Der Nachweis von Plasmazytoiden Monozyten in der

Aus dem Arbeitsbereich Pneumologie der Medizinischen Klinik und Poliklinik I am
Universitätsklinikum Charitè der Humboldt-Universität zu Berlin
[PDF-Version]
DISSERTATION
Der Nachweis von Plasmazytoiden
Monozyten in der Bronchoalveolären
Lavage - Methodik und klinische
Bedeutung
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae dentariae
(Dr. med. dent.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charitè
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Frau Kirsten Mahlig
geb. am 18.12.1967 in Wriezen
Dekan: Prof. Dr. med. M.Dietel
Gutachter:
1. Prof. Dr. Witt
2. Prof. Dr. Hauptmann
3. PD Dr. Feddersen
eingereicht im Dezember 1998
Datum der Promotion: 12.07.1999
Kurzzusammenfassung
Das primäre Ziel der vorliegenden Studie war es, Zellen der bronchoalveolären Lavage (BAL) mit
Hilfe der monoklonalen Antikörper CD68, CD36, 27E10, G16/1 und RM3/1 bei Rauchern und
Nichtrauchern zu untersuchen.
Es wurde im Verlauf der Untersuchungen ein Zelltyp gefunden, der morphologisch den Lymphozyten ähnlich war und mit den Antikörpern CD68 und CD36 eine starke Reaktion zeigte. Diese
Zellen konnten somit als plasmazytoide Monozyten (PM) charakterisiert werden. Mit der hier
vorliegenden Studie wurde erstmals der Nachweis plasmazytoider Monzyten in der BAL erbracht,
nachfolgend wurde die Abhängigkeit vom Tabakkonsum untersucht.
Das in der Studie untersuchte Patientenkollektiv bestand aus 40 Patienten mit interstitiellen
Lungenerkrankungen und 10 gesunden Kontrollpersonen, 16 davon Raucher und 34 Nichtraucher.
Im Ergebnis ließ sich ein signifikanter Anstieg plasmazytoider Monozyten bei Rauchern
nachweisen. Eine Abhängigkeit von der Art der Erkrankung bestand nicht.
Die Resultate der Studie unterstützen die Hypothese des monozytären Ursprungs der PM und
lassen eine Rolle in T-Zell-vermittelten Immunaufgaben vermuten.
Schlagwörter:
plasmazytoide Monozyten, bronchoalveoläre Lavage, interstitielle
Lungenerkrankung, Rauchen
Abstract
The primary purpose of this study was to describe the expression pattern of the surface antigens
CD68, CD36, 27E10, G16/1 and RM3/1 on bronchoalveolar lavage (BAL) cells of smokers and
nonsmokers.
We found a cell type, morphologically similar to lymphocytes, which showed a strong expression of
the monocyte markers CD68 and CD36. We therefore recognized these cells as plasmacytoid
monocytes (PM). Hereby we report the appearance of PM in the BAL and its dependency of
smoking.
The study was conducted in 40 patients with interstitial lung diseases and 10 normal subjects.
Sixteen patients and normal subjects were smokers and 34 were nonsmokers. There was a
significant increase of PM in the BAL of smokers compared with nonsmokers. However, we could
not find a disease-related increase of PM in the BAL.
Our data support the monocytic origin of PM and suggest an involvement in T-cell-mediated
responses of the lung.
Keywords: plasmacytoid monocytes, bronchalveolar lavage, interstitial lung disease,
smoking
Inhaltsverzeichnis
1
Einführung und Aufgabenstellung
6
1.1
Plasmazytoide Monozyten ( früher: Plasmazytoide T-Zellen)
6
1.2
Interstitielle Lungenerkrankungen (ILD) bei Sarkoidose, systemischer
Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes
8
1.3
Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) bei interstitiellen Lungen-erkrankungen
9
1.4
Aufgaben und Zielstellung der Arbeit
11
2
Patienten und Methoden
12
2.1
Patienten
12
2.2
Bronchoalveoläre Lavage
12
2.3
Aufbereitung der BAL und Herstellung von Zytozentrifugenpräparaten
13
2.4
Darstellung der immunhistochemischen Methode
13
2.4.1
Charakterisierung der verwendeten Antikörper: CD4, CD8, 27E10, G16/1,
RM3/1, CD36 und CD68,KP1
13
2.4.2
15
Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase-Methode (APAAP)
2.5
Auswertung der Präparate
17
2.6
Biostatistische Analyse
17
3
Ergebnisse
19
3.1
Deskription morphologischer Beobachtungen
20
3.2
BAL-Gesamtzellzahl und -Differentialzellbilder
22
3.3
Reaktionen plasmazytoider Monozyten
24
3.3.1
Antigenexpression für CD68,KP1 und CD36 bei interstitiellen
Lungenerkrankungen
24
3.3.2
Reaktionen lymphoider Zellen mit den entzündungsassoziierten Antikörpern
27E10,G16/1 und RM3/1
25
3.3.3
25
Rauchen und Antigenexpression
3.4
Charakterisierung der Alveolarmakrophagen mit den Antikörpern CD4,
27E10, G16/1, RM3/1, CD36 und CD68,KP1
28
3.4.1
Vergleich der Antigenexpression in Abhängigkeit von der Art der
Erkrankung und der Therapie mit Glukokortikoiden
28
3.4.2
28
Rauchen und Antigenexpression
3.5
Charakterisierung der Lymphozytensubpopulationen
30
4
Diskussion
31
5
Zusammenfassung
35
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Indikationen der BAL bei Sarkoidose, SSc und SLE
10
Tabelle 2: Zusammenfassende Übersicht der verwendeten Antikörper
15
Tabelle 3: Gesamtzellzahl in der BAL
22
6
Tabelle 4: Gesamtzellzahl in der BAL bei Rauchern und Nichtrauchern (Zellen x 10 /ml)
22
Tabelle 5: BAL-Differentialzellbilder bei Sarkoidose, SSc und SLE (in % der Gesamtzellzahl)
23
Tabelle 6: Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl bei Rauchern und Nichtrauchern (in %
der Gesamtzellzahl)
23
Tabelle 7: Anteil der lymphozytenähnlichen Zellen, der mit den entzündungsassoziierten
Antikörpern 27E10, G16/1 und RM3/1 positiv reagiert (in % aller lymphoider Zellen)
25
Tabelle 8: Antigenexpression auf PM bei Rauchern und Nichtrauchern unter Verwendung von
CD68,KP1, CD36, 27E10, G16/1 und RM3/1.
26
Tabelle 9: Antigenexpression bei Sarkoidose, Sklerodermie und SLE (Angaben in % aller
Makrophagen) bei Reaktion mit CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, CD68
28
Tabelle 10: Antigentragende Alveolarmakrophagen (in % aller Makrophagen) bei Rauchern und
Nichtrauchern bei Reaktion mit CD4, 27E0, G16/1, RM3/1 und CD68
29
Tabelle 11: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Sarkoidose, SSc, SLE (in % der
Gesamtlymphozytenzahl)
30
Tabelle 12: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern ( in % der
Gesamtlymphozytenzahl)
30
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prinzip der APAAP-Methode
16
Abbildung 2: Lichtmikroskopisches Bild des Zytozentrifugenpräparates von BAL-Zellen unter
Verwendung des Antikörpers CD68, KP1. Starke Reaktion der plasmazytoiden Monozyten
(Pfeile), keine morphologischen Unterschiede zu Lymphozyten. Ebenfalls starke Reaktion der
meisten Makrophagen. 160-fache Vergrößerung.
20
Abbildung 3: Monoklonaler Antikörper G16/1: Antigen-Antikörperreaktion mit einigen
Makrophagen. Keine Reaktion mit Lymphozyten, mit Ausnahme zweier größerer
lymphozytenähnlicher Zellen (Pfeile): plasmazytoide Monozyten. 160-fache Vergrößerung. 21
Abbildung 4: Anteil 27E10-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der
Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern 26
Abbildung 5: Anteil G16/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der
Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern 27
Abbildung 6: Anteil RM3/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Lymphozytenpopu-lation bei
Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern
27
Verzeichnis der Abkürzungen
AM
Alveolarmakrophagen
AMDGF
Alveolarmacrophage derived growth factor
APAAP
Alkalische Phosphatase anti-alkalische Phosphatase
BAL
Bronchoalveoläre Lavage
FKS
foetales Kälberserum
IL
Interleukin
ILD
Interstitielle Lungenerkrankung
KM
Knochenmark
LA
Lymphadenitis
LK
Lymphknoten
PBS
Phosphate buffered saline
PM
Plasmazytoide Monozyten
PMN
Polymorphkernige Neutrophile
PTZ
Plasmazytoide T-Zellen
RSA
Rinderserumalbumin
SLE
Systemischer Lupus erythematodes
SSc
Systemische Sklerodermie
TNF
Tumornekrosefaktor
1
Einführung und Aufgabenstellung
1.1
Plasmazytoide Monozyten ( früher: Plasmazytoide T-Zellen)
In vorliegender Studie wurden mit Hilfe der Antikörper CD68,KP1 und CD36 plasmazytoide
Monozyten in der BAL detektiert. Das bisher bekannte Wissen zu diesen Zellen wird im folgenden
Abschnitt dargestellt.
1958 wurden von LENNERT und REMMELE erstmals sogenannte "Lymphoblastennester" in
menschlichen Lymphknoten bei unspezifischer Lymphadenitis beschrieben. In späteren
Untersuchungen wurden die in diesen Nestern enthaltenen Zellen als morphologisch einförmige
Zellen mit rundem bis ovalen Kern, deutlichem Nucleolus und bei Giemsa-Färbung graublauem,
mäßig breitem, scharf begrenztem Zytoplasma beschrieben (62). Die "Lymphoblastennester"
standen in deutlicher Beziehung zu Venolen und Intermediärsinus. Ultrastrukturell zeigten die
Zellen einen 12µ großen Kern, einen kleinen runden Nucleolus und ein feingranuläres
Chromatingerüst. Das reichlich vorhandene endoplasmatische Retikulum deutete auf eine
sezernierende Tätigkeit dieser Zellen hin, als Sekretionsprodukt wurden Immunglobuline vermutet.
Freie Ribosomen und Mitosen fehlten fast vollständig. Daraus wurde geschlußfolgert, daß es sich
um einen ausdifferenzierten Zelltyp handelte (62).
Aufgrund ihrer Lokalisation in den T-Zonen der Lymphknoten (91), der Expression einiger Tassoziierter Antigene (63, 70, 40) und ihres Gehaltes an rauhem endoplasmatischem Retikulum
wurden die Zellen mit dem Begriff "plasmazytoide T-Zellen" (PTZ) charakterisiert.
Zunächst fand man die PTZ in 14 % aller unspezifischen Lymphadenitis-Fälle (91), wobei zervikale
Lymphknoten jüngerer Patienten besonders häufig betroffen waren. Es wurde vermutet, daß eine
Beziehung zwischen den PTZ und Virusinfektionen des unteren Respirationstraktes bestehen
könnte. Darüberhinaus wurden die Zellen häufig bei Lymphadenitiden infolge von Toxoplasmose,
Röteln und frischer Tuberkulose gefunden, und außer in Lymphknoten in Tonsillen, Thymus und
Haut nachgewiesen (91). Facchetti und Mitarbeiter (1991) fanden plasmazytoide Zellen in 90% der
von ihnen untersuchten reaktiven Lymphknoten. Sie zogen daraus den Schluß, daß diese Zellen
Teil des normalen Lymphknotenparenchyms sein müßten. Dabei traten die Zellen einzeln, als lose
Aggregate oder als Zellhaufen in Erscheinung.
In späteren Publikationen wurden maligne Lymphome beschrieben, die aus plasmazytoiden TZellen bestanden (63, 70, 7, 50; 14, 29, 3). Die Symptomatik war bei allen betroffenen Patienten
ähnlich: starker Gewichtsverlust, Asthenie, generalisierte Lymphadenopathie und eine sehr kurze
Überlebenszeit nach Diagnosestellung (im Höchstfall 15 Monate). Besonders bemerkenswert war
dabei, daß alle Patienten eine akute oder chronische myeloische Leukämie entwickelten. Die lichtund elektronenmikroskopischen Eigenschaften der Zellen in diesen Untersuchungen stimmten mit
den bereits erwähnten, von MÜLLER-HERMELINK et al. (1973) beschriebenen überein.
Die Resultate der immunhistochemischen Untersuchungen plasmazytoider T-Zellen sind sehr
unterschiedlich und z.T. widersprüchlich. Gemeinsames Ergebnis aller Studien ist die Negativität
der Zellen für B-Zell-Marker. MÜLLER-HERMELINK und Mitarbeiter (1983) fanden positive
Reaktionen für einige T-Zell Marker (OKT 4, Leu-1, Lyt-2) und für HLA-DR, und negative für OKT8
(zytotoxische T-Zellen) und OKT11 (Schaferythrozyten-Rezeptor). Sie schlossen daraus, daß die
PTZ zur Gruppe der aktivierten T-Helfer-Zellpopulation gehören könnten, die den
Schaferythrozyten-Marker während ihrer Proliferation verloren hätten. Es wurde keine Reaktion mit
Monozyten-/ Makrophagen-spezifischen Antikörpern beobachtet. Im Unterschied dazu beschrieben
PRASTHOFER und Kollegen (1985) positive Reaktionen der PTZ mit Antikörpern, die den
Schaferythrozyten-Marker detektieren, doch Negativität für HLA-DR. T4 (entspricht CD4) ergab
ebenso positive Reaktionen wie T9 (entspricht CD71) und T10 (CD38). Eine regulatorische Rolle
der PTZ bei der Myeloidzellproliferation wurde von den Autoren vermutet.
Die 1986-1992 publizierten Untersuchungen zeigen eine große Heterogenität, vor allem in Bezug
auf die nunmehr beschriebenen Reaktionen der PTZ mit Monozyten-/ Makrophagen-spezifischen
Markern. Die T-Zell Marker waren bis auf CD4 und z.T. CD5 meist negativ. Nur CALDWELL und
Mitarbeiter (1990) beschrieben positive Reaktionen auch für CD3, CD7, CD1 und CD2. Einige
CD2+ PTZ wurden auch von anderen Autoren gefunden (50, 3).
Plasmazytoide T-Zellen exprimieren laut Literaturangaben folgende Monozyten-/ MakrophagenMarker:
-CD68-KP1 (26, 29, 10, 34, 50, 3)
-Ki-M6, Ki-M7, EBM 11, und Y1/82A, die alle das CD68-Molekül detektieren (26, 29, 40, 92,
22, 34).
-CD36 (7, 8, 50, 29)
-CD14 (7, 8, 3)
-CD15 (7, 8, 29)
-CD31 (50)
Übereinstimmend positive Ergebnisse in den aufgeführten Studien gab es für HLA-DR, CD45 und
CD71 (Transferrin-Rezeptor) und Negativität für CD25 (IL-2-Rezeptor). Weniger als 2% der
plasmazytoiden Zellen trugen das Ki-67-Antigen (50, 29, 63), was auf eine geringe
Proliferationsrate schließen ließ.
