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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Immunologische Untersuchungen zur Gewinnung und Charakterisierung dendritischer Zellen (DC) vom Pferd im Hinblick auf eine DC-Therapie des equinen Sarkoids INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Eva Siffrin aus Saarbrücken Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h. c. Wolfgang Leibold 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h. c. Wolfgang Leibold 2. Gutachter: PD Dr. med. vet. Wolfgang Bäumer Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2007 Meiner Familie Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis und Glossar .......................................................................................... 1 Einleitung und Zielsetzung ................................................................................................ 13 2 Literaturübersicht............................................................................................................... 15 2.1 Das equine Sarkoid..................................................................................................................15 2.1.1 Das equine Sarkoid und seine Erscheinungsbilder................................................ 15 2.1.2 Ätiologie des equinen Sarkoids............................................................................. 17 2.1.3 Therapie des equinen Sarkoids.............................................................................. 19 2.2 Die Rolle des Immunsystems in der Tumorbekämpfung ....................................................22 2.2.1 Bekämpfungsstrategien des Immunsystems.......................................................... 22 2.2.2 Escapemechanismen von Tumorzellen ................................................................. 25 2.3 Dendritische Zellen .................................................................................................................26 2.3.1 Subpopulationen dendritischer Zellen................................................................... 27 2.3.2 Lebenszyklus dendritischer Zellen........................................................................ 28 2.3.3 Einsatz dendritischer Zellen als Tumorvakzine .................................................... 32 3 Geräte, Material und Methoden......................................................................................... 37 3.1 Geräte .......................................................................................................................................37 3.2 Material ....................................................................................................................................38 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 Klinikbedarf........................................................................................................... 38 Laborbedarf ........................................................................................................... 39 Reagenzien ............................................................................................................ 40 Antikörper und Nachweisreagenzien .................................................................... 41 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ..................................................................... 43 Zytokine................................................................................................................. 47 Tiere....................................................................................................................... 47 3.3 Methoden..................................................................................................................................48 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 Gewinnung definierter Zellpopulationen aus equinem Blut ................................. 48 Vitalitätsbestimmung von Zellen und Zellzahlermittlung..................................... 52 Durchflusszytometrie ............................................................................................ 52 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellpopulationen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) ...................................................... 55 3.3.5 Prinzip der durchflusszytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen..................................................................................................................... 57 3.3.6 Zellkultivierung in vitro ........................................................................................ 58 3.3.7 Lichtmikroskopische Untersuchung in vitro generierter dendritischer Zellen...... 61 3.3.8 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ....................................................... 62 3.3.9 Herstellung eines sterilen Tumorzelllysats............................................................ 64 3.3.10 Bestimmung der Proteinkonzentration im Tumorzelllysat .................................. 66 3.3.11 Bestrahlung definierter Zellpopulationen zur Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion ................................................................................................ 67 3.3.12 Funktionalitätsprüfung der DC mittels gemischter Leukozytenreaktion (MLR). 67 3.3.13 Statistische Verfahren .......................................................................................... 69 4 Ergebnisse........................................................................................................................... 70 4.1 Methodische Vorarbeiten .......................................................................................................70 4.1.1 Aufreinigung equiner Monozyten aus Vollblut..................................................... 70 4.2 Generierung von dendritischen Zellen aus angereicherten equinen Monozyten ..............85 4.2.1 Funktionalitätsprüfung von rekombinantem equinem IL4.................................... 85 4.2.2 Generierung equiner dendritischer Zellen nach unterschiedlichen Monozytenanreicherungsmethoden....................................................................... 91 4.3 Funktionalitätsprüfung der generierten MoDC .................................................................101 4.3.1 Einfluss von Mercaptoethanol auf die Proliferationsrate unstimulierter MNC .. 101 4.3.2 Gemischte Leukozytenreaktion mit ungepulsten DC.......................................... 104 4.3.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit gepulsten DC.............................................. 107 5 Diskussion......................................................................................................................... 110 5.1 Vergleich unterschiedlicher Aufreinigungsmethoden equiner Monozyten .....................110 5.1.1 Adhärenz equiner Monozyten als Aufreinigungsmethode.................................. 110 5.1.2 Affinitätschromatographische Separation equiner Monozyten........................... 111 5.1.3 Dichtegradientenzentrifugation ........................................................................... 112 5.2 Untersuchung der biologischen Funktionalität des req.IL4..............................................113 5.2.1 Proliferationsassay mit equinen MNC ................................................................ 114 5.2.2 Einfluss des req.IL4 auf die Differenzierung zu MoDC ..................................... 114 5.3 Beurteilung der in vitro generierten dendritischen Zellen ................................................115 5.3.1 Charakterisierung equiner DC............................................................................. 115 5.3.2 Reifeinduktion equiner DC ................................................................................. 117 5.4 Funktionalität der generierten MoDC ................................................................................118 5.4.1 Methodische Überlegungen und Vorarbeiten...................................................... 119 5.4.2 Ungepulste DC stimulieren allogene MNC......................................................... 120 5.4.3 Gepulste DC stimulieren autologe und allogene MNC....................................... 121 5.5 Ausblicke für die Sarkoidtherapie mit dendritischen Zellen ............................................122 6 Zusammenfassung............................................................................................................ 126 7 Summary ........................................................................................................................... 129 8 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 131 Abkürzungsverzeichniss und Glossar Abb. ADCC AK allogen APC autolog Aqua dest. Aqua tridest. BPV BSA bspw. bzw. °C ca. CD CDC CD4+ CD8+ CD83+ CD86+ CO2 DC DMEM DNS Dotplot DS EDTA ELA Eq., eq. EqCD FACScan® Abbildung Antibody Depending Cell Cytoxicity (Antikörperabhängige Zellzytotoxizität) Antikörper Von einem genetisch anderen Individuum derselben Art stammend. Antigen presenting cell (antigen präsentierende Zelle) Von demselben Individuum stammend. Aqua destillata (einfach destilliertes Wasser) Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Bovines Papillomavirus Bovines Serumalbumin Beispielsweise Beziehungsweise Grad Celsius Zirka Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen) Complement Depending Cell Cytoxicity (Komplementabhängige Zellzytotoxizität) Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren Zellen, die das Differenzierungsantigen CD83 an der Oberfläche exprimieren Zellen, die das Differenzierungsantigen CD86 an der Oberfläche exprimieren Kohlenstoffdioxid Dendritic cells (dendritische Zellen) Dulbecco´s minimal essential medium (minimal essentielles Medium nach Dulbecco) Desoxyribonukleinsäure Korrelierte Darstellung von zwei durchlusszytometrischen Parametern für jedes Ereignis als Punktwolke(n) Danger Signal (Gefahrensignal) Ethylendiamintetraacetat Equine leukocyte antigen, genetische Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Pferdes equin (zum Pferd gehörig) Equine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für equine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CDNomenklatur Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg). Fc FCM FCS FITC FL-1, -2, -3 Flt3 Fluide Zellen FSC g G-CSF GM-CSF Gy h Hu., hu. ICAM iDC IFN Ig IgG (H+L) IL i.m. i.n. i.v. Komplexität l LAG Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxyterminales Fragment von Immunglobulinen nach PapainSpaltung) Flow Cytometer (Durchflusszytometer) Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) Fluoreszeinisothiocyanat Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm) „FMS-like“ Tyrosinkinase3 (Mitglied der Klasse-III Tyrosinkinase (TK)–Rezeptorfamilie, Membranrezeptor auf frühen myeloiden und lymphatischen Progenitoren, der bei Bindung von Flt3 mit Flt3-Ligand (Flt3L) zur Proliferation der Progenitoren führt, FMS= fat mobilizing substance)) Zellen, die sich unter den hier durchgeführten Bedingungen nicht an die Plastikoberfläche ausreichend fest anheften, also nicht adhärent waren, so dass sie leicht durch Medium abschwemmbar waren. Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® für die Partikelgröße. Gramm Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozytenkoloniestimulierender Faktor) Granulocyte-Monocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Monozyten koloniestimulierender Factor) Gray (durch Radioaktivität und andere ionisierende Strahlung verursachte Energiedosis; beschreibt die pro Masse absorbierte Energie) hora (lateinisch: Stunde) Human (zum Menschen gehörig) intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) immature DC (unreife dendritische Zelle(n)) Interferon Immunglobulin Immunglobulin G mit schweren (heavy, H) und leichten (L) Ketten Interleukin intra muskulär intra nodal intra venös Durchflusszytometrischer Parameter des Seitwärtsstreulichts (SSC), bezieht sich auf die morphologische Oberflächenstruktur und die Granularität der Partikel. Liter Leukagglutinin LFA-1 LPS µ m M MACS mAK MBL M-CSF mDC ME MEM MIF MIF-Puffer MIP 1α, 1β MoDC MHC I MHC II MIF min MLR MNC MW N NaCl n Negative Selektion Nr. P PBS PE Pellet PGE2 PI PMN Positive Selektion Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1 Lipopolysaccharid mikro (x 10-6) milli (x 10-3) Molar (Mol/l) Magnetic cell sorting (Magnetiche Zelltrennung) monoklonale(r) Antikörper Mannose binding lectin (Mannose bindendes Lektin) Macrophage-Colony Stimulating Factor (Makrophagenkoloniestimulierender Faktor) mature DC (reife dendritische Zelle(n)) 2-Mercaptoethanol Minimum Essential Medium (minimal essentielles Medium) Membranimmunfluoreszens Waschpuffer für die Membranimmunfluoreszenz Macrophage inflammatory protein (Makrophagen inflamatorisches Protein, Mitglied der C-C-Chemokin Unterfamilie) Monocyte derived dendritic cells (aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen) Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) I Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) II Membranimmunfluoreszenz Minute(n) Mixed leukocyte reaction (gemischte Leukozytenreaktion) Mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes, bestehen aus Lymphozyten und Monozyten) arithmetischer Mittelwert bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen Natriumchlorid nano (x 10-9) Anreicherung von Monozyten aus einer MNC-Population durch die Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen im MACS. Nummer Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen. Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) Phycoerythrin Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen Prosterglandin E2 Propidiumiodid Polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten) Anreicherung von Monozytenaus einer MNC Population durch spezifische Antikörper im MACS. pulsen RANTES Req., req. Responderzellen RT S s. s.c. S/R-Ratio s.S. sek SI sog. SSC Stimulatorzellen Tab. TCR TNF u.a. U-well vgl. vs. v/v well xg z.B. z.T. Vom englischen „to pulse“ übernommerner Fachbegriff für die mehr oder weniger gezielte Antigenaufnahme, -prozessierung und –präsentation von dendritischen Zellen Regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted (reguliert nach Aktivierung, normal von T-Zellen expremiert und sezerniert) Rekombinat hergestelltes equines MNC eines Pferdes, die in der MLR eingesetzt werden und zur Proliferation angeregt werden. Raumtemperatur Standardabweichung siehe subcutan Verhältniss von Stimulatorzellen zu Responderzellen siehe Seite Sekunde(n) Stimulationsindex, berechnet sich aus der ermittelten absoluten Zahl der Blasten der Probe geteilt durch die absolute Zahl der Blasten der Mediumkontrolle. so genannte(r) Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® für die Komplexität der Partikel. Zellpopulation (DC oder MNC), die in der MLR die Responderzellen stimulieren sollen. Durch radioaktive Bestrahlung dieser Zellen wird ihre eigene Proliferationsfähigkeit unterbunden. Tabelle T Cell Receptor (T-Zellrezeptor) Tumornekrosefaktor unter anderem Mikrotiterplatten-Vertiefung mit rundem Boden. Vergleiche versus (gegen) Volumen pro Volumen Vertiefung einer Mikrotiterplatte multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) zum Beispiel zum Teil Einleitung & Zielsetzung 1 Einleitung und Zielsetzung Das equine Sarkoid ist mit Abstand der häufigste Hauttumor des Pferdes. MARTI et al. (1993) geben an, dass es sich bei ca. 90 % aller Hauttumoren beim Pferd um equine Sarkoide handelt. Die Häufigkeit innerhalb einer Population wird mit 0,78 % (FRETZ u. BARBER 1980) bis 1 % (GERBER 1989) angegeben. Die Fibroblastenproliferation betrifft primär die Dermis, in seltenen Fällen kann auch die Subkutis beteiligt sein (GOODRICH et al. 1998; KNOTTENBELT u. KELLY 2000). Sarkoide zeigen nach erfolgter chirurgischer Exzision eine hohe Rezidivtendenz und stellen nicht nur ein kosmetisches Problem dar, da sie je nach anatomischer Lokalisation und Ausdehnung auch den Gebrauchswert des Pferdes erheblich mindern. Die Hautveränderungen sind, sofern es sich nicht um ulzerierende Sarkoide handelt, nicht schmerzhaft und zeigen keinen Juckreiz. Sekundärinfektionen nach Ulzeration stellen allerdings gerade in warmen Monaten eine erhebliche Komplikation dar. Die Tumore können am ganzen Körper vorkommen, treten jedoch an einigen Prädilektionsstellen wie Schenkelinnenfläche, ventrales Abdomen und an Arealen mit dünner Haut gehäuft auf. Obwohl zahlreiche Therapieansätze bestehen, die von Chemotherapie bis hin zu homöopathischen Mitteln reichen, ist eine zufriedenstellende Therapie bei betroffenen Tieren bislang nicht bekannt; oder der Therapieerfolg nur von kurzer Dauer. Dendritische Zellen (DC), die den Angelpunkt vieler spezifischer Immunantworten darstellen, sind in den letzten Jahren zunehmend in den Focus der Forschung gerückt, da sie eine tumorspezifische Immunantwort induzieren können. Schon 1985 konnte an Mausmodellen ein therapeutischer Effekt dendritischer Zellen auf das Wachstum von Tumoren nachgewiesen werden (KNIGHT et al. 1985). Zahlreiche Studien im humanmedizinischen Bereich schlossen sich diesem Versuch an. Die Erfolge dieser Studien sind viel versprechend, wenn auch abhängig von der Art der Neoplasien und dem Stadium der Erkrankung. Sie hängt jedoch entscheidend von der Generierung der DC des Patienten in vitro ab. Die Separation, Charakterisierung und Generierung dendritischer Zellen aus Monozyten stellt beim Pferd allerdings noch eine große Herausforderung dar. Viele in der Humanmedizin angewandte Verfahren und Reagenzien sind leider nicht oder unbefriedigend auf das Pferd übertragbar. HAMMOND et al. (1999) und SIEDEK et al. (1997) gelang es zwar, dendritische Zellen des Pferdes aus peripheren Blutmonozyten zu generieren, allerdings führt die Methode der Monozytenseparation, neben einer unspezifischen Aktivierung durch Plastikadhärenz der Monozyten, auch zu sehr geringer Zellausbeute. 13 Einleitung & Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene Methoden der Monozytenseparation beim Pferd hinsichtlich ihrer Ausbeute, Reinheit und Selektion bzw. Voraktivierung zu erproben und ein optimiertes Verfahren der Monozytenaufreinigung zu finden. Des Weiteren galt es, die gewonnenen Monozyten in vitro zu dendritischen Zellen zu differenzieren, die Zellen phänotypisch zu charakterisieren und auf ihre Antigen präsentierende Funktion hin zu prüfen. Damit soll ein gezielter Einsatz equiner dendritischer Zellen zur Therapie des equinen Sarkoids vorbereitet werden. 14 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Das equine Sarkoid Bei dem equinen Sarkoid handelt es sich um einen mesenchymalen Tumor des Unterhautbindegewebes mit unterschiedlich starker Beteiligung der Epidermis. Es wächst lokal aggressiv und infiltrativ, eine Metastasierung wie bei Fibrosarkomen wird jedoch nicht beobachtet, weshalb es als semimaligner Tumor klassifiziert wird (DAHME u. WEISS 1999). Das equine Sarkoid kann isoliert oder multipel auftreten. Bei einem Drittel der erkrankten Pferde treten die Tumore multiple auf. Equine Sarkoide stellen den bei Pferden am häufigsten diagnostizierten Tumor dar. TEIFKE u. WEISS (1991) berichten, dass es sich bei 40% aller untersuchten Tumore bei Pferden um Sarkoide handelt. Dabei können Pferde unabhängig von Alter, Farbe oder Geschlecht betroffen sein. Bei Wallachen scheint es nach MOHAMMED et al. (1992) jedoch eine gewisse Häufung dieser Tumorausbildung zu geben. Dabei wird als Ursache das Trauma nach der Kastration gesehen, was sich mit der Beobachtung von RAGLAND et al. (1966) deckt, dass Sarkoide häufig an zuvor traumatisierten Stellen entstehen. 2.1.1 Das equine Sarkoid und seine Erscheinungsbilder Anhand des klinischen Erscheinungsbildes können verschiedene Formen des equinen Sarkoids unterschieden werden. KNOTTENBELT u. KELLY (2000) sowie HAMMAN (2004) teilen die Sarkoide in 6 Typen ein, wobei sie diesen auch eine Lokalisation und ein Wachstumsverhalten zuordneten. So beschrieben sie das okkulte Sarkoid als haarlose, rauhe, leicht hyperkeratotische Hautveränderung mit Prädilektionsstelle an Kopf, Hals und Schenkelinnenfläche mit langsamem Wachstum. Als Besonderheit wird zudem angegeben, dass dieser Sarkoidtyp nach Traumatisierung besonders dazu neigt in aggressivere Formen (verrukös oder fibroblastisch) überzugehen. Das verruköse Sarkoid zeigt sich durch graue, asbestartige Hautoberfläche mit warzenartigen Veränderungen. Die Läsionen können gestielt oder sessil sein und neigen zur Ulzeration und Krustenbildung. Ihr Wachstum wird als langsam und wenig aggressiv beschrieben, solange keine Traumatisierung stattfindet. Noduläre Sarkoide zeichnen sich als solide, subkutane oder intrakutane Knoten unterschiedlichster Größe aus, die sich häufig an Augenlidern oder Innenschenkeln lokalisieren. Die klinische Erscheinung des fibroblastischen Sarkoids wird durch sein fleischartiges Aussehen mit häufig feuchter und blutiger Oberfläche dominiert. Dieser Typ geht meist aus anderen Sarkoidtypen hervor und wächst schnell und unkontrolliert. Eine 15 Literaturübersicht Besonderheit stellt das von HAMANN (2004) erwähnte malevolente Sarkoid dar, da es infiltrativ in die Lymphbahn einwächst. Die betroffenen Hautareale fühlen sich strangartig und verdickt an. Von einem gemischten Sarkoid spricht man, sobald zwei Merkmale unterschiedlicher Sarkoidtypen beobachtet werden können. Dies ist häufig der Fall wenn z.B. durch Traumatisierung eine Form in eine andere übergeht. Abb. 1 Klinische Bilder des equinen Sarkoids Multiple Sarkoide an der Vorderbrust (links) und am Präputium (rechts) eines Wallachs. Nach HAMMAN (2004) können die Sarkoide in verruköe und noduläre Sarkoide eingeteilt werden. An der Vorderbrust ist deutlich zu sehen, dass eine Neigung zur Ulzeration und Blutung besteht (siehe Pfeil). MARTENS et al. (2000) untersuchte die verschiedenen Sarkoidtypen histologisch, sowie immunhistochemisch und konnte zeigen, dass epideramle Hyperplasien und Hyperkeratosen nur bei verrukösen und gemischten Sarkoiden zu finden sind. Die DNS boviner Papillomaviren sowie das Tumorsuppressorgen p53 (siehe Kapitel 2.1.2.1.1) konnte er aber in allen Typen nachweisen. In der Literatur sind noch zahlreiche andere Klassifikationen zu finden, die an dieser Stelle nicht erwähnt werden. Differentialdiagnostisch müssen Sarkoide, je nachdem um welchen Typ es sich handelt, von Dermatophytosen, chronischen Entzündungen, Keloiden und der Habronematidose abgegrenzt werden (DAHME u. WEISS 1999). In der Regel kann eine eindeutige Diagnose anhand einer histologischen Untersuchung gestellt werden. 16 Literaturübersicht 2.1.2 Ätiologie des equinen Sarkoids 2.1.2.1 Virusgenese durch Infektion mit bovinen Papillomaviren Nachdem lange Zeit die Ätiologie des equinen Sarkoids ungeklärt war, wird heute eine Virusgenese als Hauptursache vermutet. TEIFKE u. WEISS (1991) konnten mittels PCR (Polymerase Kettenreaktion) die DNS des Papillomavirus (BPV 1 und BPV 2) in allen 20 untersuchten Sarkoiden nachweisen. Allerdings wurde in den benachbarten Hautregionen der Sarkoide ebenfalls Virus-DNS detektiert, ebenso wie in Hautproben gesunder Pferde, die Kontakt zu erkrankten Tieren hatten (BOGAERT et al. 2005). Die Autoren diskutieren als Erklärung hierfür neben einer Viruslatenz auch die mögliche Kontamination der Proben. 2.1.2.1.1 Klassifikation und Struktur des bovinen Papillomavirus (BPV) Die bovinen Papillomaviren gehören zu der Familie der Papillomaviridae (VAN REGENMORTEL et al. 2000). Sie besitzen ein Genom aus einer doppelsträngigen DNS von etwa 8000 bp, die von einem ikosaedrischen Kapsid ohne Lipidhülle umgeben ist. Da Papillomaviren in der Regel eine strenge Wirts- und Gewebespezifität besitzen, wird der Wirt in die Papillomvirus-Nomenklatur miteinbezogen (z.B. HPV für humane Papillomaviren, BPV für bovine Papillomaviren). Die bovinen Papillomaviren werden zudem weiter unterteilt in sechs Typen (BPV 1 bis 6). Die Gewebespezifität bezieht sich auf epitheliale Strukturen. Das heißt, dass eine Infektion fast ausschließlich in teilungsaktiven Zellen der Haut oder Schleimhaut stattfindet (CAMPO 1997). Eine Ausnahme in der Wirts- und Gewebspezifität stellt allerdings das Pferd dar, bei dem sowohl ein dermaler als auch ein epidermaler Anteil der Haut betroffen ist. Die Genprodukte der Viren werden nach ihren Synthesezeitpunkten während der produktiven Phase der Infektion eingeteilt in frühe (E, „early“) oder späte (L, „late“) Proteine. Die frühen Gene kodieren die Nicht-Strukturproteine E1, E2, E4, E5, E6 und E7. Sie spielen bei der Replikation und Transkription der viralen DNS eine Rolle. Die Proteine E5, E6 und E7 schaffen dabei die Voraussetzung für die Virusvermehrung, indem sie das Zellwachstum stimulieren. Dieser Mechanismus scheint eine essentielle Rolle bei der Entstehung von Neoplasien zu haben. E6 kann zudem an das Tumorsuppressorgen p53 (LIVINGSTONE et al. 1992) binden und somit dessen Kontrollfunktion für das Zellwachstum aufheben. Gleiches gilt für das E7 Protein welches an das Tumorsuppressorgen p105 binden kann und es in seiner Funktion hemmt. Beide Proteine (E6 und E7) werden deshalb als Onkoproteine bezeichnet. Die späten Proteine L1 und L2 kodieren Strukturproteine der Virushülle. 17 Literaturübersicht 2.1.2.1.2 Hinweise für eine virale Pathogenese des equinen Sarkoids In Gewebeschnitten von equinen Sarkoiden konnte virale DNS des BPV in den dermalen Schichten des Tumors nachgewiesen werden, allerdings nicht in den epithelialen Zellen (TEIFKE 1994). NASIR u. REID (1999) wiesen zwar ebenfalls die viralen Transkriptionsfaktoren E2, E5 sowie die viralen Onkoproteine E6 und E7 in entfernten Sarkoiden nach, konnten aber nie infektiöses Virus finden. Sie stellten die Hypothese auf, dass Sarkoide in dem Stadium der fibroblastischen Proliferation verharren, wie sie in der Frühphase bei bovinen Papillomen anzutreffen ist und eine produktive Virusinfektion in dem fremden Wirt Pferd nicht stattfinden kann. Dem Transformationsprotein E5, welches CHAMBERS et al. (2003) in Sarkoiden von Pferden aus Großbritannien und der Schweiz nachweisen konnte, wird in der Pathogenese des Sarkoids zudem eine besondere Bedeutung beigemessen, da es die MHC-I Expression auf infizierten Zellen herunter reguliert (CHAMBERS et al. 2003b). BOGAERT et al. (2005) konnten allerdings auch in der Haut gesunder Pferde virale DNS des BPV nachweisen. Danach scheint eine Infektion mit BPV nicht die einzige Voraussetzung zur Entstehung eines Sarkoids zu sein. 2.1.2.2 Immunologische Faktoren Bei der Betrachtung innerhalb großer Pferdebestände fällt auf, dass nur einige der Tiere trotz gleicher Haltungsbedingungen Tumore ausbilden. Um dieses Phänomen zu erklären wurde das Immunsystem erkrankter Pferde, insbesondere der Major Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) sowie bestimmte Equine-Leukozyten-Antigene (ELA) genauer untersucht. LAZARY et al. (1994) und MEREDITH et al. (1986) konnten einen Zusammenhang zwischen der Erkrankung an equinem Sarkoid und bestimmten ELA-Loci I und II zeigen. Zunächst typisierten LAZARY et al. (1985) ELA von insgesamt 55 schweizerischen und 17 französischen Warmblutpferden, sowie von 24 Irish Huntern. Dabei konnten sie zeigen, dass der ELA-Haplotyp W3 bei Pferden mit equinen Sarkoiden gehäuft zu finden war, und zwar immer in Verbindung mit dem Haplotyp B1. Später zeigten LAZARY et al. (1994) einen Zusammenhang zwischen dem ELA-Klasse II Allotyp DW13 und dem Auftreten von Sarkoiden sowie dem Klasse I Allotyp A3. Trotz dieser Beobachtungen darf aber nicht außer Acht gelassen werden, dass der überwiegende Teil der Pferde mit diesen Haplotypen gesund ist. Sie sind aber als wichtige Hinweise auf eine mögliche Prädisposition zu sehen. 18 Literaturübersicht 2.1.3 Therapie des equinen Sarkoids Bisher stehen zur Therapie des equinen Sarkoids zahlreiche Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, die allerdings leider meist unzureichend effektiv sind. Man kann dabei vier verschiedene Gruppen aufgrund des Wirkungsmechanismus unterscheiden. Zur ersten Gruppe gehören die Methoden, die durch Hitze, Kälte oder andere Faktoren physikalisch die Tumorzellen zerstören sollen. Dazu zählen die Kryochirugie, die chirurgische Extirpation, das Abbinden der Tumore, die Kauterisierung, Lasertherapie, Hyperthermie oder Radiotherapie. Gruppe zwei umfasst die Immunostimulanzien wie BCG (Bacillus Calmette Guerin), Zylexis® sowie eine Autovakzine aus entferntem Tumormaterial. Gruppe drei stellt die Chemotherapie mit verschiedenen Zytostatika (z.B. Cysplatin, 5Fluorouracil, Xanthatverbindungen) dar und Gruppe vier beinhaltet eine Vielzahl homöopathischer Therapiemöglichkeiten. Wegen der Vielzahl der therapeutischen Verfahren werde ich hier nur auf die gängigsten Behandlungswege jeder Gruppe näher eingehen. Innerhalb der physikalischen Therapie stellt die chirurgische Entfernung des Sarkoids das meist verwendete Verfahren dar. Häufig stellen Nahtdehiszenzen oder Infektionen störende Komplikationen dar, die von einigen Autoren auch als Auslöser für Rezidive gehalten werden. Bei alleiniger chirurgischer Entfernung wird von einer Rezidivrate von 50% ausgegangen (DIETZ u. HUSKAMP 1999). Aus diesem Grund wird von vielen Autoren eine Kombination mehrerer Methoden befürwortet. Die Kryochirugie basiert auf extremer Kälte und führt zur Zerstörung von Zellstrukturen durch Dehydration und Kristallbildung. Dieser Effekt soll dazu ausgenutzt werden transformierte Zellen abzutöten. Als Kältequelle wird in der Medizin meist flüssiger Stickstoff verwendet, der mittels Spray oder Sonde auf das veränderte Gewebe aufgebracht wird. LANE (1977) rät dabei zu einer Prüfung der im Tumor erreichten Temperatur zur Überwachung des Therapieerfolges. Die Rezidivrate liegt bei dieser Behandlungsform bei ca. 30% (JOYCE 1975; JOYCE 1976). Die Lasertherapie wird aufgrund des notwendigen Instrumentariums nur in wenigen Kliniken durchgeführt. Meist findet ein CO2- Laser bei der Therapie von Sarkoiden Einsatz. Er zeichnet sich durch gleichzeitiges schneiden und verdampfen von Gewebe aus. Dabei soll, wie bei der Kryotherapie auch, eine Zerstörung transformierter Zellen erfolgen. Die Immuntherapie verfolgt das Ziel, den Organismus in die Lage zu versetzen den Tumor selbstständig zu eliminieren. Dabei werden entweder unspezifische Abwehrmechanismen (z.B. mit BCG oder Zylexis®) oder spezifische Immunmechanismen aktiviert. 19 Literaturübersicht Bei BCG (Bacillus Calmette Guerin) handelt es sich um einen abgeschwächten Impfstamm von Mycobacterium bovis. LAVACH et al. (1985) beschreibt BCG als Potentiator des Immunsystems. Der Impfstoff soll bei lokaler Applikation zu einer unspezifischen, zellulären, sowie zu einer spezifischen, humoralen Immunantwort führen (MURPHY et al. 1979). Die zelluläre, unspezifische Immunantwort basiert dabei hauptsächlich auf der Aktivierung von Makrophagen. Durch Freisetzung zytotoxischer Sauerstoffradikale und ihrer proteolytischen Kapazität schädigen sie die Tumorzellen direkt (LAVACH et al. 1985; VANSELOW et al. 1988) oder führen über eine Aktivierung von T-Zellen zu einer Zerstörung der Tumorzellen. LAVACH et al. (1985) konnte nach einer Impfung mit BCG Antikörper gegen tumorassoziierte Antigene nachweisen, die vermutlich nach Lyse der Tumorzellen freigesetzt wurden. Dies würde auch erklären, weshalb auch unbehandelte Sarkoide an demselben Tier teils Regressionen zeigen (WEBSTER u. WEBSTER 1985). Die beschriebenen Behandlungserfolge variieren in der Literatur zwischen 100% (LAVACH et al. 1985; WEBSTER u. WEBSTER 1985) und 59% (VANSELOW et al. 1988) Eine Kombination von chirurgischer Entfernung und BCG wird empfohlen, um die Rezidivrate zu senken (KLEIN et al. 1986). Eine autologe Vakzine kann aus patienteneigenem Tumormaterial gewonnen werden. Es handelt sich dabei um ein Verfahren, welches in der Humanmedizin unter dem Namen APSI (aktivierte patientenspezifische Immuntherapie) bekannt ist und welches auf das Pferd übertragen wurde. Dafür wird eine Mindestmenge von 1g Tumor benötigt, welcher dem Tier steril entnommen werden muss. Das Tumorgewebe wird mittels einer speziellen Technik zerkleinert und die löslichen Komponenten der Zellmembranen polymerisiert. Auf diese Weise sollen die Zellwandbestandteile Antigencharakter erhalten. In einer Studie, die KINNUNEN et al. (1999) durchführten, wurde mit dieser Behandlung bei elf von zwölf Pferden mit primären Sarkoiden und bei fünf von neun Pferden mit rezidivierenden Sarkoiden eine Tumorfreiheit erzielt. Basierend auf der Hypothese, dass equine Sarkoide durch eine Infektion mit BPV verursacht werden, wurde von MATTIL-FRITZ (2002) eine therapeutische Vakzine auf Basis der Virusproteine erprobt. Sie stellte BPV 1 chimäre Virus-ähnliche Partikel (BPV 1-CVLPs) her, die aus dem C-terminal verkürzten Hauptkapsidprotein L1 und Teilen des E7-Proteins von BPV 1 bestehen. Diese wurden dann in einer nicht Placebo-kontrollierten klinischen Phase IStudie bei zwölf Pferden mit equinen Sarkoiden getestet. Bei zwei Tieren wurde durch die Immunisierung eine Verbesserung des klinischen Zustandes erzielt, bei einem Tier konnte zwar die Regression von fünf Sarkoiden beobachtet werden, drei davon rezidivierten jedoch wieder. Fünf weitere Tiere zeigten gleichzeitig sowohl eine Tumorregression, als auch das Wachstum neuer bzw. vorhandener Sarkoide. Bei zwei Tieren erfolgte keinerlei Veränderung 20 Literaturübersicht des klinischen Zustandes, bei zwei weiteren konnte das Wachstum vorhandener Sarkoide bzw. die Neubildung equiner Sarkoide beobachtet werden. Nach dreimaliger Applikation der Vakzine konnten bei elf der zwölf Pferde L1-spezifische Antikörper und bei fünf der Tiere Antikörper gegen das E7-Protein nachgewiesen werden. Da allerdings für eine effektive „antitumorale Vakzine“ insbesondere die zelluläre Immunantwort eine wesentliche Rolle spielt, wurde von GUTMANN (2005) ein Verfahren erprobt, mit dessen Hilfe sie die durch die CVLPs induzierten, antigenspezifischen, zytotoxischen T-Zellreaktionen messen wollte. Ein Nachweis über IFNγ von CD8+ T-Zellen mit Spezifität für BPV 1 L1 und E7 gelang ihr allerdings nicht. Die Therapie des equinen Sarkoids mittels Zylexis® (ehemals Baypamun) wurde von STUDER et al. (1997) in einem Doppelblindversuch mit 10 Pferden untersucht. Lediglich bei drei Pferden, die Zylexis® (Baypamun®) erhielten konnte eine Verbesserung in Form einer Tumorregression gesehen werden, während aus der Kontrollgruppe, die mit Placebos behandelt wurden, fünf Tiere eine Regression zeigten. Dies führt zu dem Schluss, dass es sich um spontane Regressionen gehandelt hat und Zylexis® (Baypamun®) zumindest als alleinige Therapie nicht empfehlenswert ist. Zu den Chemotherapeutika, die in der Sarkoidtherapie zum Einsatz kommen, gehören die Zytostatika Cisplatin und 5-Fluorouracil. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um sogenannte Antimetaboliten, welche natürliche Metaboliten verdrängen und damit lebenswichtige Stoffwechselprozesse blockieren. Sie finden meist als Implantate ihren Einsatz, da so eine kontinuierliche Abgabe des Wirkstoffes erreicht werden kann. Aber auch Salben (5-Fluorouracil, Efudix®) und Emulsionen mit den Wirkstoffen finden ihren Einsatz. THEON et al. (1993) behandelte 19 Pferde mit Sarkoiden mit einer intratumoralen Applikation einer Cisplatin-Ölemulsion viermal im Abstand von zwei Wochen. Eine komplette Tumorregression konnte so bei 18 der Tiere erreicht werden. Dabei blieben 87% der Tiere über ein Jahr tumorfrei. STEWART et al. (2006) untersuchte den therapeutischen Effekt einer intratumoralen 5-Fluorouracil Injektion. Dabei konnte bei 9 von 13 Pferden eine Regression der Sarkoide erzielt werden, die nach 3 Jahren noch immer bestand. Auch die Homöopathie nimmt in der Tumorbekämpfung eine wichtige Stellung ein und wird meistens als Unterstützung des Immunsystems therapiebegleitend eingesetzt. Aufgrund der Vielfalt an Möglichkeiten soll an dieser Stelle aber nur ein kleiner Teil vorgestellt werden. Unter anderem finden Substanzen wie Arsenicum album, Silicea, Thuja und Tarantula cubensis ihre Anwendung zur Therapie des equinen Sarkoids. Andere schwören auf die Behandlung der Sarkoide mit handelsüblicher Zahnpasta. Einheitliche Angaben zu 21 Literaturübersicht Erfolgsraten dieser Therapieformen sind in der Literatur allerdings nicht zu finden, da die Präparate zum Teil für jeden Patienten individuell kombiniert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass es eine Vielzahl an therapeutischen Ansätzen für die Behandlung des equinen Sarkoids gibt. Leider werden allerdings nicht immer die gewünschten Erfolge bei der Behandlung erzielt, grade wenn die Tumore multiple an verschiedenen Körperstellen auftreten. Außerdem stellen die Kosten oder Nebenwirkungen der Therapieformen oft einen limitierenden Faktor dar. Eine Therapieform, die zuverlässige und nachhaltige Tumorregressionen liefert, bezahlbar ist und ohne gravierende Nebenwirkungen bei dem Patienten bleibt, steht demnach noch nicht zur Verfügung. 2.2 Die Rolle des Immunsystems in der Tumorbekämpfung 2.2.1 Bekämpfungsstrategien des Immunsystems In jedem Organismus entarten täglich einige Zellen durch unterschiedlichste Einflüsse chemischer, physikalischer oder viraler Natur zu potentiellen Krebszellen. Doch das Immunsystem ist meist in der Lage diese zu erkennen und rechtzeitig zu vernichten, noch ehe es zur Ausbildung von Tumoren kommt. Dabei spielen sowohl angeborene wie auch adaptive „erworbene“ Immunmechanismen eine wichtige Rolle. Zu den unspezifischen Komponenten zählen u.a. das Komplementsystem, neutrophile Granulozyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen. Sie ermöglichen schnelle, „sofortige“ Reaktionen des Immunsystems auf eine Vielzahl von körperfremden Strukturen wie Mikroorgansimen, insbesondere aber auf die Entstehung „unerlaubter“ körpereigener Strukturen wie entartete Zellen oder durch Noxen veränderte „Selbststrukturen“. Natürliche Killerzellen töten zum Beispiel jede Zelle, die sie aktiviert und kein eigenes MHC-I Molekül auf der Oberfläche trägt. Ein Umstand, den man bei vielen Tumorzellen findet und der nach CHAMBERS et al. (2003b) durch das Transformationsprotein E5 auch bei equinen Sarkoiden anzutreffen ist. Erworbene oder adaptive Immunreaktionen werden hauptsächlich von Lymphozyten ausgeführt, die „antigenspezifisch“ auf eine bestimmte Struktur, ein Antigen, präziser aber auf ein Teil eines Antigens, ein Epitop, reagieren können. B-Lymphozyten tragen dazu durch die Synthese und Freisetzung antigenspezifischer (präziser: Epitop-spezifischer) Antikörper bei, während T-Lymphozyten sich selbst in unterschiedliche zelluläre Immunreaktionen einbringen. So sind sie in der Lage „unerlaubt“ veränderte körpereigene Zellen, sei es ducrh 22 Literaturübersicht Fehldifferenzierung, Alterung oder maligne Transformation aber auch durch intrazelluläre Infektionen von Viren, Bakterien, Parasiten bedingt zu erkennen und zu eliminieren. 2.2.1.1 T-Zellaktivierung Naive T-Zellen, die durch die Lymphknoten wandern, binden vorübergehend an Adhäsionsmoleküle (bspw. CD50, CD54, CD58) auf professionellen, antigenpräsentierenden Zellen (insbesondere dendritische Zellen und aktivierte B-Lymphozyten). Die Bindung wird jedoch erst gefestigt, sobald sie ihren spezifischen MHC-Peptidkomplex durch ihren TZellrezeptor erkannt haben. Innerhalb der T-Zellpopulationen sind zwei Hauptgruppen zu differenzieren, die sich durch ihre Corezeptoren unterscheiden. CD8 positive (CD8+) TZellen werden in ihrer aktivierten Form als zytotoxische T-Zellen bezeichnet, während CD4 positive (CD4+) T-Zellen in ihrer aktivierten Form auch T-Helferzellen genannt werden. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Interaktion mit MHC-I und MHC-II- Molekülen. Während CD8+ Zellen mit MHC-I interagieren, erkennen CD4+ Zellen Antigene, welche von MHC-II Molekülen präsentiert werden. Dabei ist zu beachten, dass MHC-I von allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert wird, wohingegen MHC-II „normalerweise“ nur auf antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen, Monozyten und B-Zellen zu finden ist. Für eine klonale Expansion und Differenzierung der T-Zellen zu Effektorzellen ist neben der Erkennung des MHC-Peptidkomplexes noch ein zweites, costimulierendes Signal essentiell, ohne welches sie sonst in Anergie fallen würden. Zu diesen essentiellen, costimulatorischen Molekülen gehören die Moleküle CD80 und CD86, welche von antigenpräsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen, exprimiert werden. Die costimulatorischen Signale interagieren mit dem CD28-Molekül der T-Zellen und führen dort u.a. zur Expression von Zytokinrezeptoren (wie den Rezeptor für Interleukin-2: IL-2R) sowie zur Bildung von Zytokinen wie bspw. Interleukin-2 (IL-2), welches wiederum zur Differenzierung und Proliferation der T-Zellen benötigt wird. Die durch eine solche Sequenz von RezeptorLigand-Interaktionen stimulierten T-Zellen werden nun als aktivierte T-Zellen bezeichnet, die nun keine Costimulation mehr benötigen, sondern bei Erkennung ihres MHC-PeptidKomplexes direkt ihre Effektorfunktion ausüben können. Aktivierte CD8+ T-Zellen können z.B. Zellen im Körper erkennen, die den entsprechenden MHC-I-Peptid-Komplex auf der Oberfläche tragen und lysieren diese. CD4+ T-Zellen können, abhängig von den Signalen und dominierenden Zytokinen während ihrer Aktivierung, zu Th-1 oder zu Th-2-Zellen differenzieren: Dominieren in der unmittelbaren Umgebung einer aktivierten „naiven“ CD4+ T-Zelle (Th0-Zelle) IL-12 und IFN-γ , so kann 23 Literaturübersicht sie sich in eine Th1-Zelle weiter entwickeln, während eine Dominanz an IL-4 die Entwicklung zur Th2-Zelle fördert. Aktivierte CD4+ T-Zellen exprimieren den CD40 Ligand (CD40L = CD154) und übermitteln ein Stimulierungssignal auf CD40-positive dendritische Zellen. Diese CD40-40L-Interaktion verstärkt die Funktion der dendritischen Zelle, die sich wiederum in einer erhöhten Expression kostimulatorischer Moleküle (CD80 und CD86), MHC- und Adhäsionsmoleküle sowie der Sekretion von IL-12 äußert (SCHOENBERGER et al. 1998; TOES et al. 1998). Diese dendritischen Zellen sind optimal in der Lage, antigenspezifische CD8+ T-Zellen zu induzieren. Zusätzlich moduliert das sezernierte IL-12 die Entwicklung der CD4+ T-Zellen in Richtung einer Th-1-Immunantwort. Dieses ZweiStufen-Modell der T-Zellaktivierung erklärt, warum eine CD4+-T-Helferantwort für eine zytotoxische T-Zellantwort notwendig ist: CD4+ T-Zellen stimulieren erst über CD40L die DC, die dann wiederum CD8+ T-Zellen effektiv stimulieren können. Bei der Bekämpfung transformierter Tumorzellen kommt den T-Zellen somit eine wichtige Rolle zu. Sie erkennen tumorassoziierte Antigene und vermögen im Falle der zytotoxischen T-Zelle die Tumorzellen direkt zu lysieren. Voraussetzung dafür ist allerdings ein MHCPeptid-Komplex auf der Tumorzelle, der erkannt werden kann und nicht als „erlaubtes“ Selbst registriert wird. 2.2.1.2 Tumorantigene Tumorzellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Antigene, die im Normalgewebe der Umgebung nicht vorkommen. Man bezeichnet sie generell als tumorassoziierte Antigene (TAA). Man kann bei diesen Antigenen aufgrund ihrer Herkunft fünf Klassen unterscheiden. Die erste Klasse stellen tumorspezifische Antigene dar, die spezifisch in einem bestimmten Tumor hochreguliert werden und aus mutierten Proteinen (z.B. Enzymen) bestehen. Eine zweite Klasse stellen die embryonalen Antigene dar, die während der Embryonalentwicklung exprimiert werden, später wieder verschwinden, und nur nach maligner Transformation der Zelle wieder auftauchen, wie z.B. das CEA (Carzinoembryonales Antigen). Eine dritte Klasse bilden Differenzierungs-Antigene, die sich aus der Gewebeherkunft des Tumors ableiten, beispielsweise Tyrosinase in Melanomen. Oncogene und Tumorsuppressorproteine gehören zu einer weiteren Antigen-Klasse, bei der bestimmte Epitope Immunantworten induzieren können. Virusprodukte wie z.B. Hüllproteine des Virus, repräsentieren in viral induzierten Tumoren die fünfte Klasse der möglichen tumorassoziierten Antigene. 24 Literaturübersicht Werden nun tumorassoziierte Antigene (TAA) von aktivierten T-Zellen erkannt, treten sowohl zelluläre als auch humorale Mechanismen der Immunkontrolle in Kraft. Beide Mechanismenbereiche sind funktionell miteinander verbunden und regulieren sich gegenseitig. Zum einen werden CD4+ und CD8+T-Zellen spezifisch durch antigenpräsentierende Zellen stimuliert und andererseits produzieren aktivierte BLymphozyten Antikörper gegen das Antigen. Beide Mechanismen führen zu einer Immunantwort gegen die transformierte Zelle und letztlich zu deren Lyse. Im Fall der CD8+T-Zellen werden die Tumorzellen direkt lysiert (zytotoxische T-Zellen), während über die Bindung von Antikörpern an das TAA natürliche Killerzellen und Makrophagen die Zelllyse induzieren (antibody dependent cellular cytotoxicity: ADCC). 2.2.2 Escapemechanismen von Tumorzellen Trotz eines in der Regel gut funktionierenden Immunsystems entkommen Tumorzellen dennoch der Immunüberwachung und es kommt zur Ausbildung von Tumoren. Die dafür verantwortlichen Mechanismen werden als „tumor escapemechanismen“ bezeichnet und stellen einen wichtigen Forschungsschwerpunkt dar, da nur bei Kenntnis des jeweiligen Escapemechanismus geeignete und effektive Therapien möglich sind. KUMAR u. PENNY (1982) teilen die zugrunde liegenden Mechanismen in vier Kategorien ein. Die erste stellt die schwache oder fehlende Immunogenität des Tumors dar, die zweite wird durch Immunsuppression durch Tumorantigene verursacht, die dritte Kategorie beinhaltet die Induktion von Suppressorzellen und die vierte die Produktion immunsupressiver Faktoren durch den Tumor. Die meisten Tumore bedienen sich mehrerer dieser Mechanismen parallel zueinander. Einer der Wege wie transformierte Zellen der Immunabwehr entgehen ist die Oberflächenexpression ihrer MHC-Moleküle zu reduzieren. So verhindern sie das 1. Signal, welches für eine T-Zelle zur Erkennung und zur Aktivierung benötigt wird. Ein Beispiel hierfür ist die reduzierte Expression von MHC-I-Molekülen auf Zellen des equinen Sarkoids (CHAMBERS et al. 2003b). Durch Selektion durch das Immunsystem können außerdem auch die Mengen an präsentierten Tumorantigenen soweit reduziert werden, dass überlebende Tumorzellen nicht mehr von T-Zellen erkannt werden. Ein weiterer Mechanismus stellt eine gewisse Resistenz der Tumorzellen gegen die T-Zell vermittelte Zelllyse dar. Sie erreichen das, indem sie z.B. die Oberflächenexpression des Fas-Rezeptors (CD95) reduzieren. Andere Tumorzellen erhöhen die Expression des Fas-Liganden (CD95L = CD178), was zu einer Apoptoseinduktion auf Fas-tragenden T-Zellen führen kann (TADA et al. 2003; WADA et al. 2007). Diese durch CD95/CD95L induzierte Apoptose von T-Zellen konnte durch DC in vitro 25 Literaturübersicht verhindert werden, wobei eine CD58 Interaktion als ursächlich für die Protektion angenommen wurde (DANIEL et al. 1999). Eine weitere Möglichkeit des Tumors dem Immunsystem zu entkommen, stellt die Sekretion immunsuppressiver Proteine oder Zytokine (z.B. TGF-β, IL 10) dar. MENETRIER-CAUX et al. (2001) konnten zeigen, dass einige Tumorzellen IL6 und M-CSF synthetisieren und somit die Differenzierung von CD34+ Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen hemmen. Diese Blockade der DC-Entwicklung ließ sich in vitro durch Stimulation der DC mit IL4 aber umgehen. RENKVIST et al. (2001) beschreibt zudem die Problematik, dass es sich bei den meisten TAA um Antigene aus dem eigenen genetischen Repertoire handelt, wie es z.B. bei den embryonalen Antigenen der Fall ist. Da solche Strukturen im Prinzip „erlaubt“ körpereigen sind, da sie in einer frühen Entwicklungsphase physiologische exprimiert werden, und autoreaktive T-Zellen im Thymus negativ selektioniert werden, ist somit auch eine Erkennung alleine nicht möglich. Auch das von Tumoren gebildete angionesische Zytokin „Vascular endothelial growth factor“ (VEGF), übt einen inhibitorischen Effekt auf die T-Zell-Stimulation durch DCs aus (LAXMANAN et al. 2005). 2.3 Dendritische Zellen Die ersten dendritischen Zellen (DC) wurden 1868 von Paul Langerhans in der Epidermis der Haut entdeckt, und anfangs für Zellen des Nervensystems gehalten. Die wirkliche Funktion dieser Zellen blieb allerdings lange unbekannt. STEINMAN et al. (1975) entdeckten 1975 eine bis dahin unbekannte Zellpopulation in der Milz von Mäusen, die sie ebenfalls als dendritische Zellen bezeichneten. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, dass diese dendritischen Zellen aus Knochenmarksvorläuferzellen hervorgehen und in allen lymphoiden und vielen nicht lymphoiden Geweben von Säugern und Nagern vorhanden waren (CROWLEY et al. 1989; HART u. FABRE 1981b). Noch wurde aber keine Verbindung mit den von Paul Langerhans entdeckten Zellen hergestellt und beide Zellpopulationen wurden getrennt voneinander untersucht. Erst später zeigte sich, dass beide Zelltypen zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen gehören, und dass Langerhanszellen aus der Haut in vitro zu maturen dendritischen Zellen mit starkem stimulatorischem Potential ausgereift werden können (SCHULER u. STEINMAN 1985). Dass diese Zellen eine zentrale Rolle für die Induktion einer Immunantwort einnehmen, konnten BOOG et al. (1988); HEUFLER et al. (1988) und STEINMAN et al. (1988) zeigen. KNIGHT et al. (1985) entdeckte, dass dendritische Zellen eine zentrale Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren bei Mäusen spielen. 26 Literaturübersicht 2.3.1 Subpopulationen dendritischer Zellen Bei dendritischen Zellen handelt es sich um eine sehr heterogene Zellgruppe, die sich in ihrer Lokalisation, der Expression unterschiedlicher Oberflächenmoleküle und in ihrer Funktion unterscheiden (LIPSCOMB u. MASTEN 2002; SHORTMAN 2000; SHORTMAN u. LIU 2002). Die erste Einteilung der DC wird über ihre Abstammung vorgenommen. So kann man zunächst zwischen myeloider und lymphoider Abstammung der DC unterscheiden. Aus pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks gehen zwei Vorläuferzelltypen hervor, die myeloiden Stammzellen (CD11c+) und die lymphoiden Stammzellen (CD11-). Aus den myeloiden Vorläuferzellen gehen u.a. Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten hervor. KIERTSCHER u. ROTH (1996) und ROMANI et al. (1996) konnten zeigen, dass aus den CD14+Monozyten des peripheren Blutes unter Zusatz von GM-CSF und Interleukin 4 (IL4) dendritische Zellen generiert werden können (MoDC). FEAU et al. (2005) beschreiben auch den Einsatz von IL15 anstelle von IL4, wobei sie jedoch zeigen konnte, dass mit IL15 generierte DC kaum in der Lage sind IL12 zu produzieren, was ihre stimulatorische Kapazität allerdings nicht beeinflusst (PULENDRAN et al. 2004). Direkt aus den CD34+ Zellen des Knochenmarks können ebenfalls dendritische Zellen gezüchtet werden (INABA et al. 1992; SHORTMAN u. CAUX 1997). Dabei stellte sich heraus, dass aus CD34+ Zellen zwei DCSubpopulationen entstehen können: die epidermalen Langerhanszellen und die interstitiellen DC. Die interstitiellen DC befinden sich in fast allen Organen (z.B. in Herz, Leber, Niere, Pankreas, Darm, Haut, Urogenitaltrakt, Schilddrüse) (HART u. FABRE 1981a). Diese Zellen zeigen einige Gemeinsamkeiten mit DC, die aus Monozyten differenziert wurden (KELLER 2001). CAUX et al. (1997) postulierten, dass nur interstitielle DC direkt B-Zellen zur Antikörpersynthese stimulieren können. Aus den lymphoiden, CD11- Vorläuferzellen gehen u.a. die B- und T-Lymphozyten hervor. ARDAVIN et al. (1993) nimmt an, dass dendritische Zellen und T-Zellen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle entstehen können. Diese DC werden auch als plasmazytoide DC bezeichnet und finden sich vor allem in den T-Zell-Regionen lymphatischer Organe (STROBL et al. 1998). Ein wichtiger funktioneller Unterschied zwischen plasmazytoiden DC (pDC) und MoDC wird in der Expression unterschiedlicher Toll-like-Rezeptoren (TLR) gesehen. So sollen MoDC die TLR 2, 3, 4 und 5 exprimieren, während pDC die TLR 7, 8 und 9 tragen (HOCHREIN et al. 2002). Neuere Untersuchungen konnten jedoch zeigen, dass sich CD8+ und CD8- dendritische Zellen sowohl aus myeloiden, als auch aus lymphoiden Vorläuferzellen generieren lassen (DEL HOYO et al. 2002). Dies zeigt, dass es sich bei der Heterogenität der DC-Subpopulationen um einen dynamischen Prozess handelt, dessen 27 Literaturübersicht Einflüsse und Ursachen noch nicht abschließend Differenzierungswege sind in Abb.2 dargestellt. bekannt sind. Einige der Abb. 2 Herkunft und Charakterisierung der DC-Populationen Myeloide und lymphoide DC können von CD34+ Vorläuferzellen des Knochenmarks und von BlutVorläuferzellen abgeleitet werden. Dafür sind verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und Zytokinen wie GM-CSF, TNF-α, IL-4, IL15 oder IL-3 erforderlich. Der Übersicht halber sind nur die gängigsten Differenzierungswege dargestellt; es bestehen aber durchaus Vernetzungen zwischen lymphoiden und myeloiden Zellen. 2.3.2 Lebenszyklus dendritischer Zellen Als antigenpräsentierende Zellen unterlaufen dendritische Zellen einen wohl definierten Lebenszyklus, in dessen Verlauf sich sowohl morphologische als auch funktionelle Änderungen vollziehen. In jedem Stadium ihrer Entwicklung üben DC eine charakteristische Funktion aus, die bei der Wahl der zu verwendenden DC zu unterschiedlichen therapeutischen Zwecken, zu berücksichtigen ist. Auch die verschiedenen Subpopulation sind bei der Auswahl zu berücksichtigen (LIU et al. 2005). So wäre es offensichtlich ein fataler Fehler, würde man immun-toleranz-induzierende DC für die Tumortherapie einsetzen. Nur genaue Kenntnis des DC-Reifungszustandes kann hier prophylaktisch wirksam sein. 28 Literaturübersicht 2.3.2.1 Rekrutierung von DC Frisch gebildete, sogenannte unreife (oder immature iDC) DC wandern vom Knochenmark durch den Blutstrom in nicht lymphatische Gewebe ein. Dort werden einige zu ortsansässigen DC z.B. durch Interaktion mit E-Cadherin bei Langerhanszellen (CAUX et al. 2000), während der größte Teil weiterwandert. Es befindet sich stets eine relativ konstante Zahl von DC in der Blutbahn. Dies gewährleistet, dass sie bei Anwesenheit eines Antigens schnell zum Ort der Noxe wandern können. Dafür müssen sie vom Endothel des Blutgefässes in das betreffende Gewebe gelangen, was die Interaktion mit verschiedenen Selektinen, Chemokinen und Integrinen erfordert (DEL et al. 2006). ROBERT et al. (1999) konnten zeigen, dass E- und PSelektine bei der Migration durch das Endothel notwendig sind. Dass Metalloproteasen für den Weg durch das Endothel von Bedeutung sind, konnte ebenfalls bewiesen werden (CAUX et al. 2000). Dabei wurde auch festgestellt, dass verschiedene inflammatorische Chemokine unterschiedliche DC-Subtypen rekrutieren können (CAUX et al. 2000). Unreife DC exprimieren z.B. die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR5, welche die Rezeptoren für einige inflammatorische Chemokine wie z.B. MIP-1α („macrophage inflammatory protein“), MIP1β und RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted) darstellen. Nach Reifeinduktion werden diese Chemokinrezeptoren wieder herunterreguliert und CCR7 wird exprimiert (COATES et al. 2004). Dieser Rezeptor erkennt Chemokine, welche in lymphoiden Organen produziert werden und sorgt dafür, dass die DC nach Antigenaufnahme die inflammatorischen Gebiete wieder verlassen können. 2.3.2.2 Antigenaufnahme In den meisten Geweben liegen DC in ihrer unreifen Form vor, in der sie kaum T-Zellstimulatorische Kapazität aufweisen, dafür aber sehr effektiv Antigene aufnehmen können. Dies kann durch Makropinozytose, rezeptorvermittelte Endozytose oder Phagozytose vonstatten gehen. Durch Makropinozytose können von DCs bis zu 3µm große Vesikel aufgenommen werden, während andere Zellen nur Moleküle bis zu 1µm Durchmesser aufnehmen können. Die rezeptorvermittelte Endozytose erfordert die Bindung eines Antigens an einen Rezeptor auf der DC. Dafür exprimieren DC z.B. Fc-Rezeptoren (BAJTAY et al. 2006; SALLUSTO et al. 1995), das Mac-1-Molekül (CD11b/CD18-Komplex), CD14 (RESCIGNO et al. 1999), den Mannoserezeptor, DEC-205 (JIANG et al. 1995; SALLUSTO et al. 1995; TAN et al. 1997) und eine Reihe von Toll-like-Rezeptoren (TLR) (MEDZHITOV 2001). Über Fc-Rezeptoren werden Antigene aufgenommen, die an Antikörper gebunden haben. Der Rezeptor erkennt dabei den Fc-Teil des Antikörpers. Mac-1 befindet sich dagegen in intrazellulären Vesikeln der DC und wird erst nach einem Chemokinsignal an die 29 Literaturübersicht Zelloberfläche transportiert. Dort fungiert das Molekül als Rezeptor für die Komplementkomponente C3b und initialisiert die Phagozytose komplementgebundener Bakterien. Der Mannose-Rezeptor zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Karbohydraten aus und ist daher für die Internalisierung von mannosylierten Proteinen von Bedeutung. CD14 gilt als Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid (LPS, Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien) und lipopolysaccharidbindendem Protein (LBP). Die Toll-likeRezeptoren 2 und 4 (TLR2 und TLR4) konnten ebenfalls als Rezeptoren für LPS identifiziert werden (POLTORAK et al. 1998; VISINTIN et al. 2001; YANG et al. 1998). Diese Rezeptoren gehören der Familie der Transmembranrezeptoren Typ I an, von denen mittlerweile eine ganze Reihe beim Menschen identifiziert werden konnten. Jeder TLR hat dabei seine spezifischen Liganden und löst bei Bindung eine spezifische Immunantwort aus (MEDZHITOV 2001, THOMA-USZYNSKI et al. 2000). Werden DC z.B. über den TLR-2 aktiviert, sezerinieren die Zellen das IL12 inhibierende Homodimer p40, was eine Th2 polarisierte Immunantwort unterstützt, während eine Aktivierung der DC über TLR-4 zur Sekretion von IL12 und IFNγ und einer damit einhergehenden Th1 Polarisation führt (MEDZHITOV 2001; RE u. STROMINGER 2001; THOMA-USZYNSKI et al. 2000). Nekrotisches oder apoptotisches Zellmaterial wird von DC meist durch Phagozytose aufgenommen wobei die DC das Material mit pseudopodienartigen Ausläufern umschließen. MAHNKE et al. (2003) diskutieren den Einfluss der Antigenaufnahme auf die Funktion der DC. Sie postulieren, dass die Art des Antigens und der Weg der Aufnahme in die DC entscheiden, ob eine periphere Toleranz oder Immunantwort induziert wird. 2.3.2.3 Antigenprozessierung und Antigenpräsentation Dendritische Zellen können Antigene über MHC-I und MHC-II-Moleküle präsentieren. Über welches Molekül das Antigen präsentiert wird, entscheidet meist die Herkunft des Antigens. Wird eine Zelle beispielsweise durch Viren transformiert, synthetisiert sie Proteine im Zytosol, die von dem Virusgenom codiert werden. Diese Proteine viralen Ursprungs werden, wie alle zellulären Proteine und somit auch Tumorantigene, im Zytosol mit Ubiquitin markiert und durch sogenannte multikatalytische Proteasenkomplexe (Proteasome) der Zelle zu Peptidfragmenten gespalten. Dieser Vorgang wird als Prozessierung bezeichnet. Durch die Prozessierung entstehen viele kleine Peptidfragmente, welche zu sogenannten TAPMolekülen („transporters associated with antigen processing“) transportiert werden. Ihre Aufgabe besteht in dem Transport der Peptide in das Endoplasmatische Retikulum der Zelle, wo die Beladung und Bildung der MHC-I-Moleküle stattfindet. Dieser Peptid-MHC-I Komplex wird nun über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche gebracht, wo er von TZellen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) erkannt wird. Auch das MHC-II- 30 Literaturübersicht Molekül wird im endoplasmtaischen Retikulum gebildet, allerdings wird dort die Bindungsstelle für das Peptid von einer invarianten Kette blockiert und das MHC-II-Molekül stabilisiert. Fusioniert aber ein Endosom mit aufgenommenen, exogenen Proteinen mit dem MHC-II-Molekül, wird die invariante Kette abgespalten und das MHC-II-Molekül kann das antigene Peptid binden. Nach Fusion des Endosoms mit der Plasmamembran der Zelle wird der Peptid-MHC-II-Komplex auf der Zelloberfläche präsentiert. Zu beachten ist aber, dass die Prozessierungswege der Proteinspaltung und MHC-Beladung von MHC I und II nicht absolut getrennt sind. REIMANN et al. (1994) konnte zeigen, dass auch exogene, aufgenommene Proteine über MHC-I präsentiert werden können. Dieser Mechanismus der exogenen MHC-I-Beladung wird auch als „cross presentation“ bezeichnet. Bei dendritischen Zellen konnte zudem ein Weg der MHC-I-Beladung gezeigt werden, der die Notwendigkeit der Aufnahme exogener Proteine sogar gänzlich umgeht (DAVOUST u. BANCHEREAU 2000). Es wird postuliert, dass sich auf der Zelloberfläche Proteasen (z.B. die Metalloprotease CD13) befinden, welche Proteine spalten können und leere MHCMoleküle auf der Zelloberfläche direkt mit Peptiden beladen werden. Ob allerdings mögliche Peptidliganden für das MHC-I-Molekül in den Proteasomen der Zelle gespalten werden können, hängt von der Aminosäurefrequenz und dem c-terminalen Ende des Proteins ab. TANAKA u. KASAHARA (1998) zeigten, dass IFN-γ in Zellen einen Wechsel innerhalb der Proteasomen hervorruft. Die katalytischen Untereinheiten, auch als β1, β2 und β5 bezeichnet, werden durch homologe Untereinheiten ersetzt und bilden die sogenannten Immunproteasomen. Der Unterschied beider Proteasomtypen liegt dabei in ihrer Spaltungspräferenz, wobei Immunproteasomen bezüglich ihrer Produktion MHC-I bindender Peptide effizienter sein sollen. Auch hier bilden dendritische Zellen eine Ausnahme, da sie konstitutiv Immunproteasomen besitzen, unabhängig von einer vorherigen Induktion durch INF-γ. Unreife DC, wie sie zum Beispiel aus Monozyten des peripheren Blutes generiert werden können, enthalten nach MACAGNO et al. (1999) Proteasomen und Immunproteasomen in gleichen Mengen, wohingegen voll ausgereifte DC (siehe 2.3.2.4) nur Immunproteasomen tragen. 2.3.2.4 Reifung dendritischer Zellen Nach der Antigenaufnahme begeben sich die DC auf eine Wanderung über die afferenten Lymphbahnen zu den Lymphknoten. Während dieser Wanderung vollziehen sich eine Reihe von phänotypischen, morphologischen und funktionellen Veränderungen (JONULEIT et al. 1996; JONULEIT et al. 1997; SALLUSTO et al. 1995). Die unreife (immature), 31 Literaturübersicht antigenaufnehmende Zelle (iDC) wird durch diese Veränderungen zu einer reifen (maturen), antigenpräsentierenden Zelle (mDC) mit hoch effizientem stimulatorischem Potential. Es kommt zu einer erhöhten Expression von MHC-I und MHC-II-Molekülen, sowie der Kostimulations- und Adhäsionsmoleküle wie z.B. CD80, CD86, CD83, CD54 und CD40. CD83, dessen Funktion noch nicht hinreichend bekannt ist, wird dabei als besonderer Reifungsmarker angesehen (LECHMANN et al. 2001). Ferner wird die Expression des Homing-Faktors CCR7 induziert und die Expression anderer Chemokinrezeptoren (z.B. CCR6) vermindert. Der Reifungsprozess ist zudem durch die Sekretion verschiedener Zytokine und einiger morphologischer Veränderungen charakterisiert. So zeigen reife DC (mDC) sehr lange Ausläufer, wahrscheinlich um ihre Oberfläche zu vergrößern und so T- und B- Lymphozyten mehr Kontaktfläche zu bieten. In den T-Zellregionen der Lymphknoten findet schließlich die antigenspezifische Stimulation der Lymphozyten durch die maturen DC (mDC) statt (STEINMAN et al. 1988; STEINMAN 1991). Die Reifung der DC stellt funktionell einen sehr wichtigen Prozess dar, da unreife DC keine Immunantwort, sondern Toleranz induzieren (JONULEIT et al. 2000; JONULEIT et al. 2001). In vitro kann die Reifung der iDC zu mDC u.a. durch Zugabe von TNFα (SALLUSTO u. LANZAVECCHIA 1994), CD40-Ligand (BANCHEREAU et al. 1995; FELZMANN et al. 2001), LPS (SALLUSTO et al. 1995) und monozytenkonditioniertem Medium (REDDY et al. 1997) induziert werden. Daneben werden verschiedene Zytokincocktails beschrieben, die ebenfalls eine in vitro Reifung der DC induzieren sollen. STEINBRINK et al. (2000) geben ein Gemisch aus IL1β, IL6, TNFα und Prostaglandin E2 an. 2.3.3 Einsatz dendritischer Zellen als Tumorvakzine In der Onkologie werden immunologische Therapieansätze mitunter als die vierte Säule der Tumorbekämpfung bezeichnet (neben Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie). Besonders dendritische Zellen werden als vielversprechende Immuninduktoren gesehen, da sie den Angelpunkt jeder durch Lymphozyten vermittelten Immunität darstellen. Zahlreiche Studien wurden in der Humanmedizin durchgeführt, die beweisen sollten, dass DC in der Lage sind Tumorescapemechanismen zu durchbrechen. Dabei finden unterschiedlichste Verfahren der DC-Generierung, Antigenbeladung und DC-Applikation ihre Verwendung. 32 Literaturübersicht 2.3.3.1 Auswahl verschiedener Generierungsmethoden 2.3.3.1.1 Gewinnung der DC bzw. Vorläuferzellen Schon die Gewinnung dendritischer Zellen kann durch unterschiedliche Verfahren erfolgen. Mit Hilfe von Antikörper-Kits können sie z.B. direkt aus humanen Blut gewonnen werden, wie DZIONEK et al. (2000) zeigen konnten. Da allerdings die Menge der im Blut zirkulierenden DC sehr gering ist, werden die CD34+-Vorläuferzellen und somit die Blut-DC zum Teil durch Applikation von Flt3 Liganden („fms like“ tyrosine kinase 3 ligand) expandiert (MORSE et al. 2000; ROSENZWAJG et al. 1998). Aber auch durch Kultivierung der CD34+ Vorläuferzellen mit GM-CSF und TNFα lassen sich DC generieren (CAUX et al. 1997). Direkt aus dem Gewebe können DC mit Hilfe von Cell-Sortern isoliert werden (CROWLEY et al. 1990). Um größere Mengen an DC zu generieren, haben sich Monozyten des peripheren Blutes als gute Ausgangspopulation erwiesen. Sie besitzen die Fähigkeit, in Abhängigkeit des umgebenden Milieus, in Makrophagen oder dendritische Zellen zu differenzieren. Die Separation der monozytoiden Zellen kann über Plastikadhärenz, magnetic-cell-sorting (MACS) oder Dichtegradientenzentrifugation erfolgen. Für die Separation equiner Monozyten beschrieben HAMMOND et al. (1999) eine Methode, bei der zunächst mit Hilfe eines Dichtegradienten mononukleäre Zellen aus Vollblut aufgereinigt und schließlich über Plastikadhärenz Monozyten angereichert wurden. Eine leicht modifizierte Methode wendete MAUEL (2002) an. Durch eine zweimalige Überschichtung der MNC auf unterschiedliche Dichtegradienten und mehrere Adhäsionspassagen konnte sie die Reinheit und Ausbeute equiner Monozyten erhöhen, erzielte jedoch lediglich 1-5 x106 Monozyten aus 500ml Vollblut. Laut ELKORD et al. (2005) hat schon der Schritt der Monozytenaufreinigung einen erheblichen Einfluss auf die Zytokinproduktion der später generierten DC. Monozyten, welche über CD14 positiv im MACS selektioniert wurden, zeigten als mDC z.B. eine geringere Produktion der Zytokine IL12 und TNFα als mDC, welche aus über Plastikadhärenz gewonnenen Monozyten generiert wurden. Generell führt eine Aufreinigung der Monozyten, bei der die Monozyten über ihre Oberflächenmoleküle positiv selektioniert werden, zu unspezifischen Aktivierungen, die nicht genau voraussagen lassen, welche Funktionalität die generierten DC später aufweisen. Um also möglichst wenig Einfluss auf die Zellen auszuüben ist es daher von Vorteil, die Zellen so wenig wie möglich zu manipulieren. Eine elegante Methode der Anreicherung wird von DE ALMEIDA et al. (2000) beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, dass über Dichtezentrifugation mit hypertonem Percoll® eine gute Reinheit und gute Ausbeute von Monozyten aus Buffycoats möglich ist. Zu Grunde liegender Mechanismus soll dabei sein, 33 Literaturübersicht dass Lymphozyten, die sonst eine fast identische Dichte wie Monozyten aufweisen, empfindlicher auf die Hyperosmolalität reagieren. Durch Wasserverlust sollen die Lymphozyten eine höhere Dichte annehmen und sich so besser von den Monozyten trennen lassen. 