Dendritische Zellen in der Immuntherapie gegen Tumoren
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Aus dem Institut für Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Hygieneinstitut Abteilung für Immunologie der Universität Göttingen Dendritische Zellen in der Immuntherapie gegen Tumoren Untersuchungen zu der durch dendritische Zellen vermittelten spezifischen Immunantwort beim Mammakarzinom und vom Tumor ausgehende immunsupprimierende Einflüsse Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von Constanze Matthes aus Dahme Hannover 2006 Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 10.07.2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Klaus Resch Referent: Privatdozent Dr. med. Thomas Tschernig Korreferent: Prof. Dr. med. Marta Szamel Korreferent: Prof. Dr. med. Gerhard Hunsmann Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2007 Meinen Eltern, Swantje und Roland INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ______________________________________________________I Abbildungsverzeichnis _________________________________________________ III Tabellenverzeichnis ____________________________________________________ V Abkürzungsverzeichnis ________________________________________________ VI 1 Einleitung ________________________________________________________ 1 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 2 In vivo und in vitro _______________________________________________________ Aktivierung von dendritischen Zellen durch Toll-like Rezeptoren (TLR) und Polarisierung einer TH1/TH2-Immunantwort ___________________________________ Antigenprozessierung und -präsentation_______________________________________ Immunologische Effektorzellen und ihre Helferzellen ____________________________ 2 4 6 7 Das Mammakarzinom _______________________________________________ 9 Tumorimmunologie und Tumorantigenität____________________________________ 10 Zelluläre Immuntherapien und Vakzinierungsstrategien _________________________ 12 Immun-escape-Mechanismen ______________________________________________ 18 Themenstellung____________________________________________________ 21 Material und Methoden ____________________________________________ 23 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 3 Dendritische Zellen__________________________________________________ 2 Material __________________________________________________________ 23 Spendermaterial und Patientenmaterial ______________________________________ Chemikalien und Substanzgemische_________________________________________ Zellkulturutensilien und andere Verbrauchsmaterialien __________________________ Geräte und Laborinstallationen_____________________________________________ 23 24 28 29 Methoden_________________________________________________________ 31 Zellbiologische Arbeitstechniken ___________________________________________ Aufarbeitung von humanem Blut ___________________________________________ Aufarbeitung und Kultivierung von Tumoren _________________________________ Spezifische T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und Tumorzell-Lysaten sowie Lymphozytenproliferation nach Mitogenstimulation ____________________________ Durchflusszytometrische Methoden _________________________________________ Proteinbiochemische Methoden ____________________________________________ Phago- und Pinozytose-assay mit unreifen und reifen dendritischen Zellen __________ IL-10-ELISA __________________________________________________________ 31 34 42 47 52 60 64 66 Ergebnisse ______________________________________________________ 69 3.1 Optimierung der Kulturbedingungen zur Generierung monocyte-derived dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen ________________ 69 3.1.1 Morphologie der Monozyten und der dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen ____________________________________________________ 3.1.2 Vergleich der Expression der Oberflächenantigene auf unreifen dendritischen Zellen bei Mammakarzinompatientinnen mit denen gesunder Spender____________________ 3.1.3 Funktionelle Untersuchungen der unreifen dendritischen Zellen und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen _____________________________________________ 3.1.3.1 Vergleich der akzessorischen Aktivität von unreifen dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen und Spendern mittels autologem T-Zellproliferationstest 3.1.4 Untersuchungen zu verschiedenen Kulturbedingungen zur Generierung unreifer dendritischer Zellen von Patientinnen und gesunden Spendern ____________________ 69 74 85 85 91 I INHALTSVERZEICHNIS 3.1.5 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.4 3.4.1 3.4.2 4 Vergleich Phänotyp und Funktionalität der MoDC von Patientinnen unter Kulturbedingung 1 und 2 ________________________________________________ 100 Phago- und Pinozytose von unreifen und reifen dendritischen Zellen bei Patientinnen und Spendern _________________________________________ 105 Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von Patientinnen mit FITCmarkiertem Zymosan-A _________________________________________________ 106 Wie effizient phagozytieren unreife und reife MoDC lipidische Proteine einer Mammakarzinomzelllinie? _______________________________________________ 111 Pinozytose der Wasser- löslichen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 durch unreife und reife MoDC ___________________________________________________________ 116 Spezifische T-Zellstimulation und TH1/TH2-Zytokinsekretion durch Tumorzell-Lysat-gepulste dendritische Zellen__________________________ 121 Titration der Tumorzell-Lysat-Konzentration mit verschiedenen Tumorzelllinien in einem allogenen in-vitro T-Zell-Stimulations-assay ____________________________ 121 Spezifische autologe T-Zellproliferation und TH1/TH2-Zytokinsekretion induziert durch autologe Tumorzell-Lysat gepulste MoDC von Mammakarzinompatientinnen __ 125 TH1/TH2-Zytokinsekretion nach T-Zellstimulation durch SK-BR3-Lysat gepulste dendritische Zellen und Toll-like Rezeptor-Liganden___________________________ 129 Untersuchungen zu Immun-escape-Mechanismen ______________________ 133 Expression von Oberflächenantigenen auf Tumorzellen aus Gewebepräparationen von Mammakarzinomen _________________________________________________ 134 IL-10-Messungen im Serum von Mammakarzinompatientinnen und gesunden Spendern _____________________________________________________________ 137 Diskussion ______________________________________________________ 139 4.1 Monocyte-derived dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen als Auslöser einer TH1-Immunantwort __________________________________ 140 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 Morphologie und Phänotyp der MoDC von Mammakarzinompatientinnen __________ 141 Funktionalität der MoDC und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen ______ 144 Der Einfluss von IFN-γ, Patientenserum und höheren Konzentrationen IL-4/GM-CSF auf die Differenzierung der MoDC von Patientinnen ___________________________ 147 Antigenaufnahme der MoDC von Mammakarzinompatientinnen _________ 154 4.3 Antigenpräsentation der MoDC von Mammakarzinompatientinnen und Induktion einer spezifischen Immunantwort _____________________________ 158 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 Immun-escape ____________________________________________________ 163 Expression von immunregulatorischen Molekülen auf Tumorzellen von Mammakarzinomen_____________________________________________________ 164 Prognostische Relevanz von IL-10 im Serum von Mammakarzinompatientinnen in Verbindung mit dem Therapieerfolg einer Immuntherapie mit dendritischen Zellen ___ 168 Ausblick _________________________________________________________ 170 5 Zusammenfassung _______________________________________________ 171 6 Literaturverzeichnis ______________________________________________ 173 Danksagungen ______________________________________________________ 198 II ABBILDUNGSSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1: PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON FRISCH ISOLIERTEN MONOZYTEN.... 70 ABBILDUNG 2: LYMPHOZYTENANTEIL NACH DICHTEGRADIENT UND NACH ELUTRIATION IN MONOZYTEN-PRÄPARATIONEN. ........................................................................................................ 70 ABBILDUNG 3: LYMPHOZYTENANTEIL IN MODC AUS UNTERSCHIEDLICHEN MONOZYTENPRÄPARATIONEN ............................................................................................................................... 71 ABBILDUNG 4: PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON MONOZYTEN, WELCHE MIT 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF UND 150 U/ml IFN-γ ZU UNREIFEN MODC AUSDIFFERENZIERT WURDEN ............................................................................................................. 71 ABBILDUNG 5: PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON MONOZYTEN, WELCHE MIT 500 U/ml IL-4 UND 800 U/ml GM-CSF ZU UNREIFEN MODC AUSDIFFERENZIERT WURDEN ............. 72 ABBILDUNG 6: PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 8 TAGE ALTE REIFE MODC MIT 100 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-1β, 10 ng/ml TNF-α UND 1 µg/ml PGE2 AUS MONOZYTEN DIFFERENZIERT......... 73 ABBILDUNG 7: PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 7 TAGE ALTE REIFE MODC MIT 2 mg/ml POLY I:C UND 500 U/ml IFN-γ AUS MONOZYTEN DIFFERENZIERT. ...................................... 73 ABBILDUNG 8: VERGLEICH DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON MONOZYTEN UND MODC EINER PATIENTIN IM HISTOGRAMM DARGESTELLT ..................................................................................... 76 ABBILDUNG 9: PHÄNOTYP 7 TAGE ALTER MODC VON PATIENTINNEN UND SPENDERN IN ∆ % POSITIVE ZELLEN UND IN RFI DARGESTELLT. ................................................................................................... 78 ABBILDUNG 10: PHÄNOTYP 7 TAGE ALTER MODC VON NON-RESPONDER- UND RESPONDER-PATIENTINNEN ............................................................................................................... 81 ABBILDUNG 11: AUTOLOGE LYMPHOZYTENPROLIFERATION MIT MODC, LYMPHOZYTEN UND MIT TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN VON PATIENTINNEN UND GESUNDEN SPENDERN ............................. 86 ABBILDUNG 12: AUTOLOGE LYMPHOZYTENPROLIFERATION MITTELS MITOGENSTIMULATION MIT PHA ... 87 ABBILDUNG 13 TH1/TH2-ZYTOKINFREISETZUNG IM AUTOLOGEN PROLIFERATIONSTEST MIT TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN VON PATIENTINNEN UND GESUNDEN SPENDERINNEN:...................... 89 ABBILDUNG 14: EINFLUSS VON IFN-γ AUF DIE EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN VON PATIENTINNEN ................................................................................................................................... 93 ABBILDUNG 15: AKZESSORISCHE AKTIVITÄT VON PATIENTEN-MODC, WELCHE MIT UND OHNE IFN-γ KULTIVIERT WURDEN ........................................................................................................................ 95 ABBILDUNG 16: VERGLEICH DER EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN UNREIFER MODC UNTER VERSCHIEDENEN KULTURBEDINGUNGEN ∆ % POSITIVE ZELLEN DARGESTELLT ................................ 97 ABBILDUNG 17: VERGLEICH DER EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN UNREIFER MODC UNTER VERSCHIEDENEN KULTURBEDINGUNGEN RFI DARGESTELLT ............................................................. 98 ABBILDUNG 18: PHÄNOTYP 7 TAGE ALTER MODC VON N=16 MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN UND VON N=19 MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN WELCHE UNTER KULTURBEDINGUNG (1) UND (2) KULTIVIERT WURDEN....................................................................................................................... 101 ABBILDUNG 19: TH1/TH2 ZYTOKINSEKRETION VON MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN UND SPENDERN NACH SPEZIFISCHER T-ZELLAKTIVIERUNG MIT MODC AUS KULTURMODELL (2) UND TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN ....................................................................................................... 104 ABBILDUNG 20: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC EINER PATIENTIN MIT PHAGOZYTIERTEN FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKELN.................................................. 107 ABBILDUNG 21: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC EINER PATIENTIN MIT AZID UND FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKEL INKUBIERT ............................................... 107 ABBILDUNG 22: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 8 TAGE ALTER REIFER MODC EINER PATIENTIN MIT FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKELN INKUBIERT. ............................................................ 108 ABBILDUNG 23: PHAGOZYTOSEKAPAZITÄT VON UNREIFEN UND REIFEN MODC VON MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN, WELCHE MIT FITC-MARKIERTEN ZYMOSAN-A-PARTIKELN INKUBIERT WURDEN. ....................................................................................................................... 109 ABBILDUNG 24: EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC VON MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN VOR UND NACH DER PHAGOZYTOSE VON FITC-ZYMOSAN-APARTIKELN ...................................................................................................................................... 110 ABBILDUNG 25: PHAGOZYTOSEKAPAZITÄT VON FITC-MARKIERTEM PROTEIN DER MEMBRANFRAKTION DER ZELLLINIE MCF-7 DURCH UNREIFE UND REIFE MODC VON SPENDERN .......................................... 112 III ABBILDUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNG 26: EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC DER SPENDER VOR UND NACH DER PHAGOZYTOSE DES FITC-MARKIERTEM PROTEIN DER MEMBRANFRAKTION .......................................................................................................................113 ABBILDUNG 27: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT PHAGOZYTIERTEM FITC-MARKIERTEM PROTEINEN DER MEMBRANFRAKTION DER TUMORZELLLINIE MCF-7 ................................................................................................................114 ABBILDUNG 28: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT PHAGOZYTIERTEN FITC-MARKIERTEN PROTEINEN DER MEMBRANFRAKTION DER ZELLLINIE MCF-7 UND OBERFLÄCHENANTIGENFÄRBUNG FUNKTIONELL WICHTIGER ANTIGENE AUF UNREIFEN MODC.............................................................................................................................115 ABBILDUNG 29: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE- UND PHASENKONTRAST-AUFNAHMEN 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT PINOZYTIERTEM, FITC-MARKIERTEN, LÖSLICHEN PROTEINEN DER TUMORZELLLINIE MCF-7 ................................................................................................................117 ABBILDUNG 30: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE AUFNAHME (MIT ZUSÄTZLICHER HELLFELDEINBLENDUNG) 8 TAGE ALTER REIFER MODC MIT PINOZYTIERTEM, FITC –MARKIERTEN, LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7................................................................................117 ABBILDUNG 31: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 6 TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT AZID UND FITC MARKIERTEN LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7 SOWIE UNREIFER MODC MIT FITC-FARBSTOFF OHNE LÖSLICHES PROTEIN ZUR PHAGOZYTOSE INKUBIERT ..........................118 ABBILDUNG 32: PINOZYTOSEKAPAZITÄT VON UNREIFEN UND REIFEN MODC VON SPENDERN, WELCHE MIT FITC-MARKIERTEN LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7 INKUBIERT WURDEN..........119 ABBILDUNG 33: EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC VON SPENDERN VOR UND NACH DER PINOZYTOSE VON FITC-MARKIERTEN, LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7.....................................................................................................................120 ABBILDUNG 34: SPEZIFISCHE T-ZELLSTIMULATION MIT DEM LYSAT AUS DEN MAMMA-CATUMORZELLLINIEN SK-BR3 UND MCF-7, DER MELANOMZELLLINIE FM 3-13 IM VERGLEICH MIT TETANUSTOXOID..............................................................................................................................122 ABBILDUNG 35: ZYTOKINFREISETZUNG NACH T-ZELLSTIMULATIONEN MIT LYSATEN DER ZELLLINIEN SK-BR3, MCF-7 UND FM 3-13 IM VERGLEICH MIT TETANUSTOXOID ............................................123 ABBILDUNG 36: AUTOLOGE T-ZELLSTIMULATION MIT AUTOLOGEM TUMORZELL-LYSAT VON MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN IM VERGLEICH ZUR STIMULATION MIT TETANUSTOXOID ...........127 ABBILDUNG 37: T-ZELLSTIMULATION DURCH GEPULSTE MODC, WELCHE MIT TUMORZELL-LYSAT DER MAMMAKARZINOMZELLLINIE SK-BR3 BELADEN WURDEN, UND DURCH TLR-LIGANDEN ZUSÄTZLICH AKTIVIERT ....................................................................................................................130 ABBILDUNG 38: EFFEKT VON VERSCHIEDENEN TLR-LIGANDEN AUF DIE TH1/TH2-ZYTOKINPRODUKTION VON MODC UND T-ZELLEN MIT UND OHNE TUMORANTIGENSTIMULATION .....................................131 ABBILDUNG 39: DIE EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON N=11 TUMORZELLPRÄPARATIONEN AUS MAMMAKARZINOMEN, IM VERGLEICH ZU DENEN DER MAMMAKARZINOMZELLLINIEN MCF-7 UND SK-BR3 SOWIE DER FIBROBLASTENZELLLINIE Ftde. ................................................................134 IV TABBELENSVERZEICHNIS Tabellenverzeichnis TABELLE 1: FLUROCHROM-MARKIERTE MONOKLONALE ANTIKÖRPER (MAUS-α-HUMAN) UND LEBEND-TOT-FARBSTOFF PROPIDIUM IODIDE. .................................................................................. 26 TABELLE 2: FLUSSRATEN, ZENTRIFUGATIONSGESCHWINDIGKEITEN UND VOLUMINA DER FRAKTIONEN 1–5 WÄHREND DER ELUTRIATION................................................................................. 38 TABELLE 3: VERHÄLTNISSE VON MODC ZU LYSIERTEN TUMORZELLEN IM SPEZIFISCHEN T-ZELLPROLIFERATIONSTEST. ........................................................................................................... 49 TABELLE 4: VERWENDETE FLUOROCHROME UND IHRE ABSORPTIONS- UND EMMISSIONSMAXIMA............. 53 TABELLE 5: DIE KLINISCHE AUSWERTUNG DER ANALYSIERTEN responder- UND non-responderPATIENTINNEN ................................................................................................................................... 83 TABELLE 6: FREISETZUNG DER TH1/TH2-ZYTOKINE in vitro DURCH IMMUNZELLEN VON PATIENTINNEN ... 90 TABELLE 7: FREISETZUNG DER TH1/TH2-ZYTOKINE IN VITRO DURCH IMMUNZELLEN VON GESUNDEN SPENDERINNEN ................................................................................................................................. 90 TABELLE 8: ZYTOKINSEKRETION NACH KULTURMODELL (2) VON PATIENTINNEN .................................... 103 TABELLE 9: ZYTOKINSEKRETION NACH KULTURMODELL (2) VON SPENDERN ........................................... 103 TABELLE 10: ZYTOKINSEKRETION DER TH1/TH2-ZYTOKINE AUS EINEM AUTOLOGEN LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST MIT AUTOLOGEM TUMORZELL-LYSAT (IN VERSCHIEDENEN KONZENTRATIONEN) ODER MIT TETANUSTOXOID GEPULSTEN MODC VON N=4 MAMMKARZINOMPATIENTINNEN ..................................................................................................... 128 TABELLE 11: ZYTOKINPRODUKTION IN pg/ml VON MODC UND T-ZELLEN MIT UND OHNE TUMORANTIGENSTIMULATION UND VERSCHIEDENEN TLR-LIGANDEN............................................ 132 TABELLE 12: PROZENTZAHL POSITIVER ZELLEN DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON N=11 TUMORZELLPRÄPARATIONEN AUS MAMMAKARZINOMEN, DER FIBROBLASTENZELLLINIE FTDE, DER MAMMAKARZINOMZELLLINIEN MCF-7 UND SK-BR3 SOWIE DER MITTELWERTE VON N=11 MAMMAKARZINOMEN. .................................................................................................................... 135 TABELLE 13: MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN MIT ANGABEN ZUM PRIMÄRSTADIUM, METASTASIERUNG ZUM ZEITPUNKT DER MESSUNG DER IL-10-KONZENTRATION IM SERUM. ......... 138 V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis Ag Antigen(e) Ak Antikörper APC antigenpräsentierende Zellen APC Allophycocy ATCC American type culture collection BCG Bacille Calmette-Guerin BrdU Bromdesoxyuridin BSA bovine serum albumin °C Grad Celsius CBA cytometric bead array CD cluster of differentiation cm Centimeter cpm counts per minute CTL zytotoxische(r) T-Lymphozyt(en) COX2 Cyclooxygenase2 CR complete remission DAPI 4-Diamino-2-phenylindol-dihydrochlorid DC Dendritische Zelle(n) DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dpm disintegrations per minute DTH delayed-type hypersensitivity EDTA Ethylen-diaminotetraacetat FACS fluorescence-activated cell sorter (Durchflußzytometer) FcR Fc-Rezeptor von Immunglobulinen FCS fetales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC forward scatter g Gramm VI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS g Gravitation (9,81 m/s2) GM-CSF granulocyte-monocyte colony stimulating factor HLA Humanes Leukozytenantigen (Histokompartibilitätsantigen) HSA human serum albumin HuS Humanserum ICAM-1 intracellular adhesion molecule-1 IDC interdigitierende retikuläre dendritische Zelle(n) iDC immature Dendritische Zelle(n) IFN Interferon (α, β, γ) Ig Immunglobulin(e) IL Interleukin(e) KanS Kaninchenserum l Liter LAK-Zelle lymphokinaktivierte Killerzelle(n) Lf Flockungseinheiten; nach Verabreichung einer Impfdosis 0,4 ml Tetanustoxoid im Meerschweinchen wird ein TetanusAntitoxintiter von 2 IE/ml Serum induziert LFA Leukozytenfunktionsantigen LPS Lipopolysaccharide µ- mikro M Molar MФ Makrophage(n) MACS magnetic cell sorting mAk monoklonale(r) Antikörper MAP mitogen-activated protein mDC mature Dendritische Zelle(n) MFI mittlere Fluoreszenzintensität mg Milligramm MHC major histocompatibility complex min Minute (n) ml Milliliter VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS MoDC monocyte-derived dendritic cells MW Molekulargewicht NK-Zelle natürliche Killerzelle(n) OD optische Dichte p piko PAMP pathogen-associated molecular pattern PBMNL periphere Blut-Mononukleäre-Leucozyten PBS phosphate buffered saline PD progression disease PE Phycoerythrin PE-Cy5 Phycoerythrin und Cyanine 5 PerCP Peridiniumchlorophyll PGE2 Prostaglandin E2 PHA Phytohämagglutinin PI Propidium Iodide Poly I:C polyinosin-polycytosin PR partial remission PRR pattern-recognition receptors RFI relative Fluoreszenzintensität rh rekombinant human rpm rounds per minute RT Raumtemperatur SD stable disease SSC side scatter TAA tumorassoziierte Antigene TAP transporters associated with antigen processing TC tissue culture ok TCA Trichloressigsäure TCR T-Zell-Rezeptor TH1, 2 T-Helfer-Zellen, Subpopulation1 und 2 TLR Toll-like-Rezeptor(en) VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS TIL tumorinfiltrierende Lymphozyten TNF Tumor-Nekrose-Faktor (α, β) Treg-Zelle regulatorische T-Zelle(n) Triple-Mix 100 U/ml IL-4, 100 U/ml GM-CFS, 50 U/ml INF-γ TRIS Trihydoxymethylaminomethan TT Tetanustoxoid U units (Einheiten) (v/v) Volumenanteil pro Volumen VEGF vascular endothelial growth factor (w/v) Gewichtsanteil pro Volumen IX EINLEITUNG 1 Einleitung Das Immunsystem ist ein hoch differenziertes Organsystem, welches in der Lage ist, den Organismus sowohl spezifisch als auch unspezifisch gegen fremde Antigene zu schützen. Es wird in zwei funktionelle Untereinheiten, das angeborene und das adaptive Immunsystem, unterteilt. Die angeborene Immunität ist ein unspezifischer Schutz gegen Krankheitserreger. Während die angeborene Immunität (z. B. Makrophagen, natürliche Killerzellen, Komplement) beim ersten Kontakt mit einem fremden Antigen (Ag) reagieren können, muss das adaptive Immunsystem (z. B. Lymphozyten) erst aktiviert werden. Eine adaptive Immunantwort beginnt mit der Aufnahme und Prozessierung eines Antigens durch antigenpräsentierende Zellen (APC). Diese präsentieren das Antigen in Form von Peptiden auf dem major histocompatibility complex (MHC-Komplex). Naive T-Zellen binden in den sekundären lymphatischen Organen (z. B. Lymphknoten, Milz) mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) an diesen MHC-AntigenKomplex. Zur vollständigen Aktivierung der T-Zellen ist außerdem eine Interaktion zwischen dem Differenzierungscluster (CD) CD28 auf den T-Zellen und dem CD80 und CD86 auf den professionellen APC erforderlich. Nur bei erfolgter Costimulation kommt es zu einer Proliferation und Differenzierung der T-Zellen zu Effektorzellen (T-Helferzellen oder zytotoxische T-Zellen). Fehlt ein Signal, können die T-Zellen anerg werden. Die Effektorzellen verlassen die lymphatischen Organe und wandern ins Gewebe aus. Zytotoxische T-Zellen (CTL) vernichten infizierte und entartete Zellen mittels Perforin. T-Helferzellen (TH-Zellen) sind an der Proliferation und + Differenzierung der CD8 -Zellen zu CTL und der B-Zellen zu antikörpersezernierenden Plasmazellen nach Antigen-Kontakt beteiligt. Die sezernierten Antikörper (Ak) bewirken u. a. eine antigenspezifische Phagozytose von Makrophagen (MΦ) und neutrophilen Granulozyten sowie eine antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Aktivierte TH-Zellen sezernieren Zytokine, welche wiederum NK-Zellen und Makrophagen aktivieren können. So wird das angeborene Immunsystem durch die Aktivierung des adaptiven Immunsystems ebenfalls stimuliert. 1 EINLEITUNG 1.1 Dendritische Zellen 1.1.1 In vivo und in vitro Dendritische Zellen (DC) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Sie wurden von STEINMAN UND COHN erstmals 1973 in murinen Lymphknoten sowie der Milz als lang gestreckte Zellen mit Ausläufern beschrieben. DC sind die Hauptregulatoren des adaptiven Immunsystems und in der Lage, naive T-Zellen zu stimulieren (BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998). Sie stammen von pluripotenten Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ab und gelangen über das Blut in fast alle Organe (z. B. Epidermis der Haut, Lunge, Verdauungstrakt, Leber, Herz), wo sie als unreife DC (immature DC (iDC)) vorkommen. Dort nehmen sie Antigene durch Pinozytose, Phagozytose und Makropinozytose auf (FILGUEIRA ET AL., 1996; RITTIG ET AL., 1998) und prozessieren diese. Sie verfügen aber über nur geringe T-zellstimulierende Fähigkeiten. iDC besitzen eine hohe Endozytosekapazität und exprimieren geringere Mengen MHC- und costimulatorische-Moleküle. Nach einem Antigenkontakt oder der Aktivierung durch inflammatorische Stimuli wandern die iDC aus dem Gewebe aus und migrieren über die afferenten Lymphbahnen in Form von so genannten Schleierzellen (veiled cells) zu den regionalen Lymphknoten. Dort entwickeln sie sich zu interdigitierenden Retikulumzellen (IDC), treten in den T-Zellarealen mit T-Zellen in Kontakt und lösen eine Immunantwort aus (STEINMAN, 1991; CELLA ET AL., 1997). Zu diesem Zweck differenzieren die iDC zu reifen DC (mature DC (mDC)). Hier verlieren sie ihre Fähigkeit, Antigene aufzunehmen, regulieren MHC-Moleküle und costimulatorische Moleküle hoch und erwerben so die Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Eine mDC ist in der Lage, mehrere tausend T-Zellen zu stimulieren, wobei sich stabile Cluster zwischen DC und den T-Zellen bilden (BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998). In den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt, um aus CD34+-Vorläuferzellen (aus dem Knochenmark oder aus Nabelschnurblut) beim Menschen dendritische Zellen zu gewinnen (REID ET AL., 1992; CAUX ET AL., 1992). Bei gesunden Menschen sind 0,5-1,5 % der peripheren mononukleären Blutzellen zirkulierende dendritische Zellen (SANTINI UND BELARDELLI, 2003). Die Anzahl der zu isolierenden DC aus dem Blut wäre für die klinische Anwendung einer Immuntherapie damit viel zu gering. Seit 1987 2 EINLEITUNG wurden in-vitro-Verfahren zur Herstellung von DC aus Monozyten entwickelt. Die Arbeitsgruppe um Prof. Peters beschrieb bereits zu diesem Zeitpunkt, dass durch die Kultivierung von peripheren Blutmonozyten unter serumfreien Bedingungen ohne Zytokine innerhalb von 8 Tagen veiled cells entstehen. Diese Zellen wiesen eine erhöhte stimulatorische Kapazität für T-Zellen sowie eine erhöhte Expression von HLA-DR auf (PETERS ET AL., 1987). IL-4 induzierte eine Suppression von CD14 auf Monozyten und durch GM-CSF konnte die Expression von CD1a auf Monozyten induziert werden (RUPPERT ET AL., 1991; KASINRERK ET AL., 1993). Damit konnte gezeigt werden, dass Monozyten aus dem peripheren Blut unter Einfluss von IL4 und GM-CSF zu iDC differenzieren (PETERS ET AL., 1993, 1996; SALLUSTO UND LANZAVECCHIA, 1994). Zusatz von IFN-γ konnte eine in-vitro-Differenzierung zu unreifen dendritischen Zellen mit einer erhöhten Expression von HLA-DR und einer höheren akzessorischen Aktivität induzieren (PETERS ET AL., 1993; XU ET AL., 1995). Unreife MoDC, die zusätzlich mit TNF-α kultiviert wurden, exprimierten CD1a und CD83 höher und entsprachen somit phänotypisch und morphologisch reifen dendritischen Zellen. Diese Zellen zeigten eine reduzierte Makropinozytose bei gleichzeitig erhöhter Expression der costimulatorischen Signale sowie eine stärkere T-zellstimulatorische Kapazität im Vergleich zu iDC (SALLUSTO UND ET AL., 1995; ZHOU TEDDER, 1996). In den folgenden Jahren wurde eine Vielzahl von Faktoren ermittelt, welche eine Reifung bei DC induzieren können. Durch die Aufnahme und Prozessierung bestimmter Antigene (z. B. nekrotische Tumorzellen), durch Bakterien oder Lipopolysaccharide (LPS), durch inflammatorische Zytokine (z. B. IL-1β, TNF-α, IL-6 und PGE2), durch den Liganden bestimmter Oberflächenmarker (z. B. CD40-Ligand) und durch virale Produkte (z. B. doppelsträngige RNA, Poly I:C) kann eine Reifung und Aktivierung der DC induziert werden (SOMERSAN ET AL., 2001; VERHASSELT ET AL., 1997; JONULEIT ET AL., 1997; CAUX ET AL., 1994; VERDIJK ET AL., 1999). Die funktionelle und phänotypische Reifung der DC ist dynamisch und bei den verschiedenen Stimuli unterschiedlich. Neben den phänotypischen Veränderungen während der Reifung der DC und der T-zellstimulatorischen Kapazität ist das ZytokinMikromilieu, welches von den DC produziert wird, von entscheidender Bedeutung für die Aktivierung von T-Zellen und der daraus resultierenden spezifischen Immunantwort. 3 EINLEITUNG 1.1.2 Aktivierung von dendritischen Zellen durch Toll-like Rezeptoren (TLR) und Polarisierung einer TH1/TH2-Immunantwort Zusätzlich zur Antigenerkennung erfolgt die Aktivierung des Immunsystems bzw. der dendritischen Zellen nach MATZINGER (1994) durch Gefahrensignale (danger signals). Diese Gefahrensignale (z. B. TNF-α, IL-1β oder CD40-Ligand) werden zum einen von Zellen unter Stressbedingungen oder bei Infektionen und Nekrosen freigesetzt. Zum anderen können diese Signale von so genannten pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) oder von viralen Faktoren ausgehen. Diese Signale werden nur von Bakterien oder Viren gebildet und nicht von körpereigenen Zellen. Sie sind somit ein ideales Ziel für die Initiation einer Immunreaktion (MEDZHITOV, 2001). PAMPs binden an pattern-recognition receptors (PRRs) (JANEWAY, 1989). Die Toll-like Rezeptoren (TLR) gehören in die Gruppe der PRRs. Zurzeit sind 11 TLR beschrieben. Bisher sind nicht zu allen TLR die Liganden bekannt. Eine Signaltransduktion nach Ligandenbindung findet bei einigen TLR nur dann statt, wenn sie untereinander Heterodimere bilden. Die Liganden für den TLR2 sind z. Β. Peptidoglycan von gram-positiven Bakterien und bakterielle Lipoproteine (SCHWANDNER ET AL., 1999; ALIPRANTIS ET AL., 1999). Der TLR2-Rezeptor bildet entweder mit dem TLR1 oder dem TLR6 ein Heterodimer und erhöht somit seine Spezifität für bestimmte Liganden. Das TLR2/TLR6Heterodimer bindet das mykoplasmale Lipoprotein MALP-2 (TAKEUCHI ET AL., 2001). Das komplette Repertoire an TLR-Heterodimeren ist ebenfalls noch nicht bekannt. Der TLR3 bindet doppelsträngige RNA (dsRNA), ein molekulares Muster von Viren. Ein synthetisches (ALEXOPOULOU Analogon ET AL., der dsRNA 2001; CHU ET AL., ist polyinosin-polycytosin (Poly I:C) 1999). Der humane TLR4 war der erste charakterisierte Toll-like Rezeptor. Er befindet sich vorwiegend auf Zellen des Immunsystems einschließlich Makrophagen und DC und hat die Funktion des Signaltransduktions-Rezeptors für LPS gram-negativer Bakterien (MEDZHITOV ET AL., 1997; HOSHINO ET AL., 1999). TLR5 ist in die Erkennung von Flagellin involviert und TLR7 und TLR8 detektieren einzelsträngige RNA (ssRNA) von ssRNA-Viren (HAYASHI AL., ET 2001; HEIL ET AL., 2004). Unmethylierte CpG-Motive von Bakterien-DNA werden von TLR9 und uropathogene Bakterien von TLR11 erkannt (HEMMI ET AL., 2000; ZHANG ET AL., 2004). Myeloide dendritische Zellen und MoDC exprimieren TLR2 und 4 EINLEITUNG TLR4, dagegen tragen plasmazytoide dendritische Zellen TLR7 und TLR9 (KADOWAKI ET AL., 2001; HORNUNG ET AL., 2002). Myeloide und plasmazytoide DC sind Subpopu- lationen dendritischer Zellen aus dem peripheren Blut. Plasmazytoide DC werden auch als lymphoide DC bezeichnet. Sie produzieren bei viralen Infektionen hohe Mengen an Typ I Interferone (IFN-α/β), hemmen damit die virale Replikation und induzieren eine adaptive Immunantwort (MCKENNA ET AL., 2005). Myeloide DC sind abhängig vom Pathogentyp in der Lage sowohl eine TH1- als auch eine TH2-Immunantwort zu induzieren. Unterschiedliche Aufgaben hinsichtlich der Bekämpfung von Pathogenen myeloider und plasmazytoider dendritischer Zellen induzieren unterschiedliche TLRExpressionen auf den beiden DC-Subpopulationen. Durch die Aktivierung der Signaltransduktion über TLR kommt es zu einer Induktion verschiedener Gene, welche die Funktion haben, eine Gefahrenabwehr zu induzieren. Dies erfolgt durch die Synthese proinflammatorischer Zytokine wie z. B. Interferon-α (IFN-α) oder Interferon-β (IFN-β), Tumornekrosefaktoren (TNF) und Interleukin-1 (IL-1) oder durch die Heraufregulation von MHC- oder costimulatorischen Molekülen. TLR aktivieren über NF-κB und MAP (mitogen-activated protein) die verschiedenen Gene. Ein TLR-Signal resultiert in der Aktivierung und Reifung der DC sowie in der Polarisierung einer TH1-Immunantwort bei der Übermittlung des Gefahrensignals an naive T-Zellen. TLR verursachen bei DC auch die Expression verschiedener Zytokine, wie z. B. die von IL-12, welches bei der TH-Zelldifferenzierung TH1-Effektorzellen induziert (SCHNARE ET AL., 2001). IL-12 ist ein TH1-polarisierendes Zytokin (TRINCHIERI, 1995). Es wird von DC nach Stimulation mit LPS, Poly I:C oder CD40-Ligand gebildet (MC MENAMIN ET AL., 1995; CELLA ET AL., 1996; CELLA ET AL., 1999). Keine IL-12-Produktion durch DC erfolgt nach Stimulation mit TNF-α, IL-1, Pilz- oder Nematoden-Produkten (D’OSTIANTI ET AL., 2000; WHELAN ET AL., 2000). Inflammatorische Zytokine induzieren im Unterschied zu den danger-Signalen auch eine Reifung der DC und führen zu einer klonalen Expansion von CD4+-T-Zellen, sie unterstützen aber weder eine TH1-noch eine TH2-Immunantwort (SPÖRRI UND REIS E SOUSA, 2005). Eine IL-12-Produktion durch DC kann mittels z. B. Prostaglandin E2 inhibiert werden. Dendritische Zellen, welche in Anwesenheit von PGE2 generiert wurden, unterstützen eine TH2-Immunantwort (KALINSKI ET AL., 1997). Nach der 5 EINLEITUNG Aktivierung und Reifung von DC mit TLR-Stimuli erfolgt die IL-12-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum von 8–16 Stunden (LANGENKAMP ET AL., 2000). Die im Anschluss folgende Aktivierung von TH1-Zellen resultiert in der Sekretion der TH1-Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-α durch die aktivierten T-Zellen. Von TH2-Zellen werden die Zytokine IL-4, IL-5, IL-13 und IL-10 gebildet. Das durch TH2-Zellen produzierte IL-10 kann wiederum die IL-12-Produktion durch DC inhibieren und damit eine TH1-Immunantwort inhibieren oder regulieren. Die Polarisierung wird verstärkt durch eine wechselseitige Inhibition von IFN-γ gegenüber TH2-Zytokine sowie IL-4 und IL-10 TH1-Zytokine inhibieren (MOSMANN, 1991; FIORENTINO ET AL., 1991). 1.1.3 Antigenprozessierung und -präsentation Je nach Art des Pathogens werden unterschiedliche Immunantworten initiiert. Viren und im Cytosol lebende Bakterien werden über MHC-Kl I auf APC präsentiert und durch die zelluläre Immunität mittels CTL bzw. TH1-Zellen bekämpft. Dagegen werden extrazelluläre Pathogene durch dendritische Zellen phagozytiert und über MHC-Kl II-Moleküle präsentiert. Diese Pathogene werden durch die humorale Immunität mit Hilfe der TH2-Zellen und die daraus resultierende gesteigerte Antikörperproduktion eliminiert. Im Cytosol oder im endoplasmatischen Retikulum (ER) der APC werden Proteine von intrazellulären Erregern durch Proteasen in Peptide fragmentiert. Ein ATP-abhängiger Peptidtransporter TAP (transporters associated with antigen processing) transportiert diese Peptide in das Lumen des ER. Dort werden diese an MHC-Kl I-Moleküle gebunden. Das nun vollständig gefaltete MHC-Kl I-Molekül und das Peptid verlassen das ER und werden an die Zelloberfläche der mit Viren oder Bakterien infizierten Zelle transportiert (JANEWAY, TRAVERS, WALPORT UND SHLOMCHIK, 2002). Dort binden CD8+-Zellen mit ihrem TCR an die MHC-Kl I-Peptidkomplexe. Durch das costimulatorische Signal mit der Bindung von CD28 an B7-Moleküle (CD86/80) werden die CD8+-T-Zellen aktiviert. CTL sind in der Lage, Zellen zu töten, welche das fremde Peptid präsentieren. Dendritische Zellen haben die Fähigkeit, exogene Antigene, welche über eine Rezeptorvermittelte Endozytose mittels clathrin-coated vesicels, dem Lektin DEC-205 oder 6 EINLEITUNG durch Phagozytose aufgenommen wurden, über MHC-Kl I zu präsentieren (crosspresentation) (RODRIGUEZ ET AL., 1999; BONIFAZ ET AL., 2004; STEINMAN ET AL., 1999). DC können infizierte Zellen oder Tumorzellen aufnehmen und diese als Antigenquelle verwenden (CARBONE UND HEATH, 2003; SIGAL ET AL., 1999). Diese exogenen Antigene können über einen TAP-unabhängigen Transportweg im Cytosol über den Endozytosepathway auf MHC-Kl I-Moleküle geladen werden. Sie können aber auch im Cytosol von Proteasomen zerkleinert und über einen TAP-abhängigen Transportweg an MHC-KL I im ER gebunden werden (TROMBETTA UND MELLMAN, 2005). Eine cross-presentation von Antigenen auf MHC-Kl I Molekülen kann ebenfalls durch die Ligand-Rezeptorbinung von CD40, durch die Aufnahme von apoptotischen Tumorzellen, durch die Bindung von Immunkomplexen und durch Hitzeschockproteine induziert werden (DELAMARRE ET AL., 2003; SAUTER ET AL., 2000; REGNAULT ET AL., 1999; SRIVASTAVA ET AL., 1998). Somit kann eine gegen den Tumor gerichtete CTL-Antwort nach der Aufnahme von bestimmten Tumorzellbestandteilen durch DC über den MHC-Kl I-Weg induziert werden. Durch Phagozytose werden extrazelluläre Pathogene in Vesikel aufgenommen. In Endosomen werden Antigene durch endosomale Proteasen in einzelne Peptide zerlegt. MHC-KL II-Moleküle werden durch die invariante Kette (li), welche die Peptidbindungsstelle blockiert, daran gehindert, bereits im ER Peptide zu binden. In angesäuerten Endosomen wird durch Proteasen (Cathepsin S) die invariante Kette von der Peptidbindungsstelle entfernt; HLA-DM unterstützt die Bindung des Peptids, welches zuvor in Endosomen abgebaut wurde, an das MHC-Kl II-Molekül (JANEWAY, TRAVERS, WALPORT UND SHLOMCHIK, 2002). Das MHC-Kl II-Molekül wird danach an die Zelloberfläche transportiert und dort von CD4+-Zellen erkannt. Diese TH1/TH2Zellen aktivieren andere Effektorzellen des Immunsystems, wie z. B. CTL, Makrophagen und B-Zellen, welche dann unterschiedliche Effektormechanismen zur Bekämpfung des extrazellulären Pathogens induzieren können. 1.1.4 Immunologische Effektorzellen und ihre Helferzellen Zellen des Immunsystems haben die Fähigkeit, zwischen selbst und fremd zu unterscheiden. Dieses Konzept des Unterscheidens erzeugt ein T-Zellrepertoire gegen fremde Antigene. 7 EINLEITUNG T-Helferzellen mit ihrem CD4-Rezeptor spielen eine Rolle bei der B-Zellaktivierung und bei der Aktivierung von CTL und NK-Zellen. TH1-Zellen vermitteln eine zelluläre Immunantwort, indem sie die Proliferation und Differenzierung von CTL durch die Sekretion der inflammatorischen Zytokine INF-γ, IL-2 und TNF-α unterstützen. Zytotoxische T-Zellen mit ihrem Rezeptor CD8 erkennen Antigene auf den Zielzellen, die über MHC-Kl I exprimiert werden. Sie sind in der Lage, körpereigene Zellen, welche eine Mutation erfahren haben oder durch ein Virus infiziert wurden, mittels Perforin, Granzym oder auch durch die Freisetzung von IFN-γ zu eliminieren. TH2Zellen induzieren eine humorale Immunantwort, indem sie B-Zellen durch die Zytokine IL-4, IL-6, IL-9 und IL-13 aktivieren und CTL durch das Zytokin IL-10 inhibieren. B-Zellen produzieren nach Antigen-Kontakt Antikörper und bewirken eine antigenspezifische und antikörperabhängige ADCC durch NK-Zellen. Gedächtniszellen haben die Eigenschaft, dass sie sich bei einem wiederholten Antigenkontakt sehr schnell teilen und somit Erreger in Zellen schneller eliminiert werden können. B-Gedächtniszellen sezernieren in kurzer Zeit verschiedene Isotypen von Antikörpern. CD4+- und CD8+-Gedächtniszellen werden auch als zentrale und EffektorGedächtniszellen bezeichnet. Diese beiden Populationen können wesentlich schneller und leichter aktiviert werden als naive T-Zellen und sind nicht zwingend auf costimulatorische Signale angewiesen (SCHMIDT UND MESCHER, 2002). Tumorzellen, welche keine costimulatorischen Signale, aber tumorspezifische Antigene tragen, können somit Gedächtniszellen aktivieren (BECKHOVE ET AL., 2004). NK-Zellen besitzen ebenfalls zytotoxische Eigenschaften und sezernieren Zytokine. Sie können virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen bei fehlender MHC-Kl I-Expression ohne weitere Aktivierung mittels Granzym und perforinhaltiger Granula lysieren und Apoptose induzieren. Bei einer ADCC eliminieren NK-Zellen die zuvor durch Antikörper opsonierten Zellen. In der adoptiven Immuntherapie bei Karzinomen kommen Effektorzellen bzw. zytotoxische Zellen zum Einsatz. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Effektorzellen ist die Bereitstellung ausreichend großer Mengen reaktiver Zellen. Eine dendritische Zelle ist in der Lage, 100–3.000 T-Zellen spezifisch zu aktivieren (BANCHEREAU 8 UND EINLEITUNG STEINMAN, 1998). Somit erscheint der Einsatz dendritischer Zellen innerhalb einer adoptiven Immuntherapie bei Karzinompatienten sinnvoll. 1.2 Das Mammakarzinom Brustkrebs ist weltweit der am häufigsten vorkommende Tumor bei Frauen. Allein in Deutschland erkranken jährlich mehr als 60 000 an Brustkrebs (SCHLESINGER-RAAB ET AL., 2005). Die Inzidenz des Mammakarzinoms steigt seit Ende der siebziger Jahre an, wohingegen die Mortalitätsrate sinkt (BURSTEIN UND WINER, 2003). Dieser Trend spiegelt wider, dass seit mehreren Jahren ein ausgedehntes screening durch Mammographie und ärztliche Untersuchungen stattfindet. Die sinkende Sterberate ist demnach vor allen dadurch zu erklären, dass durch die engmaschigen Kontrollen sehr viel mehr Frühstadien des Mammakarzinoms erkannt werden. Die häufigsten Risikofaktoren für die Entstehung des Mammakarzinoms sind das Alter, der endogene Hormonstatus bzw. Hormontherapien, benigne Brusterkrankungen, erbliche Faktoren, wie etwa eine BRCA1- oder BRCA2-Genexpression, sowie bestimmte Ernährungs- und Umweltfaktoren (ARMSTRONG ET AL., 2000). Mammakarzinome wer- den in zwei Hauptgruppen eingeteilt: in-situ-Tumore befinden sich in den Milchgängen oder Drüsen der Brust und haben nicht das umliegende Gewebe infiltriert (SCHNITT ET AL., 1988). Im Gegensatz dazu breiten sich invasive oder infiltrierende Tumore von den Milchgängen (duktal) oder den Drüsen (lobulär) in das umliegende Gewebe aus. Die häufigste Form des Brustkrebses (75 %) ist das invasiv duktale Mammakarzinom, die zweithäufigste das invasiv lobuläre Karzinom (BURSTEIN UND WINER, 2003). Mammakarzinome werden in verschiedene Stadien eingeteilt (stage I-IV). Diese richten sich nach der Tumorgröße (T), nach dem Ausmaß des Befalls der regionalen Lymphknoten durch den Tumor (N) und nach dem Vorkommen von Metastasen in anderen Organen (M) und werden mit der TNM-Klassifikation angegeben. Neben der Klassifikation und dem Tumorstadium sind eine Reihe von prognostischen und prädiktiven Faktoren für die nachfolgenden Therapien und die Lebenserwartung entscheidend. Die Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren auf den Tumorzellen gibt Aufschluss darüber, ob eine Hormontherapie bei dem betreffenden Tumor sinnvoll ist. Für das Mammakarzinom konnte nachgewiesen werden, dass c-erbB2 (HER2)-positive 9 EINLEITUNG Fälle ein besonderes Risikokollektiv darstellen, welches in der Krebsnachsorge besonders überwacht werden muss (MARX ET AL., 1990). Dieser prognostische Marker entscheidet darüber, ob eine monoklonale Antikörpertherapie (Trastuzumab) gegen das HER2-Protein gegeben werden kann. Zu den Standardtherapien beim Mammakarzinom gehören die chirurgische Tumorentfernung, Radio-, Hormon-, Chemo- und Immuntherapie. Die Therapie und Lebenserwartung variiert je nach Stadium der Erkrankung und der biologischen Heterogenität des Tumors. Zwar konnte in den letzten Jahren durch die Mammographie-screenings und durch die adjuvanten Therapien des Mammakarzinoms ein großer Fortschritt erzielt werden, jedoch zeigten die 2005 veröffentlichten Daten des Tumorregisters vom Tumorzentrum München, dass für das metastasierte Mammakarzinom bezüglich der Lebensverlängerung in den letzten 20 Jahren keine relevanten Fortschritte erzielt werden konnten (SCHLESINGER-RAAB ET AL., 2005; ENGEL ET AL., 2003; SCHUBERT-FRITSCHLE ET AL., 2004; HÖLZEL ET AL., 2004; ENGEL ET AL., 2003). Angesichts dieser Umstände rückt die Notwendigkeit nach mehr diagnostischen Verfahren und die Entwicklung neuer Therapieformen in den Vordergrund. Nachdem in den letzten Jahren bereits erste immuntherapeutische Ansätze bei der Behandlung von Tumoren durchgeführt wurden und der Schritt zur Standardtherapie für die Antikörpertherapie zum Teil vollzogen ist, sollten diese Therapieformen weiterentwickelt bzw. optimiert werden. 