Untersuchungen zu Histaminrezeptoren am
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Hannover 2013 Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375 E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de Ulrike Schwittlick ISBN 978-3-86345-190-5 Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar. 1. Auflage 2013 © 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN 978-3-86345-190-5 Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen 0641/24466 [email protected] www.dvg.de Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen von Histaminrezeptoren am kaninen Darm und bei Hunden mit chronischen idiopathischen Darmentzündungen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) vorgelegt von Ulrike Schwittlick Rostock Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med vet. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Korinna Huber Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2013 Meiner Familie Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ............................................................................................................ 1 2 Literaturübersicht ............................................................................................... 3 2.1 Aufbau, Funktion und Histologie des kaninen Gastrointestinaltraktes ........................3 2.1.1 Magen .................................................................................................................4 2.1.2 Dünndarm ............................................................................................................5 2.1.2.1 Duodenum ..................................................................................................................... 6 2.1.2.2 Jejunum ......................................................................................................................... 6 2.1.2.3 Ileum .............................................................................................................................. 6 2.1.3 Dickdarm und Analkanal ......................................................................................6 2.2 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes...........................................................7 2.2.1 Physikalische und chemische Barrieren...............................................................7 2.2.2 Immunologische Barrieren ...................................................................................8 2.2.3 Orale Toleranz ...................................................................................................11 2.3 Inflammatory bowel disease .....................................................................................12 2.3.1 Definition, klinische Symptome, Diagnostik und Differentialdiagnosen ...............12 2.3.2 Erscheinungsformen der kaninen IBD................................................................14 2.3.3 Pathogenese der IBD ........................................................................................17 2.3.3.1 Immunpathologische Krankheitseinflüsse................................................................... 17 2.3.3.2 Diätetische und mikrobielle Einflüsse ......................................................................... 21 2.3.3.3 Genetische Krankheitseinflüsse .................................................................................. 22 2.4 Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt .............................................................23 2.4.1 Funktionelle Aspekte von Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt ..............25 2.4.1.1 Gastrointestinale Motilität ............................................................................................ 26 2.4.1.2 Sekretion ..................................................................................................................... 28 2.4.1.3 Sekretion von Magensäure und Schleimhautschutz ................................................... 28 2.4.1.4 Intestinale Hämodynamik und vaskuläre Permeabilität .............................................. 29 2.4.1.5 Immunmodulation ........................................................................................................ 30 2.4.2 Histaminrezeptoren im kaninen Gastrointestinaltrakt .........................................32 2.4.3 Histaminrezeptoren bei IBD und anderen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes .......................................................................................34 Inhaltsverzeichnis 2.5 II Immunhistochemische Methoden und deren Limitationen ........................................37 2.5.1 Prinzip der Immunhistochemie und deren Fehlerquellen....................................37 2.5.2 Probleme der immunhistochemischen Darstellung im Falle des Histaminrezeptors 4 ...........................................................................................41 3 Material und Methoden ......................................................................................45 3.1 Untersuchungsmaterial ............................................................................................45 3.1.1 Kontrollhundegruppe .........................................................................................45 3.1.2 Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes .........................48 3.1.2.1 Hunde mit lymphoplasmazellulären entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ................................................................................................ 48 3.1.2.2 Hunde mit eosinophilen entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ............ 49 3.1.3 Altersabhängige Gruppeneinteilung ...................................................................50 3.2 Aufarbeitung und Färbung der Gewebeproben ........................................................50 3.2.1 Fixierung und Aufarbeitung der Gewebeproben .................................................50 3.2.2 Übersichtsfärbung..............................................................................................51 3.3 Immunhistochemische Reaktionen...........................................................................51 3.3.1 Antikörper und Seren .........................................................................................51 3.3.2 Verstärkungsreaktion .........................................................................................52 3.3.3 Unspezifische Hintergrundfärbung .....................................................................53 3.3.4 Kontrollen ..........................................................................................................54 3.3.5 Protokoll der immunhistochemischen Reaktionen ..............................................55 3.4 In situ-Hybridisierung ...............................................................................................57 3.4.1 Herstellung der Sonde .......................................................................................57 3.4.1.1 RNA-Isolierung und Reverse Transkription ................................................................ 58 3.4.1.2 Primer .......................................................................................................................... 58 3.4.1.3 PCR und Gelelektrophorese ....................................................................................... 58 3.4.1.4 Klonierung und Isolierung der Plasmid-DNA .............................................................. 59 3.4.1.5 Kontrollen der Zielsequenz ......................................................................................... 59 3.4.1.6 PCR der Plasmidprodukte und Aufreinigung .............................................................. 60 3.4.1.7 Labelling der Sonden mit DIG ..................................................................................... 60 3.4.2 Durchführung der in situ-Hybridisierung .............................................................60 3.4.2.1 Material und Kontrollen ............................................................................................... 61 3.4.2.2 Protokoll der in situ-Hybridisierung ............................................................................. 61 Inhaltsverzeichnis 3.5 III Auswertung und Dokumentation ..............................................................................64 3.5.1 Lichtmikroskopische Beurteilung........................................................................64 3.5.2 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen .........................................64 3.5.3 Auswertung der in situ-Hybridisierung................................................................65 3.5.4 Fotografische Dokumentation ............................................................................65 3.5.5 Statistische Auswertung.....................................................................................65 4 Ergebnisse .........................................................................................................67 4.1 Pathologisch-anatomische und histopathologische Befunde der untersuchten Hunde......................................................................................................................67 4.1.1 Makroskopische und histopathologische Befunde der Kontrollhunde .................67 4.1.2 Histopathologische Befunde der Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes .......................................................................................68 4.1.3 Histopathologische Scores der untersuchten Hunde..........................................68 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ........................................70 4.2.1 Kontrollen und Absorptionsreaktionen ...............................................................70 4.2.2 Expression der Histaminrezeptoren 1, 2 und 4 bei den Kontrolltieren ................73 4.2.2.1 Expression von Histaminrezeptor 1 ............................................................................ 73 4.2.2.1.1 Expression von H1R im Magen ............................................................................ 73 4.2.2.1.2 Expression von H1R im Dünndarm ...................................................................... 74 4.2.2.1.3 Expression von H1R im Dickdarm........................................................................ 75 4.2.2.2 Expression von Histaminrezeptor 2 ............................................................................ 80 4.2.2.2.1 Expression von H2R im Magen ............................................................................ 80 4.2.2.2.2 Expression von H2R im Dünndarm ...................................................................... 81 4.2.2.2.3 Expression von H2R im Dickdarm........................................................................ 83 4.2.2.3 Expression von Histaminrezeptor 4 ............................................................................ 89 4.2.2.3.1 Expression von H4R im Magen ............................................................................ 89 4.2.2.3.2 Expression von H4R im Dünndarm ...................................................................... 90 4.2.2.3.3 Expression von H4R im Dickdarm........................................................................ 92 4.2.2.4 Zusammenfassung der immunhistochemischen Expressionsmuster von H1R, H2R und H4R bei den Kontrollhunden ...................................................................................... 96 4.2.2.5 Vergleich der immunhistochemischen Histaminrezeptorexpression bei gesunden Kontrolltieren verschiedener Altersstufen ................................................................... 97 4.2.2.5.1 Histaminrezeptor 1 bei den gesunden Kontrolltieren .......................................... 97 4.2.2.5.2 Histaminrezeptor 2 bei den gesunden Kontrolltieren ........................................ 100 Inhaltsverzeichnis IV 4.2.2.5.3 Histaminrezeptor 4 bei den gesunden Kontrolltieren ........................................ 101 4.2.2.5.4 Zusammenfassung ............................................................................................ 102 4.2.3 Expression von Histaminrezeptor 1, 2 und 4 bei Hunden mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ...............................................................103 4.2.3.1 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 1 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ......................................................................................................... 104 4.2.3.2 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 2 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ......................................................................................................... 106 4.2.3.3 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 4 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ......................................................................................................... 111 4.2.3.4 Korrelation ................................................................................................................. 113 4.2.3.5 Zusammenfassung.................................................................................................... 114 4.4 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung .....................................................................116 4.4.1 Expression von H4R-mRNA im Dünn- und Dickdarm von Kontrollhunden und in Bioptaten von Hunden mit IBD .........................................................................117 4.4.2 Kontrollen bei der in situ-Hybridisierung ...........................................................123 5 Diskussion ........................................................................................................125 5.1 Expression von H1R, H2R und H4R im Gastrointestinaltrakt....................................125 5.2 Expression von H1R, H2R und H4R bei Hunden mit inflammatory bowel disease ...138 5.3 Methodische Aspekte der immunhistochemischen Darstellung von Histaminrezeptoren unter besonderer Betrachtung des H4R .................................143 5.4 Darstellung des H4R mittels in situ-Hybridisierung..................................................146 5.5 Schlussbetrachtung................................................................................................149 6 Zusammenfassung ..........................................................................................151 7 Summary ..........................................................................................................153 8 Literaturverzeichnis .........................................................................................155 9 Anhang .............................................................................................................175 9.1 Angaben zu den untersuchten Hunden ..................................................................175 9.2 Ergebnisse der eigenen Untersuchungen ..............................................................178 Inhaltsverzeichnis V 9.3 Angaben zu den Ergebnissen der statistischen Untersuchungen ...........................184 9.4 Angaben zur in situ-Hybridisierung.........................................................................190 9.5 Färbeprotokoll der HE-Färbung im Färbegerät (Leica ST4040) ..............................191 9.6 Lösungen und Materialien für die in situ-Hybridisierung .........................................191 9.7 Bezugsquellen für Antikörper, Kits, Materialien, Geräte und Chemikalien ..............194 VI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex AEC 3-Amino-9-Ethyl-Carbazole Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillata BSA bovines Serumalbumin bp base pairs (Basenpaare) bT biotylinisiertes Thyramin bzw. beziehungsweise cDNA englisch complemetary DNA (komplementäre DNA) C Cytosin °C Grad Celsius CD englisch cluster of differentiation (Differenzierungscluster) DIG DNA Digoxigenin englisch desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGE eosinophile Gastroenteritis et al. Lateinisch et alii (und andere) g Gramm G Guanin GALT englisch gut-associated lymphoid tissue (Darmassoziiertes lymphatisches Gewebe) ggr. geringgradig HE Hämatoxylin-Eosin hgr. hochgradig H1R Histaminrezeptor 1 H2R Histaminrezeptor 2 VII Abkürzungsverzeichnis H3R Histaminrezeptor 3 H4R Histaminrezeptor 4 HUC englisch histiocytic ulcerative colitis (histiozytäre, ulzerative Kolitis) IBD englisch inflammatory bowel disease IHC Immunhistochemie IFN-γ Interferon-γ IgG Immunglobulin G IL Interleukin ISH in situ-Hybridisierung J Jahre lfd. Nr. laufende Nummer LPE lymphoplasmazelluläre Enteritis M Molarität m männlich mg Milligramm mgr. mittelgradig mk männlich-kastriert ml Milliliter Mo Monate mRNA messenger RNA µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer n Anzahl NB Nebenbefund n.u. nicht untersucht Nr. Nummer obB ohne besonderen Befund PAMP englisch: pathogen-associated molecular pattern (Pathogen-assoziierte molekulare Muster) VIII Abkürzungsverzeichnis PBS englisch phosphate-buffered saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR englisch polymerase chain reaction (PolymeraseKettenreaktion) RNA englisch ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RT-PCR englisch reverse transcriptase polymerase chain reaction (Reverse Transkriptase-PolymeraseKettenreaktion) T Thymin TGF-β englisch transforming-growth factor β TLR englisch toll-like receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor) TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α U Uracil w weiblich wk weiblich-kastriert WSAVA englisch World Small Animal Veterinary Association z.B. zum Beispiel 1 Einleitung 1 Einleitung Bei der inflammatory bowel disease (IBD) des Hundes handelt es sich um eine chronische, idiopathische Enteropathie, die mit langanhaltenden oder rezidivierenden gastrointestinalen Symptomen wie Durchfall, Erbrechen und Abmagerung einhergeht. Der idiopathische Charakter dieser Erkrankung begründet sich durch den diagnostischen Ausschluss zahlreicher erregerbedingter und allergischer Differenzialdiagnosen sowie durch die bislang unbekannte Ätiologie und nicht vollständig geklärte Pathogenese Forschungsergebnisse aus dieses Human- und Krankheitskomplexes. Veterinärmedizin Zahlreiche deuten auf immunpathologische Dysregulationen, Umweltfaktoren und genetische Komponenten hin, die zur Entstehung der IBD beitragen. Dabei stehen intestinale Mastzellen und Histamin, als einer ihrer Hauptmediatoren, im Fokus vieler Fragestellungen. Histamin vermittelt seine Wirkung über vier bisher beschriebene Histaminrezeptoren (H1R, H2R, H3R, H4R) und ist beteiligt an der Regulation und Modulation zahlreicher Funktionen im humanmedizinische Gastrointestinaltrakt. Untersuchungen Nur haben wenige, sich mit fast der ausschließlich Expression und pathogenetischen Rolle von Histaminrezeptoren bei chronischen entzündlichen Darmerkrankungen beschäftigt. Dabei zeigt sich eine veränderte Expression von H1R und H2R bei verschiedenen Krankheitsbildern, während H3R im Gastrointestinaltrakt anscheinend eine untergeordnete Rolle spielt. Der erst kürzlich beschriebene H4R ist vor allem für immunmodulatorische Vorgänge von Bedeutung, zeigt jedoch keine Veränderung der Expression bei entzündlichen Enteropathien des Menschen. Ziel dieser Arbeit war die Beschreibung des Expressionsmusters von H1R, H2R und H4R im kaninen Magendarmtrakt bezüglich ihrer anatomischen und zellulären Lokalisation mittels immunhistochemischer Methodik. Es wurde anhand einer semiquantitativen Untersuchung der Expressionsintensität, ein Vergleich der Expressionslevel bei gesunden Kontrolltieren und Hunden mit IBD vorgenommen. Während der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Untersuchungen erschien eine wissenschaftliche Arbeit, welche die Spezifität von polyklonalen Antikörpern gegen den humanen und murinen H4R in Frage stellt. Deshalb wurde Einleitung 2 zusätzlich eine in situ-Hybridisierung zur Darstellung der H4R-mRNA im kaninen Darm und zur Identifizierung der H4R-exprimierenden Zellen etabliert. 3 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Aufbau, Funktion und Histologie des kaninen Gastrointestinaltraktes Der Verdauungstrakt des Hundes kann in Kopf-, Vorder-, Mittel- und Enddarm sowie den Canalis analis eingeteilt werden (NICKEL et al. 2004). Mundhöhle und Pharynx gehören zum Kopfdarm. Ösophagus und Magen sind dem Vorderdarm zuzurechnen. Der Dünndarm, bestehend aus drei Abschnitten, Duodenum, Jejunum und Ileum, gehört zum Mitteldarm, während die Dickdarmabschnitte Zäkum, Kolon und Rektum sowie der Afterkanal und After den Enddarm bilden (NICKEL et al. 2004). Die Aufgaben des Verdauungssystems reichen von der Aufnahme der Nahrung und deren Transport, Zerkleinerung sowie enzymatischer Aufschließung, der Überführung von Energieträger-, Bau-, Nähr- und Wirkstoffen in den Körperkreislauf bis hin zur Ausscheidung des unverdaulichen Darminhalts (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Des Weiteren erfüllt der Gastrointestinaltrakt eine Barrierefunktion und stellt in seiner Gesamtheit flächenmäßig das größte, lymphatische Organ des Körpers dar (GEBBERS und LAISSUE 1989). Der histologische Wandaufbau des gesamten Intestinaltraktes folgt einem einheitlichen Prinzip. Die Schleimhaut (Tunica mucosa) setzt sich zusammen aus dem Epithel (Epithelium mucosae), dem darunterliegenden Schleimhautbindegewebe (Lamina propria mucosae) und einer schmalen mukosalen Muskelschicht (Lamina muscularis mucosae) (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Angrenzend findet sich eine ausgeprägte, Blut- und Lymphgefäße, sowie den Plexus submucosus enthaltende Bindegewebsschicht (Tela submucosa), die als Verschiebe- und Verbundschicht der zweischichtigen Darmmuskulatur (Tunica muscularis mit Stratum circulare und Stratum longitudinale) aufliegt. Zwischen Zirkulär- und Längsschicht der Tunica muscularis befinden sich neben Gefäßstrukturen auch die neuronalen Strukturen des Plexus myentericus (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Die Tunica serosa bildet mit 4 Literaturübersicht dem mesothelialen Serosaepithel und der darunterliegenden Serosabindegewebsschicht (Lamina propria serosae) die äußere Abgrenzung des Darmrohres (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Auf lokale Besonderheiten der Anatomie und Histologie der einzelnen Abschnitte wird im Folgenden kurz eingegangen. 2.1.1 Magen Die Aufgabe des Magens liegt in der Futterspeicherung und Vorverdauung der Ingesta durch die Magensäure. Der Hund hat einen einhöhligen, einfachen Magen, der vollständig durch eine drüsenhaltige Schleimhaut (Pars glandularis) ausgekleidet ist (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Die Magenschleimhaut zeigt eine diffuse Felderung, die Areae gastricae, von denen aus die Magengrübchen (Foveolae gastricae) in die Tiefe ziehen. Die Pars glandularis wird weiterhin in eine Kardiadrüsen-, Fundusdrüsen und Pylorusdrüsenzone unterteilt (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Das einschichtige, hochprismatische Epithel des Magens enthält viele schleimproduzierende Zellen, deren Sekrete vor der selbstverdauenden Wirkung der Magensäure schützen. Die Kardiadrüsen, welche sich in einer ringförmigen Zone am Mageneingang befinden, produzieren ein exokrines, alkalisches, Lysozym-haltiges, schleimiges Sekret (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Magenfundus und –korpus besteht aus dicht gelagerten und langgestreckten Schlauchdrüsen. Diese Fundusdrüsen werden in verschiedene Abschnitte eingeteilt und zeigen charakteristische Wandzellpopulationen (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Isthmus enthält nicht ausgereifte Isthmusepithelzellen, die als Ersatzzellen der oberflächlichen Epithelzellen sowie zur Schleimproduktion dienen. Im Halsbereich der Fundusdrüsen finden sich die einzeln oder in kleinen Gruppen gelegenen Nebenzellen, die ein saures, Glykosaminoglykan-haltiges Sekret absondern. Im Mittelstück sowie im Drüsengrund finden sich in großer Zahl sekretorisch aktive Hauptzellen sowie die prominenten Belegzellen, deren Aufgabe in der Salzsäureproduktion und in der Synthese eines Intrinsic-Faktors zur Reabsorption 5 Literaturübersicht von Vitamin B12 liegen. Zusätzlich finden sich hier Zellen des enteroendokrinen Systems (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Pylorusbereich ist durch stark verästelte und geknäulte Pylorusdrüsen und intraepithelial gelegene, endokrine, Gastrin-produzierende Zellen gekennzeichnet (LIEBICH 2010). Die Magenwand zeigt bei Fleischfressern eine verhältnismäßig prominente, durch Kreuzung der Muskelfasern dreischichtig erscheinende Schleimhautmuskelschicht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Weiterhin findet sich als Besonderheit des Karnivorenmagens ein Stratum subglandulare, welches zwischen Drüsengrund und Schleimhautmuskulatur lokalisiert ist und aus zwei Anteilen besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Das Stratum granulosum enthält zahlreiche Lymphozyten und Plasmazellen, während das Stratum compactum aus einer dichten Formation aus kollagenen Bindegewebsfasern besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). 2.1.2 Dünndarm Der Dünndarm zeichnet sich durch das Vorhandensein von Schleimhautzotten (Villi intestinales) und unverzeigten, schlauchförmigen Drüsen (Glandulae intestinales, Lieberkühn-Drüsen, Krypten) aus. Diese vergrößern die Schleimhautoberfläche und unterstützen damit die Dünndarmfunktion, welche in der Verdauung der Ingesta sowie Aufspaltung und Absorption der Nährstoffe besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Das einschichtige, hochprismatische Dünndarmepithel zeigt einen dichten Mikrovillibesatz und unterliegt durch ständige, mitotische Teilung der undifferenzierten Epithelzellen am Grund der Darmdrüsen einer permanenten Regeneration. Des Weiteren finden sich im Epithel auch zytoprotektiven Schleim produzierende Becherzellen und Sekretgranula-haltige, endokrine Zellen, welche intraepithelial im Kryptbereich liegen und ihre Produkte inkretorisch an das subepitheliale Kapillarnetz abgeben (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Paneth-Zellen fehlen beim Fleischfresser (BANKS 1993; LIEBICH 2010). Die Lamina propria mucosae bildet die bindegewebige Grundlage für die Darmzotten und enthält in großer Zahl und 6 Literaturübersicht unterschiedlicher Dichte Immunzellen, während sich in der Tela submucosa teils ausgeprägte, lymphatische Aggregate (Peyer-Platten) finden (LIEBICH 2010). 2.1.2.1 Duodenum In diesem Abschnitt des Dünndarms finden sich submukosal vorwiegend tubuläre Drüsenstrukturen (Brunner-Drüsen), die ein visköses, glykoproteinreiches, alkalisches Sekret produzieren, welches Pufferwirkung gegen den sauren Magensaft besitzt und damit schleimhautprotektiv wirkt. Beim Hund finden sich diese Drüsenstrukturen, im Gegensatz zur anatomischen Ausdehnung des Duodenums vom Pylorus bis zur Flexura duodenojejunalis, jedoch nur auf einer Strecke von 1,5 bis 2 cm (LIEBICH 2010; NICKEL et al. 2004). 2.1.2.2 Jejunum Das Jejunum ist der längste Dünndarmabschnitt. Es beginnt mit der Flexura duodenojejunalis am kranialen Ende der Plica duodenocolica und endet am freien Ende der Plica ileocaecalis (NICKEL et al. 2004). Histologisch sind die Darmzotten länger, schlanker und weniger dicht als im Duodenum und es finden sich vergleichsweise mehr intraepitheliale Becherzellen (BANKS 1993; LIEBICH 2010). 2.1.2.3 Ileum Das kurze Ileum ist der Endabschnitt des Dünndarms und erstreckt sich vom oralen Ende der Plica ileocaecalis bis zum Ostium ileale, welches die Einmündung in den Dickdarm darstellt (NICKEL et al. 2004). Im Vergleich zu den anderen Dünndarmabschnitten sind die Zotten des Ileums kürzer und breiter und das Epithel weist vermehrt Becherzellen auf (LIEBICH 2010). In der Tela submucosa des Ileums finden sich prominente Peyer-Platten, welche in die Lamina propria mucosae reichen, die Zotten verdrängen und sich ins Darmlumen vorwölben können. Diese lymphatischen Aggregate dienen der lokalen Immunabwehr (LIEBICH 2010). 2.1.3 Dickdarm und Analkanal Der Dickdarm umfasst Zäkum, Kolon und Rektum und dient funktionell der mikrobiellen Aufspaltung von Proteinen und Kohlenhydraten sowie der Wasser- und 7 Literaturübersicht Elektrolytresorption (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Im gesamten Dickdarm gibt es keine Darmzotten. Die Schleimhaut besteht aus einem oberflächlichen, hochprismatischen Epithel aus mit Mikrovilli besetzten Saumzellen und langgestreckten, unverzweigten und dicht nebeneinander liegenden Drüsenstrukturen. Das Epithel der Dickdarmdrüsen zeichnet sich durch eine große Anzahl von Becherzellen aus und unterliegt einer ständigen Regeneration. Auch im Dickdarm finden sich vereinzelt lymphatische Aggregate (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Analkanal ist gekennzeichnet durch den Übergang einer echten, durch prominente Längsfalten eingestülpten Schleimhaut in eine drüsenlose Schleimhaut und schließlich in die äußere Haut. Des Weiteren finden sich in diesem Bereich Analdrüsen, Zirkumanaldrüsen und die apokrinen Drüsen des Analbeutels (LIEBICH 2010). 2.2 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes Als epitheliale Oberfläche des Körpers ist gerade die Schleimhaut des Magen-DarmTraktes einer großen Zahl von Antigenen, auch nicht pathogener Natur, ausgesetzt (JUNGI 2000; STOKES und WALY 2006; MURPHY et al. 2009a). Dabei fungiert das intestinale Epithel sowohl als physikalische als auch als immunologische Barriere (SANSONETTI 2004). Das mukosale Immunsystem verfügt neben besonderen anatomischen Merkmalen (Kompartimente aus diffusem Lymphgewebe in der Lamina propria mucosae, organisierte lymphatische Strukturen wie Peyer-Platten und isolierte Lymphfollikel) auch über spezielle Effektormechanismen und immunregulatorische Funktionen (MURPHY et al. 2009a). 2.2.1 Physikalische und chemische Barrieren Das Epithel des Gastrointestinaltraktes wirkt vor allem durch feste Zell-ZellVerbindungen (tight junctions) der Epithelzellen, durch die Produktion visköser Flüssigkeiten (Mukus) und den Mechanismus der Peristaltik als physikalische Barriere gegen infektiöse Erreger (STOKES und WALY 2006; MURPHY et al. 2009b; 8 Literaturübersicht SUCHODOLSKI 2011). Diese epitheliale Barriere besitzt eine hohe Regenerationsfähigkeit durch schnell teilungsfähige Kryptepithelzellen, die in Richtung Zottenspitze migrieren (SANSONETTI 2004). Weiterhin existiert auf der Oberfläche des Darms eine kommensale Bakterienflora, die im Sinne einer kompetitiven Hemmung mit pathogenen Mikroorganismen um Nährstoffe und Anheftungsstellen auf der Epitheloberfläche konkurriert (MURPHY et al. 2009b; SUCHODOLSKI 2011). Zusätzlich wirkt der saure pH im Magen des Gastointestinaltraktes als chemische Barriere (MURPHY et al. 2009b). Verdauungsenzyme aus dem Pankreas zerlegen die Nahrungsproteine, sodass nur wenige intakte Proteine mit der Mukosa in Kontakt kommen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003). Die von Becherzellen im Dünn- und Dickdarm produzierte Mukusschicht enthält Muzine, die mit Oberflächenpolysacchariden und Proteinen bakterieller Organismen interagieren und diese in der Schleimschicht halten. Die Peristaltik des Magendarmtraktes ermöglicht den Abtransport vom Mukus und potentieller bakterieller Noxen (SANSONETTI 2004). 2.2.2 Immunologische Barrieren Die immunologischen Verteidigungsmechanismen bestehen aus dem Zusammenwirken von Komponenten der unspezifischen bzw. angeborenen und der adaptiven bzw. erworbenen Immunabwehr. Wichtige Effektoren der unspezifischen Immunität sind antimikrobiell wirksame Peptide, mononukleäre Phagozyten (Makrophagen), neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen, γδ-T-Zellen und natural killer-(NK)-Zellen (SANSONETTI 2004; STOKES und WALY 2006). Antimikrobielle Peptide (host defense peptides), wie Cathelicidin sowie α- und βDefensine, interagieren mit den Membranen bakterieller Erreger und können zur Lyse dieser führen (SANSONETTI 2004). Während beim Menschen insbesondere die α-Defensine in den Paneth-Zellen des Dünndarms produziert werden, erfolgt die Synthese von Defensinen bei Kaniden, die keine Paneth-Zellen besitzen, in 9 Literaturübersicht Makrophagen, zirkulierenden neutrophilen Granulozyten und Dünndarmepithelzellen (SANDOW und WHITEHEAD 1979; SANSONETTI 2004; LINDE et al. 2007). Funktionell wirken antimikrobielle Peptide chemotaktisch auf Immunzellen, fördern deren transepitheliale Migration und verstärken die zytotoxische Wirkung von NKZellen (LINDE et al. 2007). Makrophagen können über Oberflächenrezeptoren wie Mannose- und Glucanrezeptoren, den Scavenger-Rezeptor und Lipopolysacharidrezeptoren (CD14) Pathogene erkennen, phagozytieren und abtöten sowie in der Folge proinflammatorische Zytokine wie Interleukine (IL-1β, IL-6) und Tumornekrosefaktorα (TNF-α) freisetzen, die zur Rekrutierung weiterer Immunzellen führen (MURPHY et al. 2009b). Eine Rekrutierung und Migration von neutrophilen Granulozyten erfolgt durch Ausschüttung von IL-8 und PEEC (pathogen-elicited epithelial chemoattractant) von Darmepithelzellen im Falle einer mikrobiellen Invasion oder Kolonisation. Ein Teil der neutrophilen Granulozyten gelangt auch in das Darmlumen und übt dort ihre antibakterielle Funktion aus (SANSONETTI 2004). Die NK-Zellen und die intraepithelialen γδ-T-Zellen werden der Gruppe der innate like-Lymphozyten zugeordnet und sind in der Lage, schnell Zytokine zu produzieren (MURPHY et al. 2009b). Nicht zuletzt spielen spezifische Rezeptoren von Epithelzellen und dendritischen Zellen, wie zellmembranständige und endosomale toll-like Rezeptoren und zytosomale NOD-Proteine zur Detektion von pathogenen Strukturen (PAMP, pathogen-associated molecular pattern) eine wichtige Rolle im Rahmen von Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismen der unspezifischen Immunabwehr und induzieren über den NFκB-Signalweg die Produktion von Chemokinen und Zytokinen (SANSONETTI 2004; MURPHY et al. 2009b). Im Gastrointestinaltrakt existiert neben den Immunzellen der Lamina propria mucosae ein spezifisches lymphatisches Gewebe, bestehend aus Peyer-Platten und 10 Literaturübersicht isolierten Lymphfollikeln, welches als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) oder auch GALT (gut-associated lymphoid tissue) bezeichnet wird (ALLENSPACH und GASCHEN Immunabwehr 2003; erfolgt ALLENSPACH hier die 2011). Im Antigenaufnahme Rahmen über die der adaptiven M-Zellen des follikelassoziierten Epithels. Mittels Transzytose erfolgt eine Weiterleitung an subepithelial gelegene, Antigen-präsentierende Zellen (Makrophagen, Lymphozyten und dendritische Zellen) und nachfolgend eine Aktivierung von T-Lymphozyten und B-Vorläuferzellen (MURPHY et al. 2009a; ALLENSPACH 2011). Mit Hilfe ihrer charakteristischen Fortsätze können dendritische Zellen auch direkt Antigene durch eine intakte Epithelbarriere aufnehmen und präsentieren. Sie stellen damit ein wichtiges Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem dar. Die Sekretion von IL-6 durch dendritische Zellen induziert einen Switch zur IgAProduktion der B-Zellen (MURPHY et al. 2009a; ALLENSPACH 2011). Die Effektorzellen des spezifischen Immunsystems im Magendarmtrakt sind vor allem die intraepithelialen T-Lymphozyten (CD8+ T-Zellen) und die heterogene Zellpopulation der Lamina propria mucosae (CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, dendritische Zellen, eosinophile Granulozyten und Mastzellen) (MURPHY et al. 2009a). Den vorherrschenden Antikörpertyp im mukosalen Immunsystem stellt das lokal von Plasmazellen produzierte, dimere IgA dar (RUAUX 2011). In den Peyer-Platten und den mesenterialen Lymphknoten kommt es unter Einwirkung des Zytokins TGF-β (transforming-growth-factor β) zur Aktivierung und zum Isotypenwechsel von naiven B-Lymphozyten zu IgA-produzierenden Plasmazellen. Mittels Rezeptor-vermittelter Transzytose (Poly-Ig-Rezeptor) durch unreife Epithelzellen am Grund der Darmkrypten gelangen die Antikörper als sekretorisches IgA ins Darmlumen, binden an die Schleimschicht der Enterozyten, verhindern damit die Anheftung von Mikroorganismen und neutralisieren deren Toxine und Enzyme (MURPHY et al. 2009a; ALLENSPACH 2011). Außerdem wurde ein Einfluss der IgA-Produktion auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora festgestellt, da es bei IgA-Defizienzen zu einer hauptsächlich anaeroben Besiedlung kommt (ALLENSPACH 2011). 11 Literaturübersicht 2.2.3 Orale Toleranz Ein wichtiger Mechanismus des Darmimmunsystems ist die Entwicklung der oralen Toleranz, die eine adäquate Reaktion auf potentielle Pathogene ermöglicht und gleichzeitig eine überschießende Immunreaktion auf Antigene der kommensalen Bakterienflora oder der Nahrung verhindert (STOKES und WALY 2006; ALLENSPACH 2011). Hierbei kommt den dendritischen Zellen eine besondere Bedeutung zu, die die Ausreifung naiver T-Zellen in Richtung einer Th1-, Th2- oder Th17-Antwort beeinflussen. Im Zustand der intestinalen Homöostase und in Gegenwart einer kommensalen, bakteriellen Flora besteht eine Balance zwischen Effektor- und regulatorischen T-Zellsubpopulationen, die durch ein enges Zusammenwirken verschiedener Zytokine gewährleistet ist (ALLENPACH 2011). Ein wichtiger Faktor zur Entwicklung der oralen Toleranz sind die Eigenschaften der kommensalen Bakterien selbst, denen im Gegensatz zu pathogenen Erregern Faktoren wie Adhäsine und Invasine fehlen und die deshalb kaum die intestinale Mukusschicht durchdringen (SANSONETTI 2004). Die Immunantwort des Magendarmtraktes auf kommensale Mikroorganismen ist geprägt durch das Vorhandensein von regulatorischen T-Zellen, die durch Zytokine wie IL-10 und TGF-β die Aktivierung, Differenzierung und Proliferation anderer TZellen hemmen und damit eine entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung vermitteln. Weiterhin finden sich T-Helfer-Zellen vom Typ 2 (Th2), dendritische Zellen und Makrophagen (ALLENPACH und GASCHEN 2003; SANSONETTI 2004). Die Organismen der kommensalen Bakterienflora werden im mukosalen Immunsystem erkannt, da deren Antigene durch dendritische Zellen ohne Expression von kostimulierenden Molekülen präsentiert werden. Gleichzeitig besteht jedoch keine systemische Immunantwort (systemische Ignoranz) (MURPHY et al. 2009a). Kommt es zu Störungen der Schleimhautbarriere und zum Eindringen von Mikroorganismen oder Antigenen, verschiebt sich die Immunreaktion in Richtung einer pro-inflammatorischen, von T-Helfer-Zellen des Typ 1 (Th1) dominierten Reaktion unter der Wirkung von entzündungsfördernden Zytokinen wie IFN-γ und 12 Literaturübersicht TNF-α, die zu einer weiteren Schädigung der Darmschleimhaut führt und somit in einem circulus vitiosus resultiert (ALLENPACH und GASCHEN 2003). Studien an Nagetieren zeigen, dass die Entwicklung der oralen Toleranz durch viele Faktoren, wie Alter des Tieres, genetische und diätetische Faktoren beeinflusst wird (STOKES und WALY 2006). 