Interleukin 2 ist für T-Zellen die Voraussetzung zur Ausprägung des Transferrinrezeptors. Da
plasmazytoide T-Zellen ein IL-2 negatives, CD71-positives Profil aufwiesen, zogen BEISKE und
Kollegen (1986) die Möglichkeit in Betracht, daß die PTZ den Transferrinrezeptor anlagebedingt
besitzen könnten, etwa wie die Makrophagen. Der Nachweis Makrophagen-assoziierter Antigene
auf den PTZ bei fehlender Reaktion mit T-Zell-typischen Antikörpern ließ einige Autoren zu dem
Schluß gelangen, daß der Ursprung dieser Zellen in der Makrophagen/Monozyten-Linie zu suchen
sei (50, 3). FACCHETTI und Kollegen (1990) schlugen deshalb die Bezeichnung "plasmazytoide
Monozyten" (PM) vor, die sich in der Literatur durchgesetzt hat.
BEISKE et al. führten 1987 Untersuchungen an PM-angereicherten Tumorzellsuspensionen aus
Knochenmark- und Lymphknoten-Bioptaten ihres 1986 beschriebenen Falles durch. Sie stellten
fest, daß es in Zytozentrifugenpräparaten keinen morphologischen Unterschied zwischen den PM
und anderen runden lymphoiden Zellen gab. Das antigene Profil stimmte mit dem der ersten
Untersuchung überein. Darüberhinaus wurde festgestellt, daß sich 95% der plasmazytoiden Zellen
in der G0/G1-Phase des Zellzyklusses befanden, und daß es bei in vitro Stimulation unmöglich
war, die PM aus dieser Phase herauszutriggern. Die Autoren folgerten, daß plasmazytoide
Monozyten eine ausdifferenzierte Zellart darstellen.
Außer den beschriebenen Fällen konnten plasmazytoide Monozyten nachgewiesen werden: in
einigen axillären Lymphknoten bei Mammakarzinom (40), in reaktiven Lymphknoten bei PiringerKuchinka-Lymphadenitis und Sarkoidose (27), im Haut-assoziierten Lymphgewebe bei
lymphozytärer Infiltration Jessner (28) und bei gutartigen dermalen lymphoiden Hyperplasien (22).
Auch in diesen Untersuchungen stellten die Autoren die Hypothese auf, daß die plasmazytoiden
Monozyten eher von den Monozyten/Makrophagen als von T-Lymphozyten abstammen (27, 22,
34). Die unterschiedliche Ausprägung einiger und das Fehlen anderer Monozyten-/Makrophagenspezifischer Marker könnte gegen diesen Ursprung sprechen. Es ist jedoch hinreichend bekannt,
daß sich die Makrophagenpopulation selbst sehr heterogen bezüglich Funktion und Oberflächenphenotyp darstellt (15).
Da die plasmazytoiden Zellen in regional enger Beziehung zu den T-Lymphozyten stehen und
Ähnlichkeiten mit Makrophagen hinsichtlich ihres antigenen Profils haben, wurde die Hypothese
aufgestellt, daß plasmazytoide Monozyten ähnliche Funktionen erfüllen wie die Makrophagen
selbst. Ihre Aufgabe könnte die Antigenpräsentation bei T-Zell-vermittelten Immunaufgaben sein
(27). Denkbar ist ebenso die direkte Aktivierung und Proliferation von T-Zellen über einen
unbekannten Mediator (22).
1.2
Interstitielle Lungenerkrankungen (ILD) bei Sarkoidose, systemischer
Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes
Die vorliegende Untersuchung erfolgte anfangs mit der Aufgabenstellung, Unterschiede in der
Antigenexpression
von
Alveolarmakrophagen
und
Lymphozyten
bei
interstitiellen
Lungenerkrankungen zu untersuchen. An dieser Stelle sollen einige einführende Worte zu
Sarkoidose, systemischer Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes erfolgen, da die
Patienten dieser Studie aus diesen Erkrankungsgruppen rekrutiert und die ursprünglich geplanten
Untersuchungen auch durchgeführt wurden.
Sarkoidose, systemische Sklerodermie und systemischer Lupus erythematodes sind
Systemerkrankungen, die sich häufig an der Lunge manifestieren. Sarkoidosepatienten zeigen zu
90% Lungenbeteiligung (37), bei der systemischen Sklerodermie sind es 70% (96). Die Angaben
zur Häufigkeit der Lungenmanifestation bei SLE differieren von 3% in klinischen (24) bis zu 68% in
Autopsiestudien (36).Die häufigste interstitielle Lungenerkrankung ist die pulmonale Sarkoidose.
Darüberhinaus
spielen
interstitielle
Lungenerkrankungen
bei
den
genannten
Autoimmunkrankheiten des rheumatischen Formenkreises eine Rolle.
Die Ätiologie der hier zu besprechenden Krankheiten ist nicht vollständig geklärt, wahrscheinlich
spielen genetische und exogene Faktoren im Sinne einer Immunmodulation eine Rolle (80).
In der Aufklärung der Immunpathogenese sind in den letzten Jahren entscheidende Fortschritte
erzielt worden, nicht zuletzt durch die Technik der bronchoalveolären Lavage.
Physiologischerweise sorgt ein fein abgestimmtes immunologisches System dafür, daß inhaliertes
Antigen
durch
die
Alveolarmakrophagen
downreguliert
wird.
Eine
verringerte
Antigenpräsentationsfähigkeit
der
Alveolarmakrophagen
und
eine
Senkung
der
Lymphozytenproliferation durch Prostaglandine spielen dabei unter anderem eine Rolle (78)
Störungen in diesem System können den interstitiellen Krankheitsprozess auslösen und
letztendlich zur Lungenfibrose führen.
Die pathogenetisch bedeutsamen Vorgänge scheinen für die Sarkoidose, die SSc und den SLE
ähnlich zu verlaufen. Ausgangspunkt des interstitiellen Krankheitsprozesses ist eine Alveolitis, an
deren Entstehung Alveolarmakrophagen und T-Lymphozyten maßgeblich beteiligt sind (73, 35, 72,
82). Sowohl für die Sarkoidose als auch für die Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises
wird postuliert, daß die aus unbekannter Ursache aktivierten Alveolarmakrophagen Interleukin-1
und Tumornekrosefaktor (TNF) und die ebenfalls aktivierten T-Lymphozyten Interleukin-2 und γInterferon produzieren. Es resultiert eine Entzündungsreaktion, die die weitere Aktivierung und
Proliferation von Makrophagen und Lymphozyten nach sich zieht, Chemotaxis und
Monozyteninflux bewirkt und sich schließlich als Alveolitis darstellt (64).
Die hauptsächlich durch das γ-Interferon der T-Zellen aktivierten Alveolarmakrophagen setzen bei
interstitiellen Lungenerkrankungen spontan Fibronectin und den Alveolarmakrophagen-abhängigen
Wachstumsfaktor (AMDGF) frei, was zur Fibroblastenproliferation führt und damit der Fibrose
Vorschub leistet (73, 82, 9, 77). Darüberhinaus spielt die Aktivierung der Fibroblasten durch die
Zytokine und Wachstumsfaktoren der T-Helferzellen eine Rolle (38).
Neben diesen Prozessen gibt es krankheitsspezifische Mechanismen, die die immunologischen
Veränderungen an der Lunge beeinflussen:
Alveolarmakrophagen
von
SarkoidosePatienten
zeigen
eine
erhöhte
Antigenpräsentationsfähigkeit (84, 78), die mit der verstärkten HLA-DR-Expression erklärbar sein könnte
(89, 45). Eine vergrößerte Anzahl neu aus Blutmonozyten rekrutierter Makrophagen kommt als
weitere Ursache in Betracht (78). Tatsächlich exprimieren Sarkoidose-Makrophagen mehr
Monozytenmarker als normale Alveolarmakrophagen, was für einen Monozyteninflux aus den
Lungenkapillaren spricht (73, 4). Nach Aktivierung und Umwandlung der Makrophagen in
Epitheloidzellen bilden diese die Sarkoidosegranulome. Somit verläuft der pathogenetische Prozeß
der Sarkoidose vom Initialstadium der Alveolitis über die Granulombildung zur Lungenfibrose (65)
Bedeutsam in der Pathogenese der systemischen Sklerodermie sind die aktivierten T-Helferzellen.
Sie stimulieren die B-Zellen polyklonal, woraus die Bildung größerer Mengen an Autoantikörpern
resultiert (38). Außerdem erfolgt aus den Granulozyten, die bei der SSc in den pulmonalen
Geweben vermehrt vorhanden sind, die Freisetzung von Sauerstoff-Radikalen, die die
Basalmembran zusätzlich schädigen (35).
Im Zentrum der Abweichungen des Immunsystems beim SLE steht die erhöhte B-Zellaktivität, die
daraus folgende Überproduktion von Autoantikörpern und die Entstehung von Immunkomplexen
(80). Der Antikörperproduk-tion durch B-Zellen geht auch hier eine erhöhte T-Zellaktivität voraus
(81). Die Ablagerung der Immunkomplexe in der Lunge und die Aktivierung der
Alveolarmakrophagen durch diese Komplexe werden als Mechanismen zur Pathogenese der
interstitiellen Lungenbeteiligung bei SLE diskutiert (97).
Die Veränderungen am Lungenparenchym, insbesondere die Fibrosierung, führen zur
Ventilationsstörung mit Einschränkung der Vitalkapazität, zur Verringerung der Lungencompliance
und zur Beeinträchtigung des Gasaustausches aufgrund einer O2-Diffusionsstörung (6, 61).
Klinisch imponieren diese Störungen als zunehmende Belastungsdyspnoe.
Die Entzündung als wesentlicher pathologischer Prozeß läßt sich therapeutisch mit Hilfe von
Kortikosteroiden beeinflussen. Sie sind in vielen Fällen Mittel der Wahl in der medikamentösen
Therapie der chronisch-fibrosierend verlaufenden Erkrankungen aufgrund ihrer hemmenden
Wirkung auf die Fibroblastenproliferation und -aktivität, der Abnahme der Lymphozytenzahl und der
Hemmung der Phagozytose.
Die akute Sarkoidose mit hohen CD4/CD8-Quotienten verläuft auch ohne Therapie häufig rasch
regredient (74), eventuell sind hier nichtsteroidale Antiphlogistika indiziert. Progressive klinische
Verläufe der Sarkoidose und auch der Autoimmunerkrankungen SSc und SLE sind Indikationen für
die systemische Steroidtherapie (73, 97). Ziel dieser Therapie bei den Sarkoidosepatienten ist die
Einleitung der Remission und die Verhinderung von irreversiblen Organschäden (52). Die
Kortikoidtherapie der systemischen Sklerodermie bewirkt eine Verbesserung der
Lungenfunktionsparameter (77) und der Symptome Arthritis und Myositis (57), diese Therapieziele
bestehen in gleicher Form beim SLE.
Ein effektives Therapiemonitoring erfordert geeignete Parameter, die mit der Entzündungsaktivität
korrelieren. Die Lymphozytenzahl und die CD4/CD8-Ratio in der BAL sind Entzündungsparameter
der Sarkoidose (73). Zur Beurteilung der Therapieeffizienz des SLE werden häufig die Besserung
der Symptomatik und der Autoantikörpertiter herangezogen. SÖNNICHSEN, AUDRING und
BARTHELMES (1993) schlugen vor, ausgehend von der Pathogenese der Erkrankung die Aktivität
der T-Zellen zur Erfassung einer erneuten Exazerbation der Krankheit zu bestimmen. Aufgrund der
Ähnlichkeit der immunologischen Abweichungen wäre dies auch für die SSc vorstellbar.
1.3
Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) bei interstitiellen Lungenerkrankungen
Die bronchoalveoläre Lavage ist eine bronchoskopische Methode, mit deren Hilfe Material aus den
peripheren Atemwegen und den Alveolen gewonnen wird. Obwohl invasiv, ist diese Technik nur
mit einem geringen Risiko behaftet und kann deshalb bei fast allen Patienten durchgeführt werden
(59, 78). Die Indikation ist bei allen unklaren interstitiellen Lungenveränderungen, bei HIVinfizierten Patienten mit pulmonalen Infiltraten zum Erregernachweis und zur Aktivitätsbeurteilung
und Therapieoptimierung bei ätiologisch bereits geklärten interstitiellen Erkrankungen gegeben
(20).
Die BAL wird in Lokalanästhesie mit dem Fiberbronchoskop im Mittellappen durchgeführt, indem
100ml einer physiologischen Kochsalzlösung instilliert und anschließend wieder aspiriert werden
(17). Das so gewonnene Material wird im Labor zu Zytopräparaten weiterverarbeitet und
hinsichtlich der Zellzahl, der prozentualen Anteile der Zellen und eventueller Besonderheiten, wie
z.B. Hinweise auf eine alveoläre Lipoproteinose die zu einer milchigen Trübung der Lavage führt
(46), ausgewertet. Die von der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Tuberkulose 1988
vorgeschlagenen Normwerte für das BAL-Differentialzellbild lauten: Lymphozyten bis 15%,
Neutrophile bis 3%, Eosinophile bis 0,5%.
COSTABEL und Mitarbeiter (1985) geben ähnliche Werte an: 88-96% Makrophagen, unter 13%
Lymphozyten, unter 3% Granulozyten, Gesamtzellzahl 7 ! 3 Mill. Zellen/ml.
Neben ihrer klinischen Bedeutung spielt die BAL in der Erforschung pulmonaler
Krankheitsprozesse eine wesentliche Rolle (46). Es sind sehr viele Untersuchungen bekannt
geworden, in deren Ergebnis zelluläre, biochemische und immunologische Veränderungen in der
BAL bei Sarkoidose, SSc und SLE dargestellt ( 6, 35, 77, 97, 48, 82, 73, 74)
Die Erhöhung der Lymphozytenzahl und die Erhöhung des CD4/CD8-Quotienten hat Eingang in
die Diagnostik und Verlaufskontrolle der Sarkoidose gefunden (18, 73). Die akute Form der
Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine T-Helferzellreiche Alveolitis mit einem CD4/CD8Quotienten >3,5 (80). Die T-Zellen stellen mit 88% in der normalen BAL und mit 95% in Lavagen
von Sarkoidose-Patienten den größten Anteil der Lymphozyten (73). HOOGSTEDEN et al. (1989)
und STRIZ et al. (1993) wiesen nach, daß Alveolarmakrophagen bei Sarkoidose verstärkt die
Monozytenmarker CD13 und CD14 exprimieren, was den Monozyteninflux aus dem Blut beweist.
