Dokument_21.
Werbung
1 Aus dem Pathologischen Institut der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann Prognostische Bedeutung von Lymphfollikeln und tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten beim Hodgkin Lymphom Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Stefanie Tegtmeier aus Neustadt a. Rbge. 2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Gerald Niedobitek Korreferent: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2009 3 meinen Eltern und meinem Bruder 4 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung und Abstract 5 2 Einleitung 9 2.1 Das Hodgkin Lymphom 9 2.2 Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender Lymphozyten 11 3 Methoden 13 3.1 Patientenauswahl 13 3.2 Histologie und Immunhistochemie 13 3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode 14 3.3 Auswertungsmethode 15 3.4 Statistik 17 4 Ergebnisse 17 5 Diskussion 27 6 Literaturverzeichnis 29 7 Abkürzungsverzeichnis 32 8 Danksagung 33 9 Lebenslauf 34 5 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Da das Immunsystem nach neueren Erkenntnissen mittels einer Lymphozyteninfiltration auf Tumore reagiert, ist es ein Ziel gegenwärtiger Forschung, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) als prognostische Faktoren zu identifizieren. Diese Studie hat sich zum Ziel gesetzt, den Einfluss von Lymphfollikeln (LF) und tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten auf die Prognose von bestrahlten und/oder chemotherapeutisch behandelten Patienten mit HodgkinLymphom (HL) zu untersuchen. 1.2 Methoden Tumorbiopsien von 89 Patienten mit HL wurden immunhistochemisch gefärbt und mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms ausgewertet. Hierfür wurden B- Lymphozyten in allen 89 Fällen mit einem monoklonalen Antikörper spezifisch für CD20 markiert. Zusätzlich wurden von allen Biopsien mit genügend Paraffinmaterial (74 Fälle) immunhistochemische Untersuchungen mit einem CD21-spezifischen Antikörper zur Detektion von B-Lymphozyten und follikulären dendritischen Zellen durchgeführt. Die Zahl der interfollikulären CD20+ Lymphozyten wurde ins Verhältnis zur ausgewerteten Fläche gesetzt. Außerdem wurde in einer zweiten Auswertungsreihe die Zahl der CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel pro Fläche mittels Diascanner ausgewertet. Da die Verteilungskurven für CD20+ Zellen, CD20+ und CD21+ LF keiner Gausschen Verteilungskurve glichen, wurden die Schwellenwerte zur Unterscheidung zweier Subgruppen nicht am Median, sondern nach rein optischen Gesichtspunkten sowie in Abhängigkeit vom besten p-Wert festgelegt. Daraus ergab sich je eine Gruppe mit vielen oder wenigen B-Lymphozyten bzw. mit vielen oder wenigen Lymphfollikeln. Nach der Kaplan-Meier-Methode wurde dazu jeweils das Gesamtüberleben, das rezidivfreie, das zweittumorfreie und das ereignisfreie Überleben berechnet und mit Hilfe des Logrank-Tests verglichen. 6 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen In Bezug auf Gesamtüberleben (GSÜ), rezidivfreies Überleben (RÜ), zweittumorfreies Überleben (2TÜ) sowie ereignisfreies Überleben (EÜ) zeigten CD20+ B-Lymphozyten keinen prognostischen Einfluss (siehe Abb. 5-8). Als prognostisch einflussreich stellte sich dagegen die Dichte von CD20+ Lymphfollikeln dar: Eine hohe Anzahl an CD20+ LF korrelierte im HL tendenziell mit einem verbesserten GSÜ (p=0,065), RÜ (p=0,125), 2TÜ (p=0,155) und EÜ (p=0,064), wie in Abb. 10-13 dargestellt. Zur Validierung der Ergebnisse wurden mittels CD21+ Immunhistochemie ebenso LF im HL detektiert. Die Auswertungsergebnisse für CD20+ LF konnten bei den untersuchten Parametern GSÜ (p=0,110), RÜ (p=0,253), 2TÜ (p=0,125) und EÜ (p=0,086) bestätigt werden, wie in Abb. 15-18 gezeigt. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Lymphfollikel im HL sind möglicherweise nicht nur Relikte der ursprünglichen Lymphknoten-Struktur, sondern können Komponenten einer tumorspezifischen Immunreaktion darstellen. Die günstige Wirkung der LF basiert vermutlich auf den darin durch Antigenkontakt ausgelösten Keimzentrumsreaktionen. Dabei kommt es im Zusammenspiel von follikulären dendritischen Zellen, B-Zellen und THelferzellen über mehrere Reaktionsschritte zur Umwandlung von B-Zellen in Plasmazellen (PZ), die in der Lage sind, Antikörper gegen Oberflächenantigene von Zielzellen zu bilden. Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb eines Tumors ist von Bedeutung, da sie nicht nur Rückschlüsse auf die Prognose der Patienten liefern, sondern auch eine Basis für die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren darstellen kann. 7 Abstract Background and objective Tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) are generally considered to represent a host immune response directed against tumor antigens. This notion is underlined by the prognostic relevance of certain T-cell subsets in various human malignancies. Bcells, by contrast have received little attention. Therefore, this study aims at the analysis of the prognostic relevance of tumor-infiltrating B-cells in patients with classical Hodgkin lymphoma (cHL). Methods Formalin-fixed and paraffin-embedded tumor biopsies from 89 patients diagnosed with cHL were available. Paraffin sections were immunostained using a CD20 monoclonal antibody (mAb) for the detection of B-cells (89 cases) and a CD21 mAb for the identification of follicular dendritic cell meshworks (74 cases). The number of interfollicular CD20+ cells was evaluated in relation to the area using a computer-assisted image analysis program. Moreover the numbers of CD20+ and/or CD21+ B-cell follicles were analysed. Overall survival, disease-free survival, second-tumor-free survival, and event-free survival were analysed using Kaplan and Mayer statistics, and the curves were compared by the log-rank test. Results Concerning overall survival, disease-free, second-tumor-free and eventfree survival CD20+ B-cells did not show any prognostic relevance. By contrast, the density of CD20+ lymph follicles turned out to be prognostically influential: Large numbers of CD20+ B-cell follicles tended to correlate with a better orverall survival, disease-free, second-tumor-free and event-free survival. This result was confirmed by CD21+ immunohistochemistry. 8 Conclusions These results suggest that in cHL B-cell follicles are not only remnants of the preexisiting lymph nodes, but possibly components of an immune response which is specific to the tumor. Thus, in addition to T-cell immunitiy, the humoral immune system may play a more important role in anti-tumour immunity than hitherto recognised. Knowledge about local immune responses within a tumor is important as a means to assess patients’ prognoses as well as the basis for the development of immunological therapies. 9 2 Einleitung 2.1 Das Hodgkin Lymphom Das Hodgkin Lymphom (HL), auch als Morbus Hodgkin oder Lymphogranulomatose bezeichnet, wurde erstmals 1832 vom britischen Arzt Thomas Hodgkin beschrieben und gehört – zusammen mit der großen Gruppe der Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) – zu den malignen Lymphomen. Die Gesamtzahl der Neuerkrankungen liegt in Deutschland bei etwa 2000 pro Jahr. Die Inzidenz beträgt 2,5 pro 100 000 Einwohner jährlich. Das mittlere Erkrankungsalter liegt um das 4. Lebensjahrzehnt, wobei Männer und Frauen annähernd gleichmäßig betroffen sind (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Ein erster Altersgipfel findet sich bei jungen Erwachsenen im 3. Lebensjahrzehnt, ein zweiter im 7. Lebensjahrzehnt. In frühen Stadien ist das HL auf die Lymphknoten (LK) begrenzt, breitet sich aber im Verlauf auch hämatogen extralymphatisch aus. Diagnostiziert wird die Erkrankung laut WHO-Klassifikation histopathologisch anhand der typischen Hodgkin-/Reed-Sternberg- (HRS-) Tumorzellen, die sich in geringer Anzahl zwischen vielen nicht-neoplastischen Zellen finden (Küppers et al., 1998). HRS-Zellen sind oft mehrkernig und entstehen vermutlich durch Transformation von Keimzentrums-B-Zellen. Aufgrund dessen kann auf HRSZellen die Expression bestimmter Antigene nachgewiesen werden, wobei zu 80% mehr als ein B-Zellmarker auf der Zelloberfläche anzutreffen ist (Watanabe et al., 2000). In diesem Zusammenhang konnten Janz et al. ein gewisses Transdifferenzierungspotential auch reifer lymphatischer Zellen nachweisen: So kommt es in HRS-Zellen zur Hemmung des Transkriptionsfaktors E2A durch eine überschießende Expression des aktivierten B-Zell-Faktors 1 und von inhibitor of differentiation 2 (Id2), was eine Veränderung der Genexpression und einen Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene zur Folge hat (Janz et al., 2006). B-Lymphozyten sind eine Untergruppe der Leukozyten und leiten sich über mehrere Zwischenstufen von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks ab. Sie sind als 10 einzige Zellen in der Lage Antikörper zu bilden und stellen neben dem 2. Subtyp von T-Helferzellen (Th2) Bestandteile der humoralen Immunantwort dar. Reife BZellen exprimieren oberflächlich IgM-Rezeptoren für Antigene und zirkulieren im Blut und den lymphatischen Organen. Beim ersten Antigen-Kontakt und gleichzeitigem ko-stimulierendem Signal von Th2-Zellen, wandert die B-Zelle in ein Keimzentrum von Lymphknoten oder Milz, wo sie proliferiert und nach Differenzierung zur Plasmazelle Antikörper sezerniert. Alternativ kann es auch zu einer Differenzierung zu Gedächtnis-B-Zellen kommen. Dieser Prozess wird