Dokument_21.

1
Aus dem Pathologischen Institut
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann
Prognostische Bedeutung von Lymphfollikeln und
tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten
beim Hodgkin Lymphom
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Stefanie Tegtmeier
aus Neustadt a. Rbge.
2
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. Gerald Niedobitek
Korreferent:
Prof. Dr. med. Arndt Hartmann
Tag der mündlichen Prüfung:
11.11.2009
3
meinen Eltern
und meinem Bruder
4
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung und Abstract
5
2
Einleitung
9
2.1
Das Hodgkin Lymphom
9
2.2
Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender
Lymphozyten
11
3
Methoden
13
3.1
Patientenauswahl
13
3.2
Histologie und Immunhistochemie
13
3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode
14
3.3
Auswertungsmethode
15
3.4
Statistik
17
4
Ergebnisse
17
5
Diskussion
27
6
Literaturverzeichnis
29
7
Abkürzungsverzeichnis
32
8
Danksagung
33
9
Lebenslauf
34
5
1
Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Da
das
Immunsystem
nach
neueren
Erkenntnissen
mittels
einer
Lymphozyteninfiltration auf Tumore reagiert, ist es ein Ziel gegenwärtiger
Forschung, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) als prognostische Faktoren zu
identifizieren. Diese Studie hat sich zum Ziel gesetzt, den Einfluss von
Lymphfollikeln (LF) und tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten auf die Prognose
von bestrahlten und/oder chemotherapeutisch behandelten Patienten mit HodgkinLymphom (HL) zu untersuchen.
1.2 Methoden
Tumorbiopsien von 89 Patienten mit HL wurden immunhistochemisch gefärbt und
mit
Hilfe
eines
Bildanalyseprogramms
ausgewertet.
Hierfür
wurden
B-
Lymphozyten in allen 89 Fällen mit einem monoklonalen Antikörper spezifisch für
CD20 markiert.
Zusätzlich wurden von allen Biopsien mit genügend Paraffinmaterial (74 Fälle)
immunhistochemische Untersuchungen mit einem CD21-spezifischen Antikörper
zur Detektion von B-Lymphozyten und follikulären dendritischen Zellen
durchgeführt.
Die Zahl der interfollikulären CD20+ Lymphozyten wurde ins Verhältnis zur
ausgewerteten Fläche gesetzt. Außerdem wurde in einer zweiten Auswertungsreihe
die Zahl der CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel pro Fläche mittels Diascanner
ausgewertet.
Da die Verteilungskurven für CD20+ Zellen, CD20+ und CD21+ LF keiner
Gausschen
Verteilungskurve
glichen,
wurden
die
Schwellenwerte
zur
Unterscheidung zweier Subgruppen nicht am Median, sondern nach rein optischen
Gesichtspunkten sowie in Abhängigkeit vom besten p-Wert festgelegt. Daraus ergab
sich je eine Gruppe mit vielen oder wenigen B-Lymphozyten bzw. mit vielen oder
wenigen Lymphfollikeln. Nach der Kaplan-Meier-Methode wurde dazu jeweils das
Gesamtüberleben, das rezidivfreie, das zweittumorfreie und das ereignisfreie
Überleben berechnet und mit Hilfe des Logrank-Tests verglichen.
6
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
In
Bezug
auf
Gesamtüberleben
(GSÜ),
rezidivfreies
Überleben
(RÜ),
zweittumorfreies Überleben (2TÜ) sowie ereignisfreies Überleben (EÜ) zeigten
CD20+ B-Lymphozyten keinen prognostischen Einfluss (siehe Abb. 5-8).
Als prognostisch einflussreich stellte sich dagegen die Dichte von CD20+
Lymphfollikeln dar: Eine hohe Anzahl an CD20+ LF korrelierte im HL tendenziell
mit einem verbesserten GSÜ (p=0,065), RÜ (p=0,125), 2TÜ (p=0,155) und EÜ
(p=0,064), wie in Abb. 10-13 dargestellt.
Zur Validierung der Ergebnisse wurden mittels CD21+ Immunhistochemie ebenso
LF im HL detektiert. Die Auswertungsergebnisse für CD20+ LF konnten bei den
untersuchten Parametern GSÜ (p=0,110), RÜ (p=0,253), 2TÜ (p=0,125) und EÜ
(p=0,086) bestätigt werden, wie in Abb. 15-18 gezeigt.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Lymphfollikel im HL sind möglicherweise nicht nur Relikte der ursprünglichen
Lymphknoten-Struktur, sondern können Komponenten einer tumorspezifischen
Immunreaktion darstellen. Die günstige Wirkung der LF basiert vermutlich auf den
darin durch Antigenkontakt ausgelösten Keimzentrumsreaktionen. Dabei kommt es
im Zusammenspiel von follikulären dendritischen Zellen, B-Zellen und THelferzellen über mehrere Reaktionsschritte zur Umwandlung von B-Zellen in
Plasmazellen (PZ), die in der Lage sind, Antikörper gegen Oberflächenantigene von
Zielzellen zu bilden.
Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb eines Tumors ist von Bedeutung,
da sie nicht nur Rückschlüsse auf die Prognose der Patienten liefern, sondern auch
eine Basis für die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren darstellen kann.