2.3.3.1.2 Differenzierung monozytoider Zellen zu DC in vitro Die Generation dendritischer Zellen aus monozytoiden Vorläuferzellen stellt für DC (MoDC) zur therapeutischen Anwendung meist das Verfahren der Wahl dar, da sie sich in großen Mengen kultivieren lassen und zur Gewinnung der monozytären Vorläuferzellen nur eine Blutentnahme erforderlich ist. Die eingesetzten Zytokine zur Differenzierung der Monozyten variieren allerdings. Anstelle von IL4 finden auch IL15, TNFα oder INFα ihren Einsatz um MoDC zu erhalten. Die generierten DC unterscheiden sich dabei sowohl in ihrer Homogenität, als auch in ihrer Zytokinsekretion. So sollen IL4-DC eine homologe Population darstellen, ohne Langerhanszellen, wohingegen TNF-DC heterogene Populationen mit CD1a+ Langerhanszellen und CD14+ interstitiellen DC ergeben (CHOMARAT et al. 2003). Nach MOHAMADZADEH et al. (2001) und PULENDRAN et al. (2004) sollen IL15-DC zudem besser als IL4-DC in der Lage sein cytotoxische T-Zellen zu stimulieren. Die Kapazität zur Stimulation CD4+ T-Zellen hingegen ist bei beiden Subtypen gleich. Für INF-α-DC konnte schon nach drei Tagen Kultur ebenfalls eine starke Stimulationskapazität cytotoxischer TLymphozyten beobachtet werden (SANTINI et al. 2000; SANTINI et al. 2003; SANTINI et al. 2005). Doch nicht nur die Generierung der DC führt zu unterschiedlichen DC-Subtypen, sondern auch die verwendeten Stimuli zur Ausreifung der Zellen. Wie schon in Kapitel 2.3.2.4. beschrieben, können TNFα, CD40-Ligand, LPS und monozytenkonditoniertes Medium verwendet werden. Verschiedene Zytokincocktails wie z.B. ein Gemisch aus IL1β, IL6, TNFα und Prostaglandin E2 sollen ebenfalls zu stimulationspotenten, maturen DC führen. Welcher Stimulus allerdings der beste ist, bleibt noch Gegenstand der aktuellen Forschung, wenn auch gezeigt werden konnte, das die Kombination von IL1β und TNFα mit Typ I und II Interferonen (INFα und INFγ) in vitro zu einer starken IL12 Sekretion und tumorspezifischen CTL-Induktion führt (MAILLIARD et al. 2004). 2.3.3.1.3 Antigenpulsing der DC Eine weitere Frage, die bei der therapeutischen Anwendung von DC als Tumorvakzine berücksichtigt werden muss, ist die, ob, und wenn ja, wie DC mit Antigen beladen werden. Meist werden sie in vitro mit definierten Peptiden beladen, was für „proof-of-principleStudien“ essentiell ist, da nur so überwacht werden kann, ob eine antigenspezifische T-ZellAktivierung stattgefunden hat. Um DC mit Antigenen zu beladen, kommen viele Methoden in 34 Literaturübersicht Betracht. Neben der Fusionierung von DC mit Tumorzellen, der Transfektion der DC mit Tumor-DNS oder -RNS kommen auch heterocyclische Peptide oder Tumorzelllysate zur Pulsung (Beladung der MHC-Moleküle auf DCs) zum Einsatz. Einen direkten Vergleich zwischen mit Tumorzellen fusionierten DC und mit Lysat gepulsten DC, stellten WEIGEL et al. (2006) bei Mäusen an, und konnten keinerlei Unterschiede bezüglich der tumorprotektiven Immunantwort ausmachen. BANCHEREAU u. PALUCKA (2005) sehen generell einen Nachteil bei dem Pulsen von DC mit einzelnen Peptiden aufgrund von Immunselektion und mangelnder Diversität der antigenen Strukturen. Ein Pulsen mit möglichst vielen verschiedenen Peptiden über physiologische Prozessierungswege soll die effizienteste Antigenpräsentation induzieren. 2.3.3.1.4 Dosis und Applikationsroute von DC zur Tumortherapie Werden gepulste DC zur Tumortherapie eingesetzt, stellt sich schließlich die Frage der Dosis und des Applikationsweges. Hier gibt es folgende Ansätze: Eine intranodale Gabe unter Ultraschallkontrolle in einen vom Tumor entfernten Lymphknoten, um die DC direkt an den Ort der DC-T-Zell-Interaktion zu bringen (NESTLE et al. 1998), eine intravenöse Injektion (HOLTL et al. 1999) oder die intrakutane Injektion (FONG et al. 2001). BEDROSIAN et al. (2003) verglich die Applikationsrouten in einer klinischen Studie mit an malignen Melanomen erkrankten Patienten und fand heraus, dass alle drei Routen zu einem starken Anstieg tumorspezifischer CD8+T-Zellen führen. Dennoch konnte hier gezeigt werden, dass, gefolgt von der intradermalen Applikation, die intranodale Route zu einer höheren Stimulationsrate führte als die intravenöse Verabreichung. LINETTE et al. (2005) untersuchte u.a. die Toxizität der verabreichten DC. Bei Patienten mit verschiedenen Tumorarten wurden 10x106, 15x106 und 50x106 DC pro i.v. Applikation verwendet. Alle Patienten vertrugen die Therapie sehr gut. Einen direkten Einfluss auf den Therapieerfolg kann man aufgrund der sehr heterogenen Patientengruppe leider nicht einer Dosis zuordnen. In einer weiteren Studie konnten LEE et al. (2006) jedoch einen Einfluss der DC-Dosis auf die tumorprotektive Immunantwort bei Mäusen mit Melanomen nachweisen. Je mehr DC sie einsetzten, desto besser war die immunologische Respons der Tiere und desto höher deren mittlere Überlebenszeit. 2.3.3.2 Immunologische Überlegungen zum Einsatz dendritischer Zellen zur Therapie des equinen Sarkoids Da bisher noch keine ausreichend effektiven Behandlungen für das equine Sarkoid zur Verfügung stehen, liegt es nahe, dendritische Zellen des Pferdes zu generieren und als Tumorvakzine einzusetzen. Folgende Überlegungen spielen dabei eine Rolle: Welche 35 Literaturübersicht Tumorantigene werden von den Tumorzellen exprimiert? Welcher Escapemechanismen bedient sich der Tumor und welche Immunantwort soll induziert werden? In Kapitel 2.1.2.1.2 wurde schon erwähnt, dass z.B. die MHC-I-Expression auf transformierten Zellen durch das Tumorsuppressorprotein E5 herunterreguliert wird. Somit wäre, neben einer direkten cytotoxischen, Antikörper vermittelte Immunreaktionen von Vorteil, um den Mechanismus der antikörperabhängigen Zytotoxizität zu nutzen. Da DC in der Lage sind sowohl B- als auch T-Zellen zu stimulieren, scheinen sie ein geeignetes Mittel zur Induktion beider Immunantworten darzustellen. Geht man zusätzlich davon aus, dass der Tumor z.B. durch IL10 oder M-CSF (siehe Kapitel 2.2.2.) die Entwicklung von Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen hemmt, liegt es nahe, in vitro generierte unreife MoDC direkt in das transformierte Gewebe zu injizieren. Dort können sie geeignetes Tumorantigen aufnehmen und schließlich auf dem Weg zum Lymphknoten unter physiologischen Bedingungen ausreifen. KIM et al. (2004) konnten zeigen, dass bei Patienten, die unreife DC nach Tumorbestrahlung intratumoral appliziert bekamen, eine starke tumorspezifische Immunantwort ausgelöst wurde. Zudem wurde in equinen Sarkoiden immunhistochemisch nur eine sehr geringe Menge DC nachgewiesen (STARK 2005). Entscheidender Faktor bei dieser Methode war allerdings die Bestrahlung des Tumors, da ein inflammatorisches Mileau innerhalb des Tumors entstand, welches zur Reifung der DC nach Antigenaufnahme führte. Ohne zusätzliche Tumornoxe wäre die Gefahr der Toleranzinduktion nicht auszuschließen, da STEINMAN (2003) und STEINMAN et al. (2003) zeigen konnten, dass unreife DC bzw. reife DC ohne finalen Stimulus durch ein Gefahrensignal zu einer T-Zell-Deletion oder Anergie führen können. Allerdings ist auch bei in vitro gepulsten DC diese Gefahr nicht auszuschließen, da eine Toleranzinduktion ebenfalls von der Art der Antigenaufnahme bzw. des Rezeptors abhängig zu sein scheint. So soll z.B. eine simultane Antigenbindung des macrophage- mannose- Rezeptors (MMR), des DC-SIGN ( = CD209) und der TLRs mit Mycobakterien die DC-Reifung blockieren, indem ihre IL12Produktion heruntergefahren und die IL10 Produktion angeregt wird. Werden nur TLRs beladen, führt dies zu einer Aktivierung der DC und Sekretion von IL12 (MAHNKE et al. 2003). Die von JONULEIT et al. (2001) gemachten Beobachtungen, bei denen unreife DC im Gegensatz zu reifen DC in vivo keine tumorantigenspezifischen CTL induzierten, kann darauf beruhen, dass die DC intranodal in Lymphknoten appliziert wurden. Eine Reifung der DC während der Migration zu den Lymphknoten konnte somit nicht stattfinden. 36 Geräte, Material & Methoden 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“ Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“ Autoklav Typ GE406 Axioskop, Olympus DP 70 Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Centricon®3 – Filtrationssystem CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) (Getinge AB, Getinge/Schweden) (Zeis, Oberkochen) (Heraeus, Hanau) (Wartewig (6.001.000), Göttingen) (Amicon, Beverly/MA, USA) (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel (Alloy Products, (XX670053) pressure vessel“ Waukesha, USA) Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) ELISA-Platten Photometer MR 5000 (Dynatech, Denkendorf) ® Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan , (Becton Dickinson, Heidelberg) mit angeschlossener Computereinheit Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und (Zeiss (476250-9901), Oberkochen) Phasenkontrasteinrichtung Gammacell2000 (Bestrahlungsgerät) (Genese a/s, Tureby, Dänemark) Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau) Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen) Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, (Heraeus Instruments GmbH, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Osterode) Mikrotiterplattenrotor Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz) Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin) Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen) Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen) Osmometer OM 801 (Vogel, Giessen) Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µl) (Brand (09U2539), Wertheim) Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl, (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich) 20-200 µl, 100-1000 µl) Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand (26404), Wertheim) Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel) Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Instruments GmbH, Osterode) Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus, Hanau) Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ (ASID, Unterschleißheim) 37 Geräte, Material & Methoden Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ Schere, rostfrei Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“ Tiefkühltruhe bis -80°C Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ WinMDI, Auswertungsprogramm für Durchflusszytometerdaten, Version 2.8 Zählkammer nach Bürker Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (ASID, Unterschleißheim) (Dynatech, Denkendorf) (Fisher Scientific (9204013), Schwerte) (Heidolph (52100), Schwabach) (Einzelhandel) (Wifug (10209), Bradford/England) (Hermle, Gosheim) (GFL, Hannover) (TROTTER 1997) (Brand, Wertheim) (Heraeus Instruments GmbH, Osterode) 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf Einmalspritzen Luer steril 5 ml Einmalspritzen Luer steril 10 ml Einmalspritzen Luer steril 50 ml „Plastipak®“ Einmalskalpelle Figur 22 Cutfix Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Skin® sensitive“ Kanülen 1,80 x 40 m/m, steril „TSK STERIJECT“ (AMEFA (302010), Limburg) (AMEFA (302020), Limburg) (Becton Dickinson (300865), Drogheda/Irland) (ReboPharm (BA222), Bocholt) (Meditrade® (1221R), Kiefersfelden) (TSK-Supra, Kastner Praxisbedarf GmbH, Rastatt) Mullkompressen 10x10 cm (Noba (863110), Wetter) Penicillin-Dihydrostreptomycin Injektionssuspension (Veterinaria AG, Zürich) Scandicain Injektionslösung 2% (AstraZeneca, Zug) Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson (367300), Heidelberg) Vacutainer Halterung (Becton Dickinson, Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, ohne Zusatz (Becton Dickinson (368430), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA-K2 (18 mg) (Becton Dickinson (367525), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, Na-Heparin (170 IU) (Becton Dickinson (368480), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 4,5 ml, 3Na-Citrat (0,109mol/l, (Becton Dickinson (367704), 3,2%) Heidelberg) 38 Geräte, Material & Methoden 3.2.2 Laborbedarf Chamber-Slides System 177429 Combitips 1,25 ml Combitips 2,5 ml Einmal-Filter, 0,2µm Einmal-Filter, 0,45µm Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen Flachboden-Zellkultur-Makroplatte mit Abdeckplatte, 6 Vertiefungen Fotoapparat, Digitalkamera Homogenisator aus Glas 15ml Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml Mini & MidiMACS Starting Kit Nylon preseperation Filter 30 µm Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Petrischale (Durchmesser 94 mm) Pipettenspitzen, gelb und blau Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml Saugpipetten (10 ml) Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen (Falcons, steril) Zentrifugenröhrchen, 15 ml aus Polypropylen (Falcons, steril) Zellkulturflaschen, 200 ml Zellkulturflaschen, 75 ml Zellkulturplatten 6-Well (Cellstar® Makroplatte) Zellschaber 24 cm 39 (Nunc (177429), Wiesbaden) (Eppendorf (0030069.420), Hamburg) (Eppendorf (0030069.447), Hamburg) (Renner (06001), Darmstadt) (Renner (06002), Darmstadt) (Merck (612F1767), Darmstadt) (Sarstedt (72699), Nürnbrecht) (Greiner (616201), Frickenhausen) (Biochrom (P92960), Berlin) (Greiner (657160), Frickhausen) (Einzelhandel) (Wheaton, (357544), Millville,USA) (VWR international (215L1516), Hannover) (Myltenyi Biotech (130042501), Bergisch Gladbach) (Myltenyi Biotech, Bergisch Gladbach) (Brand (747720), Wertheim) (Greiner (633171), Frickenhausen) (Sarstedt (70/762002) (70/760002), Frickenhausen) (Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz) (Corning (430791), New York, USA) (Becton Dickinson (352008), Heidelberg) (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) (Corning (430829), Wiesbaden) (Sarstedt (62554502), Nürnbrecht) (Nunc (156499), Wiesbaden) (Nunc (136196), Wiesbaden) (Greiner (657160), Frickenhausen) (Techno Plastic Products AG (99002), Trasadingen, Schweiz) Geräte, Material & Methoden 3.2.3 Reagenzien Accustain® (Färbelösung nach Wright, modifiziert) (Sigma (WS16), Steinheim) Acridin-Orange Albumin, bovin, Fraktion V, 98% pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin) Aminosäuren MEM non essential amino acids (Sigma (A6014), Steinheim) (PAA Laboratories GmbH (K41-001100), Cölbe) (PAA Laboratories GmbH (M11003), Cölbe) (Pierce (23225), Rockford) (Sigma-Aldrich (2314487), Buchs) (PAA Laboratories GmbH (E15810), Pasching) (CG Chemikalien, Laatzen) (Baker (8228), Deventer/Holland) (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim) (Sigma-Aldrich (66H1185), Steinheim) (Biochrom (S0 113/431B), Berlin) Bicinchoninicacid (BCA) – Assay Kit Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) DMEM-Medium mit 4,5 g Glucose und L-Glutamin Ethanol 641, absolut vergällt Ethanol absolut Ethidiumbromid Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA) Fetales Kälberserum (FCS) Virus und Mykoplasmen getestet Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) Granulozyten-Monozyten-Kolonie-StimulierenderFaktor (GM-CSF), human, rekombinant Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Leukoagglutinin (LAG) Lipopolysacharid von Escherichia coli (Serotyp 055: B5) Lymphozytenseparationsmedium® (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim) (Cell Concept (04130), Umkirch) (Roth (8174.1), Karlsruhe) (Sigma (L2769), Deisenhofen) (Sigma-Aldrich (L2637), Steinheim) (PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich) 2-Mercaptoethanol (J. T. Baker (8683), Groß Gerau) MEM-Medium mit EARLES Salz und L-Glutamin (PAA Laboratories (E15-825), Pasching) Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim) Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe) (Merck KGaA (91645045037), Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Darmstadt) Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim) Penicillin(-G)-Streptomycin (Biochrom (A2213), Berlin) PercollTM (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) (Pharmacia (17089101), Freiburg) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, (Biochrom (L18210), Berlin) ohne Ca++/Mg++ Phycoerythrin (PE) (Dianova (115015068), Hamburg) Propidiumiodid (PI) (Calbiochem (537059), Bad Soden) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) (Baker (6081), Deventer/Holland) Sodiumcitrat (C6H5Na3O7.2H2O) (Sigma-Aldrich (70K0124), Steinheim) 40 Geräte, Material & Methoden 3.2.4 Antikörper und Nachweisreagenzien 3.2.4.1.1 Monoklonale Antikörper (Primärantikörper) In Tabelle 1 sind alle Antikörper aufgeführt, die zur primären Charakterisierung der Zellen in der Membranimmunfluoreszenz, zur Herstellung der Referenzzellen und zur magnetischen Zellseparation verwendet wurden. Tab.1. Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz und zur magnetischen Zellseparation Name Spezifität Donor/ Finale Isotyp Verdünnung Referenz / Bezug Bo 1 anti MHC-I Maus/IgG1 1:1 (SCHUBERTH et al. 1991) CZ4 anti equine Maus/ IgG1 1:10 (LUNN et al. 1998) MHC I CZ11 anti equine MHC II Maus/ IgG1 1:10 (LUNN et al. 1998) CVS 4 anti equine CD4 Maus/IgG1 1:5 (AcrisAntibodies GmbH 130504, Hiddenhausen) CVS 8 anti equine CD8 Maus/IgG2 1:10 (LUNN et al. 1991) HB15e anti human Maus/IgG1 1:10 (BD Pharmingen 556854) Maus/IgG2b 1:10 (BD Pharmingen 555663) Maus/IgG2a 1:10 (BD Pharmingen 555396) CD83 IT2.2 anti human CD86 M5E2 anti human CD14 134 anti equine IgE Maus/IgG1 1:4 (WAGNER et al. 2003) TÜK4, Maus IgG2a 1:11 FITC konjugiert anti human CD14 (Miltenyi Biotec 130080701, Bergisch Gladbach) *155-2 (W3-002) anti bovine Maus IgG1 1:2 (LUNN et al. 1998) Maus IgG2a 1:7 (LUNN et al. 1998) CD25 *CC199 (W3-009) anti bovine WC1? 41 Geräte, Material & Methoden *36H10 (W3-060) anti bovine Gr.,M, active.ag Maus IgG2b 1:3 (LUNN et al. 1998) Verdünnungen der verwendeten primären Antikörper wurden mit MIF-Puffer (3.2.5.3.8) durchgeführt. Die mit * markierten Antikörper sind für bovine Oberflächenstrukturen spezifisch und zeigten bei equinen Zellen keine Bindungen (LUNN et al. 1998), weshalb sie als Isotypkontrollen (3.3.8) eingesetzt wurden. 3.2.4.1.2 Sekundärantikörper Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz dienten gereinigte, polyklonale Antikörperpräparationen. Für die magnetische Zellseparation wurden anti-FITCMicroBeads eingesetzt (Tertiär-Antikörper), welche an einen FITC-konjugierten Sekundärantikörper binden. Die verwendeten Sekundärantikörper sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2. Verwendete Sekundärantikörper Name Spezifität Donor/ Isotyp Finale Verdünnung Bezug Polyklonale AK, anti-Maus IgG Ziege 1:100 (Dianova 115 015 068, Zur Herstellung von Referenzzellen 1:40 Hamburg) konjugiert mit + IgM (H+L) Fluoreszeinisothiocyanat Anti-FITC anti-FITC MicroBeads Anti-Maus Maus/ 10µl auf 107 Zellen (Miltenyi Biotec 130048701, Bergisch Gladbach) IgG1 anti Maus IgG1 Ratte 10µl auf 107 Zellen (Miltenyi Biotech, Bergisch MicroBeads Ziege-anti-Maus IgG + IgM (H+L) Gladbach) anti Maus IgG + IgM Ziege 10µl auf 107 Zellen (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., konjugiert mit Phycoerythrin (PE) 115 116 146) 42 Geräte, Material & Methoden 3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen 3.2.5.1 Zellkulturmedium MEM with Earles Salts Dem „minimal essential“ Medium (MEM) mit Earles Salz und L-Glutamin (3.2.3) wurden folgende Substanzen zugesetzt: • Autologes Serum 3% (frisch, nicht inaktiviert (3.3.1.2) • 100U/ml G-Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (3.2.3) Das Medium wurde für jeden Versuch frisch angesetzt und jeweils frisches, autologes Serum zur Supplementierung verwendet. 3.2.5.2 Komplettes Dulbecco´s MEM (kDMEM) Medium Dulbecco´s minimal essential- Medium (DMEM) (3.2.3) wurde mit folgenden Zusätzen supplementiert: • 1% (v/v) nichtessentielle Aminosäuren (3.2.3) • 100U/ml G-Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (3.2.3) • 10% (v/v) FCS (durch Inkubation bei 56°C für 60 Minuten im Wasserbad komplement- und mykoplasmeninaktiviert (3.2.3)) Für die Proliferationsversuche mit req.IL 4 wurde dem Medium des Weiteren • 50µmol 2-Mercaptoethanol, (3.2.3) für die gemischte Leukozytenreaktion (MLR) (3.3.12) wurden • 20µmol 2-Mercaptoethanol zugesetzt. (3.2.3) 3.2.5.3 Material für die Separation von Zellen 3.2.5.3.1 Lymphozytenseparationsmedium® Die Trennlösung Lymphozytenseparationsmedium® von PAA Laboratories basiert auf der Basis von Ficoll und stellt ein neutrales, hochverzweigtes, hydrophiles Polymer aus Saccharose mit einem Molekulargewicht von etwa 400 000 Dalton dar. Dichte, Osmolalität 43 Geräte, Material & Methoden und der pH-Wert werden durch Natriumdiatrizoat aufrecht erhalten. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium® unverdünnt verwendet, um mononukleäre Zellen zu separieren. 3.2.5.3.2 Percoll® Bei Percoll® handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C. Für die Herstellung der zur Monozyten-Separation benötigten, leicht hypertonen Percoll-Lösung, wurde zunächst ein Teil einer 1,5 M NaCl-Lösung auf 9 Teile Percoll gegeben und so eine Isotonie erzielt. Anschließend wurde die Dichte mittels einer geringgradig hypertonen PBS/Citrat-Lösung (3.2.5.3.6) auf 50% eingestellt. Die berechnete Dichte lag bei 1,064 g/ml mit einer Osmolalität von 340 (± 10) mOsm/kg. Vor der Verwendung des Gradienten erfolgte eine standartisierte Erwärmung auf 25°C im Wasserbad um die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Osmolalitätsänderungen zu erhöhen, sowie eine Feinmodulation der Dichte zu erzielen. Die Berechnung der Dichte erfolgte mit folgender Formel: • D1 = D% + (V% (D2 – D%) / 102) V% = Volumenprozent an isotonem Percoll D1 = gewünschte Dichte D% = Dichte der Verdünnungslösung (PBS (3.2.5.3.4) Dichte laut Hersteller ca. 1,0046 g/ml) D2 = Dichte des isotonen Percoll (Herstellerangabe: 1,123 g/ml) Für Untersuchungen, die den Einfluss der Osmolalität des Gradienten auf den Separationserfolg eruieren sollten, wurde anstelle des hypertonen PBS (3.2.5.3.6) normales PBS (3.2.5.3.4) zur Einstellung der Dichte verwendet. 3.2.5.3.3 1,5 M Natriumchloridlösung NaCl 4,3875g (3.2.3) Aqua dest. ad 50 ml 44 Geräte, Material & Methoden 3.2.5.3.4 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne EDTA Die PBS-Trockensubstanz (s. 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile lagen in den folgenden Konzentrationen vor: NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 Aqua tridest. ad 8,0 g (3.2.3) 1,24 g (3.2.3) 0,2 g (3.2.3) 0,2 g (3.2.3) 1000 ml Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.5.3.5 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit EDTA Um PBS/ EDTA zu erhalten, wurden zunächst 900 mg EDTA abgewogen und in 50 ml PBS gelöst. Anschließend wurde der pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt und die Lösung mit PBS auf 500ml aufgefüllt. Die Endkonzentration betrug somit 1,8 g/ 100ml PBS. 3.2.5.3.6 Hypertones PBS/ Citrat Zur Herstellung der Percoll-Arbeits-Lösung wurde PBS/ Citrat wie folgt angesetzt: NaH2PO4 Na2HPO4 NaCl C6H5Na3O7- x2H2O Aqua dest. ad 0,116 g (3.2.3) 0,8144g (3.2.3) 4,094 g (3.2.3) 1,912 g (3.2.3) 500 ml Der pH-Wert wurde mit HCL auf 7,2 eingestellt, die Lösung steril filtriert (Filter mit Porengröße 0,20µm) und bei 4°C gelagert. 3.2.5.3.7 Puffer für die magnetische Zellseparation (MACS-Puffer) bovines Serumalbumin 5,0 g (3.2.3) EDTA 0,59 g (3.2.3) PBS ad 1000 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 45 Geräte, Material & Methoden 3.2.5.3.8 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIFPuffer) bovines Serumalbumin 5,0 g (3.2.3) Natriumazid 0,1 g (3.2.3) PBS ad 1000 ml (3.2.5.3.4) Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.5.4 Lösungen zum Fixieren und Auszählen von Zellen 3.2.5.4.1 Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen Paraformaldehyd 40 mg (3.2.3) PBS ad 1000 ml (3.2.5.3.4) Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.5.4.2 Akridinorange-Ethidiumbromid-Lösung für Zellzählung Akridinorange 250 mg (3.2.3) Ethidiumbromid 250 mg (3.2.3) PBS ad 100 ml (3.2.5.3.4) die lichtmikroskopische Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.5.5 Lösungen für die Durchflusszytometrie Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystems nach den Messungen mit sterilfiltriertem Aqua tridest. und 1%-iger Natriumhypochlorit-Lösung gespült. 3.2.5.5.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid) Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrischen Messungen wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet. 46 Geräte, Material & Methoden 3.2.5.5.2 Propidiumiodidstammlösung Propidiumiodid (3.2.3): 100 µg/ml Propidiumiodid gelöst in Trägerflüssigkeit Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit 40 µl Propidiumiodidstammlösung/l zugesetzt, sodass sich eine Endkonzentration von 4 µg/ml sheath fluid ergab. 3.2.6 Zytokine 3.2.6.1 Rekombinantes equines Interleukin 4 Bei dem in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten equinen Interleukin 4 (req.IL4) handelt es sich um ein Konstrukt aus Zytokin und der konstanten Region einer schweren eq.IgG1Kette (WAGNER et al. 2005). Es lag in Form von Zellkulturüberstand einer CHO-Zelllinie vor, die feundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde. Zur Stimulation von Zellen wurde der Zellkulturüberstand in Medium (EARLES-MEM (3.2.3)) verdünnt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.6.2 Humanes GM-CSF Humaner Granulozyten-Monozyten-Kolonie-Stimulierender-Faktor (huGM-CSF) wurde zu 20.000U/ ml mit R0+-Medium (RPMI 1640 mit Hepes Puffer 15mmol/L, L-Glutamin 2mmol/L, NaHCO3 18mmol/L, G-Penicillin (100U/ml) und Streptomycin (100µg/ml), jedoch ohne Serumzusatz) aliquotiert und bei -20°C bis zu seiner Verwendung gelagert. Es wurde stets in der Konzentration 500U/5ml Medium eingesetzt. 3.2.7 Tiere Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um gesunde Isländerpferde aus Privatbesitz, sowie um zwei private Warmblutpferde, welche an equinem Sarkoid erkrankt waren. Eine Tierversuchsgenehmigung liegt vor. 47 Geräte, Material & Methoden 3.3 Methoden 3.3.1 Gewinnung definierter Zellpopulationen aus equinem Blut Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausschließlich mononukleäre Zellen des Pferdes benötigt, wobei es für Proliferationsversuche vornehmlich auf die lymphoide Fraktion, zur Generation dendritischer Zellen jedoch auf die monozytoide Fraktion ankam. 3.3.1.1 Gewinnung gerinnungsgehemmten Blutes Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung der Vene gewonnen. Zur Blutentnahme wurde für die Gewinnung von MNC das Vacutainersystem mit heparinhaltigen (Natrium-Heparin, 170IU/10ml) Vacutainern (3.2.1) verwendet. Für die Gewinnung von Monozyten über hypertonen Percoll wurden EDTA (DikaliumEDTA, 18mg/10ml) oder citrathaltige (Trinatriumcitrat, 0,109mol/ml, 3,2%) Vacutainer (3.2.1) eingesetzt. 3.3.1.2 Serumgewinnung Für die Serumgewinnung wurde Vollblut in Vacutainerröhrchen ohne Zusatz eines Gerinnungshemmers (3.2.1) gewonnen. Nachdem sich der Blutkuchen teilweise zusammengezogen und an der Röhrchenwand festgesetzt hatte, wurde er mit einer sterilen Pasteur-Pipette von der Röhrchenwand gelöst. Anschließend wurde das Vacutainerröhrchen bis zur vollständigen Gerinnung und Retraktion des Blutkuchens bei Zimmertemperatur gelagert und daraufhin zentrifugiert (1500 x g, 20 min, RT). Das Serum wurde abgesaugt und ein weiteres Mal abzentrifugiert. Serum wurde immer frisch verwendet, ohne Einfrieren oder Hitzebehandlung. 3.3.1.3 Isolation der MNC Fraktion aus equinem Vollblut Mononukleäre Zellen (Lymphozyten und Monozyten) lassen sich aufgrund ihrer geringeren Dichte gut von den etwas dichteren polymorphkernigen Leukozyten abtrennen. Diese Eigenschaft wird bei der Dichtegradientenzentrifugation genutzt um Zellfraktionen voneinander zu trennen. 48 Geräte, Material & Methoden Antikoaguliertes Blut (max. 24h alt) wurde zunächst in 50 ml Zentrifugenröhrchen (3.2.2) überführt und 25 min zur Sedimentation bei RT stehen gelassen. Schon in diesem Schritt wird die unterschiedliche Dichte von Zellpopulationen genutzt, um Erythrozyten von Leukozyten zu trennen. Die schweren Erythrozyten sedimentieren auf den Grund des Röhrchens, während die obere Schicht das noch stark leukozytenreiche Plasma darstellt. Das Plasma wurde vorsichtig abgesaugt und die Erythrozyten verworfen. In weiteren 50 ml Röhrchen wurden 15 ml Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) vorgelegt und das Plasma vorsichtig überschichtet. Die anschließende Zentrifugation (30 min, bei 10°C) wurde bei 1000 x g ohne Bremse durchgeführt. Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennten sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht bildete das zellfreie Plasma. Zwischen Plasma und Lymphozytenseparationsmedium® befand sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; Lymphozyten und Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen verbliebene Erythrozyten und die polymorphkernigen Leukozyten (PMN). Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesogen und in ein 50ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgelegtem PBS (3.2.5.3.4) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 50ml schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 min, 10°C; 500 x g, 250 x g und 80 x g), um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen (Flotation). Zwischen den einzelnen Zentrifugationen wurden die Zellen durch Aufschütteln resuspendiert und in ca. 40ml PBS aufgenommen. Mit dieser Methode konnten zwischen 0,8 und 2 x 106 MNC/ml Vollblut gewonnen werden. 3.3.1.4 Adhärenz der Monozyten als Methode zur Aufreinigung Um die Monozytenfraktion innerhalb der MNC anteilig zu erhöhen, sollte das in der Literatur für Monozyten beschriebene Adhärenzverhalten an Plastik genutzt werden. Dafür wurden MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) separiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen gezählt und jeweils 20 x 106 MNC in 10 ml Earles Medium (3.2.5.1) in Zellkulturflaschen (3.2.2) inkubiert. Dem Medium wurden unterschiedliche Mengen an autologem Serum (3.3.1.2) zugesetzt (0, 1, 5, 10 %). Nach 1 bis 3 h Inkubationszeit (bei 37°C und 5% CO2 in Luft) wurde der Zellkulturüberstand abgeschüttet und in 50ml Zentrifugenröhrchen aufbewahrt. Um verbliebene nicht adhärente Zellen von den adhärenten Zellen zu trennen, wurde der Boden der Zellkulturflasche 2x mit warmem (37°C) PBS abgespült. Die am Boden anhaftenden Zellen wurden anschließend mit Hilfe eines Zellschabers (3.2.2) gelöst, in PBS oder Medium aufgenommen und ebenfalls in 50 ml Röhrchen überführt. Durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min bei RT wurden die Zellen 49 Geräte, Material & Methoden aufkonzentriert und nach Zellzählung auf 5 x 106 Zellen/ml mit PBS oder Medium eingestellt. Weitere Arbeiten mit diesen Zellen erfolgten direkt im Anschluss an die Separation. 3.3.1.5 Affinitätschromatographische Anreicherung equiner Monozyten Bei der affinitätschromatographischen Anreicherung werden Zellen über monoklonale Antikörper direkt oder indirekt mit an paramagnetische Partikel gebundenen Antikörpern markiert. Die Zellsuspension mit spezifisch markierten und unmarkierten Zellen wird über eine Trennsäule gegeben, die sich in einem Magnetfeld befindet. Die Trennsäulen besitzen eine Matrix aus Stahlwolle oder eisenmagnetischen Kügelchen. Die unmarkierten Zellen durchlaufen die Säule im magnetischen Feld, die markierten Zellen bleiben an der Trennsäule hängen und können anschließend außerhalb des Magnetfeldes eluiert werden. Das MACS® System (3.2.2) kann zur Anreicherung (positive Selektion) oder zum Entfernung (Depletion) einer Zellpopulation aus einer Gesamtpopulation eingesetzt werden. 3.3.1.5.1 Negative Selektion von Monozyten durch Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen Aus 100 ml heparinisiertem Blut (3.3.1.1) wurden über Dichtegradientenzentrifugation MNCs (3.3.1.3) gewonnen. Jeweils 1 x 108 MNC wurden zur Markierung und Separation verwendet und als möglichst „trockenes“ Zellpellet mit je 200µl einer 1:2 verdünnten Maus-anti-equine CD4 und Maus-anti-equine CD8 mAk Lösung (3.2.4.1.1) für 20 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen einmal mit PBS (3.2.5.3.4) gewaschen und das gewonnene Zellpellet mit einem FITC gekoppelten Anti-maus Sekundärantikörper (3.2.4.1.2) für weitere 20 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein weiterer Waschschritt, dem sich die erneute Inkubation mit einem anti-FITC-MicroBeads-Ak (3.2.4.1.2) anschloss. Schließlich wurden die Zellen erneut gewaschen, in 10 ml MACS-Puffer (3.2.5.3.7) resuspendiert und für die Trennung in einer magnetischen Säule bereitgehalten. Die Säulen zur Trennung der Fraktionen wurden mit gekühltem MACS-Puffer (3.2.5.3.7) konditioniert (mit mindestens 3 fachem Säulenvolumen gespült) und in das magnetische Feld eines midiMacs® Magneten (3.2.2) verbracht. Die Zellen wurden über einen Nylon GazeFilter auf die Säule aufgetragen, um Zellaggregate in der Säule zu vermeiden. Anschließend wurde MACS-Puffer zum Auswaschen nicht markierter Zellen aufgetragen (mindestens 2 faches Säulenvolumen) und der Durchlauf aufgefangen. Bei konstanter Durchflussrate, kontrolliert durch die Größe der Auslassöffnung (0,9 mm Kanüle) sowie die Tropfrate (2-3 Tropfen pro Sekunde), wurde der Durchlauf wiederholt durchflusszytometrisch kontrolliert, bis keine Zellen mehr von der Säule kamen. Schließlich wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt, die aufgesetzte Kanüle verworfen, nochmals MACS-Puffer auf 50 Geräte, Material & Methoden die Säule gegeben und mittels eines mitgelieferten Stempels das Residualvolumen (1x Säulenvolumen, hier 5 mL) eluiert. Anschließend erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der angereicherten Zellen aus dem Durchlauf, bzw. der Zellen des Eluats. 