begleitet von einem Wechsel der Immunglobulin-Klasse und der somatischen Hypermutation der Immunglobulin-Gene. Neben den membranständigen Immunglobulinen tragen B-Zellen im Verlauf ihrer Reifung auf der Oberfläche weitere verschiedene Eiweißstrukturen, die als Oberflächenmarker für deren Identifizierung von Bedeutung sind. Dazu zählen unter anderem CD20 und CD21. CD21 markiert neben B-Zellen auch follikuläre dendritische Zellen (FDZ). Das histologische Bild des HL variiert aufgrund der Zusammensetzung des Infiltrats von Tumorzellen, reaktiven Lymphozyten, Histiozyten, Granulozyten und Fibroblasten und lässt eine Einteilung in zwei große Subtypen zu: nach der WHOKlassifikation von 1997 unterscheidet man das klassische vom nodulären lymphozytenprädominanten (nlp) HL. Das klassische HL tritt in vier Erscheinungsformen auf: lymphozytenreich (lr), nodulär sklerosierend (ns), gemischt zellulär (mc, mixed cellularity) oder lymphozytenarm (ld, lymphocyte depletion). In Abhängigkeit vom Erkrankungsstadium, Blutbild, Alter und Geschlecht des Patienten finden sich nach durchgeführter Chemotherapie und/oder Radiatio progressionsfreie Überlebensraten zwischen 42% und 84% (Hasenclever et al., 1998). Die Mortalität liegt in Deutschland bei 0,5 Personen pro 100 000 Einwohner im Jahr (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Zu den unabhängigen Faktoren, die die Prognose des Patienten negativ beeinflussen, zählen neben einem hohen Alter und einem schlechten Allgemeinzustand das Vorhandensein extranodaler Manifestationen, die in der Ann Arbor-Klassifikation von 1971 erfasst 11 und in Abhängigkeit vom Befallsmuster der Lymphknoten in vier Ausbreitungsstadien unterteilt wurden. Unter B-Symptomatik versteht man das zusätzliche Vorhandensein der Trias Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust. 2.2 Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender Lymphozyten Im Hinblick auf die Prognose verschiedener Tumorerkrankungen wurde der Einfluss tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) bereits vielfach untersucht: Als prognostisch einflussreich erwiesen sich diverse TILs beim Ovarial-Karzinom: Hier korrelierte eine geringe Zahl CD8+ T-Lymphozyten sowie niedrige Quotienten von CD8+/CD4+ bzw. CD8+/Treg mit einem reduzierten Gesamtüberleben (GSÜ) (Sato et al., 2005). Auch beim Kolorektalen Karzinom war eine geringe Anzahl CD8+ TLymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (Prall et al., 2004). Beim Pankreas-Karzinom korrelierte eine starke Infiltration zytotoxischer T-Zellen mit verlängerten Überlebensraten (Ryschich et al., 2005). Wie Ryschich aber weiter feststellte, geht die Expression vom humanen Leukozyten-Antigen-System-I (HLAI) im Pankreas-Karzinom allerdings oft verloren, was die Umgehung der zytotoxischen T-Zell-Infiltration nach sich zieht (Ryschich et al., 2005). Insgesamt betonen diese Untersuchungen einen prognostisch günstigen Effekt von zytotoxischen T-Zellen und einen ungünstigen Effekt regulatorischer T-Zellen. Demgegenüber finden sich nur vergleichsweise wenige Arbeiten, die die Bedeutung von tumorinfiltrierenden B-Zellen zum Gegenstand haben. So korreliert die Infiltration von B-Lymphozyten beim medullären Mamma-Karzinom (Kotlan et al., 2003 + 2005) und beim großzelligen Lungen-Karzinom (Eerola et al., 1999) mit einer günstigen Prognose. In diesem Zusammenhang hat Hansen anhand des medullären Mamma-Karzinoms nachgewiesen, dass B-Lymphozyten als Reaktion auf ein auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiertes Antigen eine humorale Immunantwort auslösen, was möglicherweise die Elimination von Tumorzellen nach sich zieht (Hansen et al., 2002). Nzula konnte beim duktalen MammaKarzinom zahlreiche Mutationen der Immunglobulingene in den infiltrierenden BZellen nachweisen, woraus er ebenfalls auf antigenabhängige Proliferationen und somatische Hypermutationen der B-Zellen schloss (Nzula et al., 2003). 12 Beim HL dominieren histologisch Th2- und regulatorische T- (Treg-) Zellen. Von Schreck konnte kürzlich der Zusammenhang zwischen einer Tumorinfiltration mit Th2-Zellen und einer günstigen Prognose nachgewiesen werden (Schreck et al., Hematol Oncol, im Druck: Sabine Schreck, Daniela Friebel, Maike Buettner, Luitpold Distel, Gerhard Grabenbauer, Lawrence S. Young, Gerald Niedobitek. Prognostic impact of tumour-infiltrating Th2 and regulatory T cells in classical Hodgkin lymphoma). Vermutlich wird die für das HL charakteristische inflammatorische Tumorinfiltration durch die von HRS-Zellen produzierten Chemound Zytokine ausgelöst (Poppema et al., 2000). Diese führen neben einer Th2-ZellInfitration zur Unterdrückung der Th1-Zell-Reaktion. Somit wird die zytotoxische Immunantwort nicht unterstützt (Poppema