Die Institute Institut für Molekulare Virologie

Die Institute
Institut für Molekulare Virologie
Institute of Molecular Virology
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Volker Erfle)
ie Bedeutung von Infektionen im
allgemeinen, und besonders die von
Virusinfektionen, für bestimmte wichtige Erkrankungen des Menschen nimmt zu
als Folge der weit reichenden Veränderungen
unserer Lebensumstände. Zum einen handelt
es sich um Infektionen mit Erregern, die
Krankheiten wie AIDS und BSE auslösen.
Zum andern spielen veränderte Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtsorganismus unter neuen Umweltbelastungen oder
bei der Anwendung neuer Therapien eine
Rolle. Die Schwerpunkte der Arbeiten liegen
daher in der Aufklärung von Mechanismen
der Virus-Persistenz, der Virus-Vermehrung
und der Krankheitsentstehung durch VirusInfektionen vor dem Hintergrund sich verändernder Belastungen des Wirtsorganismus.
Auf der Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse werden neue diagnostische und
therapeutische Konzepte entwickelt. Das
Wissen um die Strategien, mit denen Viren
und Zellen interagieren und dabei den
zellulären Stoffwechsel und das Immunsystem beeinflussen, bietet zudem einen Ausgangspunkt, Viren oder Virus-Bestandteile
als Werkzeuge für die Immun- und Gentherapie zu verwenden.
D
Ziele der derzeitigen Arbeiten sind
• Beschreibung der Einflüsse retroviraler
Kontrollgene und -elemente auf die Steuerung zellulärer Prozesse.
• Aufklärung zellulärer Mechanismen,
die die Replikation von Retroviren beeinflussen („antivirale Faktoren“).
• Entwicklung und Anwendung viraler
Vektoren für Immunprophylaxe und
-therapie mit Schwerpunkt Vaccinia Virus
Vektoren.
he importance of infections,
particularly of viral infections, for the
development of major human
diseases is increasing as a result of the farreaching changes taking place in our way
of life. On the one hand there are infections
with pathogenic agents that trigger
diseases like AIDS or BSE. On the other,
changes in the interaction between viruses
and host organisms as a result of environmental pollution or the application of new
therapies in medicine also play a role.
Therefore, research in the Institute of Molecular Virology is focused on mechanisms
of viral persistence, viral replication, and
the development of disease following virus
infections, as they relate to the changing
burden on the host organism. The results
obtained will be used to develop new
diagnostic and therapeutic concepts.
The knowledge of the strategies with which
viruses and cells interact and influence
cellular pathways and the immune system
will provide a basis for the use of viruses
or parts of them as tools for immune and
gene therapy.
Current research focuses on the following.
• Description of the effects of retroviral
control genes and elements on cellular
regulation processes
• Elucidation of the cellular mechanisms
that control retroviral replication
(antiviral factors)
• Development and application of viral
vectors in immunoprophylaxis and
therapy with a special emphasis on
Vaccinia virus vectors
• Evaluation of specific immune responses
in viral infections and after vaccination
and immune therapy (immunomonitoring)
T
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• Untersuchung der spezifischen Immunantworten bei Virus-Infektion und nach Vakzinierung und Immuntherapie (Immunmonitoring).
Im Rahmen des Helmholtz (HGF) Forschungsbereichs „Gesundheit“ integriert
sich das Institut in das Programm „Infektion
& Immunität“ und kooperiert mit anderen
HGF-Einrichtungen u.a. auf den Gebieten
„Pathogenese“, „Mikroorganismen“ und
„Prävention & Therapie“. Weitere Zusammenarbeiten bestehen im Rahmen der Programme „Vergleichende Genomforschung“,
„Umweltbedingte Störungen der Gesundheit“ und „Krebsforschung“ des HGF-Forschungsbereichs „Gesundheit“.
Die Arbeiten im Institut werden federführend von PD Dr. Ruth Brack-Werner,
Dr. I. Drexler, Prof. Dr. C. Leib-Mösch und
Prof. Dr. V. Erfle durchgeführt.