Der Nachweis der Lungenbeteiligung bei der SSc erfolgt durch pulmonale Diagnostik und die BAL,
da extrapulmonale Manifestationen keine Rückschlüsse auf eine Alveolitis zulassen (96). Die
Alveolitis ist charakterisiert durch eine hyperzelluläre BAL-Flüssigkeit mit Vermehrung der
eosinophilen und neutrophilen Granulozyten und der Lymphozyten (77, 5). Darüberhinaus besitzt
die BAL bei der systemischen Sklerodermie prognostische Relevanz, da ein Zusammenhang
zwischen dem Gehalt an Entzündungszellen der BAL und einer Verschlechterung der
Lungenfunktion im weiteren Krankheitsverlauf besteht (5). Außerdem kann die Krankheitsaktivität
mit Hilfe der BAL-Kollagenase reflektiert werden (49). ROSSI und Mitarbeiter (1985) wiesen nach,
daß Alveolarmakrophagen bei Sklerodermie verstärkt Fibronectin und AMDGF freisetzen und
dadurch die Fibroblastenproliferation stimulieren.
Das BAL-Differentialzellbild von SLE-Patienten ist ebenso wie das der SSc-Patienten durch eine
lymphozytäre Alveolitis charakterisiert (35). Während die Lymphozytose für eine gute Prognose
spricht, kennzeichnet eine Neutrophilie und Eosinophilie in der BAL ungünstige Verläufe (97), so
daß der BAL auch beim SLE prognostische Bedeutung zukommt. Die T-Helferzellen sind
gegenüber den T-Suppressorzellen geringfügig erhöht (35, 97). Als Ausdruck der Aktivierung der
BAL-T-Zellen ist die HLA-DR-Expression auf CD4+- und CD8+-Lymphozyten erhöht (35).
In der vorliegenden Arbeit wurden Lavagen von Patienten mit Sarkoidose, systemischer
Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes ausgewertet. Die BAL ist für diese
Erkrankungen in folgenden Fällen indiziert (Tabelle.1):
Tabelle 1: Indikationen der BAL bei Sarkoidose, SSc und SLE
Sarkoidose
-zur Diagnostik und Aktivitätsbestimmung
Differentialzellbild und der CD4/CD8-Ratio (18)
der
Erkrankung
mittels
-zur Krankheitsverlaufskontrolle und Therapieüberwachung anhand der
Entwicklung des CD4/CD8-Quotienten (73)
SSc
-zur Aktivitätsbestimmung der Erkrankung
-zur prognostischen Beurteilung der Erkrankung (49)
SLE
-bei Infektionshinweisen
-bei Hinweisen auf eine alveoläre Hämorrhagie
-zur Diagnostizierung einer Alveolitis (97)
1.4
Aufgaben und Zielstellung der Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Alveolarmakrophagen und Lymphozyten aus der
bronchoalveolären Lavage mittels entzündungsassoziierter monoklonaler Antikörper (27E10,
G16/1, RM3/1) und der Antikörper CD4, CD8, CD36 und CD68,KP1 bei interstitiellen
Lungenerkrankungen zu charakterisieren. Dabei sollten krankheitsspezifische Unterschiede und
der Einfluß des Rauchens untersucht und mit Hilfe des Antikörpers RM3/1 der Einfluß einer
Glukokortikoid- Therapie auf die Antigenexpression ermittelt werden.
Im Verlauf der Untersuchung wurden lymphozytenähnliche Zellen beobachtet die mit dem
Makrophagenmarker CD68,KP1 eine deutliche Reaktion zeigten. Folglich sind diese Zellen in die
Gruppe der in der Lunge bisher nicht beschriebenen plasmazytoiden Monozyten (früher
plasmazytoide T-Zellen) einzuordnen.
Plasmazytoide Monozyten konnten somit erstmalig in der BAL nachgewiesen werden. Die weiteren
Untersuchungen konzentrierten sich dann auf diese Zellen. Zunächst wurde mit einem zweiten
Antikörper (CD36) das Vorhandensein plasmazytoider Monozyten bestätigt. Anschließend wurde
die Antigenexpression auf diesen Zellen in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung und des
Tabakkonsums bestimmt, unter der Fragestellung, ob die PM für interstitielle Lungenerkrankungen
pathognomisch sind und welchen Einfluß das Rauchen auf diese Zellen hat.
2
Patienten und Methoden
2.1
Patienten
Das untersuchte Kollektiv umfaßte 50 Patienten: Sarkoidose - 19 Patienten (2 akute Fälle mit
CD4/CD8>3,5), SSc - 17 Patienten, SLE - 4 Patienten, Kontrollgruppe (4 extrapulmonale Tumoren
zur Primärtumorsuche, 2 Patienten mit unklarem Rundherd links, 2 Patienten mit Asthma
bronchiale- z.Z. der Untersuchung ohne Glukokortikoidtherapie und 2 lungengesunde PatientenIndikation:Karzinophobie) - 10 Patienten.
Die Diagnosestellung des SLE erfolgte unter Berücksichtigung der Kriterien der American
Rheumatism Association (ARA, 85.). Die SSc wurde nach den Kriterien der Arbeitsgemeinschaft
Dermatologische Forschung diagnostiziert (51). Die Kriterien zur Diagnose der Sarkoidose wurden
von der World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders formuliert: "Die
Diagnose kann gestellt werden, wenn klinische und/oder radiologische Zeichen vorliegen, die mit
einer Sarkoidose vereinbar sind, die Diagnose durch den Nachweis der charakteristischen, nicht
verkäsenden, epitheloidzelligen Granulome gestützt wird und andere Erkrankungen mit
Sarkoidose-ähnlichen Gewebsreaktionen ausgeschlossen sind" (52). Dementsprechend wurde die
Diagnose in der Synopsis der klinischen, paraklinischen und BAL-Befunde gestellt.
Charakterisierung des Krankengutes:
1. Durchschnittsalter (Angaben Mittelwert ! SD):
Gesamtkollektiv:
45,4 ! 16,3; Sarkoidose: 39,6 ! 17,2; SSc: 50,0 ! 12,6; SLE: 44,0 ! 15,1
Kontrollgruppe: 43,0 ! 12,4.
2. Geschlechtsverteilung:
Gesamtkollektiv: 18 m/32 w, Sarkoidose: 12 m/7 w, SSc: 2 m/15 w, SLE: 4 w, Kontrollgruppe: 4
m/6 w.
3. Tabakkonsum:
Gesamtkollektiv: 16 R/34 NR, Sarkoidose: 5 R/14 NR , SSc: 6 R/11 NR, SLE: 1 R/3 NR,
Kontrollgruppe: 4 R/6 NR
4. Prednisolontherapie (max. 15mg/d):
Gesamtkollektiv: 15 Patienten, Sarkoidose: 2 Patienten, SSc: 9 Patienten, SLE. 4 Patienten
2.2
Bronchoalveoläre Lavage
Die bronchoalveoläre Lavage wurde mit dem Fiberbronchoskop (FB18x bzw. 19x, Fa. Pentax,
Japan) in Lokalanästhesie durchgeführt. Die Patienten erhielten als Prämedikation 0,5-1mg
Atropin, zur Hustenstillung zusätzlich Hydrocodon.
Die BAL erfolgte bei allen Patienten im Mittellappen der Lunge. Das Bronchoskop wurde soweit in
die Peripherie eingeführt, bis das Bronchiallumen durch die Instrumentenspitze abgedichtet war,
um das Aspirieren zu ermöglichen (sogenannte "Wedge-Position“ ) . Durch den Instrumentierkanal
des Bronchoskops wurden 150 ml sterile physiologische Kochsalzlösung (37°C), in Portionen zu je
20 ml instilliert, und mit derselben Spritze bei geringem Unterdruck zurückgewonnen. Die
Flüssigkeit wurde in Plaströhrchen oder silikonisierte Gläser gefüllt, um ein Anheften der Zellen an
die Gefäßwand zu verhindern, und so einen größeren Zellverlust zu vermeiden. Die weitere
Verarbeitung erfolgte in der Kälte und so rasch wie möglich, meist unmittelbar nach Entnahme.
2.3
Aufbereitung der BAL und Herstellung von Zytozentrifugenpräparaten
Die bronchoalveoläre Flüssigkeit wurde zunächst durch zwei Lagen Spezialmull gefiltert, um sie
von Schleimflocken zu befreien. Anschließend wurde die gewonnene Menge bei 400g 10min
zentrifugiert (Beckman-Zentrifuge, GS-15R, Deutschland) und die so erhaltenen Zellen in 1000µl
PBS gebracht. Die sich anschließende Zellzählung erfolgte nach Färben mit Türkscher Lösung in
der Zählkammer nach Neubauer.
Die Zellsuspension wurde auf 1x106 Zellen/ml eingestellt und dann in der Zytozentrifuge (Cytospin
2, Fa. SHANDON, Deutschland) bei 400g 4min lang zentrifugiert. Die so gewonnenen Präparate
wurden 2-12h luftgetrocknet und danach entweder bei -20°C zur Aufbewahrung in Alufolie
eingefroren oder sofort mit Aceton fixiert und dann gefärbt.
Durch Tabakrauch stark braun verfärbte Lavagen wurden bereits an dieser Stelle aus der Studie
herausgenommen, weil eine exakte Beurteilung der später entstehenden roten Reaktionsprodukte
unmöglich war.
2.4
Darstellung der immunhistochemischen Methode
2.4.1 Charakterisierung der verwendeten Antikörper: CD4, CD8, 27E10, G16/1,
RM3/1, CD36 und CD68,KP1
Antikörper CD4
Der Antikörper DAKO-CD4, MT310 (DAKOPATTS, Dänemark) ist ein monoklonaler IgG1 MausAntikörper, der mit einem Protein reagiert, das sich auf menschlichen Lymphozyten der THelferzellen-Subpopulation befindet und das auch als Rezeptor für HIV fungiert (56). Das mit CD4
determinierte Antigen wurde ebenso auf Zellen mit Monozyten-/ Makrophagenursprung gefunden
(98). Die Funktion des CD4- Moleküls besteht in der Mitwirkung bei der Antigenpräsentation, es
fungiert als Korezeptor für MHC- Klasse- II- Moleküle (47). Der Antikörper wurde in der
Verdünnung 1:100 verwendet.
Antikörper CD8
Der monoklonale IgG1 Maus-Antikörper DAKO-CD8, DK25 (DAKOPATTS, Dänemark) detektiert
ein Molekül, das sich auf zytotoxischen T-Zellen und T-Suppressorzellen befindet (54). Er reagiert
auch mit Sinuszellen der menschlichen Milz. Der Antikörper kam in einer Verdünnung von 1:50
zum Einsatz.
Antikörper 27E10
Dieser von ZWADLO und Kollegen 1986 vorgestellte IgG1 Antikörper der Spezies Maus (BMA,
Schweiz) ist ein Marker zur Charakterisierung von Makrophagen in der Frühphase der Entzündung.
Das detektierte Antigen wurde auf etwa 20% der peripheren Blutmonozyten gefunden. Der
Antikörper reagiert nicht mit Thrombozyten und Lymphozyten, mit etwa 15% frisch isolierter
Granulozyten wird eine Kreuzreaktion beschrieben (100). In Gefrierschnitten von Haut, Lunge und
Kolon wurde keine Reaktion des Antikörpers beobachtet, wohl aber mit Monozyten-ähnlichen
Zellen in Leber und Milz. Bei vorliegender Entzündung, wie z.B. Kontaktekzem, Urtikaria, Psoriasis
vulgaris und Parodontitis reagiert 27E10 mit Monozyten/Makrophagen und mit einigen
endothelialen und epidermalen Zellen. Deshalb wird der Antikörper 27E10 für wissenschaftliche
Studien des Entzündungsprozesses bei Urtikaria und Gingivitis und zur Charakterisierung des
Entzündungsstadiums pulmonaler Infektionen mittels Phenotypisierung von Alveolarmakrophagen
aus der BAL verwendet (Produktinformation). Der Antikörper BMA 27E10 wurde in einer
Verdünnung von 1:100 eingesetzt.
Antikörper G16/1
Dieser IgG2 Antikörper (BMA, Schweiz) stammt nicht von der Maus sondern von der Ratte, was
bei der hier verwendeten APAAP-Methode die Verwendung eines zusätzlichen Maus-Anti-RatteBrückenantikörpers erforderte. Er kann gemeinsam mit 27E10 und RM3/1 zur Phenotypisierung
von Makrophagen eingesetzt werden. Das detektierte Antigen befindet sich auf der Oberfläche und
im Zytoplasma von Makrophagen im chronischen Entzündungsstadium und wurde z.B. bei BCGGranulomen, Melanomen und Sarkoidose gefunden (Produktinformation). G16/1 wurde 1:20
verdünnt angewendet.
Antikörper RM3/1
Dieser IgG1 Maus- Antikörper (BMA, Schweiz) charakterisiert vor allem die Heilungsphase der
Entzündung. Die Expression des zugehörigen Antigens wird außerdem durch Glukokortikoide
induziert (100). Das erfaßte Antigen befindet sich auf Monozyten und Makrophagen, nicht auf
Lymphozyten, Granulozyten und Thrombozyten. Die Einsatzmöglichkeiten entsprechen denen von
27E10 und G16/1. Der Antikörper kam 1:50 verdünnt zur Anwendung.
Antikörper CD68,KP1
Es wurde der monoklonale IgG1 Maus -Antikörper DAKO-CD68,KP1 (DAKOPATTS, Dänemark)
verwendet. KP1 kennzeichnet die meisten Makrophagen in verschiedenen Geweben, ähnlich wie
eine Gruppe anderer Antikörper, zu der Ki-M6, Ki-M7, EBM 11 und Y1/82A gehören (60). Im
Gegensatz zu diesen ist CD68,KP1 für die Routinediagnostik anwendbar, da er ein Epitop erkennt,
das gegen normale Fixierungen, z.B. mit Formalin, resistent ist (68). Das CD68-Molekül findet sich
in zytoplasmatischen Granula von Monozyten, Makrophagen, neutrophilen und basophilen
Granulozyten (69). Der hier verwendete Antikörper CD68,KP1 reagiert nicht mit Lymphozyten und
Thrombozyten (68). Die bisher wenig bekannten plasmazytoiden Monozyten, früher auch
plasmazytoide T-zellen genannt, werden mit Hilfe dieses Antikörpers identifiziert und von anderen
Zellen wie monozytoiden B-Zellen und Plasmazellen differenziert (50, 26, 30).Der Antikörper wurde
1:200 verdünnt.
Antikörper CD36
Der Maus-Antikörper (DIANOVA, Deutschland) detektiert ein Antigen, das mit dem
Thrombospondin Rezeptor (sehr früher Marker der erythrozytären Differenzierung) korrespondiert.
Thrombospondin ist ein Glykoprotein, das als Adhäsionsmolekül entweder in der RezeptorMolekül-Rezeptor-Interaktion oder in der Verbindung zu anderen adhäsiven Proteinen fungiert (2).
Der Antikörper agglutiniert fetale Erythrozyten und reagiert mit adulten und fetalen Monozyten,
Thrombozyten und Retikulozyten, nicht mit Lymphozyten und Granulozyten (23). Darüberhinaus
wird eine Reaktion mit plasmazytoiden T-Zellen beschrieben (7, 29).
