Einfluss von MUPP1 auf die Funktion des 5

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Die Informationsweiterleitung vom Extra- zum Intrazellulärbereich wird meist über Rezeptorproteine vermittelt, die spezifische Liganden binden. Dabei wird das Signal meist nicht
einfach weitergegeben, sondern durch vielfältige Prozesse auch moduliert. Eine Möglichkeit,
die Signalweiterleitung zu beeinflussen oder erst zu ermöglichen, ist die Bildung von intrazellulären Transduktionseinheiten, die aus mehreren Proteinen aufgebaut sind.
Ein Beispiel für ein Protein, das möglicherweise an der Bildung eines Signaltransduktionskomplexes beteiligt ist, stellt das multi-PDZ Protein 1 (MUPP1) dar, welches an den 5-HT2C
Rezeptor binden kann. Die Untersuchung dieser Interaktion ist relevant, da der 5-HT2C Rezeptor eine wichtige Rolle in der Modulation von z.B. Essverhalten und Stimmungen wie Angst
spielt. Das Verständnis der zu Grunde liegenden molekularen Signalübertragungsprozesse
könnte für die Behandlung von Essstörungen und anderen neurologischen Erkrankungen bedeutend sein.
Das Protein MUPP1 besitzt 13 PDZ Domänen und hat so das Potential mit diversen Partnerproteinen zu interagieren. Welche genaue Funktion es im physiologischen Zusammenhang
und insbesondere durch seine Bindung an den 5-HT2C Rezeptor besitzt, ist weitgehend unbekannt und Gegenstand dieser Arbeit.
So wurde zunächst die Verteilung von MUPP1 in verschiedenen Mausgeweben und durch immunhistochemische Färbungen an Maushirnschnitten ermittel und Hirnbereiche identifiziert,
die sowohl den 5-HT2C Rezeptor als auch MUPP1 exprimieren.
Mit Pulldown Experimenten konnte die Bindung der 10. PDZ Domäne von MUPP1 an das Cterminale Endes des 5-HT2C Rezeptors demonstriert werden. Durch Mutation einzelner Aminosäuren sowohl des Rezeptor C-Terminus als auch der 10. PDZ Domäne von MUPP1
wurden für die Spezifität dieser Interaktion relevante Aminosäuren identifiziert. Außerdem
konnte eine Interaktion des tandem pleckstrin homology containing Proteins 2 (TAPP2) mit
der 10. und 13. PDZ Domäne von MUPP1 nachgewiesen werden. Im in vitro Versuch zeigten
MUPP1 und TAPP2 keine gegenseitige Verdrängung bei der Bindung an die 10. PDZ Domäne von MUPP1. Als weiterer Interaktionspartner von MUPP1, der bisher nicht bekannt
war, konnte der Somatostatinrezeptor 2b identifiziert werden.
Das Zusammenspiel von MUPP1, dem 5-HT2C Rezeptor und TAPP2 wurde in einem heterologen zellulären System näher untersucht. Hier konnte die Bindung von TAPP2 an MUPP1
bestätigt werden: nach Stimulation von Zellen mit H2O2 translokalisierte MUPP1 nur an die
Plasmamembran, wenn TAPP2 koexprimiert wurde. Eine mutierte Bindestelle für PI(3,4)P2
im TAPP2 Protein inhibierte die Translokation beider Proteine, was eine dynamische Regulation der subzellulären Lokalisation von MUPP1 durch TAPP2 nahe legt.
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Die Auswirkungen der Überexpression von MUPP1 und TAPP2 auf die Funktion des 5-HT2C
Rezeptors im zellulären Kontext wurden im heterologen Expressionssystem untersucht. Während sich keine unmittelbare Modulation der Signalstärke durch Überexpression von MUPP1
zeigte, ergab sich nach Translokation des MUPP1/TAPP2 Komplexes eine leicht erhöhte intrazelluläre Signalantwort. Dies deutet darauf hin, dass MUPP1 an der Zellmembran eine modulatorische Wirkung auf die 5-HT2C Rezeptorfunktion ausüben kann.
Um die Relevanz der Interaktion zwischen MUPP1 und dem 5-HT2C Rezeptor für den ganzen
Organismus in vivo untersuchen zu können, ist die Etablierung von Tiermodellen die beste
Möglichkeit. Beim entwickelten Konzept sollte spezifisch die Interaktion zwischen MUPP1
und dem 5-HT2C Rezeptor durch Überexpression der 10. PDZ Domäne von MUPP1 oder des
C-Terminus des 5-HT2C Rezeptors in transgenen Mäusen unterbunden werden. Um dies zu erreichen, wurden Konstrukte mit unterschiedlichen Promotoren hergestellt und die Transgenexpression in kultivierten Zellen nachgewiesen.
In transgenen Tieren soll mit Hilfe des ß-Aktin Promotors eine ubiquitäre Expression erreicht
werden, mit dem CaMKIIα-Promotor im adulten Vorderhirn. Die Verwendung diese Promotors macht kompensatorische und letale Effekte unwahrscheinlich. Um eine flexible gewebeund zeitspezifische Expression des Transgens erreichen zu können, wurde außerdem ein induzierbarer Promotor verwendet. Hierzu wurde das Tet-On bzw. Tet-Off System etabliert. In
Zellkultur wurde gezeigt, dass die Transgenexpression nach Zugabe (Tet-On) bzw. Entzug
(Tet-Off) von Doxyzyklin induziert werden kann. Mit Hilfe von Pulldown Experimenten
konnte die Bindung der isoliert exprimierten 10. PDZ Domäne von MUPP1 an den 5-HT2C
Rezeptor C-Terminus gezeigt werden.
Der Einfluss der erstellten Konstrukte auf die Funktion des 5-HT2C Rezeptors wurde in der
Zellkultur getestet. Nach Überexpression der 10. PDZ Domäne von MUPP1 zeigte sich eine
verzögerte Resensitisierung des 5-HT2C Rezeptors nach Agoniststimulation. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass MUPP1 auf die Kinetik des Rezeptors Einfluss nehmen kann.
Die etablierten Konstrukte ermöglichen spätere Untersuchungen an transgenen Mäusen. Diese
können als hochspezifisches in vivo Modell wichtige Erkenntnisse über molekulare
Signaltransduktionsprozesse am 5-HT2C Rezeptor und ihre Organisation durch MUPP1
liefern. Die Modulation der Rezeptorkinetik durch MUPP1 wurde im Zellkulturexperimenten
demonstriert.