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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Nanotoxikologie
In vitro-Testverfahren zur Toxikologie
von Nanomaterialien
ALEXANDRA KROLL, DANIELA HAHN, JÜRGEN SCHNEKENBURGER
GASTROENTEROLOGISCHE MOLEKULARE ZELLBIOLOGIE, WESTFÄLISCHE WILHELMSUNIVERSITÄT MÜNSTER
Zur Bestimmung des toxischen Potenzials von Nanomaterialien ist eine
umfassende Charakterisierung ihrer physikochemischen Eigenschaften
sowie ihrer möglichen Interferenz mit verschiedensten in vitro-Testsystemen unerlässlich.
To assess the toxic potential of nanomaterials, a thorough characterization of their physico-chemical properties and their possible interference
with in vitro test systems is essential.
ó Als Nanomaterialien bezeichnet man
Strukturen, die in mindestens einer Dimension kleiner als 100 nm sind. Aufgrund ihrer
außergewöhnlichen Materialeigenschaften
finden sie breite Anwendung in unterschiedlichsten Bereichen wie der Automobilindustrie
oder Kosmetik- und Lebensmittelindustrie.
Technisch hergestellte Nanomaterialien
umfassen Substanzen verschiedener chemischer Zusammensetzung und Struktur, wie
Nanopartikel, Nanoröhrchen, Nanofasern oder
Nanoplättchen. So werden Nanopartikel aus
Titandioxid (TiO2) häufig als UV-Schutz in
Sonnencremes oder Silber-Nanopartikel als
Bakterizid in Verpackungsmaterial eingesetzt.
Kohlenstoff-basierte Nanoröhrchen (CNTs)
finden bei der Härtung verschiedenster Werk-
˚ Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme der Anhaftung von TiO2-Nanopartikeln an menschliche Hautzellen (HaCaT).
TiO2-Nanopartikel liegen als Agglomerate
(schwarze Pfeile) auf der Zelloberfläche,
N: Nukleus.
stoffe in der Sensorik und Elektronik Anwendung. Die zunehmend industrielle Herstellung von Nanomaterialien führt zu einem
erhöhten Expositionsrisiko und erfordert
daher eine genaue Überprüfung möglicher
Auswirkungen auf Mensch und Umwelt.
Nanomaterialien – Substanzen mit
einzigartigen Eigenschaften
Warum muss das Gefährdungspotenzial von
Nanomaterialien bestimmt werden, wenn die
toxikologische Unbedenklichkeit gröberer Formen derselben Substanzen bereits erwiesen
ist?
Verglichen mit ihren größeren Pendants
besitzen Nanomaterialien ein extrem großes
Verhältnis von Oberfläche zu Volumen. Daher
sind sie wesentlich reaktiver und interagieren
stärker mit biologischen Systemen als ihre
größeren Vertreter. Das toxische Potenzial
kann sich dementsprechend erheblich von
dem der zugrunde liegenden Ausgangsstoffe
unterscheiden. Zudem können verschiedene
Nanomaterialien trotz gleicher chemischer
Zusammensetzung unterschiedliche zelluläre Reaktionen auslösen. Der Einfluss der Kristallstruktur auf die biologische Aktivität konnte am Beispiel von TiO2-Nanopartikeln (Abb.
1) gezeigt werden. Partikel gleicher Größe mit
unterschiedlicher Struktur (Anatas bzw. Rutil)
riefen unterschiedliche Effekte hervor, wobei
Rutil-TiO2-Nanopartikel stärker zytotoxisch
wirkten [1–2]. Weiterhin bestimmen Löslichkeit, Aggregation/Agglomeration, Form, Oberflächenladung und -chemie die biologische
Aktivität von Nanomaterialien. Diese Parameter können sich bei Dispergierung in biologischen Medien stark verändern; Nanomaterialien umgeben sich dann mit einer „Protein-Korona“, die die biologische Aktivität entscheidend beeinflusst [3]. Zurzeit reicht die
Datenlage für eine Korrelation von physikochemischen Eigenschaften von Nanomaterialien und ihrer biologischen Wirkung nicht
aus. Daher muss für jedes technisch hergestellte Nanomaterial, bei dem eine Exposition
von Mensch und Umwelt nicht ausgeschlossen werden kann, die toxikologische Unbedenklichkeit nachgewiesen werden.
