Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in

Aus der Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie
und aus dem Institut für Versuchstierkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in den
sekundär lymphatischen Organen der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Andrea Sahle
aus Münster/ Westf.
Hannover 2001
II
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Westermann
Univ.-Prof. Dr. R. Pabst
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.- J. Hedrich
2. Gutachter: PD Dr. H.- J. Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung:30.05.2001
Diese Arbeit wurde mit der finanziellen Unterstützung des Graduierten Kollegs
„Charakterisierung von regulatorischen Peptiden und ihrer Zielproteine“ angefertigt.
III
Meiner Mutter
und
meinem Sonnenschein
Y a na -Ma r ie
Man sieht nur
mit dem Herzen gut,
das Wesentliche ist
für die Augen unsichtbar.
Antoine de Saint-Exupery
IV
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen................................................... 7
I. Einleitung........................................................................................................ 9
II. Literaturübersicht...................................................................................... 11
1. Das Immunsystem....................................................................................................... 11
2. Die lymphatischen Organe.......................................................................................... 14
3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort ................. 18
4. Die Migration von Lymphozyten................................................................................ 21
5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort...................................... 24
III. Material und Methoden ........................................................................... 31
1. Geräte und Laborbedarf.............................................................................................. 31
2. Puffer, Medien und Materialien ................................................................................. 32
3. Antikörper .................................................................................................................. 35
4. Versuchstiere.............................................................................................................. 37
5. Gewinnung, Aufbereitung und Injektion von Subpopulationen der Lymphozyten ... 38
6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten
................................................................................................................................... 40
7. Immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte in der konfokalen Mikroskopie.......... 45
8. Darstellung von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC im
Mausmodell ............................................................................................................... 46
9. Auswertung ................................................................................................................ 48
10. Verwendete Computerprogramme und Statistik ...................................................... 50
IV. Ergebnisse .................................................................................................. 52
A. Untersuchung der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit
interdigitierenden dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen
Organen der Ratte........................................................................................... 52
1. Injizierte T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen können auf
immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten identifiziert werden. ...................... 52
6
2. In den sekundär lymphatischen Organen befinden sich 80% der injizierten TLymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen. ...... 55
3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion der T-Lymphozyten lassen sich
gleiche Anteile von Membrankontakten beobachten. ............................................... 57
4. Endogene T-Lymphozyten zeigen über 60% Membrankontakte zu DC.................... 60
5. Membrankontakte zu IgD-positiven B-Lymphozyten befinden sich vorwiegend im
äußeren Bereich der periarteriolären lymphatischen Begleitscheide der Milz .......... 60
6. Membrankontakte von injizierten T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen lassen
sich auch mit konfokaler Mikroskopie aufzeigen. .................................................... 63
7. In der Maus werden interdigitierende dendritische Zellen über den spezifischen
Marker DEC-205 nachgewiesen................................................................................ 67
B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation ..................... 70
1. Ki-67+ T-Lymphozyten im Blut ................................................................................. 70
2. BrdU+ T-Lymphozyten in der Milz ............................................................................ 72
3. Die Anteile der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten sind erhöht zu finden, wenn
Membrankontakte mit IDC in der Milz vorliegen..................................................... 72
V. Diskussion.................................................................................................... 80
1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein konstantes
Phänomen dar. ........................................................................................................... 80
2. Funktion von LFA-1 bei Membrankontakten im Mausmodell .................................. 88
3. Membrankontakte beeinflussen den Anteil der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten. 88
VI. Zusammenfassung..................................................................................... 92
VII. Summary .................................................................................................. 95
VIII. Literaturverzeichnis .............................................................................. 97
IX. Anhang ..................................................................................................... 117
7
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb.
AP
APAAP
APC
Abbildung
Alkalische Phosphatase
Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase
antigen presentating cell, Antigen-präsentierende Zelle
BrdU
BSA
5’-Brom 2’-Desoxyuridin
bovines Serumalbumin
ca.
CD
CO2
CSFE
CTLA-4
circa
Cluster of Differentiation, Differenzierungskluster
Kohlendioxid
5-,6-carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester
cytotoxic T lymphocyte antigen-4, zytotoxisches T-Zellantigen-4
DC
Dig
d.h.
DMSO
DNS
dendritic cell, dendritische Zelle
Digoxigenin
das heißt
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
etc.
et cetera
FACS
fluorescence activated cell sorter,
fluoreszenzaktivierter Zellsortierer
fetal calf serum, fetales Kälberserum
FCS
GM-CSF
Granulocyte/ Macrophage-colony-stimulating factor,
Granulozyten/ Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
h
HEV
hora, Stunde
high endothelial venule, hochendotheliale Venule
ICAM-1
IDC
Ig
IL- 2
i.v.
intercellular adhesion molecule-1, interzelluläres Zelladhäsionsmolekül-1
interdigitating dendritic cell, interdigitierende dendritische Zelle
Immunglobulin
Interleukin-2
intravenös
Ko
Kontrolle
LFA-1
Lymphocyte function-associated antigen-1,
lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen-1
mAb
MAdCAM-1
monoclonal antibody, monoklonaler Antikörper
mucosal addressin-cell adhesion molecule-1,
mukosales Addressin-Zelladhäsionsmolekül-1
8
MCP
Min
MIP1-α
MHC
mLN
macrophage chemotactic protein,
Makrophagen chemotaktisches Protein
macrophage colony-stimulating factor,
Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
Molecular Institute of Borstel, Antikörper gegen nukleäres Antigen des
Zellzyklus (in der Ratte während der G1-M2-Phase exprimiert)
Minute
macrophage inflammatory protein 1-alpha
Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
mesenterial lymph node, mesenterialer Lymphknoten
MLR
mixed lymphocyte reaction, gemischte Lymphozytenreaktion
MS
Mäuseserum
NaCl
NK-Zelle
Natriumchlorid
Natürliche Killerzelle
PALS
periarteriolar lymphatic sheath,
periarterioläre lymphatische Begleitscheide
Peroxidase-Anti-Peroxidase
Phosphat-gepufferte Salzlösung
Phycoerythrin
Paraformaldehyd
negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Peyersche Platten
M-CSF
Mib5
PAP
PBS
PE
PFA
pH
PP
RANTES
RT
regulated on activation, normally T cell expressed and secreted,
durch Aktivierung reguliertes, normalerweise von T-Zellen exprimiertes und
sezerniertes Chemokin
Raumtemperatur
s.
S.
sec
SPF
siehe
Seite
Sekunde
spezifisch pathogenfrei
TH1/2
TDL
TNF-α
TTBS
TCR
T-Helfer1/ 2
thoracic duct lymphocytes, Lymphozyten aus dem Ductus thoracicus
tumor necrosis factor-alpha
Trisgepufferte Salzlösung mit Tween
T cell receptor, T-Zellrezeptor
VCAM-1
VLA-4
vascular cell adhesion molecule-1,
vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1
very late antigen-4, sehr spätes Antigen-4
z.B.
zum Beispiel
9
I. Einleitung
Das Immunsystem beschäftigt sich tagtäglich mit der Abwehr möglicher Pathogene. Im Laufe
der Evolution haben sich dabei eine angeborene und eine erworbene Immunabwehr
entwickelt, die ineinandergreifend effektiv den Organismus zu schützen imstande sind. TLymphozyten und B-Lymphozyten als Träger der erworbenen Immunabwehr erkennen über
spezialisierte Rezeptoren Antigene. Um eine T-Zellabhängige Immunantwort auszulösen,
benötigen T-Lymphozyten ihr spezifisches, in Peptide „zerlegtes“ (prozessiertes) Antigen, das
mit dem Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (MHC) zusammen präsentiert werden muss.
Da sich Immunantworten auch gegen das eigene Gewebe richten können (Autoimmunität),
müssen sie reguliert werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). In verschiedenen Modellen
konnte gezeigt werden, wie wichtig die Interaktion zwischen T-Lymphozyten, aber auch BLymphozyten mit dendritischen Zellen (DC) für die Auslösung von Immunantworten, die
Induktion und das Aufrechterhalten von peripherer Toleranz (BANCHEREAU u.
STEINMAN, 1998) und das Überleben der Lymphozyten in den peripheren Geweben ist
(BROCKER, 1997; INGULLI et al., 1997). In den sekundär lymphatischen Organen wird
durch die spezialisierte Einteilung in Kompartimente das Zusammentreffen von Antigenen
aus dem Blut oder den Geweben und der T-Lymphozyten und DC ermöglicht.
Interdigitierende dendritische Zellen (IDC) stellen DC eines reifen Phänotyps (Fähigkeit zur
Auslösung primärer T-Zellabhängiger Immunantworten) dar, die sich in den T-Zellarealen der
sekundär lymphatischen Organe befinden und mit ihrer charakteristischen Morphologie mit
zahlreichen dendritischen Ausläufern ein dichtes Netzwerk ausbilden. Durch eine hohe
Expression von MHC Klasse II und kostimulatorischen Molekülen lassen sich diese Zellen in
den Geweben nachweisen (STEINMAN et al., 1997).
Obwohl der Interaktion zwischen T-Lymphozyten und DC verschiedene wichtige Funktionen
bei der Einleitung und Regulierung von Immunantworten zugeschrieben wird, ist nicht
bekannt, in welchem Ausmaß sich die Zellen in einem in vivo Modell in Kontakt zueinander
befinden. Um diese Interaktion besser verstehen zu lernen, wurden in der vorliegenden Arbeit
durch die Auswertung von Immunhistologien nach Injektion von T-Lymphozyten in einem
kongenen Rattenmodell folgende Aspekte untersucht:
10
-
Welcher Anteil von injizierten kongenen T-Lymphozyten befindet sich in
Membrankontakt zu IDC in den T-Zellarealen der Milz, der mesenterialen
Lymphknoten und der Peyerschen Platten?
-
Haben die verschiedenen Aktivierungsstadien (naive, Effektor und „Gedächtnis“T-Lymphozyten) der T-Lymphozyten einen Einfluss auf die Anzahl der Kontakte?
-
Lassen sich die Membrankontakte mittels weitergehender Techniken (konfokaler
Mikroskopie) nachweisen?
-
Welchen Anteil von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und dendritische
Zellen lassen sich in der Maus mit einem spezifischen Marker für dendritische Zellen
feststellen?
-
Welchen Einfluss hat eine LFA-1-Defizienz
der T-Lymphozyten auf die
Membrankontakte?
-
Welchen Einfluss haben immunhistologisch nachgewiesene Membrankontakte auf den
Zellzyklus oder den Einbau von BrdU während der S-Phase des Zellzyklus für die
T-Lymphozyten?
11
II. Literaturübersicht
1. Das Immunsystem
Jeder Organismus muss tagtäglich gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen und
anderen Substanzen geschützt werden. Im Laufe der Evolution haben sich verschiedene
Mechanismen entwickelt, die der effektiven Abwehr dienen. Die Aufgabe des Immunsystems
ist es, die Integrität des Körpers gegen das Eindringen dieser Fremdstoffe von außen zu
gewährleisten. Diese Abwehrreaktionen des Organismus gegen Pathogene werden einerseits
durch die unspezifische (angeborene) und durch die spezifische (erworbene) Abwehr
vermittelt (JANEWAY et al., 1999). Diese komplexen Vorgänge werden hier allerdings nur
vereinfacht dargestellt.
Die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen ist die unspezifische Immunität, die direkt
Effektorfunktionen zur Bekämpfung der Pathogene einleitet. Physikalisch-chemische
Barrieren wie der natürliche Säuremantel der Haut und den Epithelien der Schleimhäute
reduzieren ein Eindringen von fremden Substanzen bereits auf ein Minimum. Daneben haben
Granulozyten und Makrophagen die Aufgabe, schnell alle eingedrungenen Erreger zu
beseitigen. Makrophagen gehören zu einer Familie von langlebigen Zellen, die in fast allen
Geweben verteilt sind und ein frühes Warnsystem gegenüber dem Eindringen exogener
Agentien darstellen. Lösliche, zirkulierende Moleküle wie die Komplementfaktoren sind in
der Lage, sich an Mikroorganismen anzuheften und zu einer verbesserten Erkennung und
Phagozytose (Aufnahme von Fremdstoffen und Bakterien) zu führen (Opsonisierung)
(GORDON, 1999). Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) nehmen eine Zwischenstufe zwischen
der unspezifischen und spezifischen Immunität ein, da sie einerseits Virus-infizierte Zellen
aufspüren und eliminieren können, obwohl ihnen andrerseits Antigen-spezifische Rezeptoren
fehlen. Die Verteidigungsstrategien der unspezifischen Immunität laufen stets gleichartig ab
und sind unabhängig von einem vorherigen Kontakt mit den Erregern. Wenn diese Abwehr
durchbrochen wird, ist die spezifische Immunität gefordert, die sich mit der
Höherentwicklung der Wirbeltiere etabliert hat und vorwiegend von T- und B-Lymphozyten
vermittelt wird. Die Spezifität der Antigen-spezifischen Antwort ergibt sich aus dem
12
Repertoire von Antigenrezeptoren, die von den T- und B-Lymphozyten exprimiert werden.
Jeder individuelle T- oder B-Lymphozyt trägt Antigenrezeptoren auf seiner Zelloberfläche, die
in einzigartiger Weise fähig sind, spezifische Strukturdeterminanten (Epitope) oder Antigen
zu erkennen. Die Verschiedenheit (Diversität) der Antigenrezeptoren wird durch eine
kombinatorische Neuordnung einer Varietät von Immunglobulin- oder T-ZellrezeptorGensegmenten
und
somatischer
Mutation
gewährleistet.
Dieses
breit
angelegte
Immunrepertoire erlaubt der Lymphozytenpopulation, auf jedes virtuelle, potentiell pathogene
Agens reagieren zu können.
Die selektive Vermehrung eines Lymphozytenklons, die durch ein Antigen hervorgerufen
wird, ermöglicht es dem Immunsystem, die Immunantwort an häufig vorkommende
Pathogene anzupassen und ein immunologisches Gedächtnis zu entwickeln. Durch eine
erhöhte Frequenz von Antigen-spezifischen Lymphozyten und eine erhöhte Sensibilität
gegenüber dem Antigen können die sogenannten „memory“ Lymphozyten bei erneutem
Eindringen des Antigens schneller reagieren. Zusätzlich werden durch die spezifische
Immunabwehr auch die Schutzmechanismen der unspezifischen Abwehr verstärkt, indem z.B.
durch Botenstoffe (Zytokine, Chemokine) Phagozyten an den Ort der Entzündung gelockt
werden können, die bei der Eliminierung der Fremdstoffe unterstützend wirken (HALE u.
HAYNES, 1999).
B-Lymphozyten sind die Vorläufer von Antikörper-sezernierenden Plasmazellen, die eine
humorale Immunität vermitteln. Antikörper haften an eingedrungenen Antigenen, aktivieren
das Komplementsystem und führen zur verbesserten Aufnahme durch Makrophagen.
Besonders Bakterien und deren Toxine, die sich im extrazellulären Raum befinden, werden
durch
diesen
Mechanismus
eliminiert.
T-Lymphozyten
vermitteln
hingegen
die
Antigen-spezifische zelluläre Immunität und regulieren gleichzeitig auch die Funktion der
B-Lymphozyten und Makrophagen durch zelluläre Interaktionen und die Produktion von
Zytokinen. Die Wichtigkeit der T- und B-Lymphozyten zur allgemeinen Funktion des
Immunsystems wird durch die Vielzahl der infektiösen Erkrankungen reflektiert, die bei einer
verminderten Anzahl oder dem Fehlen dieser Zellen eintreten (z.B. kongenitale
Immundefizienz, Infektion mit dem humanen Immundefizienz Virus, HIV) (HALE u.
HAYNES, 1999; JANEWAY et al., 1999).
13
Der T-Zellrezeptor erkennt keine strukturellen Determinanten oder Epitope in ihrer nativen
Form. Stattdessen erkennen T-Lymphozyten proteolytisch zerteilte Peptidfragmente des
Antigens,
die
an
den
polymorphen
Anteil
der
Moleküle
des
Hauptgewebeverträglichkeitskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) auf der
Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle gebunden sind. Der Prozess, durch den
Antigene in Peptide abgebaut und an die MHC-Moleküle gebunden werden, wird als
Antigenprozessierung bezeichnet. Dabei existieren spezialisierte Abbauwege für Antigene, die
aus dem extra- oder intrazellulären Raum stammen. Extrazelluläre Antigene wie Bakterien
und Viren werden durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen, nach ihrem Abbau an
Moleküle des MHC Klasse II gebunden, auf der Oberfläche exprimiert und von CD4+
T-Lymphozyten erkannt. CD4+ T-Lymphozyten werden auch als T-Helferzellen bezeichnet,
da sie durch direkte Zellinteraktionen und die Ausschüttung von Zytokinen Makrophagen und
B-Lymphozyten aktivieren können. Antigene innerhalb der Zellen, wie sie nach Infektion
durch Viren, obligaten intrazellulären Pathogenen oder Tumorantigenen entstehen, werden
nach proteolytischem Abbau in Zusammenhang mit Molekülen des MHC Klasse I präsentiert
und von CD8+ T-Lymphozyten erkannt. CD8+ T-Lymphozyten werden auch zytotoxische
T-Lymphozyten genannt, da sie eine immunvermittelte Zerstörung von Virus-infizierten
Zellen oder Tumorzellen einleiten.
Der prädominante Ort der Sensibilisierung von Lymphozyten gegenüber neuem Antigen sind
die sekundär lymphatischen Organe, in denen die T-Lymphozyten und Antigenpräsentierenden Zellen, wie z.B. dendritische Zellen, in einem besonderen Mikromilieu
kolokalisiert sind (GUNN et al., 1999). In den lymphatischen Organen werden den
Lymphozyten Antigene aus dem Blut und den peripheren Geweben präsentiert und damit die
Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens eines spezifischen Lymphozyten mit seinem
Antigen erhöht. Dendritische Zellen (DC) nehmen dabei in den peripheren Geweben Antigen
auf, zerteilen es in kleine Peptide, wandern in die lymphatischen Organe und präsentieren es
dort zusammen mit dem MHC-Komplex auf ihrer Oberfläche. Durch zahlreiche
Oberflächenmoleküle (kostimulatorische oder akzessorische Moleküle) können sie TLymphozyten optimal stimulieren und Immunantworten einleiten. Die Schlüsselrolle für die
Kontrolle der Immunantwort durch die DC liegt hierbei im Wechsel des Phänotyps: von der
14
effektiven Antigenaufnahme (unreifer Phänotyp) zur effektiven Antigen-Präsentation (reifer
Phänotyp) (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998).
Um die Regulation und die Einleitung von Immunantworten besser nachvollziehen zu können,
werden im folgenden Abschnitt der Aufbau und die Funktion der lymphatischen Organe
erläutert.
2. Die lymphatischen Organe
Lymphozyten stammen von lymphoiden Vorläuferzellen ab, die sich frühzeitig aus
hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark entwickeln. Das Knochenmark dient
der Vermehrung der Lymphozyten, im Thymus wird die Entscheidung über die weitere
Entwicklung der T-Lymphozyten getroffen. Im Gegensatz zum Knochenmark und dem
Thymus, die als primäre oder zentrale lymphatische Organe gelten, werden die Milz, die
Lymphknoten und Darm-, Mukosa- oder Bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe (GALT,
respektive MALT und BALT), zu denen auch die Peyerschen Platten zählen, als sekundär
oder peripher lymphatische Organe bezeichnet. Bei lymphatischen Organen handelt es sich
um organisierte Gewebe, in denen die Lymphozyten Interaktionen mit nicht-lymphatischen
Zellen eingehen, die zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen können.
2.1 Die Milz
Die Milz ist ein beim Menschen etwa faustgroßes, bei der Ratte ein circa 3 cm langes,
kompaktes Organ, das als Blutfilter fungiert. Das Parenchym der Milz besteht aus zwei
Kompartimenten: die rote und die weiße Pulpa. In der roten Pulpa werden alternde
Erythrozyten phagozytiert, die durch die enge Passage der Milzgefäße nicht wieder in die
Blutbahn gelangen können, und zur Wiederverwertung in ihre Bestandteile zerlegt. Die weiße
Pulpa repräsentiert den Teil des Organs mit der höchsten Dichte an Lymphozyten und umfasst
drei Unterkompartimente: die periarterioläre lymphatische Begleitscheide, kurz PALS genannt
(T-Zellareal), die Follikel (B-Zellareal) und die Marginalzone. Die PALS ist konzentrisch um
15
die Zentralarteriolen, die durch die gesamte Milz ziehen, gelagert. Sie beinhaltet vorwiegend
T-Lymphozyten und dendritische Zellen, die hier aufgrund ihrer Morphologie mit zahlreichen
Ausläufern interdigitierende dendritische Zellen genannt werden (STEINMAN et al., 1997).
B-Lymphozyten befinden sich nur zu einem geringen Anteil in der PALS und sind dann
bevorzugt im äußeren Anteil (äußere PALS) anzutreffen. An diesem Übergang zwischen
T- und B-Zellareal finden Antigen-spezifische Interaktionen zwischen T-Lymphozyten und
wandernden B-Lymphozyten während primärer und sekundärer Immunantworten statt.
Antigen-spezifische B-Lymphozyten wandern aus der Marginalzone in die angrenzende
äußere PALS. Durch eine gegenläufige Wanderung wird das Zusammentreffen von
Antigen-spezifischen T- und B-Lymphozyten optimiert. B-Lymphozyten können so die
notwendige T-Zellhilfe erhalten und sich in der Marginalzone zu Antikörper-produzierenden
Plasmazellen entwickeln (VAN ROOIJEN, 1990). Die angrenzenden Follikeln beinhalten
vorwiegend B-Lymphozyten und nur wenige CD4+ T-Lymphozyten. Follikuläre dendritische
Zellen, die vermutlich nicht von Vorläufern aus dem Knochenmark stammen, halten auf ihrer
Oberfläche Antigen in nativer Form als Immunkomplex zurück und präsentieren es
B-Lymphozyten in den Keimzentren (STEINMAN et al., 1997). Die Marginalzone umgibt
PALS und Follikel und bildet ein breites, gut demarkiertes Band zwischen weißer und roter
Pulpa. In dieser Zone befinden sich vorwiegend eine Population von memory BLymphozyten, die durch eine sofortige Antikörperantwort auf Polysaccharidkomponenten aus
Bakterienkapseln einen Schutz vor Sepsis bieten (STEINIGER u. BARTH, 2000).
2.2 Lymphknoten
Lymphknoten sind in die Lymphbahnen eingeschaltete Filterstationen, die in ihrer Größe und
ihrer Anzahl im Körper variieren können. In den meisten Geweben befinden sich
lymphatische Gefäße, die als afferente Lymphbahnen die Lymphknoten speisen. Lymphknoten
bestehen aus einer Bindegewebskapsel, von der aus Trabekel in das Innere einstrahlen und
den Lymphknoten segmentieren. Von außen wird die Kapsel von den Vasae afferentiae, den
zuleitenden Lymphgefäßen, unterbrochen, von denen aus die Lymphe unter der Kapsel weiter
über die Intermediärsinus in den Marksinus und abschließend in die Vasae efferentiae
weitergeleitet wird. Der Lymphknoten wirkt hierbei als Filter sowohl für inerte Partikel (z.B.
16
Farbpartikel nach Tätowierungen) als auch für Bakterien oder Zellreste, die von den Fressund Immunzellen aufgenommen werden. Im Lymphknoten werden 3 Kompartimente
unterschieden: der Kortex, der Parakortex und die Medulla. Im Kortex sind die Lymphozyten
in primäre und sekundäre Follikel mit Keimzentren angeordnet, die in der Hauptsache von BLymphozyten und wenigen CD4+ T-Helferzellen besiedelt sind. Der Parakortex besteht
vorwiegend aus T-Lymphozyten und dendritischen Zellen. Eine Besonderheit des Parakortex
ist das Vorkommen von hochspezialisierten, postkapillären Venulen mit einem kubischen
Epithel (hochendotheliale Venulen, HEV), die es den Lymphozyten in hoher Anzahl
ermöglichen, aus dem Blut in die Lymphknoten einzuwandern. (PABST, 1994).
2.3 Peyersche Platten
Die Schleimhäute des Verdauungstraktes besitzen eine besonders große Oberfläche und ein
dünnes Epithel zur effektiven Resorption von Nährstoffen. Beides ermöglicht es aber auch
Pathogenen wie Bakterien oder Viren die Schleimhautbarriere zu überwinden, in das Gewebe
einzudringen und es zu schädigen. Das Darm-assoziierte, lymphatische Gewebe vermindert
das Eindringen und die Vermehrung der Mikroorganismen. Es setzt sich aus vielen vereinzelt
(solitär) gelegenen Follikeln und aus Follikeln mit spezialisiertem Epithel, den Peyerschen
Platten, auch „Plaques“ genannt, zusammen. Letztere sind im Bereich des gesamten
Dünndarmes anzutreffen und zeichnen sich dadurch aus, dass sie keine afferenten
Lymphgefäße besitzen. Zum Darmlumen hin sind sie mit einem spezialisierten Epithel
bedeckt, das den Antigenkontakt und die -aufnahme ermöglicht. In der Histologie sind auch
hierbei deutlich abgrenzbare Kompartimente zu erkennen: bei den Follikeln handelt es sich
ausschließlich um Sekundärfollikel mit aktiven Keimzentren und einem Randwall aus
kleineren Lymphozyten. In der zwischen den Follikeln gelegenen Interfollikulärregion
befinden sich in der Hauptsache dicht gepackt liegende T-Lymphozyten, DC und HEVs. Zum
Darmlumen hin kommt es zu einer kappenartigen Ansammlung von T- und B-Lymphozyten,
die Dom-Epithel genannt wird. Aufgrund seiner Funktion zeichnet sich das Epithel dort mit
einigen Besonderheiten aus: es hat weder Krypten noch Zotten, kaum oder keine Becherzellen
und ist somit nicht von einer Schleimschicht geschützt, trägt keine IgA-Rezeptoren und
zwischen den Epithelzellen finden sich Zellen, die zum Lumen hin eine membranförmige
17
Faltung haben und aufgrund ihrer Form M-Zellen („membranous cells“) genannt werden.