2.3 Inflammatory bowel disease 2.3.1 Definition, klinische Symptome, Diagnostik und Differentialdiagnosen Die inflammatory idiopathischer bowel disease Enteropathien, wiederkehrenden, die gastrointestinalen (IBD) umfasst eine definitionsgemäß Symptomen Gruppe mit wie chronischer, anhaltenden Erbrechen, oder Durchfall, Gewichtsverlust und Inappetenz über einen Zeitraum von mindestens 3 Wochen sowie dem histologischen Nachweis von Immunzellinfiltraten in der Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes einhergehen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; CERQUETELLA et al. 2010; JERGENS und SIMPSON 2012). Das klinische Bild kann sich jedoch sehr heterogen darstellen. Ein Krankheitsverlauf in Schüben oder Rezidive sind möglich (HALL und GERMAN 2011). Die Diagnose IBD erfolgt als Ausschlussdiagnose und erfordert ein systematisches, diagnostisches Vorgehen zum Ausschluss der zahlreichen Differentialdiagnosen (siehe Tabelle 1) Die diagnostischen Schritte umfassen die Untersuchung von Kot, Urin und Blut, die medikamentöse, antiparasitäre Therapie, die Bestimmung der trypsinähnlichen Immunreaktivität (TLI), Vitamin B12- und Folatkonzentration, die mikrobiologische Untersuchung des Kotes, die sonografische Untersuchung des Bauchraumes, eine Eliminationsdiät und schließlich die endoskopische Untersuchung von Magen, Duodenum und ggf. Kolon mit Entnahme von intestinalen Bioptaten (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; HALL und GERMAN 2011). Die histopathologische Untersuchung der Gewebeproben und ein Vorhandensein von intestinalen Entzündungszellinfiltraten und in einigen Fällen auch strukturellen Veränderungen 13 Literaturübersicht der intestinalen Mukosa sind für die Diagnosestellung essentiell (JERGENS und SIMPSON 2012). Da die histopathologische Beurteilung starken Variablen wie der Anzahl und Qualität der Bioptate, der technischen Aufarbeitung der Proben und nicht zuletzt subjektiven Einflüssen durch die begutachtende Person (interobserver differences) unterliegt, wurde durch die World Small Animal Veterinary Association Gastrointestinal Standardization Group (WSAVA) ein standardisiertes Schema zur Beurteilung von entzündlichen Veränderungen des kaninen und felinen Gastrointestinaltraktes erarbeitet (DAY et al. 2008). Darüber hinaus existieren klinische Beurteilungssysteme, wie der canine inflammatory bowel disease activity index (CIBDAI) und der canine chronic enteropathy clinical activity index (CCECAI), die zur Beurteilung von Krankheitsverlauf und Behandlungserfolg verwendet werden können (JERGENS et al. 2003; ALLENSPACH et al. 2007; JERGENS und SIMPSON 2012) jedoch nicht mit dem Grad der histopathologischen Läsionen korrelieren (ALLENSPACH et al. 2007; CERQUETELLA et al. 2010). Tabelle 1: Differentialdiagnosen zur IBD bei intestinalen Symptomen des Hundes, modifiziert nach ALLENSPACH und GASCHEN (2003) Diätetische Ursachen Infektiöse Ursachen Neoplasie Weitere Ursachen Dünndarm Futtermittelintoleranz Laktoseintoleranz Futtermittelallergie Bakterielle Erreger (Campylobacter ssp., Salmonellen, Clostridien) SIBO (small intestinal bacterial overgrowth)/ARD (antibiotic responsive diarrhoea) Parasiten (Giardien, Kokzidien, Ancylostoma caninum) Malignes Lymphom Mastzelltumor Gastrinom Extraintestinale Erkrankungen (Leber- und Nierenfunktionsstörungen, Pankreasinsuffizienz) Dickdarm Futtermittelintoleranz Futtermittelallergie Parasiten (Trichuris vulpis, Giardia intestinalis) Malignes Lymphom Adenokarzinom Rektale Polypen 14 Literaturübersicht 2.3.2 Erscheinungsformen der kaninen IBD Die Einteilung der verschiedenen Erscheinungsformen der inflammatory bowel disease erfolgt nach Lokalisation der Entzündungsprozesse und nach Art des entzündlichen Infiltrats (GERMAN et al. 2003; GERMAN 2012). Insgesamt tritt die IBD vermehrt bei mittelalten Hunden auf, es besteht jedoch keine Geschlechtsdisposition. Eine Prädisposition bestimmter Rassen ist für einzelne IBDFormen bekannt (JERGENS et al. 1992; CERQUETELLA et al. 2010; GERMAN 2012). Die häufigste Form der IBD stellt die lymphoplasmazelluläre Enteritis (LPE) dar (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011; GERMAN 2012). Hierbei kann sowohl der Magen (lymphoplasmazelluläre Gastroenteritis, LPGE), als auch das Kolon (lymphoplasmazelluläre Enterokolitis, LPEK) in den Entzündungsprozess mit einbezogen sein (GERMAN 2012). Das entzündliche Infiltrat der Mukosa besteht hierbei überwiegend aus Lymphozyten und Plasmazellen, wobei der Entzündungsgrad von einer geringgradigen Infiltration bis hin zu einer hochgradigen Entzündung variieren kann (HALL und GERMAN 2011). Weitere histologische Merkmale einer LPE können Zottenatrophien bzw. -verkürzungen, Epithelläsionen im Zottenbereich, Dilatation von Lymphgefäßen, Erhöhung der intraepithelialen Lymphozytenzahl sowie Kryptdilatationen und -abszesse darstellen. Diese Veränderungen können jedoch auch bei anderen Formen der IBD auftreten (VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989; DAY et al. 2008). Betroffene Hunderassen sind vor allem Deutscher Schäferhund, Shar Pei, Rottweiler und Boxer (CRAVEN et al. 2004; HALL und GERMAN 2011), aber auch Border Collies und Weimaraner zeigen eine erhöhte Inzidenz (KATHRANI et al. 2011a). Patienten mit LPE sind häufig mittelalte bis ältere Hunde. Eine Geschlechtsdisposition ist nicht bekannt (HALL und GERMAN 2011). Gelegentlich tritt auch eine auf das Kolon beschränkte lymphoplasmazelluläre Entzündung (lymphoplasmazelluläre Kolitis, LPC) auf (HALL und GERMAN 2011). 15 Literaturübersicht Eine schwer abzugrenzende Erkrankung und gleichzeitig die wichtigste Differentialdiagnose der LPE stellt das intestinale Lymphom dar, vor allem wenn es sich um eine Neoplasie mit geringem Malignitätsgrad handelt (HALL und GERMAN 2011). Die eosinophile Enteritis kommt im Vergleich zur lymphoplasmazellulären Enteritis selten vor, stellt jedoch die zweithäufigste Form der IBD dar (HALL und GERMAN 2011; GERMAN 2012). Auch hierbei können außer dem Dünndarm andere Lokalisationen des Gastointestinaltraktes in das Entzündungsgeschehen einbezogen sein (eosinophile Gastroenteritis, EGE; eosinophile Enterokolitis, EEK) (SIMPSON und JERGENS 2011). Histologisch lässt sich neben strukturellen Veränderungen der Schleimhautarchitektur wie einer Atrophie der Darmzotten, ein gemischtzelliges, überwiegend eosinophiles Entzündungszellinfiltrat feststellen. In einigen Fällen zeigen die erkrankten Hunde zusätzlich eine periphere Eosinophilie. Häufiger als bei anderen IBD-Formen zeigen die Tiere erosive und ulzerative Läsionen, die klinisch zu Hämatemesis und Meläna führen (HALL und GERMAN 2011). Oft sind junge Tiere, im Alter von 5 Jahren oder jünger, betroffen (QUIGLEY und HENRY 1981; VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989). Eine Prädisposition besteht für den Boxer, den Deutschen Schäferhund und den Dobermann. Aufgrund der Beteiligung von eosinophilen Granulozyten sind vor allem parasitär und allergisch bedingte Erkrankungen differentialdiagnostisch auszuschließen (VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989; HALL und GERMAN 2011; SIMPSON und JERGENS 2011; GERMAN 2012). Die granulomatöse Enteritis stellt beim Hund eine sehr seltene Form der IBD dar und geht mit einer oft unregelmäßigen Infiltration von Makrophagen und Granulomformationen in der Mukosa des Dünn- und Dickdarms einher (HALL und GERMAN 2011). Darüber hinaus existieren rassespezifische Formen der inflammatory bowel disease. Die immunproliferative Enteropathie der Basenjis betrifft vor allem den Magen und proximale Teile des Dünndarms. Klinisch geht diese Erkrankung vor allem mit progressiver, unstillbarer Diarrhö und Kachexie, aber auch mit Erbrechen einher. Die histopathologischen Läsionen umfassen eine Hypertrophie der Magenschleimhaut 16 Literaturübersicht mit Hyperplasie von Haupt- und Belegzellen, Ulzerationen, Zottenverkürzung und Infiltrationen der Lamina propria mucosae mit Lymphozyten, Plasmazellen und wenigen neutrophilen Granulozyten. Weiterhin ist klinisch ein Anstieg von IgAAntikörpern im Serum festzustellen. Ein genetischer Einfluss auf die Pathogenese mit autosomal-rezessiver Vererbung wird vermutet (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011). Die Erkrankung verläuft progressiv und endet trotz medikamentöser Behandlung oft tödlich (GERMAN 2012). Die histiozytäre, ulzerative Kolitis des Boxers (HUC), auch als granulomatöse Kolitis der Boxer bezeichnet, tritt vor allem bei jungen Tieren (unter 4 Jahren) auf und zeichnet sich durch eine Kolitis mit Beteiligung von großen, in der Reaktion mit periodic acid Schiff (PAS) positiven Makrophagen sowie eine ulzerative Entzündungskomponente und den Verlust von Becherzellen aus (GERMAN et al. 2003; MANSFIELD et al. 2009; CRAVEN et al. 2011). In neueren Untersuchungen wurde ein Zusammenhang zwischen klinischer Symptomatik und dem Vorhandensein adhärenter und invasiver Escherichia coli Bakterien nachgewiesen (MANSFIELD et al. 2009), welche den idiopathischen Charakter und die Eingruppierung in den Krankheitskomplex der IBD in Frage stellen. In jüngster Zeit wurden auch Fälle von granulomatöser Kolitis bei jungen Französischen Bulldogen beschrieben, die starke Parallelen zum Krankheitsbild des Boxers zeigen und bei denen ebenfalls ein kausaler, pathogenetischer Zusammenhang mit adhärenten und invasiven Escherichia coli nachgewiesen wurde (CRAVEN et al. 2011; MANCHESTER et al. 2013). Die oft progressiv verlaufende Gastroenteropathie der Norwegischen Lundehunde (Lundehund syndrome) geht mit einer chronischen, atrophischen Gastritis, lymphoplasmazellulären Infiltraten und Lymphangiektasien im Dünndarm sowie einem Proteinverlust einher (BERGHOFF et al. 2007). Klinisch zeigen die Tiere neben Durchfall, Erbrechen und Gewichtsverlust auch Aszites, Hypalbuminämie und subkutane Ödeme. Histologische Veränderungen sind aber auch bei Tieren ohne klinische Symptomatik beschrieben worden (BERGHOFF et al. 2007). 17 Literaturübersicht Das klinische Bild der Protein-Verlust Enteropathie (protein losing enteropathy, PLE) und –Nephritis (protein losing nephropathy, PLN) beim Soft Coated Wheaten Terrier ist allem Anschein nach eine genetisch bedingte Erkrankung, die auf einen gemeinsamen, männlichen Vorfahren zurückzuführen ist. Somit sollte dieser Erkrankungskomplex nicht mehr unter dem Oberbegriff der idiopathischen IBD geführt werden (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011). 2.3.3 Pathogenese der IBD Die Pathogenese der kaninen inflammatory bowel disease ist wahrscheinlich bedingt durch eine Dysregulation des intestinalen Immunsystems, wobei jedoch auch umweltbedingte Faktoren, insbesondere Nahrungsmittelantigene und intestinale Mikroorganismen sowie genetische Einflüsse eine Rolle spielen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; GERMAN et al. 2003). 2.3.3.1 Immunpathologische Krankheitseinflüsse Die Aufgabe des intestinalen Immunsystems besteht in einer Barrierefunktion der Mukosa und der Kontrolle des Antigenkontaktes (GERMAN 2012). Dabei sorgen die Mechanismen der oralen Toleranz für eine Unterdrückung einer überschießenden Immunantwort gegen harmlose Umweltantigene. Die kanine IBD entwickelt sich, wenn diese Abläufe gestört werden, zu einer unkontrollierten immunologischen Reaktion auf Antigene aus Nahrung und kommensaler Bakterienflora, dem Zusammenbruch der intestinalen Barriere und endet in einer unkontrollierten Entzündungsreaktion (GERMAN 2012). Erkenntnisse zur Immunpathogenese der IBD bei Hunden sind begrenzt und zeigen in einigen Fällen gegensätzliche Ergebnisse. Mehrere immunhistochemische Untersuchungen zeigten eine veränderte Immunzellpopulation in der Lamina propria mucosae bei Hunden mit IBD. JERGENS et al. (1996) beschreiben eine Abnahme der CD3+ T-Zellen und IgGproduzierenden Untersuchungen Plasmazellen von im Bioptaten Duodenum aus dem erkrankter Dickdarm Tiere. von Ähnliche Tieren mit lymphoplasmazellulärer Kolitis (JERGENS et al. 1999) und von transmuralen 18 Literaturübersicht Bioptaten aus Magen, Duodenum, Ileum und Kolon von Tieren mit lymphoplasmazellulärer und eosinophiler Enteritis (KLEINSCHMIDT et al. 2006) zeigten wiederum einen deutlichen Anstieg von CD3+ T-Zellen sowie IgA- und IgGproduzierenden Plasmazellen. STONEHEWER et al. (1998) berichten von einem Anstieg von T- und B-Lymphozyten in der Mukosa des Kolons von erkrankten Hunden. Eine Studie von GERMAN et al. (2001) wies einen signifikanten Anstieg von IgG-positiven Plasmazellen, CD3+ und CD4+ T-Zellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bei erkrankten Tieren als Ausdruck proinflammatorischer Veränderungen der Mukosa nach. Eine Untersuchung von DANDRIEUX et al. (2008) zeigte, dass die Apoptoserate von Lymphozyten im Bereich der Duodenalzotten bei gesunden Tieren höher ist als bei Hunden mit IBD und möglicherweise eine Apoptoseresistenz von Lymphozyten eine pathogenetische Bedeutung bei der kaninen inflammatory bowel disease zukommt. Untersuchungen signifikante zum Abnahme Verhalten von dieser Zellen regulatorischen im T-Zellen Duodenum von zeigten eine Tieren mit lymphoplasmazellulärer und eosinophiler Enteritis, während in Magen und Kolon keine Unterschiede festgestellt wurden (JUNGINGER et al. 2012). Die Autoren vermuten eine gestörte Homöostase der regulatorischen T-Zellen als pathogenetischen Faktor bei der Krankheitsentstehung (JUNGINGER et al. 2012). Eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der oralen Toleranz spielen antigenpräsentierende dendritische Zellen. Eine Untersuchung von KATHRANI et al. (2011c) mit einem Marker gegen CD11c, welcher vor allem kanine dendritische Zellen detektiert, zeigte eine signifikante Abnahme positiver Zellen in Fällen kaniner IBD. Einige Untersuchungen beschäftigen sich mit der Rolle von Mastzellen bei der kaninen IBD. Während GERMAN et al. (2001) von einer verminderten Mastzellzahl in der Mukosa des Duodenums von IBD Tieren berichten, beschreiben die Ergebnisse einer anderen Studie (KLEINSCHMIDT et al. 2006) ein differenzierteres Bild. Diese Untersuchung zeigte eine Abnahme der Mastzellzahlen bei LPE, während bei EGE die Mastzellenzahlen erhöht waren und deutet auf unterschiedliche Pathogenesemechanismen beider Krankheitsformen hin (KLEINSCHMIDT et al. 19 Literaturübersicht 2006). Die Autoren vermuten einen Th1-dominierten Entzündungsprozess bei lymphoplasmazellulärer IBD und eine pathogenetische Bedeutung einer Typ 1 Hypersensitivitätsreaktion mit Th2-dominierter Immunantwort bei eosinophilen Formen der IBD (KLEINSCHMIDT et al. 2006). Eine Untersuchung von LOCHER et al. (2001) zeigte erhöhte Mastzellzahlen und vermehrt IgE-positive Zellen bei erkrankten Tieren, welche auf eine IgE-vermittelte Hypersensitivitätsreaktion bei der Krankheitsentstehung hindeuten. Verschiedene Studien untersuchten Veränderungen des Zytokinspektrums in Hinsicht auf pathogenetische Aspekte. GERMAN et al. (2000) beschrieben einen Anstieg proinflammatorischer und immunreguatorischer Zytokine (TNF-α bzw. TGFβ) auf mRNA-Ebene. Sowohl Zytokine einer Th1-Immunantwort wie IL-2, IL-12p40 und IFN-γ, als auch das für eine Th2-Immunreaktion charakteristische IL-5 waren aufreguliert, sodass ein uneinheitliches Zytokinprofil bei der kaninen IBD vermutet wird (GERMAN et al. 2000). PETERS et al. (2005) quantifizierten die mRNAExpression verschiedener Interleukine und Zytokine mittels real time-PCR, stellten jedoch keine Unterschiede zwischen gesunden Tieren und Hunden mit chronischen Durchfallerkrankungen Zytokinexpression fest. Neuere verschiedener Untersuchungen T-Zellsubpopulationen charakterisierten und stellten die eine verminderte Expression von IL-17A-mRNA bei erkrankten Deutschen Schäferhunden und Hunden anderer Rassen fest, während die Expression weiterer Zytokine (IL-10, IL-22, IFN-γ, TGF-β) unverändert blieb und kein deutliches Th1/Th17-Zytokinmuster erkennen ließ (SCHMITZ et al. 2012). Die Autoren vermuten, dass ein Mangel an IL17A zu einer erhöhten Permeabilität der epithelialen Barriere mit nachfolgender Verstärkung der entzündlichen Prozesse führt (SCHMITZ et al. 2012). Eine weitere Untersuchung der mRNA-Expression intestinaler Zytokine mit Meta-Analyse anderer Untersuchungen zeigte ebenfalls keine Tendenzen zu einer Th1- bzw. Th2dominerten Immunantwort (JERGENS et al. 2009). Es wurde eine konstitutive Expression von zahlreichen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen im unveränderten Intestinaltrakt gesunder Tiere nachgewiesen, welche möglicherweise eine bedeutende Rolle für die intestinale Homöostase hat (JERGENS et al. 2009). 20 Literaturübersicht Einschränkend muss bei diesen Studien beachtet werden, dass es sich um Untersuchungen auf genetischer Ebene und nicht um Messungen der Zytokine auf Proteinebene handelt. Diese können zum Beispiel durch posttranskriptionelle Regulationsmechanismen voneinander abweichen (GERMAN et al. 2000; PETERS et al. 2005; SCHMITZ et al. 2012). In einer Studie von MAEDA et al. (2012) hingegen wurden das proinflammatorische Zytokin IL-1β und dessen endogenen Antagonisten IL-1Ra auf mRNA- und Proteinebene untersucht, wobei eine Imbalance bei IBDFällen im Vergleich zu gesunden Tieren und Hunden mit einem intestinalen Lymphom nachgewiesen wurde. MAEDA et al. (2011) untersuchten auch die Rolle von Chemokinen bei kaniner IBD und beschrieben eine Aufregulation verschiedener Chemokine, die zur Migration von Entzündungszellen beitragen. Die zugehörigen Rezeptoren zeigten keine veränderte Expression (MAEDA et al. 2011). Neben den Mechanismen der adaptiven Immunantwort ist anscheinend aber auch eine Dysfunktion der angeborenen Immunität bei der Pathogenese der IBD von Bedeutung (CATCHPOLE und ALLENSPACH 2012). So zeigen Tiere mit IBD eine veränderte Expression, Dysfunktion oder Dysregulation von toll like-Rezeptoren (TLR), die der Detektion von pathogenen Strukturen (PAMP) dienen (CERQUETELLA et al. 2010; ALLENSPACH 2011). BURGENER et al. (2008) berichten von einer Aufregulation von TLR-2, -4 und -9 in Duodenum und Kolon bei Patienten mit kaniner IBD und vermuten eine Verstärkung der Entzündungsreaktion durch Interaktion mit mikrobiellen Antigenen. Der Umstand, dass auch nach klinischer Remission eine erhöhte Expression von mRNA für diese Rezeptoren bestand, deutet möglicherweise auf eine genetische Prädisposition hin. Eine andere Untersuchung zeigte eine ebenfalls eine erhöhte Expression von TLR-2, die eine leichte Korrelation mit der klinischen Symptomatik (Aktivitätsscore) aufwies (MCMAHON et al. 2010). Neben Zytokinen und toll like-Rezeptoren wurden zahlreiche, weitere serologische und gewebsspezifische Biomarker, wie pANCA (perinuclear anti-neutrophil antibody), CRP (C-reaktives Protein) und NFκB (nuclear factor kappa light-chain enhancer), 21 Literaturübersicht bezüglich ihrer diagnostischen und prognostischen Aussagekraft untersucht, dienen zur Zeit jedoch nur als ergänzende, klinische Werkzeuge (ALLENSPACH 2011; JERGENS und SIMPSON 2012). 2.3.3.2 Diätetische und mikrobielle Einflüsse Die kommensale Bakterienflora des Intestinaltraktes erfüllt die Funktion einer Schutzbarriere gegen Pathogene. Gleichzeitig beeinflusst sie die Aufnahme von Nährstoffen und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Immunsystems (SUCHODOLSKI 2011). Bei Tieren mit IBD wurde eine veränderte intestinale Mikroflora festgestellt (JERGENS und SIMPSON 2012; SUCHODOLSKI 2011). Bei erkrankten Tieren fand sich ein erhöhter Anteil an Protobacteria einschließlich Enterobacteriaceae sowie ein verminderter Anteil an Bacteriodetes in der intestinalen Flora (XENOULIS et al. 2008; JERGENS und SIMPSON 2012; SUCHODOLSKI 2011). Organismen der Gruppe Clostridiaceae wurden vermutlich aufgrund abweichender Probenentnahmeverfahren und Untersuchungspopulation sowohl vermehrt als auch in geringerer Menge bei Hunden mit IBD nachgewiesen (XENOULIS et al. 2008; SUCHODOLSKI et al. 2010). Weiterhin zeigte sich eine verminderte Speziesdiversität der bakteriellen Flora im Dünndarm von IBD Tieren (XENOULIS et al. 2008; SUCHODOLSKI 2011). Inwieweit es sich dabei um primäre Veränderungen handelt, die der Entstehung einer IBD vorrausgehen oder ob es sich um unspezifische Veränderungen der intestinalen Flora im Rahmen einer allgemeinen Entzündungsreaktion handelt, bleibt unklar. Nichtsdestotrotz wird eine Beteiligung intestinaler Mikroorganismen an der Pathogenese der kaninen inflammatory bowel disease in Form einer überschießenden Immunreaktion gegenüber kommensalen Antigenen von einigen Autoren vermutet (GERMAN et al. 2003; CERQUETELLA et al. 2010; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012) und wurde im Falle der histiozytären, ulzerativen Kolitis des Boxers inzwischen auch nachgewiesen (MANSFIELD et al. 2009; CRAVEN et al. 2011). 22 Literaturübersicht Nicht zuletzt kann die Zusammensetzung der intestinalen Flora durch exogene Faktoren, wie die aufgenommene Nahrung, beeinflusst werden (SUCHODOLSKI 2011). Eine wichtige therapeutische Maßnahme bei IBD besteht in einer Umstellung der Fütterung auf leicht verdauliche Nahrung oder auf Futter mit nur einer Proteinund Kohlenhydratquelle (JERGENS und SIMPSON 2012; HALL und GERMAN 2011). Diese Maßnahme soll die im Darm vorhandene Antigenmenge vermindern und damit den Entzündungsprozess in der Mukosa reduzieren (HALL und GERMAN 2011). Zur Abgrenzung einer Futtermittelallergie oder –unverträglichkeit, die wichtige Differentialdiagnosen zu idiopathischen Enteropathien darstellen, wird die Durchführung einer Eliminationsdiät im Rahmen der Diagnostik in der Fachliteratur empfohlen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; CERQUETELLA et al. 2010; SIMPSON und JERGENS 2011; HALL und GERMAN 2011). 2.3.3.3 Genetische Krankheitseinflüsse Die Tatsache, dass bestimmte Hunderassen prädisponiert sind und somit ein höheres Risiko tragen, an IBD zu erkranken sowie das Vorkommen einiger spezifischer IBD-Formen nur bei bestimmten Rassen oder Zuchtlinien deutet auf eine genetische Komponente der Krankheitsentstehung hin (GERMAN et al. 2003; KATHRANI et al. 2011a; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012). Wie bei der Enteropathie des Basenjis ist jedoch oft der Vererbungsmodus nicht bekannt (HALL und GERMAN 2011). Der Umstand, dass eine Aufregulation von TLR auch nach Besserung klinischer Symptome besteht, lässt eine genetische Prädisposition vermuten (BURGENER et al. 2008). Andere Autoren berichten von IBD-assoziierten, genetischen Polymorphismen (SNP, single nucleotide polymorphism) des TLR-4 und TLR-5 bei Deutschen Schäferhunden und des TLR-5 bei anderen Hunderassen, die möglicherweise mit Veränderungen der Proteinstruktur und Rezeptorfunktionalität einhergehen (KATHRANI et al. 2010; 2011b). Bei der histiozytären, ulzerativen Kolitis des Boxers wurde ein krankheitsassoziierter Nukleotidpolymorphismus in einem Gen (NCF2) entdeckt, welches an der Funktion 23 Literaturübersicht des respiratory burst in neutrophilen Granulozyten beteiligt ist und somit möglicherweise deren Fähigkeit intrazelluläre Pathogene zu eliminieren beeinträchtigt (CRAVEN et al. 2011; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012). 2.4 Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt Histamin ist ein biogenes Amin mit vielfältigen physiologischen und pathologischen Funktionen, dessen Effekte im Gastrointestinaltrakt erstmalig im Jahre 1910 beschrieben wurden (DALE und LAIDLAW 1910; PARSON und GANELLIN 2006; CORUZZI et al. 2012). Histamin wird durch das Enzym Histidindecarboxylase synthetisiert und in Mastzellen, basophilen Granulozyten und enterochromaffinähnlichen Zellen sowie im Magendarmtrakt auch in Nervenfasern und endokrinen Zellen gespeichert (PANULA et al. 1985; JUTEL et al. 2009; PARSON und GANELLIN 2006; CORUZZI et al. 2012). Andere Zellen, wie dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten, Thrombozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten sind nach Aktivierung durch verschiedene Stimuli zur de novo-Synthese von Histamin befähigt (JUTEL et al. 2002; WU et al. 2004; HUANG und THURMOND 2008; JUTEL et al. 2009; BÄUMER und ROßBACH 2010; CORUZZI et al. 2012). Bis heute wurden durch zahlreiche, mehrheitlich funktionelle Untersuchungen vier verschiedene Histaminrezeptoren beschrieben, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung als Histaminrezeptor 1 (H1R), Histaminrezeptor 2 (H2R), Histaminrezeptor 3 (H3R) und Histaminrezeptor 4 (H4R) bezeichnet werden (HILL et al. 1997; NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000). Alle Histaminrezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Proteine und besitzen sieben Transmembrandomänen, unterscheiden sich jedoch bezüglich der intrazellulären Signalübertragungsmechanismen (HILL et al. 1997; DE ESCH et al. 2005; AKDIS und SIMONS 2006; HUANG und THURMOND 2008; JUTEL et al. 2009) (siehe Tabelle 2). 24 Literaturübersicht Tabelle 2: Signalübertragungswege der Histaminrezeptoren nach HILL et al. (1997), DE ESCH et al. (2005), AKDIS und SIMONS (2006), HUANG und THURMOND (2008) und JUTEL et al. (2009) Rezeptor G-Protein H1R Gq Signalübertragung Aktivierung der Phospholipase C, Anstieg von Inositoltriphosphat (IP3), Freisetzung von intrazellulären Ca2+-Ionen Aktivierung von NFκB H2R Gs H3R Gi/o H4R Gi/o Aktivierung der Adenylylcyclase, Erhöhung intrazellulärer cAMPLevel Inaktivierung der Adenylylcyclase, Verminderung intrazellulärer cAMP-Level Inaktivierung der Adenylylcyclase, Verminderung intrazellulärer cAMP-Level Aktivierung von Phospholipase C, Freisetzung von intrazellulären Ca2+-Ionen SANDER et al. (2006) beschreiben die Expression von Histaminrezeptoren im humanen Gastrointestinaltrakt mittels molekularbiologischen und immunhistochemischen Methoden sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene. Die Ergebnisse zeigen eine ubiquitäre Expression von H1R und H2R in mehreren Lokalisationen des Darmtraktes (Duodenum, Ileum, Kolon, Rektum) sowie eine H4RExpression auf niedrigerem Level. Immunhistochemisch wurde H1R in Enterozyten, Bindegewebszellen, enterischen Immunzellen, Nervensystems Blutgefäßen, dargestellt. Myozyten H2R zeigte und ein Zellen des ähnliches immunhistochemisches Expressionsmuster in Enterozyten, Immunzellen, glatten Muskelzellen und Ganglienzellen, während H4R immunhistochemisch nur in intravasalen Leukozyten, neuroendokrinen Zellen und einigen Enterozyten (apikal der Lieberkühn-Krypten) nachgewiesen wurde. Der H3R konnte weder in der Darmwand noch in enterischen Nervenfasern immunhistochemisch dargestellt werden (SANDER et al. 2006). Auch eine Arbeit von BOER et al. (2008) beschäftigt sich mit der Expression von Histaminrezeptoren im humanen Kolon, wobei neben kolorektalen Neoplasien auch unverändertes Dickdarmgewebe untersucht wurde. Mittels real time-PCR und 25 Literaturübersicht Western Blot wurden H1R-, H2R- und H4R-mRNA und -protein in Kolongewebe nachgewiesen, während niedrige Level von H3R-mRNA nur in 7,9% der Proben aufgefunden wurden (BOER et al. 2008). Eine immunhistochemische Untersuchung im Rahmen derselben Arbeit zeigte eine kräftige Expression von H1R, H2R und H4R durch Enterozyten in unverändertem Gewebe. Eine deutliche Expression von H1R und H2R zeigten auch andere, nicht näher spezifizierte Zellen der Lamina mucosa sowie submukosale Bindegewebszellen, während die H4R-Expression dieser Zellen schwächer ausgeprägt war und im Falle der Bindegewebszellen der Tela submucosa nur sporadisch festgestellt wurde (BOER et al. 2008) Eine andere Studie wies eine mRNA-Expression von H1R, H2R und H4R in humanen CD8+ Lymphozyten nach, während H3R nicht nachgewiesen werden konnte (GANTNER et al. 2002). CD4+ Lymphozyten exprimieren niedrige Level der H4RmRNA, jedoch keine H3R-mRNA (LING et al. 2004). Hohe Level von H4R-mRNA wurden wiederum in eosinophilen Granulozyten und dendritischen Zellen festgestellt (GANTNER et al. 2002; LING et al. 2004). Dendritische Zellen tragen alle vier Histaminrezeptoren (GANTNER et al. 2002; AKDIS und SIMONS 2006; JUTEL et al. 2009). 2.4.1 Funktionelle Aspekte von Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt Histaminrezeptoren vermitteln verschiedenste intestinale Effekte und die Rolle von Histamin in der Physiologie und Pathologie des Gastrointestinaltraktes war und ist Gegenstand vieler wissenschaftlicher Studien. Dabei wurde ein Teil der Untersuchungen an humanen Proben und Geweben durchgeführt (STEAD et al. 1989; KEELY et al. 1995; BARBARA et al. 2004; LING et al. 2004; BREUNIG et al. 2007). Forschungsergebnissen aus Tiermodellen, vor allem Studien mit Meerschweinchen, Mäusen und Ratten, kommt jedoch ebenfalls eine große Bedeutung zu (HARRY 1963; BARKER und EBERSOLE 1982; RANGACHARI und MCWADE 1986; YAMANAKA und KITAMURA 1987; WANG und COOKE 1990; TRAYNOR et al. 1992; KHAN et al. 1994; COOKE et al. 1995; IZZO et al. 1998; HEMEDAH et al. 2000; HOFSTRA et al. 2003). Die Ergebnisse aus einer Vielzahl 26 Literaturübersicht dieser, oft funktionellen Untersuchungen zeigen die Bedeutung und Wirkungsweise von Histamin und seinen verschiedenen Rezeptoren für die Motilität, Sekretion, vaskuläre Permeabilität, Hämodynamik und immunologische Vorgänge in Magen und Darm (FOGEL et al. 2005a). Dabei ist zu beachten, dass ein Teil der Untersuchungen zu einem Zeitpunkt durchgeführt wurde, an dem noch nicht alle vier Histaminrezeptoren entdeckt beziehungsweise funktionell beschrieben waren. Eine Verwendung von pharmakologischen Substanzen, die hierbei als vermeintlich spezifische Liganden eingesetzt wurden, tatsächlich jedoch auch an bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte Rezeptoren banden, kann somit zur Verzerrung von Ergebnissen geführt haben (POLI et al. 2001; AKDIS und SIMONS 2006; BÄUMER und ROßBACH 2010; CORUZZI et al. 2012). Darüber hinaus bestehen mitunter starke speziesspezifische Unterschiede in Verteilungsmuster, Proteinstruktur und Nukleotidsequenzen der einzelnen Histaminrezeptoren, die sich möglicherweise auch funktionell auswirken können (KHAN et al. 1994; XIE und HE 2005; PARSON und GANELLIN 2006; JIANG et al. 2008; BÄUMER und ROßBACH 2010). 2.4.1.1 Gastrointestinale Motilität Bereits im Jahre 1910 beschrieben DALE und LAIDLAW (1910) einen Effekt von Histamin auf den Tonus von Dünndarmschlingen. Es gibt zahlreiche, meist funktionelle Studien, die verschiedene Mechanismen der Wirkung von Histamin auf die gastrointestinale Motilität beschreiben. Direkte kontraktile Effekte von Histamin auf die glatte Muskulatur des Ileums über postsynaptische, nicht cholinerge Rezeptoren wurden von HARRY (1963) im Meerschweinchenmodell gezeigt. Im Jahre 1977 zeigten HILL et al. die spezifische Bindung eines H1R-Antagonisten an den H1R in glatter Muskulatur des Darmtraktes von Meerschweinchen. Untersuchungen an der Lamina muscularis mucosae des Magens von Hunden zeigten abhängig von der Histaminkonzentration einen kontraktilen, über H1R vermittelten und einen entspannenden, via H2R vermittelten Effekt (MULLER et al. 1993). Ähnliche Beobachtungen machten auch YAMANAKA 27 Literaturübersicht und KITAMURA (1987) im Ileum von Meerschweinchen. Untersuchungen der Lamina muscularis mucosae des kaninen Kolons hingegen zeigten lediglich via H1Rvermittelte, kontraktile Effekte, während keine Reaktion auf H2R-Agonisten nachgewiesen werden konnten (MULLER et al. 1990). Weiterhin spielen Histaminrezeptoren bei der neuronalen Signalübertragung im enterischen Nervensystem eine bedeutende Rolle und modulieren die Kontraktionen der glatten Muskulatur. So berichteten BARKER und EBERSOLE (1982) in einer funktionellen Studie über kontraktile Effekte an Proben aus dem Ileum von Meerschweinchen. Diese werden durch eine H2R vermittelte Ausschüttung von Mediatoren, wie Acetylcholin und Substanz P, aus Neuronen des Plexus myentericus bewirkt (BARKER und EBERSOLE 1982). Neuronal ausgelöste, über H1R und H2R vermittelte Kontraktionen bei hohen Histaminkonzentrationen beschrieben IZZO et al. (1998) im Ileum vom Meerschweinchen. Für den H3R, der an prä- und postganglionären Lokalisationen beschrieben wurde, sind vor allem inhibitorische Effekte auf die Ausschüttung von exzitatorischen Neurotransmittern bekannt (POLI et al. 2001). Bezüglich der Expression und funktionellen Bedeutung von H3R im Magendarmtrakt existieren anscheinend speziesspezifische Unterschiede. So zeigten in vitro-Untersuchungen an Proben von Meerschweinchen (IZZO et al. 1998) eine Hemmung neuronal ausgelöster Kontraktionen der glatten Muskulatur des Ileums, die durch eine präsynaptische Inhibition an Interneuronen via H3R vermittelt wurde. POLI et al. (2001) berichteten von einer Verlängerung der gastrointestinalen Passage bei Mäusen durch die Gabe eines H3R Agonisten. Jedoch konnte in funktionellen Studien an Geweben von Kaninchen, Ratten und Menschen keine Beteiligung von H3R an der gastrointestinalen Motilität nachgewiesen werden (POZZOLI et al. 1997; HEMEDAH et al. 2000; POLI et al. 2001). Auch mittels in situ-Hybridisierung wurde im Ileum von Ratten keine H3R-mRNA nachgewiesen (HEMEDAH et al. 2000). Neuere Untersuchungen aus der Humanmedizin zeigten, dass Neuronen des Plexus submucosus durch Histamin reizbar sind und alle 4 Histaminrezeptoren an dieser Reaktion beteiligt sind (BREUNIG et al. 2007). 28 Literaturübersicht 2.4.1.2 Sekretion Einen wichtigen Aspekt der intestinalen Barrierefunktion stellt die Sekretion von Ionen und Wasser durch Epithelzellen dar, die einerseits die Fluidität der Mukusschicht erhält und andererseits durch erhöhe Sekretion Noxen im Darmlumen beseitigt (WANG und COOKE 1990; COOKE 2000). Die Regulation der Chloridsekretion kann direkt durch Histamin über H1R auf Enterozyten erfolgen wie in vitro-Untersuchungen am humanen Kolon zeigten (KEELY et al. 1995). Untersuchungen der Chloridsekretion am Meerschweinchenmodell deuten auf einen ähnlichen Mechanismus hin (WANG und COOKE 1990). Durch Untersuchungen in Ussing-Kammern am Kolonepithel von Schweinen zeigten TRAYNOR et al. (1992), dass Histamin über den H1R die Natrium- und Chloridsekretion erhöht, während die Chloridabsorption gehemmt wird. Weiterhin wurde an Kolongewebe von Meerschweinchen ein indirekter Einfluss auf die Stimulation der Chloridsekretion nachgewiesen, welcher über H2R auf Interneuronen des enteralen Nervensystems vermittelt wird (WANG und COOKE 1990; COOKE et al. 1995). Eine vermehrte Chloridsekretion ist funktionell eng verbunden mit der Regulation der Motilität (COOKE 2000). 2.4.1.3 Sekretion von Magensäure und Schleimhautschutz Weiterhin sind Histamin und insbesondere der H2R von großer Bedeutung für die Regulation der Magensäureproduktion von Belegzellen und damit für den Schleimhautschutz des Magens (HILL et al. 1997; CORUZZI et al. 2012). Dabei wird Histamin vor allem von enterochromaffin-ähnlichen Zellen freigesetzt und bewirkt eine parakrine Stimulation der basolateral lokalisierten H2R der Belegzellen (KOPIC und GEIBEL 2010). Therapeutisch werden auch in der Tiermedizin H2R-spezifische Antagonisten wie Ranitidin und Cimetidin bei Hyperazididät und peptischen Magenulzera zur Hemmung der Magensäureproduktion verwendet (NEIGER 2011). Untersuchungen von KOBAYASHI et al. (2000) an H2R-defizienten Mäusen zeigten eine Hypertrophie der Mukosa des Magens und eine veränderte Zellmorphologie von Belegzellen und enterochromaffin-ähnlichen Zellen. Histamin und Gastrin zeigten in 29 Literaturübersicht diesem Modell keinen Einfluss auf die Magensäureproduktion, während die Wirkung von Carbachol, einem Acetylcholinanalogon, erhalten blieb und der Basis-pH im Magen normal war (KOBAYASHI et al. 2000). Es wird davon ausgegangen, dass Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Signalwegen, welche die Magensäuresekretion beeinflussen, existieren (KOPIC und GEIBEL 2010). Aktuelle Studien deuten auf eine mögliche Beteiligung des H4R an der Entstehung von ulzerativen Läsionen durch Histamin hin, da die Verwendung selektiver H4RAntagonisten bei Ratten und Mäusen gastroprotektive Effekte zeigten (CORUZZI et al. 2009; CORUZZI et al. 2012). Mittels Immunhistochemie konnten MORINI et al. (2008) in der Mukosa des Magenfundus von Ratten H3R und H4R auf endokrinen Zellen darstellen. Da keine Kolokalisation dieser Rezeptoren festgestellt werden konnte, vermuten die Autoren eine Expression der jeweiligen Histaminrezeptoren auf unterschiedlichen Zelltypen und schließen auf verschiedene Funktionen von H3R und H4R (MORINI et al. 2008). 2.4.1.4 Intestinale Hämodynamik und vaskuläre Permeabilität Eine der wichtigsten Funktionen von Histamin im Rahmen einer entzündlichen Reaktion besteht in der Dilatation von Gefäßen und Erhöhung der vaskulären Permeabilität vermittelt durch H1R (WALUS et al. 1981; GUTH und HIRABAYASHI 1982; DE ESCH et al. 2005; JUTEL et al. 2009; CORUZZI et al. 2012). In vivo-Untersuchungen über die hämodynamischen Effekte von Histamin an mesenterialen Gefäßen von Hunden zeigten eine anfängliche transiente, über H1R vermittelte Vasodilatation (WALUS et al. 1981). Wurde diese H1R-Reaktion geblockt, zeigte sich eine verzögerte Vasodilatation via H2R (WALUS et al. 1981). Auch Untersuchungen zum postischämischen Blutfluss im Ileum von Hunden wiesen eine via H2R vermittelte Vasodilatation durch endogenes Histamin nach (KASZAKI et al. 1994). In Studien zur mikrovaskulären Permeabilität in der Tunica muscularis des Dünndarms von Ratten bewirkte Histamin eine dosisabhängige Erhöhung der 30 Literaturübersicht Durchlässigkeit kleiner Gefäße für Makromoleküle (GUTH und HIRABAYASHI 1982). Die Verwendung von H1R- und H2R-Agonisten und -Antagonisten deuten auf einen H1R-vermittelten Effekt hin (GUTH und HIRABAYASHI 1982). Zu anderen Ergebnissen kommen MORTILLARO et al. (1981), die die kapilläre Permeabilität am Ileum von Katzen untersuchten und eine hauptsächlich über H2R vermittelte Erhöhung der Permeabilität für Plasmaproteine beschrieben, während die Vasodilatation über H1R vermittelt wurde. 