3.3.1.5.2 Positive Selektion von Monozyten über IgE Für die Isolierung einer IgE positiven Zellfraktion mittels an paramagnetische Partikel gebundener Antikörper wurden mindestens 500 mL gerinnungsgehemmtes Blut (Heparin oder EDTA, s. 3.2.1) verwendet. Zu Beginn wurden die MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) separiert und die Zellzahl bestimmt (3.3.2). Die Markierung und Sortierung der Zellen erfolgte bei 4°C (auf Eis) und wurde mit 5 x 108 kernhaltigen, vitalen Zellen begonnen. Nach einer Inkubation (20 min.) mit dem mAK anti eq IgE 134 (3.2.4.1.1) in einem 15 mL Polypropylenröhrchen (3.2.2) wurden die Zellen einmalig mit MACS-Puffer (3.2.5.3.7) gewaschen. Anschließend wurden 100 µL Ratte anti Maus IgG1-MicroBeads (3.2.4.1.2) zu dem möglichst „trockenen“ Zellpellet gegeben und für weitere 20 min auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde dann ein Phycoerythrin-gekoppelter anti Maus Sekundärantikörper (3.2.4.1.2) in einer 1:100 Verdünnung in PBS hinzugegeben. Nach 15 min Inkubation folgte ein weiterer Waschschritt (s.o.) mit anschließender Resuspension der Zellen in 10mL MACS-Puffer (3.2.5.3.7) und eine erste durchflusszytometrische Kontrolle auf den Erfolg der Membranimmunfluoreszenz (3.3.8.2). Die Trennung mittels magnetischer Säule erfolgte wie oben beschrieben (3.3.1.5.1). 3.3.1.6 Dichtegradientenzentrifugation mit hypertonem Percoll Frisch entnommenes durch K2-EDTA koagulationsgehemmtes Blut wurde 20 min zur Sedimentation stehen gelassen. Anschließend wurde das leukozytenreiche Plasma mit einer weitlumigen Pipette abgenommen und in 50 ml Röhrchen bereitgestellt. In 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden jeweils 10 ml eines 25°C warmen, hypertonen, 50%igen Percollgradienten (3.2.5.3.2) vorgelegt und jeweils 5 ml Plasma vorsichtig überschichtet. Die Röhrchen wurden dann bei 400 x g für 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse zentrifugiert. Durch die geringe Dichte des hergestellten Gradienten, befanden sich nun hauptsächlich Monozyten in der Interphase, während Lymphozyten und Granulozyten zusammen mit verbliebenen Erythrozyten das Zellpellet am Boden bildeten. Da die entstandene Interphase eine sehr dünne Bande darstellte, wurde sie mit einer 2 ml Pasteurpippette (3.2.2) vorsichtig abgenommen und in 50 ml Röhrchen mit 10 ml vorgelegtem PBS/EDTA (3.2.5.3.5) überführt. Es war darauf zu achten, nicht zuviel vom Percoll mitzupippetieren, da sich sonst die Kontamination mit Lymphozyten erhöhte. Das 50 51 Geräte, Material & Methoden ml Röhrchen wurde schließlich mit PBS/EDTA aufgefüllt, und die Zellen dreimal mit PBS/EDTA gewaschen (je 10 min., RT, 400 x g, 200 x g und 80 x g). Zwischen den einzelnen Waschvorgängen, die der Entfernung von Thrombozyten dienten, wurde das Zellpellet durch Aufschütteln resuspendiert und das Röhrchen mit PBS/EDTA aufgefüllt. Bei der Etablierung dieser Methode für equine Monozyten stellte sich heraus, dass neben der obligaten Verwendung von frischem Blut (< 24h), auch der verwendete Gerinnungshemmer starken Einfluss auf den Separationserfolg ausübt. Da Monozyten zudem sehr stark zur Aggregatbildung mit Thrombozyten neigen, musste dem Waschpuffer EDTA (1,8 g /100ml) (3.2.5.3.5) zugesetzt werden und die Separation stets bei Raumtemperatur erfolgen. 3.3.2 Vitalitätsbestimmung von Zellen und Zellzahlermittlung Um nach erfolgter Zellseparation die Zellzahl vitaler MNC oder Monozyten zu ermitteln, wurden ca. 50 µl Zellsuspension mit gleicher Menge einer Acridinorange/EthidiumbromidLösung (3.2.5.4.2) in Eppendorfcups (3.2.2) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine Bürkerzählkammer (3.1) gegeben und im Fluoreszensmikroskop untersucht. Diese Färbung erlaubt es, vitale Zellen von toten bzw. geschädigten Zellen zu unterscheiden und gleichzeitig Zahl und Morphologie zu erfassen. Durch Acridinorange wird, bedingt durch seinen Eintritt in den Zellkern und Einlagerung in die doppelsträngige DNS, nach Anregung durch UV-Licht grün fluoreszierendes Licht emittiert. Die Zellkerne erscheinen bei vitalen Zellen somit grün. Ethidiumbromid dagegen kann nur bei toten oder stark beschädigten Zellen die Membran passieren und emittiert nach Anregung durch UV-Licht rotes Licht. Rot fluoreszierende Zellen sind somit als nicht vital zu betrachten. Die Ermittlung der Zellzahl erfolgte nach dem gebräuchlichen Auszählen vitaler Zellen in der Bürkerzählkammer. 3.3.3 Durchflusszytometrie Durchflusszytomter sind opto-elektronische Messsysteme, welche optische Signale unterschiedlicher Qualität (Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale) detektieren können. Das Prinzip eines Durchflusszytometers beruht auf der Streuung, die ein Lichtstrahl erfährt wenn er auf ein Objekt trifft. Dazu werden die zu analysierenden Zellen einer Zellsuspension innerhalb eines Probenführungssystems vereinzelt und an einem Laserstrahl vorbeigeführt. Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle, so wird er je nach Beschaffenheit der Zelle mehr oder weniger abgelenkt. Gemessen wird das so enstandene Streulicht an zwei Stellen. Eine Messstelle liegt in fast derselben Richtung, die der Strahl ursprünglich hatte. Dieses Streulicht wird als Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) bezeichnet und dient als Maß für die Größe von Zellen, sowie für deren Refraktionsindex. Die zweite Messstelle befindet sich fast 52 Geräte, Material & Methoden im 90° Winkel zum ursprünglichen Strahl und detektiert das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC). Es gibt Auskunft über die Komplexität einer Zelle, die die Granularität und Oberflächenstruktur der Zelle gemeinsam erfasst. Ein angeschlossener Computer speichert die Daten, die für jedes gemessene Ereignis detektiert werden und dient der Einstellung verschiedenster Parameter (ORMEROD 1990; RADBRUCH 1992). Bei dem für diese Arbeit verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (3.1), welches mit einem Argonlaser Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Neben den Detektoren für das Streulicht, beinhaltet dieses Gerät Detektoren, mit denen Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL1: Grünfluoreszenz: 515545 nm; FL2: Orangefluoreszenz: 564-606 nm; FL3: Rotfluoreszenz: >650 nm) erfasst werden können. Jede Zelle oder jeder Partikel, ein Messereignis (Event) kann somit durch bis zu fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert werden. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogram oder mehrparametrisch als korrelierte Punktediagramme (sog. Dotplots) dargestellt. Aufgrund der morphologischen Charakteristika (Komplexität und Größe) können in den Dotplots (SSC versus FSC) Zellpopulationen unterschieden werden. Durch das Setzen von Quadranten innerherhalb der Dotplots lassen sich zudem die relativen Verhältnisse der Zellpopulationen zueinander ermitteln. Innerhalb der mononukleären Zellpopulation (MNC) lassen sich so z.B. die Verhältnisse der lymphoiden zu den monozytoiden Zellen ermitteln (siehe Abb.3). 53 Geräte, Material & Methoden Side S catter (SSC) Equine MNC Forward Scatter (FSC) Abb. 3 Differenzierung mononukleärer Zellpopulationen (MNC) des equinen Blutes durch morphologische Charakteristika nach durchflusszytometrischer Analyse MNC wurden über Lymphozytenseparationsmedium® separiert (3.3.1.3) und im Durchflusszytometer (3.3.3) morphologisch untersucht. Dargestellt ist ein Punktediagramm (Dotplot) für morphologische Parameter (Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC)) nach Erfassung von 10.000 Ereignissen. Der eingefügte Graph gibt die prozentuale Verteilung der Zellpopulationen zueinander an. Der linke, obere Quadrant beinhaltet die Lymphozyten, die einen Anteil von hier 84,75% ausmachen, der rechte, obere Quadrant markiert die monozytoide Fraktion mit einem Anteil von hier 15,25%. Durch setzen so genannter Fenster (Gates) können einzelne Untergruppen der Zellpopulationen analysiert und ihre Verhältnisse mit Hilfe eines Graphen zueinander ermittelt werden. Durch logische Verknüpfung verschiedener Fenster können zudem mehrere Parameter als Charakteristikum festgelegt werden (z.B. vital und MNC). Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, dürfen nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. 3.3.3.1 Ermittlung der Zellvitalität in der Durchflusszytometrie Um im Durchflusszytometer „tote“ von lebenden (vitalen) Zellen differenzieren zu können, wird der Zellsupension Propidiumiodid (PJ) (3.2.5.5.2) in einer Endkonzentartion von 4 µg/ml zugesetzt. Durch Verlust der Membranintegrität bei apoptotischen oder nekrotischen Zellen kann es in die Zelle eindringen und dort in der DNS interkalieren. Interkaliertes PJ zeichnet sich durch eine stärkere Rotfluoreszenz (FL3) aus als lösliches, und lässt sich somit gut im Durchflusszytometer nachweisen. Demzufolge lassen sich mit PJ allerdings nur Zellen 54 Geräte, Material & Methoden oder Zellbestandteile identifizieren, die DNS enthalten. Zellbruchstücke ohne DNS sind mit PJ nicht anfärbbar. Sie lassen sich aber anhand ihrer Morphologie gut abgrenzen und zum Teil durch entsprechende Einstellungen am FACScan-Gerät von der Erfassung ausschließen. 3.3.4 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellpopulationen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) Während der Kultivierung von Zellen, kommt es zu Variationen in der resultierenden Zahl. Sie wird bedingt durch Zelltod oder Proliferation als Antwort auf verschiedene Stimuli oder Noxen. Um die Zellzahl nach der Kultur zu ermitteln, die absolute Zahl vitaler Zellen zu bestimmen oder die absolute Zahl blastisch transformierter Zellen zu erhalten, wird der zu messenden Probe eine bestimmte Anzahl Partikel zugesetzt, welche sich durch zumindest einen Parameter im FACScan eindeutig charakterisieren lassen. Anhand dieser Partikel kann eine Quantifizierung der gewünschten Zellen vorgenommen werden (PECHOLD et al. 1994). In diesem Fall wurden bovine mononukleäre Zellen (Referenzzellen, (3.3.4.1)) zugesetzt, deren genaue Zellzahl bekannt war. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl der zu untersuchenden Zellen ermittelt werden. Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (3.2.4.1.1) und anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (3.2.4.1.2). Eine längere Lagerung wurde durch Fixation mittels Paraformaldehyd (3.2.3) ermöglicht. Die toten und fixierten Referenzzellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (3.3.3.1) in der FL-1 und in der FL-3. 3.3.4.1 Herstellung von Referenzzellen Bei den hier verwendetetn Referenzzellen handelte es sich um bovine mononukleäre Zellen (MNC), welche über Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) separiert wurden. Für die Färbung wurden jeweils 2 x107 Zellen in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 x g und 4°C für 5 min abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und das erhaltene Zellpellet in 100µl PBS (3.2.5.3.4) resuspendiert. Nach Zugabe des gleichen Volumens des unverdünnten mAks Bo1 (3.2.4.1.1) erfolgte eine Inkubation bei 4°C für 15 min. Zum anschließenden Waschen der Zellen wurden 5 ml MIF-Puffer (3.2.5.3.8) zugegeben und die 55 Geräte, Material & Methoden Zellen für 7 min bei 80 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet nun mit 100µl eines 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-anti-MausAntikörpers (3.2.4.1.2) unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 min inkubiert. Im Anschluss erfolgte ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 ml PBS. Nach Überführung der Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (3.2.2), wurde das Röhrchen auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert. Im Anschluss erfolgte die erneute Resupension der Zellen nun in 30 ml einer 4%igen ParaformaldehydLösung (3.2.3). In dieser Lösung wurden die Zellen zur Fixation und Konservierung für 24h unter Lichtausschluss bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen für 15 min abzentrifugiert, dekantiert und mit PBS gewaschen. Das auf diese Weise gewonnene Zellpellet wurde schließlich in einer Propidiumiodidhaltigen Trägerflüssigkeit (3.2.5.5) aufgenommen und auf 4 x 105 Zellen/ ml eingestellt. Die Herstellung der Referenzzellen erfolgte stets in größeren Mengen. Die Lagerung erfolgte unter Lichtabschluss bei 4°C. 3.3.4.2 Vorbereitung der Proben für die Messung im Durchflusszytometer Proliferationsansätze oder Membranimmunfluoreszenz-Ansätze erfolgten in 96-Loch Rundbodenmikrotiterplatten (3.2.2), die nach der jeweiligen Inkubationszeit auf Eis gelagert und gerüttelt wurden, um adhärente Zellen zu lösen. Um eine gute Durchmischung und zusätzliche Ablösung zu erzielen, wurden die Zellen mittels wiederholten Auf- und Abpipettierens geerntet und in 5 ml Röhrchen für die Durchflusszytometrie (3.2.2) überführt. Die Platten wurden nach der Ernte auf verbliebene Zellen auflichtmikroskopisch untersucht. Unmittelbar vor der Messung im Durchflusszytometer wurde den Proben 100µl einer PIhaltigen (4µg/ml) Trägerflüssigkeit (3.2.5.5.2) und je nach Versuchsaufbau zusätzlich 50µl Referenzzellen (3.3.4.1) zugegeben. 3.3.4.3 Ermittlung der Zahl vitaler Zellen Je nach Anzahl der Populationen wurden 10.000 bis 20.000 Zellen durchflusszytometrisch gemessen. Da die Morphologie der Referenzzellen durch die Fixation erhalten blieb, die Zellen mit FITC markiert und zudem tot waren, konnten sie als rotfluoreszierende (FL-3) und grünfluoreszierende (FL-1) MNC leicht charakterisiert und von den Kulturzellen unterschieden werden. Durch setzten verschiedener Fenster (Gates) wurden Einzelpopulationen erfasst und gezielt in weiteren Diagrammen angezeigt. Über die Analyse mit Hilfe eines Quadranten, konnten die jeweils erzielten Messereignisse mit definierten Charakteristika sowohl absolut als auch relativ ermittelt werden. Setzte man nun die Zahl der 56 Geräte, Material & Methoden gemessenen Referenzzellen mit der Zahl der gewünschten Zellpopulation ins Verhältnis, konnte unter Kenntnis der eingesetzten Zahl Referenzzellen die absolute Zahl der gewünschten Kulturzellpopulation bestimmt werden. Es gilt folgende Formel zur Berechnung der absoluten Zahl vitaler Zellen: Anzahl Kulturzellen = gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzzellen gemessene Ereignisse Referenzzellen 3.3.5 Prinzip der durchflusszytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen Mononukleäre Zellen können durch Zusatz verschiedener Substanzen oder Zellen in vitro zur Proliferation angeregt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der proliferationsfördernde Effekt von rekombinanten equinem Interleukin 4 (req.IL4) (3.2.6.1) und 2-Mercaptoethanol (ME) (3.2.3), sowie die Stimulationskapazität verschiedener Zellpopulationen untersucht werden. Genutzt wurde dabei die morphologische Veränderung, welche aktivierte und sich teilende Lymphozyten (Blasten) erfahren. Die Zellen nehmen vor der Teilung an Größe zu (steigender FSC) und verändern durch ein verschobenes Kern/Plasma-Verhältnis auch ihre Komplexität (steigender SSC). Die blastische Transformation der Zellen zeigt sich im Durchflusszytometer in einer Verschiebung nach rechts, welchen nicht aktivierte Zellen nicht zeigen. Durch setzten eines Quadranten wurde sowohl das Verhältnis transformierter Zellen (Blasten) zu nicht transformierten Zyten ermittelt, als auch die Zahl der jeweils gemessenen Ereignisse bestimmt. Mit Hilfe der Referenzzellmethode (3.3.4) wurde dann die absolute Zahl generierter Lymphoblasten berechnet. 57 Geräte, Material & Methoden MNC mit eq.IL 4 Side Scatter (SSC) MNC der Mediumkontrolle Forward Scatter (FSC) Abb. 4 Durchflusszytometrische Analyse der Blastogenese Separierte mononukleäre Zellen (3.3.1.3) eines Pferdes wurden mit LAG vorstimuliert (3.3.6.1) und anschließend 9 Tage in vitro ohne Stimulus (linke Abbildung) oder mit rekombinantem equinen Interleukin 4 (req.IL4) (rechte Abbildung) inkubiert (3.3.6.1). Dargestellt sind korrelierte Punktediagramme (FSC vs. SSC). Blastisch transformierte Zellen lassen sich über die Zunahme der Zellgröße (höherer FSC-Wert) und der Komplexität (höherer SSC-Wert) von kleinen zytoiden Zellen unterscheiden. 3.3.6 Zellkultivierung in vitro Zellkulturen wurden im Rahmen dieser Arbeit entweder zur Messung der Proliferation von Lymphozyten verwendet, oder dienten der Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes. 3.3.6.1 Kultivierung von Lymphozyten in vitro (Proliferationstest) Um die biologische Aktivität des rekombinanten equinen IL4 zu untersuchen, wurden mit Leukoagglutinin (LAG) (3.2.3) vorstimulierte Lymphozyten des Pferdes mit verschiedenen Verdünnungsstufen (Endverdünnung 1:1; 1:10 und 1:100) des Überstandes der req.IL4 (3.2.6.1) produzierenden Zelllinie inkubiert. Nach 3 bis 9 Tagen Kultur wurden die Zellen dann auf ihre Vitalität und den Anteil blastisch transformierter Zellen untersucht. Die Vorstimulation der Lymphozyten erfolgte, indem 20 x 106 frisch separierte MNC (3.3.1.3) in einer 75 ml Zellkulturflasche (3.2.2) mit 20 ml Zellkulturmedium (komplettes DMEM (3.2.5.2)) und 1 µg/ml LAG (Leukoagglutinin, 3.2.3) über 4 Tage inkubiert wurden 58 Geräte, Material & Methoden (37°C und 5% CO2). An Tag 4 wurden die Zellen geerntet, indem die Zellkulturflasche geschüttelt und das Medium mit den Zellen in ein 50 ml Röhrchen überführt wurde. Das Röhrchen wurde sodann mit Medium (s.o.) aufgefüllt und die Zellen zwei mal bei 100 x g und RT für 10 min abzentrifugiert. Für den Proliferationsansatz wurde die Zellsuspension auf 12 x 106 Zellen/ ml mit kompletten DMEM (3.2.5.2) eingestellt. Mit 100µl dieser Zellsuspension wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt, um den Ausgangszustand der MNCMorphologie festzuhalten. Für die Kultivierung equiner MNC zur Messung der Proliferationsinduktion wurden ausschließlich Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96-Vertiefungen gewählt. Je Stimulationsansatz wurden 6 x 104 MNC ausplattiert (je 50µl Zellsuspension). Bei jedem Ansatz wurden zunächst 50µl komplettes DMEM vorgelegt, anschließend 100 µl der zu testenden Substanz (vorbereitete Verdünnungen von req.IL4) zugegeben und schließlich jeweils 50µl der Zellsuspension zugesetzt. In den Kontrollansätzen wurde anstelle der 100 µl Stimulanzlösung die gleiche Menge Medium oder irrelevantes Zytokin zugegeben. Das Endvolumen betrug somit jeweils 200µl. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Die Mikrotiterplatten wurden im Anschluss in feuchten Inkubationskammern (3.2.2), deren Boden mit gesättigter Kupfersulfatlösung (3.2.3) bedeckt wurde, bei 37°C und 5% CO2 in Luft für bis zu 9 Tage inkubiert. Die Kupersulfatlösung in der Inkubationskammer diente dazu, ein Austrocknen der Kulturansätze zu vermeiden, sowie Pilzwachstum zu unterbinden. 3.3.6.2 Generation dendritischer Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes Um dendritische Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes zu generieren, wurden Monozyten durch unterschiedliche Verfahren gewonnen und in Kultur gebracht. Abhängig von der jeweiligen Methode der Gewinnung variierte das Kulturprotokoll hinsichtlich Dauer der Inkubation und Mediumwechsel. Alle anderen Bedingungen und Zusätze blieben konstant. Da sich in den über Lymphozytenseparationsmedium® separierten MNC (3.3.1.3) mindestens 10% Monozyten befanden, wurde zunächst versucht, diese Zellen zur Generation von dendritischen Zellen heranzuziehen. Dazu wurden MNC aus heparinisiertem Vollblut (3.3.1.1) gewonnen und durchflusszytometrisch (3.3.3) sowie mikroskopisch die Zellmorphologie vor der Kultivierung untersucht. Schließlich wurden je 20 x 10 6 MNC in 20 ml Medium (EARLES MEM (3.2.5.1)) unter Zusatz von 3% autologem Serum (3.3.1.2), 59 Geräte, Material & Methoden huGM-CSF (1000 U/ 10ml) (3.2.6.2) und reqIL4 (3.2.6.1) (Endverdünnung 1:4) inkubiert (37°C und 5% CO2 in Luft). Zur Kontrolle diente ein Zellkulturansatz, dem kein req.IL 4 zugegeben wurde. Zellen, welche über IgE angereichert wurden (3.3.1.5.2), wurden zu je 5 x 106 Zellen in 5 ml Medium (s.o) in 6-well-Zellkulturplatten (3.2.2) ausgesät. Die Kulturen erhielten ebenfalls huGM-CSF, req.IL4 und autologes Serum (s.o). Nach 3 h wurde hier jedoch die Hälfte des Mediums entnommen und durch frisches ersetzt, um Mediatoren zu entfernen, welche durch Bindung des Antikörpers und daraus folgender Zellaktivierung von den Zellen sezerniert wurden. Auf diese Weise sollten einheitlichere Kulturbedingungen geschaffen werden. Die Ernte dieser Zellen erfolgte bereits nach 3 Tagen Kultur. Von den über hypertonen Percoll angereicherten Monozyten (3.3.1.6), wurden ebenfalls je 5 x 106 Zellen in 5ml Medium in 6-well-Zellkulturplatten (3.2.2) inkubiert. Es wurden jeweils Kulturen angesetzt, denen huGM-CSF (1000U/ 10ml) alleine und in Kombination mit req.IL4 (1:4 endverdünnt) zugegeben wurde. Alle Kulturen erhielten jedoch 3 % autologes Serum (3.3.1.2). An Tag 3 erfolgte ein Mediumwechsel, bzw. bei der Hälfte der Ansätze die Ernte und Analyse der Zellen. An Tag 3 wurde mittels einer weitlumigen Pipette die Hälfte des Mediums vorsichtig abgesaugt und durch frisches Medium (supplementiert mit autologem Serum, huGM-CSF und req.IL4, Konzentrationen wie oben) ersetzt, um Stoffelwechselprodukte der Zellen zu entfernen und neue Nährstoffe bzw. Zytokine bereitzustellen. Bei den Zellen, die über IgE im MACS gewonnen wurden erfolgte an Tag 3 die Ernte, ebenso bei der Hälfte der Monozyten, welche über hypertones Percoll (3.2.5.3.2) angereichert wurden. Wurden dendritische Zellen für eine gemischte Leukozytenreaktion generiert, wurde bei einigen Kulturansätzen an Tag 6 LPS (1µg/ml) (3.2.3), oder zum Pulsen der DC unterschiedliche Antigene zugesetzt (3.3.12). Nach 7 Tagen Kultur wurden schließlich alle Zellen geerntet. Für die Ernte der Zellen wurden zunächst durch schwenken und schütteln der Zellkulturflasche bzw. der Kulturplatte die meisten der Zellen gelöst und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Durch zweimaliges Spülen mit kaltem PBS und Abschaben der Zellen mit Hilfe eines Zellschabers wurden residuale, adhärente Zellen gelöst und ebenfalls in das 50 ml Röhrchen gegeben. Durch Zentrifugation mit 100 x g für 10 min bei RT konnte ein Zellpellet gewonnen werden, welches für weitere Arbeiten zur Verfügung stand. Wurden die Zellen für weitere Inkubationsansätze benötigt, erfolgte ein weiterer Waschschritt mit Medium (s.o.), um Reste der Zytokine zu entfernen. 60 Geräte, Material & Methoden 3.3.7 Lichtmikroskopische Untersuchung in vitro generierter dendritischer Zellen 3.3.7.1 Auflichtmikroskopie der Zellkulturen Zur Beurteilung der Zellvitalität, des Proliferationsstatus, sowie der morphologischen Entwicklung von kultivierten Zellen, wurden diese im Auflichtmikroskop untersucht. Dazu wurden die Zellkulturflaschen oder –platten auf eine zuvor desinfizierte Halterung gestellt und im Auflichtverfahren mikroskopiert. Durch vorsichtiges Schwenken der Zellkulturbehälter konnte die Adhärenz der Zellen prozentual geschätzt werden. So genannte Proliferationshaufen gaben Auskunft über den Aktivierungsstatus. Sie waren durch ihre Membranintegrität von so genannten Degenerationshäufchen abzugrenzen, welche als Maß für die Vitalität der Zellen betrachtet werden kann. Morphologische Veränderungen der Zellpopulationen konnten durch tägliche Untersuchung und fotographische Dokumentation verfolgt werden. 3.3.7.2 Lichtmikroskopische Untersuchung nach Färbung in situ Ein besonderes Charakteristikum in vitro generierter dendritischer Zellen stellt ihre Morphologie dar. Sie zeichnen sich durch sehr lange Zellausläufer aus, mit denen sie mit anderen dendritischen Zellen in Kontakt treten und bilden somit regelrechte Netzwerke am Boden des Zellkulturbehältnisses aus. Durch die Ernte dieser Zellen werden diese Verbindungen zerstört und auch die langen Zellausläufer sind bei z.B. durch Zentrifugation manipulierten DC lichtmikroskopisch nicht mehr darzustellen. Aus diesem Grund wurde für die Kultivierung der dendritischen Zellen, die lediglich der lichtmikroskopischen Untersuchung dienten, sogenannte Chamber-Slides (3.2.2) verwendet. Es handelt sich dabei um ein System mit zwei Zellkulturkammern, die direkt auf einem Plastikobjektträger befestigt sind. Die Wände der Kammern können am Ende der Inkubationszeit leicht entfernt werden. Die Kultivierung der Zellen erfolgt somit direkt auf der Oberfläche des Objektträgers. Für die Generierung dendritischer Zellen zur lichtmikroskopischen Untersuchung wurden Monozyten über hypertonen Percollgradienten angereichert (3.3.1.6) und jeweils 2 x 106 Monozyten in 2 ml EARLES- Medium (3.2.5.1) mit 3% autologem Serum (3.3.1.2), 200U huGM-CSF und req.IL4 (Endverünnung 1:4) eine Kammer eingefüllt. Die Zellen wurden dann in einer Inkubationsbox mit perforiertem Deckel und mit Kupfersulfatlösung-bedecktem Boden bei 37° und 5% CO2 in Luft inkubiert. Im Auflichtmikroskop wurde täglich der Entwicklungszustand der Zellen beurteilt. Nach zwei Tagen wurde die Hälfte des Medium 61 Geräte, Material & Methoden vorsichtig abgesaugt und durch frisches Medium (EARLS, zu gleichen Teilen supplementiert wie oben) ersetzt. Nach 4 Tagen zeigten die Zellen sehr deutliche Ausläufer und Netzwerke untereinander, sodass auf eine längere Kultivierungszeit verzichtet werden konnte. Das Medium wurde vollständig abgesaugt und die Wände der Chamber-Slides vorsichtig entfernt. Mit warmem (37°C) PBS wurde der Objektträger einmal vorsichtig übergossen, um nichtadhärente Zellen zu entfernen. Anschließend wurde der Objektträger luftgetrocknet und mit einer modifizierten Färbung nach Wright gefärbt. Dazu wurden die Objektträger für 30 Sekunden mit 1 mL Accustain® (3.2.3) bedeckt und nach den 30 sec zusätzlich 1 mL Aqua dest. hinzugegeben. Nach weiteren 30 Sekunden wurde der gesamte Objektträger unter fließendem Wasser abgespült, an der Luft getrocknet und lichtmikroskopisch untersucht. Da das verwendete Mikroskop (3.1) über eine Computer verbundene Digitalkammera verfügte, konnten Fotografien angefertigt werden. 3.3.8 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) Mittels Membranimmunfluoreszens (MIF) können Oberflächenstrukturen auf Zellen nachgewiesen werden, die der Charakterisierung der Zellpopulationen dienen. Dabei kommen Antikörper zum Einsatz, die gegen spezifische Epitope der Oberflächenstruktur gerichtet sind. Durch Kopplung an ein Fluorochrom werden die Strukturen detektierbar. Sind die Primärantikörper direkt an ein Fluorochrom gekoppelt, spricht man von direkter Membranimmunfluoreszenz. Von indirekter Membranimmunfluoreszens ist dagegen die Rede, wenn ein zweiter (Sekundär-) Antikörper, welcher den Primärantikörper erkennt, an ein Fluorochrom gebunden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die indirekte Membranimmunfluoreszens (MIF) verwendet. Es wurden Oberflächenmarker von frisch separierten als auch von kultivierten Zellen untersucht. Dabei wurde durchflusszytometrisch die Intensität der Färbung, als auch der Anteil der markierten Zellen erfasst. 3.3.8.1 Durchführung der Membranimmunfluoreszenz Frisch separierte oder kultivierte Zellen wurden zu jeweils 2 x 105 Zellen in 100µl PBS (3.2.5.3.4) in 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatten (3.2.2) pipettiert. Um ein Zellpellet zu erhalten, wurden die Platten bei 10°C für 5 min bei 200 x g zentrifugiert und der Überstand abgeschlagen. Durch kurzes Rütteln der Platte wurden die Zellen in der verbliebenen Restflüssigkeit resuspendiert. Für alle weiteren Arbeiten wurden die Platten ab jetzt auf Eis (4°C) gelagert. Um die Zellen vor der MIF noch einmal zu waschen, wurden jedem Well 62 Geräte, Material & Methoden 100µl MIF-Puffer (3.2.5.3.8) zugegeben und die Platten erneut zentrifugiert (200 x g, 5 min, 10°C). Die Resuspension erfolgte nach erneuten kurzem und schnellen Abschlagen des Überstandes durch kurzes Rütteln der Platte. Anschließend wurden den Zellen jeweils 25µl der gewählten Antikörperverdünnung (monoklonale Primärantikörper (3.2.4.1.1)) zugegeben. Der stets mitgeführten Konjugatkontrolle wurde, statt der Antikörperlösung, 25µl MIF-Puffer zugesetzt Dies ermöglicht bei der späteren Analyse der Daten die Kontrolle, ob der verwendete Sekundärantikörper unspezifisch direkt an die nicht markierten Zellen bindet. Die Platten wurden nun für 30 min auf Eis stehend inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen zweimal gewaschen, indem den Zellen jeweils 100µl MIF-Puffer zugegeben und die Zellen erneut bei 200 x g, 10°C für 5 min zentrifugiert wurden. Zwischen den Waschschritten erfolgte jeweils das Dekantieren des Überstandes und ein Aufrütteln der Zellen. Schließlich wurden jeweils 25µl eines FITC konjugierten Sekundärantikörpers (Ziege-anti-Maus Ig (3.2.4.1.2)) hinzupipettiert, die Suspension durch Rütteln der Platte durchmischt und die Platten auf Eis stehend und unter Lichtabschluss für weitere 30 min inkubiert. Es folgten drei weitere Waschschritte mit MIF-Puffer wie oben beschrieben, bevor die Zellen schließlich in 100µl MIF-Puffer resuspensiert wurden und in ein Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt wurden. Die Röhrchen erhielten sodann 100µl einer Trägerflüssigkeit mit PJ (3.2.5.5) und wurden im Durchflusszytometer (3.3.3) untersucht. 3.3.8.2 Messung und Auswertung der Membranimmunfluoreszenz Die Messung der einzelnen Proben im Durchflusszytometer erfolgte stets am selben Tag der Färbung. Nach gründlicher Durchmischung der Zellen in den Durchflusszytometerröhrchen (3.2.2) wurden jeweils 10.000 oder 20.000 Ereignisse (Zellen, Zelltrümmer) gemessen und die Daten jeder Probe gespeichert. Das eingesetzte Fluorochrom Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wird durch das Licht des Lasers (488nm Wellenlänge) angeregt und emittiert grünes Licht im Bereich des Fluoreszensdetektors FL-1. Die Auswertung erfolgte mittels des Analyseprogramms WinMDI ® (TROTTER 1999). Durch setzen entsprechender Fenster wurden zunächst nur vitale Zellen erfasst (Propidiumjodid negativ, geringer FL-3 Wert). Anhand der morphologischen Charakteristika konnten zudem einzelne Zellpopulationen hinsichtlich ihrer Expression von Oberflächenmarkern untersucht werden. Dafür wurden korrelierte Punktediagramme (Dotplots) angezeigt, welche die Komplexität (SSC) gegen die Grünfluoreszens (FL-1) darstellten. Mit Hilfe einer Quadrantenanalyse konnte das Verhältnis Fluoreszenz- positiver zu Fluoreszens-negativer Zellen ermittelt werden. Die Fluoreszenzintensität wurde zudem in Histogramen beurteilt, welche die gemessene Anzahl an Ereignissen gegen die FL-1 Intensität 63 Geräte, Material & Methoden wiedergeben. Nur wenn die untersuchte Population deutlich von der Fluoreszenz der Konjugatkontrolle (Ansatz nur mit Sekundärantikörper) abzugrenzen war, wurde die jeweilige Zellpopulation als positiv für die Expression des untersuchten Oberflächenmarkers bewertet. Als zusätzliche Isotyp-Kontrollen dienten Primärantikörper, die zwar keine Oberflächenstrukturen erkennen sollten, dafür aber dem Isotyp der verwendeten Primärantikörper entsprachen (3.2.4.1.1). Auf diese Weise konnte ausgeschlossen werden, dass die Primärantikörper, die zur Detektion bestimmter Oberflächenmarker eingesetzt wurden, mit ihrem Fc-Fragment unspezifische Bindungen eingehen. 3.3.9 Herstellung eines sterilen Tumorzelllysats Neoplastisch transformierte Zellen exprimieren meist Oberflächenstrukturen, die sich von Strukturen auf nicht transformierten Zellen unterscheiden. Diese tumorassoziierten Antigene (TAA) bilden die Grundlage einer spezifisch gegen den Tumor gerichteten Immunabwehr. Um Tumorantigene des equinen Sarkoids zu erhalten, wurde Tumormaterial verwendet, welches im Rahmen einer diagnostischen Absicherung der Diagnose für histopathologische Untersuchungen entnommen wurde. 3.3.9.1 Chirurgische Exzision eines equinen Sarkoids Die Operation erfolgte am stehenden Pferd nach Sedation mit Xylazin 2% Injektionslösung (0,8mg/kg i.v.) und Lokalanästhesie mit Mepivacain 2%ig (Scandicain®- Injektionslösung (3.2.1)) (Dosierung nach Bedarf) der betroffenen Hautareale. Das Fell an der Operationsstelle wurde geschoren und anschließend nass rasiert. Die Haut wurde anschließend mit Seife gewaschen und desinfiziert. Mit Hilfe eines sterilen Skalpells wurde die tumorös entartete Haut großflächig entfernt und nach erfolgter Exzision direkt in ein steriles Glasgefäß (200 ml) mit vorgelegtem PBS mit hoch konzentriertem Penicillin/Streptomycin (200U/ml G-Penicillin und 200µg/ml Streptomycin (3.2.3)) überführt. Dabei wurde darauf geachtet, dass das Tumormaterial vollständig von der Lösung bedeckt wurde. Durch diesen Schritt sollte ein Wachstum verbliebener bakterieller Mikroorganismen verhindert werden. Die Wunde wurde nach den gebräuchlichen chirurgischen Verfahren verschlossen. Die Tiere erhielten im Anschluss an die Operation jeweils 20.000U pro kg/KGW Penicillin-Dihydrostreptomycin Suspension (3.2.1) i.m. über einen Zeitraum von 5 Tagen. Die Wundversorgung erfolgte täglich bis zur Abheilung. 