Vergleich eines Stammzellmarkerprofils in einem Panel

Vergleich eines Stammzellmarkerprofils in einem Panel
ausgewählter Kolontumorzelllinien in vitro
und den korrespondierenden Xenografts in vivo
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der
Medizinischen Fakultät der
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2009
von
MEIKE SCHNEIDER
geboren in Freiburg i. Br.
Dekan:
Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. H.H. Fiebig
2. Gutachterin:
Prof. Dr. M. Engelhardt
Jahr der Promotion: 2009
Inhaltsverzeichnis
I.
1
Inhaltsverzeichnis
EINLEITUNG ............................................................................................................................... 8
1.1
EPIDEMIOLOGIE UND INZIDENZ VON KREBSERKRANKUNGEN .................................................... 8
1.2
DAS KOLOREKTALE KARZINOM .............................................................................................. 9
1.2.1
Epidemiologie .............................................................................................................. 9
1.2.2
Risikofaktoren............................................................................................................ 10
1.2.3
Histologie des Dickdarms und dessen Selbsterneuerungsprozess .......................... 10
1.2.4
Pathogenese des kolorektalen Karzinoms ................................................................ 13
1.2.5
Prognose des Kolorektalen Karzinoms ..................................................................... 16
1.3
2
DIE ANTIGENE ..................................................................................................................... 17
1.3.1
Die Bedeutung von Membranproteinen bei der eukaryontischen Zelle .................... 17
1.3.2
CD133 (AC133) ......................................................................................................... 18
1.3.3
CD44 ......................................................................................................................... 21
1.3.4
CD24 ......................................................................................................................... 24
1.3.5
CDCP1 (CUB domain containing protein 1, CD318)................................................. 25
1.3.6
CXCR4 ...................................................................................................................... 28
DIE STAMMZELLTHEORIE ..................................................................................................... 31
2.1
ALLGEMEINER TEIL.............................................................................................................. 31
2.2
SPEZIELLER TEIL ................................................................................................................. 36
2.2.1
Stammzellen bei soliden Tumoren ............................................................................ 36
2.2.2
Stammzellen beim Kolorektalen Karzinom ............................................................... 40
2.3
ZIELGERICHTETE KREBSTHERAPIE ....................................................................................... 43
3
FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT .......................... 45
4
MATERIAL UND METHODEN.................................................................................................. 47
4.1
M ATERIAL ........................................................................................................................... 47
4.1.1
Material für die Zellkultur der humanen Kolontumorzelllinien ................................... 47
4.1.2
Material für den Tumor Colony Assay ....................................................................... 47
4.1.3
Die Antikörper für die Durchflusszytometrie .............................................................. 48
4.2
DIE ZELLKULTUR ................................................................................................................. 48
4.3
DIE KOLONTUMORZELLLINIEN .............................................................................................. 49
4.4
DIE XENOGRAFTSAMMLUNG ................................................................................................. 50
4.5
DIE UNTERSUCHTEN XENOGRAFTS ....................................................................................... 52
4.6
DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE ............................................................................................. 52
4.6.1
Die Vorbereitung der Tumorzelllinien für die Messung im Durchflusszytometer ...... 55
4.6.2
Tumoraufbereitung nach dem Tumor Colony Assay................................................. 57
4.6.3
Inkubation von Tumorzelllinien mit dem Enzymcocktail des TCA-Verdaus .............. 58
Dissertation Meike Schneider
I
Inhaltsverzeichnis
5
4.6.4
Inkubation der Tumorzellen mit dem Antikörpercocktail ........................................... 58
4.6.5
Die Auswertung der im Zytometer erhobenen Daten................................................ 59
4.6.6
Analyse der Xenograftzellen auf Doppelt-/Dreifachpositivität ................................... 60
4.7
STATISTISCHE AUSWERTUNG ............................................................................................... 61
4.8
GENEXPRESSIONSANALYSE MIT AFFYMETRIX GENCHIPS® .................................................... 62
4.9
WACHSTUMSSTUDIEN .......................................................................................................... 63
4.9.1
Sortierung der Zelllinie SW620 auf CD133 ............................................................... 63
4.9.2
Statistische Auswertung der Wachstumsstudie ........................................................ 64
ERGEBNISSE ........................................................................................................................... 66
5.1
DIE EXPRESSION DER ANTIGENE BEI DEN KOLONTUMORZELLLINIEN ...................................... 66
5.1.1
CD133 ....................................................................................................................... 66
5.1.2
CD44 ......................................................................................................................... 67
5.1.3
CD24 ......................................................................................................................... 67
5.1.4
CDCP1 ...................................................................................................................... 68
5.1.5
CXCR4 ...................................................................................................................... 69
5.1.6
Statistische Korrelation der Antigene bei den ZL ..................................................... 70
5.2
ERGEBNIS DER INKUBATION DER TUMORZELLLINIEN MIT DEM ENZYMCOCKTAIL DES TCA-
VERDAUS ........................................................................................................................................ 70
5.3
DIE EXPRESSION DER ANTIGENE BEI DEN XENOGRAFTS ........................................................ 71
5.3.1
Direkt patiententumorbasierte Xenografts................................................................. 72
5.3.2
Vergleich der Antigenexpression bei der Kolontumorzelllinie und dem
korrespondierenden Xenograft.................................................................................................. 73
5.3.3
Vergleich der Antigenexpression bei der CCL 269L , dem Zelllinien- sowie dem
direkt vom Patiententumor abgeleiteten Xenograft ................................................................... 79
6
7
5.3.4
Statistische Korrelation der Antigene bei den Xenografts......................................... 79
5.3.5
Analyse von doppelt und dreifach positiven Zellen bei den Xenografts.................... 80
5.4
GENEXPRESSIONSANALYSE MIT AFFYMETRIX GENCHIPS ®.................................................... 84
5.5
SORTIERUNG DER CCL SW620 AUF CD133 ........................................................................ 86
5.5.1
Ergebnis der Wachstumsstudie: SW620................................................................... 86
5.5.2
Statistische Auswertung der Wachstumsstudie: SW620 .......................................... 88
5.5.3
Expression der Antigene bei den Xenografts aus der Wachstumsstudie ................. 88
DISKUSSION ............................................................................................................................ 92
6.1
UMSETZUNG DER FRAGESTELLUNG ...................................................................................... 92
6.2
EVALUATION DER VERSUCHSERGEBNISSE ............................................................................ 93
6.3
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE ...................................................................................... 94
6.4
KLINISCHER AUSBLICK ........................................................................................................ 99
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ......................................................................... 103
Dissertation Meike Schneider
II
Abbildungsverzeichnis
II.
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Verlauf der Mortalitätsraten unterschiedlicher Krankheiten
8
Abbildung 2: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen
Krebsneuerkrankungen
9
Abbildung 3: Histologie der Kolonschleimhaut
11
Abbildung 4: Wnt-Signalweg
12
Abbildung 5: Bottom-up/Top-down-Modell
14
Abbildung 6: Ausbreitung eines Kolorektalen Karzinoms mit Hilfe der
Kryptenteilung
15
Abbildung 7: Histologische Pathogenese des KRK nach B. Vogelstein (1988)
16
Abbildung 8: Membranprotein CD133 (AC133)
18
Abbildung 9: Struktur des CD44
21
Abbildung 10: CD24 IHC des Kolonepithels beim KRK
24
Abbildung 11: Struktur des CDCP1
26
Abbildung 12: Vergleich von CDCP1, EpCAM und CEA
27
Abbildung 13: Der Chemokinrezeptor CXCR4 mit seinem Liganden SDF-1
30
Abbildung 14: Normale Hämatopoese
31
Abbildung 15: Modelle der Tumorigenese
32
Abbildung 16: Der Wnt-/β-Catenin-Signalweg
34
Abbildung 17: Vergleich der Stammzelltherapie mit einem Baum
35
Abbildung 18: Mammaspheres
37
Abbildung 19: CD133 und GFAP Anfärbung beim Glioblastom
38
Abbildung 20: Ausdifferenzierung von CD133+ HCC-Zellen
39
Abbildung 21: Histologie des KRK und dazugehöriger Xenografts
41
Abbildung 22: Funktionelle Isolierung von Kolontumorstammzellen
42
Abbildung 23: HCT116 Zellen und HT29 Zellen
50
Abbildung 24: Die Xenograftsammlung
51
Abbildung 25: Funktionsprinzip hydrodynamische Fokussierung
53
Abbildung 26: Funktion eines Zytometers
54
Abbildung 27: Detektion der einzelnen Fluoreszenzfarben
55
Abbildung 28: Hämozytometer
56
Abbildung 29: Propidiumiodidfärbung von SW620 Zellen
59
Abbildung 30: Isotypfärbung von SW620 Zellen
60
Abbildung 31: CD133 Färbung von SW620 Zellen
60
Abbildung 32: SW620 Zellen
63
Abbildung 33: Sortierung der SW620 Zellen
64
Dissertation Meike Schneider
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 34: Mittlere Expression von CD133 auf 15 Kolontumorzelllinien
66
Abbildung 35: Mittlere Expression von CD44 auf 15 Kolontumorzelllinien
67
Abbildung 36: Mittlere Expression von CD24 auf 15 Kolontumorzelllinien
68
Abbildung 37: Mittlere Expression von CDCP1 auf 15 Kolontumorzelllinien
69
Abbildung 38: Mittlere Expression von CXCR4 auf 15 Kolontumorzelllinien
69
Abbildung 39: Korrelationskoeffizient nach Spearman bei den Zelllinien
70
Abbildung 40: Mittlere Antigenexpression bei direkt vom Patiententumor
abgeleiteten Xenografts
73
Abbildung 41: Vergleich CCL 94L und CXF 94LX
74
Abbildung 42: Vergleich CCL HT29 und CXF HT29LX
74
Abbildung 43: Vergleich CCL SW480 und CXF SW480LX
74
Abbildung 44: Vergleich CCL DLD1 und CXF DLD1LX
75
Abbildung 45: Vergleich CCL A293 und CXF A293LX
75
Abbildung 46: Vergleich CCL HCT15 und CXF HCT15LX
76
Abbildung 47: Vergleich CCL LOVO und CXF LOVO LX
76
Abbildung 48: Vergleich CCL KM20LZ und CXF KM20LZLX
77
Abbildung 49: Vergleich CCL KM12 und CXF KM12LX
77
Abbildung 50: Vergleich CCL LS174T und CXF LS174TLX
78
Abbildung 51: Vergleich CCL 269L, CXF 269LX und CXF 269 20N11
79
Abbildung 52: Statistische Korrelation der Antigene bei den Xenografts
80
Abbildung 53: Mehrfach positive Zellen im CXF1103 6N1
80
Abbildung 54: Mehrfach positive Zellen bei CXF94L
81
Abbildung 55: Mehrfach positive Zellen bei CXF 269 20N11
81
Abbildung 56: Mehrfach positive Zellen bei CXF HT29LX
82
Abbildung 57: Mehrfach positive Zellen bei CXF 243 17N12
82
Abbildung 58: Mehrfach positive Zellen bei CXF KM20LX
82
Abbildung 59: Mehrfach positive Zellen bei CXF280 16N8
83
Abbildung 60: Mehrfach positive Zellen bei CXF DLD1LX
83
Abbildung 61: Mehrfach positive Zellen bei CXF LOVO LX
83
Abbildung 62: Mehrfach positive Zellen im CXF KM12 LX
84
Abbildung 63: Wachstum unsortierter SW620 Zellen
86
Abbildung 64: Wachstum CD133 negativer Zellen
87
Abbildung 65: Wachstum CD133 positiver Zellen
87
Abbildung 66: Übersicht: Wachstumsverhalten verschiedener SW620Zellpopulationen
88
Abbildung 67: Einfach positive Zellen im Xenograft aus unsortierten SW620 Zellen89
Dissertation Meike Schneider
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 68: Doppelt positive Zellen im Xenograft aus unsortierten SW620 Zellen
89
Abbildung 69: Einfach positive Zellen in Xenografts aus CD133+ SW620 Zellen
90
Abbildung 70: Doppelt positive Zellen in Xenografts aus CD133+ SW620 Zellen
90
Abbildung 71: Einfach positive Zellen bei Xenografts aus CD133- SW620 Zellen
91
Abbildung 72: Doppelt positive Zellen bei Xenografts aus CD133- SW620 Zellen
91
Dissertation Meike Schneider
V
Tabellenverzeichnis
III.
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Expression von CD133 bei soliden Tumoren
20
Tabelle 2: Stammzellmarker bei verschiedenen Neoplasien
40
Tabelle 3: Verwendete Antikörper bei der Durchflusszytometrie
48
Tabelle 4: Verlauf der CD133-Expression bei Huh7 Zellen in der Kurzzeitkultur
49
Tabelle 5: Charakterisierung der Kolontumorzelllinien
49
Tabelle 6: Untersuchte Xenografts
52
Tabelle 7: Verwendete Farbstoffe im FACS-Gerät
55
Tabelle 8: Endkonzentration im Enzymcocktail bei Mischung aller 4 Enzyme
57
Tabelle 9: Verwendeter Antikörpercocktail
58
Tabelle 10: Inkubation der ZL mit Zellkulturmedium und den Enzymen des TCA
Verdaus
71
Tabelle 11: Korrelation zwischen CD44 bzw. CD24 und CD133
85
Tabelle 12: Korrelation zwischen CD44 und CD24
85
Tabelle 13: Korrelation zwischen CD44 und CDCP1
85
Dissertation Meike Schneider
VI
Abkürzungsverzeichnis
IV.
Abkürzungsverzeichnis
Wichtige Abkürzungen:
AML
Akute myeloische Leukämie
CA
Karzinom
CCL
Kolontumorzelllinie
CML
Chronische myeloische Leukämie
CXF
Xenograft eines humanen Kolontumors
DNA
Desoxiribonukleinsäure
ESA
Epitheliales spezifisches Antigen
FAP
Familiäre adenomatöse Polyposis
HNPCC
Hereditäres Nicht-Polypöses Kolonkarzinom
HSZ
Hämatopoetische Stammzellen
IHC
Immunhistochemie
KDa
kilo-Dalton
KRK
Kolorektales Karzinom
mRNA
messenger (Boten-) Ribonukleinsäure
PI
Propidiumiodid
RNA
Ribonukleinsäure
RPM
Rounds per minute, Umdrehungen pro Minute
SCID
Severe Combined Immunodeficiency Disorder
Schwerer kombinierter Immundefekt
TAC
Transit amplifying cell, Vorläuferzelle
TNM
Tumor, Nodes (Lymphknoten), Metastasen
ZL
Zelllinie
Dissertation Meike Schneider
VII
Einleitung
1
1.1
Einleitung
Epidemiologie und Inzidenz von Krebserkrankungen
Krebserkrankungen spielen in unserer Gesellschaft eine herausragende Rolle. Nach den
Krankheiten des Kreislaufsystems sind die bösartigen Neubildungen die zweithäufigste
Todesursache für beide Geschlechter in Deutschland.
Eine Übersicht über den Trendverlauf der Mortalitätsraten unterschiedlicher Krankheitsgruppen in Deutschland gibt Abbildung 1 (aus {68} ). {68} {41}
Abbildung 1: Verlauf der Mortalitätsraten unterschiedlicher Krankheiten
Während sich die Sterblichkeit an Herz-/Kreislauferkrankungen in den letzten 50 Jahren
deutlich verringert hat, ist diese bei den Krebserkrankungen nur leicht zurückgegangen.
Die Zahl der jährlich auftretenden Neuerkrankungen an Krebs wird in Deutschland auf ca.
230.500 Erkrankungen bei Männern und auf ungefähr 206.000 bei Frauen geschätzt. {68}
Dissertation Meike Schneider
8
Einleitung
Es bleibt also für die Forschung eine essentielle Aufgabe, die Tumorpathogenese noch
besser zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln, mit denen die Mortalität bei
Krebserkrankungen gesenkt werden kann.
1.2
Das Kolorektale Karzinom
1.2.1
Epidemiologie
Das Kolorektale Karzinom (KRK) ist bei Frauen und Männern die zweithäufigste Krebserkrankung und auch die zweithäufigste Krebstodesursache (siehe Abbildung 2, aus {68}).
Beim Mann liegt die Inzidenz für das Prostata-, bei der Frau für das Mammakarzinom am
höchsten.
Die Inzidenz des KRK variiert in Europa und ist in Deutschland bei >40/100 000 Einwohner/Jahr am höchsten. Sie ist nach einem seit 1980 zunehmenden Trend in den letzten
zehn Jahren auf unterschiedlichem Niveau nahezu unverändert.
Abbildung 2: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen
Krebsneuerkrankungen
Das KRK tritt in >90% der Fälle nach dem 50. Lebensjahr auf: Männer erkranken im Mittel
mit 69, Frauen mit 75 Jahren. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen in Deutschland
wird für Männer auf über 37 000 und für Frauen auf etwa 36 000 geschätzt. Das Karzinomrisiko in der Normalbevölkerung, d.h. bei einem über 40jährigen ohne Risikofaktoren beträgt 6% und in 2-5% der Fälle tritt das KRK an mehreren Stellen im Darm gleichzeitig auf.
Dissertation Meike Schneider
9
Einleitung
Im Gegensatz zur Entwicklung der Inzidenz nehmen die Sterberaten an Darmkrebs für
beide Geschlechter stetig ab, so dass die kumulierten relativen 5-Jahres-Überlebensraten
für Männer und Frauen inzwischen bei 60% liegen. {68} {36}
1.2.2
Risikofaktoren
Als Risikofaktoren für die Erkrankung des kolorektalen Karzinoms sind diverse ernährungsbedingte Faktoren beschrieben. Dazu zählen ballaststoffarme und fettreiche Nahrung, ein hoher Anteil an rotem (eisenhaltigem) Fleisch, ein geringer Anteil an Gemüse
und regelmäßiger Alkoholkonsum: sie erhöhen das Risiko, an Darmkrebs zu erkranken
ebenso wie Übergewicht und Bewegungsmangel.
Verwandte ersten Grades von Patienten mit kolorektalem Karzinom erkranken überdurchschnittlich häufig an derselben Krankheit. Ob dies genetisch bedingt ist oder an einer ähnlichen Lebensstilführung liegt, ist bisher noch nicht eindeutig geklärt. {68}
Bei jedem zehnten Darmkrebspatienten spielen genetische Faktoren eine Rolle. Die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) gilt als obligate Präkanzerose, beim hereditären nichtpolypösen Kolonkarzinom (HNPCC) besteht zusätzlich ein erhöhtes Risiko für extrakolonische Neoplasien wie z.B. dem Endometrium- oder Magenkarzinom. Dem HNPCC liegen
Mutationen verschiedener DNA-Missmatchreparaturgene zugrunde, die zu einer fehlerhaften DNA-Replikation und Mutationen führen. Diese begünstigen dann das Auftreten von
Neoplasien, insbesondere im proximalen Kolon.
Das kolorektale Adenom steht am Anfang der Adenom-Karzinomsequenz (siehe auch
1.2.4) und „bahnt“ somit die Entstehung des KRK. Auch chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und andere Karzinome in der Anamnese erhöhen das Risiko, am KRK zu erkranken. {36}
1.2.3
Histologie des Dickdarms und dessen Selbsterneuerungsprozess
Alle Vertebraten und fast alle Invertebraten besitzen einen Darm als Verdauungstrakt, der
mit Zellen ausgekleidet ist und auf die Verdauung von Nahrung und Aufnahme der durch
die Verdauung freigesetzten Nahrungsmoleküle spezialisiert ist. Die Mukosa des Dünnund Dickdarms besitzt ein einschichtiges Zylinderepithel, das mit einer Umlaufzeit von weniger als einer Woche erneuert und durch frisch gebildete Zellen ersetzt wird. Damit erneuert sich die Darmschleimhaut schneller als jedes andere Gewebe des menschlichen
Körpers. Dieser enorm hohe Zellumsatz wird durch gewebeeigene Stammzellen reguliert.
Das absorptive Epithel des Dünndarms besteht aus Zotten und Krypten, wobei sich die
Stamm- und Vorläuferzellen in den Krypten befinden. Aus der Darmstammzelle entstehen
vier verschiedene ausdifferenzierte Zellen des Darms: zum einen die Panethschen Kör-
Dissertation Meike Schneider
10
Einleitung
nerzellen, die in den Krypten sitzen bleiben und Teil des angeborenen Immunsystems
sind. Zum anderen gibt es die absorptiven Enterozyten mit ihrem Bürstensaum, die
schleimbildenden Becherzellen sowie die enteroendokrinen Zellen. Diese drei Zelltypen
besetzen nach Ausdifferenzierung die Zotten des Dünndarms.