et al., 2000). Des Weiteren konnte beim HL nachgewiesen werden, dass eine geringe Zahl von Th2-Zellen sowie eine gleichzeitig hohe Zahl regulatorischer T-Zellen (Tregs) mit einem signifikant reduzierten RÜ korreliert (Schreck et al., submitted, s.o.). Die lokale Akkumulation von immunsuppressiven Tregs im HL-Gewebe führt zur Hemmung von Th-Zellen und könnte somit eine mögliche Erklärung dafür sein, warum HRS-Zellen der antitumoralen Immunität entgehen (Marshall et al., 2004). Die prognostische Bedeutsamkeit der Th2-Zellen beim HL legt die Vermutung nahe, dass die humorale Immunität wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit werden daher die Effektoren der humoralen Immunität, d.h. B-Zellen und B-Zell-Follikel, untersucht. Im Gegensatz zum HL wies Carreras bei Follikulären Lymphomen (FL), die zur großen Gruppe der NHL gehören, einen prognostisch günstigen Einfluss tumorinfiltrierender Tregs nach (Carreras et al., 2006). Die lokale Immunantwort bei malignen Tumoren ist somit von Bedeutung für die Prognostik von Tumorerkrankungen und könnte zukünftig auch als Grundlage für die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren genutzt werden. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss tumorinfiltrierender interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten sowie CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel auf die Prognose von Patienten mit Hodgkin-Lymphom untersucht. 13 3 Methoden 3.1 Patientenauswahl Für die vorliegende Studie standen insgesamt 89 in Paraffin eingebettete Biopsien von Patienten mit der histopathologischen Diagnose HL zur Verfügung. Die Diagnose war zwischen 1991 und 2004 gestellt worden. Die Patienten wurden mit Chemotherapie, Radiatio oder einer Kombination aus beiden behandelt. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung betrug das Patienten-Alter zwischen vier und 78 Jahren: Dabei waren 18 Patienten unter 20, 39 zwischen 20 und 40, 16 zwischen 40 und 60 und 15 über 60 Jahre alt. Bei den 51 männlichen und 38 weiblichen Patienten wurde vor Therapiebeginn das Stadium der Erkrankung anhand der Ann Arbour-Klassifikation bestimmt: Dem Stadium 1 mit Befall einer einzigen Lymphknotenregion konnten 18 Patienten zugeordnet werden, davon zwei mit B-Symptomatik (s.o.). Dem Stadium 2 mit einer oder mehreren unilateral befallenen Lymphknotenregionen wurden 36 Patienten zugeordnet, davon 13 mit B-Symptomatik. Bei 20 Patienten hatte die Erkrankung Stadium 3 mit bilateral befallenen Lymphknotenregionen erreicht, davon sieben mit B-Symptomatik. Dem Stadium 4 mit diffusem Organbefall wurden 12 Patienten zugeordnet, die alle B-Symptome zeigten. Zweittumore entwickelten neun der 89 Patienten. Für die Auswertung der CD20+ B-Lymphozyten und CD20+ Lymphfollikel wurden alle 89 Biopsien untersucht. In die Auswertung der CD21+ Lymphfollikel konnten wegen Materialmangels nur 74 Fälle einbezogen werden. 3.2 Histologie und Immunhistochemie In Paraffin eingebettete Biopsien wurden nach Herstellung histologischer Schnitte mit der Biotin-Streptavidin-Komplex Methode immunhistochemisch gefärbt. Dabei fanden folgende monoklonale Antikörper Verwendung: CD20 (Klon L26, DakoCytomation, Hamburg, Deutschland) und CD21 (Klon 1F8, DakoCytomation, 14 Hamburg, Deutschland). Der Ablauf der immunhistochemischen Färbungen soll im Folgenden erläutert werden. 3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode Nach Entparaffinieren in absteigender Alkoholreihe – zwei mal für jeweils 10 Minuten im Xylolbad, danach jeweils für weitere 2 Minuten in 100%, 90%, 80% und 70% Alkohol, wurden die Schnitte in Tris-Puffer gestellt und thermisch mittels Mikrowelle - für jeweils 1 Minute in Citratpuffer (pH 6,0) – vorbehandelt. Nach nochmaligem Spülen in Tris-Puffer wurden die Schnitte für 1 Stunde mit den Primärantikörpern inkubiert. Dabei kamen folgende Verdünnungen zur Anwendung: 1:500 (CD20) und 1:100 (CD21). Nach Spülen mit Tris-Puffer und einem Tropfen Brij wurden die Schnitte für 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper (biotinylierter anti Maus IgG) in der Verdünnung 1:50 und - nach erneutem Spülen mit Tris-Puffer - für weitere 30 Minuten mit dem Strept-AB-Komplex Dako K 391 inkubiert. Nach erneuter Tris-Puffer-Spülung wurden die Schnitte schließlich in der Fast-RedFarbreaktion in 20 Minuten gefärbt. Zur Herstellung des Fast-Red-Gemisches musste die Reihenfolge der zugegebenen Substanzen genau eingehalten und die Lösung anschließend filtriert werden: Zu 0,0020g Naphthol-As-Mx-Phosphat wurden in der nachfolgend genannten Reihenfolge und frühestens 10 Minuten vor Verwendung gegeben: N,N Dimethylformamid 0,2ml 0,1m Tris-HCl-Puffer pH 8,6 9,8ml 1m Levamisol 10µl Fast Red 0,01g Im Anschluss daran wurden die Schnitte fließend gewässert, in destilliertes Wasser gestellt und für einige Sekunden mit Hämalaun (VWR) gegengefärbt. Nach Einstellen in Leitungswasser erfolgte die Eindeckung mit Aquatex (Merck, Darmstadt, Deutschland). 