In vitro-Methoden und ihre Grenzen
beim Testen der Toxizität von
Nanomaterialien
Derzeit basieren in vitro-Methoden zur Bestimmung des toxischen Potenzials von Nanomaterialien auf Standardverfahren, die für herkömmliche Chemikalien etabliert wurden. Man
misst dabei die potenziell schädigenden Effekte im Zellkulturmodell an Zelllinien, die entsprechend einer möglichen in vivo-Exposition
ausgewählt wurden. So verwendet man z. B.
Lungenepithelzellen, wenn die zu testende
Substanz über den Inhalationsweg aufgenommen werden kann. Als ein Parameter der zytotoxischen Untersuchungen wird beispielsweise
die Zellviabilität durch Bestimmung der Stoffwechselaktivität der Zellen mittels 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) gemessen. Die Stimulation der zellulären Apoptose oder Nekrose wird anhand
der Marker, AnnexinV, Caspase-3, Laktatdehydrogenase (LDH), untersucht; Veränderungen der Membranintegrität werden unter Verwendung von Neutralrot oder Propidiumjodid
bestimmt. Die Induktion von oxidativem ZellStress wird in der Regel fluorimetrisch mittels
2’,7’-Dichlorodihydrofluoreszeindiacetat
(H2DCF-DA) gemessen. Aufgrund der spezifischen Eigenschaften von Nanomaterialien ist
der Einsatz dieser Methoden ohne vorherige
Prüfung auf Interferenz sehr problematisch,
da sie chemische, optische und enzymatische
Nachweismethoden verfälschen können. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass KohBIOspektrum | 01.10 | 16. Jahrgang
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Tab. 1: Nanomaterialien beeinflussen in vitro-Testsysteme (verändert nach [5]).
Zytotoxizitätstests
Interferierende Nanomaterialien
Interferenz → Verfälschung
Nachweis der Stoffwechselaktivität mit MTT
Kohlenstoff-basierte Nanomaterialien
Absorption von MTT → erhöhte mitochondriale Aktivität
Nachweis des Nekrose-Markers LDH
Nanomaterialien mit metallischen Verunreinigungen
Inhibierung von LDH → erniedrigte Nekrose-Rate
Nachweis von Nekrose durch DNA-Färbung
mit Propidiumjodid
Kohlenstoff-basierte Nanomaterialien
Absorption von Propidiumjodid → erniedrigte NekroseRate
Nachweis von Apoptose-Markern mit Annexin V
(flourimetrisch)
Chitosan-Nanopartikel
Depletion von Kalzium → erniedrigte Apoptose-Rate
Nachweis von intakten Lysosomen mit Neutralrot
Kohlenstoff-basierte Nanomaterialien
Absorption von Neutralrot → erniedrigte Zellviabilität
Zn2+
Inhibierung der Caspase-3-Aktivität → erniedrigte
Apoptose-Rate
Nachweis des Apoptose-Markers Caspase-3
(fluorimetrisch)
Nanopartikel mit Spurenelementen, besonders
Nachweis von oxidativem Zellstress
(ROS-Produktion) mit DCF (fluorimetrisch)
Kohlenstoff-basierte Nanomaterialien
Fluoreszenz-Löschung → erniedrigte Indikation von
Zellstress
Nachweis der Zytokin-Sekretion mittels ELISA
Metalloxid-Nanopartikel, Kohlenstoff-basierte
Nanomaterialien
Absorption der Zytokine → erniedrigte ZytokinProduktion
MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; LDH: Laktatdehydrogenase; DCF: 2’,7’-Dichlorofluoreszein.
lenstoff-basierte Nanoröhrchen (CNTs) durch
Absorption von MTT eine falsche Zellviabilität
suggerieren [4]. Die häufig zur zytotoxikologischen Charakterisierung verwendeten Testsysteme und ihre mögliche Beeinflussung
durch Nanomaterialien sind in Tabelle 1
zusammengefasst [5].
Tab. 2: Für toxikologische Untersuchungen relevante Nanomaterialeigenschaften und geeignete
Methoden zu deren Charakterisierung.
Nanomaterialeigenschaft
Methode zur Charakterisierung
Form und Primärpartikelgröße
TEM, SEM
Größenverteilung des Pulvers
SMPS
Größenverteilung der Dispersion
AUC, DLS*
Strategien zur Bestimmung des
zytotoxischen Potenzials von
Nanomaterialien
Chemische Zusammensetzung und Reinheit
XPS, EDX, ICP-MS, TOF-SIMS
Oberflächenchemie
XPS, EDX
Aufgrund der einzigartigen Materialeigenschaften ist eine grundlegende physikalische
Charakterisierung des Nanomaterials vor der
eigentlichen Toxizitätsbestimmung dringend
erforderlich. Die physikochemischen Eigenschaften des Materials müssen sowohl in Pulverform als auch nach Dispergierung in dem
zu testenden Medium bestimmt werden.