Durch Transzytose sind diese Zellen in der Lage, große Moleküle, Bakterien und Viren
aufzunehmen und mit den räumlich nahe gelegenen Immunzellen in Kontakt zu bringen
(PABST, 1994; GEBERT, 1997; BEIER u. GEBERT, 1998).
2.4. Morpholgie der sekundär lymphatischen Organe in LFA-1-defizienten Mäusen
LFA-1 (CD11a-/-/CD18) aus der β2- Integrinrezeptorfamilie wird vor allem auf Leukozyten
exprimiert und nimmt eine Schlüsselrolle in der Funktion, wie z. B. bei der Adhäsion dieser
Zellen an andere Zellen oder das Epithel, ein. LFA-1 setzt sich aus zwei Ketten zusammen,
die auf unterschiedlichen Genen kodiert werden: Integrin alpha L (CD11a, Ly 15, Ly 29) wird
auf dem Chromosom 7 kodiert, Integrin beta 2 auf Chromosom 10 (CD18). Die Produkte
beider Gene formen das funktionelle LFA-1. Wird die Expression eines der beiden Produkte
unterdrückt wie im vorliegenden Fall die Expression von CD11a, so liegt eine Defizienz des
LFA-1-Moleküls vor. Im Vergleich zu Wildtypmäusen, die eine normale Expression des LFA1-Moleküls auf der Oberfläche der Zellen aufweisen, konnte bei LFA-1-defizienten Mäusen
eine Vergrößerung der Milz bei männlichen Tieren um das 1,7 fache, bei weiblichen Tieren
um das 1,2 fache festgestellt werden. Die peripheren Lymphknoten hingegen sind um etwa
30% kleiner als bei Wildtypmäusen, wohingegen weder die mesenterialen Lymphknoten, noch
weitere Lymphknoten diese Veränderung aufwiesen. Bei der Analyse der T- und BLymphozyten konnte ein deutlicher Verlust von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in den
peripheren Lymphknoten nachgewiesen werden, in der Milz hingegen fanden sich signifikant
mehr T-Lymphozyten. Diese LFA-1-Defizienz resultierte in einer Reduktion der
Einwanderung von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten und in die Peyerschen
Platten auf etwa 30% (BERLIN-RUFENACH et al., 1999).
In den sekundär lymphatischen Organen werden die Funktionen der spezifischen
Immunabwehr eingeleitet. Nach Antigenkontakt durchlaufen die Lymphozyten verschiedene
Phasen der Reifung und werden in naive, Effektor und memory T-Lymphozyten eingeteilt, die
im folgenden näher erläutert werden.
18
3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort
3.1. Naive T-Lymphozyten
Nach ihrer Entstehung im Knochenmark wandern Prä-T-Lymphozyten in den Thymus ein.
Das T-Zellrepertoire muss weitgehend tolerant gegenüber körpereigenen Strukturen und
Proteinen sein. Um diese „zentrale Toleranz“ zu gewährleisten, werden während der
Entwicklung im Thymus körpereigene Proteine auf MHC-Molekülen von dendritischen
Zellen präsentiert. Zum einen werden Thymozyten darauf getestet, ob sie den
Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (major histocompatibility complex, MHC) auf den
körpereigenen Zellen erkennen (positive Selektion), zum anderen, ob sie eine verstärkte
Affinität auf körpereigenes Protein zeigen (negative Selektion). Etwa 95% der TLymphozyten überstehen diesen Prozess nicht und sterben im Thymus (SPRENT et al., 1996).
Nach ihrer Differenzierung im Thymus tragen naive T-Lymphozyten auf ihrer Oberfläche
bestimmte Moleküle, die dem Anheften an bestimmten Oberflächen (Adhäsion) oder der
Bindung von Proteinen aus der Zirkulation oder auf anderen Zellen (Rezeptoren) dienen. Zu
diesen Molekülen werden der T-Zellrezeptor, CD28 und CD4 oder CD8 gezählt, die sich auch
bei einer Aktivierung des Lymphozyten nur wenig in ihrer Expression verändern. Andere
Moleküle wie CD45RC und L-Selektin werden nach einem spezifischen Antigenkontakt
weniger oder nicht mehr exprimiert (BODE, 1998). Diese Moleküle werden auch zur
Unterscheidung des Aktivierungszustandes herangezogen. Diese T-Lymphozyten, die den
Thymus verlassen haben, aber noch nicht mit ihrem spezifischen Antigen in Kontakt
gekommen sind, werden auch als naive T-Lymphozyten bezeichnet, deren Lebensspanne in
der Maus etwa 6 Monate beträgt (DI ROSA et al., 1999).
19
3.2. Aktivierung und Effektorphase
Durch den T-Zellrezeptor (TCR) erkennen und binden T-Lymphozyten Peptide in
Zusammenhang mit MHC-Molekülen. Die Antigen-abhängige Stimulation des TCR resultiert
in einer komplexen Kaskade von biochemischen Signalereignissen, die drei mögliche Folgen
hat: Proliferation und klonale Expansion, Apoptose oder Anergie. Einige Ergebnisse lassen
vermuten, dass in Abhängigkeit des gebundenen Liganden, der Zeit oder anderen
Eigenschaften der physikalischen Bindung eine qualitativ und quantitativ unterschiedliche
Antwort hervorgerufen wird (LORD et al., 1999). Die Avidität der TCR-Bindung wird durch
die Moleküle CD4 oder CD8 verstärkt und es kommt zu einer Stabilisierung des Kontaktes
und einer Veränderung des Schwellenwertes durch ein direktes Signal oder Induktion der IL2-Transkription. Die Bindung weiterer kostimulatorischer Moleküle wie beispielsweise B7.1
(CD80), B7.2 (CD86) oder des interzellulären Zelladhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1, CD54) auf
der Zelloberfläche wird benötigt, damit T-Lymphozyten proliferieren können (HALE u.
HAYNES, 1999). B7 wird dabei eine zentrale Rolle in der Regulation der Proliferation
zugeschrieben. Einerseits führt es zum Überleben der Zellen (DEETHS u. MESCHER, 1999),
andrerseits kommt es durch die Bindung an das zytotoxische T-Zellantigen-4 (cytotoxic T
lymphocyte antigen-4, CTLA-4) zu einer Hemmung der Proliferation (CHAMBERS, 2001).
Aber auch durch die Neuanordnung von weit über die Oberfläche herausragenden Molekülen
wie CD45 und CD43 (Sialophorin, 45nm), durch die eine Interaktion des kleinen TCR (15nm)
mit dem MHC ermöglicht wird, kann die Aktivierung beeinflussen (SHAW u. DUSTIN,
1997). Integrine, u.a. LFA-1, werden dabei für den initialen Zell-Zell-Kontakt und
kostimulatorische Moleküle (CD28) zur Ausbildung eines stabilen Kontaktes benötigt. Eine
Bindung des TCR an den MHC-Peptid-Komplex ohne die gleichzeitige Bindung der
kostimulatorischen Moleküle führt zu Anergie oder „unresponsiveness“ des T-Lymphozyten,
d.h. die Zelle ist zwar weiterhin überlebensfähig, aber reagiert nicht weiter auf sein
spezifisches Antigen.
Eine vollständige Aktivierung führt zur Differenzierung der Zelle. Die Funktion der Zelle
wechselt vom Erkennen des Antigens zum Eliminieren der Mikroorganismen (ABBAS et al.,
1994). Bereits innerhalb von Sekunden nach der Bindung des TCR kommt es zur Auslösung
der Signalkaskade. Biochemische Veränderungen, die mit der Aktivierung des TCR
20
einhergehen, dauern über mehrere Stunden und bieten die Möglichkeiten der Beeinflussung
durch zusätzliche regulative Wege. Nach der TCR-Aktivierung werden innerhalb von etwa 2h
Zytokine sezerniert, zur DNS-Replikation kommt es nach 24h, eine Zellteilung erfolgt nach
48h, die Differenzierung in Effektorzellen benötigt einige Tage (HALE u. HAYNES, 1999).
Bei den Effektor T-Lymphozyten handelt es sich um große, blastoide Zellen, die eine hohe
Synthese von DNS zeigen. Es kommt zu einem Wechsel des auf der Oberfläche getragenen
Molekülmusters, die zum einen die Zytokinrezeptoren betreffen und zum anderen die
Adhäsionsmoleküle, die für das Anheften der Zellen am Endothel entscheidend sind
(SPRINGER, 1994). Durch die Interaktion mit dendritischen Zellen differenzieren sich
CD4+ T-Lymphozyten in zwei Klassen T-Helferzellen: TH1-Lymphozyten, die bevorzugt
Interferon-γ (IFN-γ) exprimieren, welches bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle
spielt, und die sich durch Hyperaktivierung von Makrophagen bei der Abwehr von
intrazellulären Pathogenen beteiligen. TH2-Lymphozyten sezernieren IL-4, Il-5, IL-6 und IL-10
(MOSMANN et al., 1991) und aktivieren B-Lymphozyten zur Produktion und Sekretion von
spezifischen Antikörpern (DEFRANCO, 1988). In Abhängigkeit des Zytokins kommt es bei
den B-Lymphozyten zur Synthese von verschiedenen Antikörperklassen (SWAIN et al.,
1996). Der Mechanismus der Differenzierung der T-Helferzellen ist nicht vollständig geklärt.
Es wird jedoch vermutet, dass DC nicht nur die Signale zur klonalen Expansion der
Helferzellen geben, sondern selektive Signale von unterschiedlichen funktionellen
Subpopulationen von DC zur Differenzierung der T-Helferzellen führen (BOTTOMLY, 1999;
RISSOAN et al., 1999). CD8+ T-Lymphozyten differenzieren sich in zytotoxische Zellen, die
durch infizierte Zellen angreifen und in die Apoptose treiben können (JANEWAY et al.,
1999).
3.3 Memory T-Lymphozyten
Die von den differenzierten Zellen sezernierten Zytokine können sich auf den gesamten
Körper schädlich auswirken. Aus diesem Grunde muss nach einer erfolgreichen Eliminierung
des Antigens die Immunantwort streng reguliert werden und die potentiell gefährlichen Zellen
beseitigt werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). Ein Hauptteil der Effektor T-
21
Lymphozyten, etwa 70%, wird dabei durch einen induzierten Zelltod, die Apoptose,
unschädlich gemacht (SMITH et al., 1980; BINNS et al., 1992; BOISE et al., 1995). Dabei
wird das auf der Oberfläche von Effektor T-Lymphozyten getragene Molekül Fas (CD95) von
seinem Liganden (Fas-L, CD95L) auf den dendritischen Zellen oder den Makrophagen
aktiviert und führt über eine Signalkaskade zum Abbau der DNS in den T-Lymphozyten
(NAGATA, 1997). Nach Abklingen einer Immunantwort überleben einige Antigenspezifische T-Lymphozyten und bilden das immunologische Gedächtnis („memory“).
Memory T-Lymphozyten werden in der Ratte durch den phänotypischen Verlust des Markers
CD45RC und in der Maus über die Kombination der Marker CD45low, L-Selektinlow und
CD44high identifiziert (TIETZ u. HAMANN, 1997). Sie kommen in höherer Frequenz als
naive T-Lymphozyten vor und haben eine längere Lebensdauer als diese. Bei einem
sekundären Kontakt zum spezifischen Antigen läuft die Immunabwehr schneller ab. Um
sowohl eine möglichst breite Reihe an Antigenen erkennen zu können, aber auch gleichzeitig
eine effektive Immunantwort auslösen zu können, bedarf es eines Gleichgewichtes zwischen
dem naiven und dem memory T-Zellpool. Die Aufrechterhaltung des T-Zellpools ist ein
aktiver Prozess, der eine kontinuierliche Bindung des TCR durch MHC auf z.B. dendritischen
Zellen erfordert. Diese Interaktion scheint über die Expression von Bcl-2 das Überleben der
T-Lymphozyten vermitteln zu können (TANCHOT u. ROCHA, 1998).
4. Die Migration von Lymphozyten
Eine charakteristische und zum Auffinden des spezifischen Antigens wichtige Eigenschaft
von Lymphozyten ist ihre Fähigkeit, in nahezu alle Organe und Gewebe ein- und auswandern
zu können („Migration“). Die Rezirkulation von Lymphozyten ist ausschlaggebend für die
Interaktion zwischen T-Lymphozyten und den dendritischen Zellen zur kontinuierlichen
Präsentation des gesamten Antigenrepertoires im Körper und damit zur Einleitung von
Immunantworten (WESTERMANN u. PABST, 1990). Dabei herrscht ein reger Verkehr
zwischen dem Blut, den Geweben und der Lymphe. Etwa 5 x 1011 Lymphozyten wandern
beim Menschen jeden Tag aus dem Blut aus und wieder zurück. Das Blut enthält nur 2% der
22
gesamten Lymphozyten, die sich im Durchschnitt nur etwa 30 Min dort aufhalten. Die meisten
Lymphozyten wandern in Organe wie die Lunge, Milz, Leber, Knochenmark und nur ein
geringerer Anteil, unter physiologischen Bedingungen, auch in die Haut, die Synovia, die
Muskulatur oder das Gehirn. Durch Entzündungsgeschehen oder chronische Erkrankungen
kann sich diese Situation aber deutlich verändern (WESTERMANN et al., 1988;
WESTERMANN u. PABST, 1996).
Ein Antigen, das die angeborene Immunabwehr durchbrochen hat, wird von dendritischen
Zellen aufgenommen und zu den lymphatischen Organen transportiert, wo optimale
Bedingungen für die Antigenerkennung herrschen (MONDINO et al., 1996). Ein Großteil der
naiven T-Lymphozyten gelangt über Adhäsionsmoleküle wie L-Selektin über die
hochendothelialen Venulen (HEV) in die sekundär lymphatischen Organe und durchwandert
das Gewebe. Findet in dieser Zeit keine Antigenerkennung statt, so wandern die naiven TLymphozyten über die efferente Lymphe (SMITH u. FORD, 1983) aus und gelangen wieder
in die Zirkulation (GIRARD u. SPRINGER, 1995). Die Anheftung an das Epithel und die
anschließende Einwanderung in das Gewebe umfasst dabei mehrere Schritte und wird durch
die Interaktion der Adhäsionsmoleküle auf den T-Lymphozyten und den spezifischen
Rezeptoren auf den Endothelzellen vermittelt. Dabei werden in der Literatur immer wieder
sogenannte „Homingrezeptoren“ diskutiert, die für den Eintritt der Lymphozyten in bestimmte
Gewebe verantwortlich sein sollen, wie z.B. L-Selektin für den Eintritt in periphere
Lymphknoten (GALLATIN et al., 1983), α4β7-Integrin für den Eintritt in die Peyerschen
Platten (HAMANN et al., 1994). In LFA-1-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass
die Migration von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten zwar bis auf 30% des
Wertes bei Wildtypmäusen abfällt, jedoch andere α4-Integrine wie α4β7 oder α4β1 das Fehlen
eines funktionellen LFA-1-Moleküls teilweise kompensieren können (BERLIN-RUFENACH
et al., 1999). Für die Milz konnte kein spezifisches Molekül identifiziert werden. Zusätzlich
zu den lymphatischen Geweben wandern naive T-Lymphozyten auch in die Leber (LUETTIG
et al., 1999) und die Lunge ein.
Findet bei der Durchwanderung z.B. des Lymphknotens eine Antigenerkennung statt, so stellt
die Bindung des TCR ein Stopsignal für den T-Lymphozyten da und führt zur Beendigung der
Migration (DUSTIN et al., 1997). Dieses Phänomen wird als ein Mechanismus angesehen, um
23
Antigen-spezifische Lymphozyten im drainierenden Lymphknoten anzureichern. Dabei ist die
Bindung des membrangebundenen LFA-1 mit seinen Liganden ICAM-1, -2 oder –3 auf den
T-Lymphozyten ein früher und essentieller Schritt in der Zellaktivierung. LFA-1 gehört zur
Familie der β2-Integrine und vermittelt eine Antigen-unabhängige Bindung der TLymphozyten mit dendritischen Zellen, aber auch mit dem Endothel von Gefäßen
(SPRINGER, 1990). Durch die Rezeptor-Ligandenpaare LFA-1/ ICAM, ICAM/ LFA-1,
CD2/ LFA-3 und CD28/ CD80 wird eine transiente Adhäsion zwischen CD4+ T-Lymphozyten
und DC vermittelt, wie durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden konnte (HAUSS
et al., 1995).
Die Interaktion mit der DC erfordert mehrere Stunden zur Initiierung der Zytokinproduktion,
zum Eintritt in den Zellzyklus und zur Differenzierung. Einige dieser Effektor TLymphozyten wandern vom Parakortex in die Follikel ein und initiieren dort eine BZellantwort, die zur Ausbildung von Keimzentren führt (FULLER et al., 1993). Andere TLymphozyten verlassen auch über die efferente Lymphe den Lymphknoten auf dem Weg in
das Blut (AGER, 1994).
Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten sind phänotypische Veränderungen der Zellen
verbunden, die u.a. zu einer Funktionsänderung, aber auch zu einem veränderten
Wanderungsverhalten führen. Auf aktivierten T-Lymphozyten werden Adhäsionsmoleküle
wie LFA-1, VLA-1 und CD2 verstärkt exprimiert, von denen angenommen wird, dass sie eine
erhöhte Interaktion mit dem Endothel bewirken. Dadurch könnte eine verbesserte
Einwanderung in nicht-lymphatische Gewebe und eine erhöhte Kapazität in entzündete
Gewebe einwandern zu können, erklärt werden (SPRENT, 1994). Entgegen der Annahme,
dass über diesen Mechanismus Antigen-spezifische T-Lymphozyten so an den Ursprung der
Entzündung wandern (DUNON et al., 1996), konnte gezeigt werden, dass Effektor TLymphozyten in alle Gewebe einwandern, aber nur in ihrem Herkunftsmilieu bevorzugt
proliferieren und vermindert der Apoptose anheim fallen (BODE et al., 1999). Effektor TLymphozyten finden sich vorwiegend in nicht-lymphatischen Geweben wie Lunge, Leber und
Darm wieder (HAMANN u. REBSTOCK, 1993; LUETTIG et al., 1999). Es konnten aber
auch Effektor T-Lymphozyten im Lymphknoten und in den Peyerschen Platten nachgewiesen
24
werden (BODE et al., 1999), obwohl auf vielen Effektor T-Lymphozyten kein oder nur
geringe Mengen L-Selektin exprimiert wird (DAILEY et al., 1985), das für den Eintritt über
HEV in Lymphknoten verantwortlich gemacht wird.
T-Lymphozyten, die nach der Aktivierung und Differenzierung entstehen und eine
Immunantwort überleben, werden als „memory“ Lymphozyten bezeichnet. Es konnte jedoch
gezeigt werden, dass sowohl naive wie auch memory T-Lymphozyten in der Lage sind, über
HEV in lymphatische Gewebe einzuwandern. Beide Subpopulationen wandern ebenfalls in BZellareale und Keimzentren ein. Dabei wandern T-Lymphozyten vom memory-Phänotyp
schneller durch die T-Zellareale und lassen sich deshalb in geringer Anzahl im Gewebe
auffinden (WESTERMANN et al., 1997). Für andere Spezies wie der Maus wird beschrieben,
dass sich memory T-Lymphozyten, wie auch Effektor T-Lymphozyten, vorwiegend in Leber
und Lunge ansammeln, aber nicht von der Migration in lymphatische Gewebe ausgeschlossen
sind (TIETZ u. HAMANN, 1997).
5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort
T- und B-Lymphozyten sind zwar die Botschafter der Immunabwehr, aber ihre Funktion steht
unter der Kontrolle der DC, die zu den effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen zählen
(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). B-Lymphozyten als Vorläufer der Antikörper
sezernierenden Plasmazellen können über ihren B-Zellrezeptor natives Antigen direkt
erkennen. Zur Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort benötigt der T-Lymphozyt
sein spezifisches Antigen in einer prozessierten und präsentierten Form in einem MHCPeptid-Komplex und kostimulatorischen Molekülen wie CD28 und LFA-1. Dabei müssen die
CD8+ T-Lymphozyten Fremdpeptide auf der Oberfläche von infizierten Körperzellen finden,
die sich überall im Körper befinden können. Die Menge spezifischen MHC-Peptid-Komplexe
auf infizierten und Tumorzellen ist gering (100 oder weniger pro Zelle), es fehlen meistens
kostimulatorische Moleküle und die Zellen müssen von seltenen T-Zellklonen (1: 100.000
oder weniger) erkannt werden, die T-Zellrezeptoren mit niedriger Affinität besitzen
(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). DC haben alle phänotypischen und funktionellen
25
Eigenschaften, die zur effizienten Einleitung einer zellulären Immunantwort nötig sind: in den
meisten Geweben vertreten, binden sie in der Peripherie Antigen, prozessieren es und
präsentieren es in einem MHC-Peptid-Komplex in Zusammenhang mit kostimulatorischen
Molekülen wie ICAM-1 und der B-7-Familie. Im Gegensatz zu Makrophagen liegt ihre
Aufgabe jedoch nicht in der Beseitigung der eingedrungenen Pathogene, sondern in der
Alarmierung des Immunsystems (STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).
Dendritische Zellen sind unverwechselbare Antigen-präsentierende Zellen (APC), die drei
Hauptfunktionen haben: 1. DC sind überaus potente APC. In vitro und in vivo sind nur einige
DC notwendig, um eine starke T-Zellantwort einzuleiten. DC induzieren eine sogenannte
gemischte Leukozytenreaktion (mixed leucocyte reaction, MLR), wobei nur eine DC
notwendig ist, um 100-3000 T-Lymphozyten zu stimulieren. DC aktivieren T-Lymphozyten
nicht nur gegenüber körperfremden MHC-Molekülen, sondern auch gegenüber einer Reihe
von Fremdproteinen und mikrobiellen Proteine wie Superantigenen, die ohne Prozessierung
direkt
an
die
MHC-Moleküle
binden
(BHARDWAJ
et
al.,
1993),
oder
den
„Standardproteinen“, die eine Prozessierung erfordern einschließlich Entzündungsprodukten
(INABA et al., 1993) und Tumorantigenen (MAYORDOMO et al., 1995; ZITVOGEL et al.,
1996). 2. DC induzieren als einzige Zellen primäre T-Zellabhängige Immunantworten, die
sich anschließend in T-Helfer oder zytotoxische Zellen differenzieren. 3. Nach der
Aktivierung durch DC können T-Lymphozyten effizient mit Makrophagen und BLymphozyten interagieren.
Der Wechsel von der Prozessierung des aufgenommenen Antigens und der Präsentation mit
anschließender Aktivierung von naiven T-Lymphozyten wird allgemein als „Reifung“
bezeichnet. DC, die sich in fast alle Geweben befinden, weisen einen „unreifen“ Phänotyp
auf, d.h. sie haben nur eine schwache stimulatorische Aktivität für T-Lymphozyten, die des
weiteren mit einer niedrigeren oder abwesenden Expression von Oberflächenmolekülen wie
MHC Klasse II, CD40, ICAM-1 oder B7-1 assoziiert ist. So ist MHC Klasse II bis zu 10 mal
niedriger exprimiert. Nach Isolierung aus Geweben und Organen reifen sie jedoch in der
Kultur schnell aus, was durch eine koordinierte Reihe von Veränderungen wie der
Hochregulierung der MHC-Moleküle und kostimulatorischer Moleküle deutlich wird
(STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999). Der Prototyp der unreifen DC ist die Langerhanszelle
in der Haut, die auch unter Zugabe von M-CSF nicht zu Makrophagen ausdifferenziert. In
26
vielen verschiedenen Kultursystemen sind die Stimuli untersucht worden, die zu einer
Ausreifung der DC führen. So werden DC durch Entzündungsstimuli und infektiöse Agentien,
wie z.B. LPS aus Bakterienwänden, aktiviert und produzieren Chemokine (MIP-1α, MIP-2,
MCP-1, TNFα), die Makrophagen, NK-Zellen, Neutrophile Granulozyten und weitere unreife
DC an den Ort der Entzündung locken. Danach erst durchlaufen sie ein induziertes
Reifungsprogramm, in dem sie irreversible Veränderungen von der Antigenaufnahme
(unreifer Phänotyp) über eine intermediäre Phase von 24-48h bis zur Auslösung von
Immunantworten (reifer Phänotyp) durchlaufen (RESCIGNO et al., 1999). Verglichen mit
anderen Leukozyten sind DC ungewöhnlich reich an Genprodukten des MHC Klasse II, das
sich in intrazellulären endozytotischen Vakuolen, MHC II reiche Kompartimente (MIIC)
genannt, befindet. Nach einem Stimulus erfolgt eine erhöhte Synthese der MHC Klasse II und
die Fusion der Vesikel. Das Antigen wird an das MHC-Molekül gebunden und auf die
Oberfläche der Zelle ausgeschleust, wobei die Halbwertszeit der Komplexe über 100h beträgt
und sie so über mehrere Tage T-Lymphozyten stimulieren können. Der Wechsel der
Kompartimentalisierung aus den MIIC an die Oberfläche erfolgt in 24h bis 48h nach den
Antigenaufnahme (PIERRE et al., 1997). Die Gegenwart der MIIC erklärt, warum der unreife
Phänotyp das Stadium in der Entwicklung der DC ist, in dem DC aktiv Proteine aufnehmen
und zur Präsentation für T-Lymphozyten prozessieren. Diese endgültige Ausreifung der DC
nach Stimulierung durch Entzündungsprodukte, virale und bakterielle Komponenten oder
durch CD40Ligand wird als der Kontrollpunkt zur Einleitung von Immunantworten oder
Toleranz angesehen (STEINMAN et al., 2000). Dabei werden kostimulatorische und
Adhäsionsmoleküle wie B7-2, MHC II und CD40 bereits nach 1-2h hochreguliert, B7-1 und
MHC I hingegen erst nach 4-6h initiiert und das Maximum nach 18h erreicht. Die Expression
der Chemokinrezeptoren (u.a. CCR1, CCR5) wechselt von der Erkennung von
Entzündungschemokinen (SLC, ELC) zu konstitutiv im Gewebe exprimierten Chemokinen.
