Thies, mit dem die Zeit des Studiums so viel
leichter war, sowie an meine Freundin Britta, die mich bis zum Schluss motiviert hat, diese
Arbeit fertig zu stellen, und immer für mich da war.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Michel Pascal Bindsteiner
Geburtsdaten:
28. Oktober 1986 in Hagen
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulische Ausbildung
1993 - 1997
Grundschule, Liebfrauenschule Hagen
1997 - 2006
Hildegardisschule Hagen, Gymnasium des Erzbistums Paderborn
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
10 / 2007 – 11 / 2013
Ruhr-Universität Bochum
Studium der Humanmedizin
09 / 2009
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
11 / 2013
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr
08 / 2012 – 12 / 2012
St. Josef Hospital UK RUB, Bochum
1. Tertial: Innere Medizin
12 / 2012 – 04 / 2013
St. Josef Hospital UK RUB, Bochum
2. Tertial: Dermatologie
04 / 2013 – 07 / 2013
Marienhospital UK RUB, Herne
3. Tertial: Chirurgie
Publikationen
Gambichler, T., Bindsteiner, M., Höxtermann, S., Kreuter, A. (2013). Serum 25hydroxyvitamin D serum levels in a large German cohort of patients with melanoma. British Journal of Dermatology 168 (3), 625–628
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