15 3.3 Auswertungsmethode Die Auszählung der B-Lymphozyten erfolgte für diese Studie mit Hilfe eines Standardlichtmikroskops, von dem aus die Bilder durch eine Digitalkamera auf einen PC übertragen und unter Verwendung eines Bildanalysepogramms (COUNT, Biomas, Erlangen, Germany) ausgewertet wurden. Für die Auswertung der Lymphfollikel wurden die Objektträger mittels eines Diascanners eingescannt (Coolscan 5 ED, Nicon) und ebenfalls unter Verwendung des oben genannten Bildanalyseprogramms ausgezählt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen exemplarisch die unterschiedlichen Konzentrationen von CD20+ interfollikulären B-Zellen, die mittels Standardlichtmikroskop ausgewertet wurden. In Abbildung 3 sind CD20+ LF dargestellt, die von interfollikulären B-Zellen umgeben sind. Alle Bilder wurden mit Vergrößerung aufgenommen. Abb. 1: hohe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten bei 63facher Vergrößerung 16 Abb. 2: geringe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten bei 63facher Vergrößerung Abb. 3: Darstellung zweier CD20+ Lymphfollikel bei 40facher Vergrößerung Pro Patient wurden für CD20 und CD21 je ein bis zwei exemplarische Ausschnitte eines histologischen Schnittes ausgewertet. Die durchschnittliche Abweichung wurde quantitativ erfasst. Zunächst wurde das Verhältnis der untersuchten Lymphozyten-Subgruppe (CD20) zur Fläche (28,5 mm²) berechnet. Anschließend 17 wurde für CD20 und CD21 die Follikeldichte, d.h. die Anzahl der Lymphfollikel bezogen auf die individuelle Lymphknotenfläche berechnet. 3.4 Statistik Mit Hilfe der Kaplan-Meier-Analyse wurden verschiedene Überlebensparameter untersucht. Das Gesamtüberleben (GSÜ) errechnete sich aus dem Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung des HL und dem Tod am HL. Das RÜ wurde definiert als das Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Rezidivs. Das zweittumorfreie Überleben (2TÜ) wurde definiert als das Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors. Das EÜ beschrieb das Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors oder Rezidivs. Dabei erfolgte die Unterteilung der Patienten in Gruppen mit vielen oder wenigen CD20+ B-Lymphozyten, vielen oder wenigen CD20+ LF und vielen oder wenigen CD21+ LF. Da es sich nicht um Gaussche Verteilungskurven handelte, wurde die Teilung unabhängig vom Median festgelegt. Der Logrank-Test diente dem Vergleich der jeweiligen Untergruppen. 4 Ergebnisse Die Auswertung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten sowie der CD20+ bzw. CD21+ LF zeigte bezüglich der ausgewerteten Fläche folgende Ergebnisse: Die Anzahl der CD20+ B-Lymphozyten lag zwischen 17,6 und 2619,25 pro mm². In der zweiten Auswertung wurden zwischen 0,0 und 1,69 CD20+ LF pro mm² ausgezählt. Die Anzahl der CD21+ LF lag im Bereich zwischen 0,0 und 1,43 LF pro mm². Für die Dichte der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten ergab sich daraus der im Folgenden dargestellte Kurvenverlauf. Der Cut-off für die anschließenden KaplanMeier-Analysen wurde nach bestem p-Wert bei 283 Zellen/mm² gezogen (Pfeil). 18 Daraus ergaben sich zwei Patienten-Gruppen mit vielen (n=44) bzw. wenigen Häufigkeit (n=44) CD20+ B-Lymphozyten. 12 10 8 6 4 2 0 0 1000 2000 + Interfollikuläre CD20 Zellen pro mm² 3000 4000 Abb. 4: Dichte-Verteilung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten Die Infiltrationsdichte interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten zeigte im Hinblick auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ keinen prognostischen Einfluss (Abb. 5-8). 19 CD20+ > 283 (n=44): 89% Gesamtüberleben CD20+ < 283 (n=44): 81% p = 0.173 Jahre Abb. 5: Gesamtüberlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten CD20+ > 283 (n=44): 87% Rezidivfreies Überleben CD20+ < 283 (n=44): 79% p = 0.518 Jahre Abb. 6: Rezidivfreies Überleben bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten 20 Zweittumorfreies Überleben CD20+ > 283 (n=44): 88% CD20+ < 283 (n=44): 73% p = 0.297 Jahre Abb. 7: Zweittumorfreie Überlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten Ereignisfreies Überleben CD20+ > 283 (n=44): 76% CD20+ < 283 (n=44): 68% p = 0.577 Jahre Abb. 8: Ereignisfreie Überlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten 21 Das nachfolgende Histogramm stellt die Dichteverteilung der CD20+ Lymphfollikel dar und wurde bei 0,55 Follikeln/mm² in je eine Untergruppe mit vielen (n=24) bzw. wenigen (n=65) Lymphfollikeln aufgeteilt (Pfeil). Häufigkeit 12 10 8 6 4 2 0 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 CD20+ Lymphfollikel pro mm² Abb. 9: Dichte-Verteilung der CD20+ Lymphfollikel Bezüglich der Anzahl CD20+ Lymphfollikel korrelierte eine hohe Follikeldichte bei allen vier Parametern (GSÜ, RÜ, 2TÜ, EÜ) tendenziell mit einer günstigen Prognose (Abb. 10-13). Die Ergebnisse waren allerdings statistisch nicht signifikant. 