7
Abstract
Background and objective
Tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) are generally considered to represent a host
immune response directed against tumor antigens. This notion is underlined by the
prognostic relevance of certain T-cell subsets in various human malignancies. Bcells, by contrast have received little attention. Therefore, this study aims at the
analysis of the prognostic relevance of tumor-infiltrating B-cells in patients with
classical Hodgkin lymphoma (cHL).
Methods
Formalin-fixed and paraffin-embedded tumor biopsies from 89 patients diagnosed
with cHL were available. Paraffin sections were immunostained using a CD20
monoclonal antibody (mAb) for the detection of B-cells (89 cases) and a CD21 mAb
for the identification of follicular dendritic cell meshworks (74 cases).
The number of interfollicular CD20+ cells was evaluated in relation to the area using
a computer-assisted image analysis program. Moreover the numbers of CD20+
and/or CD21+ B-cell follicles were analysed.
Overall survival, disease-free survival, second-tumor-free survival, and event-free
survival were analysed using Kaplan and Mayer statistics, and the curves were
compared by the log-rank test.
Results
Concerning overall survival, disease-free, second-tumor-free and eventfree survival
CD20+ B-cells did not show any prognostic relevance.
By contrast, the density of CD20+ lymph follicles turned out to be prognostically
influential: Large numbers of CD20+ B-cell follicles tended to correlate with a better
orverall survival, disease-free, second-tumor-free and event-free survival. This
result was confirmed by CD21+ immunohistochemistry.
8
Conclusions
These results suggest that in cHL B-cell follicles are not only remnants of the preexisiting lymph nodes, but possibly components of an immune response which is
specific to the tumor.
Thus, in addition to T-cell immunitiy, the humoral immune system may play a more
important role in anti-tumour immunity than hitherto recognised. Knowledge about
local immune responses within a tumor is important as a means to assess patients’
prognoses as well as the basis for the development of immunological therapies.
9
2
Einleitung
2.1 Das Hodgkin Lymphom
Das
Hodgkin
Lymphom
(HL),
auch
als
Morbus
Hodgkin
oder
Lymphogranulomatose bezeichnet, wurde erstmals 1832 vom britischen Arzt
Thomas Hodgkin beschrieben und gehört – zusammen mit der großen Gruppe der
Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) – zu den malignen Lymphomen. Die Gesamtzahl
der Neuerkrankungen liegt in Deutschland bei etwa 2000 pro Jahr. Die Inzidenz
beträgt 2,5 pro 100 000 Einwohner jährlich. Das mittlere Erkrankungsalter liegt um
das 4. Lebensjahrzehnt, wobei Männer und Frauen annähernd gleichmäßig betroffen
sind (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in
Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Ein erster Altersgipfel
findet sich bei jungen Erwachsenen im 3. Lebensjahrzehnt, ein zweiter im 7.
Lebensjahrzehnt.
In frühen Stadien ist das HL auf die Lymphknoten (LK) begrenzt, breitet sich aber
im Verlauf auch hämatogen extralymphatisch aus.
Diagnostiziert wird die Erkrankung laut WHO-Klassifikation histopathologisch
anhand der typischen Hodgkin-/Reed-Sternberg- (HRS-) Tumorzellen, die sich in
geringer Anzahl zwischen vielen nicht-neoplastischen Zellen finden (Küppers et al.,
1998). HRS-Zellen sind oft mehrkernig und entstehen vermutlich durch
Transformation von Keimzentrums-B-Zellen. Aufgrund dessen kann auf HRSZellen die Expression bestimmter Antigene nachgewiesen werden, wobei zu 80%
mehr als ein B-Zellmarker auf der Zelloberfläche anzutreffen ist (Watanabe et al.,
2000).
In
diesem
Zusammenhang
konnten
Janz
et
al.
ein
gewisses
Transdifferenzierungspotential auch reifer lymphatischer Zellen nachweisen: So
kommt es in HRS-Zellen zur Hemmung des Transkriptionsfaktors E2A durch eine
überschießende Expression des aktivierten B-Zell-Faktors 1 und von inhibitor of
differentiation 2 (Id2), was eine Veränderung der Genexpression und einen Verlust
der Expression B-Zell-spezifischer Gene zur Folge hat (Janz et al., 2006).
B-Lymphozyten sind eine Untergruppe der Leukozyten und leiten sich über mehrere
Zwischenstufen von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks ab. Sie sind als
10
einzige Zellen in der Lage Antikörper zu bilden und stellen neben dem 2. Subtyp
von T-Helferzellen (Th2) Bestandteile der humoralen Immunantwort dar. Reife BZellen exprimieren oberflächlich IgM-Rezeptoren für Antigene und zirkulieren im
Blut und den lymphatischen Organen. Beim ersten Antigen-Kontakt und
gleichzeitigem ko-stimulierendem Signal von Th2-Zellen, wandert die B-Zelle in
ein Keimzentrum von Lymphknoten oder Milz, wo sie proliferiert und nach
Differenzierung zur Plasmazelle Antikörper sezerniert. Alternativ kann es auch zu
einer Differenzierung zu Gedächtnis-B-Zellen kommen. Dieser Prozess wird
begleitet von einem Wechsel der Immunglobulin-Klasse und der somatischen
Hypermutation der Immunglobulin-Gene.
Neben den membranständigen Immunglobulinen tragen B-Zellen im Verlauf ihrer
Reifung auf der Oberfläche weitere verschiedene Eiweißstrukturen, die als
Oberflächenmarker für deren Identifizierung von Bedeutung sind. Dazu zählen unter
anderem CD20 und CD21. CD21 markiert neben B-Zellen auch follikuläre
dendritische Zellen (FDZ).