1.2.1 Tumorimmunologie und Tumorantigenität Bereits 1863 beobachtete Rudolf Virchow Leukozyteninfiltrationen in Tumoren; zum ersten Mal wurde ein Zusammenhang zwischen inflammatorischen Infiltraten und malignem Tumorwachstum festgestellt. Fast einhundert Jahre später postulierten Burnet und Thomas ihre Hypothese über die Existenz der immunologischen Überwachung von Tumoren (THOMAS, 1959; WEINSTOCK, 1984). Diese These kann mit den bis heute erlangten Erfahrungen belegt werden. Einer der Haupthinweise für das Existieren einer immunologischen Überwachung von Tumoren ist das Auftreten von Spontanremissionen, auch wenn diese nur sehr selten zu beobachten sind. Bis 1999 wurde in der internationalen Literatur bei 32 Mammakarzinompatientinnen eine Spontanremission beschrieben (LARSEN 10 UND ROSE, 1999). EINLEITUNG Ein weiterer Hinweis auf die Beteiligung des Immunsystems besteht darin, dass bei immundefizienten Patienten, wie z. B. Transplantationspatienten, ein häufigeres Vorkommen an Krebserkrankungen festgestellt werden konnte (PENN, 1996; EUVRARD AL., ET 2003). Im Alter steigt die Inzidenz, ein Karzinom zu entwickeln mit einer sinken- den Funktion des Thymus und einem damit verbundenen reduzierten Vorkommen von naiven T-Zellen (HAKIM ET AL., 2004). Das Vorhandensein von Lymphozyten im Tumor kann ein positiver prognostischer Marker für das Überleben des Patienten sein und weist somit auf eine Beteiligung des Immunsystems hin (CLEMENTE ET AL., 1996). Solche Beobachtungen weisen darauf hin, dass Tumore immunogen wirkende Peptide tragen, gegen die eine tumorspezifische Immunantwort entstehen kann. Insgesamt unterscheidet man sechs verschiedene Gruppen von spezifischen Tumor-assoziierten-Antigenen (TAA), auch Tumorabstoßungsantigene genannt. Tumore tragen viele Mutationen bzw. Genumlagerungen. Diese Onkogene oder Tumorsuppressorgene zählen zu der ersten Gruppe der TAA. Durch die Mutationen entstehen veränderte Proteine, wie z. B. p53 beim Mammakarzinom, welches dann über MHCKl I präsentiert wird und eine Tumor-spezifische T-Zell-Antwort induzieren kann (GNJATIC ET AL., 1998; SVANE ET AL., 2004). Proteine, deren Gene normalerweise nur in männlichen Keimzellen (cancer-testis Antigene) exprimiert werden, gehören zu der zweiten Gruppe. MAGE ist eines dieser Antigene, es wird von Mammakarzinomen exprimiert und MAGE-Proteine können in vivo eine zytotoxische T-Zell-Antwort erzeugen (KUFER ET AL., 2002). In der dritten Gruppe von TAA sind Differenzierungsantigene zusammengefasst. Dies sind Antigene, welche erst zu einem späteren Zeitpunkt und in differenzierten normalen Geweben auftreten. NY-BR-1 ist ein Differenzierungsantigen der Mamma. Es ist in normalem Mamma- und Testisgewebe und in über 70 % der Mammakarzinome, nicht aber in anderen Tumoren exprimiert (JAGER ET AL., 2005). CEA ist ein embryonal-fetales Antigen und erscheint zu einem ontogenetisch falschen Zeitpunkt auf der Zelle (TESSERA ET AL., 1988). Es ist auf 50 % der Mammakarzinome exprimiert und kann eine CTL- und Antikörper-vermittelte Immunantwort induzieren (SCHLOM ET AL., 1996). HER-2/neu (c-Erb-2) ist ein spezifisches Antigen des Mammakarzinoms, welches im Vergleich zu normalen Zellen in den Tumorzellen stark überexprimiert ist. HER-2/neu-Peptide induzieren häufiger eine Antikörper-vermittelte 11 EINLEITUNG Immunität als eine T-Zell-vermittelte Immunität, welche zusätzlich nur kurze Zeit anhält (KNUTSON ET AL., 2002). HER-2/neu-Peptide besitzen eine höhere Affinität zu KlasseII-Allelen (SALAZAR ET AL., 2003). Ein Vertreter der fünften Gruppe ist das MUC-1, welches ebenfalls auf Mammakarzinomzellen exprimiert ist. MUC-1-Epitope können CTL stimulieren (GOYDOS ET AL., 1996). Sie gehören zu den Antigenen, welche nach der Translation eine anormale Modifikation erfahren haben. Virale Onkogene bilden die letzte Gruppe der TAA und sind Virusproteine, welche eng mit der Onkogenese assoziiert sind. Diese Virusproteine werden vom Immunsystem als fremd erkannt und können eine T-Zell-Antwort induzieren. Für das humane Mammakarzinom wurden bisher keine viralen Onkogene beschrieben. TAA, welche auf vielen Mammakarzinomen vorhanden und in der Lage sind, die Immuntoleranz zu durchbrechen, sind somit geeignete Antigene für die Herstellung von Tumorvakzinen. Durch diese Antigene können sowohl in vitro als auch in vivo Immunreaktionen gegen den Tumor ausgelöst werden. Ziel einer Immuntherapie sollte es sein, diese Induktion einer Immunantwort gegen einen Tumor zu nutzen bzw. zu verstärken. 1.2.2 Zelluläre Immuntherapien und Vakzinierungsstrategien Trotz einer Fülle an Therapien zeigten die konventionellen Behandlungsformen bislang vor allen Dingen beim metastasierten Mammakarzinom keinen wesentlichen Einfluss auf die Lebensverlängerung. Aus diesem Grund und durch die zuvor schon erwähnte Beteiligung des Immunsystems bei der Überwachung von Tumoren zielen neuere Strategien darauf ab, das patienteneigene Immunsystem für therapeutische Zwecke zu aktivieren. In den vergangenen Jahren wurde bereits mit unterschiedlichem Erfolg versucht, diverse immunologische Therapien zu etablieren. Zu diesen immuntherapeutischen Maßnahmen zählt die aktiv unspezifische Immuntherapie, bei dieser wird das lymphozytäre System direkt zu einer unspezifischen Abwehrreaktion stimuliert. Mammakarzinompatientinnen mit einer fortgeschrittenen Erkrankung wurden dazu mit Mikroorganismen wie Bacille Calmette-Guerin (BCG) im Vergleich zur Chemotherapie behandelt. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied im progressionsfreien Intervall, aber im Vergleich waren 21,8 % der Patientinnen unter BCG und 57 % der Patientinnen unter der Chemotherapie progredient (SERROU ET AL., 12 EINLEITUNG 1982). Ein signifikanter Unterschied im progressionsfreien Überleben wurde bei der Behandlung von Mammakarzinompatientinnen mit BCG in Kombination mit einer Chemotherapie im Vergleich zur Chemotherapie allein in einer randomisierten Studie gefunden (BUZDAR ET AL., 1984). Bei einer aktiv spezifischen Immuntherapie wurde versucht, durch wiederholte Injektion autologer oder allogener Mammakarzinomzellen mit und ohne Adjuvans eine spezifische Immunreaktion gegen Tumor-assoziierte Antigene zu induzieren. Mammakarzinompatientinnen wurden mit Newcastle disease virus (NDV) modifizierten und bestrahlten autologen Tumorzellvakzinen behandelt (AHLERT ET AL., 1997). Des Weiteren wurden allogene Mammakarzinomzellen mit B7.1 transfiziert, um so das fehlende costimulatorische Signal für eine direkte T-Zellaktivierung auf Tumorzellen zu ersetzen. 30 bereits vorbehandelte Stadium-IV-Mammakarzinompatientinnen wurden mit einer allogenen und mit CD80 transfizierten Zelllinie mit geringem Erfolg behandelt. Es konnte keine objektive Tumorregression, aber ein verlängerter stabiler Erkrankungsverlauf beobachtet werden (DOLS ET AL., 2003). Die Anwendung von genmodifizierten Tumorvakzinen war begrenzt, da Tumorzellen keine guten antigenpräsentierende Zellen sind und immunsupprimierende Substanzen sezernieren können (RIBAS ET AL., 2003). Für eine aktive tumorspezifische Immunisierung beim Mammakarzinom wurde mit tumorspezifischen Peptiden oder Proteinen, wie mit HER2/neu-Peptiden, vakziniert. Diese zeigten bei den Patientinnen zwar eine immunologische Reaktion, jedoch ohne klinischen Erfolg (BAXEVANIS ET AL., 2006). Eine passive spezifische Immuntherapie erfolgte mittels spezifischer, gegen Mammakarzinomzellen gerichteter, Antikörper oder mittels durch Mammakarzinomzellen aktivierter Effektorzellen. Eine bereits zu den Standardtherapien zählende Therapie beim metastasierten Mammakarzinom besteht in der Anwendung von Herceptin®. Trastuzumab (Herceptin®) ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität für das HER2-Protein. Es wird bei Mammakarzinompatientinnen mit einer Überexpression an HER2 auf den Tumorzellen angewendet. Diese Antikörpertherapie führt zur Opsonierung der Tumorzelle und in der Folge zur Lyse durch eine ADCC sowie zur Aktivierung des Komplementsystems (DILLMAN, 1999; BRODOWICZ ET AL., 13 EINLEITUNG 1997). Nach der Behandlung mit Herceptin® bei metastasierten Mammakarzinompatientinnen ohne vorhergehende Chemotherapie konnte eine response-Rate von 30–40 % erzielt werden (VOGEL ET AL., 1999). Eine response-Rate von 15–20 % konnte nach der Behandlung mit Herceptin® bei metastasierten Patientinnen, welche zuvor unter einer Chemotherapie progredient waren, erreicht werden (COBLEIGH ET AL., 1999). Diese Immuntherapie kann somit bei Patientinnen mit einer metastasierten Erkrankung zu einer Tumorrückbildung führen. Da nicht alle Mammakarzinome HER2 überexprimieren, findet diese Therapie nur bei einem bestimmten Teil der Patientinnen Anwendung. Wegen der klonalen Selektion von Tumorzellen sollte Herceptin® auch mit anderen Therapien kombiniert werden. Eine adoptive Immuntherapie beinhaltet die Übertragung einer Immunität oder Tumorresistenz von einem Individuum auf ein anderes (ROIT, 1993). Dies kann durch die Gabe von z. B. T-Lymphozyten, Interleukinen, Interferonen oder heterogenen Immungemischen aus Frischzellen erfolgen. Ebenfalls gehört dazu die Isolierung, Expansion und Rückübertragung autologer Tumor-spezifischer T-Zellen (PARMIANI ET AL., 2003). Bei Mammakarzinompatientinnen konnte mit autologen Tumor-spezifischen T-Zellen durch eine intratumorale Gabe, welche zuvor 2 Wochen in vitro mit IL-2 und den autologen Tumorzellen stimuliert wurden, eine response-Rate von 58,3 % (Partialremission und stabile Erkrankung) erzielt werden. Dagegen induzierten nichtspezifische intravenös applizierte LAK/NK-T-Zellen lediglich eine response-Rate von 18,2 % (TOH ET AL., 2003). Die Gabe allogener T-Zellen bei austherapierten Mammakarzinompatientinnen nach allogener Stammzelltransplantation vom selben Spender, von dem auch die T-Zellen isoliert wurden, konnte eine objektive Tumorregression in 6 von 16 Fällen erzielt werden (BISHOP ET AL., 2004). Ein Problem bei der Therapie mit responder-Zellen ist, Zellmengen in genügend hoher Anzahl zur Verfügung zu stellen und diese über längere Zeiträume verfügbar zu haben. Bei derzeitigen Therapien finden auch Zytokine als Aktivatoren der eigenen AntiTumor-Immunreaktion bei Krebspatienten ihre Anwendung. Zytokine werden als Adjuvans einer Anti-Tumor-Immunreaktion zur Verstärkung der Antigenpräsentation und Stimulation der adaptiven Immunität über die Expansion spezifischer T-Zellen verwendet. Die Gabe von IL-2 kann einerseits eine Verstärkung der Tumor-spezifischen T- 14 EINLEITUNG Zell-Antwort bewirken, andererseits aber auch regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) zur Proliferation anregen (ROSENBERG ET AL., 1999; AHMADZADEH UND ROSENBERG, 2006). Treg-Zellen sind T-Zellen, die eine Immunantwort hemmen können, indem sie Aktivität und Funktion anderer Zellen beeinflussen (SHEVACH, 2004). Daher ist die Verwendung von IL-2 genauestens abzuwägen. GM-CSF wird als Adjuvans bei verschiedenen Vakzinierungsstrategien oder als alleinige Anti-Tumortherapie verwendet. Es induziert eine verstärkte Antigenpräsentation über die Expansion und Differenzierung von Monozyten und dendritischen Zellen in vivo (BORRELLO ET AL., 2002). Durch eine gering dosierte GM-CSF-Therapie konnte bei 19 metastasierten Mammakarzinompatientinnen eine objektive response von 37 % (1 Komplettremission, 6 Partialremissionen und 4 stabile Erkrankungen) erzielt werden, bei einer response-Dauer im Median von 6 Monaten (KURBACHER ET AL., 2005). Die Population der dendritischen Zellen im peripheren Blut kann durch die Behandlung mit FLT3-L (fms-freisetzende Tyrosinkinase-3-Ligand) erhöht werden (BANCHEREAU UND PALUCKA, 2005). Die Anwendung von FLT3-L in Kombination mit GM-CSF oder CpG-Oligonukleotiden führt zu einer vermehrten Ausschüttung, Reifung und Aktivierung von DC in vivo und somit zu einer verstärkten Anti-Tumor-Immunität (WALLER UND ERNSTOFF, 2003; CHEN ET AL., 2005). Ein wesentliches Problem der Zytokintherapien sind die nicht unerheb- liche systemische Toxizität und die auftretenden Nebenwirkungen, wie Fieber und Kreislaufdysregulationen. Daher sind diese Therapien nur anwendbar, wenn die verwendeten Zytokine auch in niedrig dosierten Konzentrationen eine Wirkung zeigen. In den letzten Jahren hat die Möglichkeit der ex-vivo-Generierung großer Mengen dendritischer Zellen zu einer intensiven Testung der DC in vorklinischen Modellen und in Phase-I bis -III-Studien bei unterschiedlichen Karzinomentitäten geführt. Dabei wurden für die Antigenpräsentation der DC verschiedene Antigenbeladungsprozeduren verwendet. Dendritische Zellen sind in der Lage über Makropinozytose spezifische Tumorantigene aufzunehmen und diese über MHC-Kl II-Moleküle auf ihrer Oberfläche zu präsentieren. Weiterhin können DC mit Immunkomplexen, welche tumorspezifische Antigene beinhalten, über den Fcγ-Rezeptor beladen werden (REGNAULT ET AL., 1999). Tumorspezifische Antigene können auch über eine Kopplung an einen DC-spezifisch bindenden Antikörper mittels einer Rezeptor-vermittelten Phagozytose aufgenommen 15 EINLEITUNG und präsentiert werden (GILBOA, 1999; FONG UND ENGLEMAN, 2000). Sie werden exogen mit HLA-bindenden tumorspezifischen Peptiden beladen. DC können aber auch mit der DNA von tumorspezifischen Antigenen über viralen Vektoren beladen werden (RIBAS ET AL., 2002). mRNA, welche zuvor aus Tumorzellen isoliert wurde, kann mittels Elektroporation in DC gebracht werden und führt zur Produktion und Präsentation tumorspezifischer Proteine (BOCZKOWSKI ET AL., 1996). Verschiedene Methoden der Beladung mit nicht definierten Tumorantigenen wurden ebenfalls durchgeführt. Mammakarzinomzellen wurden mit DC fusioniert, in Anlehnung an die Herstellung von Hybridomen, um so das gesamte Tumorantigenrepertoire für die Antigenpräsentation auf DC bereitzustellen (AVIGAN ET AL., 2004). Wie bereits zuvor erwähnt präsentieren DC Peptide von zuvor phagozytierten nekrotischen oder apoptotischen Tumorzellen, welche auch als Tumorzell-Lysate bezeichnet werden und aus dem kompletten Proteingemisch einer Tumorzelle bestehen (SAUTER ET AL., 2000; ALBERT ET AL., 1998). Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden nur wenige vorklinische und Phase-I/II-Studien mit antigenbeladenen dendritischen Zellen bei metastasierten Mammakarzinompatientinnen durchgeführt. Eine Ursache könnte in der Verfügbarkeit von autologen Tumorgeweben bzw. an den begrenzt bekannten tumorspezifischen Antigenen liegen. Da die Primäroperation bei den Patientinnen oft sehr lang zurückliegt bzw. die Patientinnen im metastasierten Stadium mit Knochen-, Lungen-, Leber- oder zerebralen Metastasen nicht mehr operiert werden bzw. eine Operation sehr schwierig wäre, ist die Gewinnung von autologem Tumorgewebe limitiert. Erste vorklinische Studien haben gezeigt, dass DC in der Lage sind, auch in vivo durch eine intratumorale Injektion der DC Tumorantigene aufzunehmen (RIBAS ET AL., 2002). In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass mit diesen Methoden (in vivo-priming) der Antigenbeladung von DC eine detektierbare T-Zellaktivierung gegen den Tumor induziert werden kann. Diese tumorspezifische T-Zellaktivierung führte bei Patienten mit einem Lymphom, Myelom, Melanom, Neuroblastom, Nierenzell-, Blasen-, Prostataoder Colonkarzinom zu einer klinischen response (RIBAS ET AL., 2003). In jeweils einer Phase-I/II-Studie wurden Mammakarzinompatientinnen mit dendritischen Zellen, welche mit HER2/neu- und MUC-1-Peptiden beladen wurden, 16 EINLEITUNG behandelt. In beiden Studien konnte eine immunologische Reaktion, mittels DTH (delayed-type hypersensitivity) und durch den Nachweis Peptid-spezifischer T-Zellen gegen die beiden Peptide gezeigt werden (PECHER ET AL., 2002; BROSSART, 2002). Eine klinische Reaktion wurde lediglich in einer mit HER2/neu-Peptiden durchgeführten Studie beschrieben. Bei einer von sechs behandelten Patientinnen im metastasierten Stadium konnte für 6 Monate ein stabiler Erkrankungsverlauf erzielt werden. Drei Patientinnen mit einem Hoch-Risiko-Mammakarzinom erfuhren in einer follow-up-Zeit von 2,5 Jahren kein erneutes Auftreten des Tumors (MORSE ET AL., 2003). In einer weiteren Phase-I Pilotstudie wurden progrediente, metastasierte Patientinnen mit dendritischen Zellen, welche mit drei verschiedenen p53-Peptiden beladen wurden, behandelt. Ein stabiler Erkrankungsverlauf konnte bei zwei von sechs Patientinnen, eine gemischte response bei einer Patientin und eine transiente Remission einer Lymphknotenmetastase bei einer weiteren Patientin beobachtet werden (SVANE ET AL., 2004). Mit einer Fusionsvakzine aus autologen Tumorzellen und dendritischen Zellen wurden 16 metastasierte Mammakarzinompatientinnen behandelt. Bei drei Patientinnen wurde eine klinische objektive response festgestellt. Eine Patientin hatte eine komplette Remission bis zu 24 Monate nach Abschluss der Therapie. Die zweite Patientin hatte für 6 Monate eine partielle Remission, danach wurde sie wieder progredient. Ein stabiler Erkrankungsverlauf konnte bei der dritten Patientin für 5 Monate erreicht werden, auch diese wurde danach wieder progredient (AVIGAN ET AL., 2004). Auf Peptiden basierende Vakzinen haben den Vorteil, dass diese Antigene direkt auf die hierfür restringierten HLA-Moleküle geladen werden können und somit eine nachweisbare spezifische T-Zellantwort induziert werden kann. Ein wesentlicher Nachteil ist, dass einzelne tumorspezifische Antigene nicht zu 100 % auf allen Zellen des Tumors vertreten sind. Bei der Verwendung von ganzen Tumorzellen werden dagegen multiple Antigene der Zelle verwendet, auch diejenigen Antigene, welche zu diesem Zeitpunkt noch nicht identifiziert wurden. Die größte Herausforderung bei der Verwendung von autologen Tumorzellen ist, diese in genügend großer Anzahl zu gewinnen. Wie bereits erwähnt, können beim Mammakarzinom nur begrenzt Tumorzellen aus z. B. Pleuraflüssigkeiten, Aszites, Lymphknoten und Weichteilläsionen gewonnen werden. Fein- 17 EINLEITUNG nadelbiopsien und Tumorgewebe unter 1 cm3 sind nicht ausreichend für die Gewinnung von Mammakarzinomzellen zu Vakzinierungszwecken. Eine weitere Möglichkeit ist die intratumorale Injektion von unbeladenen dendritischen Zellen, wodurch das gesamte Tumorantigenrepertoire in vivo genutzt werden kann. In einer Pilotstudie konnte durch die intratumorale Applikation dendritischer Zellen in subkutane Tumoren bei 2 von 3 behandelten Mammakarzinompatientinnen eine Remission der jeweilig behandelten Läsionen beobachtet werden (TRIOZZI ET AL., 2000). YU ET AL., (2004) können diese klinischen Beobachtungen mit ihren in-vitro- Ergebnissen begründen. Sie konnten zeigen, dass eine TAA-spezifische T-Zellaktivierung außerhalb von Lymphknoten und innerhalb des Tumors möglich ist. Bei den meisten durchgeführten Studien wurden die dendritischen Zellvakzinen gut toleriert und es konnten keine Anzeichen auf Toxizität oder Autoimmunerkrankungen festgestellt werden. In einer Studie in der 91 Melanompatienten mit Tumorzell-Lysat und GM-CSF oder mit synthetischen Peptiden und GM-CSF gepulsten dendritischen Zellen sowie mit IL-2 behandelt wurden, entwickelten 7 % der Patienten eine Vitiligo und ein Patient bekam eine transiente Diabetes (CHIANESE-BULLOCK ET AL., 2005). In einer weiteren Studie, in der Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie behandelt wurden, konnte nach der Behandlung mit dendritischen Zellen bei einem Patient eine Exembildung und ein Titeranstieg eines Antinukleo-Faktors beobachtet werden, was eventuell auf die Induktion einer Autoimmunität hinweisen könnte (RODDIE ET AL., 2006). In den Studien mit dendritischen Zellen wurde insgesamt von nur wenigen oder moderaten Nebenwirkungen berichtet. 1.2.3 Immun-escape-Mechanismen Um einer gegen den Tumor gerichteten Immunreaktion zu entgehen, entwickeln Tumore immunsuppressive Netzwerke. Eine Ursache dafür, dass Immuntherapien bei Tumoren in fortgeschrittenen Stadien nur eine geringe klinische Effektivität induzieren, kann in der Entwicklung von Strategien liegen, mit denen sich der Tumor einer tumorspezifischen Immunität entzieht. In den letzten Jahren wurden viele dieser Faktoren und Mechanismen untersucht, identifiziert und Zusammenhänge zwischen den einzelnen escape-Mechanismen hergestellt. 18 EINLEITUNG Eine geringe Immunogenität des Tumors ist nicht nur allein durch die Expression vieler Selbstantigene gegeben, sondern kann auch durch einen escape-Mechanismen aktiv induziert werden. Das Stroma von Tumoren ist in der Lage, die effiziente Freisetzung von antigenen TAA zu verhindern, und erzeugt somit aufgrund der niedrigen Antigenkonzentrationen eine Ignoranz dieser Antigene innerhalb der Lymphknoten. Kommt es durch eine spätere Metastasierung zu einer verstärkten Freisetzung der antigenen TAA, so wird eine TAA-spezifische Immunreaktion induziert (ZOU, 2005). Tumoren schaffen sich somit für ihre jeweilige Situation ihr eigenes Mikromilieu, um einer Immunattacke zu entgehen. Andere direkt von den Tumorzellen ausgehende Mechanismen sind der MHC-Verlust, fehlende costimulatorische Moleküle sowie eine verhinderte Antigenprozessierung (GUDMUNDSDOTTIR ET AL., 2000; FAN ET AL., 2002; PAWELEC ET AL., 1997). Mutationen bei Tumorzellen im Antigenprozessierungs-pathway, etwa beim TAP-Transporter oder an Bestandteilen der Proteasomen, führen zu einer kompletten Resistenz der Tumorzellen gegen CD8+-T-Zellen, welche durch andere immunologische Maßnahmen nicht revidierbar ist (PAWELEC ET AL., 1997; MARINCOLA ET AL., 2000). Das TAA GA733-2, welches auf Mammakarzinomen exprimiert wird, kann über Präsentation auf MHC-Kl II die CD4+-T-Zellaktivierung blockieren und somit eine THelferzell-vermittelte Immunreaktion gegen dieses TAA verhindern (GUTZMER ET AL., 2004). Einen weiteren wichtigen von der Tumorzelle selbst induzierten escapeMechanismus stellt die Sezernierung von suppressiven Zytokinen dar. Durch diese Zytokine treten in der Folge weitere multifaktorielle, supprimierende Mechanismen auf. Tumorzellen sind die Hauptproduzenten von VEGF (vascular endothelial growth factor). Dieses Zytokin unterstützt die Entstehung von Blutgefäßen im Tumor und fördert somit sein Wachstum. VEGF wurde als erstes vom Tumor sezerniertes Zytokin beschrieben, welches die Differenzierung und Reifung von DC hemmt (GABRILOVICH ET AL., 1996). Von der gleichen Arbeitsgruppe wurden Fehlfunktionen bei Blut- dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen festgestellt, welche verminderte T-Zellaktivierungen zur Folge hatten (GABRILOVICH ET AL., 1997). IL-6 und M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) werden ebenfalls vom Tumor bzw. von Makrophagen, die sich im Mikromilieu des Tumors aufhalten, produziert und induzieren eine Differenzierung von dendritischen Zellen zu Makrophagen (MENETRIER-CAUX ET AL., 19 EINLEITUNG 1998). Das Makrophagen-Vorkommen in Infiltraten von Mammakarzinomen steht im Zusammenhang mit einer schlechten klinischen Prognose (LEEK ET AL., 1996). Makrophagen produzieren in Tumor-infiltrierten Lymphknoten H2O2 und induzieren damit eine Apoptose der sich dort befindenden T-Zellen (TAKAHASHI ET AL., 2003). Die Frage, welche und wie viele Immun-escape-Mechanismen in dem jeweiligen Tumor vorhanden sind, scheint somit in direktem Zusammenhang mit dem klinischen Ausgang der Tumorerkrankung zu stehen. IL-10 und TGF-β werden von Tumorzellen, Tumor-assoziierten Makrophagen sowie von Treg-Zellen sezerniert. Sie supprimieren ebenfalls die Reifung und Funktion von DCs (ZOU, 2005). IL-10 kann zudem die IL-12-Produktion durch DC und somit eine gegen den Tumor gerichtete TH1-Immunantwort inhibieren. Viele Tumore, darunter auch das Mammakarzinom, exprimieren hohe Konzentrationen des COX2 (Cyclooxygenase-2) (POCKAJ ET AL., 2004). Es katalysiert die Produktion von Prostaglandin-E2 (PGE2), welches wiederum die Differenzierung und Funktion von DC hemmt (KALINSKI ET AL., 1998). Zytokine, welche die Differenzierung und Funktion von DC unterstützen würden (IL-4, GM-CSF, IL-12 und IFN-γ), sind dagegen im Tumor kaum oder gar nicht vertreten (ZOU, 2005). Die vom Tumor sezernierten Zytokine wirken oft nicht direkt inhibitorisch, sondern hemmen einzelne Funktionen der Immunzellen und verhindern so eine effektive Anti-Tumor-Immunreaktion. Bei Tumorfreien Lymphknoten konnte im Vergleich zu Tumor-infiltrierten Lymphknoten bei Mammakarzinompatientinnen ein höherer Anteil an mDC festgestellt werden, während Tumor enthaltende Lymphknoten überwiegend iDC enthielten (POINDEXTER ET AL., 2004). Durch das gehäufte Auftreten von nicht vollständig differenzierten DC bzw. iDC im Mikromilieu des Tumors oder in den Lymphknoten kommt es zur Induktion von Treg- oder nicht reagierenden T-Zellen (DHODAPKAR ET AL., 2001; HAWIGER ET AL., 2001). Treg-Zellen reduzieren die Kapazität Tumor-spezifischer T-Effektorzellen, Tumorzellen töten zu können. Ein hoher Anteil an Treg-Zellen im Tumor ruft eine tolerogene Situation im Tumormikromilieu hervor. Die klassischen Treg-Zellen sind CD4+-, CD25+- und FOXP3+-T-Zellen. Treg-Zellen können auch durch andere Faktoren aktiviert werden und wiederum regulierend auf dendritische Zellen wirken. Auf myeloiden DC kann im Tumormilieu oder in den Lymphknoten das inhibitorische 20 EINLEITUNG costimulatorische Molekül B7-H1 induziert werden. Tumor-assoziierte Treg-Zellen exprimieren PD-1, den Liganden zu B7-H1. Über die Rezeptor-Ligand-Bindung kann die IL-12-Produktion durch myeloide DC und damit eine Immunantwort gehemmt werden (CHEN, 2004; CURIEL ET AL., 2003). IDO+-DC (Indoleamine 2,3-Dioxygenase) kommen in vivo in Mammakarzinomen, in Tumor-infiltrierten Lymphknoten bei Mammakarzinomen und bei in vitro generierten MoDC vor. IDO+-DC reduzieren das freie Tryptophan, welches T-Zellen zur Proliferation benötigen. Dies verhindert die klonale Expansion von T-Zellen, wodurch diese apoptotisch oder anerg werden (MUNN, 2002). Unter dem Begriff myeloide Suppressor-Zellen (MSC) werden iDC, aktivierte Granulozyten sowie Makrophagen zusammengefasst. Sie konnten bei Patientinnen mit einem Mammakarzinom nachgewiesen werden und setzen Stickstoff frei (ZOU, 2005). Stickstoff inhibiert den IL-2-Rezeptor-vermittelten Signaltransduktionsweg und führt zur Apoptose von T-Zellen (SAIO ET AL., 2001; MAZZONI ET AL., 2002). Diese Beispiele zeigen das komplexe Netzwerk an Immun-escape-Mechanismen und die daraus resultierenden Folgen. Viele dieser Mechanismen und der daraus entstehenden Fehlfunktionen bei Immunzellen können nicht durch eine von außen zugeführte Immunität revidiert werden. Im Gegenteil: Durch immuntherapeutische Maßnahmen könnten bestimmte escape-Mechanismen aktiviert oder noch verstärkt werden. Daher scheint der Einsatz therapeutischer Maßnahmen, welche die Blockade bestimmter Faktoren oder escape-Mechanismen hervorrufen, wie z. B. Ontak (Denileukin Difteritoxin) oder Cyclophosphamide gegen Treg-Zellen, von entscheidender Bedeutung. Anti-escape-Therapien vor bzw. während einer Immuntherapie kann die klinische Effizienz der Immuntherapie verbessern. 1.3 Themenstellung Die Notwendigkeit der Etablierung neuer Therapieoptionen gerade für Patienten mit einem metastasierten Mammakarzinom besteht aufgrund des limitierten Erfolges der Standardtherapien und der Tatsache, dass für das metastasierte Mammakarzinom in den letzten 20 Jahren keine relevanten Fortschritte in der Lebensverlängerung erzielt werden konnten (ENGEL ET AL., 2003; SCHUBERT-FRITSCHLE ET AL., 2004; HÖLZEL ET AL., 2004; ENGEL ET AL., 2003). Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapien sollte neben der 21 EINLEITUNG Lebensverlängerung auch die Verbesserung der Lebensqualität ein weiterer entscheidender Gesichtspunkt bezüglich des Vergleichs alter und neuer Therapiemethoden sein. Bisher wurden nur wenige Phase-I/II-Studien mit dendritischen Zellen bei Mammakarzinompatientinnen durchgeführt. Der überwiegende Anteil der Studien erfolgte mit DC, welche mit spezifischen Tumorpeptiden beladen wurden. Aufgrund der Heterogenität der Tumoren kann es durch diesen Therapieansatz zu einer klonalen Selektion von Tumorzellen kommen, welche nicht das verwendete TAA tragen. Daher erscheint es sinnvoll, das gesamte Antigenrepertoire, in Form von kompletten autologen Tumorzellen oder Tumorzelllinien, für die Beladung von dendritischen Zellen zu verwenden. Patientinnen mit einem metastasierten Mammakarzinom und keiner weiteren Therapieoption wurden innerhalb einer Phase-I/II-Studie sowie außerhalb der Studie mit Tumorzell-Lysat beladenen dendritischen Zellen und dendritischen Zellen ohne Antigen behandelt. Parallel zur Behandlung wurden in-vitro-Daten über die Qualität und Funktionalität der dendritischen Zellen erhoben. Zuvor wurde bereits bei Mammakarzinompatientinnen eine verminderte Anzahl an funktionell potenten dendritischen Zellen in vivo beschrieben (ALMAND ET AL., 2000). Daher galt es zu untersuchen, ob die in vivo beschriebenen Fehlfunktionen bei in vitro aus Monozyten generierten DC ebenfalls auftreten bzw. durch diese kompensiert werden können. In dieser Arbeit wurden in-vitro-Untersuchungen an MoDC sowohl von Mammakarzinompatientinnen als auch von gesunden Spendern sowie an Tumorzellen aus Mammakarzinomen durchgeführt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob aus Monozyten von Patientinnen phänotypisch und funktionell vergleichbare dendritische Zellen wie bei gesunden Spendern generiert werden können, um mit diesen Zellen eine effektive Immunantwort gegen den Tumor auszulösen. Aufgrund von phänotypischen und funktionellen Unterschieden erfolgte eine Optimierung der Kulturbedingungen für die Generierung von MoDC von Mammakarzinompatientinnen. Zur Untersuchung der Tumorimmunogenität wurde die Aufnahme, Präsentation und Antigenität von Tumorantigengemischen in Form von Tumorzell-Lysaten von Mammakarzinomen analysiert. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit vom Tumor ausgehenden escapeMechanismen, welche eine spezifische Anti-Tumor-Immunantwort, induziert durch dendritische Zellen, inhibieren könnten. 22 MATERIAL UND METHODEN 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Spendermaterial und Patientenmaterial 2.1.1.1 Immunzellen von Patientinnen Das Vollblut stammte von Mammakarzinompatientinnen, welche im Rahmen einer Phase-I/II-Studie mit einer dendritischen Zellvakzine in der Abteilung für Gynäkologie an der Universität Göttingen in Kooperation mit dem Institut für Tumortherapie, Duderstadt behandelt wurden. Ein Teil der in dieser Arbeit untersuchten Patienten wurden innerhalb der Studie mit dendritischen Zellen behandelt und gleichzeitig wurden Patienten untersucht, welche im Institut für Tumortherapie mit einer dendritischen Zellvakzine behandelt wurden (siehe Tabelle 5). Ein bewilligter Ethikantrag liegt in der Universität Göttingen vor. Vollblut- und Leukaphereseproben wurden mit dem Einverständnis der Patientinnen vom Institut für Tumortherapie in Duderstadt zur Verfügung gestellt. Die Einverständniserklärungen der Patientinnen hinterliegen im Institut für Tumortherapie in Duderstadt. 2.1.1.2 Immunzellen von gesunden Spendern Leukapherate von gesunden Spendern wurden freundlicherweise von der Abteilung für Transfusionsmedizin der Universität Göttingen zur Verfügung gestellt. 2.1.1.3 Tumorgewebe Primärtumore und Metastasen aus Operationen sowie die Punktate von Pleuraergüssen mit Tumorabsiedlungen wurden nach Entnahme des für die Diagnostik benötigten Materials verwendet. Das Tumorgewebe wurde mit dem Einverständnis der Patientinnen vom Institut für Tumortherapie in Duderstadt und der Abteilung für Gynäkologie der Universität Göttingen zur Verfügung gestellt. 23 MATERIAL UND METHODEN 2.1.1.4 Zellen und Zelllinien Zellen aus Patientenmaterial Tumorzellpräparationen aus Primärtumoren, Metastasen und Pleuraergüssen von Mammakarzinompatientinnen; Institut für Tumortherapie, Duderstadt; Abteilung für Gynäkologie, Universität Göttingen Zelllinien Ftde Fibroblastenzelllinie; Institut für Tumortherapie, Duderstadt FM 3-13 Melanomzelllinie; Dr. A. F. Kirkin, Institut für Tumorzell Biologie, Kopenhagen, Dänemark MCF-7 humanes Mammakarzinom; ATCC-Nr.: HTB 22, Rockville, MD, USA SK-BR-3 humanes Adenokarzinom, einer Brustdrüse; aus einem malignen Pleuraerguß; ATCC-Nr.: HTB-30, Manassas, VA, USA 2.1.2 Chemikalien und Substanzgemische 2.1.2.1 Medien, Puffer und Medienzusätze Amphotericin B Squibb von Heyden GmbH, München Ampicillin Binotal; Grünenthal GmbH, Aachen CellGro DC-Medium serumfreies Medium mit L-Glutamin; Cellgenix, Freiburg Dimethylsulfoxid (DMSO); Synopharm GmbH, Barsbüttel fetales Kälberserum (FCS); Biochrom KG, Berlin Gelifundol Biotest Pharma GmbH, Dreieich Gentamycin genta 80; ct-Arzneimittel, Chemische Tempelhof GmbH, Berlin 24 MATERIAL UND METHODEN L-Glutamin Biochrom KG, Berlin Medium RPMI 1640 Flüssigmedium mit L-Glutamin; BioWhittaker, Maryland, USA McCoys 5a Medium Biochrom KG, Berlin Metronidazol Caesar & Lorenz GmbH, Hilden phosphat buffered saline (PBS); Dulbeccos ohne Kalzium und ohne Magnesium; Invitrogen, Karlsruhe Hank’s-Puffer Biochrom KG, Berlin Sterofundin Infusionslösung; Braun Melsungen AG, Melsungen 2.1.2.2 Antikörper Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-, Phycoerythrin (PE)-, Peridiniumchlorophyll (PerCP)- oder Allophycocy (APC)- konjugierte monoklonale Primärantikörper (Maus-α α-human) mAk-Spezifität Isotypkontrollen Isotypkontrollen Ig-(Sub) Klasse FITC IgG1, κ PE IgG2a, κ PerCP IgG2b APC IgG 1,κ PE-Cy5.5 IgG1 Klon MOPC-21 G155-178 X40 X40 2T8-2F5 α-HLA-ABC PE IgG 2a,κ W6/32 α-HLA-DR FITC IgG1 L243 α-HLA-DR PE-Cy5.5 IgG1 IMU357 α-CD1a FITC IgG 1,κ HI149 α-CD1a PE-Cy5.5 IgG1 BL6 α-CD3 PE IgG 1,κ UCHT1 Quelle Becton & Dickinson, Pharmingen, Heidelberg Beckman Coulter, Krefeld Dako, Glostrup, Dänemark Becton & Dickinson Pharmingen Beckman Coulter Becton & Dickinson, Pharmingen Beckman Coulter Becton & Dickinson, 25 MATERIAL UND METHODEN α-CD11c PE IgG2b α-CD14 PerCP IgG2b α-CD14 PE-Cy5.5 IgG2a α-CD50 FITC IgG 2b,κ α-CD54 APC IgG 1,κ α-CD58 PE IgG 2a,κ α-CD64 FITC IgG 1,κ α-CD83 PE IgG 1,κ α-CD83 PE-Cy5.5 IgG2b α-CD80 FITC IgG 1,κ α-CD86 PE IgG 1,κ Propidium Iodide Staining Solution Ig-(Sub) KlasseKonjugat / Pharmingen S-HCL-3 Becton & Dickinson Pharmingen MOP9 Becton & Dickinson Pharmingen RMO52 Beckman Coulter TU41 Becton & Dickinson, Pharmingen HA58 Becton & Dickinson, Pharmingen 1C3 Becton & (AICD58.6) Dickinson, Pharmingen 10.1 Becton & Dickinson, Pharmingen HB15e Becton & Dickinson, Pharmingen HB15a Beckman Coulter L307.4 Becton & Dickinson, Pharmingen 2331 (FUN- Becton & 1) Dickinson, Pharmingen Klon Quelle / Becton & Dickinson, Pharmingen Tabelle 1: Flurochrom-markierte monoklonale Antikörper (Maus-α α-human) und Lebend-totFarbstoff Propidium Iodide. 26 MATERIAL UND METHODEN 2.1.2.3 Zytokine, Enzyme und weitere Reagenzien BSA Bovines Serumalbumin (Rinderserumalbumin) Fraktion 5; Biomol Feinchemikalien GmbH, Hamburg Cellwash BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg HSA Humanes Albumin 20 % Immuno; Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim Kaninchenserum Biochrom KG, Berlin Lymphoprep Ficoll-Trennlösung, Dichte: 1,077+0,001 g/ml; Nycomed AS Diagnostics, Oslo, Norwegen Percoll Trennlösung, Dichte: 1,24 g/ml, isoton; Biochrom KG, Berlin PHA-L Leucoagglutinin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen rh IFN-γ Imukin; Boehringer Ingelheim Pharma KG, Biberach rh IL-1β R&D Systems GmbH, Wiesbaden rh IL-4 Cellgenix, Freiburg rh IL-6 R&D Systems GmbH, Wiesbaden rh GM-CSF Leukine; Immunex Corporation, Seattle, USA PGE 2 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen rh TNF-α R&D Systems GmbH, Wiesbaden Tetanustoxoid Chiron Behring, Marburg Trypanblaulösung 0,4 % (w/v) PBS Sigma Chemie, Taufkirchen Trypsin / EDTA Lösung 0,05 % / 0,02 % (w/v) in PBS ohne Mg2+ und Ca2+; Biochrom KG, Berlin Zymosan-A Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen FITC-Zymosan-A PD Dr. Frank Petersen, Forschungszentrum Borstel 27 MATERIAL UND METHODEN 2.1.2.4 Chemikalien Aceton Merck, Darmstadt Formaldehyd-Lösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Natriumazid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Natriumcarbonat Merck, Darmstadt Natriumchlorid Merck, Darmstadt Natriumhydroxid Merck, Darmstadt Salzsäure, rauchend 37% Merck, Darmstadt Trichloressigsäure (TCA) Merck, Darmstadt Trihydroxymethylamino- Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg methan (TRIS) Triton X-114 Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg 2.1.3 Zellkulturutensilien und andere Verbrauchsmaterialien 2.1.3.1 Vorrats-, Arbeits- und Kulturgefäße Kryoröhrchen 1,8 ml; Corning NY, Mexiko Mikrotiterplatten 96-Napf Rund- und Flachboden; Corning NY, Mexiko Multiwellplatten 24 (Lumox) und 6 Näpfe; Greiner bio one, Solingen Petrischalen 56,7 cm2; Sarstedt, Nümbrecht Reaktionsgefäße 0,5 und 1,5 ml; Sarstedt, Nümbrecht Zellkulturflaschen 25 cm2, 75 cm2 und 175 cm2; Greiner bio one, Solingen Zellkulturschalen 21,5 cm2, 56,7 cm2 und 145 cm2; tissue culture (TC) Nunc GmbH, Wiesbaden 28 MATERIAL UND METHODEN Zentrifugenröhrchen 15 und 50 ml; Greiner, Frickenhausen 2.1.3.2 Pipetten und Pipettierhilfen Eppendorf Reference variabel 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl; Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf Reference pro variabel 5-100 µl, 50-1000 µl; elektronische Pipetten Eppendorf AG, Hamburg Mehrkanalpipette 12 Kanal Transferpette 50-200 µl; Brand GmbH, Wertheim Pipetten 5 ml, 10 ml und 25 ml Einmalpipetten; Greiner bio one, Solingen Pasteurpipetten Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Pipettenspitzen blau, gelb; Sarstedt, Nümbrecht Pipettierhilfe Akkubetrieben; Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt 2.1.4 Geräte und Laborinstallationen 2.1.4.1 Mikroskope Durchlichtmikroskop mit Phasenkontrast, Axiolab; Carl Zeiss AG, Oberkochen Invertmikroskop Olympus CKX 41 mit Fluoreszenzsystem (mit FITC, mit Fluoreszenz und DAPI Filtern); Olympus GmbH, Hamburg Dualband FITC / Cy3 Filter; AHF Analysentechnik, Tübingen Invertmikroskop ID 03; Carl Zeiss AG, Oberkochen Neubauerzählkammer Neubauer improved; Carl Zeiss AG, Oberkochen 29 MATERIAL UND METHODEN 2.1.4.2 Analysegeräte Durchflußzytometer FACSCalibur 4CA; BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Elisa-Reader Multiscan EX, Mikrotiterplatten Photometer; Thermo Electron Corporation, Dreieich pH-Meter WTW Mess- und Analysegerätegesellschaft mbH, Wellheim 2.1.4.3 Zelkulturlaboreinrichtung CO2 Brutschränke Heracell, Kendro Laboratory Products, Hanau Gefrierschränke -20° C Truhe Liebherr-Hausgeräte GmbH, Ochsenhausen -80° C Truhe Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel -152° C Truhe Sanyo Fisher Sales Europe GmbH, München Kühlschränke Liebherr-Hausgeräte GmbH, Ochsenhausen Sicherheitswerkbank Klasse2; Herasafe, Kendro Laboratory Products, Hanau Zentrifugen: Megafuge 1.0 R Kendro Laboratory Products, Hanau Multifuge 1-SR Kendro Laboratory Products, Hanau Biofuge 15 für 1,5 ml Reaktionsgefäße; Kendro Laboratory Products, Hanau Plattenzentrifuge Eppendorf AG, Hamburg Weitere in dieser Arbeit verwendete spezielle Hilfsmittel, Reagenzien und Lösungsansätze finden im Kontext der entsprechenden Methode Erwähnung. 30 MATERIAL UND METHODEN 2.2 Methoden 2.2.1 Zellbiologische Arbeitstechniken 2.2.1.1 Allgemeine Zellkultur Die Arbeit mit Zellkulturen erfolgte unter sterilen Bedingungen und aufgrund potentieller Infektiösität an einer Werkbank der Sicherheitsklasse II. Aufarbeitungen von Blut- und Tumormaterial wurden im Institut für Tumortherapie in speziellen Reinräumen, in welchen nach GMP-Standards gearbeitet wird, durchgeführt. 2.2.1.2 Gefrierkonservierung von vitalen Zellen 2.2.1.2.1 Einfrieren Durch Gefrierkonservierung können Zellen unter weitgehender Beibehaltung ihrer Vitalität gelagert werden. Um eine Schädigung der Zellen durch die Bildung von intrazellulären Eiskristallen zu vermeiden, werden die Zellen in einem Einfriermedium aufgenommen, welches ein Gefrierschutzmittel (DMSO) enthält (PETERS UND BAUMGARTEN, 1990). DMSO wird in einer Konzentration von 10 % (v/v) in eiskaltem Serum eingesetzt. Bei höheren Temperaturen und in der Konzentration ab 4 % (v/v) wirkt DMSO zelltoxisch, daher wird es zusammen mit dem kalten Serum erst unmittelbar vor dem Einfrieren zu den Zellen gegeben. Einfriermedium: 10 % (v/v) DMSO in Serum „Mr. Frosty“: -1°C / min Gefriercontainer, Nunc GmbH, Wiesbaden Die Art des Serums hängt vom Zelltyp der einzufrierenden Zellen ab. Zelllinien wurden in FCS, Zellen von Spendern und Patienten in autologem Serum eingefroren. Wenn kein autologes Serum zur Verfügung stand, wurde als Serumersatz Gelifundol verwendet. Beschriftete Kryoröhrchen und das Einfriermedium wurden im 4°C kalten „Mr. Frosty“ kaltgestellt. Die Zellen wurden nach der Ernte gewaschen und gezählt. Tumorzellen, 31 MATERIAL UND METHODEN Monozyten und dendritische Zellen wurden in einer Konzentration von ca. 5x107 /ml Einfriermedium aufgenommen, PBMNLs wurden in einer Konzentration von ca. 1– 2 x 108 /ml eingefroren. Die beschickten Kryoröhrchen wurden für eine Stunde bei 20°C im „Mr. Frosty“ und danach für 24 Stunden bei -80°C im „Mr. Frosty“ gelagert. War eine Langzeitlagerung erforderlich, wurden die Zellen nach 24 Stunden in eine 152°C kalte Truhe überführt. 2.2.1.2.2 Auftauen Beim Auftauen ist es wichtig, die DMSO-haltige Zellsuspension langsam mit kaltem Kulturmedium zu verdünnen, um die Zellen vor einem osmotischen Schock zu bewahren. Anschließend wird das DMSO ausgewaschen und die Zellen werden in Kultur genommen. Tiefgefrorene Kryoröhrchen wurden in der Hand fast vollständig aufgetaut und mit 70%igem (v/v) Ethanol äußerlich dekontaminiert. Über 3 min wurde 1 ml kaltes Medium langsam mit einer Pipette zu der Zellsuspension getropft. Diese Lösung wurde in ein 50 ml-Röhrchen mit 5 ml vorgelegtem Kulturmedium überführt und auf ein Endvolumen von 30 ml eingestellt. Nach mindestens zweimaligem Waschen der Zellen mit Medium (260 x g, 10 min, 4°C) wurde eine Vitalitäts- und Zellzahlbestimmung durchgeführt und die Aufnahme der Zellen erfolgte in der jeweils gewünschten Menge Kulturmedium. 2.2.1.3 Vitalitäts- und Zellzahlbestimmung Zur Bestimmung der Vitalität von Zellen werden diese mit Trypanblau angefärbt. Die Trypanblaulösung 0,4 % (w/v) (gebrauchsfertig) wurde mit der Zellsuspension im Verhältnis 1:2 gemischt. Angefärbt werden bei dieser Methode nur tote Zellen, indem der Farbstoff über die geschädigte Membran in die Zelle diffundiert. Sofort im Anschluss an die Färbung erfolgte die Auswertung. Mit Hilfe der NeubauerZählkammer wurde der prozentuale Anteil der toten Zellen bestimmt. 