Nachdem plasmazytoide Monozyten in vorliegender Studie mittels CD68,KP1 in der BAL
identifiziert werden konnten, wurde CD36 zur Bestätigung verwendet. Dieser Antikörper schien
geeignet, da eine Reaktion mit anderen lymphoiden Zellen ausgeschlossen ist und die Reaktion
mit plasmazytoiden Monozyten durch Studien mehrerer Autoren gesichert wurde (7, 8, 50, 29). Da
nicht von allen Patienten Reservepräparate zur Verfügung standen, konnten Lavagen von nur 15
Patienten (Sarkoidose n=7, SSc n=8) mit diesem Antikörper untersucht werden, ein Vergleich zur
Kontrollpopulation im Sinne einer Signifikanzprüfung war somit nicht möglich.
Tabelle 2: Zusammenfassende Übersicht der verwendeten Antikörper
Antikörper
Herkunft
Spezifität
Verdünnung
CD4
dako*
T-Helferzellen, Makrophagen
1:100
CD8
dako
zytotoxische
Thymozyten
27E10
BMA°
Makrophagen, Monozyten und Granulozyten 1:100
in der frühen Entzündungsphase
G16/1
BMA
Makrophagen
in
Entzündungsphase
RM3/1
BMA
Makrophagen und
Heilungsphase
CD68,KP1
dako
Makrophagen, Monozyten,
plasmazytoide T-Zellen
CD36
dia^
Monozyten, Megakaryozyten, Thrombozyten, 1:100
Retikulozyten, plasmazytoide Monozyten
und
-T-Zellen, 1:50
Suppressor
der
chronischen 1:20
Monozyten
in
der 1:50
Granulozyten, 1:200
*dako: Firma DAKOPATTS, Glostrup, Dänemark
°BMA: Firma BMA, Schweiz
^dia : Firma dianova-immunotech Vertriebsgesellschaft mbH, Hamburg, Deutschland
2.4.2 Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase-Methode (APAAP)
Zunächst wurden mit den monoklonalen Antikörpern Verdünnungsreihen getestet, um die für die
lichtmikroskopische Auswertung der Lavagezellen optimale Darstellung zu ermitteln.
Die Alkalische Phosphatase Anti -Alkalische -Phosphatase -Methode (APAAP), erstmals 1984
ausführlich von CORDELL und Mitarbeitern beschrieben, beruht auf folgendem Prinzip: Ein AntiMaus-Immunglobulin-Brückenantikörper verbindet den primären monoklonalen Antikörper mit
einem Immunkomplex, der aus intestinaler alkalischer Phosphatase (vom Kalb) und einem
monoklonalen Antikörper gegen dieses Enzym besteht. Die Sichtbarmachung der gebundenen
alkalischen Phosphatase kann mit Neufuchsin oder mittels Naphtol Salz als koppelndes und Fast
Red als „ färbendes“ Agens erfolgen, wobei sich deutlich rot gefärbte Reaktionsprodukte bilden, die
unter dem Mikroskop leicht erkennbar sind (16), s. Abbildung 1.
Abbildung 1: Prinzip der APAAP-Methode
Zur Herstellung der Präparate wurde in vorliegender Studie wie folgt vorgegangen:
1.
Präparate 10 min in Aceton fixieren, 5 min lufttrocknen
2.
Verdünnung des monoklonalen Primärantikörpers (s. Tabelle.2) mit Puffer A
Puffer A =
10% foetales Kälberserum (FKS)
10% Rinderserumalbumin (RSA)
PBS, (z.B. 5ml PBS, 0,5ml FKS, 0,5g RSA)
3.
Überschichten der Zellen mit je 100µl des verdünnten Antikörpers, Inkubation in feuchter
Kammer für 60min
4.
Coverplates und Objektträger in Sequenza (Firma SHANDON, Deutschland) einsetzen
5.
Waschen 5min mit 2ml Waschpuffer
Waschpuffer=
Tris 7,6 pH 0,5 molar Stammlösung: Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Merck 8382
60,6g/1l NaCl, einstellen auf pH 7,6
Gebrauchswaschlösung: 50ml Stammpuffer + 450ml phys. NaCl
6.
je 100µl Brückenantikörper in die Cover-plate-Öffnung pipettieren, 30min Reaktionszeit
1ml Brückenantikörper = 200µl AB-Serum inaktiviert (30min 56°C)
760µl Waschpuffer
40µl Anti-Maus-Immunglobulin (Rabbit immunoglobulin to mouse
immunoglobulin DAKO Code Z 259)
7.
5min waschen
8.
je 100µl verdünnten APAAP-Komplex pipettieren, 30min Reaktionszeit
APAAP-Komplex= Alkalische Phosphatase and monoklonale
Phosphatase DAKO Code D 651 (1:50 mit Waschpuffer verdünnt)
9.
5min waschen
Maus-Anti-Alkalische-
10.
Wiederholung der Schritte 6-8 bei einer Reaktionszeit von 10min, mit dem Ziel, die Färbung
zu verstärken
11.
Phosphatase-Reaktion, je 100µl Substrat 2, Reaktionszeit 20min
Substrat 2 = 49ml Tris-Puffer pH 8,2 0,1m
1ml Gemisch Dimethylformamid Merck 2937 +10mg NaphtholAS-MX Phosphat
Sigma No N 4875
50µl Levamisol Sigma L 9756 (zur Hemmung der endogenen Phosphatase)
50mg Fast Red TR Salt Sigma No F 1500
12.
5min waschen
13.
Gegenfärbung mit Hämalaun-Lösung Merck 9249, 10min
14.
5min waschen
15.
Objektträger aus den Coverplates entfernen und 10 min unter fließendem Leitungswasser
abspülen
16.
Lufttrocknen
17.
Eindecken mit angewärmten Glycergel Dako Code Nr. C 563.
2.5
Auswertung der Präparate
Die so angefertigten Präparate wurden mit dem Lichtmikroskop (Firma Carl-Zeiss-Jena,
Deutschland) unter Zuhilfenahme der Ölimmersion ausgewertet. Pro Präparat wurden 1000 Zellen
ausgezählt.
Die
Zellen
wurden
zur
Ermittlung
des
BAL-Differentialzellbildes
in
Alveolarmakrophagen, Lymphozyten und Granulozyten unterteilt. Das Kriterium zur
Unterscheidung der letzteren beiden Zellarten war die Kernmorphologie, insbesondere die
Segmentierung der Kerne. Es wurde keine Pappenheim-Färbung vorgenommen, deshalb erfolgte
keine Unterteilung der Granulozyten in Subpopulationen. Konnten die Zellen aufgrund starker
Färbung der APAAP-Präparate nicht eindeutig klassifiziert werden, wurden sie nicht in die
Auswertung einbezogen. Die Differenzierung der Zellen erfolgte für jeden Patienten an allen
angefertigten Präparaten (meist 6, bei Verwendung von CD36 7 Präparate). Die so erhaltenen
Ergebnisse wurden gemittelt.
Alveolarmakrophagen und Lymphozyten wurden je nach erfolgter oder fehlender Reaktion mit den
verwendeten Antikörpern in positive und negative Zellen eingeteilt. Die Zählungen erfolgten stets
durch den gleichen Untersucher.
2.6
Biostatistische Analyse
Zur Darstellung der Ergebnisse
Standardabweichungen berechnet.
wurden
die
Mittelwerte
und
die
dazugehörigen
Die Berechnungen von Signifikanzen und Korrelationen erfolgten mit dem Statistikprogramm
SPSS/PC. Die Ergebnisse der Zellzählungen unterlagen nicht der Normalverteilung, deshalb
wurden parameterfreie Tests verwendet. Die Differenzen der Mittelwerte in allen Gruppen wurden
zunächst mit dem Kruskal-Wallis-Test auf Signifikanz geprüft. Bei mit diesem Test nachgewiesener
Signifikanz wurden die Mittelwerte der betrachteten Kollektive in bezug auf die Kontrollpopulation
mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Abhängigkeiten wurden mittels Korrelationskoeffizient
nach Pearson geprüft.
Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,05 für die Einordnung als signifikant zugrunde
gelegt.
Die Textverarbeitung erfolgte mit Hilfe des Programms MICROSOFT WORD 6.0, grafische
Darstellungen wurden mit EXCEL 5.0 bzw. COREL DRAW 4.0 angefertigt.
3
Ergebnisse
Das an 50 Patienten erhobene Zahlenmaterial wurde unter verschiedenen Aspekten ausgewertet.
Nach Darstellung der BAL-Ergebnisse hinsichtlich der Zellzahl und des Differentialzellbildes
erfolgte die solitäre Betrachtung der Zellpopulationen plasmazytoide Monozyten,
Alveolarmakrophagen und Lymphozyten. Entsprechend der Aufgabenstellung sollte die
Antigenexpression dieser Zellen in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung und des
Tabakkonsums untersucht werden. Das Patientengut wurde deshalb wie folgt gruppiert:
Gruppe 1: nach Art der Erkrankung
a) Sarkoidose n=19
b) systemische Sklerose n=17
c) systemischer Lupus erythematosus n=4
d) Kontrollpopulation (s. 2.1.) n=10
Der Vergleich mit der Kontrollpopulation erfolgte, um den Einfluß des interstitiellen
Krankheitsprozesses
auf
die
Antigenexpression
zu
ermitteln.
Signifikanzprüfungen
unterschiedlicher Ergebnisse bei interstitiellen Erkrankungen wurden mit dem Ziel vorgenommen,
krankheitsspezifische Faktoren zu verifizieren.
Gruppe 2: nach dem Tabakkonsum
Die Einteilung erfolgte in Raucher und Nichtraucher, das Kollektiv interstitieller Erkrankungen
wurde weiterhin getrennt von der Kontrollpopulation betrachtet:
a) Raucher -ILD n=12
-Kontrollpopulation n=4
b) Nichtraucher-ILD n=28
-Kontrollpoulation n=6
3.1
Deskription morphologischer Beobachtungen
Die
lichtmikroskopischen
Bilder
der
Zytozentrifugenpräparate
zeigten
überwiegend
Alveolarmakrophagen und lymphoide Zellen, wenig Granulozyten, vereinzelte Epithelzellen (aus
der Bronchialschleimhaut) kamen vor.
Die Alveolarmakrophagen erwiesen sich als sehr vielgestaltig hinsichtlich ihrer Größe und Form
und waren z.T. mit Rauchbestandteilen, insbesondere Ruß beladen. Sie enthielten einen oder
mehrere Zellkerne. Die Anfärbung der Makrophagen mittels monoklonaler Antikörper erfolgte in
unterschiedlicher Intensität, es entstanden schwach rötlich bis kräftig rot gefärbte
Reaktionsprodukte als Ausdruck der erfolgten Antigen-Antikörper-Reaktion. Es wurden nur deutlich
gefärbte Zellen zur Auswertung herangezogen, wobei keine graduelle Unterteilung erfolgte,
sondern in positive und negative Zellen kategorisiert wurde.
Die Epitope für die Antikörper auf den Lymphozyten befanden sich häufig auf der Membran, was
diesen Zellen in einigen Fällen ein sternförmiges Aussehen verlieh. Viele Lymphozyten zeigten nur
kleine oder mittelgroße fleckförmig gefärbte Bereiche. Die Unterscheidung von positiven und
negativen Lymphozyten war eindeutiger möglich als bei den Makrophagen, da die Intensität der
Färbung weniger stark variierte.
Mittels CD68,KP1 und CD36 wurden plamazytoide Monozyten sowohl in der BAL von Patienten mit
interstitiellen Lungenerkrankungen als auch bei den Kontrollpatienten determiniert. Diese Zellen
unterschieden sich morphologisch nicht von Lymphozyten. Darüberhinaus gelang der Nachweis
Makrophagen-assoziierter Antigene auf lymphoiden Zellen, mit den Antikörpern 27E10, G16/1 und
RM3/1. Es sei an dieser Stelle bereits gesagt, daß es sich bei diesen Zellen mit hoher
Wahrscheinlichkeit ebenfalls um plasmazytoide Monozyten handelte (Abbildung 2 u. 3).
Abbildung 2: Lichtmikroskopisches Bild des Zytozentrifugenpräparates von BAL-Zellen unter
Verwendung des Antikörpers CD68, KP1. Starke Reaktion der plasmazytoiden Monozyten (Pfeile),
keine morphologischen Unterschiede zu Lymphozyten. Ebenfalls starke Reaktion der meisten
Makrophagen. 160-fache Vergrößerung.
Abbildung 3: Monoklonaler Antikörper G16/1:
Antigen-Antikörperreaktion mit einigen
Makrophagen. Keine Reaktion mit Lymphozyten, mit Ausnahme zweier größerer
lymphozytenähnlicher Zellen (Pfeile): plasmazytoide Monozyten. 160-fache Vergrößerung.
3.2
BAL-Gesamtzellzahl und -Differentialzellbilder
Gesamtzellzahl
Die in der rückgewonnenen BAL-Flüssigkeit registrierte Gesamtzellzahl verhält sich im
Patientengut wie folgt (Tabellen 3 und 4):
Gruppe 1:
Tabelle 3: Gesamtzellzahl in der BAL
Erkrankung
n
Gesamtzellzahl
Zellen/ml)
Sarkoidose
19
7,4 ! 7,3
SSc
17
6,6 ± 5,7
SLE
4
3,3 ± 4,5
Kontrolle
10
4,9 ± 7,2
(in
6
10
Die Gesamtzellzahlen unterscheiden sich nicht signifikant (p=0,46, Kruskal-Wallis-Test). Sie
befinden sich innerhalb der von Costabel (1985) angegebenen Norm von 7!3 Mill. Zellen/ml.
Gruppe 2:
Die Gesamtzellzahlen in der Gruppe der Raucher und Nichtraucher sind der Tabelle 4 zu
entnehmen.
6
Tabelle 4: Gesamtzellzahl in der BAL bei Rauchern und Nichtrauchern (Zellen x 10 /ml)
ILD
Kontrolle
Raucher
8,3 ± 7,2 * (n=12)
8,2 ± 10,6 (n=4)
Nichtraucher
4,6 ± 4,0 (n=28)
2,3 ± 1,0 (n=6)
*p<0,05 (Raucher gegen Nichtraucher ILD, Mann-Whitney)
Es ist sowohl in der Gruppe der interstitiellen Lungenerkrankungen als auch in der Kontrollgruppe
eine Erhöhung der Zellzahl bei Rauchern gegenüber Nichtrauchern erkennbar, ein signifikanter
Unterschied liegt in der ILD-Gruppe vor (p=0,03, Mann-Whitney).
BAL-Differentialzellbilder
Es erfolgte eine Differenzierung in Alveolarmakrophagen, Lymphozyten und Granulozyten.