22 CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 100% Gesamtüberleben CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 82% p = 0.065 Jahre Abb. 10: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD20+ Lymphfollikel Rezidivfreies Überleben CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 95% CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 80% p = 0.125 Jahre Abb. 11: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD20+ Lymphfollikel 23 Zweittumorfreies Überleben CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 94% CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 77% p = 0.155 Jahre Abb. 12: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD20+ Lymphfollikel Ereignisfreies Überleben CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 90% CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 66% p = 0.064 Jahre Abb. 13: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD20+ Lymphfollikel 24 Das Histogramm in Abb. 14 zeigt die Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel. CD21 gilt als Marker für B-Lymphozyten und follikuläre dendritische Zellen und wurde zur Validierung der CD20-Daten verwendet. Der Cut-off in je eine Subgruppe mit vielen (n=16) bzw. wenigen (n=58) Follikeln erfolgte für die folgenden Kaplan-Meier-Analysen bei 0,6 Lymphfollikeln/mm² (Pfeil). Häufigkeit 8 6 4 2 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 CD21+ Lymphfollikel pro mm² Abb. 14: Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel Eine hohe Dichte an CD21+ LF zeigte tendenziell einen günstigen Einfluss auf die Prognose von HL-Patienten bezogen auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ (Abb. 15-18). Allerdings waren die Ergebnisse statistisch nicht signifikant. 25 CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 100% Gesamtüberleben CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 83% p = 0.110 Jahre Abb.15: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD21+ Lymphfollikel Rezidivfreies Überleben CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93% CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 76% p = 0.253 Jahre Abb.16: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD21+ Lymphfollikel Zweittumorfreies Überleben 26 Abb.17: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD21+ Lymphfollikel Ereignisfreies Überleben CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93% CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 67% p = 0.086 Jahre Abb. 18: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte CD21+ Lymphfollikel 27 5 Diskussion In der vorliegenden Studie wurde bezüglich der TIL gezeigt, dass CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel möglicherweise günstige Prognosefaktoren bei Patienten mit HL darstellen. Eine hohe Dichte von LF korrelierte tendenziell mit einem verlängerten GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ. Für die Anzahl tumorinfiltrierender interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten konnte kein prognostischer Einfluss nachgewiesen werden. In vorangegangenen Studien wurde bereits mehrfach der Einfluss verschiedener tumorinfiltrierender Lymphozyten-Subgruppen untersucht: Alvaro-Naranjo hat zytotoxische T-Zellen auf deren prognostische Bedeutsamkeit hin beim HL analysiert: Hier war eine hohe Zahl tumorinfiltrierender TIA-1+ zytotoxischer T-Lymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (AlvaroNaranjo et al., 2005). Auch Oudejans konnte eine starke Infiltration aktivierter zytotoxischer T-Zellen, die als Haupteffektorzellen in der Elimination neoplastischer Zellen gelten, als deutlichen Indikator für einen klinisch ungünstigen Krankheitsverlauf nachweisen (Oudejans et al., 1997). Als Ursache für die Unfähigkeit aktivierter zytotoxischer T-Zellen, HRS-Zellen zu lysieren, vermutet Oudejans die Herabregulation der Haupthistokompatibilitäts-Komplexe-I (MHC-I) auf der Oberfläche von HRS-Zellen. Somit kann möglicherweise eine Erkennung der Tumorantigene durch zytotoxische T-Zellen umgangen werden (Oudejans et al., 1997). Bezüglich des Einflusses tumorinfiltrierender B-Lymphozyten sind ebenfalls bereits einige Untersuchungen bei verschiedenen Malignomen durchgeführt worden: Das medulläre Mammakarzinom zeichnet sich im Vergleich zu den anderen Subtypen des Mammakarzinoms durch eine größere Zahl tumorinfiltrierender