Der Dickdarm weist im Vergleich zum Dünndarm anstelle der Zotten ein flaches Epithel
auf. Die unteren zwei Drittel der Krypten sind mit Stamm- und Vorläuferzellen sowie wenigen Paneth-Zellen besetzt, während sich im oberen Drittel und auf der Oberfläche die
ausdifferenzierten Zellen befinden (siehe Abbildung 3, aus {64} ).
Abbildung 3: Histologie der Kolonschleimhaut
Am Boden jeder Dickdarmkrypte befinden sich schätzungsweise ein bis sechs Stammzellen, aus denen in kurzer Zeit nicht nur viele Vorläuferzellen (sog. transit amplifying cells)
für Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrine Zellen entstehen, sondern auch neue
Darmstammzellen. Durch diese asymmetrische Teilung der Stammzelle wird die Persistenz derjenigen Zelle sichergestellt, die lebenslang alle erforderlichen spezialisierten
Zelltypen des Darms bilden kann. Während der Reifung der Kolonozyten findet ein Migrationsprozess vom Boden der Krypte aus statt, bei dem die Zellen in Richtung Oberfläche
wandern. Auf diesem Weg verlieren die Zellen ihr proliferatives Potential.
Dieser beschriebene Prozess der ständigen Erneuerung der Darmschleimhaut muss natürlich genau reguliert und gesteuert werden.
Dissertation Meike Schneider
11
Einleitung
Aktuelle Literatur beschreibt den Wnt-Signalweg als wichtigste Kontrollkraft dieses Zellumsatzes, deshalb soll er an dieser Stelle erläutert werden.
Wnt-Proteine sind lokal sezernierte Signalmoleküle, die in der Embryogenese vieler Tiere
sowie auch beim Menschen eine wichtige Rolle spielen. Die Aktivierung des klassischen
Wnt-Signalweges führt in Vertebraten zur Induktion und Ausrichtung der Körperachse und
steuert die Organogenese.
Im menschlichen Genom sind knapp 20 verschiedene Wnt-Proteine bekannt, die jeweils
an einen Rezeptorkomplex binden, der aus einem Frizzled- und einem Lrp5/6-Rezeptor
besteht. Durch Bindung des Wnt-Proteins wird die Signalkaskade gestartet. (siehe
Abbildung 4, aus {67} ). Das intrazelluläre Schlüsselprotein ist ß-Catenin, das sowohl bei
der Zell/Zell-Adhäsion zusammen mit Cadherinen eine Funktion ausübt, als auch als latentes Genregulatorprotein arbeitet. In Abwesenheit des Wnt-Liganden bildet das β-Catenin
zusammen mit APC und Axin einen „Destruktionskomplex“, der von einer Kinase (GSK3β)
phosphoryliert und dadurch dem Proteasom zugeführt wird. Binden aber Wnt-Liganden,
wird ß-Catenin vermindert phosphoryliert und daraufhin dessen Abbau verhindert. Das ßCatenin akkumuliert daraufhin im Zytoplasma und wandert in den Zellkern, wo es mit DNAbindenden Proteinen der Tcf/Lef-Familie einen Komplex bildet. Dadurch verwandeln sich
diese Repressoren in Transkriptionsfaktoren und bestimmte Zielgene werden exprimiert
wie z.B. c-myc und cyclin-D1, die Entwicklung und Proliferation fördern. Noch einmal zusammengefasst bedeutet also die Akkumulation von ß-Catenin unter anderem eine erhöhte Proliferationsfähigkeit für die entsprechende Zelle.
Abbildung 4: Wnt-Signalweg
Um im gesunden erwachsenen Körper den Zellumsatz und die Homöostase in den einzelnen Geweben zu gewährleisten, wirken ähnliche, wenn nicht sogar dieselben Signalübertragungswege wie in der Embryonalentwicklung.
Dissertation Meike Schneider
12
Einleitung
So spielt der Wnt-Signalweg auch eine entscheidende Rolle als Regulator von Stammzellen beim erwachsenen Organismus. Er ist vor allem wichtig bei der Erneuerung der Haut
und den hämatopoetischen Zellen, ist aber auch essentiell bei der intestinalen Schleimhauterneuerung. {64} {8}
1.2.4
Pathogenese des kolorektalen Karzinoms
Krebs ist eine genetische Krankheit, die aufgrund von Mutationen in somatischen Zellen
entsteht. Bis heute wurden mehr als 100 Gene gefunden, die bei der Entstehung eines
Krebsgeschwulstes eine Rolle spielen können. Man nennt sie krebskritische Gene und teilt
sie in zwei Klassen ein. Auf der einen Seite gibt es die Proto-Onkogene, bei denen es
durch Mutation in einem der beiden Genallele zu einer erhöhten Aktivität des Genprodukts
kommt, was dann zu einem erhöhten Proliferationsverhalten führt. Aus einem ProtoOnkogen ist dadurch ein Onkogen geworden. Das wohl bekannteste in dieser Klasse ist
das ras-Onkogen. Ras ist ein zentrales Glied verschiedener Signaltransduktionswege, die
Wachstums- und Differenzierungsprozesse regulieren. Schon eine einzelne Punktmutation
kann zu einem permanent aktiven ras-Protein führen und es kommt zu einem andauernd
aktiven wachstumsstimulierenden Signal in der Zelle. Auch das in Abschnitt 1.2.3 beschriebene ß-Catenin gehört in die Gruppe der Proto-Onkogene.
Bei der zweiten Klasse der krebskritischen Gene handelt es sich um Tumorsuppressorgene. Hier kommt es durch Mutationen beider Allele zu einem Funktionsverlust des entsprechenden Gens. Es ist dann zu wenig Genprodukt vorhanden, was dann zur Entstehung
des Tumors führt. Als Beispiel sei hier das Retinoblastomaprotein erwähnt, das als „Bremse“ im Zellzyklus fungiert. Sein Verlust kann dazu führen, dass Zellen zum falschen Zeitpunkt und zu schnell in den Zellteilungszyklus eintreten. Zwei weitere wichtige Tumorsuppressorgene sind das p53- sowie das Adenomatöse Polyposis Coli-(APC-)-Gen.
Das p53-Gen ist etwa bei der Hälfte der Tumorerkrankungen des Menschen mutiert und
an drei grundlegenden Mechanismen beteiligt, den Organismus gegen zelluläre Schäden
und Störungen zu schützen: an der Zellzykluskontrolle, der Erhaltung der genetischen
Stabilität und nicht zuletzt an der Apoptose.
Das APC-Protein hat die physiologische Funktion, als Hemmstoff des Wnt-Signalweges zu
fungieren (s.o.). Es bildet mit ß-Catenin einen Komplex, der über einen Phosphorylierungsschritt zu einem beschleunigten Abbau des ß-Catenin führt. Sind beide APC-Allele
mutiert, gibt es kein funktionsfähiges APC-Protein. Daraufhin wird ß-Catenin nicht abgebaut und induziert im Zellkern die Proliferation des entsprechenden Dickdarmepithels. Bei
Patienten mit erblicher familiärer adenomatöser Polyposis liegt angeboren schon ein mutiertes Allel vor, das andere mutiert sehr oft somatisch. {8}
Dissertation Meike Schneider
13
Einleitung
Die Zellen im Gastrointestinaltrakt gehören zu den sich am schnellsten teilenden Zellen
des menschlichen Körpers. Der schnelle Zellumsatz bedeutet, dass differenzierte Zellen in
das Lumen abgestoßen werden und alle paar Tage ersetzt werden. Sie haben deshalb
keine ausreichende Lebenszeit, um multiple genetische Defekte zu sammeln, die für die
maligne Transformation notwendig sind. Aus diesem Grund wird die Stammzelle im
Gastrointestinaltrakt schon seit längerem als Ziel der karzinogenen Mutationen betrachtet,
denn sie hat eine deutlich längere Lebenszeit und kann eine Vielzahl an Mutationen erwerben. Außerdem ist in diesen Zellen der Selbsterneuerungsprozess schon „Tagesgeschäft“, so dass vermutlich weniger Mutationen notwendig sind, um aus einer normalen
Stammzelle eine Krebsstammzelle zu generieren. Wenn sich die Stammzelle teilt, reproduziert sie sich selbst und bildet aber durch asymmetrische Teilung gleichzeitig eine TAC
(Transit amplifying cell), aus der dann die ausdifferenzierten Zellen entstehen. Durch Mutationen der krebskritischen Gene teilt sich die Stammzelle häufiger, was dann automatisch auch zu einer gesteigerten Anzahl an Stammzellen führt. Eine Stammzelle kann
durch entsprechende Mutationen klonale Dominanz gewinnen und bildet dann ein Adenom, dessen Bildung nach zwei verschiedenen Modellen beschrieben wird: dem Bottomup sowie alternativ dem Top-down-Modell (s. Abbildung 5, aus {67}).
Abbildung 5: Bottom-up/Top-down-Modell
Das Top-down-Modell basiert auf der Beobachtung, dass sich in frühen neoplastischen
Läsionen die dysplastischen Zellen an der Oberfläche der Krypten genetisch von denen
Dissertation Meike Schneider
14
Einleitung
am Boden der Krypten unterscheiden. Die dysplastischen Zellen haben eine erhöhte Proliferationsfähigkeit und zeigen nukleäres β-Catenin. Es zeigte sich kein Unterschied zwischen den Zellen am Boden der Krypte und Schleimhautzellen des gesunden Kolonepithels. Nach dem Top-down-Modell befindet sich also das Stammzellkompartiment im
Darm entweder interkryptal, oder eine mutierte Zelle wandert zunächst aus der Krypte
heraus an die Oberfläche, bevor sie mutiert und expandiert.
Beim Bottom-up-Modell findet der maligne Transformationsprozess in der Stammzellpopulation im Kryptengrund statt. Von da aus bevölkert die mutierte Zelle die ganze Krypte und
erreicht auch die Spitze und den interkryptalen Bereich. Diese Vermutung beruht auf der
Beobachtung, dass zum Beispiel bei Patienten mit FAP zunächst eine ganze Krypte mit
dysplastischen Zellen besiedelt wird. Die weitere Ausbreitung des malignen Prozesses
erfolgt durch Teilung der Krypte. {9} Die Ausbreitung des Karzinoms mit Hilfe der Krypenteilung ist in Abbildung 6 (aus {63}) dargestellt.
Abbildung 6: Ausbreitung eines Kolorektalen Karzinoms mit Hilfe der Kryptenteilung
Beide Entstehungsmodelle werden kontrovers diskutiert. Es gibt Indizien dafür, dass ein
KRK zunächst nach dem Bottom-up-Modell entsteht, über Kryptenteilung expandiert und
schließlich später nach dem Top-down-Modell sich in angrenzendes Gewebe ausbreitet.
{63}
Unabhängig dieser Kontroverse wird bei der Entstehung des Kolorektalen Karzinoms davon ausgegangen, dass es über einen längeren Zeitraum von ca. 10 Jahren über die sog.
Adenom-Karzinom-Sequenz entsteht. Diese besagt, dass die überwiegende Zahl der Karzinome über Stufen genetischer Mutationen aus Adenomen hervorgeht (1988). {84} Histologische Untersuchungen von Polypen aus allen Abschnitten des Dickdarms bestätigten
diese Hypopthese {29}. Da sich polypöse Veränderungen bei etwa 30% aller älterer Menschen finden, muss angenommen werden, dass weniger als 1% von diesen maligne entarten. Der Tumor entsteht nach diesem Tumorprogressionsmodell über eine recht lange Zeit
und es werden schrittweise Onkogene aktiviert und Tumorsuppressorgene inaktiviert. Diese maligne Transformation führt letztendlich dazu, dass das anfangs noch kontrollierte
Wachstumsverhalten in ein unkontrolliertes malignes Wachstum übergeht, wobei die
Wahrscheinlichkeit zur malignen Entartung mit der Polypengröße steigt.
Dissertation Meike Schneider
15
Einleitung
Die Entstehung eines Adenokarzinoms nach dem von Vogelstein und Kollegen entwickelten Modell wird symbolisch in Abbildung 7 dargestellt. Es wird gezeigt, dass es eine enge
Korrelation zwischen dem Histologiebefund und der Anzahl akkumulierter Mutationen gibt.
Zusammenfassend lässt sich für die Entstehung des kolorektalen Karzinoms sagen, dass
es über einen langen Zeitraum entsteht. Als Ursprungszelle wird aufgrund ihrer längeren
Lebensdauer die Darmstammzelle vermutet, die im Laufe ihres Lebens eine Vielzahl an
Mutationen erwirbt, die letztendlich zum Karzinom führen. {84} {36}
Normales Epithel
Mutation / Verlust des
APC-Tumorsuppressorgens
Tubuläres Adenom
Mutation/Verlust des
K-RAS-Onkogens und
DCC-Tumorsuppressorgens
Adenom mit
schweren Atypien
Mutation / Verlust des
P53-Suppressor-Gens
Adenokarzinom
Abbildung 7: Histologische Pathogenese des KRK nach B. Vogelstein (1988)
1.2.5
Prognose des Kolorektalen Karzinoms
Die wichtigsten konventionellen Prognosefaktoren für das Überleben des Patienten sind
das histologische Tumorgrading sowie das Staging am Zeitpunkt der Diagnose. Das Grading bezeichnet die Differenziertheit der Tumorzellen und wird beim KRK in Grad G 1-4
eingeteilt. Je höher G, desto weniger differenziert sind die Tumorzellen und desto aggressiver ist der gesamte Tumor. Beim Staging nach der TNM-Klassifikation wird die Eindringtiefe des Tumors in die Schleimhaut bestimmt und der Befall von Lymphknoten und weiteren Organen untersucht. {36} Während Lymphknotenmetastasen der primäre Indikator für
die systemische Ausbreitung der Erkrankung sind, stellen Fernmetastasen den wichtigsten
prognostischen Faktor beim kolorektalen Karzinom dar. {79}
Dissertation Meike Schneider
16
Einleitung
Zusätzlich zu diesen klinisch-pathologischen Merkmalen können auch molekulare Marker
wie z.B. das carcinoembryonale Antigen (CEA) bestimmt werden.
Die Aussagekraft dieser Marker ist aber als beschränkt anzusehen. Sie dienen eher der
Verlaufsbeobachtung. {36} {86}
1.3
1.3.1
Die Antigene
Die Bedeutung von Membranproteinen bei der eukaryontischen Zelle
Die universelle Grundstruktur biologischer Membranen bildet die Lipid-Doppelschicht. In
diese Membran sind unterschiedliche Membranproteine integriert bzw. an diese assoziiert.
Eines der wichtigsten Proteine ist die K+Na+Pumpe, die für die Aufrechterhaltung des
Membranpotentials verantwortlich ist. {8}
Die Einrichtung spezifischer Membrandomänen ist eines der fundamentalen Prinzipien in
der Organisation der eukaryontischen Zelle. Zum einen bieten die Membranproteine die
Basis für die meisten Zellfunktionen, zum anderen sind es gerade sie, die zur Zelldifferenzierung beitragen und die Charakteristik dieser Zellen ausmachen, d.h. zum Beispiel aus
einer Zelle eine Nervenzelle machen.
Speziell Epithelzellen haben zwei ganz unterschiedliche Domänen, die basolaterale und
die apikale Seite. Beide Seiten haben spezifische Funktionen, und so besitzt z.B. die
Darmepithelzelle auf ihrer apikalen Seite Mikrovilli. Dies sind Membranvorsprünge, die die
Oberfläche und damit die resorptive Fläche vergrößern. Die basolaterale Seite dagegen
bildet mit ihren „tight junctions“ eine Diffusionsbarriere, die für das Darmepithel als transportierendes Epithel dringend notwendig ist. {86} {49}
So hat jede spezialisierte Zelle die für sie wichtigen Membrandomänen und Strukturproteine und anhand dieser Merkmale lassen sich unterschiedliche Zellen auch voneinander
abgrenzen. Durch die Beschreibung von Zelloberflächenmarkern auf hämatopoetischen
Zellen konnten Teilpopulationen mit ganz unterschiedlichen Proliferations- und Differenzierungspotentialen unterschieden werden. {8} Als Beispiel sei hier CD34 genannt, dem als
Antigen auf hämatopoetischen Stammzellen funktionelle und therapeutische Bedeutung
zukommt. {14}
Die phänotypische Charakterisierung von Zellen und deren Oberflächenantigenen ist zu
einem wichtigen Mittel geworden, Stammzellen zu beschreiben.
Dissertation Meike Schneider
17
Einleitung
1.3.2
CD133 (AC133)
Das Interesse an diesem Molekül hat in den letzten Jahren stark zugenommen, seit bekannt ist, dass es sich um einen wichtigen Zelloberflächenmarker handelt, mit dessen Hilfe
Stammzellen aus verschiedenen Geweben isoliert werden können.
AC133 wurde erstmals 1997 als Marker auf hämatopoetischen CD34+ Vorläuferzellen des
adulten menschlichen Blutes und Knochenmarkes sowie auf fetalen epithelialen Zellen
der Leber oder der Niere beschrieben. Yin und Kollegen hatten damals einen neuen monoklonalen Antikörper entwickelt, der das Antigen AC133 erkennt. AC133 war das erste
Membranprotein mit 5 Transmembran- (TM) domänen und es hatte keine homologe Ähnlichkeit mit bereits bekannten 4- oder 7-TM-Proteinen.
AC133 hat 5 Transmembrandomänen und ein Molekulargewicht von 120 kDa. Es gibt eine
N-terminale Domäne und zwei große glykolysierte Schleifen extrazellulär sowie zwei kleine
zytoplasmatische Schleifen und das C-terminale Proteinende intrazellulär. (s. Abbildung 8,
aus {30}). {89}
Abbildung 8: Membranprotein CD133 (AC133)
Im selben Jahr entdeckten Weigmann und Kollegen Prominin, das homologe Sequenzanalog bei der Maus. Es wurde insbesondere in apikalen Mikrovilli von murinen neuroepithelialen Zellen gefunden, weshalb es Prominin benannt wurde (latein. prominere). Die Sequenzhomologie selbst und auch die Tatsache, dass Prominin wie auch AC133 auf 36%
der hämatopoetischen Vorläuferzellen vertreten war führte zur Identifikation von Prominin
und AC133 als Familienmitglieder. {54}
Dissertation Meike Schneider
18
Einleitung
Während das AC133 Antigen nur von CD34+ hämatopoetischen Zellen exprimiert wurde,
fand man mRNA von AC133 in vielen unterschiedlichen Geweben, wie z.B. dem Herz, der
Leber und in der Lunge. Es stellte sich letztendlich heraus, dass das AC133 Antigen während des Ausdifferenzierungsprozesses der Zellen glykolysiert und dann nicht mehr von
dem Antikörper erkannt wird. Dies war der Grund, warum AC133 in differenzierten Epithelzellen sehr stark reduziert nachzuweisen war, die mRNA aber in größerem Umfang. Man
benannte die glykolysierte Form des AC133 CD133. Das mRNA-Verteilungsmuster des
CD133 ist dem des Prominin sehr ähnlich.
Sehr wichtig ist folglich, dass CD133 und AC133 nicht synonym zu gebrauchen sind. Die
Expression des AC133 ist auf undifferenzierte Zellen beschränkt, während CD133 die
stärker glykolysierte Form des AC133 ist und auf vielen differenzierten Zellen vorkommt.
{54} Aus diesem Grund ist AC133 ein äußerst vielversprechender Stammzellmarker.
AC133/CD133 (im folgenden vereinfachend CD133 genannt) kommt in Ausstülpungen der
Plasmamembran von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen sowie Epithelzellen
vor. Es sitzt z.B. in Mikrovilli oder Stereozilien des Gangepithels des Epididymidis. Bei dieser spezifischen Lokalisation stellt sich natürlich die Frage der Funktion dieses Antigens.
Diese ist bis heute nicht vollständig geklärt. Aufgrund seiner anatomischen Lokalisation
könnte er bei der Organisation der Plasmamembran beteiligt sein. Interaktionen zwischen
Cholesterol und CD133 könnten für die richtige Lipidzusammensetzung der Membran eine
Rolle spielen. Während der murinen Neuralrohrentwicklung wurden gleichzeitig zur Regression der Mikrovilli kleine CD133 tragende Membranpartikel im Liquor nachgewiesen.
