MYC-induzierte Zellproliferation macht menschliche B

Institut für Klinische Molekularbiologie und Tumorgenetik
Georg W. Bornkamm
rebs wird durch Veränderungen in
der Erbinformation der Zelle verursacht. Die in Chromosomen verpackte Erbinformation (DNA) gliedert sich
in eine Vielzahl kleiner funktioneller Einheiten (Gene), von denen einige Differenzierung, Zellwachstum, Zelltod und Reparatur
der zellulären DNA kontrollieren. Eine
maligne Entartung der Zelle wird durch
den Verlust der physiologischen Kontrolle
dieser Prozesse (d.h. konstitutive Aktivierung von Wachstum und Zellüberleben
fördernden Genen, Inaktivierung von
Wachstum und Zellüberleben hemmenden
Genen, Störung in Reparaturgenen) in
Gang gesetzt. Vom immunologischen
Gesichtspunkt aus gesehen bleibt festzuhalten, dass sich praktisch alle Tumorzellen
aufgrund der Akkumulation von genetischen Veränderungen von den normalen
Zellen unterscheiden, von denen die Tumorbildung ihren Ursprung nahm.
Zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterscheiden, ist eine zentrale Funktion des
zellulären Immunsystems. T-Lymphozyten
erkennen mit Hilfe ihres T-Zellrezeptors
einen Komplex aus körpereigenen HLAMolekülen und kurzen Peptiden, die physiologische Abbauprodukte intrazellulär gebildeter Proteine darstellen, gemeinsam mit
den HLA-Molekülen auf die Zelloberfläche
transportiert werden und in die Grube der
K
AKTUELLE
THEMEN
MYC-induzierte Zellproliferation
macht menschliche B-Lmphozyten
für das Immunsystem unsichtbar
Myc-induced Cell Proliferation
makes human B-Lymphocytes
invisible to the Immune
System
ancer is caused by alterations in
the genetic information of a cell.
The chromosomal DNA is arranged
in a large number of functional units, the
genes, some of which regulate differentiation, cell growth, cell death, and repair of
cellular DNA. The loss of physiological
control of these processes – in other words
the constitutive activation of genes that
promote cell growth and survival, the
inactivation of genes that inhibit these
processes, or disruption of repair genes –
leads to malignant transformation of the
cell. From an immunological viewpoint
virtually all tumour cells differ from their
cell of origin through an accumulation of
genetic alterations.
C
59
GSF
Abb. 1: T-Zellen erkennen einen Komplex aus
eigenem HLA-Molekül und fremdem Peptid.
CD8-positive zytotoxische T-Zellen erkennen
einen Komplex bestehend aus HLA-Klasse I und
fremdem Peptid, CD4-positive T-Helferzellen erkennen einen Komplex aus HLA-Klasse II und
fremdem Peptid (Quelle: Molecular Biology of
the Cell, Third Edition, Garland Publishing Inc.,
New York & London, 1994) .
HLA-Oberflächenmoleküle binden (Abb. 1).
T-Zellen, die die Abbauprodukte körpereigener Proteine im Kontext mit eigenen
HLA-Molekülen erkennen, werden im Laufe
der Entwicklung im Thymus eliminiert
(„zentrale Toleranz“). Es verbleiben die
T-Zellen im Körper, die die Abbauprodukte
in der Zelle gebildeter fremder Proteine
(z.B. viraler Proteine nach einer Virus-Infektion) im Kontext mit den eigenen HLAMolekülen erkennen.
Die Erkenntnis, dass vom Immunsystem
nicht nur Abbauprodukte körperfremder,
sondern auch mutierter körpereigener
Proteine erkannt werden können, hat der
Hoffnung neue Nahrung gegeben, das Immunsystem des Patienten gegen maligne
entartete körpereigene Zellen mobilisieren
zu können. Die klinisch-onkologische For-
c-myc: zelluläres myc Gen
MYC: Genprodukt des menschlichen c-myc Gens
60
GSF
schung war im letzten Jahrzehnt weltweit
von dieser Hoffnung und Erwartung geprägt und hat zahlreiche immuntherapeutische Konzepte hervorgebracht, die z.T.
bis in die Klinik getragen wurden, summa
summarum aber in ihren Ergebnissen
enttäuschten. Entsprechend standen in
letzter Zeit vermehrt die immunologischen
„Escape“-Mechanismen im Blickpunkt, die
einer Tumorzelle erlauben, das Immunsystem lahm zu legen bzw. zu unterlaufen.