Zum Jahresende waren im Institut
18 Wissenschaftler, 7 technische Mitarbeiter
und 13 Doktoranden beschäftigt. 11 der
MitarbeiterInnen wurden über Drittmittel
finanziert.
Neue Erkenntnisse zur Funktion
des Nef-Proteins von HIV-1
R. Brack-Werner und S. Kramer-Hämmerle
Das Nef-Protein des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) spielt eine wichtige
Rolle bei der Infektion mit HIV-1. Nef kann
schon sehr früh im Infektionsverlauf nachgewiesen werden und interagiert dann mit
zahlreichen zellulären Prozessen. In CD4positiven T-Lymphozyten, den Haupt-Zielzellen von HIV-1, ist die Folge dieser Interaktionen in jedem Fall eine Steigerung der viralen Pathogenität durch Modulation der
zellulären Eigenschaften. HIV-1 Nef aktiviert
diese T-Zellen und induziert damit eine
Steigerung der Virusproduktion.
Im Verlauf unserer Untersuchungen zur
HIV-Infektion des Gehirns haben wir bereits
gezeigt, dass Astrozyten (Abb. 1) im Vergleich zu T-Zellen in anderer Weise auf die
Infektion mit HIV-1 reagieren, dass aber
auch hierbei der Interaktion von regulatorischen HIV-Proteinen mit den Astrozyten eine
besondere Bedeutung zukommt. So ändern
218 " GSF
The Institute is integrated into the
programme ‘Infection and Immunity’
within the Helmholtz (HGF) research area
‘Health’, and collaborates with other HFG
institutions in the areas of ‘Pathogenesis’,
‘Microorganisms’, and ‘Prevention and
Therapy’. There is further collaboration
within the programmes on ‘Comparative
Genomics’, ‘Environmental Health Disorders’, and ‘Cancer Research’ in the
research area ‘Health’.
The research is coordinated by PD Dr.
Ruth Brack-Werner, Dr. I. Drexler, Professor
C. Leib-Mösch, and Professor V. Erfle.
At the end of the year, there were
18 scientists, 7 technicians, and 13 postgraduate students at the Institute,
11 of them supported by grant funds.
sich zum Beispiel die biologischen Eigenschaften von humanen Astrozyten durch die
konstitutive Expression von HIV-1 Nef: Die
Zellen verändern ihre Morphologie, zeigen
eine erhöhte Expression von Aktivierungsmarkern und eine verstärkte Tendenz, in
Nacktmäusen Tumoren zu erzeugen.
Von besonderem Interesse war daher die
Frage, welche Gene und Signalwege in
Abb.1: Humane Astrozyten, die ein grün-fluoreszierendes Protein exprimieren.
ten nachgewiesene Nef-Expression vermutlich eine lang andauernde Aktivierung der
infizierten Astrozyten zur Folge.
Expression endogener Retroviren
in Gehirn
C. Leib-Mösch
In menschlichem Gehirngewebe sind humane endogene Retroviren (HERVs) hochaktiv
und werden mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Multipler
Sklerose assoziiert. Die Rolle von HERVs in
neuropsychiatrischen Erkrankungen wie
Schizophrenie wird in der Literatur kontrovers diskutiert. In einer von der Stanley
Foundation initiierten Studie haben wir
mehr als 200 Gehirnproben von Patienten
mit Schizophrenie, bipolaren (z.B. manischdepressiven) Erkrankungen und von gesunden Kontrollpersonen auf die Expression
humaner endogener Retroviren untersucht.
Dazu wurde mit Hilfe eines Retrovirusspezifischen Microarrays, mit dem Transkripte der pol-Gene von über 50 repräsentativen Vertretern von 20 HERV-Familien
gleichzeitig identifiziert werden können, ein
gehirnspezifisches HERV-Expressionsprofil
erstellt. Der Vergleich mit den Patientenproben ergab jedoch für die meisten HERVFamilien keine Unterschiede in der Expressionsaktivität und konnte damit frühere,
positive Befunde anderer Arbeitsgruppen
nicht bestätigen. Allerdings waren Transkripte einer Subgruppe der HML-2-Famile,
HERV-K10, in beiden Patientengruppen im
Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant
überrepräsentiert. Mitglieder dieser Subgruppe sind die einzigen bekannten HERVs,
die für alle retroviralen Gene kodieren und
möglicherweise noch immer replizieren
können.