B-Zellen sowie durch eine bessere Prognose aus. Kotlan erklärte diesen Zusammenhang mit der spezifischen Tumorantigen-Bindungskapazität der Antikörper von infiltrierenden BZellen (Kotlan et al., 2003). Die Tatsache, dass der Anzahl der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten in der vorliegenden Studie kein Einfluss auf die Prognose des HL nachgewiesen werden konnte, könnte auf eine geringere Fallzahl zurückgeführt werden, insbesondere da beim HL ohnehin wenige Todesfälle, Rezidive und Zweittumore auftreten. Daher 28 müssen weitere Studien mit höheren Fallzahlen durchgeführt werden, um gesicherte Aussagen bezüglich des prognostischen Einflusses treffen zu können. Um die Rolle der LF im Rahmen der humoralen Immunabwehr genauer zu definieren, wurde in der hier vorliegenden Studie der Einfluss von CD20+ und CD21+ LF untersucht. Die hierbei gezeigte Tendenz eines verlängerten GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ derjenigen Patienten, die eine höhere Dichte an CD20+ bzw. CD21+ LF aufwiesen, kann im Zusammenhang mit den in den LF stattfindenden Immunreaktionen gesehen werden: Bezüglich der dort vorhandenen follikulären dendritischen Zellen (FDZ) stellte Alavaikko als erster die Korrelation zwischen einem positiven FDZ-Status und einer günstigen Prognose dar (Alavaikko et al., 1994). Baur konnte dieses Ergebnis bestätigen und führte dies auf die Antigenpräsentierenden Eigenschaften der FDZ und die damit verbundene Rolle in der Aufrechterhaltung der B- und T-Zell-Immunantworten zurück (Baur et al., 1998). Die Interaktionen zwischen FDZ und Keimzentrums-B-Zellen wurden bereits in diversen Studien untersucht. Dabei stellte sich das Netzwerk aus FDZ als Schlüsselstruktur des Keimzentrums dar (Baur et al., 1998). In der hier vorliegenden Studie konnte bezüglich GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ eine prognostisch günstige Wirkung von CD20+ LF für HL-Patienten gezeigt werden. Die Daten wurden anhand CD21+ LF validiert. Dies stützt die Annahme, dass eine humorale Immunreaktion bei der immunologischen Kontrolle des HL wichtig sein könnte. Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb solider Tumoren ist von Bedeutung, da sie sowohl Rückschlüsse auf die Prognose zulässt als auch eine Grundlage für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren darstellt. Die Rolle von LF und interfollikulären B-Zellen in der humoralen Immunreaktion des HL bleibt weiter zu erforschen. Insbesondere der prognostische Einfluss CD20+ BLymphozyten wurde bisher nur in wenigen Tumormodellen untersucht. 29 6 (1) Literaturverzeichnis Alavaikko MJ, Blanco G, Aine R, Lehtinen T, Fellbaum C, Taskinen PJ, Sarpola A, Hansmann ML (1994) Follicular dendritic cells have prognostic relevance in Hodgkin's disease Am J Clin Pathol. 101: 761-7. (2) Alvaro-Naranjo T, Lejeune M, Salvadó-Usach MT, Bosch-Príncep R, Reverter-Branchat G, Jaén-Martínez J, Pons-Ferré LE (2005) Tumorinfiltrating cells as a prognostic factor in Hodgkin's lymphoma: a quantitative tissue microarray study in a large retrospective cohort of 267 patients Leuk Lymphoma. 46: 1581-91. (3) Baur AS, Meugé-Moraw C, Michel G, Delacrétaz F (1998) Prognostic value of follicular dendritic cells in nodular sclerosing Hodgkin's disease Histopathology. 32(6): 512-20. (4) Carreras J, Lopez-Guillermo A, Fox BC, Colomo L, Martinez A, Roncador G, Montserrat E, Campo E, Banham AH (2006) High numbers of tumor-infiltrating FOXP3-positive regulatory T cells are associated with improved overall survival in follicular lymphoma Blood.108: 2957-64. (5) Curiel TJ, Coukos G, Zou L (2004) Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival Nat Med. 10: 942-9. (6) Eerola AK, Soini Y, Paakko P (1999) Tumour infiltrating lymphocytes in relation to tumour angiogenesis, apoptosis and prognosis in patients with large cell lung carcinoma. Lung Cancer. 26: 73-83. (7) Hansen MH, Nielsen HV, Ditzel HJ (2002) Translocation of an intracellular antigen to the surface of medullary breast cancer cells early in apoptosis allows for an antigen-driven antibody response elicited by tumorinfiltrating B cells. J Immunol. 169: 2701-11. (8) Hasenclever D, Diel V (1998) A Prognostic Score for Advanced Hodgkin's Disease. International Prognostic Factors Project on Advanced Hodgkin's Disease. N Engl J Med. 339: 1506-14. (9) Janz M, Dörken B, Mathas S (2006) Reprogramming of B lymphoid cells in human lymphoma pathogenesis Cell Cycle. 5: 1057-61. 30 (10) Kotlan B, Simsa P, Foldi J, Fridman WH, Glassy M, McKnight M, Teillaud JL (2003) Immunoglobulin repertoire of B lymphocytes infiltrating breast medullary carcinoma Hum Antibodies. 12: 113-21. (11) Krebs in Deutschland. 5. überarbeitete, aktualisierte Ausgabe. Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. und das RKI. Saarbrücken, 2006. www.rki.de, 08.11.2007 (12) Küppers R, Rajewski K (1998) Molecular single-cell analysis of Hodgkin and Reed-Sternberg cells Annu Rev Immunol. 16: 471-93. (13) Marshall NA, Christie LE, Munro LR, Culligan DJ, Johnston PW, Barker RN, Vickers MA (2004) Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma Blood. 103(5): 1755-62. (14) Nzula S, Going JJ, Stott DI (2003) Antigen-driven clonal proliferation, somatic hypermutation, and selection of B lymphocytes infiltrating human ductal breast carcinomas Cancer Res. 63: 3275-80. (15) Oudejans JJ, Jiwa NM, Kummer JA, Ossenkoppele GJ, van Heerde P, Baars JW, Kluin PM, Kluin-Nelemans JC, van Diest PJ, Middeldorp JM, Meijer CJ (1997) Activated cytotoxic T cells as prognostic marker in Hodgkin's disease Blood. 89: 1376-82. (16) Poppema S, van den Berg A (2000) Interaction between host T cells and Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphomas Semin Cancer Biol. 10: 34550. (17) Prall F, Dührkop T, Weirich V, Ostwald C, Lenz P, Nizze H, Barten M (2004) Prognostic role of CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes in stage III colorectal cancer with and without microsatellite instability Hum Pathol. 35(7): 808-16. (18) Ryschich E, Nötzel T, Hinz U, Autschbach F, Ferguson J, Simon I, Weitz J, Fröhlich B, Klar E, Büchler MW, Schmidt J (2005) Control of T-cell-mediated immune response by HLA class I in human pancreatic carcinoma Clin Cancer Res. 11: 498-504. (19) Sato E, Olson SH, Ahn J, Bundy B, Nishikawa H, Qian F, Jungbluth AA, Frosina D, Gnjatic S, Ambrosone C, Kepner J, Odunsi T, Ritter G, Lele S, Chen YT, Ohtani H, Old LJ, Odunsi K (2005) Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell 31 ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 18538-43. (20) Watanabe K, Yamashita Y, Nakayama A, Hasegawa Y, Kojima H, Nagasawa T, Mori N (2000) Varied B-cell immunophenotypes of Hodgkin/Reed-Sternberg cells in classic Hodgkin's disease Histopathology. 36: 353-61. 32 7 Abkürzungsverzeichnis CD Cluster Domain cHL klassisches Hodgkin Lymphom cHLld lymphozytenarmes cHL cHLlr lymphozytenreiches cHL cHLmc gemischt-zelluläres cHL cHLns nodulär-sklerosierendes cHL DZ Dendritische Zellen EÜ ereignisfreies Überleben EZ Effektorzellen FDZ follikuläre dendritische Zellen FL Follikuläre Lymphome GSÜ Gesamtüberleben HLA Humane Leukozyten-Antigene HRS Hodgkin-/Reed-Sternberg (-Zellen) Id2 inhibitor of differentiation 2 Ig Immunglobulin IL Interleukin LF Lymphfollikel LK Lymphknoten mAB monoclonal antibody MHC-Komplex Haupthistokompatibiltäts-Komplex NHL Non-Hodgkin-Lymphom nlpHL noduläres lymphozytenprädominantes HL p Signifikanz PZ Plasmazelle RÜ rezidivfreies Überleben Th T-Helferzellen TIL Tumorinfiltrierende Lymphozyten Treg regulatorische T-Lymphozyten 2TÜ zweittumorfreies Überleben 33 8 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner Arbeit beigetragen haben. Hierbei ist an erster Stelle mein Betreuer Prof. Dr. G. Niedobitek zu nennen, der die Anregung zu dieser Arbeit gegeben hat. Seine fachkundige Unterstützung hat einen entscheidenden Anteil am erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit. Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr. L. Distel sowohl für die Hilfestellung bei der Planung dieser Arbeit als auch für die wertvollen Ratschläge während ihrer Durchführung. Besonders hervorzuheben ist hier seine Bereitschaft zu fachkundigen Diskussionen. Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, diese Arbeit an der Strahlenklinik anzufertigen. Des Weiteren danke ich Frau Dr. S. Schreck für ihr beständiges Engagement, sowie den Mitarbeiterinnen des immunhistochemischen Labors, insbesondere Frau Christa Winkelmann und Frau Alexandra Schindler, die mir mit ihrer praktischen Erfahrung stets zur Seite gestanden haben. Den größten Dank möchte ich meinen Eltern aussprechen, die mich stets unterstützt haben und ohne die mein Studium in dieser Form nicht möglich gewesen wäre. 34 9 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Geburtsdatum: Geburtsort: Eltern: Geschwister: Familienstand: Tegtmeier, Stefanie 03.09.1981 D – Neustadt am Rübenberge Hans Joachim Tegtmeier Marion Lorenz-Tegtmeier. Kai Tegtmeier ledig Schulausbildung 1988-1992 1992-1994 1994-2001 2001 Grundschule Bad Nenndorf Orientierungsstufe Bad Nenndorf Gymnasium Bad Nenndorf Abitur Hochschulausbildung 2001-2003 2003-2007 23.07.–13.12.2007 Zahnmedizinstudium an der Albertus-Magnus Universität zu Köln Fortsetzung des Zahnmedizinstudiums an der FriedrichAlexander Universität Erlangen-Nürnberg Zahnärztliche Prüfung Beschäftigung Seit 01.04.2008 Assistenzzahnärztin bei Dr. med. dent. Chr. Pscherer, 91227 Leinburg