Gruppe 1:
Die BAL- Differentialzellbilder werden in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: BAL-Differentialzellbilder bei Sarkoidose, SSc und SLE (in % der Gesamtzellzahl)
Makrophagen
Lymphozyten
Granulozyten
Sarkoidose (n=19)
76,1 ± 15,5
22,3 ± 16,1*
1,6 ± 1,4
SSc (n=17)
86,2 ± 13,4
9,5 ± 7,2
4,3 ± 4,2*
SLE (n=4)
81,0 ± 9,0
15,1 ± 9,6
3,9 ± 1,3*
Kontrolle (n=10)
90,3 ± 17,0
8,8 ± 5,2
0,9 ± 1,0
*p<0,05 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)
Der prozentuale Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl ist bei Sarkoidosepatienten
signifikant erhöht. Nach den Normwerten der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie ist die
Lymphozytenzahl beim SLE leicht erhöht. Die Granulozyten sind bei Sklerodermie- und
Lupuspatienten signifikant vermehrt.
Gruppe 2:
Bei Rauchern und Nichtrauchern waren die Lymphozyten wie folgt an der Gesamtzellzahl beteiligt
(Tabelle 6.):
Tabelle 6: Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl bei Rauchern und Nichtrauchern (in
% der Gesamtzellzahl)
ILD
Raucher
Nichtraucher
6,3 ± 4,3 **(n=12)
21,6 ± 11,5 (n=28)
Kontrolle
6,0 ± 3,5 (n=4)
10,1 ± 4,3 (n=6)
**p=0,002 (Raucher gegen Nichtraucher ILD, Mann-Whitney)
Es besteht eine signifikante Verringerung der Lymphozytenzahl bei rauchenden Patienten in der
ILD-Gruppe gegenüber Nichtrauchern der gleichen Gruppe. Die Ergebnisse der Kontrollgruppe
stellen sich ähnlich dar, Signifkanz konnte nicht nachgewiesen werden. Die Anzahl der
Alveolarmakrophagen ist bei Rauchern stark erhöht, da der Anteil an Granulozyten sich mit dem
Rauchen nicht änderte.
3.3
Reaktionen plasmazytoider Monozyten
3.3.1 Antigenexpression für CD68,KP1 und CD36 bei interstitiellen
Lungenerkrankungen
Wie bereits erwähnt (s.3.1.), wurden in der vorliegenden Untersuchung positive Reaktionen von
lymphoiden Zellen mit Makrophagen-assoziierten Antikörpern beobachtet. Nach ausführlichen
Literaturstudien und unter Beachtung der Spezifität der Antikörper CD68,KP1 und CD36 konnte
konstatiert werden, daß diese Zellen plasmazytoide Monozyten (früher: plasmazytoide T-Zellen )
sind.
Das morphologische Erscheinungsbild der plasmazytoiden Monozyten in den untersuchten
Zytozentrifugenpräparaten entsprach dem der Lymphozyten. Aus diesem Grund wurde die
Lymphozytenpopulation als Bezugsgröße gewählt. Die berechneten Mittelwerte verstehen sich
somit als prozentualer Anteil antigenexprimierender Zellen an der Gesamtzahl lymphoider Zellen.
CD68,KP1
Der Antikörper CD68,KP1 identifiziert neben Monozyten und Makrophagen auch plasmazytoide
Monozyten (30). Mit Hilfe des Antikörpers gelang in der vorliegenden Studie der Nachweis dieser
Zellen in der bronchoalveolären Lavage.
Der prozentuale Anteil plasmazytoider Zellen an der Gesamtzahl lymphoider Zellen differierte sehr
stark innerhalb aller Lavagen, jedoch nicht krankheitsspezifisch. Immerhin fehlten die PM in keinem
Präparat vollständig.
Folgende Mittelwerte wurden errechnet (in % aller lymphoider Zellen):
Sarkoidose 36,2 ! 18,9
SSc
34,0 ! 22,0
SLE
37,5 ! 8,2
Kontrollen
45,8 ! 23,7
Es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Krankheitsgruppen.
CD68,KP1 reagierte von den verwendeten Markern am häufigsten mit plasmazytoiden Monozyten
und als Makrophagenmarker mit den Alveolarmakrophagen. Vor dem Hintergrund eines in der
Literatur vermuteten Zusammenhanges zwischen beiden Zellarten (Ursprung, Funktion, s. 1.3.),
wurde versucht, eine Abhängigkeit zu ermitteln, es konnte jedoch keine signifikante Korrelation
zwischen Alveolarmakrophagen und plasmazytoiden Monozyten, die das CD68-Molekül tragen,
hergestellt werden. Auch zwischen T-Helferzellen bzw. zytotoxischen -Zellen oder der CD4/CD8Ratio und CD68-positiven PM bestanden keine Korrelationen.
CD36
Der Antikörper CD36 wurde ebenso wie CD68,KP1 verwendet, um plasmazytoide Monozyten in
der BAL nachzuweisen. Dieser Antikörper war deshalb geeignet, weil er einerseits mit PM reagiert
und andererseits eine Reaktion mit Lymphozyten nicht erfolgt (s.1.1 und 2.4.).
CD36 kam erst zum Einsatz, nachdem die Reaktion lymphoider Zellen mit CD68 als Reaktion
plasmazytoider Monozyten (s.oben) erklärt werden konnte. Die nachträgliche Untersuchung mit
diesem Antikörper war somit nur in solchen Fällen möglich, in denen ungefärbte Reservepräparate
zur Verfügung standen. Dies waren 8 Lavagen von Sklerodermiepatienten (1Raucher) und 7 von
Patienten mit Sarkoidose (3 Raucher).
Die durchschnittliche Anzahl positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl lymphoider
Zellen betrug bei der Sarkoidose 14,3 ! 13,2%; bei der SSc 4,8 ! 3,0%. In 2 Lavagen (je 1
Sarkoidose und SSc) waren keine plasmazytoiden Monozyten vorhanden, die CD36 exprimieren.
Eine statistische Auswertung im Sinne eines Mittelwertvergleichs konnte aufgrund fehlender
Reservepräparate der Kontrollpopulation nicht erfolgen. Eine Korrelation zwischen
antigentragenden plasmazytoiden Monozyten und Alveolarmakrophagen bestand nicht.
3.3.2 Reaktionen lymphoider Zellen mit
Antikörpern 27E10,G16/1 und RM3/1
den
entzündungsassoziierten
Die entzündungsassoziierten Antikörper 27E10, G16/1 und RM3/1 sind weitgehend Makrophagenspezifisch und reagieren nach Angaben des Herstellers und Literaturangaben nicht mit
Lymphozyten. Wie bereits dargelegt, konnten eindeutige positive Reaktionen lymphozytenähnlicher
Zellen mit diesen Markern nachgewiesen werden.
Die Antigenexpression in den verschiedenen Krankheitsgruppen unterschied sich für keinen der
Antikörper signifikant. Die prozentualen Anteile der positiven Zellen an der Lymphozytenpopulation
sind der Tabelle 7 zu entnehmen.
Tabelle 7: Anteil der lymphozytenähnlichen Zellen, der mit den entzündungsassoziierten
Antikörpern 27E10, G16/1 und RM3/1 positiv reagiert (in % aller lymphoider Zellen)
Erkrankung
27E10
G16/1
RM3/1
Sarkoidose (n=19)
7,1 ± 8,5
5,2 ± 5,7
7,6 ± 10,9
Sklerodermie (n=17)
11,1 ± 10,1
7,0 ± 10,6
6,2 ± 6,1
SLE (n=4)
12,3 ± 9,6
9,8 ± 10,8
4,5 ± 5,8
Kontrolle (n=10)
9,0 ± 12,4
2,6 ± 4,9
15,9 ± 19
Auffällig ist der große Anteil RM3/1-positiver Zellen in der Kontrollgruppe im Gegensatz zu den
interstitiellen Erkrankungen, der Unterschied ist statistisch nicht signifikant.
Entsprechend der Spezifität der entzündungsassoziierten Antikörper ist es als wahrscheinlich
anzunehmen, daß die antigentragenden lymphoiden Zellen plasmazytoide Monozyten sind. Der
Diskussion vorgreifend werden diese Zellen nachfolgend plasmazytoide Monozyten genannt.
3.3.3 Rauchen und Antigenexpression
Die Antigenexpression auf plasmazytoiden Monozyten ist für alle verwendeten Antikörper bei
Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern erhöht. Signifikanz ließ sich für alle Antikörper bis auf
CD68,KP1 nachweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargelegt.
Tabelle 8: Antigenexpression auf PM bei Rauchern und Nichtrauchern unter Verwendung von
CD68,KP1, CD36, 27E10, G16/1 und RM3/1.
Raucher
CD68,KP1
CD36
27E10
G16/1
RM3/1
39,4 ± 11,7
19,1 ± 16,1*
17,1 ± 14,4*
9,3 ± 10,2*
16,6 ± 16,5*
33,8 ± 21,4
5,6 ± 3,8
5,2 ± 3,4
3,5 ± 5,1
4,3 ± 3,8
n=16
Nichtraucher
n=34
*p< 0,05 (Signifikanz für Raucher gegen Nichtraucher, Mann-Whitney)
Auffällig neben den Signifikanzen ist die starke Streuung der Werte. Um dieses Ergebnis
anschaulich zu machen und dessen Eindeutigkeit trotz der großen Streuung darzustellen, sind in
den
folgenden
Grafiken
die
Einzelwerte
und
Standardabweichungen
für
die
entzündungsassoziierten Antikörper dargestellt. Für CD68,KP1 wurde wegen der fehlenden
Signifikanz, für CD36 wegen des nur kleinen untersuchten Kollektivs darauf verzichtet.
% pos. 40
Zellen
27 E 10
30
20
10
Raucher
ILD
Raucher
Kontrolle
Nichtraucher Nichtraucher
ILD
Kontrolle
Abbildung 4: Anteil 27E10-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der
Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern
% pos. 40
Zellen
G 16/1
30
20
10
Raucher
ILD
Raucher
Kontrolle
Nichtraucher Nichtraucher
ILD
Kontrolle
Abbildung 5: Anteil G16/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der
Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern
% pos. 40
Zellen
RM 3/1
30
20
10
Raucher
ILD
Raucher
Kontrolle
Nichtraucher Nichtraucher
ILD
Kontrolle
Abbildung 6: Anteil RM3/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Lymphozytenpopu-lation
bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern
Es bestand keine Korrelation zwischen positiven plasmazytoiden Monozyten und positiven
Alveolarmakrophagen für den jeweiligen Marker.
3.4
Charakterisierung der Alveolarmakrophagen mit den Antikörpern CD4,
27E10, G16/1, RM3/1, CD36 und CD68,KP1
3.4.1 Vergleich der Antigenexpression in Abhängigkeit von der Art der
Erkrankung und der Therapie mit Glukokortikoiden
Die Untersuchung der Alveolarmakrophagen erfolgte mit dem Ziel, die Antigenexpression in
Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, vom Entzündungszustand der pulmonalen Gewebe und
von der Therapie mit Kortikoiden darzustellen. Der prozentuale Anteil positiver Makrophagen an
der Gesamtmakrophagenzahl bei Reaktion mit den Antikörpern CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, und
CD68 geht aus Tabelle 9 hervor.
Tabelle 9: Antigenexpression bei Sarkoidose, Sklerodermie und SLE (Angaben in % aller
Makrophagen) bei Reaktion mit CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, CD68
Erkrankung
CD4
27E10
G16/1
RM3/1
CD68
Sarkoidose
36,4 ± 25
32,7 ± 17,1
42,1 ± 24,6***
52,1 ± 20,4
80,9 ± 10,0
Sklerodermie
35,5 ± 20,8
29,6 ± 15,6
55,9 ± 19,0***
66,8 ± 10,4
77,2 ± 11,6
SLE
64,6 ± 5,3*
36,8 ± 14,5
26,0 ± 27,8
67,2 ± 10,5
82,1 ± 8,4
Kontrolle
43,4 ± 20,2
27,0 ± 7,6
10,5 ± 8,9
62,3 ± 13,4
80,8 ± 7,2
***p< 0,001,* p< 0,05 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)
Der erhöhte Anteil CD4-positiver Makrophagen beim SLE (*) stellt einen signifikanten Unterschied
zur Kontrollgruppe dar (p=0,02).
Die Unterschiede für den Marker 27E10 (frühe Entzündungsphase) sind nicht signifikant (p=0,6,
Kruskal-Wallis). Die Aussage dieses Markers bezieht sich auf die akute Entzündung und läßt
ähnlich wie die CD4/CD8-Ratio der Lymphozyten eine Aktivitätsbeurteilung der Erkrankung zu.
Zwischen diesen beiden Parametern findet sich zusätzlich eine signifikante positive Korrelation
(p<0,01, r=0,49).
Der Anstieg G16/1-positiver Makrophagen ist bei Sarkoidose (***) und SSc (***) im Vergleich zur
Kontrolle hochsignifikant (Sarkoidose p=0,0006, SSc p=0,0001).
Der Antikörper RM3/1 wird besonders in der Heilungsphase einer Entzündung nachgewiesen und
wird von Monozyten/Makrophagen verstärkt bei der Zufuhr von Glukokortikoiden exprimiert (100).
In der Gruppe der Sarkoidosepatienten wurden zwei von 19 Patienten, bei den Kollagenosen 13
von 21 mit Prednisolon behandelt. Die Antigenexpression für RM3/1 bei erfolgter niedrigdosierter
Prednisolontherapie zum Zeitpunkt der Untersuchung verhält sich wie folgt: mit
Kortikoiden=64,4!8,3%, ohne Kortikoide=57,1!9,4% (Patienten mit Therapie n=15, ohne Therapie
n=25), Signifikanz ließ sich nicht nachweisen.
3.4.2 Rauchen und Antigenexpression
Die Antigenexpression auf Alveolarmakrophagen unterscheidet sich bei Rauchern und
Nichtrauchern für keinen Antikörper signifikant, obwohl die CD4-positiven Alveolarmakrophagen
bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern deutlich verringert sind.
Tabelle 10: Antigentragende Alveolarmakrophagen (in % aller Makrophagen) bei Rauchern und
Nichtrauchern bei Reaktion mit CD4, 27E0, G16/1, RM3/1 und CD68
Raucher
CD4
27E10
G16/1
RM3/1
CD68,KP1
27,0 ± 25,3
28,2 ± 12,4
36,7 ± 27,6
61,5 ± 12,7
80,9 ± 9,3
45,1 ± 17,4
32,4 ± 16,1
39,4 ± 26,1
60,2 ± 18,4
79,8 ± 9,7
n=16
Nichtraucher
n=34
Bei Untergliederung der Raucher und Nichtraucher in Patienten mit interstitiellen
Lungenerkrankungen und Patienten der Kontrollgruppe konnte für CD4 innerhalb dieser nun vier
Gruppen mit dem Kruskal-Wallis-Test ein signifikanter Unterschied festgestellt werden, mit dem
Mann-Whitney-Test ließ sich dieser Fakt nicht bestätigen.