Das histologische Bild des HL variiert aufgrund der Zusammensetzung des Infiltrats
von Tumorzellen, reaktiven Lymphozyten, Histiozyten, Granulozyten und
Fibroblasten und lässt eine Einteilung in zwei große Subtypen zu: nach der WHOKlassifikation von 1997 unterscheidet man das klassische vom nodulären
lymphozytenprädominanten
(nlp)
HL.
Das
klassische
HL
tritt
in
vier
Erscheinungsformen auf: lymphozytenreich (lr), nodulär sklerosierend (ns),
gemischt zellulär (mc, mixed cellularity) oder lymphozytenarm (ld, lymphocyte
depletion).
In Abhängigkeit vom Erkrankungsstadium, Blutbild, Alter und Geschlecht des
Patienten finden sich nach durchgeführter Chemotherapie und/oder Radiatio
progressionsfreie Überlebensraten zwischen 42% und 84% (Hasenclever et al.,
1998). Die Mortalität liegt in Deutschland bei 0,5 Personen pro 100 000 Einwohner
im Jahr (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in
Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Zu den unabhängigen
Faktoren, die die Prognose des Patienten negativ beeinflussen, zählen neben einem
hohen Alter und einem schlechten Allgemeinzustand das Vorhandensein
extranodaler Manifestationen, die in der Ann Arbor-Klassifikation von 1971 erfasst
11
und
in
Abhängigkeit
vom
Befallsmuster
der
Lymphknoten
in
vier
Ausbreitungsstadien unterteilt wurden. Unter B-Symptomatik versteht man das
zusätzliche Vorhandensein der Trias Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust.
2.2 Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender Lymphozyten
Im Hinblick auf die Prognose verschiedener Tumorerkrankungen wurde der Einfluss
tumorinfiltrierender
Lymphozyten
(TIL)
bereits
vielfach
untersucht:
Als
prognostisch einflussreich erwiesen sich diverse TILs beim Ovarial-Karzinom: Hier
korrelierte eine geringe Zahl CD8+ T-Lymphozyten sowie niedrige Quotienten von
CD8+/CD4+ bzw. CD8+/Treg mit einem reduzierten Gesamtüberleben (GSÜ) (Sato
et al., 2005). Auch beim Kolorektalen Karzinom war eine geringe Anzahl CD8+ TLymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (Prall et al., 2004). Beim
Pankreas-Karzinom korrelierte eine starke Infiltration zytotoxischer T-Zellen mit
verlängerten Überlebensraten (Ryschich et al., 2005). Wie Ryschich aber weiter
feststellte, geht die Expression vom humanen Leukozyten-Antigen-System-I (HLAI) im Pankreas-Karzinom allerdings oft verloren, was die Umgehung der
zytotoxischen T-Zell-Infiltration nach sich zieht (Ryschich et al., 2005). Insgesamt
betonen
diese
Untersuchungen
einen
prognostisch
günstigen
Effekt
von
zytotoxischen T-Zellen und einen ungünstigen Effekt regulatorischer T-Zellen.
Demgegenüber finden sich nur vergleichsweise wenige Arbeiten, die die Bedeutung
von tumorinfiltrierenden B-Zellen zum Gegenstand haben. So korreliert die
Infiltration von B-Lymphozyten beim medullären Mamma-Karzinom (Kotlan et al.,
2003 + 2005) und beim großzelligen Lungen-Karzinom (Eerola et al., 1999) mit
einer günstigen Prognose. In diesem Zusammenhang hat Hansen anhand des
medullären Mamma-Karzinoms nachgewiesen, dass B-Lymphozyten als Reaktion
auf ein auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiertes Antigen eine humorale
Immunantwort auslösen, was möglicherweise die Elimination von Tumorzellen
nach sich zieht (Hansen et al., 2002). Nzula konnte beim duktalen MammaKarzinom zahlreiche Mutationen der Immunglobulingene in den infiltrierenden BZellen nachweisen, woraus er ebenfalls auf antigenabhängige Proliferationen und
somatische Hypermutationen der B-Zellen schloss (Nzula et al., 2003).
12
Beim HL dominieren histologisch Th2- und regulatorische T- (Treg-) Zellen. Von
Schreck konnte kürzlich der Zusammenhang zwischen einer Tumorinfiltration mit
Th2-Zellen und einer günstigen Prognose nachgewiesen werden (Schreck et al.,
Hematol Oncol, im Druck: Sabine Schreck, Daniela Friebel, Maike Buettner,
Luitpold Distel, Gerhard Grabenbauer, Lawrence S. Young, Gerald Niedobitek.
Prognostic impact of tumour-infiltrating Th2 and regulatory T cells in classical
Hodgkin lymphoma). Vermutlich wird die für das HL charakteristische
inflammatorische Tumorinfiltration durch die von HRS-Zellen produzierten Chemound Zytokine ausgelöst (Poppema et al., 2000). Diese führen neben einer Th2-ZellInfitration zur Unterdrückung der Th1-Zell-Reaktion. Somit wird die zytotoxische
Immunantwort nicht unterstützt (Poppema et al., 2000).