Diesem Wechsel wird auch die erhöhte Wanderungsaktivität in lymphatische Gewebe
zugeschrieben, wo sie in den T-Zellarealen zurückgehalten werden und sich auf die Suche
nach Antigen-spezifischen T-Lymphozyten machen (RESCIGNO et al., 1999).
Wie es auch der Fall bei anderen Zellen von myeloider Abstammung ist, ist die Morphologie
zur Identifizierung der DC nützlich. So weisen DC lange, blattähnliche Ausläufer, die auch
27
Lamellipodia oder „veiled“ genannt werden, auf, die in verschiedene Richtungen vom
Zellkörper ausstrahlen. Im lebenden Zustand werden diese Ausläufer ständig neu geformt und
aktiv bewegt. Diese ungerichteten Bewegungen sind bei anderen Leukozyten nicht zu
beobachten. Obwohl diese Zelleigenschaften nicht so diagnostisch sind wie die gefärbten
Granula von eosinophilen oder basophilen Granulozyten, so ist doch die Morphologie der DC
ausreichend charakteristisch, um die Identifikation und Aufreinigung zu erlauben. In
humanem Blut, afferenter Lymphe und Haut von Mäusen, Affen und Menschen, aber auch in
den lymphatischen Organen von Mäusen, Ratten und Menschen sind DC untersucht worden.
Die einzigartige Morphologie der DC wurde dazu herangezogen, Methoden zur Gewinnung
von großen Mengen von DC zu etablieren. Durch FACS-Untersuchungen konnte gezeigt
werden, dass neben zahlreichen anderen Molekülen vor allem MHC-Produkte auf der
Oberfläche von DC exprimiert werden. Besonders MHC Klasse II ist überreichlich exprimiert.
Quantitative Bindungsstudien mit monoklonalen Antikörpern ergaben mehr als 106
Bindungsstellen pro Zelle (CELLA et al., 1997). Durch die Expression von MHC Klasse I,
sowie MHC Klasse II präsentieren DC sowohl Antigene aus dem Zytosol der Zelle, wie auch
aus endozytotischen Vesikeln (JANEWAY et al.,1999). DC exprimieren die meisten der
bekannten akzessorischen oder kostimulatorischen Moleküle für T-Lymphozyten wie CD40,
ICAM-1 (CD54), CD58, B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Diese Moleküle erklären die
Effizienz, mit der DC T-Lymphozyten binden und stimulieren. Die Interaktion ist
bidirektional in dem Sinne, dass die Bindung der T-Lymphozyten zu Veränderungen des TLymphozyten wie auch der DC führen. Dies ist besonders kennzeichnend für die Bindung von
CD40. Nach Interaktion mit CD40L auf aktivierten T-Lymphozyten bleibt die Lebensfähigkeit
der DC erhalten und sie produzieren große Mengen an IL-12 (HOWLAND et al., 2000;
KOCH et al., 1996; TAKASHIMA u. KITAJIMA, 1998). Spezifische Marker für andere
Leukozyten fehlen auf DC wie CD14 für Makrophagen, CD16 für NK-Zellen, CD19 und
CD20 für B-Lymphozyten. Zellspezifische Marker waren bislang aufgrund geringer
verfügbarer Anzahl an DC nur sehr schwierig zu identifizieren. Für den Menschen werden 3
Antigene zur Identifizierung verwendet: S100b, p55 und CD83, die jedoch nicht
zellspezifisch sind, da sie ebenfalls auf Zellen im Neuralgewebe exprimiert werden
(STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).
28
Die Charakterisierung der DC macht die Separation von anderen Leukozyten, im besonderen
aber von den Makrophagen notwendig. Diese Separation ist aufwendig, da DC in nur sehr
geringer Anzahl vorkommen, wie z.B. im humanen Blut, in dem sich das Verhältnis von
Monozyten zu DC auf 20-50:1 belaufen. Durch die Entwicklung von Kulturprotokollen ist es
neuerlich möglich (CRAWFORD et al., 1999; TALMOR et al., 1998), größere Mengen von
DC zu gewinnen und in der aktiven Immuntherapie gegen Tumorzellen oder virale Antigene
einzusetzen (HIRAO et al., 2000; LUDEWIG et al., 1999a; MANICKASINGHAM u. REIS,
2000; SCHULER u. STEINMAN, 1997). So konnten aus CD34+ humanen Blutzellen und aus
Monozyten durch die Zugabe von GM-CSF und Zytokinen Zellen mit DC-Charakter
gewonnen werden (TALMOR et al., 1998).
DC sind in vivo in den meisten Geweben (z.B. Langerhanszellen in der Epidermis, in der
afferenten Lymphe, in Herz, Nieren, IDC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe)
vorhanden und können aus den verschiedenen Kompartimenten über die afferente Lymphe
oder das Blut in die T-Zellareale der lymphatischen Organe einwandern. DC stellen jedoch
keine einheitliche Gruppe von Zellen dar. So konnte gezeigt werden, dass DC aus mehreren
verschiedenen Vorläuferzellen, aber auch verschiedene funktionelle Phänotypen von DC aus
der gleichen Vorläuferzellen in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen gewonnen werden
können (GRABBE et al., 2000). Auch im Blut, in der Milz (STEINMAN et al., 1997), den
Lymphknoten (DE ST GROTH, 1998; SALOMON et al., 1998) und den Peyerschen Platten
(ANJUERE et al., 1999; VREMEC u. SHORTMAN, 1997) sind verschiedene Subtypen von
DC anwesend.
Die speziellen Fähigkeiten der DC scheinen nur in Relation zur Expression der
Oberflächenmoleküle und zu ihrer Regulierung vor und während der Immunantworten zu
stehen (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Im Vergleich zu anderen Antigenpräsentierenden Zellen wie B-Lymphozyten oder Makrophagen werden MHC- Produkte und
MHC- Peptid-Komplexe auf den DC 10-100mal höher exprimiert. Des weiteren synthetisieren
DC hohe IL-12-Spiegel, die die angeborene wie erworbene Immunabwehr stimulieren
(CELLA et al., 1996; KOCH et al., 1996; SOUSA et al., 1997). Durch Freisetzung von
Chemokinen können sie T- und B-Lymphozyten anlocken und das Überleben der
rezirkulierenden T-Lymphozyten sichern. DC befinden sich in der afferenten Lymphe, sind
aber nicht in der efferenten Lymphe nachzuweisen (INGULLI et al., 1997). So sind DC 48h
29
nach enger Interaktion mit T-Lymphozyten nicht mehr nachzuweisen. DC erhalten während
einer Antigen-spezifischen Interaktion mit T-Lymphozyten auch Signale durch die TLymphozyten, u.a. durch Bindung des Fas-L, das die Apoptose der DC vermittelt (MATSUE
et al.,). Der aktive Zelltod der DC stellt einen Mechanismus zur Herunterregulierung einer
Immunantwort dar, um eine ständige Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten
zu vermeiden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).
Auch die Einleitung und das Aufrechterhalten der peripheren Toleranz benötigt ein Absuchen
der DC durch die T-Lymphozyten. Die Kontakte sind notwendig, um potentiell reaktive Klone
zu deletieren oder die Anergie zu versetzen. So sind DC in der Lage, apoptotische Zellen aus
dem Intestinaltrakt, die beim physiologischen Zelluntergang anfallen, von Tumoren, nach
Transplantationen oder nach Virusinfektion aufzunehmen, über die afferente Lymphe in die
Lymphknoten zu transportieren und dort den rezirkulierenden T-Lymphozyten zu präsentieren
(ALBERT et al., 1998a; ALBERT et al., 1998b; HUANG et al., 2000). Diese Wanderung tritt
auch in Abwesenheit von Antigen oder Entzündungen auf, wie in SPF-Tieren gezeigt werden
konnte. Im Gegensatz zur Nekrose führt die Aufnahme der apoptotischen Zellen jedoch nicht
zur Ausreifung der DC. Diese sind deshalb nur in geringem Ausmaß fähig, eine
Immunantwort gegenüber dem Selbstantigen auszulösen (SAUTER et al., 2000; STEINMAN
et al., 2000b).
Obwohl DC von großem Interesse für die Wissenschaft sind, ist der physikalische Kontakt in
vivo in den lymphatischen Organen nicht weiter untersucht worden. Gerade bei klinischem
Einsatz von DC bei neu entwickelten Impfschemata (DNS-Vakzinierung) oder in der
Tumorbehandlung ist es von Interesse, Immunantworten über die Charakterisierung der
Kontakte, das Wissen über die Funktion und die beteiligten Moleküle besser verstehen zu
lernen und beeinflussen zu können. So ist nicht weiter bekannt, ob die Mikroumgebung wie
die verschiedenen Kompartimente in den lymphatischen Organen die Interaktion beeinflusst,
wie es für die Einwanderung über HEV in die lymphatischen Organe berichtet wurde. Auch
der Einfluss der Oberflächenmoleküle auf die Interaktion von T-Lymphozyten und DC ist
bislang nicht weiter untersucht worden. Es wurde in der vorliegenden Arbeit versucht zu
klären, welcher Anteil der durch die lymphatischen Organe wandernden T-Lymphozyten
Kontakte zu dendritischen Zellen ausbildet. Durch ein kongenes Rattenmodell konnten
30
injizierte Zellen auf Immunhistologien nachgewiesen werden und damit das Verhalten in vivo
in den Kompartimenten aufgeklärt werden.
31
III. Material und Methoden
1. Geräte und Laborbedarf
Geräte
Autoklav
Memmert, Schwabach
Coulter Counter
Coulter Counter Electronics, England
Durchlichtmikroskop
Fa. Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Okular:
Kpl W 12,5
Objektive:
Zeiss 10x/ 0,22
Neofluar 25x/ 0,60
Zeiss 40x/ 0,65
IKA Schüttler, KS 501 D
Fa. Janke u. Kunkel, IKA-Labortechnik,
Staufen
konfokales Mikroskop
Objektive:
Leica TCS, Benzheim
Plan Apo, Immersionsöl 40x/ 1,0
Plan Apo, Immersionsöl 100x/ 1,4
Filtersätze:
N2.1 für TRITC, Cy3, Alexa 568
I3 für FITC, Cy2, Alexa 488
Kryostat, Typ 1720
Leitz, Wetzlar
pH-Meter, CG 840
Schott, Wiesbaden
Photomikroskop
Zeiss, Oberkochem
+Mikroskopkamera MC 80DX
Pipetten, einstellbar
Zeiss, Oberkochem
Eppendorf, Fa. Hinz, Hamburg
(100-1.000µl, 20-200µl, 10-100µl, 1-20µl)
Tischventilator FT-30
Salco, Bensheim
Zentrifuge Universal 30 RF
Hettich, Tuttlingen
Zytozentrifuge Typ Cytospin
Shandon INC., Pittsbourgh, USA
32
Geräte für Zellkulturarbeiten
CO2-Brutschrank
Heraeus, Hanau
Pinzette, gebogen, anatomisch
Aesculap, Tuttlingen
Sterile Werkbank
Mahl, Neuss
Drahtnetz (Porengröße 0,4mm)
Forschungswerkstatt der Medizinischen
Hochschule Hannover
Laborbedarf
Kulturflaschen , 260ml
Greiner, Frickenhausen
Objektträger, 76 x 25mm, geputzt
Menzel, Braunschweig
Pipettenspitzen, gelb und blau
Sarstedt, Nümbrecht
PAP-Pen (Wachsstift)
science service
Blue caps, 50ml
Falcon, Dänemark
Becton Dickinson, Heidelberg
2. Puffer, Medien und Materialien
PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung)
Serva, Heidelberg
TBS (Tris gepufferte Salzlösung)
Serva, Heidelberg
TTBS (TBS mit 0,05% Tween)
Merck, Darmstadt
EDTA-Puffer
(1mmol/l EDTA auf 1l Aqua dest.,
0,372mg EDTA-Puffer, mit 1mol/l NaOH
auf pH7,2 einstellen)
Antiklotting-Medium
( 0,9% NaCl + 2,5mmol/l EDTA
+ 5%BSA, auf pH7,2 einstellen)
33
Schwinzerlyse
(8,3g NH4Cl + 0,1g EDTA + 1,0g KHCO3
auf 1l Aqua dest.)
in vitro Stimulation
Kulturmedium (KM):
RPMI 1640
Biochrom KG, Berlin
mit
4mmol/l Glutamin
Biochrom KG, Berlin
15 µmol/l Hepes
ICN flow, Eschwege
100 U/ml Penicillin + 100µmol/lStreptomycin
Biochrom KG, Berlin
0,1 nmol/l beta-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt
Medium 199/ Hanks’
Biochrom KG, Berlin
fetales Kälberserum (FCS)
Biochrom KG, Berlin
5’-Brom-2’-Desoxyuridin (BrdU)
Sigma, Deisenhofen
Trypanblau, 0.16% in NaCl
Serva, Heidelberg
2% hitzeinaktiviertes Rattenserum in PBS
laboreigene Herstellung: gepooltes Blut von LEW (RT7a) und LEW.7B(BH)
Ratten wurde für 30 Min bei RT stehen gelassen, anschließend für 30 Min bei
800xg (RT) zentrifugiert, der Überstand in Blue caps aufgenommen und erneut
für 30 Min bei 800xg (RT) zentrifugiert. Das so erhaltene Serum wurde in 5ml
Portionen für 30 Min bei 56°C in Wasser inaktiviert und anschließend bei
-20°C bis zur Verwendung gelagert
Markierung der Mauszellen
2µmol/l 5-,6-carboxyfluorescein diacetat
succinimidyl ester (CSFE 557) in PBS
Molecular probes, USA
DIG-NHS
Boehringer Mannheim, Mannheim
34
(DIG-antibody labeling Kit Nr.1367200)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Immunhistologie
PAP-Substrat
280mmol/l 3,3’-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid
in 0,2% H2O2 in TTBS
Sigma, Deisenhofen
APAAP-Substrat
540µmol/l Naphthol-AS-MX-phospat
Sigma N4875, Deisenhofen
2,5mmol/l Fast Blue oder 1mMol Fast Red
Sigma, Deisenhofen
2% N,N-Dimethylformamid
Fluka 40240, Buchs
1mmol/l Levamisol
Sigma L 9756, Deisenhofen
0,1 mol/l Tris, pH 8,2
Fixierung:
Paraformaldehyd (PFA)
4%ig: 8g Paraformaldehyd auf 200ml PBS pH 7,2
Methanol, z.A. (6009)
Merck, Darmstadt
Aceton, z.A. (14.2500)
Merck, Darmstadt
Hämatoxylin
Fluka, Buchs
Glycergel (Einschlußmittel C 563)
Dako, Hamburg
Moviol (4-88)
Hoechst AG, Frankfurt
35
3. Antikörper
Primäre Antikörper
Tabelle 1 zeigt Antikörper (Spalte 2), die in der vorliegenden Arbeit für die Charakterisierung
in der Immunhistologie eingesetzt worden sind. Soweit nicht anders beschrieben, wurden
monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Die Antikörper wurden mit verschiedenen
Konjugationen eingesetzt (Spalte 3). Des weiteren wird die Verdünnung, der Isotyp des
Antikörpers und die Veröffentlichung angegeben, in der der Einsatz des Antikörpers
beschrieben wurde.
Spezifität
Antikörper/
Konjugat
Isotyp
Spezies
Verdünnunga Referenz
IgG1
Ratte
1:2, 1:5
Klon
Anti-TCR
R73b
(HUNIG et al., 1989)
Anti-CD28
JJ319
b
IgG1
Ratte
1:2, 1:5
(TACKE et al., 1997)
B-Lymphozyten
HIS 14
IgG1
Ratte
1:50
(KROESE et al., 1987)
Ratte
1:100
IgG1
Ratte
1:100
(KAMPINGA
1990)
α-IgD
CD45RC
c
His 41
biotinyliert
et
al.,
MHC Klasse II
Ox 6
IgG1
Ratte
1:500
(FUKUMOTO et al.,
1982)
ICAM-1
1A29
IgG1
Ratte
1:300
1:500
(konfokal)
(TAMATANI
u.
MIYASAKA, 1990)
Ki-67 Antigen
MIB5
IgG1
Ratte
1:5000
(SCHLUTER
1993)
Interdigitierende
dendritische
Zellen
NLDC-145d
IgG 2a
Maus
1:50
(KRAAL et al., 1986)
(BREEL et al., 1987)
Alkalische
Phosphatase
IgG
Maus
1:150
biotinyliert
IgG1
Maus
1:5000
Anti-DigoxigeninAP
Anti-Fluoreszin
B13-DE-1
biotinyliert
a
et
al.,
(RIGBY et al., 1977)
Die Verdünnung erfolgte, soweit nicht anders aufgeführt, für die primären Antikörper in der Ratte in 0,9% NaCl
+ 5% Rattenserum, 1:2. In der Maus erfolgte die Verdünnung in PBS + 5% Mäuseserum, zu gleichen Teilen.
Die Verdünnung der biotinylierten Antikörper erfolgte in PBS und 20% Mäuseserum.
b
Zur Stimulierung der T-Lymphozyten wurden die Zellkulturüberstände dieser Hybridome eingesetzt.
c
Nachweis des RT7b Molekül nach Injektion von Zellen in kongene LEW (RT7a)
d
Wird in der Literatur auch als Multilektin-Rezeptor DEC-205 bezeichnet.
Antikörper und sekundäre Nachweisreagenzien
36
Tabelle 2 zeigt die Antikörper und die sekundären Reagenzien, die in der vorliegenden Arbeit
für den Nachweis gebundener Antikörper eingesetzt wurden. Soweit nicht anders beschrieben,
wurden monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Zusätzlich wird die Verdünnung,
der Isotyp des Antikörpers und die Firma angegeben, die diesen Antikörper vertreibt.
Spezifität
Antikörper
Konjugat
Isotyp
Verdünnunga Firma/ Vertrieb
Kaninchen-Ig
Alexa 568
CyTM 5
IgG
1:100
Dianova, Hamburg
CyTM 3
IgG
1:100
Dianova, Hamburg
Ig-Fraktion
1:50
Dako, Hamburg
polyklonal
(Ziege)
Hamster-Ig
Alexa 488
polyklonal
(Ziege)
Maus-Ig
Z259, polyklonal
(Kaninchen)
Maus-Ig
Ratten-Ig
D651
APAAP
1:50 (in TTBS)
Z494, polyklonal
Dako, Hamburg
b
Dako, Hamburg
1:100 b
Dako, Hamburg
1:100
Boehringer
1:100
(Kaninchen)
Ratten-Ig
D488
BrdU
APAAP
Peroxidase
IgG1
Mannheim,
Mannheim
Alkalische Phosphatase-
1:50
Dako, Hamburg
1:50
Dako, Hamburg
1:500
Dianova, Hamburg
Anti-Alkalische
Phosphatase (APAAP)
Peroxidase-AntiPeroxidase (PAP)
Streptavidin-Peroxidase
(SAAP)
a
die Verdünnung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, in PBS und 5% Rattenserum
b
in TTBS + 5% Mäuseserum
37
4. Versuchstiere
Als
Versuchstiere
wurden
kongene
Lewis-Rattenstämme
eingesetzt.
Durch
den
Polymorphismus im Gen RT7 (Allele RT7a und RT7b) exprimieren LEWIS (RT7a) und
LEW.7B(BH)
Rattenstämme
zwei
unterschiedliche
Varianten
der
Protein-Tyrosin-
Phosphatase, Rezeptor Typ C (Ptprc, CD45) (WONIGEIT, 1979). Das Gen RT7 wurde auch
als ART-1, RT-Ly-1, T200 oder Leucocyte common antigen (L-ca) bezeichnet. Dabei kann
das RT7B-Molekül durch den monoklonalen Antikörper His41 nachgewiesen werden
(KAMPINGA et al., 1990). Bei einer Transplantation oder einer Injektion von Zellen eines
Stammes in den anderen findet keine Abstoßungsreaktion statt und Zellen lassen sich in
einem in vivo Modell verfolgen. Die Ratten wurden unter spezifiziert pathogenfreien
Bedingungen (SPF) im Tierlabor der medizinischen Fakultät der Universität Manchester
(naive, memory T-Lymphozyten-Versuche) und im Tierhaus der Medizinischen Hochschule
Hannover (Effektor T-Lymphozyten-Versuche) gezüchtet und gehalten. Die Ratten wurden in
Gruppen bis zu drei Tieren in Makrolonkäfigen Typ III auf staubfreiem Weichholzgranulat
gehalten. Die in den Kontrollversuchen zum Nachweis der DC eingesetzten C57BL/6 Mäuse
wurden in Makrolonkäfigen Typ II gehalten. Die Raumtemperatur lag bei 22±2°C, die relative
Luftfeuchtigkeit bei 55±5%, die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt. Die
Tiere wurden mit einem pelletierten, autoklavierten Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der
Firma Altromin GmbH (Lage) [Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,00%, Rohfett 4%, Rohfaser
6,00%, Rohasche 7,00%, Rohwasser 10% und N-freie Extraktstoffe 54%; Zusatzstoffe (je kg):
Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg] gefüttert. Zur
Wasserversorgung wurde steriles Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libitum bereitgestellt.
Die Tiere wurden regelmäßig jedes Quartal auf das Vorkommen von Erregern entsprechend
der Liste GV-SOLAS (1986) untersucht.
Lymphozyten-Funktionsantigen-1-defiziente (LFA-1, αL/ β2, CD11a-/-/ CD18) Mäuse wie sie
von BERLIN-RUFENACH et al. (1999) beschrieben wurden, wurden freundlicherweise von
Frau Dr. N. Hogg, England, zur Verfügung gestellt. LFA-1-defiziente Mäuse wurden im
Tierlabor des „Lymphocyte Molecular Biology Labratory“, London, gezüchtet und unter
spezifisch pathogenfreien Konditionen in Übereinstimmung mit Regulationen des „United
38
Kingdom Home Office“ gehalten. Sie wurden routinemäßig auf Parasiten, Bakterien und Pilze
untersucht und wurden für pathogenfrei befunden.
Das Gewicht richtete sich nach dem Verwendungszweck und lag bei den Ratten zwischen
250-350g, bei den Mäusen zwischen 20-30g.
Genehmigung:
Das Tierversuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Hannover unter der Nummer 60442502-94/716, ein Fortsetzungsantrag unter der gleichen Nummer und ein Neuantrag unter
der Nummer 604-42502-99/166 genehmigt.
5. Gewinnung, Aufbereitung und Injektion von Subpopulationen der
Lymphozyten
5.1. Naive und memory CD4+ T-Lymphozyten
Durch die Kanülierung des Ductus thoracicus von Spendertieren konnte die Lymphe über
mehrere Stunden gesammelt werden. Nach der von WESTERMANN et al. (1996)
beschriebenen Aufbereitung der Zellen wurden jedem kongenen Empfängertier 20 x 106 naive
(CD45RC+) oder memory (CD45RC-) CD4+ T-Lymphozyten in die Schwanzvene injiziert Die
Empfängertiere wurden nach 30 Min (jeweils n=5 für Ratten mit naiven oder memory CD4+
T-Lymphozyten), nach 2 Stunden (n= 6, jeweils naive und memory), nach 24 Stunden (n=6
für naive, n=5 für memory) und nach 48 Stunden (n= 2 für naive, n= 1 für memory) unter
Etheranästhesie durch Entbluten aus der Bauchaorta getötet. Es wurden die Milz, die
mesenterialen Lymphknoten, sowie die Peyerschen Platten entnommen, in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Von diesen Organen wurden anschließend
Gefrierschnitte in einer Dicke von 5µm angefertigt, luftgetrocknet und bis zur weiteren
Verwendung (s. 6.1.) in Aluminiumfolie gewickelt bei -20°C gelagert.
39
5.2. Effektor T-Lymphozyten
Zwei LEW.7B(BH) Ratten wurden nach CO2-Begasung durch Herzpunktion entblutet. Die
axillären, zervikalen, brachialen und mesenterialen Lymphknoten wurden unter sterilen
Bedingungen entnommen und in einem Metallsieb (0,4mm Porendurchmesser) in maximal
50ml Medium-199/Hanks zerzupft und in ein 50ml Blue Cap aufgenommen. Anschließend
wurde die Zellsuspension für 10 Min bei 400xg (bei 4°C) zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Pellet in 20ml (4°C) neues Medium wieder aufgenommen. Nekrotische
Zellen wurden beseitigt, indem die Zellsuspensionen mit 5ml FCS unterschichtet und danach
bei 400xg für 10 Min (bei 4°C) zentrifugiert wurden. Nach zweimaligem Waschen in M199
wurde das Pellet in 10ml aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen mit 0,16%
Trypanblau in NaCl angefärbt und mikroskopisch eine Zellzählung der vitalen Zellen
durchgeführt.