3.5
Charakterisierung der Lymphozytensubpopulationen
Der Vollständigkeit halber seien noch die Ergebnisse der Untersuchung an Lymphozyten
dargelegt.
Es bestehen deutliche Unterschiede in der Anzahl zytotoxischer T-Zellen (CD8+) bei Sarkoidose
und SSc im Vergleich zur Kontrollgruppe, Signifikanz ließ sich nur für die Sarkoidose feststellen
(p=0,007). Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt.
Tabelle 11: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Sarkoidose, SSc, SLE (in % der
Gesamtlymphozytenzahl)
CD8
CD4
Sarkoidose (n=19)
24,6 ± 17,0**
45,0 ± 22,6
SSc (n=17)
30,4 ± 18,0
38,3 ± 21,2
SLE (n=4)
39,0 ± 13,5
40,2 ± 10,4
Kontrolle (n=10)
39,8 ± 15,6
43,9 ± 16,6
**p=0,007 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)
Die CD4/CD8-Ratio unterscheidet sich im untersuchten Kollektiv nicht signifikant und ist in allen
Krankheitsgruppen niedrig: Sarkoidose=2,3 ± 1,6; PSS=2,3 ± 2,0; SLE=1,2 ± 0,6; Kontrolle=1,5 ±
1,4
Die Ergebnisse in Abhängigkeit vom Tabakkonsum sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern ( in % der
Gesamtlymphozytenzahl)
ILD,CD8
Raucher
Nichtraucher
ILD,CD4
27,2 ±
(n=12)
12,5 41,7 ± 20,1
28,4 ±
(n=28)
19,6 43,4 ± 22,0
Kontrolle CD8
Kontrolle CD4
38,9 ± 27,1
38,1 ± 26,9
(n=4)
40,4 ± 9,2
(n=6)
46,8 ± 11,0
4
Diskussion
In der vorliegenden Studie wurden Zellen der BAL, zunächst Alveolarmakrophagen und
Lymphozyten, mit Hilfe monoklonaler Antikörper untersucht. Nachdem mit Hilfe des Antikörpers
CD68,KP1 plasmazytoide Monozyten in der BAL nachgewiesen wurden standen diese relativ
wenig bekannten Zellen im Mittelpunkt des Interesses.
Plasmazytoide Monozyten
Mit der vorliegenden Studie konnte nach Wissen des Autors erstmalig der Nachweis von
plasmazytoiden Monozyten in der BAL erbracht werden.
Diese Zellen, früher als plasmazytoide T-Zellen bezeichnet, wurden zunächst in Lymphknoten bei
Lymphadenitis (91), später in malignen Lymphomen (63), in reaktiven Lymphknoten bei Sarkoidose (26), im Haut-assoziierten Lymphgewebe bei lympozytärer Infiltration Jessner und in einigen
axillären Lymphknoten bei Mammakarzinom (40) gefunden. Das Vorkommen dieser Zellen in der
BAL und der Einfluß des Rauchens wurde in dieser Studie gezeigt..
Der monoklonale Antikörper CD68,KP1 identifiziert plasmazytoide Monozyten und differenziert sie
von anderen Zellen wie monozytoiden B-Zellen und Plasmazellen (30). In der Literatur findet man
zahlreiche Beschreibungen der Reaktion plasmazytoider Zellen mit den verschiedenen
Antikörpern, die das CD68-Molekül detektieren: KP1, Ki-M6, Ki-M7, EBM11 und Y1/82A (10, 3, 34,
22, 92, 53, 7, 8, 26, 29). In der vorliegenden Untersuchung zeigten durchschnittlich 40% aller
lymphoider Zellen eine deutliche Reaktion mit diesem Antikörper. Entsprechend der Charakteristik
des Antikörpers stellen diese Zellen die Population der plasmazytoiden Monozyten in der BAL dar.
Es bestanden keine morphologischen Unterschiede zwischen PM und Lymphozyten. BEISKE und
Mitarbeiter (1987) arbeiteten ebenfalls mit Zytozentrifugenpräparaten und fanden keine
morphologischen Unterschiede zwischen plasmazytoiden Monozyten und anderen lymphoiden
Zellen. Im Gegensatz dazu erscheinen plasmazytoide Monozyten in Schnittpräparaten aus der
Haut oder aus Lymphknoten größer als Lymphozyten, sie sind bei Giemsa-Färbung relativ leicht
als Zellen mit graublauem Zytoplasma, die in Herden zusammengeballt liegen, zu erkennen (91).
Trotz morphologischer Ähnlichkeiten zwischen Lymphozyten und PM und des Nachweises des
CD4-Antigens auf den PM vermuten viele Autoren den Ursprung dieser Zellen in der monozytären
Linie aufgrund des Nachweises Monozyten-/Makrophagenassoziierter Antigene auf diesen Zellen
(50, 27, 22, 3).
In der Literatur sind bisher keine plasmazytoiden Monozyten in der bronchoalveolären Lavage
beschrieben worden. Zur Bestätigung des Ergebnisses dieser Studie wurde deshalb ein zweiter
Antikörper, der ebenfalls mit plasmazytoiden Zellen reagiert, gesucht. Plasmazytoide Monozyten
reagieren nach CD68 am häufigsten mit dem Antikörper CD36 (26, 7, 50). Außerdem wurden
Reaktionen mit CD15 (26), CD 14 (7) und CD31 (50) beschrieben. Für die vorliegende Studie
wurde CD36 ausgewählt, da plasmazytoide Monozyten einerseits das zugehörige Antigen häufig
exprimieren und andererseits eine Reaktion mit Lymphozyten nicht stattfindet (23). An 15 zur
Verfügung stehenden Reservepräparaten konnten positive Reaktionen lymphoider Zellen mit CD36
beobachtet werden, die entsprechend der Antikörperspezifität plasmazytoide Monozyten
darstellen.
Die große durchschnittliche Anzahl plamazytoider Monozyten in der BAL und die Tatsache, daß sie
in keiner Lavage völlig fehlten (bei Reaktion mit CD68,KP1), könnten darauf hinweisen, daß sie
Teil des normalen pulmonalen Zellmusters sind. Eine ähnliche Vermutung äußerten FACCHETTI
und Mitarbeiter (1988): Sie ermittelten, daß die Lymphozytenproliferation bei lymphozytärer
Infiltration Jessner von einer hohen Anzahl plasmazytoider Monozyten begleitet war und
schlußfolgerten daraus, daß die PM eine früher unbekannte Komponente des Haut-assoziierten
Lymphoidgewebes sein könnten. ECKERT und Mitarbeiter (1989) nahmen an, daß plasmazytoide
Monozyten in lymphatischen Geweben als meist seßhafte Zellen eine Rolle in der
Antigenpräsentation spielen. Das Vorhandensein der PM in der BAL könnte darauf hindeuten, daß
die PM ähnlich den Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen auf einen (noch unbekannten)
Reiz hin in das Gewebe einwandern können und dann ihre Aufgabe im immunologischen
Geschehen übernehmen.
In der vorliegenden Studie reagierten lymphoide Zellen mit den entzündungsasso-ziierten
Makrophagenmarkern 27E10, G16/1 und RM3/1. Eine Reaktion dieser Antikörper mit Lymphozyten
findet nicht statt (100, Herstellerangaben). In der Literatur findet man keine Angaben zur
Expression dieser Marker auf plasmazytoiden Monozyten, was unter anderem sicher daran liegt,
daß diese Antikörper insgesamt selten verwendet werden. Nach dem bisher Gesagten ist es als
sehr wahrscheinlich anzunehmen, daß die hier angefärbten Zellen keine Lymphozyten sondern
ebenfalls plasmazytoide Monozyten sind.
Die Reaktionen der PM mit allen hier verwendeten Makrophagenmarkern unterstützt die
Hypothese vieler Autoren, die den Ursprung dieser Zellen von der monozytären Linie vermuten.
(50, 27, 22, 3).
Der Anteil antigentragender plasmazytoider Monozyten bei Reaktion mit CD36, 27E10, G16/1 und
RM3/1 war bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern signifikant erhöht, bei Reaktion mit
CD68,KP1 ebenfalls erhöht, wenn auch nicht signifikant.
Unter der Annahme des monozytären Ursprungs der PM ist es denkbar, daß diese Erhöhung durch
ähnliche Mechanismen verursacht wird wie die hinreichend bekannte Erhöhung der Anzahl der
Alveolarmakrophagen in der BAL bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern (88, 17). Die
erhöhte Anzahl plasmazytoider Monozyten wäre somit als Ergebnis einer unspezifischen
Stimulierung des Immunsystems zu erklären.
De VOS und Mitarbeiter (1990) stellten die Hypothese auf, daß die PM Vorläufer anderer
monozytärer Zellen sein könnten. Folgt man dieser Theorie, wäre eine Blockierung der
Differenzierung der PM durch das Zigarettenrauchen denkbar, die zur Akkumulation in der BAL
führen würde. Dagegen spricht die Untersuchung von BEISKE und Mitarbeitern (1987), die
beobachteten, daß die PM sehr geringe mitotische Aktivität zeigten und die Reaktionen mit Ki-67
(Kernantigen proliferierender Zellen) negativ waren, was für einen ausdifferenzierten Zelltyp
spricht.
Aufgrund ihrer Untersuchungen an Hautbiopsien vermuteten einige Autoren, daß die
plasmazytoiden Monozyten eventuell eine Funktion als antigenpräsentierende Zelle in der
Aktivierung und Proliferation von T-Zellen übernehmen (22, 26). Folgt man diesen Autoren und
nimmt weiterhin ähnliche Wechselwirkungen an, die -vermittelt durch Lymphokine- zwischen TLymphozyten und Makrophagen bestehen, könnte die erhöhte Anzahl plasmazytoider Monozyten
die verstärkte Immunantwort der T-Zellen reflektieren. Die Beteiligung der PM an T-Zellvermittelten Immunantworten könnte auch die relativ hohe Anzahl plasmazytoider Monozyten in
der BAL von Nichtrauchern erklären.
Eine weitere Möglichkeit der Erklärung wäre eine beeinträchtigte Apoptose der PM durch den
Tabakkonsum und daraus folgend eine Anhäufung plasmazytoider Monozyten in pulmonalen
Strukturen, ähnlich der verzögerten Eosinophilen-Apoptose bei chronisch eosinophilen
Entzündungen (76).
CALDWELL und Mitarbeiter (1990) stellten die Hypothese auf, daß die PM myeloische und
lymphoide Wachstumsfaktoren produzieren könnten. Auch BADDOURA und Kollegen (1992)
erwogen nach Untersuchungen an einem PM-Tumor mit nachfolgender myeloproliferativer Störung
die Möglichkeit, daß die plasmazytoiden Zellen Mediatoren produzieren, die myeloischen
Stammzellen die Proliferation erleichtern. Die Morphologie der Zellen, insbesondere der gut
entwickelte Golgi-Apparat und das reichlich vorhandene endoplasmatische Retikulum sprechen für
eine sekretorische Tätigkeit der Zellen, obwohl bisher kein Sekretionsprodukt nachgewiesen
werden konnte (63, 29). Die Expression entzündungsassoziierter Antigene der plasmazytoiden
Monozyten in vorliegender Untersuchung unterstützt die Annahme, daß die PM in den Prozess der
Immunantwort auf entzündliche Reize involviert sind. Dabei bestanden für keinen Antikörper
Korrelationen zwischen der Antigenexpression auf PM und Alveolarmakrophagen, so daß trotz
eventueller Gemeinsamkeiten beider Zellarten hinsichtlich des Ursprungs und der vermuteten Rolle
als antigenpräsentierende Zellen, für die PM eine eigenständige Aufgabe im Immunsystem
anzunehmen ist.
Eine krankheitsspezifische Rolle der PM wurde in dieser Studie nicht nachgewiesen, so daß die
plasmazytoiden Monozyten weder für die Sarkoidose noch für die Erkankungen des rheumatischen
Formenkreises pathognomisch sind.
Es bleibt späteren Untersuchungen vorbehalten, weitere Anhaltspunkte für die Funktion der
plasmazytoiden Monozyten zu finden. Diese späteren Studien könnten dann auch mit einer
größeren Palette von Antikörpern das antigene Profil der PM untersuchen. Hilfreich wären hier
Doppelfärbungen der Zellen; zunächst mit CD68,KP1 zur Determinierung der PM und dann mit
dem Zweitantikörper.
Alveolarmakrophagen
Die monoklonalen Antikörper 27E10, G16/1 und RM3/1 können zur Phenotypisierung von
Makrophagen und zur Abgrenzung von Entzündungsphasen dienen, wobei 27E10 die Frühphase,
G16/1 die chronische und RM3/1 die Heilungsphase kennzeichnet (Herstellerangaben, 100). In
dieser Studie zeigte sich eine signifikant erhöhte Antigenexpression für G16/1 auf den
Alveolarmakrophagen von Sarkoidose- und SSc-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Das
spricht für den Verlauf beider Erkrankungen als chronisch fibrosierende Alveolitis bei den meisten
Patienten des untersuchten Kollektivs. Die Anzahl von 27E10-positiven Makrophagen war bei SLE
am höchsten innerhalb der Gruppe interstitieller Erkrankungen, die Antigenexpression für G16/1
am niedrigsten. Statistische Signifikanz bestand nicht. Tendenziell lassen sich diese Ergebnisse
jedoch gut mit der von MENSING (1990) geäußerten Ansicht in Übereinstimmung bringen, daß der
SLE überwiegend akut entzündliche Merkmale aufweist, während die Sklerodermie zum
chronischen Verlauf tendiert.
Der Vergleich dieser Ergebnisse mit dem BAL-Differentialzellbild ergibt für die Sarkoidosepatienten des untersuchten Kollektivs eine logische Befundsynopsis: sowohl die moderate
Erhöhung der Lymphozytenzahl als auch die niedrige CD4/CD8-Ratio deuten gemeinsam mit der
signifikant erhöhten Antigenexpression für G16/1 auf den chronischen Verlauf der Erkrankung im
untersuchten Kollektiv hin. Für die Sklerodermiepatienten stellen sich die Ergebnisse ähnlich dar.
Beim SLE treffen die leichte Erhöhung der Lymphozytenzahl mit der eben dargestellten
Antigenexpression für 27E10 und G16/1 zusammen.
Zusätzlich konnte eine statistisch signifikante Korrelation des CD4/CD8-Quotienten mit der
Antigenexpression für 27E10 auf den Alveolarmakrophagen ermittelt werden. Die Ausprägung von
27E10 auf den Makrophagen der BAL ist also ebenso wie die CD4/CD8-Ratio Ausdruck der
Aktivität der Erkrankung.