Des Weiteren konnte beim HL nachgewiesen werden, dass eine geringe Zahl von
Th2-Zellen sowie eine gleichzeitig hohe Zahl regulatorischer T-Zellen (Tregs) mit
einem signifikant reduzierten RÜ korreliert (Schreck et al., submitted, s.o.). Die
lokale Akkumulation von immunsuppressiven Tregs im HL-Gewebe führt zur
Hemmung von Th-Zellen und könnte somit eine mögliche Erklärung dafür sein,
warum HRS-Zellen der antitumoralen Immunität entgehen (Marshall et al., 2004).
Die prognostische Bedeutsamkeit der Th2-Zellen beim HL legt die Vermutung
nahe, dass die humorale Immunität wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit werden
daher die Effektoren der humoralen Immunität, d.h. B-Zellen und B-Zell-Follikel,
untersucht.
Im Gegensatz zum HL wies Carreras bei Follikulären Lymphomen (FL), die zur
großen Gruppe der NHL gehören, einen prognostisch günstigen Einfluss
tumorinfiltrierender Tregs nach (Carreras et al., 2006).
Die lokale Immunantwort bei malignen Tumoren ist somit von Bedeutung für die
Prognostik von Tumorerkrankungen und könnte zukünftig auch als Grundlage für
die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren genutzt werden. Vor diesem
Hintergrund wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss tumorinfiltrierender
interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten sowie CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel
auf die Prognose von Patienten mit Hodgkin-Lymphom untersucht.
13
3
Methoden
3.1 Patientenauswahl
Für die vorliegende Studie standen insgesamt 89 in Paraffin eingebettete Biopsien
von Patienten mit der histopathologischen Diagnose HL zur Verfügung. Die
Diagnose war zwischen 1991 und 2004 gestellt worden. Die Patienten wurden mit
Chemotherapie, Radiatio oder einer Kombination aus beiden behandelt.
Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung betrug das Patienten-Alter zwischen vier und
78 Jahren: Dabei waren 18 Patienten unter 20, 39 zwischen 20 und 40, 16 zwischen
40 und 60 und 15 über 60 Jahre alt.
Bei den 51 männlichen und 38 weiblichen Patienten wurde vor Therapiebeginn das
Stadium der Erkrankung anhand der Ann Arbour-Klassifikation bestimmt: Dem
Stadium 1 mit Befall einer einzigen Lymphknotenregion konnten 18 Patienten
zugeordnet werden, davon zwei mit B-Symptomatik (s.o.). Dem Stadium 2 mit einer
oder mehreren unilateral befallenen Lymphknotenregionen wurden 36 Patienten
zugeordnet, davon 13 mit B-Symptomatik. Bei 20 Patienten hatte die Erkrankung
Stadium 3 mit bilateral befallenen Lymphknotenregionen erreicht, davon sieben mit
B-Symptomatik. Dem Stadium 4 mit diffusem Organbefall wurden 12 Patienten
zugeordnet, die alle B-Symptome zeigten.
Zweittumore entwickelten neun der 89 Patienten.
Für die Auswertung der CD20+ B-Lymphozyten und CD20+ Lymphfollikel wurden
alle 89 Biopsien untersucht. In die Auswertung der CD21+ Lymphfollikel konnten
wegen Materialmangels nur 74 Fälle einbezogen werden.
3.2 Histologie und Immunhistochemie
In Paraffin eingebettete Biopsien wurden nach Herstellung histologischer Schnitte
mit der Biotin-Streptavidin-Komplex Methode immunhistochemisch gefärbt.
Dabei fanden folgende monoklonale Antikörper Verwendung: CD20 (Klon L26,
DakoCytomation, Hamburg, Deutschland) und CD21 (Klon 1F8, DakoCytomation,
14
Hamburg, Deutschland). Der Ablauf der immunhistochemischen Färbungen soll im
Folgenden erläutert werden.
3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode
Nach Entparaffinieren in absteigender Alkoholreihe – zwei mal für jeweils 10
Minuten im Xylolbad, danach jeweils für weitere 2 Minuten in 100%, 90%, 80%
und 70% Alkohol, wurden die Schnitte in Tris-Puffer gestellt und thermisch mittels
Mikrowelle - für jeweils 1 Minute in Citratpuffer (pH 6,0) – vorbehandelt. Nach
nochmaligem Spülen in Tris-Puffer wurden die Schnitte für 1 Stunde mit den
Primärantikörpern inkubiert. Dabei kamen folgende Verdünnungen zur Anwendung:
1:500 (CD20) und 1:100 (CD21). Nach Spülen mit Tris-Puffer und einem Tropfen
Brij wurden die Schnitte für 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper (biotinylierter
anti Maus IgG) in der Verdünnung 1:50 und - nach erneutem Spülen mit Tris-Puffer
- für weitere 30 Minuten mit dem Strept-AB-Komplex Dako K 391 inkubiert. Nach
erneuter Tris-Puffer-Spülung wurden die Schnitte schließlich in der Fast-RedFarbreaktion in 20 Minuten gefärbt. Zur Herstellung des Fast-Red-Gemisches
musste die Reihenfolge der zugegebenen Substanzen genau eingehalten und die
Lösung anschließend filtriert werden: Zu 0,0020g Naphthol-As-Mx-Phosphat
wurden in der nachfolgend genannten Reihenfolge und frühestens 10 Minuten vor
Verwendung gegeben:
N,N Dimethylformamid
0,2ml
0,1m Tris-HCl-Puffer pH 8,6
9,8ml
1m Levamisol
10µl
Fast Red
0,01g
Im Anschluss daran wurden die Schnitte fließend gewässert, in destilliertes Wasser
gestellt und für einige Sekunden mit Hämalaun (VWR) gegengefärbt. Nach
Einstellen in Leitungswasser erfolgte die Eindeckung mit Aquatex (Merck,
Darmstadt, Deutschland).