Danach erfolgte eine Antikörperinkubation für 30 Min auf Eis. Dazu wurden die Zellen erneut
zentrifugiert (200xg, 10 Min, 4°C) und mit den Kulturüberständen der Hybridome R73
(Antikörper gegen den αβ-T-Zellrezeptor gerichtet) und JJ319 (Antikörper gegen CD28
gerichtet) inkubiert, wobei für eine vollständige Antikörperanlagerung 1ml der optimalen
Konzentration (1:2 bis 1:5 in M199, abhängig von der verwendeten Charge, durch Titration
im Facs kontrolliert, beschrieben von BODE, 1998) des Kulturüberstandes auf 10 x 106
Zellen eingesetzt wurden. Nach erneutem Waschen und Zentrifugation bei 200xg für 10 Min
bei 4°C wurde zur Markierung der aktivierten Zellen, wie bereits beschrieben (FRITZ et al.,
1990) dem Kulturmedium 5µmol/l BrdU zugesetzt, das als Thymidinanalogon während der SPhase des Zellzyklus in die DNS eingebaut wurde.
Zur Kreuzvernetzung der Antikörper wurden 260ml Kulturflaschen vor dem Gebrauch mit
Ziegenantikörpern gegen Mausimmunglobuline (Maus-Ig, 3µg/ml) in PBS über Nacht bei 4°C
beschichtet. Der überschüssige Antikörperanteil wurde vor der Eingabe der Zellen zweimal
mit PBS ausgewaschen (TACKE et al., 1995). Die jeweiligen Zellsuspensionen mit einer
Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml wurden bei 37°C und einer 5% CO2-Konzentration für 72
Stunden im Brutschrank inkubiert. BODE (1998) konnte mit dieser Methode 78,8 ± 6,1% der
Zellen nachweisen, die BrdU eingebaut hatten. Von diesen Zellen war der überwiegende Teil
40
T-Lymphozyten,
die
jeweils
etwa
zur
Hälfte
CD4+
und
CD8+ gewesen
sind.
Kontrollexperimente zur Messung des BrdU-Einbaus wurden im ELISA durchgeführt und
ebenfalls von BODE (1998) beschrieben.
Um die mit BrdU markierten 20-100 x 106 Lymphknotenzellen zu injizieren, wurden
männliche LEW-Ratten (RT7a) mit Ethylether narkotisiert und die Zellen intravenös (i.v.) in
1ml M199 in die Schwanzvene gegeben. Die Ratten wurden nach 1h (n=3), 9h (n=4), 24h
(n=8), 72h (n=4) und 96h (n=3) erneut narkotisiert und durch Öffnen der Aorta abdominalis
entblutet. Die Lymphknoten, die Peyerschen Platten und die Milz wurden entnommen, in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Von diesen Organen wurden 5-7µm
dicke Gewebeschnitte angefertigt, an der Luft getrocknet und anschließend bis zur weiteren
Verwendung (s. 6.2.) in Aluminiumfolie bei -20°C gelagert.
6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten
Gewebeschnitten
6.1. Darstellung der Membrankontakte zwischen naiven oder memory CD4+ TLymphozyten mit interdigitierenden dendritischen Zellen in den T-Zellarealen der
lymphatischen Organe
Die Färbung und Fixierung der Präparate erfolgte nach bereits etablierter Methode
(WESTERMANN et al., 1997). Die Fixierung wurde durch eine 10 minütige Inkubation (bei
-20°C) in Methanol und Azeton zu gleichen Teilen vorgenommen. Anschließend erfolgte eine
Spülung mit 0,05% Tween 20 in TBS. In einem ersten Schritt wurde der monoklonale
Antikörper gegen das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, 1A29) in einer
Verdünnung von 1:300 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) für 30 Min auf die Objektträger
aufgebracht, das sowohl von dendritischen Zellen wie auch von B-Lymphozyten exprimiert
wird. Alternativ dazu wurde der monoklonale Maus-Antikörper anti-IgD in einer Verdünnung
von 1:100 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) verwendet. Nach zweimaligem Waschen in
PBS erfolgte eine zweite Inkubation für 30 Min mit einem Brückenantikörper Kaninchen-anti-
41
Maus in der Verdünnung von 1:50 (in PBS und 5% Rattenserum). Nach zweimaligem
Waschen in PBS wurde der Brückenantikörper erneut für 15 Min aufgetragen und wieder
abgespült. Anschließend wurde zur Wiedererkennung der injizierten Spender-T-Lymphozyten
des PVG.7B Stammes der biotinylierte Antikörper His 41 (1:100, 30 Min, in PBS und 20%
Mäuseserum), gefolgt von Avidin-Peroxidase (30 Min) verwendet. Für die Anfärbung der
Spenderzellen in braun wurde Diaminobenzidin eingesetzt. Die dendritischen Zellen (s.Abb.1,
S. 53), beziehungsweise die B-Lymphozyten (s.Abb.4, S. 60) wurden mit dem Substrat Fast
Blue in blau sichtbar gemacht. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in 70%igem Ethanol
(30 Min) fixiert und luftgetrocknet. Hämatoxylin diente in den meisten Fällen als
Gegenfärbung. Die Präparate wurden mit Dako-Glycergel eingedeckelt und wie in 9.1.
beschrieben ausgewertet.
6.2. Darstellung der Membrankontakte von Effektor T-Lymphozyten mit IDC in den TZellarealen der lymphatischen Organe
Die Gewebeschnitte der Milz, der Lymphknoten und der Peyerschen Platten der
Empfängertiere nach Injektion von aktivierten Lymphknotenzellen wurden untersucht. Diese
wurden bei -20°C für 10 Min in gleichen Teilen Methanol/Aceton fixiert und danach in TTBS
gewaschen.
Alle nachfolgenden Inkubationsschritte erfolgten 30 Min bei Raumtemperatur (RT) in einer
feuchten Kammer. Die Objektträger wurden mit dem primären Antikörper inkubiert, um die
injizierten LEW.7B(BH)-Lymphozyten (mAb His41) und die Expression von ICAM-1 (mAb
1A29) auf den dendritischen Zellen darzustellen. Nach zweimaligem Waschen in TTBS
wurden die Zellen mit dem sekundären Antikörper Z259 (Kaninchen-anti-Maus, 1:50 in PBS
+ 5% RS) inkubiert. Nach erneutem Waschen in TTBS wurde der tertiäre Antikörper (D651,
Maus-APAAP, 1:50 in TBS-Tween) auf die Präparate gegeben. Zur Verstärkung des Signals
wurde die Inkubation mit dem sekundären und tertiären Antikörper für jeweils 15 Min
wiederholt. Das Oberflächenantigen, an das der primäre Antikörper (His41) gebunden hatte,
wurde durch die Inkubation des APAAP-Substrates mit Fast Blue in blau visualisiert
(WESTERMANN u. PABST, 1996; WILLFUHR et al., 1989). Nach gründlichem Spülen
42
wurden die Präparate in 70%igem Ethanol für 30 Min fixiert und für weitere 30 Min vor dem
Ventilator getrocknet.
Um das eingebaute BrdU zu detektieren, wurden die Präparate mit Formamid und NaOH
denaturiert. Dazu wurden 190ml Formamid auf 70°C erwärmt und dann 8 Min mit 100mmol/l
NaOH gemischt. In diesem Gemisch wurden die Objektträger 30 sec inkubiert. Nach Waschen
in 70°C warmen TTBS wurden die Präparate für 15 Min in 70°C warmen Formamid mit
7,5mmol/l Trinatriumcitrat inkubiert. Darauf erfolgte ein Spülen in eiskaltem TBS für 15 Min
und eine Fixierung mit 1% Formaldehyd bei RT. Des weiteren wurden sie mit TTBS
gewaschen und 10 Min mit 0,2% Glutaraldehyd bei RT fixiert. Nach erneutem Spülen in
TTBS wurden die Objektträger über Nacht mit 50µl Anti-BrdU-Antikörper (1:500, in TBS +
5% Rattenserum, 1:2) im Kühlschrank inkubiert. Nach Abspülen des überschüssigen
Antikörpers mit TTBS wurden die Objektträger mit dem APAAP-Komplex inkubiert und die
Inkubationsschritte ein zweites Mal für jeweils 15 Min wiederholt. Zur Darstellung des BrdU
wurden 2mg Fast Red mit 3ml APAAP vorsichtig vermischt und für 10 Min bei RT stehen
gelassen. Anschließend wurden die Präparate für genau 25 Min damit inkubiert. Wie in
Abb.10 (s. S. 73) zu erkennen ist, waren die injizierten T-Lymphozyten nach dieser Färbung
in blau, BrdU+ Zellen anhand eines roten Kernes zu erkennen. Dendritische Zellen stellten
sich durch den Nachweis des ICAM-1 auf ihrer Oberfläche in braun dar. Nach gründlichem
Waschen mit TTBS wurden die Präparate mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die fertigen
Präparate wurden mit Dako Glycergel eingedeckelt.
6.3. Herstellung und Färbung von Blutzytospots
Um die injizierten Zellen im Blut der Empfängertiere zu detektieren und auszuzählen, wurden
500µl Blut mit 10ml Schwinzerlyse versetzt und für 10 Min inkubiert. Anschließend wurden
die Leukozyten zentrifugiert (400xg, 10 Min, RT). Diese Zellen (1 x 106 Zellen/ml) wurden in
Antiklotting-Medium (0,9%NaCl, 2,5mmol/l EDTA, 5% BSA bei pH 7,2) aufgenommen und
bei 200xg für 8 Min bei RT in einer Zytozentrifuge auf Objektträger aufgebracht.
Anschließend wurden diese getrocknet und bis zur immunzytologischen Färbung (s. 6.4.) bei 20°C gelagert.
43
6.4. Darstellung der Zellen im Zellzyklus
Der monoklonale Antikörper MIB5 reagiert mit dem nukleären Protein „Ki-67“, das während
aller aktiven Phasen des Zellzyklus (G1-M2) in der Ratte exprimiert wird und mit der
Zellproliferation assoziiert wird (GERLACH et al., 1997). Die Spezifität des Antikörpers in
der Immunhistochemie und bei anderen Analysen ist von CATTORETTI et al. (1992) und
SCHLUTER et al. (1993) beschrieben worden.
Zur Darstellung der Ki-67+-Zellen wurden Zytospots vom Blut (s. 6.3.) und 5-7µm dicke
Gefrierschnitte der Milz und der Lymphknoten nach Injektion von naiven, memory (s. 5.1.)
und aktivierten (s. 5.2.) T-Lymphozyten immunhistochemisch angefärbt. Dabei wurde, wie
bereits für die Darstellung von BrdU (siehe 6.2.) beschrieben, zuerst eine Oberflächenfärbung
und nach Denaturierung die Färbung des Zellkernantigens durchgeführt. Nach dem Trocknen
der Gewebeschnitte und Einkreisen mit dem PAP-Pen wurden die Präparate für 10 Min bei
-20°C in einem Gemisch von Methanol/Aceton zu gleichen Teilen fixiert und danach
zweimalig in PBS gewaschen. Im weiteren wurden die Objektträger für 30 Min bei RT mit
50µl des primären Antikörpers inkubiert, um auf der Oberfläche der Zellen ICAM-1 (1A29,
1:300, in 0,9%NaCl und Rattenserum, zu gleichen Teilen) zu identifizieren. Nach
zweimaligem Spülen in PBS wurden die Präparate bei 4°C für 45 Min in Paraformaldehyd
(PFA) fixiert und anschließend zweimal in TBS gewaschen. Daraufhin wurden die
Gefrierschnitte mit dem sekundären Antikörper, einem Kaninchenantikörper gegen Maus-Ig
(1:50, in PBS und 5%Rattenserum, 1:2) für 30 Min auf dem Schüttler inkubiert und einmal in
TBS/Tween abgewaschen. Eine weitere Inkubation erfolgte mit einem Maus-APAAPAntikörper für 30 Min bei RT. Die letzten beiden Inkubationsschritte wurden jeweils für 15
Min wiederholt. Die Identifizierung der injizierten LEW.7B(BH) Lymphozyten erfolgte durch
die Inkubation mit dem biotinylierten, monoklonalen Antikörper His41 (His41-Biotin in PBS
und 20% Mäuseserum, 1:100), wie bereits unter 6.2. beschrieben. Die Inkubation erfolgte für
1h bei 4°C in einer feuchten Kammer. Zur Visualisierung des biotinylierten His41 wurden die
Präparate für 45 Min bei RT mit Streptavidin alkalische Phosphatase (in PBS und 5%
Rattenserum) inkubiert, in TBS gewaschen und für 10 Min in Benzidin (4ml TBS/Tween mit
80µl H2O2 und 160µl Benzidin) inkubiert. Anschließend wurden die Oberflächenantigene
44
durch 25minütige Inkubation des APAAP-Substrates und Fast Blue in blau visualisiert,
gewaschen, für 30 Min mit 70%igem Ethanol fixiert und anschließend getrocknet.
Zur Darstellung des Zellkernantigens Ki-67 wurden die Zellen in EDTA (0,372g/l, pH 7,2) in
90°C warmen Wasserbad für 45 Min denaturiert. Daraufhin erfolgte ein zweimaliges Spülen
in eiskaltem TBS für jeweils 10 Min. Über Nacht wurde der Antikörper zur Darstellung von
Ki-67 (Mib5, 1:5000, in PBS, 1% BSA und 0,1NaN3) auf die Objektträger aufgebracht.
Nachdem der überschüssige Antikörper durch Spülen mit PBS entfernt worden ist, erfolgte
die Visualisierung des APAAP-Komplexes mit Fast Red, so dass proliferierende Zellen durch
einen roten Kern zu identifizieren waren. Wie in der Darstellung des BrdU in 6.2. stellen sich
dendritische Zellen durch die Expression von ICAM-1 in braun, injizierte T-Lymphozyten in
blau dar. Mib+ Zellen lassen sich durch einen roten Zellkern differenzieren (ähnlich der
Abb.10, S.73, keine eigene Darstellung).
Nach einer Gegenfärbung für 30 sec mit Hämatoxylin wurden die fertigen Präparate mit
Glycergel eingedeckelt.
6.5. Darstellung der BrdU+ Effektor T-Lymphozyten
Wie unter 5.2. beschrieben, wurden Lymphknotenzellen gewonnen und mit Antikörpern
gegen den TCR und CD28 (1:2 bis 1:5 abhängig von der Charge) für 30 Min auf Eis
inkubiert. Um herausfinden zu können, welcher Anteil der injizierten T-Lymphozyten sich
innerhalb der untersuchten Organe in der S-Phase befindet, wurde abweichend von dieser
Beschreibung dem Kulturmedium kein BrdU zugesetzt. Zur Kreuzvernetzung der Antikörper
wurden die Zellen für 72h bei 37°C und einer 5% CO2-Konzentration in Kulturflaschen
inkubiert, die zuvor mit Ziegenantikörpern gegen Maus-Ig (3µl/ml) beschichtet worden waren.
Die Injektion erfolgte wie in 5.2. beschrieben in die Schwanzvene. Nach 24h (n=2) und 72h
(n=10) wurden die Tiere durch Entbluten getötet und die Organe entnommen. Eine Stunde vor
der Entblutung erfolgte unter Ethernarkose eine intravenöse Injektion von 5mg BrdU/ 100g
Körpergewicht. Alle Zellen, die sich innerhalb dieser Stunde in der S-Phase befunden haben,
haben BrdU eingebaut. Es wurden Gewebeschnitte angefertigt und die Darstellung der Zellen
erfolgte wie bereits in 6.2. beschrieben.
45
7.
Immunhistologisch
gefärbte
Gewebeschnitte
in
der
konfokalen
Mikroskopie
Naive und memory T-Lymphozyten wurden, wie bereits unter 5.1. beschrieben, gewonnen
und die Milz 24h nach Injektion der Spenderlymphozyten aufbereitet (jeweils n=3). Es
wurden 14µm dicke Gewebeschnitte der Milz angefertigt und auf Gelatine-beschichtete
Objektträger aufgebracht. Die Gefrierschnitte wurden dabei mit einem Wachsstift (PAP-Pen)
umrandet und 1-2 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Präparate wurden für 10 Min
in einem Gemisch von Methanol/Aceton zu gleichen Teilen fixiert und anschließend für 3 x 5
Min in TBS mit Tween 20 gewaschen. Anschließend wurde die Vorinkubationslösung
(PBS+BSA+1% NaN3+10% Ziegenserum) auf die Schnitte aufgetragen und diese für 1 h in
einer feuchten Kammer bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Objektträger 3 x 5
Minuten in TBS + Tween gewaschen und danach der in PBS+1%BSA+0,1%NaN3 verdünnte
primäre Antikörper (ICAM-1, 1:500) aufgegeben. Der nichtgebundene Anteil des primären
Antikörpers wurde nach einer Stunde durch erneutes Waschen in TTBS entfernt und
anschließend der fluorochrom-markierte sekundäre Antikörper (Alexa 568, 1:100, in PBS+5%
Rattenserum) aufgegeben und in einer feuchten Kammer 1 h im Dunkeln inkubiert. Zur
Darstellung der injizierten T-Lymphozyten wurde der zweite primäre Antikörper (His41bio,
1:100, in PBS+10% Mäuseserum) auf die Objektträger aufgegeben und für 1h inkubiert. Nach
wiederholtem Waschen wurde der zweite, Fluorochrom-markierte sekundäre Antikörper,
Alexa 488 (1:100, in PBS+5% Rattenserum) für 1h aufgetragen. Nach 3 x 5 Min Spülen in
TTBS wurden die Objektträger mit Moviol eingedeckelt. Wie in Abb.6 (S.63/ 64)
zu
erkennen ist, stellten sich die injizierten T-Lymphozyten anschließend in der roten
Fluoreszenz, die ICAM-1+ DC in der grünen Fluoreszenz dar.
Die Schnitte wurden mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie untersucht. Nach
Anregung der Fluorochrome bei 488nm und 568nm mit einem Laser wurden für die
Übersichtsaufnahmen 11-17 Schnitte im Abstand von 0,5µm mit dem 40er Objektiv bei
unterschiedlichen Nachvergrößerungen aufgenommen und im ‘extended focus’-Modus
übereinander projiziert. Zur Dokumentation von Detailaufnahmen der Membrankontakte
zwischen den injizierten, kongenen T-Lymphozyten und dendritischen Zellen wurde ein 100 x
46
Ölimmersions-Objektiv (numerische Apertur 1,4) verwendet und einzelne Schnitte im 0,5µm
Abstand gespeichert. Diese wurden als Einzelschnitte untersucht oder in einer Projektion
betrachtet. Die Bilder wurden digital nachbearbeitet (Adobe Photoshop 4.0). Zur
photographischen Dokumentation wurden Ekta Chrom 64 Filme von Kodak verwendet.
8. Darstellung von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC
im Mausmodell
8.1 Darstellung der Expression des Multilektin-Rezeptors DEC-205 auf
interdigitierender dendritischer Zelle im T-Zellareal der Milz
Die Milz von 12 Wochen alten C57BL/6 Mäusen wurde entnommen, tiefgefroren und daraus
Gewebeschnitte hergestellt. Diese wurden für 10 Min bei -20°C in einem Gemisch von
Methanol/Aceton fixiert und danach gewaschen. Die Objektträger wurden für 30 Min mit dem
primären Antikörper NLDC-145 (non-lymphoid dendritic cell antigen of 145 kDa, 1:50)
inkubiert, um die dendritischen Zellen im T-Zellareal der Milz über die Expression des
Multilektinrezeptors DEC-205 darzustellen. Nach erneutem Waschen wurden die Präparate
mit dem sekundären Antikörper Z494 (1:100 mit PBS und 5% Mäuseserum) für 30 Min
inkubiert, gewaschen und mit dem tertiären Antikörper D488 (1:100) für weitere 30 Min
inkubiert. Zur Verstärkung der Bindung wurde die Inkubation mit dem sekundären und
tertiären Antikörper für jeweils 15 Min wiederholt. Die Darstellung des Oberflächenantigens
des primären Antikörpers erfolgte durch die Inkubation des APAAP-Substrates mit Fast Blue.
Nach gründlichem Spülen wurden die Präparate mit Hämatoxylin für 30 Min gegengefärbt
und anschließend mit Dako-Glycergel eingedeckelt. Wie in Abb.8 (S.68) zu erkennen, stellen
sich die dendritischen Zellen in blau dar.
47
8.2 Nachweis von Membrankontakten zwischen markierten Wildtyp- oder
LFA-1-defizienten Zellen und DC in der PALS der Maus
Zur Markierung der Zellen wurden C57BL/6 und LFA-1-defiziente (CD11a-/-/ CD18) Mäuse
im Alter von 12 Wochen durch Genickbruch getötet und die Milz und der mesenteriale
Lymphknoten entnommen. In einem engmaschigen Drahtnetz (Porengröße 0,4mm), bedeckt
mit Medium 199, wurde vorsichtig das Fett entfernt und die Organe zerzupft. Die so
gewonnenen Zellsuspensionen wurden bei 400xg für 10 Min bei RT zentrifugiert, der
Überstand abgesaugt und die Zellen in M199 wieder aufgenommen. Durch die Zugabe von
25ml Schwinzerlyse für 10 Min wurden die Erythrozyten lysiert und durch Zentrifugation bei
400xg für 10 Min entfernt. Die Zellen wurden wiederholt in PBS gewaschen und in 12ml
resuspendiert. Nach Zugabe von 10ml PBS pH7,2 wurden die Zellen erneut für 10 Min bei
400xg zentrifugiert, anschließend in 1ml PBS aufgenommen und bis 2ml aufgefüllt.
Anschließend wurden die Zellen mit 0,16% Trypanblau in NaCl angefärbt und mikroskopisch
eine Zellzählung der vitalen Zellen (80-210 x 106 Zellen) durchgeführt.
Zum Nachweis der Zellen in den Empfängermäusen wurde ein Teil der Zellsuspension mit
Fluoreszenzmarker CSFE markiert. Da gleichzeitig Spenderzellen aus LFA-1-defizienten
Mäusen, aber auch von Wildtypmäusen intravenös in Wildtypmäuse injiziert wurden, wurden
die Zellsuspensionen mit zwei unterschiedlichen Markierungen (CSFE und DIG-NHS)
versehen. Dazu wurden 50 x 106 Zellen (in 2ml) mit einer 2µmol/l CSFE-Lösung (in PBS) für
30 Min bei 37°C inkubiert. Zur Markierung des anderen Anteils der Zellsuspension mit DIGNHS wurden 50 x 106 Zellen in 60µg DIG-NHS für 15 Min bei RT inkubiert. Nach der
Markierung wurden die Zellen in PBS gewaschen, bei 400xg für 10 Min bei RT zentrifugiert
und in 1200µl PBS+0,1%BSA resuspendiert. Um einen Einfluss der Markierung auf das
Wanderungsverhalten der Zellen ausschließen zu können, wurde die Markierung für die
LFA-1-defizienten Zellen und die Wildtypzellen gewechselt.
Als Empfängertiere dienten 12 Wochen alte männliche Wildtypmäuse (C57BL/6), die 300µl
eines Gemisches aus CSFE- und DIG-NHS-markierten (Wildtypzellen und LFA-1defiziente
Zellen in wechselnder Markierung) Zellen i. v. in die Schwanzvene erhalten haben.
Nach 2h wurden die Empfängermäuse durch Genickbruch getötet, die Milz entnommen und
tiefgefroren. Wie unter 8.1. beschrieben, wurden Gewebeschnitte hergestellt und nach einer
48
Fixierung in Methanol/Aceton der primäre Antikörper NLDC-145 (1:50) und im Falle der
Darstellung der CSFE-Markierung der Antikörper B13-DE-1bio (1:5000) aufgegeben. Nach
gründlichem Waschen wurden die Objektträger mit dem sekundären (Z494, 1:100 in TTBS +
5% Mäuseserum) und dem tertiären (D488, 1:100 in TTBS + 5% Mäuseserum) Antikörper für
jeweils 30 Min inkubiert und beide Schritte nach erneutem Waschen für jeweils 15 Min
wiederholt. Zuzüglich zu den DC in der PALS wurden die vor der Injektion markierten Zellen
dargestellt. Um Zellen darzustellen, die mit DIG-NHS markiert worden sind, wurden die
Präparate mit anti-Dig P (1:150 in PBS + 5% Mäuseserum) für 30 Min inkubiert, gewaschen
und für 10 Min mit Benzidin inkubiert. Durch die anschließende Inkubation des APAAPSubstrates mit Fast Blue für 25 Min wurde das Oberflächenantigen des primären Antikörpers
visualisiert. Zellen, die mit CSFE markiert worden waren, wurden für 30 Min mit
Streptavidin-Phosphatase inkubiert, im weiteren, wie zuvor beschrieben, mit Benzidin und
anschließend Fast Blue dargestellt. Injizierte Zellen wiesen damit eine braune Färbung auf.
Dendritische Zellen waren in blau zu erkennen (siehe Abb.8, S.68). Alle Präparate wurden mit
Dako-Glycergel eingedeckelt.