2.4.1.5 Immunmodulation Eine enge mikroanatomische Lokalisation von Immunzellen und enterischen Nervenfasern bildet die Basis für neuroimmunologische Interaktionen im Magendarmtrakt (STEAD et al. 1989; BARBARA et al. 2004). Eine besondere Bedeutung kommt hierbei den intestinalen Mastzellen zu, die teilweise einen direkten Membrankontakt zu peripheren Nervenfortsätzen aufweisen (STEAD et al. 1989) und durch Ausschüttung von Mediatoren, unter anderem Histamin, eine parakrine Signalübertragung bewirken (HE 2004; CORUZZI et al. 2012). Untersuchungen von HOFSTRA et al. (2003) zeigten eine Expression von H4R in humanen Mastzellen sowie eosinophilen und basophilen Granulozyten. In derselben Studie wurde eine über H4R vermittelte, chemotaktische Wirkung von Histamin auf murine Mastzellen beschrieben (HOFSTRA et al. 2003). Es fanden sich jedoch keine Hinweise auf via H4R vermittelte Effekte auf die Degranulation, Proliferation oder Lebenszeit von Mastzellen (HOFSTRA et al. 2003). Einige Autoren stellen die Hypothese eines self-amplification-Mechanismus von Mastzellen auf (HE 2004; XIE und HE 2005). Es wird vermutet, dass Mastzellen durch autokrine und parakrine Wirkung der Mastzellmediatoren, vor allem Histamin, wiederum eine Degranulation der umliegenden Mastzellen bewirken und eine Stimulation ihrer selbst im Sinne eines positiven Feedbackmechanismus via H1R stattfindet (HE 2004; XIE und HE 2005). Weiterhin spielen Histaminrezeptoren eine bedeutende Rolle bei der Chemotaxis verschiedener anderer Entzündungszellen (HUANG und THURMOND 2008). 31 Literaturübersicht Unterschiedliche Konzentrationen von Histamin bewirken chemotaktische Bewegungen von eosinophilen Granulozyten in vitro, welche mit Veränderungen der Zellform und Aufregulierung von Adhäsionsmolekülen einhergehen (LING et al. 2004). Diese Effekte werden durch H4R vermittelt, dessen Expression durch den Nachweis von H4R-mRNA durch die Autoren gezeigt wurde. Bei neutrophilen Granulozyten konnte mRNA von H4R jedoch nicht nachgewiesen werden (LING et al. 2004). Frühere Studien zeigten via H2R vermittelte, inhibitorische Effekte bei neutrophilen Granulozyten (AKDIS und SIMONS 2006). So hemmt Histamin mittels H2R-Signalübertragung die Chemotaxis und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten sowie deren Degranulation und die Synthese oxidativer Stoffe (SELIGMANN et al. 1983; AKDIS und SIMONS 2006). Die Migration von dendritischen Zellen wiederum wird durch H2R und H4R vermittelt, während immunmodulatorische Effekte durch H4R reguliert werden (GUTZMER et al. 2005; HUANG und THURMOND 2008). Weiterhin wird ein Einfluss von Histamin via H2R bei der Reifung von dendritischen Zellen vermutet (XIE und HE 2005; AKDIS und SIMONS 2006). Bei der Chemotaxis von T-Lymphozyten hingegen sind anscheinend H1R und H4R von Bedeutung (HUANG und THURMOND 2008). Auch die Regulation der Zytokinproduktion und -freisetzung von Entzündungszellen wird zum Teil über Histaminrezeptoren moduliert (HUANG und THURMOND 2008). Beispielsweise zeigte eine Untersuchung von GANTNER et al. (2002), dass die Freisetzung von IL-16 aus humanen CD8+ T-Lymphozyten durch H2R und H4R vermittelt wird. Interleukin 16 ist ein Chemoattraktant für CD4+ T-Lymphozyten, welche ebenfalls den H4R exprimieren (LING et al. 2004; DE ESCH et al. 2005). Deshalb wird vermutet, dass Histamin einen indirekten Einfluss auf die Rekrutierung von T-Zellen hat (HUANG und THURMOND 2008). Weiterhin beeinflusst Histamin die Balance zwischen der Th1- und Th2-Immunantwort und reguliert die Immunglobulinsynthese (JUTEL et al. 2002). Untersuchungen von JUTEL et al. (2001) zeigten, dass Th1-Zellen vorwiegend H1R exprimieren und die Bindung von Histamin an H1R eine Th1-dominierte Immunantwort triggert. Die Stimulation von H2R bewirkte eine Herunterregulierung sowohl der Th1- als auch der Th2-Zytokinsekretion und scheint einen negativen Regulationsmechanismus für T-Zellen darzustellen 32 Literaturübersicht (JUTEL et al. 2001). H1R und H2R- defiziente Mäuse zeigten eine stark abweichende Immunantwort mit verändertem Zytokinspektrum und Unterschieden bei der Antikörperproduktion (JUTEL et al. 2001). In vitro-Untersuchungen an humanen Monozyten aus dem peripheren Blut zeigten, dass diese Zellen H4R exprimieren und eine Stimulation des H4R zu einer verminderten Produktion des Proteins CCL2 (CC-Chemokin-Ligand 2) führt (DIJKSTRA et al. 2007). Das Zytokin CCL2 spielt eine Rolle bei der Migration von Monozyten, aktivierten T-Zellen und natural-killer-Zellen im Rahmen einer Th2Immunantwort (DIJKSTRA et al. 2007). Außerdem ist Histamin an der Regulation von Entzündungsprozessen durch die H2R-vermittelte Sekretion von IL-10 beteiligt, welches als Inhibitor der Proliferation und Zytokinantwort bei T-Zellen fungiert (JUTEL et al. 2002; JUTEL et al. 2009). Zusammenfassend bewirkt die Freisetzung von Histamin und die Signalvermittlung über Histaminrezeptoren eine chemotaktische Wirkung auf gewebsständige und zirkulierende Zellen und hat einen indirekten Einfluss auf die T-Zellaktivierung (HUANG und THURMOND 2008). Dabei wird dem H1R eine eher immunstimulierende, proinflammatorische Wirkung zugeschrieben, während H2R vermittelte Signale einen eher inhibitorischen Effekt auf Entzündungsvorgänge ausüben (AKDIS und SIMONS 2006; BÄUMER und ROßBACH 2010). Der H4R wiederum vermittelt die Akkumulation verschiedener Entzündungszellen am Ort der Immunreaktion (AKDIS und SIMONS 2006). 2.4.2 Histaminrezeptoren im kaninen Gastrointestinaltrakt Das Verteilungsmuster und Vorkommen von Mastzellen, die eine der Hauptquellen von Histamin im Magen-Darmtrakt darstellen, wurde in verschiedenen Untersuchungen an gesunden und erkrankten Hunden beschrieben (GERMAN et al. 2001; LOCHER et al. 2001; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Wenig ist jedoch über die Expression und Funktion Gastrointestinaltrakt, bekannt. kaniner Histaminrezeptoren, vor allem im Literaturübersicht 33 Im Jahre 1980 untersuchten KONTUREK und SIEBERS die Rolle von H1R und H2R durch Messung der myoelektrischen Aktivität im kaninen Dünndarm. Ihre Ergebnisse zeigen, dass Histamin via H1R die Motilität des Dünndarms steigert, während für H2R kein Effekt nachgewiesen wurde (KONTUREK und SIEBERS 1980). BERTACCINI et al. (1984) untersuchten die Wirkung von verschiedenen H2R-Antagonisten am Dünndarm von Hunden in vivo und in vitro und beschrieben einen H2R unabhängigen kontraktilen Effekt einiger H2R-Blocker, unter anderem von Ranitidin. Andere funktionelle Studien zur Kontraktilität an der Lamina muscularis mucosae des kaninen Magens zeigten einen via H1R vermittelten kontraktilen Effekt sowie eine durch H2R vermittelte Entspannung der glatten Muskulatur, während für H3R kein funktioneller Effekt nachgewiesen werden konnte (MULLER et al. 1993). Eine Studie von CHOU und SIREGAR (1982) beschreibt eine über H1R vermittelte Wirkung von endogenem Histamin auf die postprandiale Hyperämie im kaninen Jejunum. In vivo-Untersuchungen zur Regulation der Magensäureproduktion an Beaglen lassen auf einen via H3R vermittelten inhibitorischen Effekt schließen und vermuten eine Lokalisation der H3R auf parakrinen Zellen (SOLDANI et al. 1994). Im Jahr 1986 untersuchten RANGACHARI und MCWADE kanines Kolongewebe in Ussing-Kammern unter Messung des Kurzschluss-Stroms (short circuit current) bei Zugabe von Histamin. Der Vergleich einer Präparation mit darin enthaltenen, neuronalen Plexus mit einer nur aus Lamina mucosa bestehenden Präparation ließ auf direkt und indirekt vermittelte Effekte von Histamin schließen (RANGACHARI und MCWADE 1986). Ein ähnlicher Versuchsaufbau (RANGACHARI und PRIOR 1994) zeigte unter Verwendung von selektiven Agonisten und Antagonisten direkte Effekte, welche über H1R und H2R vermittelt wurden und durch H1R vermittelte, neuronale Effekte. Einflüsse auf die Sekretion zeigten sich, da die Stimulation von H1R und H2R eine Chloridsekretion des Epithels bewirkte (RANGACHARI und PRIOR 1994). Der H3R wurde funktionell nicht nachgewiesen (RANGACHARI und PRIOR 1994). 34 Literaturübersicht KHAN et al. (1994) wiesen mittels RT-PCR mRNA von H1R und H2R in isolierten Kolonkrypten von Hunden nach. Zwei weitere Präparationen, die einerseits aus submukosalen Neuronen des enterischen Nervensystems, glatten Muskelzellen und Immunzellen und andererseits aus der Zirkulär- und Längsschicht der Tunica muscularis bestanden, enthielten ebenfalls mRNA von H1R und H2R (KHAN et al. 1994). Die mRNA-Expression von H3R und H4R wurde in der genannten Studie nicht untersucht. Zu diesem Zeitpunkt war der H3R noch nicht sequenziert und die Existenz des H4R war noch unbekannt. Im Jahre 2008 gelang es JIANG et al., den kaninen H4R zu klonieren und eine Homologie von 71% zum humanen H4R aufzuzeigen. Obwohl die grundsätzlichen pharmakologischen Eigenschaften bezüglich Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung des kaninen H4R mit denen anderer Spezies übereinstimmen, können aufgrund der unterschiedlichen Proteinstruktur Abweichungen bei detaillierten pharmakologischen Fragestellungen nicht ausgeschlossen werden (JIANG et al. 2008). Weiterhin wiesen diese und andere Untersuchungen H4R mittels RT-PCR in verschiedenen kaninen Geweben und unter anderem auch im Dünndarm (JIANG et al. 2008) und Kolon (EISENSCHENK et al. 2011) nach. 2.4.3 Histaminrezeptoren bei IBD und anderen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes Obwohl verschiedene Untersuchungen zur Rolle von Mastzellen bei der kaninen IBD existieren (GERMAN et al. 2001; LOCHER et al. 2001; KLEINSCHMIDT et al. 2006), gibt es bislang keine Veröffentlichungen, die die Bedeutung von Histaminrezeptoren bei chronischen, idiopathischen Enteropathien von Hunden behandeln. Aus diesem Grund werden an dieser Stelle Forschungsergebnisse aus der Humanmedizin und Erkenntnisse aus Untersuchungen an Tiermodellen dargestellt. Dabei ist zu beachten, dass es sich bei der IBD von Hund und Mensch zwar um ähnliche, multifaktoriell bedingte Erkrankungen handelt, bei denen jedoch bezüglich Klinik und pathogenetischen Aspekten gewisse Unterschiede bestehen (CERQUETELLA et al. 2010). 35 Literaturübersicht In einer humanmedizinischen Untersuchung von SANDER et al. (2006) wurde eine signifikante Aufregulierung Lebensmittelallergien und von H1R- irritable und bowel H2R-mRNA syndrom bei Patienten festgestellt, mit welcher möglicherweise im Zusammenhang mit einer Histaminhypersensitivität infolge einer vermehrten Histaminrezeptorexpression eine pathogenetische Bedeutung zukommt (SANDER et al. 2006). Eine andere Studie (VON RAHDEN et al. 2012) beschäftigte sich mit Patienten mit schwerer Divertikulitis und beschreibt ebenfalls einen Anstieg der H1R- und H2R-Expression auf mRNA- und Proteinebene im Kolon. Die Autoren zeigten eine Expression dieser Histaminrezeptoren auf Enterozyten und stellten mittels Immunfluoreszenzdoppelfärbung eine Kolokalisation mit Histamin dar. Diese ist möglicherweise von pathogenetischer Bedeutung für die massiven Entzündungsprozesse im Kolon bei schweren Fällen von Divertikulitis (VON RAHDEN et al. 2012). Auch andere Autoren halten eine Histaminfreisetzung aus intestinalen Mastzellen und deren parakrine Wirkung auf enterische Neurone für einen wesentlichen, pathogenetischen Faktor beim irritable bowel syndrom und bei Enteropathien, die mit wässrigem Durchfall und abdominalen Schmerzen einhergehen (BARBARA et al. 2004; WOOD 2004 und 2006). In mehreren Untersuchungen des irritable bowel syndroms sowie der ulzerativen Kolitis und Crohn`s Disease, welche die beiden Hauptformen der humanen IBD darstellen, wurden ein Anstieg der Mastzellzahlen in der Mukosa, ein Anstieg des Gesamthistamingehalts und der Histaminfreisetzung sowie erhöhte Histaminkonzentrationen in der Mukosa festgestellt (KNUTSON et al. 1990; NOLTE et al. 1990; RAITHEL et al. 1995; BARBARA et al. 2004; HE 2004; FOGEL et al. 2005a). Untersuchungen von FOX et al. (1993) zeigten, dass aus Kolongewebe von IBD-Patienten stammende Mastzellen teilweise mehr Histamin freisetzen als Mastzellen aus unverändertem Gewebe. KNUTSON et al. (1990) beschreiben eine erhöhte Histaminsekretion nur bei Patienten mit aktiver Crohn`s Disease, während die Werte bei Patienten mit einem niedrigeren klinischen Aktivitätsscore nicht signifikant verändert waren. 36 Literaturübersicht Weiterhin können Veränderungen des Ionen- und Flüssigkeitstransportes über das intestinale Epithel für die sekretorische Komponente bei entzündlichen Enteropathien bedeutsam sein. Eine Untersuchung zum Elektrolyttransport an Kolongewebe von Schweinen zeigte einen durch H1R vermittelten Anstieg der Sekretion von Natriumund Chloridionen sowie eine neuronale Stimulation der Chloridsekretion durch den Entzündungsmediator Leukotrien C4 (TRAYNOR et al. 1992). Der H3R spielt im Gastrointestinaltrakt und bei der Pathogenese der IBD anscheinend eine untergeordnete Rolle (FOGEL et al. 2005a), da dieser Rezeptor in verschiedenen Untersuchungen des humanen Gastrointestinaltraktes nicht nachgewiesen werden konnte (POLI et al. 2001; SANDER et al. 2006). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Untersuchungen der funktionellen Expression und Physiologie des H3R im Meerschweinchenmodell (WOOD 2006). Trotz speziesspezifischer Unterschiede stellen Tiermodelle bei der Erforschung der Pathogenese der inflammatory bowel disease ein wichtiges Werkzeug dar. Untersuchungen an einem Kolitis-Mausmodell für humane IBD (Crohn`s disease) zeigten eine signifikante Aufregulierung von H4R-mRNA und eine verminderte Expression von H1R-mRNA im Kolon von Tieren mit einer trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induzierten Entzündung im Rahmen einer Th1-dominierten Reaktion (SUTTON et al. 2008). In derselben Studie wurde weiterhin mittels einer Nematodeninfektion eine Th2-Immunantwort induziert, wobei ein protektiver Effekt unter anderem durch eine Abnahme der H4R-mRNA-Expression und damit verbundener Limitation der Entzündungszellinfiltration gezeigt werden konnte (SUTTON et al. 2008). VARGA et al. (2005) zeigten ebenfalls an TNBS-induzierten Kolitiden bei Ratten einen antiinflammatorischen Effekt zweier H4R-Antagonisten. Diese bewirkten einen verminderten Gewebsschaden, einen reduzierten Influx von neutrophilen Granulozyten und verminderte TNF-α Level im Vergleich zu unbehandelten Tieren (VARGA et al. 2005). Im Hinblick auf eine Anwendung zur Therapie von chronischen Enteropathien werden besonders auf Antagonisten des jüngst entdeckten H4R große Hoffnungen gesetzt (XIE und HE 2005; HUANG und THURMOND 2008; CORUZZI et al. 2012). Literaturübersicht 37 Eine Untersuchung von H1R-, H2R- und H3R/H4R-Antagonisten in einem Modell für ulzerative Kolitis bei Ratten zeigte eine Reduktion des Gewebeschadens und verschiedener Entzündungsmarker bei den behandelten Tieren (FOGEL et al. 2005b). Die Autoren vermuten eine direkte oder indirekte Hemmung der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten, möglicherweise durch verminderte Produktion von TNF-α, und Bindung von H4R auf Mastzellen als mögliche Ursache dieser antiinflammatorischen Effekte (FOGEL et al. 2005b). 2.5 Immunhistochemische Methoden und deren Limitationen 2.5.1 Prinzip der Immunhistochemie und deren Fehlerquellen Die immunhistochemische Methodik nutzt markierte Antikörper zur Darstellung von Antigenen in situ (POLAK und VAN NOORDEN 1987). Dabei existiert eine Vielzahl von Methoden und Möglichkeiten, die eine direkte oder indirekte Antigenmarkierung, die Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper sowie den Einsatz verschiedener Enzyme und Detektionssysteme erlauben (NOLL und SCHAUBKUHNEN 2000; POLAK und VAN NOORDEN 1987). Die in dieser Arbeit verwendete immunhistochemische Technik basiert auf der Verwendung eines spezifischen, unkonjugierten Erstantikörpers, der das Antigen im Gewebe bindet. Im zweiten Schritt wird ein gegen die Donatorspezies des Primärantikörpers gerichteter, biotinylierter Zweitantikörper verwendet. Mittels ABCMethode (Avidin-Biotin-Komplex) wird ein Strepavidin-Biotinenzymkomplex an den Zweitantikörper gekoppelt. In einem weiteren Schritt bindet biotinyliertes Tyramin an diesen ABC-Komplex und es entstehen in Zusammenwirkung mit Wasserstoffperoxid weitere Bindungsstellen, die wiederum von den erneut hinzugefügten StreptavidinBiotin-Enzymkomplexen belegt werden und so eine Signalverstärkung bewirken. Die an den ABC-Komplex gebundene Peroxidase setzt das zugegebene Chromogen (AEC, 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol) in ein rot gefärbtes Reaktionsendprodukt um und detektiert damit das Antigen als Farbstoffniederschlag am Ort der Reaktion. 38 Literaturübersicht Die Fehlerquellen und Schwierigkeiten der Immunhistochemie sind vielfältig und können sowohl in der Fixierung und Behandlung der zu untersuchenden Gewebeproben als auch in der Auswahl der verwendeten Antikörper und Reagenzien sowie der Abfolge der Reaktionsschritte des Protokolls begründet liegen (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Die Anforderungen an einen „guten Antikörper“ beinhalten eine hohe Affinität und spezifische Bindung an das gewünschte Antigen, eine ausgeprägte Avidität des Antikörpers sowie den Einsatz in einer möglichst hohen Verdünnung, um unspezifische Reaktionen zu minimieren (POLAK und VAN NOORDEN 1987). Die Verwendung von polyklonalen Antikörpern birgt im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern die Gefahr, dass es durch unerwünschte Kreuzreaktionen mit anderen, strukturell ähnlichen Antigenen zu falsch positiven Ergebnissen kommt (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Die Spezifität und Sensitivität von Antikörpern kann stark differieren, vor allem beim Vergleich zweier Antikörper, die unterschiedliche Epitope desselben Antigens detektieren (LEONG und LEONG 2011). Weiterhin gehören kommerziell angebotene Antikörper oft in die Kategorie „research use only“ (nur für Forschungszwecke), deren Herstellung nicht unter Einhaltung festgelegter, stringenter Bestimmungen erfolgt (CHU und WEISS 2009). Die Fixation und Einbettung des Gewebes kann zur Veränderung der Tertiärstruktur von Proteinen führen und eine Schädigung der antigenen Strukturen von Proteinen und Peptiden herbeiführen (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Auch können sich lange Lagerungsdauer und hohe Lagerungstemperaturen von Schnittpräparaten negativ auf die Epitopstabilität auswirken und zu einer reduzierten Reaktionsintensität führen (VAN DEN BROEK und VAN DE VIJVER 2000). Für die immunhistochemische Antigendetektion an Paraffingewebe ist häufig eine Antigendemaskierung durch Hitzeeinwirkung oder enzymatische Wirkung notwendig, welche durch die Fixation entstandene Aldehydvernetzungen von Proteinen löst und dadurch Epitope freilegt (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Bezüglich der hitzeinduzierten Methoden zur Antigendemaskierung erzielen höhere Temperaturen in der Regel bessere Ergebnisse und bewirken nicht nur eine Verstärkung des 39 Literaturübersicht positiven Signals, sondern reduzieren auch in vielen Fällen unspezifische Hintergrundreaktionen (SHI et al. 1997). Die Einhaltung der genauen Reaktionstemperaturen und –zeiten ist hierbei von besonderer Bedeutung (LEONG und LEONG 2011). Zur Verhinderung unspezifischer Färbungen können NichtImmunseren zur Absättigung elektrostatischer Ladungen auf dem Gewebeschnitt eingesetzt werden. Eine Hemmung der endogenen Enzymaktivität ist notwendig, um eine Umsetzung des Chromogens durch gewebeeigene Enzyme und damit eine unspezifische Färbung zu verhindern (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Eine weitere Problematik beschreiben HORLING et al. (2012), die eine unspezifische Färbung in und um nervale Plexus im Gastrointestinaltrakt von Ratten festgestellt haben. Diese Problematik entsteht durch endogenes Biotin, welches als zusätzliche Bindungsstelle für Streptavidin fungiert und trat bei der Verwendung von Gefrierschnitten auf (SHI et al 1997; HORLING et al. 2012). Dennoch betonen die Autoren die Wichtigkeit einer adäquaten Negativkontrolle bei Verwendung eines Streptavidin-haltigen Detektionssystems. Eine stärkere Färbung von Zellen in Bereichen des Schnittrandes kann durch den edge effect (Randeffekt) auftreten. Dieser entsteht infolge stärkerer Fixation des Gewebes in diesen Bereichen oder durch Einsickern der Reagenzien unter den Gewebeschnitt und Reaktion an beiden Oberflächen des Gewebes (RAMOS-VARA 2005; LEONG und LEONG 2011). Schnittartefakte wie Risse oder Falten sowie nekrotische Bereiche oder apoptotische Zellen im Gewebe können eine falsch-positive Farbreaktion hervorrufen (LEONG und LEONG 2011). Aufgrund dieser Schwierigkeiten sichert nicht zuletzt die Verwendung adäquater Kontrollen die Ergebnisse einer immunhistochemischen Untersuchung. Man unterscheidet Reaktionskontrollen, die die Funktionsweise der Methodik und der verwendeten Reagenzien betreffen und Spezifitätskontrollen, die die spezifische Bindung des Antikörpers überprüfen (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011). Als Positivkontrolle sollte ein bei der immunhistochemischen Reaktion mitgeführtes Gewebe oder eine im untersuchten Gewebe vorhandene Zellpopulation (interne bzw. 40 Literaturübersicht endogene Kontrolle) dienen, welche sicher positiv reagiert (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011). Die Negativkontrollen dienen dem Ausschluss von unspezifischen Reaktionen des Primärantikörpers und des Detektionssystems. Negativkontrollen können unter Auslassung des Erstantikörpers oder Ersetzen des Erstantikörpers durch nicht immunisiertes Serum bzw. Verwendung eines unpassenden Antikörpers erfolgen. Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung von Gewebe dar, welches das Antigen sicher nicht enthält (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011). Zur Überprüfung der Antikörperspezifität kann eine Absorptionsreaktion durchgeführt werden, wobei das Antiserum vor der Verwendung mit dem spezifischen Antigen inkubiert wird. Der Antikörper bindet an das Antigen und steht für eine Bindung von Antigenen im Gewebe nicht mehr zur Verfügung (kompetetive Hemmung). Zur Überprüfung der Absorptionsreaktion sollte das Antiserum mit einem unpassenden Antigen inkubiert werden (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUBKUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011). Trotz allem existiert keine Standardisierung für immunhistochemische Protokolle, die eine sichere Reproduzierbarkeit und Übereinstimmung zum Beispiel bei der Durchführung in unterschiedlichen Laboren sichert (LEONG und LEONG 2011). Unterschiede entstehen dabei nicht nur durch Art und Dauer der Fixation, Lagerung und Lagerdauer von angefertigten Schnittpräparaten, die Verwendung unterschiedlicher Geräte, Reagenzien, Temperaturen und Reaktionszeiten bei der hitzeinduzierten Antigendemaskierung und Antikörperinkubation, sondern auch durch interobserver variability (Untersucher-bedingte Variabilität) bei der Auswertung (LEONG und LEONG 2011). Auch die Verwendung automatisierter Färbesysteme, die eine genauere Kontrolle von Inkubationszeiten und –temperaturen ermöglichen, und computergestützter Auswertungsmethoden löst diese Probleme nicht vollständig, da unterschiedliche Systeme mit verschiedenen Funktionsprinzipien angeboten werden, die eine Reihe weiterer Variablen schaffen (LEONG und LEONG 2011). 41 Literaturübersicht 2.5.2 Probleme der immunhistochemischen Darstellung im Falle des Histaminrezeptors 4 Mehrere Autoren berichteten bereits über die Darstellung von Histaminrezeptoren unter Verwendung spezifischer Antikörper im gastrointestinalen Gewebe von Ratten und Menschen mittels Immunhistochemie- oder Immunfluoreszenztechniken (SANDER et al. 2006; BOER et al. 2008; MORINI et al. 2008; VON RAHDEN et al. 2012) (siehe Übersicht in Tabelle 3). SANDER et al. (2006) verwendeten dabei zum Nachweis aller 4 Histaminrezeptoren kommerziell erhältliche, polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen. Die immunhistochemischen Untersuchungen vom MORINI et al. (2008) am Magen von Ratten wurden mit Antikörpern durchgeführt, deren Herstellung und Validierung zuvor durch andere Arbeiten beschrieben wurde (CHAZOT et al. 2001; VAN RIJN et al. 2006; CANNON et al. 2007). Bei beiden Antikörpern handelt es sich um polyklonale und affinitätschromatografisch aufgereinigte, gegen Rezeptor-spezifische Aminosäuresequenzen gerichtete und im Kaninchen hergestellte Antikörper (CHAZOT et al. 2001; VAN RIJN et al. 2006). VON RAHDEN et al. (2012) stellten den H1R und den H2R im humanen Kolongewebe unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper dar und Immunfluoreszenzdoppelfärbung zur verwendeten Darstellung diese der auch für eine Kolokalisation von Histaminrezeptoren und Histamin. BOER et al. (2008) untersuchten ebenfalls H1R, H2R und H4R im humanen Kolongewebe, verwendeten dabei aber polyklonale Antikörper eines anderen Anbieters. 42 Literaturübersicht Tabelle 3: Übersicht der in der Literatur verwendeten Antikörper gegen Histaminrezeptoren am Magendarmtrakt Histamin- Untersuchte Methode rezeptor Spezies H1R H2R IHC, IF, Mensch WB H3R H4R H3R Ratte IHC Mensch IHC, IF H4R H1R H2R Antikörper Alle von Acris Antibodies GmbH, Deutschland Herstellung nach CHAZOT et al. (2001) Herstellung nach VAN RIJN et al. (2006) Anti-human H1R (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) Anti-human H2R (Acris Antibodies GmbH, Deutschland) Publikation SANDER et al. (2006) MORINI et al. (2008) VON RAHDEN et al. (2012) H1R Alle von Alpha Diagnostic H2R Mensch IHC, WB BOER et al. (2007) International, TX, USA H4R Abkürzungen: IHC = Immunhistochemie; IF = Immunfluoreszenz; WB = Western Blot; Die Arbeit von BEERMANN et al. (2012) beschäftigt sich intensiv mit der Spezifität von mehreren kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen den humanen und murinen H4R (siehe Tabelle 4). Die Ergebnisse umfassender Untersuchungen mittels Western Blot und Durchflusszytometrie an H4R-infizierten und transient H4Rtransfizierten Zellen, Zellen aus der Milz von H4R-knock-out-Mäusen und Kontrolltieren sowie Zellen aus dem humanen peripheren Blut lassen die Autoren auf eine unspezifische Bindung aller drei getesteten Antikörper schließen (BEERMANN et al. 2012). Diese zeigte sich in einem ähnlichen Fluoreszenz- und Färbeverhalten der Antikörper mit den untersuchten Zellpopulationen, unabhängig von der H4RExpression dieser Zellen (BEERMANN et al. 2012). Die Autoren betonen die Bedeutung adäquater Kontrollen, wie z.B. die Verwendung von Gewebe von knockout-Tieren in eigenen Untersuchungen und die Notwendigkeit einer umfassenden Validierung der Spezifität von Antikörpern durch die Hersteller (BEERMANN et al. 2012). 43 Literaturübersicht Tabelle 4: Übersicht der von BEERMANN et al. (2012) und GUTZMER et al. (2012) verwendeten H4R-Antikörper Histamin- Untersuchte rezeptor Spezies Mensch, Maus, Ratte H4R Mensch Methode Antikörper Publikation Anti-H4R sc M120 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) FC, WB BEERMANN et al. Anti-H4R sc H110 (Santa Cruz (2012) Biotechnology, CA, USA) Anti-H4R ab13183 (Abcam, Mensch Cambridge, UK) Anti-H4R C20 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) Anti-H4R Q20 (Santa Cruz GUTZMER et al. H4R Mensch FC Biotechnology, CA, USA) (2012) Anti-H4R #H4R41-A (Alpha Diagnostic International, TX, USA) Abkürzungen: FC= flow cytometry (Durchflusszytometrie); WB= Western Blot; Auch GUTZMER et al. (2012) berichten von unspezifischem Bindungsverhalten einiger kommerziell erhältlicher, polyklonaler, im Kaninchen hergestellter Antikörper gegen H4R (siehe Tabelle 4). Ein Einsatz solcher Antikörper bei bestimmten Fragestellungen ist laut den Autoren nach gründlicher Überprüfung der Spezifität und vorsichtiger Validierung dieser jedoch möglich (GUTZMER et al. 2012). Eine andere Studie (GSCHWANDTNER et al. 2010) verwendete ebenfalls einen durch BEERMANN et al. (2012) getesteten Antikörper, kam jedoch im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen, inklusive der Verwendung von knock-out-Material als Negativkontrolle, zu anderen Ergebnissen (GUTZMER et al. 2012). Einige Arbeitsgruppen, deren Fragestellungen zwar nicht den Gastrointestinaltrakt betreffen und die nur teilweise immunhistochemische Methoden nutzten, verwendeten einen nach VAN RIJN et al. (2006) eigens hergestellten Antikörper gegen H4R (DIJKSTRA et al. 2007; BÄUMER et al. 2008; DIJKSTRA et al. 2008; CONNELLY et al. 2009; GUTZMER et al. 2012). In der Mehrzahl dieser Untersuchungen wurden sowohl Isotypkontrollen als auch eine Präabsorption des Antikörpers mit dem zur Immunisierung verwendeten Peptid (Absorptionskontrolle) durchgeführt (DIJKSTRA et al. 2007; BÄUMER et al. 2008; DIJKSTRA et al. 2008). Literaturübersicht 44 45 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial Für die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen standen formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Proben des Gastrointestinaltraktes von insgesamt 49 Hunden verschiedener Rassen und unterschiedlichen Alters zur Verfügung. Die als Kontrollgruppe untersuchten Tiere stammen aus dem Obduktionsgut des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Gewebeproben der erkrankten Hunde entstammen dem Routineeinsendungsmaterial des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Hierbei wurden ausschließlich Fälle von Patienten aus der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und der Kleintierklinik Duisburg-Asterlagen verwendet. Nähere Angaben zu Alter, Geschlecht, Rasse, Fallnummer und gegebenenfalls klinischen und pathologischen Befunden finden sich in den Tabellen 5 bis 7. 3.1.1 Kontrollhundegruppe Als Kontrollmaterial lagen formalinfixierte und paraffineingebettete Gewebeproben aus pathologisch-anatomisch unveränderten, gastrointestinalen Geweben von 24 Hunden aus dem Obduktionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vor. Bei den beprobten Tieren handelte es sich um Patienten der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (Tiere mit den laufenden Nummern 8 bis 24) sowie um einen von Extern eingesandten Fall (Tier mit der laufenden Nummer 7) und um Tiere aus einer externen Versuchstierhaltung (Tiere mit den laufenden Nummern 1 bis 6), die vorberichtlich keine Erkrankungen des Verdauungsapparates hatten und aus Gründen euthanasiert wurden, die nicht im Zusammenhang mit Erkrankungen des Magendarmtraktes standen. Die Probeentnahme erfolgte im Rahmen einer Routineobduktion (mit Ausnahme des Tieres mit der laufenden Nummer 3, bei dem lediglich die Entnahme der Proben erfolgte) in einem Zeitraum von höchstens 2 Stunden nach Euthanasie an folgenden festgelegten Lokalisationen: Fundus des Magens, Pars descendens des Material und Methoden 46 Duodenums, mittleres Jejunum, mittleres Ileum und Kolon. Bei dem Tier mit der laufenden Nummer 6 standen keine Proben aus dem Fundus des Magens und dem Ileum zur Verfügung. Nach Aufarbeitung und Färbung der Gewebeproben erfolgte eine histologische Beurteilung der genannten Lokalisationen durch drei Untersucher (Prof. Hewicker-Trautwein, Johannes Junginger und Ulrike Schwittlick). Angaben zur Bezeichnung, Rasse, Alter, Geschlecht, Gewicht und die wichtigsten pathologischen Befunde finden sich in Tabelle 5. 47 Material und Methoden Tabelle 5: Angaben zu den Hunden der Kontrollgruppe Lfd. UnterNr. suchungsNr. 1 V 614/10 2 V 867/10 3 V 1180/10 4 V 1181/10 5 V 295/10 6 V 325/10 7 S 719/11 8 S 680/11 Rasse Beagle Beagle Beagle Beagle Beagle Beagle Leonberger Briard 9 S 979/10 10 11 12 S 1579/09 S 987/10 S 977/10 13 14 S 1109/10 S 1510/10 15 S 1098/10 16 S 997/10 17 S 307/10 Labrador Retriever DSH Rehpinscher Sibirischer Husky Kuvasz Australian Cattle Dog Yorkshire Terrier Springer Spaniel Border Collie 18 19 20 21 S 1112/10 S 350/10 S 1042/10 S 1196/10 Mischling Bernhardiner Mischling DSH 22 S 1265/10 WHWT Alter (Jahre, Monate) 6M 8M 1 J, 2 M 1 J, 2 M 2 J, 2 M 2 J, 4 M 1M 11 M Geschl. Gewicht Pathologische (kg) Hauptdiagnose m w w w w w w w 7 8,9 11,5 9,5 10 10 2,7 26 2M w 4,8 2M 6M 4J w w m 9 4,7 28,7 NB NB n. u. NB NB NB Megaösophagus, Pneumonie NB (klinisch progressive Ataxie) Idiopathischer Megaösophagus Neuronale Degeneration Atlantoaxiale Subluxation Idiopathische Epilepsie 4J3M 4J5M m m 37 23,3 Fibrosarkom Wirbelsäule GME 6J3M m 2,8 NLE, GME 7J7M wk 25,7 Neuronale Degeneration 8J2M mk 18,4 10 J 4 M 10 J 2 M 12 J 7 M 12 J 10 M 14 J 9 M m m m wk 7,2 60 32 31,3 NB/funktionelle Polyneuropathie GME Bandscheibenprotrusionen Neuronale Degeneration Hämangiosarkom wk 7 Kardiomyopathie, Glomerulopathie 23 S 1336/10 Mischling 15 J 2 M w 13,8 Adenokarzinom Pankreas 24 S 1363/10 Mischling 12 J wk 25,4 Bandscheibenprotrusion Abkürzungen: J = Jahr/Jahre; M = Monat/Monate; m = männlich; mk = männlich kastriert; w = weiblich; wk = weiblich kastriert; DSH = Deutscher Schäferhund; WHWT= Westhighland White Terrier; NB = Nebenbefunde ohne klinische Relevanz; n. u. = nicht untersucht; GME = granulomatöse Meningoenzephalitis; NLE = nekrotisierende Leukoenzephalitis 48 Material und Methoden 3.1.2 Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Die Gewebeproben der Tiere der Erkrankungsgruppen stammen aus dem Einsendungsgut des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Dabei handelt es sich ausschließlich um Probenmaterial von Patienten aus der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und der Kleintierklinik Duisburg-Asterlagen, welche formalinfixiert eingesendet wurden und im Rahmen der Routinediagnostik aufgearbeitet wurden. Für die Untersuchungen im Rahmen dieser Dissertation wurden alle Fälle erneut durch drei Untersucher (Prof. Hewicker-Trautwein, Johannes Junginger und Ulrike Schwittlick) beurteilt. Aufgrund der gestellten, histopathologischen Diagnosen sowie der klinischen Informationen über Symptomatik, Verlauf, diagnostische Schritte und Behandlungserfolg wurde eine Einteilung in zwei Gruppen vorgenommen. Dabei wurden Hunde mit lymphoplasmazellulären Enteritiden und Hunde mit eosinophilen Läsionen unterschieden. 3.1.2.1 Hunde mit lymphoplasmazellulären entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Bei den in Tabelle 6 aufgeführten Tieren handelt es sich um Probenmaterial, welches histologisch lymphoplasmazelluläre Entzündungszellinfiltrationen aufwies. Tabelle 6: Hunde mit lymphoplasmazellulären entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Lfd. UnterNr. suchungsNr. 25 E 1573/11 26 E 1853/11 27 E 1993/10 28 E 5763/10 29 E 1770/11 30 31 32 33 E 4307/10 E 4343/10 E 5573/10 E 1042/11 Rasse Mischling Hovawart Labrador Malinois Jack Russel Terrier Boxer Mischling WHWT Pudel Alter (Jahre, Monate) 10 M 2 J 4M 2 J 10 M 4J 5J3M GeUntersuchte Lokalisationen schl. m m wk wk wk Magen, Duodenum Magen, Duodenum, Kolon Magen, Duodenum, Kolon Magen, Duodenum Magen, Duodenum, Kolon 6J 6J6M 6 J 10 M 7J m mk wk wk Magen, Duodenum, Kolon Magen, Duodenum Magen, Duodenum, Kolon Magen, Duodenum, Kolon 49 Material und Methoden Fortsetzung der Tabelle 6: Hunde mit lymphoplasmazellulären entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Lfd. UnterRasse Nr. suchungsNr. 34 E 4453/10 Mischling 35 E 2510/10 Belgischer Schäferhund 36 E 2068/10 Hovawart 37 E 1648/10 Mischling 38 E 2074/10 Labrador 39 E 2225/11 DSH 40 E 3727/10 WHWT 41 E 4889/10 Mischling Abkürzungen: J = Jahr/Jahre; M Alter (Jahre, Monate) 7J2M 7 J 10 M GeUntersuchte Lokalisationen schl. wk w Magen, Duodenum Magen, Duodenum 8J m Magen, Duodenum 10 J m Magen, Duodenum 10 J m Magen, Duodenum 10 J mk Magen, Duodenum, Kolon 10 J wk Magen, Duodenum 10 J wk Magen, Duodenum = Monate; m = männlich; mk = männlich kastriert; w = weiblich; wk = weiblich kastriert; DSH = Deutscher Schäferhund; WHWT = Westhighland White Terrier; 3.1.2.2 Hunde mit eosinophilen entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Die histologischen Läsionen der Proben dieser 8 Hunde (siehe Tabelle 7) wiesen eine deutliche eosinophile Entzündungsreaktion auf. Tabelle 7: Hunde mit eosinophilen, entzündlichen Läsionen Lfd UnterRasse Nr. suchungsNr. 42 E 1182/10 Mischling 43 E 6234/10 Mischling 44 E 3970/10 Mischling 45 E 6103/10 Border Collie 46 E 1852/11 Mischling 47 E 2281/10 Irish Terrier 48 E 3980/10 Rottweiler 49 E 5489/10 Mischling Abkürzungen: J = Jahr/Jahre; M weiblich; wk = weiblich kastriert; Alter GeUntersuchte Lokalisationen (Jahre, schl. Monate) 1J mk Magen, Duodenum 3J m Magen, Duodenum 4J7M m Magen, Duodenum, Jejunum, Kolon 4J9M m Magen, Duodenum 7J mk Magen, Duodenum 7J w Magen, Duodenum 9J w Magen, Duodenum, Kolon 10 J 4 M m Magen, Duodenum, Kolon = Monate; m = männlich; mk = männlich kastriert; w = 50 Material und Methoden 3.1.3 Altersabhängige Gruppeneinteilung Basierend auf dem vorberichtlich angegebenen Alter der Tiere erfolgte eine Einteilung der Kontrolltiere in unterschiedliche Altersgruppen. Bei den Tieren mit der laufenden Nummer 1 bis 6 handelt es sich ausschließlich um Beagle mit einem Alter bis 2,5 Jahren (Beaglegruppe). Die Tiere mit den laufenden Nummern 7 bis 11 zählen zu der Gruppe der „jungen Tiere“ mit einem Alter von unter 1 Jahr. Die Gruppe „mittelalte Tiere“ umfasst die Hunde mit den laufenden Nummern 12 bis 16, deren Alter zwischen 4 und 8 Jahren lag. Zur Gruppe der „alten Tiere“ zählen die Hunde, die älter als 8 Jahre waren (laufende Nummern 17 bis 24). Analog hierzu wurden auch die erkrankten Tiere in Altersgruppen eingeteilt, abhängig von deren Alter zum Zeitpunkt der Biopsieentnahme. Aufgrund der Heterogenität und Anzahl der Proben umfasst die Gruppe der „jungen Tiere“ bei den IBD-Tieren auch Hunde zwischen 1 und 3 Jahren. Eine Übersicht der Gruppeneinteilung findet sich im Anhang (siehe Tabelle 11). 3.2 Aufarbeitung und Färbung der Gewebeproben 3.2.1 Fixierung und Aufarbeitung der Gewebeproben Die bei der Sektion entnommenen Gewebeproben der Kontrollgruppe wurden für 24 bis 48 Stunden in gepuffertem 10%igen Formalin fixiert. Diese Gewebeproben und die bereits in Formalin fixierten, eingesandten Bioptate wurden anschließend unter Verwendung eines Gewebeeinbettautomaten (Pathcenter) in Paraplast Plus Paraffin eingebettet. Von den anschließend hergestellten Paraffinblöcken wurden mit Hilfe eines Bandmikrotoms 2 bis 3 µm dicke Schnitte angefertigt, in einem Wasserbad bei zirka 40°C gestreckt und auf Superfrost Plus Objektträger aufgezogen. Danach erfolgte die Trocknung der Schnitte in einem Wärmeschrank bei 65°C für 2 bis 3 Stunden. Bis zur weiteren Verwendung wurden Schnitte und Blöcke bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. 51 Material und Methoden 3.2.2 Übersichtsfärbung Die Färbung der histologischen Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin erfolgte nach einem standardisierten Protokoll (siehe Anhang 9.5) in einem automatischen Färbecenter (Leica ST 4040). Anschließend erfolgte die histologische Beurteilung und Graduierung der Gewebeproben von Kontrolltieren und erkrankten Tieren nach einer Veröffentlichung der WSAVA (DAY et al. 2008). Im Rahmen dieser Beurteilung wurde basierend auf den Kriterien von DAY et al. (2008) ein Scoring-Wert für jede untersuchte Lokalisation erstellt, die im Folgenden als WSAVA-Score bezeichnet wird. 3.3 Immunhistochemische Reaktionen Zur Untersuchung des intestinalen Expressionsmusters von H1R, H2R und H4R bei gesunden und kranken Tieren wurden Gewebeschnitte des Magendarmtraktes von Kontrolltieren und die Bioptate der Tiere der Erkrankungsgruppen immunhistochemisch gefärbt. Zunächst wurde die optimale Verdünnung von Primär- und Sekundärantikörpern im Rahmen von Vorversuchen ermittelt. Gleichzeitig wurde eine Verstärkungsreaktion mit biotinyliertem Tyramin zur Verbesserung des Reaktionsbildes für alle durchgeführten Untersuchungen etabliert. 