Die Mikrovilli entwickelten sich zu großen pleomorphen Protuberanzen. Diese Beobachtung spricht für die potenzielle Funktion des CD133, einen Stammzellphänotyp aufrechtzuerhalten. Nach der Freisetzung von CD133 wird aus der Stammzelle eine differenzierte
Zelle. {51}
Vorläuferzellen aus dem Knochenmark machen ungefähr 1% der Zellen des normalen
Knochenmarkes und 0,5% der peripheren Blutzellen aus und haben viele Oberflächenmarker mit den ausdifferenzierten Zellen gemeinsam. Hämatopoetische Stammzellen
exprimieren CD34, mit dessen Hilfe sie von den übrigen Blutzellen separiert werden können. Typischerweise waren 20-60% der CD34+ Zellen aus dem Knochenmark, aber auch
aus dem peripheren Blut, der fetalen Leber und dem Nabelschnurblut gleichzeitig positiv
für CD133. Umgekehrt betrachtet war die Expression von CD133 in diesen Geweben auf
CD34+ Zellen beschränkt. {89}
Die Vorstellung, CD133+ Zellen könnten vielleicht nicht nur Stammzellen des Blutes beschreiben, ist sehr attraktiv. Es gibt erste Hinweise, dass CD133+ Zellen in verschiedene
nicht-hämatopoetische Gewebe einwandern, dort differenzen und die Geweberegeneration
Dissertation Meike Schneider
19
Einleitung
fördern. Dies ist eine spannende gedankliche Vorstellung, denn diese CD133-Zelltherapie
könnte eine erfolgversprechende Behandlung für Erkrankungen darstellen.
Humane CD133+ periphere Blutzellen können sich in vitro in Muskelzellen differenzieren
und tragen zur Muskelregeneration bei M. Duchenne bei. {81} Eine CD133+ Population
wurde aus der adulten Niere isoliert, diese konnte sich sowohl in Epithel- wie auch endotheliale Zellen differenzieren und somit durch ihren Stammzellcharakter Nierenerkrankungen verbessern {54}. Ein weiteres sehr anschauliches Beispiel ist die Transplantation von
CD133+ Knochenmarkzellen bei Patienten mit Hepatozellulärem Karzinom. Diese wurden
mit einer Portalvenenembolisation behandelt, um die Blutversorgung des Karzinoms zu
unterbinden. Die Hypertrophie des kontralateralen Leberlappens war durch die Knochenmarktransplantation um mindestens zweieinhalb mal so groß wie bei der unbehandelten
Kontrollgruppe {10}
CD133 gilt nicht nur als physiologisch vorkommender Stammzellmarker, sondern auch als
Krebsstammzellmarker. Er wird auf Tumorzelllinien wie z.B. auf der Teratokarzinomzelllinie NT-2 oder der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 beschrieben, konnte aber auch bei einigen soliden Tumoren gefunden werden. Eine Übersicht über in der Literatur beschriebene
solide Tumoren, die CD133 exprimieren, gibt Tabelle 1. {54} (siehe auch Abschnitt 2.2.)
Tabelle 1: Expression von CD133 bei soliden Tumoren
Phänotyp
Humaner Tumor
CD133, CD44, α1β1
Prostatakarzinom
CD133
Kolorektales Karzinom
CD133
Nierenzellkarzinom
CD133, ABCG2
Pankreasadenokarzinom
CD133
Hepatozelluläres Karzinom
CD133, Nestin
ZNS-Tumoren
Wie in Kapitel 1.2.3 beschrieben dient der Wnt-Signalweg der Aufrechterhaltung einer Balance zwischen Proliferation und Differenzierung und die Dysregulation dieses Weges
spielt in der Tumorigenese mehrerer Gewebe eine entscheidende Rolle, u.a. auch beim
Kolorektalen Karzinom (s.a. 1.2.3 und 1.2.4). Könnte der Stammzellmarker CD133 etwas
mit dem Wnt-Signalweg zu tun haben?
Zur Beantwortung dieser Frage wurden humane CD133+ Nabelschnurblutzellen in einem
Medium kultiviert, das Wnt-Moleküle, Aktivatoren des gleichnamigen Signaltransduktionsweges, enthielt. Je nach Art des Wnt-Moleküls reagierten die CD133+ Zellen unterschied-
Dissertation Meike Schneider
20
Einleitung
lich. Durch Wnt3a z.B. behielten die Zellen ihren undifferenzierten Charakter bei, während
Wnt5a interessanterweise sowohl das zytoplasmatische als auch das nukleäre β-Catenin
in der CD133+ Zelle erhöhte. Dieses β-Catenin führt zur übermäßigen Zellteilung (s.a.
1.2.4) und kann zur Tumorigenese beitragen. Dieser Versuch stellte die proliferationsfördernde Wirkung von Wnt-Signalstoffen in CD133+ Zellen unter Beweis und unterstützt die
Theorie, dass es sich bei dem CD133-Antigen um einen Krebsstammzellmarker handelt.
{57}
CD133 ist ein äußerst attraktiver Stammzellmarker sowohl im hämatopoetischen System
wie auch bei soliden Tumoren, der mit hoher Wahrscheinlichkeit auch therapeutische Relevanz aufweist.
1.3.3
CD44
CD44 ist ein ubiquitäres, multistrukturelles und -funktionales Zelloberflächenglykoprotein,
das in der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion seine Hauptfunktion hat.
Das CD44-Gen liegt beim Menschen auf Chromosom 11 und kodiert für 20 Exons. Obwohl
dieses Antigen nur von einem Gen kodiert wird, gibt es eine heterogene Gruppe von
CD44-Molekülen. Diese unterscheiden sich in der Anzahl der Exons sowie der posttranslationalen Modifikation. Eine Übersicht über die Struktur des CD44 gibt Abbildung 9 (aus
{69}):
Abbildung 9: Struktur des CD44
Dissertation Meike Schneider
21
Einleitung
Es gibt die Standard- oder hämatopoietische Form des CD44-Antigens (CD44s oder
CD44H), die aus den Exons 1-5 (S1-S5) und 16-20 (S6-S10) aufgebaut ist. Diese Form
wird von vielen Zelltypen wie zum Beispiel Epithel-, Endothel- und Nervenzellen sowie
auch auf T-Lymphozyten und Granulozyten exprimiert.
Neben dieser Standardform CD44s gibt es zusätzlich Isoformen. Die Exone 6-15 heißen
auch V1-V10 und können durch alternatives Splicing Teil des Transmembranproteins werden. Auf diese Weise entstehen variante Isoformen des CD44, zum Beispiel CD44E. Hierbei handelt es sich um eine spezielle Epithelvariante, die zusätzlich zur Standardform die
Exons V8-V10 enthält und von bestimmten Tumorzelllinien exprimiert wird. {35} Die Exone
V6-V10 werden bei Neoplasien des Menschen und auch der Tieren überexprimiert. {69}
CD44v6 ist ein Beispiel für eine Isoform, das vor allem bei der Tumorigenese und der Metastasierung von Tumorzellen eine wichtige Rolle spielt. {23}
Die Hauptaufgabe des CD44 ist die des Rezeptors für Hyaluronsäure. Hyaluronat ist die
Hauptkomponente der extrazellulären Matrix und ein Glucosaminoglykan, das aus Glukuronsäure und N-Acetylglukosamin besteht. Aggregate aus Hyaluronat und Proteoglykanen
haben vor allem mechanische Funktion in vielen Geweben, des weiteren sind sie wichtig
bei der Wundheilung, Entzündungen, der Gewebserneuerung sowie der Morphogenese.
CD44 ist folglich einerseits mitbeteiligt am Aufbau einer stabilen dreidimensionalen ZellExtrazellulärmatrixverbindung, indem es als Bindeglied zwischen dem intrazellulären Zytoskelett und den Proteinen der Extrazellularmatrix fungiert. Andererseits ist es aber auch
an der Erneuerung von Gewebe beteiligt.
Die extrazelluläre Domäne der CD44-Proteine bindet neben Hyaluronsäure jedoch noch
weitere Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Kollagen Typ I und IV, Fibronektin und Laminin. Außerdem können speziell modifizierte CD44 Moleküle Wachstumsfaktoren binden und mittels Signaltransduktion Zellwachstum und –teilung initiieren.
Die Splicevariante CD44v3 trägt Heparansulfatseitenketten und hat durch diese eine hohe
Affinität für Wachstumsfaktoren z.B. für den HGF(hepatocyte growth factor), der Metastasierung fördert. Die Bindung von HGF an CD44v3 verstärkt deutlich die c-MetRezeptortyrosinkinaseaktivität und spielt vermutlich eine bedeutende Rolle in der Tumorigenese. Diese These wird durch die Tatsache unterstützt, dass c-Met und HGF in Verbindung mit CD44 erhöht exprimiert nachgewiesen worden sind. {88}
Es zeigte sich, dass CD44-Proteine auf hämatopoietischen Zellen als
„Lymphozyten-homing-Rezeptor“ agieren, was bedeutet, dass sie neben verschiedenen
anderen Molekülen die Adhäsion von Lymphozyten an spezialisierten Endothelzellen in
den HEV (high endothelial venules) ermöglichen und auf diese Weise den Übertritt der
Lymphozyten aus dem Blutgefäßsystem in sekundäre lymphoide Gewebe erlauben. Über
Dissertation Meike Schneider
22
Einleitung
diesen Mechanismus gelangen Leukozyten in geschädigtes Gewebe, in dem sie gebraucht werden, z.B. in entzündliches Gebiet.
Eine besonders wichtige Eigenschaft von malignen Zellen ist die Fähigkeit, die Verbindung
zu anderen Zellen und der Extrazellulärmatrix zu lösen. Dadurch können sie in andere
Gewebe auswandern und dort metastastieren. CD44 ist ein Beispiel für ein Zelladhäsionsprotein, das sich während der malignen Transformation einer Zelle strukturell und funktionell verändert. {69} Dies konnte an zwei Pankreastumorzelllinien gezeigt werden. Beide
entstanden aus demselben Adenokarzinom, die eine war im Tiermodell metastasierend,
die andere nicht. Aus der metastasierenden Zelllinie wurde die cDNA für CD44v6 kloniert
und in die nicht metastasierende transduziert. Daraufhin war diese metastasierend. Die
Blockade des CD44v6 durch einen spezifischen Antikörper verhinderte wiederum die Metastasenbildung, was CD44v6 als spezifisches Antigen identifizierte, das Metastasenbildung induziert {34}
Viele Krebszelltypen, genauso wie deren Metastasen, exprimieren CD44 in hoher Menge.
Während manche Tumore, wie z.B. Gliome haupsächlich die Standardform CD44s aufzeigen, exprimieren andere Tumoren wie zB das Pankreaskarzinom, das KRK oder das
Mamma-CA zusätzlich oder hauptsächlich isoforme Varianten des CD44. Durch die Expression von CD44v erwerben nicht-metastasierende Tumorzellen metastatisches Potential und dies könnte neoplastischen Zellen einen Wachstumsvorteil verleihen. {27}
Normale Kolonepithelzellen exprimieren CD44s sowie auch in geringerem Umfang die
Isoformen v5, v7 und v9 in der Basalschicht des Kryptenepithels. CD44v4 und v6 kommen
im normalen Kolonepithel hingegen nicht vor. Immunhistochemische Untersuchungen von
neoplastischem Kolonepithel zeigten, dass die alternativen Spleißformen v3-v10 schon
früh bei kolorektalen Adenomen überexprimiert sind: v5 ist bei Adenomen stark überexprimiert, während v6 in 17% der frühen adenomatösen Veränderungen und in 82% der
fortgeschrittenen Karzinome nachzuweisen war. Die Expressionsrate von CD44v6 korreliert positiv mit dem Dysplasiegrad in prämalignen Tumoren. {69} Bei Karzinomen ist die
CD44v6 nicht mehr so stark exprimiert und wird bei metastasierten Zellen nur noch bei
etwa 1/3 der Zellen detektiert. Dieser Verlust während der Karzinogenese könnte die Tumorzellen aus ihrer Umgebung „freigeben“ und zur Metastasierung führen. {23}
In einem anderen Versuch wurden Mäuse mit humanen Brustkrebs-Xenografts mit monoklonalem anti-CD44-Antikörper behandelt, um herauszufinden, ob CD44 positive Zellen
im Tumorwachstum und dem Rezidivverhalten eine Rolle spielen. Nach Gabe des Antikörpers verlangsamte sich das Tumorwachstum und es traten nach chemotherapieinduzierter
Remission weniger Rezidive auf. Kam es jedoch zum Rezidiv, so war CD44 auf den Zellen
stark angereichert. {62}
Dissertation Meike Schneider
23
Einleitung
1.3.4
CD24
Im Jahre 1989 wurde das humane Antigen CD24 erstmals von Knapp und Kollegen als
Zelloberflächenprotein auf B-Zellen beschrieben.
Es besteht aus einem Proteinkern mit 31 Aminosäuren und ist über einen Glykosylphosphatidylinositolanker in der Plasmamembran verankert. Zusätzlich kann dieser
Proteinkern an 16 Positionen über N- oder O-Verknüpfungen variabel glykosyliert werden,
so dass ein unterschiedlich großes Molekulargewicht daraus resultiert (30-70kDa).
CD24 wird in verschiedenen sich entwickelnden Zellen exprimiert, einschließlich während
der B-Zell-Entwicklung auf prä-B-Zellen, bei der Pankreas- und Gehirnentwicklung, sowie
auch auf Keratinozyten und renalen Nierenepithelzellen. Aber dieses Antigen wird nicht
nur auf Gewebevorläuferzellen, sondern auch auf einer ganzen Reihe von Tumoren mittels
Immunhistochemie nachgewiesen: CD24 wurde in hoher Rate beim Ovarialkarzinom, dem
Mamma-CA, beim NSCLC, beim Prostata- und Pankreaskarzinom sowie auch beim Kolorektalen Karzinom entdeckt. {86} {42} Bei der immunhistologischen Färbung des Darmgewebes zeigten sich zwei unterschiedliche Lokalisationen von CD24: eine zytoplasmatische
Form sowie eine membranständige Form dieses Antigens. Während gesundes Gewebe
nahezu CD24 negativ ist, zeigte sich beim KRK ein starker Expressionsgrad. Knapp 80%
dieser Tumore exprimierten CD24 membranständig, während die Karzinome mit besonders starker CD24 Expression mit vermehrter systemischer Metastasierung einhergingen.
Bei circa 95% der Tumorzellen ließ sich CD24 intrazellulär nachweisen, was wiederum
signifikant mit höherem Duke-Stadium, nodaler und systemischer Metastasierung einherging. Abbildung 10 (aus {86} zeigt eine immunohistochemische Anfärbung von CD24 beim
kolorektalen Karzinom: in der Übergangszone zwischen niedriggradig dysplastischen Epithel und invasivem Anteil kommt es abrupt zu einer starken Expression dieses Antigens.
Abbildung 10: CD24 IHC des Kolonepithels beim KRK
Die physiologische Funktion von CD24 ist nicht vollständig geklärt, aber es scheint bei der
Kontrolle der Zellproliferation, Apoptose und Zelladhäsion eine wichtige Rolle zu spielen.
Dissertation Meike Schneider
24
Einleitung
Der bislang einzige identifizierte Ligand des Rezeptorproteins CD24 ist P-Selectin. Es gibt
drei verschiedene Typen von Selectinen, die alle vorübergehende Zell/Zell-Adhäsionen im
Blutstrom vermitteln. P-Selectin kommt auf Endothelzellen und Thrombozyten vor und
dient der Bindung von Leukozyten an die Endothelzellen. Diese Bindung befähigt damit die
Blutzellen zur Auswanderung ins Gewebe. Wenn Tumorzellen nun auch den passenden
Rezeptor CD24 für P-Selectin besitzen, könnten diese auf die gleiche Weise ins Gewebe
gelangen und Metastasen bilden. {8} {86}
Um diese Fähigkeit zur Metastasenbildung experimentell zu überprüfen, wurde die
schwach metastatische Pankreaskarzinomzelllinie 1AS mit einem CD24 exprimierenden
Vektor transfiziert. Diese Zelllinie wurde dann subkutan auf spezielle Ratten implantiert, als
Kontrolle dienten Ratten, bei denen der leere Vektor in die Zelllinie transfiziert wurde.
CD24 erhöhte die Anzahl an Lungenmetastasen signifikant. In weiteren Versuchen konnte
gezeigt werden, dass CD24 die Tumorzellproliferation fördert, und es ändert die adhäsiven Eigenschaften zu P-Selektin, Fibronektin, Kollagen I und IV sowie Laminin. Insgesamt
begünstigt dieses Antigen also die Ausbreitung, Motilität und Invasivität der Tumorzellen.
{13}
In einem weiteren in-vivo-Versuch mit Xenograft-Modellen wurden Mäuse mit subkutan
implantierten HT29-Zellen mit monoklonalem Antikörper gegen CD24 behandelt. Daraufhin
reduzierte sich die Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors signifikant. Auch mit entsprechender siRNA behandelte Tumorzelllinien zeigten nach Behandlung eine verminderte
Teilungsfähigkeit und wuchsen nach Implantation auf die Maus langsamer an. {71}
Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig CD24 für das Wachstum, das Überleben und die
Metastasierung von Tumorzellen ist.
1.3.5
CDCP1 (CUB domain containing protein 1, CD318)
CDCP1 ist ein Typ-I-Transmembranprotein mit drei extrazellulären CUB1-Domänen. Diese
CUB-Domänen sind Immunglobulinen strukturell sehr ähnlich und wichtig für die Zell-Zell& Zell-Matrix-Interaktion. Je nach Glykolysierungsgrad hat das Molekül zwischen 135 und
140 kDa. Intrazellulär befinden sich Tyrosinreste, die bei Aktivierung phosphoryliert werden (s. Abbildung 11, aus {74}).
1
CUB steht für “complement protein subcomponents C1/1r, urchin embryonic growth factor and
bone morphogenetic protein1”
Dissertation Meike Schneider
25
Einleitung
Abbildung 11: Struktur des CDCP1
Ursprünglich wurde CDCP1 im Jahre 2001 als epitheliales Antigen beschrieben, das in
physiologischem gastrointestinalen Gewebe vorkommt. Gleichzeitig konnte dieses Antigen
als viel stärker exprimiertes Tumorantigen beim Adenokarzinom der Lunge und des Kolons
nachgewiesen werden. {74} Drei Jahre später wurde CDCP1 als Stammzellmarker auf
hämatopoetischen Stammzellen identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass CDCP1 von
CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen des Blutes exprimiert wird, aber nicht von differenzierten Zellen. {18} {17} Untersuchungen von malignen hämatopoetischen Zellen zeigten,
dass sowohl CDCP1 als auch CD133 auf leukämischen Blasten vorkommen, aber mit einer niedrigeren Häufigkeit als CD34. {18}
CUB-domain-containing protein 1 (CDCP1) ist ein Phosphoprotein, das von Kinasen aus
der Scr-Familie (SFK) 2 phosphoryliert wird. SFKs spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen Zellfunktionen wie Zellproliferation, -adhäsion und –migration, die durch extrazelluläre Stimuli reguliert werden. Viele Studien zeigen eine erhöhte SFK-Expression bei
Krebszellen und die Aktivität der SFKs korreliert mit dem malignen Potential dieser Zellen
sowie einer schlechten Prognose. SFKs könnten also bei vielen Aspekten der Tumorprogression, Unterbrechung von Zell-Zell-Kontakten und auch zur Resistenz gegenüber
Apoptose beitragen.
Src-Kinasen interagieren also auf der einen Seite mit CDCP1 und wirken andererseits bei
der Zellzyklusregulation mit. Uekita und Kollegen fanden heraus, dass CDCP1 mit Hilfe
der src-Kinasen an der Regulation der Anoikis3resistenz beteiligt ist. Das durch die srcKinase phosphorylierte CDCP1 verleiht den Lungenkarzinomzellen die Fähigkeit, losgelöst
von einem Zellverband bzw. der extrazellulären Matrix zu überleben. {83} Ein erhöhter
Phosphorylierungsgrad des CDCP1 ermöglicht der Zelle also, unabhängig von einer kom-
2
SFK = src family kinases
3
Anoikis= Form der Apoptose; programmierter Zelltod, der durch eine Unterbrechung der Zell-
Substrat-Adhäsion bei epithelialen Zellen auftritt, die die Verbindung zur extrazellulären Matrix eigentlich benötigen
Dissertation Meike Schneider
26
Einleitung
plexen Gewebestruktur zu existieren. Diese Eigenschaft könnte speziell für eine Tumorstammzelle von Bedeutung sein. {83}
Awakura und Kollegen konnten mit Hilfe von Microarray-Analysen zeigen, dass je höher
CDCP1 beim Nierenzellkarzinom exprimiert wird, desto schlechter war das krankheitsspezifische bzw. rezidivfreie Überleben. CDCP1 dient demnach beim Nierenzellkarzinom als
potentieller prognostischer Faktor. {11}
Um CDCP1 als Marker für das Kolorektale Karzinom zu validieren, wurde dessen Expression
mit zwei weiteren tumorassoziierten Antigenen verglichen: EpCAM und CEA (s.