Zunächst sollten Größe und Form der Primärsubstanz, z. B. mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht werden. Produktionsbedingte Verunreinigungen,
z. B. Katalysatormetalle oder Endotoxine müssen mit chemischen Nachweisverfahren ausgeschlossen werden. Zur Bestimmung der
Kristallinität und Kristallmodifikation bietet
sich eine Messung der Röntgenbeugung (XRD,
X-ray diffraction) an. Das elektrische Potenzial an der Oberfläche (Zetapotenzial) und die
Löslichkeit sollten sowohl in Wasser als auch
im Testmedium ermittelt werden, da das Dispersionsmittel beide Parameter beeinflusst.
Gleiches gilt auch für die Aggregation bzw.
Agglomeration von Nanomaterialien [6]. Um
dosisabhängige Effekte untersuchen zu können, muss zudem das Sedimentationsverhalten der Nanomaterialien berücksichtigt wer-
Spezifische Oberfläche des Pulvers
BET
Kristallinität
XRD
Löslichkeit
ICP-MS
Oberflächenpotenzial
Zetapotenzial
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*Bei monodispersen Systemen. TEM/SEM: transmission/scanning electron microscopy; SMPS: scanning mobility
particle sizer; AUC: analytical ultracentrifugation; DLS: dynamic light scattering; XPS: X-ray photoelectron spectroscopy; EDX: energy dispersive X-ray spectroscopy; ICP-MS: inductively coupled plasma mass spectrometry;
TOF-SIMS: time-of-flight secondary ion mass spectrometry; BET: Analyseverfahren zur Größenbestimmung von
Oberflächen; XRD: X-ray diffraction.
den. Darüber hinaus sollten Oberflächenmodifikationen (Protein-Korona) des in Zellkulturmedium oder Pufferlösung dispergierten
Nanomaterials z. B. mithilfe der RöntgenPhotoelektronenspektroskopie (XPS, X-ray
photoelectron spectroscopy), der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX, energy
dispersive X-ray spectroscopy) und/oder der
Massenspektrometrie (z. B. TOF-SIMS, timeof-flight secondary ion mass spectrometry) analysiert werden (Tab. 2).
Vor Verwendung der in vitro-Systeme muss
sichergestellt werden, dass das zu testende
Nanomaterial in der eingesetzten Konzentration nicht mit den Nachweisreagenzien oder
Enzymen interagiert. Werden Fluoreszenz-
basierte Zytotoxizitätstests durchgeführt (fluorimetrisch, Tab. 1), so muss die Eigenfluoreszenz bzw. die Unterdrückung der Indikator-Fluoreszenz durch das getestete Nanoobjekt zuvor ausgeschlossen werden. Nanomaterialien, wie z. B. TiO2 oder ZnO, die eine
photokatalytische Aktivität aufweisen, müssen unter Ausschluss von Lichteinstrahlung
getestet werden, wenn diese zu einer Verfälschung der Ergebnisse beiträgt.
Wir konnten zeigen, dass der Nachweis toxischer Effekte eines untersuchten Nanoobjekts
abhängig von den verwendeten Zytotoxizitätstests und Zelllinien stark unterschiedlich
ausfallen kann [2]. Folglich sollten Nanomaterialien mit verschiedenen Testverfahren und
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˚ Abb. 2: A, Schematische Darstellung der Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) mit dem Zell-Monitoring-System
cellZscope® (nanoAnalytics). Die Methode erlaubt es, die zu testende Substanz an der apikalen oder der basolateralen Seite der Zellen zu applizieren.
B, Zeitlicher Verlauf des TEER von Nierenepithelzellen (NRK-52E). Die Zellen wurden 24 Stunden auf porösen Membranen kultiviert und in ein
cellZscope überführt. Nach drei Stunden wurde das Medium gegen TiO2- bzw. ZnO-Dispersionen (7,5 μg/cm2) bzw. Medium (Kontrolle) ausgetauscht.
Nach 22 Stunden wurde das Detergens Triton-X-100 zugegeben, um die Zellschichten zu zerstören. TEER ist angegeben in Prozent des Ausgangswertes.
Bild verändert nach www.nanoanalytics.de/de/hardwareprodukte/cellzscope/funktionsweise/kapitel02.
Zelllinien unterschiedlicher Herkunft geprüft
werden, um hinreichend gesicherte Aussagen hinsichtlich ihres toxischen Potenzials
treffen zu können.