15
3.3 Auswertungsmethode
Die Auszählung der B-Lymphozyten erfolgte für diese Studie mit Hilfe eines
Standardlichtmikroskops, von dem aus die Bilder durch eine Digitalkamera auf
einen PC übertragen und unter Verwendung eines Bildanalysepogramms (COUNT,
Biomas, Erlangen, Germany) ausgewertet wurden. Für die Auswertung der
Lymphfollikel wurden die Objektträger mittels eines Diascanners eingescannt
(Coolscan 5 ED, Nicon) und ebenfalls unter Verwendung des oben genannten
Bildanalyseprogramms ausgezählt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen exemplarisch
die unterschiedlichen Konzentrationen von CD20+ interfollikulären B-Zellen, die
mittels Standardlichtmikroskop ausgewertet wurden. In Abbildung 3 sind CD20+ LF
dargestellt, die von interfollikulären B-Zellen umgeben sind. Alle Bilder wurden mit
Vergrößerung aufgenommen.
Abb. 1: hohe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten bei
63facher Vergrößerung
16
Abb. 2: geringe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten
bei 63facher Vergrößerung
Abb. 3: Darstellung zweier CD20+ Lymphfollikel bei 40facher
Vergrößerung
Pro Patient wurden für CD20 und CD21 je ein bis zwei exemplarische Ausschnitte
eines histologischen Schnittes ausgewertet. Die durchschnittliche Abweichung
wurde quantitativ erfasst. Zunächst wurde das Verhältnis der untersuchten
Lymphozyten-Subgruppe (CD20) zur Fläche (28,5 mm²) berechnet. Anschließend
17
wurde für CD20 und CD21 die Follikeldichte, d.h. die Anzahl der Lymphfollikel
bezogen auf die individuelle Lymphknotenfläche berechnet.
3.4 Statistik
Mit Hilfe der Kaplan-Meier-Analyse wurden verschiedene Überlebensparameter
untersucht.
Das Gesamtüberleben (GSÜ) errechnete sich aus dem Zeitintervall zwischen der
Diagnosestellung des HL und dem Tod am HL. Das RÜ wurde definiert als das
Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Rezidivs. Das
zweittumorfreie Überleben (2TÜ) wurde definiert als das Zeitintervall zwischen der
Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors. Das EÜ beschrieb das
Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors
oder Rezidivs. Dabei erfolgte die Unterteilung der Patienten in Gruppen mit vielen
oder wenigen CD20+ B-Lymphozyten, vielen oder wenigen CD20+ LF und vielen
oder wenigen CD21+ LF. Da es sich nicht um Gaussche Verteilungskurven handelte,
wurde die Teilung unabhängig vom Median festgelegt. Der Logrank-Test diente
dem Vergleich der jeweiligen Untergruppen.
4
Ergebnisse
Die Auswertung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten sowie der CD20+
bzw. CD21+ LF zeigte bezüglich der ausgewerteten Fläche folgende Ergebnisse:
Die Anzahl der CD20+ B-Lymphozyten lag zwischen 17,6 und 2619,25 pro mm². In
der zweiten Auswertung wurden zwischen 0,0 und 1,69 CD20+ LF pro mm²
ausgezählt. Die Anzahl der CD21+ LF lag im Bereich zwischen 0,0 und 1,43 LF pro
mm².
Für die Dichte der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten ergab sich daraus der im
Folgenden dargestellte Kurvenverlauf. Der Cut-off für die anschließenden KaplanMeier-Analysen wurde nach bestem p-Wert bei 283 Zellen/mm² gezogen (Pfeil).
18
Daraus ergaben sich zwei Patienten-Gruppen mit vielen (n=44) bzw. wenigen
Häufigkeit
(n=44) CD20+ B-Lymphozyten.
12
10
8
6
4
2
0
0
1000
2000
+
Interfollikuläre CD20 Zellen pro mm²
3000
4000
Abb. 4: Dichte-Verteilung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten
Die Infiltrationsdichte interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten zeigte im Hinblick
auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ keinen prognostischen
Einfluss (Abb. 5-8).
19
CD20+ > 283 (n=44): 89%
Gesamtüberleben
CD20+ < 283 (n=44): 81%
p = 0.173
Jahre
Abb. 5: Gesamtüberlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende
CD20+ B-Lymphozyten
CD20+ > 283 (n=44): 87%
Rezidivfreies Überleben
CD20+ < 283 (n=44): 79%
p = 0.518
Jahre
Abb. 6: Rezidivfreies Überleben bezogen auf tumorinfiltrierende
CD20+ B-Lymphozyten
20
Zweittumorfreies Überleben
CD20+ > 283 (n=44): 88%
CD20+ < 283 (n=44): 73%
p = 0.297
Jahre
Abb. 7: Zweittumorfreie Überlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten
Ereignisfreies Überleben
CD20+ > 283 (n=44): 76%
CD20+ < 283 (n=44): 68%
p = 0.577
Jahre
Abb. 8: Ereignisfreie Überlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende CD20+ B-Lymphozyten
21
Das nachfolgende Histogramm stellt die Dichteverteilung der CD20+ Lymphfollikel
dar und wurde bei 0,55 Follikeln/mm² in je eine Untergruppe mit vielen (n=24) bzw.
wenigen (n=65) Lymphfollikeln aufgeteilt (Pfeil).