64 Geräte, Material & Methoden 3.3.9.2 Herstellung des Tumorzelllysates Noch am selben Tag der Entnahme wurde das Tumormaterial weiterverarbeitet. Um Blut und andere Verunreinigungen zu entfernen, wurden die Hautareale unter der Lamin-Air (3.1) unter sterilen Kautelen mit PBS-P/S (200U/ml G-Penicillin und 200µg/ml Streptomycin (3.2.3)) gewaschen und anschließend in sterile Petrischalen (3.2.2) überführt. Ein Teil des Tumormaterials mit Haut wurde in Formalin eingelegt (10%) und zur histopathologischen Untersuchung gegeben. Bei beiden Pferden konnte die Diagnose equines Sarkoid histologisch bestätigt werden. In den Petrischalen wurde mittels eines sterilen Einmal-Skalpells (3.2.1) die potentiell kontaminierte oberflächliche Haut abpräpariert und das saubere Tumorgewebe sofort in eine frische sterile Petrischale gelegt. Abb. 5 Gewinnung sterilen Tumormaterials Durch equines Sarkoid veränderter Hautlappen nach chirurgischer Exzision (3.3.9.1) und daraus isoliertes „sauberes Tumorgewebe“. In der linken Petrischale ist der entnommene, tumorös veränderte Hautlappen eines Pferdes in der Aufsicht auf die Hautoberfläche zu sehen. Die unter der Epidermis liegenden, nicht ulzerierten Knoten wurden von der Rückseite des Hautlappens abpräpariert und in eine zweite saubere Petrischale überführt (rechte Petrischale). Mit einem neuen Skalpell wurde das saubere Tumorgewebe in der zweiten Petrischale zerkleinert, bis alle Stückchen mit ca 3x3 mm die gleiche Größe hatten. Die Tumorstückchen wurden in sterile 50 ml Röhrchen gegeben und gewogen. Von Pferd 1 (Stute, 12 Jahre, Sachsen) konnten 1,94 g Tumormaterial gewonnen werden, von Pferd 2 (Wallach, 13 Jahre, Westfale) 4,15 g. Pro g Tumormaterial wurden 5 ml PBS (ohne P/S (3.2.5.3.4)) zugegeben 65 Geräte, Material & Methoden und die Proben viermal schnell (bei -80°C) eingefroren und langsam (bei RT) aufgetaut. Durch diese wiederholte Prozedur sollte die Zellstruktur zerstört werden, sodass Zellbestandteile später löslich im PBS vorliegen. Schließlich wurde die Suspension in einen sterilen Homogenisator (3.2.2) gegeben und durch Reibung eine weitere Zerstörung des Zellgewebes erreicht. Das Gewebe wurde solange homogenisiert, bis sich am Boden des Homogenisators eine einheitlich feine Gewebekonsistenz erkennen ließ. Durch Schütteln konnte der Gewebebrei wieder in dem PBS gelöst und in ein steriles 50 ml Röhrchen überführt werden. Es folgte ein hoch-touriges Abzentrifugieren (4000 x g, 15 min, RT), nach welchem der Überstand durch Absaugen mit einer weitlumigen Pipette in ein 15 ml Röhrchen überführt wurde. Der restliche Gewebebrei wurde bei -80°C eingefroren und gelagert. Der gewonnene Überstand, welcher jetzt zahlreiche Proteine des Tumormaterials enthielt, wurde erneut hoch-tourig abzentrifugiert, um alle korpuskulären Bestandteile zu entfernen (4000 x g, 15 min, RT). Anschließend wurde der Überstand erneut abgesaugt und in ein neues 15 ml Röhrchen überführt. Um restliche Partikel zu entfernen wurde der Überstand mit einer sterilen 20 ml Spritze aufgenommen und durch einen Filter mit 0,45µm Porengröße in ein neues Röhrchen gedrückt. Diese Prozedur wurde mit einem Filter mit 0,2µm Porengröße wiederholt, um Sterilität des zellfreien Zelllysates zu erzielen. Das sterile Tumorzelllysat wurde bei -80°C bis zu seiner Verwendung gelagert. 3.3.10 Bestimmung der Proteinkonzentration im Tumorzelllysat Um den Proteingehalt innerhalb des Tumorzelllysates zu evaluieren, wurde das BCA-Test-Kit der Firma Pierce (3.2.3) verwendet. Der Kit enthält die Lösung A (BCA, Bicinchoninic acid) und Lösung B (4% CuSO4 x 5H2O). Proteine reduzieren im alkalischen Milieu Cu2+ zu Cu+. Die Bichinolin-4-carbonsäure (BCA) reagiert mit Cu+, wobei zwei Bichinolinsäure-Moleküle einen intensiv purpur gefärbten Chelatkomplex mit dem Cu+-Ion eingehen. Zur Herstellung der Arbeitslösung wurde 1 Teil der Lösung B mit 49 Teilen Lösung A vermischt. Als Standardlösungen wurde BSA (Bovines Serumalbumin (3.2.3)) in PBS verdünnt. Folgende Verdünnungsstufen wurden gewählt: 2.000, 1.000, 500, 250, 125 und 62,5 µg/ml. Die zu messenden Proben wurden ebenfalls 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8 und 1:10 in PBS verdünnt. Anschließend wurden jeweils 50µl der jeweiligen Standardverdünnung bzw. Probenverdünnung in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit jeweils 200µl Arbeitslösung in je eine Vertiefung gegeben. Als Leerwert diente PBS. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Extinktion in einem Photometer (3.1) bei 570 nm Wellenlänge gemessen. Die Auswertung erfolgte nach Korrektur der Standard- und Probenwerte um den Leerwert (PBS) und 66 Geräte, Material & Methoden Erstellung einer korrigierten Standardkurve. Anhand der Eichreihe aus BSA bekannter Konzentration, konnte die unbekannte Proteinkonzentration in der Probe bestimmt werden. 3.3.11 Bestrahlung definierter Zellpopulationen zur Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion In einer gemischten Leukozytenreaktion sollte die Funktion der generierten DC ermittelt werden. Dazu wurden die DC mit frisch isolierten Lymphozyten in Cokultur gebracht (3.3.12). Um zu vermeiden, dass in der späteren Auswertung auch DC miteinbezogen werden, die morphologisch im Bereich der Blasten liegen, musste ein Verfahren gewählt werden, welches eine sichere Abgrenzung der DC von den Responderzellen erlaubte. Zudem musste eine Proliferation der Stimulatorzellen unterbunden werden. Beide Prämissen konnten durch radioaktive Bestrahlung der DC vor der Coinkubation erreicht werden. Dazu wurden die Zellen nach der Gewinnung (Ernte oder Separation) in DMEM-Medium (3.2.5.2) aufgenommen und in 15 ml Röhrchen aufbewahrt. Die Röhrchen wurden sodann in ein Bestrahlungsgerät (3.1) mit 137Cäsium als Strahlungsquelle (γ und β Strahlung) verbracht und für 11 min bestrahlt. Diese Zeit ergab unter Berücksichtigung der Halbwertszeit und dem Verfallsbeginn der Cäsium-Isotope eine Dosisleistung von 30 Gy. Die Wirkung der ionisierenden Strahlen beruht hauptsächlich auf der sogenannten Radiolyse, bei der Wassermoleküle in OH- und H-Radikale zerfallen. Diese Radikale diffundieren in der Zelle und führen an verschiedenen Molekülen zu Veränderungen und Mutationen. Folge dieser Veränderungen sind Stoffwechselstörungen innerhalb der Zelle und Proliferationsunfähigkeit. Nach 3 Tagen Kultur tritt bei allen anfangs lebenden bestrahlten Zellen der Zelltod ein. Da in durchflusszytometrischen Untersuchungen stets nur vitale Zellen (FL3 negativ) analysiert wurden, konnten die Stimulatorzellen von der Analyse sicher ausgeschlossen werden (3.3.3.1). 3.3.12 Funktionalitätsprüfung der DC mittels gemischter Leukozytenreaktion (MLR) Dendritische Zellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, naive Lymphozyten in vitro zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen. Um die in dieser Arbeit generierten DC auf diese Fähigkeit zu untersuchen, wurde die gemischte Leukozytenreaktion verwendet, eine Methode, die ursprünglich zum Nachweis von Gewebeunverträglichkeiten bei Transplantationen entwickelt wurde. Dabei kommt es vor allem aufgrund von MHC-II-Polymorphismen zu einer Proliferation von CD4+ T-Zellen (JANEWAY et al. 2005). 67 Geräte, Material & Methoden Als Stimulatorzellen dienten DC, welche aus Monozyten generiert (3.3.6.2) wurden, die über einen hypertonen Percollgradienten (3.3.1.6) gewonnen wurden. Für jede MLR wurden stets zwei Tiere gleichzeitig untersucht, um DCs und MNCs jeweils in autologen als auch in allogenen Coinkubations-Ansätzen testen zu können. Nach 7 Tagen Kultur wurden die generierten DC geerntet. Am gleichen Tag wurde denselben Tieren, deren Monozyten zur DC-Generierung dienten, K2-EDTA- Blut entnommen und daraus sowohl MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3), als auch Monozyten über hypertones Percoll® (3.3.1.6) frisch gewonnen. Die Monozyten und die generierten DC (Stimulatorzellen) wurden in 15 ml Röhrchen gegeben und mit einer Dosisleistung von 30 Gy bestrahlt (3.3.11). Anschließend wurden sie einmal mit Medium (komplettes DMEM, 2Mercaptoethanol 20µmol (3.2.5.2)) gewaschen (100 x g, 10 min, RT) und mit Medium (s.o) in jeweils zwei Konzentrationen (0,6 x 105 Zellen/ml und 6 x 105 Zellen/ml) eingestellt. Die frisch isolierten MNC (Responderzellen) wurden mit Medium (s.o) auf 2 x 106/ml eingestellt. In sterilen 96-Loch-Rundboden-Mikrotiterplatten wurden jeweils 100µl der MNC-Suspension (2 x 105 Zellen) mit 100µl der entsprechenden Stimulatorzellsuspension zusammen pipettiert. Auf diese Weise wurden S/R-Ratios von 3:100 und 30:100 Stimulatorzellen zu Responderzellen erzielt. Die Ansätze erfolgten für beide Ratios in autologen (mit selbst MNC) und allogenen (MNC des anderen Pferdes) Cokulturen. Alle Ansätze erfolgten jeweils in Triplikaten. Zur Kontrolle dienten Kulturen, die nur MNC enthielten. Um die Vitalität der Stimulatorzellen zu überprüfen, wurden zudem Ansätze mitgeführt, die lediglich Stimulatorzellen enthielten. Nach 3 Tagen waren die Stimulatorzellen im Durchflusszytometer alle PJ positiv (FL-3). Wurden gepulste DC verwendet, änderte sich das Protokoll dahingehend, dass die verwendeten DC 24h vor der Ernte BSA (3.2.3) oder Tumorzelllysat (3.3.9.2) in einer Menge von 100µg/ml zugesetzt bekamen („gepulst“ wurden). Um einen Einfluss dieser Antigene direkt auf die MNC evaluieren zu können, wurden bei diesen Ansätzen als zusätzliche Kontrolle MNCs mit ebenfalls 100µg/ml Antigen, jedoch ohne DC Zusatz mitgeführt. Nach 5 und 7 Tagen Cokultur wurden die Triplikate untersucht. Die Proben wurden durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in der Mikrotiterplatte gewonnen und in Röhrchen für das Durchflusszytometer überführt. Den Zellen wurde zusätzlich 50 µl einer PJ haltigen Trägerflüssigkeit (3.2.5.5), sowie 50µl einer Referenzzellsuspension (3.3.4) zugesetzt. Die Auswertung erfolgte nach durchflusszytometrischer Messung durch setzen entsprechender Regionen. Analysiert wurde die Anzahl blastisch transformierter, vitaler Zellen (3.3.5). Zur graphischen Darstellung wurde zum Teil der Stimulationindex (SI) für die Responderzellen eines jeden Pferdes ermittelt. Er errechnete sich aus der absoluten Zahl Blasten in der Probe 68 Geräte, Material & Methoden geteilt durch die absolute Zahl Blasten der MNC-Mediumkontrolle. Auf diese Weise erhielt die Mediumkontrolle (unstimulierte MNC) immer den Wert 1. 3.3.13 Statistische Verfahren Alle durchflusszytometrisch gewonnenen Daten wurden mit der Software WinMDI® (TROTTER 1999) ausgewertet, mit Hilfe der Software Extract® (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth) formatiert und in Microsoft Excel® bearbeitet. Die statistische Auswertung erfolgte mit der Software GraphPad Prism 4®. Ab einer Gruppengröße von N>4 konnte auf Normalverteilung getestet und statistische Analysen angewendet werden. Dabei fanden je nach Versuchsaufbau der gepaarte t-Test oder der Tukey´s Multiple Comparison Test Anwendung. In den Graphiken werden ab N≥2 (unabhängige Versuche) jeweils die aritmethischen Mittelwerte mit Standardabweichung gezeigt. 69 Ergebnisse 4 Ergebnisse Um die wesentlichen Fragen dieser Arbeit anzugehen, mussten equine Monozyten aus dem peripheren Blut gewonnen werden, die später für die Generierung dendritischer Zellen (DC) mit req.IL4 (rekombinantem equinem Interleukin 4) und hu.GM-CSF (humanem Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender-Faktor) in ausreichender Menge zur Verfügung stehen. Dazu waren eine Reihe methodischer Vorarbeiten erforderlich, die die Separationsmethode der Monozyten, sowie die Überprüfung der biologischen Funktionalität des zur Verfügung stehenden req.IL 4 beinhalteten. Weiterhin wurden verschiedene Oberflächenmarker zur Charakterisierung der DC auf ihre Kreuzreaktivität beim Pferd untersucht. Nachfolgend galt es, die Funktionalität der generierten DC zu testen. 4.1 Methodische Vorarbeiten 4.1.1 Aufreinigung equiner Monozyten aus Vollblut Da für das Pferd noch keine ausreichend effektiven Methoden der Monozytenaufreinigung etabliert sind, wurden verschiedene Verfahren der Separation in Vorarbeiten erprobt. Ziel war es, ein Verfahren zur Separation equiner Monozyten zu finden, welches eine hohe Ausbeute an Monozyten mit möglichst hoher Reinheit, geringer Voraktivierung und ohne Selektion von Monozytensubpopulationen durch die Separationsmethode erlaubt. 4.1.1.1 Anreicherung equiner Monozyten über Plastikadhärenz Monozyten sollen, im Gegensatz zu Lymphozyten, die Fähigkeit besitzen, unter geeigneten Bedingungen besonders effizient an Plastik zu adhärieren (FELZMANN et al. 2003; OBUNIKE et al. 1997). Um zu überprüfen, ob sich equine Blutmonozyten nach vorangegangener Separation der MNC (mononukleäre Zellen) über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) durch selektive Adhärenz anreichern lassen, wurden MNC (je 20 x 106) von 4 Pferden (3.2.7) in Earles-Medium (3.2.5.1) mit unterschiedlichen Konzentrationen an autologem Serum (3.3.1.2) für 1 bis 3 h in Plastikzellkulturflaschen (3.2.2) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde der Kulturüberstand samt nichtadhärenter (= fluider) Zellen abgegossen und die adhärenten Zellen durch zweimaliges Spülen mit 30°C bis 37°C warmem PBS (3.2.5.3.4) von restlichen nicht-adhärenten Zellen befreit. Abschließend wurden die adhärenten Zellen in etwas Medium (3.2.5.1) mit einem Zellschaber (3.2.2) vorsichtig abgelöst und in ein separates Röhrchen überführt. 70 Ergebnisse Die MNC Fraktionen wurden vor und nach Plastikadhärenz durchflusszytometrisch und mikroskopisch nach morphologischen Kriterien untersucht (3.3.3), um die Reinheit und Ausbeute an Monozyten zu bestimmen. Um eine Aussage über den Erfolg dieser Methode geben zu können, wurden die nicht-adhärenten Zellen (fluide Zellen) und die adhärenten Zellen auf ihre Gesamtzahl und ihren Monozytenanteil untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 dargestellt. Monozytenanteil Zellausbeute 10.0 % Monozyten Zellzahl x 10^6 12.5 7.5 5.0 2.5 35 Fluide Zellen 30 Adhärente Zellen 25 Monozytenanteil der Ausgangspopulation 20 15 MNC 10 5 0.0 0 1% 5% 10 % 1% Serumkonzentration 5% 10 % Serumkonzentration Abb. 6 Zellausbeute und dazugehöriger Monozytenanteil nach Adhärenzselektion. Aus heparinisiertem Vollblut (3.3.1.1) von 4 Pferden (3.2.7) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation über Lymphozytenseparationsmedium® MNC in einer Reinheit von >95% gewonnen (3.3.1.3). Jeweils 20 x106 dieser MNC pro 10 ml Earles-Medium (3.2.5.1) wurden mit 1%, 5% oder 10% autologem Serum (3.3.1.2) in 75ml Plastikzellkulturflaschen (3.2.2) für 2h bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Nach Adhärenzselektion (3.3.1.4) wurden die adhärenten und die fluiden (=nichtadhärenten) Zellen gezählt (3.3.2) und der jeweilige Monozytenanteil durchflusszytometrisch (3.3.3) bestimmt. Die linke Abbildung zeigt die wiedergewonnene absolute Zellzahl (von eingesetzten 20 x106 MNC) in Abhängigkeit von der Konzentration an autologem Serum. Der dazugehörige prozentuale Anteil an Monozyten ist in dem rechten Graphen wiedergegeben, ebenso der relative Monozytenanteil an der Ausgangs-MNC-Fraktion. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte von vier Pferden mit Standardabweichung. Durch die Überschichtung leukozytenreichen Plasmas (3.3.1.3) auf Lymphozytenseparationsmedium® ließen sich bei den vier Pferden im Mittel 216 x 106 mononukleäre Zellen aus 100 ml heparinisiertem Vollblut gewinnen. Der Anteil an Monozyten machte bei dieser Fraktion im Mittel 8,03 % (17,35 x 106) aus. Die „restlichen“ Zellen konnten im Durchflusszytometer morphologisch als Lymphozyten angesprochen werden. Granulozyten 71 Ergebnisse wurden durch die hier gewählte Dichtegradientenzentrifugation fast gänzlich eliminiert (siehe Abbildung 7). Side S catter (SSC) Equine MNC Forward Scatter (FSC) Abb. 7 Zellfraktionen equiner MNC nach Dichtegradientenzentrifugation Leukozytenreiches Plasma (3.3.1.3) wurde über Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) geschichtet und durch Dichtegradientenzentrifugation die mononukleären Zellen separiert (3.3.1.3). Der eingefügte Quadrant gibt die prozentuale Verteilung der Zellpopulationen an. Mit 86,4% (unten links) macht die lymphoide Fraktion den größten Anteil aus, während 13,2% (unten rechts) zu den monozytoiden Zellen zählen. Aufgrund ihrer morphologischen Charakteristika wären Granulozyten in den oberen Quadranten zu erwarten (Kreis), die hier nur einen Anteil von <1% ausmachen. Vergleicht man die Ausbeute der adhärenten Zellen, die der fluiden Zellen, sowie den jeweils dazugehörigen Monozytenanteil, so fällt auf, dass sich durch Plastikadhärenz mit Zusatz von 10% autologem Serum zwar eine relative Anreicherung der Monozyten erreichen lässt (bei 10% Serumzusatz sind im Mittel 23,87 % der MNCs Monozyten), mit den fluiden Zellen allerdings auch die Hälfte an Monozyten verloren geht. So sind im Mittel 9,1 x106 MNC nach 2h Inkubation und 10% Serum fluide, die sich zu 8,9% aus Monozyten zusammensetzen (0,81 x 106 Monozyten). Das heißt, dass trotz geringeren prozentualen Anteils an Monozyten, die Gesamtzahl dennoch fast identisch ist mit der aus der adhärenten Fraktion. Tabelle 3 verdeutlicht den Zellverlust am Beispiel der Adhärenzselektion mit 10 % autologem Serum. 72 Ergebnisse Tab. 3. Monozytenverluste durch Adhärenzselektion Zellfraktion Ausbeute [x 106] Monozytenanteil in % Ausgangspopulation 20,0 8,0 Monozytenanteil [x 106] 1,7 Adhärente Zellfraktion 3,5 23,9 0,8 Fluide Zellfraktion 9,1 8,9 0,8 Jeweils 20 x 106 equine MNC wurden separiert (3.3.1.3) und mit 10% autologem Serum (3.3.1.2) für 2h bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Anschließend wurde die adhärente Zellfraktion von den fluiden Zellen getrennt (3.3.1.4). Die Zellen wurden gezählt und der Monozytenanteil sowohl prozentual als auch absolut bestimmt (3.3.4.3). Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte von 4 Tieren. Die beste erzielte Monozytenreinheit lag bei nur 30,5% mit einer Ausbeute von 50% aller Monozyten. Durch die fluiden Zellen gingen allerdings auch fast 50% der gesamten Monozyten verloren. Wegen geringer Ausbeute und mangelnder Reinheit wurde diese Methode der Aufreinigung nicht weiter verwendet. Zudem gehen während der Separation eine erhebliche Anzahl Zellen aus technischen Gründen verloren (Zellschaber, residuale Zellen in den Flaschen). Daneben führt eine Plastikadhärenz neben unspezifischer Aktivierung der Monozyten evtl. auch zu einer Selektion bestimmter Monozytensubpopulationen. 4.1.1.2 Affinitätschromatographische Anreicherung equiner Monozyten 4.1.1.2.1 Positive Selektion IgE-positiver Zellen Nachdem ROHWER (2004) zeigen konnte, dass ca. 10% der Monozyten beim Pferd stark IgE binden können, sollte versucht werden, aus angereicherten MNC (3.3.1.3) über eine positive Selektion im MACS (magnetic cell sorting) (3.3.1.5.2), die Reinheit der Monozyten in der MNC-Fraktion zu erhöhen. Von drei Pferden wurde heparinisiertes Vollblut gewonnen (3.3.1.1) und die MNC-Fraktion isoliert (3.3.1.3). Anschließend wurden die Zellen mit Mäuse-IgG1-AK gegen equines IgE (3.2.4.1.1) inkubiert und schließlich mit Ratten-AK gegen Mäuse-IgG1-Microbeads (3.2.4.1.2) magnetisch umlagert. Die Zellen, welche aufgrund des magnetischen Feldes zunächst in der Säule verblieben, wurden nach ihrer Gewinnung durch Entfernung des magnetischen Feldes durchflusszytometrisch (3.3.3) und mikroskopisch (3.3.2) untersucht. Die in Abbildung 8 gezeigten Dotplots, geben die Zellverteilung bei einem Tier vor und nach MACS-Separation wieder. 73 Ergebnisse Ausgangspopulation Side S catter (SSC) Eluat Forward Scatter (FSC) Abb. 8 Positive Selektion IgE positiver Zellen im MACS MNC eines Pferdes wurden mit Mäuse-IgG1-AK gegen equines IgE (3.2.4) inkubiert und mit RattenAK gegen Mäuse-IgG1-MicroBeads (3.2.4) magnetisch markiert. Mit Hilfe einer Midi-Macs-Säule (3.2.2) erfolgte eine Auftrennung der Zellen in einem magnetischen Feld (3.3.1.5.2). Dargestellt sind korrelierte Punktediagramme (Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC)). Der linke Dotplot gibt die Ausgangssituation der MNC-Fraktion eines Pferdes wieder, bei der nur 9,56 % der Zellen als Monozyten angesprochen werden können. Nach der positiven Selektion über IgE (rechter Dotplot) liegen 64,48% der Zellen in der für equine Monozyten charakteristischen SSC-FSC Region. Aus 10 x 106 MNC konnte mit dieser Methode im Mittel 0,16 x 106 MNC mit einem Anteil von 70,2 % monozytoiden Zellen gewonnen werden. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, ist die Ausbeute und Reinheit der Zellen jedoch erheblichen individuellen Schwankungen unterworfen, was auf eine unterschiedlich starke Expression des Fcε-Rezeptors bzw. seines Besatzes mit IgE schließen lässt. Tab. 4. Ausbeute an MNC und an IgE+ Monozytenanteil nach IgE-MACS-Separation Pferd Hetja Mysla Fönn Ausbeute aus 10 x106 MNC [x 105] 3 0,9 1 Reinheit in % Monozyten 70,7 75,6 64,5 Jeweils 10 x106 MNC (3.3.1.3) von 3 Pferden (3.2.7) wurden über IgE positiv in der MACS separiert (3.3.1.5.2). Die Tabelle gibt die mikroskopisch ermittelte Zellzahl (in x 105) nach der Separation, sowie den durchflusszytometrisch bestimmten relativen Monozytenanteilen der Zellpopulationen an. 74 Ergebnisse Obwohl mit dieser Methode eine sehr gute relative Anreicherung von Monozyten (70,2%) erzielt werden konnte, war die Ausbeute der wiedergewonnen MNC mit 1,6% (im Mittel) der eingesetzten Zellen sehr gering. Des Weiteren zeigte sich bei Kultivierungsversuchen (vgl. Kapitel 4.2.2.1) ein sehr hoher Aktivierungsgrad der MACS-separierten Zellen. Zudem ist die Funktion IgE+ Monozyten noch ungeklärt und Gegenstand aktueller Forschung. 4.1.1.2.2 Positive Selektion über CD14 Häufig wird für eine Anreicherung im MACS (magnetic cell sorting) CD14 als Zielstruktur auf den Monozyten verwendet (FELZMANN et al. 2003). Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun überprüft werden, ob diese Methode auch für das Pferd anwendbar ist. Ein speziesspezifischer Anti-CD14 Antikörper steht für das Pferd noch nicht zur Verfügung. Aus diesem Grund wurde in der Membranimmunfluoreszenz (MIF) (3.3.8) zunächst geprüft, ob sich ein anti-CD14 Antikörper aus dem humanen System (3.2.4) auch für das Pferd verwenden lässt. Dazu wurden equine MNC mit anti-humanen-CD14-Antikörpern zweier verschiedener Zellklone (3.2.4.1.1) inkubiert und mittels eines an FITC gekoppelten Sekundärantikörpers (soweit erforderlich) (3.2.4) markiert. Anschließend wurden die Zellen durchflusszytometrisch auf ihre Fluoreszenzintensität (3.3.8.2) untersucht. Um die Bindungsaffinität und Spezifität für das Pferd beurteilen zu können, wurden gleichzeitig humane MNC demselben Verfahren unterzogen. Beide in dieser Arbeit verwendeten antiCD14-AK zeigten ähnliche Bindungsmuster. In Abbildung 9 ist die Bindung einer der untersuchten anti-CD14-Antikörper im Vergleich zur Konjugatkontrolle (3.3.8) im Histogramm (3.3.8.2) dargestellt. 75 Ergebnisse Mensch, Tag 0, CD 14 Ereignisse Pferd, Tag 0, CD 14 FL-1-Fluoreszenzintensität Abb. 9 Expression von CD14 auf humanen und equinen MNC im Vergleich Menschliche MNC (links) und equine MNC (rechts) wurden direkt nach der Separation (3.3.1.3) in der Membranimmunfluoreszens mit monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD14 (3.2.4.1.1) auf die Expression von CD14 untersucht (3.3.8.2). Die Histogramme zeigen die Anzahl an Ereignissen gegen deren FL1-Fluoreszenzintensität. In Rot ist die Konjugatkontrolle (Sekundärantikörper mit FITC (3.2.4)), in Blau die CD14 markierten Zellen dargestellt. Bei den menschlichen MNC konnte man in der FL1-Fluoreszenz einen deutlich von der Konjugatkontrolle abgesetzten Peak im Histogramm sehen, während sich bei den equinen MNC keine deutliche Markierung erzielen ließ. Mit den in dieser Arbeit verwendeten Antikörpern (3.2.4.1.1) ist eine Anreicherung equiner Monozyten im MACS demnach nicht sinnvoll. Doch auch wenn diese Antikörper die gewünschte Struktur selektiv binden würden, wäre eine Anreicherung über CD14 im MACS kein optimales Verfahren um Monozyten zu gewinnen, die später zu potenten CTLstimulierenden mDC generiert werden sollen. ELKORD et al. (2005) verglich die Zytokinsekretion von DCs, die aus über Plastikadhärenz separierten Monozyten generiert wurden (Adhärenz/MoDC) mit der Zytokinsekretion von DCs, welche aus über CD14 positiv im MACS selektionierten Monozyten generiert wurden (MACS/MoDC). Dabei zeigte sich, dass MACS/MoDCs deutlich weniger IL12, TNFα und IL10 sezernierten als die Adhärenz/MoDC. Da durch die positive Selektion von Monozyten im MACS demnach neben einer nicht gewünschten Selektion auch eine Manipulation und/oder Aktivierung der Zellen erfolgt, wurde darauf verzichtet, weitere Antikörper für die positive MACS Separation zu testen. 76 Ergebnisse 4.1.1.2.3 Negative Selektion über CD 4 und CD 8 -Depletion Um die Nachteile der positiven MACS-Selektion zu umgehen, sollte versucht werden über eine negative Selektion Monozyten anzureichern. Da in der über Lymphozytenseparationsmedium separierten MNC Population die Lymphozyten mit ca. 90% die größte „Störquelle“ darstellen, sollte in diesem Versuch überprüft werden, ob sich CD4+ bzw. CD8+ Zellen mit Hilfe von anti-CD4 und anti-CD8 Antikörpern und MACS-Separation aus den MNC entfernen lassen. Auf diese Weise sollte sich der relative Anteil an Monozyten erhöhen. Von zwei Pferden wurden zunächst über Dichtegradientenzentrifugation MNC (3.3.1.3) separiert und anschließend mit Mäuse-Antikörpern gegen equines CD4 und CD8 (3.2.4) inkubiert. Schließlich wurden die Zellen mit FITC gekoppelten Ziegen-Antikörpern gegen Mäuse IgG(H+L) (3.2.4) markiert und anhand der Fluoreszenz die Bindung der AK im Durchflusszytometer kontrolliert (3.3.8.2). In Abbildung 10 ist ein korreliertes Punktediagramm (Dotplot) dargestellt, welches die Fluoreszenzintensität (FL-1) gegen die Größe der Zellen (FSC) zeigt. Forward Scatter (FSC) CD 4 und CD 8 pos. MNC Monozyten Lymphozyten FL 1-Fluoreszenzintensität Abb. 10 Kontrolle der Bindungsaffinität eines anti-CD4 und eines anti-CD8Antikörpers in der Membranimmunfluoreszenz Equine MNC wurden über Lymphozytenseparationsmedium® separiert (3.3.1.3) und mit einem kontrollierten Gemisch aus anti-equinen CD4 und anti-equinen CD8 Antikörpern (3.2.4) in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (3.3.8.1) untersucht. Dargestellt ist der Dotplot (3.3.3) eines Pferdes für Größe (FSC) gegen Grünfluoreszens (FL1). Die senkrechte Linie markiert die Fluoreszenzintensität der Konjugatkontrolle. Die Kreise zeigen die Bereiche, in denen morphologisch die monozytoide Zellen (oben) bzw. die lymphoiden Zellen (unten) zu finden sind. Zellen, die sich rechts der senkrechten Linie befinden, sind als positiv für CD4 und CD8 zu bewerten (61,2%). 77 Ergebnisse War die Bindung beider AK zufriedenstellend (mindestens 50% aller Zellen positiv und die Monozytenfraktion weitgehend negativ, siehe Abbildung 10.) wurden die Zellen mit antiFITC-Mikrobeads (3.2.4) inkubiert und durch eine magnetische Säule aufgetrennt (3.3.1.5). In Abbildung 11 sind die Dotplots (FSC vs. FL1) der Zellen vor der MACS-Separation, der Zellen aus dem Durchfluss (CD4 und CD8 negativ), sowie der Zellen des Eluats (CD 4 und CD 8 positiv) exemplarisch von einem Pferd dargestellt. Forward Scatter (FSC) MNC vor MACS FL 1-Fluoreszenzintensität Durchlauf Forward Scatter (FSC) Forward S catter (FSC) Eluat FL 1-Fluoreszenzintensität FL 1-Fluoreszenzintensität Abb. 11 Monozytenaufreinigung über eine Depletion CD4 und CD8 – positiver MNC im MACS Equine MNCs wurden mit anti-CD4 und anti-CD8 Primärantikörpern (3.2.4.1.1), anti-Maus-FITCkonjugierten Sekundärantikörpern (3.2.4.1.2), sowie anti-FITC-Tertiärantikörpern (3.2.4.1.2) inkubiert und in einer magnetischen Säule aufgetrennt (3.3.1.5.1). Der oberste Dotplot zeigt die Komposition der MNC-Ausgangspopulation. Im unteren linken Dotplot sind die Zellen dargestellt, welche die Säule trotz Magnetfeld passiert haben (Durchfluss). Die Zellen, die in der Säule festgehalten wurden (Eluat) sind im unteren, rechten Dotplot zu sehen. Alle Dotplots zeigen die Größe (FSC) gegen die Fluoreszenzintensität (FL1). Der Quadrant markiert auf der X-Achse die Lage der Konjugatkontrolle und auf der Y-Achse die morphologische Grenze zwischen lymphoiden und monozytoiden Zellen. Gefenstert wurde auf vitale MNC (3.3.3.1). 78 Ergebnisse In den oben gezeigten Dotplots (Größe (FSC) versus Grünfluoreszenz (FL1)) ist zu sehen, dass eine Anreicherung der Monozyten über Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen erreicht werden kann, allerdings die Reinheit der Monozyten nicht über 38% aller MNC steigt (Abb. „Durchlauf“, Quadrant oben links). Die Ausbeute an CD4 und CD8 depletierten MNC (Durchlauf) lag bei nur 6,8% der zur Separation eingesetzten MNC. Des Weiteren kann man erkennen, dass auch einige Zellen CD4 und CD8 exprimieren, die morphologisch in der Region der monozytoiden Zellen liegen (hohes FSC, Quadrant oben rechts). Diese Zellen befinden sich nach der Depletion im Eluat mit den Lymphozyten zusammen. Im Zuge dieses Trennverfahrens findet somit eine Selektion in CD4 und CD8 -positive und -negative Monozyten statt. Aufgrund zu geringer Ausbeute an CD4 und CD8- depletierten MNC (6,8 % der eingesetzten MNC) und der Vorselektion der Monozyten wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. 4.1.1.3 Anreicherung über hypertonen Percollgradienten Eine sehr elegante Methode der Monozytenaufreinigung wurde von DE ALMEIDA et al. (2000) für den Menschen beschrieben: Über einen hypertonen 50%igen Percollgradienten gelang es ihnen, humane Monozyten in beeindruckender Reinheit und Ausbeute zu separieren. Um zu überprüfen, ob diese Methode auch zur Aufreinigung equiner Monozyten verwendet werden kann, wurde Vollblut von verschiedenen Pferden gewonnen und das leukozytenreiche Plasma auf einen hypertonen Percollgradienten (3.2.5.3) geschichtet. Nach der Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6) konnten im Rahmen dieser Untersuchungen erstmals auch beim Pferd MNCs gewonnen werden, die Monozytenanteile zwischen 50% bis 90% enthielten (4.1.1.3.2). Der Separationserfolg variierte jedoch interindividuell als auch intraindividuell. Deshalb galt es die für die Schwankungen ursächlichen Faktoren zu ermitteln. 4.1.1.3.1 Einfluss des Antikoagulanz und der Percolltemperatur auf den Separationserfolg mit hypertonem Percoll Zunächst wurden zwei verschiedene Antikoagulanzien miteinander verglichen, da Monozyten sehr zu einer Aggregation an Thrombozyten neigen. Dafür wurde demselben Tier (Warmblüter) Blut in Vaccutainern (3.2.1) entnommen, welche entweder Citrat oder EDTA als Gerinnungshemmer enthielten. Das leukozytenreiche Plasma jeder Blutprobe wurde abgenommen und auf einen Percollgradienten mit einer berechneten Dichte (3.2.5.3.2) von 1,0638 g/ml und einer Osmolalität von 340 mOsm/kg geschichtet. Durch Verwendung von 79 Ergebnisse Percollgradienten unterschiedlicher Temperatur (7°C und 25°C) wurde zudem gleichzeitig ermittelt, ob eine Feinmodulation der Dichte mittels Temperatur des Gradienten möglich ist. In Tabelle 5 sind die nach Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6.) ermittelten Zellzahlen, der prozentuale Monozytenanteil sowie der absolute Monozytenanteil dargestellt. Tab. 5. Ausbeute und Monozytenreinheit in Abhängigkeit zu Antikoagulanz und Temperatur Antikoagulanz Citrat Citrat EDTA EDTA Percolltemperatur 7°C 25°C 7°C 25°C Ausbeute aller MNC aus 20 ml Vollblut [x 106] 0,6 0,3 0,9 0,7 Reinheit in % Monozyten Monozyten [x 106] 42,8 43,6 72,6 88,1 0,27 0,11 0,62 0,60 Einem Pferd wurden jeweils 40 ml Citrat- und EDTA– antikoaguliertes (3.3.1.1) Blut zeitgleich entnommen und über Dichtegradientenzentrifugation mit hypertonem Percoll (3.2.5.3.2) bei Temperaturen von 7° oder 25°C die Monozytenfraktion angereichert. Dargestellt sind die mikroskopisch ermittelten Zellzahlen, sowie der durchflusszytometrisch bestimmte prozentuale Monozytenanteil. (Zur Zellausbeute vergleiche Kapitel 4.1.1.3.2.) Es zeigte sich, dass EDTA antikoaguliertes Blut eine weitaus bessere relative und absolute Anreicherung equiner Monozyten erlaubte, als dies bei Citrat antikoaguliertem Blut der Fall war. Durch die höhere Temperatur des Percollgradienten konnte zudem eine Feinmodulation der Dichte erzielt werden, da lediglich durch die höhere Temperatur des Gradienten die Reinheit der Monozyten um über 15% gesteigert werden konnte, ohne jedoch in der Gesamtzahl der Mononzyten (0,60 vs. 0,62 x 106) zu hohe Verluste zu erzielen. Abbildung 12 zeigt Dotplots (Komplexität (SSC) versus Größe (FSC)) der Monozyten, welche aus EDTA-Blut bei unterschiedlichen Percolltemperaturen gewonnen wurden. 80 Ergebnisse MNC nach Percoll bei 25°C Side Scatter (SSC) MNC nach Percoll bei 7°C Forward Scatter (FSC) Abb. 12 Monozytenreinheit in Abhängigkeit der Dichtegradiententemperatur Für die Separationserfolge mit EDTA-Blut sind die Dotplots aus dem Durchflusszytometer exemplarisch für beide Temperaturen (7° & 25°C) des Gradienten (3.2.5.3.2) dargestellt. Gezeigt wird die Morphologie der Zellen anhand ihrer Komplexität (SSC) und ihrer Größe (FSC). Der linke Dotplot zeigt die Zellen, welche über hypertonen Percollgradienten bei 7°C separiert wurden, während der rechte Dotplot die Zellen zeigt, die zwar über den gleichen Gradienten, allerdings bei 25°C isoliert wurden (3.3.1.6). Der Trennstrich in der Graphik markiert die morphologische Grenze der lymphoiden und monozytoiden Fraktion. Für folgende Versuche wurde, basierend auf diesen Ergebnissen, ausschließlich EDTA antikoaguliertes Blut verwendet, und der verwendete Percollgradient im Wasserbad auf eine Temperatur von 25°C erwärmt. 4.1.1.3.2 Einfluss von Dichte und Osmolalität auf den Separationserfolg equiner Monozyten Um zu prüfen, ob sich die von DE ALMEIDA et al. (2000) für den Menschen beschriebene Methode auch generell für das Pferd eignet, wurde das Verfahren für die Separation equiner Monozyten verwendet sowie seine Abhängigkeit von Osmolalität und Dichte auf den Separationserfolg eruiert. Dazu wurden verschiedene Dichten eines Percollgradienten mit unterschiedlicher Osmolalität hergestellt (3.2.5.3.2) und die erzielte Monozytenreinheit und Ausbeute an vier Pferden (2 Warmblüter und 2 Islandponies) untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 dargestellt. 