3.3.1 Antikörper und Seren Zur Darstellung der Expression der Histaminrezeptoren 1, 2 und 4 wurden die Paraffinschnitte nach der Vorbehandlung (Entparaffinierung, Rehydratisierung und Hemmung der endogenen Peroxidase) einer Demaskierung in kochendem Zitratpuffer unterzogen. Nach der Inkubation mit dem Blockserum wurden die Schnitte mit polyklonalen Primärantikörpern gegen H1R, H2R und H4R inkubiert. Die Verdünnung der Primärantikörper erfolgte mit PBS-Pufferlösung, dem 1% BSA zugesetzt wurde. Nach Inkubation über Nacht wurde der Zweitantikörper aufgetragen, welcher am Vortag mit PBS-Pufferlösung und 20% inaktiviertem Hundeserum angesetzt worden war. Vor dem Auftragen wurde dieser Ansatz des 52 Material und Methoden Zweitantikörpers kurz zentrifugiert. Diese Behandlung unterdrückt unspezifische Bindungen des Zweitantikörpers an kanine Proteinstrukturen auf dem Schnitt und vermindert die unspezifische Markierung von Plasmazellen in der Lamina propria mucosae. Die Antikörper wurden aliquotiert, teils vorverdünnt und bei -20°C gelagert. Genauere Angaben zu Art, Herkunft und Verdünnungen sowie zum Detektionssystem für die Primärantikörper sowie zu den verwendeten Zweitantikörpern finden sich in Tabelle 8. Ergänzend muss erwähnt werden, dass der Antikörper gegen H4R aufgrund der vergleichsweise hohen, eingesetzten Konzentration nachgekauft werden musste. Das Produkt wurde jedoch vom ursprünglichen Anbieter (Novus Biologicals; USA) zu diesem Zeitpunkt nicht mehr vertrieben. Bei dem Antikörper von Acris Antibodies, Herford, handelt es sich um das Ersatzprodukt, welches gegen dasselbe Immunogen gerichtet ist (persönliche Korrespondenz mit Acris Antibodies GmbH, Herford vom 19.10.2011). Tabelle 8: Verwendete Primär- und Sekundärantikörper und Verdünnungen Darstellung von Blockserum Histaminrezeptor 1 Pferd Histaminrezeptor 2 Histaminrezeptor 4 Ziege Zweitantikörper (Hersteller) Erstantikörper (Hersteller) Goat anti-human HRH1, 1:80 (Abcam, Cambridge, UK) Goat anti-human HRH2, 1: 900 (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA) Rabbit anti-human HRH4, 1:50 (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA; Ersatzartikel: Acris Antibodies, Herford, Deutschland) Detektions -system Horse anti-goat 1:200 (Vector Laboratories, Inc., USA) ABC Goat anti-rabbit 1:200 (Vector Laboratories, Inc., USA) 3.3.2 Verstärkungsreaktion Die Anwendung einer Verstärkungsreaktion ermöglicht eine Erhöhung der Antikörpersensitivität, eine Reduzierung der Hintergrundfärbung und verringert den Einsatz von Erstantikörper durch Verwendung höherer Verdünnungen. Bei der Material und Methoden 53 Verstärkungsreaktion mit biotinyliertem Tyramin (tyramine amplification technique, TAT) werden durch Bindung des Tyramins an den Avidin-Biotin-Enzymkomplex zusätzliche Bindungsstellen geschaffen. In einem weiteren Schritt wirkt das an Tyramin gekoppelte Biotin als Tracer-Molekül und bindet weitere Avidin-BiotinEnzymkomplexe, die im Folgenden das verwendete Chromogen umsetzen (VON WASIELEWSKI et al. 1997; MENGEL et al. 1999, RAMOS-VARA 2005). Durch die Erhöhung der Bindungsstellen und damit der gebundenen Peroxidase kommt es zu einer Verstärkung des Farbsignals. Diese Verstärkungstechnik funktioniert für viele Antikörper, zeigt aber hohe Variabilitäten bezüglich des Verstärkungseffekts, der durch viele Faktoren beeinflusst wird (Art des Gewebes, Tyraminkonzentration, Konzentration des Erstantikörpers, Menge der vorhandenen Epitope) und muss für jeden Antikörper getestet werden (VON WASIELEWSKI et al. 1997; MENGEL et al. 1999). Weiterhin muss eine falsch positive Färbung durch Bindung des Detektionssystems an endogenes Biotin durch adäquate Negativkontrollen sicher ausgeschlossen werden (HORLING et al. 2012). In den Vorversuchen konnte bei Anwendung der Verstärkungsreaktion nach VON WASIELEWSKI et al. (1997) mit biotinyliertem Tyramin keine Abweichung des Reaktionsmusters an den verwendeten Schnittpräparaten festgestellt werden. Die Negativkontrollen zeigten keine unspezifische Färbung von Gewebestrukturen. 3.3.3 Unspezifische Hintergrundfärbung Neben der Verwendung einer Verstärkungsreaktion wurden weitere Maßnahmen zur Verminderung einer unspezifischen Hintergrundreaktion ergriffen. Die Hemmung der endogenen Peroxidase des Gewebes, die zur unspezifischen Farbstoffumsetzung des ABC-Detektionssystems führen kann, erfolgte durch Inkubation in 0,5%igem Wasserstoffperoxid im Anschluss an die Entparaffinierung und Rehydratisierung. Vor dem Auftragen des Erstantikörpers wurde mit verdünntem Normalserum geblockt. Hierbei werden elektrostatische Ladungen von Proteinen gesättigt und unspezifische, hydrophobe Bindungen verhindert, sodass der Primärantikörper nur spezifische Bindungen mit dem gesuchten Epitop eingehen kann. Dabei wurde Normalserum derjenigen Tierart verwendet, aus welcher der Sekundärantikörper stammt. Weiterhin 54 Material und Methoden wurde dem Verdünnungsmedium (Antikörperpuffer) 1% BSA (Bovines Serumalbumin) zugesetzt, welches zusätzlich hydrophobe Immunglobuline bindet und eine unspezifische Bindung dieser am Gewebe vermindert. Nachdem sich in den Vorversuchen in der Negativkontrolle unter Auslassung des Primärantikörpers wenige zytoplasmatisch positive Zellen in der Lamina propria mucosae (vermutlich Plasmazellen) feststellen ließen, erfolgte ein Zusatz von 20% inaktiviertem Hundenormalserum zum Sekundärantikörper. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und vor der Verwendung kurz abzentrifugiert. Dadurch sollten unspezifische Reaktionen des Sekundärantikörpers mit tierartspezifischen Proteinstrukturen abgesättigt werden. Die unspezifische Anfärbung der Zellen in der Lamina propria mucosae ließ sich durch diese Behandlung vollständig beseitigen. Ein weiteres, bekanntes Problem ist die unspezifische Anfärbung von Mastzellen (BUSSOLATI und GUGLIOTTA 1983; HARLEY et al. 2002) bei der Verwendung eines kommerziellen ABC-Nachweissystems. Zur Verhinderung dieser Reaktion wurde der pH-Wert des Puffers, in welchem die Substrate des ABC-Kits verdünnt werden, von 7,4 auf 9,4 erhöht. Diese Methode hemmt die Reaktion des basischen Proteins Avidin mit den Sulfatgruppen des Heparins der Mastzellen und somit die unspezifische Anfärbung (BUSSOLATI und GUGLIOTTA 1983). 3.3.4 Kontrollen Zur Überprüfung der immunhistochemischen Reaktion wurden sowohl Reaktionskontrollen als auch Spezifitätskontrollen durchgeführt. Die Positivkontrollen wurden teilweise als interne Positivkontrollen nach Angaben des Herstellerdatenblattes genutzt. Der Antikörper gegen H1R sollte eine positive Reaktion der glatten Muskulatur des Dünndarms aufweisen. Der gegen H4R gerichtete Antikörper reagiert mit Lymphozyten im Lymphknoten aber auch in PeyerPlatten. Für den Antikörper gegen H2R wurde Tonsillengewebe genutzt. Als Negativkontrollen wurden Gewebeschnitte der Kontrollhunde mitgeführt, bei denen an Stelle des Erstantikörpers ausschließlich Antikörperpuffer eingesetzt wurde. Zusätzlich erfolgten Versuche, in denen der Erstantikörper durch Serum von 55 Material und Methoden nicht immunisierten Ziegen (Ziegennormalserum) ersetzt wurde. Dabei wurde das Normalserum so weit verdünnt, dass die IgG-Konzentration des verdünnten Normalserums annähernd Gebrauchsverdünnung der entsprach IgG-Konzentration (ausgehend von des Antikörpers 18-24 mg/ml in der IgG im Ziegennormalserum). Aufgrund aktueller Forschungsergebnisse (BEERMAN et al. 2012) wurde zur Absicherung der Antikörperspezifität zusätzlich eine Absorptionsreaktion für die Primärantikörper gegen H1R und H2R durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Konzentrationsstufen kommerziell erhältlicher Blocking-Peptide, die dem Immunisierungspeptid bei der Antikörperherstellung entsprechen, mit dem Antikörper versetzt, über Nacht bei 4°C inkubiert und vor Verwendung kurz abzentrifugiert. 3.3.5 Protokoll der immunhistochemischen Reaktionen Der immunhistochemische Nachweis der Antigene erfolgte mittels Avidin-BiotinKomplex (ABC)-Methode nach folgendem Protokoll. Die Angaben zu Vorbehandlungen, verwendeten Antikörpern und Verdünnungen finden sich in Tabelle 8. Erster Tag 1. Entparaffinieren und Rehydrieren der Paraffinschnitte für jeweils 5 Minuten in einer absteigenden Alkoholreihe (Roti-Histol 1 bis 3, Isopropanol, 96%iges und 70%iges Ethanol). 2. Hemmung der endogenen Peroxidase in einer 0,5%igen WasserstoffperoxidLösung (197 ml 70%iges Ethanol und 3 ml 30%iges Wasserstoffperoxid). 3. Dreimaliges Spülen der Schnitte für je 5 Minuten in PBS-Pufferlösung unter langsamem Rühren. 4. Hitzeinduzierte Demaskierung der Antigene durch Kochen der Schnitte in Zitratpuffer für 20 Minuten in der Mikrowelle bei 750 Watt. 56 Material und Methoden 5. Dreimaliges Spülen der Schnitte für je 5 Minuten in PBS-Pufferlösung unter langsamem Rühren. 6. Überführen der Schnitte in Shandon Coverplates. 7. Überschichten der Schnitte mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Normalserum und Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur zur Blockierung elektrostatischer Bindungsstellen. 8. Auftragen des verdünnten Erstantikörpers (jeweilige Verdünnung in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin) und Inkubation über Nacht bei 4°C. 9. Ansetzen des jeweiligen Zweitantikörpers: Verdünnung 1:200 in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin und 20%igem inaktivierten Hundenormalserum und Inkubation über Nacht bei 4°C. Zweiter Tag 10. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten. 11. Auftragen des verdünnten Zweitantikörpers und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. 12. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten. 13. Auftragen des ABC-Reagenz und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. 14. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten. 15. Überschichten der Schnitte mit Biotinyl-Thyramid in 0,2%igem Wasserstoffperoxid und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 57 Material und Methoden 16. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten. 17. Auftragen des ABC-Reagenz und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 18. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten. 19. Aufbringen von 4 Tropfen AEC-Lösung pro Schnitt und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 20. Überschichten der Schnitte mit PBS-Pufferlösung zum Abstoppen der Farbreaktion und Verbringen der Schnitte in eine Küvette. 21. Spülen der Schnitte für 10 Minuten in fließendem Leitungswasser. 22. Gegenfärbung in Hämalaun nach Mayer für 45 Sekunden. 23. Bläuen der Schnitte für 10 Minuten in fließendem Leitungswasser. 24. Eindecken der Schnitte mit Mounting-Medium. 3.4 In situ-Hybridisierung 3.4.1 Herstellung der Sonde Für die Untersuchungen mittels in situ-Hybridisierung wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Neuropathologie und Neuroimmunologie des Institutes für Pathologie (Kerstin Hahn, Andre Habierski) eine Digoxigenin (DIG)-markierte Sonde gegen den Histaminrezeptor 4 synthetisiert. Als Referenzsequenz für die Sondenherstellung wurde die von JIANG et al. (2008) publizierte Sequenz des kaninen Histamin H4 Rezeptors verwendet (entspricht der veröffentlichen Sequenz mit der accession-nr.: XM547634.2). Die einzelnen Schritte der Sondenherstellung wurden nach GRÖTERS (2004), GRÖTERS et al. (2005) und HAHN et al. (2013) modifiziert und werden im Folgenden kurz dargestellt. 58 Material und Methoden 3.4.1.1 RNA-Isolierung und Reverse Transkription Zunächst wurde aus 30 mg gefrorenem Milzgewebe eines Hundes aus dem Sektionsgut des Institutes für Pathologie (S-Nummer 984/12; Deutscher Schäferhund-Rüde, Alter: 3 Jahre, 6 Monate) unter Verwendung des RNeasy Mini-Kit (Quiagen, Hilden) RNA isoliert. Die so gewonnene RNA wurde mittels eines weiteren Kits (Omniscript RT Kit; Quiagen, Hilden) in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben. 3.4.1.2 Primer Ausgewählt wurden ein vorwärtsgerichteter Primer (in 5‘-3‘-Richtung) mit der Sequenz CATATACTGGAGCCTGTGGAAG und ein rückwärtsgerichteter Primer (in 3‘-5‘-Richtung) mit der Sequenz CAAAGGAACAGATGGTGCTG. Die Primer wurden durch die Firma Eurofins MWG Operon, Ebersberg synthetisiert. Die daraus hergestellten Sonden haben eine Größe von 253 bp (T3-Sonde) bzw. 233 bp (T7Sonde) und kodieren für die Aminosäuren 203 bis 256 des kaninen Rezeptors. Diese Aminosäuresequenz liegt in der 3. intrazytoplasmatischen Domäne des kaninen H4RProteins. 3.4.1.3 PCR und Gelelektrophorese Mit der gewonnenen cDNA, die als template eingesetzt wurde und den oben beschriebenen Primern wurde eine PCR zur Amplifikation der spezifischen Nukleotidsequenz durchgeführt. Die initiale Denaturierung wurde für 3 Minuten bei 95°C durchgeführt. Dann folgten 30 Zyklen bestehend aus Denaturierungsschritt bei 94°C für 1 Minute, Annealingschritt bei 58,5°C für 1 Minute und Elongationsschritt bei 72°C für 1 Minute. Final erfolgte eine Elongationsphase bei 72°C für 10 Minuten. Die anschließende Gelelektrophorese erfolgte in TAE (Tris-Acetat-EDTA)-Puffer auf einem Ethidiumbromid-haltigen, 2%igen Agarosegel bei 100 Volt für eine Stunde. Die DNA-Bande (erwartet bei 163 bp) wurde unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht und aus dem Gel geschnitten. Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugieren (14000 rpm für 1 Minute) durch einen Filter aus dem Agarosegel gelöst. Material und Methoden 59 3.4.1.4 Klonierung und Isolierung der Plasmid-DNA Das gewonnene PCR-Produkt wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen™; Life Technologies GmbH, Darmstadt) in den pCR™4-TOPO®-Vektor kloniert. Das Plasmid wurde anschließend mittels Hitzeschock (45 Sekunden bei 42°C, anschließend 2 Minuten Inkubation auf Eis) in chemisch kompetente E. coli (NEB 5alpha Competent E. coli von New England BiolLabs GmbH, Frankfurt am Main) transformiert. Dann erfolgten eine einstündige Inkubation unter Schütteln (200 rpm) bei 37°C in S.O.C.-Medium (im Kit enthalten) und anschließende Anzucht der E. coli auf Selektivmedium (Ampicillin-haltige LB (lysogeny broth)-Agarplatten). Nach einer Inkubation im Brutschrank über Nacht wurden 10 Kolonien gepickt und in Ampicillinhaltigem LB-Nährmedium bei 37°C und über Nacht kultiviert. Für die anschließende Plasmidisolierung wurde das NucleoSpin® Plasmid Kit (Macherey und Nagel GmbH und Co KG; Düren) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert (bei 4°C, 3000 rpm für 15 Minuten). Das Pellet wurde in Resuspensionspuffer gelöst und mit Lysispuffer (5 Minuten Inkubation) und Neutralisationspuffer versetzt. Nach einer weiteren Zentrifugation (14000 rpm für 20 Minuten) zur Entfernung von Proteinbestandteilen wurde der Überstand mit dem gleichen Volumen an Isopropanol vermischt, um die darin enthaltene DNA auszufällen. Anschließend wurden die Proben erneut zentrifugiert (14000 rpm für 10 Minuten), das DNA-Pellet in 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in autoklaviertem Wasser resuspendiert. Die DNA-Gehalte wurden mit einem Spektrophotometer (Nano drop; Peqlab Biotechnologies, Erlangen) bestimmt. Zusätzlich wurden von der Bakteriensuspension aus der Klonierungsreaktion Glycerolstocks zur dauerhaften Lagerung bei -80°C angelegt. 3.4.1.5 Kontrollen der Zielsequenz Zur Überprüfung der isolierten Plasmide und zur Sicherung der Sondenspezifität wurden 2 Plasmide mit den M13 forward- sowie mit den M13 reverse-Primern (Invitrogen, Life technologies GmbH, Darmstadt) durch die Firma Seqlab Sequence Laboratories Göttingen GmbH, Göttingen sequenziert. 60 Material und Methoden Zusätzlich wurde ein enzymatischer Verdau der Plasmide mit EcoRI durchgeführt und die elektrophoretische Auftrennung wie oben beschrieben durchgeführt. 3.4.1.6 PCR der Plasmidprodukte und Aufreinigung Zur Herstellung der RNA-Sonden wurde mit den genannten, spezifischen Primern in Kombination mit den kommerziell erhältlichen M13 reverse bzw. M13 forward Primern und der Plasmid-DNA als template eine weitere PCR und Gelelektrophorese durchgeführt. Danach erfolgte die Aufreinigung des PCR-Produktes unter Verwendung des Nucleospin®-Extract II Kit (Macherey und Nagel GmbH und Co KG; Düren). 3.4.1.7 Labelling der Sonden mit DIG Die Synthese der Digoxigenin-markierten Sonde erfolgte unter Verwendung des DIG RNA Labelling-Mix (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) und dem Zusatz entsprechender T3- und T7-Polymerase (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim) und des PCR-Produktes. Für die hergestellten Sonden gegen kanine H4R-mRNA entspricht die T3-Sonde der sense-Sonde, die komplementär zum codogenen Strang der DNA orientiert ist und als interne Negativkontrolle verwendet werden kann. Die T7-Sonde ist die antisense-Sonde, die komplementär zum nicht-codogenen (bzw. sense-) DNA-Strang orientiert ist und in der ISH mit der mRNA hybridisiert bzw. die mRNA detektiert. Die Lagerung der fertigen Sonden erfolgte in Aliquots bei -80°C. 3.4.2 Durchführung der in situ-Hybridisierung Die Durchführung der in situ-Hybridisierung erfolgte nach einem dreitägigen Protokoll in Anlehnung an die von GRÖTERS et al. (2005) und JACOBSEN et al. (2010) verwendete Methode. Die verwendeten Lösungen und Puffer wurden im Vorfeld autoklaviert und die Glaswaren mit Heißluft sterilisiert. Die Inkubation der Schnitte erfolgte in Standküvetten bzw. in feuchten Kammern bei Raumtemperatur. Bei von der Raumtemperatur abweichenden Inkubationstemperaturen wurden die jeweils verwendeten Lösungen in einem Wasserbad vorgewärmt und die Standküvetten im 61 Material und Methoden Wasserbad inkubiert. Die Rezepte zur Herstellung der Puffer, Lösungen und Reagenzien sind im Anhang (Kapitel 9.6) aufgeführt. Die Detektion der Sonde erfolgte durch einen gegen Digoxigenin (DIG) gerichteten Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt ist und das Chromogen Nitroblau-Tetrazoliumchlorid zu einem violetten Reaktionsprodukt umsetzt. Der entstandene Farbniederschlag lagert sich in unmittelbarer Nähe zum Entstehungsort ab und ist sehr stabil. 3.4.2.1 Material und Kontrollen Die Durchführung der in situ-Hybridisierung gegen H4R-mRNA zielte auf die Darstellung des Expressionsmusters am kaninen Darm und wurde exemplarisch nur an einem Teil der Gesamtuntersuchungspopulation durchgeführt. Es wurden Proben aus dem Duodenum und Kolon von insgesamt 9 Kontrollhunden und Bioptate aus diesen Bereichen von 6 Hunden der IBD-Gruppe mittels in situ-Hybridisierung untersucht (siehe Tabelle 26 im Anhang). Als Reaktionskontrolle wurde bei jeder durchgeführten in situ-Hybridisierung eine etablierte Sonde aus der Routinediagnostik des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mitgeführt. Hierbei handelte es sich um eine RNA-Sonde gegen das kanine Staupevirus, die Antigen in einem Zellpellet aus CDVinfizierten DH82-Zellen detektiert (GRÖTERS 2004; GRÖTERS et al. 2005). Als Negativkontrolle dienten zusätzlich mitgeführte Gewebeschnitte der untersuchten Lokalisationen, die lediglich mit Hybridisierungspuffer ohne Sondenzusatz behandelt wurden. 3.4.2.2 Protokoll der in situ-Hybridisierung Erster Tag 1. Entparaffinierung der Schnitte: dreimal 5 Minuten in Roti®-Histol, je 5 Minuten in Isopropanol, 96%igem Alkohol und 70%igem Alkohol, anschließendes Spülen der Schnitte in DEPC-haltigem Aqua bidest. (5 Minuten und 1 Minute) und 5 Minuten in PBS-Pufferlösung. 62 Material und Methoden 2. Inkubation in 0,2 M HCl für 20 Minuten zum Aufschluss der Zellmembranen. 3. Spülen der Schnitte für zweimal 30 Minuten in 2xSSC + 5 mM EDTA bei 50°C. 4. Proteolyse mit 4 µg/ml Proteinase K (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 1 ml 1 M TRIS pH 8, 1 ml 0,1 M CaCl2 ad 60 ml DEPC-haltiges Aqua bidest. und eine Proteinase K-Konzentration von 7 µl/ml für Darmgewebe). 5. Inkubation der Schnitte für 5 Minuten in 0,2%igem Glycin-PBS zum Abstoppen der Proteolysereaktion. 6. Nachfixierung der Schnitte in 4%igem Paraformaldehyd für 4 Minuten. 7. Spülen der Schnitte für zweimal 1 Minute in 1xPBS. 8. Inkubation der Schnitte für 15 Minuten 1xPBS + 5 mM MgCl2. 9. Azetylierung in 0,25%igem Azetanhydrid in 0,1 Triethanolamin (pH 7,5) für 10 Minuten (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 745 mg TEA ad 50 ml DEPC-haltiges Aqua bidest. und 125 µl Aca). 10. Spülen der Schnitte für zweimal 1 Minute und anschließend 15 Minuten in 1xPBS. 11. Prähybridisierung für mindestens 60 Minuten bei 37°C in Prähybridisierungspuffer (Lösung wird frisch angesetzt unter Verwendung einer eingefrorenen Stammlösung unter Zugabe von 0,5 ml ssDNA und 1,25 ml RNA-Lösung). 12. Hybridisierungspuffer herstellen (Lösung wird frisch angesetzt unter Verwendung einer eingefrorenen Stammlösung unter Zugabe von 18 µl RNA-Lösung, 20 µl ssDNA, 80 µl Dextransulfat und der jeweiligen Sonde in einer Konzentration von 1500 ng/100 µl HB-Mix). 63 Material und Methoden 13. Überschichten der Schnittpräparate mit 35 µl Hybridisierungspuffer, Abdecken mit Gel-bond® und Abdichten mit Fix-O-Gum®. 14. Inkubation über Nacht bei 52°C in einer feuchten Kammer im Wärmeschrank. Zweiter Tag 1. 2. Entfernen des Gel-bond®-Films und des Fix-O-Gum®. Posthybridisierungswaschung für zweimal 15 Minuten bei 42°C mit 6xSCC + 45%igem Formamid (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 36 ml 20xSCC, 54 ml 100%iges Formamid und 30 ml Aqua bidest.). 3. Spülen der Schnitte für zweimal 5 Minuten in 2xSCC. 4. Inkubation der Schnitte bei 37°C für 30 Minuten in RNAse-Lösung (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 10 ml 3 M NaCl, 600 µl 1 M TRIS (pH 8,0), 120 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 49 ml Aqua bidest, 15 µl RNAse A und 50 µl RNAse T). 5. Spülen der Schnitte für zweimal 5 Minuten in 2xSCC. 6. Spülen der Schnitte für zweimal 15 Minuten in 0,2xSCC bei 50°C. 7. Spülen der Schnitte für 1 Minute in Puffer 1. 8. Inkubation der Schnitte für 30 Minuten in Blockinglösung (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 1,2 ml steriles, neutrales Schafserum und 1,8 ml 10%iges Triton X-100, ad 60 ml Puffer 1). 9. Inkubation der Schnitte für 2 Stunden mit anti-DIG-Antikörper (Verdünnung 1:200) in Antikörperpuffer (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 31 µl NNS, 94 µl 10%iges Triton X-100 und 3 ml Puffer 1) in einer feuchten Kammer. 64 Material und Methoden 10. Spülen der Schnitte für zweimal 15 Minuten in Puffer 1. 11. Spülen der Schnitte für 2 Minuten in Puffer 3. 12. Inkubation der Schnitte für max. 24 Stunden in Färbelösung (Lösung wird frisch angesetzt und enthält 225 ml NBT, 175 µl X-Phosphat und 12 µl Levamisol ad 50 ml Puffer 3) im Dunkeln, ggf. Wechsel der Färbelösung nach 12-16 h). Dritter Tag 1. Abstoppen der Farbreaktion durch Inkubation der Schnitte für zweimal 10 Minuten mit Puffer 4 im Dunkeln. 2. Spülen der Schnitte für zweimal 2 Minuten in Aqua bidest. 3. Mehrmaliges Spülen der Schnitte in warmem Leitungswasser. 4. Eindecken der Schnitte mit bei 50°C vorgewärmten Glycergel®. 3.5 Auswertung und Dokumentation 3.5.1 Lichtmikroskopische Beurteilung Die Auswertung der HE-gefärbten Schnittpräparate sowie der immunhistochemischen Reaktion und der in situ-Hybridisierung erfolgte mittels eines Binokular-Lichtmikroskops (Typ Axioplan, Carl Zeiss AG, Oberkochen). 3.5.2 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Schnittpräparate erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung und Scoring der Reaktionsintensität in jeweils 5 Gesichtsfeldern im oberen Zottenbereich und basalen Kryptbereich der Tunica mucosa. In den Lokalisationen Magen und Kolon wurden anstatt der Zottenregion der obere Bereich der Lamina propria mucosae sowie das Epithel beurteilt. Wie in Tabelle 9 ersichtlich reichte der Score hierbei von 0 (keine Expression) bis 3 65 Material und Methoden (hochgradige, intensive Reaktion). Aus den so erhobenen Rohdaten wurde jeweils ein Mittelwert für die apikale und basale Expression errechnet. Tabelle 9: Verwendung der Scores Reaktionsintensität/ Expression Semiquantitativer Score negativ geringstgradig geringgradig geringbis mittelgradig mittelgradig mittelbis hochgradig hochgradig - (+) + +(+) ++ ++(+) +++ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Zahlenscore 3.5.3 Auswertung der in situ-Hybridisierung Die Beurteilung der Schnittpräparate aus der in situ-Hybridisierung erfolgte lediglich deskriptiv. Dabei wurden nur NBT-Präzipitate als positiv angesehen, die sich in derselben Ebene wie der Gewebsschnitt befanden, zellassoziiert waren und sich nicht in einem nur mit Hybridisierungspuffer behandelten Kontrollschnitt wiederfanden. 3.5.4 Fotografische Dokumentation Die fotografische Dokumentation erfolgte digital mittels eines Fotomikroskops des Typs Olympus BX 51 und der PC-Software „Cell^D“. 3.5.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der semiquantitativ erhobenen Scores erfolgte mit der Statistiksofware „Statistical Analysis System“ (SAS; Version 9.3). Es wurde eine deskriptive Untersuchung für alle untersuchten Expressionsintensitäten (H1R, H2R und H4R) sowie für die WSAVA-Scores durchgeführt. Da die erhobenen Daten nicht normal verteilt waren, wurden ausschließlich nicht-parametrische Test verwendet. Für den Vergleich der Kontrollgruppen untereinander sowie zwischen Kontrolltieren und erkrankten Tieren wurden der Kruskal-Wallis-Test sowie der Wilcoxon-Rangsummen-Test verwendet. Dabei wurde ein p-Wert von kleiner als 0,0001 (p-Wert < 0,0001) als statistisch Material und Methoden 66 hochsignifikant und ein p-Wert kleiner als 0,05 (p-Wert < 0,05) als statistisch signifikant angesehen, p-Werte von kleiner als 0,1 (p-Wert < 0,1) wurden als statistisch auffällig interpretiert. Die Ergebnisse der statistischen Untersuchungen wurden mittels des Statistikprogrammes „Superior Performing Software System“ (SPSS; Version 20.0) in Boxplot-Diagrammen dargestellt. Außerdem wurde unter Verwendung des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman eine Korrelationsanalyse durchgeführt. Diese Berechnung erfolgte ebenfalls mit SAS (Version 9.3). 67 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Pathologisch-anatomische und histopathologische Befunde der untersuchten Hunde 4.1.1 Makroskopische und histopathologische Befunde der Kontrollhunde Bei den Hunden der Kontrollgruppe handelt es sich ausschließlich um Tiere, die vorberichtlich klinisch keinerlei Symptome einer gastrointestinalen Erkrankung aufwiesen. Bei der Sektion und Probenentnahme wurde der Magen-Darmtrakt makroskopisch beurteilt. Bei der Mehrzahl der Tiere zeigten sich keine Auffälligkeiten. Das Tier mit der laufenden Nummer 19 zeigte eine geringgradige Koprostase im distalen Dickdarm. Bei dem Tier mit der laufenden Nummer 3 fanden sich im Rahmen der Probenentnahme segmental geringgradig Nematodenstadien im Dünndarm. Nach Aufarbeitung der Proben und einer Übersichtsfärbung mittels HE erfolgte eine histologische Beurteilung der ausgewählten Lokalisationen. Eine detaillierte Auflistung der histologischen Befunde aller Kontrolltiere findet sich in Tabelle 12 im Anhang. Zusammengefasst fanden sich dabei in den Proben des Magens bei 6 Tieren vermehrt lymphoide Aggregate in der Lamina propria mucosae (26,1%). Bei 5 Tieren fanden sich geringgradige, lymphoplasmazelluläre Entzündungszellinfiltrate (21,7%). Das Tier mit der laufenden Nummer 12 zeigte zusätzlich eine geringgradige Infiltration mit neutrophilen Granulozyten. In den Dünndarmlokalisationen zeigten sich im Duodenum bei 6 Tieren sowie im Jejunum bei einem Tier geringgradige, teils multifokale Kryptdilatationen und -abszesse (25% respektive 4,2%). Im Duodenum wiesen 7 Tiere ein vermehrtes lymphoplasmazelluläres Infiltrat auf (29,2%). Bei einem Tier fanden sich geringgradige, neutrophile Infiltrate (4,2%). Eosinophile Entzündungszellinfiltrationen 68 Ergebnisse der Lamina propria mucosae konnten im Duodenum bei einem Tier (4,2%), im Jejunum bei 6 Tieren (25%) und im Ileum bei 3 Tieren (12,5%) festgestellt werden. Die Proben des Kolons wiesen bei 12 Tieren eine meist geringgradige, vermehrte, lymphoplasmazelluläre Zellinfiltration auf (50%). Jeweils bei einem Tier fanden sich eine geringgradige, eosinophile Entzündungsreaktion, geringgradige, multifokale Kryptdilatationen sowie eine geringgradige Fibrose der Lamina propria mucosae (je 4,2%). 4.1.2 Histopathologische Befunde der Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Bei den Tieren der Erkrankungsgruppen handelt es sich um Patienten, die vorberichtlich Leitsymptome einer gastrointestinalen Erkrankung über einen Zeitraum von mehreren Untersuchungen Wochen durch Kotuntersuchungen, antiparasitische inflammatory zeigten. die behandelnden bildgebende Vorbehandlungen bowel disease Mittels Verfahren, wurden weiterführender Tierärzte, diätetische wichtige ausgeschlossen. In wie diagnostischer Blut- und Maßnahmen und Differentialdiagnosen allen Fällen wurde der eine diagnostische Gastro- und Duodenoskopie, in einigen Fällen zusätzlich auch eine Koloskopie mit Biopsieentnahme durchgeführt. Nach Aufarbeitung der Proben und Übersichtsfärbung mittels HE wurden die Proben im Rahmen der Routinediagnostik beurteilt. Für die Untersuchungen der vorliegenden Studie erfolgte eine weitere histopathologische Bewertung der Fälle nach den Kriterien der WSAVA (DAY et al. 2008) durch drei Untersucher (Prof. Hewicker-Trautwein, Johannes Junginger und Ulrike Schwittlick). Bei allen Tieren fanden sich mindestens gering- bis mittelgradige pathohistologische Veränderungen in einer der untersuchten Lokalisationen. Detaillierte Angaben über Grad und Charakter der entzündlichen Veränderungen finden sich in Tabelle 13 im Anhang. 4.1.3 Histopathologische Scores der untersuchten Hunde Die histopathologische Untersuchung und Beurteilung aller Lokalisationen des Magendarmtraktes aller untersuchten Tiere wurde nach den Richtlinien und Bewertungskriterien der WSAVA (DAY et al. 2008) durchgeführt. Aus den einzelnen 69 Ergebnisse Befunden wurde nach DAY et al. (2008) ein Score (WSAVA-Score, siehe Tabelle 14 im Anhang) ermittelt, der zum statistischen Vergleich der histopathologischen Veränderungen zwischen den verschiedenen Gruppen herangezogen wurde. Hierbei zeigten sich im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöhte WSAVA-Scores bei den Tieren mit lymphoplasmazellulären Gastrointestinaltraktes (p < 0,0001). und Zwischen eosinophilen den Läsionen des WSAVA-Scores der lymphoplasmazellulären und der eosinophilen Form der IBD fanden sich keine signifikanten Unterschiede (siehe Abb. 1). Dies zeigte sich auch im Vergleich der einzelnen anatomischen Lokalisationen (Magen, Duodenum und Kolon). Die einzelnen p-Werte sind in Tabelle 21 im Anhang aufgeführt. Abb. 1: Vergleichende Darstellung der WSAVA-Scores in allen Lokalisationen zwischen Kontrollhunden und Tieren mit IBD Abkürzungen: EGE = eosinophile Gastroenteritis, IBD = inflammatory bowel disease, LPE = lymphoplasmazelluläre Enteritis, WSAVA-Score = Score nach den Richtlinien der World Small Animal Veterinary Association Gastrointestinal Standardization Group Ergebnisse 70 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen 4.2.1 Kontrollen und Absorptionsreaktionen Die durchgeführten Negativkontrollen unter Auslassung des primären Antikörpers zeigten keine spezifischen Reaktionen in den Präparaten von Dünn- und Dickdarm. Im Magen fand sich allerdings eine artifizielle, schwache bis kräftige, granulärzytoplasmatische Anfärbung der Belegzellen, die nicht eliminiert werden konnte, sodass eine Beurteilung dieser Zellen im Rahmen der Auswertung nicht stattfand. Der Mukus der Magenschleimhaut sowie der Inhalt von Becherzellen im Dickdarm zeigte in einigen Fällen eine Anfärbung ohne Zellassoziation, wobei es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um eine unspezifische Farbstoffablagerung handelt. Weiterhin fanden sich in einigen Schnittpräparaten artifizielle, teils deutliche, großflächige, homogene, intravasale AEC-Ablagerungen, die eine Beurteilung der endothelialen Reaktion erschwerten. Derartige unspezifische, klumpige AECAblagerungen fanden sich gelegentlich auch an der Außenseite der Serosa. Bei der Verwendung von Serum von nicht-immunisierten Ziegen als Negativkontrolle kam es zu einer sehr starken Hintergrundreaktion, die zu einer starken Anfärbung zahlreicher Strukturen in der gesamten Darmwand führte. Erst bei Verdünnung des eingesetzten Serums über 1:10000 verschwand diese Reaktion und war bei Verdünnungen über 1:50000 konstant nicht mehr feststellbar. Die Ursache dieses Phänomens blieb unklar. Möglicherweise lag eine unspezifische Kreuzreaktion von Antikörpern aus dem Serum der verwendeten, nicht-immunisierten Tiere vor. Zusätzlich wurde eine Absorptionsreaktion durch Präinkubation der Erstantikörper gegen H1R und H2R mit verschiedenen Konzentrationen spezifischer Blockingpeptide durchgeführt (siehe Abb. 2 bis 4). Dadurch ließen sich die Reaktionen der Erstantikörper hemmen, wobei für eine optimale Hemmung der Antikörperreaktion unterschiedliche Peptidkonzentrationen eingesetzt wurden. Die Absorptionsreaktion mit dem H1R-Blockingpeptid zeigte gute Ergebnisse bei einer Peptidkonzentration von 0,0005 bis 0,005 mg/ml. Für die Absorption mit dem H2R-Blockingpeptid wurde eine Hemmung der Antikörperreaktion bei einem Einsatz von 0,001 bis 0,005 mg/ml Ergebnisse 71 Blockingpeptid erreicht. Bei beiden Reaktionen wurden nach der Absorption jedoch multifokale, teils über der Ebene liegende, klumpige AEC-Ablagerungen festgestellt. Bei der Absorptionsreaktion des Antikörpers gegen H2R blieb eine Anfärbung der Ganglien des Plexus submucosus und des Plexus myentericus bestehen, sodass von einem unspezifischen, färberischen Artefakt ausgegangen werden kann. Zusätzlich zeigten sich bei der Absorptionsreaktion mit dem H2R-Blockingpeptid im Zottenbereich multifokale, filamentöse Farbablagerungen. Wie diese Effekte entstanden sind, bleibt unklar. Möglicherweise handelt es sich um eine unspezifische Ablagerung von Peptid-Antikörperkomplexen auf dem Schnitt. Abb. 2: a, b) IHC zum Nachweis von H1R (anti-H1R-Antikörper 1:80); Zottenbereich (a) und Kryptbereich (b) aus dem Jejunum von Kontrollhund Nr. 9 c, d) Absorptionsreaktion mit H1R Blockingpeptid (anti-H1R-Antikörper 1:80 und Blockingpeptid 1:5000 (a) bzw. 1:10000 (b)); Zottenbereich (a) und Kryptbereich (b) aus dem Jejunum von Kontrollhund Nr. 9 Ergebnisse Abb. 3: IHC zum Nachweis von H2R (anti-H2R Antikörper 1:900); Jejunum von Kontrollhund Nr. 9 Abb. 4: Absorptionsreaktion mit H2R Blockingpeptid (anti-H2R-Antikörper 1:900 und Blockingpeptid 1:500); Jejunum von Kontrollhund Nr. 9 72 73 Ergebnisse 4.2.2 Expression der Histaminrezeptoren 1, 2 und 4 bei den Kontrolltieren Die Expression der jeweiligen Histaminrezeptoren wurde an 24 Kontrolltieren untersucht und deskriptiv ausgewertet. Die Ergebnisse sind in den folgenden Abschnitten (4.2.2.1 bis 4.2.2.3) dargestellt und anschließend im Kapitel 4.2.2.4 zusammengefasst. Wie in Kapitel 4.2.1 erwähnt, war die Beurteilung der Belegzellen des Magens aufgrund färberischer Artefakte nicht möglich. 4.2.2.1 Expression von Histaminrezeptor 1 4.2.2.1.1 Expression von H1R im Magen Die Untersuchung des Magenfundus von 23 Kontrolltieren zeigte ein einheitliches Expressionsmuster für H1R. Das oberflächliche Epithel sowie das Epithel im Isthmusbereich zeigte in allen Fällen eine deutliche, teils feingranulierte zytoplasmatische Reaktion (siehe Abb. 5), wobei die Epithelzellen der Areae gastricae oft stärker reagierten. Die Hauptzellen der Fundusdrüsen waren in 95,6% (22/23) der Fälle positiv (siehe Abb. 6). Die Immunzellen der Lamina propria mucosae, hauptsächlich Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen, waren schwer zu identifizieren, zeigten aber oft (86,9%; 20/23) eine positive Reaktion (siehe Abb. 5). Die Zellen der lymphoiden Aggregate in der Magenschleimhaut waren soweit vorhanden deutlich positiv. Bei einem Teil der Tiere (69,5%; 16/23) fanden sich schwache Reaktionen von spindelförmigen Zellen in der Lamina propria mucosae, bei denen es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um Fibrozyten und Myozyten handelt. Die glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae zeigten bei fast allen Präparaten (95,6%, 22/23) eine dezente bis deutliche positive Reaktion. Die kollagenen und elastischen Fasern der Tela submucosa waren größtenteils negativ (91,3%; 21/23), es fanden sich jedoch in vielen Schnitten positive, irreguläre bis langgestreckte Strukturen, deren Ursprung unklar blieb. Eine deutliche positive Reaktion des Plexus submucosus war nur in 2 Fällen (8,7%) feststellbar, während in den anderen Präparaten dieser neuronale Plexus nicht eindeutig identifiziert werden 74 Ergebnisse konnte. Die Myozyten der Tunica muscularis zeigten in 91,3% (21/23) der untersuchten Funduslokalisationen eine dezente bis deutliche, feingetüpfelte, positive Reaktion. Die neuronalen und glialen Strukturen des Plexus myentericus zeigten in 82,6% der Fälle eine positive Reaktion. In allen Schnitten zeigten die serosalen Deckzellen eine zytoplasmatische, feingranulierte Anfärbung. Die Gefäße in der Tunica muscularis und der Tela submucosa wiesen regelmäßig eine endotheliale Reaktion (95,7%; 22/23) und positive Reaktion der glatten Gefäßwandmuskulatur (95,7%; 22/23) auf. Die Erythrozyten zeigten durchgehend keine Reaktion. 4.2.2.1.2 Expression von H1R im Dünndarm Die insgesamt 71 Dünndarmlokalisationen aus Duodenum, Jejunum und Ileum zeigten insgesamt ein einheitliches Expressionsmuster für H1R. So zeigten die Enterozyten in allen Lokalisationen eine positive Reaktion (siehe Abb. 7 und 8), die jedoch zwischen zarter zytoplasmatisch getüpfelter Anfärbung und kräftiger, im basalen Bereich der Zellen akzentuierter Reaktion variierte. In einigen Fällen fanden sich auch deutliche Reaktionen im apikalen Zellbereich (9,9%, 7/71). In der Lamina propria mucosae fand sich bei 28,2% (20/71) eine meist zarte, feingranulierte Reaktion von spindelförmigen oder langgestreckten Zellen, bei denen es sich vermutlich um Fibrozyten, Fibroblasten oder Myozyten handelte. In der Mehrzahl der untersuchten Lokalisationen wies ein Teil der Immunzellen, hauptsächlich Lymphozyten und Plasmazellen, eine deutliche positive Reaktion auf (98,6%; 70/71; siehe Abb. 7 und 8), wobei die positiven Zellen mitunter clusterartig zusammen lagen. Die Lamina muscularis mucosae ließ nur teilweise eine dezente, positive Reaktion der glatten Muskulatur erkennen (63,4%, 45/71). Die Tela submucosa zeigte keine Reaktion der kollagenen und elastischen Fasern, der Plexus submucosus wies jedoch überwiegend eine kräftige Reaktion der zugehörigen neuronalen und glialen Strukturen auf (95,8; 68/71). In der Mehrzahl der Präparate waren teils zellkernassoziierte, unregelmäßige, kräftig gefärbte Strukturen im Bereich der Tela submucosa erkennbar (93%; 66/71). 