Inzwischen sind eine Vielzahl solcher
„Escape“-Mechanismen bekannt, wie z.B.
der Verlust von HLA-Molekülen von der
Oberfläche der Tumorzellen, die Produktion
immunsuppressiver Zytokine wie TGF-
und IL10, sowie die Expression des Liganden von CD95 (Fas/ApoI) auf der Oberfläche der Tumorzellen mit der Konsequenz
der Eliminierung der zytotoxischen T-Zellen
durch die Tumorzellen. All diesen immunologischen „Escape“-Mechanismen ist gemeinsam, dass sie als Adaptationsmechanismen des Tumors gegenüber einem effizienten Immunsystem angesehen werden,
die einer entsprechenden Selektion in vivo
unterliegen.
Das Burkitt-Lymphom, ein hochmalignes
menschliches B-Zell-Lymphom, das durch
eine konstitutive Aktivierung des Onkogens c-myc durch Translokation in einen
der Immunglobulingenloci gekennzeichnet
ist, zeigt ausgeprägte Merkmale eines
„Immune Escape“: die Expression von
HLA-Klasse I- und II-Molekülen ist deutlich
erniedrigt, die Zellen haben ein geringes
Potential, allogene T-Zellen (T-Zellen eines
anderen Individuums) zu stimulieren, die
für den Kontakt mit T-Zellen wichtigen
Adhäsions- und kostimulatorischen Oberflächenmoleküle sind niedrig exprimiert
oder fehlen gänzlich, die Aktivität des
für den zytoplasmatischen Proteinabbau
verantwortlichen Proteasekomplexes (des
Proteasoms) sowie der Transport der
Abbauprodukte (Peptide) ins endoplasmatische Retikulum sind stark vermindert.
Obwohl die Ausprägung von einem oder
zwei der beschriebenen Merkmale wahrscheinlich ausreichen würden, das Immunsystem zu unterlaufen, ist in BurkittLymphomzellen offensichtlich ein ganzes,
AKTUELLE
THEMEN
Abb. 2: Das experimentelle Zellsystem.
Primäre B-Lymphozyten wurden mit einem immortalisierungsdefizienten EBV-Stamm infiziert,
dem das für die Immortalisierung von B-Zellen notwendige EBNA2-Gen fehlt. Zur Komplementation der EBNA2-Funktion wurden die Zellen gleichzeitig mit einem rekombinanten Virus infiziert,
das für ein Östrogenrezeptor-EBNA2-Fusionsprotein kodiert. Die Östrogenrezeptordomäne verleiht dem gesamten Protein die Fähigkeit, in Abwesenheit von Östrogen an Heat Shock Protein 90
(HSP90) zu binden und dadurch eine inaktive Konformation einzunehmen. Hormonzugabe führt
zur Dissoziation des HSP90-Proteins, zur Umfaltung des Fusionsproteins in eine aktive Konformation und zur Translokation des Proteins in den Zellkern.
Durch die Doppelinfektion mit einem EBNA2-defizienten Virus und dem rekombinanten
ER-EBNA2 kodierenden Virus wurde eine EBV-immortalisierte B-Zelllinie hergestellt (EREB2-5),
die in Gegenwart von Östrogen proliferiert, in Abwesenheit von Hormon aber ihre Proliferation
einstellt und nur begrenzt lebensfähig ist.