81 Ergebnisse Einfluss von Dichte und Osmolalität auf den Anteil der Monozyten an den MNC 2.5 2.0 % Monozyten Zellzahl aller MNC in x 10 6 Zellausbeute in Abängigkeit zu Osmolalität und Dichte 1.5 1.0 0.5 0.0 1.0614 1.0638 1.0662 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.0614 Percolldichte g/ml 1.0638 1.0662 Percolldichte g/ml Abb. 13 Einfluss von Dichte und Osmolalität auf Zellausbeute und Monozytenanteil Von vier Pferden wurde EDTA-antikoaguliertes Blut (3.3.1.1) gewonnen und durch hypertone Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6) Monozyten angereichert. Die verwendeten Percollgradienten unterschieden sich dabei in Dichte und Osmolalität (gelb: 330 mOsm/kg, orange: 345 mOsm/kg). Der linke Graph zeigt den Einfluss der beiden Parameter auf den relativen Anteil der Monozyten der wiedergewonnenen MNC, der rechte Graph gibt die dazugehörige absolute Ausbeute aller MNC wieder, die aus 20 ml Vollblut gewonnen werden konnten. Dargestellt sind die Mittelwerte der vier Pferde mit Standardabweichung. Der Pfeil markiert die bei bester Reinheit erzielte beste Ausbeute an Monozyten. Es zeigte sich, dass die Osmolalität in dem hier geprüften Bereich keinen Einfluss auf den Reinheitsgrad der Monozyten hatte. Auch die geringen Dichteunterschiede der Gradienten zeigten keinen Unterschied bezüglich des relativen Monozytenanteils. Betrachtet man aber die Ergebnisse des Dichtegradienten mit 1,0638 g/ml Dichte in der Ausbeute (siehe Pfeil in Abb. 13), fällt auf, dass durch die Hypertonie mehr Zellen gewonnen werden konnten (2 x 106 MNC aus 20 ml Vollblut). Separiert man leukozytenreiches Plasma von EDTA-Blut über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) erhält man im Mittel 20 x 106 MNC, von denen lediglich ca. 10% Monozyten sind (absolut 2 x 106). Separiert man das gleiche leukozytenreiche Plasma über den hier beschriebenen hypertonen Percollgradienten, erhält man im Durchschnitt nur Einzehntel der MNC (2 x 106), von denen jedoch 70% Monozyten sind (1,4 x 106). Somit kann durch einen einzigen Separationsschritt über hypertonen Percollgradienten fast die gleiche Anzahl an Monozyten gewonnen werden, jedoch in wesentlich höherer Reinheit (50 bis 90%). 82 Ergebnisse Neben der sehr guten Ausbeute und der hohen Reinheit der Monozyten, findet bei dieser Methode keine erkennbare unspezifische Vorselektion oder Aktivierung der Monozyten statt. Aus diesen Gründen wurde für weitere Untersuchungen Percollgradient mit 1,0638 g/ml Dichte und 345 mOsm/kg verwendet. 4.1.1.3.3 Zeit nach Blutentnahme als Einflussfaktor auf den Separationserfolg equiner Monozyten Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob der Verarbeitungszeitpunkt des Blutes nach der Entnahme einen Einfluss auf den Separationserfolg im Hinblick auf Reinheit und Ausbeute der Monozyten ausübt. Hierfür wurde von vier Pferden (2 Isländerponies und 2 Warmblütern) EDTA-Blut entnommen und jeweils die Hälfte des Blutes 1h nach Entnahme verarbeitet, während die andere Hälfte erst nach 24h Lagerung bei Raumtemperatur verwendet wurde. Die Monozytenseparation erfolgte zu beiden Zeitpunkten mit hypertonem (ca. 345mOsm/kg) Percollgradienten mit einer Dichte von 1,0638 g/ml. Die Ansätze erfolgten in Duplikaten, um eventuelle Schwankungen während der Messung feststellen zu können. Anschließend wurden die Zellen mit PBS-EDTA (3.2.5.3.5) dreimal gewaschen und durchflusszytometrisch der Anteil an Monozyten bestimmt. In Abbildung 14 sind die Mittelwerte der erzielten Anteile der Monozyten an den MNC für zwei unterschiedliche Zeitspannen von der Blutentnahme bis Bearbeitung dargestellt. Monozytenanteil % Monozytenreinheit in Abhängigkeit zum Zeitpunkt der Blutentnahme 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1h 24 h Zeitpunkt Abb. 14 Einfluss des Verarbeitungszeitpunktes des Blutes auf den Anteil von Monozyten an den MNC EDTA antikoaguliertes Blut (3.3.1.1) von vier Pferden wurde für 1h und 24h nach Entnahme bei RT gelagert und dann zur Isolierung der Monozytenfraktion mittels hypertonem Percollgradienten (3.3.1.6) verwendet. Zu sehen ist der erzielte prozentuale Monozytenanteil der MNC in Abhängigkeit zum Separationszeitpunkt nach Blutentnahme. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung der vier Tiere. 83 Ergebnisse Es zeigte sich ein starker Unterschied in der erzielten Reinheit der Monozytenpopulationen in Abhängigkeit zum Verarbeitungszeitpunkt. Die erzielte Reinheit betrug nach 1h im Mittel aller vier Pferde 66,1%, wohingegen nach 24h Lagerung bei Raumtemperatur trotz sonst gleicher Bedingungen nur noch 24,2% der gewonnen MNC-Fraktion zu den Monozyten gezählt werden konnte. Zur Monozytenseparation ist es demnach essentiell, möglichst frisch entnommenes Vollblut zu verwenden. Monozytenanteil % 4.1.1.3.4 Rassebezogener Einfluss auf den Separationserfolg Im Rahmen dieser Untersuchungen deutete sich an, dass rassebezogene Unterschiede im Hinblick auf die Anreicherung von Blutmonozyten über hypertonen Percoll-Gradienten bestehen könnten, die in einem weiteren Versuch zu prüfen waren. Dafür wurden jeweils vier Pferden der Rassen Westfale und Sachsen (im Folgenden als Warmblüter bezeichnet) und vier Isländerponies EDTA-Blut (3.3.1.1) entnommen und Monozyten separiert (3.3.1.6). Der erzielte Monozytenanteil beider Pferderassen wurde anschließend miteinander verglichen. Dabei zeigte sich sich die Tendenz, dass bei Warmblütern eine bessere Reinheit der Monozyten erreicht werden kann als bei Islandponies (vgl. Abb. 15). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Warmblut-Pferde Isländer-Ponies Pferderasse Abb. 15 Rassebedingte Unterschiede bei der Aufreinigung von Blutmonozyten Je 4 Pferden der Rasse Warmblut und Islandponies wurde EDTA-Blut entnommen und über einen 50%igen hypertonen Percollgradienten die Monozytenfraktion aufgereinigt (3.3.1.6). Durchflusszytometrisch wurde der Anteil der erzielten Monozyten an der Gesamt-MNC-Fraktion ermittelt (3.3.3) und in % Monozytenanteil an den gewonnenen MNC ausgedrückt (Y-Achse). Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte der beiden Pferderassen von je 4 Tieren mit Standardabweichung. 84 Ergebnisse Werden equine Monozyten über einen hypertonen Percollgradienten angereichert ist eine gute Reinheit und Ausbeute erreichbar. Der zu erzielende Monozytenanteil ist allerdings z.T. erheblichen Schwankungen unterworfen. Den größten Einfluss üben der Zeitpunkt der Blutverarbeitung nach Entnahme, sowie der verwendete Gerinnungshemmer im Blut aus. Mitunter wurden jedoch auch Schwankungen innerhalb eines Individuums beobachtet, welches in wiederholten Versuchen beobachtet wurde, mit intraindividuellen Unterschieden von bis zu 40%. Hier könnte als möglicher Einflussfaktor die Blutentnahme durch groß- oder kleinlumige Kanülen (Schaumbildung) eine Rolle spielen. Dennoch stellt diese Methode von allen derzeit beschriebenen und für das Pferd anwendbaren Verfahren die beste Möglichkeit der Aufreinigung equiner Monozyten dar, da aus nur 20 ml Vollblut ca. 1-2 x 106 MNC mit monozytoiden Anteilen von 50 bis 90% erzielt werden können. Zudem erfahren die Monozyten hierbei keine erkennbare Selektionierung oder Aktivierung, die ihre weitere Funktionsfähigkeit beeinträchtigen könnten. 4.2 Generierung von dendritischen Zellen aus angereicherten equinen Monozyten 4.2.1 Funktionalitätsprüfung von rekombinantem equinem IL4 Ein Weg um Monozyten des peripheren Blutes in vitro zu dendritischen Zellen ausdifferenzieren zu lassen, führt über die Kultivierung der Monozyten mit den Zytokinen Granulozyten-Monozyten-koloniestimulierender-Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL4) (KIERTSCHER u. ROTH 1996; ROMANI et al. 1996). Für humanes GM-CSF soll dabei eine ausreichende Kreuzreaktivität für das Pferd bestehen (HAMMOND et al. 1999), wohingegen Interleukin 4 als speziesspezifisch gilt. Aus diesem Grunde sollte für die Generierung der DC rekombinantes equines Interleukin 4 (req.IL4) verwendet werden, welches von Dr. B. Wagner gentechnisch hergestellt (WAGNER et al. 2005) und freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde. Zunächst mussten jedoch die biologische Funktionalität bestätigt, und die optimale Dosis des req.IL4 bestimmt werden. 85 Ergebnisse 4.2.1.1 Einfluss verschiedener IL 4 Konzentrationen auf die absolute Zellzahl equiner MNC nach mitogener Vorstimulation Da Interleukin 4 eine proliferationsfördernde Wirkung auf B- und T-Zellen ausübt, kann die Funktionalität anhand eines Proliferationsansatzes mit LAG (Leukoagglutinin, s.3.2.3) vorstimulierten eq. MNC überprüft werden. Dafür wurden MNC von vier Pferden über Lymphozytenseparationsmedium® isoliert (3.3.1.3) und mit LAG (3.3.6.1) für 4 Tage vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen in Proliferationsansätzen zu je 6 x 104 MNC mit unterschiedlichen IL-4 Verdünnungen weiter inkubiert. Die Messung der Proliferation erfolgte über die Referenzzellmethode (3.3.4) nach 3, 5, 7 und 9 Tagen weiterer Kultur jeweils in Triplikaten. Da es sich bei dem untersuchten Interleukin 4 um ein IL4-IgG-Konstrukt handelt (WAGNER et al. 2005), erfolgte zusätzlich zu einer Mediumkontrolle, eine Kontrolle mit einem req.INFγ-IgG-Konstrukt (ebenfalls von Dr. B. Wagner freundlicherweise zur Verfügung gestellt) in der Verdünnung 1:4. Damit sollte ein Einfluss der Fusionskomponente (konstanter IgG-Bereich) erfasst werden, da INFγ alleine keine proliferationsfördernde Wirkung auf MNC ausüben soll. In Abbildung 16 sind der Übersicht halber nur die Ergebnisse der Tage 5 (höchste erzielte Zellzahl) und 9 (niedrigste erzielte Zellzahl) dargestellt. 86 Ergebnisse Proliferationstest Absolute Zellzahl MNC 700000 Tag 5 Tag 9 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0 1:2 1:4 1:10 IL4 1:100 1:4 INFγ Abb. 16 Dosis-Zeit abhängige Proliferation vorstimulierter equiner MNC nach Stimulation mit req. IL4 Equine MNC (3.3.1.3) von vier Pferden wurden für vier Tage mit 1µg/ml LAG (3.2.3) vorstimuliert, gewaschen und anschließend zu 6 x 104 Zellen/ well in einer 96 U-Well-Zellkulturplatte ausplattiert (3.3.6.1). Für weitere 5 bis 9 Tage wurden die Zellen mit kompletten DMEM (3.2.5.2) ohne und mit Interleukin 4 (req.IL4) (3.2.6.1) in den Endverdünnungen 1:2, 1:4, 1:10 und 1:100 kultiviert. Zur zusätzlichen Kontrolle wurde ein weiteres Zytokin-IgG-Konstrukt (INFγ-IgG, 1:4) mitgeführt, um den Einfluss des IgG-Fragmentes des Zytokinkonstruktes ermitteln zu können. Dargestellt sind die MW der vier Tiere mit Standardabweichung. Nach fünf Tagen Inkubation mit req.IL 4 in einer Verdünnung von 1:4 konnte die stärkste Proliferation gemessen werden. Ab Tag 7 war dagegen schon ein erhöhtes Zellsterben zu beobachten. Im Vergleich zur Mediumkontrolle (0, ohne Interleukin 4) bestand nur bei den niedrigsten Verdünnungsstufen 1:2, 1:4 und 1:10 ein deutlicher Unterschied. Das INFγ-IgGKonstrukt zeigte dagegen keinen Unterschied zur Mediumkontrolle, was einen Einfluss der IgG-Komponente an dem req.IL4 ausschließen lässt. Die biologische Aktivität des Zytokins konnte somit hinsichtlich der Proliferationsinduktion vorstimulierter equiner Lymphozyten bestätigt werden. 4.2.1.2 Einfluss von req.IL4 auf die monozytoide Fraktion equiner MNC Nachdem die biologische Aktivität des req.IL4 auf die Proliferation von Lymphozyten als gesichert galt, stellte sich die Frage nach der biologischen Funktionalität im Bezug auf die 87 Ergebnisse Differenzierung equiner Monozyten zu dendritischen Zellen. Da innerhalb der zuvor im Proliferationstest untersuchten MNC (4.2.1.1) die monozytoiden Zellen einen Anteil von 15% (MW) ausmachten, wurde zunächst geprüft, ob sich innerhalb dieser Zellpopulation eine Konditionierung der Monozyten zu dendritischen Zellen messen lässt. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 GM-CSF IgG2b IgG2a IgG1 CD 86 CD 83 MHC II MHC I GM-CSF + req.IL4 Konjugat % FL1 positiver MNC Dazu wurden die MNC von 5 Pferden über Lymphozytenseparationsmedium® isoliert (3.3.1.3) und mit huGM-CSF (1000U/10ml, 3.3.6.2) alleine und in Kombination mit req.IL4 (Endverdünnung 1:4) für 7 Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Antikörpern gegen MHC I, MHC II, CD83 und CD86 (3.2.4.1.1) inkubiert und durch Inkubation mit einem Sekundärantikörper (an Fluoreszeinisothiocyanat gekoppelt) markiert (3.2.4.1.2). Im Durchflusszytometer konnte so der Prozentsatz FL1-positiver Zellen ermittelt werden (3.3.8.2). Wie Abbildung 17 zeigt, konnte innerhalb einer MNC Population kein signifikanter Unterschied in der Expression der geprüften Oberflächenstrukturen zwischen den Kulturansätzen gemessen werden. Oberflächenmarker Abb. 17 Expression verschiedener Oberflächenmarker auf eq.MNCs nach in-vitro Kultur mit und ohne reqIL4 Equine MNC von fünf Pferden wurden über 7 Tage mit huGM-CSF (3.2.6.2) alleine und in Kombination mit req.IL4 kultiviert (3.3.6.2). An Tag 7 wurden die Zellen in der Membranimmunfluoreszenz (3.3.8) auf die Oberflächenmarker MHC I, MHC II, CD83 und CD86 (3.2.4.1.1) untersucht. Als Kontrollen dienten die entsprechenden Isotypkontrollen (3.2.4.1.1), um unspezifische Bindungen und somit falsch positive Ergebnisse ermitteln zu können. Nur MHC I und MHC II sind als positive Population zu erkennen. Nach Test auf Normalverteilung der Differenzen, die bei der MHC II-Expression zwischen den Kulturansätzen mit und ohne req.IL4 zu messen waren, wurde der gepaarte t-test angewendet, um die Unterschiede der Ansätze zu erfassen. Demnach war die Steigerung der MHC II-Expression unter req.IL4-Zusatz statistisch nicht signifikant. 88 Ergebnisse Erwartungsgemäß sind alle kernhaltigen Zellen MHC-I positiv. Bei Pferden besteht die Besonderheit, dass neben allen B-Lymphozyten auch ein erheblicher Teil T-Lymphozyten MHC-II positiv sind (LUNN et al. 1993), was hier sehr deutlich zu erkennen ist. Die Antikörper CD83 und CD86 sind als negativ zu bewerten, da sie nicht über das Niveau der entsprechenden Isotypkontrolle hinausreichen. Für den anti-hu-CD86-Antikörper sind in der Literatur (MAUEL 2002) jedoch Kreuzreaktivitäten des verwendeten AK mit equinen Zellen beschrieben worden. Eine weitere mögliche Erklärung für die fehlende Expression von CD83 und CD86, trotz prinzipiell geeigneter Kulturbedingungen, könnte darin bestehen, dass das verwendete req. IL4 nicht in der Lage ist, seine biologische Funktion zur Differenzierung von Monozyten in DC auszuüben. Dieser Annahme widersprachen jedoch die auflichtmikroskopischen Befunde der Zellkulturen, die in Abbildung 18 exemplarisch für ein Pferd gezeigt sind. 89 Ergebnisse Tag 0 Tag 7, GM-CSF Tag 7, GM-CSF + req.IL4 Abb. 18 Auflichtmikroskopische Aufnahmen equiner MNC in Kultur Die auflichtmikroskopischen Aufnahmen (Vergrößerung: 10x Okular, 20x Objektiv 3.3.7.1) zeigen equine MNC direkt nach der Separation (3.3.1.3) (Tag 0) und 7 Tage nach Kultur mit hu.GM-CSF (3.2.6.2) alleine (links unten) und in Kombination mit req.IL4 (3.2.6.1) (rechts unten) in EarlesMedium (3.3.6.2). Deutlich sind in der Kultur mit req.IL4 Zellen mit langen Ausläufern (Pfeile) zu erkennen, die in der Kultur ohne req.IL4 nicht zu finden waren. Nur in den Ansätzen mit req.IL4 und GM-CSF konnten nach 7 Tagen Zellen gesehen werden, welche die für DC charakteristischen phänotypischen Merkmale aufwiesen: So zeigten einige Zellen sehr lange Ausläufer, mit denen sie in Kontakt zu anderen Zellen standen, während das Zellbild der Kulturen ohne req.IL4 in keinem der Fälle solche Zellen beinhaltete. In beiden Kulturansätzen dominierten jedoch die Lymphozyten das Zellbild. 90 Ergebnisse 4.2.2 Generierung equiner dendritischer Zellen nach unterschiedlichen Monozytenanreicherungsmethoden Um einen Nachweis dendritischer Zellen mittels Membranimmunfluoreszenz über CD83 und CD86 führen zu können, schien es unumgänglich zu sein, den relativen Anteil der Monozyten zu erhöhen. Aus diesem Grund wurde an equinen MNC mit einem monozytoiden Anteil von mindestens 60% der Einfluss des zuvor eingesetzten req.IL4 auf die Differenzierung eq.Monozyten zu DC weiter untersucht. Um Einflüsse auf die Monozyten ermitteln zu können, die durch die Aufreinigungsmethode zustande kommen, wurden Monozyten, welche über IgE positiv im MACS selektioniert (4.1.1.2.1) und Monozyten welche über einen hypertonen Percollgradienten aufgereinigt worden waren (4.1.1.3), zur DC-Generation verwendet. 4.2.2.1 DC-Generierung aus IgE positiven Monozyten nach MACS Monozyten des Pferdes wurden über IgE positiv im MACS selektioniert (4.1.1.2.1) und anschließend mit huGM-CSF (3.2.6.2) alleine und in Kombination mit req. IL4 (3.2.6.1) in Kultur gebracht. Die Zellkulturen wurden täglich mikroskopisch auf Zellvitalität und Morphologie untersucht. Nach 3 Tagen in Kultur zeigte sich schon ein stark aktiviertes Zellbild, so dass die Zellen geerntet und in der Membranimmunfluoreszenz auf die Expression von CD83, CD86 und MHC II untersucht wurden. Zum Vergleich wurden von demselben Tier MNCs (über Lymphozytenseparationsmedium® separiert, 3.3.1.3) unter den gleichen Bedingungen kultiviert und der Prozentsatz der in der MIF positiven Zellen miteinander verglichen. Abbildung 19 gibt die Ergebnisse der durchgeführten MIF für alle vier Kulturansätze wieder (Ausgangs-MNC-Population über Lymphozytenseparation® separiert und z.T. zusätzlich über IgE angereicherte Monozyten mit und ohne req.IL4.). 91 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 GM-CSF Oberflächenmarker Isotyp.IgG2b Isotyp.IgG2a Isotyp.IgG1 CD86 CD83 MHC II MHC I GM-CSF + req.IL4 Konjugat % FL1 positiver M N C Isotyp.IgG2b Isotyp.IgG2a Isotyp.IgG1 CD86 CD83 MHC II MHC I 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 IgE positive Monozyten mit 67 % monoztyoidem Anteil 100 Ausgangs-MNC-Population mit 12 % monoztyoidem Anteil Konjugat % FL1 positiver M N C Ergebnisse Oberflächenmarker Abb.19 Expression verschiedener Oberflächenmarker auf MNC ohne Monozytenanreicherung und auf IgE positiven angereicherten Monozyten mit und ohne req.IL4 Von einem Pferd wurden zeitgleich MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) gewonnen. Ein Teil der MNC wurde anschließend einer affinitätschromatographischen Monozytenanreicherung über IgE unterzogen (3.3.1.5.2). Die IgE positiven Zellen (rechte Abb.) und die Ausgangs-MNC-Population (linke Abb.) wurden für 3 Tage in Earles-Medium (3.2.5.1) mit GMCSF (3.2.6.2) alleine oder in Kombination mit req.IL4 kultiviert (3.2.6.1). An Tag 3 wurden die Zellen geerntet und in der MIF (3.3.8) auf die Oberflächenmarker MHC I, MHC II, CD83 und CD86 untersucht. Der linke Graph zeigt den prozentualen Anteil FL1 positiver Zellen der Ausgangs-MNCKultur, der rechte Graph zeigt den Anteil FL1 positiver Zellen aus der Kultur der über IgE angereicherten Monozyten. Werden Monozyten über IgE angereichert, lassen sich nach der Kultivierung mit req.IL4 und GM-CSF Oberflächenmarker nachweisen, die für dendritische Zellen charakteristisch sind: CD 83 und CD 86. Bemerkenswert ist hier zudem die Tatsache, dass für eine Differenzierung der Monozyten zu DC nur 3 Tage ausreichend waren und ohne zusätzlichen Stimulus (LPS, TNF etc.) eine deutliche Expression des Reifungsmarkers CD 83 zu detektieren war. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass auch in der Kultur ohne req.IL4 (grüne Säulen) ein nicht unerheblicher Anteil der Zellen eine Expression von CD 83 und CD 86 zeigte. Unter Zusatz von req.IL4 stieg der Prozentsatz der positiven Zellen jedoch weiter an. Im Gegensatz dazu war in der MNC-Kultur mit nur 12% Monozyten kein Nachweis von DC über die Oberflächenmarker in der MIF möglich. 92 Ergebnisse Die hier eingesetzten Antikörper gegen CD 83 und CD 86 konnten nun als beim Pferd kreuzreaktiv angesehen, und somit für die Charakterisierung der dendritischen Zellen verwendet werden. Auch für das req.IL4 war ein Einfluss auf die Differenzierung der Monozyten zu DC nachgewiesen. 4.2.2.1.1 Durchflusszytometrische Erfassung der morphologischen Differenzierung IgE positiver Monozyten zu DC Um die morphologische Differenzierung der IgE positiven Monozyten innerhalb der 3 Tage Kultur darzustellen, wurden die Zellen im Durchflusszytometer direkt nach der Separation über MACS (4.1.1.2.1) (d 0) und an Tag 3 der Kultur (d 3) untersucht. Abb.20 zeigt exemplarisch die Dotplots eines Pferdes für Komplexität (SSC) versus Größe (FSC) der IgEpositiven Monozyten an d 0 und an d 3. MoDC nach 3d Kultur Side S catter (SSC) Separierte Monozyten d0 Forward Scatter (FSC) Abb. 20 Morphologische Differenzierung IgE positiver Monozyten nach 3 Tagen Kultur Monozyten eines Pferdes wurden über IgE positiv im MACS (4.1.1.2.1) selektioniert und für 3 Tage mit GM-CSF und req.IL4 in Earles-Medium kultiviert (3.3.6.2). Die Zellen wurden direkt nach der Anreicherung und nach drei Tagen Kultur (GM-CSF + req.IL4) durchflusszytometrisch auf ihre Morphologie untersucht (3.3.3). Dargestellt sind Dotplots der frisch MACS-separierten Monozyten (Tag 0) und der über 3 Tage kultivierten Zellen in der morphologischen Darstellung Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC). Es zeigte sich, dass im Verlauf der Kultivierung die Zellen eine Zunahme an Größe und Komplexität erfahren. Obwohl sich in den Versuchen herausstellte, dass über IgE angereicherte Monozyten in der Lage sind, in vitro zu dendritischen Zellen zu differenzieren, wurde von dieser Methode zur 93 Ergebnisse Gewinnung von DC zum therapeutischen Einsatz in der Tumortherapie Abstand genommen. Grund dafür war eine zu geringe Ausbeute der Zellen (2 bis 5 x 106 MNC aus 500ml Vollblut), die Vorselektion einer Subpopulation von (IgE-pos.) Monozyten sowie eine unspezifische Aktivierung der MACS-angereicherten Zellen. Zudem ist noch nicht bekannt, welche Funktionen IgE+ Monozyten bzw. DC in vivo ausüben. 4.2.2.2 DC-Generierung aus equinen Monozyten nach Anreicherung über hypertonen Percoll-Gradienten Wie in Kapitel 4.1.1.3 gezeigt wurde, lassen sich equine Monozyten über einen leicht hypertonen Percollgradienten in guter Reinheit und Ausbeute gewinnen. Nun sollte überprüft werden, ob diese Zellen - ebenso wie IgE-angereicherte eq. Monozyten - in der Lage sind, in dendritische Zellen zu differenzieren. Von vier Pferden wurden Monozyten angereichert und mit GM-CSF und req.IL4 in Kultur gebracht. Da sich zuvor zeigte (4.2.2.1), dass eine Expression der DC-Marker schon nach 3 Tagen Kultur erreicht werden konnte, in der Literatur aber 7 Tage als Differenzierungsdauer equiner MoDC angegeben wird (MAUEL et al. 2006), wurden diese Zellen nach 3 bzw. 7 Tagen Inkubation geerntet und durchflusszytometrisch sowie lichtmikroskopisch untersucht. Mit Hilfe einer MIF (3.3.8) wurde der prozentuale Anteil Zellen ermittelt welche CD83 und CD86 exprimieren. 4.2.2.2.1 Charakterisierung der MoDC in der Membranimmunfluoreszenz Mit der Membranimmunfluoreszenz sollte nun überprüft werden, ob sich bei hyperton angereicherten Monozyten nach Kultivierung die für DC charakteristischen Oberflächenstrukturen CD83 und CD86 nachweisen lassen. Zudem sollte untersucht werden, ob sich, wie bei den über IgE angereicherten Zellen, schon nach 3 Tagen eine deutliche Expression dieser Marker messen lässt. Anschließend wurde der prozentuale Anteil der FL1 positiven Zellen an Tag 3 und Tag 7 ermittelt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 21 wiedergegeben. 94 Ergebnisse % FL1 positive M N C 60 Tag 3 Tag 7 50 40 30 20 10 0 CD 83 CD 86 Oberflächenmarker Abb. 21 Zeitkinetik der Expression des costimulatorischen Moleküls CD86 und des DC Reifungsmarkers CD83 auf equinen MoDC Über hypertones Percoll (4.1.1.3) angereicherte Monozyten von vier Pferden wurden für 3 bzw. 7 Tage mit huGM-CSF (3.2.6.2) und req.IL4 (3.2.6.1) kultiviert (3.3.6.2). Nach den jeweiligen Inkubationszeiten wurden die Zellen mittels Membranimmunfluoreszens (3.3.8) auf ihre Expression von CD83 und CD86 untersucht. Ermittelt wurde der Prozentsatz FL1 positiver Zellen. Dargestellt sind die Mittelwerte von vier Pferden mit Standardabweichung. Nach 3 Tagen Kultur waren die Zellen zu 13% (MW) CD86 positiv. Wurden die Zellen für insgesamt 7 Tage in Kultur belassen, stieg der Prozentsatz der CD86 exprimierenden Zellen jedoch deutlich weiter an. CD83 war an Tag 3 schon bei 9% aller Zellen ebenfalls nachweisbar und wurde an Tag 7 von 17% der Zellen exprimiert. Im Gegensatz zu den über IgE angereicherten Zellen benötigten die über Percoll angereicherten Zellen 7 Tage Kultivierungszeit, um ein vergleichbares Niveau der CD83 und CD86 Expression zu erreichen. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die über IgE und MACS aufgereinigten Zellen bereits durch die affinitätschromatographische Aufreinigung eine erhebliche Aktivierung erfahren hatten. Eine MIF mit den Antikörpern vor der Kultivierung zeigte, dass die Zellen direkt nach der Separation (Tag 0) CD83 und CD86 negativ waren. Mitgeführte Konjugat- und Isotypkontrollen waren ebenfalls negativ. Exemplarisch ist dies für ein Pferd in Abbildung 22 in Histogrammen dargestellt. 95 Ergebnisse Ereignisse Tag 0, CD 83 Tag 7, CD 83 Tag 7, CD 86 Tag 0, CD 86 FL-1-Fluoreszenzintensität Abb. 22 Expressionsanstieg der Oberflächenmarker CD 83 und CD 86 von d 0 zu d 7 Über hypertonen Percoll angereicherte Monozyten (4.1.1.3), wurden direkt nach der Separation (Tag 0) und nach 7 Tagen Kultur mit huGM-CSF und reqIL4 (3.3.6.2) in der Membranimmunfluoreszenz auf die Expression von CD 86 und CD 83 untersucht. Die Histogramme zeigen die Ereignisse in der FL1-Fluoreszenzintensität an Tag 0 und Tag 7. Gefenstert wurde auf morphologisch als Monozyten (Tag 0) oder dendritische Zellen (Tag 7) identifizierbare Zellen. Schwarze Linie: Konjugatkontrolle, Blaue Linie: Isotypkontrolle, Rot: CD 83 positive Zellen (oben) und CD 86 positive Zellen (unten). Um ausschließen zu können, dass kontaminierende Lymphozyten unspezifisch an die antiCD83 und anti-CD86-Antikörper binden, wurde zusätzlich die Morphologie der Zellen gegen die FL1-Fluoreszenz beurteilt (Abbildung 23). Während die morphologisch als DC identifizierbaren Zellen durch Bindung der Antikörper eine Verschiebung nach rechts (zunehmende FL1-Fluoreszenz) erfahren, blieben die Lymphozyten negativ. Eine Bindung der anti-CD 83 und anti- CD 86-Antikörper findet somit selektiv nur bei den DC statt. 96 Ergebnisse Side Scatter (SSC) CD 83 CD 86 Dendritische Zellen Dendritische Zellen Lymphozyten Lymphozyten FL 1- Fluoreszenz Abb. 23 Kontrolle der FL1-Fluoreszenz kontaminierender Lymphozyten im Vergleich zu Monozyten bzw. DCs Aus Monozyten generierte DC (3.3.6.2) wurden in einer MIF (3.3.8) auf die Oberflächenmarker CD83 und CD86 untersucht. Um unspezifische Bindungen der Antikörper an die kontaminierenden Lymphozyten ausschließen zu können, wurde die Komplexität gegen die Fluoreszenzintensität (FL1) beurteilt. Die senkrechte Linie markiert den FL1-Wert der Konjugatkontrolle. Für beide Oberflächenmarker (CD83 links, CD86 rechts) ist deutlich zu erkennen, dass nur die monozytoiden/ dendritischen Zellen eine Verschiebung nach rechts erfahren. 97 Ergebnisse 4.2.2.2.2 Durchflusszytometrische, morphologische Charakterisierung der MoDC Im Durchflusszytometer zeichneten sich die dendritischen Zellen durch eine starke Zunahme ihrer Komplexität aus, was sich in einem erhöhten Seitwärtsstreulicht (SSC) im Durchflusszytometer darstellt. Exemplarisch ist dies für ein Pferd im Dotplot nach 7 Tagen Kultur dargestellt. MoDC nach 7d Kultur Side Scatter (SSC) Separierte Monozyten d0 Forward Scatter (FSC) Abb. 24 Durchflusszytometrische Erfassung der DC-Morphologie Der linke Dotplot zeigt die über hypertones Percoll frisch angereicherten Monozyten (3.3.1.6) eines Pferdes in der morphologischen Darstellung (Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC)). Der rechte Dotplot zeigt dieselben Zellen nach 7 Tagen Kultur (3.3.6.2) in Earles Medium unter Zusatz von huGM-CSF und req.IL4 (3.2.6). Die senkrechte Linie markiert die Grenze zwischen Lymphozyten (links) und Monozyten (rechts). Während die frisch isolierten Monozyten eine sehr homogene Population darstellen, streuen die MoDC wesentlich stärker. Die Zellen werden geringgradig größer (FCS-Zunahme) und zeichnen sich durch eine komplexere Oberflächenstruktur aus (SSC-Zunahme). Diese morphologische Veränderung konnte lichtmikroskopisch ebenfalls beobachtet werden (vgl. 4.2.2.2.3). 4.2.2.2.3 Mikroskopische Beurteilung der dendritischen Zellen Um die Zellmorphologie, sowie die Zellverbindungen besser darstellen zu können, wurde ein Teil der Monozyten in Chamber-Slides (3.2.2) kultiviert. Dabei findet die Kultivierung der Zellen direkt auf einem speziellen Objektträger statt, was später eine Färbung und mikroskopische Untersuchung der Zellen ermöglicht ohne sie durch Manipulationen zu 98 Ergebnisse beschädigen oder in ihrer Morphologie zu beeinflussen. Abbildung 25 zeigt mikroskopische Aufnahmen der Zellen in situ. 50µm 200µm A B 50µm C 50µm D Abb. 25 Lichtmikroskopische Aufnahmen generierter dendritischer Zellen in situ Monozyten wurden für 4 Tage in Chamber-Slides (3.2.2) in Earles Medium (3.2.5.1) mit Zusatz von huGM-CSF und req.IL 4 kultiviert (3.3.6.2). Nach 4 Tagen wurden die auf dem Objektträger adhärierenden Zellen luftgetrocknet und mit einer modifizierten Färbung nach Wright angefärbt. Foto A zeigt die Zellen in einer Übersichtsaufnahme. Foto B, C und D verdeutlichen die Zell-zuZellkontakte der DC, sowie die Anlagerung von Lymphozyten (Pfeile). 4.2.2.3 Einfluss eines finalen Stimulus auf die CD-Expression equiner MoDC Das Oberflächenmolekül CD 83 wird in der Literatur als Reifungsmarker dendritischer Zellen bezeichnet, obwohl über seine Funktion noch wenig Erkenntnisse vorliegen (LECHMANN et al. 2001). Bei Mensch und Maus wird es erst auf reifen DC nachgewiesen, wobei die Reifung einen finalen Stimulus erfordert. Obwohl beim Pferd die Expression von CD 83 schon alleine 99 Ergebnisse durch Kultivierung peripherer Blutmonozyten mit GM-CSF und req.IL4 zu einer Expression dieser Oberflächenstruktur bei 15-30% der MNC führte (siehe oben), sollte überprüft werden, ob durch Zugabe von LPS (1µg/ml) 24 h vor Ernte der DC eine Zunahme in der Expression dieses Reifungsmarkers zu detektieren ist. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 IgG2b IgG1 CD 86 CD 83 MHC II Tag 0 Tag 7 ohne LPS Stimulation Tag 7 mit LPS Konjugat % FL1 positive MNC Hierfür wurden Monozyten von vier Pferden über einen hypertonen Percollgradienten (3.2.5.3.2) angereichert und jeweils in zwei Zellkulturflaschen 10 x 106 MNC mit hohem Monozytenanteil pro Pferd mit GM-CSF und req.IL4 für 7 Tage kultiviert (3.3.6.2). An Tag 6 wurde der Hälfte der Kulturansätze LPS (3.2.3) in einer Endkonzentration von 1µg/ml zugesetzt. 24 Stunden später wurden alle Zellen mit Hilfe eines Zellschabers geerntet und in der MIF auf ihre Expression von MHC II, CD83 und CD86 untersucht. In Abbildung 26 sind die Ergebnisse der MIF dargestellt. Oberflächenmarker Abb. 26 Einfluss einer finalen 24 stündigen Stimulation mit LPS auf die CD-Expression equiner MoDC Monozyten von vier Pferden wurden mit GM-SCF (3.2.6.2) und req.IL4 (3.2.6.1) für 7 Tage kultiviert (3.3.6.2). Die Hälfte der Kulturen erhielten an Tag 6 LPS (1µg/ml) (3.2.3). An Tag 0 (Separation der Monozyten) und Tag 7 wurden die Zellen in einer MIF auf die Expression von MHC II, CD83 und CD86 untersucht (3.3.8). Dargestellt sind die MW von vier Tieren der FL1-positiven Zellen in % der gesamten MNC-Population einschließlich der Isotypkontrollen IgG1 und IgG2b (3.2.4.1.1). 100 Ergebnisse Es zeigte sich bei allen Kulturen ein Anstieg der CD83 und CD86 Expression im Vergleich zu Tag 0. Eine finale Stimulation mit LPS führte aber zu keinerlei Unterschieden im Vergleich zu der entsprechenden Kultur ohne LPS. 4.3 Funktionalitätsprüfung der generierten MoDC Für dendritische Zellen ist bekannt, dass sie als einzige Zellen des Immunsystems in der Lage sind, nicht nur Gedächtniszellen sondern auch naive T- und B-Lymphozyten zu aktivieren. Eine Möglichkeit diese Angelpunktfunktion der DC in vitro zu prüfen, ist die gemischte Leukozytenreaktion (MLR, mixed leucocyte reaction). Dabei werden DC eines Pferdes (als Stimulatorzellen) mit Lymphozyten eines anderen Pferdes (als Responderzellen) in Cokultur gebracht (allogene MLR) und die Proliferationsrate im Vergleich zu einer Mediumkontrolle der Lymphozyten sowie zu einer autologen MLR (Stimulator- & Responderzellen vom selben Individuum) bestimmt. Um ein optimales Wachstum und Überleben der Lymphozyten zu gewährleisten, wird für die Kultivierung dem verwendeten Medium 2-Mercaptoethanol (ME) zugesetzt. 4.3.1 Einfluss von Mercaptoethanol unstimulierter MNC auf die Proliferationsrate Bei 2-Mercaptoethanol (ME) handelt es sich um ein Thioglycol mit zwei funktionellen Gruppen: einer Hydroxgruppe (-OH) und einer Mercaptogruppe (-SH). Es findet in der Forschung häufig Einsatz als Mediumzusatz für die Kultivierung von Lymphozyten, da es vitalitätserhaltend und wachstumsfördernd wirkt. Als zugrunde liegende Mechanismen werden dabei der Schutz vor oxidativen Noxen und eine verbesserte Aufnahme von Cystein aus dem Medium angegeben (PRUETT et al. 1989). Da ME alleine schon in der Lage ist, eine Proliferation der Lymphozyten zu induzieren, galt es zunächst, eine Konzentration für equine Zellen zu finden, welche zwar eine deutliche Proliferation der Blasten erlaubt, aber kein zu großes Hintergrundrauschen in Form MEinduzierter Proliferation der MNCs alleine verursacht. Zur Ermittlung der optimalen ME-Konzentration wurden MNC von zwei Isländerponies über Lymphozytenseparationsmedium® separiert (3.3.1.3) und jeweils in Duplikaten von 2 x 105 MNCs mit unterschiedlichen Konzentrationen ME in DMEM (3.2.5.2) für 3, 5, 7 und 9 Tage kultiviert. 101 Ergebnisse Absolute Zahl Blasten 200000 Tag 3 Tag 5 Tag 7 Tag 9 150000 100000 50000 0 0 1,5 5 15 50 ME µmol Abb. 27 Bestimmung der optimalen Mercaptoethanol-Konzentration für equine MNC Separierte MNC (3.3.1.3) von zwei Isländerponies wurden für 3,5,7 und 9 Tage zu jeweils 2 x 105 Zellen in 96-well-Rundbodenmikrotiterplatten (3.2.2) mit unterschiedlichen Konzentrationen an 2Mercaptoethanol (ME) in DMEM kultiviert (3.3.6). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen durchflusszytometrisch untersucht und über die Referenzzellmethode (3.3.4) die absolute Zahl blastisch transformierter Zellen bestimmt (3.3.5). Angegeben sind die MW der beiden Pferde samt Standardabweichung. Es zeigte sich, dass die MNC der Isländerponies schon bei einer Konzentration von 15µmol ME eine deutliche Proliferationsinduktion erfahren, die mit 50µmol nicht mehr wesentlich gesteigert werden konnte. Im Rahmen dieser Untersuchung zeigte sich zudem, dass die Lymphozyten zwischen Tag 5 und Tag 7 einen erheblichen Proliferationsschub mit MEKonzentrationen von 15 und 50 µmol erfahren, weshalb für die MLR Tag 5 und Tag 7 als geeignete Messzeitpunkte festgelegt wurden. Derselbe Versuch wurde ein weiteres Mal mit Blut von zwei Warmblutpferden wiederholt, deren DC später in der MLR untersucht werden sollten. Dabei zeigte sich, dass die Lymphozyten dieser beiden Warmblüter durch ME wesentlich weniger proliferierten als die Lymphozyten der Islandponies. Doch ließ sich auch hier ein deutlicher Proliferationsschub zwischen Tag 5 und Tag 7 bei den Konzentrationen 15 und 50µmol ME erkennen. 