9. Auswertung
9.1. Ermittlung der Anzahl von Membrankontakten zwischen den injizierten TLymphozyten und den dendritischen Zellen in den sekundär lymphaischen Organen
In den T-Zellarealen der Milz, des Lymphknotens und der Peyerschen Platten wurden
mindestens 200 injizierte T-Lymphozyten gezählt und von diesen der Anteil ermittelt, die sich
in direktem Membrankontakt zu ICAM-1+ dendritischen Zellen befinden. Dabei wurden 3-6
Gewebeschnitte eines jeden Organs des jeweiligen Empfängertieres begutachtet und in die
Auswertung einbezogen. Für den Zeitpunkt 24h nach Injektion wurden für naive (n=6), für
memory (n=5) und für Effektor (n=7) Empfängertiere ausgewertet und aus diesen Mittelwert
und Standardabweichung errechnet. Für die weiteren Zeitpunkte wurden 3 bis 5 unabhängige
Versuche ausgewertet.
49
9.2. Ermittlung der Anzahl von Membrankontakten mit der konfokalen Mikrospkopie
In einer 100er Vergrößerung der PALS wurden in der Teilprojektion (computergestützte
Übereinanderlagerung von 9 Einzelschnitten) einzelne injizierte Lymphozyten ausgewählt und
eingeteilt, ob sie einen Membrankontakt mit einer DC aufweisen (mit/ohne Kontakt). Diese
Zellen wurden über die Einzelschnitte verfolgt, um festzustellen, in wie vielen Schichten die
Zellen Kontakt haben und wie der Kontakt ausgebildet ist. Durch Einzelschnitte, die ober- und
unterhalb der Teilprojektion gelegt worden waren, konnte zudem analysiert werden, ob die
ausgewählten T-Lymphozyten weitere Membrankontakte aufwiesen. Es wurden 24h nach
Injektion Präparate von naiven und memory T-Lymphozyten (je n=3) ausgewählt. Es wurden
pro Tier 3 bis 5 Ausschnitte der PALS ausgewertet.
9.3. Ermittlung der Membrankontakte im Mausmodell
Milz- und Lymphknotenzellen aus Wildtypmäusen und aus LFA-1-defizienten Mäusen
wurden wechselweise mit CSFE oder Digoxigenin markiert und gleichzeitig zu gleichen
Anteilen in Wildtypmäuse injiziert. Zwei Stunden nach der Injektion wurde die Milz der
Empfängertiere entnommen und die unter 8.2. beschriebenen Immunhistologien ausgewertet.
Dabei wurde zum einen der Anteil der empfängereigenen (endogenen) Zellen bestimmt, die
Membrankontakt zu DC in der PALS aufgewiesen haben. Zum anderen wurde die Anzahl der
markierten Zellen ausgewertet und unter diesen der Anteil der Zellen mit einem Kontakt zu
DC bestimmt. Es wurden jeweils n=6 Tiere für die Markierung mit CSFE und Digoxigenin
ausgewertet, wobei für jeden Versuch mindestens 3 Schnitte ausgewertet wurden. Es wurden
Mittelwert und Standardabweichung errechnet.
9.4. Ermittlung des Prozentsatzes von T-Lymphozyten im Zellzyklus oder in der S-Phase
im Blut
Nach 24h und 72h wurde der Prozentsatz der Lymphozyten im Zellzyklus (Ki-67+) oder in der
S-Phase (BrdU+) ermittelt. Dazu wurden mindestens 100 His41+ injizierte Lymphozyten
50
identifiziert und der prozentuale Anteil daran bestimmt, der sowohl His41+, als auch BrdU+
oder Mib+ war. Aufgrund des geringen Prozentsatzes BrdU+ Lymphozyten wurden nur etwa
20-40 dieser Zellen ermittelt. Es wurden Mittelwert und Standardabweichung von 2-10
Versuchen errechnet.
9.5. Ermittlung von Membrankontakten von T-Lymphozyten im Zellzyklus oder in der
S-Phase mit DC in der Milz
In immunhistologischen 3-fach Färbungen der Milz sind 1h, 9h, 24h, 72h und 96h nach
Injektion der kongenen Spenderzellen die His41+ T-Lymphozyten analysiert worden, die einen
Kontakt zu einer DC hatten und daran der Anteil ausgewertet, der sich im Zellzyklus (Mib+)
befand. Zum Vergleich dazu wurde der Anteil der His41+-Mib+ ermittelt, die keinen Kontakt
mit DC hatten. In der Milz wurde zuzüglich zwischen einem inneren und äußeren Anteil der
PALS unterschieden.
Mit dem gleichen Prinzip sind Präparate von Tieren ausgewertet worden, die eine Stunde vor
der Organentnahme BrdU intravenös erhalten hatten. Es sind die Zeitpunkte 24h und 72h nach
Injektion ausgewertet worden. Es wurden mehrere Organschnitte von jeweils 2-10
unabhängigen Versuchen ausgewertet.
10. Verwendete Computerprogramme und Statistik
Zur Auswertung der computergespeicherten konfokalen Bilder wurde das Programm confocal
assistant und Adobe Photoshop, Version 4.0 verwendet.
10.1. Statistik
Die Daten wurden mit SPSS für Windows Version 6.0 oder Version10.0 (SPSS Inc., Chicago,
IL, USA) erfasst. Mittelwerte und Standardabweichung wurden errechnet. Als nichtparametrische Tests dienten entweder der Mann-Whitney-U-Test oder der Wilcoxon Test.
51
Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn in einem der Tests p<0,05
erreicht wurde.
10.2. Graphik
Die graphische Verarbeitung der Daten erfolgte mit Sigma Plot Version 5.0 (Scientific
Graphing Software, Jandel Cooperation, Erkrath).
52
IV. Ergebnisse
A. Untersuchung der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit
interdigitierenden dendritischen Zellen in den sekundär
lymphatischen Organen der Ratte
Als prädominanter Ort der Sensibilisierung von T-Lymphozyten gegenüber ihrem
spezifischen Antigen und der Regulation vieler T-Zellabhängigen Immunantworten sind die
sekundär lymphatischen Organe bekannt. Die Ausübung dieser Funktionen setzt die
Kolokalisation von 2 verschiedenen Populationen von Leukozyten voraus: die TLymphozyten und die dendritischen Zellen. Aus diesem Grunde war es wichtig, im
vorliegenden in vivo Modell sowohl die T-Lymphozyten, als auch die interdigitierenden
dendritischen Zellen immunhistologisch in der Milz, den Lymphknoten und den Peyerschen
Platten identifizieren zu können.
1.
Injizierte T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen
können
auf
immunhistologisch
gefärbten
Gewebeschnitten
identifiziert werden.
Im kongenen Rattenmodell konnte festgestellt werden, welche Anzahl von T-Lymphozyten in
Membrankontakt zu den interdigitierenden dendritischen Zellen lag. Durch die Separation von
naiven und memory T-Lymphozyten über die Expression der hohen (CD45RChigh) oder
niedrigen (CD45RClow) Isoform des allgemeinen Leukozytenantigens und die polyklonale
Aktivierung über den T-Zellrezeptor und CD28 konnten verschiedene Aktivierungszustände
beobachtet werden.
In Abb. 1A ist die Milz zu erkennen. Um die Zentralarterie herum befindet sich die
periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), in der sich vorwiegend T-Lymphozyten
und nur wenige B-Lymphozyten befinden. Angrenzend sind Follikel zu erkennen, die sich
durch die gut demarkierte Marginalzone von der roten Pulpa unterscheiden lässt. Auch im
53
Lymphknoten und in den Peyerschen Platten sind T-Zellareale zu sehen, in denen sich
zahlreiche injizierte T-Lymphozyten differenzieren lassen. Im Lymphknoten (Abb. 1C) lassen
sich die T-Lymphozyten überwiegend im Parakortex ausmachen. Angrenzend ist der Kortex
mit einem Follikel zu sehen. Die Medulla ist in diesem Anschnitt nicht zu erkennen.
Betrachtet man einen vergrößerten Ausschnitt der PALS in Abb. 1B, so lassen sich zahlreiche
injizierte, in braun angefärbte T-Lymphozyten erkennen. Daneben sind über die Expression
des interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) in blau angefärbte Zellen zu erkennen, die
interdigitierende dendritische Zellen darstellen. Bei der Auswertung von Immunhistologien
der lymphatischen Organe wurden verschiedene Kriterien zur Identifizierung der DC zu
Grunde gelegt, da bislang kein monoklonaler Antikörper in der Ratte zur Verfügung steht.
Reife DC exprimieren auf ihrer Oberfläche das Molekül ICAM-1 sowie MHC II. Diese lassen
sich über monoklonale Antikörper (1A29, respektive Ox6) nachweisen. Ein zweites Kriterium
ist die charakteristische Morphologie der DC, die zur Unterscheidung herangezogen wurde.
Neben einem großen Zellkern besitzen DC zahlreiche blattähnliche Zellausläufer, die sich in
alle Richtungen von der Zelle aus erstrecken und die diesen Zellen ihren Namen verliehen
haben. Die Lokalisation der ICAM-1+-DC im T-Zellareal der lymphatischen Organe stellt das
dritte Kriterium dar.
B-Lymphozyten und auch Makrophagen exprimieren ebenfalls ICAM-1 und MHC II auf ihrer
Oberfläche. Wie in Abb.1A zu erkennen ist, ist die Expression von ICAM-1 auf den BLymphozyten
jedoch
schwächer
und
ermöglicht
eine
deutliche
Abgrenzung
der
Kompartimente. Aus diesem Grunde wurden in den nachfolgenden Versuchen DC über die
Expression von ICAM-1 nachgewiesen. Des weiteren weisen B-Lymphozyten eine zumeist
runde Morphologie auf und sind deutlich kleiner als die DC und befinden sich in der
Hauptsache in den an die PALS grenzenden Follikeln. B-Lymphozyten erleichtern so die
Abgrenzung zwischen roter und weißer Pulpa. Makrophagen lassen sich aufgrund ihrer
unregelmäßigen Konturen von DC und B-Lymphozyten unterscheiden und sind in der PALS
nur selten anzutreffen.
54
Abb. 1
Im kongenen Rattenmodell können die den Empfängertieren injizierten T-Lymphozyten durch den mAb
His41 und interdigitierende dendritische Zellen durch die hohe Expression von ICAM-1 nachgewiesen
werden.
Dargestellt sind immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte der Milz, des mesenterialen Lymphknotens und der Peyerschen
Platten. Naive (CD45RChigh) und memory (CD45RClow) CD4+ T-Lymphozyten wurden in kongene Empfängertiere injiziert.
Die lymphatischen Organe wurden 24h später entnommen. T-Lymphozyten wurden durch den mAb His41
immunhistologisch in braun dargestellt. Zusätzlich sind interdigitierende dendritische Zellen über ihre hohe Expression des
interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1) in blau dargestellt und durch ihre charakteristische Morphologie und ihre
Lokalisierung im T-Zellareal identifiziert worden.
(A) In der Übersichtsvergrößerung der Milz sind die rote (RP) und weiße Pulpa zu erkennen, wobei sich die letztere weiter in
die um die Zentralarterie (Za) gelegene periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), die Follikel (F) und die
Marginalzone (Mz) einteilen läßt. (APAAP-Technik, 250fache Vergrößerung)
(B) Deutlich sind zahlreiche Membrankontakte (schwarze Pfeile) zwischen den injizierten T-Lymphozyten und
interdigitierenden dendritischen Zellen zu erkennen. (APAAP-Technik, 1000fache Vergrößerung).
(C) Im Lymphknoten lassen sich ein Follikel (Fo) im Kortex und der Parakortex (Pk), das T-Zellareal, unterscheiden
(400fache Vergrößerung).
(D) In den Peyerschen Platten lassen sich das Domepithel (Do), die Krypten (Kr), Follikel (Fo) und Interfollikulärregion (Ifr)
abgrenzen (400fache Vergrößerung).
55
2. In den sekundär lymphatischen Organen befinden sich 80% der
injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden
dendritischen Zellen.
In der PALS, deutlicher zu erkennen in der höheren Vergrößerung (Abb.1B), befindet sich ein
großer Anteil der injizierten T-Lymphozyten in enger Nachbarschaft zu stark ICAM-1+
interdigitierenden dendritischen Zellen. Durch ihre zahlreichen langen Ausläufer bilden IDC
ein Netzwerk, durch das die T-Lymphozyten wandern. Die Pfeile weisen auf
Membrankontakte zwischen den einzelnen Zellen hin. Ausgewertet wurde im folgenden der
Anteil der T-Lymphozyten, die in Membrankontakt zu IDC liegen, als Prozentsatz an den
injizierten kongenen T-Lymphozyten, die im Organ zu identifizieren sind. Es sind keine
Zellanhäufungen (Kluster) der injizierten T-Lymphozyten um die IDC zu beobachten, wenn
sich auch häufig mehr als ein T-Lymphozyt an einer IDC befindet.
Wie in Abb.2 zu erkennen ist, befinden sich in der Milz über 80% His41+ T-Lymphozyten in
Membrankontakt mit IDC. Die untersuchten Subpopulationen der T-Lymphozyten, d.h. die
naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten, unterscheiden sich hinsichtlich des
prozentualen Anteils der Kontakte nicht. Für alle Subpopulationen liegt der Mittelwert des
Prozentsatzes bei 80%±10%. Betrachtet man daraufhin den mesenterialen Lymphknoten oder
die Peyerschen Platten, so findet sich das gleiche Bild auch dort wieder. Die
Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten mit IDC stellen ein konstantes Phänomen dar,
das vermutlich von den Subpopulationen der T-Lymphozyten nicht beeinflusst wird, obwohl
BODE (1998) zeigen konnte, dass sich die Expression von z.B. L-Selektin und des IL-2Rezeptors deutlich auf naiven und aktivierten T-Lymphozyten unterscheidet. Auch die
unterschiedliche Mikroumgebung in den sekundär lymphatischen Organen scheint keinen
Einfluss auf das Ausmaß der Membrankontakte zwischen den T-Lymphozyten mit den IDC
zu haben. Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist das dichte Netzwerk, dass durch die
DC mit ihren zahlreichen Ausläufern gebildet wird, wie es sich auch in der Immunhistologie
in Abb.1 zu sehen ist. Gelangen T-Lymphozyten in die sekundär lymphatischen Organe,
müssen sie auf ihrer Wanderung durch dieses Netzwerk hindurch und bekommen so
zahlreichen Kontakt zu den DC.
56
100
Milz
80
Anteil der T-Lymphozyten in Membrankontakt
mit IDC an injizierten T-Lymphozyten [%]
60
40
20
100
Lymphknoten
80
60
40
20
100
Peyersche Platten
80
60
40
20
naiv
memory
E
effektor
Subpopulationen der T- Lymphozyten
Abb. 2
In der Milz, dem mesenterialen Lymphknoten und den Peyerschen Platten befinden sich über
80% der injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen
Zellen.
Zum Zeitpunkt 24h nach Injektion von kongenen naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten
wurden die Milz, der mesenteriale Lymphknoten und die Peyerschen Platten entnommen und
Gewebeschnitte angefertigt (siehe 5.1 und 5.2). Immunhistologisch wurden die injizierten TLymphozyten mit dem mAb His41 und IDC über ICAM-1 dargestellt. Die Membrankontakte der TLymphozyten mit IDC wurden ermittelt und der Anteil der Kontakte als Prozentsatz an den injizierten
T-Lymphozyten aufgeführt. Es sind Mittelwert und Standardabweichung von n=5-7 unabhängigen
Versuchen aufgeführt.
57
Neben den Kriterien der Lokalisation und ihrer charakteristischen Morphologie wurde die
hohe Expression von ICAM-1 zur Identifikation der IDC verwendet. Auf ausgereiften
interdigitierenden dendritischen Zellen ist jedoch MHC Klasse II sehr hoch exprimiert, ein
Molekül, das bei der Antigenerkennung durch CD4+ T-Lymphozyten eine entscheidende
Rolle spielt. Bei der Auswertung der Membrankontakte über einen anti-MHC Klasse IIAntikörper (s.III.3.) befinden sich in allen untersuchten lymphatischen Organen über 80% der
injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC (s. Tabelle 1). Bei der Verwendung
von MHC Klasse II als Nachweis für die IDC findet sich kein signifikanter Unterschied dieser
Anteile zwischen naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten oder zwischen den
verschiedenen sekundär lymphatischen Organen, was die bisherigen Ergebnisse bestätigt. Da
beide Nachweise für die DC zu gleich guten Ergebnissen führten, die Abgrenzung der
Kompartimente mit der Färbung des ICAM-1 jedoch deutlicher zu sehen war, wurde dieser im
folgenden zur Färbung der DC herangezogen.
3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion der T-Lymphozyten
lassen sich gleiche Anteile von Membrankontakten beobachten.
Um die Frage zu beantworten, ob sich zu früheren oder späteren Zeitpunkten der Anteil der
Kontakte verändert, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der kongenen
T-Lymphozyten die Membrankontakte analysiert. Abb. 3 zeigt verschiedene Zeitpunkte von
0,5h bis 96h nach Injektion der T-Lymphozyten. Obwohl vermutet wird, dass die Wanderung
der Subpopulationen der T-Lymphozyten durch die Gewebe verschieden lange dauert und sich
das Migrationsverhalten deutlich unterscheidet, befinden sich bereits nach einer halben Stunde
naive und memory T-Lymphozyten in Membrankontakten zu IDC. Zu diesem frühen
Zeitpunkt finden sich absolut gesehen weniger kongene T-Lymphozyten in den T-Zellarealen
der Milz (Daten nicht gezeigt). Festzustellen ist jedoch, dass sich der Anteil der injizierten
T-Lymphozyten, die sich in Membrankontakt mit IDC befinden, auf 80±10% beläuft. Auch
Effektor T-Lymphozyten, deren Verhalten nach 1h analysiert wurde, weisen ebenfalls in der
großen Mehrheit Membrankontakte auf. Zu allen weiteren untersuchten Zeitpunkten (2h, 9h,
58
24h, 48h, 72h und 96h) nach der Injektion lassen sich die gleichen Anteile der Kontakte
feststellen. Damit erscheinen die Membrankontakte ein von der Zeit unbeeinflusstes
Phänomen darzustellen, die unabhängig von der absoluten Anzahl der im Organ
nachzuweisenden T-Lymphozyten in großer Mehrheit nachzuweisen sind.
In der Zeitkinetik konnte kein unterschiedliches Verhalten von naiven, memory oder Effektor
T-Lymphozyten festgestellt werden. Sie sind aus diesem Grunde in der Graphik gemeinsam
dargestellt.
Tabelle 1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozytena und interdigitierenden
dendritischen Zellenb, die über die Oberflächenexpression von MHC Klasse II in den
sekundär lymphatischen Organen nachgewiesen worden sind.
Subpopulationen injizierter T-Lymphozyten
Organec
naive
memory
Effektor
Milz
80,6 ± 10,5d
82,7 ± 7,1
71,6 ± 9,5
Lymphknoten
82,7 ± 4,6
80,7 ± 6,9
83,0 ± 5,5
Peyersche Platten
84,5 ± 3,7
84,5 ± 8,8
84,4 ± 6,9
Aus dem Ductus thoracicus wurden naive (CD45RC+) und memory (CD45RC-) T-Lymphozyten
separiert. T-Lymphozyten aus Lymphknoten wurden über den T-Zellrezeptor und CD28 in Gegenwart
von BrdU für 72h polyklonal aktiviert. LEW.7B(BH) T-Lymphozytensubpopulationen sind LEW
(RT7a)-Empfängertieren in die Schwanzvene injiziert worden
b
Interdigitierende dendritische Zellen wurden über ihre hohe Oberflächenexpression MHC Klasse II,
ihre charakteristische Form und ihrer Lokalisation in den T- Zellarealen der peripheren lymphatischen
Organe identifiziert.
c
Die Organe wurden 24 Stunden nach der Injektion der T-Lymphozyten entnommen und durch
immunhistochemische Färbungen von Gefrierschnitten ausgewertet. In den T-Zellarealen der Milz,
der Lymphknoten und den Peyerschen Platten wurde der Anteil der injizierten T-Lymphozyten mit
einem Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen an den injizierten Zellen ermittelt.
d
Die Werte sind Mittelwert und Standardabweichung von n=4-7 unabhängigen Experimenten.
a
Anteil der T-Lymphozyten in Membrankontakt
mit interdigitierenden dendritischen Zellen
an injizierten T- Lymphozyten [%]
59
100
90
80
70
60
50
40
0.5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
24
48
72
96
Zeit nach Injektion [h]
Abb. 3
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der T-Lymphozyten befinden sich gleiche Anteile
der Zellen in Membrankontakt zu DC.
Nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten wurden nach 30min, 2h und 48h (•) und nach
Injektion von aktivierten T-Lymphozyten nach 1h, 9h, 24h, 72h und 96h (■) die Milz entnommen und
Gewebeschnitte hergestellt. Die kongenen T-Lymphozyten wurden über den mAb His41, die DC über
ihre Expression des ICAM-1 immunhistologisch identifiziert. Es wurde die Anzahl der injizierten TLymphozyten ermittelt und davon der Anteil bestimmt, der sich in Membrankontakt zu den DC in der
PALS befindet. Da sich für die Anteile der Membrankontakte von naiven und memory TLymphozyten keine signifikanten Abweichungen ergeben haben, sind diese in der Zeitkinetik
zusammengefasst dargestellt. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von n=3-7
unabhängigen Versuchen.
60
4. Endogene T-Lymphozyten zeigen über 60% Membrankontakte zu DC
Endogene T-Lymphozyten liegen dicht gedrängt in den T-Zellarealen der lymphatischen
Organe, durch die IDC mit ihren zahlreichen Ausläufern ein Netzwerk bilden. Wenn kongene
naive, memory und Effektor T-Lymphozyten zu gleichen Anteilen Membrankontakte
ausbilden, so müssten auch endogene, empfängereigene T-Lymphozyten einen hohen Anteil
an Kontakten aufweisen. In einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin und über den Nachweis der
IDC konnten auch Membrankontakte zwischen endogenen T-Lymphozyten und IDC
ausgewertet werden. Nach der Injektion von naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten
wurden auch die Anzahl der Membrankontakte der endogenen T-Lymphozyten ausgewertet.
In der Milz befand sich der größte Anteil, 65,9±3,8%, der endogenen Zellen in
Membrankontakt zu IDC.
5. Membrankontakte zu IgD-positiven B-Lymphozyten befinden sich
vorwiegend im äußeren Bereich der periarteriolären lymphatischen
Begleitscheide der Milz
Neben den IDC gelten auch B-Lymphozyten als Antigen-präsentierende Zellen, die sowohl
MHC, als auch ICAM-1 schwach auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Dabei steht jedoch
nicht die Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort im Mittelpunkt, sondern die
B-Lymphozyten benötigen die Interaktion mit Antigen-spezifischen T-Helfer-Zellen zur
Enddifferenzierung in Antikörper-sezernierende Plasmazellen.
In Abbildung 4A und B sind im inneren Anteil der PALS nur vereinzelt B-Lymphozyten zu
erkennen, im äußeren Anteil und zu den Follikeln hingegen sind jedoch zahlreiche, dicht
beieinander liegende B-Lymphozyten zu sehen. Der Hauptteil der injizierten T-Lymphozyten
befindet sich gleichmäßig verteilt sowohl im inneren, als auch im äußeren Anteil der PALS.
Einige T-Lymphozyten sind auch in den Follikeln zu erkennen. Abb.5 zeigt den Anteil der
injizierten T-Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu den IgD+ B-Lymphozyten im
inneren Anteil der PALS aufweisen und 20±5% ausmacht. Im äußeren Teil der PALS
61
hingegen beläuft sich der Kontakt auf über 70%, eine vergleichbare Größenordnung zu den
Membrankontakten mit IDC. Lässt sich zwischen den Membrankontakten zwischen den Tund B-Lymphozyten ein deutliches Gefälle zwischen innerem und äußerem Anteil der PALS
feststellen, so sind die Kontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC gleichmäßig über die
gesamte PALS verteilt (hellgraue Balken). Auch in den Anteilen der Membrankontakte zu BLymphozyten lässt sich kein Unterschied zwischen naiven, memory und Effektor TLymphozyten finden (Daten nicht gezeigt). Membrankontakte zwischen T- und BLymphozyten sind vorwiegend im äußeren Bereich der PALS anzutreffen.
Abb.4
Membrankontakte zwischen injizierten T-Lymphozyten und IgD+B-Lymphozyten finden
vorwiegend im äußeren Anteil der PALS statt.
(A) Gezeigt ist ein immunhistologisch gefärbter Gewebeschnitt der Milz 24h nach Injektion von kongenen naiven
(CD45RChigh) T-Lymphozyten. Die periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), Follikel (F),
Marginalzone (MZ) und die rote Pulpa (Rp) lassen sich durch die Darstellung der B-Lymphozyten mit einem
anti-IgD-Antikörper in blau deutlich abgrenzen. Die Pfeile weisen auf den äußeren Anteil der PALS, in dem der
Hauptteil der T-Lymphozyten Membrankontakt zu B-Lymphozyten zeigt.
(B) Injizierte T-Lymphozyten zeigen im vergrößerten Ausschnitt durch die Anfärbung mit dem mAb His41 eine
intensive braune Membranfärbung (Pfeilspitzen). Vorwiegend im äußeren Anteil der PALS sind zahlreiche
Membrankontakte zu deutlich blau gefärbten B-Lymphozyten zu sehen (schwarze Pfeile).