32 MATERIAL UND METHODEN 2.2.1.4 Mykoplasmentest Mykoplasmen sind als Erreger vieler Krankheiten, als Kontaminanten in Gewebekulturen und als harmlose Schmarotzer bekannt. Als Angehörige der Mykoplasmen-Gruppe sind sie die kleinsten selbständig vermehrungsfähigen Prokaryoten (SCHLEGEL, 1992). Mykoplasmen besitzen keine Zellwände, der Protoplast wird nach außen durch die Zytoplasmamembran begrenzt. Dadurch sind die Zellen leicht verformbar und können durch die Poren eines 0,2 µm-Sterilfilters durchdringen. In der Folge ist eine regelmäßige Überprüfung der Kulturen erforderlich, um Artefakte, die durch Mykoplasmen entstehen können, auszuschließen. Mykoplasmen greifen unter anderem in verschiedene Stoffwechselwege der Wirtszelle ein und können sie so zytogenetisch schädigen (LANG, 1985; MC GARRITY ET AL., 1984). Zu Fehlinterpretationen kann es durch ihre Wirkung als Mitogen oder je nach Spezies auch durch ihre Inhibition der Mitogen-Stimulation kommen. Mykoplasmen induzieren außerdem eine überschießende Freisetzung von Interferon sowie den Prozess des so genannten natural killing (BIRKE ET AL., 1981). Als gängigste Methode zur Darstellung von Mykoplasmen hat sich das Anfärben mit DNA-spezifischen Farbstoffen durchgesetzt. Dabei wird die DNA von Zellen und Erregern zytochemisch durch DNA-spezifische Fluoreszenzfarbstoffe angefärbt (RUSSEL ET AL., 1975). Bei adhärenten, zytoplasmareichen Zellen sind die Mykoplasmen leicht auf der Zelloberfläche zu identifizieren. Mykoplasmen auf runden, kleinen Zellen und Suspensionszellen sind schwer auszuwerten. Da sie sich auch in Kulturüberständen befinden, kann in diesen Fällen die Infektion zum Nachweis auf Indikatorzelllinien übertragen werden. Lösung 1 in Aqua bidest.: 26 % (v/v) Ethanol + 2 % (v/v) Essigsäure DAPI: Boehringer, Mannheim DAPI-Stammlösung: 100 µg/ml PBS DAPI-Gebrauchslösung: DAPI-Stammlösung 1:100 in Methanol Vorbereitung der Objektträger und Flexipermkammern: Die Objektträger wurden 3 Tage zur Entfettung in Lösung 1 aufbewahrt und einen Tag in Aqua bidest. gewässert. 33 MATERIAL UND METHODEN Flexipermkammern und Objektträger wurden getrocknet, montiert, in Biofolie eingeschweißt und autoklaviert (PETERS UND BAUMGARTEN, 1990). Es wurden ausschließlich adhärent wachsende Zellen getestet. Die Aussaat der Zellen erfolgte in 5–10x106 Zellen pro Kammer. Nach der Adhärenz der Zellen wurde das Medium vollständig abgesaugt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 200 µl DAPI-Gebrauchslösung pro Feld pipettiert. Während der Färbung wurden die Zellen für 10–15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden die Flexipermkammern vom Objektträger abgenommen, die Färbelösung abgegossen und die Objektträger kurz mit Wasser gespült. Die Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem DAPI-Filter in Wasserimmersion. Mykoplasmen erscheinen hier als kleine leuchtende Punkte einheitlicher Größe, vorwiegend an der Zellperipherie und auf den Zytoplasmafortsätzen. 2.2.2 Aufarbeitung von humanem Blut Mit dem Ziel, Methoden und verwendete Materialien für eine klinische Anwendung zu etablieren, wurden Patienten- und Spenderblut bzw. -leukapheresen unter GMPBedingungen aufgearbeitet. Die verschiedenen Methoden wurden dabei auf ihre Eignung getestet, Monozyten möglichst in einem geschlossenen System sowie in hoher Anzahl zu gewinnen. 2.2.2.1 Gewinnung von peripheren mononukleären Blutleukozyten (PBMNL) Die Gradientenzentrifugation ermöglicht es, Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte voneinander zu trennen (BοYUM, 1964). Lymphoprep ist die Lösung, welche bei der Dichtegradientenzentrifugation benutzt wird. Sie setzt sich aus Methylzellulose (Ficoll) und Natrium-Metrizoat zusammen. Natrium-Metrizoat ist ein Stoff mit hoher Dichte und stellt das eigentliche Trennmedium dar. Durch die Methylzellulose aggregieren die Erythrozyten, wodurch sich ihre Sedimentationsgeschwindigkeit erhöht und sie das Trennmedium passieren. Nach der Dichtegradientenzentrifugation sind die Granulozyten in der untersten Schicht des Pellets zu finden, darüber liegen die aggregierten Erythrozyten und das Trennmedium. Die folgende Schicht wird durch die 34 MATERIAL UND METHODEN Interphase gebildet, sie enthält die zu isolierenden PBMNL. Plasma bildet die oberste Phase des Gradienten. 2.2.2.1.1 Präparation von Vollblut Zur Blutentnahme wurden 9,5 ml-Monovetten, die K+/EDTA als Antikoagulans enthielten, verwendet. Bei Patienten und Spendern wurden 100–200 ml Vollblut entnommen. Vollblut sollte nach der Entnahme sofort verarbeitet werden, da so die Ausbeute an PBMNL erhöht und die Anzahl der toten Zellen gesenkt werden kann. Bei Lagerung von mehreren Stunden empfiehlt es sich, das Blut bei Raumtemperatur auf einer Wippe zu lagern. In sechs 50 ml-Zentifugenröhrchen wurden je 12,5 ml Lymphoprep vorgelegt. Das Vollblut (100 ml) wurde in eine sterile Glasflasche überführt und 1:2 mit PBS (RT) verdünnt. Je 12,5 ml Trennmedium wurden mit 25–35 ml des verdünnten Blutes überschichtet. Die Dichtegradientenzentrifugation erfolgte bei 800 x g, 20 min, ohne Bremse. Von nun an wurde mit 4°C kaltem PBS und vorgekühlten Gefäßen gearbeitet, um ein Adhärieren der Monozyten zu verhindern und eine maximale Ausbeute an peripheren mononukleären Blutleukozyten (PBMNL) zu erzielen. Die Interphase wurde bei allen sechs Röhrchen abgenommen und in vier weiteren Zentrifugenröhrchen gesammelt. Diese wurden dann mit PBS aufgefüllt und gewaschen (800 x g, 10 min, 4°C ohne Bremse). Die sich im Überstand befindenden Thrombozyten wurden abgesaugt, das Pellet in 50 ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (360 x g, 10 min, 4°C, ohne Bremse). Dieser Waschschritt wurde so oft wiederholt (ab jetzt mit Bremse), bis der Überstand klar war und sich im Pellet nach mikroskopischer Kontrolle keine Thrombozyten mehr befanden. Kontaminierende Thrombozyten und deren Metabolite können sowohl stimulierende (NAJAR ET AL., 1990; PETERS ET AL., 1990) als auch inhibierende (RUEDA ET AL., 1989) Effekte auf Monozyten haben. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in einem Röhrchen vereinigt, in 50 ml PBS aufgenommen und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Aus 100 ml Vollblut konnten 1x107 bis 1,5x108 PBMNL gewonnen werden. Der Monozytenanteil in dieser PBMNL-Präparation entsprach ca. 10–30 %. Die Zellzahl gewonnener PBMNL war stark abhängig von dem Leukozytenstatus des Patienten bzw. Spenders. 35 MATERIAL UND METHODEN 2.2.2.1.2 Präparation von Leukapheresezellen Neben PBMNL aus Vollblut wurden auch Zellen aus der Apherese verwendet. Das Apheresesystem (COBE SpectraTM, Gambro BCT, Martinsried) dient zur Trennung und Sammlung der Blutkomponenten von Spendern und Patienten. Das System verwendet eine Zentrifugalmethode, um Vollblut in seine Hauptbestandteile aufzutrennen. Das Vollblut wurde einem Spender oder Patienten entnommen, mit ACD-A antikoaguliert, über ein Einmalset in den Trennkanal in eine sich drehende Zentrifuge gepumpt und dort in seine Bestandteile aufgetrennt. Durch dieses Verfahren wird die Komponente mit der höchsten Dichte (Erythrozyten) an der äußeren Kanalwand angereichert, der Leukozytenfilm liegt in der Mitte, und das thrombozytenreiche Plasma (mit der geringsten Dichte) bildet die innere Schicht. Über einen Auslassschlauch im Kanal wurden die weißen Blutkörperchen abgesammelt und die restlichen Blutkomponenten über einen separaten Auslass dem Spender / Patienten zurückgeleitet. Es findet dadurch eine extreme Anreicherung von Leukozyten auf ein Gesamtvolumen von ca. 100 ml Leukapherat statt. Durch die starke Zellkonzentration wurden die Leukapheresezellen (bei einem Volumen von 100 ml) mindestens 1:3 mit PBS verdünnt und auf zwölf Gradienten mit 12,5 ml Lymphoprep geschichtet. Die restliche Aufarbeitung erfolgte wie unter 2.2.2.1.1. Pro 100 ml Leukapheresevolumen konnten bei Spendern 4–10x109 PBMNL und bei Patienten 0,5–7x109 PBMNL gewonnen werden. 2.2.2.2 Gewinnung von Monozyten durch Adhärenz Monozyten können im Gegensatz zu Lymphozyten an unphysiologischen Oberflächen adhärieren. Diese Eigenschaft macht man sich zunutze, wenn es um die Trennung der Zellen geht. So wird der Prozess der Adhärenz durch Anwesenheit von Serum- bzw. Plasmaproteinen sowie Wärme, Ca2+ und hydrophoben Plastikoberflächen der Kulturgefäße unterstützt, während Kälte und EDTA ihr entgegen wirken. Kulturmedium: RPMI 1640 + 5 % (v/v) autologes Serum 36 MATERIAL UND METHODEN Aufgereinigte PBMNL (siehe 2.2.2.1.1 und 2.2.2.1.2) wurden in serumhaltigem Medium auf eine Zellzahl von 0,5-1 x 107/ ml eingestellt. Diese wurden dann je nach Gesamtzellzahl und Ansatzgröße auf TC-Zellkulturschalen mit 5 ml der Suspension auf 21,5 cm2, 10 ml Zellsuspension auf 56,7 cm2 und 20 ml Zellsuspension auf 145 cm2 Schalengröße ausplattiert. Die ausplattierten PBMNL wurden für 30–60 min bei 37°C in einem CO2-Brutschrank inkubiert. Nach mikroskopischer Kontrolle der Adhärenz wurden die nicht adhärenten T- und B-Lymphozyten sowie NK-Zellen mit warmen PBS abgespült. Wurden die autologen Lymphozyten für weitere Tests benötigt, so wurde der Überstand in 50 ml Röhrchen gesammelt (siehe 2.2.2.6). Dieser Waschschritt wurde wiederholt, bis die mikroskopische Kontrolle zufrieden stellend war und die Lymphozyten weitgehend abgespült waren. Die Monozyten wurden im Anschluss in Kultur genommen (Zellkulturansatz siehe 2.2.2.4). 2.2.2.3 Gewinnung von Monozyten durch Elutriation Neben der Monozytengewinnung durch Adhärenz aus Vollblut und Leukapheresen wurden Monozyten durch Elutriation gewonnen. Das ElutraTM (Gambro BCT, Martinsried) Zellseparationssystem ist ein semi-automatisches, zentrifugenbasiertes Gerät, welches in der Lage ist, über Zentrifugalkraft und einem gegenläufigen Mediumfluss die Zellen aus Leukapheresen je nach Größe und Dichte in mehrere Fraktionen zu separieren. Während der Elutriation wirkt der Mediumfluss in einer Separationskammer im Widerstand zu der durch die Zentrifugalkraft induzierten Sedimentation von Zellen. Letztlich werden die Zellen dabei primär nach Größe und sekundär nach Dichte separiert und in der Kammer aufgereiht. Durch eine Erhöhung des Mediumflusses in der Kammer, bei gleich bleibender Zentrifugengeschwindigkeit, werden die Zellen vom Zellbett der Kammer getrennt und in verschiedene Fraktionssammelbeutel geleitet. Das ElutraTM Zellseparationssystem ist ein geschlossenes System und ermöglicht somit die Isolierung von großen Mengen an Monozyten bei Patienten und Spendern für eine klinische Anwendung (ADAMSON ET AL. 2004; BERGER ET AL. 2005). 37 MATERIAL UND METHODEN Medium: Hanks + 1 % (v/v) HSA Percoll Dichte 1,068 g/ml: 52,94 ml Percoll + 47,06 ml PBS In die ElutraTM wurde ein Einmalschlauchset eingelegt, bestehend aus Separationskammer, Schläuchen und Beuteln. Der Leukapheresebeutel des Spenders / Patienten wurde mit diesem verbunden und die Probe in die Separationskammer eingeladen. Im Anschluss wurde ein semi-automatisches Monozyten-Anreicherungsprotokoll gestartet. Für dieses Protokoll wurde vorher noch das Leukapheresevolumen, die Konzentration an Leukozyten und Erythrozyten ermittelt. Die fünf Fraktionen wurden über die folgenden Flussraten und Zentrifugationsgeschwindigkeiten separiert: Fraktion Flussrate Zentrifugen- Volumen (ml/min) geschwindigkeit (ml) (rpm) 1 37 2400 900 2 97,5 2400 975 3 103,4 2400 975 4 103,9 2400 975 5 103,9 2400 250 Tabelle 2: Flussraten, Zentrifugationsgeschwindigkeiten und Volumina der Fraktionen 1–5 während der Elutriation. In Fraktion 1 befanden sich danach Plasma, Thrombozyten und Erythrozytentrümmer, in Fraktion 2 Erythrozyten und Lymphozyten. Die Fraktionen 3 und 4 waren Waschfraktionen, welche noch restliche Lymphozyten enthielten. In Fraktion 5 befand sich nach der Elutriation eine reine Monozytenpopulation. Eine Granulozytenabreicherung fand bereits durch ein spezielles Sammelverfahren während der Leukapherese statt. Bei Patienten mit bestimmten Vortherapien konnten weder durch das Sammelverfahren in der Leukapherese, noch durch die Elutriation die Granulozyten komplett von den Monozyten getrennt werden. War die Fraktion 5 mit mehr als 20 % Granulozyten kontaminiert, wurde im Anschluss an die Elutriation die Fraktion 5 auf 10 Percollgradienten à 12,5 ml (Dichte: 1,068 g/ml) verteilt und eine Dichtegradienten38 MATERIAL UND METHODEN zentrifugation vorgenommen. Aus einem 100 ml Leukapherat konnten durch die Elutriation bei Spendern und bei Patienten 0,2 – 2x109 Monozyten gewonnen werden. 2.2.2.4 Kulturbedingung von Monozyten und deren Ausdifferenzierung zu unreifen und reifen dendritischen Zellen Monozyten des peripheren Blutes dienen als Ausgangsmaterial zur Differenzierung humaner dendritischer Zellen in vitro. Peters und Mitarbeiter zeigten, dass durch die Zugabe der Zytokine GM-CSF, IL-4 und IFN-γ bei Monozyten die Differenzierung zu monocyte-derived dendritic cells (MoDC) induziert wird (PETERS KRÄMER, 1993; XU ET AL., ET AL., 1991; 1995; PEISER, 1998), welche einen unreifen Phänotyp aufweisen. Durch die Zugabe von TNF-α und / oder anderen Reifungssignalen kann eine Differenzierung der unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen induziert werden (SALLUSTO UND LANZAVECCHIA, 1994; ZHOU UND TEDDER, 1996). Monozyten, die durch Adhärenz aus Vollblut oder Leukapheresen (siehe 2.2.2.1.1 und 2.2.2.1.2) bzw. aus Leukapheresen und Elutriation (siehe 2.2.2.3) gewonnen wurden, wurden zu unreifen MoDC (immature MoDC; iMoDC) oder zu reifen MoDC (mature MoDC; mMoDC) (JONULEIT ET AL., 1997; VERDIJK ET AL., 1999) mit folgenden Kulturbedingungen ausdifferenziert: Kulturansätze für unreife MoDC: 1. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 300 U/ml IL-4 + 300 U/ml GM-CSF + / - 150 U/ml INF γ 2. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml GM-CSF Kulturansätze für reife MoDC : 1. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml GM-CSF + 100 ng/ml IL-6 + 10 ng/ml IL-1β + 10 ng/ml TNF-α + 1 µg/ml PGE2 2. RPMI 1640 + 2,5 % (v/v) autologes Serum + 500 U/ml IL-4 + 800 U/ml GM-CSF + 10 µg/ml Poly I:C + 500 U/ml IFN-α 39 MATERIAL UND METHODEN 2.2.2.5 Gewinnung von Plasma und Serum Der flüssige Bestandteil des Blutes wird als Plasma bezeichnet. Serum ist fibrinogenfreies Plasma und wird den Medien zur Kultivierung von Zellen zugesetzt. Plasma wird zum Beschichten von Objektträgern und Zellkulturschalen benutzt, damit auf diesen Oberflächen Monozyten und andere Zellen leichter haften. Zur Vermeidung von Fremdstimulation bzw. im Hinblick auf die klinische Applikation wurde ausschließlich im autologen System gearbeitet. a) Plasmagewinnung: Vollblut wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1600 x g, 10 min, RT, ohne Bremse zentrifugiert. Der dabei entstandene Plasmaüberstand wurde abgenommen und zur Beschichtung der Kulturgefäße genutzt. Das verbliebene Zellpellet konnte zur PBMNL-Aufarbeitung (siehe 2.2.2.1.1) weiter verwendet werden. Ebenso konnte Plasma im Verlauf einer Leukapherese gewonnen werden. Über einen weiteren Auslasskanal wurde die innere Schicht abgesammelt (siehe 2.2.2.1.2). Bei der Verwendung von Plasma ist zu beachten, dass in einer Plasmafraktion auch immer Thrombozyten enthalten sind und stets die Gefahr der Kontamination der Kultur mit Thrombozyten besteht. b) Serumgewinnung: Zur Serumgewinnung wurden jedem Spender / Patienten 40–100 ml Blut in Serummonovetten, die mit Defibrinisierungskügelchen beschickt waren, entnommen. Die Monovetten blieben bis zum vollständigen Ablauf der Gerinnung bei RT stehen und wurden dann bei 1600 x g, 10 min, RT, ohne Bremse zentrifugiert. Der Überstand konnte nun als Serum gewonnen werden. In Abhängigkeit zur Fragestellung wurden die Komplementproteine des Serums durch eine halbstündige Inkubation bei 56°C inaktiviert. 40 MATERIAL UND METHODEN 2.2.2.6 Gewinnung von Lymphozyten durch Adhärenztechnik Die durch Adhärenztechnik isolierten Lymphozyten stellen eine Mischpopulation aus ca. 80 % T- und 15 % B-Zellen dar. Diese ist zudem geringfügig mit bis zu 15 % NKZellen und 0,1–1 % dendritischen Zellen kontaminiert. Zuerst wurden PBMNL nach 2.2.2.1.1 bzw. 2.2.2.1.2 aufgearbeitet. Die suspendierten Zellen wurden nach 30–60 min Adhärenz der Monozyten abgespült, gesammelt, gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse) und nach der Zellzahlbestimmung entweder bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert oder in Aliquots (0,2–2x108 Zellen) eingefroren. Bei einer Leukapherese konnten 1–1,6x109 und aus 50 ml Vollblut 2–4x107 Lymphozyten gewonnen werden. 2.2.2.7 Pan T-Zellisolierung durch MACS (Magnetic cell sorting) Dabei werden T-Zellen durch die Depletion von nicht-T-Zellen isoliert. Die nicht-TZellen werden zuerst mit einem Cocktail aus Biotin-konjugierten monoklonalenAntikörpern markiert. Dieser Cocktail besteht aus folgenden monoklonalen-Antikörpern: α-CD14 (bindet Monozyten), α-CD16 (bindet Makrophagen und neutrophile Zellen), α-CD19 (bindet B-Zellen), α-CD36 (bindet Thrombozyten), α-CD56 (bindet NK-Zellen), α-CD123 (bindet Knochenmarksstammzellen, Granulozyten und Megakaryozyten) und Glycophorin A (bindet Erythrozyten). Mit einem Sekundärantikörper, Anti-Biotin konjugiert mit MicroBeads, werden die primär markierten nicht-T-Zellen sekundär magnetisch gekoppelt. Die markierten Zellen werden durch eine MACS-Säule, welche im Magnetfeld eines MACS-Separators befindet, geleitet. Alle magnetisch markierten Zellen bleiben in der Säule, während die unmarkierten T-Zellen die Säule passieren (negative Selektion). MACS Puffer: PBS + 0,5 % (v/v) autologes HuS + 2 mM EDTA Die durch die Adhärenz gewonnenen Lymphozyten (siehe 2.2.2.6) wurden gezählt und der Überstand vollständig vom Zellpellet entfernt. Das Pellet wurde in 40 µl MACSPuffer pro 107 Gesamtzellen resuspendiert. 10 µl des Biotin-Antikörper-Cocktails wurden ebenfalls pro 107 Gesamtzellen hinzugegeben, danach wurden die Zellen 41 MATERIAL UND METHODEN resuspendiert und für 10 min bei 4–8°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde auf die Zellen 30 µl MACS-Puffer und 20 µl Anti-Biotin MicroBeads auf 107 Gesamtzellenzahl gegeben und für weitere 15 min bei 4-8°C inkubiert. Im Anschluss erfolgte das Waschen der Zellen durch die Zugabe des 10-20 fachen Färbevolumens an MACS Puffer und die Zentrifugation der Zellen bei 300 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Gesamtzellen resuspendiert. Die magnetische Separation erfolgte in MS- (für bis zu 2x108 Gesamtzellen) oder in LS- (für bis zu 2 x 109 Gesamtzellen) Säulen, diese wurden in das magnetische Feld des MACS-Separators gespannt und dreimal mit MACS-Puffer gewaschen (MS mit 500 µl und LS mit 3 ml). Nach dem Waschen wurde die Waschfraktion unterhalb der Säule verworfen, ein neues Röhrchen bereitgestellt und die gefärbte Zellpopulation auf die Säule gegeben. Die Negativfraktion (angereicherte TZellen) passierten die Säule, die Positivfraktion (nicht-T-Zellen) verblieb in der Säule. Die isolierten T-Zellen wurden einmal gewaschen und gezählt, dann wurde ein Aliquot zum Zweck der durchflusszytometrischen Analyse entnommen. Diese Probe wurde mit α-CD3-PE gefärbt um die Reinheit der Population zu messen (siehe 2.2.5). Die so isolierten T-Zellen wurden im Anschluss für funktionelle assays weiter verwendet. 2.2.3 Aufarbeitung und Kultivierung von Tumoren Bei längerer Kulturdauer bilden die meisten Tumoren durch den Selektionsdruck Subzelllinien, die mit der Ausgangszelllinie bezüglich des Karyotyps und der Wachstumseigenschaften nicht mehr identisch sein müssen (PETERS UND BAUMGARTEN 1990). Die Arbeit mit frischen Tumorzellpräparationen oder Kurzzeit-Primärkulturen von isolierten Tumorzellen umgeht die Transformation der Tumorzellen. Um vergleichende Untersuchungen zwischen schon bewährten Permanentlinien und frisch isoliertem Patientenmaterial durchzuführen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Primärtumoren, Metastasen und Pleuraergüsse von Mammakarzinompatientinnen aufgearbeitet. Diese Präparationen wurden zytopathologisch begutachtet, um sicher zustellen, dass es sich bei den isolierten Tumorzellen um Zellen des Originaltumors handelte. 42 MATERIAL UND METHODEN 2.2.3.1 Mechanische Aufarbeitung von Tumoren Die mechanische Isolierung von Tumorzellen stellt die am häufigsten verwendete Methode dar. Im Gegensatz zur enzymatischen Aufarbeitung besteht hier nicht die Gefahr des Verlustes der antigenen Eigenschaften der Tumorzellen. So können vitale isolierte Einzelzellen sofort für eine weitere Expansion genutzt werden, eine durchflusszytometrische Analyse der Oberflächenmarker auf Tumorzellen kann durchgeführt oder die Zellen können für weitere Verwendungszwecke vital eingefroren werden. Transport- bzw. Aufarbeitungsmedium: RPMI 1640 + 2,5 µg/ml Amphotericin B + 10 µg/ml Ampicillin + 50 µg/ml Gentamycin + 20 µg/ml Metronidazol 55 % iges (v/v) Percoll (Dichte: 1.07 g/ml) steriles Zell-Gewebedissoziations Kit: autoklavierbare Siebhalterung + 60-Mesh- und 80- Mesh-Siebe + Glaspistill + Pinzette; Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen Einmalskalpelle; Aeskulap AG, Tuttlingen Operativ gewonnenes Tumormaterial wurde in einem sterilen, gekühlten (4–8°C) Transportbehälter, der mit dem Transportmedium gefüllt war, transportiert. Das Material wurde in eine Petrischale mit vorgelegtem Aufarbeitungsmedium überführt. Mittels eines Skalpells erfolgte die Fragmentierung des Tumorgewebes in möglichst kleine Stücke. Eventuell vorhandenes Fettgewebe wurde entfernt. Nach Überführung der fragmentierten Tumorstücke in ein 60-Mesh-Sieb wurden die Gewebestücke mit einem Glaspistill weiter zerkleinert, indem sie durch das Sieb gepresst wurden. Diese Prozedur wurde so lange wiederholt bis sich kaum noch vollständiges Gewebe im Sieb befand. Ein zweites autoklavierbares 80-Mesh-Sieb wurde in eine dritte Petrischale gestellt. Das 60-Mesh-Sieb wurde aus der zweiten Schale entfernt und das Medium aus der zweiten Schale mit den Einzelzellen und kleineren Gewebsverbänden wurde durch das 80-MeshSieb mit dem Glaspistill gegeben. Dadurch konnte eine vollständige Einzelzellsuspension hergestellt werden. Durch die makroskopische Betrachtung des Gewebes vor der Aufarbeitung und eine mikroskopische Beurteilung der vorliegenden Zellsuspension wurde entschieden, ob im Anschluss eine Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll durchgeführt wurde. War das 43 MATERIAL UND METHODEN Gewebe stark vaskularisiert oder befanden sich in der Einzelzellsuspension sehr viele Erythrozyten, wurde die Einzelzellsuspension im Aufarbeitungsmedium auf zwei Gradienten mit je 12,5 ml Percoll gegeben und bei 800 x g für 20 min ohne Bremse zentrifugiert. Mit diesem Schritt wurden Erythrozyten, Granulozyten und Zelltrümmer entfernt. Erfolgte kein Gradient, wurden die Einzelzellen aus der Petrischale in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen mit PBS aufgefüllt. Die Zellen wurden sowohl mit als auch ohne Gradient dreimal in PBS gewaschen (360 x g, 10 min, 4°C, 1 x ohne; 2 x mit Bremse), um verbliebe Fettreste auszuwaschen. Anschließend wurden die Zellen mit einer Lebend-Totfärbung mittels Trypanblau (siehe 2.2.1.3) gezählt. Von der Zellsuspension wurde ein Ausstrich auf einem Objektträger angefertigt. Der fixierte Ausstrich wurde zur zytologischen Begutachtung an die Pathologie in Bonn übersand. Da in Tumoren auch andere Zellen, z. B. Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL), vorkommen, war für weitere Analysen und Verwendungszwecke der genaue Tumorzellanteil von Bedeutung. Dieser wurde von dem Pathologischen Institut der Universität Bonn mitgeteilt. Die so aufgearbeiteten Zellen wurden eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C bzw. -152°C gelagert. 2.2.3.2 Enzymatische Aufarbeitung von Tumoren Metastasen lassen sich mit Hilfe der mechanischen Aufarbeitungsmethode ohne weiteres in Einzelzellsuspension bringen. Bei primären Mammakarzinomen sind die einzelnen Zellen oftmals fest im umliegenden Stroma verankert, was das mechanische Zerkleinern erschwert bzw. unmöglich macht. Ebenso befinden sich in Mammakarzinomen häufig Mikrokalzifikationen, welche eine mechanische Aufarbeitung ebenfalls erschweren. In diesen Fällen werden Proteasen verwendet, die das Stützgewebe des Tumors angreifen und so eine Vereinzelung der Tumorzellen fördern. Eine Standardmethode besteht darin, die Zellen zunächst soweit wie möglich mechanisch aufzuarbeiten um die Zellsuspension im Anschluss in 0,005 %iger (v/v) Kollagenase / Dispase (Boehringer, Mannheim) für 30 Minuten zu inkubieren. Diese Methode wurde nur für experimentelle Fragestellungen verwendet, da für die Anwendung am Patienten eine enzymatische Aufarbeitung nicht erlaubt ist. 44 MATERIAL UND METHODEN 2.2.3.3 Isolierung von Tumorzellen aus Pleura- bzw. Aszitesergüssen Bei Karzinomerkrankungen können seröse Körperflüssigkeiten aus der Pleura oder der Peritonealhöhle metastatische Absiedlungen mit enthaltenen Tumorzellen enthalten. Auch sind in diesen Ergüssen häufig Entzündungszellen wie Lymphozyten und Makrophagen zu finden. Diese Ergüsse werden aus diagnostischen und therapeutischen Gründen unter sterilen Bedingungen punktiert und in sterile Sekretbeutel aufgenommen. Für den Transport wurden die Aspirate gekühlt bei 4–8°C gelagert. Sie wurden in 50 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt und bei 360 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse zentrifugiert. Der serumhaltige Überstand wurde abgenommen und aufbewahrt. Je nach Erythrozytengehalt des abzentrifugierten Pellets wurde eine Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll durchgeführt (siehe 2.2.3.1). Die Zellen wurden danach mit PBS gewaschen (360 x g, 10 min, 4°C, mit Bremse), gezählt und entweder im serumhaltigen Überstand eingefroren oder in Kultur genommen. Tumorzellen konnten aus Punktaten am vitalsten und schnellsten isoliert werden. 2.2.3.4 Kultivierung von Tumorzellen Die Kultivierung von Tumorzellen aus Primärtumoren von Mammakarzinomen war aufgrund der Aufarbeitungsprobleme (siehe 2.2.3.2) sehr schwierig bzw. nicht möglich. So konnten z.B. stromale Fibroblasten epitheliale Zellen in einer Zellkultur überwachsen, was zu Problemen beim Ansatz der Primärkulturen führte. Die Isolierung vitaler Tumorzellen aus Metastasen und Ergüssen war hingegen wesentlich einfacher und erfolgreicher. Insbesondere Tumorzellen aus Ergüssen konnten leicht in Kultur genommen werden und vermehrten sich dort schnell. Kulturmedium: RPMI 1640 + 10 % (v/v) autologes HuS + 50 µg/ml Gentamycin Damit sich die Zellen ihr Medium besser konditionieren konnten, wurden sie in kleinen Gewebekulturflaschen (21,5 cm2) ausgesät. Bei aus Ergüssen kultivierten Tumorzellen, wurde dem Kulturmedium statt autologem Humanserum der serumhaltige Zentrifugationsüberstand als Serumersatz und als Wachstumsfaktor zugesetzt. Waren Zell- 45 MATERIAL UND METHODEN teilungsstadien zu beobachten, so wurde die Mediumfarbe täglich kontrolliert. Bei Verbrauch des Mediums erfolgte ein 50 %iger Mediumwechsel. Bei etwa 75 %iger Konfluenz wurden die Zellen durch die Zugabe von Trypsin / EDTA Lösung abgelöst, einmal mit Kulturmedium gewaschen und zu gleichen Teilen auf zwei 2 21,5 cm -Gewebekulturflaschen verteilt. Durch Untersuchungen des Tumormaterials in pathologischen Instituten unter nicht vollständig sterilen Bedingungen oder durch die Dauer der Kulturzeit, mit schwach proliferierenden Zellen, wächst die Gefahr einer Infektion stark an. In Primärkulturen können so leicht Keime heranwachsen. Um eine Kontamination mit Keimen zu verhindern, wurden allen Kulturmedien 2,5 µg/ml Amphotericin B, 10000 U/ml Penizillin und 10000 µl/ml Streptomycin zugesetzt. Bei besonders erhöhter Infektionsgefahr wurden zusätzlich Antibiotika wie Gentamycin, Amphotericin B, Ampicillin und Metronidazol (siehe 2.2.3.1 Aufarbeitungsmedium) verwendet. Waren die Tumorzellpräparation von Fibroblasten kontaminiert, wuchsen diese in der Regel sehr schnell, entzogen dem Medium Nährstoffe und überwucherten die vorhandenen Tumorzellen. Die Tumorzellen wurden in einem zertifizierten, LPSfreien RPMI-Medium ohne FCS kultiviert, um einen unbedenklichen Einsatz der Tumorzellen in autologen dendritischen Zellvakzine zur Behandlung von Mammakarzinompatientinnen zu gewährleisten. 2.2.3.5 Herstellung eines Tumorzell-Lysates Für das Pulsen der dendritischen Zellen und deren Antigenaufnahme müssen Tumorzellen abgetötet und aufgeschlossen werden. Dann können dendritische Zellen sowohl membranständige als auch intrazelluläre Antigene zur Aufnahme bereitgestellt werden. Es sollte dabei eine Methode verwendet werden, bei der Proteine und Proteinfragmente ihre Ausgangskonfiguration beibehalten und wobei keine Substanzen auftreten, die zelltoxisch auf die dendritischen Zellen wirken könnten. Aufgrund dieser Überlegung kamen keine Detergenzien und Ultraschallzerkleinerungen zum Einsatz. Die Zellen wurden durch mehrfachen Wechsel zwischen Schockgefrieren und Auftauen abgetötet und aufgeschlossen. Beim Einfrieren wurde kein DMSO zum Einfriermedium gegeben, wodurch es zur Kristallbildung inner- und außerhalb der Zelle sowie in der 46 MATERIAL UND METHODEN Folge zum Zerplatzen der Zellmembran kam. Die Tumorzellen wurden dafür aus der Kultur genommen oder aufgetaut, gezählt und auf die entsprechend benötigte Zellzahl eingestellt. Es wurden 1–10 x 107 Tumorzellen / ml RPMI 1640 aufgenommen und je 1 ml auf die Kryoröhrchen verteilt. Diese wurden im Anschluss für 15 min in ein Stickstoff-beschicktes Dewargefäß gegeben. Danach wurden die Kryoröhrchen für 15 min bei 37°C aufgetaut. Dieser Vorgang wurde mindestens dreimal wiederholt. Durch eine mikroskopische Kontrolle über eine Lebend-Totfärbung mit Trypanblau wurde kontrolliert, ob alle Zellen tot bzw. nur noch Zellfragmente zu erkennen waren. Das Zell-Lysat konnte im Anschluss zum Pulsen der dendritischen Zellen verwendet werden. Dabei wurde auf eine dendritische Zelle das Lysat einer Tumorzelle gegeben. Für spätere Verwendungszwecke wurde das Lysat bei -152°C gelagert. 2.2.4 Spezifische T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und Tumorzell-Lysaten sowie Lymphozytenproliferation nach Mitogenstimulation Mit Hilfe der Messung der spezifischen T-Zellaktivierung gegen Tetanustoxoid sollte die akzessorische Aktivität der dendritischen Zellen verschiedener Patienten und Spender untersucht werden. Mit der Messung der spezifischen T-Zellaktivierung gegen Tumorzell-Lysate konnte festgestellt werden, welche Antigenstimulation durch das autologe Tumorzell-Lysat induziert wurde. Die MoDC und Lymphozyten eines Spenders / Patienten fungieren dabei als Stimulator- und Responderzellen. Das Tumorzell-Lysat des gleichen Patienten stellte das Antigen dar. Es wurde im streng autologen System gearbeitet, um eine allogene Stimulation der Lymphozyten auszuschließen. 2.2.4.1 Spezifische T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid Um die akzessorische Aktivität der dendritischen Zellen (Antigenaufnahme, prozessierung, -präsentation, Lymphozytenaktivierung) standardisiert untersuchen zu können, wurde ein Lymphozytenproliferationstest mit Tetanustoxoid als Standardantigen durchgeführt. Durch vorausgegangene Schutzimpfungen kann davon ausgegangen werden, dass bei jedem Spender eine Sekundärreaktion ausgelöst werden kann. Kulturmedium: RPMI 1640 + 2,5 % (v / v) autologes Serum 47 MATERIAL UND METHODEN MoDC wurden unter den jeweiligen Kulturbedingungen ausdifferenziert (siehe 2.2.2.4), geerntet, gezählt und anschließend auf eine Konzentration von 1x104 / 100 µl Kulturmedium eingestellt. Da MoDC nicht proliferieren entfiel das sonst übliche Bestrahlen der Stimulatorzellen. Eine MoDC-Kontrolle wurde bei jedem Test mitgeführt. Die MoDC wurden mit je 100 µl pro Napf auf eine sterile 96-Napf-Platte mit Flachboden ausplattiert. Das Tetanustoxoid wurde in einer Konzentration von 60 Lf/ml eingesetzt. Zu den MoDC wurden 50 µl (3 Lf) Tetanustoxoid pipettiert. Zur Antigenaufnahme wurden die MoDC mit dem Tetanustoxoid für 3–4 Stunden bei 37°C inkubiert. In dieser Zeit wurden die autologen Lymphozyten, welche nach Aufarbeitung des Patienten- bzw. Spenderblutes eingefroren worden waren, aufgetaut und es erfolgte eine T-Zellisolierung über MACS (siehe 2.2.2.7). Im Anschluss wurden die T-Zellen auf eine Konzentration von 2 x106 / ml eingestellt. Pro Napf wurden 50 µl T-Zellen hinzugefügt. Zu Kontrollzwecken wurden bei jedem Test T-Zellen allein, MoDC allein, T-Zellen und MoDC gemeinsam mit T-Zellen und Tetanustoxoid mitgeführt. Die [3H] – Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung erfolgte nach 4 Tagen Kulturdauer (siehe 2.2.4.4 und 2.2.4.5). 2.2.4.2 Spezifische T-Zellaktivierung mit autologen Tumorzell-Lysaten und allogenen Lysaten aus Tumorzelllinien Mit Hilfe der Messung der spezifischen T-Zellproliferation induziert durch TumorzellLysate sollte geklärt werden, ob Tumorantigene aus Tumorzell-Lysaten aufgenommen und präsentiert werden, sowie zu einer Lymphozytenproliferation führen. Weiterhin sollte untersucht werden ob durch die Präsentation von Tumorantigenen aus TumorzellLysaten eine TH1- bzw. TH2-Immunantwort induziert werden kann. MoDC wurden unter den jeweiligen Kulturbedingungen ausdifferenziert (siehe 2.2.2.4) und in gleicher Konzentration bzw. Mediummenge wie unter 2.2.4.1 in 96-Napf-Platten mit Flachboden ausplattiert. Das Tumorzell-Lysat wurde in folgenden Konzentrationen bzw. Verhältnisse pro Napf mit den dendritischen Zellen zusammengegeben: 48 MATERIAL UND METHODEN dendritische Zellen / ml lysierte Tumorzellen / ml Verhältnis / Napf 1 x 104 1 x 104 1:1 1 x 104 2 x 104 1:2 1 x 104 4 x 104 1:4 1 x 104 8 x 104 1:8 1 x 104 1,6 x 105 1:16 Tabelle 3: Verhältnisse von MoDC zu lysierten Tumorzellen im spezifischen T- Zellproliferationstest. Zu den MoDC wurden jeweils 50 µl Tumorzell-Lysat pipettiert. Analog dem Verfahren bei Tetanustoxoid wurden die MoDC zur Antigenaufnahme wieder für 3-4 Stunden bei 37°C mit Tumorzell-Lysat inkubiert. Die Lymphozyten bzw. T-Zellen wurden wie unter 2.2.4.1 beschrieben vorbereitet und in der gleichen Konzentration eingesetzt. Als Kontrollen wurden hier ebenfalls bei jedem Test T-Zellen allein, MoDC allein, T-Zellen und MoDC gemeinsam mit T-Zellen und Tumorzell-Lysat mitgeführt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden Kulturüberstände aus den dafür vorgesehenen Proben geerntet und bei -80°C bis zur Durchführung des Cytometric bead arrays (CBA) eingefroren (siehe 2.2.5.3). Die [3H] – Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung der restlichen Proben erfolgte wieder nach 4 Tagen Kulturdauer. 2.2.4.3 Lymphozytenstimulation mit PHA Um die Proliferationsfähigkeit der Lymphozyten von Spendern und Patienten zu vergleichen, wurden diese mit dem polyklonalen Mitogen Phytohämaglutinin (PHA) inkubiert. PHA stammt aus der Phaseolus vulgaris (Gartenbohne) und kann bei Lymphozyten eine Mitose auslösen (JANEWAY UND TRAVERS, 1995). PHA Stammlösung: 100µg/ml Die Lymphozyten wurden mit 1x105/ Napf und MoDC mit 1x104/ Napf in Kulturmedium (siehe 2.2.4.1) in eine 96-Napf-Platte mit Flachboden ausplattiert. PHA wurde in einer Konzentration von 1µg/ml zu den Lymphozyten und MoDC gegeben. Die 49 MATERIAL UND METHODEN Zellen wurden dann für 4 Tage bei 37°C im Brutschrank inkubiert, danach erfolgte die [3H] – Thymidin- oder BrdU-Markierung (siehe 2.2.4.4 und 2.2.4.5). 2.2.4.4 Proliferationstest mit [3H] – Thymidin Zur Beobachtung der proliferationsbedingten Stoffwechselaktivität von Zellen wird häufig der Einbau von niedermolekularen Vorläufersubstanzen in die DNA der Zelle verwendet (LINDL, 2000). Dafür werden radioaktive Nukleotidbasen zum Einbau in die DNA verwendet. Die üblichste Methode besteht im Einbau von radioaktivem Thymidin ([3H] – Thymidin) in die DNA. Die inkorporierte Radioaktivität wird durch eine Gasentladungsmethode gemessen. Hierbei strömt über die mit Tritiumthymidin markierte Probe das Edelgas Helium und wird durch β-Strahlen ionisiert. Es resultieren Entladungen, die von einem Detektor registriert und als Zählrate in counts per minute [cpm] angegeben werden. Dieser Wert wird zur Korrektur der Zählausbeute mit einem zugeordneten Faktor (4,6) multipliziert, um die Aktivität der Probe in disintegrations per minute [dpm] zu erhalten. [3H] – Thymidinstammlösung: 10 µCi / ml RPMI Die Zellen wurden wie unter 2.2.4.1 bis 2.2.4.3 beschrieben für vier Tage kultiviert. Um Randphänomene zu vermeiden, welche durch Verdunstung und Temperaturgradient entstehen können, wurden in die äußersten Näpfe der Mikrotiterplatten 200 µl PBS pipettiert. In jeden Napf wurden 20 µl [3H] – Thymidinlösung mit einer Konzentration von 0,2 µCi gegeben und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Um die Reaktion abzustoppen, wurde die Platte anschließend bei -20°C eingefroren, dadurch wurden die Zellen aufgeschlossen und die DNA freigesetzt. Nach dem Auftauen wurden die Lysate mit Hilfe eines Harvesters auf ein Glasfaserfilter überführt. Die DNA bleibt auf dem Filter zurück, während ungebundenes Thymidin herausgewaschen wird. Die Glasfasermembranen wurden im Anschluss für 30 min bei 60°C getrocknet und danach wieder auf RT abgekühlt. Die Messung der inkorporierten Radioaktivität erfolgte im β-Counter. 50 MATERIAL UND METHODEN 2.2.4.5 Messung der Proliferation mittels Bromdesoxyuridin (BrdU) BrdU kann als Thymidin-Analogon verwendet werden, um DNA-Syntheseraten zu messen. Diese nicht-radioaktive Methode beruht darauf, dass das Pyrimidin-Analogon BrdU statt Thymidin in die DNA eingebaut wird. Es wurde ein ZellproliferationsELISA verwendet, welcher eine colormetrische Methode zur Messung der BrdUInkorporation beinhaltet. Mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen BrdU kann das inkorporierte BrdU gebunden und quantifiziert werden, sowie daraus die DNASyntheserate errechnet werden. Colormetrischer-Zellproliferations-ELISA: 1 Kit (1000 Tests); Roche Diagnostics GmbH, Penzberg BrdU -Färbelösung (1. Flasche): BrdU-Färbereagenz (1 ml) 1:100 mit RPMI 1640 verdünnen (100 µM BrdU) Fixierungspuffer (2. Flasche): 2 x 100 ml gebrauchsfertig Anti-BrdU-POD Stocklösung (3. Flasche): Anti-BrdU-POD-Lyophilisat in 1,1 ml doppelt destilliertem Wasser lösen Anti-BrdU-POD Gebrauchslösung: Anti-BrdU-POD-Stocklösung 1:100 mit der Antikörper Verdünnungslösung (4. Flasche) verdünnen Waschpuffer (5. Flasche): Waschpufferkonzentrat 1:10 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen Substratlösung (6. Flasche): 100 ml TMB (Tetramethyl-Benzidin) gebrauchsfertig Stopplösung: 1 M H2SO4 Maxi-Sorp Platten; Nunc Wiesbaden Die Zellen wurden wie unter 2.2.4.1 bis 2.2.4.3 beschrieben in 96 Napf Flachboden Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 4 Tagen Inkubationszeit wurde zu den Zellen 20 µl / Napf BrdU-Färbelösung gegeben und die Zellen wurden für weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Da sich in den Proliferationstests meist adärente und Suspensionszellen befanden, wurden die Zellen anschließend für 10 min mit 300 g und bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und die Zellen für 1 Stunde bei 60°C getrocknet. Die Zellen wurden im Anschluss mit 200 µl Fixierungslösung / Napf für 30 min bei RT fixiert. Der Fixierungspuffer wurde entfernt 51 MATERIAL UND METHODEN und die Platte mit einem Tuch getrocknet. 100 µl Anti-BrdU-POD-Gebrauchslösung / Napf wurden für 90 min, bei RT zugegeben. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand entfernt und jeder Napf dreimal mit 200 µl Waschpuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand wieder verworfen und 100 µl Substratlösung pro Napf für 15-30 min, bei RT zugegeben. Die Peroxidasereaktion wurde mit 25 µl 1 M H2SO4 / Napf abgestoppt und die Proben für die Messung von der TC-Platte in eine Maxi-Sorp-Platte überführt. Danach fand die photometrische Detektion durch den ELISA-Reader, einem Filter der Wellenlänge 450 nm sowie einem Referenzfilter mit 690 nm statt. Bei jedem assay wurden ein Blank und eine Hintergrundkontrolle mitgeführt. Der Blankinhalt bestand aus 100 µl Zellkulturmedium ohne Zellen, BrdU-Färbelösung und Anti-BrdU-POD-Gebrauchslösung, um die unspezifischen Bindungen des BrdU und Anti-BrdU-POD zumessen. Die OD (Absorption A 690 nm- A 450 nm) im Blank durfte nicht höher als 0,1 sein und wurde von allen gemessenen Werten abgezogen. Die Hintergrundkontrolle enthielt die Zellen und Anti-BrdU-POD, um die unspezifischen Bindungen des Antikörpers an den Zellen zu messen. Die Hintergrundkontrolle wurde in jedem assay mitgeführt und angegeben. 2.2.5 Durchflusszytometrische Methoden Die Durchflußzytometrie (FACS Fluorescence activated cell sorting) ermöglicht das Zählen von Zellen sowie die Analyse ihrer physikalischen und molekularen Eigenschaften in einem Flüssigkeitsstrom. Eine Hauptanwendung besteht darin, mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren. Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Zur Analyse werden die mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff angefärbten Zellen in Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung kontinuierlich hintereinander an zwei gebündelten Laserstrahlen der Wellenlängen 488 nm und 633 nm vorbeigeführt. Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen die 52 MATERIAL UND METHODEN Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen einer höheren Wellenlänge) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts verhält sich proportional zur Zahl der gebundenen Fluorochrommoleküle (Antikörper / Zelle). Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und –streuung Informationen über die Zellgröße und die Granularität der Zellen gewonnen. Eine gleichzeitige FACS-Analyse mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist im FACS-Calibur möglich, da sich die eingesetzten Farbstoffe (FITC, PE und PerCP) zwar durch eine gemeinsame Wellenlänge (Argonlaser, 488 nm) anregen lassen, dagegen aber über unterschiedliche Farbstoff-charakteristische Emmissionsspektren verfügen (siehe Tabelle 4). Der vierte Fluoreszenzfarbstoff (APC) wird über einen zweiten Laser (HeNe-Laser, 633 nm) angeregt. Absorptionsmaxima Emmissionsmaxima [nm] [nm] 495 519 FITC 480; 565 578 PE Peridiniumchlorophyll 490 675 PerCP Allophycocy 650 660 APC Propidiumjodid 550 650 PI 480; 565; 649 670 PE-Cy5 Fluorochrom Fluoreszeinisothiozyanat R-Phycoerythrin Abkürzung Phycoerythrin und Cyanine 5 (Tandemkonjugat) Tabelle 4: Verwendete Fluorochrome und ihre Absorptions- und Emmissionsmaxima. Die digitalisierten Werte werden zur Korrelation und quantitativen Auswertung auf einen Computer übertragen. Die Daten können in unterschiedlichen Darstellungen ausgewertet werden. Im einfachen Histogramm wird ein Parameter in Relation zur Signalintensität dargestellt, zur vergleichenden Darstellung zweier Proben wird dagegen das overlay-Histogramm verwendet. In einem Zytogramm (Dot Plot) können 53 MATERIAL UND METHODEN verschiedene Parameter gegeneinander dargestellt werden. Eine detailliertere Analyse der erhobenen Daten erfolgt im Cell-Quest-Programm. Für die Darstellung der Ergebnisse werden die Zahl der positiven-Zellen (%) sowie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der gemessenen Proben herangezogen. Durch Subtraktion des für die Isotypkontrolle gemessenen Wertes wird so der korrigierte Wert der Anzahl positiverZellen (∆ %) und der mittleren-Fluoreszenzintensität (∆ MFI) errechnet. Durch die Division von ∆ MFI durch die MFI des Isotypes wird die relative Fluoreszenzintensität (RFI) errechnet. 2.2.5.1 Immunfluorometrische Analyse membranständiger Antigene Die Fluoreszenzfärbung von Zellen für die Durchflußzytometrie (FACS-Färbung) stellt im Wesentlichen eine immunzytochemische-Färbung dar. Durch Kombination verschiedener monoklonaler Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker auf bestimmten Zellen können diese mit der FACS-Färbung und der anschließenden Messung charakterisiert werden. Ein allgemein gültiges System ist das CD-System (cluster of differentiation-System), mit Hilfe dessen man die einzelnen Untergruppen der Leukozyten und deren Antigene gut unterscheiden kann. Dieses System wird ständig aktualisiert und erweitert. Die FACS-Färbung kann in einer Mikrotiterplatte oder in FACS-Röhrchen durchgeführt werden. Alle Gebrauchslösungen müssen möglichst steril aufbewahrt werden, um Partikelverunreinigungen, welche die Messung stören könnten, zu vermeiden. GekühlteLösungen sowie die Versuchsdurchführung auf Eis verlangsamen den Stoffwechsel der Zellen, verringern die Internalisierung und Abgabe von Oberflächenantigenen und verhindern die Ansammlung von Antigenen am Pol einer Zelle. Vor jeder Färbung werden die Fc-Rezeptoren auf den Zellen geblockt, um unspezifische Bindungen der Fluorochrom-gekoppelten-Antikörper mit dem Fc-Fragment an diese Rezeptoren zu verhindern. Diese Fc-Rezeptoren werden mittels der gut an diesen Rezeptoren bindenden Antikörper aus dem Kaninchenserum geblockt. Nach Zugabe der Fluorochrom-gekoppelten-Antikörper werden die Proben im Dunkeln gelagert, um eine Abnahme der Fluoreszenzintensität zu verhindern. Nach Abschluss der Färbung können 54 MATERIAL UND METHODEN die Zellen entweder sofort gemessen werden oder sie werden in Formalin fixiert und können so bis zu einer Woche bei 4°C für die Messung aufbewahrt werden. 