Abbildung 12, aus {60}).
Abbildung 12: Vergleich von CDCP1, EpCAM und CEA
EpCam ist ein 40kDa großes epitheliales Zelladhäsionsprotein, das bei einer Reihe von
physiologisch vorkommenden Epithelgewebe wie z.B. dem Pankreas, der Niere oder dem
Gastrointestinaltrakt vorkommt. Viel stärker überexprimiert wird EpCAM allerdings von
Karzinomen u.a. dem Kolorektalen Karzinom. Hier trägt es zur verstärkten Epithelproliferation bei, indem es die erhöhte Expression von Zielgenen wie dem c-myc oder Cyclinen
induziert.
Dieser Zusammenhang trifft in gleicher Weise für die Epithelzellen der Darmschleimhaut
zu: auch hier korreliert die Expression von EpCAM mit verstärkter Proliferation und Differenzierungsverlust. In der ohnehin EpCAM-positiven Kolonschleimhaut ist die Ausbildung
von Polypen mit einer verstärkten Expression von EpCAM assoziiert. {12}.
Carcinoembryonales Antigen (CEA) ist ein Tumormarker, der insbesondere bei Dickdarmtumoren in höheren Stadien (z.B. bei Dukes D zu >90%) vorkommt. {36}
Dissertation Meike Schneider
27
Einleitung
Mittels Real-Time-PCR wurde die Expression von CDCP1, EpCAM und CEA in normalem
Gewebe mit der beim Kolorektalen Karzinom verglichen (s. Abbildung 12). Der Vergleich
der Expression zwischen CDCP1, EpCAM und CEA ergab, dass alle drei Marker in gleich
signifikanter Weise beim KRK hochreguliert waren. Dies bestätigt das Potential von
CDCP1 als neuer (Stamm-) Zellmarker. {60}
1.3.6
CXCR4
Da CXCR4 ein Chemokinrezeptor ist, soll zunächst das menschliche Chemokinsystem
kurz erläutert werden.
Das menschliche Chemokinsystem beinhaltet derzeit 50 Chemokine und 18 Chemokinrezeptoren. Die Chemokine stellen eine Familie kleiner Moleküle dar, die für ihre Fähigkeit
bekannt ist, Zellmigration im Körper zu steuern und zu kontrollieren. In jedem Chemokinmolekül findet man zwei Cysteinreste. Je nachdem, ob diese zwei Cysteine direkt aufeinanderfolgen oder ob eine oder drei andere Aminosäuren dazwischen liegen, unterscheidet
man CC-, CXC- sowie CX3C-Chemokine. Chemokine werden von Leukozyten und Gewebezellen wie z.B. Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten als Antwort auf einen Zytokinreiz (z.b. IL-1) produziert. Die Hauptaufgabe der Chemokine ist das „Anlocken“ der
Leukozyten.
Die Chemokinrezeptoren besitzen sieben Transmembranhelices und gehören zur Klasse
der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Wie bei den Chemokinen unterscheidet man zwischen Rezeptoren für CXC- und solche für CC-Chemokine. Die durch Bindung des Liganden (Chemokins) ausgelöste Transformationsänderung wird intrazellulär an G-Proteine
weitergegeben, mit denen sie gekoppelt sind. Auf diese Weise erfolgt die Signalweiterleitung des extrazellulär gebundenen Liganden ins Zellinnere. {37}
Die Chemokinrezeptoren sind auf vielen verschiedenen Zelltypen vorhanden. Ursprünglich
wurden sie auf Leukozyten entdeckt, auf denen sie eine wichtige Funktion bei der Wanderung zu Entzündungen haben: viele der gebildeten Chemokine liegen gebunden an Endothelzellen vor, so dass vorbeischwimmende Leukozyten daran binden können. Die zunächst lose Anhaftung der weißen Blutkörperchen geht in eine stärkere Bindung über, die
es schließlich den Leukozyten ermöglicht, in das Gewebe einzuwandern. Die Chemokinrezeptoren induzieren eine direkte Migration von Zellen entlang eines chemotaktischen Zytokingradienten, so dass die Lymphozytenwanderung zwischen Blut und Sekundärgewebe
kein zufälliger Prozess ist; er wir durch unterschiedliche Expression der Zytokine in den
einzelnen Geweben gesteuert. {56} {19}
Es gibt Chemokine, die speziell bei Entzündungen induziert und gebildet werden und solche, die konstitutiv produziert werden. Zu letzteren gehört der Stromal derived factor 1
(SDF-1, =CXCL12), der Ligand des CXCR4 ist.
Dissertation Meike Schneider
28
Einleitung
SDF-1 wird vor allem von Stromazellen im Knochenmark gebildet. Die Stromazellen schaffen im Knochenmark spezielle Plätze, sog. Nischen, in denen hämatopoetische Stammzellen (HPSZ) und Vorläuferzellen zurückgehalten werden für deren Mitose und Ausdifferenzierung. Dieses „Festhalten“ von CXCR4 exprimierenden HPSZ kann über die Bindung an
SDF-1 geschehen. Klinische Studien haben gezeigt, dass die Gabe eines CXCR4Antagonisten alleine oder in Kombination mit G-CSF die Mobilisationszeit von HPSZ aus
dem KM extrem verkürzt. Dies bestärkt die Hypothese, dass die chemotaktische Wirkung
von SDF-1 die hämatopoetischen Stammzellen veranlasst, im Knochenmark zu bleiben.
Weiterhin spielt der SDF-1 eine wichtige Rolle als Wachstumsfaktor in der B-ZellEntwicklung, aber vor allem auch bei der Erneuerung und Reparatur von Geweben. In
hypoxischem Gewebe wird u.a. hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) gebildet, welcher die
Expression von SDF-1 auf Endothelzellen induziert. Auf diese Weise werden dann CXCR4 exprimierende (Vorläufer-) zellen für die Gewebereparatur selektiv angelockt.
CXCR4 ist auf vielen Blutzellen vorhanden und wird bei verschiedenen hämatologischen
Erkrankungen wie z.B. der CLL oder dem Multiplen Myelom verstärkt exprimiert. Es dient
der Wanderung ins Knochenmark (dem „Homing“), dem Überleben sowie der Adhäsion
dieser Zellen. Weiterhin dient CXCR4 dem HI-Virus als Eintrittspforte in Lymphozten und
wird auch bei verschiedenen soliden Tumoren ausgebildet.
Es gibt starke Hinweise dafür, dass epitheliale Tumorzellen die Mechanismen des „Leukozyten-Trafficking“ ausnutzen. Speziell in hypoxischen Teilen des Tumors, aber auch in
Lymphknoten, Lunge, Leber und dem Knochenmark produzieren karzinomassoziierte
Fibroblasten bzw. normale Stromafibroblasten SDF-1. Dieses Chemokin lockt Krebszellen
an, die CXCR4 exprimieren und fördert somit die Progression und Invasivität (Metastasierung) eines Tumors, in dem es den Tumorzellen eine geeignete „Überlebensnische“ bietet
und auch direkt als parakriner Wachstumsfaktor für diese Zellen fungiert. CXCL12 ist aber
auch in der Lage, die Angiogenese zu fördern, indem es auf endokrinem Wege endotheliale Vorläuferzellen anlockt. (s. Abbildung 13, aus {19})
Dissertation Meike Schneider
29
Einleitung
Abbildung 13: Der Chemokinrezeptor CXCR4 mit seinem Liganden SDF-1
CXCR4 spielt eine zentrale Rolle beim Mammakarzinom und beim kleinzelligen Bronchialkarzinom. Aber auch bei Hirntumoren, Pankreas-, Nieren- und Prostatakrebs sowie dem
Kolorektalen Karzinom induziert die SDF-1-CXCR4-Achse Migration und Überleben von
neoplastischen Zellen. Speziell beim KRK korreliert die CXCR4-Expression mit der Rezidivrate, der Metastasierung und dem Überleben der Patienten. {40}
In vielen Geweben wird CXCR4 bereits von den normalen Gewebestammzellen exprimiert,
aus denen sich dann ein zugehöriger Tumor entwickeln könnte, z.B. wird dieser Marker
auf retinalen Stammzellen des Pigmentepithels exprimiert und ebenfalls beim Retinoblastom.
Zusammengefasst gibt es also die begründete Vermutung, dass das „Trafficking“ physiologischer Stammzellen und die Metastasierung von Krebsstammzellen ähnlichen Mechanismen unterliegen, denn CXCR4 wird einerseits von normalen hämatopoetischen und
anderen Gewebestammzellen, andererseits aber auch von mehreren Tumoren exprimiert.
{44}
Die SDF1-CXCR4-Achse ist ein interessantes Target für neue Substanzen, weil CXCR4Antagonisten Tumorzellen aus ihrer geschützten Umgebung (Microenvironment) herauslösen und somit für die konventionelle Tumortherapie zugänglich machen. Weiterhin kann
dadurch die Wirkung des SDF-1 als Wachstumsfaktor verhindert werden.
Dissertation Meike Schneider
30
Die Stammzelltheorie
2
Die Stammzelltheorie
In diesem Kapitel wird die Theorie der Existenz von Stammzellen bei hämatologischen und
soliden Neoplasien erläutert. Im allgemeinen Teil wird zunächst nach einem historischen
Exkurs auf verschiedene Krebsentstehungsmodelle eingegangen, während es im speziellen Teil um Stammzellen bei soliden Tumoren geht. Die Stammzelltheorie beim Kolorektalen Karzinom wird separat erläutert.
2.1
Allgemeiner Teil
Ist jede Krebszelle dazu fähig, das Wachstum eines neuen Tumors zu initiieren?
Diese Frage steht aktuell im Mittelpunkt der Diskussion und stellt die Wissenschaft vor
eine große Herausforderung.
Das Ziel jeder Krebstherapie liegt darin, die Krankheit vollständig zu bekämpfen und den
Patienten damit zu heilen. Um dieses Ziel erreichen zu können, ist es unbedingt erforderlich, die Ursprungszellen zu kennen und den Zelltyp zu identifizieren, der das Tumorwachstum initiiert und dann auch weiterhin unterhält. Es gilt deshalb herauszufinden, ob
jede Zelle einer Neoplasie tumorinitiierende Fähigkeiten besitzt oder nur eine kleine Subpopulation, die sog. Krebsstammzellen.
Die Geschichte des Krebsstammzellkonzepts ist noch recht jung und beginnt im Grunde
mit der Entdeckung und Charakterisierung von Stammzellen im hämatopoetischen System
in den 60er Jahren des vergangenen Jahrhunderts.
Es konnte damals gezeigt werden, dass die Hämatopoese von einer kleinen Population
pluripotenter Stammzellen gesteuert wird (s. Abbildung 14, aus {65}).
Abbildung 14: Normale Hämatopoese
Aus der hämatopoetischen Ur-Stammzelle entsteht durch asymmetrische Teilung wieder
eine Stammzelle sowie verschiedene Progenitor- oder Vorläuferzellen, aus denen dann
nach vielen Reifungsschritten die vielen verschiedenen Blutzellen hervorgehen. Die Existenz der hämatopoetischen Stammzelle wurde in einem Versuch bewiesen, bei dem das
Dissertation Meike Schneider
31
Die Stammzelltheorie
eigene Knochenmark von Mäusen durch Bestrahlung zerstört wurde. Durch die Transplantation des kleinen Knochenmarkanteils von 0,05% Stammzellen konnte bei diesen Mäusen
das Knochenmark und damit das gesamte hämatopoetische System lebenslang ersetzt
werden. Da dieses Experiment mit anderen Zellpopulationen nicht gelang, kann nur der
Stammzellpopulation diese einzigartige Fähigkeit zugeschrieben werden.
Mit dem verfügbaren Wissen über die normale Hämatopoese begann in den 70er Jahren
die Forschung an Leukämien. Filakow und Kollegen stellten fest, dass Krankheiten wie die
CML, die AML oder die essentielle Thrombozythämie durch Proliferation einer monoklonalen Population von Blutzellen entstehen. Gleichzeitig fand man heraus, dass sich nur eine
kleine Untereinheit der Tumorzellen extensiv in vitro und in vivo vermehren kann. Die AML
war 1986 die erste Malignität, bei der man beobachtete, dass nur eine Minderheit an leukämischen Blasten in vitro Kolonien formt. Diese beiden Tatsachen legten den Grundstein
für das Konzept der funktionellen Heterogenität in Tumoren und die Existenz von Stammzellen. {85}
Durch die Erkenntnis, dass es in hämatologischen Neoplasien heterogene Zellpopulationen gibt, entwickelten sich zwei konkurrierende mögliche Stammzellmodelle (s. Abbildung
15, aus {85}):
Abbildung 15: Modelle der Tumorigenese
a)
Das Zufallsmodell:
Bei diesem Modell hat jede Tumorzelle die gleiche Wahrscheinlichkeit, extensiv zu proliferieren und sich wie eine Stammzelle zu verhalten, denn ob sich eine Zelle selbst erneuert
oder Nachkommenzellen bildet, geschieht zufällig. {85}. Der resultierende Tumor besteht
dann aus einer heterogenen Mischung von unabhängigen Subklonen, die durch unterschiedliche genetische Mutationen entstanden sind und auch verschiedene funktionelle
Dissertation Meike Schneider
32
Die Stammzelltheorie
Eigenschaften besitzen. Die Metastase stellt die Expansion eines einzelnen individuellen
Subklons dar, in dem sich dann weitere Mutationen anhäufen. In diesem Modell sind der
Primärtumor und die dazugehörige Metastase erheblich verschieden. {25} Nach dem Zufallsmodell bringen bestimmte Krebszellpopulationen, die aufgrund einer bestimmten phänotypischen Erscheinung isoliert wurden, keine erhöhte tumorinitiierende Fähigkeit mit.
Bilden injizierte Zellen in vivo keinen Tumor, so wird dies als technischer Fehler interpretiert. {21}
b)
Das Stammzellmodell:
Im Stammzellmodell gibt es unterschiedliche Zellklassen innerhalb eines Tumors und nur
ein kleiner Teil davon kann das Tumorwachstum veranlassen. Die intratumorale Heterogenität wird bei diesem Modell durch Zelldifferenzierung genau dieser Zellen erzeugt. Der
Tumor entsteht als dreidimensionales Gewebe, dessen Differenzierungsprozess dem im
originalen Primärgewebe ähnelt. {25}. Wenn die injizierte Tumorzellzahl unter eine gewisse Schwelle fällt und der Tumor nicht anwächst, liegt dies daran, dass keine (fähige)
Stammzelle dabei war, die den Tumor zum Wachsen gebracht hätte. {21}
Bei der AML verfolgte man diese beiden Möglichkeiten durch den Einsatz von NOD-SCID
Mäusen genauer (1997). Und tatsächlich bewies sich die Stammzellhypothese: nur
CD34+CD38- Zellen, also Zellen mit einem ganz bestimmten Phänotyp, konnten in den
Mäusen den Tumor erfolgreich nachbilden, obwohl ihr Anteil an der Gesamttumorzellpopulation mit 0,2% gering war. Ausgereiftere Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38+ erzeugten in vivo keinen Tumor.
Obwohl die AML-Stammzellen nicht identisch mit den normalen hämatopoetischen
Stammzellen sind, gibt das gleiche Oberflächenmarkerprofil CD34+CD38- doch einen
starken Hinweis darauf, dass die AML-Stammzelle aus der HSZ entsteht und nicht aus
einer Vorläuferzelle. {15}
Was zunächst für die AML bewiesen wurde, konnte später für weitere hämatologische
Erkrankungen und solide Tumoren wie z.B. das Mamma-CA gezeigt werden.
Die Frage, ob Neoplasien nach dem Zufalls- oder Stammzellmodell entstehen, hat auch
Relevanz für die Entwicklung neuer Antitumormittel.
Während sich die Forschung beim erstgenannten Modell auf die Masse der Tumorzellen
beziehen kann, so muss beim zweiten Modell zunächst die Stammzellpopulation näher
begutachtet werden. Zum Beispiel können biochemische Signalwege, die in der Mehrzahl
der Tumorzellen aktiv sind, von geringerer funktioneller Bedeutung sein als solche, die in
Krebsstammzellen aktiv sind. Letztere könnten dann die Schlüsselrolle in der Krebsbiologie sein und das gesamte langfristige Verhalten des Tumors bestimmen.
Es war und ist folglich von größter Bedeutung, diese Stammzellen näher zu charakterisieren.
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33
Die Stammzelltheorie
Stammzellen werden durch drei Haupteigenschaften charakterisiert: Differenzierungsfähigkeit, Selbsterneuerung und homöostatische Kontrolle. Stammzellen bilden eine heterogene Nachkommenschaft, die dauerhaft ein Gewebe aufbaut, besitzen aber gleichzeitig
die Fähigkeit der Selbsterneuerung. Die homöostatische Kontrollfunktion moduliert und
stimmt Differenzierung und Selbsterneuerung unter Berücksichtigung von Umwelteinflüssen und genetischen Bedingungen aufeinander ab. {25}
Stammzellen sind in bestimmten Nischen lokalisiert und unterliegen einer engen Kommunikation mit den Nischenzellen und der Umgebung, dem sog. Microenvironment.
Ihre Existenz und Selbsterneuerung wird über verschiedene Signalwege und Wachstumsfaktoren reguliert, wie z.B. den Wnt-/β-Catenin-Signalweg (s. Abbildung 16, aus {65} und
Abschnitt 1.2.3), den Notch- oder den Hedgehog-Signalweg.
Abbildung 16: Der Wnt-/β-Catenin-Signalweg
Krebsstammzellen proliferieren wahrscheinlich aufgrund einer Dysregulation von Signalwegen, die in der normalen Stammzellselbsterneuerung involviert sind. Die Fehlsteuerung
kommt häufig durch Mutationen zustande, die sich im Laufe des Lebens der Zellen anhäufen. Oft sind Gewebestammzellen die einzigen langlebigen Zellen in einem Gewebe und
damit hervorragende Kandidaten für Mutationen wie z.B. die APC-Mutation (s. Abschnitt
Histogenese), die beim Wnt-Signalweg eine Rolle spielt. {25}. Die Dysregulation des WntSignalweges wurde beim Darmkrebs, aber auch bereits beim Prostata- und Ovarialkarzinom beschrieben. Hämatopoetische in
vitro-Kulturen proliferieren mit 100facher Ge-
schwindigkeit, wenn sie stabilisiertes β-Catenin besitzen, differenzieren dabei aber weniger aus. {9}
Stammzellen zeigen Eigenschaften, die sie zu einer langen Lebenszeit befähigen: sie sind
in ihrem Proliferationsverhalten relativ ruhend und im Vergleich zu ausdifferenzierten Zellen durch die Expression von sog. ABC-Transportproteinen resistenter gegenüber Medikamenten und natürlichen Toxinen. ABCG2 gehört zu den ABC-Transportproteinen, stellt
eine Effluxpumpe dar und kommt in hämatopoetischen Stammzellen vor. Zellen mit diesem Transporter werden Side Population Cells genannt, weil sie als kleine Zellpopulation
den Hoechst-Farbstoff 33342 mit Hilfe dieses Transmembrantransporters herauspumpen.
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34
Die Stammzelltheorie
Mit Hilfe des ABCG2 Proteins kann die Zelle neben dem Hoechst-Farbstoff auch Toxine
und Medikamente aus der Zelle befördern, wodurch letztendlich eine Resistenz gegenüber
diesen Stoffen erreicht wird. Weiterhin haben Stammzellen vermutlich effizientere DNAReparatursysteme, die ihnen zu erhöhter Radioresistenz verhelfen und sie weisen höhere
Mengen an BCL-2 auf, einem antiapoptotisch wirkenden Protein. {45}
Stammzellen unterscheiden sich also in ihren biochemischen Eigenschaften von ausdifferenzierten Zellen. Doch wie unterscheidet man sie funktionell?
Will man die Krebsstammzelle von anderen Tumorzellen abgrenzen, so gibt es drei entscheidende Kriterien im in vivo-Versuch, die die Existenz von Krebsstammzellen definieren: Kriterium eins besagt, dass nur eine Minderheit der Tumorzellen die Fähigkeit besitzt,
in der immunsupprimierten Maus einen Tumor zu erzeugen. Diese tumorigenen Zellen
können mittels Durchflusszytometrie oder anderen immunselektiven Verfahren von nichttumorigenen Zellen getrennt werden (Kriterium 2). Drittes Hauptkriterium ist, dass der originale heterogene Tumor durch die Stammzellen nachgebildet wird.