EREB2-5-Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die das c-myc-Gen entweder konstitutiv (A1Zellen) oder über Tetrazyklin regulierbar (P493-6-Zellen) exprimieren. Beide Zelllinien können im
Gegensatz zur parentalen EREB2-5-Zelllinie in Abwesenheit von Östrogen wachsen, P493-6-Zellen
allerdings nur unter der Voraussetzung, dass das c-myc-Gen (in Abwesenheit von Tetrazyklin) angeschaltet ist. EREB2-5-Zellen wachsen wie andere EBV-immortalisierte Zellen in großen Klumpen, A1-Zellen wie Burkitt-Lymphomzellen in Einzelsuspension, P493-6 in Einzelzellsuspension
mit leichter Klumpenbildung. Das Wachstumsverhalten spiegelt die Expression oder Nicht-Expression von Adhäsionsmolekülen wider.
ineinandergreifendes Programm aktiviert,
die Zellen für das Immunsystem unsichtbar
zu machen. Dieser offensichtliche Widerspruch hat uns veranlasst zu hinterfragen,
ob das „Immune Escape“-Phänomen
tatsächlich, wie allgemein angenommen,
einer In-vivo-Selektion unterliegt oder ob
es nicht vielmehr Teil des MYC-induzierten
Proliferationsprogramms der Zelle ist.
Um diese Frage experimentell anzugehen,
haben wir uns eines zellulären Systems
bedient, das in unserem Institut von Axel
61
GSF
62
GSF
Stimulation index
20
A
15
10
5
0
A1
EREB2-5
P493-BL
P493-LCL
80
% Specific lysis
Polack und Bettina Kempkes entwickelt
wurde und das wichtige Merkmal des Burkitt-Lymphoms, nämlich die konstitutive
MYC-Aktivierung und MYC-induzierte Zellproliferation, widerspiegelt. Das System ist
in Abbildung 2 dargestellt. Als erstes wurden primäre menschliche B-Lymphozyten
mit einem Epstein-Barr-Virus-Stamm infiziert, dem das für die B-Zellimmortalisation
essentielle EBNA2-Gen fehlt. Die notwendige EBNA2-Funktion wurde durch eine
zweite Infektion mit einem rekombinanten
Virus bereitgestellt, das für ein Fusionsprodukt von EBNA2 mit der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors kodiert
(ER-EBNA2). In Abwesenheit von Östrogen
bindet das Heat Shock Protein 90 (HSP90)
an die Hormonbindungsdomäne des
Östrogenrezeptors und hält das ER-EBNA2
Fusionsprotein in einer inaktiven Konformation im Zytoplasma zurück. Zugabe von
Östrogen führt zur Abdissoziation des
Heat Shock Proteins, zur Umfaltung des
Fusionsproteins in eine aktive Konformation und zum Transport in den Zellkern
(siehe das eingefügte Fenster in Abb. 2).
Auf diese Weise wurde aus primären
B-Lymphozyten eine EBV-immortalisierte
B-Zelllinie (EREB2-5) etabliert, die in
Gegenwart von Hormon proliferiert, aber
nach Hormonentzug die Proliferation einstellt. In diese Zelllinie wurde ein Konstrukt
eingeführt, auf dem das c-myc-Gen – in
gleicher Weise wie bei einer t(2;8) Chromosomentranslokation in Burkitt-Lymphomzellen – unter die Kontrolle der Regelelemente des Immunglobulin--Locus gebracht ist. Das auf diese Weise aktivierte
c-myc-Gen macht die Zellen in ihrer Proliferation von Hormon unabhängig (Zelllinie
A1). Parallel hierzu wurde eine zweite Zelllinie (P493-6) etabliert, in der das c-mycGen durch Entzug oder Zugabe von Tetrazyklin an- und abgeschaltet werden kann.
Auch diese Zelllinie kann nach Anschaltung des c-myc-Gens in Abwesenheit von
Hormon proliferieren (–Tetrazyklin, –Östrogen), dieselbe Linie kann jedoch auch durch
Aktivierung von EBNA2 und von EBNA2regulierten viralen und zellulären Zielgenen
zur kontinuierlichen Proliferation gebracht
werden (+ Östrogen, + Tetrazyklin).
B
60
40
20
0
EBNA3B
vaccinia
control
vaccinia
EBNA3B
peptide
control
peptide
Abb. 3: Durch MYC zur Proliferation gebrachte
B-Zellen sind für T-Zellen unsichtbar.
(A) Allogene T-Zellstimulation in einer gemischten Lymphozytenkultur. Durch MYC zur Proliferation gebrachte Zellen haben die Fähigkeit
der parentalen EREB2-5-Zellen verloren, allogene T-Zellen zu stimulieren. Bei gleichzeitiger
Expression von MYC und EBNA2 in P493-6Zellen ist die Wirkung von EBNA2 dominant.