2.2.5.1.1 Direkte-Immunfluoreszenz Beim direkten Verfahren ist der primäre Antikörper an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt (kovalent gebunden). Für eine Negativkontrolle (Isotypkontrolle) wurden Fluorochrom-markierte-, irrelevante-Antikörper eingesetzt, die der gleichen Immunglobulinsubklasse angehören wie die zu testenden Antikörper (siehe Tabelle 1). DirekteImmunfluoreszenzfärbungen wurden an Zellen aus Vollblut und an im Vorfeld isolierten Zellen durchgeführt. Blockpuffer: Cellwash + 10 % (v/v) KanS Färbepuffer: Cellwash+ 2% (v/v) FCS Fixierungspuffer: 0,5 % (v/v) Paraformaldehyd in PBS Uti-LyseTM Erythrozyten-Lyse-Reagenz A und B Dako Cytomation, Carpinteria, Kalifornien USA a)Vollblutmethode: 100 µl-Vollblut wurden mit 20 µl-fluoreszentem-monoklonalem-Antikörper für 20 min im Dunkeln bei RT inkubiert und danach die Erythrozyten lysiert. Es folgten die Inkubation des Vollblutes für 10 min mit 100 µl Reagenz-A (Uti-LyseTM) im Dunkeln bei RT und die Hinzugabe von 1 ml Reagenz-B (Uti-LyseTM). Die Probe wurde gevortext und wieder für 10 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Abschließend wurde die Probe mit 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Probe wurde in 300 µl PBS aufgenommen und schließlich entweder analysiert oder mit 200 µl Fixierungspuffer fixiert. b) Isolierte Zellen: Nach abgeschlossener Aufreinigung der PBMNL (siehe 2.2.2.1) wurden die zu färbenden Zellen 1–2-mal in PBS bei 260 x g für 7 min bei 4°C gewaschen und auf eine Konzentration von 0,5–1 x 106 Zellen / Ansatz eingestellt. 100 µl-Blockpuffer wurden pro Ansatz pipettiert und 20 min auf Eis inkubiert. Nach dem Blocken wurden die 55 MATERIAL UND METHODEN Zellen bei 320 x g für 2 min ohne Bremse zentrifugiert und der Überstand verworfen. Danach erfolgte eine makroskopische Kontrolle des Pellets und Resuspendierung des Sediments. Bei der Zugabe des Fluorochrom-konjugierten –Primärantikörpers (abhängig vom Antikörper, siehe Beipackzettel) wurde jede Probe in 20 µl-Antikörper sowie 80 µl-Färbepuffer aufgenommen und für 45 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Proben zweimal mit 200 µl-Cellwash gewaschen (320 x g für 2 min ohne Bremse). Die Zellen wurden entweder direkt im Anschluss gemessen oder die einzelnen Ansätze wurden in 200 µl Fixierungspuffer aufgenommen und lichtgeschützt bis zur Messung aufbewahrt. 2.2.5.1.2 Indirekte-Immunfluoreszenz Monoklonale-Antikörper ohne die Konjugation eines Fluoreszenzfarbstoffes werden zur Sichtbarmachung mit einem Fluoreszenz-gekoppelten-Zweitantikörper inkubiert, welcher den Erstantikörper sichtbar macht. Dabei kann eine leichte Verstärkung gegenüber der direkten-Immunfluoreszenz erreicht werden. Als Isotypkontrolle wird hier ein unkonjugierter, nicht-humaner, spezifischer-Antikörper verwendet. Im Übrigen verläuft die indirekte-Färbung analog zur direkten-Färbung. Sekundärantikörper: Kaninchen-α-Maus: F (ab’)2-Fragment, FITC- oder PE-markiert Probenauftrag, Blocken, Färben mit dem Primärantikörper und das Waschen erfolgte wie unter 2.2.5.1.1 beschrieben. Danach wurden 20 µl Fluorochrom-konjugierterSekundärantikörper (abhängig vom Antikörper, siehe Beipackzettel) sowie 80 µl Färbepuffer in jeden Napf pipettiert und für weitere 45 min inkubiert. Abschließend wurde wieder zweimal mit 200 µl Cellwash / Ansatz gewaschen. 2.2.5.1.3 Mehrfarbanalyse Für die detaillierte Analyse von Zellsubpopulationen können Kombinationen von 2–4 bei 488 nm anregbaren Fluorochromen eingesetzt werden (siehe 2.2.5). Da bei Farbstoffen wie FITC und PE eine spektrale Überlappung auftritt, muss eine Kompensation vorgenommen werden, um in der zweidimensionalen Darstellung und der dazugehörigen Statistik eine zweifelsfreie Zuordnung zu ermöglichen sowie falsch positive 56 MATERIAL UND METHODEN oder falsch negative Ergebnisse auszuschließen. Für die Kompensation der unerwünschten Einstrahlung eines Fluorochroms in den benachbarten Fluoreszenzkanal kann anteilig ein entsprechender Spannungswert subtrahiert werden (FL2-%FL1 bei FITCEinstrahlung in den PE / FL2-Kanal oder FL1-%FL2 bei PE-Einstrahlung in den FITC / FL2-Kanal). Dafür müssen zuvor die einzelnen Fluorochrome in Einzelfärbungen gegeneinander kompensiert werden. Die Instrumenteneinstellung (Einstellung der Detektoren und der Kompensation) kann für nachfolgende Versuche gespeichert und wieder verwendet werden. Direkt FITC-, PE-, PerCP- oder APC-markierte-Antikörper unterschiedlicher Spezifität wurden im selben Ansatz eingesetzt, um zwei verschiedene Antigene auf einer Zelle gleichzeitig nachzuweisen. Die Färbung erfolgte im Wesentlichen wie unter 2.2.5.1.1 beschrieben. Das Zellpellet wurde hier jedoch mit zwei bis drei Antikörpern zugleich inkubiert. Dies geschah durch die Zugabe von je 20 µl der FITC-, PE-, PerCP- oder APC-markierten-Antikörper pro Ansatz. Eine weitere Anwendung der Mehrfarbanalyse bestand darin, die z. B. mit FITC intrazellulär Fluochrom-markierten-Zellen waren zusätzlich über spezifische-Antikörper (z. B. mit PE-Cy5) zu färben (siehe 2.2.7.1). Dafür mussten Überlappungen Fluorochrome aufwiesen, da ausgesucht bei einer werden, sehr welche intensiven keine spektralen intrazellulären- Fluoreszenzfärbung und eine schwach positiven-Oberflächenmarker-Fluoreszenzfärbung keine korrekte Kompensation möglich war bzw. die schwache Fluoreszenz überstrahlt wurde. 2.2.5.2 Durchflusszytometrische-Vitalitätsbestimung Propidiumjodid ist ein fluoreszierender-Farbstoff, welche im FL2-Kanal emittiert. Er dringt in tote Zellen ein und interkaliert dort in die DNA. Durch diese Markierung kann durchflusszytometrisch die lebend-tot-Rate einer Zellsuspension bestimmt werden. Zu beachten ist, dass die Zellen für die Vitalitätsbestimmung nicht fixiert werden dürfen. Aus diesem Grund wurde Propidiumjodid erst kurz vor der Analyse zu den Zellen gegeben. 57 MATERIAL UND METHODEN Die Probe für die Vitalitätsbestimmung wurde auf 1 x 105 Zellen in einem Röhrchen in Cellwash eingestellt, mit 10 µl-Propidiumjodid versetzt und sofort im Anschluss gemessen. 2.2.5.3 TH1/TH2 Cytokine Cytometric Bead Array (CBA) Das CBA-System ist ein Partikel-basierender Immuno-assay, welcher durchflusszytometrisch mit Hilfe der Fluoreszenzintensität analysiert wird. Der CBA besteht aus 6 beads-Populationen mit jeweils einer bestimmten Fluoreszenzintensität, welche an 6 verschiedenen, spezifische-Antikörper gekoppelt sind. Das beads-Antikörpergemisch liegt in Suspension vor und ermöglicht die Analyse von 6 verschiedenen Parametern in einer Probe. Mit dem TH1/TH2-cytokine-CBA können quantitativ die Zytokine IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α und IFN-γ auf Proteinebene bestimmt werden. Durch die Zugabe eines PE-konjugierten-Detektionsantikörpers und der Inkubation mittels eines rekombinanten-Standards oder einer Probe (Kulturüberstände, EDTA-Plasma oder Serumproben) werden sandwich-Komplexe gebildet. Human-TH1/TH2-Cytokine-CBA-Kit; BD Pharmingen, Heidelberg A1-A6 humane-IL-2-, IL-4-, Il-6-, IL-10-, TNF-α-, IFN-γ-capture beads B humanes-TH1/TH2 PE-Detektions-Reagenz C humaner-TH1/TH2-Standard D Zytometer-setup beads E1 und E2 PE- und FITC-Positivkontroll-Detektor F Waschpuffer G assay-diluent BD-CaliBRITE-beads; BD Pharmingen, Heidelberg Für den CBA wurden Kulturüberstände aus spezifischen T-Zell-assays oder Lymphozytenproliferationstests verwendet (siehe 2.2.4.1 und 2.2.4.2). Die Proben wurden bis zur Durchführung eingefroren und bei -80°C gelagert. Die Überstände wurden unver58 MATERIAL UND METHODEN dünnt oder 1:2-verdünnt in den assay eingesetzt. Zu Beginn wurde eine Verdünnungsreihe mit dem Standard angesetzt, dazu wurde der lyophilisierte-Standard in 0,2 mlassay-diluent für 15 min gelöst. 9–10 FACS-Röhrchen wurden für die Verdünnungsreihe bereitgestellt. In das erste Röhrchen wurden 900 µl-assay-diluent und in alle anderen 300 µl-assay-diluent pipettiert. 100 µl der 10-fach-Standardstammlösung wurden in das erste Röhrchen überführt, das Röhrchen wurde geschüttelt und aus dem ersten Röhrchen wiederum 300 µl entnommen und in das zweite Röhrchen überführt. Dies wurde jeweils für die restlichen 7–8 Röhrchen durchgeführt. Der Topstandard enthielt somit eine Proteinkonzentration von 5000 pg/ml von allen 6 Zytokinen; die 1:2-Verdünnung enthielt 2500 pg/ml; 1:4 1250 pg/ml; 1:8 625 pg/ml; 1:16 312,5 pg/ml; 1:32 156 pg/ml; 1:64 80 pg/ml; 1:128 40 pg/ml; 1:256 20 pg/ml; optional 1:512 10 pg/ml. Im Anschluss wurde das Gemisch der Zytokin-capture-beads vorbereitet. Von allen 6-capture-beads wurden jeweils 10 µl für jede assay-Probe, Standard und eine Negativkontrolle entnommen, gemischt und geschüttelt. Danach wurden 50 µl-capturebeads in jedes assay-Röhrchen überführt und noch 50 µl-PE-Detektions-Reagenz dazu gegeben. Zuletzt wurden 50 µl der Standardverdünnungen und 50 µl der Proben in die einzelnen Röhrchen gegeben und diese wurden für 3 Stunden bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurde jedes Röhrchen mit 1 ml-Waschpuffer gewaschen und mit 200 x g für 5 min zentrifugiert. Vorsichtig wurde danach der Überstand von den Röhrchen abgenommen und das Pellet mit 300 µl-Waschpuffer resuspendiert. Die Proben konnten im Anschluss analysiert werden. Bevor die Messung beginnen konnte, wurde eine Kalibration des FACSCalibur mit BD-CaliBRITE-beads und der FACSComp-Software durchgeführt. Danach erfolgte eine Instrumenteneinstellung für die Durchführung des CBA unter Verwendung der BD-CellQuest-Software und speziellen setup-beads. 50 µl dieser beads wurden in jeweils 3 Röhrchen gegeben: Das erste Röhrchen wurde so belassen, während ins zweiten Röhrchen 50 µl einer FITC-Positivkontrolle hinzugefügt und in das dritte Röhrchen 50 µl einer PE-Positivkontrolle zu pipettiert wurden. Die beads wurden für 30 min bei RT im Dunkeln inkubiert und danach mit 450 µl-Waschpuffer im 1. Röhrchen und 400 µl-Waschpuffer in Röhrchen 2 und 3 aufgefüllt. Die Instrumenteneinstellung mit den setup-beads im CBA-Messdokument erfolgte wie im BD-CBA- 59 MATERIAL UND METHODEN Handbuch beschrieben. Im Anschluss erfolgten zuerst die Messung des Standards und dann, die der Proben. Die Messdaten wurden (in separaten Ordnern) gespeichert. Die Analyse erfolgte mittels einer speziellen BD-CBA-Software. Für jedes gemessene Zytokin wurde eine Standardkurve logarithmisch aufgetragen, anhand derer die Messdaten der Proben analysiert und tabellarisch aufgezeichnet wurden. 2.2.6 Proteinbiochemische Methoden Zum Nachweis der Phago- und Pinozytose von Proteingemischen aus Tumorzellen wurden Tumorzellen der Zelllinie MCF-7 lysiert. Mit dem Detergenz-Triton X-114 wurden sowohl Membran- als auch lösliche Proteine dieser Zelllinie isoliert. Die lipidischen Proteine und die löslichen-Proteine wurden quantifiziert. Zur Untersuchung der Phagozytoseeffizienz und deren Auswirkung auf den Phänotyp bei unreifen und reifen dendritischen Zellen wurden die Proteingemische mit dem Fluoreszenzfarbstoff-FITC-markiert. Die so isolierten- und markierten-Proteingemische wurden in den Phagozytose-assay eingesetzt (siehe 2.2.7). 2.2.6.1 Zellaufschluss und Proteinfraktionierung mit Triton X-114 Nach der Methode von BORDIER, (1981) können mit einer Triton X- 114-Phasenseparierung Proteine eines Zelllysates in lösliche-Proteine und integraleMembranproteine getrennt werden. Hierbei wird das Zell-Lysat mit dem nichtionischenDetergenz-Triton X-114 behandelt. Dieses Detergenz besitzt die Eigenschaft, bei 0°C in einer Phase mit wässriger Umgebung vorzuliegen (klares Lysat), während es bei Erwärmung auf 20°C zu einer Separation des Triton X-114 von der wässrigenUmgebung kommt (Eintrübung des Lysates). Während dieses Phasenüberganges transferiert das Detergenz alle integralen-Membranproteine in eine so genannte Detergenzphase, die von Triton X-114 an diesem Cloud-Point gebildet wird. Alle löslichenProteine verbleiben dabei in der wässrigen-Phase. Der Cloud-Point gibt die Temperatur an, ab welcher keine homogene Verteilung der Triton-Micellen mehr vorliegt. 60 MATERIAL UND METHODEN Heizblock Bioblock Scientific; Schütt Labortechnik GmbH, Göttingen TRIS-gepufferte Salzlösung (TBS), 10 x Ansatz: 100 mM TRIS; 1,5 M NaCl, mit HCl (rauchend) auf pH 7,6 eingestellt Triton X-114-Lysepuffer: 90 % (v/v) TBS + 10 % (v/v) Triton X-114 (präkondensiert nach BORDIER, (1981)) Die MCF-7-Zellen wurden geerntet, auf eine Anzahl von 1 x107 pro Reaktionsgefäß (1,5 ml) eingestellt und bei 360 x g für 10 min bei 4°C mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen im Pellet bei -80°C eingefroren. Die Zellpellets wurden aufgetaut und einmal mit kaltem PBS gewaschen. Danach wurden die Pellets auf Eis gestellt und mit 500 µl-eiskalter, 1 % iger Triton X-114-Lösung versetzt sowie anschließend für 30 min auf Eis, bei gelegentlichem Schütteln, inkubiert. Zelltrümmer und Kerne wurden bei 6000 U/min (bezogen auf Biofuge 15, Kendro) für 15 min abzentrifugiert. Der Überstand mit dem Triton X-114 (bei noch einheitlicher Lysatphase) wurde abgenommen und in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Das Pellet mit Zelltrümmern und Zellkernen wurde verworfen. Unter gelegentlichem Vortexen wurden die Überstände für 10 min in einem 37°C-Heizblock erwärmt und im Anschluss bei 1500 U/min für 10 min bei RT zentrifugiert. Die wässrige- (hydrophile) Phase im Überstand (ca. 450 µl) wurde vorsichtig abgenommen und in einem separaten Reaktionsgefäß auf Eis aufbewahrt. Die untere (hydrophobe) Detergenzphase (ca. 50 µl) wurde mit 500 µl eiskaltem-PBS noch einmal gewaschen (1500 U/min für 10 min bei RT) und das Pellet mit den integralen-Membranproteinen im Anschluss in 500 µleiskaltem-PBS aufgenommen und auf Eis bis zur Proteinbestimmung gelagert. 2.2.6.2 Proteinbestimmung nach Lowry (Mikromethode) Die Proteinbestimmung nach Lowry beruht auf 2 Reaktionen. Sie ist sensitiver als die Biuret-Methode und es können auch kleinere Proteinmengen bestimmt werden. In der ersten Reaktion wird ein blau-violetter-Komplex zwischen Peptidbindungen und Kupfer(II)-Ionen in alkalischer-Lösung gebildet. Dieser Komplex reduziert in der zweiten Reaktion ein Phospormolybdän-Phosphorwolframsäure-Reagenz (Folin-Ciocalteu- 61 MATERIAL UND METHODEN Phenol-Reagenz) durch aromatische Aminosäuren unter Bildung von Mischoxiden. Es entsteht ein blauer Farbstoff. Lösung A: 2 % (w/v) Natriumcarbonat in 0,1 N Natronlauge Lösung B: 1 % (w/v) Kupfersulfat x 5 Kristallwasser, 2 % (w/v) Kaliumnatriumtartrat, Kupfersulfat und Kaliumnatriumtartrat wurden für die Lösung-B in gleichen Anteilen gemischt Lösung C: zu 50 ml Lösung-A wurde 1 ml Lösung-B gegeben Lösung D: Folinreagenz und Aqua dest. 1:2 mischen 40 % (w/v) Trichloressigsäure (TCA) Protein-Standard: BSA 01, mg/ml in Aqua dest. Eppendorf Photometer; Eppendorf AG, Hamburg Der BSA-Standard wurde in PBS in jeweils 500 µl-Volumina, in folgenden Proteinkonzentrationen aufgenommen: 1, 2, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40 und 50 µg. Von den zu bestimmenden Proteinproben der wässrigen-Phase wurden jeweils 2,5 und 5 µl und von den Proben der Detergenzphase jeweils 2 und 4 µl entnommen. Alle Proben wurden auf 500 µl mit PBS aufgefüllt und als Doppelproben angesetzt. Der Standard und die Proben wurden mit jeweils 500 µl 40 % iger TCA versetzt, so dass eine Fällungskonzentration von 20 % iger TCA vorlag. Alle Proben wurden für 30 min auf Eis gestellt und anschließend bei 11.000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge für 25 min pelletiert. Es folgte die Waschung des Pellets in eiskaltem-Aceton (-25°C) sowie die Zentrifugation des Pellets in der Eppendorf-Zentrifuge bei 11.000 U/min für 10 min. Die Proben wurden nun bei 60°C im Heizblock eingedampft. Der BSA-Standard und die Proteinproben der hydrophilen-Phase wurden in 750 µl Lösung-C resuspendiert. Bei den Proteinproben der hydrophoben-Phase ergab sich das Problem der schlechten Löslichkeit nach Acetonwaschung. Doch durch die Zugabe von je 50 µl-1 N NaOH konnten diese Pellets gelöst und anschließend mit 700 µl-Lösung-C versetzt werden. Alle Proben wurden für 30 min bei RT inkubiert. Danach wurden 75 µl-Lösung-D auf alle Proben gegeben und für weitere 30 min bei RT inkubiert. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 578 nm in einem Eppendorf Photometer gemessen. Als Referenz 62 MATERIAL UND METHODEN diente der obige Lösungsansatz ohne Protein, bei hydrophoben-Proben musste die 1 N NaOH im Referenzwert berücksichtigt werden. Die ermittelten Extinktionen des BSA-Standards wurden in einer Eichkurve gegen den bekannten BSA-Gehalt aufgetragen. Die Eichkurve diente der Ermittlung der Proteinkonzentrationen innerhalb der Proben der hydrophilen- und hydrophoben-Phase. 2.2.6.3 FITC-Markierung der löslichen und Membran-Proteine Der FITC-Fluoreszenzfarbstoff kann über primäre-Amine an Proteine binden, wodurch sich Farbstoff-Protein-Komplexe bilden können. Die Absorptions- und Emissionsmaxima von FITC-gekoppelten-Proteinen liegen bei 494 nm und 518 nm und können somit im FL1-Kanal des FACS detektiert werden bzw. mit einem für FITC-geeignetenFilter im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Mittes dieser FITCMarkierungsreaktion gelingt die Markierung von Proteinen mit Größen über 30 kDa. In einer Reaktion können Proteinmengen von 0,2–2 mg markiert werden. FluoReporter-FITC-Protein-Labeling-Kit; Molecular Probes, Leiden, Niederlande 1 M Natriumbikarbonat-Puffer pH 9: 0,84 g NaHCO3 in 9 ml deionisiertes Wasser lösen, pH 9 mit NaOH einstellen und mit Wasser auf 10 ml auffüllen Das Protein, welches FITC-markiert werden sollte, wurde auf eine Konzentration von 1–10 mg/ml PBS eingestellt. Ein Aliquot von 200 µl-Protein wurde für die Färbereaktion verwendet. Die 200 µl-Protein wurden in ein Reaktionsgefäß mit Rührmagnet überführt, mit 20 µl der 1 M Natriumbikarbonatlösung versetzt und auf ein Rührgerät gestellt. Im Anschluss wurden der FITC-Farbstoff und das DMSO auf Raumtemperatur gebracht und eine 10 mg/ml-Stammlösung FITC-Farbstoff hergestellt. Dazu wurde ein Aliquot Farbstoff in 50 µl-DMSO gelöst und mehrmals resuspendiert. 10 µl der FITC-Stocklösung wurden zu dem Protein gegeben. Unter ständigem Rühren wurde die Färbereaktion für 1 Stunde bei RT im Dunkeln durchgeführt. In dieser Zeit wurde die Zentrifugationssäule von der Größe 30,000 MW mit PBS und 2 mM-Natriumazid vorbereitet. Die Säule wurde in ein Sammelröhrchen gestellt und für 3 min mit 1100 x g 63 MATERIAL UND METHODEN bei RT zentrifugiert, damit das PBS in das Sammelröhrchen gelangt. Nach einer Stunde Inkubation wurde die Säule mittig mit dem Protein-FITC-Farbstoffgemisch beladen und danach nochmals im Sammelröhrchen für 5 min mit 1100 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befanden sich 200–250 µl FITC-markiertes-Protein in PBS und 2 mM Natriumazid im Sammelröhrchen. Das markierte Protein wurde bei 4°C im Dunkeln gelagert. Bei längerer Lagerung über mehrere Monate sollte das Protein bei -20°C eingefroren werden. 2.2.7 Phago- und Pinozytose-assay mit unreifen und reifen dendritischen Zellen Die Aufnahme von festen Partikeln in eine Zelle über Endozytose wird als Phagozytose bezeichnet. Dabei werden Makromoleküle und Partikel an die Zellmembran angelagert, von dieser in Form von Versikeln umschlossen und in Phagolysosomen in die Zelle aufgenommen. Die Aufnahme von löslichen-Bestandteilen in die Zelle wird als Pinozytose bezeichnet. Zellen mit besonderer Phago- und Pinozytoseaktivität sind Granulozyten, Monozyten, Makrophagen und unreife dendritische Zellen. Die Phagozytosekapazität von humanen unreifen dendritischen Zellen ist geringer als die peripherer Blutmonozyten und Alveolarmakrophagen, aber höher als die der reifen dendritischen Zellen (KIAMA ET AL. 2001). Dendritische Zellen verlieren mit der Reifung die Fähigkeit zu phagozytieren. Natriumazid 20 % ige Stammlösung: RPMI + 1 % (v/v) Natriumazid FITC-Zymosan-A-Stammlösung: 40 mg/ml FITC-Zymosan-A mit Zymosan-A ohne FITC 1:2 verdünnt Stammlösung: 1 mg/ml FITC-Zymosan-A-Endkonzentration: 10 µg/ml FITC-Protein der Membranfraktion der MCF-7-Stammlösung 5 mg/ml: Endkonzentration 10 µg/ml RPMI FITC- lösliches-Protein der MCF-7-Stammlösung 3,5 mg/ml: Endkonzentration 10 µg/ml RPMI 1 x 107 PBMNL oder 1 x 106 elutriierte Monozyten wurden pro Napf von Spendern oder Patientinnen in 8 Näpfen von jeweils zwei 24-Napf-Platten ausplattiert. Nach einer 64 MATERIAL UND METHODEN Stunde Adhärenz wurden die Lymphozyten von den PBMNL-Näpfen abgespült und die Monozyten auf beiden Platten für 6 Tage in RPMI + 2,5 % autologem Serum + 800 U/ml GM-CSF + 500 U/ml IL-4 kultiviert. Nach 6 Tagen Kulturdauer wurde der Phagozytose-assay mit unreifen dendritischen Zellen mittels einer 24-Napf-Platte durchgeführt. Dazu wurden folgende Ansätze mit jeweils 2 Näpfen pro Ansatz gefahren: 2 Näpfe verblieben als Kontrollnäpfe ohne jegliche Zusätze, bei der Azidkontrolle wurden für 30 min 1 % Natriumazid auf die dendritischen Zellen gegeben, danach wurden in diese Ansätze und in die Phagozytoseansätze für 2 Stunden 10 µg/ml FITCmarkiertes Zymosan-A, FITC-Protein der Membranfraktion oder lösliches-FITC-Protein gegeben. Zuvor wurden das Zymosan und die Proteine im Ultraschallbad gut homogenisiert. Nach der zweistündigen Phagozytose wurden die Proben durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Auf die zweite 24-Napf-Platte wurde ab dem 6. Tag 2 Tage lang der „Jonuleit-Mix“ mit 100 ng/ml IL-6 + 10 ng/ml IL-1β + 10 ng/ml TNF-α + 1 µg/ml PGE2 gegeben. Nach diesen 8 Tagen erfolgte dann der Phagozytose-assay der reifen dendritischen Zellen, die Ansätze waren mit dem Phagozytose-assay der unreifen dendritischen Zellen identisch. 2.2.7.1 Durchflusszytometrische Analyse der unreifen und reifen dendritischen Zellen nach Phago- bzw. Pinozytose Die 24-Napf-Platten der unreifen bzw. reifen dendritischen Zellen wurden für die Ernte der Zellen für 30 min auf Eis gestellt. Bei einer sehr ausgeprägten Phagozytose wurden die unreifen dendritischen Zellen wieder sehr adhärent, daher war eine Inkubation auf Eis erforderlich. Die nicht-markierten-Zellen, die Zellen aus der Azidkontrolle und aus den Phagozytoseansätzen wurden jeweils getrennt geerntet und zweimal mit PBS bei 4°C mit 260 g für 5 min gewaschen. Danach wurden die nicht-markierten-Zellen und die Zellen aus dem Phagozytoseansatz auf 7 FACS-Röhrchen mit 1x106 Zellen / Ansatz eingestellt. Damit wurden folgende Proben gefärbt und analysiert: Zellen ohne jegliche Färbung, Propidiumjodidfärbung, Isotypkontrolle, CD14 PE-Cy5, HLA-DR PE-Cy5, CD1a PE-Cy5 und CD83 PE-Cy5. Die Verwendung des Tandemkonjugates- PE-Cy5 erzielte zwei Effekte: zum einen wurde eine spektrale Überlappung mit dem FITC 65 MATERIAL UND METHODEN vermieden (siehe 2.2.5.1.3), zum anderen konnte eine Verstärkung der Oberflächensignale gegenüber einem starken intrazellulären FITC-Siganal erreicht werden. Die Zellen aus der Azidkontrolle wurden in einer FACS-Probe ungefärbt analysiert. 2.2.7.2 Fluoreszenzmikroskopische-Analyse der unreifen und reifen dendritischen Zellen nach Phago- bzw. Pinozytose Die Zellen für fluoreszenzmikroskopische-Aufnahmen wurden in 24-Napf-LumoxPlatten (Platten mit Teflonboden) oder in 24-Napf-Lumox-Platten auf runden Objektträgern kultiviert. Die Kultivierung und die Phagozytoseansätze erfolgten wie unter 2.2.7 beschrieben. Nach der zweistündigen Phagozytose wurde das Medium von den Zellen entfernt, die Zellen wurden in den Näpfen zweimal vorsichtig mit PBS abgespült und danach mikroskopisch begutachtet. Für weitere Oberflächenmarkerfärbungen wurde der Teflonboden der Lumoxplatten mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt bzw. wurde der runde Glasobjektträger entnommen und ebenfalls auf einen anderen Objektträger gelegt. Auf die Zellen wurde dann für 20 min 50 µlBlockpuffer gegeben, dieser danach abgenommen und weitere 20 µl der folgenden Antikörper: Isotyp PE IgG2a, κ, HLA-ABC PE, HLA-DR PE, CD1a PE, CD83 PE, CD80 PE und CD86 PE auf verschiedene Objektträger gegeben. Die Objektträger wurden danach einmal vorsichtig mit PBS gespült und sofort im Anschluss mikroskopisch begutachtet oder mit Mounting-Medium eingedeckelt im Kühlschrank dunkel aufbewahrt und innerhalb der nächsten 48 Stunden begutachtet. Die Proben wurden im Fluoreszenzmikroskop mit Dualbandfilter FITC / Cy3 ausgewertet. 2.2.8 IL-10-ELISA In Serum, Plasma und Kulturüberständen kann durch einen enzyme-linkedsorbent assay der Gehalt an Zytokinen bestimmt werden. Bei einem sandwich-ELISA wird ein für dieses Zytokin spezifischer monoklonaler Antikörper, welcher an eine 96-Napf-Platte gekoppelt ist, verwendet. Dieser Antikörper bindet spezifisch das zu bestimmende Zytokin, während ein weiterer Enzym-markierter-Antikörper ebenfalls spezifisch und in 66 MATERIAL UND METHODEN Abhängigkeit von der gebundenen Menge mit dem Antigen reagiert. Der entstandene Enzym-Antikörperkomplex wird über den Farbumschlag eines Substrates im ELISAreader gemessen sowie im Abschluss quantitativ ausgewertet. BD-OptEIATM IL-10-ELISA-Kit II; BD Pharmingen, Heidelberg 96-Napf-Platte mit gekoppeltem-humanem-α-IL-10 Antikörper Detektionsantikörper: biotinylierter-α-IL-10 Antikörper Standard: lyophilisiertes, recombinates, humanes-IL-10 Enzymkonzentrat : 250 x Avidin-Meerrettich-Peroxidase Konzentrat Standard- / Proben-diluent: tierisches Serum mit 0,09 % Natriumazid ELISA-diluent: Puffer mit Protein und 0,09 % Natriumazid Waschpuffer-Konzentrat: 20 x konzentrierte Detergenzlösung mit 0,2 % Thimerosal TMB-Substrat-Reagenz: 3,3`,5,5`- Tetramethylbenzidin in gepufferter Lösung Stopplösung: 1 M Phosphorsäure Serumproben der Patienten und Spender wurden bis zur Durchführung des ELISA bei -20°C gelagert. Alle Reagenzien, Standard und Proben wurden vor Beginn auf Raumtemperatur gebracht. Es wurde mit dem Standard-diluent eine Standardstocklösung von 500 pg/ml hergestellt und folgende Standardkonzentrationen für die Standardkurve mit Standard-diluent angesetzt: 500 pg/ml; 250 pg/ml; 125 pg/ml; 62,5 pg/ml; 31,3 pg/ml; 15,6 pg/ml und 7,8 pg/ml. Zu Beginn des ELISA wurden 50 µl ELISA-diluent in jeden Napf pipettiert und 100 µl von jeder Standardkonzentration, jeweils in Doppelansätzen, hinzugegeben. Die zu testenden Serumproben wurden ebenfalls mit 100 µl in Doppelansätzen in folgenden Verdünnungen dazu pipettiert: konzentriert, 1:2 und 1:10. Die Ansätze wurden vorsichtig gemischt und für 2 Stunden bei RT inkubiert. 15 min vor Benutzung wurde der Detektionsantikörper mit dem Enzymkonzentrat angesetzt, 2 µlEnzymkonzentrat pro Ansatz und 8 µl-Detektionsantikörper pro Ansatz wurden in ein separates Röhrchen pipettiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand aus der Platte abgenommen, die Näpfe wurden mit je 300 µl-Waschpuffer, welcher zuvor aus 100 ml-Waschpufferkonzentrat und 1900 ml destilliertem Wasser angesetzt worden war, gewaschen. Dieser Waschschritt wurde noch viermal wiederholt. Nach dem letzten 67 MATERIAL UND METHODEN Waschen wurde die Platte auf einem Tuch abgetrocknet. 100 µl-Peroxidase-Detektionsantikörper wurden für 1 Stunde auf jeden Ansatz gegeben. Im Anschluss wurde jeder Napf siebenmal mit 300 µl-Waschpuffer gewaschen. Die Näpfe wurden dann mit 100 µl-TMB-Substrat für 30 min im Dunkeln inkubiert. Zuletzt wurde die Farbreaktion mit 50 µl-Stopplösung pro Napf abgestoppt. Innerhalb von 30 min wurde die optische Dichte im ELISA-reader unter Verwendung eines 570 nm-Messfilters und eines 450 nm-Referenzfilters gemessen. An Hand der Standardkurve wurde der IL-10-Gehalt im Serum in pg/ml berechnet. 68 ERGEBNISSE 3 Ergebnisse 3.1 Optimierung der Kulturbedingungen zur Generierung monocyte-derived dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Herstellung einer dendritischen Zell-Vakzine für die Behandlung von Mammakarzinompatientinnen optimiert werden. Dafür sollte der Einfluss patienteneigener Hemmfaktoren auf die Differenzierung dendritischer Zellen von Mammakarzinompatientinnen untersucht werden. Es wurden qualitative Unterschiede in dem Phänotyp und der Funktionalität der dendritischen Zellen bei gesunden Spendern und Mammakarzinompatientinnen untersucht und in Relation zum klinischen Ansprechen gebracht. 3.1.1 Morphologie der Monozyten und der dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen Monozyten des peripheren Blutes können unter dem Einfluss von Zytokinen zu dendritischen Zellen oder auch, nur durch die Inkubation mit Medium und Serum, zu Makrophagen differenzieren. Monozyten sind im Blut in relativ hoher Zahl (3–7 % der mononukleären Zellen) vorhanden, sie sind einfach zu isolieren und daher als Ausgangsmaterial für eine dendritische Zelldifferenzierung besonders geeignet. Monozyten wurden aus Vollblut oder Leukapheresen mittels eines Ficollgradienten und einer Isolation über Plastikadhärenz isoliert (siehe 2.2.2.1 und 2.2.2.2) oder durch eine Elutriation (siehe 2.2.2.3) von den übrigen PBMNL separiert. Monozyten adhärierten nach einer Sedimentationszeit von 30 bis 60 min und waren im Phasenkontrast als kleine, rundliche und stark abgeflachte Zellen ohne Zytoplasmafortsätze zu beobachten. Monozyten bzw. MoDC, welche über Adhärenz isoliert wurden, waren mit restlichen Lymphozyten kontaminiert, während elutreierte Monozyten und die daraus generierten MoDC mit keinen bzw. wesentlich weniger Lymphozyten kontaminiert waren (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). 69 ERGEBNISSE Monozyt Lymphozyt Abbildung 1: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme von frisch isolierten Monozyten, welche über die Adhärenzmethode isoliert wurden. PBMNL wurden in RPMI und 5 % autologem Serum für 60 min bei 37°C auf TC-Schalen inkubiert, danach wurden die nicht adhärenten Lymphozyten abgespült und die adhärenten Monozyten verblieben in der Kulturschale. a) Adhärenzmethode b) Elutriation Lymphozyten in PMBNL nach Dichtegradient 100 101 102 CD14 103 Lymphozyten in Monozytenfraktion nach Elutriation 104 100 101 102 103 104 CD14 Abbildung 2: Lymphozytenanteil nach Dichtegradient (a) und nach Elutriation (b) in MonozytenPräparationen von Patientinnen. (a) SSC/CD14 Dot Plot-Darstellung von PBMNL aus dem Vollblut welche über Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden. (b) SSC/CD14 Dot Plot-Darstellung von Monozyten aus Leukapheraten wie unter 2.2.2.3 beschrieben über die Elutriation von den restlichen PBMNL separiert. Sie wurden durchflusszytometrisch im SSC und mittels einer CD14-FITC-Färbung analysiert. Gate um die Lymphozytenpopulation in der PBMNL- und Monozyten-Fraktion gesetzt. 70 ERGEBNISSE a) Adhärenzmethode b) Elutriation Lymphozyten 17,79 % 0 200 400 600 FSC-Height 800 Lymphozyten 1,23 % 0 1000 200 400 600 FSC-Height 800 1000 Abbildung 3: Lymphozytenanteil in MoDC aus unterschiedlichen Monozyten-Präparationen von 7 Tage alten Patienten-MoDC. (a) MoDC wurden 7 Tage aus Monozyten, welche durch Dichtegradientenzentrifugation und über die Adhärenzmethode isoliert wurden, generiert. (b) MoDC wurden 7 Tage aus Monozyten, welche über Elutriation isoliert wurden, generiert und durchflusszytometrisch im SSC/FSC analysiert. Gate um die Lymphozytenpopulation gesetzt. Abbildung 4: Aus Monozyten ausdifferenzierte unreife MoDC. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme von unreifen MoDC, welche 7 Tage in RPMI, 2,5 % Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ ausdifferenziert wurden. 71 ERGEBNISSE Innerhalb von sieben Tagen wurden Monozyten in RPMI, 2,5 % autologem Serum und entweder mit 300 U/ml IL-4 und GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ oder mit 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF zu unreifen MoDC ausdifferenziert und morphologisch verglichen. Charakteristisch für diese Zellen sind ihre verzweigten Ausläufer, die aufgrund ihrer segelartigen Form veils genannt werden. Unreife MoDC bildeten unter beiden Kulturbedingungen cluster, waren nicht mehr adhärent und stärker granuliert als Monozyten. Einige adhärente Zellen mit lang ausgestreckten Fortsätzen und einer relativ inhomogenen Morphologie konnten nach siebentägiger Kultur ebenfalls beobachtet werden. Diese Zellen wurden in dem Kulturmodell mit 300 U/ml IL-4 und GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ häufiger beobachtet als in dem mit 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Abbildung 5: Aus Monozyten ausdifferenzierte unreife MoDC. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme von unreifen MoDC, welche 7 Tage in RPMI, 2,5 % Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF 7 Tage kultiviert wurden. Durch die Zugabe von Reifungssignalen können aus unreifen MoDC reife MoDC generiert werden. Dazu wurden zu der Kultur unreifer MoDC am 5. Kultur-Tag 72 ERGEBNISSE 100 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-1β, 10 ng/ml TNF-α, 1 µg/ml PGE2 (JONULEIT ET AL., 1997) oder 2 mg/ml Poly I:C, 500 U/ml IFN-α (VERDIJK ET AL., 1999) gegeben und bis zum 7. bzw. 8. Tag weiter kultiviert. Die unreifen MoDC mit veils differenzierten in Richtung reife MoDC mit vielen kleinen Ausläufern, welche zu einem „Igel“-förmigen Aussehen führten. In den Kulturen der reifen MoDC konnten zum Teil größere cluster und kaum noch adhärente Zellen beobachtet werden (siehe Abbildung 6 und Abbildung 7). Abbildung 6: 8 Tage alte reife MoDC aus Monozyten differenziert. Am 5. Tag wurden zu den unreifen MoDC 100 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-1β, 10 ng/ml TNF-α und 1 µg/ml PGE2 gegeben und für weitere 2-3 Tage unter diesen Kulturbedingungen kultiviert und im Anschluss im Phasenmikroskop betrachtet. Abbildung 7: 7 Tage alte reife MoDC aus Monozyten differenziert. Am 5. Tag wurden zu den unreifen MoDC 2 mg/ml Poly I:C und 500 U/ml IFN-α gegeben und für weitere zwei Tage unter diesen Kulturbedingungen kultiviert und im Anschluss im Phasenmikroskop betrachtet. 73 ERGEBNISSE 3.1.2 Vergleich der Expression der Oberflächenantigene auf unreifen dendritischen Zellen bei Mammakarzinompatientinnen mit denen gesunder Spender Frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe von Prof. J. H. Peters haben gezeigt, dass es bei Monozyten, die mit dem so genannten „Triple-Mix“ (300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ) kultiviert wurden, im Vergleich mit einer Zytokin-freien Monozytenkultur zu einer Heraufregulation der charakteristischen und funktionellen Oberflächenantigene kommt (KRÄMER, 1993; XU ET AL., 1995; PEISER, 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Monozyten sich in der Gegenwart von Mammakarzinomund Melanomzelllinien zu MoDC ausdifferenzieren lassen und für einen Einsatz in einer Immuntherapie zur Verfügung stehen (HOLLMANN, 1998; MATTHES, 1998). Diese Ergebnisse gaben den Anlass dazu, MoDC in einer Immuntherapie bei Mammakarzinompatientinnen in einer Phase-I/II-Studie einzusetzen und MoDC von Patientinnen studienbegleitend zu untersuchen. Zur Untersuchung patienteneigener Hemmfaktoren auf den Differenzierungsgrad unreifer MoDC wurden MoDC von gesunden Spendern mit denen von Patientinnen verglichen. Hierzu wurden Oberflächenantigene analysiert, welche für MoDC charakteristisch sind und für eine Initiierung einer spezifischen Immunantwort bzw. bei der Aktivierung von T-Zellen notwendig sind. Charakteristische Moleküle auf MoDC sind das CD1a, welches ebenfalls auf natürlichen Langerhans-Zellen vorkommt, CD83 (ein Molekül auf reifen zirkulierenden dendritischen Zellen), CD14, der LPS-Rezeptor auf Monozyten sowie der Makrophagenmarker CD64. Antigene können je nach Art der Aufnahme und ihren Eigenschaften auf MHC-Kl I (HLA-ABC) oder -Kl II (HLA-DR, DP, DQ) -Moleküle geladen und anschließend auf der Oberfläche von MoDC präsentiert werden. Für eine spezifische Immunantwort und Aktivierung von T-Zellen sind die costimulatorischen Signale CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) von essentieller Bedeutung. Das Adhäsionsmolekül CD11c bindet an CD18, welches auf Leukozyten exprimiert ist. In der Antigenen-Ausstattung verglichen wurden Patientenmonozyten an Tag 0 und unreife MoDC an Tag 7. Die Expression der Oberflächenantigene von unreifen MoDC wurde bei Patientinnen und Spendern an Tag 7 verglichen. Retrospektiv wurde die 74 ERGEBNISSE Differenzierung der unreifen MoDC bei den Patientinnen in Relation zum klinischen Ansprechen ausgewertet. 3.1.2.1 Expressionsprofil zellulärer Oberflächenantigene der Monozyten und unreifen dendritischen Zellen von einer Mammakarzinompatientin Frisch isolierte Monozyten der Patientin 5 (siehe Tabelle 5) wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ kultiviert. Die Veränderung der oben genannten charakteristischen und funktionellen Oberflächenantigene wurde durch eine direkte Immunfluoreszenzfärbung und eine durchflusszytometrische Analyse an Tag 0 und an Tag 7 gemessen (siehe Abbildung 8). 75 ERGEBNISSE Abbildung 8: Vergleich der Oberflächenantigene von Monozyten und MoDC der Patientin 5 im Histogramm dargestellt. Monozyten der Patientin 5 wurden an Tag 0 und MoDC der Patientin 5 wurden an Tag 7 durchflusszytometrisch analysiert. In den Kurven ist die Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Ereignisse der Monozyten an Tag 0 (graue Kurve) und der MoDC an Tag 7 (schwarze Kurve) in einem overlay aufgetragen. Die durchflusszytometrische Analyse der Monozyten und MoDC der Patientin 5 ergab eine deutliche Herunterregulation des Monozytenmarkers CD14 und des Makrophagenmarkers CD64. Parallel dazu kam es zu einer Heraufregulation des für 76 ERGEBNISSE unreife MoDC relevanten Markers CD1a. Die vermehrte Fähigkeit zur Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen ist durch die erhöhte Expression von HLADR, CD11c und den costimulatorischen Signalen CD80 und CD86 gegeben. 3.1.2.2 Vergleich der Prozentzahl positiver Zellen mit relativer Fluoreszenzintensität (RFI) bei Oberflächenantigenen unreifer dendritischer Zellen von Patientinnen und gesunden Spendern Um immunsuppressive Einflüsse von Tumoren und Vortherapien (wie z. B. Chemotherapie und Bestrahlung) auf die Differenzierung von MoDC bei Patientinnen zu untersuchen, wurde der Differenzierungsstatus von MoDC bei Patientinnen und Spendern verglichen. Dazu wurden von n=16 Mammakarzinompatientinnen (siehe Tabelle 5) und n=17 gesunden Spendern (n=16 weibliche und n=1 männlicher Spender) Monozyten aus dem Vollblut isoliert. Innerhalb von 7 Tagen wurden diese, mit den oben genannten Kulturbedingungen, zu unreifen MoDC generiert (siehe 3.1.2.1). Die Zellen wurden nach sieben Tagen geerntet, durchflusszytometrisch analysiert und nach ∆ % positive Zellen bzw. im Vergleich RFI ausgewertet. In diese Auswertung wurden alle rekrutierten Studienpatientinnen mit einem Mammakarzinom und zusätzlich Mammakarzinompatientinnen, welche außerhalb der Studie mit einer dendritischen Zelltherapie behandelt wurden und bei denen es möglich war für zusätzliche Analyse ausreichend Zellmaterial zu gewinnen, aufgenommen. 77 ERGEBNISSE a) 120 HLA-DR CD11c CD86 ∆% positive Zellen 100 80 Pat. Sp. Pat. Sp. n.s. n.s. Pat. Sp. n.s. CD1a 60 CD80 CD14 40 CD83 20 0 -20 b) Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. p=0,005 n.s. n.s. Pat. Sp. n.s. 800 600 p=0,039 p=0,039 HLA-DR RFI 400 200 n.s. CD14 n.s. CD11c n.s. CD1a n.s. CD83 n.s. CD80 n.s. CD86 0 Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Pat. Sp. Abbildung 9: Phänotyp 7 Tage alter MoDC von Patientinnen und Spendern in (a) ∆ % positive Zellen und in (b) RFI dargestellt. Monozyten der Patientinnen und Spender wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ kultiviert. Im Mittel + SD dargestellte ∆ % positive Zellen (a) und RFI (b) der in der durchflusszytometrischen Analyse untersuchten Oberflächenantigene von n=16 Patientinnen (Pat.) und n=17 Spendern (Sp.). Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mit dem T-Test bestimmt, nicht signifikante Unterschiede wurden mit n.s. angegeben. Die vergleichenden Analysen der unreifen dendritischen Zellen von Patientinnen und Spendern weisen signifikante Unterschiede in der Expression der Oberflächenantigene 78 ERGEBNISSE auf. Insbesondere die Heraufregulation von CD1a ist bei den gesunden Spendern signifikant höher als bei den Patientinnen in der Prozentzahl positiver Zellen (p=0,005). Die Antigendichte (RFI) von CD1a ist im Mittel bei den Patientinnen mit 0,58 und bei den Spendern mit 11,6 ebenfalls unterschiedlich, aber nicht signifikant. Von den stark exprimierten Antigenen HLA-DR, CD11c und CD86 auf MoDC ist das Transplantationsantigen HLA-DR in der RFI auf den Zellen der Spender signifikant höher (p=0,039) als auf den Zellen der Patientinnen vertreten. Das costimulatorische Molekül CD80 ist im Mittel in der Prozentzahl positiver Zellen mit 15,39 % bei den Patientinnen und 26,47 % bei den Spendern sowie in der RFI mit 0,065 bei den Patientinnen und 4,02 bei den Spendern höher auf den Zellen der Spender im Vergleich zu den Zellen der Patientinnen exprimiert. Sowohl die Unterschiede in der RFI als auch die Positivität der Zellen des B7.1-Moleküls waren nicht signifikant. Geringe Unterschiede konnten im Mittel bei der Herunterregulation des CD14 bei Patientinnen (20,52 %) und Spendern (17,46 %) und der Heraufregulation von CD83 mit 11,77 % bei den Patientinnen und 14,35 % bei den Spendern gemessen werden. Diese Unterschiede waren ebenfalls nicht signifikant. Darüber hinaus war bei beiden Gruppen eine hohe interindividuelle Varianz zu verzeichnen. 3.1.2.3 Vergleich der Oberflächenantigene auf unreifen dendritischen Zellen von Patientinnen in Relation zum klinischen Ansprechen Um zu untersuchen, ob der Grad der Erkrankung der Patientinnen eine Rolle bei der Differenzierungsfähigkeit von MoDC spielen könnte oder ob der Differenzierungsstatus der unreifen MoDC von Patientinnen einen Einfluss auf den Therapieerfolg haben könnte, wurde das Patientenkollektiv (n=16) (siehe Tabelle 5) retrospektiv in nonresponder-Patienten und responder-Patienten aufgeteilt. Die Patientinnen erhielten 1-25 dendritische Zellvakzinen, der Verlauf der Erkrankung wurde in diesem Zeitraum dokumentiert. Parallel wurden zu jeder dendritischen Zelltherapie Interferone als Begleitmedikation gegeben. Einige außerhalb der Studie behandelte Patientinnen erhielten auch noch andere Standardtherapien parallel zu den dendritischen Zell- 79 ERGEBNISSE vakzinen, unter welchen sie bereits zuvor progredient waren. In die Gruppe der nonresponder-Patientinnen wurden alle Patientinnen (n=7) aufgenommen (siehe Tabelle 5), die unter der dendritischen Zelltherapie progredient (progression desease PD) waren. Zu den responder-Patientinnen wurden Patientinnen (n=9) gezählt (siehe Tabelle 5), welche ein Ansprechen auf die Therapie zeigten, die Patientinnen hatten in dieser Zeit entweder einen Tumormarkerabfall, einen stabilen Erkrankungsverlauf (stable desease SD), eine Partial- (partial remission PR) oder Vollremission (complete remission CR). Die klinische Auswertung der responder- und non-responder-Patientinnen wurde anhand der WHO-Kriterien durchgeführt. 80 ERGEBNISSE a) 120 HLA-DR CD11c CD86 ∆ % positive Zellen 100 res. 80 n-res. n-res. res. res. 60 CD14 n-res. p = 0,04 CD1a CD80 40 CD83 20 res. 0 -20 res. n-res. res. n-res. res. n-res. n-res. b) 100 80 CD11c 60 40 RFI HLA-DR CD86 20 CD14 0 CD1a CD83 CD80 res. n-res. res. res. res. res. res. res. n-res. n-res. n-res. n-res. n-res. n-res. -20 Abbildung 10: Phänotyp 7 Tage alter MoDC von non-responder- und responder-Patientinnen in (a) ∆ % positive Zellen und in (b) RFI dargestellt. Monozyten der Patientinnen wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ kultiviert. Im Mittel + SD dargestellte ∆ % positive Zellen (a) und RFI (b) der in der durchflusszytometrischen Analyse untersuchten Oberflächenantigene von n=9 responder-Patientinnen (res.) und n=7 non-responderPatientinnen (n-res.). Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem T-Test bestimmt. 81 ERGEBNISSE Im Vergleich der beiden Patientengruppen ist der Differenzierungsstatus der nonresponder-Patientinnen nochmals deutlich verringert gegenüber den responderPatientinnen. Unter den non-responder-Patientinnen exprimierten signifikant weniger Zellen CD1a (p=0,04) im Vergleich zu den Zellen der responder. Im Mittel war bei 23,58 % der responder-Patientinnen und bei 4,86 % der non-responder-Patientinnen weniger CD80 exprimiert. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Geringe Unterschiede im Mittel konnten bei der Herunterregulation von CD14 und der Heraufregulation in der RFI bei CD11c, HLA-DR und CD86 zwischen responder- und non-responder-Patientinnen festgestellt werden; diese waren ebenfalls nicht signifikant. Keine Unterschiede ergaben sich in der Expression von CD83. Patientin Alter 82 TNM 1 46 2 54 3 53 4 39 5 66 6 44 7 64 pT1 pN1 M0 G2 8 43 pT1c pN0 G3 2. Karzinom pT2pN3/8 G2 Therapie vor DC pT2 pN2 M0 G3 Primär-OP Rezidiv-OP Bestrahlung Mistel pT4b pN2 R1 Primär-OP G3 M2 Chemo. Bestrahlung Herceptin/Taxol pT2 pN1 M0 Primär-OP Bestrahlung Hormon Chemo. pT3 pN2biii Primär-OP Mx Chemo. Hormon Bestrahlung Muc-1-Vakzine pT3 pN1M1 Chemo. inoperabl Hormon pT2 pN0 G2 Primär-OP Bestrahlung Primär-OP Rezidiv-OP Chemo. Bestrahlung Hormon Primär-OP Rezidiv-OP Chemo. Hormon Bestrahlung Hyperthermie Metastasierung vor DC Art DC klinisches Ansprechen lokal LK Rezidiv Knochen DC + TZ-Lysat non-res. PD ossäre Metastasen Pleuraerguss Lunge Knochen Lokalrezidiv Leber Pleura + Aszites Leber Leber Knochen Lokalrezidiv Hautmetastasen Lunge Lokalrezidiv Lokalrezidiv Haut Zweitkarzinom: andere Brust Rezidiv Knochen DC ohne non-res. TZ-Lysat PD ossäre + + pulmonale Herceptin Metastasen DC ohne non-res. TZ-Lysat PD der Lebermetastase DC ohne TZ-Lysat und DC + TZ-Lysat DC ohne TZ-Lysat DC ohne TZ-Lysat DC ohne TZ-Lysat DC ohne TZ-Lysat + Chemo responder CR Leber CR Pleura, Aszites, Peritoneum responder SD non-res. PD pulmonale Metastasen responder SD responder SD ERGEBNISSE 9 48 keine Angaben Primär-OP Hormon Knochen DC ohne TZ-Lysat 10 42 DC ohne TZ-Lysat 58 Knochen Leber 12 44 pT3 pN1M0 G2 Primär-OP re. Chemo Primär-OP li. Bestrahlung Hormon Primär-OP Chemo. Hormon Aredia Bestrahlung Primär-OP Chemo. Hormon Bestrahlung Knochen (Sternummetastase mit Weichteilinfiltration) 11 pT2 pN1 M0 rechts pT2pN0M0 G2 links pT4b pN2 M1 G3 DC ohne TZ-Lysat + DC + TZ-Lysat DC + TZ-Lysat 13 64 pT4 pNx M1 Primär-OP Hormon Ostac Bestrahlung 14 58 pT4b pN1b G3 M1 15 52 pT1 pN0 M0 Primär-OP Chemo. Hormon Bestrahlung ASI Hyperthermie Primär-OP Hormon 16 62 pT4bG3 (Hautrezidiv) pT4c pN1biv G2 M1 Primär-OP Hormon Aredia ovarielle Metastasierung Beckenwandrezidiv Knochen Pleurakarzinose Knochen Lunge Leber LK-Befall Hautrezidiv Leber Knochen non-res. PD ossäre Metastasen responder SD non-res. PD zerebrale Metastasen non-res. PD der Lunge DC ohne TZ-Lysat + Aromasin Zometa DC + TZ-Lysat + Chemo. Hormon responder SD DC ohne TZ-Lysat + Herceptin DC ohne TZ-Lysat + Hormon Ostac Aredia responder SD responder SD responder SD Tabelle 5: Die klinische Auswertung der analysierten responder- und non-responder-Patientinnen. Die klinische Auswertung in PD, SD, PR und CR wurde anhand der WHO-Kriterien durchgeführt. Aufgeführt wurden das Alter der Patientinnen bei Erstdiagnose, die TNM-Klassifikation des Primär- bzw. Sekundärkarzinoms und bisher durchgeführte Therapien. Mit der TNM-Klassifikation wird über T die Größe des Tumors, N der Lymphknotenbefall (LK-Befall) und M die Anzahl der Fernmetastasen in einem Schlüssel angegeben. Mit G wird das grading des Tumors angegeben. Lokalisation der Metastasen vor der DC-Therapie, Begleittherapien zur DC-Therapie und die Art der DC-Vakzine, ob mit oder ohne Tumorzell-Lysat beladen, wurden ebenfalls dokumentiert. 83 ERGEBNISSE Bei der Patientin 4 mit einer hepatischen Metastasierung, Peritonealkarzinose und Pleuraerguss konnte nach 3 Monaten und 3 dendritischen Zell-Vakzinierungen ohne Tumorzell-Lysat mittels Ultraschall, Computer-Tomographie (CT) und PositronenEmissions-Tomographie (PET) eine klinische Komplettremission der Peritonealkarzinose, des malignen Pleuraergusses und der multiplen, diffusen Lebermetastasierung festgestellt werden. Nach der 4. Vakzinierung waren die Tumormarker CEA und CA 15-3 bis auf den Normbereich abgefallen. Nach weiteren 6 Monaten der klinischen Komplettremission kam es bei der Patientin zu einem erneuten Tumormarkeranstieg (CA 15-3). Einen Monat später wurden ein Zweitkarzinom (Ovarialkarzinom) und ein erneuter Progress der Lebermetastasierung diagnostiziert und die Patientin verstarb nach weiteren 3 Monaten (NEßELHUT ET AL., 2004). Patientin 5 mit einem inoperablen Mammakarzinom erhielt unbeladene dendritische Zellen intratumoral in den Tumor in der Brust. Dadurch konnte eine teilweise Rückbildung des Tumors erzielt werden, insgesamt war die Patientin für 11 Monate stabil, danach trat eine Progression der Erkrankung in der Leber ein. Ebenfalls intratumoral wurden unbeladene dendritische Zellen bei der Patientin 8 in die Hautmetastasen eines Lokalrezidives appliziert. Sie hatte eine stabile Erkrankung für 12 Monate, sie entwickelte danach einen Progress der Knochenmetastasen und zerebrale Metastasen. Bei der Patientin 7 (Studienpatientin) mit einem axillären Lokalrezidiv konnte für 21 Monate ein stabiler Erkrankungsverlauf unter der DC-Therapie erzielt werden. Danach wurde ein Progress des Rezidivs in der Axilla diagnostiziert. Bei Patientin 10 (Studienpatientin) mit einer Sternummetastase und Weichteilinfiltrationen konnte mit der DC-Therapie ein stabiler Erkrankungsverlauf für 3 Monate erreicht werden. Ein Tumormarkerabfall und eine stabile Erkrankung für jeweils 7 Monate wurden bei Patientin 14 mit Leber-, Lungenmetastasen und Lymphknotenbefall sowie bei Patientin 15 mit einem Hautrezidiv und Lebermetastasen festgestellt. Die Patientinnen 13 und 16 mit Knochenmetastasen waren unter der DCTherapie und Begleittherapien für jeweils 19 und 15 Monate stabil (siehe Tabelle 5). Die Patientinnen 1, 2, 3 (Studienpatientin), 6 (Studienpatientin), 9, 11 und 12 (Studienpatientin) waren unter der dendritischen Zelltherapie progredient. 84 ERGEBNISSE 3.1.3 Funktionelle Untersuchungen der unreifen dendritischen Zellen und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen Es ist bekannt, dass Patienten mit fortgeschrittenen Karzinomen Funktionsstörungen im Immunsystem haben, die durch vom Tumor ausgehende Einflüsse induziert werden können. So konnten z. B. bei unreifen, CD1a-positiven dendritischen Zellen in Mammakarzinomen nur wenige oder keine Aktivierungsmarker gemessen werden (COVENTRY ET AL., 2002). Fehlfunktionen bei dendritischen Zellen und T-Zellen können auch durch Vortherapien, wie z. B. Chemotherapien, entstehen, welche zu einer signifikant geringen Anzahl an DC1-Zellen und einer erniedrigten IFN-γ-Produktion durch TH1-Zellen führt (FERRARI ET AL., 2005). Daher wurde die akzessorische Kapazität der dendritischen Zellen von den Patientinnen in einem autologen spezifischen T-Zellproliferationstest mit Tetanustoxoid als Antigen untersucht. Es wurde ausschließlich im autologen System gearbeitet, da sowohl die MoDC als auch die autologen Lymphozyten des Patienten im Zusammenhang untersucht werden sollten. Die Antigen-unabhängige Proliferationsfähigkeit der Lymphozyten wurde durch eine Mitogen-Stimulation mit PHA untersucht, ebenso wie deren Fähigkeit der Zytokinproduktion nach Tetanustoxoidstimulation. 3.1.3.1 Vergleich der akzessorischen Aktivität von unreifen dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen und Spendern mittels autologem TZellproliferationstest Monozyten wurden aus dem Vollblut über Adhärenz als Stimulatorzellen isoliert und die suspendierten Zellen desselben Patienten bzw. Spenders als Lymphozyten (responder-Zellen) gewonnen (siehe 2.2.2.2 und 2.2.2.6). Während die Monozyten 7 Tage zu MoDC in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ ausdifferenziert wurden, wurden die Lymphozyten kryokonserviert. Nach 7 Tagen wurden die MoDC geerntet und mit 1x104 pro Napf ausplattiert. Die Lymphozyten wurden nach dem Auftauen und einer zweiten Adhärenz, um tote Zellen und restliche Monozyten abzureichern, mit 1x105 pro Napf eingesetzt. Tetanustoxoid wurde als Antigen mit 3 Lf pro Napf hinzugegeben sowie Kontrollen mitgeführt. Im 85 ERGEBNISSE Mittel + SD wurden die Proliferationstests bei n=6 Patientinnen (Patientin 3, 5, 6, 7, 10 und 12 siehe Tabelle 5) und n=8 gesunde Spenderinnen (siehe 3.1.2.2) ausgewertet (siehe Abbildung 11). n=6 Mamma-Ca Patientinnen n=8 gesunde Spender 60000 50000 dpm 40000 30000 20000 10000 0 MoDC Abbildung 11: Autologe Lymphozyten MoDC+Lymphozyten Lymphozytenproliferation mit MoDC, MoDC+Lymphozyten+TT Lymphozyten und mit Tetanustoxoid als Antigen von Patientinnen und gesunden Spendern. Die Mittelwerte + SD von n=6 Mammakarzinompatientinnen (weiße Balken) und n=8 gesunden Spenderinnen (graue Balken) sind in den Kontrollen: MoDC allein, Lymphozyten allein und MoDC und Lymphozyten, sowie der Proliferationstest mit MoDC, Lymphozyten und Tetanustoxoid dargestellt. Die Proliferation der Lymphozyten wurde mittels [3H] – Thymidin-Markierung gemessen und in dpm angegeben. Der Proliferationstest zeigte im Mittel mit 28.006 dpm eine geringere akzessorische Aktivität der Patienten-MoDC im Vergleich zu den Spender-MoDC mit im Mittel 34.443 dpm. Der Unterschied der akzessorischen Aktivität der Patienten- und SpenderMoDC war nicht signifikant. Bei dem Patientenproliferationstest war eine höhere interindividuelle Varianz mit einer SD von 25.022 dpm zu messen als bei den Spenderinnen mit einer SD von 14.857 dpm. Bei beiden Gruppen konnte eine Autoproliferation der Lymphozyten in den Kontrollen gemessen werden. 86 ERGEBNISSE 3.1.3.2 Vergleich der Lymphozytenproliferation nach PHA-Stimulation bei Patientinnen und Spendern Mit dem polyklonalen Mitogen PHA wurde die Antigen-unabhängige Proliferationsfähigkeit von Lymphozyten bei n=6 Patienten (Patientin 3, 5, 6, 7, 10 und 12 siehe Tabelle 5) und n=8 gesunde Spenderinnen (siehe 3.1.2.2) untersucht. n=6 Mamma-Ca Patientinnen n=8 gesunde Spender 160000 140000 120000 100000 dpm 80000 60000 40000 20000 0 MoDC Lymphozyten MoDC+Lymphozyten MoDC+Lymphozyten+PHA Abbildung 12: Autologe Lymphozytenproliferation mittels Mitogenstimulation mit PHA Die Mittelwerte + SD der Lymphozyten ohne und mit PHA sind von n=6 Mammakarzinompatientinnen (weiße Balken) und n=8 gesunden Spenderinnen (graue Balken), sowie den Kontrollen dargestellt. Die Proliferation der Lymphozyten wurde mittels [3H] – Thymidin-Markierung gemessen und in dpm angegeben. Die Lymphozyten von beiden Gruppen ließen sich durch PHA zur Proliferation bringen. Die Lymphozytenproliferationsfähigkeit der Patientinnen war im Mittel mit 76.098 dpm ebenfalls geringer als die der Spenderinnen mit 93.250 dpm. Der Unterschied der Lymphozytenproliferation war nicht signifikant. Auch hier konnte bei den Patientinnen eine größere Varianz bei einer SD von 64.005 dpm im Vergleich zu den Spenderinnen mit einer SD von 58.687 dpm festgestellt werden (siehe Abbildung 12). 87 ERGEBNISSE 3.1.3.3 Vergleich der TH1/TH2-Zytokinsekretion in der spezifischen TZellaktivierung mit Tetanustoxoid von Mammakarzinompatientinnen und Spendern Eine weitere Effektorfunktion der T-Zellen ist die Sekretion von Zytokinen nach erfolgter Antigenaufnahme und -präsentation von dendritischen Zellen sowie der damit verbundenen T-Zellaktivierung. Durch eine effektive Antigenpräsentation in Verbindung mit Costimulation durch MoDC sezernieren T-Zellen IL-2, expandieren und differenzieren zu T-Effektorzellen, welche jeweils spezielle TH1- und TH2-Zytokine produzieren können. Da diese Zytokinproduktion am Ende einer durch antigenpräsentierende Zellen (APC) vermittelten T-Zellimmunantwort steht, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob durch MoDC und T-Zellen von Mammakarzinompatientinnen und dem Antigen Tetanustoxoid TH1- und TH2-Zytokine effizient im Vergleich zu Spendern sezerniert werden. Dafür wurden aus 2 Tage alten autologen T-Zellproliferationstests mit Tetanustoxoid von n=3 Patientinnen (Patientin 3, 7 und 10 siehe Tabelle 5) und n=3 gesunden Spenderinnen (siehe 3.1.2.2; 3.1.3.1 sowie 3.1.3.2) Kulturüberstände gesammelt (siehe 2.2.4.1). Bei diesen wurden durchflusszytometrisch mithilfe des CBA-Tests (siehe 2.2.5.3) die TH1-Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-2 sowie die TH2-Zytokine IL-4, IL-6 und IL-10 analysiert und quantifiziert (siehe 2.2.5.3). 88 ERGEBNISSE a) Patientinnen MoDC Lymph MoDC+Lymph Lymph+TT MoDC+Lymph+TT IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 100 200 300 400 500 600 pg/ml 700 800 900 1000 b) gesunde Spender MoDC Lymph MoDC+Lymph Lymph+TT MoDC+Lymph+TT IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 100 200 300 400 pg/ml 500 600 700 800 Abbildung 13 a Patientinnen und b gesunde Spenderinnen: TH1/TH2-Zytokinfreisetzung im autologen Proliferationstest mit Tetanustoxoid als Antigen von n=3 Mammakarzinompatientinnen und n=3 Spenderinnen. Monozyten von Patienten und Spendern wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ kultiviert, geerntet und zusammen mit den autologen Lymphozyten in ein autologen Lymphozytenproliferationstest mit Tetanustoxoid als Antigen eingesetzt. Nach 2 Tagen Kokulturdauer des Proliferationstests wurden Kulturüberstände geerntet und in einem Partikel-basierten-Immuno-assay (CBA) durchflusszytometrisch gemessen. Anhand der Standardkurve, welche logarithmisch aufgetragen wurde, wurden die Messdaten der Proben quantitativ ausgewertet. Von den erhobenen Werten der n=3 Patientinnen (a) und n=3 Spenderinnen (b) wurden Mittelwerte gebildet und in obiger Graphik dargestellt. 89 ERGEBNISSE Patienten pg/ml MoDC Lymphozyten MoDC+ Lymphozyten Lymphozyten + TT MoDC+TT+ Lymphozyten IFN-γγ 0 TNF-α α 98,5 IL-10 0 IL-6 35,2 IL-4 0 IL-2 0 (0; 0; 0) (295,6; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 105,6) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 100,1 19,9 0 306,3 0 0 (0; 113,6; 186,6) (59,6; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 520,8; 398) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 41 66,4 0 128,4 0 0 (123; 0; 0) (199,2; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 169,2; 216) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 301,9 54 0 566,5 0 56,6 (0; 242; 663,8) (98,8; 0; 63,2) (0; 0; 0) (0; 908,8; 790,8) (0; 0; 0) (0; 42,8; 127) 378,5 78,3 0 998,2 0 115 (402; 318,8; 414,8) (234,8; 0; 0) (0; 0; 0) (239; 1363,8; 1391,8) (0; 0; 0) (233; 62,8; 49,2) Tabelle 6: Freisetzung der TH1/TH2-Zytokine in vitro durch Immunzellen von Patientinnen Mittelwerte und Rohdaten der TH1/TH2-Zytokine von n=3 Patientinnen aus autologen Lymphozytenproliferationstests mit Tetanustoxoid als Antigen Spender pg/ml MoDC Lymphozyten MoDC+ Lymphozyten Lymphozyten + TT MoDC+TT+ Lymphozyten IFN-γγ 0 TNF-α α 0 IL-10 0 IL-6 0 IL-4 0 IL-2 0 (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 0 0 0 27,8 0 0 (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (83,4; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 0 0 0 59,8 0 0 (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (98,3; 81,2; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 284,5 69,6 0 69,1 0 42,9 (80,5; 204; 569) 208,8; 0; 0) (0; 0; 0) (93; 73,2; 41) (0; 0; 0) (0; 21,5; 107,3) 706 71,8 0 162,3 0 184,8 (115; 591; 1412) (215,4; 0; 0) (0; 0; 0) (233,3; 145,4; 108,3) (0; 0; 0) (92,4; 207,2; 254,8) Tabelle 7: Freisetzung der TH1/TH2-Zytokine in vitro durch Immunzellen von gesunden Spenderinnen Mittelwerte und Rohdaten der TH1/TH2-Zytokine von n=3 Spenderinnen aus autologen Lymphozytenproliferationstests mit Tetanustoxoid als Antigen MoDC der Patientinnen produzierten TNF-α und geringe Mengen IL-6, die MoDC der Spenderinnen bildeten keine der getesteten Zytokine. Die Lymphozyten der Patientinnen sezernierten IL-6, IFN-γ und geringe Mengen TNF-α, die der Spenderinnen bildeten nur 90 ERGEBNISSE geringe Mengen IL-6. Bei den mit den autologen Lymphozyten kokultivierten MoDC der Patienten konnte ebenfalls TNF-α, IL-6 und wenig IFN-γ gemessen werden, bei den Spenderinnen wurden in dieser Probe lediglich geringe Mengen IL-6 detektiert. Das Antigen Tetanustoxoid allein mit Lymphozyten zusammen induzierte sowohl bei den Patientinnen als auch bei den Spenderinnen eine Sekretion der Zytokine IFN-γ, TNF-α, IL-6 und IL-2 (siehe Abbildung 13 und Tabelle 6 sowie Tabelle 7). Da die meisten Menschen gegen Tetanus immunisiert wurden, ist dies eine Sekundärimmunantwort durch so genannte Gedächtniszellen. Die größten Unterschiede zwischen Patienten und Spendern ergaben sich im vollständigen Versuchsansatz mit MoDC, Tetanustoxoid und Lymphozyten. Die Immunzellen der Patientinnen sezernierten in der durch Tetanustoxoid induzierten T-Zellantwort wesentlich höhere Mengen (998,2 pg/ml) des TH2-Zytokins IL-6 im Vergleich zu den Spenderinnen mit 162,3 pg/ml IL-6. Weiterhin produzierten die T-Zellen der Patientinnen nach Tetanustoxoidstimulation geringere Mengen des TH1-Zytokins IFN-γ (378,5 pg/ml). Die Spender-T-Zellen bildeten dagegen mit 706 pg/ml höhere Mengen an IFN-γ, was auf eine TH1-Immunantwort bei den Spenderinnen und eine TH2-Immunantwort bei den Patientinnen hinweist. Zusätzlich wurden von den Spender-T-Zellen höhere Mengen an IL-2 (184,8 pg/ml) produziert, was durch die höheren Proliferationsraten in der Lymphozytenproliferation von den Spenderinnen bestätigt wurde (siehe 3.1.3.1). 3.1.4 Untersuchungen zu verschiedenen Kulturbedingungen zur Generierung unreifer dendritischer Zellen von Patientinnen und gesunden Spendern Nachdem sowohl phänotypische als auch funktionelle Unterschiede in der Generierung unreifer MoDC von Patientinnen im Vergleich zu Spendern gezeigt werden konnten, sollte in den folgenden Versuchsreihen untersucht werden, ob die Zugabe von IFN-γ zu Beginn der Kultur, eine Steigerung der Zytokindosis von IL-4 und GM-CSF oder der Einfluss des Serums modulierend auf den Phänotyp wirkt. In der Arbeitsgruppe von Prof. Peters war eines der wesentlichen Argumente für IFN-γ in der Differenzierung von Monozyten zu MoDC, dass es die Steigerung der Expression von HLA-DR bewirkt (PETERS ET AL., 1993). Unklar ist allerdings, ob IFN-γ einen positiven Einfluss auf die 91 ERGEBNISSE Differenzierung von Patienten-MoDC hat; daher sollte die Auswirkung einer IFN-γ-Zugabe an Patientenzellen untersucht werden. Da höhere Konzentrationen an IL-4 und GM-CSF zurzeit standardmäßig in einigen Laboren zur Generierung von unreifen bzw. reifen MoDC eingesetzt werden (SALLUSTO THURNER ET AL., UND LANZAVECCHIA, 1994; 1999), stand hier ein mögliche Dosisabhängigkeit der Zytokine IL-4 und GM-CSF bei der Markerexpression der Patientinnen ebenfalls im Vordergrund. Im Serum von Patienten können Zytokine, Zytokinrezeptoren, Reifungsfaktoren wie CD40-Ligand und andere Faktoren enthalten sein, die die Differenzierung der Zellen in vitro beeinflussen könnten. Daher haben serumfreie Kulturen den Vorteil, dass die Differenzierung der Zellen unter definierteren Bedingungen verfolgt werden kann. 3.1.4.1 Der Einfluss von IFN-γγ auf die Generierung unreifer dendritischer Zellen von Patientinnen Monozyten wurden aus dem Vollblut von n=7 Mammakarzinompatientinnen (Patientin 2, 9, 11, 13, 14, 15 und 16 siehe Tabelle 5) über Plastikadhärenz isoliert und in den folgenden zwei Kulturansätzen: RPMI, 2,5 % autologes Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ und RPMI, 2,5 % autologes Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF parallel 7 Tage kultiviert. Die Zellen beider Ansätze wurden nach 7 Tagen morphologisch betrachtet, geerntet, gezählt, eine Färbung der membranständigen Antigene durchgeführt und im Anschluss im Durchflusszytometer analysiert. Von den n=7 Mammakarzinompatientinnen konnte nur von 5 Patientinnen (Patientin 2, 9, 13, 14, und 16) für die phänotypischen Untersuchungen ausreichend Zellen gewonnen werden. Für die funktionellen Untersuchungen wurden bei allen 7 Patientinnen genügend Zellen isoliert. 92 ERGEBNISSE a) mit IFN-γ kultivierte DC's ohne IFN-γ kultivierte DC's 120,00 90,96 93,82 95,53 ∆% positive Zellen 100,00 87,71 91,87 92,60 53,78 80,00 36,86 60,00 37,69 26,33 40,00 21,67 18,16 9,32 20,00 10,43 7,96 2,70 0,00 CD 14 CD11c HLA-DR b) CD83 CD1a mit IFN-γ kultivierte DC's CD80 CD86 CD64 ohne IFN-γ kultivierte DC's 80 37,51 70 60 50 RFI 22,03 40 17,11 30 20,39 14,80 20 10 0 0 0,01 CD 14 CD11c HLA-DR 0,93 1,53 1,85 0,49 0,06 0,22 CD83 CD1a CD80 1,81 CD86 0,24 0,17 CD64 Abbildung 14: Einfluss von IFN-γγ auf die Expression von Oberflächenantigenen von Patientinnen, Vergleich (a) ∆ % positive Zellen und in (b) RFI dargestellt. Monozyten der Patientinnen wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ (blaue Balken) und in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF (rote Balken) 93 ERGEBNISSE kultiviert. Im Mittel + SD dargestellte ∆ % positive Zellen und RFI der in der durchflusszytometrischen Analyse untersuchten Oberflächenantigene von n=5 Patientinnen. In der Kultur mit IFN-γ waren morphologisch größere Zellen, welche stärker granuliert und weniger adhärent waren, es konnten im Mittel aus 100 ml Vollblut der Patientinnen 5,1x106 MoDC mit IFN-γ generiert und 3,3x106 MoDC ohne IFN-γ generiert werden. Die Vitalität der MoDC mit IFN-γ war mit 95 % höher als bei den MoDC, welche ohne IFN-γ kultiviert (82 %) wurden. Die durchflusszytometrische Analyse der 7 Tage alten MoDC von Patientinnen, die mit oder ohne IFN-γ kultiviert wurden, zeigte bei der Prozentzahl positiver Zellen einen deutlichen Unterschied der charakteristischen Oberflächenmarker CD14, CD64, CD1a und CD83. Der LPS-Rezeptor (CD14) und der Makrophagenmarker (CD64) sind wesentlich geringer auf MoDC, welche ohne IFN-γ generiert wurden, exprimiert. Die charakteristischen Marker für unreife MoDC (CD1a) und reife MoDC (CD83) wurden in der IFN-γ-freien Kultur höher heraufreguliert als in der Kultur mit IFN-γ. Die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 und das Adhäsionsmolekül CD11c waren ebenfalls höher exprimiert auf MoDC, welche ohne IFN-γ kultiviert wurden, CD80 in der Prozentzahl positiver Zellen und CD86 sowie CD11c in der Antigendichte. Im Vergleich zu der IFN-γ-haltigen Kultur zeigte sich auf den MoDC ohne IFN-γ bei dem akzessorischen MHC-KL II-Molekül (HLA-DR) eine Heraufregulation in der Expressionsdichte, was diese Zellen zu einer vermehrten Antigenpräsentation befähigt. Daher wurde in den folgenden Versuchen die akzessorische Aktivität des Antigens Tetanustoxoid in einem autologen Lymphozytenproliferationstest durch MoDC, welche mit und ohne IFN-γ generiert wurden, untersucht. Die 7 Tage alten, mit und ohne IFN-γ kultivierten MoDC wurden geerntet, mit 1x104 pro Napf ausplattiert und Tetanustoxoid wurde als Antigen mit 3 Lf pro Napf hinzugegeben, Lymphozyten wurden mit 1x105 pro Napf eingesetzt. In den Kontrollen wurden einzelnen oder mehrere Zellpopulationen weggelassen. Im Mittel + SD wurden die Proliferationstests bei n=7 Patientinnen (Patientin 2, 9, 11, 13, 14, 15 sowie 16 siehe Tabelle 5) ausgewertet (siehe Abbildung 15). 94 ERGEBNISSE mit IFN-γ kultivierte DC's ohne IFN-γ kultivierte DC's 80000 70000 60000 dpm 50000 40000 30000 20000 10000 0 MoDC allein Lymph. allein MoDC+Lymph MoDC+Lymph+TT Abbildung 15: Akzessorische Aktivität von Patienten-MoDC, welche mit und ohne IFN-γγ kultiviert wurden und in einem autologen Lymphozytenproliferationstest mit Tetanustoxoid eingesetzt wurden. Monozyten der Patientinnen (2, 9, 11, 13, 14, 15 sowie 16 siehe Tabelle 5) wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ (blaue Balken) und in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF (rote Balken) kultiviert. Die Zellen wurden nach 7 Tagen geerntet und mit Tetanustoxoid als Antigen und mit den Lymphozyten als Responderzellen für weitere 5 Tage kultiviert. Am Tag 5 der Kokultur wurden die Zellen für 24 Stunden mit [3H]-Thymidin markiert und im β-Counter analysiert. Die Werte wurden in dpm im Mittel + SD dargestellt. Im Mittel konnte mit 36.419 dpm bei den mit IFN-γ generierten MoDC eine leicht höhere akzessorische Aktivität gemessen werden im Vergleich zu den ohne IFN-γ generierten MoDC mit 32.918 dpm. Bei beiden Gruppen war eine sehr hohe intraindividuelle Varianz zu messen, welche sich in den beiden Standardabweichungen widerspiegelt. Bei den MoDC ohne IFN-γ und den Lymphozyten ohne Tetanustoxoid wurde eine höhere Autoproliferation detektiert. 95 ERGEBNISSE 3.1.4.2 Expression der Oberflächenantigene unreifer dendritischer Zellen von gesunden Spendern unter verschiedenen Kulturbedingungen Nachdem der Einfluss von IFN-γ auf die Differenzierung von Patienten-MoDC analysiert wurde, wurde im Anschluss eine Zytokindosiserhöhung von IL-4 und GM-CSF sowie der Einfluss des Serums auf die Ausdifferenzierung von unreifen MoDC untersucht. Gegenwärtig existieren Protokolle mit unterschiedlichen IL-4- und GM-CSFKonzentrationen in der Literatur. JONULEIT ET AL., (1997) beschrieb ein Protokoll zur Differenzierung von dendritischen Zellen aus Monozyten mit einer weit höheren IL-4Konzentration (1000 U/ml). Andererseits wurde beschrieben, dass bei hohen IL-4 Konzentrationen so genannte disabeled DC entstehen können, welche in ihrer Migrationsfähigkeit eingeschränkt sein können (THURNHER ET AL., 2001). Anhand von Spender- zellen wurde in vier verschiedenen Kulturmodellen die Expression von Oberflächenantigenen miteinander verglichen. Dafür wurden Monozyten aus Leukapheresen von n=5 gesunden Spendern (Normalspender aus der Blutbank der Universität Göttingen) über Plastikadhärenz gewonnen und für 7 Tage unter den vier nachfolgenden Kulturbedingungen parallel kultiviert: (1) RPMI, 2,5 % autologes Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ; (2) RPMI, 2,5 % autologes Serum, 500 U/ml IL-4, 800 U/ml GM-CSF; (3) CellGro, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ; (4) RPMI, 2,5 % allogenes Patientenserum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ (siehe Abbildung 16 und Abbildung 17). Die Zellen wurden nach 7 Tagen geerntet, die Oberflächenantigene wurden gefärbt und im Anschluss durchflusszytometrisch analysiert. 96 100 40 30 20 10 ∆% positive Zellen ∆% positive Zellen ERGEBNISSE 1 3 2 0 4 96 92 88 1 2 3 4 84 CD14 HLA-DR 30 20 10 0 1 2 3 4 ∆% positive Zellen ∆% positive Zellen 40 80 60 40 20 0 1 2 CD83 3 4 CD1a 97 95 93 1 2 3 4 ∆% positive Zellen ∆% positive Zellen 60 99 40 20 0 91 1 CD11c 4 CD80 80 40 1 2 3 4 ∆% positive Zellen ∆% positive Zellen 3 100 120 0 2 80 60 40 20 1 2 3 4 0 CD86 CD64 Abbildung 16: Vergleich der Expression von Oberflächenantigenen unreifer MoDC Mittelwerte + SD der ∆ % positive Zellen von n=5 gesunden Spendern unter folgenden Kulturbedingungen dargestellt: Kulturbedingungen RPMI CellGro 2,5 % autologes Serum 2,5 % allogenes Serum IL-4 300 U/ml IL-4 500 U/ml GM-CSF 300 U/ml GM-CSF 800 U/ml IFN-γ 150 U/ml 1 + 2 + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + 97 6 120 4 80 RFI RFI ERGEBNISSE 2 0 40 1 2 3 1 4 CD14 3 4 HLA-DR 3 20 2 RFI RFI 2 0 10 1 0 1 2 3 4 0 1 2 CD83 RFI RFI 0,8 60 40 0,4 20 1 2 3 1 4 3 4 CD80 2 20 1 4 2 RFI 30 RFI 2 0 CD11c 10 4 CD1a 80 0 3 1 3 1 0 0 CD86 2 3 4 CD64 Abbildung 17: Vergleich der Expression von Oberflächenantigenen unreifer MoDC Mittelwerte + SD der RFI von n=5 gesunden Spendern unter folgenden Kulturbedingungen dargestellt: Kulturbedingungen RPMI CellGro 2,5 % autologes Serum 2,5 % allogenes Serum IL-4 300 U/ml IL-4 500 U/ml GM-CSF 300 U/ml GM-CSF 800 U/ml IFN-γ 150 U/ml 98 1 + 2 + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + ERGEBNISSE Das für Monozyten charakteristische Oberflächenantigen CD14 erfuhr die stärkste Herunterregulation in der Prozentzahl positiver Zellen und in der Antigendichte im Kulturmodell (3) unter komplett serumfreien Bedingungen. Die meisten positiven Zellen für CD14 und CD64 wurden unter der Standardkulturbedingung Kulturmodell (1) gemessen. Das Kulturmodell mit der hohen Zytokinkonzentration (2) und Kulturmodell (3) erzeugten eine komplette Herunterregulation des Makrophagenoberflächenantigens CD64. Die Oberflächenantigene CD1a und CD83 wurden in der Prozentzahl positiver Zellen und in der Antigendichte im Kulturmodell (2) am stärksten auf den Zellen exprimiert. Ebenso verhielt es sich mit den costimulatorischen Molekülen CD80 und CD86. Diese waren auf den Zellen, die mit der hohen Zytokinkonzentration (2) kultiviert wurden, in der Anzahl positiver Zellen und in der Antigendichte am höchsten heraufreguliert. Unter serumfreien Bedingungen im Kulturmodell (3) wurde die niedrigste Expression der beiden costimulatorischen Moleküle gemessen. Bei den stark exprimierten Oberflächenantigenen CD11c und HLA-DR konnte eine Steigerung der Antigendichte auf den Zellen aus dem Kulturmodell (2) beobachtet werden sowie die niedrigste Antigendichte an HLA-DR unter den Kulturbedingungen des Modells (3). Die niedrigste Expression des für die Antigenpräsentation wichtigen HLA-DR und der beiden costimulatorischen Moleküle, welche für eine T-Zellproliferation nach Antigenbindung erforderlich sind, fand unter serumfreien Bedingungen mit CellGro 300 U/ml IL4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ statt. Die Standardkultur (1) mit RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ und das Kulturmodell (4) mit der gleichen Zytokinkonzentration und dem allogenen Patientenserum verhielten sich bis auf die CD14-Expression annähernd gleich. Die höchste Expression der für unreife MoDC charakteristischen und funktionell wichtigen Oberflächenantigene konnte in dem Kulturmodell (2) mit RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF gemessen werden. Daher wurde für die weiteren Untersuchungen das Protokoll mit den Konzentrationen 800 U/ml GM-CSF und 500 U/ml IL-4 übernommen (ZHOU UND TEDDER, 1996). 99 ERGEBNISSE 3.1.5 Vergleich Phänotyp und Funktionalität der MoDC von Patientinnen unter Kulturbedingung 1 und 2 Die in dem vorhergehenden Abschnitt durchgeführten Untersuchungen zur Optimierung der Kulturbedingungen von unreifen MoDC wurden in dem folgenden Abschnitt auf die Generierung von unreifen MoDC von Mammakarzinompatientinnen übertragen. Hierfür wurde das Kulturmodell (2) (RPMI, 2,5 % autologes Serum, 500 U/ml IL-4, 800 U/ml GM-CSF), welches unter 3.1.4 die stabilste und höchste Expression charakteristischer und funktionell wichtiger Oberflächenantigene auf unreifen MoDC gezeigt hatte, hinsichtlich der Expression der Oberflächenantigene anhand einer größeren Patientenzahl (n=19 Patientinnen (Patientin 13 und 15 siehe Tabelle 5; Patientin 17 und 18 siehe Tabelle 13 sowie 15 weiteren Mammakarzinompatientinnen)) mit dem Kulturmodell (1) (n=16 Patientinnen (siehe Tabelle 5)) verglichen. Da zu diesem Zeitpunkt die Studie beendet war und einige der Patientinnen, welche unter 3.1.2.2 ausgewertet wurden verstorben oder nicht mehr in Behandlung waren, mussten die folgenden Untersuchungen zum Teil an weiteren Mammakarzinompatientinnen durchgeführt werden. Der Vergleich der Funktionalität, mittels der Antigen induzierten TH1/TH2-Zytokinsekretion von T-Zellen, erfolgte am Kulturmodell (2) an n=4 Patientinnen, diese vier Patientinnen gehören ebenfalls zu den bereits oben erwähnten 15 weiteren Mammakarzinompatientinnen, sowie n=3 Spendern (Normalspender der Blutbank, Universität Göttingen). 3.1.5.1 Oberflächenantigene Die hierfür verwendeten Monozyten wurden über Plastikadhärenz aus dem Vollblut oder aus Leukapheraten von n=19 Patientinnen gewonnen. Die Monozyten wurden für 7 Tage kultiviert. Nach 7 Tagen wurden die Zellen geerntet, die Oberflächenantigene gefärbt und im Durchflusszytometer analysiert. Die Expression der Oberflächenantigene auf unreifen MoDC von den n=19 Patientinnen wurde im Mittel in der ∆ % positiver Zellen und RFI mit den unter 3.1.2.2 erhobenen Daten der MoDC von n=16 Patientinnen, welche in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ generiert wurden, verglichen. 100 ERGEBNISSE a) 120 HLA-DR CD11c n.s. p=0,024 CD86 100 ∆% positive Zellen 80 n.s. CD1a CD83 60 CD80 CD14 40 20 p=0,0001 p=0,0001 p=0,0015 0 p=0,0031 -20 b) 160 140 120 HLA-DR RFI 100 CD11c 80 60 CD86 40 20 0 CD14 CD1a CD83 CD80 p=0,01 n.s. n.s. p=0,0154 n.s. p=0,0084 p=0,002 -20 Abbildung 18: Phänotyp 7 Tage alter MoDC von n=16 Mammakarzinompatientinnen (blaue Punkte) und von n=19 Mammakarzinompatientinnen (rote Punkte) in (a) ∆ % positive Zellen und in (b) RFI dargestellt. Monozyten der Patientinnen wurden 7 Tage in den beiden oben genannten Kulturbedingungen (1) und (2) kultiviert. Im Mittel + SD dargestellte ∆ % positive Zellen (a) und RFI (b) der in der durchflusszytometrischen Analyse untersuchten Oberflächenantigene von n=16 Patientinnen (Kulturmodell 1) und n=19 Patientinnen (Kulturmodell 2). Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mit dem T-Test bestimmt, nicht signifikante Unterschiede wurden mit n.s. angegeben. 101 ERGEBNISSE Der Vergleich der unreifen dendritischen Zellen von Patientinnen zwischen denen im Kulturmodell (1) und (2) generierten Zellen ergab signifikante Unterschiede in der Prozentzahl positiver Zellen und/oder in der RFI bei allen untersuchten Oberflächenantigenen. Insbesondere war eine Heraufregulation des DC-spezifischen Markers CD1a festzustellen, welcher sowohl in der % positiver Zellen (p=0,001) als auch in der RFI (p=0,01) signifikant höher auf den Zellen des Kulturmodells (2) exprimiert war. Bei dem CD83 konnte ebenfalls eine signifikant höhere Expression (p=0,001) in dem Anteil positiver Zellen des Kulturmodells (2) verzeichnet werden. Die hoch exprimierten Oberflächenantigene HLA-DR, CD11c und CD86 wurden auf den Zellen des Kulturmodells (2) in der Antigendichte (RFI) signifikant gesteigert. Das costimulatorische Molekül CD80 war ebenfalls signifikant (p=0,0015) auf einem höheren Anteil positiver Zellen des Kulturmodells (2) exprimiert. MoDC des Kulturmodells (2) können durch die erhöhte Expression der costimulatorischen Moleküle eine gesteigerte spezifische TZellproliferation induzieren. Die signifikant geringere Expression von CD14 (p=0,0031) auf den Zellen den Kulturmodells (2) weist auf einen stabileren, unreifen MoDC-Status unter dieser Kulturbedingung hin; gleichwohl waren bei beiden Gruppen wiederum hohe Varianzen innerhalb einer Gruppe zu verzeichnen. 3.1.5.2 Vergleich der TH1/TH2-Zytokinsekretion nach spezifischer T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und MoDC von Patientinnen und Spendern unter Kulturbedingung 2 generiert Um die akzessorische Aktivität der unter Kulturbedingung (2) generierten MoDC von Patientinnen und Spendern und deren Fähigkeit, spezifische T-Zellen zur Proliferation anzuregen, zu untersuchen, wurden TH1/TH2-Zytokine nach spezifischer T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und den unter Kulturbedingung (2) generierten MoDC mittels CBA analysiert. Die hier aufgeführten Daten wurden mit den unter Abschnitt 3.1.3.3 erhobenen Daten von Patientinnen- und Spender-MoDC, welche unter Kulturbedingung (1) generiert wurden, verglichen. 102 ERGEBNISSE Patienten pg/ml MoDC Lymphozyten MoDC+ Lymphozyten Lymphozyten + TT MoDC+TT+ Lymphozyten IFN-γγ 0 TNF-α α 0 IL-10 0 IL-6 7,4 IL-4 0 IL-2 0 (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0;0) (0; 0; 0; 29,4) (0; 0; 0, 0) (0; 0; 0; 0) 0 0 0 0 0 0 (0; 0, 0; 0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0;0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) 13,9 0 5 0 0 0 (55,4; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) (20,1; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) 29,3 0 0 87,4 0 0 (52,5; 0; 39,4; 25,3) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0;0) (0; 200,2; 0; 149,4) (0; 0; 0; 0) (0; 0; 0; 0) 446,6 30,5 14,1 114,5 0 186,5 (226,5; 547,6; 660,9; 351,4) (60,8; 0; 38,9; 22,4) (0; 15,1; 41,1; 0) (59,8; 110,5; 92,1; 195,5) (0; 0; 0; 0) (0; 202; 383; 161) Tabelle 8: Zytokinsekretion nach Kulturmodell (2) von n=4 Patientinnen: Mittelwerte und Rohdaten der TH1/TH2-Zytokine aus einem autologen Lymphozytenproliferationstest mit Tetanustoxoid als Antigen und mit MoDC, welche in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL4 und 800 U/ml GM-CSF generiert wurden. Die Daten wurden durchflusszytometrisch mittels CBAassay erhoben und ausgewertet. Spender pg/ml MoDC Lymphozyten MoDC+ Lymphozyten Lymphozyten + TT MoDC+TT+ Lymphozyten IFN-γγ 0 TNF-α α 0 IL-10 0 IL-6 0 IL-4 0 IL-2 0 (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 14,1 0 0 0 0 0 (42,3; 0, 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 13,7 0 0 9,7 0 0 (41,1; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 0) (0; 0; 29) (0; 0; 0) (0; 0; 0) 203,6 167,3 0 85,7 0 311,3 (103,5; 75,3; 432) (0; 0; 502) (0; 0; 0) (35; 0; 222) (0; 0; 0) (26; 196;712) 2499,9 1056,2 0 166,5 9 669,6 (1220,3; 515,3; 5764) (48,1; 34; 3086,5) (0; 0; 0) (52; 0; 447,6) (0; 26,9; 0) (42,6; 449; 1517,3) Tabelle 9: Zytokinsekretion nach Kulturmodell (2) von n=3 Spendern: Mittelwerte und Rohdaten der TH1/TH2-Zytokine aus einem autologen Lymphozytenproliferationstest mit Tetanustoxoid als Antigen und mit MoDC, welche in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF generiert wurden. Die Daten wurden durchflusszytometrisch mittels CBA-assay erhoben und ausgewertet. 103 ERGEBNISSE a) Patientinnen MoDC Lymph MoDC+Lymph Lymph+TT MoDC+Lymph+TT IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 50 100 150 200 250 pg/ml 300 350 400 450 b) gesunde Spender MoDC Lymph MoDC+Lymph Lymph+TT MoDC+Lymph+TT IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 500 1000 pg/ml 1500 2000 2500 Abbildung 19: TH1/TH2 Zytokinsekretion nach spezifischer T-Zellaktivierung mit MoDC aus Kulturmodell (2) und Tetanustoxoid als Antigen von n=4 Mammakarzinompatientinnen (a) und n=3 Spendern (b) (siehe oben unter 3.1.5). Von den erhobenen Werten der n=4 Patientinnen (a) und n=3 Spender (b) wurden Mittelwerte gebildet und in der obigen Graphik dargestellt. MoDC allein blaue Balken, Lymphozyten allein orange Balken, MoDC und Lymphozyten gelbe Balken, Lymphozyten und Tetanustoxoid hellblaue Balken sowie MoDC, Lymphozyten und Tetanustoxoid weinrote Balken. Die durch Patientinnen- bzw. Spender-MoDC, die im Kulturmodell (2) generiert wurden, und Tetanustoxoid vermittelte T-Zellzytokinproduktion der TH1-Zytokine konnte im Mittel bei Patientinnen und Spendern gesteigert werden (siehe 3.1.3.3). Die Produktion von IFN-γ nach Tetanustoxoidstimulation wurde bei den Spendern (von 706 pg/ml auf 2499,9 pg/ml) im Mittel deutlich höher heraufreguliert als bei den Patientinnen (siehe Tabelle 7 und Tabelle 9). Die durch Spender-MoDC und durch 104 ERGEBNISSE Tetanustoxoid aktivierten T-Zellen produzierten ebenfalls im Mittel höhere Mengen IL-2 und TNF-α als unter Kulturmodell (1) (siehe 3.1.3.3) sowie mehr als die PatientenT-Zellen, welche durch MoDC aus dem Kulturmodell (2) und Tetanustoxoid, aktiviert wurden (siehe Tabelle 8, Tabelle 9 und Abbildung 19). Unter Kulturbedingung (2) generierte Patienten-MoDC produzierten nach 48 Stunden sehr geringe Mengen IL-6. Bei den T-Zellen ohne Antigen und ohne MoDC wurde keine Zytokinsezernierung der getesteten Zytokine gemessen. In der Kontrolle MoDC und Lymphozyten wurden sehr geringe Mengen an IFN-γ und IL-10 gemessen; ebenso wie nur wenig IFN-γ und IL-6 in der Probe mit Lymphozyten und Tetanustoxoid detektiert werden konnte. Die durch Patienten-MoDC, welche unter Kulturmodell (2) generiert wurden, und Tetanustoxoid vermittelte T-Zellzytokinproduktion weist Unterschiede hinsichtlich einer wesentlich geringeren IL-6-Produktion (114,5 pg/ml), einer höheren Produktion der TH1-Zytokine INF-γ (446,6 pg/ml) und IL-2 (186,5 pg/ml) im Vergleich zu den unter 3.1.3.3 erhobenen Daten auf. Während die durch MoDC des Kulturmodells (1) und Tetanustoxoid induzierten Zytokine von T-Zellen größere Mengen an TH2Zytokinen produzierten, sezernierten T-Zellen, welche über MoDC des Kulturmodells (2) aktiviert wurden, höhere Mengen an TH1-Zytokinen. MoDC, in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF generiert, induzieren eher eine TH1-Immunantwort als MoDC, welche in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 300 U/ml IL-4, 300 U/ml GM-CSF, 150 U/ml IFN-γ generiert wurden. 3.2 Phago- und Pinozytose von unreifen und reifen dendritischen Zellen bei Patientinnen und Spendern Mononukleäre Zellen des Phagozytensystems wie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, myeloide dendritische Zellen und Langerhanszellen spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr, da sie sowohl für die angeborene Immunantwort als auch für die Induktion einer spezifischen Immunantwort essentiell sind. Insbesondere unreife dendritische Zellen sind in der Lage, phagozytierte Antigene im Kontext mit MHC-Kl II zu präsentieren. Die Antigenpräsentation ist ein entscheidender Schritt zur Aktivierung 105 ERGEBNISSE von naiven T-Zellen. Daher wurde in dem folgenden Abschnitt dieser Arbeit die Fähigkeit zur Phagozytose von unreifen und reifen Patienten-MoDC mit dem FITCmarkierten-Modellantigen-Zymosan-A untersucht. Im zweiten Teil dieses Abschnittes wurde die Aufnahme von Bestandteilen des Tumorzell-Lysates, durch eine vorhergehende Proteinisolierung von löslichen und lipidischen Proteinen der Zelllinie MCF-7, anhand von Spender-MoDC analysiert. Die Expression einiger charakteristischer Oberflächenantigene auf MoDC vor und nach der Phagozytose von Tumorantigenen wurde ebenfalls verglichen. 3.2.1 Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von Patientinnen mit FITC-markiertem Zymosan-A Zymosan ist ein nicht lösliches Zellwandpolysaccharid der Hefe, es induziert die Produktion proinflammatorischer Zytokine in Immunzellen. Zymosan bindet direkt an den TLR2 und induziert damit über den NF-kappaB-Signaltransduktionsweg die Produktion proinflammatorischer Gene (SATO ET AL., 2003). Um die Phagozytose- aktivität von unreifen und reifen Patienten-MoDC zu untersuchen, wurden MoDC von n=3 Patientinnen (Patientin 11, 13 und 15 (siehe Tabelle 5))mit FITC-markierten Zymosan-A-Partikeln inkubiert. Dafür wurden unreife MoDC von Patientinnen 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF generiert. Reife MoDC von Patientinnen wurden generiert, indem an Tag 6 zu den unreifen MoDC der „Jonuleit-Mix“ aus IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 (siehe 2.2.2.4) für 2 weitere Kulturtage gegeben wurde. Unreife MoDC an Tag 6 und reife MoDC an Tag 8 wurden für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markierten Zymosan-A-Partikeln inkubiert. Eine Azidkontrolle wurde durchgeführt, dafür wurden die dendritischen Zellen für 30 min mit 1 % Natriumazid für 30 min inkubiert und im Anschluss wurden die Zellen mit 10 µg/ml FITC-Zymosan inkubiert. Azid hemmt die Myeloperoxidase und inhibiert damit die Phagozytose von peripheren, mononukleären Zellen (SIMMS ET AL., 1989). Zellen ohne phagozytierte FITC-Zymosan-Partikel wurden als Kontrollen mitgeführt (siehe 2.2.7). Die Zellen wurden nach der zweistündigen Phagozytose mikroskopisch im Fluoreszenzmikroskop begutachtet, danach geerntet und die Anzahl der Zellen, welche 106 ERGEBNISSE FITC-Zymosan-A internalisiert hatten, durchflusszytometrisch analysiert. Die Expression der Oberflächenmarker CD14, HLA-DR, CD83 und CD1a wurde vor und nach der Phagozytose der FITC-Zymosan-Partikel mittels Durchflusszytometer untersucht. Abbildung 20: 6 Tage alte unreife MoDC einer Patientin mit phagozytierten FITC-Zymosan-APartikeln. Monozyten von Patientinnen wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert. Nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-Zymosan-A inkubiert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der MoDC mit internalisierten FITC-Zymosan-A-Partikeln. Abbildung 21: 6 Tage alte unreife MoDC einer Patientin mit Azid und FITC-Zymosan-A-Partikel inkubiert. Nach sechstägiger Kulturdauer wurden die unreifen MoDC der Patientin für 30 min mit 1 % Natriumazid inkubiert und im Anschluss erfolgte die zweistündige Inkubation mit 10 µg/ml FITCZymosan-A. Azid hemmt die Atmungskette und inhibiert die Myeloperoxidase. Es dient somit als Kontrolle, um die Aufnahme der FITC-Zymosan-A-Partikel zu verhindern. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der MoDC mit nicht internalisierten FITC-Zymosan-A-Partikeln. 107 ERGEBNISSE Abbildung 22: 8 Tage alte reife MoDC einer Patientin mit FITC-Zymosan-A-Partikeln inkubiert. Monozyten von Patientinnen wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und für 2 weitere Tage mit IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 ausgereift. Nach 8 Tagen Kulturdauer wurden die reifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-Zymosan-A inkubiert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der MoDC mit nicht bzw. teilweise internalisierten FITC-Zymosan-A-Partikeln. Unreife MoDC der Patientinnen, welche sich vorher in Suspension befanden, wurden nach erfolgter Phagozytose der FITC-Zymosan-A-Partikel adhärent und bildeten weit auslaufende Fortsätze. In der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme der unreifen Patienten-MoDC nach Phagozytose der FITC-Zymosan-A-Partikel sind in allen Zellen grün fluoreszierende Partikel zu erkennen (siehe Abbildung 20). Dagegen wurden von den unreifen MoDC in der in Abbildung 21 dargestellten Azidkontrolle keine FITCZymosan-A-Partikel aufgenommen, die Aufnahme wurde durch das Natriumazid verhindert. In der Kultur der 8 Tage alten reifen MoDC der Patientin konnten ebenfalls keine oder nur teilweise vereinzelt internalisierte fluoreszierende Partikel beobachtet werden. Unreife MoDC verlieren durch den Prozess der Reifung die Fähigkeit zu phagozytieren und nehmen somit keine oder nur wenige FITC-Zymosan-A-Partikel auf (siehe Abbildung 22). 108 ERGEBNISSE iMoDC ohne ZyA mMoDC ohne ZyA iMoDC mit ZyA mMoDC mit ZyA iMoDC mit ZyA+Azid mMoDC mit ZyA+Azid ∆% FITC positive Zellen 100 82,21 90 80 70 60 29,55 50 40 30 20 10 12,28 1,66 6,44 0,7 0 Abbildung 23: Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von n=3 Mammakarzinompatientinnen, welche mit FITC-markierten Zymosan-A-Partikeln inkubiert wurden. Der Anteil FITC-markierter Zellen wurde bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Patientinnen nach zweistündiger Inkubation mit FITC-markierten Zymosan-A-Partikeln im Durchflusszytometer bestimmt. Sowohl bei unreifen als auch bei den reifen MoDC wurden jeweils eine Azidkontrolle und unmarkierte Zellen als Kontrolle mitbestimmt. Die Werte sind im Mittel + SD dargestellt. 