Der Begriff der Krebsstammzelle dient als Arbeitshypothese. Diese wurde zunächst für
myeloische Leukämien entwickelt und bewiesen und wird nun auch seit einigen Jahren als
Konzept für solide Tumoren diskutiert. {25}
Konventionelle
Therapie
Therapie der
Stammzellen
Abbildung 17: Vergleich der Stammzelltherapie mit einem Baum
Vergleicht man einen Tumor mit einem Baum (s. Abbildung 17), so sind die Krebsstammzellen die Wurzeln des Baumes. Konventionelle Chemotherapeutika bekämpfen vermutlich
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35
Die Stammzelltheorie
oft nur den an der Oberfläche sichtbaren Baum und nicht die Wurzeln. Aus diesen übrig
gebliebenen Wurzeln entsteht dann ein neuer Baum, im übertragenen Sinn nach Absetzen
der Antitumortherapie das Tumorrezidiv. Nur das Beseitigen der Wurzeln eliminiert den
Tumor auf lange Sicht, weil ein Baum ohne Wurzeln nur noch eine begrenzte Überlebensfähigkeit hat und ohne Wurzeln auch keine neue Pflanze mehr entsteht. Um mit einer Therapie genau die Wurzeln oder Stammzellen zu treffen, müssen diese zunächst „freigelegt“
und näher charakterisiert werden.
2.2
Spezieller Teil
Im nun folgenden speziellen Teil wird zunächst das Stammzellkonzept bei soliden Tumoren und danach beim Kolorektalen Karzinom erläutert.
2.2.1
Stammzellen bei soliden Tumoren
Die Stammzellhypothese geht davon aus, dass das Wachstum und die Metastasierung
des Tumors von einer kleinen Untereinheit der Tumorzellen ausgeht: den Krebsstammzellen.
Diese Hypothese wurde bereits für die akute myeloische Leukämie bewiesen, bei der nur
eine Subpopulation von CD34+CD38- Zellen, nicht aber die ausgereifteren CD34+CD38+
Zellen, einen Tumor in der immunsupprimierten Maus ausbilden. Andere hämatologische
Neoplasien wie die CML, ALL, und das MDS sind ebenfalls klonale Stammzellerkrankungen. Auch beim Multiplen Myelom sind Stammzellen beschrieben, die in vitro, wie auch in
vivo das Tumorwachstum induzieren. {45}
Neben den hämatologischen/leukämischen Stammzellen wurde das Stammzellkonzept in
den letzten Jahren auch für mehrere solide Tumoren entdeckt und bewiesen.
Vor über 150 Jahren stellten Rudolph Virchow, Begründer der Zellularpathologie, und Julius Connheim eine Verbindung zwischen der embryonalen Organogenese und der Tumorentwicklung fest. Die beiden stellten die Hypothese auf, dass adultes Gewebe Inseln mit
Überbleibseln aus der embryonalen Entwicklung enthält. Diese Residuen „schlafen“ sozusagen im Gewebe, können aber maligne entarten. Die beiden stellten diese Hypothese
anhand Beobachtungen beim Teratokarzinom fest. Die moderne Version dieser „embryonalen Resttheorie“ ist das Konzept der Krebsstammzellen. {6}
Im Jahre 2003 entdeckten Al-Hajj und Kollegen Stammzellen beim Mammakarzinom. Sie
konnten eine Zellpopulation mit dem Oberflächenmarkerprofil CD44+/CD24-/low/ESA4+
von anderen Krebszellen abgrenzen. Gerade mal 1000 von diesen Zellen konnten im
Brustfettgewebe der Maus einen Tumor bilden, während Zellen mit anderer Oberflächen-
4
ESA= epitheliales spezifisches Antigen
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36
Die Stammzelltheorie
markerkombinationen bei Injektion von 10.000 und mehr Zellen dazu nicht in der Lage
waren. Nachdem der gebildete Ersttumor mehrmals passagiert wurde, genügten sogar
200 dieser Stammzellen, um einen Tumor zu bilden. Sie konnten sich nicht nur selbst reproduzieren, sondern differenzierten sich auch zu anderen Zelltypen aus. Interessant dabei ist, dass CD44 und ESA auch von frühen Vorläuferzellen des Brustdrüsengewebes
produziert werden. Dieses Ergebnis ist mit der o.g. Hypothese von Virchow und Connheim
vereinbar. {7} In einem weiteren Versuch konnte dann bestätigt werden, dass die tumorbildende Fähigkeit dieser Zellen auch in vitro nicht verloren ging. Aus Patiententumoren entwickelten sich sog. „Mammaspheres“ (s. Abbildung 18, aus {61}), die in vitro über längere
Zeit als undifferenzierte „Mammaspheres“ kultiviert werden konnten. Tatsächlich stellte
sich heraus, dass diese Zellen das Stammzellmarkerprofil CD44+/CD24- hatten und eine
geringe Zellzahl auch hier in der NOD/SCID Maus einen Tumor induzierte. {61}
Abbildung 18: Mammaspheres
Weiterhin wurden Krebsstammzellen bei mehreren humanen Hirntumoren nachgewiesen.
Im Jahr 2004 konnten Singh und Kollegen beim Medulloblastom und dem Glioblastom
eine kleine Zellpopulation als Stammzellpopulation identifizieren, die CD133 positiv war.
Patiententumoren wurden anhand ihrer CD133-Expression sortiert und subkutan auf die
Maus implantiert. 100 CD133+ Zellen konnten ein Xenograft erzeugen, ganz im Gegensatz zu 105 CD133- Tumorzellen. In der Immunhistochemie des Tumors wie auch des
Xenografts des Gliobastoms zeigte sich bei gleichzeitiger Anfärbung von CD133 und
GFAP5, dass diese beiden Marker gleichzeitig, aber in unterschiedlichen Zellpopulationen
vorkommen.
5
GFAP=glial fibrillary acidic protein, exprimiert von (differenzierten) Astrozyten
Dissertation Meike Schneider
37
Die Stammzelltheorie
Abbildung 19: CD133 und GFAP Anfärbung beim Glioblastom
Abbildung 19 (aus {76}) zeigt links die Anfärbung von CD133 (braun) und rechts die
gleichzeitige Anfärbung von CD133 (schwarzer Pfeil) und GFAP (roter Pfeil) beim Medulloblastom-xenograft. Die CD133 positiven Zellen exprimierten gleichzeitig Nestin. Dies ist
ein zytoplasmatisches Intermediärfilamentprotein, das von primitiven Neuroepithelzellen
exprimiert wird und bei der neuralen Differenzierung eine Rolle spielt. {76} Dieses Ergebnis erinnert an die o.g. embryonale Resttherorie von Virchow und Kollegen: Zellen, die
CD133 und Nestin exprimieren, könnten beim Erwachsenen Überbleibsel aus der Embryonalentwicklung sein, die Ursprungszellen bei der Pathogenese des Medulloblastoms sind.
Darüber hinaus zeigten in vitro Studien, dass sich CD133+ ZNS-Tumorzellen zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten ausdifferenzieren können. {76}
Li und Kollegen gelang es, auch beim Pankreaskarzinom eine besondere Zellpopulation
von anderen Krebszellen abgrenzen zu können. 0,2-0,8% der Pankreaskarzinomzellen
hatten folgenden Phänotyp: CD44+CD24+ESA+. 100 dieser Zellen bildeten den Originaltumor nach, und zwar mit einem 100fach erhöhten tumorigenen Potential im Vergleich zu
den anderen Tumorzellen. {47}
CD133 wurde auch von Ma und Kollegen als Stammzellmarker in verschiedenen Untersuchungen beim hepatozellulären Karzinom beschrieben. Um herauszufinden, welche Proteine bei der Leberregeneration involviert sind, wurden Mäuse partiell hepatektomiert und
Histologieproben am Tag 3 und 7 nach Operation gewonnen. Man untersuchte diese mit
einem cDNA-Mikroarraychip und stellte fest, dass am dritten postoperativen Tag CD133
fast 100 fach stärker exprimiert war, am Tag 7 der Marker aber schon wieder deutlich herunterreguliert war. Die CD133+Fraktion bei HCC-Proben lag bei 1-3%, während in gesundem Lebergewebe 0,025-0,1% dieses Antigen exprimierten. Von 8 getesteten Lebertumorzelllinien waren nur diejenigen in vivo tumorigen, die CD133 exprimierten: Huh7 (65%
CD133+ Zellen), PLC8024 (60%) und Hep3B (90%) Zellen. Diese Zelllinien wurden dann
auch auf CD133 hin separiert und auf ihre Proliferationsfähigkeit getestet: CD133+ Zellen
vermehrten sich deutlich schneller. Bezüglich ihres Adhärenz- und Lebendigkeitsverhaltens gab es keinen Unterschied. In einem weiteren Versuchsansatz wurden CD133+ und
Dissertation Meike Schneider
38
Die Stammzelltheorie
CD133- Zellpoopulationen in Nackt- und SCID-Mäuse implantiert. Es waren dabei 50-60
mal so viele CD133- für die Ausbildung des Tumors nötig wie bei Implantation von
CD133+ Zellen. Die CD133+ Zellen exprimierten dabei höhere mRNA Level von βCatenin, Bmi und anderen proliferationsrelevanten Genen. {50}
Eine wichtige Fähigkeit von Stammzellen ist ihre Differenzierungsfähigkeit. Diese hatten
CD133+ HCC-Zellen, denn sie konnten sich in Nicht-Hepatozyten differenzieren. (s.
Abbildung 20, aus {50}). Während die Expression von CD133 dabei zurückging, bildeten
sich Marker anderer Gewebe aus: MEF2C6 ist ein herzspezifischer Marker, der in der
Embryonalentwicklung als Transkriptionsfaktor dient und MyoD1 als skelettmuskelspezifischer Marker.
Abbildung 20: Ausdifferenzierung von CD133+ HCC-Zellen
Zusammengefasst wurde für das Hepatozelluläre Karzinom von Ma und Kollegen mit einer Reihe von Untersuchungen eine CD133+ Population identifiziert, für die viele für
Stammzellen typische Charakteristika zuteffen (s. auch 2.1). {50}
Chiba und Kollegen konnten beweisen, dass auch kommerziell verfügbare Zelllinien aus
einer Mischpopulation an Zellen bestehen. In 2 von 4 untersuchten HCC-Zelllinien konnten
jeweils eine kleine Menge an Side Population (SP) Cells identifiziert werden: bei Huh7Zellen waren es 0,25%, bei PLC/PRF/5 Zellen 0,8%. Xenografttransplantationsversuche
zeigten, dass 1x103 SP Zellen einen Tumor generierten, während 1x106 Nicht-SP Zellen
dies nicht konnten. Die aus SP Zellen gewachsenen Tumoren enthielten sowohl SP Zellen, wie auch andere. Diese Ergebnisse bringen im Vergleich zu den bis jetzt beschriebenen Erkenntnissen die zusätzliche Information, dass nicht nur solide Tumoren heterogen
aufgebaut sind, sondern auch Tumorzellinien. Auch letztere besitzen Zellen mit höherem
tumorigenen Potential und gleichzeitiger Differenzierungsfähigkeit. {22} Stammzellen, die
aufgrund der Hoechstfärbung als solche definiert wurden, waren sogar im immunkompetenten in vivo-Modell tumorigen. {43} Auch beim Prostatakarzinom, den Kopf-/HalsTumoren und anderen soliden Tumoren sind bestimmte Oberflächenmarker beschrieben,
6
MEF2C= myocyte enhancer factor 2
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39
Die Stammzelltheorie
die die Stammzellen dieser soliden Tumore näher charakterisieren. Tabelle 2 gibt abschließend einen Überblick über in der Literatur beschriebene Stammzellmarker. {67}
Tabelle 2: Stammzellmarker bei verschiedenen Neoplasien
Akute myeloische Leukämie
CD34+CD38-
Mamma-CA
CD44+CD24-/low
Gehirntumor
CD133+
Prostata-CA
CD44+
Metastatisches Melanom
CD20+
Hepatozelluläres Karzinom
CD133+
Kopf- und Halstumoren
CD44+
Kolorektales Karzinom
CD133+
Pankreaskarzinom
CD44+CD24+ESA+
2.2.2
Stammzellen beim Kolorektalen Karzinom
Obwohl das Kolorektale Karzinom schon seit langem als Erkrankung der intestinalen
Stammzellen betrachtet wird, konnte dies lange nicht bewiesen werden.
Zwei Forschergruppen haben nun kürzlich unabhängig voneinander eine kleine Population
undifferenzierter Zellen identifiziert, die CD133 exprimieren.
Normales Kolongewebe exprimierte auch CD133, aber das Karzinom wies eine mindestens 6fach stärkere Expressionsrate auf (0,4-2,1% versus 8,9-15,9%). {58}
Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass dieses Antigen durch onkogene Transformation zum Beispiel in normalen Kolonstammzellen hochreguliert und dann verstärkt exprimiert wird. {67} Die CD133+ Zellen exprimieren zusätzlich das epitheliale Antigen BerEp4
(=ESA, = EpCAM), das die Tumorzelle als Epithelzelle kennzeichnet. Sie exprimieren jedoch nicht Zytokeratin 20, ein intermediäres Filamentprotein, das in maturen Zellen des
Magen- und Darmepithels vorkommt. {67}
O´Brien und Kollegen separierten CD133+ und CD133- Fraktionen von Patiententumorproben und injizierten die Zellen in die subrenale Kapsel von NOD/SCID Mäusen. Von den
47 Mäusen, die mit CD133- Zellen implantiert wurden, bildete nur eine Maus einen Tumor
aus. Diese hatte die höchste Zelldosis von 2,5x105 bekommen. Im Gegensatz dazu bildete
sich konstant ein Tumor, wenn 1x103 CD133+ Kolontumorzellen implantiert wurden. Bei
vier Versuchstieren genügten dafür sogar 100 dieser Zellen. Histologisch zeigt sich bei
den Xenografts ein phänotypisch dem Ursprungstumor sehr ähnlicher Typ. Nach erneuter
Auftrennung der +/- Fraktionen des Xenografts zeigte sich, dass auch hier nur die positive
Dissertation Meike Schneider
40
Die Stammzelltheorie
Fraktion einen Tumor bilden konnte, und zwar erneut mit analoger Histologie. (s.
Abbildung 21, aus {58}) {58}.
Abbildung 21: Histologie des KRK und dazugehöriger Xenografts
Dass es sich bei den CD133- Zellen auch um Kolontumorzellen handelt, zeigte sich an der
Expression von CEA und auch in der APC- und p53-Mutation, die in normalem Kolonepithel nicht vorzufinden ist. {58}
Ricci-Vitiani und Kollegen wiesen der CD133+Tumorzellpopulation ebenfalls ein höheres
tumorigenes Potential nach, indem sie separierte Zellen subkutan auf der Maus implantierten. Neben dieser Wachstumsstudie nahmen sie aber zusätzlich das in vitro-Verhalten der
CD133+ Zellen genauer unter die Lupe. Kolontumorzellen entstanden zunächst durch mechanische und enzymatische Disaggregation aus Karzinomgewebe. Die Zellen wurden
dann in serumfreiem Medium mit epidermalem und Fibroblastenwachstumsfaktor kultiviert.
Unter diesen Bedingungen bildeten sich sog. „Colonspheres“, kleine Anhäufungen von
undifferenzierten Zellen, die sich bei Analyse als CD133 exprimierend herausstellten. Auf
diese Art ließen sich die undifferenzierten Tumorsphären ein Jahr lang kultivieren und es
entwickelte sich immer noch der phänotypisch gleiche Tumor. Lässt man die Wachstumsfaktoren weg und gibt 5%iges Serum dazu, differenzieren diese Zellen zu adhärenten Zellen aus. Dabei differenzierten die Zellen aus, verloren CD133, zeigten dann aber Differenzierungsmarker reifer Kolonozyten wie z.B. Zytokeratin 20. {66}
Die Publikationen von O´Brien und Ricci-Vitiani geben starke Hinweise dafür, dass das
Stammzellkonzept auch für das Kolorektale Karzinom zutreffen könnte. Abbildung 22 {67}
gibt eine Übersicht über die funktionelle Gewinnung von Kolontumorstammzellen. Frisches
Tumormaterial kann zunächst in vitro kultiviert („Colonspheres“) und untersucht werden (A)
oder direkt nach der Herstellung von Einzelzellen auf CD133 sortiert in die Maus implantiert werden. {66}
Dissertation Meike Schneider
41
Die Stammzelltheorie
Abbildung 22: Funktionelle Isolierung von Kolontumorstammzellen
Zusätzliche zur CD133+ basierten Identifikation von Kolontumorstammzellen entdeckten
Dalerba und Kollegen ein weiteres Oberflächenmarkerprofil, mit dessen Hilfe eine Zellpopulation
mit
besonderen
tumorinitiierenden
abgegrenzt
werden
konnte.
CD44+EpCAMhighCD166+ hieß die neue Dreierkombination. CD166 ist ein mesenchymaler
Stammzellmarker, dessen erhöhte Expression beim KRK mit einem schlechten klinischen
Outcome verbunden ist. Alle analysierten Tumoren hatten eine unterschiedlich hohe Anzahl an EpCAM+/CD44+/CD166+ Zellen, aber verglichen mit normalen Kolonozyten war
der Anteil positiver Zellen doch mehr wie doppelt so hoch (durchschnittlich 3,7 versus 10%
bei Karzinomzellen). Die Zellsortierung und in vivo Experimente ergaben hier, dass das
Tumorwachstum auf die Zellen beschränkt war, die diese Marker exprimierten. CD44 wurde auch auf CD133- Zellen gefunden, so dass die Isolierung von Kolontumorstammzellen
mittels dieses Protokolls auch eine Alternative darstellt. {26}
Der Krebsstammzellhypothese zufolge kann das kolorektale Karzinom als eine Krankheit
betrachtet werden, bei der die normale Mukosastammzelle durch Mutationen in eine maligne Krebsstammzelle verwandelt wird, die für die Generierung des Tumors verantwortlich
ist. Für die in den Veröffentlichungen identifizierten Zellpopulationen trafen die in den Abschnitten 2.1 und 2.2 beschriebenen Anforderungen an eine Stammzelle zu, wie z.B. die
Fähigkeit zur Differenzierung und erhöhtes Proliferationsverhalten. Um diese neuen ErDissertation Meike Schneider
42
Die Stammzelltheorie
kenntnisse über Kolontumorstammzellen auch therapeutisch nutzen zu können, müssen
vor allem die Zellen selbst, aber auch der Bezug zur Pathogenese des KRK näher beschrieben und geklärt werden.
2.3
Zielgerichtete Krebstherapie
Obwohl es in den vergangenen Jahren zu einem enormen Fortschritt in der Früherkennung und Behandlung von Neoplasien kam, sind die Therapien in ihrer Fähigkeit, diese
Krankheiten zu heilen, limitiert. {45} Das Auftreten von Metastasen und eines Rezidivs
führen oft zum Tode des Patienten. Dies trifft insbesondere auch für das KRK zu. {79} Chirurgie, Chemo-, Radio- und Immuntherapie sind alle danach ausgerichtet, die Haupttumormasse zu reduzieren. Nach Beendigung der Therapie wächst der Tumor häufig erneut
und es kommt zu einem Rezidiv. Viele, vor allem ältere Antitumormittel sind auch unspezifisch und oft sehr toxisch. Sie zerstören nicht nur die Tumorzellen, sondern auch gesunde
Zellen. {45}
Durch die bedeutenden Fortschritte der Molekularbiologie konnten in den vergangenen
Jahren viele zelluläre Veränderungen auf Molekülebene entdeckt werden, die spezifisch
für bestimmte maligne Zellen sind. Dank dieser Erkenntnisse konnten neue Antitumormittel
entwickelt werden, die als zielgerichtete Therapie bezeichnet werden. Es gibt zwei große
Klassen: zum einen die kleinen Moleküle sowie zum anderen die monoklonalen Antikörper. Der entscheidende Vorteil der zielgerichteten Therapie ist im Vergleich zur klassischen Chemotherapie die höhere Spezifität, mit der maligne Zellen getroffen werden. Der
therapeutische Index ist groß und die optimale effektive Behandlung kann mit einer niedrigen, unter der maximal tolerablen Dosis durchgeführt werden. Dadurch werden gesunde
Zellen „geschont“ und die Nebenwirkungsrate ist geringer.
Das wohl bekannteste Beispiel für ein „small molecule“ ist Imatinib, das sehr erfolgreich
bei der CML sowie den gastrointestinalen Stromatumoren eingesetzt wird. Es blockiert die
ATP-Bindungsstelle der (BCR-) ABL-Tyrosinkinase und reduziert so dessen Aktivität und
dadurch die Proliferation der malignen Zellen.