Bei der Maus dagegen sind neurotrope
Varianten des murinen Leukämievirus MLV
bekannt und sehr gut charakterisiert. Da
diese neurotropen Retroviren ein sehr ähnliches Pathogenitätsspektrum aufweisen wie
Prioneninfektionen, zum Beispiel spongiforme Veränderungen (Abb. 2), haben wir in
Kooperation mit der Arbeitsgruppe von H.
Schätzl, Institut für Virologie der TU Mün-
Die Institute
Astrozyten durch Nef beeinflusst werden
und inwieweit sich diese Ergebnisse mit
denen von HIV-infizierten T-Zellen decken.
Mit Hilfe der Microarray-Technik wurden
deshalb die Genexpressionsmuster von
Astrozyten, die mit dem Nef-Gen (Wildtyp
bzw. Mutanten) stabil transfiziert worden
waren, untersucht. Parallel dazu wurden
Datenbank-basierte Analysen der bereits
aus früheren Untersuchungen von HIVinfizierten T-Zellen gewonnenen Ergebnisse
durchgeführt. Im Fokus standen dabei
Gene, die anhand der Literaturanalyse
einem Nef-verbundenen Netzwerk zugeordnet werden konnten und deren Promotoren
nun einer vergleichenden Sequenzanalyse
(Genomatix Software GmbH) unterworfen
wurden.
Die statistische Auswertung der Microarrays zeigte kleine, spezifisch hochregulierte
Gencluster in Wildtyp-Nef-Zellen im Vergleich zu Zellen, die eine nicht-myristylierte
Nef-Variante exprimierten. Diese Nef-Mutante ist nicht funktionell, da ihr die für die
Assoziation mit der Zellmembran essentielle
Myristylierung fehlt. Mindestens drei signifikant überrepräsentierte Gen-Gruppen (kleiner GTPase Signalweg, Regulation der
Apoptose und Lipidmetabolismus) wurden
gefunden und der JAK/STAT Signalweg als
das verbindene Element der drei Gengruppen identifiziert.
Diese Ergebnisse wurden bestätigt durch
den parallel durchgeführten theoretischen
Ansatz zur Promotoranalyse. Die Organisation der entsprechenden Promotoren gab
nach Abgleich mit den bisher beschriebenen
experimentellen Daten Hinweise auf eine
gemeinsame transkriptionelle Regulation
und auf die direkte Verknüpfung mit HIV-1
Nef.
Somit konnten wir durch die im Microarray-Ansatz gewonnenen Daten und ihre
Bestätigung durch die Analysen der Promotoren von gemeinsam regulierten Genen
neue Erkenntnisse zu den grundlegenden
Mechanismen der komplexen Funktionen
des Nef-Proteins in HIV-infizierten Zellen
gewinnen. Die Resultate unserer Analysen
sprechen dafür, dass HIV-1 Nef in Astrozyten
ähnliche Signalwege wie in HIV-infizierten
T-Zellen beeinflussen kann. So hat die schon
früh im Verlauf der HIV-Infektion in Astrozy-
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nicht infiziert
Prion-infiziert
Abb. 2: Spongioforme Veränderungen (↑) im murinen Gehirn nach Prioninfektion.