75 Ergebnisse Die glatte Muskulatur der Tunica muscularis zeigte überwiegend positive Reaktionen (95,8%, 68/71), die in variierender Intensität als zytoplasmatisch, teils perinukleär getüpfelt beschrieben werden können (siehe Abb. 9). Der Plexus myentericus zeigte in 97,2% der untersuchten Lokalisationen eine positive Reaktion von neuronalen und glialen Zellen (siehe Abb. 9). Die Tunica serosa zeigte überwiegend eine kräftige Anfärbung der mesothelialen Zellen (95,8%, 68/71). In 28 der insgesamt 71 untersuchten Dünndarmlokalisationen fanden sich Anschnitte von Peyer-Platten, die alle eine dezente bis deutliche, zytoplasmatische Reaktion der Lymphozyten aufwiesen (siehe Abb. 7), die teilweise im basalen Bereich der lymphoiden Aggregate stärker ausgeprägt war. In einem Teil der untersuchten Dünndarmlokalisationen zeigte sich eine positive Reaktion der Gefäßwandmuskulatur (38%; 27/71) sowie des Endothels (97,2%; 69/71) von Gefäßen der einzelnen Darmwandschichten sowie mesenterialen Gefäßen. In 2 Lokalisationen des Duodenums waren Anschnitte der Brunner-Drüsen vorhanden, die jeweils eine positive Reaktion der epithelialen Drüsenzellen zeigten. 4.2.2.1.3 Expression von H1R im Dickdarm In den 24 untersuchten Kolonproben fand sich ein konstantes Expressionsmuster für H1R. In allen Schnitten zeigte sich eine deutliche, teils feingranulär- membranassoziierte, teils zytoplasmatische, basal verstärkte positive Reaktion der Kolonepithelzellen (siehe Abb. 10). Die Lymphozyten und Plasmazellen der Lamina propria mucosae wiesen ebenfalls in allen Kolonlokalisationen eine teils kräftige zytoplasmatische Reaktion auf, wobei auch regelmäßig Zellen mit schwächerer Reaktion aufgefunden wurden (siehe Abb. 10). Die Bindegewebszellen der Lamina propria mucosae zeigten teilweise eine schwache, getüpfelte positive Färbung (75%; 18/24), während die glatte Muskulatur der Lamina muscularis mucosae nur in der Hälfte der Fälle eine dezente, zytoplasmatische, feingetüpfelte Reaktion zeigte. Die Tela submucosa wies keine Reaktion der kollagenen Fasern auf, zeigte jedoch in allen Fällen eine deutliche positive Reaktion des Plexus submucosus. Weiterhin fanden sich durchgehend irreguläre, stark gefärbte Einzelstrukturen. Die Tunica muscularis zeigte eine deutliche, zytoplasmatisch getüpfelte Reaktion der glatten Ergebnisse 76 Muskulatur sowie eine kräftige Reaktion des Plexus myentericus in allen untersuchten Schnitten. Die Serosa war in allen Lokalisationen positiv. In 12 der untersuchten Kolonlokalisationen fanden sich lymphoide Aggregate, die in allen Fällen eine dezente bis deutliche, positive zytoplasmatische Reaktion der Lymphozyten zeigten. Die Mehrzahl der Gefäßstrukturen zeigte eine positive, endotheliale Reaktion (91,7%; 22/24) sowie eine Anfärbung der glatten Muskulatur der Gefäßwände (62,5%; 15/24). Abb. 5: IHC zum Nachweis von H1R; oberflächliches Epithel und Lamina propria mucosae des Magens von Kontrollhund Nr. 1; positive Reaktion von Epithelzellen (Pfeile) und Immunzellen (Pfeilspitzen) Ergebnisse Abb. 6: IHC zum Nachweis von H1R; Drüsenepithel des Magens von Kontrollhund Nr. 1; deutliche Reaktion der Hauptzellen (Pfeilspitzen) und artifiziell dezent angefärbte Belegzellen (Pfeile) (siehe Kapitel 4.2.1) Abb. 7: IHC zum Nachweis von H1R; Tunica mucosa und Tela submucosa des Duodenums von Kontrollhund Nr. 7; deutliche Reaktion von Enterozyten (Pfeile), einzelnen Immunzellen der Lamina propria mucosae (Pfeilspitzen) und Lymphozyten der Peyer-Platten (PP) 77 Ergebnisse Abb. 8: IHC zum Nachweis von H1R; Zottenbereich des Jejunums von Kontrollhund Nr. 11; deutliche Reaktion von Enterozyten (Pfeile) und einzelnen Immunzellen der Lamina propria mucosae (Pfeilspitzen) Abb. 9: IHC zum Nachweis von H1R; Tunica muscularis mit Plexus myentericus vom Kontrollhund Nr. 11; kräftige Reaktion von Neuronen (Pfeilspitzen) und dezente, multifokale Reaktion der glatten Muskulatur (Pfeil) 78 Ergebnisse Abb. 10: IHC zum Nachweis von H1R; Kolon von Kontrollhund Nr. 11; positive Reaktion von Enterozyten (Pfeile) und teils clusterartig zusammenliegenden Immunzellen (Pfeilspitzen) 79 80 Ergebnisse 4.2.2.2 Expression von Histaminrezeptor 2 4.2.2.2.1 Expression von H2R im Magen Die Lokalisationen des Magenfundus von 23 untersuchten Tieren der Kontrollgruppe wiesen ein konstantes Expressionsmuster für den H2R auf. Aufgrund der Ergebnisse der Absorptionsreaktion ist die Reaktion der nervalen Plexus jedoch als fraglich einzustufen. Die Zellen des oberflächlichen Epithels sowie des Isthmusepithels zeigten in der Mehrzahl der Fälle (86,9%; 20/23) eine feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion, meist mit perinukleär akzentuierter Verstärkung der Färbung. In 82,6% der Fälle fand sich eine positive Reaktion der Hauptzellen der Fundusdrüsen, die sich teilweise als zarte, feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion darstellte (siehe Abb. 11). In einigen Fällen (26,1%; 6/23) fanden sich im Bereich der Fundusdrüsen zusätzlich multifokal intensiv panzytoplasmatisch angefärbte Einzelzellen (siehe Abb. 11). Die Immunzellen Plasmazellen, der Lamina zeigten in propria mucosae, 91,3% der Fälle vorwiegend (21/23) Lymphozyten eine multifokale und bis panzytoplasmatische Reaktion. In 13 der untersuchten Lokalisationen aus dem Fundus fanden sich lymphoide Aggregate im Bereich der basalen Lamina propria. In 69,2% (9/13) der Präparate zeigte die Mehrzahl der Lymphozyten in diesem Bereich eine dezente, punktuell verteilte bis panzytoplasmatische Reaktion. Nur in wenigen Schnitten (26,1%; 6/23) war teilweise eine minimale, oft fokale, zytoplasmatische Reaktion von spindelförmigen Zellen der Lamina propria mucosae zu verzeichnen, bei denen es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um Myozyten, Fibroblasten oder Fibrozyten handelt. Im Gegensatz dazu zeigten 73,9% (17/23) der Lokalisationen eine dezente, zytoplasmatische, feingranulierte Reaktion der glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae. In der Tela submucosa stellten sich die kollagenen und elastischen Fasern durchgehend negativ dar. In 26,1% der Fälle zeigte der Plexus submucosus eine deutliche, feingranulierte, zytoplasmatische, positive Reaktion der Neuronen. Gliale Elemente konnten nicht sicher differenziert werden. In der Mehrzahl der Schnitte 81 Ergebnisse konnte der Plexus submucosus nicht aufgefunden werden (73,9%; 17/23). Darüber hinaus fanden sich in der Mehrzahl der Schnitte (95,6%; 22/23) multifokal intensiv gefärbte, teils große, oft zellassoziierte, unregelmäßige Strukturen. Die Tunica muscularis zeichnete sich in 86,9% (20/23) der untersuchten Anschnitte durch eine dezente bis kräftige, zytoplasmatische, getüpfelte Reaktion der Myozyten aus. Der Plexus zytoplasmatische myentericus bis intensiv zeigte in 86,9% panzytoplasmatische, (20/23) teils eine granulierte membranassoziierte Reaktion der Nervenzellen und eine getüpfelte, zytoplasmatische Reaktion der Gliazellen, wobei in 3 Schnitten der Plexus myentericus nicht angeschnitten war. In allen untersuchten Schnitten zeigte sich eine positive, zytoplasmatische, feingranulierte Reaktion der serosalen Mesothelzellen. Die Gefäße der Magenwand und soweit vorhanden auch die mesenterialen Gefäße zeigten eine feingetüpfelte, endotheliale Reaktion (siehe Abb. 11) sowie teilweise eine zarte granulierte Reaktion der Gefäßmedia. In 43,5% (10/23) zeigte sich eine dezente endotheliale Reaktion auch in den kapillären Gefäßen der Mukosa. Intravasale Erythrozyten waren durchgehend negativ, während sich in 26,1% der Fälle einzelne intensiv gefärbte intravasale, mononukleäre Zellen fanden. 4.2.2.2.2 Expression von H2R im Dünndarm Die untersuchten Lokalisationen aus Duodenum, Jejunum und Ileum der 24 Hunde zeigten ein einheitliches Expressionsmuster für den H2R. Die Enterozyten des Dünndarms zeigten in 95,8% der Fälle (68/71) eine zytoplasmatisch-getüpfelte Reaktion (siehe Abb. 12 und 13). Alle untersuchten Lokalisationen zeigten intensive, fokale, apikale Reaktionen einzelner Epithelzellen beziehungsweise kräftige, teils granulierte, panzytoplasmatische Reaktionen einzeln gelegener, länglicher Epithelzellen (siehe Abb. 12 und 13). Diese waren vor allem im basalen und mittleren Kryptbereich, vereinzelt aber auch im Bereich der Zotten auffindbar. Ergebnisse 82 Die in der Lamina propria mucosae lokalisierten Immunzellen (v.a. Lymphozyten und Plasmazellen) zeigten in der Mehrzahl der Fälle (94,4%; 67/71) eine granulierte bis panzytoplasmatische Reaktion in variierender Intensität. Teilweise fanden sich diese positiv angefärbten Zellen clusterartig zusammengelagert. Während nur in wenigen Fällen (18,3%, 13/71) eine multifokale, minimale Anfärbung von spindelförmigen bis länglichen Lamina propria-Zellen (Fibrozyten oder Myozyten) festzustellen war, zeigten in etwa der Hälfte der untersuchten Lokalisationen (52,1%; 37/71) die glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae eine geringgradige, zytoplasmatische, getüpfelte Reaktion. Die Tela submucosa zeichnete sich durch eine regelmäßige, intensive Reaktion des Plexus submucosus aus (95,8%; 68/70). Hierbei war eine sichere Differenzierung von Nervenzellkörpern und glialen Zellen lichtmikroskopisch nicht immer möglich, die Neuronen der Ganglien stellten sich jedoch zytoplasmatisch zart getüpfelt bis deutlich granuliert dar. Die Bindegewebsfasern waren durchgehend negativ. Des Weiteren fanden sich in fast allen Schnitten multifokale, unregelmäßige, sowohl freie als auch zellassoziierte, intensiv gefärbte Einzelstrukturen, deren Bedeutung unklar bleibt. Die Myozyten der Tunica muscularis zeigten in 98,6% (70/71) der Fälle eine zytoplasmatische, teils kernmembranassoziierte, fein getüpfelte Reaktion (siehe Abb. 14). Der Plexus myentericus reagierte immer positiv. Neuronen und Gliazellen zeigten eine feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion teilweise mit verstärkter membranassoziierter Anfärbung. In 85,9% der untersuchten Schnitte (61/71) fand sich eine positive, meist feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion der Mesothelzellen der Tunica serosa. In 32 der untersuchten Dünndarmlokalisationen fanden sich Anschnitte von PeyerPlatten, von denen 31 (96,9%) eine dezente bis kräftige, multifokale bis diffuse Reaktion des Zytoplasmas der Lymphozyten zeigten. Ergebnisse 83 Der Großteil der untersuchten Lokalisationen (97,2%; 69/71) zeigte eine positive Reaktion der Gefäßwände im mesenterialen Gewebe, der Tunica muscularis und der Tela submucosa. Hierbei waren die Myozyten der Gefäßmedia meist deutlich multifokal zytoplasmatisch angefärbt. Darüber hinaus zeigte sich eine teils kräftige, positive Reaktion von Endothelzellen, welche sich auch in wenigen Lokalisationen in der Tunica mucosa feststellen ließ (26,8%; 19/71). Während die Erythrozyten immer negativ waren, zeigten sich in wenigen Lokalisationen (16,9%; 12/71) auch kräftig positive, intravasale, mononukleäre Zellen, bei denen es sich um zirkulierende Leukozyten handeln könnte. Eine genauere Spezifizierung dieser intravasalen Zellen war nicht möglich. In zwei Lokalisationen des Duodenums fanden sich Anschnitte von Brunner-Drüsen, die eine zarte Anfärbung des Drüsenepithels aufwiesen. 4.2.2.2.3 Expression von H2R im Dickdarm Die untersuchten Proben aus dem Kolon von 24 Hunden wiesen ein konstantes Expressionsmuster für H2R auf. So fand sich in fast allen Schnitten (95,8%; 23/24) eine geringgradige bis deutliche, feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion der Enterozyten (siehe Abb. 15). In 41,6 % der Fälle (10/24) wiesen einzelne Epithelzellen der basalen Krypten fokale zytoplasmatische Reaktionen im apikalen Zellbereich auf. Teilweise fanden sich auch einzelne längliche Zellen mit kräftiger panzytoplasmatischer Reaktion im Kryptepithel (siehe Abb. 15 und 16). Die Lamina propria der Mukosa zeigte regelmäßig (95,8%; 23/24) eine deutliche homogenzytoplasmatische Reaktion von Immunzellen, welche größtenteils (75%; 18/24) clusterartig zusammenliegend lokalisiert waren (siehe Abb. 15). In nur 29,2% der untersuchten Fälle (7/24) stellten sich teilweise auch spindelförmige Zellen der Lamina propria mucosae dezent zytoplasmatisch gefärbt dar. Die Lamina muscularis mucosae zeigte in 62,5% der untersuchten Lokalisationen (15/24) eine dezente zytoplasmatische Tüpfelung der Myozyten. In der Tela submucosa stellte sich das kollagene und elastische Bindegewebe durchgängig negativ dar. In 91,7% der Schnitte (22/24) fand sich eine fein- bis grobgranulierte, zytoplasmatische Reaktion der Strukturen des Plexus submucosus, wobei neuronale und gliale Strukturen meist nicht sicher abgrenzbar waren. Darüber 84 Ergebnisse hinaus fanden sich im Großteil der Schnitte (95,8%; 23/24) teils zellassoziierte, unregelmäßig angefärbte Einzelstrukturen. Die Tunica muscularis wies in 95,8% der Fälle (23/24) sowohl eine positive, zytoplasmatisch getüpfelte Reaktion der Myozyten, als auch eine feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion von glialen Zellen und Nervenzellkörpern des Plexus myentericus auf. Dabei zeigten die Neuronen in einem Teil der Fälle auch eine deutliche membranassoziierte Reaktion. Die Mehrzahl der Kolonschnitte (83,3%; 20/24) wies eine zytoplasmatische Reaktion der serosalen Zellen in unterschiedlicher Intensität auf. In 12 Lokalisationen der untersuchten Schnitte fanden sich Anschnitte von lymphoiden Aggregaten, welche in 91,6% (11/12) meist eine geringgradige, multifokale, zytoplasmatische Reaktion bis hin zu einer dezenten panzytoplasmatischen Färbung der Lymphozyten aufwiesen. In der Mehrzahl der Fälle (91,7%; 22/24) zeigten die Gefäße des Mesenteriums, der Tunica muscularis und der Tela submucosa eine positive Reaktion. Es zeigte sich eine zytoplasmatische Tüpfelung der Myozyten der Gefäßmedia sowie teilweise eine endotheliale Reaktion (siehe Abb. 17). Bei einem Drittel der Fälle (33,3%, 8/24) ließ sich darüber hinaus eine geringgradige endotheliale Reaktion der kapillären Gefäße feststellen. Einige Schnitte (37,5%; 9/24) wiesen positiv angefärbte, intravasale, mononukleäre Zellen auf, bei denen es sich möglicherweise um zirkulierende Leukozyten handelt. Ergebnisse Abb. 11: IHC zum Nachweis von H2R; Drüsenepithel des Magens von Kontrollhund Nr. 1; deutliche, granuläre Reaktion der Hauptzellen (schmale Pfeile) und kräftige, positive Reaktion einzelner Epithelzellen (Pfeilspitzen) in den basalen Drüsenschläuchen; positive Reaktion von Endothelzellen (breite Pfeile) Abb. 12: IHC zum Nachweis von H2R; Tunica mucosa des Duodenums von Kontrollhund Nr. 2; positive Reaktion von Enterozyten (schmale Pfeile) und kräftige Reaktion einzelner Zellen im Kryptepithel (breite Pfeile) 85 Ergebnisse Abb. 13: IHC zum Nachweis von H2R; Enterozyten im Kryptbereich des Duodenums von Kontrollhund Nr. 2; positive Reaktion von Enterozyten und kräftige Reaktion einzelner Zellen im Kryptepithel (breite Pfeile) Abb. 14: IHC zum Nachweis von H2R; Tunica muscularis des Duodenums von Kontrollhund Nr. 21; Reaktion der Myozyten; Inset: Detailvergrößerung eines Myozytenkerns mit kernmembranassoziierter Reaktion 86 Ergebnisse Abb. 15: IHC zum Nachweis von H2R; Tunica mucosa des Kolons von Kontrollhund Nr. 17; dezente Reaktion der Enterozyten (Pfeile) und deutliche Reaktion von teilweise clusterartig zusammenliegenden Immunzellen (Pfeilspitzen) in der Lamina propria mucosae Abb. 16: IHC zum Nachweis von H2R; Tunica mucosa des Kolons von Kontrollhund Nr. 17; kräftige Reaktion des apikalen Zellpols von Kryptepithelzellen (Pfeile) 87 Ergebnisse Abb. 17: IHC zum Nachweis von H2R; Tunica mucosa des Kolons von Kontrollhund Nr. 17; Blutgefäße mit deutlicher Reaktion von Endothelzellen (breiter Pfeil) und unspezifische AEC-Ablagerungen im Gefäßlumen (L, siehe Kapitel 4.2.1) 88 89 Ergebnisse 4.2.2.3 Expression von Histaminrezeptor 4 4.2.2.3.1 Expression von H4R im Magen Die untersuchten Magenlokalisationen aus dem Bereich des Fundus von 23 Tieren zeigen ein einheitliches Expressionsmuster für den H4R. Die Zellen des Oberflächenepithels und der Magengrübchen (Foveolae gastricae) zeigten mehrheitlich (65,2%; 15/23) eine positive Reaktion, die von einer dezenten, homogenen, zytoplasmatischen Färbung der Zellen bis hin zu einer deutlichen zytoplasmatischen Tüpfelung variierte. In mehr als der Hälfe der untersuchten Lokalisationen (56,5%, 13/23) fand sich eine prominente Reaktion der oberflächlichen Epithelzellen akzentuiert im Bereich zwischen den Magengrübchen. Diese Zellen zeigten eine feingranulierte, meist basal betonte, zytoplasmatische Reaktion, die teilweise den subepithelialen Bereich miteinbezog (siehe Abb. 18). Die Hauptzellen der Drüsenschläuche im Fundus des Magens zeigten in allen Fällen eine feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion. In der Lamina propria der Tunica mucosa fanden sich vereinzelt Immunzellen mit punktueller, zytoplasmatischer Reaktion in 95,6% (22/23) der Fälle. In 12 der untersuchten Magenlokalisationen fanden sich lymphoidzellige Aggregate im basalen Bereich der Lamina propria, die größtenteils vereinzelte, punktuelle, zytoplasmatische Reaktionen der Lymphozyten zeigten (91,6%; 11/12). Glatte Muskelzellen, Fibrozyten, Fibroblasten und bindegewebige Fasern der Lamina propria mucosae stellten sich in allen Fällen negativ dar. In der Tela submucosa waren die bindegewebigen Fasern durchgehend negativ, jedoch fanden sich regelmäßig positive, teils zellassoziierte Einzelstrukturen. Der Plexus submucosus war nur in einem kleinen Bruchteil der Schnitte auffindbar und war lediglich in einem Fall positiv angefärbt. Die glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae zeigten teilweise eine dezente, zytoplasmatische Reaktion in Form einzelner bis multipler, punktueller Anfärbungen (47,8%; 11/23). 90 Ergebnisse Die Myozyten der Tunica muscularis zeigten bei nahezu allen Fällen (95,6%, 22/23) eine positive Reaktion, welche sich in dezenter bis deutlicher, zytoplasmatischer Tüpfelung zeigte. In einigen Lokalisationen zeigte sich ebenfalls eine teils kernmembranassoziierte Anfärbung (34,7%; 8/23). Die Nervenzellkörper des Plexus myentericus zeigten in 69,6% (16/23) der untersuchten Fälle eine zytoplasmatische, fein- bis grobgranulierte Expression, während in 17,4% (4/23) der Schnitte kein Plexus myentericus auffindbar war. In 78,2 % (18/23) der untersuchten Fälle fand sich eine meist feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion der serosalen Mesothelzellen. Eine positive Reaktion der glatten Muskulatur der Media von einigen Gefäßen ließ sich in 86,9 % (20/23) der untersuchten Lokalisationen v.a. in der Tela submucosa und der Tunica muscularis auffinden. Des Weiteren fanden sich in 43,5% der Fälle (10/23) intravasal stark positiv angefärbte Einzelzellen mit panzytoplasmatischem Expressionsmuster. 4.2.2.3.2 Expression von H4R im Dünndarm Die Proben der 24 untersuchten darmgesunden Hunde zeigten ein konstantes Expressionsmuster für den Histamin H4 Rezeptor in Duodenum, Jejunum und Ileum. Die Enterozyten des Dünndarmepithels zeigten in der Mehrzahl der Fälle (90,1%, 64/71) eine dezente bis kräftige, zytoplasmatisch getüpfelte Reaktion. Darüber hinaus fanden sich in 94,4% (67/71) der Dünndarmschnitte einzelne, stark positive, grobgranulär zytoplasmatisch reagierende Enterozyten an der Kryptbasis (siehe Abb. 19). Die in der Lamina propria der Tunica mucosa enthaltenen Immunzellen (v.a. Plasmazellen und Lymphozyten) zeigten teilweise eine positive, feine punktuelle bis multifokale, zytoplasmatische Reaktion in der Mehrzahl der untersuchten Präparate (95,7%; 68/71). Etwa bei 19,7% (14/71) waren im Zottenspitzenbereich auffallend mehr positive Lamina propria-Zellen aufzufinden. Weiterhin fanden sich in fast allen untersuchten Fällen (94,4%, 67/71) in der Lamina propria mucosae aller Dünndarmlokalisationen zytoplasmatisch stark angefärbte positive, Einzelzellen intensiv in grobgranulär variierender bis Anzahl. homogen Myozyten, Ergebnisse 91 Fibrozyten, Fibroblasten und bindegewebige Fasern der Lamina propria mucosae waren in allen Fällen negativ. In der Tela submucosa waren die kollagenen und elastischen Fasern durchgehend negativ. Dennoch ließen sich regelmäßig (74,6% 53/71) teils zellkernassoziierte, positive, nicht näher identifizierbare Einzelstrukturen auffinden. Der Plexus submucosus zeigte bei 71,8% (51/71) der untersuchten Fälle eine positive, zytoplasmatisch-granuläre Reaktion der Nervenzellkörper. Gliale Elemente ließen sich nicht abgrenzen. Auffällig erschien, dass die Tiere, welche keine neuronale Reaktion des Plexus submucosus zeigten, fast ausschließlich der Beaglegruppe angehörten. Weiterhin fand sich in einigen Fällen (39,4%, 28/71) eine dezente, positive, multipunktuelle Reaktion der Myozyten der Lamina muscularis mucosae. Die Tunica muscularis wies größtenteils eine positive, zytoplasmatisch getüpfelte, teils kernmembranassoziierte Reaktion der Myozyten im Längs- und Querschnitt auf (97,2%, 69/71). In 36,9% (24/65) der untersuchten Lokalisationen konnte eine intensivere Reaktion in dem der Tela submucosa angrenzenden Bereich festgestellt werden. Der Plexus myentericus zeigte in 67,6% (48/71) der untersuchten Fälle eine positive, zytoplasmatische, meist feingetüpfelte Reaktion (siehe Abb. 20). Auch hier waren es fast ausschließlich die Dünndarmproben der Beaglegruppe (88,2%, 15/17), die keine Reaktion der Ganglien zeigten. Die Serosa zeigte eine positive, zytoplasmatische Reaktion der Mesothelzellen im Großteil der Fälle (83,1%, 59/71). Diese variierte von punktuellen, zellassoziierten Reaktionen bis hin zu einer feingranulären, zytoplasmatischen Reaktion. In 31 der untersuchten Lokalisationen fanden sich Anschnitte von Peyer-Platten, die ausnahmslos eine positive Reaktion der lymphatischen Zellen zeigten. Das Reaktionsmuster variierte von wenigen, zarten, punktuellen bis hin zu multifokalen, grobgranulären, zytoplasmatischen Reaktionen der Lymphozyten mit dezenter Hintergrundfärbung im Bereich des Follikelzentrums. Ergebnisse 92 In 2 Anschnitten des Duodenums waren Brunner-Drüsen auffindbar, deren Drüsenepithelzellen eine deutliche, feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion aufwiesen. In einem Fall stellten sich die Epithelzellen der Ausführungsgänge intensiv angefärbt dar. Die glatte Muskulatur der Media von Blutgefäßen v.a. im Mesenterium, in der Tela submucosa und der Tunica muscularis zeigte in 83,1% (59/71) der Fälle eine fein getüpfelte, zytoplasmatische Reaktion in mindestens einer der untersuchten Lokalisationen. Die kapillären Gefäße der Tunica mucosa waren durchgehend negativ. Intravasal prominent zytoplasmatisch reagierende Einzelzellen ließen sich in 47,9 % (34/71) der untersuchten Fälle feststellen. 4.2.2.3.3 Expression von H4R im Dickdarm Die Kolonlokalisationen der 24 untersuchten Hunde zeigten in 91,7% der untersuchten Schnitte (22/24) eine zarte, feingetüpfelte, zytoplasmatische Reaktion des Kolonepithels sowie in 87,5% (21/24) eine intensive, grobgranuläre, teils basal akzentuierte bis panzytoplasmatische Reaktion einzelner Enterozyten im Bereich der Kryptbasis (siehe Abb. 21). Die Lamina propria der Tunica mucosa wies vorwiegend eine positive Reaktion der Immunzellen (v.a. Lymphozyten und Plasmazellen) mit zytoplasmatischem, multipunktuellem Reaktionsmuster auf (91,7%, 22/24). Weiterhin fanden sich in fast allen Schnitten einzelne, deutlich positive, grobgranuliert bis panzytoplasmatisch gefärbte Lamina propria-Zellen in variabler Anzahl (91,7%, 22/24). Myozyten, Fibrozyten, Fibroblasten und bindegewebige Fasern der Lamina propria mucosae waren meist negativ (87,5%, 21/24). In der Tela submucosa reagierte der Plexus submucosus nur in etwa der Hälfte der Fälle positiv (58,3%, 14/24). Die neuronalen Zellen zeigten ein feingranuliertes, zytoplasmatisches Reaktionsmuster, während sich die glialen Zellen nicht mit Sicherheit abgrenzen ließen. In 50% der Dickdarmlokalisationen (12/24) fanden sich nicht näher bestimmbare, zellassoziierte Einzelstrukturen im submukosalen Stroma. Die Bindegewebsfasern zeigten konstant keine Reaktion und die Lamina muscularis mucosae war in der Mehrzahl der Fälle negativ (79,2%, 19/24). Ergebnisse 93 In allen Dickdarmschnitten zeigte sich eine multipunktuelle, zytoplasmatische, teils zusätzlich kernmembranassoziierte Reaktion der Myozyten in der Tunica muscularis. In 40,9% (9/22) der beurteilten immunhistochemischen Präparate zeigten die an die Tela submucosa angrenzenden Myozyten der inneren, zirkulären Muskelschicht eine Verstärkung bzw. Intensivierung der Reaktion. Der Plexus myentericus wies in 58,3% (14/24) der Fälle eine zytoplasmatische, grob- bis feingranuläre Reaktion der Nervenzellkörper auf, wobei ausschließlich die Beaglegruppe eine negative Reaktion aufwies. Gliale Zellen waren teilweise punktuell kernmembranassoziiert positiv (37,5%, 9/24). In 79,2% der Fälle (19/24) zeigte sich eine positive, meist multifokale, feingranulierte, zytoplasmatische Reaktion der Serosa. Lymphatische Aggregate fanden sich in 13 der 24 untersuchten Lokalisationen und zeigten regelmäßig (84,6%; 11/13) punktuelle, zytoplasmatische Reaktionen der Lymphozyten. Die glatte Muskulatur der Gefäße zeigte in 70,1% (17/24) der Fälle eine zarte, zytoplasmatische, getüpfelte Reaktion in Mesenterium, Tunica muscularis und/oder Tela submucosa, während sich in der Tunica mucosa keine vaskuläre Reaktion feststellen ließ. Teilweise (37,5%; 9/24) fanden sich kräftig positive Einzelzellen in den Gefäßlumina. Ergebnisse Abb. 18: IHC zum Nachweis von H4R; oberflächliches Epithel und Lamina propria mucosae des Magens von Kontrollhund Nr. 24; deutliche Reaktion des Oberflächenepithels und der subepithelialen Lamina propria mucosae Abb. 19: IHC zum Nachweis von H4R; Tunica mucosa des Jejunums von Kontrollhund Nr. 17; deutliche Reaktion einzelner Epithelzellen im Kryptbereich (Pfeile) 94 Ergebnisse Abb. 20: IHC zum Nachweis von H4R; Tunica muscularis des Jejunums von Kontrollhund Nr. 21; Reaktion des Plexus myentericus Abb. 21: IHC zum Nachweis von H4R; Tunica mucosa des Kolons von Kontrollhund Nr. 15; starke Reaktion einzelner Kryptepithelzellen (Pfeile) 95 96 Ergebnisse 4.2.2.4 Zusammenfassung der immunhistochemischen Expressionsmuster von H1R, H2R und H4R bei den Kontrollhunden Zusammenfassend kann eine ubiquitäre Expression von H1R und H2R im kaninen Magendarmtrakt festgestellt werden. H4R wird von vielen Zellen exprimiert, in quantitativer Hinsicht im Vergleich zur H1R- und H2R-Expression jedoch in geringerem Ausmaße. Einen Überblick über die Expressionsmuster der einzelnen Histaminrezeptoren gibt Tabelle 10. Tabelle 10: Expressionsmuster von H1R, H2R und H4R im kaninen Gastrointestinaltrakt Tunica mucosa Epithelium mucosae Enterozyten Hauptzellen Oberflächenepithel des Magens Lamina propria Immunzellen Fibrozyten Myozyten Lamina muscularis mucosae Myozyten Tunica submucosa Bindegewebsfasern Neuronen des Plexus submucosus Lymphozyten der Peyer-Platten Tunica muscularis Myozyten Neuronen des Plexus myentericus Tunica serosa Mesothelzellen H1R H2R H4R + + + + + + + + + + +/+/- + +/+/- +/- +/- +/- +/- + + ? + + + + + + ? + + + + + Legende: + = positive Reaktion; - = keine Reaktion; +/- = teilweise positive Reaktion; ? = fraglich positive Reaktion; 97 Ergebnisse 4.2.2.5 Vergleich der immunhistochemischen Histaminrezeptorexpression bei gesunden Kontrolltieren verschiedener Altersstufen Wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben, wurde die Intensität der immunhistochemischen Reaktion mit Hilfe eines semiquantitativ erhobenen, numerischen Scores erfasst. Dies ermöglicht einen Vergleich der Histaminrezeptorexpression zwischen verschiedenen Altersgruppen der Kontrolltiere sowie zwischen Kontrollgruppen und Tieren mit IBD. Zusätzlich wurden dabei jeweils zwei Lokalisationen in der Tunica mucosa, apikal im Bereich der Zotten bzw. des Oberflächenepithels sowie basal im Kryptbereich, beurteilt, um eventuelle Unterschiede der Expression erfassen zu können. Ein Vergleich zwischen der Expressionsintensität der jeweiligen Histaminrezeptortypen war bedingt durch die Verwendung verschiedener Antikörper nicht möglich. Die zur Auswertung verwendeten Werte des semiquantitativen Scorings sowie die pWerte der statistischen Untersuchung finden sich im Anhang (Tabellen 15 bis 17 bzw. 18 bis 20). 4.2.2.5.1 Histaminrezeptor 1 bei den gesunden Kontrolltieren Der Vergleich der apikalen H1R-Expression zeigte kaum signifikante Unterschiede. Lediglich im Kolon ließ sich ein signifikanter Unterschied zwischen einer niedrigen H1R-Expression bei der Beaglegruppe und einer vergleichsweise hohen H1RExpression bei den alten Tieren feststellen. Bezüglich der basalen Expression von H1R ließen sich deutliche Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen. So zeigte sich insgesamt eine signifikant niedrigere H1R-Expression bei den jungen Tieren und der Beaglegruppe gegenüber den mittelalten und alten Tieren (siehe Abb. 22). Ergebnisse 98 Abb. 22: Basale H1R-Expression bei den Kontrollhunden im gesamten Gastrointestinaltrakt Ergebnisse 99 Im Magen zeigten sich diese Unterschiede zwischen den jungen und den alten Tieren als statistische Tendenz. Im Kolon war die basale H1R-Expression bei der Beaglegruppe signifikant niedriger als bei den anderen Gruppen (siehe Abb. 23). Abb. 23: Basale H1R-Expression bei den Kontrollhunden im Kolon Ergebnisse 100 4.2.2.5.2 Histaminrezeptor 2 bei den gesunden Kontrolltieren Die apikale und basale H2R-Expression der Kontrollgruppen zeigte insgesamt eine signifikant höhere Expression bei den alten Tieren gegenüber allen anderen untersuchten Gruppen (siehe Abb. 24). Abb. 24: Vergleich der apikalen und basalen H2R-Expression bei den Kontrollhunden im gesamten Gastrointestinaltrakt Diese Expressionsunterschiede spiegelten sich auch bei der Untersuchung der einzelnen anatomischen Lokalisationen in signifikanten und statistisch auffälligen Werten bzw. Tendenzen wider. So fanden sich eine signifikant höhere apikale und basale H2R-Expressionen bei den alten Hunden im Vergleich zur Beaglegruppe in Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon. Signifikante Expressionsunterschiede Ergebnisse 101 zwischen mittelalter und alter Kontrollgruppe zeigten sich für die apikale H2RExpression im Magen sowie als statistische Tendenzen im Duodenum und Kolon. Für die basale H2R-Expression fand sich ein derartiger Unterschied nur im Duodenum. Weiterhin zeigte sich eine signifikant höhere basale H2R-Expression bei der mittelalten Tiergruppe gegenüber der Beaglegruppe im Kolon. Eine höhere H2RExpression bei den alten Tieren im Vergleich zur Gruppe der jungen Hunde zeigte sich nur als statistische Tendenz für die apikale Expression in Magen und Duodenum sowie für die basale Expression im Magen. 4.2.2.5.3 Histaminrezeptor 4 bei den gesunden Kontrolltieren Die Auswertung der apikalen H4R-Expression zeigte insgesamt signifikant niedrigere Werte bei den Beaglen gegenüber den anderen Kontrollgruppen, gleichzeitig war die H4R-Expression bei den jungen Tieren signifikant höher als bei allen anderen Vergleichsgruppen (siehe Abb. 25). Signifikante Unterschiede zwischen der Beaglegruppe mit niedrigen Werten für die apikale H4R-Expression und der Gruppe der jungen Tiere mit höherer Expression fanden sich in Duodenum, Jejunum und Kolon. Auch waren im Duodenum bzw. Kolon signifikant niedrigere H4RExpressionen bei den Beaglen gegenüber den Gruppen der mittelalten bzw. alten Tiere festzustellen. Bezüglich der basalen H4R-Expression zeigte sich ein ähnliches Muster. Die Beaglegruppe zeigte insgesamt sowie in Magen, Duodenum, Ileum und Kolon eine signifikant geringere basale H4R-Expression im Vergleich zu den mittelalten und alten Tieren. Ein signifikanter Unterschied der basalen H4R-Expression zwischen der Beaglegruppe und den jungen Hunden fand sich darüber hinaus auch für alle Lokalisationen gemeinsam sowie in Ileum und Kolon (siehe Abb. 25). Im Magen war die basale H4R-Expression bei den jungen Hunden signifikant geringer als bei den alten Tieren. 102 Ergebnisse Abb. 25: Vergleich der apikalen und basalen H4R-Expression bei den Kontrollhunden im gesamten Gastrointestinaltrakt 4.2.2.5.4 Zusammenfassung Die Ergebnisse der Untersuchungen an den Kontrollhunden deuten auf das Vorliegen altersabhängiger Expressionsunterschiede für alle untersuchten Histaminrezeptoren hin. Dabei wiesen vor allem die jungen Hunde unter einem Jahr teilweise eine geringere oder auch wie im Falle des H4R eine erhöhte Rezeptorexpression auf. Die Expression des H2R war bei den alten Tieren am höchsten und nahm anscheinend mit steigendem Alter zu. 103 Ergebnisse Auffällig war die durchgängig niedrige Histaminrezeptorexpression bei der Beaglegruppe im Vergleich zu den anderen Kontrollgruppen, die sich aus Tieren unterschiedlichster Rassen und entsprechend verschiedenen Altersgruppen zusammensetzen. 4.2.3 Expression von Histaminrezeptor 1, 2 und 4 bei Hunden mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes Das Expressionsmuster der jeweiligen Histaminrezeptoren wie für die Kontrolltiere beschrieben, fand sich in den Bioptaten der IBD-Tiere wieder. Die Ergebnisse des semiquantitativen Scorings aller untersuchten Proben wurden verwendet, um die Expression der verschiedenen Histaminrezeptoren zwischen Darm-gesunden Kontrolltieren und Tieren mit IBD zu vergleichen. Dabei standen die anatomischen Lokalisationen Magen, Duodenum und Kolon im Fokus der Untersuchungen, da im Rahmen der IBD-Diagnostik regelmäßig aus diesen Lokalisationen endoskopische Biopsien entnommen werden. Es ist anzumerken, dass nur in einem Teil der hier untersuchten Fälle Bioptate aus dem Kolon vorlagen. Aus diesem Grund konnten für einige Fragestellungen, wie zum Beispiel bezüglich den eosinophilen Entzündungen im Kolon, aufgrund der zu geringen Anzahl der erhobenen Werte keine statistischen Aussagen getroffen werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen an den Kontrolltieren zeigten Expressionsunterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (s.o.), die im Folgenden durch gezielte Auswahl der Vergleichsgruppen berücksichtigt wurden. Eine Auflistung der p-Werte zu den durchgeführten statistischen Untersuchungen findet sich im Anhang (Tabellen 22 bis 24). 104 Ergebnisse 4.2.3.1 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 1 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD Aufgrund der Beobachtungen bei der Untersuchung der Kontrollgruppen erfolgte die statistische Auswertung der H1R-Expression ohne Einbeziehung der Beaglegruppe und der Gruppe der jungen Tiere. Die apikale H1R-Expression der erkrankten Tiere war insgesamt signifikant, teils sogar hochsignifikant höher als die der Vergleichsgruppen. Dies zeigte sich auch in den einzelnen anatomischen Lokalisationen (Magen, Duodenum, Kolon). Betrachtet man die lymphoplasmazelluläre und die eosinophile Form der IBD einzeln im Vergleich zu den Kontrolltieren, so zeigte sich in Magen, Duodenum und Kolon jeweils eine signifikant höhere apikale H1R-Expression bei den Hunden mit LPE, während die apikale H1R-Expression bei den Tieren mit EGE nur im Duodenum signifikant höher war (siehe Abb. 26). Ein Unterschied zwischen Tieren mit LPE und EGE konnte statistisch nicht nachgewiesen werden, lediglich bei der gemeinsamen Betrachtung der apikalen H1R-Expression im Duodenum der mittelalten und alten Kontrolltiere gegenüber der Expression der IBD Tiere gleichen Alters fand sich eine statistisch auffällig erhöhte H1R-Expression bei LPE-Tieren (p = 0,0512). Ergebnisse 105 Abb.26: Vergleich der apikalen H1R-Expression bei den Kontrollhunden und bei an LPE- und EGE-erkrankten Hunden im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: EGE = eosinophile Gastroenteritis, LPE = lymphoplasmazelluläre Enteritis Die basale H1R-Expression aller Lokalisationen gemeinsam sowie in Magen und Kolon zeigte ebenfalls signifikante, teils hochsignifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den IBD-Tieren. Im Duodenum war lediglich eine statistische Tendenz zu einer höheren basalen H1R-Expression festzustellen. Bei der Betrachtung der einzelnen Erkrankungsgruppen im Vergleich zu den Kontrolltieren zeigte sich eine signifikant höhere basale H1R-Expression bei der LPE-Gruppe für alle Lokalisationen gemeinsam sowie in Magen und Kolon (siehe Abb. 27). Im Duodenum fand sich dahingehend nur eine statistische Tendenz. Eine statistisch 106 Ergebnisse höhere basale H1R-Expression bei der EGE-Gruppe wurde nur im Magen und für alle Lokalisationen gemeinsam festgestellt (siehe Abb. 27). Ein signifikanter Unterschied der basalen H1R-Expression zwischen Hunden mit LPE und EGE fand sich nicht. Abb. 27: Vergleich der basalen H1R-Expression bei den Kontrollhunden und bei an LPE- und EGE-erkrankten Hunden im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: EGE = eosinophile Gastroenteritis, LPE = lymphoplasmazelluläre Enteritis 4.2.3.2 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 2 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD Die Untersuchung der H2R-Expression ergab eine höhere Expression in der Gruppe der alten Tiere, sodass diese Altersgruppe bei der statistischen Auswertung zusätzlich auch separat betrachtet wurde. 