Häufigkeit
12
10
8
6
4
2
0
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
CD20+ Lymphfollikel pro mm²
Abb. 9: Dichte-Verteilung der CD20+ Lymphfollikel
Bezüglich der Anzahl CD20+ Lymphfollikel korrelierte eine hohe Follikeldichte bei
allen vier Parametern (GSÜ, RÜ, 2TÜ, EÜ) tendenziell mit einer günstigen
Prognose (Abb. 10-13). Die Ergebnisse waren allerdings statistisch nicht signifikant.
22
CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 100%
Gesamtüberleben
CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 82%
p = 0.065
Jahre
Abb. 10: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD20+
Lymphfollikel
Rezidivfreies Überleben
CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 95%
CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 80%
p = 0.125
Jahre
Abb. 11: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD20+ Lymphfollikel
23
Zweittumorfreies Überleben
CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 94%
CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 77%
p = 0.155
Jahre
Abb. 12: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD20+ Lymphfollikel
Ereignisfreies Überleben
CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 90%
CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 66%
p = 0.064
Jahre
Abb. 13: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD20+ Lymphfollikel
24
Das Histogramm in Abb. 14 zeigt die Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel.
CD21 gilt als Marker für B-Lymphozyten und follikuläre dendritische Zellen und
wurde zur Validierung der CD20-Daten verwendet. Der Cut-off in je eine
Subgruppe mit vielen (n=16) bzw. wenigen (n=58) Follikeln erfolgte für die
folgenden Kaplan-Meier-Analysen bei 0,6 Lymphfollikeln/mm² (Pfeil).
Häufigkeit
8
6
4
2
0
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
CD21+ Lymphfollikel pro mm²
Abb. 14: Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel
Eine hohe Dichte an CD21+ LF zeigte tendenziell einen günstigen Einfluss auf die
Prognose von HL-Patienten bezogen auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ
und EÜ (Abb. 15-18). Allerdings waren die Ergebnisse statistisch nicht signifikant.
25
CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 100%
Gesamtüberleben
CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 83%
p = 0.110
Jahre
Abb.15: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD21+
Lymphfollikel
Rezidivfreies Überleben
CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93%
CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 76%
p = 0.253
Jahre
Abb.16: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD21+ Lymphfollikel
Zweittumorfreies Überleben
26
Abb.17: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD21+ Lymphfollikel
Ereignisfreies Überleben
CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93%
CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 67%
p = 0.086
Jahre
Abb. 18: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte
CD21+ Lymphfollikel
27
5
Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde bezüglich der TIL gezeigt, dass CD20+ bzw.
CD21+ Lymphfollikel möglicherweise günstige Prognosefaktoren bei Patienten mit
HL darstellen. Eine hohe Dichte von LF korrelierte tendenziell mit einem
verlängerten GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ. Für die Anzahl tumorinfiltrierender
interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten konnte kein prognostischer Einfluss
nachgewiesen werden.
In vorangegangenen Studien wurde bereits mehrfach der Einfluss verschiedener
tumorinfiltrierender Lymphozyten-Subgruppen untersucht:
Alvaro-Naranjo hat zytotoxische T-Zellen auf deren prognostische Bedeutsamkeit
hin beim HL analysiert: Hier war eine hohe Zahl tumorinfiltrierender TIA-1+
zytotoxischer T-Lymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (AlvaroNaranjo et al., 2005). Auch Oudejans konnte eine starke Infiltration aktivierter
zytotoxischer
T-Zellen,
die
als
Haupteffektorzellen
in
der
Elimination
neoplastischer Zellen gelten, als deutlichen Indikator für einen klinisch ungünstigen
Krankheitsverlauf nachweisen (Oudejans et al., 1997). Als Ursache für die
Unfähigkeit aktivierter zytotoxischer T-Zellen, HRS-Zellen zu lysieren, vermutet
Oudejans die Herabregulation der Haupthistokompatibilitäts-Komplexe-I (MHC-I)
auf der Oberfläche von HRS-Zellen. Somit kann möglicherweise eine Erkennung
der Tumorantigene durch zytotoxische T-Zellen umgangen werden (Oudejans et al.,
1997).
Bezüglich des Einflusses tumorinfiltrierender B-Lymphozyten sind ebenfalls bereits
einige Untersuchungen bei verschiedenen Malignomen durchgeführt worden: Das
medulläre Mammakarzinom zeichnet sich im Vergleich zu den anderen Subtypen
des Mammakarzinoms durch eine größere Zahl tumorinfiltrierender B-Zellen sowie
durch eine bessere Prognose aus. Kotlan erklärte diesen Zusammenhang mit der
spezifischen Tumorantigen-Bindungskapazität der Antikörper von infiltrierenden BZellen (Kotlan et al., 2003).
Die Tatsache, dass der Anzahl der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten in der
vorliegenden Studie kein Einfluss auf die Prognose des HL nachgewiesen werden
konnte, könnte auf eine geringere Fallzahl zurückgeführt werden, insbesondere da
beim HL ohnehin wenige Todesfälle, Rezidive und Zweittumore auftreten. Daher
28
müssen weitere Studien mit höheren Fallzahlen durchgeführt werden, um gesicherte
Aussagen bezüglich des prognostischen Einflusses treffen zu können.