Neben den zuvor genannten Zytotoxizitätsmethoden bieten sich Testsysteme an,
die neue toxikologische Endpunkte und
neue Toxizitätsbiomarker erfassen. Hierzu
zählen toxikogenomische Studien, die den
Einfluss von Nanomaterialien auf bestimmte mRNA-Spezies, Proteine oder Metaboliten ermitteln. Da diese Techniken meist
auch auf optischen Nachweisverfahren beruhen, ist eine vorherige Überprüfung auf
Beeinflussung durch Nanomaterialien
unverzichtbar. Elektrochemische Nachweisverfahren wie beispielsweise die Impedanz-Spektroskopie scheinen hingegen sehr
geeignet zur Bestimmung der Toxizität von
Nanomaterialien, da das Messprinzip eine
Interferenz mit dem Testsystem nahezu ausschließt. Mit dieser Methode kann die Auflösung von Zell-Zell-Kontakten als Parameter der Viabilität nicht-invasiv und mit hoher
zeitlicher Auflösung quantitativ registriert
werden (Abb. 2A). Dazu werden epitheliale
oder endotheliale Zellen auf einer porösen
Membran bis zur Konfluenz kultiviert und
zwischen zwei Elektroden positioniert, die
über das Kulturmedium leitend miteinander verbunden sind. Als Messgröße dient
der elektrische Wechselstromwiderstand
(Impedanz), der dichte Zellverband wirkt
dabei als Isolatorschicht. Wir haben elektrochemische Impedanzmessungen eingesetzt,
um den Einfluss von Metalloxid-Nanopartikeln auf Nierenepithelzellen zu untersuchen
(Abb. 2B). Dabei scheint ZnO im Gegensatz
zu TiO2 einen Einfluss auf die Integrität der
epithelialen Barriere zu haben. Vergleichbare Ergebnisse konnten auch durch andere in vitro-Toxizitätsstudien bestätigt werden [2] und belegen daher die Eignung dieses Testsystems für zukünftige Toxizitätsbestimmungen von Nanomaterialien im
Standardverfahren.
Ausblick
Zuverlässige und evaluierte in vitro-Testsysteme sind notwendig, um die Toxizität der
großen Anzahl verschiedener Nanomaterialien zu erfassen. Gegenwärtig muss jeder Test
für jedes Material anhand der beschriebenen
Strategie standardisiert werden. Messmethoden, die von den spezifischen Eigenschaften
der Nanomaterialien nicht beeinflusst werden, können diesen Prozess vereinfachen. Die
Aufklärung des Einflusses von Materialeigenschaften auf die biologische Wirkung sollte es künftig ermöglichen, kritische Parameter, die zu hoher Toxizität führen, zu identifizieren. So können Nanomaterialien zukünftig klassifiziert und zeitaufwendige Einzeluntersuchungen vermieden werden.
Derzeit sind in vivo-Studien zur toxikologischen Bewertung unverzichtbar. Mittels standardisierter in vitro-Testverfahren könnte vorab eine Auswahl von Nanomaterialien mit
toxischem Potenzial erfolgen, um die Anzahl
notwendiger in vivo-Studien zu reduzieren.
Danksagung
Diese Arbeit wurde mit Mitteln des BMBF
(NanoCare, Cell@Nano), der EU (FP6 STREP
LOCCANDIA) und des Landes NRW (NanoPaCT) gefördert.
ó
Literatur
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nanoscale titania structure with toxicity: a cytotoxicity and
inflammatory response study with human dermal fibroblasts
and human lung epithelial cells. Toxicol Sciences 92:174–185
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Frankfurt a. M., Dechema e. V.
[3] Lundqvist M, Stigler J, Elia G et al. (2008) Nanoparticle
size and surface properties determine the protein corona with
possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad
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they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Lett 6:1261–1268
[5] Kroll A, Pillukat MH, Hahn D et al. (2009) Current in vitro
methods in nanoparticle risk assessment: limitations and
challenges. Eur J Pharm Biopharm 72:370–377
[6] Schulze C, Kroll A, Lehr C-M et al. (2008) Not ready to use
– overcoming pitfalls when dispersing nanoparticles in
physiological media. Nanotoxicology 2:51–61
Korrespondenzadresse:
1
2
Dr. Alexandra Kroll1
Dr. Daniela Hahn2
Dr. Jürgen Schnekenburger3
Medizinische Klinik und
Poliklinik B
Westfälische WilhelmsUniversität
Domagkstraße 3A
D-48149 Münster
Tel.: 0251-83-52534
Fax: 0251-83-57938
[email protected]
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