107 Ergebnisse Die apikale H2R-Expression aller erkrankten Tiere war insgesamt und in allen untersuchten anatomischen Lokalisationen (Magen, Duodenum und Kolon) hochsignifikant höher als bei den Kontrolltieren. Betrachtete man nur die Tiere über 8 Jahren, fanden sich diese signifikanten Unterschiede ebenfalls für alle Lokalisationen gemeinsam sowie in Magen und Duodenum (Abb. 28). Die beiden Erkrankungsgruppen (LPE und EGE) zeigten ebenfalls signifikant höhere apikale H2R-Expressionen als die Kontrolltiere. Dies fand sich auch in Magen und Duodenum wieder, im Kolon zeigte sich dieser Unterschied lediglich für die LPETiere. Besonders deutlich zeigten sich die Unterschiede der apikalen H2R-Expression beim Vergleich der jungen und mittelalten Kontrolltiere mit den gleichaltrigen IBDTieren (Abb. 29). Im Duodenum zeigten auch die an LPE erkrankten Hunde im Alter von über 8 Jahren eine höhere apikale H2R-Expression als die alten Kontrolltiere. Unterschiede zwischen LPE- und EGE-Tieren waren weitestgehend nicht vorhanden. Beim Vergleich der apikalen H2R-Expression der jungen und mittelalten Tieren für alle anatomischen Lokalisationen gemeinsam zeigten sich jedoch signifikant höhere Werte bei den EGE-Tieren im Vergleich zu an LPE erkrankten Hunden. Ergebnisse 108 Abb. 28: Vergleich der apikalen H2R-Expression bei den Kontrollhunden und den IBD-Tieren im Alter über 8 Jahren im Magen und Duodenum Abkürzungen: IBD = inflammatory bowel disease Ergebnisse 109 Abb. 29: Vergleich der apikalen H2R-Expression bei den Kontrollhunden und bei an LPEund EGE-erkrankten Hunden der jungen und mittelalten Altersgruppen im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: EGE = eosinophile Gastroenteritis, LPE = lymphoplasmazelluläre Enteritis, Die Untersuchung der basalen H2R-Expression erbrachte ähnliche Ergebnisse. Auch hier zeigten die erkrankten Tiere insgesamt sowie in Magen, Duodenum und Kolon eine signifikante, teils hochsignifikant höhere basale H2R-Expression. Bei den alten Tieren zeigte sich dieser Unterschied nur für alle anatomischen Lokalisationen gemeinsam. Auch die einzelnen IBD-Formen (LPE und EGE) zeigten eine signifikant höhere basale H2R-Expression als die Kontrollgruppen. Dies zeigte sich in Magen und Ergebnisse 110 Duodenum sowie für LPE auch im Kolon (siehe Abb. 30). Dies fand sich ebenfalls für die Tiere im Alter unter 8 Jahren (junge und mittelalte Kontroll- und IBD-Tiere gemeinsam). Bei den alten Tieren hingegen fand sich eine signifikant höhere H2RExpression bei der LPE-Gruppe nur im Duodenum. Beim Vergleich zwischen LPE und EGE zeigte sich bei der Betrachtung aller anatomischen Lokalisationen gemeinsam eine signifikant höhere basale H2RExpression bei den EGE-Tieren. Bei der Untersuchung der IBD-Tiere im Alter unter 8 Jahren (junge und mittelalte Gruppe gemeinsam) fand sich im Magen eine signifikant höhere basale H2R-Expression bei der EGE-Gruppe im Vergleich zur LPE-Gruppe. Abb. 30: Vergleich der basalen H2R-Expression bei den Kontrollhunden und bei an LPE- und EGE-erkrankten Hunden im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: EGE = eosinophile Gastroenteritis, LPE = lymphoplasmazelluläre Enteritis 111 Ergebnisse 4.2.3.3 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 4 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD Aufgrund der Ergebnisse aus der Untersuchung der Kontrollgruppen wurden bei der statistischen Auswertung der H4R-Expression die Beaglegruppe und die Gruppe der jungen Tiere nicht in die Kontrollgruppe einbezogen. Zusätzlich wurden ebenfalls die Tiere älter als 4 Jahre (d. h. Tiere der mittelalten und alten Kontroll- und IBDGruppen gemeinsam) separat betrachtet. Die apikale H4R-Expression bei den erkrankten Tieren war in allen untersuchten Lokalisationen signifikant, teils hochsignifikant höher als die der Kontrolltiere (Abb. 31). Dies zeigte sich auch für Tiere älter als 4 Jahre. Die Tiere mit LPE zeigten insgesamt sowie in Magen und Duodenum eine signifikant höhere apikale H4R-Expression. Die apikale H4R-Expression der Hunde mit EGE war insgesamt sowie im Duodenum erhöht, im Magen zeigte sich nur eine statistische Tendenz. So verhielt es sich auch für die Tiere älter als 4 Jahre. Signifikante Unterschiede der apikalen H4R-Expression zwischen LPE und EGE fanden sich nicht. Im Magen zeigte sich jedoch eine statistisch auffällig höhere apikale H4R-Expression bei Tieren mit LPE gegenüber Hunden mit EGE. Ergebnisse 112 Abb. 31: Vergleich der apikalen H4R-Expression bei den Kontrolltieren und bei den IBDTieren im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: IBD = inflammatory bowel disease Die basale H4R-Expression hingegen zeigte im Duodenum eine signifikant geringere Expression bei den erkrankten Tieren gegenüber den Kontrolltieren (siehe Abb. 32). Beim Vergleich der basalen H4R-Expression der Kontrolltiere mit LPE- und EGETieren fand sich nur im Duodenum ein signifikanter Unterschied. Hier war die basale H4R-Expression der LPE-Hunde signifikant geringer als die der Kontrolltiere. 113 Ergebnisse Abb. 32: Vergleich der basalen H4R-Expression bei den Kontrolltieren und bei den IBDTieren im Magen, Duodenum und Kolon Abkürzungen: IBD = inflammatory bowel disease 4.2.3.4 Korrelation Zur Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen dem Grad der histopathologischen Veränderungen, repräsentiert durch den WSAVA-Score, und der Expression der jeweiligen Histaminrezeptoren wurde eine statistische Korrelationsanalyse durchgeführt. Dabei wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman berechnet, der als nichtparametrisches Test-Pendant zum Pearson´schen Korrelationskoeffizienten als Maß der Stärke einer monotonen Beziehung zweier Variablen fungiert und zwischen -1 (perfekte bzw. vollständige negative Korrelation) und 1 (perfekte bzw. vollständige positive Korrelation) liegt (BÄRLOCHER 1999; 114 Ergebnisse SCOTT et al. 2013). Besteht keinerlei lineare Interdependenz zwischen zwei Variablen liegt der Korrelationskoeffizient bei 0 (KAPS und LAMBERSON 2009). Da in der Literatur keine allgemein gültigen Richtlinien zur Beurteilung der Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman existieren, wurden Werte zwischen 0 und 0,2 als nicht zusammenhängend, Werte zwischen 0,2 und 0,5 als schwach bis mäßig zusammenhängend, Werte zwischen 0,5 und 0,8 als deutlich zusammenhängend und Werte von 0,8 bis 1 als hohe bis perfekte Korrelation bewertet (Quelle: www.medi-stat.de, Stand Juni 2013). Im Allgemeinen werden Korrelationskoeffizienten höher als 0,7 bzw. geringer als -0,7 als hochsignifikant und praktisch bzw. klinisch relevant angesehen (SCOTT et al. 2013). Die jeweiligen Rangkorrelationskoeffizienten und die dazugehörigen p-Werte finden sich in Tabelle 25 im Anhang. Es zeigten sich bei signifikanten p-Werten in Magen und Duodenum schwache bis mäßige, im Kolon auch deutliche Zusammenhänge der apikalen und basalen H1RExpression mit dem WSAVA-Score. Ähnlich verhielt es sich für die apikale und basale H2R-Expression, die mäßige bis deutliche Zusammenhänge mit den histologischen Läsionen in Magen, Duodenum und Kolon aufwiesen. Für den H4R wurden nur schwache lineare Zusammenhänge zwischen apikaler Expression und WSAVA-Score in diesen anatomischen Lokalisationen festgestellt. Die basale H4RExpression zeigte lediglich im Kolon schwache statistische Zusammenhänge mit einem signifikanten p-Wert. 4.2.3.5 Zusammenfassung Die statistische Untersuchung der Expression von H1R, H2R und H4R bei Hunden mit IBD im Vergleich zu einer Gruppe von Darm-gesunden Kontrollhunden zeigte deutliche Expressionsunterschiede. So waren die apikale und basale Expression von H1R und H2R bei den erkrankten Tieren signifikant höher als bei den Vergleichsgruppen. Dies zeigte sich auch für die lymphoplasmazelluläre und die eosinophile Form der IBD. Unterschiede zwischen den beiden IBD-Formen waren jedoch weitestgehend nicht feststellbar. 115 Ergebnisse Die apikale und basale Expression des H4R verhielt sich hingegen teilweise gegensätzlich. Während die apikale H4R-Expression bei den Hunden mit IBD signifikant höher war als bei der Kontrollgruppe, zeigten sich für die basale H4RExpression kaum signifikante Unterschiede. Im Duodenum war die basale H4RExpression der IBD-Tiere sogar niedriger als in der Kontrollgruppe. Die festgestellten Expressionsunterschiede fanden sich meist in allen untersuchten anatomischen Lokalisationen als signifikante Unterschiede, teilweise auch als statistische Auffälligkeiten. Aufgrund der Ergebnisse der Rangkorrelationsanalyse nach Spearman können schwache bis mäßige, teils auch deutlich positive, lineare Zusammenhänge zwischen Histaminrezeptorexpression Veränderung angenommen werden. und Grad der histopathologischen 116 Ergebnisse 4.4 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung Bei der in situ-Hybridisierung handelt es sich um eine komplexe und recht störanfällige Methode (HEMEDAH et al. 2000; SRINIVASAN et al. 2002). Durch eine fehlerhafte Charge des Anti-DIG-Antikörpers (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim) traten in der Etablierungsphase der hier verwendeten Sonden verschiedene technische Schwierigkeiten auf. Nach Beseitigung dieser Probleme wurde neben der Mitführung einer Reaktionskontrolle außerdem zur Sicherung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse die in situ-Hybridisierung an den Proben der Kontrolltiere zweimalig bzw. an den Bioptaten der IBD-Gruppe dreimalig durchgeführt. Die detaillierten Ergebnisse der qualitativen Auswertung der in situ-Hybridisierung finden sich in Tabelle 27 im Anhang. Als positives Signal wurden zellassoziierte, perinukleäre, violette Farbpräzipitate gewertet, wenn gleichzeitig ein deutlicher Unterschied der Signale zwischen der T3und der T7-Sonde bestand. Da es sich bei der T7-Sonde gegen den kaninen H4R um die antisense-Sonde handelt, die mRNA detektiert, wurde nur ein deutlich stärkeres Signal der T7-Sonde im Vergleich zur T3-Sonde als sicher positiv angesehen (siehe Abb. 38). Die T3-Sonde ist in der Lage an genomische DNA zu binden und kann ein schwaches Signal hervorrufen (GRÖTERS 2004). Die Kontrolle unter Verwendung von Hybridisierungspuffer ohne Sondenzusatz war in jedem Fall negativ. Die Hintergrundfärbung in den untersuchten Schnitten war größtenteils geringgradig und von spezifischen Signalen gut zu unterscheiden. Die Tunica muscularis zeigte artifizielle, multifokale, großflächige Farbstoffablagerungen, die möglicherweise durch Unebenheiten der Paraffinschnitte zustande kamen. Da sich diese Artefakte in allen Schnitten, auch in den Negativkontrollen, in unterschiedlicher Ausprägung fanden, konnten die Tunica muscularis sowie der Plexus myentericus nicht beurteilt werden. 117 Ergebnisse 4.4.1 Expression von H4R-mRNA im Dünn- und Dickdarm von Kontrollhunden und in Bioptaten von Hunden mit IBD Von den 9 untersuchten Kontrollhunden ließ sich mittels in situ-Hybridisierung mit der T7-Sonde gegen den kaninen H4R bei 8 Tieren ein deutlich positives Signal in mindestens einer Darmlokalisation darstellen. Lediglich bei dem Tier mit der laufenden Nummer 19 konnte weder im Duodenum noch im Kolon H4R-mRNA nachgewiesen werden. Ein spezifisches Expressionsmuster von H4R-mRNA im Duodenum konnte bei 8 Tieren festgestellt werden. Bei diesen zeigten die Enterozyten ein dezentes bis kräftiges, perinukleäres, im basalen Zellbereich akzentuiertes Signal (siehe Abb. 33 und 34). Dieses Signal war regelmäßig (77,8%; 7/9) im basalen Kryptbereich deutlicher ausgeprägt und verlor in Richtung Duodenalzotten an Intensität (siehe Abb. 35). Die Immunzellen der Lamina propria mucosae zeigten in 8 von 9 Fällen (88,9%) ein positives Signal (siehe Abb. 33), welches jedoch bezüglich der Intensität des Signals stark variierte. So fand sich bei 4 Tieren (44,4%) ein eher schwaches perinukleäres Signal, während bei 4 anderen Tieren (44,4%) ein ausgeprägtes, deutliches Signal von Lamina propria-Zellen feststellbar war. Es fanden sich jedoch in allen Fällen auch Immunzellen in der Lamina propria mucosae, die kein positives Signal zeigten. Ein wiederkehrendes Expressionsmuster von H4R-mRNA im Kolon konnte bei 8 Tieren (88,9%) festgestellt werden. Die Enterozyten zeigten bei 5 Tieren (55,6%) ein perinukleäres, teils basal akzentuiertes, positives Signal (siehe Abb. 37), während bei 3 Tieren (33,3%) das positive Signal sich diffus-zytoplasmatisch darstellte (siehe Abb. 36). Die Immunzellen der Lamina propria mucosa zeigten bei 8 Tieren (88,9%) ein positives Signal (siehe Abb. 36). Der Plexus submucosus im Duodenum wies bei 6 Tieren (66,7%) ein positives Signal auf, während im Kolon nur bei 4 Tieren (33,3%) ein deutliches, positives Signal nachgewiesen werden konnte. Im Duodenum eines Tieres und im Kolon von drei Tieren war das Signal am Plexus submucosus fraglich. Ergebnisse 118 Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA an ausgewählten Bioptaten der IBD-Hunde waren vergleichsweise heterogen und ließen sich nicht zuverlässig reproduzieren. Nach dreimaliger Durchführung des Protokolls konnte in zwei von 6 Lokalisationen aus dem Duodenum und in einer Probe aus dem Kolon ein deutliches, positives Signal von monozytären Zellen in der Lamina propria mucosae festgestellt werden (siehe Abb. 38 und Abb. 39). Ein schwach positives Signal der Immunzellen fand sich im Duodenum von zwei Tieren und in zwei Kolonlokalisationen. Die Enterozyten waren größtenteils negativ, zeigten jedoch in wenigen Fällen (2 Lokalisationen aus dem Duodenum) eine multifokale, dezente, am basalen Zellpol lokalisierte, schwache Anfärbung. Insgesamt 2 Duodenumlokalisationen und 3 der untersuchten Proben aus dem Kolon zeigten kein überzeugendes, positives Signal und wurden als fraglich oder negativ bezüglich der Expression von H4R-mRNA eingestuft. Ergebnisse Abb. 33: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Tunica mucosa des Duodenums von Kontrollhund Nr. 7 mit deutlichem, basal akzentuierten Signal der Enterozyten (Pfeile) und positiven Immunzellen (Pfeilspitzen) Abb. 34: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Kryptepithel der Tunica mucosa des Duodenums von Kontrolltier Nr. 13 mit deutlichem, basal akzentuierten Signal der Enterozyten (Pfeile) 119 Ergebnisse Abb. 35: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Tunica mucosa des Duodenums von Kontrollhund Nr. 7 mit deutlichem Signal der Kryptepithelzellen (schmale Pfeile) und dezentem Signal der Enterozyten im Zottenbereich (breite Pfeile) Abb. 36: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Tunica mucosa des Kolons von Kontrollhund Nr. 7 mit positiven Signal von Enterozyten (Pfeile) und Lamina propria Immunzellen (Pfeilspitzen) 120 Ergebnisse Abb. 37: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Kryptepithel des Kolons von Kontrollhund Nr.: 10 mit perinukleärem, basal akzentuiertem, positivem Signal der Enterozyten Abb. 38: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA, T3 (links) und T7 (rechts; jeweils 1500ng/100µl HB-Mix) im Vergleich; Duodenalzotte eines Bioptates von einem Hund mit IBD (lfd. Nr.: 30); deutliches Signal von Immunzellen der Lamina propria mucosae 121 Ergebnisse Abb. 39: in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA (T7 1500ng/100µl HB-Mix); Tunica mucosa eines Bioptates aus dem Kolon von einem Hund mit IBD (lfd. Nr.: 27) mit deutlich positivem Signal von Immunzellen in der Lamina propria mucosae (Pfeilspitzen) 122 123 Ergebnisse 4.4.2 Kontrollen bei der in situ-Hybridisierung Als Reaktionskontrolle wurde bei jeder Durchführung des Protokolls jeweils eine Reaktion mit einer Sonde gegen das kanine Staupevirus mitgeführt, die an einer persistent infizierte Zelllinie angewendet wurde (GRÖTERS et al. 2005). Diese Reaktionskontrolle reagierte zuverlässig und zeigte ein kräftig positives, feingranuläres, perinukleäres Signal bei etwa 25 bis 35% der Zellen im Pellet. Als Negativkontrolle dienten Schnitte, die lediglich mit Hybridisierungsmix ohne Sondenzusatz behandelt wurden. Diese wiesen durchgehend kein spezifisches Signal auf, zeigten allerdings einen variierenden, meist jedoch geringgradig ausgeprägten Hintergrund auf. Ergebnisse 124 Diskussion 125 5 Diskussion Zahlreiche Untersuchungen zur kaninen und humanen inflammatory bowel disease haben gezeigt, dass intestinalen Mastzellen und deren Mediator Histamin eine große Bedeutung bei der Entstehung der entzündlichen Läsionen im Gastrointestinaltrakt zukommt (KNUTSON et al. 1990; NOLTE et al. 1990; FOX et al. 1993; RAITHEL et al. 1995; GERMAN et al. 2001; LOCHER et al. 2001; HE 2004; XIE und HE 2004; FOGEL et al. 2005a und 2005b; WOOD 2006; KLEINSCHMIDT et al. 2006). Nur wenige Autoren berichten jedoch über die Rolle von Histaminrezeptoren bei der Pathogenese chronischer, entzündlicher Enteropathien und anderer, entzündlicher Prozesse im Gastrointestinaltrakt (SANDER et al. 2006; SUTTON et al. 2008; VON RAHDEN et al. 2012; CORUZZI et al. 2012). Das Ziel dieser Arbeit war die immunhistochemische Charakterisierung der Histaminrezeptorexpression im Magendarmtrakt von Hunden. Diese wurde bei Darmgesunden Kontrolltieren untersucht und detailliert deskriptiv ausgewertet. Weiterhin wurde die Histaminrezeptorexpression von Kontrolltieren und Hunden mit der klinischen Diagnose IBD anhand einer semiquantitativen Auswertung verglichen. Im Laufe der Arbeiten zu dieser Dissertation wurde die Spezifität mehrerer kommerziell erhältlicher Antikörper gegen H4R angezweifelt (BEERMAN et al. 2012), sodass ergänzend zu den immunhistochemischen Untersuchungen zusätzlich eine in situ-Hybridisierung gegen H4R mRNA etabliert und durchgeführt wurde. 5.1 Expression von H1R, H2R und H4R im Gastrointestinaltrakt Die Untersuchung der Histaminrezeptorexpression mittels Immunhistochemie und deren detaillierte Auswertung erfolgten an einer Gruppe von Kontrolltieren, die einen zufälligen Ausschnitt einer normalen Hundepopulation repräsentiert und ein weites Alters- und Rassespektrum umfasst. Die untersuchten Tiere zeigten vorberichtlich keine gastrointestinalen Symptome, dennoch fanden sich histologisch bei einem Teil der Hunde in einzelnen Lokalisationen dezente bis geringgradige Veränderungen, sodass der erhobene WSAVA-Score in diesen Fällen von 0 abweicht. Ähnliche Diskussion 126 Beobachtungen bei klinisch gesunden Hunden bzw. Kontrolltieren machten auch andere Autoren in ihren Untersuchungen am kaninen Magendarmtrakt (GERMAN et al. 2001; KLEINSCHMIDT et al. 2008; WOOTEN et al. 2010; JUNGINGER et al. 2012). Hierbei handelt es sich möglicherweise um Veränderungen, die als physiologischer Hintergrund angenommen werden können und deren genaue Ursachen unklar bleiben. Die immunhistochemischen Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit zeigten eine weitreichende Expression von H1R im Magen und in der Darmwand. Es fanden sich positive Reaktionen der Enterozyten, der Immunzellen der Lamina propria mucosae sowie der Lymphozyten in Peyer-Platten und lymphoiden Aggregaten, der glatten Muskulatur der Tunica muscularis und der Gefäßwände, der neuronalen Plexus (Plexus submucosus und Plexus myentericus) sowie des Endothels. Diese Ergebnisse stimmen weitestgehend mit den Beschreibungen von SANDER et al. (2006) überein, die in ihren Untersuchungen am humanen Gastrointestinaltrakt die H1R-Expression als ubiquitär über die gesamte Darmwand beschrieben. Dabei berichteten SANDER et al. (2006) von einer H1R-Expression der Enterozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Gefäße, Myozyten und enterischen Nerven in Dünn- und Dickdarm. Auch VON RAHDEN et al. (2012) beschrieben eine immunhistochemische H1R-Expression der Kolonepithelzellen im humanen Colon sigmoideum. In einer Untersuchung von BOER et al. (2008) an humanem Kolongewebe wurde ebenfalls ein kräftiges immunhistochemisches Signal für H1R an Enterozyten und nicht näher spezifizierten, nicht-epithelialen, mukosalen Zellen beschrieben. Funktionelle Untersuchungen an humanem Gewebe und Tiermodellen belegten schon früher die Existenz von H1R im Gastrointestinaltrakt und dessen Bedeutung für die intestinale Motilität (HILL et al. 1977; KONTUREK und SIEBERS 1980; YAMANAKA und KITAMURA 1987; MULLER et al. 1993; IZZO et al. 1998; BREUNIG et al. 2007). Die eigenen immunhistochemischen Untersuchungen zeigen eine H1R-Expression der Myozyten in der Tunica muscularis in nahezu allen untersuchten Proben aus Diskussion 127 Magen, Dünn- und Dickdarm der Kontrollhunde. Dies geht konform mit den Ergebnissen von KHAN et al. (1994), die H1R-mRNA in der Tunica muscularis von Hunden mittels RT-PCR nachwiesen. Weitere Autoren zeigten eine Expression von H1R auf den Myozyten der Lamina muscularis mucosae bei Hunden (MULLER et al. 1993) und der Tunica muscularis beim Meerschweinchen (HILL et al. 1977; YAMANAKA und KITAMURA 1987). Eine funktionelle Studie an der Lamina muscularis mucosae im Magen von Hunden zeigte eine via H1R vermittelte kontraktile Wirkung von Histamin und H1R-Agonisten. Diese kontraktile Wirkung wurde nicht über nervale Strukturen vermittelt, da eine Zugabe von Tetrodotoxin die Reaktionen nicht veränderte (MULLER et al. 1993). Eine ähnliche Untersuchung zeigte das Vorhandensein von H1R auch in einer Präparation der Lamina muscularis mucosae und des Plexus submucosus des kaninen Kolons (MULLER et al. 1990). Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen zeigten in fast allen untersuchten Schnittpräparaten des Magens und in der Hälfte der Proben des Kolons ein dezentes bis deutlich positives Signal der glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae, die ebenfalls für eine direkte Signalübertragung via H1R auf Myozyten spricht. Die in den vorliegenden Untersuchungen gezeigte immunhistochemische Expression von H1R durch Enterozyten im Dünn- und Dickdarm stimmt mit den Ergebnissen von KHAN et al. (1994) überein, die H1R-mRNA in isolierten, kaninen Kolonkrypten nachwiesen. Andere Untersuchungen zur gastrointestinalen Sekretion zeigten eine funktionelle Regulation via H1R auf den Enterozyten im Dickdarm bei Mensch und Meerschweinchen (WANG und COOKE 1990; KEELY et al. 1995). RANGACHARI und PRIOR (1994) zeigten in ihren Untersuchungen an Kolonschleimhaut die funktionelle Existenz von H1R beim Hund und vermuteten deren Lokalisation auf den Kolonepithelzellen. Bezüglich der Immunzellen zeigten die hier durchgeführten, immunhistochemischen Untersuchungen eine H1R-Expression von nicht-epithelialen Zellen der Lamina propria mucosae, die aufgrund ihrer Morphologie als Lymphozyten und Plasmazellen angesprochen wurden. Auch die Lymphozyten der Peyer-Platten im Dünndarm bzw. Diskussion 128 der lymphoiden Aggregate im Kolon wiesen, sofern im Anschnitt vorhanden, eine dezente bis deutliche, positive Reaktion auf. Verschiedene Untersuchungen zeigten eine H1R-Expression von B-Zellen, dendritischen Zellen und T-Helferzellen (JUTEL et al. 2001; AKDIS und SIMONS 2006; BÄUMER und ROßBACH 2010), die sowohl im Zentrum von Peyer-Platten (ALLENSPACH 2011; JUNGINGER et al. 2013) als auch in der Lamina propria mucosae anzutreffen sind (GERMAN et al. 2001; JUNGINGER et al. 2013). Auch bei eosinophilen Granulozyten, Makrophagen und verschiedenen T-Zellsubtypen (CD4+ und CD8+ T-Zellen), die ebenfalls in der Lamina propria mucosae vorkommen, wurde eine H1R-Expression in verschiedenen Untersuchungen beschrieben (HILL et al. 1997; GERMAN et al. 2001; JUTEL 2001; GANTNER et al. 2002; JUTEL et al. 2002; FOGEL et al. 2005a). Weiterhin zeigten die eigenen Untersuchungen in einem Teil der untersuchten Lokalisationen eine H1R-Expression von spindelförmigen oder langgestreckten Zellen in der Lamina propria mucosae, bei denen es sich sowohl um Fibrozyten bzw. Fibroblasten als auch um stromale Myozyten handeln kann. In der Literatur finden sich diesbezüglich unterschiedliche Ergebnisse. In der Studie von SANDER et al. (2006) zeigten Bindegewebszellen der Lamina propria mucosae ein positives immunhistochemisches Signal. Durch eine Untersuchung von aus intestinaler Mukosa isolierten Fibroblasten mittels PCR wurde die Expression auf mRNA Ebene bestätigt (SANDER et al. 2006). VON RAHDEN et al. (2012) hingegen berichten, dass im Dickdarm der Kontrollgruppe stromale Zellen immunhistochemisch keine Reaktion aufwiesen, während in Proben von Patienten mit Divertikulitis ein schwaches Signal auf eine H1R-Expression schließen lässt. Die Ganglien des enterischen Nervensystems zeigten mit Ausnahme des Plexus submucosus im Magen in fast allen Fällen eine deutliche H1R-Expression in der durchgeführten Immunhistochemie. Dies wurde bereits durch mehrere Autoren in funktionellen Studien an Dünn- und Dickdarm von Mensch, Meerschweinchen und Hund berichtet (RANGACHARI und PRIOR 1994; IZZO et al. 1998; BREUNIG et al. 2007). Inwieweit der Plexus submucosus im Magen tatsächlich kaum H1R exprimiert Diskussion 129 oder in den untersuchten Schnittpräparaten lediglich keine Ganglienstrukturen in der Tela submucosa angeschnitten waren, lässt sich nicht abschließend feststellen. Die Gefäße der Darmwand wiesen immunhistochemisch zum größten Teil sowohl eine H1R-Expression der glatten Gefäßwandmuskulatur, als auch der Endothelzellen auf. Hämodynamische, via H1R vermittelte, funktionelle Effekte an mesenterialen Gefäßen von Hunden wurden schon früh beschrieben (WALUS et al. 1981). Die Expression von H1R durch Endothelzellen ist ebenfalls in der einschlägigen Literatur belegt (GANTNER et al. 2002; JUTEL et al. 2009). Die immunhistochemische Untersuchung der Expression von H2R im kaninen Gastrointestinaltrakt zeigte positive Reaktionen von Enterozyten, Immunzellen der Lamina propria mucosae, Lymphozyten der Peyer-Platten, Myozyten der Tunica muscularis und teilweise auch der Lamina muscularis mucosae und der Gefäßwände sowie des Endothels. Ein ähnliches Verteilungsmuster beschreiben auch SANDER et al. (2006), die mittels Immunhistochemie eine H2R-Expression durch Enterozyten, Immunzellen und Lymphozyten der Peyer-Platten, glatte Muskulatur und den Plexus myentericus nachwiesen. Auch BOER et al. (2008) und VON RAHDEN et al. (2012) berichten in ihren immunhistochemischen Untersuchungen von einer H2R-Expression der Enterozyten im humanen Kolon. BOER et al. (2008) beschrieben darüber hinaus auch eine positive Reaktion von nicht näher spezifizierten, mukosalen, nichtepithelialen Zellen und eine schwache Reaktion von Bindegewebszellen in der Tela submucosa. Die hier dargelegten immunhistochemischen Ergebnisse stehen im Einklang mit Resultaten aus funktionellen Untersuchungen der H2R-Expression. So vermittelt Histamin direkt via H2R auf den glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae im Magen von Hunden eine Rexalation (MULLER et al. 1993). Die eigenen Untersuchungen zeigten in einem Großteil der untersuchten Proben ein positives immunhistochemisches Signal der Lamina muscularis mucosae des Magens. Dies zeigte sich auch in der Mehrzahl der untersuchten Proben aus dem Kolon. MULLER et al. (1990) konnten hingegen keinen funktionellen Effekt von H2R-Agonisten auf eine Präparation der Lamina muscularis mucosae aus dem kaninen Kolon zeigen. 130 Diskussion Da auch die Myozyten der Tunica muscularis der in dieser Arbeit untersuchten Proben größtenteils immunhistochemisch eine H2R-Expression zeigten, ist zu vermuten, dass Histamin auch hier einen direkten Effekt vermitteln kann, wie von YAMANAKA und KITAMURA (1987) am Ileum von Meerschweinchen gezeigt wurde. Auch der durch KHAN et al. (1994) erbrachte Nachweis von H2R-mRNA in der Lamina muscularis mucosae und Tunica muscularis des kaninen Kolons steht im Einklang mit den Ergebnissen der eigenen Untersuchungen. Besondere klinische und therapeutische Bedeutung kommt dem H2R im Zusammenhang mit der Magensäureproduktion zu. Diese wird über mehrere Mechanismen gesteuert, wobei die Aktivierung von Belegzellen durch Histamin aus enterochromaffin-ähnlichen Zellen via basolateral lokalisierten H2R als wichtigster direkter Regulationsweg gilt (WELSCH 2006a; KOPIC und GEIBEL 2010; NEIGER 2011). Eine Aussage über die H2R-Expression der Belegzellen im kaninen Magen kann im Rahmen dieser Untersuchung nicht getroffen werden, da eine Bewertung des immunhistochemischen Signals aufgrund nicht eliminierbarer Farbartefakte nicht möglich war. Die eigenen immunhistochemischen Untersuchungsergebnisse zeigten in fast allen untersuchten Lokalisationen eine Expression von H2R durch die Enterozyten in Dünn- und Dickdarm. Diese Lokalisation des H2R vermuteten schon RANGACHARI und PRIOR (1994), die in Untersuchungen von kaniner Kolonschleimhaut in UssingKammern Histaminrezeptoren funktionell typisierten. KHAN et al. (1994) wiesen mRNA von H2R mittels PCR in isolierten Kolonkryptepithel von Hunden nach. Darüber hinaus zeigten die eigenen Untersuchungen vor allem im Dünndarm, aber auch in Magen und Dickdarm einzelne intraepitheliale, langgestreckte Zellen mit einem starken positiven Signal, die sich in Dünn- und Dickdarm deutlich vermehrt im basalen Kryptbereich befanden. Möglicherweise handelt es sich bei diesen Zellen um enteroendokrine Zellen, deren Morphologie im Gastrointestinaltrakt variiert (STINSON und CALHOUN 1992; WELSCH 2006b). Einerseits treten sie als kleine, einzeln und basal im Epithel gelegene, pyramidenförmige Zellen auf (STINSON und CALHOUN 1992; BANKS 1993; WELSCH 2006b), andererseits erreichen sie mit 131 Diskussion einem mikrovillibesetzten Zellapex die luminale Oberfläche (STINSON und CALHOUN 1992; WELSCH 2006b). Neben diesen morphologischen Kriterien spricht vor allem das Verteilungsmuster dafür, dass es sich um enteroendokrine Zellen handeln könnte. Diese befinden sich im Dünndarm im Bereich der Krypten und an der Zottenbasis (WELSCH 2006a). In Untersuchungen zu endokrinen Zellen im Kolon und Rektum von Beaglen waren die endokrinen Zellen hauptsächlich in der unteren Hälfte der Mukosa lokalisiert und fanden sich verglichen mit dem Rektum und dem distalen Kolon in größerer Zahl im proximalen Kolonabschnitt (PERANZI und LEHY 1984). Zur genaueren Spezifizierung dieser Zellen müssten weiterführende Untersuchungen zum Beispiel in Form einer immunhistochemischen Doppelfärbung mit einem Marker für endokrine Zellen oder einer ultrastrukturellen Charakterisierung durchgeführt werden (PERANZI und LEHY 1984). Die Immunzellen der Lamina propria mucosae und die Peyer-Platten zeigten regelmäßig ein deutlich positives immunhistochemisches Signal. Ähnlich wie der H1R wird der H2R laut einschlägiger Literatur auf vielen Zelltypen, wie T- und B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen und eosinophilen Granulozyten exprimiert (GANTNER et al. 2002; JUTEL et al. 2009), die auch im kaninen Magendarmtrakt vorkommen (GERMAN et al. 2001; JUNGINGER et al. 2013). Lediglich in einem geringen Teil der untersuchten Lokalisationen von Magen, Dünnund Dickdarm zeigten spindelförmige oder langgestreckte Zellen in der Lamina propria mucosae ein minimales bis dezentes immunhistochemisch positives Signal. Bezüglich der H2R-Expression von mukosalen Bindegewebszellen finden sich in der Literatur unterschiedliche Angaben. SANDER et al. (2006) konnten weder immunhistochemisch eine H2R-Expression in humanem Dünn- und Dickdarm feststellen noch H2R-mRNA in isolierten, intestinalen Fibroblasten mittels RT-PCR nachweisen. VON RAHDEN et al. (2012) berichten von einem schwachen immunhistochemischen Signal der stromalen Zellen der Lamina propria mucosae bei Patienten mit Divertikulitis, während die Kontrollgruppe keine H2R-Expression dieser Zellen zeigte. 132 Diskussion Eine H2R-Expression von Ganglien des enteralen Nervensystems konnte im Rahmen der eigenen Untersuchungen nicht eindeutig nachgewiesen werden, da bei einer Kontrollreaktion nach Absorption des Primärantikörpers (siehe Kapitel 4.2.1) eine Anfärbung der Ganglien nicht eliminiert werden konnte. Deshalb muss von einer unspezifischen Reaktion möglicherweise durch Kreuzreaktionen des Primär- oder Sekundärantikörpers mit einem anderen, unbekannten Antigen ausgegangen werden. Hinweise auf eine H2R-Expression der neuronalen Plexus im Gastrointestinaltrakt gibt es jedoch in der einschlägigen Literatur (BARKER und EBERSOLE 1982; IZZO et al. 1998; SANDER et al. 2006). Die Gefäße in Magen, Dünn- und Dickdarm zeigten regelmäßig eine positive Reaktion von Myozyten der Tunica media in der immunhistochemischen Untersuchung zum Nachweis von H2R. Ergebnisse von WALUS et al. (1981) zeigten eine H2R-Expression an mesenterialen Gefäßen von Hunden in Form funktioneller, vasodilatativer Effekte. Auch eine H2R-Expression von Endothelzellen, wie durch JUTEL et al. (2009) beschrieben, wurde immunhistochemisch festgestellt. Einschränkend muss gesagt werden, dass eine starke, artifizielle, intraluminale Ablagerung von Farbstoff die Auswertung erschwerte. Darüber hinaus gibt es Untersuchungen (GANTNER et al. 2002), die an Lungengewebe gegensätzliche Ergebnisse erzielten und keine H2R-mRNA in humanen Endothelzellen von Mikrogefäßen nachweisen konnten. Zur abschließenden Klärung dieser Frage wären weitere Untersuchungen wie ein Nachweis von H2R-mRNA in isolierten Endothelzellen notwendig. Die Bedeutung und Expression von H3R im kaninen Gastrointestinaltrakt bleibt unklar. Verschiedene humanmedizinische Untersuchungen (LOVENBERG et al. 1999; HEMEDAH et al. 2000; SANDER et al. 2006; BOER et al. 2008) konnten eine H3R-Expression nicht oder nur in einem sehr geringen Bruchteil der untersuchten Proben mittels RT-PCR und Northern Blot nachweisen. Weiterhin zeigten RANGACHARI und PRIOR (1994) eine funktionelle Abwesenheit von H3R an der Kolonschleimhaut von Hunden. Basierend auf diesen Informationen wurde im Rahmen der eigenen Untersuchungen auf den Versuch einer immunhistochemischen 133 Diskussion Darstellung des H3R am Magendarmtrakt des Hundes verzichtet. Es gibt jedoch in der einschlägigen Literatur Hinweise auf speziesspezifische Unterschiede bezüglich der H3R-Expression. So lassen Untersuchungen am Ileum von Meerschweinchen (IZZO et al. 1998) und zur Magendarmpassage bei Mäusen (POLI et al. 2001) auf eine funktionelle Bedeutung des H3R bei diesen Tieren schließen. Außerdem gibt es Hinweise, dass der H3R bei der Regulation der Magensäureproduktion im kaninen Magen eine Rolle spielen könnte und möglicherweise auf parakrinen Zellen der Magenschleimhaut lokalisiert ist (SOLDANI et al. 1994). Zur Beantwortung der Fragen inwieweit und von welchen Zellen der H3R im Gastrointestinaltrakt von Hunden exprimiert wird, wären weiterführende Untersuchungen zum Beispiel mittels PT-PCR und in situ-Hybridisierung nötig. Die eigenen Untersuchungen der immunhistochemischen Expression von H4R zeigten eine zumeist dezente, punktuelle bis multifokale Expression der Enterozyten und Immunzellen der Lamina propria mucosae sowie ein positives immunhistochemisches Signal der glatten Muskulatur und größtenteils der Ganglien des enterischen Nervensystems. Aufgrund aktueller Ergebnisse von BEERMANN et al. (2012) müssen die Ergebnisse der eigenen Untersuchung sehr vorsichtig interpretiert werden (siehe Kapitel 5.3). Darüber hinaus finden sich in der einschlägigen Literatur widersprüchliche Ergebnisse zur immunhistochemischen Darstellung des H4R im Magendarmtrakt (SANDER et al. 2006; BOER et al. 2008). Das in dieser Arbeit gezeigte Expressionsmuster stimmt größtenteils nicht mit der von SANDER et al. (2006) beschriebenen H4R-Expression überein. SANDER et al. (2006) zeigte eine immunhistochemische H4R-Expression nur bei vergleichsweise wenigen Zellen wie intravasalen und gewebsständigen Leukozyten und wenigen Enterozyten am apikalen Ende der Lieberkühnkrypten. BOER et al. (2008) wiederum wiesen mittels Immunhistochemie eine extensive H4R-Expression der Enterozyten im unveränderten Kolon nach. Eine weniger stark ausgeprägte H4R-Expression zeigten auch nicht-epitheliale Zellen der Mukosa und submukosale Bindegewebszellen (BOER et al. 2008). 134 Diskussion Der H4R hat anscheinend keinen Einfluss auf die gastrointestinale Motilität wie die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zeigen (POZZOLI et al. 2009; CORUZZI et al. 2012). Im Gegensatz dazu wurde in den eigenen immunhistochemischen Untersuchungen eine geringgradige H4R-Expression der glatten Muskulatur festgestellt. Die mögliche funktionelle Bedeutung dieses Befundes für den Hund bleibt jedoch unklar. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von BOER et al. (2008) wurde auch im Rahmen der eigenen Untersuchungen eine H4R-Expression durch Enterozyten gezeigt. Bei den hier beschriebenen einzelnen, kräftig positiven Epithelzellen im basalen Kryptbereich, die sich in den meisten Dünn- und Dickdarmlokalisationen fanden, könnte es sich möglicherweise um enteroendokrine Zellen handeln. Hinweisend hierfür sind Verteilung und Morphologie dieser Zellen (PERANZI und LEHY 1984; STINSON und CALHOUN 1992; WELSCH 2006a). SANDER et al. (2006) beschrieben ebenfalls eine H4R-Expression von Zellen im Epithel des humanen Dünn- und Dickdarms, die eine ähnliche Morphologie wie neuroendokrine Zellen aufweisen. In der Arbeit von MORINI et al. (2008) wurde immunhistochemisch eine H4R-Expression durch endokrine Zellen im Magenfundus von Ratten nachgewiesen. Derartige Befunde haben sich in den eigenen Untersuchungen am kaninen Magen jedoch nicht ergeben. Die eigenen Untersuchungen zeigten weiterhin eine regelmäßige, meist dezente, oft multifokale, positive Reaktion von Immunzellen der Lamina propria mucosae. Weiterhin fanden sich in einem Großteil der untersuchten Dünn- und Dickdarmlokalisationen einzelne, grobgranuliert bis panzytoplasmatisch gefärbte, deutlich positive Lamina propria-Zellen in variierender Anzahl. Es ist bekannt, dass H4R durch viele Zellen des Immunsystems, wie eosinophile und basophile Granulozyten, T-Lymphozyten und Mastzellen exprimiert wird (GANTNER et al. 2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; DE ESCH et al. 2005; AKDIS und SIMONS 2006; DIJKSTRA et al. 2008; BÄUMER und ROßBACH 2010; CORUZZI et al. 2012). Um welchen Zelltyp es sich bei den stark gefärbten, einzeln liegenden Zellen handelt, kann nicht mit Sicherheit bestimmt werden. Möglicherweise könnte es 135 Diskussion sich um Mastzellen handeln, die nachweislich H4R tragen (HOFSTRA et al. 2003) und deren Verteilungsmuster im kaninen Gastrointestinaltrakt von KLEINSCHMIDT et al. (2006) beschrieben wurde. Diese Vermutung müsste in weiteren Untersuchungen z.B. durch eine Doppelmarkierung mittels Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz geklärt werden. Die Neuronen der nervalen Plexus in Magen, Dünn- und Dickdarm zeigten in der Mehrzahl der untersuchten Lokalisationen eine positive Reaktion der neuronalen Strukturen. Eine Ausnahme bildete der Plexus submucosus des Magens, der nur in einem Fall positiv reagierte. Die Ursache hierfür bleibt unklar. Funktionelle Untersuchungen von BREUNIG et al. (2007) an humanem Dünn- und Dickdarmgewebe zeigten eine Erregbarkeit von Neuronen des Plexus submucosus via H4R und sprechen damit ebenfalls für eine H4R-Expression der enteralen Plexus. Andere Untersuchungen zeigten jedoch funktionell keine via H4R vermittelten Effekte am Plexus myentericus des humanen Kolons oder am Duodenum von Ratten (POZZOLI et al. 2009; CORUZZI et al. 2012). Die größeren Gefäße des Gastrointestinaltraktes zeigten neben einem positiven immunhistochemischen Signal der glatten Gefäßwandmuskulatur in einigen Fällen auch intravasale Zellen, die eine H4R-Expression aufwiesen. Hierbei könnte es sich um zirkulierende Monozyten handeln, die laut DIJKSTRA et al. (2007) H4R exprimieren. Auch SANDER et al. (2006) berichten in ihren immunhistochemischen Untersuchungen zum H4R-Nachweis von intravasalen, stark positiven Leukozyten und vermuteten eine Herunterregulierung dieses Rezeptors nach Einwanderung der Leukozyten in das Gewebe. Bei allen drei durchgeführten immunhistochemischen Untersuchungen (H1R, H2R und H4R) fanden sich in einem großen Teil der untersuchten Präparate in der Tunica submucosa teils zellassoziierte, unregelmäßige AEC-Ablagerungen, während die kollagenen Fasern in allen Fällen negativ waren. Inwieweit es sich möglicherweise um spezifische, positive Reaktionen zellulärer Strukturen, möglicherweise von Fibroblasten oder Fibrozyten, handelt, konnte nicht eindeutig festgestellt werden. In der Literatur wird eine schwache H1R- und H2R-Expression und eine sporadische 136 Diskussion H4R-Expression von submukosalen Bindegewebszellen beschrieben (BOER et al. 2008). Eine unspezifische Ablagerung von Farbstoff bedingt durch einen hohen Bindegewebs- und Kollagenfaseranteil in diesem Bereich der Darmwand und daraus resultierenden Unregelmäßigkeiten der Schnittoberfläche kann jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Bei der semiquantitativen Auswertung der Histaminrezeptorexpression wurden auch unterschiedliche Altersgruppen innerhalb der Kontrollhunde verglichen, um mögliche altersassoziierte Expressionsunterschiede festzustellen. Dabei zeigte sich für die H1R-Expression im Kryptbereich (basaler Wert) eine signifikant niedrigere Expression bei den jungen Hunden und der Beaglegruppe, bei denen es sich ausnahmslos um Tiere jünger als zweieinhalb Jahre handelte. Die apikale und basale H2R-Expression war bei der Gruppe der alten Hunde (über 8 Jahre) signifikant höher als bei den Vergleichsgruppen. Möglichweise gibt es also bei Hunden einen Anstieg der Expression dieser beiden Histaminrezeptoren mit zunehmendem Alter. Altersassoziierte Veränderungen im kaninen Gastrointestinaltrakt bezüglich der mukosalen Morphologie, Epithelzellproliferation, Zusammensetzung der mukosalen Immunzellpopulationen und bakteriellen Mikroflora wurden durch mehrere Autoren beschrieben (KUZMUK et al. 2005; BAUM et al. 2007; KLEINSCHMIDT et al. 2008; DAY 2010; DE CONTO et al. 2010; KIL et al. 2010). Wie KIL et al. (2010) zeigten, unterliegt ein Teil der Gene in der kaninen Kolonschleimhaut einer signifikanten, altersabhängigen Änderung der Expression, was auf eine erhöhte Anfälligkeit für entzündliche und neoplastische Darmerkrankungen bei alten Hunden hindeutet. In der genannten Studie wurden allerdings keine expliziten Aussagen über die Histaminrezeptorexpression gemacht (KIL et al. 2010). Einer mit steigendem Alter zunehmenden H1R- und H2R-Expression könnte möglicherweise funktionell durch eine veränderte Kontraktilität und Sekretion im kaninen Gastrointestinaltrakt oder durch Modulationen immunologischer Vorgänge eine gewisse Bedeutung zukommen. 