chen, untersucht, ob endogene Retroviren
und andere Retrotransposons der Maus bei
Prionenerkrankungen als Kofaktoren involviert sein könnten. Dazu wurden die Expressionsprofile endogener Retroviren in mit
Scrapie infizierten und nicht infizierten,
neuronalen Zelllinien miteinander
verglichen. Es zeigte sich, dass die Infektion
mit Maus-adaptierten Scrapie-Proteinen
insbesondere die Transkriptionsaktivität von
MLV und intrazisternalen A-Typ Partikeln
(IAP) beeinflusst, dass dieser Effekt sowohl
Zelltyp-spezifisch ist, als auch vom verwendeten Scrapiestamm abhängt und reversibel
auf die „Heilung“ der Zellen mit Pentosanpolysulfat reagiert. Mit Hilfe eines DNAMicroarrays des GSF-Instituts für Experimentelle Genetik konnten außerdem potentielle zelluläre Kofaktoren in den
Prion-infizierten Zellen ermittelt werden, die
insbesondere Transportproteine, ATP- und
Kalzium-bindende Proteine und Proteine des
Zytoskeletts umfassen, sowie einige differentiell exprimierte Gene, die auch bei
Alzheimer und anderen neurodegenerativen
Erkrankungen eine Rolle spielen.
Dendritische Zellen und ihre
Bedeutung für die Entwicklung
MVA-basierter Impfstoffe
I. Drexler und W. Kastenmüller
Dendritische Zellen (DC) sind professionelle
antigenpräsentierende Zellen, die komplexe
Antigene prozessieren können, damit diese
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zusammen mit kostimulatorischen Molekülen auf der Zelloberfläche zur Erkennung für
zytotoxische T-Zellen präsentiert werden.
Orthopockenviren werden nicht nur zur
Herstellung von Pockenimpfstoffen benutzt,
sondern mittlerweile vornehmlich als Vektoren für die Entwicklung von Impfstoffen
gegen andere Infektionskrankheiten und
Krebserkrankungen herangezogen. Eines
dieser Vektorsysteme ist das hoch attenuierte Modifizierte Vaccinia Virus Ankara (MVA),
das auf Hühnerembryofibroblasten gezüchtet wird und in Säugetierzellen nicht mehr
vermehrungsfähig ist. Trotz dieses Defekts
erlaubt MVA in den meisten Säugetierzellen
die Synthese aller viralen Proteine, was
wiederum die Expression rekombinanter
Gene unter der Kontrolle von Vacciniaspezifischen Promotoren und somit die
Produktion heterologer Antigene erlaubt.
Auf diese Weise ist es gelungen, rekombinante MVA-Impfstoffe gegen ein breites
Spektrum von Infektionskrankheiten viraler,
bakterieller und parasitärer Art sowie gegen
Tumorerkrankungen zu entwickeln, die
inzwischen auch in einer Reihe von klinischen Studien getestet wurden. Ein vielversprechender Ansatz im Rahmen solcher
Impfstoffentwicklungen ist dabei die Kombination von MVA-Vakzinen mit dendritischen
Zellen, um die entsprechenden Antigene
dem Empfängerorganismus möglichst
effektiv und immunogen präsentieren zu
können.
Am Beispiel des melanomassoziierten
Antigens Tyrosinase konnte bisher in mehreren klinischen Studien gezeigt werden,
fanden und auch die lebensfähigen unreifen
DC trotz Expression der kostimulatorischen
Moleküle nicht mehr in der Lage waren,
unter spezifischer Zytokinbehandlung zu
reifen. DC können auch virale Antigene aus
infizierten apoptotischen Zellen präsentieren. Dieser MVA-induzierte Prozess trägt
möglicherweise zur effektiveren Stimulation
der antigenspezifischen zytotoxischen TZellen bei. Im Gegensatz zu früheren Berichten über replikationsfähige Vacciniaviren
waren in unserem Infektionsansatz mit
replikationsdefizienten MVA-Konstrukten die
kostimulatorischen Moleküle CD80 und
CD86 nicht signifikant von der Zelloberfläche herunterreguliert.
Unsere gewonnenen Erkenntnisse zur
MVA-DC Interaktion liefern zum einen eine
Möglichkeit, den Erfolg des DC-abhängigen
MVA-Vektors in den klinischen Studien zu
erklären. Zum anderen werden sie dazu
beitragen, zukünftige MVA-basierte Impfstoffe und ihre immunologische Präsentation durch dendritische Zellen zu optimieren.