Aus den Ergebnissen und den oben angegebenen Literaturrecherchen zu den Antikörpern kann
geschlußfolgert werden, daß die Antikörper 27E10 und G16/1 in der Untersuchung
bronchoalveolärer Flüssigkeit bei interstitiellen Lungener-krankungen nützlich sind, um Aussagen
zum Entzündungszustand pulmonaler Strukturen zu treffen. Für die klinische Diagnostik bringt die
angewandte Methode keinen zusätzlichen Informationsgewinn. Interessant wäre allerdings, zu
ermitteln, wann im Krankheitsverlauf G16/1 ansteigt. Späteren Untersuchungen bleibt es
vorbehalten zu überprüfen, ob es mit diesem Marker eventuell gelingen könnte, den Übergang von
der akuten zur chronischen Alveolitis frühzeitig zu diagnostizieren.
Der Antikörper RM3/1 charakterisiert die Heilungsphase eines entzündlichen Prozesses, die Ausprägung
des zugehörigen Antigens wird aber auch durch Glukokortikoide induziert (100). In der Literatur findet man
unterschiedliche Angaben zum Kortikoideinsatz bei Sarkoidose. SALTINI und Mitarbeiter (1995)
verwenden Kortikosteroide bei hohem CD4/CD8-Quotienten mit dem Ziel, diesen zu senken. Im Gegensatz
dazu stellten SCHMIDT und WIRTZ (1995) fest, daß eine hohe CD4/CD8-Ratio eine gute Prognose und
somit keine Indikation zur Kortikoidtherapie darstellt. Vor diesem Hintergrund und mit dem Ziel, ein
objektives Nachweiskriterium für die Reaktion pulmonaler Strukturen auf Kortikoide zu erarbeiten, wurde
die Antigenexpression für RM3/1 in Abhängigkeit von der Therapie untersucht: Der Anteil positiver
Makrophagen war bei Patienten, die zum Zeitpunkt der Untersuchung unter einer niedrigdosierten
Prednisolontherapie standen, leicht erhöht, statistisch jedoch nicht signifikant. Der Einsatz von RM3/1 zur
Beurteilung der Therapieeffizienz erscheint deshalb nicht sinnvoll.
In der vorliegenden Studie konnten keine krankheitspezifischen Unterschiede in der
Antigenexpression für RM3/1 festgestellt werden. Bei Rauchern und Nichtrauchern gab es für
keinen der entzündungsassoziierten Marker Unterschiede.
Die Anzahl der Epitope für CD4 war auf den Alveolarmakrophagen bei Rauchern im Gegensatz zu
Nichtrauchern deutlich verringert. Eine Signifikanz ließ sich aufgrund der starken Streuung nicht
nachweisen. CD4-Moleküle sind mit MHC-Klasse 2-Molekülen assoziiert (47). PANKOW und
Mitarbeiter (1991) fanden eine erniedrigte Ausprägung von HLA-DR bei Rauchern. Sie stellten die
Hypothese auf, daß diese zur Verringerung der Antigenpräsentation der Makrophagen und damit
zur erhöhten Anfälligkeit der Raucher gegen pulmonale Infektionen führen könnte. Schließt man
sich dieser These an, könnte die hier beschriebene geringere Antigenexpression für CD4 auf den
Makrophagen damit im Zusammenhang stehen.
Der Antikörper CD68,KP1 kennzeichnet die meisten Makrophagen in verschiedenen Geweben
(60). In der vorliegenden Studie reagierten im Durchschnitt 77-82% aller Alveolarmakrophagen mit
diesem Antikörper, ohne krankheitsspezifische oder vom Tabakkonsum abhängige Unterschiede.
Folgt man den oben genannten Autoren, müßte der Anteil positiver Makrophagen an der
Gesamtmakrophagenzahl größer sein. Das Ergebnis könnte zum einen dadurch bedingt sein, daß
untersucherabhängig ein Maßstab angelegt wurde, der nur solche Zellen als positiv bewertete,
deren gefärbte Epitope unzweifelhaft erkennbar waren. Zum anderen kann es methodisch bedingt
(BAL, Zentrifugation, evt. nicht sofort erfolgte Verarbeitung) zur Verringerung der
Antigenexpression der Zellen oder auch zum Absterben von Zellen gekommen sein, was das
Ergebnis erklären könnte. Die oben erwähnten Literaturangaben beziehen sich auf
Gewebsschnitte. Es ist aus den genannten Gründen denkbar, daß auf den Makrophagen der BAL
eine geringere Epitopdichte für CD68 zu verzeichnen ist als auf Makrophagen in Schnittpräparaten.
BAL-Differentialzellbild und Lymphozyten
Die Ergebnisse hinsichtlich des Differentialzellbildes und der Lymphozyten in vorliegender Studie
unterscheiden sich nicht von bisher bekannten Untersuchungen und bringen keine neuen
Informationen. Sie sollen deshalb hier nicht diskutiert werden. Erwähnt sei, daß sie herangezogen
wurden, um Ergebnisse hinsichtlich der Alveolarmakrophagen zu überprüfen und zu vergleichen,
was oben bereits beschrieben wurde.
5
Zusammenfassung
In der vorliegenden Studie konnten mit Hilfe der Antikörper CD68,KP1 und CD36 erstmalig
plasmazytoide Monozyten in der BAL und damit im alveolären Bereich detektiert werden. Der
große Anteil plasmazytoider Zellen in der BAL und die Tatsache, daß die PM in keiner Lavage
fehlten, könnten dafür sprechen, daß diese Zellen Teil des pulmonalen Gewebsmusters sind.
Darüberhinaus konnten Reaktionen dieser Zellen mit den Monozyten-/Makrophagenmarkern
27E10, G16/1 und RM3/1 festgestellt werden, was einerseits darauf hinweist, daß plasmazytoide
Monozyten in den immunologischen Prozess des Entzündungsgeschehens involviert sind und
andererseits die Hypothese des Ursprungs dieser Zellen von der monozytären Linie unterstützt.
Krankheitsspezifische Unterschiede in der Antigenexpression der PM bestanden für keinen der hier
verwendeten Antikörper. Deshalb kann konstatiert werden, daß plasmazytoide Monozyten weder
für die Sarkoidose noch für die hier untersuchten Erkrankungen des rheumatischen Formenkreise
pathognomisch sind.
Die Anzahl plasmazytoider Monozyten war bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern erhöht,
was zum einen durch unspezifische Stimulierung des Immunsystems durch den Zigarettenkonsum
verursacht sein könnte. Die erhöhte Anzahl der PM könnte auch eine verstärkte Immunantwort der
T-Zellen reflektieren, insbesondere vor dem Hintergrund der vermuteten Funktion plasmazytoider
Monozyten als antigenpräsentierende Zellen. Ausgehend von der Hypothese, plasmazytoide
Monozyten könnten Vorläufer monozytärer Zellen sein, ist es vorstellbar, daß durch den
Tabakkonsum die Differenzierung der PM blockiert wird mit nachfolgender Akkumulation der Zellen
in der BAL. Schließlich könnte eine verminderte Apoptose zum Ansteigen der plasmazytoiden
Monozyten in der BAL führen.
Die Untersuchung von Alveolarmakrophagen mit Hilfe der entzündungsassoziierten Antikörper
27E10 und G16/1 gibt Aufschluß über den Zustand pulmonaler Strukturen. Da aber enge
Parallelen zu bereits bekannten Entzündungsmarkern, insbesondere der CD4/CD8-Ratio und der
Lymphozytenzahl, bestanden und diese wesentlich leichter und schneller zu bestimmen sind,
bringt die angewandte Methode für die klinische Diagnostik keinen zusätzlichen Gewinn. Weiterhin
ist es nicht möglich, mit Hilfe des Antikörpers RM3/1, dessen zugehöriges Antigen durch Kortikoide
induziert wird, ein effektives Therapiemonitoring durchzuführen. Der Tabakkonsum beeinflußt die
Antigenexpression nicht.
Literaturverzeichnis
1.
Agostini C, Semenzato G. Immune responses in the lung: basic principles. Lung 1990
Suppl:1001-12
2.
Asch AS, Barnwell J, Silverstein RL, Nachman RL. Isolation of the thrombospondin
membran receptor. J Clin Invest 1987;79:1054-61
3.
Baddoura FK, Hanson C, Chan WC. Plasmacytoid monocyte proliferation associated with
myeloproliferative disorders. Cancer 1992;69:1457-67
4.
Barbosa IL, Gant VA, Hamblin AS. Alveolar macrophages from patients with bronchogenic
carcinoma and sarcoidosis similarly express monocyte antigens. Clin exp. Immunol.
1991;86:173-8
5.
Behr J, Luderschmidt C. Neue Erkenntnisse zur Diagnostik und Prognose der interstitiellen
Lungenerkrankung bei Sklerodermie. Z Rheumatol 1990;49:279-83
6.
Behr J, Adelmann-Grill B, Hein R, Schwaiblmair M, Degenkolb B, Krombach F, Fruhmann
G. Die pulmonale Manifestation der systemischen Sklerodermie: Pathophysiologische und
klinische Bedeutung der Aktivierung von Lungenfibroblasten. Pneumologie 1995;49:266-72
7.
Beiske K, Langholm R, Gordal T, Marton PF. T-zone lymphoma with predominance
of
"plasmacytoid T-cells" associated with myelomonocytic leukaemia - a distinct
clinicopathological entity. J Patho. 1986;150:247-55
8.
Beiske K, Munthe-Kaas A, Davies CL, Marton PF, Gordal T. Single cell studies on the
immunological marker profile of plasmacytoid T-zone cells. Lab Investig 1987;56:381-93
9.
Bitterman PB, Adelberg S, Crystal RG. Mechanisms of pulmonary fibrosis. Spontaneous
release of the alveolar macrophage-derived growth factor in the interstitial lung disorder. J
Clin Invest 1983;72:1801-13
10.
Brado B, Möller P. The plasmacytoid T cell or plasmacytoid monocyte- a sessile lymphoid
cell with unique immunophenotype and unknown function, still awaiting linaege affiliation.
Curr Top Pathol 1990;84(Pt 1);179-92
11.
Brain JD. Lung macrophages: How many kinds are there? What do they do? Am Rev
Respir Dis 1988;137:507-9
12.
Brentjens JR, O`Connell DW, Pawlowski IB, Hsu KC, Andres GA. Experimental immune
complex disease of the lung: The pathogenesis of a laboratory model resembling certain
human interstitial lung diseases. J Exp med 1974;140:105-25
13.
Brubaker R, Swerdlow SH. Plasmacytoid T- cells in a reactive lymph node. Am J Clin
Pathol 1990;93:569-71
14.
Caldwell CW, Yesus YW, Loy TS, Bickel JT, Perry MC. Acute leukemia/ lymphoma of
plasmacytoid T-cell type. Am J Clin Pathol 1990;94:778-86
15.
Campbell DA, Poulter LW, Dubois RM. Phenotypic analysis of BAL cells from patients with
interstitial disease. Thorax 1986;41:429
16.
Cordell JI, Falini B, Erber WN, Ghosh AK, Abdulaziz Z, Macdonald S, Pulford KAF, Stein
H, Mason DY. Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune
complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAPcomplexes). J Histo Cyto 1984;32(No 2):219-29
17.
Costabel U, Bross KJ, Matthys H. Bronchoalveoläre Lavage: Klinische Bedeutung
zytologischer und immunzytologischer Befunde. Prax Klin Pneumol 1985;39:343-55
18.
Dauber JH, Rossman MD, Daniele RP. Bronchoalveolar cell populations in acute
sarcoidosis. J Lab Clin Med 1979;94:862-71
19.
Deutsche Gesellschaft für Pneumologie und Tuberkulose. Empfehlungen
diagnostischen bronchoalveolären Lavage. Prax Klin Pneumol 1987;41:239-41
zur
20.
Deutsche Gesellschaft für Pneumologie und Tuberkulose. Richtlinien
Qualitätssicherung in der Bronchologie. Prax Klin Pneumol 1988;42:119-22
die
21.
De Vos R, de Wolf-Peeters C, Facchetti F, Desmet V. Plasmacytoid monocytes in
epitheloid cell granulomas: ultrastructural and immunelectron microscopic study. Ultrastruct
Pathol. 1990;14:291-302
22.
Eckert F, Schmid U. Identification of plasmacytoid T cells in lymphoid hyperplasia of the
skin. Arch Dermatol 1989;125:1518-24
23.
Edelman P, Vinci G, Villeval JL, Vainchenker W, Henri A, Miglierina R, Rouger P, Reviron
J, Breton-Gorius J, Sureau C, and Edelman L. A monoclonal antibody against an
erythrocyte ontogenic antigen identifies fetal and adult erythroid progenitors. Blood
1986;67:56-63
24.
Eisenberg H, Dubois EL, Sherwin RP, Balchum OJ. Diffuse interstitial lung disease in
systemic lupus erythematosus. Arch Intern Med 1973;79:37-45
25.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C, van den Oord JJ, Desmet VJ. Immunohistochemical
visualization of plasmacytoid T cells in paraffin sections. Hum Pathol 1987;18:1300
26.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C, van den Oord JJ, de Vos R, Desmet VJ. Plasmacytoid T
cells: a cell population normally present in the reactive lymph node. Hum Pathol
1988;19:1085-92
27.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C, Mason DY, Pulford K, van den Oord JJ, Desmet VJ.
Plamacytoid T-cells. Immunohistochemical evidence for their moncyte / macrophage origin.
Am J Pathol 1988;133:15-21
28.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C, van den Oord JJ, Desmet VJ. Plasmacytoid T cells in a
case of lymphocyte infiltration of skin. A component of the skin-associated lymphoid
tissue? J Pathol 1988;155:295-300
29.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C, Kennes C, Rossi G, de Vos R, van den Oord JJ, Desmet
VJ. Leukemia-associated lymph node infiltrates of plasmacytoid monocytes (so-called
plasmacytoid T-cells). Am J Surg Pathol 1990;14(2):101-12
30.
Facchetti F, de Wolf-Peeters C. The plasmacytoid monocyte (the so called plasmacytoid Tcells). An enigmatic cell of the human lymphoid tissue. Biotest Bulletin 1991;4:225-40
31.
Frachon I, Fattal-German M, Magnan A, Cerrina J, le Roy Ladurie F, Parquin F, Rain B,
Lecerf F, Dartevelle P, Emilie D, Berrih-Aknin S. Emergence of inflammatory alveolar
macrophages during rejection or infection after lung transplantation. Transplantation
1994;57:1621-28
32.
Gant VA, Hamblin AS. Human bronchoalveolar macrophage heterogeneity demonstrated
by histochemistry, surface markers and phagocytosis. Clin exp Immunol 1985;60:539-45
33.
Gant VA, Shakoor Z, Barbosa IL, Hamblin AS. Normal and sarcoid alveolar macrophages
differ in their ability to present antigen and to cluster with autologous lymphocytes. Clin exp
Immunol. 1991;86:494-9
34.
Gloghini A, Volpe R, Carbone A. Ki-M6 immunostaining in routinely processed sections of
reactive and neoplastic human lymphoid tissue. Am J Clin Pathol 1990;94:734-41
35.
Groen H, Aslander M, Bootsma H, van der Mark TW, Kallenberg CGM. Bronchoalveolar
lavage cell analysis and lung function impairment in patients with sytemic lupus
erythematosus (SLE). J Clin Exp Immunol 1993;94:127-33
36.