82,21 % der unreifen MoDC von Patientinnen waren im Mittel FITC-positiv und hatten die FITC-Zymosan-A-Partikel internalisiert. Unreife MoDC von Patientinnen können somit effizient Partikel über Phagozytose aufnehmen. Die Phagozytose der unreifen MoDC konnte durch Natriumazid verhindert werden, nur 12,28 % der Zellen waren FITC-positiv. Die Vitalität der Zellen in der Azidkontrolle war im Vergleich zu Zellen ohne Azid identisch. Durch die Ausreifung der Patienten-MoDC sank die Anzahl der FITC-positiven Zellen auf 29,55 %. Die Phagozytose konnte auch bei reifen MoDC durch Azid (6,44 % FITC-positive Zellen) geblockt werden. Zellen ohne FITCZymosan-A-Partikel waren nicht FITC-positiv (siehe Abbildung 23). 109 ERGEBNISSE iMoDC ohne ZyA iMoDC mit ZyA mMoDC ohne ZyA mMoDC mit ZyA 140 93,66 ∆% FITC positive Zellen 120 93,18 85,86 100 92,91 92,74 88,43 65,91 72,55 80 68,98 56,20 44,37 60 40 14,16 20 9,78 6,16 11,58 2,87 0 CD14 HLA-DR CD83 CD1a Abbildung 24: Expression der Oberflächenantigene bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Mammakarzinompatientinnen (Patientin 11, 13 und 15 siehe Tabelle 5) vor und nach der Phagozytose von FITC-Zymosan-A-Partikeln. Die Expression der charakteristischen Oberflächenantigene wurde jeweils bei den n=3 Patientinnen von den unreifen und reifen MoDC mit und ohne FITCZymosan-A-Partikel-Phagozytose durchflusszytometrisch analysiert. Dafür wurden die Zellen vor und nach der Phagozytose mit Antikörpern, welche an das Tandemkonjugat PE-Cy5 gekoppelt waren, gefärbt (siehe 2.2.7.1). Die Prozentzahl positiver Zellen ist im Mittel + SD dargestellt. Im Mittel waren 14,16 % der unreifen MoDC vor der Phagozytose CD14-positiv. Nach der Phagozytose der FITC-Zymosan-A-Partikel kommt es zu einer kompletten Herunterregulation (2,87 %) von CD14. Reife MoDC waren lediglich zu 9,78 % positiv für CD14. Auch bei diesen Zellen mit einer nur sehr geringen Phagozytose kommt es zu einer weiteren Herunterregulation von CD14 auf 6,16 % im Mittel. Bei dem stark exprimierten Antigen HLA-DR konnten in der Prozentzahl positiver Zellen keine Unterschiede gemessen werden. CD83, der Marker für reife dendritische Zellen, war auf den unreifen MoDC der Patientinnen im Mittel nur auf 11,58 % der Zellen exprimiert. Nach der Phagozytose der FITC-Zymosan-A-Partikel durch unreife MoDC waren 68,98 % der Zellen CD83-positiv. Die Phagozytose von Zymosan-A durch unreife MoDC von Patientinnen ist somit ein Reifungssignal. Auf den reifen MoDC der Patientinnen war das CD83 auf den MoDC vor der Phagozytose bereits auf fast allen 110 ERGEBNISSE Zellen exprimiert, es konnte kein Unterschied auf den Zellen nach der Phagozytose gemessen werden. Die Phagozytose von FITC-Zymosan-A-Partikeln induzierte eine leichte Heraufregulation der positiven Zellen für CD1a. Vor der Phagozytose waren 44,37 % positiv für CD1a und danach waren 56,2 % der Zellen CD1a-positiv. Bei den reifen MoDC kam es im Gegensatz dazu nach der Phagozytose zu einer leichten Herunterregulation von CD1a von 72,55 % der Zellen auf 65,95 % positiver Zellen, was ebenfalls auf ein Reifungssignal, induziert durch die Phagozytose von FITC-Zymosan-A-Partikeln hinweist. 3.2.2 Wie effizient phagozytieren unreife und reife MoDC lipidische Proteine einer Mammakarzinomzelllinie? Dendritische Zellen sind in der Lage unterschiedliche Endozytosemechanismen zur Aufnahme von Antigenen zu benutzen. In Abhängigkeit von den Eigenschaften des Antigens, der Aufnahmekapazität und des Aufnahmeweges können funktionell unterschiedliche Aktivierungssignale in den dendritischen Zellen induziert werden. Im Hinblick darauf stellte sich die Frage, ob unterschiedliche Zellkompartimente, wie Membranproteine oder intrazelluläre Proteine von nekrotischen Tumorzellen, mit gleicher Effizienz aufgenommen werden und zu einer MoDC-Aktivierung führen können. Daher wurde eine Proteinaufreinigung mittels Triton X-114 und anschließender Markierung der löslichen und lipidischen Proteine mit FITC aus dem Zell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 durchgeführt (siehe 2.2.6.1 und 2.2.6.3). Monozyten wurden aus Leukapheraten und Elutriaten von gesunden Spendern (Normalspender aus der Blutbank der Universität Göttingen) isoliert und 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF für die Generierung von unreifen MoDC kultiviert. Reife MoDC wurden für 2 weitere Tage unter den gleichen Kulturbedingungen und zusätzlich mit dem „Jonuleit-Mix“ (IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 (siehe 2.2.2.4)) ab Tag 6 kultiviert. Die Zellen wurden für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in 24 Napf Lumoxplatten kultiviert und nach 6 bzw. 8 Tagen wurde zu den unreifen bzw. reifen MoDC für 2 Stunden 10µg/ml FITC-markiertes Protein der Membranfraktion gegeben. Eine Azidkontrolle, eine Kontrolle mit FITC-Farbstoff allein 111 ERGEBNISSE und unmarkierte Zellen zum Vergleich wurden ebenfalls mitgeführt. Nach der zweistündigen Phagozytose wurden alle Ansätze im Fluoreszenzmikroskop begutachtet und die Aufnahme des Proteins wurde im Durchflusszytometer quantifiziert (siehe 2.2.7.1 und 2.2.7.2). Für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen mit Oberflächenantigenfärbung wurden die Zellen in 24-Napf-Lumoxplatten auf Objektträgern kultiviert, der Phagozytose-assay durchgeführt und anschließend gefärbt. iMoDC mMoDC iMoDC + Azidkontrolle mMoDc + Azidkontrolle iMoDC mit FITC-Farbstoff ohne Protein 120 74,67 ∆% FITC positive Zellen 100 80 60 30,13 40 14,5 12,015 20 0,265 0 0 0,425 0 1 0 MoDC ohne Protein der Membranfraktion MoDC mit Protein der Membranfraktion Abbildung 25: Phagozytose von FITC-markiertem Protein der Membranfraktion der Zelllinie MCF-7 durch unreife und reife MoDC bei n=3 Spendern. Der Anteil FITC-markierter Zellen wurde bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Spendern nach zweistündiger Inkubation mit FITC-markiertem Protein der Membranfraktion im Durchflusszytometer bestimmt. Sowohl bei den unreifen als auch bei den reifen MoDC wurden jeweils eine Azidkontrolle, eine FITC-Farbstoffkontrolle und unmarkierte Zellen als Kontrolle mitbestimmt. Die Werte sind im Mittel + SD dargestellt. Die lipipdischen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 wurden von 74,67 % der unreifen MoDC der Spender (n=3) phagozytiert. Im Vergleich zur Aufnahme von Zymosan (siehe Abbildung 23) und löslichen Proteinen (siehe Abbildung 32) der Zelllinie wurden Proteine der Membranfraktion von weniger unreifen MoDC phagozytiert. 30,13 % der reifen MoDC nahmen die FITC-markierten Proteine der Membranfraktion auf. In den Kontrollen waren keine Zellen durch den FITC-Farbstoff allein angefärbt worden. Die 112 ERGEBNISSE Phagozytose konnte sowohl bei unreifen als auch bei reifen MoDC mit Azid verhindert werden. iMoDC ohne Protein der Membranfraktion mMoDC ohne Protein der Membranfraktion iMoDC mit Protein der Membranfraktion mMoDC mit Protein der Membranfraktion 120 48,87 96,20 97,15 91,67 95,43 ∆% PE-Cy5 positive Zellen 100 65,39 86,20 80 33,09 40,11 60 26,69 23,60 15,01 40 20 4,78 3,60 4,60 4,88 0 CD14 HLA-DR CD83 CD1a Abbildung 26: Expression der Oberflächenantigene bei den unreifen und reifen MoDC der n=3 Spendern vor und nach der Phagozytose des FITC-markiertem Protein der Membranfraktion. Die Expression der charakteristischen Oberflächenantigene wurde jeweils bei den n=3 Spendern von den unreifen und reifen MoDC mit und ohne Phagozytose des Proteins der Membranfraktion durchflusszytometrisch analysiert. Dafür wurden die Zellen vor und nach der Phagozytose mit Antikörpern, welche an das Tandemkonjugat PE-Cy5 gekoppelt waren, gefärbt (siehe 2.2.7.1). Die Prozentzahl positiver Zellen ist im Mittel + SD dargestellt. Vor und nach der Phagozytose von Proteinen der Membranfraktion der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 ergaben sich keine Unterschiede in dem sowohl bei unreifen als auch bei reifen MoDC schwach exprimierten LPS-Rezeptor CD14 und dem stark exprimierten MHC-Kl II-Antigen HLA-DR. Veränderungen in der Expression konnten vor allem bei dem Marker für reife dendritische Zellen CD83 gemessen werden. Sowohl bei den unreifen MoDC von 15,01 % auf 40,01 % und bei reifen MoDC von 65,39 % auf 86,2 % konnte eine gesteigerte Expression des CD83 nach der Phagozytose Proteinen der Membranfraktion festgestellt werden. CD1a wurde auf unreifen MoDC nach der Aufnahme der Proteine nur leicht heraufreguliert und bei den 113 ERGEBNISSE reifen MoDC induzierte die Phagozytose eine Herunterregulation von CD1a, was ebenfalls ein Hinweis auf eine weitere Ausreifung bzw. Aktivierung der Zellen ist (siehe Abbildung 26). Die Phagozytose von lipidischen Proteinen der Zelllinie MCF-7 induzierte somit eine Reifung bei unreifen MoDC und ist ein weiteres Reifungssignal bei reifen MoDC von Spendern. a) b) Abbildung 27: 6 Tage alte unreife MoDC mit phagozytiertem FITC-markiertem Proteinen der Membranfraktion der Tumorzelllinie MCF-7. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markiertem Protein der Membranfraktion inkubiert. Phasenkontrast- (a) und Fluoreszenzmikroskopische-Aufnahme (b) der MoDC, welche FITCProteine der Membranfraktion internalisiert haben. 114 ERGEBNISSE a) d) HLA-DR HLA-ABC b) e) HLA-DR (Phasenkontrast) HLA-ABC c) CD80 f) CD86 Abbildung 28: 6 Tage alte unreife MoDC mit phagozytierten FITC-markierten Proteinen der Membranfraktion der Zelllinie MCF-7 und Oberflächenantigenfärbung funktionell wichtiger Antigene auf unreifen MoDC. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage auf Lumoxplatten mit Objektträgern in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markiertem Protein der 115 ERGEBNISSE Membranfraktion inkubiert. Nach der Phagozytose wurde der Überstand aus den Näpfen entnommen, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließend wurden die Objektträger aus den Näpfen entnommen. Die Färbung mit den PE-gekoppelten Antikörpern gegen HLA-DR ((a) Fluoreszenz- und (b) Phasenkontrast-Aufnahme), CD80 ((c) Fluoreszenz-Aufnahme), HLA-ABC((d) und (e) FluoreszenzAufnahmen) sowie CD86 ((f) Fluoreszenz-Aufnahme) erfolgte wie unter 2.2.7.2 beschrieben. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen erfolgten mit einem Breitband-Filter, welcher sowohl FITC als auch PE emitiert. Wie in den Abbildung 28 a-f an der Grünfluoreszenz zu erkennen ist, hatten alle Zellen das FITC-markierte Protein der Membranfraktion internalisiert und die für die Antigenpräsentation essentiellen Oberflächenantigene waren nach der Phagozytose der lipidischen Proteine deutlich auf den unreifen MoDC exprimiert. Die stärkste Expression konnte bei dem MHC-Kl I-Molekül HLA-ABC und dem costimulatorischen Molekül CD86 beobachtet werden. Ein ebenfalls stark exprimiertes Antigen mit einer starken Rotfluoreszenz war das MHC-Kl II-Molekül HLA-DR. Eine schwächere Rotfluoreszenz war bei dem B7.1-Molekül (CD80) zu sehen. Nach der Phagozytose von Proteinen der Membranfraktion waren die für die im Folgenden beschriebenen wichtigen Moleküle der Antigenprozessierung und -präsentation im hohen Maße auf unreifen MoDC exprimiert. 3.2.3 Pinozytose der Wasser- löslichen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 durch unreife und reife MoDC Um die Aufnahme von löslichen Bestandteilen des Tumorzell-Lysates zu untersuchen, wurde die Proteinaufreinigung, Markierung mit FITC, Kultivierung der unreifen und reifen MoDC von Spendern und der Pinozytose-assay mit 10 µg/ml löslichem Protein der Tumorzelllinie MCF-7 wie bereits im vorhergehenden Abschnitt (3.2.2) beschrieben durchgeführt. Die Proben wurden wie zuvor sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch durchflusszytometrisch analysiert. 116 ERGEBNISSE a) b) Abbildung 29: 6 Tage alte unreife MoDC mit pinozytiertem, FITC-markierten, löslichen Proteinen der Tumorzelllinie MCF-7. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und nach 6 Tagen Kulturdauer wurden die unreifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITC-markierten löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7 inkubiert. Fluoreszenzmikroskopische- (a) und Phasenkontrast-Aufnahmen (b) der MoDC mit pinozytierten, löslichen Proteinen. a) b) Abbildung 30: 8 Tage alte reife MoDC mit pinozytiertem, FITC –markierten, löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7. Monozyten von Spendern wurden für 6 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF kultiviert und für 2 weitere Tage mit IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 ausgereift. Nach 8 Tagen Kulturdauer wurden die reifen MoDC für 2 Stunden mit 10 µg/ml FITCmarkierten löslichen Proteinen inkubiert. Fluoreszenzmikroskopische (a) (mit zusätzlicher HellfeldEinblendung, um unmarkierte Zellen darzustellen) und Phasenkontrast-Aufnahme (b) der MoDC mit pinozytierten, löslichen Proteinen. 117 ERGEBNISSE a) b) Abbildung 31: 6 Tage alte unreife MoDC mit Azid und FITC markierten löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7 sowie unreife MoDC mit FITC-Farbstoff ohne lösliches Protein zur Phagozytose inkubiert. Nach sechstägiger Kulturdauer wurden die unreifen MoDC der Spender für 30 min mit 1 % Natriumazid inkubiert und im Anschluss erfolgte die zweistündige Inkubation mit 10 µg/ml FITCmarkierten, löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7 (a). In Abbildung b) dargestellte fluoreszenzmikroskopische Aufnahme zeigt MoDC, welche mit dem für die FITC Markierung verwendeten Farbstoff (Endkonzentration: 10µg/ml) kokultiviert wurden. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der MoDC mit Azid und löslichen Proteinen und mit dem FITC-Farbstoff mit zusätzlicher Hellfeld-Einblendung aufgenommen, um unmarkierte Zellen darzustellen. In der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme der 6 Tage alten unreifen MoDC haben fast alle Zellen das grün fluoreszierende, lösliche Protein der Tumorzelllinie MCF-7 aufgenommen (siehe Abbildung 29). Dagegen waren in der 8 Tage alten Kultur mit reifen MoDC kaum noch FITC-markierte Zellen zu erkennen (siehe Abbildung 30). In den Kontrollen mit Azid und dem FITC-Farbstoff ohne Protein waren keine grün fluoreszierenden Zellen zu beobachten (siehe Abbildung 31). 118 ERGEBNISSE iMoDC iMoDC Azidkontrolle mMoDC mMoDc Azidkontrolle iMoDC FITC Farbstoff ohne Prot. 120 81,25 ∆% FITC positive Zellen 100 36,51 80 60 40 26,2 6,93 20 3,4 2,22 0 0 0,42 0 0,96 MoDC ohne lösliches Protein MoDC mit löslichem Protein 10µg/ml Abbildung 32: Pinozytose von FITC-markierten löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7 durch unreife und reife MoDC von n=3 Spendern. Der Anteil FITC-markierter Zellen wurde bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Spendern nach zweistündiger Inkubation mit FITC-markierten löslichen Proteinen im Durchflusszytometer bestimmt. Sowohl bei unreifen als auch bei reifen MoDC wurden jeweils eine Azidkontrolle, eine FITC-Farbstoffkontrolle und unmarkierte Zellen als Kontrolle mitbestimmt. Die Werte sind im Mittel + SD dargestellt. Das lösliche Protein der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 wurde im Mittel von 81,25 % der unreifen MoDC aufgenommen (rechter, grüner Balken). Bei den reifen MoDC nahmen nur noch 36,51 % der Zellen lösliche Bestandteile der Tumorzellen auf (rechter, gelber Balken). Im Vergleich zur Phagozytose von Zymosan-Partikeln und Proteinen der Membranfraktion nahmen mehr reife MoDC lösliches Protein der Tumorzelllinie auf (siehe 3.2.1 und 3.2.2). In den Azidkontrollen wurde die Pinozytose bei den unreifen MoDC bis auf 26,2 % der Zellen und bei den reifen MoDC bis auf 6,93 % der Zellen inhibiert (rechte, oranger und roter Balken). Zellen, die den FITC-Farbstoff allein gebunden hatten, wurden nicht detektiert (siehe Abbildung 32). 119 ERGEBNISSE iMoDC ohne lösl. Protein iMoDC mit lösl. Protein mMoDC ohne lösl. Protein mMoDC mit lösl. Protein ∆ % PECy5 positive Zellen 140 68,59 120 95,23 92,90 100 70,67 91,10 91,53 38,19 80 32,23 60 18,85 15,81 18,87 40 20 13,96 4,82 10,22 9,49 3,15 0 CD14 HLA-DR CD83 CD1a Abbildung 33: Expression der Oberflächenantigene bei unreifen und reifen MoDC von n=3 Spendern vor und nach der Pinozytose von FITC-markierten, löslichen Proteinen der Zelllinie MCF-7. Die Expression der charakteristischen Oberflächenantigene wurde jeweils bei den n=3 Spendern von den unreifen und reifen MoDC mit und ohne Pinozytose der FITC-markierten, löslichen Proteine durchflusszytometrisch analysiert. Dafür wurden die Zellen vor und nach der Pinozytose mit Antikörpern, welche an das Tandemkonjugat PE-Cy5 gekoppelt waren, gefärbt (siehe 2.2.7.1). Die Prozentzahl positiver Zellen ist im Mittel + SD dargestellt. Wie in Abbildung 33 zu sehen ist, konnte bei keinem der gemessenen charakteristischen Oberflächenantigene eine Veränderung vor und nach der Pinozytose von löslichem Protein der Zelllinie MCF-7 verzeichnet werden. Die Pinozytose von löslichem Protein der MCF-7 ist somit kein Reifungssignal für unreife MoDC bzw. beeinträchtigt nicht die Reifung durch andere Reifungssignale („Jonuleit-Mix“), wie in der Heraufregulation von CD83 vor und nach der Pinozytose bei reifen MoDC und in der weiteren Herunterregulation von CD14 auf reifen MoDC deutlich zu erkennen ist. 120 ERGEBNISSE 3.3 Spezifische T-Zellstimulation und TH1/TH2-Zytokinsekretion durch Tumorzell-Lysat-gepulste dendritische Zellen Die Antigenbeladung von dendritischen Zellen mit dem gesamten Tumorantigenrepertoire von kompletten Tumorzellen stellt eine attraktive Methode zum Pulsen der MoDC für eine Immuntherapie mit dendritischen Zellen bei Karzinompatienten dar. Um die immunstimulatorische Kapazität von Tumorzell-Lysat-gepulsten MoDC zu untersuchen, wurden in vitro spezifische T-Zellstimulations-assays durchgeführt und die TH1/TH2-Zytokinsekretion gemessen. Für eine optimale Beladung der MoDC mit dem Tumorzell-Lysat wurden Dosisfindungsuntersuchungen anhand von Tumorzelllinien und autologem Tumorzell-Lysat von Mammakarzinompatientinnen durchgeführt. Zur Unterstützung der durch das Lysat induzierten Immunantwort und zusätzlichen Aktivierung der dendritischen Zellen wurde parallel hierzu die Wirkung von TLRLiganden auf die TH1/TH2-Immunantwort untersucht. 3.3.1 Titration der Tumorzell-Lysat-Konzentration mit verschiedenen Tumorzelllinien in einem allogenen in-vitro T-Zell-Stimulations-assay Zur Untersuchung der spezifischen T-Zellstimulation durch Tumorzell-Lysat-gepulste MoDC wurden Lysate der Mammakarzinomzelllinien SK-BR3 und MCF-7, der Melanomzelllinie FM 3-13 und Tetanustoxoid in ihrer Stimulationsfähigkeit miteinander verglichen. MoDC gesunder Spender (Normalspender der Blutbank, Universität Göttingen) wurden aus Monozyten von Leukapheraten 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF generiert, danach geerntet und in jeweils drei Parallelansätzen mit lysierten Tumorzellen der Zelllinien in den Konzentrationen eine MoDC auf eine lysierte Tumorzelle, 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16 wie unter 2.2.4.2 beschrieben für 34 Stunden gepulst. Die autologen T-Zellen der Spender wurden wie unter 2.2.2.7 beschrieben aus den Lymphozyten, welche über 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum und 50 U/ml IL-2 kultiviert wurden, isoliert und mit 1x105 pro Napf in den assay eingesetzt. Tetanustoxoid wurde wie unter 2.2.4.1 beschrieben zu den MoDC und T-Zellen gegeben. Die T-Zellstimulation wurde 5 Tage durchgeführt und danach im BrdU-ELISA analysiert, nach 48 Stunden wurden Kulturüberstände für die Messung der TH1/TH2-Zytokine von den Proben abgenommen. 121 ERGEBNISSE 1,8 1,6 1,4 SK-BR3 OD 1,2 MCF-7 1 0,8 FM 3-13 0,6 0,4 0,2 0 MoDC -0,2 T-Zellen TZ-Lysat T-Zellen+ MoDC+ TZ-Lys T-Zellen 01:01 01:02 01:04 01:08 01:16 TT-Ko Abbildung 34: Spezifische T-Zellstimulation mit dem Lysat aus den Mamma-Ca-Tumorzelllinien SK-BR3 und MCF-7, der Melanomzelllinie FM 3-13 im Vergleich mit Tetanustoxoid. Die optische Dichte aus jeweils drei Parallelansätzen von n=3 Spendern mit SK-BR3-, MCF-7- und FM 3-13-Lysaten wurde im Mittel + SD dargestellt. Als Kontrollen wurde der BrdU-Einbau bei den MoDC allein, T-Zellen allein, dem Tumorzell-Lysat allein, T-Zellen und Tumorzell-Lysat sowie MoDC und T-Zellen gemessen und dargestellt. In den roten Balken ist dargestellt die spezifische T-Zellproliferation, induziert durch MoDC, welche mit den lysierten SK-BR3-Zellen gepulst wurden. In den hellgrünen Balken ist die Stimulation durch das Lysat der MCF-7-Zelllinie und in den braunen Balken die des Lysates der Melanomzelllinie FM 3-13 dargestellt. Der Vergleich zu der T-Zellproliferation, hervorgerufen durch die Stimulation der MoDC mit Tetanustoxoid, ist ganz rechts im Mittel + SD in der Graphik dargestellt. Die höchste spezifische T-Zellproliferation wurde im Mittel + SD bei zwei von drei Spendern durch die Stimulation der MoDC durch Tetanustoxoid induziert. Das Lysat der Zelllinie SK-BR3 ergab bei einem Konzentrationsverhältnis von 1:2 (MoDC:TZ) die im Mittel + SD höchste gemessene T-Zellproliferationsrate im Vergleich zu den anderen eingesetzten Lysaten der Zelllinien. Eine Dosis-Wirkungsbeziehung konnte bei der Stimulation mit dem SK-BR3-Lysat nur bis zu dem Verhältnis 1:2 beobachtet werden, bei den nachfolgenden höheren Konzentrationen fällt die Proliferationsrate zu einem Plateau ab. Eine Dosis-Wirkungsbeziehung von der Konzentration 1:1 bis 1:16 konnte bei der Stimulation mit dem Lysat der Melanomzelllinie FM 3-13 gesehen werden, die stärkste T-Zellproliferation wurde Mittel + SD durch die Stimulation mit der höchsten 122 ERGEBNISSE Konzentration an FM 3-13-Lysat induziert. Die schwächste T-Zellproliferation wurde im Mittel im Vergleich zu den beiden anderen Zelllinien durch die antigene Wirkung der Zelllinie MCF-7 verursacht. Wobei darauf hingewiesen werden muss, dass bei diesen drei Parallelansätzen die größten Schwankungen zu messen waren, was sich in der großen Standardabweichung widerspiegelt. Das Lysat der MCF-7 zeigte eine schwache Dosis-Wirkung in den Konzentrationen 1:1 bis 1:8, danach kam es zu einem Abfall der T-Zellproliferationsrate. a) MoDC MoDC+T-Zellen+SK-BR 3 Lys 1:1 T-Zellen MoDC+T-Zellen+MCF-7 Lys 1:1 MoDC+T-Zellen MoDC+T-Zellen+FM 3-13 Lys 1:1 IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 50 100 150 200 pg/ml b) MoDC T-Zellen MoDC+T-Zellen MoDC+T-Zellen+TT IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a IFN-g 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 pg/ml Abbildung 35: Zytokinfreisetzung nach T-Zellstimulationen mit Lysaten der Zelllinien SK-BR3, MCF-7 und FM 3-13 (a) im Vergleich mit Tetanustoxoid (b) mit 48 Stunden alten Kulturüberständen. Die Kulturüberstände der drei Parallelansätze von jeweils einem Spender mit je einer Tumorzelllinie wurden gemischt, bis zur Durchführung des CBA eingefroren und unverdünnt im CBA eingesetzt sowie durchflußzytometrisch Tetanustoxoidstimulation wurden im analysiert. Mitten aus Die allen Daten n=3 der Zytokinfreisetzung Spendern dargestellt (b). nach Die 123 ERGEBNISSE Zytokinfreisetzung der Kontrollen MoDC allein (weiße Balken), T-Zellen allein (blaue Balken) und MoDC + T-Zellen (gelber Balken) sind graphisch mit dargestellt. Die TH1/TH2-Zytokine der T-Zellen nach Lysatstimulation mit SK-BR3 sind in den roten Balken, die der MCF-7 in den hellgrünen Balken und die Stimulation mit FM 3-13 ist in den braunen Balken aufgezeichnet. Die Sekretion der Zytokine wurde bei allen Lysaten lediglich im Verhältnis 1 MoDC: 1 lysierte Tumorzelle gemessen. Die Kokultivierung mit MoDC und den T-Zellen führte im geringen Maße zur IL-6- und IFN-γ-Produktion. Durch die Stimulation der MoDC, welche mit dem Lysat der SKBR 3 gepulst wurden, kam es zu einer geringen Steigerung der IFN-γ-Sekretion (27,46 pg/ml) im Vergleich zu den Kontrollen. Weitere TH1/TH2-Zytokine wurden nicht gebildet. Die zweite Mammakarzinomzelllinie MCF-7 induzierte lediglich eine geringfügig höhere Produktion an IL-6 mit 24,8 pg/ml. Ansonsten wurden durch die Stimulation mit dem Lysat der MCF-7 keine weiteren Zytokine sezerniert. Die höchste Menge an IFN-γ (34,4 pg/ml) und IL-6 (177,1 pg/ml) im Vergleich zu den Lysaten der Mammakarzinomzelllinien induzierte das Lysat der Melanomzelllinie FM 3-13. Im Vergleich zu der Zytokinproduktion, welche durch Tetanustoxoidstimulation erreicht wurde mit IFN-γ (2499,9 pg/ml), TNF-α (1056,2 pg/ml), IL-6 (166,5 pg/ml) und IL-2 (669,6 pg/ml) (siehe Rohdaten in Tabelle 9), fand eine bis zu 100fach höhere Zytokinsekretion der TH1- und TH2-Zytokine durch das Tetanustoxoid statt und kaum eine Produktion dieser Zytokine durch die Stimulation mit den Lysaten der Tumorzelllinien. 124 ERGEBNISSE 3.3.2 Spezifische autologe T-Zellproliferation und TH1/TH2-Zytokinsekretion induziert durch autologe Tumorzell-Lysat gepulste MoDC von Mammakarzinompatientinnen Nach der in vitro-T-Zellstimulation mit dem Lysat der Mammakarzinomzelllinien und deren Fähigkeit zur Induktion von TH1/TH2-Zytokinen sollte die T-Zellproliferation nach Stimulation mit dem autologen Tumorzell-Lysat untersucht werden. Dazu wurden aus dem Vollblut von n=4 Mammakarzinompatientinnen (Patientin G; siehe Tabelle 12 und 3 weitere Mammakarzinompatientinnen, siehe auch 3.1.5) Monozyten und Lymphozyten isoliert, sowohl MoDC als auch T-Zellen wurden wie unter 3.3.1 beschrieben generiert und isoliert und in den T-Zellstimulations-assay eingesetzt. Das autologe Tumorzell-Lysat wurde wie unter 2.2.3 beschrieben hergestellt und in dem gleichen Verhältnis wie die Tumorzelllinien in den assay eingesetzt sowie mit der Stimulation, welche durch Tetanustoxoid induziert wird, verglichen. Die Kulturüberstände für die Zytokinbestimmungen wurden ebenfalls nach 48 Stunden Kokultivierung der MoDC mit dem Lysat und den autologen T-Zellen entnommen, die T-Zellproliferation wurde nach 5 Tagen mittels BrdU-ELISA bestimmt. 125 ERGEBNISSE 1 DC : 1 TZ 1 DC : 2 TZ 1 DC : 4 TZ Patientin TZ2 Patientin TZ1 1,4 1,4 1,2 1,2 OD OD 1,6 1,6 1 0,8 1 0,8 0,6 0,6 0,4 0,2 0,4 0,2 0 0 A B C D E F G H I J A K B C 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1,4 F G H I J K 1 OD OD 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 A B C D E F G H I J 1 DC : 8 TZ A T-Zellen TumorzellLysat Tetanustoxoid K A B C D E 1 DC : 16 TZ B C MoDC 126 E Patientin TZ4 (G) Patientin TZ3 1,6 0 D + + + + F G H I J K DC + TT D E F G H I J K + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + (1:1) (1:2) (1:4) (1:8) (1:16) + ERGEBNISSE Abbildung 36: Autologe T-Zellstimulation mit autologem Tumorzell-Lysat von n=4 Mammakarzinompatientinnen im Vergleich zur Stimulation mit Tetanustoxoid. Die OD der T-Zellproliferationsrate aus n=4 Proliferations-assays mit autologen Tumorzell-Lysaten in einer Verdünnungsreihe 1:1 bis 1:16 (entspricht 16 Tumorzellen zu 1 MoDC) ist von 4 Mammakarzinompatientinnen (TZ1, TZ2, TZ3 und TZ4) einzeln dargestellt. Als Kontrollen wurde der BrdU-Einbau bei den MoDC allein, T-Zellen allein, Tumorzell-Lysat allein, T-Zellen und Tumorzell-Lysat sowie MoDC plus T-Zellen gemessen. Bei 3 von 4 Patientinnen (Patientin TZ1, TZ3 und TZ4) ergab sich die höchste spezifische T-Zellproliferation bei einem Verhältnis von 1 MoDC: 4 lysierten Tumorzellen. Die T-Zellen der Patientin 2 proliferierten am stärksten bei einem Verhältnis MoDC zu Tumorzellen von 1:2. Keine Steigerung der T-Zellproliferation konnten bei allen 4 Patientinnen durch die Zugabe von höheren Mengen lysierter Tumorzellen (1:8 und 1:16) erzielt werden. Im Vergleich zu der Stimulation durch die autologen Tumorzell-Lysate induzierte das Tetanustoxoid bei den T-Zellen der Mammakarzinompatientinnen bei 3 von 4 Patientinnen eine stärkere Proliferation der T-Zellen. Durch das autologe Tumorzell-Lysat der Patientin TZ1 konnte eine stärkere T-Zellproliferation erzielt werden als durch Tetanustoxoid. Insgesamt war die Induktion der T-Zellproliferation durch die autologen TumorzellLysate von Patientin zu Patientin sehr verschieden, was auf eine unterschiedliche Antigenität der Tumorzell-Lysate hinweisen könnte. Die T-Zellen der Patientin TZ2 produzierten nach Stimulation mit autologem Tumorzell-Lysat gepulsten MoDC als einzigste IFN-γ in geringen Mengen. Die IFN-γ Produktion der T-Zellen wurde nicht durch höhere Mengen Tumorzell-Lysat, mit welchen die MoDC gepulst wurden, gesteigert. IL-6 wurde als einziges weiteres Zytokin von den Zellen der Patientin TZ1 bei allen Tumorzell-Lysat-Konzentrationen gebildet, sowie bei Patientin TZ3 ab einem Tumorzell-Lysat zu MoDC Verhältnis von 1:4 bis 1:16. In den Kontrollen bildeten ebenfalls die MoDC der Patientin TZ4 IL-6 (siehe Tabelle 8). Wie sich bereits bei den Patientenzellen gezeigt hat, wurden durch die Stimulation mit Tetanustoxoid von den T-Zellen die Zytokine IFN-γ (446,6 pg/ml), TNF-α (30,5 pg/ml), 127 ERGEBNISSE IL-6 (114,5 pg/ml) und IL-2 (186,5 pg/ml) sezerniert (siehe Tabelle 10: und siehe ebenfalls Tabelle 8 darin wurden die selben Patientinnen ausgewertet). pg/ml TZ-Lysat, 1,6x106 Zellen T-Zellen + TZLysat MoDC + TZ-Lysat (1:1) + T-Zellen MoDC + TZ-Lysat (1:2) + T-Zellen MoDC + TZ-Lysat (1:4)+ T-Zellen MoDC + TZ-Lysat (1:8)+ T-Zellen MoDC + TZ-Lysat (1:16)+ T-Zellen MoDC + Tetanustoxoid + T-Zellen IFN-γγ TNF-α α IL-10 IL-6 IL-4 IL-2 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 15,3 (17,4; 43,9; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 3,82 (0; 15,3; 0; 0) 12,58 (35,1; 0; 0; 15,2) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 6,85 (0; 27,4; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 2,65 (0; 10,6; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 11,003 (13,4; 30,7; 0; 0) 2,98 (11,9; 0; 0; 0) 9,22 (36,9; 0; 0; 0) 24,22 (69,5; 0; 27,4; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 8,07 (0; 32,3; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 2,97 (0; 11,9; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0 0 (0; 0; 0; 0 9,78 (15,4; 23,7; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 2,53 (10,1; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 30,5 (60,8; 0; 38,9; 22,4) 14,05 (0; 15,1; 41,1; 0) 0 (0; 0; 0; 0) 186,5 (0; 202; 383; 161) 446,6 (226,5; 547,6; 660,9; 351,4) 0 (0; 0; 0; 0) 17,98 (45,5; 0; 26,4; 0) 19,95 (45,8; 0; 34; 0) 114,5 (59,8; 110,5; 92,1; 195,5) Tabelle 10: Zytokinsekretion von Mammkarzinompatientin TZ1-TZ4: Mittelwerte und Rohdaten (in der Reihenfolge Patientin TZ1-TZ4 aufgeführt) der TH1/TH2-Zytokine aus einem autologen Lymphozytenproliferationstest mit autologem Tumorzell-Lysat (in verschiedenen Konzentrationen) oder mit Tetanustoxoid gepulsten MoDC. Die Daten wurden durchflusszytometrisch mittels CBA-assay erhoben und ausgewertet. Die Werte der Kontrollen MoDC, T-Zellen und MoDC plus T-Zellen siehe Tabelle 8, in Tabelle 8 wurden die selben 4 Patientinnen ausgewertet. Die Sensitivitätsgrenze des CBAs liegt bei 20 pg/ml. 128 ERGEBNISSE 3.3.3 TH1/TH2-Zytokinsekretion nach T-Zellstimulation durch SK-BR3-Lysat gepulste dendritische Zellen und Toll-like Rezeptor-Liganden Dendritische Zellen können durch bestimmte Signale wie z. B. Bestandteile von Erregern, die auch als Pathogen-assoziierte molekulare Patterns (PAMPs) bezeichnet werden, aktiviert werden. Diese Bestandteile wie z. B. Poly I:C (doppelsträngige RNA) und BCG (Bacille-Calmette-Guerin) binden auf dendritischen Zellen an so genannte Toll-like Rezeptoren. Über diese Ligand-Rezeptorbindung bekommt die dendritische Zelle ein danger-Signal, welches erstmals von MATZINGER, 1994 beschrieben wurde. Dadurch wird ein Programm aktiviert, das eine möglichst schnelle und effektive Antigenerkennung durch T-Zellen und die Induktion einer effizienten Immunantwort ermöglichen soll. In diesem Zusammenhang sollte untersucht werden, ob mit einem Tumorzell-Lysat gepulste MoDC durch TLR-Liganden (danger-Signale) eine verstärkte T-Zell-vermittelte Immunantwort im Vergleich zu fehlenden TLR-Liganden oder zu der Kontrolle dem Recall-Antigen Tuberkulin (PPD) induziert werden kann. Dazu wurden Monozyten und T-Zellen von einem gesunden Spender aus einer Leukapherese gewonnen, MoDC wurden 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum, 500 U/ml IL-4 und 800 U/ml GM-CSF generiert, 1x104 MoDC wurden in den assay eingesetzt. Die autologen T-Zellen wurden wie unter 2.2.2.7 beschrieben aus den Gesamtlymphozyten, welche über 7 Tage in RPMI, 2,5 % autologem Serum und 50 U/ml IL-2 kultiviert wurden, isoliert und mit 1x105 pro Napf in den Proliferations-assay eingesetzt. Die MoDC wurden mit 1x104 lysierten SK-BR3-Zellen gepulst und mit Poly I:C (2mg/ml) oder BCG (1x104 lebenden Keimen) kokultiviert. Die mit und ohne SK-BR3 gepulsten MoDC wurden mit den TLR-Liganden und den T-Zellen für 5 Tage kultiviert, danach wurde die T-Zellproliferation mittels BrdU-Einbau gemessen. Nach 48 Stunden wurden Kulturüberstände von allen Proben für die TH1/TH2-Zytokinmessungen abgenommen. 129 ERGEBNISSE 1,2 1,1 1,035 1 0,82 0,7545 0,725 OD 0,8 0,5735 0,6 0,4 0,57 0,375 0,2 0,0305 0 MoDC T-Zellen SK-BR3-Lysat 0 0 + + + + + PPD BCG Poly I:C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Abbildung 37: T-Zellstimulation durch gepulste MoDC, welche mit Tumorzell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie SK-BR3 beladen wurden, und durch die TLR-Liganden Poly I:C und BCG zusätzlich aktiviert. Im Vergleich dazu die T-Zellstimulation mit PPD allein und mit PPD und SK-BR3 Lysat. T-Zellproliferation, induziert durch MoDC, welche mit dem Lysat von SK-BR3-Zellen (1:1) gepulst wurden und/oder mit den TLR-Liganden Poly I:C und BCG bzw. mit PPD kokultiviert wurden. Die OD ist im Mittel aus einem Experiment mit zwei Parallelansätzen dargestellt. BrdU-Einbau der MoDC allein, T-Zellen allein, SK-BR3-Lysat allein, SK-BR3-Lysat und T-Zellen sowie MoDC und T-Zellen wurden als Kontrollen mitgeführt. Durch die Cokultivierung der Tumorzell-Lysat-gepulsten MoDC mit dem TLRLiganden BCG und dem Recall-Antigen PPD konnte keine höhere T-Zellproliferationsrate im Vergleich zu der T-Zellproliferationsrate mit SK-BR3-Lysat ohne BCG und PPD erzielt werden. Die Kokultur mit MoDC, BCG und PPD ergab eine höhere Proliferation der T-Zellen als in den Proben mit BCG und SK-BR3-Lysat bzw. in PPDund SK-BR3-Lysat. Die höchste T-Zellproliferation konnte bei den Ansätzen, mit SK- 130 ERGEBNISSE BR3-Lysat und Poly I:C gemessen werden. MoDC und Poly I:C allein erzielte keine hohe T-Zellproliferation. MoDC T-Zellen SK-BR3-Lysat PPD BCG IFN-γ TNF-α IL-10 IL-6 IL-4 IL-2 Poly I:C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0 2000 4000 6000 8000 pg/ml 10000 12000 14000 Abbildung 38: Effekt von verschiedenen TLR-Liganden auf die TH1/TH2-Zytokinproduktion von MoDC und T-Zellen mit und ohne Tumorantigenstimulation. Die 48 Stunden alten Überstände der zwei Parallelansätze wurden jeweils gepoolt und durchflußzytometrisch mittels CBA analysiert (siehe Abbildung 37). MoDC wurden mit und ohne SK-BR3-Lysat-Zugabe und mit den TLR-Liganden Poly I:C und BCG sowie mit dem Antigen PPD zusätzlich kokultiviert. Die Zytokinproduktion der Kontrollen MoDC allein, T-Zellen und MoDC und T-Zellen ist ebenfalls dargestellt. 131 ERGEBNISSE pg/ml MoDC IFN-γ 0 TNF-α 0 IL-10 0 IL-6 0 IL-4 0 IL-2 0 T-Zellen 14,1 0 0 0 0 0 MoDC + TZellen 13,7 0 0 0 0 0 MoDC + TZellen+ SKBR3 MoDC + TZellen + SK-BR3 + BCG MoDC + TZellen + BCG MoDC + TZellen + SK-BR3 + PPD MoDC + TZellen + PPD MoDC + TZellen + SK-BR3 + PolyI:C MoDC + TZellen + Poly I:C 27,5 0 0 11,9 0 0 2946,8 2163,1 31,8 2294,3 0 0 2985,3 1195,2 0 1045,9 0 0 2014,3 855,9 0 446 0 38,5 2425,5 331,4 12,9 429,1 0 35,8 6045,2 8153,2 52,4 6664,3 0 0 11656,6 10678,6 89 9899,9 0 0 Tabelle 11: Zytokinproduktion in pg/ml von MoDC und T-Zellen mit und ohne Tumorantigenstimulation und verschiedenen TLR-Liganden. Der Vergleich MoDC gepulst mit SK-BR3-Lysat und der zusätzlichen Stimulation durch die TLR-Liganden BCG und Poly I:C sowie Tuberkulin zeigte eine deutliche Verstärkung der Zytokinproduktion an IFN-γ, TNF-α und IL-6. Bei den analysierten Proben ergab sich keine zusätzlich höhere Zytokinproduktion durch die Zugabe des Poly I:C und PPD zu den MoDC gepulst mit SK-BR3-Lysat. MoDC, stimuliert mit den TLRLiganden allein, induzierten zum Teil höhere Mengen an TH1/TH2-Zytokinen. Die höchste INF-γ-Sekretion durch T-Zellen konnte durch die Stimulation der MoDC mit Poly I:C und MoDC, gepulst mit SK-BR3-Lysat, sowie Poly I:C, erzielt werden. TNF-α, 132 ERGEBNISSE IL-6 und IL-10 wurden ebenfalls durch die Stimulation mit Poly I:C am stärksten freigesetzt. Durch die zusätzliche Stimulation von BCG der MoDC gepulst mit SK-BR3-Lysat konnten höhere Mengen an TNF-α, IL-6 und IL-10 im Vergleich zu allein mit BCG stimulierten MoDC induziert werden. IL-2 wurde lediglich in den Proben mit dem Recall-Antigen PPD detektiert. Bei einer starken T-Zellproliferation kann es zu einem schnellen Verbrauch des sezernierten IL-2 kommen. IL-4 wurde in keiner der Proben gemessen. Insgesamt wurden durch die Stimulation der MoDC mit TLR-Liganden große Mengen an den TH1-Zytokinen IFN-γ und TNF-α von den T-Zellen sezerniert. Es wurden aber auch durch die Stimulation mit den TLR-Liganden höhere Mengen IL-6 freigesetzt sowie geringe Mengen IL-10 sezerniert. 3.4 Untersuchungen zu Immun-escape-Mechanismen Tumore entwickeln verschiedene Mechanismen, um mit dem körpereigenen Immunsystem zu coexistieren oder um sich vor einer möglichen Immunantwort gegen sich selbst zu schützen. Einer der Mechanismen ist die unvollständige oder fehlende Expression von Oberflächenantigenen auf Tumorzellen, welche für die T-Zellerkennung und -aktivierung nötig sind, womit der Tumor einen toleranten Status erzielt. Ein anderer Mechanismus ist die Sekretion von Zytokinen durch Tumorzellen, die eine Immunantwort hemmen können bzw. dem Tumor ein weiteres Wachstum ermöglichen. Um diese Mechanismen zu untersuchen, wurden zum einen funktionell wichtige Oberflächenantigene auf Tumorzellen aus Mammakarzinomen, welche für eine spezifische T-Zellerkennung wichtig sind, untersucht. Zum anderen wurde IL-10 im Serum von Mammakarzinompatientinnen vor Therapiebeginn mit einer dendritischen Zellvakzine bestimmt, um dieses möglicherweise als einen prädiktiven Parameter für die Therapie nutzen zu können. 133 ERGEBNISSE 3.4.1 Expression von Oberflächenantigenen auf Tumorzellen aus Gewebepräparationen von Mammakarzinomen Tumorzellpräparationen aus Mammakarzinomen wurden mechanisch, wie unter 2.2.3.1 beschrieben, aufgearbeitet. Nach der zytologischen Befundung der Einzelzellen durch einen Pathologen wurden nur Präparationen, welche > 90 % Tumorzellen enthielten, für die Analyse der Oberflächenantigene HLA-DR, HLA-ABC, CD58, CD54, CD80 und CD86 verwendet. Als zusätzliche Kontrolloberflächenantigene wurden die Marker CD14 für Monozyten/Makrophagen und CD3 für Lymphozyten mit untersucht. 1x106 Tumorzellen wurden pro Färbung verwendet und die Zellen wurden im Anschluss durchflusszytometrisch analysiert (siehe 2.2.5.1.1). Die Expression der Oberflächenantigene der Tumorzellpräparationen wurden mit derjenigen der Mammakarzinomzelllinien MCF-7 und SK-BR3 und der Fibroblastenzelllinie Ftde verglichen. Fibroblasten MCF-7 SK-BR3 Tumorzellen von n=11 Mammakarzinomen 100 90 ∆% positive Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HLA-DR HLA-ABC CD58 CD54 CD80 CD86 CD3 CD14 Abbildung 39: Die Expression der Oberflächenantigene im Mittel + SD in der Prozentzahl positiver Zellen von n=11 Tumorzellpräparationen aus Mammakarzinomen, im Vergleich zu denen der Mammakarzinomzelllinien MCF-7 und SK-BR3 sowie der Fibroblastenzelllinie Ftde. Unter den analysierten Mammatumoren waren drei pT1-Tumore (Patientin E, G, K), drei pT2-Tumore (Patientin D, F, I), ein pT3-Tumor (Patientin C) sowie ein pT4-Tumor (Patientin H). Bei drei Patientinnen lagen keine Angaben zu den Primärstadien vor. Die 134 ERGEBNISSE analysierten Tumorzellen stammten bei zwei Patientinnen (F und K) aus dem Primärtumor, bei drei Patientinnen (A, C und D) aus einem Axilla- bzw. Lokalrezidiv sowie bei zwei Patientinnen (B und E) aus Lungenmetastasen. Aus einer Lebermetastase stammten die Tumorzellen bei der Patientin G und bei drei weiteren Patientinnen (H, I und L) wurden die Tumorzellen aus Pleuraergüssen gewonnen. [%] positive Zellen Pat. A HLADR HLAABC CD58 CD54 CD80 CD86 CD14 CD3 7,37 70,88 42,18 79,06 0 0 0 0 Pat. B 0 45,02 46,12 75,89 0,86 1,78 2,63 2,26 Pat. C 4,45 34,94 7,94 12,98 0,63 5,22 0 1,45 Pat. D 52,55 79,37 66,9 74,62 0 30,06 9,98 46,9 Pat. E 35,37 75,55 28,25 59,59 0 10,06 0 3,29 Pat. F 0 52,35 15,77 41,06 0 4,1 0 1,83 Pat. G 0 56,48 36,33 76,9 0 1,77 0 4,39 Pat. H 34,3 89,16 50,69 71,59 0 27,68 15,52 35,14 Pat. I 19,46 78,22 66,47 52,86 0 0 3,71 10,34 Pat. K 45,02 38,59 24,42 68,58 0,9 8,42 40,17 2,94 Pat. L 55,48 95,53 45,62 81,72 0 10,19 41,19 14,76 Mittel 23,09 65,1 39,15 63,17 0,222 9,02 10,29 11,21 0 93,83 93,85 11,56 0 3,99 0 2,2 MCF-7 11,05 0 64,85 70,61 0,74 1,85 0,41 0,81 SK-BR3 0 58,12 74,95 56,25 0,15 0,42 0,03 0,17 n=11 Pat. Fibroblasten Tabelle 12: Prozentzahl positiver Zellen der Oberflächenantigene von n=11 Tumorzellpräparationen aus Mammakarzinomen, der Fibroblastenzelllinie Ftde, der Mammakarzinomzelllinien MCF-7 und SK-BR3 sowie der Mittelwerte von n=11 Mammakarzinomen. Für das MHC-Kl I-Molekül HLA-ABC konnte bei keinem der analysierten Tumore ein kompletter Verlust gemessen werden. Eine mittlere Expression (20–60 %) von HLA-ABC auf den Tumorzellen konnte bei 5 von 11 und eine hohe Expression 135 ERGEBNISSE (60-100 %) bei 6 von 11 Präparationen festgestellt werden. Das LymphozytenFunktionsantigen LFA-3 war in 2 von 11 Tumoren sehr gering (< 20 %) exprimiert. Bei den meisten (7 von 11) Tumorzellpräparationen zeigte sich eine mittlere Expression des CD58 und bei nur 2 von 11 Patientinnen konnte eine hohe Expression gemessen werden. Kein kompletter Verlust konnte ebenfalls bei dem Adhäsionsmolekül ICAM-1 beobachtet werden. Eine niedrige Expression (< 20 %) zeigte sich in einem Fall, 3 von 11 Tumoren exprimierten CD54 zu 20–60 % und bei 7 von 11 konnte eine hohe Expression gemessen werden. Die Tumorzellen der Patientin C exprimierten HLA-ABC, LFA-3 als auch ICAM-1 am niedrigsten, was auf einen escapeMechanismus bei den Tumorzellen dieser Patientin hindeuten könnte. Keiner der untersuchten Mammatumoren exprimierte B7.1 (CD80). Das B7.2-Molekül konnte in 9 von 11 Fällen nicht bzw. auf weniger als 20 % der Zellen nachgewiesen werden. Zwei der untersuchten Präparationen exprimierten CD86 moderat (20–60 %). Eine Expression von HLA-DR unter 20 % der Zellen konnte bei 5 von 11 Tumorzellpräparationen gemessen werden. 6 von 11 Patientinnen exprimierten HLA-DR moderat, mit 20–60 % Anteil positiver Zellen. Sowohl die costimulatorischen Moleküle als auch das HLA-DR sind eher auf antigenpräsentierenden Zellen zu erwarten und nicht auf Tumorzellen. Eine fehlende Costimulation von CD80 und CD86 kann allerdings bei gleichzeitiger Expression von MHC-Molekülen auf Tumorzellen zu einer Toleranz des Tumors führen und stellt somit einen escape-Mechanismus dar. Eine Kontamination mit Monozyten lag im Mittel mit 10,29 % vor und mit Lymphozyten 11,2%, die Monozyten- bzw. Lymphozytenkontamination führte bei einem Teil der untersuchten Mammatumore zu einem höheren HLA-DR-Wert. Die Expression der einzelnen Oberflächenantigene variierte stark zwischen den einzelnen Patientinnen. 94 % der Fibroblasten, im Mittel 65 % der Tumorzellen aus Mammatumoren und 58 % der SK-BR3-Zellen exprimierten HLA-ABC. Ein kompletter Verlust des MHC-Kl-I-Moleküls wurde bei der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 gemessen. Die geringste Expression an CD58 (LFA-3) zeigte sich bei den Tumorzellpräparationen im Mittel (39 %) im Vergleich zu den Fibroblasten (94 %) und den Zelllinien MCF-7 (65 %) und SK-BR3 (75 %). Das Adhäsionsmolekül ICAM-1 war sowohl auf den Zelllinien MCF-7 mit 71 % und SK-BR3 mit 56 % der Zellen sowie auf den 136 ERGEBNISSE Tumorzellen der Mammakarzinome mit 63 % der Zellen im Mittel stark exprimiert. Die Fibroblasten waren kaum positiv für CD54 (12 %). Die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 waren im Mittel auf allen im Vergleich untersuchten Zellen gar nicht oder nur sehr gering exprimiert (< 10 %). Keine Expression von HLA-DR konnte auf den Fibroblasten und der Mammakarzinomzelllinie SK-BR3 gemessen werden. Die Zellen der MCF-7 waren zu 11 % positiv für HLA-DR und im Mittel konnte die höchste Expression des MHC-Kl II-Moleküls bei den Tumorzellpräparationen mit 23-% gemessen werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Oberflächenantigene auf den Tumorzellpräparationen untereinander sehr heterogen waren. Ein vollständiger Verlust, der für eine effektive T-Zellantwort wichtigen Moleküle MHC-Kl-I, ICAM-1 und LFA-3, konnte auf den Tumorzellen der Mammakarzinome nicht gemessen werden. Lediglich die Mammakarzinomzelllinie MCF-7 zeigte einen kompletten Verlust des MHC-Kl-I-Moleküls. Sowohl bei den Tumorzellpräparationen als auch bei der MCF-7 konnte eine erhöhte Expression von HLA-DR bei gleichzeitig fehlender Costimulation gemessen werden, was zu einer Toleranzinduktion dieser Tumorzellen führen könnte. 