Trastuzumab (Herceptin) ist ein monoklonaler Antikörper, der am Her2/neu (ErbB2) Tyrosinkinaserezeptor (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor) bindet. Dieser wird beim Mammakarzinom zum Teil überexprimiert und kann daher als spezifisches Target therapeutisch
genutzt werden. Durch Bindung des Antikörpers werden wachstumsfördernde Signale unterbunden und es kommt zur Zerstörung der Tumorzellen.
Als weiteres Beispiel für eine sehr spezifische Therapie sei noch Rituximab genannt, das
spezifisch am CD20 angreift und dadurch die Zerstörung dieser Zellen bewirkt. Es wird
folglich bei lymphoproliferativen Erkrankungen angewandt, die dieses Antigen exprimieren.
So gibt es, bis jetzt vor allem bei hämatologischen Erkrankungen, viele neue revolutionäre
Dissertation Meike Schneider
43
Die Stammzelltheorie
Therapiemöglichkeiten durch die Entdeckung spezifischer Angriffspunkte bei malignen
Zellen. {32}
Geht man vom Stammzellkonzept aus, so haben Medikamente, die nicht gegen die
Stammzellen selbst gerichtet sind, wenig Erfolg. Sie bekämpfen die große Masse der Tumorzellen, verhindern dann aber nicht, dass es zu einem Rezidiv oder dem Auftreten von
Metastasen kommt. Tumorstammzellen scheinen sich auch in einem eher ruhenden Zustand (G0) zu befinden und sind in diesem Fall gegen traditionell wirkende Chemotherapeutika resistent. Das Stammzellkonzept könnte erklären, warum die klinischen Ergebnisse beim Einsatz neuer Krebsmedikamente manchmal andere Ergebnisse bringen als im in
vitro Versuch zuvor. Traditionsgemäß werden Antitumormittel im Screening auch dahingehend getestet, wie stark sie zu einer Regression des Tumors führen. Dieser Ansatz neigt
dazu Mittel zu selektieren, die auf die Masse der Tumorzellen wirkt, aber nicht unbedingt
auf die Stammzellen (siehe auch Abschnitt 2.1) Ein Mittel, das speziell Stammzellen bekämpft, kann gegebenenfalls kein schnelles Schrumpfen des Tumors bewirken, aber zu
einem langfristigen Erfolg in der Therapie der Krankheit führen. Deshalb ist es wichtig,
auch die Testmethode von neuen Antitumormitteln zu überdenken und gegebenenfalls zu
modifizieren. {25}
Die Identifikation neuer Targets ist sowohl bei hämatologischen Neoplasien, als auch bei
soliden Tumoren das absolut erstrebenswerte Ziel. Verfolgt man das Konzept der Krebsstammzellen, so sind vielleicht gerade sie diejenigen Zellen, die möglicherweise spezifische Angriffspunkte bieten. Im Abschnitt Klinischer Ausblick 6.4 werden neue Therapieerfolge vorgestellt, bei denen die Antigene der vorliegenden Arbeit die zentrale Rolle spielen.
Dissertation Meike Schneider
44
Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
3
Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Darmkrebs ist bei Frauen und Männern die zweithäufigste Krebserkrankung. Im Gegensatz zu der gleich bleibend hohen Inzidenz nehmen die Sterberaten am kolorektalen Karzinom für beide Geschlechter stetig ab. Dennoch nimmt der Darmkrebs in der Krebstodesursachenstatistik für Frau und Mann den zweiten Platz ein. {68} Die Epidemiologie dieser
Erkrankung sowie die immer noch ungenügenden Behandlungsmöglichkeiten erfordern die
weitere Erforschung der Tumorpathologie, um neue innovative Therapien entwickeln zu
können
Im Jahr 2003 wurden von Al-Hajj und Kollegen erstmals Stammzellen bei einem soliden
Tumor, dem Mammakarzinom, beschrieben. In wenigen Jahren wurden bis heute bei einigen weiteren soliden Tumoren Stammzellen charakterisiert, u.a. auch beim Kolorektalen
Karzinom. Diese Charakterisierung erfolgt zunächst einmal durch die Beschreibung einer
besonderen, sog. Stammzellpopulation. Typischerweise sind es bestimmte Oberflächenantigene sowie besondere Zelleigenschaften wie erhöhte Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit, durch die sich die Stammzellen auszeichnen, und die sie von den übrigen
Tumorzellen abgrenzen.
In der Literatur werden unterschiedliche sog. Stammzellantigene bei soliden Tumoren beschrieben. Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit lag darin, die Expression einer Auswahl von Stammzellantigenen auf Kolontumorzelllinien und bei von Patienten abgeleiteten
Xenografts zu überprüfen und zu quantifizieren. Es wurden die Oberflächenproteine
CD133, CD24, CD44, CDCP1 und CXCR4 ausgewählt, deren Expression zunächst bei
einer Auswahl von 15 verschiedenen Kolontumorzelllinien mittels Durchflusszytometrie
bestimmt werden sollte. Da das Panel aus kommerziell erhältlichen und im eigenen Institut
etablierten Zelllinien bestand, stellte sich auch insbesondere die Frage, ob es Unterschiede im Expressionsmuster der verschiedenen Tumorzelllinien gibt.
Tumorzelllinien zeigen ähnliche funktionelle Hierarchien wie Gewebe in vivo bzw. Tumoren
und können zu einer wichtigen Quelle für die Aufreinigung und Charakterisierung minoritärer Zellpopulationen, wie z. B. Tumorstammzellen, werden. {22} Da sie aber das Originaltumorgewebe nicht ersetzen, lag die Überprüfung der Expression dieser Antigene in vivo
nahe. Dazu wurden die Zelllinien subkutan in die Nacktmaus implantiert und der nach
mehreren Passagen entstandene Tumor (Xenograft) erneut auf dessen Expression der
oben genannten Antigene hin untersucht. Die zentrale Fragestellung lag hier insbesondere
in dem Vergleich der Antigenexpression in vitro und in vivo, d.h. es wurde folglich der potentielle Stammzellanteil bei der Zelllinie mit dem im Xenograft gegenübergestellt. Darüber hinaus sollten auch insbesondere Xenografts analysiert werden, die direkt aus dem
Dissertation Meike Schneider
45
Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Patiententumor auf der Maus etabliert wurden, da diese histoarchitektonisch dem originalen Patiententumor noch ähnlicher sind.
Durch das geeignete Mittel der Mehrfarbendurchflusszytometrie stand insbesondere auch
die zentrale Frage im Raum, ob die analysierten Zellen gleichzeitig mehr als eines der
Antigene exprimierten.
Während die Antigene bei den Tumorzelllinien und den Xenografts mit dem Durchflusszytometer auf Proteinebene detektiert wurden, sollte bei den Xenografts zusätzlich eine Genexpressionsanalyse auf mRNA-Ebene durchgeführt werden. Eine statistische Analyse
sollte dabei zeigen, ob es Korrelationen im Expressionsverhalten der Antigene untereinander gab.
Neben dieser analytisch deskriptiven Untersuchung der potenziellen Stammzellmarker
CD133, CD44, CD24, CDCP1 und CXCR4 war insbesondere auch die Frage spannend,
ob sich Zellen, die einen dieser Marker exprimieren von denen, die ihn nicht haben, unterscheiden. Aus diesem Grund sollten identifizierte Subpopulationen auf ihre funktionelle
Relevanz bezüglich Stammzelleigenschaften in einer Wachstumsstudie überprüft werden.
Bei der Zelllinie SW620 sollten die CD133 exprimierenden Zellen von den negativen separiert werden. Anschließend sollten die einzelnen Zellpopulationen dann getrennt subkutan
auf die Maus implantiert und in ihrem Proliferationsverhalten, d.h. in ihrer Fähigkeit einen
Tumor zu bilden, beobachtet werden. Dieser Versuch sollte zeigen, ob die CD133+ Zellpopulation im Vergleich zur unsortierten Zelllinie bzw. der negativen Population eine höhere tumorigene Eigenschaft und damit eine höhere potenzielle Stammzelleigenschaft besitzt.
Dissertation Meike Schneider
46
Material und Methoden
4
Material und Methoden
4.1
4.1.1
Material
Material für die Zellkultur der humanen Kolontumorzelllinien
Tumorzelllinien (siehe Abschnitt 4.3)
Zellkulturflaschen
Zellkulturmedium RPMI 1640
Gibco
Trypsin
Gibco
Einmalglaspipetten, Pipettierboy
Brutschrank 37°C, 4% CO2
Wasserbad
Zentrifuge
4.1.2
Material für den Tumor Colony Assay
DNAse I
Roche
Hyaluronidse
Roche
Collagenase IV
Sigma
Dispase II
Roche
PBS Dulbeccos
Life Technologies
Besteck und sonstiges:
Petrischalen
Skalpelle
Pinzetten
50ml Schott-Flasche mit Rührfischchen
20ml Spritze
200µm und 50µm Metallsiebe
Korsolex AF
Bode Chemie; Wisma
Wasserbad 37°C
Dissertation Meike Schneider
47
Material und Methoden
4.1.3
Die Antikörper für die Durchflusszytometrie
Folgende Antikörper wurden bei der Durchflusszytometrie verwendet (s.Tabelle 3):
Tabelle 3: Verwendete Antikörper bei der Durchflusszytometrie
Antikörper
Hersteller/Vertrieb
Bestellnummer
CD133/1 (AC133)-PE
Miltenyi Biotec, Deutschland 130-080-801
CD44-FITC (Clone J.173) Beckman Coulter
IM1219U
CD24-PC5
Beckman Coulter
IM2645
CDCP1-FITC
MBL/Mobitec
K0150-4
CXCR4-PE-Cy7
ebioscience
25-9999
Isotyp-Antikörper
Hersteller/Vertrieb
Bestellnummer
IgG1-FITC
Beckman Coulter
A07795
IgG1-PE
Miltenyi Biotec, Deutschland 130-092-212
IgG1-PC5
Beckman Coulter
A07798
IgG2a,k-PE-Cy7
ebioscience
25-4724
4.2
Die Zellkultur
Als Zellkultur bezeichnet man die Kultivierung von pflanzlichen und tierischen Zellen in
einem Nährmedium außerhalb des Organismus.
HeLa-Zellen waren die ersten humanen Tumorzellen, aus denen eine permanente Zelllinie
etabliert werden konnte. Die Zellen stammten von einem Zervixkarzinom der Patientin
Henrietta Lacks aus dem Jahr 1951 und sie waren die ersten Tumorzellen, die in vitro kultiviert werden konnten. Sie vermehrten sich in der Zellkultur so gut, dass sie seitdem vielfach in der Forschung eingesetzt werden.
Zellkulturen lassen sich anhand verschiedener Eigenschaften unterscheiden, z.B. ob sie
adhärent oder in Suspension wachsen. Das wichtigste Unterscheidungsmerkmal ist jedoch, ob eine Zellkultur nur zeitlich begrenzt kultiviert werden kann oder ob sie sich zeitlich
unbegrenzt kultivieren lässt, d.h. eine permanente Kultur bildet. {75} In der vorliegenden
Arbeit wurden 15 permanente Kolonumorzelllinien mit adhärentem Wachstumsverhalten
untersucht.
Für die Etablierung einer Kolontumorzelllinie wird zunächst eine Primärkultur aus dem
Originalgewebe hergestellt. Das Primärgewebe wird zunächst mechanisch, dann enzymatisch verkleinert und kultiviert. Die gewünschten Zellen müssen wiederholt selektioniert
und gewaschen werden, bis die gewünschte permanente Zelllinie entsteht.
Dissertation Meike Schneider
48
Material und Methoden
Ältere Tumorzelllinien weisen meist eine einigermaßen homogene Zellpopulation auf, weil
sich nach einiger Zeit ein dominierender Zelltyp herauskristallisiert hat. Eine junge Zelllinie
hingegen kann dagegen eine Mischpopulation unterschiedlicher Zellen aufweisen.
Dieses beschriebene „Einstellen“ einer bestimmten Kombination unterschiedlicher Tumorzellen innerhalb einer Zelllinie sei an einem experimentellen Beispiel erläutert. Auf der hepatozellulären Karzinomzelllinie Huh7 wird CD133 auf 65% der Zellen exprimiert. Sortiert
man nun die CD133+ Zellen von den negativen und nimmt die positiven extra in Kultur, so
beträgt die Expressionsrate zunächst ca. 95%.
Tabelle 4: Verlauf der CD133-Expression bei Huh7 Zellen in der Kurzzeitkultur
Prozentsatz an CD133+ Zellen (FACS-Analyse)
CD133
0
<10
Tage in Kultur
10-20
20-30
>40
+
95%
75%
68%
65%
63%
auf CD133 gesortete
Huh7 Zellen
Nach einem Zeitraum von 4 Wochen bildet sich wieder ein steady-state Wert aus, der wieder ungefähr beim Ursprungswert, nämlich bei ca. 65% liegt (s. Tabelle 4, aus [{50}]). {50}
Nach dieser Zeit hat sich wieder ein konstantes Verhältnis der Zellzusammensetzung einer
Tumorzelllinie gebildet.
4.3
Die Kolontumorzelllinien
Bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Kolontumorzelllinien handelt es sich um
permanente adhärent wachsende Zelllinien, die zum Teil käuflich erworben und zum Teil
selbst im eigenen Institut etabliert worden sind (94L, 269L) (s.Tabelle 5).
Tabelle 5: Charakterisierung der Kolontumorzelllinien
Zelllinie
Histologie
HCT116
Wenig
differenziertes
Geschlecht/Alter
primäres M/ erwachsen
Dukes Stage Quelle
n.v.
{16}
n.v.
{5}
n.v.
{31}
{46}
KRK
LOVO
Primäres KRK
HT29
Mäßig
differenziertes
M/56 Jahre
primäres W/44
KRK
SW620
Lymphknotenmetastase eines KRK M/51
C
DLD1
Primäres KRK
C
Dissertation Meike Schneider
M/ erwachsen
49
Material und Methoden
HCT15
Gut bis mäßig diff. CA des Kolon M/n.v.
C
{28}
B
{46}
C
Onco-
sigmoideum
SW480
Mäßig diff. CA des Kolon descen- M/50
dens
269L
Primäres KRK
M/56
test
A293
94L
Primäres KRK
M/70
n.v.
Oncotest
COLO205 isoliert aus Aszitesflüssigkeit bei M/70
D
{3}
primärem KRK
HCC2998 Gut diff. Primäres KRK
n.v.
n.v.
{82}
KM12
Primäres KRK
n.v.
B
{2}
KM20L2
Primäres KRK
n.v.
D
{55}
LS174T
Primäres KRK
W/58
B
{4}
n.v.: nicht verfügbar
Abbildung 23 zeigt links HCT116 Zellen {16} und auf der rechten Seite HT29 Zellen (Oncotest), die auf dem Boden einer Kulturflasche wachsen.
Abbildung 23: HCT116 Zellen und HT29 Zellen
4.4
Die Xenograftsammlung
Die Freiburger Xenograft-Sammlung besteht aus einer Vielzahl humaner Tumormodelle.
Mehr als 1850 Patiententumoren, die zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken
chirurgisch entfernt wurden, wurden subkutan in athymische Nacktmäuse implantiert. Mehr
als 350 Modelle konnten so in den vergangenen 20 Jahren etabliert werden und eine
Dissertation Meike Schneider
50
Material und Methoden
Sammlung verschiedener Tumor-Organgruppen entstand, die die wichtigsten und häufigsten, überwiegend soliden Tumoren des Menschen umfasst. Es handelt sich um Modelle,
die in Serienpassage etabliert werden konnten und hinsichtlich ihrer Stabilität der histologischen Morphologie, der Zytologie, des Differenzierungsgrades, des Wachstumsverhaltens, der Chemosensitivität und weiterer Merkmalen untersucht wurden. Entscheidend für
ein etabliertes Modell ist auch die Möglichkeit, Kryokonserven nach Lagerung in flüssigem
Stickstoff wieder reaktivieren zu können. Auf die Kryokonserven kann zurückgegriffen
werden, um auf Dauer niedrige Passagen zur Verfügung zu haben. Aus einigen der etablierten Xenografts konnte eine permanente Tumorzelllinie etabliert werden. (s. Abbildung
24)
Abbildung 24: Die Xenograftsammlung
Diese humanen Xenografts sowie auch die Zelllinien stellen ein stabiles, jederzeit verfügbares Tumor-Material dar, das für molekularbiologische Untersuchungen, Validierung und
Entwicklung von Krebstherapien verwendet werden kann.
Dissertation Meike Schneider
51
Material und Methoden
4.5
Die untersuchten Xenografts
Tabelle 6: Untersuchte Xenografts
Es wurden insgesamt 15 verschiedene Xe- Xenograft
Anzahl
nografts für die Expression der o.g. Antigene
sungen
der
untersucht. Elf dieser Tumore waren aus der CXF HT29/8
1
implantierten Zelllinie gewachsen, indem jeweils CXF LS174T/9
1
8
Tumorzellen subkutan auf die CXF KM20/7
1
Nacktmaus implantiert wurden. Durch mehrmali- CXF DLD1/2
1
ges Passagieren, d.h. Implantieren kleiner Tu- CXF94L/6
2
morstücke des herangewachsenen Tumors auf CXF KM12/9
1
eine neue Maus, konnte die Zelllinie einen histo- CXF LOVO/5
1
architektonisch aufgebauten Tumor bilden, der CXF A293/3
1
dann für den TCA-Verdau und die weitere Ana- CXF HCT15/7
1
lyse zur Verfügung stand (s. Abschnitte 4.6.2 CXF SW480
1
und 4.6.4). Vier Tumore waren Originalxe- CXF269LX
1
nografts, die direkt aus einem Patiententumor CXF269 20N11
2
auf der Nacktmaus gewachsen sind. Diese tra- CXF1103 6N1
2
gen in ihrem Namen ein N, das die Lagerung im CXF243 17N12
2
Stickstofflager kennzeichnet.
2
etwa 1x10
Eine Übersicht CXF280 16N8
Mes-
über die untersuchten Xenografts gibt Tabelle 6.
4.6
Die Durchflusszytometrie
Ein Durchflusszytometer ist ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop, das gleichzeitig
morphologische Eigenschaften wie Größe und Granularität sowie mehrere Fluoreszenzeigenschaften der einzelnen Zelle erfassen kann. Über spezifische Färbungen mit fluoreszenten Antikörpern oder andere fluoreszente Färbeverfahren können in flexibler Weise
immunologische, funktionelle und biochemische Eigenschaften einzelner Zellen in heterogenen Zellgemischen erfasst werden. Oberflächenproteine auf Zellen, sog. Antigene, werden mit Hilfe monoklonaler Antikörper detektiert. Diese Antikörper sind mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, die durch einen Laser zur Emission von Licht mit bestimmter Wellenlänge angeregt werden. Dieses Licht wird schließlich mit spezifischen Detektoren nach
elektronischer Verstärkung durch Photomultiplier (PMT) erfasst. Die Analyse der Fluoreszenz stellt grundsätzlich eine nur relative Vermessung von Zellen ohne feste Bezugsgröße
dar. Neue gerätetechnische Methoden (sog. Referenzpartikel) ermöglichen jedoch auch
Dissertation Meike Schneider
52
Material und Methoden
eine Quantifizierung von Antigenen mit der Durchflusszytometrie. {70} {24} Die registrierten Fluoreszenzintensitäten korrelieren demnach mit der exprimierten Antigenmenge pro
Zelle.
Zu den häufigsten Anwendungen zählt neben der Detektion von Oberflächenantigenen
die Analyse von intrazellulären Molekülen. Außerdem lassen sich mit Hilfe von RNA/DNAFarbstoffen Zellzyklus-Analysen und Apoptoseassays durchführen. Es gibt auch Fluoreszenzfarbstoffe, die eine Analyse des intrazellulären pH-Wertes und den Ionenfluss an
Zellmembranen erlauben.
Im folgenden wird das Funktionsprinzip eines Durchflusszytometers näher erläutert.