Um die Rolle der LF im Rahmen der humoralen Immunabwehr genauer zu
definieren, wurde in der hier vorliegenden Studie der Einfluss von CD20+ und
CD21+ LF untersucht. Die hierbei gezeigte Tendenz eines verlängerten GSÜ, RÜ,
2TÜ und EÜ derjenigen Patienten, die eine höhere Dichte an CD20+ bzw. CD21+ LF
aufwiesen, kann im Zusammenhang mit den in den LF stattfindenden
Immunreaktionen gesehen werden: Bezüglich der dort vorhandenen follikulären
dendritischen Zellen (FDZ) stellte Alavaikko als erster die Korrelation zwischen
einem positiven FDZ-Status und einer günstigen Prognose dar (Alavaikko et al.,
1994). Baur konnte dieses Ergebnis bestätigen und führte dies auf die Antigenpräsentierenden Eigenschaften der FDZ und die damit verbundene Rolle in der
Aufrechterhaltung der B- und T-Zell-Immunantworten zurück (Baur et al., 1998).
Die Interaktionen zwischen FDZ und Keimzentrums-B-Zellen wurden bereits in
diversen Studien untersucht. Dabei stellte sich das Netzwerk aus FDZ als
Schlüsselstruktur des Keimzentrums dar (Baur et al., 1998).
In der hier vorliegenden Studie konnte bezüglich GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ eine
prognostisch günstige Wirkung von CD20+ LF für HL-Patienten gezeigt werden.
Die Daten wurden anhand CD21+ LF validiert. Dies stützt die Annahme, dass eine
humorale Immunreaktion bei der immunologischen Kontrolle des HL wichtig sein
könnte.
Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb solider Tumoren ist von
Bedeutung, da sie sowohl Rückschlüsse auf die Prognose zulässt als auch eine
Grundlage für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren darstellt. Die
Rolle von LF und interfollikulären B-Zellen in der humoralen Immunreaktion des
HL bleibt weiter zu erforschen. Insbesondere der prognostische Einfluss CD20+ BLymphozyten wurde bisher nur in wenigen Tumormodellen untersucht.
29
6
(1)
Literaturverzeichnis
Alavaikko MJ, Blanco G, Aine R, Lehtinen T, Fellbaum C, Taskinen PJ,
Sarpola A, Hansmann ML (1994) Follicular dendritic cells have prognostic
relevance in Hodgkin's disease Am J Clin Pathol. 101: 761-7.
(2)
Alvaro-Naranjo T, Lejeune M, Salvadó-Usach MT, Bosch-Príncep R,
Reverter-Branchat G, Jaén-Martínez J, Pons-Ferré LE (2005) Tumorinfiltrating cells as a prognostic factor in Hodgkin's lymphoma: a
quantitative tissue microarray study in a large retrospective cohort of 267
patients Leuk Lymphoma. 46: 1581-91.
(3)
Baur AS, Meugé-Moraw C, Michel G, Delacrétaz F (1998) Prognostic
value of follicular dendritic cells in nodular sclerosing Hodgkin's disease
Histopathology. 32(6): 512-20.
(4)
Carreras J, Lopez-Guillermo A, Fox BC, Colomo L, Martinez A,
Roncador G, Montserrat E, Campo E, Banham AH (2006) High numbers
of tumor-infiltrating FOXP3-positive regulatory T cells are associated with
improved overall survival in follicular lymphoma Blood.108: 2957-64.
(5)
Curiel TJ, Coukos G, Zou L (2004) Specific recruitment of regulatory T
cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced
survival Nat Med. 10: 942-9.
(6)
Eerola AK, Soini Y, Paakko P (1999) Tumour infiltrating lymphocytes in
relation to tumour angiogenesis, apoptosis and prognosis in patients with
large cell lung carcinoma. Lung Cancer. 26: 73-83.
(7)
Hansen MH, Nielsen HV, Ditzel HJ (2002) Translocation of an
intracellular antigen to the surface of medullary breast cancer cells early in
apoptosis allows for an antigen-driven antibody response elicited by tumorinfiltrating B cells. J Immunol. 169: 2701-11.
(8)
Hasenclever D, Diel V (1998) A Prognostic Score for Advanced Hodgkin's
Disease. International Prognostic Factors Project on Advanced Hodgkin's
Disease. N Engl J Med. 339: 1506-14.
(9)
Janz M, Dörken B, Mathas S (2006) Reprogramming of B lymphoid cells
in human lymphoma pathogenesis Cell Cycle. 5: 1057-61.
30
(10)
Kotlan B, Simsa P, Foldi J, Fridman WH, Glassy M, McKnight M,
Teillaud JL (2003) Immunoglobulin repertoire of B lymphocytes infiltrating
breast medullary carcinoma Hum Antibodies. 12: 113-21.
(11)
Krebs in Deutschland. 5. überarbeitete, aktualisierte Ausgabe. Gesellschaft
der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. und das RKI.
Saarbrücken, 2006. www.rki.de, 08.11.2007
(12)
Küppers R, Rajewski K (1998) Molecular single-cell analysis of Hodgkin
and Reed-Sternberg cells Annu Rev Immunol. 16: 471-93.
(13)
Marshall NA, Christie LE, Munro LR, Culligan DJ, Johnston PW,
Barker RN, Vickers MA (2004) Immunosuppressive regulatory T cells are
abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma Blood. 103(5):
1755-62.