3.4.2 IL-10-Messungen im Serum von Mammakarzinompatientinnen und gesunden Spendern Bei n=16 Mammakarzinompatientinnen im metastasierten Stadium wurde vor Beginn der dendritischen Zelltherapie IL-10 im Serum mittels ELISA bestimmt. Als Kontrollgruppe wurde bei n=8 gesunden Spendern ebenfalls IL-10 im Serum analysiert. Bei n=5 Patientinnen (31 %) konnte IL-10 im Serum < 8 pg/ml nachgewiesen werden. In der Kontrollgruppe wurde bei keinem der 8 Spender IL-10 im Serum detektiert. 10 von 16 der untersuchten Patientinnen waren hämatogen metastasiert, bei 4 dieser 10 Patientinnen konnte IL-10 im Serum nachgewiesen werden. Die hämatogen metastasierte Patientin mit dem höchsten IL-10-Spiegel im Serum hatte als einzige auch ein inflammatorisches Mammakarzinom (siehe Tabelle 13., Patientin 19) Ein Lymphknotenlokalrezidiv wiesen 3 der Patientinnen auf, bei einer dieser Patientinnen wurde ebenfalls IL-10 im Serum gemessen. Die Patientin hatte zum Zeitpunkt der IL-10- 137 ERGEBNISSE Bestimmung einen sehr weit ausgedehnten Befund des Lokalrezidivs. 3 der analysierten Patientinnen waren nach Rezidivoperation tumorfrei, es konnte bei diesen Patientinnen kein IL-10 nachgewiesen werden. Von den 16 untersuchten Patientinnen waren bis Juli 2005 7 Patientinnen verstorben, bei 3 von diesen Patientinnen wurde IL-10 im Serum gemessen. 9 Patientinnen lebten zu diesem Zeitpunkt noch, 2 von ihnen hatten einen positiven IL-10-Spiegel im Serum. Patientin 3 Stadium pT2pN1M0 6 pT2pN0G2 7 9 11 pT1pN1M0G2 keine Angaben pT3pN1M0G2 15 pT4bG3 17 18 pT1cpN1biM0 pT2pN0M0G2 19 pT2 inflammatorisch 20 21 pT1pN3M0G2 pT1pN0M0G2 22 23 24 keine Angaben pT1cpN1biiiM0G2 pT1pN0MoG2 25 pT4NxM1G2 26 keine Angaben Metastasierung Lokalrezidiv, Lebermetastasierung Lokalrezidiv, Lungen-, Hautmetastasen Lokalrezidiv Knochenmetastasen ovarielle Metastasierung;, Beckenwandrezidiv, Knochenmetastasen, Pleurakarzinose Hautrezidiv, Lebermetastase Lymphknotenmetastase Knochen-, Hirnmetastase Knochen-, Leber-, Hirnmetastase Lymphknotenmetastase Axillarezidiv, Lungenmetastase Axillarezidiv Axillarezidiv Lokalrezidiv, Lymphknotenmetastase Knochenmetastase, Peritonealkarzinose Knochenmetastasen IL10 pg/ml 8 0 0 0 13 0 0 14 30 0 0 12 0 0 0 0 Tabelle 13: Mammakarzinompatientinnen mit Angaben zum Primärstadium, Metastasierung zum Zeitpunkt der Messung der IL-10-Konzentration im Serum. 138 DISKUSSION 4 Diskussion Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Jede achte bis zehnte Frau ist davon betroffen. Zu den Standardtherapien beim Mammakarzinom zählen die Operation, Bestrahlung, Chemotherapie, Hormontherapie sowie eine Antikörper-vermittelte Immuntherapie. Trotz drastischer Verminderung der Tumormasse durch diese Therapien bleibt oft ein Reservoir von malignen Zellen übrig. Für eine Heilung bzw. einen besseren Therapieerfolg müssen daher alle malignen Zellen beseitigt werden. Eine elegante Methode wäre die Induktion einer spezifischen Immunantwort, welche in der Lage ist, alle Tumorzellen zu eliminieren, ohne gesunde Zellen dabei in Mitleidenschaft zu ziehen. Die Reduktion der Nebenwirkungen und die damit verbundene Verbesserung der Lebensqualität rücken bei der Etablierung neuer Therapiekonzepte für Krebspatienten immer weiter in den Vordergrund. Einige immuntherapeutische Ansätze wurden in den letzten Jahren auch für die Behandlung des Mammakarzinoms entwickelt. Immuntherapien zur Bekämpfung von soliden Tumoren sind nach zwei unterschiedlichen Prinzipien angelegt. Bei einer passiven Immuntherapie wird durch eine Antikörpergabe, wie z. B. das Herceptin, das an den Wachstumsfaktorrezeptor HER-2/neu auf Mammakarzinomzellen bindet, eine NK-Zell-vermittelte Lyse der Tumorzellen herbeigeführt. Bei einer aktiven Immuntherapie sollen Tumorantigen-spezifische zytotoxische T-Zellen, die mittels antigenpräsentierender Zellen wie z. B. DC induziert werden, zur Lyse des Tumors führen. Die Hauptprobleme bei immuntherapeutischen Ansätzen sind zum einen die Fehlfunktionen der Immunzellen bei Krebspatienten und zum anderen die nicht mehr vorhandene oder mäßige Immunogenität des Tumors in vivo, die Heterogenität des Tumors sowie Immun-escape-Mechanismen. Es stellt sich daher die Frage, wie eine solche gegebenenfalls vorhandene Tumorantigenität in eine Tumorimmunogenität zu überführen ist. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob es möglich ist, im Rahmen einer klinischen Anwendung dendritische Zellen von Mammakarzinompatientinnen zu generieren, welche phänotypisch und funktionell vergleichbar mit denen von gesunden Spendern sind, um damit eine effektive Immunantwort gegen den Tumor induzieren zu können. Weiterhin wurde die Aufnahme, Präsentation und Immunogenität von Tumorantigengemischen in Form von Tumorzell-Lysaten von Mammakarzinomen untersucht. 139 DISKUSSION Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit vom Tumor ausgehenden escapeMechanismen, welche eine spezifische Antitumor-Immunantwort, induziert durch dendritische Zellen, inhibieren könnten. 4.1 Monocyte-derived dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen als Auslöser einer TH1-Immunantwort Dendritische Zellen sind spezielle antigenpräsentierende Zellen des Immunsystems, welche als einzige in der Lage sind, naive T-Zellen zu aktivieren. Sie besitzen somit eine entscheidende Bedeutung bei der Induktion einer adaptiven Immunantwort. In den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt, um entweder aus CD34+Vorläuferzellen aus dem Nabelschnurblut oder Knochenmark oder aus Monozyten des peripheren Blutes große Mengen an dendritischen Zellen zu gewinnen. Ein Ziel dieser Arbeit war nicht nur, dendritische Zellen von Mammakarzinompatientinnen für die klinische Anwendung in großer Anzahl und unter good manufacturing practice (GMP) Bedingungen ex vivo zu generieren, sondern auch ihr funktionelles Potential zu untersuchen. Die Arbeitsgruppe von Prof. Peters war die erste, die zeigen konnte, dass Monozyten in Richtung eines funktionell und phänotypisch DC-ähnlichen Zelltyps differenzieren können. Durch den Einfluss der Zytokine IL-4, GM-CSF und IFN-γ konnte eine in vitroDifferenzierung zu unreifen dendritischen Zellen mit einer hohen akzessorischen Aktivität induziert werden (KRÄMER, 1993; PETERS ET AL., 1993; XU ET AL., 1995; PEISER, 1998). Auf der Basis dieses Protokolls wurden Monozyten von Mammakarzinompatientinnen für die klinische Anwendung aus dem peripheren Blut oder aus Leukapheraten mittels Elutriation gewonnen und unter GMP-Bedingungen in RPMI + 2,5 % autologem Serum + 300 U/ml IL-4 + 300 U/ml GM-CSF und 150 U/ml IFN-γ für sieben Tage kultiviert (siehe 2.2.2.1 bis 2.2.2.4). Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass dendritische Zellpopulationen isoliert aus dem peripheren Blut, lymphoiden Geweben, aus Tumoren von Krebspatienten oder von tumortragenden Mäusen geringere Expressionen an MHC-Kl II und costimulatorischen Molekülen aufweisen (GABRILOVICH AL., 140 1997; CHEN ET AL., ET AL., 1996; NESTLE ET 2004). Des Weiteren ist bei diesen Zellen die Fähigkeit, DISKUSSION T-Zellen zu aktivieren, reduziert (CHAUX ET AL., 1996). Daher war eine Fragestellung in dieser Arbeit, ob sich aus Monozyten ausdifferenzierte dendritische Zellen von Mammakarzinompatientinnen sowohl phänotypisch als auch funktionell vergleichbar zu gesunden Spendern generieren lassen, um somit tumorbedingte Fehlfunktionen dieser dendritischen Zellen zu überwinden. Außerdem sollte die für Mammakarzinompatientinnen beschriebene verminderte Anzahl an funktionell potenten dendritischen Zellen (ALMAND ET AL., 2000) in vivo umgangen werden. 4.1.1 Morphologie und Phänotyp der MoDC von Mammakarzinompatientinnen Die charakteristische Morphologie der dendritischen Zellen des Blutes mit ihren baumartigen Verzweigungen (STEINMANN UND COHN, 1973) und ihren weit auslaufenden Zytoplasmafortsätzen konnte am Tag 7 bei den unreifen dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen im Phasenkontrast beobachtet werden (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Reife dendritische Zellen zeigten ein „Igel“-förmiges Aussehen, welches zu einer Oberflächenvergrößerung der Zelle und damit verbunden zu einer höheren Expression der für die Antigenpräsentation wichtigen Oberflächenmoleküle und verstärkten Antigenpräsentation der reifen dendritischen Zellen führt. Durch die Elutriationsmethode konnten von den Patientinnen wesentlich höhere und reinere Mengen an Monozyten in einem geschlossenen System als über die FicollAdhärenzmethode gewonnen werden (Daten im Methodenteil siehe 2.2.2.3). Dendritische Zellkulturen aus elutrierten Monozyten waren im Vergleich zu über Adhärenz isolierten Monozyten reiner und lymphozytenärmer (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3), was zu standardisierten Kulturbedingungen und reineren dendritischen Zellen für die klinische Anwendung führt (WONG ET AL., 2001; ADAMSON ET AL., 2004). Kontaminierende Lymphozyten könnten mit der Freisetzung von verschiedenen Mediatoren die Generierung von dendritischen Zellen beeinflussen. Die Expression der für die Antigenpräsentation und die Aktivierung von T-Zellen wichtigen Oberflächenantigene wurde auf den MoDC der Patientinnen und der gesunden Spender heraufreguliert. Von einer Differenzierung der Monozyten in Richtung unreifer dendritischer Zellen ist sowohl bei den Patientinnen als auch bei den 141 DISKUSSION Spendern auszugehen, dies zeigte sich an der Heraufregulation des CD1a und CD80. Diese Markerexpression entspricht dem charakteristischen Phänotyp, welcher für unreife dendritische Zellen angenommen wird (SANTIN ET AL., 1999). Unterschiede zwischen Patientinnen und gesunden Spendern ergaben sich in der Expression von CD1a, HLA-DR und CD80. Auf den dendritischen Zellen der Patientinnen waren CD1a und HLA-DR signifikant schlechter exprimiert als auf den Zellen der gesunden Spender (siehe Abbildung 9). Dies könnte ein Hinweis auf eine verminderte Fähigkeit zur Antigenpräsentation bei MoDC von Mammakarzinompatientinnen sein. GERVAIS AL., ET (2005), konnten ebenfalls bei mit IL-4 und GM-CSF generierten MoDC von Mammakarzinompatientinnen eine Verminderung der HLA-DR-Expression feststellen. Eine verringerte Expression von HLA-DR wurde auch bei dendritischen Zellen aus dem peripheren Blut und bei dendritischen Zellen aus tumorinfiltrierten Lymphknoten von Mammakarzinompatientinnen im Vergleich zu gesunden Spendern gezeigt (SATTAPORN ET AL., 2004). Eine schlechtere Expression von HLA-DR auf dendritischen Zellen kann mit der Karzinomerkrankung in Verbindung stehen. So konnte nachgewiesen werden, dass auf dendritischen Zellen von Leberzellkarzinompatienten signifikant weniger HLA-DR exprimiert war im Vergleich zu dendritischen Zellen von Patienten mit einer Leberzirrhose und gesunden Spendern (NINOMIYA ET AL., 1999). Somit scheinen vom Tumor ausgehende Faktoren oder Vortherapien der Patienten einen Einfluss auf die Expression des MHC-Kl II-Moleküls zu haben. Bei unreifen MoDC von Melanompatienten im Stadium IV wurde ebenfalls eine verminderte Expression von CD1a, welches für die Präsentation von lipidischen Antigenen wichtig ist, festgestellt (NAGAYAMA ET AL., 2003). GERLINI ET AL., (2004) konnten nachweisen, dass eine signifikant geringere Expression von CD1a auf dendritischen Zellen aus Melanommetastasen auf vom Tumor sezerniertes IL-10 zurückzuführen ist. Die dendritischen Zellen aus primären Melanomen wiesen eine normale Expression von CD1a auf. COVENTRY ET AL., (2002) fanden eine reduzierte oder sogar fehlende Expression von CD1a bei tumorinfiltrierenden unreifen dendritischen Zellen in Mammatumoren. CD1a auf dendritischen Zellen in Tumoren scheint somit direkt durch Immun-escapeMechanismen inhibiert zu werden und könnte eine wesentliche Rolle bei der Inhibition von Anti-Tumor-Immunreaktionen spielen. Auch die Aktivierung von T-Zellen kann bei 142 DISKUSSION den Mammakarzinompatientenzellen vermindert sein, da eines der costimulatorischen Signale (CD80) in den vorliegenden Untersuchungen im Mittel geringer auf den Patientenzellen exprimiert war. Bei dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen aus dem peripheren Blut und aus tumorinfiltrierten Lymphknoten wurde bisher eine verringerte Expression von CD86, nicht aber von CD80 beschrieben (SATTAPORN ET AL., 2004). Eine verminderte Costimulation durch eine geringere Expression von CD80 und CD86 und eine damit verbundene signifikant geringere T-Zellproliferation wurde bei dendritischen Zellen aus Ösophagustumoren gezeigt (CHEN ET AL., 2004). Insgesamt war eine sehr hohe inter- und intraindividuelle Varianz bei der Expression der Oberflächenantigene von Patienten und gesunden Spendern festzustellen. Diese Varianz konnte auch bei ex vivo generierten dendritischen Zellpräparationen von Melanompatienten gemessen werden (RIBAS ET AL., 2004). Der Differenzierungsstatus der aus Monozyten ausdifferenzierten dendritischen Zellen könnte einen Einfluss auf den Therapieerfolg bei den behandelten Patientinnen haben. Dies konnte mit den hier vorliegenden retrospektiv ausgewerteten Daten gezeigt werden. Wobei darauf hingewiesen werden muss, dass die insgesamt ausgewertete Patientenfallzahl relativ gering war. Patientinnen der responder-Gruppe exprimierten signifikant höhere Mengen an CD1a und im Mittel höhere Mengen des costimulatorischen Moleküls CD80 (siehe Abbildung 10). Dies deutet darauf hin, dass die in vitro generierten dendritischen Differenzierungsstatus Zellen von Patientinnen (non-responder-Patientinnen) die mit in einem vivo bestimmten beschriebenen Fehlfunktionen bei dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen nicht beheben konnten (ALMAND ET AL., 2000). Durch die Generierung von dendritischen Zellen in vitro aus CD34+-Vorläuferzellen konnte bei Patientinnen mit einem fortgeschrittenen Mammakarzinom eine Fehlfunktion der Blut-DC aufgehoben werden. Diese Zellen induzierten eine bessere T-Zellantwort als die Blut-DC der Patientinnen (GABRILOVICH ET AL., 1997). Andererseits konnte kein Zusammenhang zwischen dem Phänotyp und dem Zytokinprofil von in vitro generierten dendritischen Zellen von Melanompatienten und deren Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu induzieren, gefunden werden (RIBAS ET AL., 2004). 143 DISKUSSION Keine Korrelation konnte zwischen dem Phänotyp der generierten dendritischen Zellen und der Tumorgröße bzw. Ausbreitung des Tumors auf bestimmte Organe gesehen werden. In der Literatur sind widersprüchliche Aussagen zu dem Vorkommen und der Art der dendritischen Zellen in Mammatumoren in Korrelation zum klinischen Verlauf zu finden. LESPAGNARD ET AL., (1999) konnten keinen Zusammenhang in der Häufigkeit von S100+-DC in Mammatumoren und dem progressionsfreien Überleben sowie dem Gesamtüberleben erkennen. Dagegen konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass eine höhere Anzahl an CD83+ dendritischen Zellen in Mammatumoren verbunden ist mit einem längeren progressionsfreien Überleben und einem längeren Gesamtüberleben (IWAMOTO ET AL., 2003). Diese Unterschiede könnten sich durch die zwei verschiedenen Bestimmungsmethoden ergeben haben, sowohl reife als auch unreife dendritische Zellen sind S100-positiv. Geringere Zellzahlen an insgesamt isolierten und generierten dendritischen Zellen konnten bei Patientinnen direkt nach einer Chemotherapie nachgewiesen werden. Toxische Effekte von Chemotherapeutika auf dendritische Zellen und dadurch verringerte Mengen an dendritischen Zellen sowie Fehlfunktionen von dendritischen Zellen konnte bereits in Zellkulturen, im Tiermodell und bei Patienten gezeigt werden (CHAO ET AL., 1999; LIMPENS ET AL., 1991; MARKOWICZ ET AL., 2002). Diese Daten weisen darauf hin, dass aus Monozyten von Mammakarzinompatientinnen unreife dendritische Zellen generierbar sind. Diese MoDC aber zum Teil (nonresponder-Patientinnen) im Vergleich zu gesunden Spendern einen unterschiedlichen Phänotyp aufweisen und könnten somit ein unterschiedliches Ansprechen auf eine dendritische Zellvakzine verursachen. 4.1.2 Funktionalität der MoDC und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen Da die Unterschiede im Phänotyp zwischen Patienten und Spendern bzw. zwischen den responder- und non-responder-Patienten sich im Wesentlichen auf antigenpräsentierende und costimulatorische Moleküle beziehen, liegt eine Fehlfunktion dieser dendritischen Zellen in ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, nahe. Dieses reduzierte 144 DISKUSSION Vermögen der MoDC von Patientinnen, T-Zellen zu aktivieren, konnte mittels eines autologen T-Zellproliferationstest mit Tetanustoxoid gezeigt werden (siehe 3.1.3.1). Im Mittel konnte bei den Patienten-MoDC eine geringere akzessorische Aktivität, welche allerdings nicht signifikant war, und eine damit verbundene niedrigere T-Zellproliferation gemessen werden als bei den gesunden Spenderinnen (siehe Abbildung 11). Dieses verminderte Vermögen, autologe T-Zellen mittels PPD zu aktivieren, konnte SATTAPORN ET AL., (2004) bereits an dendritischen Zellen aus dem peripheren Blut und bei dendritischen Zellen aus tumorinfiltrierten Lymphknoten von Mammakarzinompatientinnen zeigen. Auch die Arbeitsgruppe um Gabrilovich konnte eine verminderte allogene T-Zellproliferation nach Tetanustoxoidstimulation mit Blut-DC von Mammakarzinompatientinnen nachweisen (GABRILOVICH ET AL., 1997). Somit scheint bei natürlichen dendritischen Zellen von Mammakarzinompatientinnen die Fehlfunktion in der Aktivierung von T-Zellen nicht durch diese in vitro aus Monozyten generierten dendritischen Zellen aufgehoben werden zu können. Andererseits sind auch Fehlfunktionen, wie verringertes Proliferationsvermögen und eine reduzierte Produktion an TH1- und erhöhte Sezernierung an TH2-Zytokinen, bei den T-Zellen von Mammakarzinompatientinnen beschrieben worden (POCKAJ ET AL., 2004). Daher wurden in dieser Arbeit sowohl die dendritischen Zellen als auch die Lymphozyten der Mammakarzinompatientinnen untersucht. Durch die Mitogenstimulation der Lymphozyten mit PHA konnte gezeigt werden, dass die Lymphozyten der Mammakarzinompatientinnen im Mittel ein nicht signifikantes, gering vermindertes Proliferationsvermögen im Vergleich zu den gesunden Spenderinnen aufwiesen (siehe Abbildung 12). Dieses verringerte Stimulationsvermögen bei Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen durch PHA wurde bereits bei noch nicht therapierten Patientinnen und nicht weit fortgeschrittenen Karzinomerkrankungen festgestellt (BLIDARU ET AL., 1998). Abnormalitäten im Phänotyp und in der Funktion von T-Zellen wurden bei Mammakarzinompatientinnen noch bis zu 6–12 Monate nach HochdosisChemotherapien gefunden. Die T-Zellproliferation nach PHA-Stimulation war bei diesen Patientinnen signifikant vermindert (AVIGAN ET AL., 2000). Bei Melanom- patienten konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Proliferationsfähigkeit von T-Zellen assoziiert war mit der verminderten Expression des Präsentationsantigens 145 DISKUSSION HLA-DR (JOVIC ET AL., 2001). Ein weiterer Grund für die Fehlfunktionen von T-Zellen oder einer Immunsuppression in Folge einer progredienten Erkrankung oder Chemotherapie kann das Vorkommen von regulatorischen T-Zellen (Treg) sein. CD4+-CD25+-T-Zellen sezernieren erhöhte Mengen an IL-10 und können damit eine antigenspezifische T-Zell-Antwort inhibieren (GROUX ET AL., 1997; ASSEMAN ET AL., 1999). Im Blut von Mammakarzinompatientinnen konnte bisher im Vergleich zu gesunden Spendern keine erhöhte Prozentzahl an Treg nachgewiesen werden. Dagegen befanden sich im Blut von nichtkleinzelligen Lungenkarzinompatienten erhöhte Mengen an Treg (OKITA ET AL., 2005). Für eine zelluläre Antitumor-Immunantwort ist die Bildung von TH1-Zellen und die damit verbundene Produktion von TH1-Zytokinen erforderlich. In einigen Studien konnte bei Blasenkarzinom-, Gliom-, Prostata- und weiter fortgeschrittenen Hals-Kopftumor-Patienten gezeigt werden, dass überwiegend bei diesen Patienten ein TH2-Zytokinprofil und eine verminderte TH1-Immunantwort vorlag (AGARWAL ET AL., 2005; HU ET AL., 2001; FILELLA ET AL., 2000; SPARANO ET AL., 2004). Um die Funktion der Effektor-T-Zellen bei den Mammakarzinompatientinnen näher zu untersuchen und die Inhibierung einer effektiven Antitumor-Immunantwort durch Treg auszuschließen, wurde das TH1- und TH2-Zytokinprofil nach Stimulation der MoDC der Patientinnen mit Tetanustoxoid analysiert. Dabei konnte bei den Mammakarzinompatientinnen ein TH2-Zytokinprofil mit erhöhten Mengen an IL-6 und geringen Mengen an IFN-γ gemessen werden. Ein Hinweis auf eine vermehrte Induktion von Treg lag bei den Patientinnen nicht vor, da bei keiner der Patientinnen IL-10 detektiert werden konnte (siehe Abbildung 13 und Tabelle 6). Bei den gesunden Spenderinnen dagegen wurde eine TH1-Immunantwort mit einer wesentlich höheren Menge an IFN-γ und mehr IL-2 bestimmt (siehe Abbildung 13). Eine überwiegende TH2-Immunantwort und eine damit verbundene Immunsuppression und Blockade der zellulären Antitumor-Immunität konnte bisher bei fortgeschrittenen Mammakarzinompatientinnen durch eine erhöhte Expression von COX-2 im Tumor und der damit verbundenen Synthese von Prostaglandin E2 nachgewiesen werden (POCKAJ ET AL., 2004). Zuvor konnte bereits gezeigt werden, dass PGE2 die IL-12-Produktion bei in IL-4 und GM-CSF kultivierten Monozyten hemmt und dieses mit einer erhöhten TH2-Immunantwort assoziiert war 146 DISKUSSION (KALINSKI ET AL., 1997). Da die MoDC der Patientinnen mit dem autologen Serum generiert wurden und auch alle T-Zell-assays mit dem Serum der Patienten durchgeführt wurden, könnte ein erhöhter PGE2-Spiegel im Serum zu einer TH2-Antwort geführt haben. Ein weiterer Grund für einen shift in eine TH2-Immunantwort bei Mammakarzinompatientinnen ist die Anwendung von Chemotherapien. So konnte bei metastasierten Patientinnen nach Chemotherapie ein signifikanter Rückgang an IFN-γ und eine Zunahme an dem TH2-Zytokin IL-4 gemessen werden (FERRARI ET AL., 2005). Zusammenfassend kann zu den bisher diskutierten Daten gesagt werden, dass sich unter dem Einfluss der Zytokine IL-4, GM-CSF, IFN-γ und autologem Serum aus den Monozyten der Mammakarzinompatientinnen dendritische Zellen generieren lassen. Diese in vitro generierten dendritischen Zellen tendieren allerdings im Vergleich zu denen von gesunden Spendern zu einer qualitativ schlechteren Expression an funktionell wichtigen Oberflächenmarkern, was zu, bereits für Blut-DC von Patienten beschriebenen, Fehlfunktionen führt. 4.1.3 Der Einfluss von IFN-γγ, Patientenserum und höheren Konzentrationen IL-4/GM-CSF auf die Differenzierung der MoDC von Patientinnen Auf der Basis der zuvor diskutierten Ergebnisse werden in den folgenden Abschnitten einige Bestandteile des Kultursystems diskutiert, um durch die Veränderung der Kulturbedingungen phänotypisch und funktionell bessere dendritische Zellen von Patientinnen herzustellen. Im Vergleich zu der bisherigen Standardsituation soll nun der Einfluss von IFN-γ auf die Differenzierung und Funktionalität von Patienten-MoDC, welche mit und ohne IFN-γ generiert wurden, diskutiert werden. Im Anschluss daran werden weitere Faktoren, wie der Einfluss von höheren Zytokinkonzentrationen an IL-4 und GM-CSF, sowie der Einfluss des autologen Serums auf die Differenzierung, diskutiert. Letztere Daten wurden anhand von Normal-Spenderzellen erhoben, da aufgrund der vielen Versuchssituationen viele Zellen benötigt wurden und Patientenzellen nur begrenzt zur Verfügung standen. HLA-DR ist ein MHC-Klasse II-Molekül, das auf dendritischen Zellen und auf anderen antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird (CAUX ET AL., 1992). Bereits (1986) 147 DISKUSSION konnten WALSH ET AL. eine gesteigerte Expression von HLA-DR und HLA-DQ durch IFN-γ auf gingivalen Langerhans-Zellen feststellen. Auch Peters und seine Arbeitsgruppe beobachteten 1993 einen fördernden Effekt von IFN-γ auf die Expression von HLA-DR. Ebenso konnte RONGCUN ET AL., (1998) eine stark erhöhte Expression von HLA-DR auf MoDC unter dem Einfluss von IFN-γ induzieren. Bei den hier vorliegenden Daten der Patienten-MoDC konnte unter dem Einfluss von IFN-γ eine im Mittel leichte Steigerung der HLA-DR-Expression beobachtet werden. Eine höhere Antigendichte des HLA-DR-Moleküls war allerdings auf den MoDC, welche ohne IFN-γ generiert wurden, zu verzeichnen. Keine verstärkte HLA-DR-Expression durch IFN-γ in serumhaltigen Kulturen konnte bei MoDC von gesunden Spendern gemessen werden, dagegen wurde eine erhöhte HLA-DR-Expression durch IFN-γ auf MoDC in serumfreien Kulturen festgestellt (SENSEN, 2004). Serumkomponenten scheinen somit einen Einfluss auf die Expression von HLA-DR bei der Generierung von MoDC zu haben. CD14, der LPS-Rezeptor auf Monozyten und Makrophagen, dient zur Erkennung von Lipopolysacchariden im menschlichen Serum (WRIGHT ET AL., 1990). Die Herunter- regulation von CD14 bei der Differenzierung von Monozyten zu dendritischen Zellen kann durch die alleinige Gabe von IL-4 oder GM-CSF nicht erzielt werden (RUPPERT ET AL., 1993). Peters und seine Arbeitsgruppe stellten darüber hinaus fest, dass IFN-γ die Herunterregulation von CD14 inhibiert, sie diskutierten einen antagonistischen Effekt von IFN-γ zu IL-4. Die hier vorliegenden Ergebnisse belegen die Untersuchungen von PETERS ET AL, (1993). Bei den Patienten-MoDC konnte gezeigt werden, dass in der Kultur ohne IFN-γ CD14 nahezu komplett herunterreguliert wurde, wogegen mit IFN-γ ein Teil der Zellen weiterhin CD14 exprimierte. SANTIN ET AL., (1999) bezeichnete das Vorkommen von CD14 als ein Hinweis auf mangelnde DC-Differenzierung. CD64 ist ein Monozyten- und Makrophagenmarker, welcher als Fcγ-Rezeptor Endozytose vermittelt. Der Verlust von CD64 stellt in der Differenzierung von Monozyten zu MoDC ein endscheidenes Signal in dem Differenzierungsprozess dar (CHAPUIS ET AL., 1997). Das CD64 verhielt sich in der Expression auf den Patienten-MoDC mit und ohne IFN-γ ähnlich wie das CD14. Durch IFN-γ wurde die Expression von CD64 auf den Patienten-MoDC stabilisiert. Ähnliche Daten bezüglich des IFN-γ-Einflusses konnte bei 148 DISKUSSION MoDC von gesunden Spendern gezeigt werden (SENSEN, 2004). Dagegen ist CD64 auf den MoDC, welche ohne IFN-γ kultiviert wurden, drastisch herunterreguliert. CD1a ist ein antigenpräsentierendes Molekül und dient der Antigenpräsentation von lipophilen Antigenen (BECKMAN ET AL., 1994). Die über CD1-Moleküle präsentierten Antigene werden über einen separaten pathway präsentiert (SUGITA ET AL., 1999). Der Heraufregulation von CD1a wird eine ganz entscheidende Bedeutung zugemessen: CD1a stellt den Marker für unreife dendritische Zellen dar, wohingegen es auf reifen dendritischen Zellen wieder herunterreguliert wird (STEINMAN ET AL., 1997; ZHOU UND TEDDER, 1995). RONGCUN ET AL., (1998) stellten fest, dass INF-γ einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf die Expression von CD1a auf MoDC hat. Dieser Effekt des IFN-γ konnte auch bei den hier vorliegenden Untersuchungen an den MoDC der Mammakarzinompatientinnen beobachtet werden. Mit IFN-γ ist die Expression von CD1a deutlich herunterreguliert. Diese Daten der CD1a-Expression auf den MoDC der Patienten könnten ein ganz entscheidender Hinweis darauf sein, warum die in vitro generierten dendritischen Zellen der Mammakarzinompatientinnen nicht die Fehlfunktionen, die auch für Blut-DC beschrieben wurden, beheben konnten. MoDC mit einer fehlenden oder mangelnden Expression von CD1a können T-Zellen zwar stimulieren, führen aber zu einer TH2-Immunantwort (CHANG ET AL., 2000). Für eine effektive zelluläre Antitumor-Immunantwort ist es erforderlich, eine zytotoxische TH1Antwort zu induzieren. CD83 ist der spezifische Marker für reife dendritische Zellen. CD14+-Blutmonozyten können mit Hilfe von IL-4, GM-CSF und TNF-α, als Reifungssignal, in komplett reife CD83+-dendritische Zellen differenziert werden (ZHOU UND TEDDER, 1996). Bisher ist keine Funktion für das CD83-Molekül bekannt. Da es sich bei den Patienten-MoDC um unreife MoDC handelt, war eine komplette Heraufregulation von CD83 daher nicht zu erwarten. Auf den hier vorliegenden unreifen Patienten-MoDC ist CD83 zum Teil exprimiert, somit konnte eine Steigerung oder Herunterregulation der Expression durch IFN-γ auf diesen Zellen beurteilt werden. IFN-γ hatte einen inhibierenden Effekt auf die Expression von CD83 auf den Patienten-MoDC. Ein gegenteiliger Effekt von IFN-γ konnte auf MoDC nachgewiesen werden, welche durch IFN-γ eine erhöhte Expression an CD83 aufwiesen (NAKAHARA ET AL., 2005). Die Zellen wurden in Gegenwart von 149 DISKUSSION FCS kultiviert und nicht im autologen Serum; somit könnte das FCS zu diesem Effekt geführt haben. CD80 und CD86 sind die costimulatorischen Moleküle B7.1 und B7.2. Sie sind die Liganden für CD28 und CTLA-4 auf T-Zellen und für die vollständige Aktivierung von T-Zellen verantwortlich. Das CD86 ist bereits auf Monozyten exprimiert. Durch die generierenden Zytokine kommt es zu einer Expressionssteigerung in der Antigendichte auf MoDC. Dagegen ist CD80 nicht auf Monozyten exprimiert und muss somit in der Differenzierung von MoDC induziert werden. Damit scheint das CD80 zusammen mit dem IL-12 eine der Schlüsselstellungen bei der Aktivierung von T-Zellen zu haben. IL-12 ist bei der Induktion einer effektiven TH1-Immunantwort das entscheidende Zytokin, welches von DC sezerniert wird (HILKENS ET AL., 1997). Bei den hier vorliegenden Patienten-MoDC kam es bei den ohne IFN-γ kultivierten Zellen zu einer Steigerung von CD80 und einer Steigerung in der Antigendichte von CD86. In der Literatur fanden sich dazu gegensätzliche Aussagen. RONGCUN ET AL., (1998) konnten ebenfalls eine reduzierte Expression von CD80 auf MoDC unter IFN-γ Einfluss nachweisen, keinen Einfluss fanden sie beim CD86. Nakahara und seine Arbeitsgruppe fanden einen fördernden Effekt von IFN-γ auf CD80 und CD86 in einer FCS-haltigen Kultur (NAKAHARA ET AL., 2005). CD11c ist eine Untereinheit des Komplementrezeptors 4 und vorwiegend auf myeloiden Zellen exprimiert. IFN-γ hatte einen inhibierenden Effekt auf das CD11c. Die Antigendichte des CD11c konnte auf den MoDC der Patientinnen ohne IFN-γ gesteigert werden. Dies konnte auch an MoDC von gesunden Spendern unter IFN-γ-Einfluss beobachtet werden (SENSEN, 2004). Die Qualität von aus Monozyten differenzierten dendritischen Zellen kann letztlich erst mit ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, beurteilt werden. So wurde bei der Etablierung der IFN-γ-Kulturbedingungen festgestellt, dass MoDC, welche mit IFN-γ generiert wurden, eine ähnliche T-Zellstimulationskapazität besitzen wie Blut-DC (XU ET AL., 1995). RONGCUN ET AL., (1998) stellten eine schlechtere T-Zell-stimulatorische Aktivität bei mit IFN-γ generierten MoDC fest. Dies kann durch die hier vorliegenden Daten nicht bestätigt werden. MoDC mit und ohne IFN-γ-Einfluss induzierten mittels 150 DISKUSSION Tetanustoxoid eine etwa gleich starke T-Zellaktivierung, wobei die MoDC mit IFN-γ− Einfluss eine sogar leicht höhere T-Zellproliferation induzierten (siehe Abbildung 15). Diese Ergebnisse und die unter dem Einfluss von IFN-γ verminderte Expression von CD1a könnten im Zusammenhang mit den von CHANG ET AL, (2000) dargestellten Ergebnissen stehen. Diese Arbeitsgruppe berichtete, dass CD1a-negative dendritische Zellen zwar eine T-Zellstimulation induzieren können, diese aber eine TH2-Immunantwort hervorrufen. Wie bereits in dem oberen Abschnitt diskutiert wurde, induzierten die mit IFN-γ generierten Patienten-MoDC eine TH2-Immunantwort. Dagegen induzierten die unter den gleichen Kulturbedingungen generierten Spender-MoDC, welche zuvor eine höhere CD1a-Expression als die Patientenzellen zeigten, eine TH1-Immunantwort. Diese Beobachtungen legen die Schlussfolgerung nahe, auf den Einsatz von IFN-γ zu Beginn der Generierung von Patienten-MoDC zu verzichten. Denn für die Applikation von dendritischen Zellen in einer Antitumor-Immuntherapie ist die Induktion einer TH1-Immunantwort primäre Voraussetzung für einen Therapieerfolg. Bei dem Einsatz von Patientenseren zur Differenzierung von dendritischen Zellen sind sowohl positive als auch negative Aspekte zu betrachten. Serum ist einerseits ein wichtiger Kulturzusatz, es beinhaltet Wachstumsfaktoren und entgiftende Moleküle, andererseits befinden sich im Serum auch Hemmfaktoren als Teil der Immun-escapeMechanismen. Im Serum von Patienten mit malignen Knochentumoren wurde ein erhöhter Spiegel an löslichem CD40 Ligand nachgewiesen (HOLZER ET AL., 2003). CD40-Ligand ist ein Reifungssignal für dendritische Zellen, induziert damit die IL-12-Produktion und erhöht die T-Zell-Stimulations-Kapazität (CELLA ET AL., 1996). Bei hämatogen metastasierten Patienten befinden sich Tumorproteine im Serum, wie z. B. CEA und CA 15-3, welche bei Mammakarzinompatientinnen im Serum bestimmt werden können. Diese Tumorproteine können in der Zellkultur von den dendritischen Zellen aufgenommen werden. Somit kann eine Beladung der dendritischen Zellen mit diesen tumorspezifischen Proteinen erfolgen. MARTEN ET AL., (2000) konnten zeigen, dass dendritische Zellen, kultiviert mit Patientenserum, welches einen erhöhten Spiegel an CA 19-9 enthielt, die Zytotoxizität der Effektorzellen gegen Pankreaskarzinomzellen erhöhen konnten. 151 DISKUSSION Weiterhin befinden sich im Serum der Patienten Antikörper, Immunkomplexe und andere Proteine, welche von den dendritischen Zellen während ihrer Differenzierung aufgenommen werden könnten. Negative Effekte auf die Differenzierung von MoDC könnten im Serum der Patienten vorkommendes IL-6 und M-CSF haben. MENETRIERCAUX ET AL., (1998) konnten zeigen, dass IL-6 und M-CSF in Zelllinienüberständen aus einem Nierenkarzinom die Differenzierung von CD34+-Zellen zu dendritischen Zellen hemmen. Ein erhöhtes PGE2-Vorkommen bei Mammakarzinompatientinnen konnte bereits nachgewiesen werden (POCKAJ ET AL., 2004). PGE2 in Überständen von frisch entnommenen Tumoren aus dem Colon und der Mamma hemmte die Differenzierung von MoDC und induzierte eine TH2-Immunantwort IL-10-Produktion der MoDC (SOMBROEK ET AL., durch eine vermehrte 2002). Somit können vom Tumor produzierte Mediatoren im Serum die Differenzierung der MoDC beeinflussen. Bei den hier vorliegenden Daten konnte kein inhibitorischer Effekt der Patientenseren auf die Differenzierung der allogenen Spenderzellen gesehen werden. Die Expression der Oberflächenmarker ergab keine Unterschiede im Vergleich zu der autologen Situation, bis auf das CD14, welches durch die Inkubation mit den Patientenseren komplett herunterreguliert wurde. Dagegen kam es in der serumfreien Differenzierung zu deutlichen Unterschieden im Vergleich zur serumhaltigen Standardkultur. Sowohl die costimulatorischen Moleküle als auch HLA-DR und CD11c waren unter serumfreien Kulturbedingungen drastisch reduziert (siehe Abbildung 16 und Abbildung 17). Eine serumhaltige Kultur begünstigt eher die Expression von CD86 (SENSEN, 2004), während CD1a unter serumhaltigen Kulturbedingungen eher schlechter exprimiert ist im Vergleich zur serumfreien Kulturbedingung (DUPERRIER ET AL., 2000). Dies können auch die hier vorliegenden Daten bestätigen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Verwendung von Patientenseren zwar keine standardisierten Differenzierungsverhältnisse für MoDC schafft; da aber in den hier vorliegenden Ergebnissen keine inhibitorischen Effekte bei dem Patientenserum gesehen wurde und serumfreie Kulturbedingungen sich nachteilig auf den Differenzierungsstatus auswirkten, wurden die nachfolgenden Experimente weiter mit autologen Patientenseren durchgeführt. 152 DISKUSSION Ausgehend von den Standardkulturbedingungen im Labor Peters mit jeweils 300 U/ml GM-CSF und IL-4 sowie 150 U/ml IFN-γ in einer serumhaltigen Kultur, konnte der beschriebene Phänotyp mit schwach exprimiertem CD14, einer Heraufregulation von CD86 und einer Neuinduktion der Oberflächenmarker CD1a und CD80 erzielt werden (PETERS ET AL., 1993; PEISER ET AL., 1998). Dieses Expressionsschema entspricht dem Phänotyp von unreifen MoDC (SANTIN ET AL., 1999). Wie bereits zuvor diskutiert konnte die Expression dieser Oberflächenmarker für die Patientenzellen nicht in gleicher Qualität wie im Vergleich zu den von gesunden Spendern generierten MoDC erzielt werden, was letztlich zu der Induktion einer TH2-Immunantwort durch die Patienten-MoDC führte. Bei metastasierten Patienten konnte durch die systemische Gabe und damit verbundene Konzentrationserhöhung in vivo von GM-CSF und IL-4 das Verhältnis von preDC1- zu preDC2-Zellen zugunsten von DC1-Zellen gelenkt werden, welche in der Lage waren, eine TH1-Immunantwort zu induzieren (KIERTSCHER ET AL., 2003). Bei IL-4-Konzentrationen ab 500 U/ml während der Differenzierung von MoDC konnte gezeigt werden, dass IL-4 den blockierenden Effekt von IL-6 aus Tumorzelllinienüberständen auf die Differenzierung der MoDC korrigieren kann (MENETRIERCAUX ET AL., 1998; MENETRIER-CAUX ET AL., 2001). Andererseits waren die Ergebnisse von THURNHER ET AL., (2001) zu beachten. Diese Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass IL-4 in den Konzentrationen 500-1000 U/ml die Aktivität von Phospholipasen bei MoDC hemmt. Dies führt zu einer verminderten Migrationsfähigkeit, T-Zellaktivierung und NK-Zellaktivierung dieser Zellen. Bei den hier vorliegenden Daten konnte durch die Konzentrationsveränderung auf 800 U/ml GM-CSF und 500 U/ml IL-4 ohne IFN-γ in einer serumhaltigen Kultur die Expression aller funktionellen und charakteristischen Oberflächenmarker auf den Patienten-MoDC im Vergleich zu den zuvor erhobenen Daten der MoDC von Mammakarzinompatientinnen signifikant verbessert werden (siehe Abbildung 18). Insbesondere die stark signifikante Verbesserung von CD1a, CD83 sowie CD80 unter diesen Kulturbedingungen kann einer der Gründe für die drastische Reduktion des TH2-Zytokins IL-6 und die erhöhte Sezernierung der TH1-Zytokine IFN-γ und IL-2 sein. Dies wird durch die bereits zuvor diskutierten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe um Chang bestätigt. Diese postulierte sogar, dass die 153 DISKUSSION Expression von CD1a und die Produktion von IL-12 durch den gleichen Mechanismus reguliert werden (CHANG ET AL., 2000). Wenngleich darauf hingewiesen werden muss, dass durch die veränderten Kulturbedingungen die TH1-Zytokinproduktion der Spenderzellen stärker gesteigert werden konnte als die der Patientenzellen bei ähnlicher CD1a-Expression (Daten nicht gezeigt). Somit scheinen noch andere Regulationsprozesse bei der Induktion der TH1-Immunantwort eine Rolle zu spielen. Abschließend kann zu diesem Teil der Arbeit gesagt werden, dass durch die Modifizierung des Kultursystems, indem auf den Einsatz von IFN-γ verzichtet und die IL-4- bzw. GM-CSF-Konzentration heraufgesetzt wurde, es gelang, phänotypisch und funktionell potentere MoDC von Mammakarzinompatientinnen zu generieren. Diese Zellen waren in der Lage, eine TH1-Immunantwort zu induzieren und stehen somit für eine Antitumor-Immuntherapie zur Verfügung. Diese MoDC der Mammakarzinompatientinnen könnten somit eventuell die für Blut-DC beschriebenen Fehlfunktionen korrigieren. Alle nachfolgend diskutierten Ergebnisse wurden auf der Basis dieses Protokolls erhoben. 4.2 Antigenaufnahme der MoDC von Mammakarzinompatientinnen Antigenpräsentierende Zellen sind in der Lage, unterschiedliche Endozytosemechanismen zur Aufnahme von Antigenen zu benutzen. Dies ist zum einen abhängig von der Art des Antigens und der Antigenaufnahmekapazität und zum anderen führen die verschiedenen Aufnahmerouten zu funktionell unterschiedlichen Konsequenzen. Durch Phagozytose werden große Partikel oder Zellen >1 µm im Durchmesser aufgenommen. Monozyten und unreife dendritische Zellen phagozytieren mit einer hohen Kapazität apoptotische Zellen, Bakterien, Partikel oder Liposomen (TROMBETTA UND MELLMAN, 2005). Unreife MoDC sind ebenfalls in der Lage, apoptotische Zellen zu phagozytieren. Die exogene Aufnahme von apoptotischen Zellen führt bei MoDC zu einer vermehrten cross-Präsentation von exogenen Antigenen auf MHC-KL I und einer damit verbundenen Entwicklung von zytotoxischen T-Zellen (ALBERT sowie zu Selbsttoleranz (STEINMAN ET AL., ET AL., 1998) 2000). Dendritische Zellen phagozytieren nicht nur tote Zellen, sie nehmen auch durch so genanntes „Abbeißen“ Bestandteile von 154 DISKUSSION benachbarten lebenden Zellen auf und präsentieren diese ebenfalls über cross-Präsentation auf MHC-Kl I (HARSHYNE ET AL, 2001; JOLY UND HUDRISIER, 2003). MoDC besitzen eine hohe Endozytoseaktivität bei der Aufnahme von löslichen Antigenen durch Makropinozytose und der Rezeptor-vermittelten Endozytose (BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998). Sowohl die Phagozytose als auch die Makropinozytose werden durch die Reifung von dendritischen Zellen herunterreguliert, dagegen hat die Reifung von DC nur einen geringen Effekt auf die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Antigenen (GARRETT ET AL., 2000). In den folgenden Abschnitten wird die Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von Mammakarzinompatientinnen diskutiert. Des Weiteren wird die Phagozytose und Pinozytose von Membran- und löslichen Proteinen aus nekrotischem Tumorzell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 im Hinblick auf die Induktion einer Reifung der dendritischen Zellen betrachtet. Die Funktion der Antigenaufnahme durch Phagozytose war bei fast allen unreifen MoDC (82,21 %) der Mammakarzinompatientinnen vorhanden (siehe Abbildung 23). Kein Unterschied zwischen der Phagozytosekapazität von unreifen MoDC von Mammakarzinompatientinnen und denen von gesunden Spendern wurde von GERVAIS ET AL., (2005) beschrieben. Durch die Kultivierung von unreifen MoDC mit einem Cocktail aus IL-6, IL-1β, TNF-α und PGE2 ab Tag 5 kommt es zu einer kompletten Reifung der dendritischen Zellen (JONULEIT ET AL., 1997). Die Phagozytoseaktivität der reifen MoDC von den Patientinnen war durch den „Jonuleit-Mix“ bis auf 29,55 % der Zellen im Mittel herunterreguliert. Wie bereits zuvor schon erwähnt konnten GARRETT ET AL., (2000) zeigen, dass durch die Reifung der dendritischen Zellen sowohl die Makropinozytose als auch die Phagozytose reduziert wird. Durch die Reifungssignale CD40-Ligand und IFN-α/TNF-α konnte bei dendritischen Zellen aus CD34+ Vorläuferzellen von gesunden Spendern eine reduzierte Phagozytosekapazität auf 34 % mit CD40-Ligand und auf 31 % mit IFN-α/TNF-α der Zellen festgestellt werden (CHEN ET AL., 2001). KIAMA ET AL., (2001) wiesen nach, dass die Reduktion der Phagozytose mit zunehmender Reifung auch auf die in vivo-Situation zu übertragen ist. Diese Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass Alveolarmakrophagen die höchste Phagozytosekapazität im Vergleich zu den peripheren Monozyten besitzen, dass Monozyten eine 155 DISKUSSION höhere Phagozytosekapazität als unreife DC und diese wiederum als reife DC besitzen. Mit zunehmendem Grad der dendritischen Zelldifferenzierung wird die Phagozytose reduziert und die Prozesse der Antigenpräsentation rücken verstärkt in den Vordergrund. Durch die Phagozytose von bestimmten Materialien kann eine Reifung induziert werden und somit dann zu einer verstärkten T-Zellstimulation durch diese reifen DC führen. Zymosan bindet an den TLR-2 und induziert die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen in Immunzellen (SATO ET AL., 2003). Bei den hier vorliegenden Ergebnissen konnte eine Reifung der unreifen Patienten-MoDC durch die gesteigerte Expression von CD83 nach Zymosanphagozytose gezeigt werden (siehe Abbildung 24). Auch andere Arbeitsgruppen konnten nachweisen, dass die Phagozytose von Zymosan durch Monozyten zu einer Differenzierung der Monozyten zu intermediären dendritischen Zelle führt (ROSENZWAJG ET AL., 2002). Diese dendritischen Zellen besitzen einen Phänotyp zwischen unreifen und reifen DC. Nicht alle phagozytierten Materialien verursachen eine Reifung. TOROSANTUCCI ET AL., (2004) wiesen nach, dass Candida albicans keine dendritische Zelldifferenzierung bei humanen Monozyten induzierte. Ebenso wurde durch die Phagozytose von PLGA (poly lactide co glycolide)-Partikeln keine Reifung bei unreifen MoDC hervorgerufen (WAECKERLE-MEN ET AL., 2004). Im Folgenden soll die Aufnahme von Membran- und löslichen Proteinen von nekrotischen Tumorzellen hinsichtlich der Aufnahmekapazität und der Induktion einer Reifung von MoDC diskutiert werden. Bei der Verwendung von kompletten Tumorzellpräparationen zum Pulsen der dendritischen Zellen spielt die Art des Zelltodes der Tumorzellen eine entscheidende Rolle. Für die Antigenbeladung der dendritischen Zellen werden nekrotische Tumorzellen, in Form von Tumorzell-Lysaten, und apoptotische Tumorzellen, durch osmotischen Schock oder UV-B-Bestrahlung induziert, verwendet. Exogene Antigene werden in dendritischen Zellen nicht ausschließlich über MHC-Kl II präsentiert, über einen so genannten cross-Präsentations-pathway können exogen aufgenommene Antigene auch auf MHC-Kl I präsentiert werden (CARBONE ET AL., 1990). SAUTER ET AL., (2000) zeigten, dass nekrotische Tumorzellen zu einer Reifung der dendritischen Zellen mit einer gesteigerten CD83-Expression führen. Diese DC waren potente Stimulatoren für CD4+- und CD8+-T-Zellen. Andererseits konnte die Arbeitsgruppe ebenfalls zeigen, 156 DISKUSSION dass die Aufnahme von apoptotischen Tumorzellen zu einer cross-Präsentation auf MHC-Kl I führt. In einer früheren Arbeit wiesen sie bereits nach, dass die Aufnahme von apoptotischen Zellen eine über alphavbeta 5 Integrin und CD36-Rezeptorvermittelte Aufnahme ist und diese zu der cross-Präsentation führt (ALBERT 1998). In neueren Untersuchungen zeigten DALGAARD ET AL., ET AL., (2005), dass auch nekrotische Zellen über eine CD36-vermittelte Rezeptoraufnahme von peripheren BlutDC aufgenommen werden. In der hier vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich nekrotische Tumorzellen, in Form von Tumorzell-Lysaten, welche durch Einfrieren und Auftauen hergestellt wurden, verwendet. Dies hatte zum Teil pragmatische Gründe. Die meisten Studien mit apoptotischen Tumorzellen wurden mit Zelllinien durchgeführt. Für diese Arbeit wurde mit dem autologen, nativen Tumorgewebe der Patientinnen gearbeitet. Dieses Gewebe wies zum Teil bereits nach der Entnahme aus dem Patienten Nekrosen auf. Durch die mechanische Aufarbeitung des Gewebes waren bereits zu Beginn sehr viele tote Tumorzellen in den Präparationen enthalten. Daher wurde entschieden, mit nekrotischen Tumorzellen zu arbeiten, um einen massiven Verlust an autologen Tumorzellen der Patientinnen zu vermeiden. Bei den hier vorliegenden Daten konnte eine effiziente Aufnahme der FITC-markierten löslichen Proteine des Lysates und der FITC-markierten lipidischen Proteine des Tumorzell-Lysates bei fast allen unreifen MoDC gezeigt werden. Die Phago- und Makropinozytose wurde durch die Reifung der dendritischen Zellen mit dem „Jonuleit-Mix“ inhibiert. Die Aufnahme von Tumorzell-Lysaten durch dendritische Zellen konnte bereits mit FITC-markierten Tumorzell-Lysaten von Neuroblastomen gezeigt werden (ACKERMANN ET AL., 2004). Die Aufnahme von CFSEmarkierten allogenen und apoptotischen B-Zellen durch dendritische Zellen wurde in vitro und in der Maus gezeigt (IYODA ET AL., 2002). Ein überraschendes Ergebnis dieser Arbeit war, dass nur die Proteine der Membranfraktion von dem Tumorzell-Lysat der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 eine Reifung der MoDC mit einer gesteigerten Expression von CD83 induzierte, während sich bei den löslichen Proteinen der Zelllinie keine Veränderung der analysierten Oberflächenmarker ergaben (siehe Abbildung 26 und Abbildung 33). Dies bestätigt die von SAUTER ET AL., (2000) bereits erwähnten Ergebnisse, dass nekrotische Tumorzellen zwar eine Reifung induzieren, nach den hier 157 DISKUSSION vorliegenden Ergebnissen können aber nur die lipidischen Proteine der TumorzellLysate diese Reifung induzieren. Dass Membranproteine gegenüber löslichen Proteinen eine übergeordnete Rolle zu spielen scheinen, kann durch die Ergebnisse von IYODA ET AL., (2002) untermauert werden. Diese Arbeitsgruppe fand bei den MHC-Peptid- komplexen überwiegend Membranproteine von toten Zellen, welche zuvor durch dendritische Zellen phagozytiert wurden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sich in Kulturüberständen von nekrotischen Tumorzelllinien Hitzeschockproteine (hsp70 und gp90) im Vergleich zu normalen Primärzellen befinden. Das Hitzeschockprotein 70 induzierte eine Reifung bei dendritischen Zellen (SOMERSAN ET AL., 2001). Somit könnten Hitzeschockproteine in oder auf den Membranen von Tumorzellen einer der Gründe für die Induktion der Reifung bei dendritischen Zellen sein. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die in nekrotischen Tumorzellen enthaltenen Membranfraktionen eine Reifung der dendritischen Zellen induzieren und somit eine verstärkte T-Zellstimulation hervorrufen könnten. Ebenfalls zu erwähnen ist, dass Membranen lipidische Proteine beinhalten und bereits zuvor dem CD1a, als antigenpräsentierendes Molekül von lipidischen Antigenen, eine entscheidende Bedeutung in der Aktivierung einer effizienten Antitumor-Immunantwort zugewiesen wurde. Ein näherer Zusammenhang zwischen dem CD1a und der Induktion der Reifung durch lipidische Proteine konnte bisher nicht gefunden werden und ist somit rein hypothetisch zu sehen. 4.3 Antigenpräsentation der MoDC von Mammakarzinompatientinnen und Induktion einer spezifischen Immunantwort In diesem Abschnitt soll die T-Zell-stimulatorische Kapazität von Mammakarzinomzelllinien und autologen Tumorzell-Lysaten sowie deren Induktion einer AntitumorImmunantwort diskutiert werden. Neben spezifischen, definierten Tumorpeptiden oder genetisch transfizierten Tumorzellen ist die komplette Tumorzelle eine Quelle von Tumorantigenen. Der Vorteil des gesamten Tumorzellrepertoires ist, dass alle im Tumor vorhandenen Antigene für das Pulsen der dendritischen Zellen zur Verfügung stehen und physiologische Prozesse aus dem vorhandenen Tumor auf die in vitro-Situation übertragen werden können. Weitere Vorteile dieser Methode sind, dass keine detaillierten Tumoranalysen der spezifischen Tumorantigene und HLA-Typisierungen 158 DISKUSSION bei Patienten erforderlich sind. Für das Peptidpulsen stehen lediglich MHC-Kl Irestringierte Peptide zur Verfügung, an MHC-Kl II-Peptide sind nur wenige charakterisiert und problematisch bei der Anwendung, da es zu viele unterschiedliche MHC-Kl-II-Typen gibt (THUMANN ET AL., 2003). Ein weiteres Argument für die Verwendung von Tumorzell-Lysaten ist die mögliche Präsentation von Antigenen über MHC-Kl I oder MHC-Kl II. Apoptotische Tumorzell-Lysate induzieren eine crossPräsentation auf CD8+-T-Zellen, während nekrotische Tumorzell-Lysate eine potente Stimulation von CD4+- und CD8+-T-Zellen induzieren (SAUTER ET AL., 2000). Für eine effektive Anti-Tumor-Immunantwort entscheidender Bedeutung (TOES sind ET AL., CD4+-T-Helferzellen von ganz 1999). Die Verwendung von Tumorzell- Lysaten ist allerdings limitiert durch das begrenzt vorhandene Material. Andererseits besteht die Möglichkeit, dass bei vorhandenen Metastasen diese andere Antigene exprimieren als der Primärtumor. Die verwendeten nekrotischen Tumorzell-Lysate der Mammakarzinomzelllinien (1 MoDC:2 SK-BR3; 1 MoDC:8 MCF-7) und den autologen Tumorzellpräparationen (3 von 4 Patientinnen bei 1 MoDC:4 TZ; Patientin TZ1 bei 1 MoDC:2 TZ) zeigten bei unterschiedlichen Verhältnissen Tumorzell-Lysat zu MoDC mit zum Teil großen Standardabweichungen die jeweils stärkste T-Zellstimulationskapazität (siehe Abbildung 34 und Abbildung 36). Dies weist darauf hin, dass sowohl innerhalb der Zelllinien als auch innerhalb der autologen Tumorzellpräparationen unterschiedliche T-Zell-stimulatorische Antigene vorhanden waren. In der Literatur finden sich ebenfalls verschiedene Dosisangaben zum Pulsen der dendritischen Zellen mit TumorzellLysaten. In einem Mausmodell wurden die dendritischen Zellen in einem Verhältnis von 1:3 mit Fibrosarkomzellen einer Zelllinie gepulst (FIELDS ET AL., 1998). Die höchste Beladung dendritischer Zellen mit lysierten Tumorzellen einer Melanomzelllinie konnte in einem Verhältnis von 1:5 durchgeführt werden, ohne größere Verluste an dendritischen Zellen in Kauf zu nehmen. Bei höheren Konzentrationen kam es zu einer Readhärenz der dendritischen Zellen an den Plastikoberflächen der Kulturgefäße und somit zu einer schlechteren Ausbeute der dendritischen Zellen (THUMANN ET AL., 2003). Dieses Phänomen konnte bei den hier durchgeführten Experimenten ebenfalls beobachtet werden. Wir deuten dies als Induktion von MФ-Eigenschaften durch die 159 DISKUSSION Masse des Materials. Hohe Tumorantigenkonzentrationen in Form von Lysaten führen zur Apoptose von dendritischen Zellen. Somit ist die Konzentration des TumorzellLysates ein kritischer und entscheidender Punkt (POSPISILOVA ET AL., 2002). Letztlich bedeuten diese Ergebnisse, dass die Konzentration für jeden Tumor eines jeden Patienten auf die beste T-Zell-stimulatorische Kapazität getestet werden müsste, diese aber nicht das Verhältnis von 1:4 aus den oben genannten Gründen überschreiten sollte. Insgesamt war im Vergleich zu der durch das Tetanustoxoid induzierten T-Zellproliferation eine schwächere T-Zell-stimulatorische Kapazität sowohl durch die Mammakarzinomzelllinien als auch durch die autologen Tumorzell-Lysate zu verzeichnen. Dieses kann zum einen an einer sehr starken Sekundärantwort, welche durch das Tetanustoxoid induziert wurde, liegen oder an einer schwach immunogenen Stimulation durch die autologen Tumorzell-Lysate. Ein Grund für die schwache TZellproliferation könnte wie bereits zuvor erwähnt die Art des Zelltodes der Tumorzellen bei der Stimulation der T-Zellen sein. Autologe Lysate aus Blasten einer akuten lymphatischen Leukämie stimulierten geringere Mengen an T-Zellen als apoptotische Zellen der allogenen Jurkat-Zelllinie. Die nekrotischen Blastenlysate waren in der Lage, eine Reifung der DC und eine TH1-Immunantwort zu induzieren (POSPISILOVA ET AL., 2002). GALEA-LAURI ET AL., (2004) konnten zeigen, dass dendritische Zellen, welche mit Tumorzellen fusioniert wurden, und dendritische Zellen gepulst mit apoptotischen Tumorzellen zu einer höheren T-Zellstimulation führten als Tumorzell-Lysat-gepulste DC. Die hier vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass Lysatgepulste dendritische Zellen eine nur schwache TH1-Immunantwort mit der Tendenz zu einer TH2-Immunantwort durch die Produktion von IL-6 induzierten. Die Ergebnisse von Galea-Lauri werden durch die in dieser Arbeit erhobenen Daten bestätigt. Die Mammakarzinomzelllinie SK-BR3 induzierte eine sehr schwache TH1-Antwort, während die MCF-7 sogar eine TH2-Antwort, wenn auch ebenfalls mit nur sehr schwacher IL-6-Produktion, induzierte. Ein Grund könnte die schwache Antigenität der Mammakarzinomzelllinien sein, denn eine ebenfalls getestete Melanomzelllinie (FM 3-13) induzierte zwar eine mäßige T-Zellproliferation, aber die T-Zellen produzierten höhere Mengen IL-6, IFN-γ und TNF-α. Weiterhin sei darauf hingewiesen, dass alle Zelllinien allogen waren und somit auch eine allo-reaktive Stimulation der 160 DISKUSSION T-Zellen stattfand. Die autologen Tumorzell-Lysate bestätigen die bereits zuvor diskutierten Ergebnisse. Nur bei einer von 4 Patientinnen konnte eine nur sehr geringe Produktion des TH1-Zytokins IFN-γ gemessen werden. Ansonsten konnte lediglich eine schwache TH2-Antwort festgestellt werden. MoDC der Spender und der Patientinnen waren grundsätzlich in der Lage, eine TH1-Antwort zu induzieren, wie mit den Tetanustoxoid-gepulsten MoDC gezeigt werden konnte (siehe Abbildung 19). Insgesamt konnte durch das nekrotische Tumorzell-Lysat von Mammakarzinomen eine nur sehr schwache Immunantwort hervorgerufen werden. Offensichtlich scheint die dendritische Zelle bei der Bereitstellung eines schwach immunogenen antigenen Repertoires ein zusätzliches Signal zu benötigen. Dieses zusätzliche Signal, auch danger Signal genannt, kann bereits durch die Verwendung von apoptotischen Tumorzellen - dies sind Zellen, welche durch ein internes Zerstörungsprogramm einen Abbau der Kern-DNA erfahren haben - zur Verfügung gestellt werden. RAD ET AL., (2003) konnten zeigen, dass apoptotische Tumorzellen, bei welchen zuvor durch die Behandlung mit Chemotherapeutika Apoptose induziert wurde, eine höhere T-Zellstimulation und IL-12Produktion bewirkten als nekrotische Tumorzellen. Der programmierte Zelltod und der daraus resultierende DNA-Schaden bei apoptotischen Zellen ist wahrscheinlich das entscheidende danger-Signal für die dendritischen Zellen, was zu einer effektiveren TH1-Immunantwort führt. Diese Ergebnisse können durch Studien belegt werden, laut denen Chemotherapien in Kombination mit dendritischen Zellen besser wirken (YU ET AL., 2004). SONG UND LEVY, (2005) zeigten im Mausmodell, dass die alleinige Gabe von dendritischen Zellen intratumoral keinen Effekt und die Anwendung einer Chemotherapie nur eine transiente Tumorregression induzierte, während die intratumorale Injektion der dendritischen Zellen nach erfolgter Chemotherapie zu einer lang anhaltenden Tumorregression führte. Da aus den bereits oben genannten Gründen eine Herstellung apoptotischer Zellen aus primären Tumorzellpräparationen sehr schwierig war, wurde sich im Kontext dieser Arbeit für die klassischen danger-Signale entschieden. MATZINGER, 1994 und GALLUCCI UND MATZINGER, 2001 prägten den Begriff danger- Signal als ein Zeichen für Immunzellen, über Inflammation die Anwesenheit von Gefahr zu vermitteln. Eines dieser Muster, diese Gefahr zu vermitteln, sind die so genannten 161 DISKUSSION PAMPs mit ihren Rezeptoren, den PRRs. Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mitglieder dieser PRRs. Eine Aktivierung der TLR über TLR-Liganden führt bei aktivierten dendritischen Zellen zu einer effektiven TH1-Immunantwort, während inflammatorische Zytokine allein auf dendritischen Zellen zwar die klonale Expansion von CD4+-T-Zellen unterstützen, aber keine TH1/TH2-Immunantwort fördern (SPÖRRI UND REIS E SOUSA, 2005). Aus diesen Gründen wurde entschieden, über verschiedene TLR-Liganden und nicht über einzelne inflammatorische Zytokine (wie z. B. im „Jonuleit-Mix“) die über das Tumorzell-Lysat aktivierten dendritischen Zellen mit einem zusätzlichen dritten Signal zu stimulieren, um so eine effektive TH1-Immunantwort zu induzieren. Die hier verwendeten TLR-Liganden BCG, welches an den TLR2 bindet, und Poly I:C (dsRNA), welches an den TLR3 bindet, induzierten mit und ohne Tumorzell-Lysat einer Mammakarzinomzelllinie eine TH1-Immunantwort mit hohen Mengen IFN-γ und TNF-α sowie dem TH2-Zytokin IL-6. IL-6 wird bei einer TLR-Aktivierung gebildet, um die reagierenden T-Zellen bei einer überschießenden TH1-Immunantwort zu regulieren (PASARE UND MEDZHITOV, 2003). Poly I:C induzierte dabei die effektivste TH1-Immunantwort, während BCG und das Recall-Antigen PPD eine schwächere TH1-Antwort hervorriefen (siehe Abbildung 38). BCG induzierte ebenfalls eine TH2-Antwort über die Produktion von IL-10. Die Arbeitsgruppe ATKINS ET AL., (2003) konnte gleichzeitige IL-12- und IL-10-Produktion nach BCG-Stimulation nachweisen, dagegen induzierten LPS und CpG eine reine TH1-Immunantwort. Das Tumorzell-Lysat unterstützte die TH1-Antwort nicht zusätzlich, die TH1-Antwort, induziert durch das Poly I:C und das Lysat, war schwächer als ohne Lysat. Dies könnte mit einer Überaktivierung der T-Zellen in Richtung TH1-Antwort zusammenhängen, denn ohne ein zusätzliches Antigen (Lysat) wurde das TH1-supprimierende Zytokin IL-10 gebildet. Durch die Aktivierung der dendritischen Zellen mit dem Lysat und Poly I:C konnte die IL-10-Produktion reduziert werden. Zwischen der TH1- und TH2-Immunantwort finden immer gegenseitig regulierende Mechanismen statt, um so eine überschießende Reaktion in die eine oder andere Richtung zu verhindern. TH1- und TH2-assoziierte Zytokine regulieren sich gegenseitig, IFN-γ inhibiert TH2-Zytokine und IL-4 und IL-10 inhibieren TH1-Zytokine (MOSMANN, 1991; FIORENTINO ET AL., 1991). 162 DISKUSSION Eine T-Zellantwort kann somit durch die Aktivierung der dendritischen Zellen mit einem Tumorzell-Lysat und dsRNA als danger-Signal wesentlich verstärkt werden. Die Ergebnisse von BAI ET AL., (2002) zeigen ebenfalls, dass durch ein zusätzliches dangerSignal die Immunogenität des Tumors erhöht wird. Sie erzielten eine verstärkte memory-T-Zellantwort durch MCF-7-Lysat-gepulste dendritische Zellen wobei das Lysat der Zelllinie zuvor mit Newcastle disease virus (NDV) versetzt wurde. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass schwach immunogene Antigene, wie autologe Tumorzell-Lysate, durch die zusätzliche Aktivierung über TLR-Liganden auf dendritischen Zellen zu einer wesentlichen Verstärkung der TH1-Immunantwort führen können. Dabei stellte sich in dieser Arbeit die dsRNA (Poly I:C) als der potenteste Aktivator für eine effiziente TH1-Immunantwort heraus. Somit steht für eine AntitumorImmuntherapie eine sichere und potente dendritische Zellvakzine zur Verfügung, mit dem Potential eine verstärkte Immunreaktion gegen den Tumor zu erzeugen. 4.4 Immun-escape Eine pathologische Interaktion zwischen Tumorzellen und den eigenen Immunzellen in der Tumorumgebung schafft eine immunsuppressive Situation, welche ein Tumorwachstum unterstützt, den Tumor vor Immunattacken schützt und die Effizienz von immuntherapeutischen Ansätzen vermindern kann. Tumorzellen entwickeln Mechanismen, mit welchen sie einer Immunerkennung entkommen können. Wie bereits in den Abschnitten zuvor erwähnt, sind die Fehlfunktionen von Blut-dendritischen Zellen bei Mammakarzinompatientinnen einer dieser escape-Mechanismen (GABRILOVICH ET AL., 1997). Durch eine Anzüchtung der MoDC in vitro werden sie diesen Einflüssen für den kritischen Zeitraum ihrer Differenzierung entzogen. Durch eine Immuntherapie mit in vitro generierten dendritischen Zellen sollen diese Fehlfunktionen ausgeglichen werden. Andere vom Tumor ausgehende escape-Mechanismen sind der MHC-Verlust auf Tumorzellen, fehlende costimulatorische Moleküle sowie schwach immunogene Tumorantigenexpression. Tumorzellen von Mammakarzinomen sezernieren immunsuppressive Faktoren wie PGE-2 (POCKAJ AL., ET AL., 2004), VEGF sowie IL-6 BENOY ET (2002) und manchmal IL-10 KOZLOWSKI ET AL., (2003) und können damit T-Zellen 163 DISKUSSION und ihre Effektorfunktionen sowie Reifung und Funktion von dendritischen Zellen inhibieren. Zur Optimierung von immuntherapeutischen Ansätzen müssen inhibitorische Faktoren und phänotypische Veränderungen des Tumors sowie die Bildung von Resistenzen und die von außen zugeführten immunaktivierenden Signale gleichzeitig betrachtet werden. 4.4.1 Expression von immunregulatorischen Molekülen auf Tumorzellen von Mammakarzinomen Damit eine Tumorzelle durch eine zytotoxische T-Zellantwort angreifbar ist, muss sie MHC-Kl I und ICAM-1 tragen, um mit dem T-Zellrezeptor und dem Adhäsionsmolekül LFA-1 auf T-Zellen in Kontakt treten zu können. Andere Adhäsionsmoleküle wie LFA-3, welches an den CD2-Rezeptor auf T-Zellen und NK-Zellen bindet, sind essentiell für eine zelluläre Zytotoxizität. Eine fehlende Costimulation von CD80 und CD86 bei gleichzeitiger Expression von MHC-Molekülen (wie z.B. HLA-DR) auf Tumorzellen ist einer der häufigsten escape-Mechanismen von Tumoren und führt zu einer Toleranz des Tumors. Der Tumor kann sich mit dem Verlust der MHC-Kl I-Moleküle einer zytotoxischen T-Zellerkennung entziehen. Bei den hier untersuchten Tumorzellpräparationen von Mammakarzinomen zeigte sich bei der Expression der MHC-Kl I-Komplexe eine starke Varianz bei den einzelnen Tumoren. Eine mäßige bis starke Expression von HLA-ABC sowie kein kompletter Verlust von MHC-Kl I weist auf eine mögliche T-Zellerkennung dieser Mammakarzinomtumoren nach spezifischer Aktivierung der T-Zellen durch dendritische Zellen hin. GUDMUNDSDOTTIR ET AL., (2000) zeigten bei 187 Mamma- karzinompatientinnen im Stadium I und II, dass die meisten Patientinnen (52 %) ebenfalls eine mäßige bis starke Expression von HLA Kl I aufwiesen. Im Gegensatz zu den hier vorliegenden Daten wies diese Arbeitsgruppe bei einem wesentlich höheren Anteil an Patientinnen (48 %) einen fast kompletten Verlust (< 10 % positiver Zellen) an MHC-Kl I nach. Sie konnten ebenfalls zeigen, dass Patientinnen mit einer gemischten Expression von HLA-ABC eine höhere Rezidivwahrscheinlichkeit hatten als Patientinnen mit einem negativen oder positiven Phänotyp. Bei einer gemischten 164 DISKUSSION MHC-Kl I-Expression scheint es nur zu einer teilweisen Erkennung von MHC-Kl Itragenden Tumorzellen durch das Immunsystem zu kommen. Der andere Teil der Tumorzellen ohne MHC-Kl I-Expression wird dadurch selektiert und könnte zu einem erneuten Tumorwachstum führen. Eine große Varianz der MHC-Kl I-Expression konnte auch bei einem Karzinom der Blase, dem Transitionalzell-Karzinom, festgestellt werden. Der überwiegende Teil der Patienten wies eine moderate bis starke Expression auf und nur ein Patient von 18 hatte einen kompletten Expressionsverlust von MHC-Kl I (NOURI ET AL., 1990). SMITH ET AL., (1989) zeigten ähnliche Ergebnisse: Bei n=30 Adenokarzinomen exprimierte nur ein Tumor kein HLA-ABC. MHC-Kl I-Moleküle waren bei den Mammakarzinomzelllinien abnormal und deutlich schlechter als bei den Tumorzellpräparationen exprimiert. Ein kompletter Verlust von MHC-Kl I bei der in dieser Arbeit untersuchten MCF-7-Zelllinie weist auf einen escape-Mechanismus über die antigenpräsentierenden Moleküle hin. Für eine T-Zellerkennung in der Effektorphase ist neben den MHC-Kl I-Molekülen das Adhäsionsmolekül ICAM-1 für eine erfolgreiche zytotoxische Immunreaktion notwendig. Bei Lungen-, Ovarial- und Mammakarzinomen konnte gezeigt werden, dass Tumoren sowohl MHC-Kl I als auch ICAM-1 oder keines der beiden Moleküle exprimieren können. In einem Zytotoxizitäts-assay konnten durch T-Zellen nur die Tumorzellen lysiert werden, welche sowohl MHC-Kl I als auch ICAM-1 auf > 50 % der Zellen exprimierten (VANKY ET AL., 1990). Die hier untersuchten Tumorzellpräparationen und Tumorzelllinien exprimierten alle bis auf zwei Tumore ICAM-1 > 50 %. Das Mammakarzinom mit der geringsten ICAM-1Expression exprimierte auch das MHC-Kl I-Molekül von allen untersuchten Mammatumoren am schwächsten. Die von der Patientin C analysierten Tumorzellen stammten aus einem pT3-Tumor, welcher ebenfalls p53 und HER2 neu positiv war. Es handelt sich somit um einen weit fortgeschrittenen Tumor mit zwei ungünstigen prognostischen Parametern. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass sich dieser Tumor durch den escape-Mechanismus der immunologischen Kontrolle entziehen und somit eine Immuntherapie mit dendritischen Zellen nicht zu dem gewünschten Erfolg führen könnte. Die Expression von ICAM-1 kann mit dem klinischen Verlauf korreliert werden; dies konnte bei Patienten mit Kopf- und Halstumoren, welche signifikant 165 DISKUSSION höhere Mengen an ICAM-1 exprimierten, gezeigt werden. Patienten mit einer hohen ICAM-1-Expression hatten ein signifikant höheres rezidivfreies Überleben im Vergleich zu Patienten mit einer niedrigen ICAM-1-Expression (SHIRAI ET AL., 2003). Neben einer fehlenden Expression von ICAM-1 auf Tumorzellen und der damit verbundenen Verhinderung eines T-Zell-vermittelten Abtötens der Tumorzellen können die abgelösten ICAM-1-Moleküle im Serum ebenfalls hemmend wirken. Lösliches ICAM-1 inhibierte die Konjugatbildung zwischen T-Zellklonen und autologen Melanomzellen und verhinderte so eine zytotoxische T-Zellantwort gegen diese Melanomzellen (BECKER ET AL., 1995). GHO ET AL., (2001) zeigten, dass lösliches ICAM-1 die Angiogenese im Tumor unterstützt und ein Tumorwachstum fördert. Somit ist dem ICAM-1-Molekül eine doppelte Bedeutung zuzuschreiben: Zum einen wird durch eine fehlende Expression eine zytotoxische T-Zellerkennung verhindert und zum anderen inhibiert die lösliche Form des Moleküls zusätzlich T-Zellen und unterstützt das Tumorwachstum. Das Lymphozyten-Funktionsantigen LFA-3 war bei den meisten Mammatumoren eher mäßig exprimiert, die Patientin C mit der geringsten MHC-KL I- und ICAM-1Expression exprimierte auch das LFA-3 am schwächsten von allen untersuchten Tumoren. Somit scheint dieser fortgeschrittene Tumor sowohl beim T-Zellkontakt als auch in der Antigenpräsentation seine escape-Mechanismen aufgebaut zu haben und entzieht sich so einer Tumor-spezifischen T-Zellreaktion. Die Expression des LFA-3 war bei den Mammatumoren stärker heterogen als die des ICAM-1, somit scheint die Expression des LFA-3 bei Mammatumoren eher einen escape-Mechanismus darzustellen. NOURI ET AL., (1996) beschrieben beim Blasenkarzinom eine starke und homogene Expression des LFA-3 auf den Tumorzellen. Ebenfalls eine gute LFA-3Expression konnte bei sieben Ovarialkarzinomzelllinien nachgewiesen werden (TOUTIRAIS ET AL., 2003). Naive T-Zellen werden nur aktiviert, wenn sie auf ein und derselben Zelle sowohl an ein fremdes Peptid in einem MHC-Molekül und mit ihrem CD28-Rezeptor an ein costimulatorisches Signal binden. Nur dendritische Zellen, MФ und B-Zellen tragen sowohl beide MHC-Moleküle als auch costimulatorische Signale. Kommt es zu einer Expression von MHC-KL I und II-Molekülen auf anderen Zellen (wie z. B. Tumor- 166 DISKUSSION zellen), der Präsentation von Antigenen (wie z. B. Tumorantigenen) und der Antigenbindung an den T-Zellrezeptor ohne Costimulation, dann wird die T-Zelle inaktiv bzw. gerät in den Zustand der Anergie. Sie kann dann auch nicht mehr durch professionelle APC aktiviert werden, welche ihr das gleiche Antigen (Tumorantigen) präsentieren. Somit nutzen Tumorzellen den Mechanismus der Selbsttoleranz als einen Immun-escape-Mechanismus und können sich so einer spezifischen Immunreaktion entziehen. Sowohl Fibroblasten als auch Tumorzellen konnten erfolgreich mit B7-Molekülen transfiziert werden und waren danach in der Lage eine klonale Vermehrung naiver T-Zellen zu induzieren (JANEWAY, TRAVERS, WALPORT UND SHLOMCHIK, 2002; DOLS ET AL., 2003). Bei den hier vorliegenden Daten konnte bei keinem der Mammatumoren und bei keiner Zelllinie B7.1 und nur bei zwei Mammatumoren B7.2 nachgewiesen werden (Abbildung 39). Eine geringere Expression von CD80 und CD86 wurde bei der MCF-7-Zelllinie im Vergleich zu einer Zelllinie von normalen Mammazellen festgestellt (FAN ET AL., 2002). Die MCF-7 exprimierte bei den hier vorliegenden Ergebnissen weder CD80 noch CD86. Diese Unterschiede können durch unterschiedliche Passagierungen der Zelllinie entstehen. AML-Blasten von Patienten mit akuter myeloider Leukämie, welches entartete Monozyten sind und Monozyten in der Regel B7-Moleküle tragen, wiesen ebenfalls eine geringe Expression an CD80 auf, dagegen war CD86 bei der Hälfte der getesteten Patienten wie bei gesunden Monozyten oder B-Zellen exprimiert. Bei den AMLPatienten, deren Zellen sowohl CD80 als auch CD86 exprimierten, konnte eine signifikant längere Remission festgestellt werden (WHITEWAY ET AL., 2003). Bei etwa der Hälfte der in dieser Arbeit untersuchten Tumorzellpräparationen könnte eine Präsentation von Tumorantigenen über HLA-DR stattfinden. Da bei lediglich zwei Mammatumoren B7.2 gemessen werden konnte, können durch die fehlende Costimulation anerge T-Zellen entstehen. Somit scheinen sich die Tumorzellen ohne costimulatorische Signale einer immunologischen Kontrolle zu entziehen, sind dadurch tolerant und fördern das Wachstum des Tumors. Die andere Hälfte der Mammatumore sowie die MCF-7-Zelllinie exprimierten nur sehr geringe Mengen HLA-DR oder kein HLA-DR wie die SK-BR 3- und Fibroblasten- 167 DISKUSSION zelllinie. Dies bestätigen die Daten von FAN ET AL., (2002): Diese Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass SK-BR 3 und MCF-7 von fünf untersuchten Mammakarzinomzelllinien die schlechteste HLA-DR-Expression aufwiesen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Mammatumoren eine stark heterogene Expression der jeweiligen Oberflächenmoleküle, welche für eine zytotoxische T-Zellerkennung wichtig sind, aufwiesen. Somit wäre eine Diagnostik jedes einzelnen Tumors von Bedeutung, um die verschiedenen escape-Mechanismen zu untersuchen und immuntherapeutische Therapiekonzepte für jeden Tumorpatienten zu erstellen. Des Weiteren scheinen escape-Mechanismen bei den untersuchten Mammatumoren nicht an der Expression einzelner Oberflächenmoleküle zu liegen, sondern in der Kombination von mehreren funktionellen Oberflächenmolekülen begründet zu sein, was ebenfalls nur über individuelle Diagnostik jedes Tumors zu erkennen wäre. 4.4.2 Prognostische Relevanz von IL-10 im Serum von Mammakarzinompatientinnen in Verbindung mit dem Therapieerfolg einer Immuntherapie mit dendritischen Zellen Interleukin-10 ist ein multifunktionelles TH2-Zytokin, es reguliert auf B-Zellen MHC-Kl II-Moleküle herauf und costimuliert das Mastzellwachstum (GO ET AL., 1990; CHUNG, 2001). IL-10 ist aber vor allem ein immunsuppressives Zytokin und kann die Entwicklung und Progression von verschiedenen Tumoren begünstigen (ZHOU ET AL., 2004). Es wird von Tumorzellen gebildet, kann dadurch eine zelluläre TH1-Immunantwort inhibieren oder die Zytokinausschüttung von Makrophagen verhindern und diese damit inaktivieren (FIORENTINO ET AL., 1991). Für einen Erfolg versprechenden Ansatz einer Immuntherapie mit dendritischen Zellen ist es daher notwendig, diese inhibitorischen Faktoren bei den zu behandelnden Patienten zu untersuchen, um gegebenenfalls vor Therapiebeginn Gegenmaßnahmen zu ergreifen. In der Literatur finden sich widersprüchliche Aussagen hinsichtlich vorhandenem IL-10s im Serum von Mammakarzinompatientinnen: NIWA ET AL., (2001) fanden kein erhöhtes IL-10 im Plasma von n=43 Mammakarzinompatientinnen. Ebenso konnten MENDONCA 168 ET AL., DISKUSSION (2005) bei n=23 Mammapatientinnen im Stadium I–III keine signifikanten Unterschiede beim IL-10 Serumspiegel im Vergleich zu gesunden Spendern finden. Bei den in dieser Arbeit untersuchten metastasierten Mammakarzinompatientinnen konnten positive IL-10-Spiegel im Serum gemessen werden, wenn auch niedriege. Das IL-10 im Serum der Patientinnen korrelierte aber mit dem Ausmaß der Erkrankung. Die meisten Patientinnen mit positiven IL-10-Spiegeln waren Patienten mit hämatogen metastasierten Tumoren. Die höchste IL-10 Konzentration im Serum wurde bei einer Patientin mit einem inflammatorischen Mammakarzinom gemessen. IL-10 ist ein proinflammatorisches Zytokin und wird bei Entzündungen gebildet. Dies könnte darauf hinweisen, dass inflammatorische Mammakarzinome höhere Konzentrationen von IL-10 produzieren als nicht inflammatorische Karzinome. Eine Patientin mit einem sehr weit ausgedehnten Lymphknotenlokalrezidiv hatte ebenfalls nachweisbares IL-10 im Serum. Diese Daten werden durch die Ergebnisse von KOZLOWSKI ET AL., (2003) bestätigt. Die Mitglieder der Arbeitsgruppe fanden bei Mammakarzinompatientinnen in Abhängigkeit vom klinischen Stadium signifikant höhere Konzentrationen IL-10 im Serum. Die Ausdehnung des Tumors steht im Zusammenhang mit einem IL-10-Nachweis im Serum; dies konnte bereits bei mehreren Tumorentitäten gefunden werden. Beim Melanom, Ovarialkarzinom und beim Weichteilsarkom konnte gezeigt werden, dass die IL-10-Konzentration im Serum in Abhängigkeit zum Grad der Metastasierung steht (DUMMER ET AL., 1995; GERLINI ET AL., 2004; ZHOU ET AL., 2004; RUKA ET AL., 2001). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass vor allem bei Patienten mit weit fortgeschrittenen Erkrankungen und ausgedehnten Metastasierungen IL-10 im Serum messbar ist. Somit eignet sich die Messbarkeit von IL-10 im Serum nicht als prädiktiver Parameter, da es erst bei Mammakarzinompatientinnen mit einer sehr weit ausgedehnten Erkrankung und Tumorlast nachweisbar ist. Ein inhibitorischer Effekt des Zytokins auf einen immuntherapeutischen Ansatz mit dendritischen Zellen ist daher vor allem bei inflammatorischen Karzinomen nicht auszuschließen. Somit sollte das Patientenkollektiv für eine Immuntherapie mit dendritischen Zellen auf weniger weit fortgeschrittene Tumorerkrankungen begrenzt werden, oder Patienten mit IL-10 im Serum müssen zunächst einer Reduktion der Tumormasse, um eine Nachproduktion von IL-10 zu verhindern, unterzogen werden. 169 DISKUSSION 4.5 Ausblick Innerhalb der vergangenen Jahre sind verschiedene Therapiekonzepte mit unterschiedlichen Erfolgen entwickelt worden, um die Antigenität des Tumors und die spezifische Anti-Tumor-Immunantwort zu steigern. Dendritische Zellen stehen am Anfang einer spezifischen Primärantwort und sind somit in der Lage, das größte Spektrum an Immunzellen zu aktivieren. Sie eignen sich besonders im Vergleich zu einzelnen Effektorzellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapien. In mehreren Phase-I/II-Studien konnte bei Karzinompatienten, welche mit dendritischen Zellen behandelt wurden, gezeigt werden, dass diese nicht toxisch wirken, gut verträglich sind, Tumor-spezifische T-Zellen induzieren und klinische Rückbildungen des Tumors erzielen können. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich phänotypisch und funktionell potente MoDC von Mammakarzinompatientinnen, nach einer Optimierung der Kulturbedingungen, generieren ließen. Innerhalb der Patienten und zwischen Patienten und Spendern ergaben sich qualitative Unterschiede im Phänotyp und in der Funktion. Dies bedeutet, dass in vitro erhobene Generierungsprotokolle an gesunden SpenderMoDC bei Tumorpatienten modifiziert werden müssen, um vergleichbar funktionelle MoDC von Karzinompatienten generieren zu können. Die Antigenität und Immunogenität der Tumorzellen scheint sich auf die Membranbestandteile der Tumorzelle zu begrenzen. Zur Steigerung der Antigenität von Tumorzellen wurde hier das dangerKonzept mittels TLR-Liganden benutzt, wodurch eine verstärkte TH1-Immunantwort induziert wurde. Die vorhandene Toleranz gegenüber Tumoren muss durch zusätzliche Gefahrensignale unterlaufen werden, um so eine Immunreaktion gegen den Tumor induzieren zu können. Die Reaktion des Immunsystems auf Tumoren ist ein komplexes Geschehen, und die Durchführung einer Immuntherapie erfordert ein Vorgehen, das der Vielschichtigkeit des Problems gerecht werden muss. Somit sollte in zukünftigen Studien die Vielzahl bereits untersuchter escape-Mechanismen von Tumoren therapeutisch mit berücksichtigt werden. Durch Kombinationstherapien von immuntherapeutischen Ansätzen mit Anti-escape-Therapien könnte die klinische Effizienz der Immuntherapien weiter gesteigert werden. Je genauer die escape- und Toleranzmechanismen der Tumoren verstanden werden, umso effektiver können Strategien zur Bekämpfung und effektiveren Induktion einer Anti-Tumortherapie entwickelt werden. 170 ZUSAMMENFASSUNG 5 Zusammenfassung Die Inzidenz des Mammakarzinoms steigt seit Ende der siebziger Jahre stetig an. Nachdem die konventionellen Therapien in der adjuvanten Behandlung von Mammakarzinompatientinnen gute Erfolge erzielten, konnten für Patientinnen mit einem metastasierten Mammakarzinom in den letzten Jahren bei der Lebensverlängerung keine relevanten Fortschritte erzielt werden. Daher nahm das Interesse an neuen Therapieoptionen, wie der Immuntherapie, verstärkt zu. Am Beginn einer spezifischen Immunantwort stehen dendritische Zellen, welche in der Lage sind, Fremdantigene aufzunehmen, sie zu prozessieren und sie Helfer- und Effektorzellen zu präsentieren. Mit der Beantwortung der Frage nach der Herkunft von dendritischen Zellen konnten diese in der Folge in größeren Mengen gewonnen werden und standen somit auch für klinische Anwendungen zur Verfügung. Bei Mammakarzinompatientinnen wurde bereits eine verminderte Anzahl an funktionell potenten in vivo-DC beschrieben. Daher war eine der Fragestellungen in dieser Arbeit, ob sich in vitro aus Monozyten von Mammakarzinompatientinnen phänotypisch und funktionell potente DC generieren lassen, um somit Tumor-bedingte Fehlfunktionen von dendritischen Zellen in vivo zu überwinden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: MoDC von Patientinnen exprimierten unter den Kulturbedingungen mit IL-4, GM-CSF und IFN-γ signifikant schlechter CD1a und HLA-DR als MoDC von gesunden Spendern. Der Differenzierungsstatus der MoDC könnte einen Einfluss auf den Therapieerfolg bei den behandelten Patientinnen haben, denn Patientinnen der responder-Gruppe exprimierten CD1a ebenfalls signifikant höher als Patientinnen der non-responder-Gruppe. MoDC von Patientinnen besaßen eine geringere T-Zell-stimulatorische Kapazität als MoDC von Spendern. Das Proliferationsvermögen der Lymphozyten von Patientinnen war leicht vermindert im Vergleich zu den Lymphozyten der gesunden Spender. MoDC der Patientinnen induzierten nach Antigenstimulation ein TH2-Zytokinprofil, dagegen induzierten MoDC der gesunden Spender nach Antigenstimulation ein TH1-Zytokinprofil. 171 ZUSAMMENFASSUNG Durch eine Optimierung des Kultursystems sowie Einsatz höherer Konzentrationen von IL-4, GM-CSF und ohne IFN-γ gelang es, phänotypisch und funktionell potente MoDC von Patientinnen zu generieren. Diese MoDC induzierten nach Antigenstimulation ein TH1-Zytokinprofil. Unreife MoDC von Patientinnen phagozytierten effizient und die Phagozytose konnte durch die Ausreifung der Zellen inhibiert werden. Erstmals konnte gezeigt werden, dass nach der Phagozytose von lipidischen Proteinen der Tumorzelllinie MCF-7 eine Reifung bei MoDC induziert wurde. Lösliche Proteine von Tumorzellen induzierten keine Reifung. Autologe Tumorzell-Lysate und mit Lysaten von Mammakarzinomzelllinien beladene DC induzierten nur schwache T-Zellproliferationen und Zytokinproduktionen. Die schwache Antigenität der Tumorzell-Lysate konnte durch TLR-Liganden (wie Poly I:C) verstärkt werden, dies führte zu einer starken TH1-Immunantwort. Die Expression der für die T-Zellerkennung wichtigen Oberflächenantigene auf Tumorzellen erwies sich bei den einzelnen Mammatumoren als sehr heterogen. Ein kompletter Verlust eines Markers konnte auf den untersuchten Mammatumoren nicht gefunden werden. Ein inhibitorischer Effekt von IL-10 im Serum ist nicht ausgeschlossen, da dieses bei Patientinnen mit einer ausgedehnten Tumorerkrankung nachgewiesen werden konnte. Als prädiktiver Parameter eignet es sich aufgrund des späten Auftretens nicht. Im Rahmen der Dissertation war es nicht möglich, ausreichend große Kollektive zu untersuchen, um statistische Aussagen zu machen. Die Ergebnisse sind daher als orientierend anzusehen. Sie können die Richtung für weitergehende Untersuchungen in größer angelegten Studien aufzeigen. Die Daten dieser Arbeit verdeutlichen, dass nachfolgende Studien mit Immuntherapien gegen Tumoren in Kombination mit weiteren Therapien durchzuführen sind, um somit die Effektivität der spezifischen Anti-Tumortherapie zu erhöhen. Weiterhin müssen diagnostische Verfahren individualisiert werden, um für den jeweiligen Patienten escape-Mechanismen und tumorbiologische Aspekte mit in die Immuntherapie einbeziehen zu können. 172 LITERATURVERZEICHNIS 6 Literaturverzeichnis ACKERMANN, B., TROGER, A., GLOUCHKOVA, L., KORHOLZ, D., GOBEL, U. und DILLOO, D. (2004): "Characterization of CD34+ progenitor-derived dendritic cells pulsed with tumor cell lysate for a vaccination strategy in children with malignant solid tumors and a poor prognosis," Klin Padiatr, 216, 176-82. ADAMSON, L., PALMBORG, A., SVENSSON, A., LUNDQVIST, A., HANSSON, M., KIESSLING, R., MASUCCI, G., MELLSTEDT, H. und PISA, P. (2004): "Development of a technology platform for large-scale clinical grade production of DC," Cytotherapy, 6, 363-71. AGARWAL, A., VERMA, S., BURRA, U., MURTHY, N. S., MOHANTY, N. K. und SAXENA, S. 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(2005): "Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance," Nat Rev Cancer, 5, 263-74. 193 LEBENSLAUF Name Constanze Matthes Anschrift Bürgerstr. 30 37073 Göttingen Tel: 0551/300974 Geburtsdatum/-ort 30.12.1971 in Dahme Nationalität deutsch Familienstand ledig 09/78-07/88 Oberschule in Luckau 09/88-07/90 Erweiterte Oberschule J.-W. Goethe in Lübben 07/90 Abitur (Note: 1,8) Praktikum 09/90-04/92 Kreiskrankenhaus Luckau Studium 04/92-09/92 Studiengang Sonderpädagogik Biologie/Chemie Lehramt Freie Universität Berlin 10/92-10/94 Grundstudium Biologie-Diplom Universität Göttingen 10/94 Vordiplom 10/94-03/97 Hauptstudium Biologie-Diplom Fächerkombination: Zoologie/ Immunologie/Organische Chemie Universität Göttingen 05/97-12/98 Diplomarbeit in der Abteilung für Immunologie bei Prof. Peters: Untersuchungen zum Einfluss maligner Zellen auf Ausdifferenzierung Monozytenabgeleiteter dendritischer Zellen und Herstellung einer Fusionsvakzine aus beiden Zelltypen Diplom (Note: 1,7) Schulbildung 12/98 Berufliche Tätigkeit ab 2/99 Laborleitung und wissenschaftliche Mitarbeiterin im Institut für Tumortherapie in Duderstadt in Zusammenarbeit mit der Abteilung Immunologie Universität Göttingen Promotion Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Kongressen vorgestellt bzw. veröffentlicht: MATTHES, C., MARX, D., HOLLMANN, K., CILLIEN, N., LORENZEN, D. R. und NEßELHUT, T. (2002): "Differences in marker expression of monocyte derived dendritic cells and clinical response," Bamberg, 7th International symposium on dendritic cells. MATTHES, C., MARX, D., CILLIEN, N., GORTER, R., LORENZEN, D. R., PETERS, J. H. und NEßELHUT, T. (2003): "Marker expression of monocyte derived dendritic cells in healthy individuals and cancer patients; correlation to clinical response," Chicago: ASCO, 180, 39th Annual Meeting American Society of Clinical Oncology. MATTHES, C., MARX, D., LORENZEN, D. R., CILLIEN, N., PETERS, J. H. und NEßELHUT, T. (2003): "Differences in phenotype and function of monocyte derived dendritic cells cancer patients and healthy donors," Berlin: J Immunobiology, 207, 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology. MATTHES, C., MARX, D., LORENZEN, D. R., CILLIEN, N., NEßELHUT, J., NEßELHUT, T. und PETERS, J. H. (2004): "Monocyte-derived dendritic cells from breast cancer patients for immunotherapeutical application," Maastricht: J Immunobiology, 368, Joint Annual Meeting of the German and Dutch Societies for Immunology (JAMI). NEßELHUT, T., MATTHES, C., MARX, D., CHANG, R. Y., NEßELHUT, J., CILLIEN, N., LORENZEN, D. R., GORTER, R., STÜCKER, W. und PETERS, J. H. (2005): "Cancer therapy with immature monocyte derived dendritic cells in patients with advanced breast cancer," Orlando, FL: ASCO, 41st Annual Meeting American Society of Clinical Oncology. Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel: Dendritische Zellen in der Immuntherapie gegen Tumoren Untersuchungen zu der durch dendritische Zellen vermittelten spezifischen Immunantwort beim Mammakarzinom und vom Tumor ausgehende immunsupprimierende Einflüsse im Institut für Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover unter Leitung von Prof. Dr. med. K. Resch mit Unterstützung durch Prof. Dr. med. J.H. Peters Hygieneinstitut Abteilung für Immunologie der Universität Göttingen ohne sonstige Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort angeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keiner inoder ausländischen Medizinischen Fakultät ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt. vorliegende Dissertation wird im folgendem Publikationsorgan Anti Cancer Res veröffentlicht Hannover, den 09.08.2006 Danksagungen Herrn Prof. Dr. K. Resch, Institut für Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover danke ich für die stets gute Zusammenarbeit und fachliche Beratung bei der Durchführung meiner Arbeit. Bei Herrn Prof. Dr. J.H. Peters, Abteilung für Immunologie der Universität Göttingen möchte ich mich besonders für die Überlassung des Themas, für die vielfältige und ausdauernde Unterstützung bei meiner Arbeit sowie für die Durchsicht des Manuskriptes herzlich bedanken. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. T. Neßelhut, Institut für Tumortherapie Duderstadt für die Möglichkeit zum wissenschaftlichen arbeiten neben meiner Tätigkeit als Laborleitung sowie seiner jahrelangen persönlichen Unterstützung für die Fertigstellung meiner Arbeit. Ein ganz besonders liebes Dankeschön möchte ich Frau Dr. Dagmar Marx und Frau Dr. Kirsten Neßelhut sagen für ihre zu jeder Tages- und Nachtzeit fachliche und stets freundschaftlich-moralische Unterstützung, womit sie maßgeblich zu der Beendigung dieser Arbeit beigetragen haben. Ebenfalls möchte ich mich bei Dr. Gerald Schlaf für die Hilfe bei der Proteinaufreinigung und bei Dr. Dirk Lorenzen für die fachliche Beratung bei der Durchführung der funktionellen assays bedanken. Bei Frau Sandra Knöpfel möchte ich mich für die wertvolle technische Unterstützung und freundschaftliche Zusammenarbeit ganz herzlich bedanken. Ebenfalls möchte ich mich für die zahlreichen Hilfestellungen bei Katja Heinrichs, Thomas Schulz und Andrea Struck sowie allen Mitarbeitern des Instituts für Tumortherapie, dem Praxisteam und den Mitarbeitern der Abteilung für Immunologie bedanken. Roland Schwarz gilt mein persönlichstes Dankeschön für die Erstellung der vielen Graphiken, Formatierungen und am aller meisten für seine liebevolle Geduld und den Glauben, dass wir promovieren werden. Meiner Schwester Swantje Matthes möchte ich für ihre Ruhe und Gelassenheit mit der sie in all den Jahren meine Höhen und Tiefen über sich ergehen ließ danken sowie für unser lustiges und turbulentes Zusammenleben in dieser Zeit. Meinen Eltern danke ich für ihre uneingeschränkte und liebevolle Unterstützung bei allen Dingen in meinem Leben. Unseren Patienten gilt mein letzter Dank, deren Kraft, Mut und Leidensweg mich oft während dieser Zeit bewegt und beeindruckt haben.