Anregungslicht
Fluoreszenzlicht
Photomultiplier
Laser
Hüllstrom
Messküvette
Hüllstromflüssigkeit
Probe mit gefärbten Zellen
Abbildung 25: Funktionsprinzip hydrodynamische Fokussierung
Die Zellsuspension wird mit einem Ansaugsystem unter Druck in einer Stahlkapillare zu
einer konisch verlaufenden Quarzküvette geführt. Jetzt erfolgt eine hydrodynamische Fokussierung jeder Zelle im Laserstrahl. Basis dieser Fokussierung ist ein aufwendiges Flüssigkeitssystem innerhalb des Messbereichs eines Durchflusszytometers: die Stahlkapillare
wird von einer zellfreien Flüssigkeit (Hüllstrom), die mit hoher Geschwindigkeit fließt, umspült und ist auf das Zentrum der Küvette gerichtet. Am Ende der Kapillare unmittelbar vor
der kleinen Öffnung der Küvette trifft dieser Hüllstrom auf die Zellflüssigkeit und beschleunigt diese, so dass die Zellen vereinzelt werden. Durch den konisch verlaufenden engen
Eingang der Quarzküvette werden die Zellen fokussiert in einer Sequenz von Einzelzellen
Dissertation Meike Schneider
53
Material und Methoden
(im „Gänsemarsch“) im rechten Winkel an einer Lichtquelle vorbeigeführt. Am definierten
Messpunkt werden die Zellen somit optimal vom Laser erfasst (s. Abbildung 25). {24} {70}
Je nach
Größe und Gestalt werden die Zellen im sog. Vor- und Seitwärtsstreulicht-
Punktewolkendiagramm abgebildet. Abbildung 26 zeigt links die Messküvette, in der die
Zellen durch den Laserstrahl getroffen werden. Die Vorwärtsstreulicht (FSC) bildet im Plot
die Zellgröße ab, während das Seitwärtsstreulicht (SSC) die Granularität wiedergibt.
Rechts im Bild ist die typische Verteilung verschiedener Leukozytenpopulationen aufgrund
morphologischer Eigenschaften dargestellt: die relativ kleinen und wenig granulären Lymphozyten werden unten links dargestellt und die großen Granulozyten oben rechts. Zelltrümmer befänden sich theroretisch in der linken unteren Ecke.
SSC
(graGranulozyten
nulari-
Laser
SSC
ty)
FSC
FSC- Forward Scatter, Vorwärtsstreuung
SSC- Side Scatter, Seitwärtsstreuung
FSC: Zellgröße
Monozyten
Lymphozyten
Abbildung 26: Funktion eines Zytometers
Zusätzlich zu dem FSC/SSC Signal senden die Zellen je nach Bindung spezifischer fluoreszenzgekoppelter Antikörper charakteristische Lichtsignale aus, die mittels geeigneter
Detektoren gemessen werden (s. Abbildung 27).
Die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden mit einem Cytomics FC500 von Beckman Coulter durchgeführt. Ein Argonlaser regt im Bereich 490-550 nm verschieden Farbstoffe an, dessen Emissionsspektren dann in fünf, entsprechend aufsteigender Wellenlänge durchnummerierten, Detektoren (FL1-FL5) registriert werden können. {24}
Dissertation Meike Schneider
54
Material und Methoden
SSC
FL 1
FL 2
FSC
FL 3
FL 4
Y
FL 5
FITC
Abbildung 27: Detektion der einzelnen Fluoreszenzfarben
Tabelle 7 zeigt die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Farbstoffe, ihre Emissionswellenlängen sowie der dazugehörige Kanal (FL), in dem die Fluoreszenz detektiert wurde.
Tabelle 7: Verwendete Farbstoffe im FACS-Gerät
Verwendete Farbstoffe beim Argonlaser des Cytomics FC500
Fluoreszenzfarbstoff
Argonlaser
FL1
Fluorescein (FITC)
494
518
R-Phycoerythrin (PE)
565
Propidiumiodid
536
PE-Cy5
565
PE-Cy7
565
FL2
FL3
FL4
FL5
575
617
670
767
Da sich die Emissionsspektren der einzelnen verwendeten Farben überlappen, kommt der
Farbkompensation eine außerordentlich große Rolle zu. Die Einstellung dieser Kompensation übernahm freundlicherweise ein Produktspezialist der Firma Beckman Coulter.
4.6.1
Die Vorbereitung der Tumorzelllinien für die Messung im Durchflusszytometer
Die Kolontumorzellen wuchsen adhärent auf dem Boden der Zellkulturflaschen und mussten mit Hilfe von Trypsin abgelöst werden. Dazu wurde das Zellkulturmedium aus den
Zellkulturflaschen abgekippt und die Zellen ca. 10 min mit Trypsin inkubiert. Jetzt wurden
die Tumorzellen wieder in 10ml Medium resuspendiert und bei 1800 RPM 5 min abzentrifugiert. Nach Abkippen des Überstandes wurde das Zellpellet in 10 ml PBS resuspendiert
Dissertation Meike Schneider
55
Material und Methoden
und noch einmal abzentrifugiert. Dann entstand durch erneute Resuspension der Zellen
die sog. Stammlösung, mit der eine kombinierte Zellzählung mit Vitaltest im Hämocytometer (Neubauer-Zählkammer) durchgeführt wurde. Der Vitaltest beruht auf dem Azofarbstoff
Trypanblau (syn. Benzaminblau), der selektiv nur in tote Zellen eindringt, bei denen die
Zellmembran durchlässig geworden war. Hier färbt Trypanblau als Anion zytoplasmatische
kationische Zellproteine an, wodurch die Zelle im Lichtmikroskop dann blau erscheint. Auf
diese Weise konnte der Anteil an toten Zellen bestimmt werden und auch schwach blau
gefärbte Zellen wurden als tote Zellen gezählt.
Für die Bestimmung der Zellzahl wurde nach folgendem Schema eine 1:10 Verdünnung
aus der Stammlösung hergestellt:
100µl Zellsuspension
800µl PBS
100µl Trypanblau
Diese gefärbte Zellsuspension wurde dann in die Zählkammer pipettiert und durch mäanderförmiges Auszählen der 4x16 Quadrate (s. Abbildung 28) die Zellzahl nach folgender
Formel bestimmt:
Zellzahl/ml = (gezählte Zellen in 4x16 Quadraten)/4 x 10 x 104
Abbildung 28: Hämozytometer
Aus der Stammlösung wurde nun je Zelllinie drei mal die Flüssigkeitsmenge entnommen,
die einer Zellzahl von 5x106 Zellen entsprach, und in 3 FACS-Röhrchen pipettiert. Die Tumorzellen wurden nun in den FACS-Röhrchen bei 1800 RPM 5 min abzentrifugiert und in
100µl PBS resuspendiert. Sie standen dann für die Inkubation mit den Antikörpern bereit
(s. 4.6.4).
Dissertation Meike Schneider
56
Material und Methoden
4.6.2
Tumoraufbereitung nach dem Tumor Colony Assay
Der Tumor Colony Assay (TCA) dient dazu, aus einem soliden Tumor/Xenograft wieder
einzelne Tumorzellen zu machen. Zunächst wird der Tumor mechanisch zerkleinert und
anschließend mit einem bestimmten „Enzymcocktail“ inkubiert.
An den resultierenden
einzelnen Zellen werden in unserem Institut dann Chemotherapeutika auf ihre Wirksamkeit
hin getestet.
In der vorliegenden Arbeit wurde der TCA-Verdau mit Xenografts durchgeführt, die aus der
implantierten Zelllinie sowie auch direkt aus dem ursprünglichen Patiententumor gewachsen waren. Die resultierenden Einzelzellen konnten dann genauso wie die Tumorzelllinien
mit der Durchflusszytometrie auf das Vorkommen der Oberflächenantigene CD133, CD44,
CD24, CDCP1 und CXCR4 hin untersucht werden.
Die Enzyme für den TCA-Verdau wurden im Vorfeld in Medium RPMI 1640 (ohne fetales
Kälberserum) in 5 ml Vials aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Dabei wurde die Konzentration der Enzyme so berechnet, dass folg. Endkonzentration im Enzymcocktail bei
Mischung aller 4 Enzyme vorlag:
Tabelle 8: Endkonzentration im Enzymcocktail bei Mischung aller 4 Enzyme
DNAse I
Collagenase IV
Hyaluronidase
Dispase II
125 U/ml
41 U/ml
100 U/ml
1 U/ml
Zunächst wurden bei dem Tumor Bindegewebsreste und Nekrosen entfernt und der Tumor
dann mit dem Skalpell zerkleinert. Die Tumorstücke wurden dann in eine 50ml SchottFlasche mit Rührfisch überführt, in die dann auch die aufgetauten Enzyme zugesetzt wurden. Anschließend wurde der Tumor mit den Enzymen im Wasserbad bei 37°C für 45 min
inkubiert.
Die Tumorsuspension wurde danach mit einer Weithalspipette aufgesaugt und zuerst
durch ein 200 µm-Sieb und dann durch ein 50 µm-Sieb pipettiert. Die Petrischen und Siebe wurden mit PBS nachgespült und dieses ebenfalls in das 50 ml Falcon überführt.
Jetzt wurden die Zellen bei 1800 RPM 5 min abzentrifugiert und der Überstand abgegossen. Die Zellen wurden mit 30 ml PBS gewaschen und noch einmal 5 min bei 1800 RPM
abzentrifugiert. Das entstehende Zellpellet wurde zum Schluss in 10 ml PBS wiederaufgenommen und die Tumorzellzahl mittels Hämocytometer (gemäß Abschnitt 4.6.1) bestimmt.
Es wurden auch hier stets 5x106 Zellen in jedes FACS-Röhrchen gegeben, die in einem
Endvolumen von 100µl PBS für die Färbung mit dem Antikörpercocktail bereit standen.
Dissertation Meike Schneider
57
Material und Methoden
4.6.3
Inkubation von Tumorzelllinien mit dem Enzymcocktail des TCA-Verdaus
Um zu überprüfen, ob die untersuchten Antigene CD133, CD44, CD24, CDCP1 sowie
CXCR4 durch die Enzyme des TCA-Verdaus abgebaut werden, wurden zwei Tumorzelllinien mit demselben Enzymcockail gleich lange inkubiert, mit dem auch die Tumore für die
Einzelzellsuspension aufbereitet wurden.
Es wurden die Zelllinien 269L und 94L ausgewählt. Beide hatten bereits wiederholt eine
hohe Expression der Antigene gezeigt, so dass ein Abbau durch den Enzymcocktail detektiert werden konnte. Nach der Exposition mit den Enzymen wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und in100µl PBS für die Antikörperfärbung resuspendiert.
4.6.4
Inkubation der Tumorzellen mit dem Antikörpercocktail
Von jeder Tumorzelllinie bzw. jedem Xenograft wurden jeweils 3 FACS-Röhrchen, wie in
den Abschnitten 4.6.1 bis 4.6.3 beschrieben, vorbereitet. Diese drei Röhrchen bildeten
zusammen ein Panel, welches aus dem Ansatz Isotypen, dem Ansatz A sowie dem Ansatz
B bestand. Je Ansatz wurde zunächst eine Mischung der Antikörper hergestellt, die für drei
Zelllinien/Xenografts ausreichte. Von jedem Antikörper wurden 10µl verwendet, diese
Menge war zuvor experimentell in einer Verdünnungsreihe für die Färbung von 5x106 Zellen als ausreichend bestimmt worden. Tabelle 9 gibt einen Überblick über den verwendeten Antikörpercocktail.
Tabelle 9: Verwendeter Antikörpercocktail
Ansatz Isotypen
IgG1-FITC
10 µl
IgG1-PE
10 µl
IgG1-PC5
10 µl
IgGa,k-PE-Cy7 10 µl
PI
4 µl
Ansatz A
CD133/1
10 µl
CD44
10 µl
CD24
10 µl
PI
4 µl
Ansatz B
CD133/1
10 µl
CDCP1
10 µl
CXCR4
10 µl
PI
4 µl
Die Zellen wurden mit den Antikörpern vermischt und 10 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert.
Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit PBS gewaschen und abzentrifugiert. Nach Abkippen des Überstandes resuspendierte man das Zellpellet in 600µl PBS. Vor der Messung
im Durchflusszytometer wurden in jedes Röhrchen 4µl Propidiumiodid (PI, Konzentration
1mg/ml) zugegeben. PI dient im Zytometer der Anfärbung von toten Zellen, so dass diese
aus der Messung ausgeschlossen werden konnten.
Dissertation Meike Schneider
58
Material und Methoden
4.6.5
Die Auswertung der im Zytometer erhobenen Daten
Die Analyse der gefärbten Zellen erfolgte in dem in Abschnitt 4.6 beschriebenen Cytomics
FC500 Gerät von Beckman Coulter. Die den physikalischen Eigenschaften der Zellen entsprechenden Lichtsignale wurden für jede Zelle einzeln in einen Datenspeicher geschrieben und in einem zweiten Schritt ausgewertet. Diese Trennung von Messung und Datenanalyse erlaubte eine korrelierte Untersuchung der Messparameter für verschiedene Populationen oder Gruppen von Zellen.
Bei jeder Zelllinie wurden mindestens 100.000 Zellen gemessen, bei den Xenografts waren es mindestens 200000 Zellen. Die bei der Messung erhobenen Daten wurden mit der
dazugehörigen MXP Software ausgewertet.
Zunächst wurde mit Hilfe der Propidiumiodidfärbung (FL3) die Population der lebenden
Zellen AC im Histogramm (Abbildung 29) „gegatet“, d.h. für die weitere Analyse ausgewählt. Ein Histogramm ist eine eindimensionale Darstellung von Messwerten, in der ein
Messwert gegen die Häufigkeit der Zellen aufgetragen wird. Ein Gate ist eine Region oder
eine Kombination von Regionen, die zur Auswahl von Zellen in einer weitergehenden
Darstellung dient {70}. Das Gate AC beinhaltet die lebenden Zellen während Gate X die
die toten Zellen darstellt. In diesem Beispiel waren 90,52% der Zellen lebendig, und 9,4%
tot.
AC
X
Abbildung 29: Propidiumiodidfärbung von SW620 Zellen
Diese (90,52%) lebendigen Zellen wurden dann weiter analysiert für ihre Anfärbung, also
Positivität in den weiteren Kanälen FL1, FL2, FL4 und FL5. Die Negativkontrolle mit den
Isotypen dient dazu, die unspezifische Bindung der Antikörper aus den Ansätzen A und B
einzuschätzen. Ein Isotypantikörper hat die gleiche Grundstruktur und Leuchtkraft wie ein
spezifischer, nur fehlt ihm die spezifische Bindetasche für ein Antigen. Anhand der Isotypfärbung wurde die Grenze zur Positivität festgelegt: das Gate W wurde so gelegt, dass
der Anteil an positiven Zellen in der Isotypkontrolle ungefähr bei 1% lag (s. Abbildung 30).
Dissertation Meike Schneider
59
Material und Methoden
W
Abbildung 30: Isotypfärbung von SW620 Zellen
Genau dieses Gate W wurde dann auch in der Färbung mit den spezifischen Antikörpern
angewandt und auf diese Weise dann der Anteil an positiven Zellen bestimmt. Abbildung
31 zeigt die Färbung von SW620 Zellen mit dem PE gelabelten Antikörper gegen CD133.
In diesem Beispiel tragen 49,3% (50,06% - 0,76%) der Zellen CD133 auf ihrer Oberfläche.
W
Abbildung 31: CD133 Färbung von SW620 Zellen
Auf diese Weise wurde auch in den Kanälen FL1, FL4 und FL5 der Anteil an positiven Zellen bestimmt.
4.6.6
Analyse der Xenograftzellen auf Doppelt-/Dreifachpositivität
Die Tumorzellen der Xenografts wurden daraufhin analysiert, ob sie nicht nur eines der
Antigene tragen, sondern gleichzeitig auch die anderen Antigene auf der Oberfläche
exprimieren. Aufgrund der verschiedenen Versuchsansätze A und B konnten mit Hilfe des
in Abschnitt 4.6.5 beschriebenen Gatings spezielle Kombinationen überprüft werden: die
CD133 positiven Zellen wurden überprüft, ob sie gleichzeitig zusätzlich CD24 u/o CD44
bzw. CDCP1 u/o CXCR4 auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Dissertation Meike Schneider
60
Material und Methoden
4.7
Statistische Auswertung
Für die Bestimmung der Antigenexpression wurde jeweils aus den 4 Zelllinien- bzw. 2 Xenograftmessungen (a i ) der Mittelwert
a
gebildet. Weiterhin wurde als Maß der Homo-
bzw. Heterogenität der Stichprobe die Standardabweichung
σ
nach folgender Formel
bestimmt:
∑ (a
σ=
i
−a
)
2
n −1
Bei der Analyse von mehreren Antigenen ist neben der Frage nach Doppelt- und Dreifachpositivität auch interessant, ob es eine statistische Korrelation der einzelnen Marker untereinander gibt. Für diese Untersuchung wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach
Spearman mit Hilfe des SigmaStat Programms für die einzelnen Oberflächenmarkerkombinationen bestimmt.
Der Korrelationskoeffizient nach Spearman ist ein Maß für die Stärke eines monotonen
Zusammenhangs und basiert auf den Rangzahlen der Beobachtungswerte (xi, yi). Um den
Koeffizienten zu berechnen, werden alle x- und y- Werte sortiert und mit Rangzahlen versehen. Jeder Beobachtungseinheit wird eine Rangzahl n für das x-Merkmal und eine für
das y-Merkmal zugeordnet. Die Differenz dieser beiden Rangzahlen sei di. Aus diesen
Differenzen wird der Spearman´sche Korrelationskoeffizient rs nach folgender Formel berechnet:
n
6 × ∑ di 2
rs = 1 −
i =1
2
n × (n − 1)
Der Koeffizient kann Werte zwischen –1 und +1 annehmen. Rs nimmt den maximalen Betrag 1 an, wenn der Zusammenhang streng monoton ist. Ein positives Vorzeichen symbolisiert einen gleichsinnigen, ein negatives Vorzeichen einen gegensinnigen Zusammenhang. Ist rs =0, so ist kein monotoner Zusammenhang nachweisbar. {87}
Zusätzlich zum Spearmankorrelationskoeffizienten wurde der p-Wert bestimmt. Dieser
quantifiziert die Wahrscheinlichkeit, dass das gefundene Testergebnis zustande kommt,
wenn in Wirklichkeit die Nullhypothese richtig ist. Diese würde im vorliegenden Fall sagen,
dass es keine Korrelation in der Expression der verschiedenen Marker gibt. Der p-Wert
drückt die Wahrscheinlichkeit aus, mit der das Testergebnis ein reiner Zufallsbefund ist. Je
kleiner p, desto wahrscheinlicher ist ein gefundener Zusammenhang zwischen zwei Antigenexpressionen. Der zum Korrelationskoeffizienten zugehörige p-Wert entscheidet, ob
die errechnete Korrelation statistisch signifikant ist. Bei einem p < 0,05 ist dies der Fall. (Ist
Dissertation Meike Schneider
61
Material und Methoden
p < 0,05, so ist die Wahrscheinlichkeit, eine Korrelation fälschlicherweise anzunehmen
kleiner als 5%). Bei Variablenpaaren (rs/p) mit positivem Korrelationskoeffizienten und einem p-Wert <0,05 gibt es eine Tendenz der positiven Korrelation zweier Antigene. {87}
4.8
Genexpressionsanalyse mit Affymetrix Genchips®
Die Genchip-Technologie ist ein Hochdurchsatzverfahren, mit dem Genexpressionen bestimmt werden können. Sie ermöglicht es zum Beispiel, die Expressionslevel mehrerer
tausend verschiedener mRNAs simultan zu messen, um so ein umfassendes Expressionsprofil von einem Gewebe zu erhalten.
Der Chip besteht aus einem Quarzträger, auf dem Oligonukleotide an definierten Positionen gebunden sind. Eine Gruppe von Oligonukleotiden ist jeweils komplementär zu einer
bestimmten nachzuweisenden mRNA. Um die Genexpression einer Zelle mittels Genchip
zu ermitteln, wird zunächst die mRNA einer Zelle isoliert, vermehrt und mit einem Fluorochrom markiert. Sie wird dann auf den Chip gegeben, auf dem sie mit den Oligonukleotiden hybridisiert. Anhand der Stärke des von der mRNA-Menge abhängigen Hybridisierungssignals an der entsprechenden Stelle des Chips kann eine zuverlässige Aussage
über die Stärke der Expression einzelner Gene getroffen werden. {1}
Die Genexpressionsdaten von acht der untersuchten Xenografts wurden mit Hilfe dieser
Genchip-Technologie bestimmt. Der verwendete Chip Affymetrix HG-U133 plus 2.0
analysiert den Expressionsgrad von 38 500 gut charakterisierten Genen und über 47 000
Transkripten. Die Intensität der Fluoreszenz gibt den Expressionsgrad eines gewissen
Gens wider und diese Rohdaten werden auf den Median des Leuchtsignals des Chips
bezogen. So entstanden für die einzelnen Antigene Zahlenwerte, die die Expressionsstärke anzeigen und mit deren Hilfe der Spearmankorrelationskoeffizient mit Hilfe des SigmaStat-Statistikprogramms berechnet werden konnte. Auf diese Weise konnte untersucht
werden, ob es bei den Xenografts eine Korrelation zwischen dem mRNA Level der einzelnen Antigene gibt.