(B) EREB2-5-Zellen, aber nicht durch MYC zur
Proliferation gebrachte P493-6-Zellen, werden
nach Expression von EBNA3B mittels VakziniaVirus-Infektion von einem zytotoxischen T-Zellklon lysiert, der EBNA3B im Kontext mit
HLAA11 erkennt. Zugabe von exogenem Peptid
rekonstituiert die T-Zell-vermittelte Lyse.
Bemerkenswerterweise zeigen die durch
c-myc-Aktivierung zur Proliferation gebrachten Zellen ein völlig anderes Wachstumsverhalten und Oberflächenexpressionsmuster als die parentalen EREB2-5Zellen. EREB2-5-Zellen wachsen in großen
Klumpen und zeigen das typische Expressionsmuster von Aktivierungsmarkern,
Zelladhäsions- und kostimulatorischen
Molekülen auf der Oberfläche wie sonstige
EBV-immortalisierte Zelllinien. Die durch
c-myc-Aktivierung zur Proliferation gebrachten A1- und P493-6-Zellen sind dagegen in vielen Aspekten Burkitt-Lymphomzellen sehr ähnlich: sie wachsen in Einzelzellsuspension, haben die charakteristischen Oberflächenmarker EBV-immortalisierter Zellen herunterreguliert und expri-
A1 EREB2-5
sind jedoch nicht nur für allogene T-Zellen
unsichtbar, sondern auch für zytotoxische
T-Zellen. Um die Erkennbarkeit durch zytotoxische T-Zellen zu prüfen, wurden in
EREB2-5-, A1- und P493-6-Zellen definierte
Antigene, für die gut charakterisierte zytotoxische T-Zellen zur Verfügung stehen,
mit Hilfe eines Vaccinia-Virussystems zur
Expression gebracht. Trotz effizienter
Expression der Antigene in den Zellen wurden die Vaccinia Virus-infizierten A1- und
P493-6-Zellen von den antigenspezifischen
zytotoxischen T-Zellen nicht, die EREB2-5Zellen jedoch sehr gut erkannt (Abb. 3B,
nur für P493-6-Zellen gezeigt). Wenn das
entsprechende, von den T-Zellen im
Kontext mit einem HLA-Molekül erkannte
Peptid jedoch von außen auf die Zellen gegeben wurde, konnte die T-Zellerkennung
weitgehend rekonstituiert werden. Dies
legt nahe, dass in erster Linie nicht die verminderte Expression der HLA-Moleküle auf
der Zelloberfläche (Abb. 4A) für die T-Zellerkennung limitierend ist, sondern die in-
AKTUELLE
THEMEN
mieren einige wenige zusätzliche Antigene
auf ihrer Zelloberfläche, wie CD38, CD77 und
IgM, die auf EBV-immortalisierten Zellen
nicht oder niedrig, auf Burkitt-Lymphomzellen jedoch hoch exprimiert sind.
Unterschiedliches Wachstumsverhalten
und Oberflächenexpressionsmuster korrelieren mit einer unterschiedlichen Fähigkeit
der Zellen, allogene T-Lymphozyten in
einer gemischten Lymphozytenkultur zur
Proliferation anzuregen. EREB2-5-Zellen
sind wie alle EBV-immortalisierten Zellen
ausgezeichnete Stimulatorzellen, während
die durch c-myc-Aktivierung zur Proliferation gebrachten Zellen die Fähigkeit zur
Allostimulation praktisch völlig verloren
haben (Abb. 3A). In P493-6-Zellen ist die
Fähigkeit zur Allostimulation von der Aktivierung des viralen Genexpressionsprogramms abhängig, bei gleichzeitiger Aktivierung von EBV und c-myc ist der Effekt
der viralen Gene dominant.
Die durch c-myc-Aktivierung zur Proliferation gebrachten A1- und P493-6-Zellen
EREB2-5 A1
80
c-Myc
–2m
EBNA2
60
B49
Vmax
LMP1
Lmp2
Lmp7
40
A11
B7
PA28a
20
PA28b
0
TAP1
ER/EB2-5
TAP2
A
A1
ER/EB2-5
SucVVLY-MCA
B
A1
BocLRR-MCA
C
Abb. 4: Expression von HLA-Klasse I, von Proteasomkomponenten und des Peptidtranporters sowie enzymatische Aktivität des Proteasoms in EREB2-5- und A1-Zellen.