Anteil der T-Lymphozyten in Membrankontakt
mit IDC oder B-Lymphozyten
an injizierten T-Lymphozyten [%]
62
100
B-Lymphozyten
IDC
80
60
40
20
innerer
äußerer
Anteil der PALS
Abb. 5
Die Anteile der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit IDC oder mit B-Lymphozyten
unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Verteilung in der PALS.
Bei der Auswertung der in Abb. 4 gezeigten Gewebeschnitte wurde ein innerer (Mitte) und ein
äußerer (Peripherie) Anteil der PALS unterschieden. Gezeigt ist die Auswertung der
Membrankontakte zwischen den naiven T- und den B-Lymphozyten (schwarze Balken), die sich
vorwiegend im äußeren Teil der PALS nachweisen lassen. Die grauen Balken geben zum Vergleich
die Membrankontakten zwischen naiven T-Lymphozyten und IDC in einer ICAM-1-Färbung wieder.
Im inneren Bereich der PALS befinden sich signifikant mehr T-Lymphozyten in Membrankontakt zu
IDC als zu B-Lymphozyten (p<0,05; Wilcoxon-Test). Dargestellt sind Mittelwert und
Standardabweichung von n=5 unabhängigen Versuchen.
63
6. Membrankontakte von injizierten T-Lymphozyten mit dendritischen
Zellen lassen sich auch mit konfokaler Mikroskopie aufzeigen.
In der bei den Immunhistologien verwendeten APAAP-Technik kommt es zur Verwendung
von Brückenantikörpern, die optisch einen erhöhten Farbniederschlag vorspiegeln können.
Dadurch könnten Überlagerung der Farbniederschläge in der Auswertung zu einem höheren
Anteil an Membrankontakten führen. In der konfokalen Mikroskopie werden Fluorochromgekoppelte Antikörper verwendet, die den primären Antikörper erkennen und durch einen
Laser zur Emission angeregt werden und somit einen deutlich geringeren Farbniederschlag
aufweisen. Ein weiterer Vorteil der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass durch einen
immunhistologischen Schnitt mehrere Ebenen gelegt werden können, die bei einer
computergestützten Projektion ein dreidimensionales Bild der Kontakte wiedergibt. Es ist
also, wie in Abb.6 gezeigt, möglich, den Verlauf und die Lokalisation der Membrankontakte
zu verfolgen und des weiteren Überlagerungen ober- oder unterhalb der Schnittebene
auszuschließen. Im grünen Kanal lassen sich deutlich die mit His41 angefärbten injizierten TLymphozyten (siehe Abb.6A) erkennen. Im roten Kanal ist der Zellkörper einer IDC mit einer
hohen Expression von ICAM-1 und zu mehreren Seiten abgehenden dendritischen
Zellausläufern zu sehen (Abb.6B). In der Projektion sind einige der T-Lymphozyten in
direkter Nähe zu der IDC zu erkennen, der gelbe Saum entsteht durch eine Überlagerung des
roten und grünen Kanals. Auf den folgenden, 0,5µm auseinander liegenden Schnitten lässt
sich ein Membrankontakt zwischen der IDC und einem T-Lymphozyten verfolgen
(Sternchen). Auch andere T-Lymphozyten weisen einen Membrankontakt auf, sind aber nicht
als ganze Zelle im Schnitt enthalten. Mit einem Dreieck gekennzeichnet ist ein T-Lymphozyt,
der über die gesamte Schnittebene keinen Kontakt aufweist.
In den Immunhistologien, die mittels konfokaler Mikroskopie ausgewertet worden sind, haben
sich 60±5% der injizierten T-Lymphozyten in engem Membrankontakt zu den IDC befunden.
Die Kontakte, die sich schichtweise pro Zelle verfolgen lassen, sind dabei gleichmäßig
verteilt. Durch einen T-Lymphozyt konnten 9,5±1,9 Schichten gelegt werden, was einem
berechneten Durchmesser von etwa 5µm entspricht. In einem Hauptteil der verfolgten
Kontakte haben die T-Lymphozyten über alle Schichten Kontakt, was in Abb.7 dargestellt ist.
64
Zellen, die sich komplett im Schnitt befunden haben, wurden dabei von oben bis unten
durchgemustert. Dabei hatten 33 von 84 ausgewerteten T-Lymphozyten in allen Schichten
(100%) Membrankontakt zu einer IDC. In nur weniger als 5% der untersuchten Zellen
konnten Überlagerungsartefakte festgestellt werden, d.h. in den Einzelschnitten konnte kein
Kontakt festgestellt werden, obwohl in der Projektion die Zelle als positiv (mit Kontakt)
gewertet worden war (falsch positiv). Hingegen konnte mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie
festgestellt werden, dass fast 50% der Zellen ohne Kontakt ober- oder unterhalb der
Schnittebene Kontakte aufgewiesen haben (falsch negativ).
Abb. 6
In der konfokalen Mikroskopie lassen sich die Membrankontakte über den ganzen Kontakt
verfolgen.
Gezeigt ist eine Immunhistologie der Milz 24h nach Injektion von CD4+ Gedächtnis T-Lymphozyten
im kongenen Modell. Bei den Einzelbildern handelt es sich um Ausschnitte aus der PALS (1000fache
Vergrößerung).
a) Im grünen Kanal sind T-Lymphozyten (T) über Fluorochromfarbstoff-gekoppelte Antikörper (mAb
His41) in grüner Fluoreszenz dargestellt, der gegen den LEWIS RT7b-Phänotyp gerichtet ist. Es sind
mehrere T-Lymphozyten zu erkennen.
b) Im roten Kanal ist durch eine Markierung mit anti-ICAM-1 (Antikörper 1A29) eine
interdigitierende dendritische Zelle dargestellt, deren Zellkörper und einige dendritische Ausläufer zu
sehen sind.
c) Die Abbildung zeigt eine konfokale Gesamtprojektion des grünen und roten Kanals durch
computergestützte
Übereinanderlagerung
der
optischen
Einzelschnitte.
Durch
die
Übereinanderlagerung der Kanäle erscheinen die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und
IDC in gelb.
d-l) Optische konfokale Folgeschnitte im Abstand von 0,5µm durch den Ausschnitt der PALS der
Milz. Mit einem Stern (*) gekennzeichnet ist ein T-Lymphozyt, der durch alle optische Einzelschnitte
hindurch verfolgt werden kann und einen deutlichen Membrankontakt zur dendritischen Zelle
aufweist. Mit einem Dreieck (∆) gekennzeichnet ist hingegen ein T-Lymphozyt, bei dem über alle
Einzelschnitte kein Kontakt zu beobachten ist. Die Pfeile (→) weisen exemplarisch auf
Membrankontakte zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den dendritischen Zellen (mit einer
gelb erscheinenden Überlappungszone) hin.
65
Anzahl der injizierten T-Lymphozyten
66
35
30
25
20
15
10
5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
100
Ausmaß der Membrankontakte in Prozent
Abb. 7
Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC lassen sich in der Mehrzahl über
mehrere Schichten verfolgen.
Auf Gewebeschnitten wurden die injizierten naiven (CD45RChigh) und memory (CD45RClow) TLymphozyten mit dem fluorochrom-markierten Antikörper His41 in grün dargestellt. Über die
Expression von ICAM-1 wurden IDC in der PALS in roter Fluoreszenz nachgewiesen. Mit
Unterstützung eines bildgebenden Verfahrens am Computer wurden insgesamt 9 (Z-Dicke = 0,5µm)
durch einen Ausschnitt der PALS gelegte Einzelschnitte übereinander gelagert und als Teilprojektion
definiert. In dieser Darstellung wurden in der PALS injizierte T-Lymphozyten ausgewählt, die einen
Membrankontakt zu einer IDC aufgewiesen haben und über die Einzelprojektionen der Kontakt
verfolgt. Es wurden bei der Auswertung nur Zellen genommen, die sich mit ihrer gesamten
Zelloberfläche innerhalb des Gewebeschnittes befunden haben. Die y-Achse zeigt dabei die Anzahl
der T-Lymphozyten an, die x-Achse den prozentualen Anteil der Schichten, in denen die TLymphozyten einen Membrankontakt aufweisen, an allen Schichten der Zelle. Dabei sind TLymphozyten, die in allen Schichten Membrankontakt aufweisen, unter 100% aufgeführt. Zellen, die
nur in der Hälfte ihrer Schichten Kontakte hatten, sind in der Kategorie 50% aufgeführt. Angegeben
sind nur die T-Lymphozyten (n=84), die in der Teilprojektion wie auch den Einzelschnitten
Membrankontakte gezeigt haben.
67
7. In der Maus werden interdigitierende dendritische Zellen über den
spezifischen Marker DEC-205 nachgewiesen.
Um herauszufinden, ob es sich bei der beobachteten Größenordnung von Membrankontakten
um speziesspezifische Effekte handelt, die sich nur in der Ratte darstellen lassen, wurden im
weiteren auch Mäuse untersucht. In der Maus sind spezifische Marker für IDC bekannt. Ein
Beispiel ist der Nachweis des Multilektinrezeptors DEC-205, der sich in den T-Zellarealen der
lymphatischen Organe identifizieren lässt. Auch weitere spezifische Marker, Mac-1 und
CD11c, für IDC wurden auf den Immunhistologien getestet, erbrachten jedoch keine zufrieden
stellenden Ergebnisse. So war Mac-1auf Gewebeschnitten nur auf Makrophagen in der roten
Pulpa exprimiert und konnte zum Nachweis der IDC nicht weiter eingesetzt werden. CD11c
konnte nicht in gleicher Intensität wie NLDC-145 in der Maus oder ICAM-1 in der Ratte
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
In Abb.8 ist im inneren Bereich der PALS eine deutliche Markierung von Zellen mit IDCCharakter zu beobachten, die sich zum äußeren Bereich der PALS hin verliert. Die
Abgrenzung zu den Follikeln im äußeren Anteil der PALS ist nicht so deutlich ausgeprägt,
wie es bei der Verwendung von ICAM-1 (s.Abb.1) oder MHC Klasse II (nicht gezeigt) in der
Ratte der Fall ist. Endogene T-Lymphozyten liegen zu 55,7 ± 2,7% in Membrankontakt mit
IDC. Die Membrankontakte von endogenen T-Lymphozyten mit IDC in der Ratte und in der
Maus liegen in einer vergleichbaren Größenordnung. Das Mausmodell eröffnet hingegen eine
Reihe weiterer Untersuchungsmöglichkeiten.
7.1. LFA-1-defiziente Zellen weisen eine unverändert hohe Anzahl von
Membrankontakten zu DC auf.
Durch die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen ist es möglich, die Beteiligung von
Oberflächenmolekülen bei der Ausbildung der Membrankontakte zu untersuchen. LFA-1 ist
als ein wichtiges Molekül bei der Migration der Lymphozyten aus den Blutgefäßen bekannt,
spielt aber auch eine entscheidende Rolle in der Vermittlung von transienten Zell-Zell-
68
Interaktionen. Um herauszufinden, welche Rolle LFA-1 in der Ausbildung von
Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC hat, wurden Wildtypmäusen
gleichzeitig markierte Wildtypzellen und LFA-1-defiziente (αL-/-/ β2, CD11a-/-/ CD18)
Lymphozyten injiziert. Immunhistologisch konnten Membrankontakte zu IDC, die über den
spezifischen Antikörper NLDC-145 nachgewiesen wurden, in der Milz ausgewertet werden.
Dabei befanden sich Zellen aus Wildtyptieren zu gleichen Anteilen (59,9±5,2%) in
Membrankontakt zu IDC wie die Zellen aus LFA-1-defizienten Tieren (59,0±5,3%). Eine
mögliche Erklärung dieses Ergebnis ist die Expression von LFA-1 auf den Dendritischen
Zellen und des ICAM-1 auf den T-Lymphozyten, die den Kontakt gewährleisten könnten.
Auch andere Ligand-Rezeptorbindungen wie CD2/ LFA-3 oder CD28/ CD80 können
Antigen-unabhängige Membrankontakte vermitteln. Durch eine zusätzliche Blockierung mit
einem Antikörper, der gegen ICAM-1 gerichtet ist, könnte in einer weiteren Untersuchung der
Einfluss des LFA-1 auf die Membrankontakte deutlicher gezeigt werden. Ob das fehlende
LFA-1-Molekül Auswirkungen auf die Signaltransduktion für die T-Lymphozyten mit sich
bringt, bleibt in weiteren Studien mit diesen genetisch veränderten Mäusen zu zeigen.
69
Abb. 8
In der Maus lassen sich IDC über den spezifischen Marker DEC-205 nachweisen.
Gewebeschnitt der Milz einer Wildtypmaus. IDC lassen sich über die Expression des
Multilektinrezeptors DEC-205 (Antikörper NLDC-145) in blau darstellen.
(A) Im inneren Anteil der PALS heben sich die DC durch die Färbung besonders hervor, zum äußeren
Bereich der PALS hin ist die Färbung schwächer ausgeprägt. Endogene T-Lymphozyten zeigen durch
eine Gegenfärbung mit Hämalaun eine schwach blaue Färbung. Es ist zu erkennen, dass sie dicht
gedrängt in der PALS liegen. Angrenzend an die PALS sind Follikel (F) schwach zu erkennen. (250 x
Vergrößerung, APAAP-Technik)
(B) In der Ausschnittsvergrößerung sind einzelne T-Lymphozyten aus einer Wildtypmaus zu
erkennen, die vor der Injektion in Wildtypmäuse mit Digoxigenin markiert worden ist. Die schwarzen
Pfeile weisen auf T-Lymphozyten hin, die einen Membrankontakt zu einer DC aufweisen. (1000 x)
70
B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation
Eine wesentliche, in der Literatur beschriebene Funktion der DC liegt in der Auslösung von
primären oder sekundären T-Zellabhängigen Immunantworten. Dabei wird einem
T-Lymphozyt sein spezifisches Antigen in einem MHC-Peptid-Komplex verbunden mit
kostimulatorischen Molekülen präsentiert, d.h. es erfolgt eine vollständige Aktivierung der
Zelle. Diese führt zur Proliferation und zur klonalen Expansion des spezifischen
T-Lymphozyten. Als ein Nachweis für Proliferation gilt der Einbau von BrdU, eines
Thymidinanalogons, in die DNS. Als eine weitere wichtige Funktion der DC wird das
Überleben von aktivierten, aber auch von naiven und memory T-Lymphozyten beschrieben. In
verschiedenen Modellen konnte gezeigt werden, dass T-Lymphozyten ohne den regelmäßigen
Kontakt zu DC nicht lange überleben können, sondern vermutlich durch eine
Grundaktivierung im Zellzyklus gehalten werden müssen.
Aus diesem Grunde ist im zweiten Teil der Arbeit der Fokus auf den Zellzyklus und die
Proliferation in Abhängigkeit von Membrankontakten gerichtet worden.
1. Ki-67+ T-Lymphozyten im Blut
Um Hinweise auf die Funktion der morphologisch beobachteten Membrankontakte zu
erhalten, wurde die Expression des nukleären Zellantigens Ki-67 von aktivierten TLymphozyten ausgewertet. Ki-67, das durch den spezifischen Marker Mib5 nachzuweisen ist,
wird in der Ratte in der G1-Phase, der M1-Phase, der S-Phase und der M2-Phase exprimiert.
Diese Phasen werde im weiteren als „Zellzyklus“ referiert. Nach Aktivierung der TLymphozyten wie unter 5.2 beschrieben, sind etwa die Hälfte der T-Lymphozyten im
Inokulum Ki-67+, d.h. sie befinden sich im Zellzyklus. Wie in Abb.9 zu erkennen ist, befinden
sich nach intravenöser Injektion in die Schwanzvene von Empfängertieren bereits nach einer
Stunde davon nur noch ein Fünftel, d.h. 10% der im Blut identifizierten Zellen, im Zellzyklus.
Dieser Wert bleibt über 9h, 24h und 96h konstant. Es ist nicht geklärt, ob sich nach einer
Stunde oder zu späteren Zeitpunkten vermehrt T-Lymphozyten in den Organen im Zellzyklus
71
befinden und ob die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und dendritischen Zellen
Anteil der Zellen im Zellzyklus von den
injiziertenT-Lymphozyten im Blut
einen Einfluss darauf haben.
60
Blut
50
%
40
30
20
10
0
Inokulum
1h
9h
24h
96h
Zeit nach Injektion
Abb. 9
Zeitkinetik von injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus im Blut
Kongene T-Lymphozyten aus den Lymphknoten wurden über den TCR und CD28 polyklonal aktiviert
und Empfängertieren i.v. in die Schwanzvene injiziert (siehe 5.2). Nach 1h, 9h, 24h und 96h wurden
jeweils Tiere durch Entbluten getötet. Auf Blutzytospots (siehe 6.3 und 6.4) wurden durch den
monoklonalen Antikörper His41 die injizierten T-Lymphozyten identifiziert. Unter diesen wurde der
Anteil der Zellen ermittelt, die Mib+ waren. Dieser Antikörper erkennt das nukleäre Zellantigen Ki67, das während des Zellzyklus (G1-M2) exprimiert wird. Es sind Mittelwert und Standardabweichung
aus n= 3-7 unabhängigen Versuchen gezeigt.
72
2. BrdU+ T-Lymphozyten in der Milz
Während das nukleäre Zellantigen Ki-67 während des gesamten Zellzyklus über alle Phasen
außer G0 exprimiert wird, wird das Thymidinanalogon BrdU nur während der S-Phase des
Zellzyklus in die DNS eingebaut. Befindet sich eine Zelle in der S-Phase, so durchläuft sie in
den meisten Fällen eine aktive Zellteilung, wohingegen der Zellzyklus vorher an bestimmten
Checkpunkten gestoppt werden kann, um unkontrollierte Proliferation verhindern zu können.
Um festzustellen, inwiefern sich die eingewanderten, aktivierten Lymphozyten in der Milz
teilen, wurde den Ratten eine Stunde vor dem Entbluten BrdU appliziert (siehe 6.5). Dadurch
haben nur solche Zellen BrdU in ihre DNS einbauen können, die sich in den Organen in der
S-Phase befunden haben. Bereits 24h nach i.v. Injektion der aktivierten T-Lymphozyten waren
2,2% BrdU+ T-Lymphozyten zu finden, 72h nach der Injektion war der Anteil auf 3,3%
angestiegen. Aufgrund sehr niedriger Zellzahlen wurden die Rohdaten für 24h (n=2), für 72h
(n=10 unabhängige Versuche) zu einer Summe zusammengezogen und daran der Anteil der
BrdU+ Zellen ermittelt. Wie zu erwarten gewesen war, lag der Anteil der BrdU+ Zellen
deutlich unter den Anteilen der Ki-67+ T-Lymphozyten.
Von Interesse ist für diese Arbeit gewesen, ob die Membrankontakte zwischen den injizierten
T-Lymphozyten und den IDC in der PALS den Anteil der Zellen im Zellzyklus (Expression
von Ki-67) und den Anteil der proliferierenden Zellen (Einbau von BrdU) beeinflussen
können.
3. Die Anteile der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten sind erhöht zu finden,
wenn Membrankontakte mit IDC in der Milz vorliegen
Wie im ersten Teil beschrieben, befinden sich 80±10% der injizierten T-Lymphozyten, aber
auch 60±5% der endogenen T-Lymphozyten in Membrankontakt mit den IDC. Abb.10 zeigt
eine 3fach Färbung der Milz, in der deutlich die T-Lymphozyten in blau und die IDC mit ihrer
charakteristischen Morphologie in braun zu erkennen sind. Die schwarzen Pfeilköpfe weisen
73
auf injizierte His41+ T-Lymphozyten hin, die in Membrankontakt zu einer IDC liegen.
Deutlich zu erkennen ist ein T-Lymphozyt mit Membrankontakt zu einer IDC, der sich durch
einen roten (BrdU+) Zellkern hervorhebt (schwarzer Pfeil). Auch endogene Zellen sind zu
beobachten, die eine rote Zellkernfärbung aufweisen (weiße Pfeilköpfe). Sie sind ein Indiz
dafür, dass sich sowohl injizierte, als auch empfängereigene Zellen zum Zeitpunkt der
Organentnahme in der S-Phase des Zellzyklus befunden haben. Im folgenden wurde
ausgewertet, ob sich vermehrt T-Lymphozyten in der S-Phase des Zellzyklus oder in allen
Phasen des Zellzyklus außer G0 nachweisen lassen, wenn sie einen Membrankontakt zu IDC
aufweisen. Dabei wurden die Zeitpunkte 24h und 72h nach der Injektion der T-Lymphozyten
ausgewählt, da sich frühestens nach 24h die DNS-Replikation und nach 48h die Zellteilung
nachweisen lassen.
3.1. T-Lymphozyten, die in der Milz einen Membrankontakt zu IDC aufweisen,
befinden sich signifikant erhöht im Zellzyklus und in der S-Phase
Vergleicht man in der Milz die injizierten T-Lymphozyten, die einen Membrankontakt mit
IDC haben, mit solchen, die keinen haben, so lässt sich sowohl bei Ki-67+ Zellen, wie auch
bei den BrdU+ Zellen ein signifikanter Unterschied feststellen. Wie es in Abb.11 zu erkennen
ist, sind bereits 24h nach der Injektion 28,9±7,3% der T-Lymphozyten mit einem Kontakt Ki67+ gegenüber 20,2±8,9% T-Lymphozyten ohne Kontakt zu einer IDC. In der Darstellung der
Einzeltiere wird deutlich, dass zwar die Anteile der Zellen im Zellzyklus zwischen 20 bis 50%
schwanken können, aber doch deutlich mehr Zellen mit Kontakt das Ki-67-Antigen
exprimieren. 72h nach der Injektion sinkt der Anteil der Zellen im Zellzyklus auf 13±5,1% ab,
aber auch hier befinden sich signifikant mehr Zellen im Zellzyklus, wenn sie gleichzeitig
einen Membrankontakt zu einer IDC aufweisen. Der Anteil der T-Lymphozyten, die während
der S-Phase BrdU eingebaut haben, liegt deutlich niedriger: nach 24h bei etwa 8%, nach 72h
bei noch etwa 4%. Doch auch hier lässt sich ein signifikanter Unterschied feststellen, wenn
man Zellen mit und ohne Kontakt vergleicht. Diese Ergebnisse scheinen darauf hinzuweisen,
74
dass T-Lymphozyten auf Kontakte zu IDC angewiesen sind, um im Zellzyklus zu verbleiben
und in geringerem Maße zu proliferieren.
Abb. 10
Injizierte, proliferierende T-Lymphozyten befinden sich in Membrankontakten zu IDC.
Auf einem Gewebeschnitt der Rattenmilz ist ein Ausschnitt der PALS gezeigt. Die Milz wurde 72 Stunden nach
Injektion von polyklonal über den TCR und CD28 aktivierten T-Lymphozyten entnommen (s.5.2. und 5.3.). Eine
Stunde zuvor wurde den Tieren BrdU i.v. in die Schwanzvene injiziert, um die Proliferation von Zellen
nachweisen zu können. Die injizierten T-Lymphozyten zeigen durch die Anfärbung mit dem mAb His41 eine
intensive blaue Membranfärbung. IDC sind über ihre hohe Expression des ICAM-1 in braun dargestellt.
Proliferierende Zellen zeigen durch den Nachweis des während der S-Phase in die DNS eingebauten BrdU eine
intensive rote Kernfärbung. Deutlich zu erkennen ist ein injizierter T-Lymphozyt in Membrankontakt zu einer
IDC, der einen intensiv roten, BrdU+ Zellkern aufweist (schwarzer Pfeil). Die schwarzen Pfeilköpfe verweisen
auf Membrankontakte zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Auch endogene Zellen haben
BrdU eingebaut und weisen eine rote Kernfärbung auf (weiße Pfeilköpfe). (APAAP-Technik, 1000fache
Vergrößerung)
75
*
50
|__________|
40
28.9 + 7.3
30
20
20.2 + 8.9
10
1.2
0.8
ohne
m it
72h nach Injektion
*
20
|___________|
15
13.0 + 5.1
10
+
K i-67 T-Lym phozyten an den injizierten T-Lym phozyten [%]
24h nach Injektion
8.6 + 4.4
5
ohne
m it
M em brankontakt zu dendritischen Zellen
Abb. 11
T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC weisen einen erhöhten Anteil von
Ki-67+Zellen auf.
Jeweils 24h und 72h nach Injektion von aktivierten T-Lymphozyten wurde die Milz entnommen,
tiefgefroren und T-Lymphozyten und IDC immunhistochemisch anfärbt. Zusätzlich wurden Zellen,
die sich im Zellzyklus befinden, über das nukleäre Zellkernantigen Ki-67 (mAb Mib5) nachgewiesen.
Der Prozentsatz (y-Achse) gibt an, welcher Anteil der His41+ Lymphozyten sich im Zellzyklus
befindet. Die x-Achse gibt Auskunft, ob die T-Lymphozyten Membrankontakt gezeigt haben.
Signifikant mehr T-Lymphozyten befinden sich im Zellzyklus, wenn sie einen Kontakt zu einer IDC
aufweisen. Zusätzlich sind Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben
worden, die allerdings aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe
zusammengefasst worden sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=5-6 unabhängigen
Versuchen. Das Sternchen (*) verweist auf eine Signfikanz von p<0,05, die mit dem Wilcoxon-Test
berechnet wurde.