Die Institute
dass der Transfer von autologen, ex vivo mit
MVA-Tyrosinase infizierten DC eine spezifische T-Zell-abhängige Immunantwort induziert, dass jedoch eine solche Immunreaktion bei der Wahl eines anderen Applikationsweges wie beispielsweise einer direkten
Impfung mit diesem Vektor ausbleibt. Um
den Mechanismus der effektiveren Antigenpräsentation durch DC zu charakterisieren,
haben wir unreife und reife dendritische
Zellen in vitro mit einem MVA Konstrukt,
welches für das humane HER-2/neu-Antigen
kodiert, infiziert und die Expression des
rekombinanten als auch der viralen Antigene untersucht. Trotz Einschränkung der
Genexpression auf die frühen Virusgene
wurde das durch MVA produzierte Tumorantigen in beiden DC-Populationen sehr effizient produziert und präsentiert.
Auch die unreifen DC waren in der Lage,
das HER-2/neu Antigen zu prozessieren und
entsprechende Peptide an T-Zellen zu präsentieren, obwohl wir in dieser nicht homogenen Population viele apoptotische Zellen
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"
Zusammenarbeit
"
Ausgewählte Veröffentlichungen
Der Leiter des Instituts ist o. Univ. Professor für Virologie
und Leiter des Instituts für Virologie der Technischen
Universität München. Mit der TU München bestehen
außerdem Kooperationen innerhalb des DFG-Sonderforschungsbereiches 456 („Zielstrukturen für selektive
Tumorinterventionen“). Mit der LMU München bestehen
Kooperationen in den DFG-Sonderforschungsbereichen
SFB Transregio 6007 („Chromatin: Aufbau und Vererbung
von Struktur und Genaktivität“) und SFB 455 („Virale
Funktionen und Immunmodulation“). Enge Kooperationen
bestehen darüber hinaus mit dem Klinikum Mannheim
der Universität Heidelberg, dem Paul-Ehrlich-Institut (PEI)
in Langen, dem Institut für Virologie und Seuchenhygiene
der Med. Hochschule Hannover, und den Universitäten
Edinburgh und Jerusalem.
Frank, O., Giehl, M., Zheng, C., Hehlmann, R., LeibMösch, C., Seifarth, W.: Human endogenous retrovirus
expression profiles in samples from brains of patients
with Schizophrenia and bipolar disorders. J. Virol. 79,
10890-10901 (2005)
Kooperationen bestehen auch mit dem Verbund FORPRION („The role of activated retroviral genes as cofactors in prion-induced spongiform encephalopathy“) der
bayerischen Forschungsstiftung, sowie in verschiedenen
EU-Projekten (“New vaccinia virus MVA vaccines”,
“New influenza virus vaccines”, “AIDS vaccine integrated
project (AVIP)”). Außerdem besteht eine Kooperation mit
Carl-Zeiss-Vision (“Anpassung und Optimierung von
Imaging-Verfahren“) und eine enge Zusammenarbeit mit
Genomatix Software GmbH auf dem Gebiet der Genomund Promotoranalysen.
Kramer-Hämmerle, S., Hahn, A., Brack-Werner, R.,
Werner, T.: Elucidating effects of long-term expression of
HIV-1 Nef on astrocytes by microarray, promoter, and
literature analysis. Gene 358, 31-38 (2005)
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Greenwood, A., Horsch, M., Stengel, A., Vorberg, I.,
Lutzny, G., Maas, E., Schädler, S., Erfle, V., Beckers, J.,
Schätzl, H., Leib-Mösch, C.: Cell line dependent RNA
expression profiles of prion-infected mouse neuronal
cells. J. Mol. Biol. 349, 487-500 (2005)
Kramer-Hämmerle, S., Ceccherini-Silberstein, F., Bickel,
C., Wolff, H., Vincendeau, M., Werner, T., Erfle, V., BrackWerner, R.: Identification of a novel Rev-interacting
cellular protein. BMC Cell Biology 6:20 (2005)
Staib, C., Kisling, S., Erfle, V., Sutter, G.:Inactivation of the
viral interleukin 1 receptor improves CD8+ T-cell memory
responses elicited upon immunization with modified
vaccinia virus Ankara. J. Gen. Virol. 86, 1997-2006 (2005)