(A) Die konstitutive Expression von HLA-Klasse-I-Molekülen ist in A1-Zellen gegenüber den parentalen EREB2-5-Zellen stark vermindert. (B) Die Interferon- induzierten Untereinheiten des Immunproteasoms (Lmp2, Lmp7, PA28 und ) sind ebenso wie die beiden Ketten des Peptidtransporters (TAP1 und TAP2) in A1-Zellen nicht exprimiert.
Die veränderte Zusammensetzung des Proteasoms spiegelt sich auch in einer verminderten Chymotrypsin- und Trypsin-ähnlichen enzymatischen Aktivität des Proteasoms (C) wider.
63
GSF
trazelluläre Antigenprozessierung. Aus
Abb. 4B wird ersichtlich, dass sich A1- und
EREB2-5-Zellen sowohl in der Zusammensetzung des Proteasoms als auch in der
Expression der Transportmoleküle, die die
Peptide ins endoplasmatische Retikulum
transportieren, unterscheiden. Dem entspricht, dass auch die enzymatische Aktivität des Proteasoms in A1-Zellen stark
gegenüber der der parentalen EREB2-5Zellen vermindert ist (Abb. 4C).
Zusammenfassend belegen diese Untersuchungen schlüssig, dass das Phänomen
des „Immune Escape“ in Burkitt-Lymphomzellen nicht auf einer In-vivo-Selektion von
nicht-immunogenen Tumorzellen beruht,
sondern integraler Bestandteil des MYCinduzierten Proliferationsprogramms der
Zelle ist. Maligne Entartung und fehlende
Immunogenität der Zellen können, wie am
Beispiel der MYC-induzierten Zellproliferation gezeigt, unmittelbar gekoppelte Prozesse sein. Immuntherapeutische Ansätze,
die sich dieser Zusammenhänge nicht bewusst sind, sind von vornherein zum
Scheitern verurteilt. Es wird deutlich, dass
wir ein besseres Verständnis der molekularen Zusammenhänge zwischen maligner
Entartung und Immunogenitiät/NichtImmunogenität benötigen, um therapeutisch gezielt eingreifen zu können. Es ist
Gegenstand unserer gegenwärtigen Forschung, die Bindeglieder in der Kette zwischen MYC-Aktivierung und Nicht-Immunogenität der Zelle auf molekularer Ebene
zu identifizieren. Wir sehen dies als Voraussetzung für eine mögliche therapeutische
Intervention an und hoffen, die Fortschritte
auf diesem Gebiet im kommenden Jahre
vorstellen zu können.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Kempkes, B., Spitkovsky, D., Jansen-Dürr, P., Ellwart,
J.W., Kremmer, E., Delecluse, H.J., Rottenberger, C.,
Bornkamm, G.W., Hammerschmidt, W.: B-cell proliferation and induction of early G1-regulating proteins by
Epstein-Barr virus mutants conditional for EBNA2.
EMBO J. 14, 88–96 (1995)
Polack, A., Hörtnagel, K., Pajic, A., Christoph, B.,
Baier, B., Falk, M., Mautner, J., Geltinger, C., Bornkamm,
G. W., Kempkes, B.: c-myc activation renders proliferation of Epstein-Barr virus (EBV)-transformed cells
independent of EBV nuclear antigen 2 and latent
membrane protein 1. Proc. Natl. Acad. Sci. 93,
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64
GSF
Gavioli, R., Frisan, T., Vertuani, S., Bornkamm, G.W.,
Masucci, M.G.: C-myc overexpression activates
alternative pathways for intracellular proteolysis in
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Staege, M.S., Lee, S.P., Frisan, T., Mautner, J., Scholz, S.,
Pajic, A., Rickinson, A.B., Masucci, M.G., Polack, A.,
Bornkamm, G.W.: MYC overexpression imposes a nonimmunogenic phenotype on Epstein-Barr virus-infected
B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4550–4555 (2002)