24h nach Injektion
10
8
7.8 + 1.1
6
4.9 + 1.1
4
2
0.8
0.5
ohne
10
mit
72h nach Injektion
*
8
|__________|
BrdU+ T-Lymphozyten unter den injizierten T-Lymphozyten [%]
76
6
3.9 + 1.0
4
2
2.0 + 0.5
ohne
mit
Membrankontakt zu dendritischen Zellen
Abb. 12
T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC sind zu einem erhöhten Anteil BrdU+.
Wie für Abb. 11 beschrieben wurden T-Lymphozyten polyklonal aktiviert, injiziert und nach 24h und
72h die Milz entnommen und tiefgefroren. Injizierte T-Lymphozyten wurden über den mAb His41
und die IDC über ICAM-1 identifiziert. Zusätzlich wurden Zellen, die sich in der S-Phase befanden,
über das Thymidinanalogon BrdU nachgewiesen. Der Prozentsatz gibt an, welcher Anteil der His41+
Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC haben, sich in der S-Phase befindet. Signifikant
mehr T-Lymphozyten proliferieren, wenn sie einen Kontakte zu einer IDC aufweisen. Zusätzlich sind
Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben worden, die allerdings
aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe zusammengefasst worden
sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=2-10 unabhängigen Versuchen. (*, p<0,05;
Wilcoxon-Test)
77
3.2. Ki-67+ T-Lymphozyten sind gleichmäßig über die PALS verteilt, T-Lymphozyten
mit BrdU-Einbau befinden sich hingegen vorwiegend im äußeren Anteil der PALS.
Wie in Abb.5 gezeigt wurde, finden Membrankontakte von T-Lymphozyten zu BLymphozyten vorwiegend im äußeren Anteil der PALS statt. Auf ihrer Wanderung gelangen
sowohl T-, als auch B-Lymphozyten in diesen Randbereich zwischen Follikeln und PALS.
Die Kontakte zwischen CD4+ T-Lymphozyten und B-Lymphozyten sind entscheidend für die
Einleitung einer humoralen Immunantwort, also der Enddifferenzierung der B-Lymphozyten
in Plasmazellen und der Produktion von spezifischen Antikörpern. Nach ihrer Aktivierung im
inneren Anteil der PALS wandern T-Helferzellen in den äußeren Anteil der PALS und in die
Follikel, wo sich Antigen-spezifische B-Lymphozyten befinden. Betrachtet man nun in
Abb.13 den Anteil der injizierten Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC
aufweisen, in Abhängigkeit von der Lokalisation, also dem inneren oder äußeren Anteil der
PALS, so lässt sich feststellen, dass sich im äußeren Anteil mehr Lymphozyten in der S-Phase
(BrdU+) befinden als im inneren Anteil. Im Gegensatz dazu lässt sich bei Lymphozyten im
Zellzyklus (Mib5+) kein signifikanter Unterschied feststellen. Etwa 30% der T-Lymphozyten
befinden sich in der gesamten PALS gleichmäßig verteilt im Zellzyklus. Eine mögliche
Erklärung für dieses Ergebnis könnte die gegenseitige Aktivierung der CD4+ T-, wie auch der
B-Lymphozyten in diesem Randbereich der PALS sein, der zu einem erhöhten Anteil an
BrdU+ Zellen unter den injizierten T-Lymphozyten führen könnte.
78
+
BrdU T-Lymphozyten
72h nach Injektion
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
**
|____________|
Anteil der BrdU + T-Lymphozyten
an injizierten T-Lymphozyten
24h nach Injektion
+
Anteil der Mib + T-Lymphozyten
an injizierten T-Lymphozyten
Ki-67 T-Lymphozyten
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
innere
äußere
innere
äußere
Lokalisation der injizierten T-Lymphozyten
in der PALS der Milz
79
Abb. 13
In der äußeren PALS befinden sich signifikant mehr BrdU+ T-Lymphozyten als in der inneren
PALS, wohingegen sich kein Unterschied der Verteilung der Ki-67+ T-Lymphozyten feststellen
lässt.
Jeweils 24h und 72h nach Injektion von kongenen, polyklonal aktivierten T-Lymphozyten wurde die
Milz entnommen und Immunhistologien angefertigt. Der Nachweis der T-Lymphozyten wurde über
den mAb His41, der DC über die Expression von ICAM-1 geführt. Zellen in der S-Phase wurden
durch den Einbau von BrdU, das eine Stunde vor der Organentnahme i.v. injiziert wurde,
nachgewiesen.
Zellen
im
Zellzyklus
wurden
hingegen
durch
das
Zellzyklus-assoziierte
Zellkernantigen Ki-67 (Antikörper Mib5) identifiziert. Es wurde ausgewertet, welcher prozentuale
Anteil der injizierten T-Lymphozyten, die einen Kontakt zu DC aufweisen, sich in der S-Phase oder
im Zellzyklus befindet. Bei der Auswertung wurde zusätzlich unterschieden, ob sich die injizierten
Zellen im inneren (Mitte) oder äußeren Bereich (Peripherie) der PALS befanden. Angegeben sind die
Werte von Einzeltieren aus jeweils n=2-10 unabhängigen Versuchen. Die Signifikanz (**, p<0,02)
wurde mit dem Wilcoxon-Test für nicht parametrische Tests ermittelt. Für 24h (BrdU) ließ sich
aufgrund der geringen Anzahl der Versuche keine Signifikanz ermitteln.
80
V. Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Anzahl der Membrankontakte zwischen TLymphozyten und dendritischen Zellen (DC) in vivo in den T-Zellarealen der sekundär
lymphatischen Organen zu untersuchen. DC werden eine essentielle Rolle in der TZellaktivierung (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998)), dem Überleben der TLymphozyten
in
Abhängigkeit
der
peripheren
MHC-Präsentation
(BEUTNER
u.
MACDONALD, 1998; BROCKER, 1997; DANIEL et al., 1998), der peripheren Toleranz
(STEINMAN et al., 2000a), der Tumorimmunität (SCHULER u. STEINMAN, 1997) und der
Entwicklung von Autoimmunität (DELEMARRE et al., 1999; LUDEWIG et al., 1999b)
zugeschrieben. Um diese vielfältigen Aufgaben wahrnehmen zu können, benötigen die Zellen
jedoch den Kontakt zueinander. Bisherige Daten zur physikalischen Interaktion sind
vorwiegend aus Kultursystemen in vitro (GEIJTENBEEK et al., 2000; POPE et al., 1995)
oder aus adoptiven Transfermodellen (TANCHOT u. ROCHA, 1998) bekannt geworden. In
diesen, wie auch in anderen Untersuchungen zur Interaktion von T-Lymphozyten mit
dendritischen Zellen (BOTTOMLY, 1999; RISSOAN et al., 1999; SCHUHBAUER et al.,
2000), aber auch zur Interaktion mit B-Lymphozyten (DEFRANCO, 1988; GARSIDE et al.,
1998; KUSHNIR et al., 1998), mit Makrophagen (UNDERHILL et al., 1999), mit Mastzellen
(MEKORI u. METCALFE, 1999) oder mit Endothelzellen (JANCIC et al., 1998) bleibt
unbekannt, welche Anzahl von Membrankontakten stattfindet. Diese Größenordnung der
Membrankontakte kann zu einem grundlegenden Verständnis über die Kommunikation der TLymphozyten mit ihrer Umgebung führen.
1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein
konstantes Phänomen dar.
Identifizierung der T-Lymphozyten und der interdigitierenden dendritischen Zellen
Bei den Untersuchungen für diese Arbeit wurde auf Gewebeschnitten der Rattenmilz die
Membrankontakte von T-Lymphozyten mit DC in vivo analysiert. Als Grundlage dieser Arbeit
wurde das etablierte, kongene Modell (WONIGEIT, 1979) eingesetzt, da es eine
81
Identifizierung injizierter T-Lymphozyten erlaubte, ohne eine vorherige Markierung der
Zellen vornehmen zu müssen. So blieben die Oberflächenmoleküle auf den Zellen
unbeeinträchtigt und ermöglichten immunhistochemische Mehrfachfärbungen.
Durch die Verwendung von immunhistologischen Färbungen konnten T-Lymphozyten, sowie
DC in den Kompartimenten und die Anzahl der Membrankontakte zwischen den beiden
Zelltypen in vivo nachgewiesen werden. DC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe,
auf die in dieser Arbeit Bezug genommen wurde, werden aufgrund ihrer charakteristischen
Morphologie mit zahlreichen Zellausläufern auch als interdigitierende dendritische Zellen
(IDC) bezeichnet (STEINMAN et al., 1997). Neben der Morphologie und der Lokalisation
exprimieren IDC, die durch ihre Kapazität zur Auslösung einer T-Zellabhängigen
Immunantwort einen reifen Phänotyp der DC darstellen, MHC Klasse II und
Adhäsionsmoleküle wie das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) auf ihrer
Zelloberfläche. Mit Antikörpern gegen ICAM-1 oder gegen den MHC Klasse II konnten so
die IDC gut identifiziert werden, obwohl bisher kein spezifischer Antikörper in der Ratte
bekannt ist. Es konnten mit beiden Antikörpern gleiche Anteile an Membrankontakten
festgestellt werden (etwa 80%), wobei im weiteren der Antikörper gegen ICAM-1 verwendet
worden ist. Bei der Auswertung von Immunhistologien bleibt die Morphologie der Organe
erhalten und ermöglicht so eine Zuordnung der Zellen in bestimmte Kompartimente. Im
Gegensatz hierzu werden beim Einsatz von durchflußzytometrischen (FACS) Messungen die
Zellen aus ihren Gewebeverbänden herausgelöst betrachtet (WESTERMANN u. PABST,
1992). Membrankontakte, wie sie im Falle dieser Arbeit beschrieben werden, können so nicht
ausgewertet werden.
Probleme beim Nachweis der Membrankontakte
Wenn man 24h nach der Injektion die periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS) der
Milz
immunhistologisch
betrachtet,
befinden
sich
80%
der
T-Lymphozyten
in
Membrankontakt zu IDC. Die bei der Darstellung der Zellen verwendete APAAP-Technik
kann durch die Signalverstärkung über Brückenantikörper zu einem Farbniederschlag führen.
Es ist nicht auszuschließen, dass sich dadurch ein Farbring um die Zellen bildet, der in die
Wertung der Zellkontakte eingeht und zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Der Einsatz der
82
konfokalen Mikroskopie ermöglicht die Darstellung ganzer T-Lymphozyten und eine
Minimierung der Farbniederschläge. In der konfokalen Mikroskopie konnten
über 60%
Membrankontakte zwischen den T-Lymphozyten und IDC beobachtet werden. Um eine
bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Immunhistologie mit der konfokalen
Mikroskopie zu erreichen, wurden computergestützt durchschnittlich 15 Schichten von 0,5µm
Dicke durch eine Histologie gelegt (gescannt). Davon wurden die 9 mittleren Schichten
ausgewählt und übereinander projiziert, so dass diese „Teilprojektion“ einem Gewebeschnitt
im Durchlichtmikroskop entsprach. Dieses Vorgehen ermöglichte es, einzelne Zellen
auszuwählen, erst in der Teilprojektion Membrankontakte festzustellen und diese nachfolgend
in den unter- und oberhalb liegenden Schichten zu verfolgen. Interessanterweise ließ sich bei
diesem Vorgehen feststellen, dass von den 40% der T-Lymphozyten, die in der Teilprojektion
keinen Membrankontakt hatten, noch etwa die Hälfte unter- und oberhalb der Teilprojektion
Membrankontakt zu einer IDC hatte. Finden wir also in der Immunhistologie 80%
Membrankontakte, die zum Teil durch Farbniederschläge um die Zellen zustande kommen
können, so können wir doch aus den Ergebnissen der konfokalen Mikroskopie schließen, dass
weit über 60% der T-Lymphozyten Membrankontakte aufweisen müssen. Überlappungen
(falsch-positive Ergebnisse), d.h. dass durch die Lichtführung im Mikroskop Zellen einen
Kontakt aufweisen, die sich auf unterschiedlichen Ebenen befinden, ließen sich in nur weniger
als 5% der Fälle nachweisen. Die Vorhersage, dass sich eine T-Zelle in der Teilprojektion in
Kontakt zu einer DC befindet, trifft mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu. Durch diese
Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass sich der Hauptteil der in der Milz
einwandernden naiven T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC befindet.
Naive, Effektor und CD4+ Gedächtnis T-Lymphozyten weisen in allen lymphatischen
Organen zu 80% Membrankontakte mit IDC auf.
Übereinstimmend mit der Beobachtung, dass in allen sekundär lymphatischen Organen ein
dichtes Netzwerk von IDC durch die T-Zellareale ausgebildet wird, durch das die TLymphozyten kontinuierlich rezirkulieren (STEINMAN et al., 1997), befinden sich jeweils
etwa 80% Membrankontakte zwischen injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Keinen
Einfluss scheint auch die Herkunft der Antigene zu haben, da die Milz Antigene aus dem Blut,
83
die Lymphknoten aus den von ihnen drainierten Geweben und die Peyerschen Platten über MZellen aus dem Darm erhalten (JANEWAY et al., 1999). Den sekundär lymphatischen Organe
ist die Aufgabe gemein, durch ihre spezialisierte Aufteilung in T- und B-Zellkompartimente
die Auslösung und Regulation von Immunantworten zu unterstützen und zu erleichtern. In den
lymphatischen Organen wird ein konzentriertes Zusammentreffen von T-Lymphozyten auf der
Suche nach ihrem spezifischen Antigen und Antigen-spezifischen IDC ermöglicht.
Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten gehen phänotypische Veränderungen einher, die mit
einer Veränderung der Expression von Adhäsionsmolekülen und Aktivierungsmarkern
verbunden ist (BODE, 1998). Damit unterscheiden sich Effektor T-Lymphozyten deutlich von
naiven T-Lymphozyten. Memory T-Lymphozyten in der Ratte werden durch die niedrige
Expression des CD45RC von naiven T-Lymphozyten unterschieden, wobei nach neueren
Erkenntnissen ein Teil der memory T-Lymphozyten wieder die hohe Isoform des CD45RC
exprimieren kann (BELL u. SPARSHOTT, 1990). Da Adhäsionsmoleküle für die spezifische
Einwanderung in lymphatische oder nicht-lymphatische Organe und für die Interaktion mit
anderen Zellen wie auch den DC verantwortlich gemacht werden, wurden naive, Effektor und
memory T-Lymphozyten auf die Anzahl ihrer Membrankontakte zu IDC untersucht. Bislang
gibt es in der Literatur keine Daten zu der Anzahl der Membrankontakte zwischen TLymphozyten und DC. Aufgrund der Reexpression der hohen Isoform des CD45RC kann eine
„Verunreinigung“
der
hier
betrachteten
naiven
Zellpopulation
nicht
vollständig
ausgeschlossen werden. Da sich aber die Membrankontakte zwischen naiven und memory TLymphozyten mit den IDC nicht signifikant unterscheiden, ist diese Verunreinigung
höchstwahrscheinlich nicht relevant.
Membrankontakte endogener T-Lymphozyten
Da sich kongene, injizierte T-Lymphozyten wie empfängereigene T-Lymphozyten verhalten,
müssten auch endogene T-Lymphozyten in hohem Maße Membrankontakte zu DC aufweisen.
In den T-Zellarealen liegen endogene T-Lymphozyten dicht gedrängt beieinander, was sich
durch eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin darstellen lässt. Ein Hauptteil der endogenen TLymphozyten (über 60%) liegt ebenfalls in Membrankontakt mit den ICAM-1-positiven IDC.
Dieses unterstützt die aus der Elektronenmikroskopie gewonnenen Beobachtungen, dass IDC
ein Netzwerk formen, durch das die T-Lymphozyten kontinuierlich rezirkulieren und so
84
spezifische Klone für das präsentierte Antigen herausfiltern können (STEINMAN et al.,
1997). Die niedrigere Frequenz (60% versus 80%) der Membrankontakte im Vergleich zu den
injizierten T-Lymphozyten kann teilweise durch die fehlende Färbung der T-Lymphozyten
erklärt werden, da nur die IDC durch den ICAM-1 Antikörper nachgewiesen werden.
Auswirkung der Membrankontakte auf die T-Lymphozyten
Interessant sind diese Ergebnisse im Hinblick darauf, dass die Aktivierungsstadien der TLymphozyten, wie sie hier beobachtet worden sind, unterschiedliche Ansprüche an die
Membrankontakte stellen. So sind naive T-Lymphozyten abhängig von der Präsentation ihres
spezifischen
Antigens
in
Zusammenhang
mit
einem
MHC-Peptid-Komplex
und
kostimulatorischen Molekülen, um zu proliferieren, sich in Effektorzellen zu differenzieren
(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998) und benötigen damit den ständigen Kontakt zu
zahlreichen IDC in den lymphatischen Organen. Effektor T-Lymphozyten sind bereits
aktiviert und potentiell schädlich für den Organismus. Nach erfolgreicher Eliminierung des
Antigenstimulus ist es wichtig, die Ansammlung einer großen Anzahl von Effektorzellen zu
verhindern. Zur Aufrechterhaltung der Homöostase wird nach Aktivierung des TCR das FasMolekül (CD95) hochreguliert. Die Bindung von Fas/CD95 durch FasL/CD95L auf den IDC
führt zur Aktivierung des programmierten Zelltods (Apoptose) und damit zur Beendigung der
Immunantwort (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).
Memory T-Lymphozyten, die bei einer Sekundärantwort schneller Effektorfunktionen
(Sekretion von IFN-γ, IL-4, IL-5 nach 12-24h, Proliferation bei geringen AntigenKonzentrationen) exprimieren können, könnten durch die Membrankontakte mit IDC in
Abwesenheit des Antigens überleben (LONDON et al., 1999). Aber auch für die Auslösung
einer sekundären Immunantwort benötigen memory T-Lymphozyten die Präsentation des
spezifischen Antigens durch eine IDC. Auch die unterschiedliche Herkunft und Behandlung
der naiven, memory (Ductus thoracicus durch Separation) und Effektor (Lymphknoten durch
polyklonale Aktivierung über den T-Zellrezeptor und CD28) T-Lymphozyten scheint für das
Phänomen der Membrankontakte eine untergeordnete Rolle zu spielen.
85
Dynamik der Membrankontakte
Die T-Zellareale können nach Betrachtung der Membrankontakte von naiven, memory und
Effektor T-Lymphozyten mit IDC als Kompartimente eingeordnet werden, in denen die
Membrankontakte ein sehr robustes Phänomen darstellen. IDC bilden dabei ein dichtes
Netzwerk aus, durch das sich die T-Lymphozyten während ihrer Wanderung bewegen und
zahlreiche Kontakte aufnehmen können. GUNZER et al. (2000) konnten in einem 3-DKollagengel ebenfalls zeigen, dass sich T-Lymphozyten in ständigem Kontakt zu IDC
befinden. Interessanterweise konnten sie zeigen, dass die Kontakte dynamischer Natur (im
Minutenbereich) sind und T-Lymphozyten von einer IDC zur nächsten wandern, bevor sie
aktiviert werden. Dieses Modell könnte eine Erklärung für die hohe Anzahl Membrankontakte
bieten, die sich in vivo finden lassen. LORD et al., (1999) berechnen über die
Dissoziationskonstanten der beteiligten Moleküle ein kinetisches Modell, in dem durch die
niedrige Affinität viele verschiedene Antigen-präsentierende Zellen abgesucht werden
können. Die von uns gemachte Beobachtung, dass zu verschiedenen Zeitpunkten 80% der TLymphozyten Membrankontakte mit IDC in einem Antigen-unspezifischen Modell aufweisen,
unterstützt diese dynamische Sicht. Die Anzahl der Membrankontakte ist unabhängig von den
verschiedenen beobachteten Zeitpunkten (24h, 48h, 72h und 96h) der Untersuchung. Diese
Feststellung lässt vermuten, dass diese Kontakte zu jeder Zeit stattfinden.
Übereinstimmend mit der hohen Anzahl der Membrankontakte ist die Beobachtung von
vorübergehenden, kurz andauernden (transienten) Kontakten zwischen T-Lymphozyten und
DC, wenn kein spezifisches Antigen präsentiert wird (HAUSS et al., 1995; INGULLI et al.,
1997). Die transiente Bindung der Zellen könnte erklären, wie T-Lymphozyten während ihrer
Wanderung durch die lymphatischen Gewebe eine möglichst hohe Anzahl von DC nach ihrem
Antigen absuchen können.
Keine Ausbildung von Zellaggregaten (Kluster) von T-Lymphozyten mit IDC im in vivo
Modell
Die Möglichkeit zur physikalischen Überwachung und Beobachtung der anatomischen
Lokalisation von T-Lymphozyten und IDC in den Kompartimenten der lymphatischen
Organen erlaubt einige Schlussfolgerungen in Hinblick auf die Antigen-Präsentation in vivo in
den Geweben. So wird aus verschiedenen Studien berichtet, dass IDC Zellaggregate (Kluster)
86
mit T-Lymphozyten (INGULLI et al., 1997; KUDO et al., 1997) oder B-Lymphozyten
(DUBOIS et al., 1997; KUSHNIR et al., 1998) ausbilden. In dieser Miniaturumgebung
können IDC die Proliferation von ruhenden T-Lymphozyten einleiten, wobei die Ausbildung
der Zellaggregate ein Adhäsionsmolekül abhängiges Phänomen zu sein scheint. In der
untersuchten Antigen-unspezifischen Situation lassen sich hingegen keine oder nur sehr kleine
Kluster (weniger als 5 T-Lymphozyten/IDC) zwischen den injizierten T-Lymphozyten und
den IDC finden. Das Fehlen von großen Klustern mit mehr als 5 T-Lymphozyten an einer IDC
im
Gewebe
kann
durch
verschiedene
Beobachtungen
erklärt
werden.
Die
Wanderungsdynamik der T-Lymphozyten im Gewebe vermindert das stabile Binden an die
IDC und favorisiert das Ablösen der Zellen. Die Beweglichkeit der T-Lymphozyten ist stark
erhöht und ist in der Gegenwart von IDC verlängert, vermutlich hervorgerufen durch
Zytokine, die von den IDC sezerniert werden (TANG und CYSTER, 1999). Diese locken
nicht nur naive oder Effektor T-Lymphozyten in IDC-enthaltende Kompartimente, sondern
fördern auch eine ungerichtete Migration in den Kompartimenten. Auch wurde vorwiegend
aus Antigen-spezifischen in vitro Kulturen über die Ausbildung von Klustern berichtet. In
diesen Kulturen fehlt jedoch die dreidimensionale Miniaturumgebung mit extrazellulärer
Matrix und retikulären Zellen, die das Grundgerüst der Organe stellen und die
Wanderungsdynamik und die Position von wandernden Zellen deutlich beeinflusst. GUNZER
et al. (2000) konnten in einem, dem Gewebe nachgeahmten 3D-Kulturgel ebenfalls keine
Ausbildung von Klustern feststellen.
Vergleich der Membrankontakte im Rattenmodells mit einem Mausmodell
Es stellt sich die Frage, ob es sich bei den bisher nachgewiesenen Membrankontakten
zwischen T-Lymphozyten und IDC um speziesspezifische Effekte in der Ratte handeln kann.
Um einen Vergleich zu den Immunhistologien der Ratte erstellen zu können, wurden die
Membrankontakte der endogenen T-Lymphozyten (Gegenfärbung mit Hämatoxylin) mit IDC
in der Maus ausgewertet, die über einen Antikörper gegen DEC-205 (NLDC-145)
nachgewiesen worden sind. Endogene T-Lymphozyten in der Maus weisen zu etwa 60%
Membrankontakte zu diesen IDC in der Milz auf. Dabei ist allerdings zu beachten, dass DC
keine phänotypisch oder funktional einheitliche Gruppe bilden (GRABBE et al., 2000).
Diskutiert wird dabei zum einen die Abstammung von einer myeloiden Stammzelle, die sich
87
unter verschiedenen Kulturbedingungen sowohl in Makrophagen (M-CSF), als auch bei
Zugabe des GM-CSF und verschiedenen Zytokinen wie IL-4 oder TGF-β in dendritische
Zellen differenzieren kann. Aber auch die Abstammung von einer lymphoiden Stammzelle,
die sich in Lymphozyten und DC differenzieren kann, konnte nachgewiesen werden. In der
Milz werden lymphoide und myeloide DC-Populationen aufgrund der Expression von CD8α,
33D1 und DEC-205 unterschieden (SALOMON et al., 1998). So sind DC der myeloiden
Abstammung, Cd8α-, DEC-205-/low CD11b+, vorwiegend in der Marginalzone anzutreffen.
Diese führen zur Produktion eines unterschiedlichen Zytokinprofils in T-Lymphozyten und
sind verantwortlich für die Einleitung von T-Zellabhängigen Immunantworten. Lymphoide
DC, Cd8α+, DEC-205+ CD11b-, die zu hohen Anteilen in Milz, Thymus, Lymphknoten und
Peyersche Platten anzutreffen sind, sind für die Induktion von Toleranz zuständig (CELLA et
al., 1997). Finden wir also in der Maus eine Größenordnung von 60% Membrankontakten, so
könnte eine Begründung sein, dass der verwendete Antikörper DEC-205 nur DC der
myeloiden Abstammung erfasst. Im Gegensatz zu den spezifischen Markern in der Maus,
exprimieren alle IDC eines reifen Phänotyps ungeachtet ihrer Herkunft oder Funktion hohe
Level an MHC Klasse I und II und kostimulatorische Moleküle wie ICAM-1
(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Definition
der IDC und einem einheitlichen spezifischen Marker für IDC in der Ratte ist deshalb die
Arbeit auf den ausgereiften Phänotyp beschränkt und ermöglicht dadurch eine eindeutige
Identifikation. In diesem Sinne ist es von Vorteil gewesen, sich die Expression von ICAM-1
und MHC Klasse II zunutze zu machen, die, unabhängig von der myeloiden oder lymphoiden
Abstammung oder den Kulturbedingungen, auf allen IDC des reifen Phänotyps einheitlich ist.