102 Ergebnisse Absolute Zahl Blasten 200000 Tag 3 Tag 5 Tag 7 Tag 9 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0 0 1.5 5 15 50 ME µmol Abb. 28 Bestimmung der Warmblütern optimalen Mercaptoethanol-Konzentration bei zwei MNC von zwei Warmblutpferden wurden separiert (3.3.1.3) und jeweils 2 x 105 Zellen in DMEM (3.2.5.2) für 3,5,7 und 9 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen ME kultiviert. An den Tagen 3,5,7 und 9 wurde anhand der Referenzzellmethode (3.3.4) die absolute Zahl Blasten bestimmt. Dargestellt sind die MW der beiden Pferde amt Standardabweichung. Um erkennen zu können, welche ME-Konzentration für eine Detektion einer Stimulation erforderlich ist, wurde eine gemischte Leukozytenreaktion (MLR) mit autologen und allogenen MNC durchgeführt. Dazu wurde denselben Tieren wie aus Abb. 27 und 28 Blut entnommen und die MNCFraktion separiert (3.3.1.3). Die MNC der Isländerponies wurden als Stimulatorzellen verwendet und vor dem Einsatz in der MLR mit je 30Gy bestrahlt (3.3.11) um eine Proliferation dieser Zellen zu unterbinden. Im Verhältnis 3:100 und 30:100 wurden dann die Stimulatorzellen (Isländer-MNC) mit den Responderzellen (Warmblüter-MNC) mit verschiedenen Konzentrationen 2ME in DMEM in Cokultur gebracht. An den Tagen 3,5,7 und 9 wurden die Zellen geerntet und anhand der Referenzzellmethode die absolute Zahl Blasten bestimmt. 103 Ergebnisse Absolute Zahl Blasten 200000 3:100 Tag 3 3:100 Tag 5 3:100 Tag 7 3:100 Tag 9 30:100 Tag 3 30:100 Tag 5 30:100 Tag 7 30:100 Tag 9 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0 5 15 50 ME µmol Abb. 29 Einfluss der ME-Konzentration auf die Proliferationsinduktion in der MLR Von 2 Isländerponies und 2 Warmblutpferden wurden MNC separiert (3.3.1.3). Die MNC der Isländerponies wurden als Stimulatorzellen verwendet und vor dem Einsatz in der MLR mit 30Gy bestrahlt (3.3.11). Die MNC der Warmblutpferde dienten als Responderzellen. Im Verhältnis 3:100 und 30:100 wurden die Stimulatorzellen mit den Responderzellen in DMEM (3.2.5.2) mit unterschiedlichen ME-Konzentrationen in Cokultur gebracht. Nach 3,5,7 und 9 Tagen wurden die Zellen geerntet und mit der Referenzzellmethode (3.3.4) die Anzahl der Blasten (3.3.5) bestimmt. Dargestellt sind die MW ± SD der Blasten der Responderzellen. Die Werte der unstimulierten Ansätze (nur Responderzellen) sind Abb. 28 zu entnehmen. Vergleicht man Abb. 28 und Abb. 29 zeigt sich, dass bei einer ME-Konzentration von 15µmol vor allem bei dem Stimulator-Responder-Verhältnis (S/R-Ratio) 30:100 ein deutlicher Anstieg der Blastogenese detektierbar ist. Das geringere Verhältnis von 3:100 führte dagegen bei 50µmol ME zu einem besser sichtbaren Anstieg der Proliferationsrate. Für die MLR sollte aufgrund dieser Ergebnisse eine Konzentration von 20µmol ME eingesetzt werden, da die spontane Proliferationsrate der höchsten Konzentration (50 µmol) zu hoch liegt und bei 15µmol noch kein sehr deutlicher Unterschied zwischen unstimulierten und stimulierten MNC in der S/R-Ratio 3:100 zu sehen ist. 4.3.2 Gemischte Leukozytenreaktion mit ungepulsten DC Um zu überprüfen, ob die generierten MoDC in der Lage sind Antigene effektiv aufzunehmen und zu präsentieren, wurden DC von sieben Pferden generiert und in einer gemischten Leukozytenreaktion (MLR) auf ihre Funktionalität untersucht. Die dendritischen Zellen 104 Ergebnisse wurden als Stimulatorzellen mit autologen und allogenen MNCs in Cokultur gebracht (autologe und allogene MLR). Nach 5 und 7 Tagen Coinkubation wurden die Zellen geerntet und die absolute Zahl der Blasten bestimmt. Als Kontrolle dienten Ansätze, in denen sich die Responderzellen nur in Medium befanden, sowie frisch isolierte Monozyten. Um einen Einfluss der S/R-Ratio (Verhältnis von Stimulator- zu Responderzellen) ermitteln zu können, wurden die Verhältnisse 3:100 und 30:100 untersucht. Alle Kulturansätze wurden in Triplikaten angelegt. Um einen besseren Vergleich zwischen den einzelnen Stimulatorzellen pro Responderpopulation zu ermöglichen, wurde der Stimulationsindex (SI) für den jeweiligen Ansatz bestimmt. Er wurde für jedes Pferd einzeln aus dem Quotienten der absoluten Zahl an Blasten in den stimulierten Ansätzen durch die absolute Zahl an Blasten aus der Mediumkontrolle gebildet. Die Mediumkontrolle erhält auf diese Weise immer den Wert 1. allo. Mo. 30:100 allo. Mo. 3:100 auto. Mo. 30:100 auto. Mo. 3:100 allo. DC 30:100 allo. DC 3:100 aut.DC 30:100 auto. DC 3:100 Kontrolle 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Stimulationsindex Abb. 30 Gemischte Leukozytenreaktion (MLR) mit generierten DC im Vergleich zu Monozyten (Mo) Equine MNC von 7 Pferden wurden frisch separiert (3.3.1.3) und mit aus Monozyten (3.3.1.6) generierten DC (3.3.6.2) als Stimulatorzellen in zwei S/R-Ratios (3:100 und 30:100) in DMEM (3.2.5.2) cokultiviert. Es erfolgten jeweils allogene und autologe Stimulationsansätze (3.3.12). An Tag 7 wurden die Zellen geerntet und die absolute Zahl Blasten mit der Referenzzellmethode (3.3.4) bestimmt. Dargestellt ist der Stimulationsindex (SI), welcher sich aus der absoluten Anzahl Blasten des stimulierten Ansatzes geteilt durch die absolute Anzahl Blasten aus der Mediumkontrolle berechnet. Nach Test auf Normalverteilung wurde der Tukey's Multiple Comparison Test angewendet. Innerhalb der Gruppe, die mit der Mediumkontrolle verglichen wurde, zeigte sich nur bei allogenen DC in der S/R-Ratio 30:100 ein signifikanter Unterschied (p<0,5). 105 Ergebnisse Nach Test auf Normalverteilung erfolgte die statistische Auswertung mit dem Tukey's Multiple Comparison Test, der alle Gruppen untereinander vergleicht. Dabei zeigte sich innerhalb der Gruppen, die mit der Mediumkontrolle verglichen wurden nur bei den allogenen Stimulatorzellen (DC) in der S/R-Ratio 30:100 ein signifikanter Unterschied zur Mediumkontrolle. Ein Unterschied im Vergleich zu frisch isolierten allogenen Monozyten bestand allerdings nicht. Autologe Monozyten führten zu einem negativen Stimulationsindex (autologe Proliferationshemmung). Bei zwei Tieren war zudem eine Hemmung der Proliferation durch autologe DC zu beobachten, die in Abhängigkeit des Verhältnisses von Stimulatorzellen zu Responderzellen stand. Exemplarisch ist dies für ein Pferd graphisch mit Angabe der absoluten Zahl an Blasten dargestellt. Gezeigt werden Daten aus zwei unabhängigen Versuchen mit demselben Tier. Je mehr autologe DC ohne Antigenkontakt mit den Lymphozyten kultiviert wurden, desto geringer fiel die Proliferation aus (vgl. Abb. 31, Pfeil). Limara 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 allo. Mo. 30:100 allo. Mo. 3:100 auto. Mo 30:100 auto. Mo 3:100 allo. DC 30:100 allo. DC 3:100 auto. DC 30:100 auto. DC 3:100 Kontrolle Absolute Zahl Blasten Abb. 31 Absolute Anzahl Blasten nach Stimulation mit verschiedenen Stimulatorzellen Equine MNC eines Pferdes wurden separiert (3.3.1.3) und mit generierten, autologen und allogenen DC (3.3.6.2) und frischen Monozyten (3.3.1.6) in den S/R-Ratios 3:100 und 30:100 in DMEM (3.2.5.2) für 7 Tage cokultiviert (3.3.12). Die DC und Monozyten (Stimulatorzellen) wurden vor der Cokultur mit 30Gy bestrahlt (3.3.11). Dargestellt sind die Mittelwerte eines Pferdes aus zwei unabhängigen Versuchen (jeweils Triplikate) mit Standardabweichung. Deutlich zu erkennen ist die Reduktion der Blastogenese in der höheren S/R-Ratio bei den autologen DCs (Pfeil). 106 Ergebnisse Bei diesem Tier zeigte sich deutlich, dass allogene, ungepulste DC in unterschiedlichen Konzentrationen, autologe DC jedoch nur in der niedrigen Konzentration (3:100) in der Lage sind, MNC effektiv zu stimulieren. Autologe DC in hoher Konzentration (30:100) führten dagegen wiederholt zu einer Proliferationshemmung. 4.3.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit gepulsten DC Da sich mit ungepulsten DC hauptsächlich im allogenen System eine signifikante Steigerung des Stimulationsindex erzielen ließ, sollte in einem weiteren Versuch überprüft werden, ob durch Zugabe eines Antigens (pulsing) 24h vor der Ernte der DC eine proliferationsfördernde Wirkung auch im autologen System erzielt werden kann. Als Antigenquelle wurde Tumorzelllysat aus equinen Sarkoiden oder bovines SerumAlbumin gewählt. Für diesen Versuch wurde von zwei an equinen Sarkoiden erkrankten Pferden (Warmblüter) Tumormaterial entnommen und daraus steriles Zelllysat gewonnen (3.3.9). Anschließend wurden von denselben Tieren MoDC generiert (3.3.6.2) und nach 6 Tagen Kultur das jeweilige Antigen (Proteinkonzentration 100µg/ml, 3.3.10) zu den DC gegeben. An Tag 7 wurden die DC geerntet und mit frisch isolierten Lymphozyten derselben Tiere in die MLR eingebracht (3.3.12). Die Ansätze erfolgten jeweils in Triplikaten. Um Einflüsse auf die Lymphozyten ermitteln zu können, die von Rückständen der verwendeten Antigene ausgehen, wurden als zusätzliche Kontrollen Lymphozyten mit dem jeweiligen Antigen zusammen inkubiert. 107 Ergebnisse A B aut.Mo allo.Mo aut. DZ + BSA allo.DZ + BSA aut.DZ + allo.Tumor allo. DZ +aut.Tumor aut.DZ + aut.Tumor allo.DZ + allo. Tumor aut. DZ allo.DZ Medium + BSA Medium + BSA Medium + aut.Tumor Medium + allo.Tumor Medium Medium 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.0 0.5 Limara autologer SI C 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 3.0 3.5 D aut.Mo allo.Mo aut. DZ + BSA allo.DZ + BSA aut.DZ + allo.Tumor allo. DZ +aut.Tumor aut.DZ + aut.Tumor allo.DZ + allo. Tumor aut.DZ allo.DZ Medium + BSA Medium + BSA Medium + aut.Tumor Medium + allo.Tumor Medium 0.0 1.0 Limara allogener SI Medium 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Fores autologer SI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Fores allogener SI Abb. 32 Einfluss des Antigen-Pulsing auf die stimulatorische Kapazität autologer und allogener DC Von zwei an Sarkoiden erkrankten Pferden wurden MNC separiert (3.3.1.3) und mit generierten autologen (A und B) und allogenen (C und D) DC (3.3.6.2) in DMEM (3.2.5.2) in Cokultur (MLR) (3.3.12) gebracht. Ein Teil der DC erhielt 24 h vor dem Einsatz in der MLR einen Antigen-Pulse in Form von autologem oder allogenem Tumorzelllysat (100µg/ml) (3.3.9) bzw. BSA (100µg/ml) (3.2.3). Zur Kontrolle dienten jeweils frisch separierte Monozyten (3.3.1.6) sowie MNC in Medium und mit Zusatz des jeweiligen Antigens in gleicher Endkonzentration. Dargestellt ist der Stimulationsindex für jedes Pferd, der sich aus der absoluten Zahl Blasten des jeweiligen Ansatzes geteilt durch die absolute Zahl der Blasten der Mediumkontrolle berechnet. Es zeigte sich, dass die generierten autologen DC in der Lage sind, Antigen aufzunehmen und effektiv zu präsentieren. Autologes Tumormaterial erwies sich dabei allerdings als nicht so effektiv, wie es bei allogenem Tumorzelllysat bzw. BSA der Fall war. Diese Befunde rechtfertigen eingehendere Untersuchungen zur autologen und allogenen Beladung (Pulsing) von dendritischen Zellen für zukünftige Therapiekonzepte. 108 Ergebnisse Die allogenen DC, welche bei diesen beiden Pferden ohne Antigen-Pulse keine Proliferation der MNC induzierten, führten jedoch nach Antigenzusatz ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg des Stimulationsindex. Vor allem bei dem Pferd „Fores“ konnte durch einen Pulse der allogenen DC mit autologem Tumormaterial eine sehr deutliche Steigerung des SI beobachtet werden. 109 Diskussion 5 Diskussion Dendritische Zellen (DC) spielen eine zentrale Rolle in der Initiierung einer antigenspezifischen Immunantwort und finden zunehmend Bedeutung im therapeutischen Einsatz zur Bekämpfung von Tumoren. Erster Schritt zur therapeutischen Anwendung von DC ist ihre Gewinnung in ausreichender Menge und Reinheit. Aus Monozyten des peripheren Blutes können unter geeigneten Bedingungen in vitro DC entwickelt werden (MoDC). Für die Separation und Aufreinigung von Monozyten aus dem Blut stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, die zum Teil auch auf das Pferd übertragen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit galt es zunächst die verschiedenen Techniken dieser Separationen auf ihre Ausbeute, Reinheit, Vorselektion und Aktivierung der Blutmonozyten zu prüfen. In weiteren Untersuchungen sollten die generierten dendritischen Zellen phänotypisch charakterisiert und ihre Funktionalität hinsichtlich ihrer Antigenpräsentation geprüft werden. 5.1 Vergleich unterschiedlicher Aufreinigungsmethoden equiner Monozyten 5.1.1 Adhärenz equiner Monozyten als Aufreinigungsmethode Eine häufig verwendete Methode der Monozytenaufreinigung ist die selektive Anreicherung monozytoider Zellen über Plastikadhärenz. HAMMOND et al. (1999) wendeten sie an, um equine Monozyten aus Vollblut zu gewinnen. Als Ausbeute werden 2 x 106 bis 8 x 106 Zellen pro 100 ml Blut angegeben (2-8%). Zur Reinheit der Zellen sind keine Daten gezeigt. Prozentuale Angaben zur Zellausbeute beziehen sich im Folgenden jeweils auf die absolute Zahl Monozyten, die gewonnen werden kann, wenn mononukleäre Zellen (MNC) über Lymphozytenseparationsmedium® separiert werden. Innerhalb dieser Dissertation wurden mit dieser Methode aus 10 ml Vollblut ca. 10 x 106 MNC mit einem relativen Anteil von 10% (also 1 x 106) monozytoider Zellen gewonnen. Eine 100%ige Ausbeute an Monozyten entspräche demnach einer Monozytenzahl von 1 x 106 aus 10 ml Vollblut. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass nur die Hälfte der eingesetzten Monozyten nach 2h Inkubationsdauer an der Plastikzelkulturflasche adhärent war. Die andere Hälfte der monozytoiden Zellen wurde durch den ersten Separationsschritt mit den fluiden (nicht-adhärenten) Zellen zusammen entfernt. Den größten Anteil der adhärenten Zellen machte dennoch die lymphoide Fraktion aus. Mit steigender Serumkonzentration konnte zwar die Adhärenz der kontaminierenden Lymphozyten selektiv reduziert werden, die beste erzielte Monozytenreinheit lag jedoch bei nur 30% der MNC (4.1.1.1). Diese Ergebnisse zeigen, dass 110 Diskussion equine Lymphozyten ebenso wie Monozyten in den ersten Stunden der Inkubation stark an Plastikzellkulturflaschen adhärieren, die Adhäsion dieser Zellen jedoch von der zugesetzten Menge Serum abhängt. Über mehrere Adhäsionspassagen konnte MAUEL (2002) zwar die Reinheit equiner Monozyten erhöhen, gab als Ausbeute jedoch lediglich 1 – 5 x 106 Zellen aus 500 ml Vollblut an. Unter den oben genannten Bedingungen würde dies einer Ausbeute von 2-10 % der Monozyten und somit einer erheblichen Selektion entsprechen. Dies deckt sich mit den in dieser Arbeit erhobenen Befunden zu den Zellverlusten durch Adhärenzaufreinigung. Für die Anreicherung equiner Monozyten ist demnach eine Separation über das Adhärenzverhalten nicht ausreichend effektiv, sodass nach alternativen Methoden gesucht werden musste. 5.1.2 Affinitätschromatographische Separation equiner Monozyten Nachdem ROHWER (2004) zeigen konnte, dass ca. 10% equiner Monozyten in der Membranimmunfluoreszenz IgE positiv sind, sollte untersucht werden, ob sich mit Hilfe eines anti-equinen-IgE mAk Monozyten im MACS anreichern lassen. Mit 65- 70% monozytoidem Anteil der MNC erwies sich diese positive Selektion als eine äußerst effektive Form der Anreicherung von Monozyten. Mit nur 1,6 % Ausbeute an Monozyten lag sie jedoch weit unter der erhofften Monozytenanzahl. Zudem findet bei dieser Methode eine Selektion von Monozyten-Subtypen statt, deren Funktion und Eigenschaften noch weitgehend unbekannt sind. In der humanmedizinischen Forschung konnte gezeigt werden, dass Fcε-Rezeptor-I tragende dendritische Zellen in engem Zusammenhang mit Atopien und IgE Serumspiegeln stehen (ALLAM et al. 2003; FOSTER et al. 2003; HOLLOWAY et al. 2001; KATOH et al. 2000). Welche Rolle dieser Subtyp beim Pferd spielt, ist noch nicht bekannt und Gegenstand der aktuellen Forschung. Der LPS-Rezeptor CD 14 wird von murinen und humanen Monozyten stark exprimiert, weshalb er häufig für die affinitätschromatographische Aufreinigung dieser Zellpopulation verwendet wird. Ein spezifischer anti-CD 14-Antikörper stand für das Pferd leider nicht zur Verfügung. Kreuzreaktivitäten mit anti-human-CD 14 mAk sind für den Klon „big 10“ jedoch beschrieben (STEINBACH et al. 2005). Für die beiden in dieser Arbeit verwendeten antihumanen-CD-14-mAk (3.2.4.1.1) konnten im direkten Vergleich humaner MNC mit equinen MNC keine Kreuzreaktivitäten festgestellt werden. Wie man in Abb. 9 erkennen kann, ist bei humanen Monozyten ein deutlich von der Konjugatkontrolle abgesetzter Peak zu erkennen, während die equinen monozytoiden Zellen lediglich im Bereich der Konjugatkontrolle liegen. Eine positive MACS Separation ist demnach mit den hier verwendeten Antikörpern nicht möglich. Auf die Überprüfung weiter Antikörper für den Einsatz zur positiven Selektion im 111 Diskussion MACS wurde verzichtet, da generell eine Bindung von Antikörpern zu einer nicht gewollten Selektion von Monozytensubpopulationen führt. Daneben konnten ELKORD et al. (2005) zeigen, dass DCs, welche aus über CD14 im MACS angereicherten Monozyten generiert wurden, eine erheblich geringere Menge der Zytokine IL12, TNFα und IL10 sezernieren und so als antigenpräsentierende Zelle weniger, wenn überhaupt geeignet sind. Aus diesen Gründen wurde auf eine positive Anreicherung equiner Monozyten mittels magnetic-cellsorting (MACS) basierend auf ihrer Bindung von anti-CD14-AK verzichtet. Eine Depletion von CD4+ und CD8+ Lymphozyten aus einer equinen MNC-Präparation, die auch Monozyten enthält, erwies sich zwar als eine Möglichkeit der relativen Anreicherung von Monozyten, jedoch ohne hinreichende Reinheit der Monozyten. Bei murinen DC konnten verschiedene DC-Subtypen als CD8 und CD4 positiv bzw. negativ identifiziert werden (SCHNORRER et al. 2006). Ob es im equinen System ähnliche Subtypen gibt, ist nicht bekannt. Unter den CD4 und CD8 positiven Zellen waren im Rahmen dieser Untersuchungen einige zu finden, die im morphologischen Bereich der Monozyten lagen (4.1.1.2.3). Demnach findet schon in diesem Schritt der Aufreinigung eine ungewollte Selektion von Monozyten statt. Eventuell würde ein Cocktail aus anti-CD3 und anti-CD21 mAk zu einer erfolgreichen Selektion führen. Für equine Zellen stehen diese Ak allerdings noch nicht zur Verfügung. 5.1.3 Dichtegradientenzentrifugation Alle bisher beschriebenen Methoden wurden bei mononukleären Zellen (MNC) angewendet, welche zuvor über einen Dichtegradienten von den polymorphkernigen Zellen (PMN) getrennt wurden. Eine elegantere Methode wäre, die Monozyten schon in diesem ersten Schritt von den Lymphozyten zu trennen, was sich aufgrund der sehr ähnlichen Dichte beider Zellpopulationen als schwierig gestaltet. DE ALMEIDA et al. (2000) konnten aber über einen leicht hypertonen, 50%igen Percollgradienten humane Monozyten in beeindruckender Reinheit und Ausbeute gewinnen. Der zugrunde liegende Mechanismus soll dabei sein, dass Lymphozyten empfindlicher auf hypertonen Stress reagieren als Monozyten und aufgrund der osmotischen Verhältnisse Wasser aus den Zellen austritt. Dies würde die Dichte der Lymphozyten geringgradig erhöhen und so den Dichteunterschied zwischen Lymphozyten und Monozyten steigern. Eine Auftrennung könnte so ermöglicht werden. Die Methode erwies sich als auf das Pferd übertragbar und lieferte Monozytenreinheiten zwischen 50 und 90% mit einer Ausbeute von 1,4 x 106 Monozyten aus 20ml Vollblut, was 70% der Ausgangspopulation entspricht (unter der Annahme, dass über Lymphozytenseparationsmedium aus 20 ml Vollblut 20 x 106 MNC gewonnen werden 112 Diskussion können mit einem Monozytenanteil von ca. 10% und somit 2 x 106 Monozyten aus 20 ml Vollblut einer 100%igen Ausbeute entsprechen würde). Wurde die Dichte des Gradienten geringgradig erhöht oder erniedrigt, zeigten sich jedoch in der erzielten Reinheit keine wesentlichen Unterschiede (4.1.1.3). Eine Reduktion der Dichte führte lediglich zu einer geringeren Ausbeute. Eine Erhöhung der Osmolalität des Gradienten führte bei dem 1,0638 g/ml dichten Gradienten zu einer Erhöhung der Ausbeute an MNC ohne auf die Reinheit der Monozyten einen Einfluss auszuüben. Weshalb die höhere Osmolalität bei gleicher Reinheit zu mehr Monozytenausbeute führt ist jedoch nicht mit dem oben beschriebenen Mechanismus zu erklären. Man würde erwarten bei gleicher Dichte und geringerer Hypertonie mehr MNC zu gewinnen, die allerdings dann einen geringeren Monozytenanteil aufweisen. Diese Beobachtung zeigte, dass neben dem Gradienten noch andere Einflüsse auf den Separationserfolg einwirken, die es näher zu bestimmen galt. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, dass neben dem verwendeten Antikoagulanz, der Verarbeitungszeitpunkt des Blutes nach Blutentnahme einen erheblichen Einfluss auf die Reinheit der Monozyten ausübte. Welche Faktoren für die z.T. erheblichen intraindividuellen Schwankungen im Separationserfolg verantwortlich waren, konnte nicht abschließend geklärt werden. Mögliche Ursachen könnten jedoch in unterschiedlichen Gerinnungsstadien des Tieres oder der jahreszeitlich bedingten unterschiedlichen Temperatur bei der Verarbeitung bzw. Gewinnung des Blutes liegen. Nach DE ALMEIDA et al. (2000) sollte die Verarbeitung des Blutes möglichst bei Temperaturen von 25 – 35°C erfolgen, da Kälte eine Aggregation der Thrombozyten an die Monozyten fördert und den Separationserfolg negativ beeinflusst. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Anreicherung equiner Monozyten über einen 50%igen, leicht hypertonen (340 ± 10 mOsm/kg) Percollgradienten die besten Ergebnisse erbrachte, was hohe Reinheit und Ausbeute bei nicht erkennbarer Vorselektion der Monozyten betraf. 5.2 Untersuchung der biologischen Funktionalität des req.IL4 Eine approbate Methode, Monozyten des peripheren Blutes zu dendritischen Zellen in vitro zu differenzieren, liegt in der Supplementierung des Mediums mit GM-CSF und Interleukin 4. Humanes rekombinantes GM-CSF wurde bereits beim Pferd als funktionell beschrieben (HAMMOND et al. 1999), was sich im Rahmen dieser Arbeit bestätigte. Interleukin 4 hingegen gilt als sehr speziesspezifisch und lag für diese Arbeit als Zytokin-IgG-Konstrukt vor, dessen biologische Aktivität es zunächst zu prüfen galt. 113 Diskussion 5.2.1 Proliferationsassay mit equinen MNC Eine Möglichkeit die biologische Aktivität des req.IL4 zu prüfen ist ein Proliferationsassay, da vorstimulierte equine Lymphozyten (T- und B- Lymphozyten) durch req.IL4 zur weiteren Proliferation angeregt werden (DOHMANN et al. 2000). Zur Messung der Proliferation wurde die morphologische Blastenbildung im Durchflusszytometer mittels der Referenzzellmethode quantifiziert. Sie basiert auf der Messung einer bekannten Zahl Partikel zusammen mit der Probe und der anschließend rechnerischen Bestimmung der absoluten Zellzahl innerhalb des Testansatzes. Im Durchflusszytometer lassen sich zudem morphologische Charakteristika erfassen, die zur Auswertung bestimmter Populationen herangezogen werden können. Die blastische Transformation, die Lymphozyten vor der Teilung erfahren, konnte so durchflusszytometrisch erfasst und Blasten von den nicht transformierten Lymphozyten unterschieden werden. Bei der anschließenden Analyse mit setzen geeigneter Fenster, wurde so die absolute Zahl blastisch transformierter Zellen bestimmt. Bei dieser Methode des Proliferationsassays kann auf eine radioaktive Markierung der Zellen (3H-Thymidin-Einbau) verzichtet werden (PECHOLD et al. 1994). Das mir zur Verfügung stehende req.IL4 lag in Form von Zellkulturüberstand mit unbekannter Konzentration vor. Zur Ermittlung der optimalen Dosis wurden daher Verdünnungsreihen des Zellkulturüberstandes angefertigt und auf ihre Proliferationsinduktion auf equine Lymphozyten untersucht. Die höchste erzielte Proliferationsrate lag bei einer finalen Verdünnung von 1:4 (4.2.1). Die niedrigere Verdünnung von 1:2 dagegen lag deutlich unter dem Niveau, was vermutlich durch eine verminderte Vitalität der Zellen aufgrund zu stark verbrauchten Mediums zurückzuführen ist (die Hälfte des Mediums war bei dieser Verdünnung der IL4-Zellkulturüberstand). Um zu überprüfen, ob das IgG-Fragment des req.IL4-Konstrukts einen Einfluss auf die Proliferation ausübt, der IL4 unabhängig ist, wurde zur zusätzlichen Kontrolle ein INFγ-IgG-Konstrukt mit demselben eqIgG-Isotyp (Zellkulturüberstand, 1:4 endverdünnt) mitgeführt. Dadurch konnte ein Einfluss der IgGKomponente ausgeschlossen und die biologische Aktivität des req.IL4 nachgewiesen werden. 5.2.2 Einfluss des req.IL4 auf die Differenzierung zu MoDC Nachdem für das verwendete req.IL4 eine proliferationsfördernde Wirkung gezeigt und eine optimale Dosis gefunden wurde, galt es den Einfluss auf die Differenzierung monozytoider Zellen des Pferdes zu prüfen. Zunächst wurden MNC mit huGM-CSF alleine und in Kombination mit req.IL4 kultiviert. Die monozytoide Fraktion der eingesetzten MNC machte ca 10% aus. Nach der Inkubationszeit durchgeführte Membranimmunfluoreszenzen sollten 114 Diskussion Aufschluss über eventuell generierte DC geben. Eine Detektion dendritischer Zellen über CD83 oder CD86 war jedoch innerhalb dieser Zellpopulation nicht möglich (4.2.1.2). Dafür wurde zunächst eine fehlende Kreuzreaktivität der verwendeten anti-humanen-mAk als ursächlich angenommen. Bei auflichtmikroskopischen Untersuchungen der Kulturen zeigten sich jedoch nur in den Kulturansätzen mit req.IL4 Zellen, welche morphologische Charakteristika dendritischer Zellen hatten (4.2.1.2), was für einen Einfluss des req.IL4 sprach. Wurden jedoch MNC Präparationen mit > 50% (statt 10 %) Monozytenanteil mit huGM-CSF und req.IL4 inkubiert, ließen sich die zu DC differenzierten Zellen nicht nur morphologisch, sondern auch anhand ihrer deutlichen Expression von CD86 und CD83 phänotypisch nachweisen. Damit war einerseits die Brauchbarkeit der hier verwendeten antiCD83 und anti-CD86 AK belegt, andererseits zeigte sich, wie wichtig eine hohe Aufreinigung der Blutmonozyten für die effiziente Entwicklung equiner MoDC in vitro war. Die mit req.IL4 höhere MHC II Expression im Vergleich zu den Ansätzen ohne req.IL4 (4.2.1.2) war zwar statistisch nicht signifikant, würde sich aber mit Angaben in der Literatur decken. So konnte bei Rind und Maus gezeigt werden, dass durch IL4 die Expression von MHC II auf BLymphozyten gesteigert wird (ESTES et al. 1995; ROEHM et al. 1984). 5.3 Beurteilung der in vitro generierten dendritischen Zellen 5.3.1 Charakterisierung equiner DC Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aufreinigungsmethoden für equine Monozyten und die daraus generierten dendritischen Zellen untersucht. Zur Charakterisierung dendritischer Zellen finden neben Anti-MHC-II-mAk, mAk gegen CD86 und gegen CD83 Verwendung. Bei CD86 (früher B7-2 genannt) handelt es sich um ein sogenanntes costimulatorisches Molekül, welches mit CD 28 bzw. mit CTLA-4 (CD152) auf aktivierten T-Zellen interagiert und T-Lymphozyten nach Erkennung ihres MHC-Peptid-Komplexes stimuliert. Es wird von interdigitierenden DCs im Lymphknoten, von Blut-DCs und Langerhanszellen exprimiert. Aber auch Gedächtnis-B-Zellen und Monozyten exprimieren dieses Molekül in geringen Mengen (BOUSSIOTIS et al. 1993; FREEMAN et al. 1993; PRABHU DAS et al. 1995). Das Molekül CD83 gilt dagegen als Reifungsmarker für dendritische Zellen, da es bei in vitro generierten DC nur nach einem finalen Stimulus induziert wird (LECHMANN et al. 2002; WOLENSKI et al. 2003b). In vivo wird es bei zirkulierenden DC, nicht-follikulären DCs, Langerhanszellen und interdigitierenden DC im Lymphknoten gefunden, aber auch aktivierte 115 Diskussion T- und B-Zellen können dieses Molekül aufweisen (BRELOER et al. 2007; WOLENSKI et al. 2003a). Über die Funktion dieses Moleküls ist allerdings noch wenig bekannt. Da für das Pferd keine spezifischen anti-CD86 und anti-CD83 mAk zur Verfügung standen, wurden Antikörper aus dem humanen System verwendet. Wurden equine Monozyten vor der Kultivierung ausreichend angereichert, war eine Detektion der Oberflächenmarker CD83 und CD86 auf den daraus generierten DC möglich (4.2.2.1). In durchgeführten Kontrollen zeigte sich, dass beim Pferd nur die Zellen in der Membranimmunfluoreszenz positiv waren, die auch im morphologischen Bereich der DC lagen. Frisch separierte Monozyten, ebenso wie die lymphoide Fraktion der MNCs waren für beide Antikörper negativ. Somit konnten die gewählten mAk als geeignet zur Charakterisierung equiner dendritischer Zellen bezeichnet werden. MHC-II dagegen wird nicht selektiv auf DCs hochreguliert. In durchflusszytometrischen Untersuchungen erwiesen sich zwischen 60 und 95% der equinen MNC (Monozyten und Lymphozyten) als stark positiv für MHC-II in der Membranimmunfluoreszenz, was sich mit Beobachtungen von LUNN et al. (1993) deckt, dass beim Pferd neben allen B-Lymphozyten auch zahlreiche T-Lymphozyten MHC II exprimieren. Wurden equine IgE positive Monozyten mit req.IL4 und huGM-CSF in Kultur gebracht, zeigte sich bereits nach 3 Tagen im Auflichtmikroskop ein stark aktiviertes Zellbild. Es waren Zellausläufer und Zellagglumerate sichtbar. Um keine zu hohen Verluste (z.B. durch Apoptose) der Zellen in Kauf nehmen zu müssen, wurden die Zellen schon nach 3 Tagen geerntet und auf CD83 und CD86 untersucht. Im Gegensatz zu Angaben aus der Literatur, nach denen equine MoDC zur Differenzierung mindestens 7 Tage benötigen (MAUEL et al. 2006), exprimierten ca. 50% bzw. ca. 60% dieser Zellen an ihrer Oberfläche CD83 bzw. CD86 unter dem Einfluss von req.IL4. Zudem zeigten 30% der Zellen in den Kulturen ohne req.IL4 ebenfalls eine Expression von CD83 und CD86. Die positiven Zellen lagen morphologisch ausschließlich in der für DCs charakteristischen FSC–SSC-Region im Durchflusszytometer. Um welche DC- Subtypen es sich bei diesen Zellen handelt, ist nicht bekannt. Die Vermutung liegt jedoch nahe, dass die angereicherten Monozyten den FcεRezeptor-I exprimieren und in vivo mit IgE beladen wurden, da dies für humane Monozytenpopulationen bereits gezeigt werden konnte (HED et al. 1989; KATOH et al. 2000; NOVAK et al. 2001). Somit hat durch die Anreicherung der Monozyten über antiequines-IgE eine Selektion und Aktivierung equiner Subpopulationen stattgefunden, deren Funktionen noch nicht bekannt sind. NOVAK et al. (2001) zeigte, dass humane IgE – vernetzte Monozyten in vitro nicht mehr in der Lage waren in DC zu differenzieren. Dies konnte – zumindest morphologisch und phänotypisch - für das Pferd nicht bestätigt werden. Morphologie und Oberflächenmarker sprachen dafür, dass es sich bei den in dieser Arbeit 116 Diskussion generierten Zellen durchaus um DCs handelte. Welche Funktionen diese Zellen ausführen und welche Rolle sie in vivo einnehmen, ist allerdings noch Gegenstand der aktuellen Forschung. Es wird jedoch vermutet, dass diese Zellen eine zentrale Rolle bei allergischen Reaktionen spielen (NOVAK et al. 2004; SHIBAKI 1998; VILELLA 2006). Da das Ziel dieser Arbeit darin bestand, eine möglichst große Menge dendritischer Zellen zur therapeutischen Anwendung von Sarkoiden zu generieren, wurde auf IgE angereicherte Monozyten als Ausgangspopulation verzichtet. Eine gemischte Leukozytenreaktion (MLR) mit diesen Zellen sollte Einblicke in die Regulation der Lymphozytenstimulation geben; besonders vor dem Hintergrund, dass DC abhängig von der Antigenaufnahme entweder stimulatorische oder toleranzinduzierende Funktionen innehaben können (BAJTAY et al. 2006; MAHNKE et al. 2003). Dass über IgE angereicherte Monozyten durch ihre Aufreinigung bereits eine Voraktivierung erfahren hatten, zeigte sich sehr deutlich im Vergleich zu den über hypertonen Percollgradienten angereicherten Monozyten. Diese Monozyten benötigten eine Kultivierungszeit von 7 Tagen, um ein vergleichbares Niveau der CD83 und CD86 Expression zu erreichen wie die „IgE+ Zellen“ es bereits nach 3 Tagen Kultivierung taten. Mögliche Erklärung hierfür könnte neben einer Aktivierung der Zellen über den FcεRezeptor-I, auch die Vorselektion eines DC-Subtypes sein, dessen Differenzierung weniger Zeit beansprucht. 5.3.2 Reifeinduktion equiner DC Für CD83 ist mehrfach beschrieben worden, dass es auf humanen MoDC erst nach einer finalen Stimulation exprimiert wird, die z.B. durch Zusatz von LPS, TNFα und Cocktails verschiedener Zytokine erreicht werden kann. CD 83-Expression gilt dabei als charakteristisches Merkmal einer maturen (reifen) dendritischen Zelle mit antigenpräsentierenden Eigenschaften. THURNHER et al. (1997) konnte jedoch neben dem Einfluss eines finalen Stimulus auch den Einfluss der eingesetzten Zelldichte auf die Expression von CD83 nachweisen. Je geringer die Zelldichte war, desto höher fiel die Expression der Marker CD83 und CD86 aus. Die Zellen, die im Rahmen dieser Arbeit generiert wurden, exprimierten unabhängig von einem finalen Stimulus bereits CD83. Durch Zusatz von LPS 24h vor der Ernte konnte die Expression nicht gesteigert werden. Dies deckte sich mit den von MAUEL et al. (2006) gemachten Beobachtungen, dass LPS keinen Einfluss auf die Reifung equiner DC ausübte. Da von REDDY et al. (1997) beschrieben wurde, dass eine Reifung humaner DC schon durch 117 Diskussion monozytenkonditioniertes Medium erreicht werden kann, ist jedoch nicht auszuschließen, dass die hier generierten DC durch die zuvor durch die Monozyten freigesetzten Faktoren zur Reifung angeregt wurden. NERSTING et al. (2003) wiesen dennoch auf die Notwendigkeit des LPS-Zusatzes zur Reifungsinduktion hin, wenn auch wesentlich geringere Dosen erforderlich waren. Eventuell liegt hier jedoch ein Einfluss der Zelldichte vor (s.o.). Für equine MoDC scheint alleine eine Kultivierung der Zellen über 3 bzw. 7 Tage schon zu einer Expression des Reifungsmarkers zu führen. Ob diese Reifung jedoch auch mit einem Verlust der Antigenaufnahme und dem Erlangen stimulatorischer Kapazität der Zellen einhergeht, galt es in einer gemischten Leukozytenreaktion zu prüfen. 