137 Diskussion Andererseits stellt auch die Zusammensetzung der Nahrung einen wichtigen Einflussfaktor auf die intestinale Morphologie, Genexpression und Immunabwehr dar (KUZMUK et al. 2005; DAY 2010; KIL et al. 2010). Über diesen Faktor können im Rahmen der eigenen Untersuchungen keine Aussagen getroffen werden, da ein Großteil der untersuchten Tiere aus Privathaltungen stammt und keine Informationen zur Fütterung vorlagen. Die apikale und basale Expression des H4R war bei der Beaglegruppe niedriger als bei den anderen Kontrollgruppen. Bezüglich der H4R-Expression im apikalen Bereich der Mukosa zeigten die Hunde im Alter unter einem Jahr eine höhere Expression als die mittelalten und alten Hunde. Aufgrund aktueller Forschungsergebnisse (BEERMANN et al. 2012) müssen diese Ergebnisse jedoch sehr vorsichtig interpretiert werden (siehe Kapitel 5.3). Ein möglicher Erklärungsansatz für die hier festgestellte Abnahme der apikalen Expressionsintensität von H4R könnte jedoch eine von KLEINSCHMIDT et al. (2008) beschriebene, altersabhängige Abnahme von CD3+ positiven T-Lymphozyten im kaninen Gastrointestinaltrakt darstellen. Es ist bekannt, dass bestimmte TZellsubtypen den H4R tragen (GANTNER et al. 2002; CORUZZI et al. 2012) und auch eine verstärkte Lokalisation von T-Zellen in der apikalen Mukosa wurde berichtet (KLEINSCHMIDT et al. 2008). Die abweichende Histaminrezeptorexpression der Beaglegruppe könnte einerseits mit dem Alter der Tiere zusammenhängen. Da die in dieser Untersuchung beprobten Beagle alle jünger als zweieinhalb Jahre und teilweise nur wenige Monate alt waren, kann es sich zum Beispiel bei den Expressionsunterschieden des H1R durchaus um altersbedingte Effekte handeln. Andererseits können auch hunderassespezifische Effekte nicht ausgeschlossen werden, da es sich hier um eine Untersuchung mit einer zufälligen Zusammensetzung der Hunderassen handelt (DAY 2010; DE CONTO et al. 2010). Inwieweit die hier beobachteten, altersabhängigen Veränderungen der Histaminrezeptorexpression im kaninen Magendarmtrakt tatsächlich bestehen und 138 Diskussion relevante funktionelle Auswirkungen, z.B. im Form einer Immunoseneszenz (DAY 2010), haben, kann an dieser Stelle nicht abschließend beurteilt werden und würde eine weitergehende Erforschung unter standardisierten Bedingungen bezüglich Untersuchungspopulation und diätetischen Einflüssen erfordern. 5.2 Expression von H1R, H2R und H4R bei Hunden mit inflammatory bowel disease Die Tiere der IBD-Gruppen zeigten vorberichtlich klinische Zeichen einer inflammatory bowel disease. Auch die Befunde der histologischen Untersuchungen der im Rahmen der Diagnostik entnommenen Bioptate zeigten ein Bild wie für IBD beschrieben. Die Verwendung des WSAVA-Scores nach DAY et al. (2008) in dieser Arbeit ermöglichte einen statistischen Vergleich der histopathologischen Läsionen bei Kontrolltieren und Hunden der IBD-Gruppen. Dieser zeigte signifikant höhere WSAVA-Scores bei den IBD-Hunden. Darüber hinaus dienten die Verwendung des WSAVA-Scores nach DAY et al. (2008) in dieser Untersuchung sowie die Beurteilung der histologischen Präparate durch mehrere Personen der Gewährleistung von Vergleichbarkeit und Transparenz der Ergebnisse und der Minimierung von interobserver differences. Im Vergleich der apikalen und basalen Histaminrezeptorexpression bei den gesunden Kontrollhunden mit der Expression bei den an IBD-erkrankten Hunden zeigte sich insgesamt eine erhöhte Expression von H1R und H2R bei den erkrankten Tieren. Diese Ergebnisse zeigen, nach aktuellem Stand der Literatur, erstmals eine veränderte Histaminrezeptorexpression bei chronischen, entzündlichen Enteropathien des Hundes. In mehreren humanmedizinischen Untersuchungen wurden Veränderungen der Histaminrezeptorexpression bei entzündlichen und neoplastischen Darmerkrankungen bereits mittels unterschiedlicher Methoden nachgewiesen (SANDER et al. 2006; BOER et al. 2008; VON RAHDEN et al. 2012). SANDER et al. (2006) zeigten bei Patienten mit irritable bowel syndrom und Lebensmittelallergien eine erhöhte Expression von H1R und H2R. Obwohl es sich beim irritable bowel syndrom und der IBD um verschiedene Krankheitsbilder handelt 139 Diskussion und auch die kanine und humane IBD gewisse Unterschiede aufweisen, werden teilweise ähnliche pathogenetische Mechanismen vermutet (BERCIK et al. 2005; CERQUETELLA et al. 2010). Der Mediator Histamin und dessen Histaminrezeptoren sind von großer Bedeutung bei der Regulation der intestinalen Motilität und Sekretion (DALE und LAIDLAW 1910; MULLER et al. 1993; KEELY et al. 1995; IZZO et al. 1998). Eine Dysregulation kann zu klinischen Symptomen wie Bauchschmerzen und Diarrhö führen (BARBARA et al. 2004; SANDER et al. 2006). SANDER et al. (2006) bzw. VON RAHDEN et al. (2012) vermuteten, dass bei Patienten mit irritable bowel syndrom bzw. bei Patienten mit komplizierten Fällen von Divertikulitis die Aufregulation von H1R und H2R mit einer vermehrten, epithelialen Sekretion und einer gesteigerten, gastrointestinalen Motilität einhergeht und so mit dem Auftreten klinischer Symptome im Zusammenhang stehen könnte. Dies könnte auch für die kanine IBD zutreffen. SUTTON et al. (2008) zeigten in einem Mausmodell mit induzierter Kolitis einen Zusammenhang zwischen Histamin-induzierter, epithelialer Sekretion und der mRNA-Expression für H1R. Allerdings zeigten die betroffenen Mäuse in der entsprechenden Studie eine verminderte H1R-Expression und Hyposekretion (SUTTON et al. 2008). Es wird davon ausgegangen, dass via H1R hauptsächlich proinflammatorische Effekte wie eine verstärkte Entzündungszellmigration und eine erhöhte, vaskuläre Permeabilität vermittelt werden (DE ESCH et al. 2005; AKDIS und SIMONS 2006). Eine verstärkte H1R-Expression bei IBD könnte somit pathogenetisch als ein „sichselbst-verstärkender“ Mechanismus interpretiert werden, ähnlich dem von ALLENSPACH und GASCHEN (2003) für proinflammatorische Zytokine bei kaniner IBD beschriebenen Effekt. Auf der anderen Seite wird angenommen, dass H2R eher antiinflammatorische Effekte vermittelt und die Zytokinproduktion von T-Zellen hemmt (JUTEL et al. 2001; AKDIS und SIMONS 2006). Die in den dieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen festgestellte Zunahme der H2R-Expression bei Fällen kaniner IBD 140 Diskussion stellt möglicherweise eine Gegenregulation zu den entzündlichen Prozessen in der Darmschleimhaut dar. WOOD (2006) interpretierte eine Zunahme der Histaminrezeptorexpression wie von SANDER et al. (2006) beschrieben als Bestandteil eines festgelegten, intestinalen Abwehrprogrammes, welches durch Histaminfreisetzung und das enterische Nervensystem reguliert wird und symptomatisch mit wässriger Diarrhö und abdominalen Schmerzen einhergeht. Ein derartiger histaminergic call up stellt nach WOOD (2006) einen generellen Abwehrmechanismus dar, der sich zwischen verschiedenen Spezies nicht deutlich unterscheidet. Ein anderer Autor (KIRK in einem Diskussionsbeitrag zu BOER et al. (2012)) deutet eine Erhöhung der Histaminrezeptorexpression bei entzündlichen, intestinalen Läsionen nicht als kausalen, pathogenetischen Faktor sondern als eine aus dem Entzündungsprozess resultierende Veränderung im Sinne eines Epiphänomens. Inwieweit es sich beim Anstieg der Histaminrezeptorexpression bei den Hunden der IBD-Gruppe Mechanismus tatsächlich um handelt oder einen es ursächlichen, sich hierbei pathogenetisch lediglich um ein relevanten mit der Entzündungsreaktion einhergehendes Epiphänomen handelt, kann im Rahmen dieser Untersuchungen nicht abschließend geklärt werden. Auch sollte erwähnt werden, dass der kaninen IBD eine multifaktorielle Pathogenese zu Grunde liegt und genetische und mikrobielle Faktoren, die im Rahmen dieser Arbeit nicht einbezogen wurden, ebenfalls eine bedeutenden Rolle spielen (JERGENS und SIMPSON 2012). Bei der gesonderten Betrachtung der IBD-Formen, also lymphoplasmazellulärer und eosinophiler Gastroenteritiden, zeigte sich überwiegend auch für die einzelnen Krankheitsformen eine höhere H1R- und H2R-Expression als bei der Kontrollgruppe. Der Vergleich der Histaminrezeptorexpression bei Hunden mit LPE und Hunden mit EGE zeigte meist keine statistisch signifikanten Unterschiede. Lediglich bei der Untersuchung des H2R zeigte sich teilweise eine signifikant höhere Expression bei Hunden mit eosinophilen Gastroenteritiden (siehe Kapitel 4.2.3.2). Untersuchungen der Mastzellzahlen bei LPE und EGE deuten auf unterschiedliche 141 Diskussion Pathomechanismen hin, die zur Entwicklung der jeweiligen IBD-Formen beim Hund führen (KLEINSCHMIDT et al. 2007; CERQUETELLA et al. 2010). Weiterhin ist bekannt, dass unterschiedliche Altersgruppen und Rassen für bestimmte IBDFormen prädisponiert sind (HALL und GERMAN 2011; GERMAN 2012). KLEINSCHMIDT et al. (2008) vermuteten eine Th2-dominierte Immunantwort bei eosinophilen Gastroenteritiden und JUTEL et al. (2001) zeigten, dass H2R vorwiegend von Th2-Lymphozyten exprimiert wird. Möglichweise spricht die in der vorliegenden Arbeit festgestellte höhere Expression von H2R ebenfalls für eine Th2Immunantwort bei der eosinophilen Form der kaninen IBD. Demgegenüber berichten andere Autoren von einer gemischten Th1/Th2-Immunantwort mit einem breiten Zytokinspektrum bei der IBD des Hundes (GERMAN et al. 2000; JERGENS et al. 2009). Zudem wurde eine H2R-vermittelte Hemmung sowohl der Th1- als auch der Th2-Zytokinproduktion gezeigt (JUTEL et al. 2001). Einschränkend muss gesagt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit eine vergleichsweise kleine Population untersucht wurde und teilweise für bestimmte Kombinationen von Gruppen (z.B. EGE) und Lokalisationen (z.B. Kolon) aufgrund zu geringer Tierzahlen keine statistischen Aussagen gemacht werden konnten. Die Klärung der Frage, ob sich die Histaminrezeptorexpression bei den verschiedenen Formen der kaninen IBD unterscheidet, erfordert weitere Untersuchungen mit einer größeren Tierzahl und ggf. zusätzlichen Methoden wie einer quantitativen PCR. Die H4R-Expression im Zottenbereich bzw. im apikalen Bereich der Mukosa war im Vergleich bei den Hunden mit IBD höher als bei der Kontrollgruppe. Die basale Expression von H4R zeigte kaum signifikante Unterschiede, lediglich im Duodenum war die H4R-Expression der IBD-Tiere bzw. der Hunde mit LPE signifikant niedriger als bei den Kontrolltieren. Da die Spezifität von kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen den H4R laut aktueller Literatur (BEERMANN et al. 2012) und aufgrund der eigenen Ergebnisse der in situ-Hybridisierung als fraglich angesehen werden muss, sollten diese Ergebnisse sehr vorsichtig interpretiert werden (siehe Kapitel 5.3). Auch in der einschlägigen Literatur existieren Widersprüche bezüglich der H4RExpression bei entzündlichen Enteropathien. SANDER et al. (2006) stellten keine 142 Diskussion Unterschiede der H4R-Expression auf mRNA- oder Proteinebene im Vergleich von Patienten mit irritable bowel syndrom und Lebensmittelallergien mit einer Kontrollgruppe fest. SUTTON et al. (2008) hingegen zeigten an einem Mausmodell einen starken Anstieg der mRNA von H4R bei Tieren mit TBNS-induzierter Kolitis, der mit einer starken Entzündungszellinfiltration und mukosalen Läsionen einherging. Eine mögliche Erklärung für den in dieser Untersuchung festgestellten Anstieg der apikalen H4R-Expression bei IBD-Tieren kann die Einwanderung von H4R-tragenden Entzündungszellen, wie eosinophilen Granulozyten, bestimmten T-Zellsubtypen und Mastzellen (GANTNER et al. 2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; DE ESCH et al. 2005) in diese Regionen der Lamina propria mucosae darstellen (GERMAN et al. 2001). Demgegenüber steht, dass sowohl dendritische Zellen als auch Mastzellen zwar H4R tragen (HOFSTRA et al. 2003; DIJRKSTRA et al. 2008), bei der kaninen IBD jedoch in verminderter Anzahl in der Mukosa aufzufinden sind (GERMAN et al. 2001; KLEINSCHMIDT et al. 2006; JUNGINGER et al. 2013). Die im Duodenum festgestellte Abnahme der H4R-Expression bei den Hunden der IBD-Gruppe stellt ein unerwartetes Ergebnis dar. Eine verminderte Expression dieses Rezeptors wurde bis jetzt lediglich im Zusammenhang mit neoplastischen Veränderungen beschrieben (BOER et al. 2008), während bei entzündlichen Läsionen eher von einer unveränderten oder erhöhten H4R-Expression berichtet wurde (SANDER et al. 2006; SUTTON et al. 2008). Neben der bekannten Wirkung von H2R-Antagonisten auf die Magensäureproduktion zeigten verschiedene in vivo-Studien ein therapeutisches Potential anderer Histaminrezeptorliganden bei gastrointestinalen Erkrankungen. Im besonderen Fokus steht dabei der v.a. auf Immunzellen exprimierte H4R (DE ESCH et al. 2005; CORUZZI et al. 2012). VARGA et al. (2005) untersuchten die Wirkung zweier H4RAntagonisten bei induzierten Kolitiden von Ratten und zeigten antiinflammatorische Effekte durch verminderte makroskopische Läsionen, einen reduzierten Influx von neutrophilen Granulozyten und niedrigere TNF-α-Level bei den behandelten Tieren. FOGEL et al. (2005b) zeigten in einem ähnlichen Modell verminderte Gewebsläsionen im Kolon bei Gabe von H1R- und H2R-Antagonisten und einem Diskussion 143 unselektiven H3R/H4R-Antagonisten. CORUZZI et al. (2009) berichteten von gastroprotektiven Effekten des H4R-Antagonisten JNJ7777120 bei Maus und Ratte. Inwieweit derartige antiinflammatorische Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten auch bei entzündlichen Enteropathien des Hundes und im Besonderen bei der kaninen IBD auftreten, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. 5.3 Methodische Aspekte der immunhistochemischen Darstellung von Histaminrezeptoren unter besonderer Betrachtung des H4R Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war die Darstellung verschiedener Histaminrezeptoren im Magendarmtrakt des Hundes. Als Methode für die Markierung der Rezeptorproteine wurde die Immunhistochemie gewählt, die eine etablierte und in Forschung und Diagnostik viel genutzte Technik darstellt (RAMOS-VARA 2005). Trotzdem existieren zahlreiche Fehlerquellen und Limitationen bei der IHC (siehe Kapitel 2.5), die im Rahmen dieser Arbeit v.a. bei der Untersuchung des H4R eine große Rolle spielten. Die kritische Betrachtung und Diskussion der durchgeführten Untersuchungen und Ergebnisse dieser Arbeit ist daher ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit. Bei den hier verwendeten Antikörpern gegen den humanen H1R und H2R besteht laut Herstellerangaben eine Kreuzreaktivität mit dem kaninen Antigen, was den Einsatz an Geweben vom Hund erlaubt. Diese Angaben basieren jedoch, wie eine Nachfrage bei den Herstellern ergab, lediglich auf Sequenzhomologien zwischen kaninem und humanem Protein des als Immunogen verwendeten Polypeptids. Diese ist mit 93% für H1R relativ hoch und beträgt für den H2R sogar 100% (persönliche Korrespondenz mit Abcam, UK vom 20.08.2012 und Novus Biologicals, USA vom 23.08.2013). Zusätzlich wurde für beide Antikörper eine Absorptionsreaktion durchgeführt, die zur Hemmung der Antikörperreaktion führte (siehe Kapitel 4.2.1). Diese Reaktion zeigt, dass die Antikörper tatsächlich an Epitope des als Immunogen verwendeten Polypeptids binden. Es stellte sich jedoch für die Reaktion gegen H2R heraus, dass eine Anfärbung der neuronalen Plexus sowie multipler, filamentöser Strukturen im 144 Diskussion Zottenbereich bestehen blieb. Hierbei handelt es sich daher vermutlich um eine unspezifische Reaktion, deren genaue Ursache unklar bleibt. Eine falsch-positive Anfärbung bedingt durch unspezifische Bindungen des Chromogens an Avidinbindungsstellen wie von HORLING et al. (2012) für Gefrierschnitte des murinen Gastrointestinaltraktes ausgeschlossen werden, da beschrieben, die kann Negativkontrolle mit großer unter Sicherheit Auslassung des Primärantikörpers diesen Effekt nicht zeigte. Auch das Vorhandensein von Antikörpern gegen andere Antigene als H2R in der verwendeten Antikörperlösung, was bei polyklonalen Antikörpern der Fall sein kann (RAMOS-VARA 2005), erscheint unwahrscheinlich, da es sich um ein aufgereinigtes Produkt handelt. LEONG und LEONG (2011) berichten von einem edge effect (Randeffekt), der sowohl durch eine stärkere Fixation des Gewebes in den peripheren Randbereichen des Gewebeschnittes als auch durch Einsickern der Reagenzien unter den Schnitt und daraus resultierender, stärkerer Farbreaktion in diesen Bereichen zustande kommen kann. Bei den im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gewebeproben handelt es sich um kleine, endoskopisch entnommene Bioptate, sodass die Gefahr einer unzureichenden Fixation zwar kaum besteht, im Verhältnis zur Gesamtgröße der Proben jedoch die Randbereiche überwiegen. Ein Einfluss des von LEONG und LEONG (2011) beschriebenen Randeffekts darf deshalb nicht außer Acht gelassen werden. Zur Minimierung des Randeffektes wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zwei Lokalisationen der Tunica mucosa (die apikale Expression im Zottenbereich und die basale Expression im Kryptbereich) sowie jeweils, soweit möglich fünf Gesichtsfelder untersucht. Weiterhin ließen sich darüber hinaus statistisch relevante Korrelationen zwischen Histaminrezeptorexpression und Grad der histologischen Läsionen, repräsentiert durch den WSAVA-Score feststellen. Um die hier gezeigten Ergebnisse zu untermauern, könnte zukünftig eine ergänzende quantitative RT-PCR durchgeführt werden um den Anstieg der Histaminrezeptorexpression auch auf mRNA-Ebene nachzuweisen. Bezüglich des verwendeten Antikörpers gegen H4R ergaben sich im Laufe dieser Untersuchungen gewisse Schwierigkeiten. Es ließen sich zwar ohne weiteres mit 145 Diskussion dem ausgewählten Antikörper gegen den humanen H4R und dem hier verwendeten Protokoll (siehe Kapitel 3.3.5) positive Signale im kaninen Gastrointestinaltrakt darstellen, eine aktuelle Studie von BEERMANN et al. (2012) zweifelt jedoch die Epitopspezifität mehrerer, kommerziell erhältlicher Antikörper gegen den humanen und murinen H4R an. Die Autoren zeigten mittels Durchflusszytometrie und Western Blot sowie unter Verwendung von transfizierten Zellen und Geweben aus knock-outMäusen, dass die detektierten, positiven Signale nicht durch spezifische Bindungen an das H4R-Rezeptorprotein, sondern durch ein unspezifisches Bindungsverhalten dieser Antikörper hervorgerufen wurden (BEERMANN et al. 2012). Ähnliche Beobachtungen machten GUTZMER et al. (2012). Eine strukturelle Ähnlichkeit von Rezeptorsubtypen derselben Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, in diesem Fall also von H1R, H2R und H3R, kann möglicherweise ein solches unspezifisches Bindungsverhalten bedingen (MICHEL et al. 2009). Weiterhin sollte in Betracht gezogen werden, dass Rezeptorproteine mit anderen Zellmembrankomponenten interagieren und sich Einflüsse auf Sekundär- und Tertiärstruktur ergeben können, die möglicherweise Unterschiede im fraglichen Epitop bedingen (BEERMANN et al. 2012). Zwar sind die von BEERMAN et al. (2012) und GUTZMER et al. (2012) verwendeten Antikörper nicht mit den in der vorliegenden Arbeit benutzten Produkten von Novus Biologicals, USA bzw. Acris Antibodies, Herford, identisch, jedoch sind diese teilweise ebenfalls gegen ein Immunogen in der 3. zytoplasmatischen Domäne gerichtet. Dies lässt auf Überschneidungen der Epitope schließen. MICHEL et al. (2009) berichten darüber hinaus, dass bei vielen Antikörpern gegen Rezeptoren aus der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Spezifität fraglich ist. Daher fordern MICHEL et al. (2009) und BEERMANN et al. (2012) eine gründliche Validierung solcher Antikörper durch Hersteller und Arbeitsgruppen, die mindestens eine der folgenden vier Kriterien erfüllt. Erstens sollten sich Zellen und Gewebe von knock-out-Modellen sicher negativ in Immunhistochemie und Immunblots darstellen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Zweitens sollten Zellen und Tiere, die durch genetische Modifikation eine (zeitweise) Diskussion 146 verminderte Rezeptorexpression aufweisen, also knock-down-Modelle, ein deutlich reduziertes Signal zeigen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Eine dritte Option zur Sicherung der Epitopspezifität stellt die Transfektion von verschiedenen Rezeptorsubtypen in eine geeignete Zelllinie dar. Lediglich der fragliche Rezeptor, nicht jedoch die ähnlichen Rezeptorsubtypen sollten eine positive Färbung hervorrufen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Und viertens sollten mehrere Antikörper gegen verschiedene Epitope des jeweiligen Rezeptorproteins sehr ähnliche Färbemuster bei Verwendung von immunhistochemischen Methoden oder Immunblots aufweisen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Untersuchungen zur Validierung des verwendeten Antikörpers wie von MICHEL et al. (2009) und BEERMANN et al. (2012) gefordert, wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt. Darüber hinaus besteht eine vergleichsweise niedrige Homologie von nur 71% zwischen den Aminosäuresequenzen des H4R-Proteins von Mensch und Hund (JIANG et al. 2008), die den Einsatz eines Antikörpers gegen den humanen H4R an kaninen Geweben als suboptimal erscheinen lässt. Aufgrund dieser Entwicklungen wurde zusätzlich eine in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA im kaninen Magendarmtrakt etabliert. Dabei ist zu beachten, dass mRNA-Expression und eine Expression auf Proteinebene aufgrund translationaler Modifikationen nicht zwingend übereinstimmen müssen (RAMOSVARA 2005; MICHEL et al. 2009). 5.4 Darstellung des H4R mittels in situ-Hybridisierung Einen Nachweis der Expression von H4R auf mRNA-Ebene im kaninen Dünn- und Dickdarm erbrachten bereits verschiedene Arbeitsgruppen (JIANG et al. 2008; EISENSCHENK et al. 2011). Die Verwendung einer RT-PCR wie bei JIANG et al. (2008) und EISENSCHENK et al. (2011) erlaubt jedoch keine Spezifizierung der H4R-Expression auf zellulärer Ebene. Um die H4R-Expression im kaninen Duodenum und Kolon auf zellulärer Ebene zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine in situ-Hybridisierung mit eigens 147 Diskussion hergestellten Sonden gegen den kaninen Rezeptor durchgeführt. Dabei konnte an einem Großteil der Proben aus Duodenum und Kolon der Kontrollgruppe eine Expression von H4R-mRNA durch Enterozyten und mononukleäre Zellen der Lamina propria mucosae festgestellt werden. Obwohl aufgrund translationaler Modifikationen die Expression von mRNA und des dazugehörigen Proteins nicht zwingend übereinstimmen müssen (RAMOS-VARA 2005; MICHEL et al. 2009), zeigen diese Ergebnisse dennoch unseres Wissens erstmals, dass Enterozyten im kaninen Darm das Potential zur H4R-Expression auf Proteinebene besitzen. Dabei zeigte sich im Duodenum, dass die H4R-Expression der Enterozyten im Zottenbereich abnimmt. Die basal in der Tunica mucosa gelegenen Kryptepithelzellen bestehen aus multipotenten, adulten Stammzellen und besitzen ein hohes Regenerationspotential (SANSONETTI 2004; SIMONS und CLEVERS 2011). Sie migrieren in apikale Richtung zur Zottenspitze und bilden eine dynamische, intestinale Barriere (SANSONETTI 2004; SIMONS und CLEVERS 2011). Während der Wanderung in Richtung Zottenspitze differenzieren die Zellen zu reifen Enterozyten (SIMONS UND CLEVERS 2011). Möglicherweise kommt es im Rahmen dieses Reifungsprozesses zur Abnahme bzw. Herunterregulierung der H4R-Expression. Dies könnte auf eine Bedeutung des H4R bei der Regulation der Epithelerneuerung hindeuten. Verschiedene Autoren vermuteten bereits einen Einfluss auf die Regulation proliferativer Prozesse via H4R (BOER et al. 2008; CORUZZI et al. 2012), da bei Neoplasien im humanen Kolon eine verminderte H4R-Expression festgestellt wurde (BOER et al. 2008) und in vitro-Untersuchungen proliferationshemmende Effekte durch eine H4R-Aktivierung zeigten (CORUZZI et al. 2012). Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung zeigten weiterhin eine Expression von H4RmRNA durch mononukleäre Zellen in der Lamina propria mucosae. Dies stimmt mit mehreren Untersuchungen überein, die eine H4R-Expression durch zahlreiche Immunzellen wie eosinophile und basophile Granulozyten, T-Lymphozyten, dendritische Zellen und Mastzellen unter Verwendung verschiedener Methoden belegten (GANTNER et al. 2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; DE ESCH et al. 2005; AKDIS und SIMONS 2006; DIJKSTRA et al. 2008; BÄUMER und ROßBACH 2010; CORUZZI et al. 2012). Jedoch fanden sich in der in situ- 148 Diskussion Hybridisierung auch regelmäßig Zellen in der Lamina propria mucosae ohne spezifisches Signal. HOFSTRA et al. (2003) haben gezeigt, dass murine BLymphozyten keinen H4R tragen. Möglicherweise kann es sich bei diesen H4Rnegativen Zellen um intestinale Plasmazellen handeln, die aus B-Lymphozyten hervorgehen (JUNGI 2000). In der Mehrzahl der untersuchten Darmlokalisationen ließ sich eine H4R-Expression des Plexus submucosus feststellen. Dies stimmt mit Ergebnissen von BREUNIG et al. (2007) überein, die H4R funktionell am Plexus submucosus im humanen Dünnund Dickdarm nachwiesen. Die heterogenen, teils nicht sicher reproduzierbaren Signale der in situHybridisierung gegen H4R-mRNA bei den Bioptaten der IBD-Hunde stellten ein überraschendes Ergebnis dar. Hierbei ließ sich das an den Kontrolltieren gezeigte Expressionsmuster nur teilweise und an wenigen Proben nachvollziehen. So zeigten überwiegend die Immunzellen der Lamina propria mucosae ein teils schwaches Signal in der in situ-Hybridisierung. Die Enterozyten wiesen nur in 2 Proben aus dem Duodenum ein schwaches Signal auf. Den Grund hierfür könnte eine tatsächliche Herunterregulierung der H4R-Expression bei Tieren mit IBD darstellen, wahrscheinlicher sind jedoch methodische Ursachen. Es ist bekannt, dass RNA während einer Fixation in formalinhaltigen Lösungen degradiert werden kann (SRINIVASAN et al. 2002). Weiterhin haben Probengröße und Fixationszeit einen Einfluss auf die Integrität von Nukleinsäuren in Gewebeproben (SRINIVASAN et al. 2002). Bei den hier untersuchten Bioptaten handelte es sich um sehr kleine Gewebeproben, die entsprechend schnell vollständig „durchfixiert“ wurden. Die genaue Fixationszeit dieser Proben variiert stark und ist nicht nachvollziehbar, da diese nach der endoskopischen Entnahme zum Teil mit der Post versandt wurden. Möglicherweise resultieren die stark heterogenen Ergebnisse der in situ- Hybridisierung mit teils nur schwachen Signalen aus einer fixationsbedingten Schädigung der H4R-mRNA. Im Vergleich wurden die Gewebeproben der als Kontrolltiere verwendeten Hunde schnellstmöglich, d.h. innerhalb von höchstens 2 Stunden nach Euthanasie, entnommen und für maximal 48 Stunden in 10%igem, 149 Diskussion gepuffertem Formalin fixiert, sodass negative Effekte auf die Protein- und Nukleotidintegrität durch post mortem-Degradierung und Fixation (SRINIVASAN et al. 2002) bestmöglich minimiert werden sollten. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die H4R-mRNA-Expression und das immunhistochemische Expressionsmuster des H4R-Rezeptorproteins teilweise Überschneidungen zeigen. So zeigten Enterozyten, ein Teil der Immunzellen der Lamina propria mucosae und der Plexus submucosus jeweils positive Signale in der Immunhistochemie und der in situ-Hybridisierung. Eine starke Expression des Rezeptorproteins in einzelnen Kryptepithelzellen bzw. einzelnen Zellen der Lamina propria mucosae wie in der Immunhistochemie gezeigt, ließ sich anhand der Ergebnisse der in situ-Hybridisierung auf mRNA-Ebene nicht nachvollziehen. 5.5 Schlussbetrachtung Abschließend zeigen die Untersuchungen, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, dass die Darstellung von kaninen Histaminrezeptoren mittels etablierter Methoden ähnlich wie beim Menschen gewissen Limitationen unterliegt (BEERMANN et al. 2012). Es gelang das Expressionsmuster von H1R und H2R immunhistochemisch darzustellen. Die Expression von H4R wurde zusätzlich auch auf mRNA-Ebene mittels in situ-Hybridisierung untersucht, da Zweifel an der Epitopspezifität des verwendeten Antikörpers bestanden. Der semiquantitative Vergleich der Expression dieser Histaminrezeptoren zeigte altersbedingte Expressionsveränderungen und mehrheitlich eine erhöhte Expression bei Tieren mit IBD. Ergänzend zu diesen Beobachtungen könnte die Expression der Histaminrezeptoren mittels quantitativer PCR auf mRNA-Ebene nachvollzogen werden. Dabei sollten Probenentnahme und Fixation allerdings zwingend standardisiert erfolgen, um Verzerrungen der Ergebnisse z.B. durch eine mögliche fixationsbedingte Degradierung von Nukleinsäuren zu vermeiden (SRINIVASAN et al. 2002). Die Darstellung des H4R-Proteins in kaninen Geweben stellte sich im Rahmen dieser Arbeit als besonders schwierig dar. Dies ist wahrscheinlich begründet in der 150 Diskussion fraglichen Epitopspezifität kommerzieller Antikörper und einer geringen Homologie zwischen humanem und kaninem Protein (JIANG et al. 2008; BEERMANN et al. 2012). Zur Lösung dieses Problems empfiehlt sich die Herstellung und Validierung eines Antikörpers gegen den kaninen H4R. Dabei sollte mindesten eines der von MICHEL et al. (2009) und BEERMANN et al. (2012) geforderten Kriterien erfüllt sein. Zusätzlich könnten Zelltypen, die immunhistochemisch eine starke Expression bestimmter Histaminrezeptoren zeigten, mittels Doppelimmunhistochemie- oder Doppelimmunfluoreszenzmethoden genauer charakterisiert werden. Um die Rolle der Histaminrezeptorexpression bei der Pathogenese der IBD eingehender zu beurteilen, wären höhere Tierzahlen in den einzelnen Erkrankungsgruppen wünschenswert, um ggf. vorhandene Unterschiede besser zu erkennen. Zusätzlich könnten Tiere mit anderen intestinalen Erkrankungen (z.B.: Parasitosen, Neoplasien) als Vergleichsgruppe herangezogen werden. 151 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Untersuchungen von Histaminrezeptoren am kaninen Darm und bei Hunden mit chronischen idiopathischen Darmentzündungen Ulrike Schwittlick Bei der kaninen inflammatory bowel disease handelt es sich um eine heterogene Gruppe chronischer Enteritiden, deren Ätiologie unbekannt und deren Pathogenese nur unzureichend geklärt ist. Immunologische, genetische, mikrobielle und umweltbedingte Einflüsse werden vermutet. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass Mastzellen und deren Mediator Histamin bei der IBD eine zentrale Rolle spielen. Für die Diagnose dieser Erkrankung ist eine Entnahme von Bioptaten aus Magen, Dünn- oder Dickdarm und deren histologische Untersuchung unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Expression verschiedener Histaminrezeptoren (H1R, H2R und H4R) im Magendarmtrakt von gesunden Kontrollhunden und bei Hunden mit IBD, die entzündliche Infiltrate in verschiedenen intestinalen Lokalisationen aufwiesen. Dazu wurden formalinfixierte und in Paraffineingebettete Vollschichtproben aus Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon von 24 Kontrollhunden sowie endoskopisch entnommene Bioptate aus Magen, Duodenum und/oder Kolon von insgesamt 25 Hunden mit IBD immunhistochemisch unter Verwendung kommerziell erhältlicher, polyklonaler Antikörper untersucht. H1R und H2R zeigten ein ähnliches Verteilungsmuster und wurden durch Enterozyten, Haupt- und Epithelzellen im Magen, Immunzellen der Lamina propria mucosae und der Peyer-Platten, Myozyten und enterale Nervenplexus exprimiert. Der H4R wurde ebenfalls durch Enterozyten, Immunzellen, Myozyten und Ganglien exprimiert, jedoch ergaben sich Zweifel an der Epitopspezifität und Eignung des verwendeten Antikörpers. Zusätzlich wurde mittels eigens hergestellter Sonden eine in situHybridisierung gegen H4R-mRA an Proben aus Duodenum und Kolon von 9 Kontrollhunden und 6 Hunden mit IBD durchgeführt. Eine Expression von H4R-mRA durch Enterozyten, Immunzellen und Neuronen des Plexus submucosus konnte am Zusammenfassung 152 Material der Kontrollhunde gezeigt werden. Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung an den Bioptaten der erkrankten Tiere waren sehr heterogen, was möglicherweise durch fixationsbedingte Schäden an der mRNA bedingt wurde. Eine semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Ergebnisse zeigte altersabhängige Veränderungen sowie einen Anstieg der Expression von H1R, H2R und teilweise auch H4R bei Hunden mit IBD. Die beiden untersuchten IBD-Formen, LPE und EGE, zeigten weitestgehend keine unterschiedliche Expression. Da Histamin über seine spezifischen Rezeptoren viele Funktionen im Magendarmtrakt, wie Motilität, Sekretion, Permeabilität und Immunregulation, beeinflusst, könnte eine vermehrte Expression dieser Rezeptoren bei der kaninen IBD pathogenetisch bedeutsam sein und gastrointestinale Symptome wie Diarrhö und abdominale Schmerzen verstärken. Möglicherweise handelt es sich jedoch auch um eine unspezifische Expressionsveränderung, die mit den entzündlichen Prozessen einhergeht ohne diese hervorzurufen (Epiphänomen). Weitere Untersuchungen mittels quantitativer PCR könnten möglicherweise Aufschlüsse über einen Anstieg der Expression auf m-RNA-Ebene geben. Die Herstellung und Validierung eines Antikörpers gegen das kanine H4R-Protein ist wünschenswert und würde eine sichere Darstellung des Rezeptors im Gastrointestinaltrakt und anderen kaninen Geweben ermöglichen. 153 Summary 7 Summary Analysis of intestinal histamine receptors in healthy dogs and dogs with chronic idiopathic inflammatory enteritis Ulrike Schwittlick Canine inflammatory bowel disease (IBD) includes different forms of chronic enteritis in dogs with unknown aetiology. The pathogenesis of these conditions remains unclear, but involves immunologic, genetic, microbial and environmental factors. Mast cells and their mediator histamine play a central role in IBD. For the diagnosis of this disease it is necessary to take biopsies from stomach, small and large intestine for histopathological examination. The aim of this study was to analyse the expression of several histamine receptors, namely H1R, H2R and H4R, in the intestine of healthy dogs and in dogs with canine IBD. Formalin-fixed and paraffin-embedded full-thickness samples of stomach, duodenum, jejunum, ileum and colon from 24 healthy control dogs as well as biopsies from stomach, duodenum and colon from 25 cases of canine IBD were used for immunohistochemistry with polyclonal antibodies against particular histamine receptors. H1R and H2R were similarly expressed by enterocytes, epithelial cells of stomach, chief cells, lamina propria immunocytes, lymphocytes of Peyer´s patches, myocytes and enteric nervous plexuses. Expression pattern of H4R also involved enterocytes, immunocytes, myocytes and ganglia. During this study the epitope specifity of commercially available antibodies against human H4R was questioned. Therefore, in situ-hybridisation was performed additionally on samples from the duodenum and colon of 9 control animals and 6 cases of canine IBD. H4R-mRNA expression was shown in enterocytes, immunocytes and plexus submucosus in the control group. Expression of H4R-mRNA in the endoscopic tissue samples was quite heterogenic, most likely caused by RNA damage due to formalin fixation. Semiquantitative examination of immunohistochemical results showed age- dependent variation of histamine receptor expression. Furthermore, an increased Summary 154 expression of H1R, H2R and to some extent of H4R was shown. Expression of histamine receptors in lymphoplasmacytic and eosinophilic forms of canine IBD did not differ in most cases. A pathogenic relevance of these findings may be possible because histamine mediates several gastrointestinal functions through the observed receptors. Gastrointestinal motility, immunomodulation, secretion and permeability could be influenced by increased histamine receptor expression and influence symptoms like diarrhoea and abdominal pain. On the other hand changes in the expression of histamine receptors could also be an epiphenomenal event being a result of the inflammatory infiltration, rather than the cause of the inflammatory process. Further experiments using quantitative PCR could reveal an increase of histamine receptor expression on mRNA level. Furthermore, production and validation of a specific antibody against the canine H4R-protein would be useful. Further characterization of the cells expressing histamine receptors could be possible by using double-labelling techniques like immunofluorescence or immunohistochemistry. Literaturverzeichnis 155 8 Literaturverzeichnis AKDIS C. A., F. E. SIMONS (2006): Histamine receptors are hot in immunopharmacology. Eur J Pharmacol 533: 69-76. ALLENSPACH, K., F. GASCHEN (2003): Chronische Darmerkrankungen beim Hund: Eine Übersicht. Schweiz Arch Tierheilk145: 209-222. ALLENSPACH, K., B. WIELAN, A. GRÖNE, F. 