In der Ratte scheint der Unterschied zwischen verschiedenen Phänotypen der DC keinen
Einfluss auf die Anzahl der Membrankontakte zu haben.
88
2. Funktion von LFA-1 bei Membrankontakten im Mausmodell
Um besser verstehen zu können, wie die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und
DC, die bisher in der Immunhistologie und der konfokalen Mikroskopie betrachtet worden
sind, in vivo zustande kommen und zu bewerten sind, wurde die Rolle des
Leukozytenfunktionsantigens-1 (LFA-1) untersucht.
Mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Wildtypzellen und LFA-1-defiziente Zellen wurden
gleichzeitig in Wildtypmäuse injiziert. Nach 2h wurden die Membrankontakte zu DC in der
Milz betrachtet. Obwohl LFA-1 eine Schlüsselrolle bei der Zelladhäsion zugeschrieben wird
(DEETHS u. MESCHER, 1999), befanden sich sowohl die Wildtypzellen, als auch die
LFA-1-defizienten Zellen zu etwa 60% in Membrankontakt zu DC. Das fehlende LFA-1 auf
den T-Lymphozyten scheint den Anteil der Membrankontakte nicht zu beeinflussen. Eine
Erklärung für diese Befunde könnte sein, dass auch DC das LFA-1-Molekül und
T-Lymphozyten den Bindungspartner ICAM-1 exprimieren. Erst durch den zusätzlichen
Einsatz von Antikörpern gegen LFA-1 oder ICAM-1 könnte in einem weiteren
Versuchsansatz der Einfluss des LFA-1 auf die Kontakte deutlicher gezeigt werden. Aber wie
SWARTE et al. (1998) zeigen konnten, wird auch über L-Selektin ein Kontakt zwischen
Zellen ausgebildet, was auf eine gewisse Redundanz der Zelladhäsion schließen läßt. Auch
weitere Liganden-Rezeptorenpaare wie CD2/ LFA-3, CD28/ CD80 und CD40/ CD40L
können die Antigen-unabhängige, transiente Bindung zwischen T-Lymphozyten und DC in
Abwesenheit des LFA-1-Moleküls vermitteln (HAUSS et al., 1995).
3. Membrankontakte beeinflussen den Anteil der Ki-67+ und BrdU+
T-Lymphozyten
Die Proliferation der injizierten Effektor T-Lymphozyten wurde über die Expression des
Zellzyklus-assoziierten Zellkernantigen Ki67 dargestellt, das über den gesamten Zellzyklus
(G1-M2) hindurch exprimiert wird (GERLACH et al., 1997). Ein weiterer Nachweis der
Proliferation ist der Einbau von BrdU, das während der S-Phase des Zellzyklus in die DNS
89
eingebaut wird. Bei der Untersuchung der Proliferation der injizierten Effektor TLymphozyten zeigte sich, dass zu allen Beobachtungszeitpunkten Proliferation in der PALS
nachweisbar war (Daten nicht gezeigt). Im Inokulum befindet sich ein Anteil von 50% der TLymphozyten im Zellzyklus, jedoch sind im Blut nach bereits 1h und zu späteren Zeitpunkten
nur noch 10% der injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus nachzuweisen. Das entspricht der
Beobachtung, dass nach Aktivierung von T-Lymphozyten etwa 70% dieser Zellen innerhalb
von 24h nach Injektion absterben (BINNS et al., 1992; SMITH et al., 1980). Betrachtet man
diesen Anteil der proliferierenden T-Lymphozyten näher und in Abhängigkeit zu den
Membrankontakten, so war festzustellen, dass sich signifikant mehr injizierte T-Lymphozyten
im Zellzyklus und auch in der S-Phase befanden, wenn sie gleichzeitig einen Membrankontakt
mit einer DC aufwiesen. Nach 24h befanden sich etwa 30% der injizierten T-Lymphozyten
mit Kontakt zu einer DC im Zellzyklus, jedoch nur 20% der T-Lymphozyten, die keinen
Kontakt zu einer DC aufwiesen. Individuelle Schwankungen zwischen den Tieren sind von
20-40% zu finden, die Tendenz zeigt sich jedoch in allen untersuchten Tieren. Die Hälfte der
T-Lymphozyten ohne Membrankontakt konnte mit der Hilfe des konfokalen Mikroskops als
falsch-positiv erkannt werden. Korrigiert man die 20% der T-Lymphozyten im Zellzyklus um
diese Erkenntnis, so liegt man bei etwa 10% der injizierten Zellen im Zellzyklus, die sich auch
im Blut wiederfinden lassen.
Auch für die T-Lymphozyten in der S-Phase konnten gleiche Tendenzen gefunden werden. Es
war ein Anstieg der Zellen im Zellzyklus oder der S-Phase um 50% zu verzeichnen, wenn die
T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC lagen. Auch nach 72h ist der Einfluss der
Membrankontakte auf den Zellzyklus und die S-Phase der T-Lymphozyten noch
nachzuweisen. Im Vergleich zu den Werten nach 24h sind die Werte auf etwa die Hälfte
abgefallen, bleiben in der Tendenz jedoch gleich. Auch hier finden sich signifikante
Unterschiede von T-Lymphozyten mit Membrankontakt zu IDC.
In diese Ergebnisse kann auch die Überlegung einbezogen werden, die mit dem konfokalen
Mikroskop gezeigt werden konnte. So ist zu vermuten, dass auch die Hälfte der TLymphozyten im Zellzyklus oder in der S-Phase, die keinen Membrankontakt aufgewiesen
haben, ober- oder unterhalb der Schnittebene durchaus in Membrankontakt liegt. Eine weitere
Erklärung für den Prozentsatz der T-Lymphozyten im Zellzyklus ohne Kontakt kann die
Dynamik der Zell-Zellkontakte bieten, die von GUNZER et al. (2000) gefunden wurden. So
90
können
die
T-Lymphozyten
durch
zahlreiche
Kontakte
zu
verschiedenen
DC
aufeinanderfolgende Signale akkumulieren und so weiter im Zellzyklus verbleiben oder weiter
durch die S-Phase geleitet werden. Die Gewebeumgebung unterstützt die Ansammlung von
Einzelsignalen, die schlussendlich zu einer Aktivierung und Auslösung einer Immunantwort
führen kann.
Da sich im äußeren Anteil der PALS vermehrt auch B-Zellen aufhalten (STEINIGER et al.,
2000), die zu ihrer Enddifferenzierung in Plasmazellen die Hilfe von aktivierten,
Antigen-spezifischen T-Lymphozyten benötigen (DEFRANCO, 1988), stellte sich die Frage,
ob sich die Membrankontakte zwischen dem äußeren und inneren Anteil der PALS
unterscheiden und nachfolgend zu einer erhöhten Proliferation führen. Die Membrankontakte
zwischen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten belaufen sich im äußeren Bereich auf über
70%. Im inneren Bereich der PALS haben nur 20% der injizierten T-Lymphozyten
Membrankontakt zu B-Lymphozyten. Es lässt sich also vermuten, dass am Übergang der
PALS zu den Follikeln T-Lymphozyten sowohl zu DC, als auch gleichzeitig zu BLymphozyten Membrankontakte haben. Diese Mikroumgebung nimmt eine Schlüsselrolle für
die Funktion der T- und B-Lymphozyten, sowie den DC während einer Immunantwort ein
(VAN ROOIJEN, 1990). T-Lymphozyten, die sich im Zellzyklus befinden, sind gleichmäßig
über beide Bereiche der PALS verteilt. Im inneren, wie im äußeren Bereich befinden sich 30%
der injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus, wenn sie einen Membrankontakt zu DC
aufweisen. Betrachtet man hingegen die T-Lymphozyten, die sich in der S-Phase befinden,
also eine Zellteilung durchlaufen, so finden sich nach 24h im inneren Anteil 6% der TLymphozyten in der S-Phase, im äußeren sind es jedoch über 8%. Deutlicher wird dieser
Unterschied nach 72h, wenn sich nur noch 2% im inneren Bereich, aber mehr als die doppelte
Anzahl im äußeren Bereich in der S-Phase befindet. Auch zahlreiche endogene Lymphozyten,
bei denen allerdings nicht zwischen T- oder B-Lymphozyten unterschieden werden konnte,
proliferieren im äußeren Bereich der PALS. Nach Kontakt zu DC können stimulierte THelferzellen im äußeren Anteil der PALS auf B-Zellen treffen und diese zur
Antikörperproduktion stimulieren. Im Zusammenspiel mit CD8+ T-Lymphozyten können sie
diese zu einer zytotoxischen Immunantwort „lizenzieren“ (LANZAVECCHIA, 1998) oder
aber Makrophagen unterstützen bei der Eliminierung von Fremdkörpern (GORDON, 1999;
JANEWAY et al.,1999).
91
Membrankontakte finden unabhängig von der Lokalisation, dem Aktivierungsstatus der TLymphozyten und unabhängig vom Zeitpunkt auf einem sehr hohen Niveau statt. Mit diesen
Ergebnissen können die in verschiedenen Zelltransfermodellen ermittelten Daten in anderem
Licht
betrachtet
werden.
So
produzieren
DC
Chemokine,
die
verschiedene
Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten, andere DC oder weitere Zelltypen anlocken können
wie z.B. das secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) (GUNN et al., 1999). Durch ständig
im Gewebe (konstitutiv) exprimierte Chemokine können DC Lymphozyten in T- und BZellkompartimente unterteilen. In Anbetracht der erhobenen Daten ist es jedoch fraglich, ob
die Anlockung von T-Lymphozyten ausschließlich durch die von DC sezernierten Chemokine
zustande kommt oder ob nicht die Mikroumgebung der Kompartimente und das Netzwerk der
DC zu ersten Membrankontakten zwischen den Zellen führen. Chemokine könnten die Art
und Funktion des Kontaktes zwischen T-Lymphozyten und DC bestimmen und
Immunantworten regulieren. Dieser Frage wäre in der Fortsetzung dieser Arbeit weiter
nachzugehen.
92
VI. Zusammenfassung
Andrea Sahle
Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in den sekundär
lymphatischen Organen der Ratte
Bisher sind nur wenige in vivo Daten zu den Kontakten zwischen T-Lymphozyten und DC
erhoben worden, obwohl dem Zusammenspiel von T-Lymphozyten und dendritischen Zellen
eine ausschlaggebende Rolle bei der Kontrolle von Immunantworten und zahlreichen weiteren
Funktionen zugeschrieben wird. Dendritische Zellen werden als besonders potente Antigenpräsentierende Zellen beschrieben, da sie in der Peripherie Antigen aufnehmen, es
prozessieren und durch ihre sehr hohe Expression von MHC und kostimulatorischen
Molekülen primäre und sekundäre T-Zellabhängige Immunantworten auslösen können.
T-Lymphozyten, die vom Blut in die Gewebe und zurück wandern können, nehmen in den
sekundär lymphatischen Organen vielfachen Kontakt zu den Antigen-tragenden DC auf.
Durch dieses System wird aus weiten Gebieten des Körpers Antigen konzentriert in den
lymphatischen Organen angeboten. Um ein sensibles Zusammenspiel zu gewährleisten,
benötigen die Zellen direkten physikalischen Kontakt und Interaktion miteinander. Es ist
jedoch bislang in keinem System analysiert worden, in welcher Anzahl die Kontakte in einer
physiologischen Situation in vivo in den Kompartimenten der lymphatischen Organe
vorkommen und durch welche Parameter sie beeinflusst werden. Diese Erkenntnis könnte zu
einem besseren Verständnis der Regulation von Immunantworten beitragen.
Um immunhistologisch nachweisen zu können, welcher Anteil von T-Lymphozyten sich in
Membrankontakt
zu
IDC
befindet,
wurden
CD4+ T-Lymphozyten
des
kongenen
Rattenstammes LEW.7B(BH) in naive (CD45RC+) und memory (CD45RC-) Zellen separiert.
Des weiteren wurden aus dem Lymphknoten stammende T-Lymphozyten mit monoklonalen
Antikörpern über den T-Zellrezeptor und CD28 aktiviert und während der Inkubation mit
5’-Brom-2’Desoxyuridin (BrdU) markiert. Diese Zellpopulationen wurden intravenös in
LEW-Ratten (RT7a)
injiziert. Nach 24h wurden die Milz, die Lymphknoten und die
93
Peyerschen Platten entnommen. Außerdem wurde die Milz zu weiteren Zeitpunkten (1h, 9h,
72h 96h) gewonnen. Es erfolgte die immunhistologische Darstellung der Membrankontakte
zwischen den T-Lymphozyten und DC in den jeweiligen T-Zellarealen (PALS, Parakortex,
interfollikuläre Region). Es zeigte sich, dass sich in vivo 80±10% der injizierten
T-Lymphozyten in Membrankontakt zu DC befindet. Dieses Phänomen lässt sich unabhängig
vom lymphatischen Organ, unabhängig vom Zeitpunkt nach Injektion und unabhängig vom
Aktivierungsstadium der injizierten T-Lymphozyten beobachten. Auch die dem Empfänger
eigenen, endogenen T-Lymphozyten befinden sich zu über 60% in Membrankontakt zu IDC.
Durch ihre langen Ausläufer bilden IDC ein dichtes Netzwerk in den T-Zellarealen und
ermöglichen eine effektive Überwachung des aus der Peripherie stammenden Antigens durch
die wandernden T-Lymphozyten.
Um ausschließen zu können, dass der hohe Anteil der Membrankontakte durch eine
Übereinanderlagerung des Farbniederschlags auf den Zelloberflächen zustande kommt,
erfolgte im weiteren eine Aufarbeitung der Immunhistologien in der konfokalen Mikroskopie.
Durch die Verwendung von Fluorochrom-markierten Farbstoffen kommt ein geringerer
Farbniederschlag zustande. Es konnte auch mit dieser Methode ein Anteil von über 65%
Membrankontakte aufgezeigt werden. Die Kontakte waren in mehr als der Hälfte der durch
die Zelle gelegten Schichten ausgebildet. In etwa 50% der Fälle ließen sich auch ober- oder
unterhalb der Schnittebene noch Kontakte feststellen. Damit konnten die hohen Anteile an
Membrankontakten in der lichtmikroskopischen Methode bestätigt werden.
Um Hinweise auf die Funktion der bislang morphologisch nachgewiesenen Membrankontakte
zu erhalten, wurden T-Lymphozyten im Zellzyklus und in der S-Phase immunhistologisch
identifiziert. Es zeigte sich, dass sich signifikant mehr T-Lymphozyten im Zellzyklus (Ki-67+)
oder in der S-Phase (BrdU+) befanden, wenn sie einen Kontakt zu einer IDC aufwiesen.
Unter Verwendung eines spezifischen Markers für DC im Mausmodell konnte gezeigt
werden, dass auch spezies-unspezifisch der Hauptteil der endogenen T-Lymphozyten in der
Milz Membrankontakt zu DC aufweist.
Im Mausmodell wurde die Rolle des Leukozytenfunktionsantigen-1 (LFA-1) getestet. Vor der
Injektion in Wildtypmäuse wurden Zellen von LFA-1-defizienten (CD11a-/-/CD18) Mäusen,
aber auch Wildtypzellen markiert und immunhistologisch in den Kompartimenten der Milz
94
nachgewiesen. Die Membrankontakte erwiesen sich als unabhängig von der LFA-1Expression
auf den T-Lymphozyten. Da jedoch auch dendritische Zellen LFA-1 und
T-Lymphozyten das ICAM-1-Molekül auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, müsste in
weiteren Versuchen durch den Einsatz eines anti-ICAM-1-Antikörpers der Einfluss von LFA1 auf die Membrankontakte zwischen den Zellen untersucht werden. Aber auch weitere
Liganden-Rezeptorpaare wie CD2/ LFA-3 und CD28/ CD80 können transiente, Antigenunabhängige Kontakte vermitteln. Diese Redundanz der Moleküle weist darauf hin, wie
wichtig die Interaktion der Zellen im Organismus ist.
Die Wanderung der T-Lymphozyten durch das enge Netzwerk von DC in den T-Zellarealen
der sekundär lymphatischen Organe ermöglicht das Absuchen von möglichst vielen
Oberflächen (DC) nach spezifischem Antigen und damit der Regulierung und Kontrolle von
Immunantworten. Fraglich bleibt die Rolle der Chemokine bei der Anlockung der
Antigen-spezifischen T-Lymphozyten. Möglich wäre auch
dynamische Aufnahme von
zahlreichen Kontakten, deren Signale kumuliert würden, um T-Lymphozyten zu aktivieren.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen eine einfache Möglichkeit auf, wie die
Regulierung und Kontrolle einer Immunantwort gewährleistet werden kann.
95
VII. Summary
Andrea Sahle
Interaction of T-lymphocytes with dendritic cells in the secondary lymphoid organs of the rat
The interaction between T lymphocytes and dendritic cells (DC) plays a major role in the
control of the immune response and in many other functions. However, few in vivo data have
been collected so far on this interaction. Dendritic cells are very potent antigen presenting
cells since they take up antigen in the periphery, process it, and thus initiate primary and
secondary T cell dependent immune responses. They do this through their high expression of
MHC and costimulatory molecules. T lymphocytes, which migrate from the blood to the
tissue and back, interact in lymphatic organs with the antigen bearing DC. Antigen from all
areas of the organism is presented in a concentrated way via this system. In order to ensure
interaction the cells need direct physical contact. It has not been studied in animals or humans
how many such contacts occur in the physiological situation in vivo in the compartments of
lymphatic organs and what parameters influence these contacts. These investigations could
lead to a better understanding of the regulation of the immune response.
In order to investigate what proportion of T lymphocytes have direct physical contact with DC
in the T cell areas of lymphatic organs, lymphocytes of congenic LEW.7B(BH) rats were
separated into naïve (CD45RC+) and memory (CD45RC-) cells. Furthermore, lymph node T
cells were stimulated with monoclonal antibodies against the T cell receptor and CD28 in the
presence of BrdU to show proliferation. These cell populations were injected iv into
LEW (RT7a) rats. Spleen, lymph node, and Peyer’s patches were removed after 24h.
Additionally, spleen was removed at various time points (1h, 9h, 72h, 96h). An
immunohistological demonstration of the membrane contacts between T lymphocytes and DC
in the respective T cell area (PALS, paracortex, interfollicular region) followed. It was shown
in the congenic rat model that in vivo 80±10% of the injected T cells had membrane contact
with DC. This phenomenon was observed independent of the lymphatic organ and T
lymphocyte subset studied. It was also independent of the time following cell injection. More
96
than 60% of the endogenous T cells also had membrane contact with DC building a network
via their long dendritic branches.
Then an analysis of the immunohistologies using a confocal microscope was performed. It
was shown that more than half of the sections through a cell revealed contact between the
cells. Furthermore, in 50% of the cases contact could still be observed above and below the
projection.
Using a mouse model the role of leukocyte function antigen-1 (LFA-1) was investigated.
Before injection into wild type mice, wild type cells or cells from LFA-1 deficient (CD11a-//CD18) mice were labelled. These cells were then analysed immunohistologically in the
spleen compartments. In the mouse model, using a specific DC marker, the majority of
injected T lymphocytes also had membrane contact with DC. This contact was not dependent
on LFA-1 expression on T lymphocytes. To exclude a redundant expression of surface
molecules it would be interesting to use a monoclonal antibody against ICAM-1 or LFA-1
showing the influence of LFA-1. Meanwhile other receptor/ligand pathways, CD2/ LFA-3,
CD28/ CD80 or Cd40/ CD40L could be involved in the transient, antigen independent
contacts between T lymphocytes and DC.
Furthermore, T lymphocytes were immunohistogically identified in cell cycle (Ki-67+) and in
the S-phase (BrdU+). Significantly more T lymphocytes were in cell cycle or S-phase, ie
proliferating, when contact with a DC was observed.
Contact is important for the survival of T lymphocytes and DC and for tolerance. It is a
constant phenomenon that is not dependent on cell surface molecules such as L-selectin, IL-2,
which change upon activation of T lymphocytes and molecules such as LFA-1. During
migration T lymphocytes take up dynamic contact with DC allowing them to control the
immune response against foreign and most likely self proteins.
The migration of T lymphocytes through the tight network of DC in the secondary lymphoid
organs could show a simple mechanism to regulate and control immune responses.
97
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117
IX. Anhang
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Membrankontakte von T-Lymphozyten mit
dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen Organen der Ratte“ selbständig verfasst
habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
-
die Versuche zur Kanülierung des Ductus thoracicus mit anschließender Aufreinigung
der CD4+T-Lymphozyten wurden von Frau Ulrike Geismar, Frau Dr. rer. nat. Ulrike
Bode und Herrn Prof. Dr. med. J. Westermann durchgeführt.
-
Die Gewinnung von T-Lymphozyten aus peripheren und mesenterialen Lymphknoten
und anschließender Aktivierung in vitro wurde von Frau Dr. rer. nat. Ulrike Bode, geb.
Peters, als Methode etabliert und mit ihr als Verantwortlicher zusammen durchgeführt.
-
Die Gefrierschnitte der Organe und die immunhistologische Färbung derselbigen
wurden mit der tatkräftigen Unterstützung von Frau I. Dressendörfer und Frau
S. Lopez-Kostka angefertigt.
-
Die Konfokale Mikroskopie wurde methodisch von Frau Dr. med. Astrid Markus
etabliert. In Zusammenarbeit mit ihr wurden die immunhistochemischen Färbungen
zur Auswertung mit der konfokalen Mikroskopie erstellt.
-
LFA-1-defiziente Mäuse wurden im Institut von Frau N. Hogg etabliert und gezüchtet.
LFA-1-defiziente T-Lymphozyten wurden der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr.
J. Westermann zur Verfügung gestellt.
Ich
habe
keine
entgeltliche
Hilfe
von
Vermittlungs-
bzw.
Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
118
Ich habe die Dissertation an der folgenden Institution angefertigt:
-
Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule
Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Eigenhändige Unterschrift:
119
Aus Prioritätsgründen wurden Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit vorgestellt:
Vorträge
SAHLE, A., U. BODE, E. B. BELL, R. PABST, J. WESTERMANN
Interaktion von naiven, aktivierten und memory T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in
T-Zellarealen von lymphatischen Organen.
94. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft, Hamburg, 26.-29.03.1999
WESTERMANN, J., A. SAHLE
Interaktion von dendritischen Zellen und T-Lymphozyten Subpopulationen in vivo.
22. Arbeitstagung Norddeutscher Immunologen, Borstel, 10.12.1999
Poster
SAHLE, A., U. BODE, E. B. BELL, R. PABST, J. WESTERMANN
Interaction of naive, activated and memory T cells with interdigitating dendritic cells in
lymphoid organs.
30. Tagung der Deutsche Gesellschaft für Immunologie, Hannover , 29.09.-02.10.1999
(Immunobiol. 200, S.445-6, 1999)
120
Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. R. Pabst danke ich für die freundliche Überlassung des Themas, die
guten technischen Voraussetzungen bei der Durchführung dieser Arbeit und die Bereitstellung
der notwendigen Räumlichkeiten.
Bei Herrn Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich möchte ich mich für die freundliche Übernahme
der wissenschaftlichen Betreuung bedanken.
Bei Herrn Prof. Dr. med. J. Westermann möchte ich mich ganz besonders für die gute
Betreuung und die stete, auch kurzfristige Bereitschaft zur Diskussion und Kritik bedanken.
Ich habe in dieser Zeit nicht nur wissenschaftlich, sondern auch menschlich viel gelernt.
Meinen Kobetreuern im Graduierten Kolleg, Herrn Prof. Dr. med. H.-G. Forssmann und
Herrn Priv.-Doz. Dr. med. H. Holtmann möchte ich danken, dass sie mir die Möglichkeit
gegeben haben, in diesem Rahmen zu promovieren.
Ganz herzlich möchte ich mich bei meinen Kolleginnen Frau Dr. U. Bode und Frau Dr. B.
Lüttig bedanken, mit deren Geduld, Wissen und moralischer Unterstützung ich jederzeit
rechnen konnte.
Frau Dr. A. Markus danke ich für die viele Zeit und Mühe, die sie sich mit der Anfertigung
und Verarbeitung der konfokalen Bilder gemacht hat. Herrn Priv.-Doz. Dr. med. A. Gebert
danke ich für die Unterstützung bei der Auswertung der konfokalen Bilder und für seine
Unterstützung in allen graphischen und computerrelevanten Fragen.
Frau I. Dressendörfer und Frau S. Lopez danke ich für die tatkräftige Hilfe und die Geduld bei
der Anfertigung zahlreicher Präparate und Immunhistologien.
Allen Mitarbeitern der Abteilung, deren freundliche Unterstützung, Ratschläge und Geduld
eine angenehme und motivierende Arbeitsatmosphäre schaffte, möchte ich herzlich danken.
Meiner Mutter, meinem Bruder und meiner Schwägerin möchte ich für das offene Ohr und die
telefonische Aufbauarbeit in den kritischen Momenten dieser Arbeit danken.
Frau med. vet. U. Raschke und Frau med. vet. A. Heipke danke ich für den konstanten
moralischen Beistand, ohne den ich so manches Mal verzweifelt wäre. Abschließend danke
ich meiner Tochter, dass sie mir in den schwierigsten Momenten geholfen hat, das Lachen
nicht zu verlernen.