Gross M, Esterly JR, Earle RH. Pulmonary alterations in systemic lupus erythematosus.
Am Rev Respir Dis 1972;105:572-7
für
37.
Hance AJ, Douches S, Winchester RJ, Ferrans VJ, Crystal RG. Characterization of
mononuclear phagocyte subpopulations in the human lung by ising monoclonal antibodies:
changes in alveolar macrophage phenotype associated with pulmonary sarcoidosis. J
Immunol 1985;134:284-92
38.
Haustein UF, HerrmannK, Hofmann C, Bruns M. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und
Therapie der Kollagenosen Teil 2. H+G 1993;68:672-8
39.
Hoogsteden HC, van Dongen JM, van Hal PTW, Delahaye M, Hop W, Hilvering C.
Phenotype of blood monocytes and alveolar macrophages in interstitial lug disease. Chest
1989;95:574-7
40.
Horny HP, Feller AC, Horst HA, Lennert K. Immuncytology of plasmacytoid T-cells: Marker
analysis indicates a unique phenotype of this enigmatic cell.Hum Pathol 1986; 18:28-32
41.
Horny HP, Kaiserling E, Handgretinger R, Ruck P, Frank D, Weber R, Jaschonek KG.
Evidence for a lymphotropic nature of circulating plasmacytoid monocytes: findings from a
case of CD56+ chronic myelomonocytic leukemia. Eur J Haematol 1995;54:209-16
42.
Horst HA, Schumacher U, Horny HP, Lennert K. Lectin-binding profile of plasmacytoid
monocytes. Hum Pathol 1992;23:1178-81
43.
Hunninghake GW, Fauci AS. Pulmonary involvement in the collagen vascular diseases.
Am Rev Respir Dis 1979;119:471-94
44.
Hunninghake GW, Crystal RG. Pulmonary sarcoidosis. Disorder mediated by excess
helper T-lymphocyte activity at sites of disease activity. N Engl J Med 1981;305:429-34
45.
Ina Y, Takada K, Yamamoto M, Morishita M, Miyachi A. Antigen- presenting capacity in
patients with sarcoidosis. Chest 1990;98:911-16
46.
Klech H, Pohl W. Technical recommendations and guidelines for bronchalveolar lavage
(BAL). Eur Respir J 1989;2:561-85
47.
Klein J. Immunologie. Weinheim; New York-Basel-Cambridge: VCH,1991
48.
König G, Behr J, Luderschmidt C. Neue Erkenntnisse zur Diagnostik und Prognose der
interstitiellen Lungenerkrankung bei Sklerodermie. Z Rheumatol 1990;49:279-83
49.
König G, Luderschmidt C, Hammer C, Adelmann-Grill BC, Braun-Falco O, Fruhmann G.
Lung involvement in scleroderma. Chest 1984;85:318-23
50.
Koo CH, Mason DY, Miller R, Ben-Ezra J, Sheibani K, Rappaport H. Additional evidence
that "plasmacytoid T-cell lymphoma" associated with chronic myeloproliferative disorders is
of macrophage / monocyte origin. Am J Clin Pathol 1990;93:822-27
51.
Krieg T, Meurer M. Systemic scleroderma. Clinical and pathophysiologic aspects. J Am
Acad Dermatol 1988;18:457-81
52.
Kühnel W, Dostatni R. Aktivitätsparameter bei Sarkoidose. Produktinfo der DPC Biermann
GmbH 1997
53.
Kuo TT, Lo SK, Chan HL. Immunohistochemical analysis of dermal mononuclear cell
infiltrates in cuteneous lupus erythematosus, polymorphous light eruption, lymphocytic
infiltration of Jessner, and cutaneous lymphoid hyperplasia. J Cutan Pathol 1994;21:430-6
54.
Ledbetter JA, Evans RL, Lipinski M, Cunningham-Rundles C, Good RA, Herzenberg LA.
Evolutionary conservation of surface molecules that distinguish T lymphocyte
helper/inducer and cytotoxic/suppressor subpopulations in mouse and man. J Exp Med
1981;153:310-23
55.
Lennert K, Remmele W. Karyometrische Untersuchungen an Lymphknotenzellen des
Menschen. Acta haemat 1958;19:99-113
56.
McClure MD, Sattentau QJ, Beverly PCL et al. HIV infection of primate lymphocytes and
conservation of the CD4 receptor. Nature 1987;330:487-9
57.
Mensing H. Systemische Sklerodermie. Dt Derm 1990;38:952-6
58.
Mensing H. Zirkumskripte Sklerodermie. Dt Derm 1990;38:944-6
59.
Merrill WW, Smith GJ. Bronchoalveolar Lavage. Let's focus on clinical utility. Chest
1992;102:1641
60.
Micklem K, Rigney E, Cordell J, Simmons D, Stross P, Turley H et al. A human
macrophage-associated antigen (CD68) detected by six different monoclonal antibodies. Br
J Heamatol 1989;73:6-11
61.
Morgenroth K, Nolte D. Atlas der Pneumologie. Pharmazeutische Verlagsgesellschaft. 13445 u. 184-9
62.
Müller-Hermelink HK, Kaiserling E, Lennert K. Pseudofollikuläre Nester von Plasmazellen
(eines besonderen Typs?) in der paracorticalen Pulpa menschlicher Lymphknoten.
Virchows Arch [Cell Pathol] 1973;14:47-56
63.
Müller-Hermelink HK, Stein H, Steinmann G, Lennert K. Malignant lymphoma of
plasmacytoid T-cells. Morphologic and immunologic studies characterizing a special type of
T-cell. Am J Surg Pathol 1983;7:849-62
64.
Müller-Quernheim J. Steuerung der Sarkoidosetherapie mittels immunpathologischer
Parameter. Pneumologie;1994 48:47-9
65.
Müller-Quernheim J, Ferlinz F. Sarkoidose- eine Immundysregulation. Dt Ärtzebl
1988;85:1179-83
66.
Nagai S, Fujimura N, Hirata T, Izumi T. Differentiation of idiopathic pulmonary fibrosis and
interstitial pneumonia with collagen vascular disease by OKT4(+) and OKT8(+) cells in
BAL. Am Rev Respir Dis 1983;127(No4. Pt2):63
67.
Papadimitriou CS, Stephanaki-Nikou SN, Malamou-Mitsi D. Comparative immunostaining
of T-associated plasma cells and other lymph-node cells in paraffin sections. Virchows
Arch [Cell Pathol] 1983;43:31-6
68.
Pulford KAF, Rigney EM, Micklem KJ, Jones M, Stross WP, Gatter KC, Mason DY. KP1: a
new monoclonal antibody that detects a monocyte / macrophage associated antigen in
routinely processed tissue sections. J Clin Pathol 1989;42:414-21
69.
Pulford KAF, Sipos A, Cordell JL, Stross WP, Mason DY. Distribution of the CD68
macrophage/myeloid associated antigen. Int Immunol 1990;2:973-80
70.
Prasthofer EF, Grizzle WE, Prchal JT, Grossi CE. Plamacytoid T-cell lymphoma associated
with chronic myeloproliferative disorder. Am J Surg Pathol 1985;9:380-7
71.
Rich EA, Tweardy DJ, Fujiwara H, Ellner JJ. Spectrum of immunoregulatory functions and
properties of human alveolar macrophages. Am Rev Respir Dis 1987; 136:258-65
72.
Rossi GA, Bitterman PB, Rennard SI, Ferrans VJ, Crystal RG. Evidence for chronic
inflammation as a component of the interstitial lung disease associated with progressive
systemic sclerosis. Am Rev Respir Dis 1985;131:612-7
73.
Saltini C, Crystal RG. Pulmonary sarcoidosis: pathogenesis, staging and therapy. Int Archs
Allergy appl Immun 1995;76(suppl 1):92-100
74.
Schmidt M, Wirtz H. Sarkoidose der Lunge: Klinischer Verlauf und entzündliche Aktivität.
Pneumologie. 1995;49:226-32
75.
Schwegler F, Holzmann H. Ratschläge für Kranke mit progressiver systemischer
Sklerodermie. Dt Derm 1990;38:958-9
76.
Simon HU. Die Bedeutung einer verzögerten Eosinophilen-Apoptose in chronischallergischen Entzündungen. Schweiz med Wochenschr 1997;127:1743-1747
77.
Silver RM, Miller KS, Kinsella MB, Smith EA, Schabel SI. Evaluation and management of
scleroderma lung disease using bronchoalveolar lavage. Am J Med 1990;88:470-76
78.
Smith DL, deShazo RD. Integrins, macrophages, and sarcoidosis. Chest 1992;102:659-60
79.
Sollberg S, Hunzelmann N, Roux M, Krieg T. Therapie der systemischen Sklerodermie.
H+G 1994;69:6-14
80.
Sönnichsen N, Apostoloff E. Autoimmunkrankheiten. Gustav Fischer Verlag JenaStuttgart-1992
81.
Sönnichsen N, Audring H, Barthelmes H. Aktuelle Befunde zur Diagnostik und Therapie
des kutanen Lupus erythematodes. H+G 1993;68:750-5
82.
Spiteri MA, Clarke SW, Poulter LW. Phenotypic and functional changes in alveolar
macrophages contribute to the pathogenesis of pulmonary sarcoidosis. Clin exp Immunol
1988;74:359-64
83.
Spiteri MA, Clarke SW, Poulter LW. Alveolar macrophages that suppress T- cell responses
may be crucial to the pathogenesis outcome of pulmonary sarcoidosis. Eur Respir J
1992;5:394-403
84.
Striz I, Wang YM, Teschler H, Sorg C, Costabel U. Phenotypic markers of alveolar
macrophage maturation in pulmonary sarcoidosis. Lung 1993;171:293-303
85.
Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ, Rothfield NF, Schaller JG, Talal N,
Winchester RJ. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus
erythematosus. Arthritis Rheum 1982;25:1271-7
86.
Toews GB, Vial WC, Dunn MM, Guzzetta p, Nunez G, Stastny P, Lipscomb MF. The
Accessory cell function of human alveolar macrophages in specific T cell proliferation. J
Immunol 1984;132(No.1):181-6
87.
van Furth R. Cellular biology of pulmonary macrophages. Int Arch Allergy appl Immun
1985;76(suppl.1):21-7
88.
Velluti G, Capelli O, Lusuardi M, Braghiroli A, Azzolini L. Broncoalveolar Lavage in the
normal lung. Second of three parts: cell distribution and cytomorphology. Respiration
1984;46:1-7
89.
Venet A, Hance AJ, Saltini C, Robinson BWS, Crystal RG. Enhanced alveolar
macrophage-mediated antigen-induced T- lymphocyte proliferation in sarcoidosis. J Clin
Invest 1985;75:293-301
90.
Vogt HJ. Retrospektive Studien zur Sklerodermie. Dt Derm 1990;38:975-6
91.
Vollenweider R, Lennert K. Plasmacytoid T-cell clusters in non-specific lymphadenitis.
Virchows Arch [Cell Pathol] 1983;44:1-14
92.
Wacker HH, Hansmann ML, Lumbeck H, Radzun HJ, Parwaresch MR. Ein neuer PanMakrophagen Antikörper Ki-M1P erkennt plasmazytoide Lymphknotenzellen in
Paraffinschnitten. Verh Dtsch Ges Path 1990;74:159-164
93.
Wassermann K, Subklewe M, Pothoff G, Banik N, Schell-Frederick E. Expression of
surface markers on alveolar macrophages from symptomatic patients with HIV infection as
detected by flow cytometry. Chest 1994;105:1324-34
94.
Weaver AL, Divertie MB, Titus JL. The lung in scleroderma. Mayo Clin Proc 1967; 42:75466
95.
Weissler JC, Mendelson C, Moya F, Yarbrough WC. Effect of interstitial lung disease
macrophages on T- cell signal transduction. Am J Respir Crit Care Med. 1994;149:191-6
96.
Witt C, Hiepe F, Brenke A, Romberg B, Apostoloff E. Interstitielle Lungenmanifestation bei
systemischer Sklerodermie (SSc). Z ärtzl Fortbild.1994;88:867-71
97.
Witt C, Schaberg T, Hiepe F. Pleuro-pulmonale Manifestationen bei systemischem Lupus
erythematodes (SLE) unter besonderer Berücksichtigung der bronchoalveolären Lavage
(BAL). Z ärtzl Fortbild 1992;86:241-4
98.
Wood GS, Warner NL,Warnke RA. Anti-Leu-3/T4 antibodies react with cells of
monocyte/macrophage and Langerhans lineage. J Immunol 1983;131:212-6
99.
Zissel G, Müller-Quernheim J. Accessory cell function of alveolar macrophages from
patients with pulmonary sarcoidosis. Immunbiology 1992;186:130
100.
Zwadlo G, Schlegel R, Sorg C. A monoclonal antibody to a subset of human monocytes
found only in the peripheral blood and inflammatory tissues. J Immunol 1986;137(2):512-8
101.
Zwadlo-Klarwasser G, Bent S, Haubeck HD, Sorg C,Schmutzler W. Glucocorticoid-induced
appearance of the macrophage subtype RM3/1 in peripheral blood of human. Int Arch Appl
Immunol 1990;91:175-80
LEBENSLAUF
Vor- und Zuname
Adresse
Kirsten Mahlig, geb. Bettac
Schönfließer Straße 6
15890 Eisenhüttenstadt
Geburtsdatum
18. 12. 1967
Geburtsort
Wriezen
Familienstand
verheiratet seit 1989, zwei Kinder
Schulausbildung 1974 - 1984 Polytechnische Oberschule Eisenhüttenstadt
1984 - 1986 Erweiterte Oberschule Eisenhüttenstadt
Schulabschluß
Juli 1986 Abitur
Studium
1987-1992 Humanmedizin an der Humboldt-Universität
Berlin
1992-1997 Zahnmedizin an der Humboldt-Universität
Berlin
Abschluß
November 1997 Staatsexamen Zahnmedizin
Praktika
1986-1987 Vorpraktikum im Krankenhaus
Eisenhüttenstadt
Tätigkeit
seit 01.01.98 Assistenzzahnärztin in der Praxis Dr. Bettac
in Eisenhüttenstadt
Wiss. Tätigkeit
-Beginn der Arbeiten zur Dissertation Januar 1995 in der
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I, Arbeitsbereich
Pneumologie an der Medizinischen Fakultät der Humboldt
Universität zu Berlin
-öffentliche Disputation 12.07.99
Eisenhüttenstadt, den 01.09.1999
EKLÄRUNG AN EIDES STATT
Ich erkläre an Eides Statt, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne die
(unzulässige) Hilfe Dritter verfaßt habe. Die Dissertation stellt auch in Teilen keine Kopie
anderer Arbeiten dar, die verwendeten Hilsmittel und die Literatur sind vollständig
angegeben.
Eisenhüttenstadt, den 01.09.1999