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Nematoden obB obB obB obB obB obB obB obB WHWT DSH Mischling Bernhardiner Springer Spaniel Border Collie Mischling Yorkshire Terrier obB obB obB ggr. Koprostase obB obB obB obB Kuvasz obB Australian Cattle Dog obB Sibirischer Husky Beagle Beagle Beagle Beagle Leonberger Briard Labrador Retriever DSH Rehpinscher obB ggr. lplz. Inf.; mf. lymph. A. ggr. lplz. Entz. obB obB obB mf. lymph. A. obB obB obB obB obB obB obB obB ggr. lplz. Inf., ggr. neutr. Inf.; lymph. A.; obB f. lymph. A. obB obB obB obB ggr. mf. Ka., ggr. lplz. Inf. obB obB ggr. lplz. Inf. ggr. lplz. Ent., ggr. Kd./Ka. ggr. lplz. Inf., ggr. Ka. ggr. lplz. Inf., ggr. Ka. ggr. lplz. Inf. ggr. lplz. Inf. obB obB mf. ggr. Kd./Ka. obB f. ggr. neutr. Ent. ggr. eos. Ent. mf. ggr. Ka. obB obB obB obB Histologischer Befund Magen Duodenum Jejunum ggr. eos. Inf. obB obB obB ggr. eos. Ent. obB obB obB obB obB ggr. eos. Ent. obB of ggr. Kd. obB obB ggr. eos. Ent. ggr. eos. Ent. mf. ggr. eos. Inf. obB obB obB Ileum obB obB obB obB obB obB obB obB obB ggr. eos. Inf. obB obB obB obB ggr. eos. Ent. ggr. eos. Ent. obB obB obB obB mf. ggr. lplz. Inf. ggr. lplz. Inf. obB obB ggr. mf. lplz. Inf. ggr. lplz. Inf. ggr. lplz. Inf. obB obB ggr. eos. Inf., ggr. lplz. Inf. Kolon mf. ggr. Kd., f. ggr. lplz. Inf. mf. ggr. eos. Inf.; mf. ggr. lplz. Inf.; obB obB mgr. lplz. Ent. obB obB obB ggr. lplz. Ent. obB obB obB obB obB mf. ggr. lplz. Inf. ggr. lplz. Inf.; 23 S 1336/10 Mischling obB obB obB obB obB mf. lymph. A. ggr. lplz. Entz; mf. ggr. lplz. Inf.; 24 S 1363/10 Mischling obB obB obB obB mgr. lymph. A. ggr. Fibrose Abkürzungen: DSH = Deutscher Schäferhund; WHWT = Westhighland White Terrier; obB = ohne besonderen Befund; ggr. = geringgradig; mgr. = mittelgradig; f.= fokal, mf. = multifokal; lymph. A. = vermehrt lymphoide Aggregate; lplz. Inf. = lymphoplasmazelluäres Infiltrat; eos. Inf. = eosinophiles Infiltrat; Kd.= Kryptdilatationen; Ka. = Kryptabszesse; lplz. Ent. = lymphoplasmazelluläre Enteritis; eos. Ent.= eosinophile Enteritis; neutr. Ent. = neutrophile Enteritis; Entz. = Entzündung; - = fehlt; V 867/10 V 1180/10 V 1181/10 V 295/10 V 325/10 S 719/11 S 680/11 S 979/10 S 1579/09 S 987/10 2 obB V 614/10 1 Beagle Makroskopischer Befund Lfd. UntersuchungsRasse Nr. Nr. Tabelle 12: Übersicht der makroskopischen und histologischen Befunde der Kontrollhunde 176 177 Anhang Tabelle 13: Histopathologische Befunde der IBD-Hunde Lfd. Nr. 25 UnterRasse suchungsNr. E 1573/11 Mischling 26 27 E 1853/11 E 1993/10 Hovawart Labrador 28 E 5763/10 Mallinois 29 E 1770/11 30 E 4307/10 Jack Russel T. Boxer 31 E 4343/10 Mischling ggr.-mgr. lplz. Entz. 32 E 5573/10 WHWT 33 E 1042/11 Pudel mgr.-hgr. lplz. Entz.; ggr. neu. Entz.; ggr. Epil. ggr. mf. lz. Gastritis 34 35 E 4453/10 E 2510/10 Mischling Belg. SH 36 E 2068/10 Hovawart 37 E 1648/10 Mischling 38 E 20 74/10 Labrador 39 E 2225/11 DSH 40 E 3727/10 WHWT 41 E 4889/10 Mischling 42 E 1182/10 43 E 6234/10 44 E 3970/10 45 E 6103/10 46 E 1852/10 47 E 2281/10 48 E 3980/10 49 E 5489/10 Histologischer Befund Magen Duodenum Kolon mgr.-hgr. lplhz. Entz.; neu. Inf.; Epil. mgr. lplz. Entz.; ggr. Fibr. obB ggr.-mgr. lplz. Entz.; neu. Inf.; Epil. ggr. lplz. Entz.; ggr. ieInf. ggr. lplz. Entz.; mgr. neu. Inf.; ggr. mf. Zv. mgr.-hgr. lplz. Entz., ggr.mgr. ieInf.; ggr. Kd. mgr. lplz. Entz.; mgr. neu. Entz.; ggr. Ka. mgr. lplz. Entz.; ggr. ieInf.; hgr. mf. Fibr. ggr.-mgr. lplz. Entz.; ggr. ieInf.; hgr. mf. Fibr. ggr.-mgr. lplz. + neu. Entz.; mgr.-hgr. Lek. ggr.-mgr. lplhz. Entz.; mf. Epil. + Ka. ggr. lplz. Entz. ggr. lplhz. + neu. Entz.; ggr. ieInf. ggr.-mgr. lplz. Entz.; ggr. ieInf.; ggr. Epil.; ggr. Lek. mgr. lplz. Entz.; ggr. Zv.; ggr.-mgr. ieInf.; mf. La. mgr.-hgr. lplz. Entz.; ggr. Epil.; mgr. Zv. ggr.-mgr. lplz. + neu. Entz.; hgr. ieInf. ggr.-mgr. lplz. + neu. Entz.; ggr. Epil. n.u. mgr.-hgr. lplz. Entz.; ggr. Epil. obB obB ggr. lplz. Entz. mgr. lplhz. Entz.; ggr. neu. Entz.; ggr. ieInf. mgr. lplz. Entz.; ggr. Fibr. ggr.-mgr. lplz. + neu. Entz.; ggr. Epil.; lymph. A. hgr. lplz. Entz.; mgr. Epil.; ggr. Fibr. obB mgr.-hgr. lplz. Entz.; lymph. A., mgr. Fibr.; ggr. ieInf.; ggr. Epil. mgr.-hgr. lplz. Entz.; ggr. neu. Entz.; ggr. Epil. ggr. mf. lplz. Entz.; ggr.mgr. Fibr. ggr.-mgr. lplz. Entz.; mgr. ieInf. Mischling ggr. lplz. Entz.; ggr.-mgr. eos. + neu. Entz.; ggr. Lek.; ggr. ieInf. Mischling mgr. lymph. A.; ggr. Epil. mgr. lplz. + eos. Entz.; ggr. Epil. Mischling mgr. eos. Entz.; ggr. lplz. ggr. lplz. Entz.; Zv.; ggr. Entz. Lek. Border ggr.-mgr. Fibr.; ggr.-mgr. lplz. + eos. Collie Entz. Mischling ggr. lplz. Entz.; ggr. Fibr.; ggr.-mgr. eos. + neu. mgr. Epil. Entz. Irish Terrier ggr. lplz. + eos. Entz. mgr. lplz. + eos. Entz.; mgr. Epil.; mgr.-hgr. ieInf. Rottweiler ggr. lplz. + eos. + neu hgr. eos. Entz.; ggr. lplz. Entz. ggr. Fibr.; ggr. Epil. Entz.; ggr. ieInf.; ggr. Epil. Mischling ggr. neu. Entz.; ggr. Fibr. ggr. mf. lplhz. Entz. ggr.-mgr. lplz. Entz.; ggr. mf. Kep. n.u. ggr.-mgr. lplz. Entz.; mgr. Kd. mgr. lplz. Entz.; mgr. Fibr.; ggr. Kd. n.u. ggr.-mgr. lplz. Entz.; ggr. Epil.; ggr. Kd. mgr. lplhz. Entz.; ggr. mf. Fibr. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. ggr. lplz. Entz.; ggr. Kd. + Epil. n.u. n.u. n.u. n.u. ggr. lplhz + neu. + eos. Entz. ; ggr. Kd. n.u. n.u. n.u. ggr. lplz. Entz.; ggr. eos. Inf. hgr. Mukussekretion ggr.-mgr. lplhz. Entz.; ggr. ggr. lplz. Entz.; ggr. eos. Entz. Epil. Abkürzungen: DSH = Deutscher Schäferhund; Belg. SH = belgischer Schäferhund; WHWT = West Highland White Terrier; obB = ohne besonderen Befund; ggr. = geringgradig; mgr. = mittelgradig; hgr. = hochgradig f.= fokal, mf. = multifokal; lz. = lymphozytär; lplz. = lymphoplasmazellulär; lplhz. = lymphplasmahistiozytär; neu.= neutrophil; eos. = eosinophil; Inf. = Infiltration; Entz. = Entzündung; Kd.= Kryptdilatationen; Ka. = Kryptabszesse; lymph. A. = vermehrt lymphoide Aggregate; Epil. = Epithelläsionen des oberflächlichen Epithels bzw. des Krypt- oder Drüsenepithels; Kep. = Kryptepithelproliferation; Fibr. = Fibrose; ieInf. =intraepitheliales Lymphozyteninfiltrat; Zv. = Zottenverkürzung; Lek. = Lymphangiektasien; n.u. = nicht untersucht 178 Anhang 9.2 Ergebnisse der eigenen Untersuchungen Tabelle 14: WSAVA-Scores der untersuchten Lokalisationen von Kontroll- und IBD-Hunden Lfd. Nr. Untersuchungs- WSAVA-Score Nr. Magen Duodenum Jejunum Ileum 1 V 614/10 0 0 0 0 0,5 2 V 867/10 0 0 0 0 1 3 V 1180/10 0 0 1 0 0 4 V 1181/10 0 0 0 0 0 5 V 295/10 0 0,5 0,5 0 2 6 V 325/10 n. u. 0 0 n. u. 0 7 S 719/11 0 1 0 0 0 8 S 680/11 0 1 1 1 0 9 S 979/10 0 0,5 1 1 1 10 S 1579/09 0 0 1 0 0 11 S 987/10 0 0 0 0 0 12 S 977/10 2 1 0 0,5 1 13 S 1109/10 0 0 0 0 0 0 Kolon 14 S 1510/10 0,5 0 0 0 15 S 1098/10 0,5 1 0 0 0,5 16 S 997/10 0 0 0 0 0 17 S 307/10 0 0 1 0 1 18 S 1112/10 0 1 0 0 1 19 S 350/10 1 1 0 0 0 1 20 S 1042/10 1 0,5 0 0 21 S 1196/10 0 1 1 0 0,5 22 S 1265/10 0 1 0 0 1 23 S 1336/10 0,5 0 0 0 0 24 S 1363/10 2 0 0 0 0,5 25 E 1573/11 5,5 2,5 n. u. n. u. n. u. 26 E 1853/11 4 2 n. u. n. u. 2 27 E 1993/10 0 4 n. u. n. u. 3 28 E 5763/10 3,5 5 n. u. n. u. n. u. 29 E 1770/11 0 4 n. u. n. u. 2,5 30 E 4307/10 0 4 n. u. n. u. 5 179 Anhang Lfd. Nr. Untersuchungs- WSAVA-Score Nr. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon 31 E 4343/10 n. u. n. u. 32 E 5573/10 6 5,5 n. u. n. u. 2,5 33 E 1042/11 1 2,5 n. u. n. u. 3 34 E 4453/10 1 1 n. u. n. u. n. u. 35 E 2510/10 5 3 n. u. n. u. n. u. 36 E 2068/10 3 4,5 n. u. n. u. n. u. 37 E 1648/10 4,5 6 n. u. n. u. n. u. 38 E 2074/10 8 6,5 n. u. n. u. n. u. 39 E 2225/11 0 6,5 n. u. n. u. 3 40 E 3727/10 7,5 3,5 n. u. n. u. n. u. 41 E 4889/10 5,5 3,5 n. u. n. u. n. u. 42 E 1182/10 2,5 5,5 n. u. n. u. n. u. 43 E 6234/10 4 5 n. u. n. u. n. u. 44 E 3970/10 3 4 5 n. u. 4 45 E 6103/10 1,5 2,5 n. u. n. u. n. u. 46 E 1852/11 2,5 4 n. u. n. u. n. u. 47 E 2281/10 2 8,5 n. u. n. u. n. u. 48 E 3980/10 5 7 1,5 5,5 49 E 5489/10 2 2,5 Abkürzungen: n. u. = nicht untersucht; n. u. n. u. n. u. 3 n. u. n. u. 2 180 Anhang Tabelle 15: Score-Mittelwerte der apikalen und basalen H1R-Expression von Kontroll- und IBD-Hunden Lfd. Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Untersuchungs -Nr. V 614/10 V 867/10 V 1180/10 V 1181/10 V 295/10 V 325/10 S 719/11 S 680/11 S 979/10 S 1579/09 S 987/10 S 977/10 S 1109/10 S 1510/10 S 1098/10 S 997/10 S 307/10 S 1112/10 S 350/10 S 1042/10 S 1196/10 S 1265/10 S 1336/10 S 1363/10 E 1573/11 E 1853/11 E 1993/10 E 5763/10 E 1770/11 E 4307/10 E 4343/10 E 5573/10 E 1042/11 E 4453/10 E 2510/10 E 2068/10 E 1648/10 E 2074/10 E 2225/11 E 3727/10 E 4889/10 E 1182/10 Mittelwerte der Scores der H1R-Expression Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 1,5 1,4 1,7 1,5 0,8 n.u. 1,4 1,1 0,7 1,3 1,6 1,4 1,9 1,3 1,4 1,1 1,4 0,8 2,1 1,3 1,8 1,2 1,5 1,1 2,1 1,4 1,5 2,1 1,9 1,3 1,8 2,3 1,6 1,1 1,4 2 1,4 2,1 1,88 1,8 1,9 1,8 1,2 1,4 1,6 1,7 0,9 n.u. 0,5 1,1 0,2 1 1,7 1,2 1,5 1,5 1,6 1,2 1,2 1,3 1,3 1,4 1,5 1,5 1,3 1,3 2 1,2 1,4 1,9 1,1 1,7 1,6 2,2 1,7 1,7 1,7 1,7 1,5 1,3 2,25 1,7 1,5 1,7 0,9 1,5 1,6 1,4 0,7 0,6 1,2 0,9 1,4 1,1 1,6 1,3 1,3 1,3 1,4 1,9 1,4 1 1,7 1 1,6 1,6 1,7 1,6 2,2 1,7 2,3 2,2 2,0 2,2 2,2 2 2,17 2,2 2 2,2 2,2 2,1 2,5 2,2 2,1 2,3 0,7 1,7 1,4 1,4 0,8 0,8 0,9 0,9 1,5 0,9 1,7 1,7 0,8 1,5 1,1 1,7 1,1 1,2 1,8 0,9 1,7 1,6 1,6 1,2 1,1 n.u. 1,6 n.u. 1,3 1,6 2 1,7 1,88 2,1 1,3 2,17 2,2 1,63 1,6 1,25 1,33 1,25 1,4 1,7 1,4 1,5 0,8 0,4 0,7 1,3 1,3 1,4 2,3 1,4 1,2 1,5 1,6 2 1,2 1,1 1,7 1,5 1,8 1,4 1,6 1,1 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,5 1,6 1,4 1,4 1 0,6 0,6 1,3 1,5 1,4 2,1 1,5 1,8 1,2 1,2 2 1,5 1,3 1,7 1,3 1,9 1,7 1,7 1,1 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,5 1,8 1,6 1,7 0,8 n.u 1,2 0,9 1,7 1,5 1,6 1,7 1,6 1,6 0,8 1,2 1,2 1,5 1,4 1,5 1,5 1,4 1,6 1 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,2 1,8 1,4 1,4 0,80 n.u. 1,3 1,1 1,5 1,1 1,4 1,7 1,7 1,6 0,9 1,6 1,3 1,2 1,3 1,9 1,3 1,6 1,5 1,1 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,4 1,1 1 0,8 0,7 0,7 1,2 0,84 1,5 1,3 1,1 1,4 1,4 1,4 0,6 1,9 1,3 1,5 0,7 1,8 1,5 1,4 1,4 1,4 n.u. 1,9 1,8 n.u. 2,4 2,3 n.u. 1,5 1,9 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2,2 n.u. n.u. n.u. 1,3 1 0,8 0,8 0,5 0,4 1,1 1,5 1,5 1,2 2 1,5 1,5 1,5 0,9 1,9 1,6 2,1 0,7 2,2 1,6 1,6 1,3 1,3 n.u. 1,6 1,7 n.u 2,6 2 n.u. 1,7 2 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 22,2 n.u. n.u. n.u. 181 Anhang Lfd. Nr. 43 44 45 46 47 48 49 Untersuchungs -Nr. E 6234/10 E 3970/10 E 6103/10 E 1852/11 E 2281/10 E 3980/10 E 5489/10 Mittelwerte der Scores der H1R-Expression Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 1,5 1,9 0,7 1,9 2,3 1,8 1,7 1 1,7 1,88 1,75 2,2 1,7 1,4 2,2 2 1,9 1,9 1,7 2,1 2,3 n.u. 2,2 n.u. 1,6 1,4 n.u. 2,67 n.u. 2,6 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2,7 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,9 n.u. n.u. n.u. 1,4 1,8 n.u. 1,8 n.u. n.u. n.u. 1,8 2,3 Abkürzungen: n.u. = nicht untersucht; Tabelle 16: Score-Mittelwerte der apikalen und basalen H2R-Expression von Kontroll- und IBD-Hunden Lfd. Untersuchungs- Mittelwerte der Scores der H2R-Expression Nr. Nr. Magen Duodenum Jejunum Ileum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 V 614/10 V 867/10 V 1180/10 V 1181/10 V 295/10 V 325/10 S 719/11 S 680/11 S 979/10 S 1579/09 S 987/10 S 977/10 S 1109/10 S 1510/10 S 1098/10 S 997/10 S 307/10 S 1112/10 S 350/10 S 1042/10 S 1196/10 S 1265/10 S 1336/10 S 1363/10 E 1573/11 E 1853/11 E 1993/10 E 5763/10 E 1770/11 E 4307/10 Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 0,3 1,3 0,9 1,2 1,1 n.u. 1,4 1 0,5 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 1,1 1,5 1,5 1,2 1,2 0,8 1,3 1 1,7 2 1,6 1,6 1,8 2,2 1,4 0,2 1,1 0,9 0,9 1,5 n.u. 1,4 1,4 0,6 0,4 0,5 0,6 2 0,3 0,6 1,2 1 1,4 1,9 1,5 1,1 1,8 0,8 1,5 1,8 1,9 1,3 0,8 1,8 1,6 0,5 0,8 0,6 0,3 0,2 0,3 1,6 0,7 0,5 0,3 0,6 0,5 0,6 0,5 0,7 1,6 1,4 0,9 1,6 1,4 1 1,5 1,1 0,8 2 1,8 1,5 2,5 2 2,2 0,4 1,3 0,9 0,6 0,6 0,5 1,8 1,1 0,8 0,5 0,9 0,5 1 0,7 0,7 1,14 1,5 1,2 1 1,4 1,3 1,4 1 1 1,8 n.u. 2,3 1,38 2,1 1,7 1,2 0,3 0,7 0,4 0,6 0,3 1,8 1,2 0,4 0 0,6 0,2 0,6 0,8 1,3 1,5 1 1,2 0,9 1,1 1,4 1 1 0,9 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,2 0,8 1,2 0,8 0,9 0,6 2,1 1,4 0,7 0,2 0,7 0,7 1 1,1 1,3 1,9 1,2 1,3 1,4 1,6 1,6 1,6 0,9 1 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,9 0,3 0,7 0,4 0,4 n.u. 1,3 1,3 0,4 0,5 0,6 0,6 0,8 0,3 1,8 1,6 0,5 1,4 1,1 1,4 1,3 1,2 1,5 0,6 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,9 0,7 0,7 0,5 0,7 n.u. 1,4 1,4 0,8 0,6 0,7 1,1 0,9 0,5 1,7 1,9 0,9 1,2 1,1 1,3 1,3 1,7 1,4 0,8 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,7 0,7 0,4 ,4 0,6 0,7 1,9 1,2 0,5 0,5 0,1 0,6 0,7 0,4 0,7 1,3 1,2 1,1 1 1,1 0,9 1 1,2 1 n.u. 1,8 1,5 n.u. 2 1,8 1,1 0,7 0,7 0,7 0,7 0,3 1,8 1,4 0,6 0,9 0,1 0,8 0,8 0,8 1,3 1,4 1,10 1,4 0,9 1,1 0,9 1,3 1,3 1,2 n.u. 1,7 1,9 n.u. 1,8 1,5 182 Anhang Lfd. Untersuchungs- Mittelwerte der Scores der H2R-Expression Nr. Nr. Magen Duodenum Jejunum Ileum 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E 4343/10 E 5573/10 E 1042/11 E 4453/10 E 2510/10 E 2068/10 E 1648/10 E 2074/10 E 2225/11 E 3727/10 E 4889/10 E 1182/10 E 6234/10 E 3970/10 E 6103/10 E 1852/11 E 2281/10 E 3980/10 E 5489/10 Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 1,8 n.u. 2,4 1,3 1,6 1,7 1,4 2,3 1,1 2,5 2 2,1 2,2 0,7 1,9 2,3 1,9 1,7 1,6 1,3 n.u. 2,2 1 1,8 1,7 1 1,8 0,8 1,2 1,5 1,9 2,4 2,1 1,88 1,9 1,5 1,4 1,8 2,1 1,8 2,3 2,2 2,1 2,1 2,6 2,2 2,1 2 2,1 2 2,2 1,7 0,6 2,5 2 1,4 2,4 1,3 1,63 1,5 1,9 1,9 1,4 2,3 1,5 1,8 1,4 1,38 1,6 1,67 2,6 n.u. 2,5 1,9 0,75 2,5 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2,2 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2,2 1,7 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 2,1 n.u. n.u. n.u. n.u. 2 n.u. n.u. n.u. 1,3 2,3 n.u. 2,4 2,17 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,6 n.u. n.u. n.u. n.u. 2 n.u. n.u. n.u. 1,3 2,2 Abkürzungen: n.u. = nicht untersucht Tabelle 17: Score-Mittelwerte der apikalen und basalen H4R-Expression von Kontroll- und IBD-Hunden Lfd. Untersuchungs- Mittelwerte der Scores der H4R-Expression Magen Duodenum Jejunum Ileum Nr. Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 V 614/10 V 867/10 V 1180/10 V 1181/10 V 295/10 V 325/10 S 719/11 S 680/11 S 979/10 S 1579/09 S 987/10 S 977/10 S 1109/10 S 1510/10 S 1098/10 S 997/10 S 307/10 S 1112/10 Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 0,7 0,8 0,8 0,5 0,1 n.u. 0,6 0,5 1,1 0,8 0,7 0,7 0,9 0,5 1,3 0,5 0,4 0,51 1 0,4 0,9 0,6 0,4 n.u. 0,7 0,6 0,7 1,3 1,1 1,2 1,1 1,4 1,2 1,1 1,4 0,8 0,4 0,3 0,4 0,3 0,3 0,2 0,6 0,4 0,7 0,6 1 0,6 0,5 0,5 0,7 0,5 0,4 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,7 0,3 1,1 0,8 1,3 1 0,7 1 1,1 0,6 0,7 0,6 0 0,2 0,4 0,4 0,2 0,1 0,6 0,8 0,9 0,7 1,3 0,9 0,5 0,3 0,3 0,2 0 0,5 0,3 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,5 0,6 1,4 0,8 1,2 1,3 0,9 0,6 0,7 0,3 0,3 0,6 0,4 0,6 0,3 0,3 0,3 n.u. 0,8 0,3 0,7 0,7 0,8 0,7 0,7 0,5 0,4 0,2 0,2 0,7 0,3 0,4 0,2 0,1 0,3 n.u. 0,8 0,3 0,5 0,7 1 1,1 0,6 0,6 0,9 0,3 0,5 0,8 0,5 0,1 0,4 0,4 0,2 0,1 1 1,2 0,3 1,1 0,7 0,8 0,4 0,2 0,5 0,6 0,5 1,1 0,2 0,2 0,2 0,1 0,3 0,2 0,9 0,5 0,5 0,8 0,6 0,9 0,3 0,3 0,6 0,7 0,5 1,3 183 Anhang Lfd. Untersuchungs- Mittelwerte der Scores der H4R-Expression Nr. Nr. Magen Duodenum Jejunum Ileum 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 S 350/10 S 1042/10 S 1196/10 S 1265/10 S 1336/10 S 1363/10 E 1573/11 E 1853/11 E 1993/10 E 5763/10 E 1770/11 E 4307/10 E 4343/10 E 5573/10 E 1042/11 E 4453/10 E 2510/10 E 2068/10 E 1648/10 E 2074/10 E 2225/11 E 3727/10 E 4889/10 E 1182/10 E 6234/10 E 3970/10 E 6103/10 E 1852/11 E 2281/10 E 3980/10 E 5489/10 Kolon Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal Apikal Basal 0,4 1 1,3 0,4 1,1 0,6 1,3 1,4 1,2 1,2 1,6 1 1,2 1,8 0,9 1,2 1,2 1,6 1 1,5 1,83 0,8 1,3 1,2 0,9 0,7 1,1 1,6 0,7 0,8 1,3 1,4 1,6 1,5 1,2 1,2 1,1 0,5 1,5 1,1 0,7 1,2 1,2 1 1,75 1,5 1,3 0,9 1,5 0,5 0,6 1,33 0,3 0,9 1,3 1,1 0,7 1,7 1,4 0,88 0,8 1,2 0,2 0,5 0,9 0,6 0 0,1 0,7 1,7 0,3 1,1 2,0 0,6 1,6 1,4 0,9 1,1 1,2 1,1 1,1 0,5 1,2 1,2 1 0,9 0,6 1,5 0,9 0,9 0,5 0,75 1,5 0,8 0,8 0,9 1,5 0,4 0,7 0,3 n.u. 0,25 0,5 0,7 0,13 0,5 0,75 0,5 0,8 1 0,33 1 0,13 0,63 0,83 0,25 0,63 n.u. 1,1 n.u. 0,5 0,4 0,25 0,88 1 1 1,2 0,3 0,3 0,4 n.u. n.u. 0,6 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,9 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,8 1,3 0,9 0,5 0,3 0,6 n.u. n.u. 0,6 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 1,2 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,4 0,9 0,6 0,5 0,3 0,4 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,6 1 1,3 1,2 0,2 0,3 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,6 0,9 0,7 0 0,7 0,5 n.u. 0,9 n.u. n.u. 1,4 0,6 n.u. 1,4 0,5 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,6 n.u. n.u. n.u. n.u. 1,1 n.u. n.u. n.u. 1 1 0,7 0,7 1,2 0,3 0,9 0,4 n.u. 1,2. n.u. n.u. 1,2 0,5 n.u. 1,3 0,7 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. 0,6 n.u. n.u. n.u. n.u. 1 n.u. n.u. n.u. 0,6 1 Abkürzungen: n.u. = nicht untersucht 184 Anhang 9.3 Angaben zu den Ergebnissen der statistischen Untersuchungen Tabelle 18: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich der Kontrollhunde für Histaminrezeptor 1 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Histaminrezeptor 1 Wert für die apikale Expression Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere – alte Tiere Gruppenvergleich 0,8861 0,3443 0,7131 0,9264 0,5982 0,1423 0,2153 0,6714 0,5795 0,3558 0,6704 0,1898 0,1012 0,8248 0,077 0,4743 0,2058 0,0357 0,0965 0,5232 0,3398 0,462 1 0,3976 0,0767 0,5566 0,2051 0,7688 0,7656 0,1822 1 0,9412 0,6556 0,6059 0,5527 0,8774 Histaminrezeptor 1 Wert für die basale Expression alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere – alte Tiere 0,4686 0,0052 0,0141 0,0417 0,0497 0,7597 0,2492 1 0,8231 0,1412 0,0874 0,7049 0,458 0,3052 0,2427 0,5912 0,2636 0,8825 0,9263 0,358 0,1932 0,9163 0,6565 1 0,832 0,3991 0,8827 0,14 0,5011 0,3353 0,0219 0,021 0,0159 1 0,4169 0,6039 alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant Tabelle 19: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich der Kontrollhunde für Histaminrezeptor 2 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Histaminrezeptor 2 Wert für die apikale Expression Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere – alte Tiere 0,3377 0,1489 Gruppenvergleich Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere– alte Tiere alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon 0,6004 0,3088 0,7125 0,2888 0,9263 0,2463 0,195 0,3591 0,3443 0,5607 <0,0001 0,184 0,0029 0,027 0,0229 0,0021 0,605 1 0,915 0,7533 0,5993 0,8335 0,0024 0,056 0,0782 0,2302 0,209 0,5042 0,007 0,01 0,0777 0,5071 1 0,0892 Histaminrezeptor 2 Wert für die basale Expression alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon 0,3284 0,06 0,8335 1 0,1399 1 0,0654 0,2121 0,312 0,4621 0,0134 0,5993 0,2102 0,0256 0,9268 0,3131 0,0188 0,6723 0,3015 0,5065 0,1653 0,1363 0,0079 0,5296 0,3758 1 0,6404 0,03 0,0071 1 0,6574 0,3725 <0,0001 0,6058 0,0095 0,0104 Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant 185 Anhang Tabelle 20: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich der Kontrolltiere für Histaminrezeptor 4 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere – alte Tiere Gruppenvergleich Beagle - junge Tiere Beagle - mittelalte Tiere Beagle - alte Tiere junge Tiere - mittelalte Tiere junge Tiere - alte Tiere mittelalte Tiere – alte Tiere Histaminrezeptor 4 Wert für die apikale Expression alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon 0,6704 0,0118 0,0078 0,0652 0,0349 0,0014 0,5947 0,0069 0,165 0,3383 0,1148 0,0031 0,825 0,5995 0,0904 0,3812 0,0318 0,005 1 0,4521 0,7533 0,1945 0,1437 0,0099 0,6054 0,0887 0,2709 0,237 0,2377 0,9134 0,6579 0,1573 0,4567 0,9421 0,3758 Histaminrezeptor 4 Wert für die basale Expression <0,0001 alle Lok. Magen Duodenum Jejunum Ileum Kolon <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,2463 0,0114 0,0101 0,1363 0,0393 0,4089 0,1122 0,0086 0,0217 1 0,8243 0,4599 0,0895 0,1591 0,4636 0,074 0,3367 0,6034 0,0345 0,0339 0,0391 0,9163 0,8253 1 0,0066 0,0109 0,0026 0,6723 0,8827 0,3738 0,6747 0,602 0,8549 Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant Tabelle 21: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich für den WSAVAScore (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE WSAVA-Score alle Lok. Magen Duodenum Kolon <0,0001 <0,0001 0,0002 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,9692 0,7925 0,4456 0,0043 1 Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant 186 Anhang Tabelle 22: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich Histaminrezeptor 1 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Altersgruppen Histaminrezeptor Expression alle Lok. 1 Magen Wert für die Duodenum Gruppenvergleich < 0,0001 0,0133 <0,0001 Kontrolltiere ohne <0,0001 0,0193 <0,0001 Beagle und junge <0,0001 0,0807 0,0004 Tiere 0,449 0,6981 0,3533 Histaminrezeptor 1 Wert für die basale Altersgruppen Expression Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE < 0,0001 Kontrolltiere ohne 0,0003 Beagle und junge < 0,0001 Tiere 0,2983 alle Lok. für den apikale Kolon 0,0016 0,0015 - Magen Duodenum Kolon 0,0039 0,0056 0,0158 0,9766 0,0591 0,0826 0,1977 0,693 0,0067 0,0167 - Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; - = nicht untersucht aufgrund geringer Anzahl der Ausgangswerte; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant 187 Anhang Tabelle 23: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich Histaminrezeptor 2 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Altersgruppen für den Histaminrezeptor 2 Wert für die apikale Expression alle Lok. Magen Duodenum Gruppenvergleich <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 alle Gruppen <0,0001 0,0007 0,0009 0,8049 0,6191 0,3935 n.u. n.u. nur junge und n.u. 0,0001 0,0001 mittelalte Kontroll- <0,0001 und IBD-Tiere <0,0001 0,0038 0,0074 (< 8 Jahre) 0,014 0,2215 0,5701 <0,0001 0,0485 0,0044 nur alte Kontroll0,0784 0,1232 0,0042 und IBD-Tiere 0,1155 (> 8 Jahre) 0,6866 Histaminrezeptor 2 Wert für die basale Altersgruppen Expression Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE <0,0001 <0,0001 alle Gruppen <0,0001 0,0183 nur junge und n.u. mittelalte Kontroll- <0,0001 und IBD-Tiere <0,0001 (< 8 Jahre) 0,4392 0,0286 nur alte Kontroll0,0784 und IBD-Tiere 0,1155 (> 8 Jahre) 0,6866 alle Lok. Kolon <0,0001 <0,0001 n.u. 0,0056 - Magen Duodenum Kolon 0,0015 0,0272 0,0011 0,6399 n.u. 0,0157 0,005 0,034 0,907 0,6574 - <0,0001 <0,0001 0,0019 0,2153 n.u. 0,0007 0,0058 0,2114 0,1024 0,038 - <0,0001 0,0001 n.u. 0,0056 - Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; - = nicht untersucht aufgrund geringer Anzahl der Ausgangswerte; n.u. = nicht untersucht; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant 188 Anhang Tabelle 24: Darstellung der p-Werte im Gruppenvergleich Histaminrezeptor 4 (Wilcoxon-Rangsummen-Test) Gruppenvergleich Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Altersgruppen für den Histaminrezeptor 4 Wert für die apikale Expression alle Lok. Magen Duodenum Gruppenvergleich <0,0001 0,0009 <0,0001 Kontrollgruppe <0,0001 0,0006 0,0002 ohne Beagle und <0,0001 0,0635 0,0034 junge Tiere 0,1086 0,0684 0,2918 0,0018 <0,0001 nur mittelalte und <0,0001 0,0015 <0,0001 alte Kontroll- und <0,0001 IBD-Tiere <0,0001 0,0936 0,0068 (> 4 Jahre) 0,1232 0,1562 0,4059 Histaminrezeptor 4 Wert für die basale Altersgruppen Expression Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE Kontrolle-IBD Kontrolle-LPE Kontrolle-EGE LPE-EGE 0,9615 Kontrollgruppe 0,6767 ohne Beagle und 0,4184 junge Tiere 0,3327 nur mittelalte und 0,9559 alte Kontroll- und 0,7977 IBD-Tiere 0,5863 (> 4 Jahre) 0,5035 alle Lok. Kolon 0,0243 0,1437 0,0375 0,2515 - Magen Duodenum Kolon 0,2102 0,2217 0,4134 0,7703 0,2281 0,2506 0,4489 0,9341 0,0218 0,0221 0,2017 0,5785 0,0518 0,0573 0,276 0,8159 0,1481 0,2318 0,2286 0,3974 - Abkürzungen/Legende: Lok. = Lokalisation; - = nicht untersucht aufgrund geringer Anzahl der Ausgangswerte; n.u. = nicht untersucht; weiße Felder = nicht signifikant; hellgraue Felder = statistische Tendenzen; mittelgraue Felder = signifikant; dunkelgraue Felder = hochsignifikant Anhang 189 Tabelle 25: Darstellung der Korrelationskoeffizienten und p-Werte Variablenvergleich für die Histaminrezeptoren 1, 2 und (Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman) im 4 H1R Apikaler Expressionsscore Basaler Expressionsscore H2R Apikaler Expressionsscore Basaler Expressionsscore H4R Apikaler Expressionsscore Basaler Expressionsscore Korrelationskoeffizient p-Wert Korrelationskoeffizient p-Wert Korrelationskoeffizient p-Wert Korrelationskoeffizient p-Wert Korrelationskoeffizient p-Wert Korrelationskoeffizient p-Wert Magen WSAVAScore 0,44939 Duodenum WSAVAScore 0,62153 Kolon WSAVAScore 0,60642 0,0007 0,32967 <0,0001 0,37031 <0,0001 0,62239 0,0159 0,64288 0,0081 0,71117 <0,0001 0,45538 <0,0001 0,41224 <0,0001 0,61658 0,0060 0,44716 <0,0001 0,38937 <0,0001 0,56658 0,0071 0,33524 0,00400 -0,06259 <0,0001 -0,10054 0,0490 0,38140 0,6562 0,4782 0,0238 Abkürzungen/Legende: mittelgraue Felder = signifikant; 190 Anhang 9.4 Angaben zur in situ-Hybridisierung Tabelle 26: Auflistung der mittels in situ-Hybridisierung untersuchten Hunde Gruppenbezeichnung Kontrollgruppe LPE EGE IBD-Gruppe Lfd. Nummer 7, 9, 10, 13, 16, 17, 19, 22, 23 27, 30, 33 44, 48, 49 Lokalisationen Duodenum, Kolon Duodenum, Kolon Abkürzungen: LPE = lymphoplasmazelluläre Entzündung; EGE = eosinophile Gastroenteritis; Tabelle 27: Ergebnisse der dreimalig durchgeführten in situ-Hybridisierung mit T7-Sonde gegen H4R-mRNA Lfd. LokaliNr. sation 7 Duod. Kolon 9 Duod. Kolon 10 Duod. Kolon 13 Duod. Kolon 16 Duod. Kolon 17 Duod. Kolon 19 Duod. Kolon 22 Duod. Kolon 23 Duod. Kolon 27 Duod. Kolon 30 Duod. Kolon 33 Duod. Kolon 44 Duod. Kolon 48 Duod. Kolon 49 Duod. Kolon in situHybrid. 1 + + (+) + ? ? + + + ? ? + + + ? + + ? ? - in situHybrid. 2 + + + + + + + + + + + ? + + + + (+) ? ? ? ? ? ? (+) (+) in situHybrid. 3 n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. + (+) (+) ? ? ? + + Lokalisation des Signals Enteroz., (LPIZ), PSM Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., (LPIZ) Enteroz., LPIZ Enteroz., (LPIZ), PSM Enteroz., LPIZ Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., (LPIZ), PSM Enteroz., LPIZ Enteroz., LPIZ Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., LPIZ, PSM Enteroz., LPIZ LPIZ LPIZ LPIZ, (Enteroz.) (LPIZ) (LPIZ) (LPIZ), (Enterozyten) (LPIZ) Abkürzungsverzeichnis: lfd. Nr. = laufende Nr.; Duod. = Duodenum; + =positiv, (+) = schwach positiv; = negativ; ? = fraglich positiv; n.u. = nicht untersucht; Enteroz. = Enterozyten; LPIZ = Lamina propriaImmunzellen; PSM = Plexus submucosus; (LPIZ) = schwache Expression der Lamina propriaImmunzellen; (Enteroz.) =schwache Expression der Enterozyten Anhang 191 9.5 Färbeprotokoll der HE-Färbung im Färbegerät (Leica ST4040) 1.) Entparaffinieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: je 5 Minuten Roticlear® 1 bis 3 und Isopropanol, nachfolgend Ethanol (96%, 70% und 50%ig) für 2-3 Minuten, dann Spülen mit Aqua dest. 2.) Behandlung mit Hämalaun nach Mayer für 6 Minuten, nachfolgend Spülen mit Aqua dest. 3.) Behandlung mit 1%igem Eosin für 1 Minute, nachfolgend Spülen mit Aqua dest. 4.) Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: je 2-3 Minuten 70%iges und 96%iges Ethanol, nachfolgend 5 Minuten Isopropanol und jeweils 5 Minuten in EBE (Essigsäurebutylester) 1 bis 3 5.) Eindecken der Schnitte mittels Roti®-Histokit II 9.6 Lösungen und Materialien für die in situ-Hybridisierung Aqua bidest mit Dieethylpyrokarbonat (DEPC): 1 ml DEPC ad 1000 ml Aqua bidest.; über Nacht rühren, im Anschluss autoklavieren; Trishydroxymethylammoniumethan (TRIS) 1 M: 12,11 g auf 100 ml Aqua bidest. Mit HCl auf pH 8 einstellen Calciumchlorid-2hydrat (CaCl2) 0,1 M: 1,47 g auf 100 ml Aqua bidest. 20,33 g auf 100 ml Aqua bidest. Natriumchlorid (NaCl): für 5 M: 29,22 g auf 100 ml Aqua bidest. für 3 M: 17,53 g auf 100 ml Aqua bidest. Salzsäure (HCl) 0,2 N: 50 ml 2N HCl auf 450 ml Aqua bidest. Natronlauge (NaOH) 5 M: 20 NaOH-Plätzchen auf 100 ml Aqua bidest. Anhang 192 EDTA-Na2 0,5 M: 18,6 g Di-Natrium-EDTA-Dihydrat auf 60 ml Aqua bidest./DEPC mit HCl auf pH 8 einstellen, ad 100 ml Aqua bidest./DEPC., autoklavieren Piperazin-N, N´bis[2-ethansulafat]-Säure (PIPES) 0,5 M: 8,6575 g auf 50 ml Aqua bidest. Phosphat-gepuffertes Natrium (PBS): 10xPBS: 80,0 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 ad 1000 ml Aqua bidest, autoklavieren 1xPBS: 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,88 Na2HPO4, 0,48 g KH2PO4 ad 2000 ml Aqua bidest, mit NaOH auf pH 7,4 einstellen, autoklavieren Standard Saline Citrate (SSC): 20xSSC: 175,3 g NaCl, 88,2 g Na-Citrat ad 800 ml Aqua bidest., mit HCl auf pH 7,0 einstellen, ad 1000 ml Aqua bidest auffüllen, autoklavieren Puffer 1: 12,11 g TRIS, 8,77 g NaCl ad 1000 ml Aqua bidest., mit HCl auf pH 7,5 einstellen, autoklavieren Puffer 3: 12,11 g TRIS, 5,84 g NaCl ad 1000 ml Aqua bidest., mit HCl auf pH 9,5 einstellen, autoklavieren, vor Verwendung Zugabe von MgCl2-Hexahydrat (1,025 g auf 100 ml Puffer 3) Puffer 4: 12,11 g TRIS, 0,37 g EDTA ad 1000 ml Aqua bidest., mit HCl auf pH 8,0 einstellen, autoklavieren 1xPBS+5 mM MgCl2: zur Reaktion frisch ansetzten: 6 ml 10xPBS, 0,3 ml 1 M MgCl ad 60 ml Aqua bidest/DEPC 2xSSC+5 mM EDTA-Na2: Aqua bidest. vorlegen, 5 ml 0,5 M EDTA-Na2, 50 ml 20xSSC ad 500 ml Aqua bidest. 0,2%iges Glycin in 1xPBS: 1 g Glycin, 500 ml 1xPBS pH 7,4, autoklavieren Anhang 193 4%iges Paraformaldehyd (PFA): 20 g Paraformaldehyd in 400 ml 1xPBS lösen (bei 60°C-70°C auf Magnetrührer), pH 7,35-7,4 einstellen, mit 1xPBS auf 500 ml auffüllen 50xDenhardts: 5 g Ficoll, 5g Polyvenylpyrolidone, 5 g BSA ad 500 ml ad 500 ml steriles Aqua bidest., aliquotieren 20xHybridisierungssalze: 10 ml 0,5 M EDTA pH8, 10 ml 0,5 M PIPES pH 7,0, 30 ml 5 M NaCl Prähybridisierungsmix: 450 ml 20xSCC, 675 ml deionisiertes, 100%iges Formamid, 150 ml 50xDenhardts, 210 ml Aqua bidest./DEPC, Hybridisierungsmix: 16 ml deionisiertes, 100%iges Formamid, 8 ml Hybridisierungssalze, 3,2 ml 50xDenhardts, 320 µl Heparin, 320 µl 10% Triton X-100 (autoklaviert und verdünnt); aliquotieren; Single strang-DNA (ss-DNA): in 25 ml Puffer 4 pH 8 lösen, Endkonzentration: 10mg/ml RNA: Stammlösung mit Aqua bidest. DEPC herstellen, 250 mg mit 25 ml Aqua bidest./DEPC versetzen, Endkonzentration: 10 mg/ml Proteinase K: Herstellen der Stammlösung durch 10 mM TRIS-HCl pH 7,5 Nitrotetrazoliumchlorid (NBT): 1 g NBT ad 13,3 ml 70%iges Dimethylformamid, Konzentration der Stammlösung: 75 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat): Herstellen der Stammlösung mit 500 mg X-Phosphat ad 10 ml 100%iges Dimethylformamid Dimethylformamid: 70%iges Dimethylformamid: 14 ml Dimethylformamid, 6 ml Aqua bidest. Anhang 9.7 Bezugsquellen für Antikörper, Kits, Materialien, Geräte und Chemikalien Abcam, Cambrigde, UK Goat polyclonal to HRH1, Art.-Nr.: ab78224 Acris Antibodies GmbH, Herford Polyclonal Antibody to Histamine H4 receptor, Art.-Nr.: AP31136PU-N Biocyc GmbH & Co KG, Luckenwalde ProTaqs Citrat-Puffer-Konzentrat, Art.-Nr.: 400300692 Bauknecht Hausgeräte GmbH, Stuttgart Mikrowelle MWS 2924 Brand GmbH & Co KG, Wertheim Pipettenspitzen, Art.-Nr. 702504 Carl Zeiss AG, Oberkochen Standard Binokular Lichtmikroskop; Typ Axioplan, Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark Dako Pen, Art.-Nr.: S2002 Dako North America Inc., Carpinteria CA, USA Dako Gycergel Mounting Medium, Art.-Nr.: C0563 AEC+ High Sensitivity Substrate Chromogen Ready-to-use; Art.-Nr.: K3469 Engelbrecht Medizin- und Labortechnik GmbH, Edermünde Automat-Star Deckgläser für Mikroskopie; Art.-Nr.: K12440a1,0 Fluka Chemica, Buchs: Essigsäureanhydrid, Art.-Nr.: 45830 Paraformaldehyd, Art.-Nr.: 76240 Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig Menzel-Gläser Superfrost® Plus Objektträger GFL-Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel Paraffinstreckbad 1052 Leica Biosystem GmbH, Nussloch Lineares Färbegerät Leica ST 4040 194 Anhang Invitrogen™ Life Technologies GmbH, Darmstadt TOPO TA Cloning Kit mit pCR™4-TOPO®-Vektor ; Art.-Nr.: K457501 Lonza, Rockland, ME USA GelBond® Film, Art.-Nr.: 53748 (bezogen über Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Art.-Nr.: 863748) Macherey und Nagel GmbH und Co KG, Düren NucleoSpin® Extract II; Art.-Nr.:740609.50 NucleoSpin® Plasmid Kit; Art.-Nr.: 740588.10 Marabu GmbH & Co KG, Bietigheim-Bissingen Fixogum, Art.-Nr.: 2901 17 000 Merck KGaA, Darmstadt Calciumchlorid-2hydrat, Art.-Nr.: 1.02382.0500 Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, Art.-Nr.: 1.06580.1000 Formamide, Art.-Nr.: 1.09684.2500 Glycin, Art.-Nr.: 1.4201.1000 Hydrogen peroxide, Art.-Nr.: 1.07209.0250 Kaliumchlorid, Art.-Nr.:1.04936.0250 Kaliumhydrogenphosphat, Art.-Nr. 1.04873.0250 Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Art.-Nr.: 1.05833.0250 Natriumchlorid, Art.-Nr. 1.06404.1000 Natronlauge, Art.-Nr.: 1.09137.1000 Salzsäure, Art.-Nr.: 1.09063.1000 Triethanolamine, Art.-Nr.: 1.08379.0250 Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Art.-Nr. 1.08386.1000 Triton®-X 100; Art.-Nr.: 1.08603.1000 Microm International, Walldorf Bandmikrotom HM 350 MP Biomedicals Europe, Illkirch Formamide deionized, Art.-Nr.: FORMD002 Müller Ratiolab®, Dreieich Pipettenspitzen, Art.-Nr.: 210060 New England BiolLabs GmbH, Frankfurt am Main NEB 5-alpha Competent E.coli; Art.-Nr.: C2987H 195 Anhang 196 NOBA Verbandmittel Danz GmbH und Co KG, Wetter NOBAGLOVE®-Latex; Art.-Nr.:REF905451, PZN0598339 Novus Biologicals LLC, Littelton, CO, USA HRH2 Antibody, Art.-Nr.: NB600-812 HRH2 Peptide, Art.-Nr.: NB600-812PEP HRH1 Peptide, Art.-Nr.: NB600-795PEP Histamine H4 Receptor Antibody, Art.-Nr.: NLS6816 Olympus Europa Holding GmbH, Hamburg Fotomikroskop Olympus BX 51 Software „Cell^D“ (Version) Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Nanodrop ND 1000 UV-Spektralphotometer Quiagen GmbH, Hilden RNeasy Mini Kit, Art.-Nr.: 74104 Omniscript® RT Kit; Art.: 205110 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments, Art.-Nr.: 11 093 274 910 DIG RNA Labelling-Mix; Art.-Nr.:11277073910 T3 Polymerase, Art.-Nr.: 11031163001 T7 Polymerase, Art.-Nr.: 10881767001 Proteinase K, recombinant PCR Grade; Art.-Nr.: 03 115 828 001 RNase T1, Art.-Nr.: 10 109 193 001 RNase A, DNase-free, Art.-Nr.: 11 119 915 001 Roth, Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe 2-Propanol, Art.-Nr.: 9866.4 Agar-Agar; Art-Nr. 2266.1 DEPC; Art.-Nr.: K028.2 Ethanol vergällt, Art.-Nr.: K928.2 Roti®-Histol, Art.-Nr.: 6640.2 Ti-Natrium-Di-Hydrat, Art.-Nr.: 3580.1 Mikrozentrifuge SD 6000 rpm, Art.-Nr.: 053094 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt, Art.-Nr.: B66777-500MG Ampicillin; Art.-Nr.: A9518-5G BSA, Art.-Nr.: A2153-10G Anhang 197 Desoxyribonucleic acid sodium salt, from herring testes, Art.-Nr.: D6898250MG Dextran sulfate sulfate sodium salt from Leuconostoc spp., Art.-Nr.: D890510G Dimethylformamide, Art.-Nr.: D4254 Ficoll, Art.-Nr.: F2637-25G Levamisol, Art.-Nr.: L-9756 Neutrales steriles Schafserum, Art.-Nr.: S2263 Nitrotetrazolium Blue chloride, Art.-Nr.: N6639-1G PIPES (Piperazine-N,N´-bis[2-ethansulfonsäure]), Art.-Nr.: P-3768 Polyvenylpyrolidone, P-5288 Ribonucleic acid from calf liver, Art.-Nr.: R7250-250MG Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg Di-Natrium-EDTA-Di-hydrat, Art.-Nr.: 11280.02 Thermo Scientific, Anatomical Pathology International, Astmoor, United Kingdom bzw. Thermo Scientific Inc.; Heidelberg Heraeus Wärmeschrank UT6, Art.-Nr.:50042297 Heraeus Wärmeschrank ST6200 (Wärmeschrank zur Sterilisation) Paraplast Plus® Paraffin Pathcenter (Gewebeeinbettautomat) Shandon Coverplate™, Art.-Nr.: 72110017 Shandon Sequenza® Slide Rack, Art.-Nr.: 7331017 Superfrost® Plus Objektträger, Art.-Nr.: J1800AMNZ Vector Laboratories, Inc.; Burlingame CA, USA: Zweitanikörper Horse anti-Goat biotylinisiert Art.-Nr.: BA-9500 (über Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Kronshagen) Zweitantikörper Goat anti-Rabbit biotylinisiert, Art.-Nr.: BA-1000 (über Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Kronshagen) Vectastain® ABC Kit (über Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Kronshagen) Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen: Eismaschine ZBE 70-35 198 199 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bedanken bei… … Frau Prof. Hewicker-Trautwein für die Überlassung des Themas, die umsichtige Betreuung und Begleitung dieser Arbeit, die Unterstützung und den wissenschaftlichen Austausch auch in schwierigen Phasen sowie nicht zuletzt für eine angenehme Atmosphäre in der Arbeitsgruppe Immunpathologie. … Herrn Prof. Baumgärtner für die Bereitstellung des Labors, des Know-hows seiner Mitarbeiter und der Sonde gegen das kanine Staupevirus. … Kerstin Hahn und Andre Habierski für das Bauen der anti-H4R-Sonde…vielen, vielen, vielen Dank! Und was für ein schönes Signal… … Herrn Prof. Bäumer und Frau Dr. Roßbach für die wissenschaftliche Diskussion und die pharmakologische Perspektive des H4R-Problems. … Klaus Kuhlmann, Bettina Buck und Danuta Waschke für Geduld, gute Tipps und das Einweisen in die Geheimnisse von Paraffinschnitten, Immunhistochemie und in situHybridisierung. … Herrn Dr. Rohn für die Beratung bei statistischen Fragen und ISP für seine Gedanken zur Korrelation. … meinen Büronachbarn und Freunden Sofie, Ina und Nikki sowie dem Schmidtchen für schöne Zeiten Tür an Tür und nette Abende auch außerhalb der Patho. … meinen lieben Kolleginnen, Kollegen und Freunden Charlotte, Steffi, Andre, Patricia, Anna, Susi, Kerstin, MEY, MAK, NJU, FRS, AKD, AKU, MKU….und allen die an dieser Stelle nicht namentlich genannt wurden für gute Zusammenarbeit, Mensagänge und das ein oder andere Entspannungs- und Besprechungskäffchen zwischendurch. … meinen Freunden aus Schulzeit, Studium und Arbeitsleben, ganz besonders Mattie, Katja, Birte, Ana, Katharina und Katrin, für die gemeinsame Zeit und viele schöne Momente. … Nico, dafür dass es dich gibt! … meinen Eltern und meiner Familie für das Daumendrücken, den Rückhalt und Trost und für ganz viel Zuversicht während des gesamten Studiums und v.a. während meiner Zeit an der Pathologie. Hannover 2013 Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375 E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de Ulrike Schwittlick ISBN 978-3-86345-190-5