5.4 Funktionalität der generierten MoDC Dendritische Zellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, naive Lymphozyten in vitro stimulieren und zur Proliferation anregen zu können. Eine Möglichkeit, diese Funktionalität der generierten Zellen zu testen, besteht in der gemischten Leukozytenreaktion (MLR). Es handelt sich dabei um eine Methode, die ursprünglich zur in-vitro Simulation von Gewebetransplantatabstoßung entwickelt wurde und auf der MHC-Erkennung auf antigenpräsentierenden Zellen (APC) durch T-Lymphozyten beruht. Für die Proliferation sind dabei hauptsächlich CD4+ Zellen bei Interaktionen mit MHC-II-differenten APC verantwortlich (JANEWAY et al. 2005). Die Bindung der T-Zellen an die fremden MHCMoleküle kann dabei aus zwei Gründen erfolgen. Entweder das präsentierte Antigen wird von dem T-Zellrezeptor (TCR) erkannt und reicht für eine Erkennung aus (peptiddominierte Bindung) oder es werden charakteristische Bereiche des fremden MHC-Komplexes erkannt (MHC-dominierte Bindung) (JANEYWAYet al. 2005). In beiden Fällen kommt es zu einem ersten, stimulatorischen Signal durch die MHC-TCR-Interaktion, dem ein zweites, costimulatorisches Signal durch die Moleküle CD80/86 nach Interaktion mit CD28 auf der TZelle folgt. Dadurch wird ein Signal ausgelöst, das die Expression von Zytokinrezeptoren an der Oberfläche der T-Zellen und die Expression von Zytokinen durch die APC induziert. Erst dadurch wird eine Proliferation und Differenzierung der T-Lymphozyten möglich. In vitro lassen sich diese Interaktionen simulieren, indem man Lymphozyten eines Spenders als Responderzellen mit antigenpräsentierenden Zellen (DC) eines MHC-II-differenten anderen Spenders als Stimulatorzellen coinkubiert. 118 Diskussion 5.4.1 Methodische Überlegungen und Vorarbeiten Das übliche Protokoll zur Durchführung einer MLR beinhaltet die Bestrahlung der Stimulatorzellen vor dem Einsatz in die Cokultur, um eine Proliferation dieser Zellen zu vermeiden und somit eine Ein-Wege-MLR durchführen zu können, bei der ausschließlich die Proliferation der Responderzellen erfasst wird. Die Proliferationsrate der Responderzellen wird üblicherweise durch den Einbau von radioaktivem 3H-Thymidin bestimmt. Darauf konnte hier verzichtet werden, da die Proliferation der MNC zuverlässiger mit Hilfe der Referenzzellmethode bestimmt wurde (PECHOLD et al. 1994). Eine Erfassung der Stimulatorzellen bei der Messung der Proliferation war auszuschließen, da diese Zellen durch die Bestrahlung lediglich 3 Tage in der Kultur überlebten. Ab Tag 4 waren Kontrollansätze, die nur bestrahlte Stimulatorzellen enthielten Propidiumjodid positiv (tot) und konnten aufgrund ihrer FL3-Fluoreszenz im Durchflusszytometer von der Auswertung eliminiert werden. Um auch geringe Proliferationsinduktionen bei naiven Lymphozyten detektieren zu können, wird dem verwendeten Medium 2-Mercapoethanol (ME) zugesetzt. Es handelt sich dabei um ein Thioglycol mit zwei funktionellen Gruppen; einer Hydroxygruppe (-OH) und einer Mercaptogruppe (–SH). Es soll in der Kultivierung von Lymphozyten einen vitalitätserhaltenden und proliferationsfördernden Effekt ausüben, da es das Redox-Potential des Mediums stabilisiert und die Aufnahme von Cystin durch die Zellen ermöglicht. Dies geschieht, da es aufgrund seines reduzierenden Potenzials Cystein zu Cystin reduziert. Dem Cystin-Glutamat-Antiporter cXT wird in diesem Zusammenhang große Bedeutung beigemessen. Kultivierte Fibroblasten von Mäusen, die kein cXT exprimierten, starben in Kultur nach 24 h wenn ihnen kein 2-Mercaptoethanol zugesetzt wurde (SATO et al. 2005). Auch murine Lymphozyten zeigten in Kultur eine stärkere mitogen-induzierte Proliferation wenn ihnen ME zugesetzt wurde, und zwar unabhängig von der Dosis des zur Verfügung stehenden Cystins. Humane Lymphozyten wurden dagegen durch ME-Zusatz in vitro in ihrer Proliferation gehemmt. Wurde die intrazelluläre Glutathion-Konzentration allerdings durch Zusatz von Buthionine Sulfoximine (BSO, hemmt Glutathionsynthese) gesenkt und gleichzeitig ME in die Kultur gegeben, konnte eine mitogen-induzierte Proliferation verstärkt werden. Dies führte zu der Vermutung, dass eine bestimmte Menge an Thiolen für die Proliferation in vitro kultivierter Lymphozyten essentiell ist (MESSINA u. LAWRENCE 1992). Welchen Einfluss ME auf die in vitro Proliferation equiner Lymphozyten ausübt, ist nicht bekannt. Aus diesem Grund galt es zunächst den Effekt von ME auf equine Lymphozyten zu evaluieren und eine geeignete Konzentration zur Proliferationsmessung zu finden. In den 119 Diskussion Untersuchungen zeigte sich ein rassebezogener Unterschied in der ME abhängigen MNCProliferation. Während die von Isländerponies gewonnenen MNC (mononukleäre Zellen) schon ab 15µMol ME eine deutliche Proliferationssteigerung zeigten, benötigten die MNC von Warmblutpferden Konzentrationen von 50µMol ME. Beiden gemein war, dass alleine schon durch ME eine Proliferation der MNC induziert wurde. Da equine Lymphozyten in Kultur auch ohne ME überleben, scheint es zumindest ähnliche, wenn nicht gleiche Transporter wie den humanen cXT zu geben. Anders als bei humanen Lymphozyten wurde durch ME bei Pferden eine dosisabhängige Proliferation induziert. Dass die Zellen der Islandponies zudem deutlich stärkeres Wachstum zeigten als dies bei den Warmblutpferden der Fall war, könnte an unterschiedlichen Thiolpräferenzen der Zellen liegen, wie es für murine und humane Lymphozyten schon gezeigt werden konnte (MESSINA u. LAWRENCE 1992). ME würde demnach bei Islandponies zu einer besseren Reduktion des Cysteins führen und somit zu einer stärkeren Aufnahme der Aminosäure. Ob diese Hypothese jedoch zutrifft, müsste durch Analyse der intrazellulären Glutamat- und Cystinkonzentrationen bestätigt werden. Denkbar wäre auch, dass die Lymphozyten der Warmblutpferde über weniger cXT verfügen und somit abhängiger von einer Reduktion des Cysteins durch ME im Medium sind. Um zu prüfen, welchen Einfluss eine Stimulation der Zellen unter Einfluss verschiedener ME-Konzentartionen ausübt, wurde ein vereinfachtes Modell einer MLR durchgeführt. Dafür dienten MNC von Isländerponies als Stimulatorzellen und MNC von Warmblutpferden als Responderzellen. Durch die Wahl der beiden unterschiedlichen Rassen sollte eine möglichst hohe MHC-Divergenz gewährleistet werden. Während die Stimulation durch die allogenen MNC mit geringen Konzentrationen ME keinen Unterschied zur Mediumkontrolle aufwiesen, konnte ab einer Konzentration von 15µMol ME ein deutlicher Unterschied zwischen der Proliferation ohne Stimulatorzellen und mit Stimulatorzellen gesehen werden. Allerdings war dieser Unterschied zur Mediumkontrolle (ohne Stimulatorzellen) nur bei der höheren Stimulator/Responder-Ratio (S/R-Ratio) sichtbar. Die geringere S/R-Ratio von 3:100 zeigte dagegen bei 50µMol ME einen deutlichen Anstieg der Proliferationsrate (4.3.1). Demnach scheint für die Detektion einer Proliferationsinduktion im Rahmen einer MLR die Verwendung von ME von Vorteil zu sein. Für die MLR mit in vitro generierten DC wurde aufgrund dieser Untersuchungen eine Konzentration von 20µMol ME gewählt. 5.4.2 Ungepulste DC stimulieren allogene MNC Die in dieser Arbeit generierten dendritischen Zellen waren in der Lage bei allogenen MNC eine im Vergleich zur Mediumkontrolle signifikant gesteigerte Proliferation zu induzieren. Verglich man die Proliferationsinduktion der allogenen DC jedoch mit der Induktion der 120 Diskussion durch frisch isolierte Monozyten erzielten Proliferation, ließ sich kein signifikanter Unterschied ausmachen (4.3.2). Allogene Monozyten erwiesen sich demnach als ebenfalls proliferationsfördernd. Diese Beobachtung verwundert nicht, da Monozyten, wie DC, zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC) zählen und beim Pferd zudem stark MHC II exprimieren. Für humane Monozyten konnte sogar eine ähnliche Dichte an HLA-DR und den akzessorischen Molekülen LFA-3, ICAM-1, und B7 (CD80/86) auf frisch isolierten DC und Monozyten gezeigt werden (THOMAS et al. 1993). Für equine Monozyten konnte eine Expression von CD86 nicht bestätigt werden (vgl. Abb. 22); dennoch scheinen ähnliche stimulatorische Kapazitäten im allogenen System vorzuliegen. Bei einigen Tieren konnte in der autologen MLR mit ungepulsten DCs eine deutliche, dosisabhängige Proliferationsinhibition gesehen werden. Diese Beobachtung deckt sich mit Angaben aus der Literatur, nach denen ungepulste bzw. immature DC im autologen System Toleranz induzieren (JONULEIT et al. 2000; STEINMAN 2003). Ob dies allerdings durch die Induktion regulatorischer T-Zellen zustande kommt oder durch Anergieinduktion bleibt noch zu klären. 5.4.3 Gepulste DC stimulieren autologe und allogene MNC In weiteren Versuchen sollte überprüft werden, ob die generierten DC Antigene aufnehmen und präsentieren können. Als Antigenquelle diente Tumorzelllysat oder BSA (bovines SerumAlbumin), dass den DC für 24h vor der MLR zugesetzt wurde. Eine deutliche Steigerung der T-Zell-Proliferation konnte nur gesehen werden, wenn zu ihnen autologe DC, gepulst mit allogenem Tumorzelllysat, zugegeben wurden (4.3.3). Autologe DC, die mit autologem Tumormaterial gepulst wurden, führten dagegen zu keiner deutlichen Steigerung der Proliferation. Dies führte zu der Annahme, dass autologe DC Antigene aus dem autologen Tumorzelllysat aufnehmen, die nicht ausreichend immunogen genug sind, um eine effektive autologe Stimulation zu induzieren oder aber Komponenten aufgenommen werden, die als Selbst erkannt und toleriert werden. Dass das Tumorzelllysat selbst direkte oder indirekte, inhibitorische Einflüsse auf die Stimulationskapazität der DC ausübt (z.B. durch enthaltene Zytokine wie IL10 etc.) kann ausgeschlossen werden, da die autologen DC mit dem jeweils allogenen Tumorzelllysat zu einer effektiven Stimulation führten. Der gesteigerte SI durch DC, die mit allogenem Tumor oder mit BSA gepulst wurden, kann als Beweis für die Antigen präsentierende Funktion der generierten DC gesehen werden. Bemerkenswert ist allerdings, dass die in dieser Arbeit generierten Zellen zu einem hohen Prozentsatz den Reifungsmarker CD83 unabhängig von einer finalen Stimulation aufwiesen 121 Diskussion (vgl. 5.3.2). Die Expression dieses Markers stellt bei Mensch und Maus den Übergang der antigenaufnehmenden, immaturen DC (iDC) zur antigenpräsentierenden, maturen DC (mDC) dar (RATTA et al. 2000; THURNHER et al. 1997). Demnach würde man erwarten, dass Zellen, die diese Struktur exprimieren, keine Antigene mehr aufnehmen können, was aber den in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen widerspricht. Entweder die Expression von CD83 auf equinen DC zeigt nicht -wie bei Mensch und Maus- das Stadium der finalen Ausreifung und der damit verbundenen Unfähigkeit dieser DCs, Antigen aufzunehmen, oder die hier praktizierte Antigenzugabe erfolgte noch zu einem Zeitpunkt, zu dem eine ausreichende Anzahl DC noch nicht positiv für diesen Marker war. Es ist jedoch auch nicht auszuschließen, dass in der MLR die DC für die Stimulation der Lymphozyten verantwortlich waren, die an Tag 7 nicht positiv für CD83 waren, da lediglich 17% der DC den Marker exprimierten (vgl. 4.2.2.2.1) 5.5 Ausblicke für die Sarkoidtherapie mit dendritischen Zellen Monozyten des Pferdes können über einen hypertonen, 50%igen Percollgradienten® in guter Reinheit und Ausbeute separiert werden und sind in der Lage in vitro in dendritische Zellen zu differenzieren. Eine Charakterisierung der DC ist sowohl morphologisch als auch phänotypisch über die Oberflächenmarker CD83 und CD86 möglich. In einer gemischten Leukozytenreaktion (MLR) wurde die Antigen präsentierende Funktion der in vitro generierten dendritischen Zellen bestätigt. Dabei zeigte sich, dass autologe DCs effektive Stimulatoren darstellen; die Aufnahme geeigneter Antigene vorausgesetzt. In dem hier durchgeführten in vitro Modell erwies sich autologes Tumorzelllysat allerdings als weniger geeignete Antigenquelle im Hinblick auf eine induzierte T-Zellproliferation. Allogenes Tumormaterial oder BSA (bovines Serum-Albumin) dagegen wurde sehr effektiv aufgenommen und präsentiert, was an einer deutlichen Proliferation der Responderzellen erkennbar war. Für die therapeutische Verwendung von DCs zur Sarkoidtherapie ist demnach ein in vitropulsen autologer DCs mit autologem Tumorzelllysat noch kritisch zu prüfen. Eventuell würde das Pulsen mit autologen apoptotischen Tumorzellen zu einer besseren Stimulationskapazität führen, wie es von KOKHAEI et al. (2004) beschrieben wurde. Das beinhaltet jedoch die Gefahr der induzierten Metastasierung, die durch ein konsequentes Tumorzelllysat auszuschließen ist. Eine weitere Überlegung ist, ob eine Vakzination mit allogenen DC, welche mit autologem Tumormaterial gepulst wurden, nicht ebenfalls zur therapeutischen Anwendung in Betracht kommt. Bei dem Pferd „Fores“ (Abb. 32, D) konnte durch allogene DC, welche autologes Tumormaterial präsentierten, eine starke Proliferation der MNC 122 Diskussion induziert werden. Vergleichbare Ansätze wurden von HUS et al. (2005) durchgeführt, der Studien mit an Leukämie erkrankten Personen durchführte. Während der Behandlung mit allogenen, gepulsten DC sanken die Zellzahlen der leukämischen Zellen, und einer von neun Patienten zeigte einen signifikanten Anstieg cytotoxischer T-Lymphozyten die spezifisch für das Tumorantigen RHAMM/CD168 waren. HOLTL et al. (2002) und HOLTL et al. (2005), die ähnliche Untersuchungen an Patienten mit Nierenzellkarzinomen durchführten, kamen jedoch zu dem Schluss, dass gepulste, autologe DC bessere Immunantworten induzierten. Die optimale Vorgehensweise scheint demnach von der Art des Tumors abhängig zu sein und kann eventuell sogar patientenindividuell divergieren. Nach den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen kann die mangelnde stimulatorische Kapazität der autologen DC (mit autologem Tumorzellysat gepulst) im Hinblick auf die Proliferation bedeuten, dass autologes Material anders reguliert wird (partielle Toleranz), oder aber eine massive Ausdifferenzierung CTL (CD8 positiver T-Zellen) ohne wesentliche Proliferation stattfindet. Würde man diese Zellen ungepulst direkt in das Sarkoid des Patienten injizieren, könnten sie evtl. geeignetes Tumorantigen aufnehmen (evt. in Form apoptotischer Tumorzellen, s.o.) und schließlich auf dem Weg zum Lymphknoten unter physiologischen Bedingungen ausreifen. KIM et al. (2004) konnten zeigen, dass bei Patienten, die unreife DC nach Tumorbestrahlung intratumoral appliziert bekamen, eine starke tumorspezifische Immunantwort ausgelöst wurde. Zudem wurde in equinen Sarkoiden immunhistochemisch nur eine sehr geringe Menge DC nachgewiesen (STARK 2005), was diese therapeutische Vorgehensweise unterstützen würde. Die Gefahr, eine Autoaggression in dem Patienten hervorzurufen, falls die DCs körpereigene Strukturen präsentieren sollten, besteht nach den vorliegenden Ergebnissen nicht. Bei einigen Pferden wurde durch ungepulste, autologe DC eine dosisabhängige Inhibition der Lymphozytenproliferation induziert (4.3.2), die eventuell auf der Aufnahme von SelbstAntigenen aus dem autologen Serum beruht, welches im Rahmen der DC-Kultivierung zugesetzt wurde. Die Gefahr einer Toleranzinduktion, wie sie für immature DC beschrieben wird (STEINMAN et al. 2003; STEINMAN 2003), ist zwar nicht gänzlich auszuschließen, beim Pferd aber unwahrscheinlich, da der Reifungsmarker CD83 bei den generierten DC unabhängig von einer finalen Stimulation durch ein Gefahrensignal exprimiert wurde. Zudem ist auch bei in vitro gepulsten, maturen DC diese Gefahr nicht auszuschließen, da eine Toleranzinduktion ebenfalls von der Art der Antigenaufnahme bzw. des Rezeptors abhängig zu sein scheint (MAHNKE et al. 2003). Je nachdem über welchen Rezeptor Antigen aufgenommen wird, werden intrazelluläre Signalkaskaden in der DC eingeleitet, die entweder die Reifung der Zelle zur maturen, Antigen präsentierenden DC induzieren, oder aber die Reifung der DC inhibieren und so zur Toleranzinduktion führen. Die von JONULEIT et al. 123 Diskussion (2001) gemachten Beobachtungen, bei denen unreife DC (CD83 negativ) im Gegensatz zu reifen DC (CD83 positiv) in vivo keine tumorantigenspezifischen CTL induzierten, kann darauf beruhen, dass die DC intranodal appliziert wurden. Eine Reifung der DC während der Migration zu den Lymphknoten konnte somit nicht stattfinden. In Abbildung 33 ist schematisch dargestellt, wie mit den im Rahmen dieser Dissertation generierten autologen DC eine effektive Tumorbekämpfung erreicht werden könnte. Abb. 33 Mechanismen der Tumortherapie mit immaturen dendritischen Zellen Die in vitro generierten immaturen DC (iDC) werden lokal in das Tumorgewebe appliziert. Dort erfolgt die Aufnahme von Tumorzellfragmenten und tumorassoziierten Antigenen (TAA). Nach Antigenaufnahme migrieren die iDC durch das Gewebe und treten in die regionalen Lymphgefäße ein. Während der Migration reifen die iDC zu maturen (mDC), was sich in einer erhöhten Expression der Moleküle MHCII, CD80, CD83 und CD86 zeigt. Im Lymphknoten werden die mDC von TLymphozyten „abgetastet“ und auf einen passenden MHC-Peptid-Komplex untersucht. Erkennt eine T-Zelle über ihren T-Zell-Rezeptor (TCR) eine passende Struktur im MHC, wird die Bindung an die mDC gefestigt. Durch ein zweites Signal über die costimulatorischen Moleküle auf der DC (CD 80/86) wird die T-Zelle zur Proliferation und Differenzierung in eine Effektorzelle angeregt. Die aktivierten Effektorzellen treten aus dem Lymphknoten aus und zirkulieren solange in Körper, bis sie auf MHC-Peptid-Komplexe stoßen, welche den zuvor auf den DC erkannten MHC-Peptid-Molekülen entsprechen. Exprimiert eine Zelle solche Strukturen und wird durch eine cytotoxische T-Zelle (CD8- 124 Diskussion Zelle) erkannt, so wird sie lysiert. Eine weitere Möglichkeit der Immunantwort stellt der humorale Weg dar, der durch T-Helferzellen (CD4-Zellen) induziert wird. Erkennt ein B-Lymphozyt antigene Strukturen auf der Tumorzelle, kann er unter dem Einfluss der T-Helferzelle zur Plasmazelle ausdifferenzieren. Produziert sie spezifisch gegen die TAA gerichteten Antikörper, kann eine Opsonisierung der Tumorzellen erfolgen, welche zur Aktivierung von Komplement und somit ebenfalls zur Lyse der Tumorzelle führt (CDC, complement dependent cytoxicity). Die Antikörperbindung an die TAA kann auch zur Erkennung der Tumorzelle durch natürliche Killerzellen (NK-Zelle) und zu einer damit einhergehenden Zelllyse (ADCC, antibody dependent cell cytoxicity) der Tumorzelle führen . 125 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Eva C. Siffrin Immunologische Untersuchungen zur Gewinnung und Charakterisierung dendritischer Zellen (DC) vom Pferd im Hinblick auf eine DC-Therapie des equinen Sarkoids Dendritische Zellen des Pferdes sind zentrale Initiatoren einer breiten Immunantwort gegen equine Sarkoide. Zur Herstellung dendritischer Zellen (DC) können Monozyten des peripheren Blutes als Ausgangspopulation verwendet werden, die unter geeigneten Kulturbedingungen in vitro zu DCs differenzieren. Da für die Separation equiner Monozyten noch keine ausreichend effektiven Methoden beschrieben sind, wurden verschiedene Verfahren der Aufreinigung untersucht und miteinander verglichen. Des Weiteren galt es, die in vitro generierten DCs phänotypisch und funktionell zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Separation equiner Monozyten aus Vollblut Eine Anreicherung equiner Monozyten über ihr Adhärenzverhalten an Plastikoberflächen erwies sich als uneffektiv, da sie mit erheblichen Monozytenverlusten einherging und keine ausreichende Reinheit der Population erbrachte. Die beste Reinheit an Monozyten, die in dieser Arbeit erzielt werden konnte lag bei 30% aller MNC. Durch die Depletion equiner mononukleärer Zellen (MNC) von CD4 und CD8 positiven Zellen mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) konnte zwar eine deutliche relative Anreicherung von Monoyzten (fast 40% aller MNC) erreicht werden, jedoch lag die Ausbeute der an Monozyten angereicherten MNC bei geringen 6,4% der eingesetzten MNC. Zudem fand eine Selektion bestimmter Monozytensubtypen statt, da CD4 und CD8 positive monozytoide Zellen bei diesem Verfahren ebenfalls entfernt wurden. Eine Anreicherung von Monzyten über ihr membrangebundenes IgE im MACS führte zwar zu einer Monozytenreinheite von bis zu 70% der MNC. Nachteil war allerdings, dass auch hier eine Selektion bestimmter Subtypen (IgE positiver Monozyten) stattfand. Des Weiteren wurden von den vorhandenen Monozyten mit diesem Verfahren nur sehr wenige gewonnen: 1,6% der Ausgangspopulation an Monozyten. Als beste Methode, equine Monozyten zu separieren erwies sich eine Dichtegradientenzentrifugation, bei der leukozytenreiches Plasma über einen 50%igen, leicht hypertonen (340 ± 10 mOsm/kg) Percollgradienten® geschichtet wurde. Der erzielte relative Monozytenanteil an den MNC lag zwischen 50 und 90% mit einer Ausbeute an Monozyten von 70%. Als entscheidende Einflussfaktoren stellten sich bei dieser Methode das verwendete Antikoagulanz und der Zeitraum zwischen Entnahme und Verarbeitung des Blutes. 126 Zusammenfassung 2. Generierung dendritischer Zellen und ihre phänotypische Charakterisierung Zur phänotypischen Charakterisierung equiner dendritischer Zellen wurden monoklonale Antikörper (mAK) gegen humanes CD83 und humanes CD86 verwendet. Diese mAK banden nur an Zellen, die in durchflusszytometrischen Analysen im Bereich der DC lagen. Lymphozyten oder frisch isolierte Monozyten waren für beide AK in der Membranimmunfluoreszenz negativ. Wurden über IgE angereicherte Zellen mit huGM-CSF und req.IL4 kultiviert, zeigte sich bereits nach 3 Tagen Kultur eine deutliche Expression der Oberflächenmoleküle CD83 und CD86. Monozyten, die über hypertone Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden, benötigten dafür 7 Tage Differenzierungszeit, um ein vergleichbares Expressionsniveau dieser Oberflächenmarker zu erreichen. Obwohl CD83 bei Mensch und Maus einen Reifungsmarker darstellt, der nur auf maturen DC (mDC) zu finden ist, bleibt es offen, ob CD83 beim Pferd evtl. schon auf immaturen DC (iDC) expremiert wird. Eine finale Stimulation mit LPS führte zu keiner Expressionssteigerung von CD83 auf equinen DC. 3. Antigen präsentierende Funktion der in vitro generierten DC In gemischten Leukozytenreaktionen (MLR) wurde die antigenpräsentierende Funktion der DCs in allogenen und autologen Ansätzen überprüft. Zunächst wurden die Zellen ungepulst, d.h. ohne exogene Beladung mit Antigen untersucht. Im Vergleich zur Mediumkontrolle zeigte sich nur bei allogenen T-Zellen eine signifikante Proliferationssteigerung durch DCs, die sich jedoch von der Stimulation durch allogene, frisch isolierte Monozyten nicht signifikant unterschied. Autologe DC führten zu keiner signifikanten Steigerung des Stimulationsindex, erwiesen sich bei einzelnen Tieren sogar als proliferationsinhibierend. Eine Hemmung der Proliferation wurde ebenfalls beobachtet, wenn frisch isolierte, autologe Monozyten als Stimulatorzellpopulation fungierten. Eine Antigenpulsung (exogene Beladung mit Antigen) 24h vor Einsatz der DC in der MLR führte zu deutlichen Stimulationen allogener als auch autologer T-Zellen. Entscheidend war jedoch, welche Antigene durch die DC präsentiert wurden. So führten autologe DC zu einer deutlichen Stimulation wenn sie als Antigenquelle allogenes Tumormaterial oder BSA (bovines Serum-Albumin) erhielten. Mit autologem Tumorzelllysat gepulste, autologe DCs konnten nur eine geringe Proliferation der T-Zellen induzieren. Auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit ist es nun möglich, equine dendritische Zellen in größerer Menge aus hoch angereicherten und weder voraktivierten noch vorselektierten Monozyten zu generieren. Die in vitro generierten Zellen sind in der Lage, effektiv Antigene aufzunehmen und zu präsentieren, was ihren therapeutischen Einsatz zur Behandlung des 127 Zusammenfassung equinen Sarkoids erlaubt. Empfohlen wird die intratumorale Applikation autologer, in vitro nicht-gepulster DC. 128 Summary 7 Summary Eva C. Siffrin Immunological studies on the production and the characterisation of equine dendritic cells (DC) in respect to a DC based therapy of equine sarcoids Dendritic cells of the horse are key initiators of a wide range of immune reactions against equine sarcoids. Peripheral blood monocytes are a suitable source to generate dendritic cells (DC) in vitro under appropiate conditions. Thus, aiming for a high yield of peripheral blood monocytes which have neither been preselected nor preactivated by the harvesting procedure we scrutinized different published methods. Monocyte derived DC were characterised phenotypically by means of their expression of CD83 and CD 86 and functionally in respect to their antigen presenting capacity. The following results were achieved: 1. Separation of equine monocytes from whole blood An enrichment of equine monocytes due to their adherence on plastic surfaces turned out to be ineffective, because it comprised a considerable loss of monocytes and an insufficient purity of maximally 30% of the mononuclear cell (MNC) fraction. Depleting MNC from CD4 and CD8 positive cells by magnetic cell sorting (MACS) resulted in a higher purity of monocytes (up to 40% of MNC) but with an unacceptable low gain of only 6.4% of the MNC to start with plus a selective loss of CD4 and CD8 positive monocytes. Enrichment of IgE positive monocytes via MACS separation resulted in an impressive purity of monocytes (up to 70% of MNC). Disadvantages of that method were, however, a selection of a monocyte subset (IgE positive monocytes only were retrieved) and a very low yield of monocytes (only 1.6% of the monocytes available). The best method to enrich for equine monocytes proved to be an overlay of leukocyte-rich-plasma on a slightly hyperosmotic (340 ± 10 mOsm/kg) gradient of 50% percoll followed by density centrifugation, resulting in a purity of 50% to 90% monocytes and yield of 70% of the monocytes available. Highly influencial on the outcome of the latter procedure, however, is the anticoagulant used and the time between harvest and processing of the blood. 129 Summary 2. Generation of dendritic cells and phenotypical characterisation of the DCs For phenotypical characterisation of the generated dendritic cells, monoclonal antibodies (mAb) against human CD83 and human CD86 were used. They labelled exclusively cells, residing in the morphological region of DCs in flowcytometric analyses. Lymphocytes or freshly isolated monocytes were negative for both mAbs. When IgE positive cells were enriched and cultured with huGM-CSF and req. IL4, a clear expression of the surface molecules CD83 and CD86 already appeared after 3 days in cell culture. Monocytes enriched by hyperosmotic density gradient centrifugation required 7 days in cell culture with huGMCSF and req. IL4 to reach a comparable expression level of these surface markers. In man and mouse CD83 expression indicates the differentiation to mature DC (mDC), it remains unclear whether CD83 is expressed on immature DC (iDC) in horse as well. A final stimulation of differentiating equine DCs with LPS did not lead to an increased expression of CD83. 3. Antigen presenting functionality of in vitro generated DC The antigen presenting capacity of the DCs were tested in allogeneic and autologous mixed leucocyte reactions (MLR). Initially unpulsed (without exogenous antigen loaded) DC were examined. In comparison to the medium control T-cell proliferation increased significantly in the presence of allogeneic DCs. However, this stimulation did not differ significantly from that induced by allogeneic freshly isolated monocytes. Unpulsed DCs did not stimulate autologous T-cells to a significant proliferation but rather inhibited their proliferation in single animals. Likewise T-cell proliferation was also inhibited by freshly isolated, autologous monocytes. Exogenous loading of DC with antigen (antigen pulse) 24h before application of the DC as stimulator cells in MLR, caused a clear stimulations of allogeneic as well as autologous T-cells. However, it was decisive which antigens were presented by the DC: Autologous DC pulsed with allogeneic tumour material or BSA (bovine serum albumin) as antigen source initiated a clear stimulation of T-cells, while DCs pulsed with autologous tumourcell lysat turned out to be less effective in inducing autologous T-cell proliferation. Based on these results it is now possible to generate sufficient amounts of equine dendritic cells from highly enriched peripheral blood monocytes which are neither preactivated nor preselected. The in vitro generated DC are capable of taking up antigens and presenting them efficiently to T-cells. This permits their therapeutic application in the treatment of equine sarcoids. The intratumorale application of autologous, unpulsed DC is recommended. 130 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis ALLAM, J. P., N. NOVAK, C. FUCHS, S. ASEN, S. BERGE, T. APPEL, E. GEIGER, J. P. KOCHAN u. T. BIEBER (2003): Characterization of dendritic cells from human oral mucosa: a new Langerhans' cell type with high constitutive FcepsilonRI expression. J. Allergy Clin. Immunol. 112, 141-148 ARDAVIN, C., L. WU, C. L. LI u. K. SHORTMAN (1993): Thymic dendritic cells and T cells develop simultaneously in the thymus from a common precursor population. Nature 362, 761-763 BAJTAY, Z., E. CSOMOR, N. SANDOR u. A. ERDEI (2006): Expression and role of Fc- and complement-receptors on human dendritic cells. Immunol Lett. 104, 46-52 BANCHEREAU, J., B. DUBOIS, J. FAYETTE, N. BURDIN, F. BRIERE, P. MIOSSEC, M. C. RISSOAN, K. C. VAN u. C. CAUX (1995): Functional CD40 antigen on B cells, dendritic cells and fibroblasts. Adv. Exp. Med. Biol. 378, 79-83 BANCHEREAU, J. u. A. K. 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Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für die Arbeit erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgender wissenschaftlichen Einrichtung angefertigt: Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. _____________________________________ (Eva Siffrin) Hannover, 23.03.2007 150 Danksagung An erster Stelle möchte ich allen Pferden danken, die durch Ihre mehr oder weniger bereitwillige Blutspende diese Arbeit überhaupt erst ermöglichten. Ganz besonders sind dabei „Kufur“, „Limara“ und „Fores“ zu erwähnen, die mich unglaublich motiviert haben und mir mehr als nur ihr Blut spendeten. In dieser Hinsicht möchte ich mich auch bei den Besitzern der Tiere, Herr Callewege, Frau Dr. med. vet. Kleinsorgen und Herr Dr. med. vet. Kleinsorgen, ganz herzlich für das in mich gesetzte Vertrauen und die Bereitstellung der Pferde bedanken. Herrn Univ. Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. Wolfgang Leibold danke ich ganz herzlich für die Überlassung des interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie für sein in mich gesetztes Vertrauen dieses Thema selbstständig zu bearbeiten und meine Ideen frei umsetzen zu dürfen. Danke auch dafür, dass mein Hund „Bonny“ immer herzlich am Institut willkommen war! Großer Dank gilt zudem Frau Dr. med. vet. Bettina Wagner, die mir freundlicherweise das von ihr hergestellte, rekombinante equine Interleukin 4 zur Verfügung stellte und somit ein essentieller Faktor für das Gelingen dieser Arbeit bereitstand. Herrn Stefan Hampel möchte ich für die kompetente Unterstützung im Umgang mit den Pferden sowie deren medizinischer Versorgung herzlich danken. Herrn Dr. med. vet. Jens Rohwer möchte ich für seine Ideen und Anregungen danken, die so manches Mal ein wenig Licht ins Dunkel brachten und zum Nachdenken anregten. Herrn Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth möchte ich für die - mitunter recht unterhaltsamen- Diskussionen danken sowie für sein stets offenes Ohr für FACSProblemchen und seine konstruktiven Ideen. Der Medizinischen Hochschule Hannover, insbesondere Herrn Prof. Dr. rer. nat. Volkhard Kaever aus dem Institut Pharmakologie und Toxikologie, möchte ich an dieser Stelle sehr herzlich für die freundliche Genehmigung zur Benutzung des Bestrahlungsgerätes danken. Unermesslicher Dank geht an die drei Mitarbeiter des Labors der Arbeitsgruppe Immunologie Frau Silke Schöneberg, Frau Sonja Kordex und Herrn Udo Rabe. Durch ihre hohe fachliche Kompetenz, ihre unerschöpfliche Geduld und ihre liebe Hilfsbereitschaft haben sie mir geholfen, die großen und kleinen Laborgeheimnisse zu enträtseln. 151 Der Tierpflegerin Kerstin Liebig möchte ich für die sehr liebe Betreuung der Tiere danken. Besonders ihr Talent, freie Pferdeboxen an der TiHo zu organisieren, wird mir in guter Erinnerung bleiben. Weiterhin möchte ich mich bei allen Doktoranden der Arbeitsgruppe Immunologie bedanken. Ihr habt die Arbeit (fast immer) zum Vergnügen werden lassen! Nicht zu vergessen sind eure tröstenden Worte und helfenden Hände in Zeiten der Not. Zudem kann ich jetzt endlich mal Doppelkopf spielen. Nicht zu Letzt möchte ich mich bei meinen lieben Eltern Gabriele Siffrin und Horst Siffrin von ganzem Herzen bedanken, die mich während meines Studiums und meiner Doktorarbeit mental und finanziell unterstützten. Ihr habt immer an mich geglaubt und wart immer für mich da. Danke! Holger Kokert möchte ich für seine unendliche Geduld mit mir danken und für seine stets gewährte Hilfe und Unterstützung; sei es im Kampf mit den Pferden, mit statistischen Analyseprogrammen oder mit mir. Du bist mein Fels in der Brandung gewesen! Fehlen darf an dieser Stelle aber auch nicht meine super liebe Hündin „Bonny“, die mich tagtäglich in die Immunologie begleitet hat und mir die Zentrifugenpausen versüßt hat. Wie aufbauend kann ein lieber Hundeblick doch wirken! 152