(14)
Nzula S, Going JJ, Stott DI (2003) Antigen-driven clonal proliferation,
somatic hypermutation, and selection of B lymphocytes infiltrating human
ductal breast carcinomas Cancer Res. 63: 3275-80.
(15)
Oudejans JJ, Jiwa NM, Kummer JA, Ossenkoppele GJ, van Heerde P,
Baars JW, Kluin PM, Kluin-Nelemans JC, van Diest PJ, Middeldorp
JM, Meijer CJ (1997) Activated cytotoxic T cells as prognostic marker in
Hodgkin's disease Blood. 89: 1376-82.
(16)
Poppema S, van den Berg A (2000) Interaction between host T cells and
Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphomas Semin Cancer Biol. 10: 34550.
(17)
Prall F, Dührkop T, Weirich V, Ostwald C, Lenz P, Nizze H, Barten M
(2004) Prognostic role of CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes in stage III
colorectal cancer with and without microsatellite instability Hum Pathol.
35(7): 808-16.
(18)
Ryschich E, Nötzel T, Hinz U, Autschbach F, Ferguson J, Simon I,
Weitz J, Fröhlich B, Klar E, Büchler MW, Schmidt J (2005) Control of
T-cell-mediated immune response by HLA class I in human pancreatic
carcinoma Clin Cancer Res. 11: 498-504.
(19)
Sato E, Olson SH, Ahn J, Bundy B, Nishikawa H, Qian F, Jungbluth
AA, Frosina D, Gnjatic S, Ambrosone C, Kepner J, Odunsi T, Ritter G,
Lele S, Chen YT, Ohtani H, Old LJ, Odunsi K (2005) Intraepithelial
CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell
31
ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer Proc Natl
Acad Sci U S A. 102: 18538-43.
(20)
Watanabe K, Yamashita Y, Nakayama A, Hasegawa Y, Kojima H,
Nagasawa T, Mori N (2000) Varied B-cell immunophenotypes of
Hodgkin/Reed-Sternberg cells in classic Hodgkin's disease Histopathology.
36: 353-61.
32
7
Abkürzungsverzeichnis
CD
Cluster Domain
cHL
klassisches Hodgkin Lymphom
cHLld
lymphozytenarmes cHL
cHLlr
lymphozytenreiches cHL
cHLmc
gemischt-zelluläres cHL
cHLns
nodulär-sklerosierendes cHL
DZ
Dendritische Zellen
EÜ
ereignisfreies Überleben
EZ
Effektorzellen
FDZ
follikuläre dendritische Zellen
FL
Follikuläre Lymphome
GSÜ
Gesamtüberleben
HLA
Humane Leukozyten-Antigene
HRS
Hodgkin-/Reed-Sternberg (-Zellen)
Id2
inhibitor of differentiation 2
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
LF
Lymphfollikel
LK
Lymphknoten
mAB
monoclonal antibody
MHC-Komplex
Haupthistokompatibiltäts-Komplex
NHL
Non-Hodgkin-Lymphom
nlpHL
noduläres lymphozytenprädominantes HL
p
Signifikanz
PZ
Plasmazelle
RÜ
rezidivfreies Überleben
Th
T-Helferzellen
TIL
Tumorinfiltrierende Lymphozyten
Treg
regulatorische T-Lymphozyten
2TÜ
zweittumorfreies Überleben
33
8 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner
Arbeit beigetragen haben.
Hierbei ist an erster Stelle mein Betreuer Prof. Dr. G. Niedobitek zu nennen, der die
Anregung zu dieser Arbeit gegeben hat. Seine fachkundige Unterstützung hat einen
entscheidenden Anteil am erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit.
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr. L. Distel sowohl für die Hilfestellung bei der
Planung dieser Arbeit als auch für die wertvollen Ratschläge während ihrer
Durchführung. Besonders hervorzuheben ist hier seine Bereitschaft zu fachkundigen
Diskussionen.
Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der
Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, diese Arbeit an der
Strahlenklinik anzufertigen.
Des Weiteren danke ich Frau Dr. S. Schreck für ihr beständiges Engagement, sowie
den Mitarbeiterinnen des immunhistochemischen Labors, insbesondere Frau Christa
Winkelmann und Frau Alexandra Schindler, die mir mit ihrer praktischen Erfahrung
stets zur Seite gestanden haben.
Den größten Dank möchte ich meinen Eltern aussprechen, die mich stets unterstützt
haben und ohne die mein Studium in dieser Form nicht möglich gewesen wäre.
34
9
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Eltern:
Geschwister:
Familienstand:
Tegtmeier, Stefanie
03.09.1981
D – Neustadt am Rübenberge
Hans Joachim Tegtmeier
Marion Lorenz-Tegtmeier.
Kai Tegtmeier
ledig
Schulausbildung
1988-1992
1992-1994
1994-2001
2001
Grundschule Bad Nenndorf
Orientierungsstufe Bad Nenndorf
Gymnasium Bad Nenndorf
Abitur
Hochschulausbildung
2001-2003
2003-2007
23.07.–13.12.2007
Zahnmedizinstudium an der Albertus-Magnus Universität zu
Köln
Fortsetzung des Zahnmedizinstudiums an der FriedrichAlexander Universität Erlangen-Nürnberg
Zahnärztliche Prüfung
Beschäftigung
Seit 01.04.2008
Assistenzzahnärztin bei
Dr. med. dent. Chr. Pscherer, 91227 Leinburg