Dissertation Meike Schneider
62
Material und Methoden
4.9
Wachstumsstudien
4.9.1
Sortierung der Zelllinie SW620 auf CD133
SW480 und SW620 Zellen stammen vom gleichen Patienten, einem 50jährigen kaukasischen Mann. Er hatte primär ein kolorektales Karzinom, aus dem die Kolontumorzelllinie
SW480 etabliert werden konnte. In dieser Zellkultur zeigte sich eine Mischung aus kleinen
Epithelzellinseln und bipolaren Zellen, die oft polygonal waren mit Mikrovilli auf der Oberfläche.
Abbildung 32: SW620 Zellen
SW620 Zellen wurden aus einer Lymphknotenmetastase des gleichen Patienten isoliert,
als es zu einem Rezidiv der Erkrankung kam. Diese Zellen schienen nun weiter entdifferenziert zu sein, denn sie waren alle isodiametrisch und hatten keine Mikrovilli mehr auf
ihrer Oberfläche (s. Abbildung 32, aus {46}). Beide Zelllinien produzierten in schwachem
Ausmaß das für das KRK typische CEA. {46}
Bei der Bestimmung der o.g. potentiellen Stammzellmarkern im Panel der Kolontumorzelllinien stellte sich heraus, dass die Zelllinie SW620 das Antigen CD133 durchschnittlich zu
47,5% exprimierte.
Da also ungefähr die Hälfte der Zellen CD133 auf ihrer Oberfläche exprimierte und die
andere Hälfte nicht, sollten die positiven von den negativen Zellen mit einem MoFlo Gerät
(Hersteller: Cytomation) voneinander getrennt und anschließend getrennt subkutan in die
SCID-Maus implantiert werden.
Das MoFlo Gerät funktioniert im Prinzip wie ein Durchflusszytometer, kann neben der reinen Analyse von Zellen aber auch unterschiedlich gefärbte Zellpopulationen voneinander
trennen. Dazu werden die Zellen nacheinander einzeln in einem Flüssigkeitsstrahl vom
Gerät elektrisch geladen und dann durch Ablenkung dieses Strahls in zwei unterschiedliche Auffanggefäße geleitet. Auf diese Weise konnte in dem vorliegenden Versuch die
CD133 positive von der negativen Zellpopulation separiert werden.
Dissertation Meike Schneider
63
Material und Methoden
Die Zellen wurden dazu wie in Abschnitt 4.6.1 beschrieben vorbereitet. In diesem Fall
wurden 1x108 Zellen mit 200µl CD133-PE Antikörper gefärbt. Tote Zellen wurden durch
Anfärbung mit Propidiumiodid von der Messung ausgeschlossen.
Nach Einstellung des Gerätes mit ungefärbten und mit Isotyp gefärbten Zellen waren zwei
deutliche Populationen im Scatter sichtbar (siehe Abbildung 33). Die obere stellt den Anteil
der SW620 Zellen dar, der CD133 exprimiert, die untere Population ist CD133 negativ.
Abbildung 33: Sortierung der SW620 Zellen
Um die Trennschärfe der positiven und negativen Zellen zu erhöhen, wurde für die Sortierung das Gate R4 (CD133+) bzw. R5 (CD133-) so gewählt, dass nur die Randbereiche der
Population im Gate liegen. Die Reinheit der Zellpopulationen wurde durchflusszytometrisch vor der Implantation bestätigt.
Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und in einer Konzentration von 1x104 bzw. 1x105
auf jeweils 5 immundefiziente SCID-Mäuse subkutan implantiert. Als Kontrolle wurden
unsortierte SW620 Zellen in denselben Zellkonzentrationen subkutan injiziert. Der Versuch
lief über 12 Wochen und zweimal wöchentlich wurden gewachsene Tumoren mit einem
Messschieber auf ihre Größe hin bestimmt.
4.9.2
Statistische Auswertung der Wachstumsstudie
Um einen statistisch signifikanten Unterschied im Wachstum der einzelnen implantierten
Zellpopulationen nachzuweisen, wurden der t-Test sowie eine Varianzanalyse (one way
analysis of variance) durchgeführt.
Der t-Test vergleicht zwei unverbundene Stichproben der Umfänge n1 und n2, die einer
normalverteilten Grundgesamtheit mit derselben Varianz entstammen. Mit diesem Test
wurden am Tag 46 jeweils zwei Versuchsgruppen dahingehend überprüft, ob die Tumor-
Dissertation Meike Schneider
64
Material und Methoden
größen in den Gruppen statistisch signifikant unterschiedlich waren. Die in den Gruppen
gemessenen Mittelwerte sind Schätzer für den Erwartungswert der Grundgesamtheit, der
mit einer festgelegten Konfidenzwahrscheinlichkeit von 95% in diesem Intervall zu finden
ist. Das Signifikanzniveau und damit die Irrtumswahrscheinlichkeit beträgt 5%. Der p-Wert
quantifiziert dabei die Wahrscheinlichkeit, dass das gefundene Testergebnis zustande
kommt, wenn in Wirklichkeit die Nullhypothese richtig ist. Ist p kleiner als das festgelegte
Signifikanzniveau, wird ein Unterschied in den untersuchten Gruppen angenommen.
Während der t-Test jeweils zwei Versuchsgruppen miteinander vergleicht, ersetzt die Varianzanalyse den t-Test bei mehr als zwei Stichproben. Mit Hilfe der Varianzanalyse wurden
alle drei Gruppen (CD133+, CD133-, unsortiert) miteinander verglichen.
Dissertation Meike Schneider
65
Ergebnisse
5
Ergebnisse
5.1
Die Expression der Antigene bei den Kolontumorzelllinien
Jede Zelllinie hatte ihr eigenes spezifisches Expressionmuster der untersuchten Antigene.
Der durchschnittliche Anteil lebender Zellen lag bei 85,95%. Die CCL LOVO hatte den
höchsten Anteil toter Zellen, der Anteil lebender Zellen belief sich hier durchschnittlich auf
56,7%.
Jede Zelllinie wurde an 4 unterschiedlichen Versuchstagen getestet und insgesamt war die
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sehr hoch mit einer Standardabweichung von <10%
bei 108/120 Messungen.
5.1.1
CD133
Die Expression von CD133 war bei den einzelnen Zelllinien unterschiedlich (s. Abbildung
34):
CD133
% positive Zellen
100
86,0 85,9
80
60
47,5
40,4 38,0
40
14,9
20
9,1
8,6
6,6
3,1
0,2
0,1
0,0
0,0
0,0
HC T
15
H CT
116
SW4
80
HC C
2 998
LS1 7
4T
0LZ
A293
1
DLD
KM2
2
KM1
COL
O2 05
SW6
20
LOV
O
HT29
94 L
26 9L
0
n= 4
= Standardabweichung
Abbildung 34: Mittlere Expression von CD133 auf 15 Kolontumorzelllinien
HCT116, HCT15 und LS174T exprimierten diesen Marker nicht auf ihrer Oberfläche, während jeweils eine kleine Population von 0,1% bzw. 0,2% der HCC2998 bzw. SW480-Zellen
CD133 exprimierte.
Fünf Zelllinien hatten zwischen 3 und 20% CD133 positive Zellen: A293 hatte 3,1%, während KM12, DLD1 und KM20LZ um die 8% und COLO205 14,9% positive Zellen hatten.
Bei den Zelllinien HT29, LOVO und SW620 exprimierten 38-47,5% der Zellen CD133.
Dissertation Meike Schneider
66
Ergebnisse
Den deutlich höchsten Anteil an CD133 positiven Zellen hatten die beiden OncotestZelllinien 269L und 94L mit jeweils 86 bzw. 85,9%.
5.1.2
CD44
CD44 war auf allen Zelllinien nachweisbar (s. Abbildung 35):
CD44
% positive Zellen
100
97,6 95,8 95,6 95,3 94,3
92,4 89,3
80
83,5 82,7 82,2
78,4 78,3
60
41,2
40
11,2
20
3,6
2998
20
HCC
SW6
15
H CT
O
LOV
O205
A293
0LZ
4T
26 9L
K M2
COL
n= 4
= Standardabweichung
LS17
80
SW4
9 4L
2
KM1
H T29
1
DLD
H CT
116
0
Abbildung 35: Mittlere Expression von CD44 auf 15 Kolontumorzelllinien
Die niedrigste Expression von CD44 hatte die Zelllinie HCC2998 mit 3,6% positiven Zellen.
11,2% der SW620 Zellen und ungefähr die Hälfte (41,2%) der HCT15 Zellen
exprimierten dieses Antigen auf ihrer Oberfläche. Die restlichen 12 Zelllinien hatten eine
deutlich höhere Expressionsrate, die von 78,3% bei LOVO Zellen bis zu 97,6% bei
HCT116 Zellen reichte.
5.1.3
CD24
Das CD24-Antigen zeigte insgesamt im untersuchten Panel auf etwa 2/3 der Tumorzelllininen eine hohe Expression, während es im übrigen Drittel wenig detektiert wurde. (s.
Abbildung 36)
Dissertation Meike Schneider
67
Ergebnisse
CD24
% positive Zellen
100
97,4 96,7
92,9 92,0 89,8
86,1 85,9
84,6 76,8
80
58,1
60
35,2
40
20
5,9
5,4
5,2
3,5
80
SW4
O
LOV
A 293
2998
15
HCC
HCT
11 6
1
HCT
DLD
94L
HT29
2
0LZ
LS17
4T
SW6
20
2 69L
KM2
KM1
COL
O205
0
n= 4
= Standardabweichung
Abbildung 36: Mittlere Expression von CD24 auf 15 Kolontumorzelllinien
Anhand der Expression von CD24 konnte das Panel in drei Gruppen eingeteilt werden: 9
der 15 Zelllinien exprimierten dieses Antigen zwischen 76,8% auf DLD1 Zellen und 97,4%
auf COLO205 Zellen. Etwa ein Drittel der HCT15 Zellen (35,2%) exprimierte CD24 und
hatte somit zusammen mit HCT116 Zellen (58,1%) eine gewisse Mittelstellung.
In deutlich geringerem Ausmaß konnte CD24 auf den übrigen 4 Zelllinien nachgewiesen
werden: mit 3,5% zeigte die SW480-ZL die geringste Expression, war aber ähnlich niedrig
wie die bei HCC2998, LOVO und A293 Zellen (5,2-5,9%).
5.1.4
CDCP1
Auch CDCP1 hatte ein ganz spezifisches Expressionmuster innerhalb der untersuchten
Zelllinien (s. Abbildung 37). Bei 10 der 15 Zelllinien war die Expression von CDCP1 mindestens 86% (94L), wobei die HCC2998 mit 98,6% den größten Anteil an positiven Zellen
aufwies. Bei den übrigen fünf zeigte sich folgendes Ergebnis: KM20LZ hatte 60,8% positive Zellen, bei HCT116 und KM12 Zellen war ungefähr die Hälfte der Zellen positiv für
CDCP1 (44,5 bzw. 45,6%). Während bei LOVO Zellen die Expressionsrate bei 27,8% lag,
war bei der Kolontumorzelllinie A293 der geringste Anteil an CDCP1 positiven Zellen
nachzuweisen (9%).
Dissertation Meike Schneider
68
Ergebnisse
100
98,6 97,9 97,1 97,0 96,3 96,3 96,0 95,5
92,3 86,0
80
60,8
60
44,5
45,6
40
27,8
9,0
20
A293
O
LOV
116
2
H CT
KM1
K M2
0LZ
9 4L
15
1
H CT
DLD
H T29
4T
20
LS17
SW6
O205
C OL
26 9L
SW4
HCC
80
0
2998
% positive Zellen
CDCP1
n= 4
= Standardabweichung
Abbildung 37: Mittlere Expression von CDCP1 auf 15 Kolontumorzelllinien
5.1.5
CXCR4
CXCR4 war auf drei der fünfzehn getesteten Zelllinien nachweisbar (s. Abbildung 38):
CXCR4
80
60
41,0
40
23,5
20
0,2
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
15
HCT
O
LOV
2998
2
K M1
1
D LD
4T
0LZ
KM2
LS17
20
SW6
H CC
n= 4
= Standardabweichung
HT29
1 16
HCT
269 L
O205
C OL
94 L
SW4
-20
80
0
A293
% positive Zellen
100
Abbildung 38: Mittlere Expression von CXCR4 auf 15 Kolontumorzelllinien
Dissertation Meike Schneider
69
Ergebnisse
Die geringste Expressionsrate zeigte sich auf der 94L Zelllinie mit 0,2%. Mit 23,5% CXCR4
positiven Zellen nehmen SW480 Zellen die Mittelstellung ein, während A293 mit 41% positiven Zellen die höchste Expression dieses Antigens zeigte.
5.1.6
Statistische Korrelation der Antigene bei den ZL
Abbildung 39 zeigt das Ergebnis der berechneten Korrelationskoeffizienten rs nach
Spearman bei den Zelllinien. Rs liegt im Bereich zwischen –0,485 und 0,349, im Durchschnitt bei 0,06. Die p-Werte liegen durchschnittlich bei 0,55.
Zellinhalte
Spearman Korrel. Koeff.
P-Wert
Anzahl der Proben
cd44
cd24
cd24
cdcp1
cxcr4
cd133_a
cd133_b
0,114
0,676
15
0,111
0,686
15
-0,485
0,0639
15
0,272
0,319
15
0,349
0,194
15
-0,254
0,353
15
0,0894
0,743
15
-0,0215
0,934
15
-0,0546
0,842
15
-0,14
0,611
15
0,0573
0,832
15
0,127
0,639
15
-0,00256
0,985
15
-0,213
0,433
15
cdcp1
cxcr4
cd133_a
0,964
0
15
Abbildung 39: Korrelationskoeffizient nach Spearman bei den Zelllinien
Diese Ergebnisse zeigen, dass es keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression der einzelnen Antigene untereinander gibt, denn nur Variablenpaare
(rs/p-Wert) mit positivem rs und einem p-Wert<0,05 zeigen diesen Zusammenhang an.
Die Messung von CD133 in zwei unterschiedlichen Ansätzen (a, b) diente als Positivkontrolle mit einem rs von 0,964 und dem p-Wert von 0. Dies zeigte, dass mit dem CD133Antikörper zuverlässig in beiden verwendeten Antikörperansätzen (s.a. 4.6.4) gleich hohe
Expressionsraten dieses Antigens detektiert wurden.
5.2
Ergebnis der Inkubation der Tumorzelllinien mit dem Enzymcocktail des TCAVerdaus
Um die Frage zu klären, ob die Enzyme des TCA-Verdaus die Antigene auf den Tumorzellen abbauen, wurden zwei verschiedene Zelllinien mit den entsprechenden Enzymen in
Kulturmedium inkubiert. Als Kontrolle diente die Inkubation der Zellen in Kulturmedium
alleine.
Dissertation Meike Schneider
70
Ergebnisse
Tabelle 10 zeigt das Ergebnis nach der Inkubation der Zelllinie 269L bzw. 94L mit Zellkulturmedium allein, sowie in einem parallelen Ansatz mit den Enzymen des TCA-Verdaus.
Tabelle 10: Inkubation der ZL mit Zellkulturmedium und den Enzymen des TCAVerdaus
269L
RPMI
94L
EC
RPMI
EC
%pos. Zellen %pos. Zellen %pos. Zellen %pos. Zellen
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
84,7
73,89
81,33
96,63
0
85,4
74,72
58,84
91,36
0
88,73
68,15
97,48
81,09
0,11
73,73
57,56
92,85
81,2
0,03
RPMI= RPMI 1640, Zellkulturmedium
EC= Enzymcocktail des TCA-Verdaus
Die angegebenen Werte in der Tabelle gibt den Anteil (in %) der Zellen wieder, die das
jeweilige Antigen exprimieren.
Wie aus der Tabelle zu entnehmen, wurde CDCP1 nicht abgebaut. Die CD24- und CD133Expression wurde bei der 269L nicht beeinflusst und war bei der 94L um ca. 10% verringert. CD44 wurde bei der 269L durch die Enzyme teilweise abgebaut bzw. von 81,3 auf
58,8% positive Zellen herunterreguliert. Die Expression von CD44 auf 94L hingegen wurde
nicht beeinflusst. CXCR4 wurde von den untersuchten Zellen nicht exprimiert.
Zusammenfassend lässt sich für den Abbau der Antigene durch den Enzymcocktail sagen,
dass in der überwiegenden Anzahl der Messungen keine Reduktion der Expressionsrate
durch die Enzyme stattfand. Sofern durch eine ausreichend breite Testung die gewonnenen Ergebnisse verifiziert werden sollten, konnte der TCA-Verdau für die Herstellung der
Einzelzellsuspension aus den Tumoren für eine nachfolgende durchflusszytometrische
Messung eingesetzt werden.
5.3
Die Expression der Antigene bei den Xenografts
Jedes Xenograft zeigte eine eigene charakteristische Antigenexpression. Der Anteil lebender Zellen im Xenograft lag bei durchschnittlich 52,67%. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war sehr gut, denn die Standardabweichung lag bei den fünf Xenografts, die in
zwei unabhängigen Experimenten gemessen wurden, bei <5%.
In den folgenden Abbildungen werden die Ergebnisse der direkt aus dem Patiententumor
etablierten Xenografts getrennt von denen aus der Zelllinie gewachsenen Tumoren darge-
Dissertation Meike Schneider
71
Ergebnisse
stellt. Bei letzteren ist immer der Vergleich der Antigenexpression zwischen Zelllinie und
dem resultierenden Tumor dargestellt.
Im Falle der CCL 269/CXF 269 konnten sowohl ein direkt vom Patiententumor abgeleitetes
sowie auch ein von der Zelllinie abgeleitetes Xenograft mit der Zelllinie verglichen werden.
5.3.1
Direkt patiententumorbasierte Xenografts
Abbildung 40 zeigt die Expressionsraten der Antigene bei den direkt vom Patiententumor
abgeleiteten Xenografts: CXF1103, CXF243, CXF269 sowie CXF280. Von jeder Entität
wurden unabhängig voneinander zwei Xenografts gemessen (n=2), die berechnete Standardabweichung war dabei sehr klein und betrug jeweils <5%.
% positive Zellen
50
40
30
20
10
4
0,6
0,7
1,9
0,0
0
CXF1103 6N1 (n=2)
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
% positive Zellen
50
40
30
20
14,45
6,8
10
1,0
0
0,9
0,0
CXF243 17N12 (n=2)
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
% positive Zellen
50
40
30
20
11,25
10
5,8
2,4
2,8
0,0
0
CXF269 20N11 (n=2)
CD133
Dissertation Meike Schneider
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
72
Ergebnisse
% positive Zellen
50
36,2
40
30
18,1
20
7,4
10
6,8
0,0
0
CXF280 16N8 (n=2)
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 40: Mittlere Antigenexpression bei direkt vom Patiententumor abgeleiteten Xenografts
CD133 war auf allen vier Xenografts exprimiert, in einem Bereich zwischen 4% beim
CXF1103 und 36,2% positiven Zellen beim Xenograft CXF280. CD24 war auch bei allen
vier untersuchten Xenografts detektierbar, bei dreien lag der Anteil an positiven Zellen bei
durchschnittlich 6,6%, CXF1103 exprimierte dieses Antigen nur zu 0,6%. CD44 war auf
0,7-6,8% der Tumorzellen vorhanden. CXF280 ragte im Vergleich zu den anderen Xenografts mit 18,1% CDCP1 positiven Zellen heraus, während CXCR4 von keinem der untersuchten Xenografts exprimiert wurde.
5.3.2
Vergleich der Antigenexpression bei der Kolontumorzelllinie und dem korrespondierenden Xenograft
Vergleicht man die Zelllinie mit dem korrespondierenden Xenograft, so fand eine starke
Reduktion der Expression aller untersuchten Antigene CD133, CD44, CD24, CDCP1 sowie CXCR4 statt. Dies traf auf die größte Anzahl von Messungen zu, es gab allerdings
auch einzelne Ausnahmen. Bei drei von 11 Vergleichspaaren wurde CD133 im Xenograft
stärker exprimiert als bei der Zelllinie. In einem weiteren Xenograft waren sowohl CD24 als
auch CXCR4 in höherem Ausmaß als bei der entsprechenden Zelllinie vorhanden.
Die Darstellung der nun folgenden Zelllinien-Xenograft-Vergleiche orientiert sich am Expressionsverhalten des CD133 Markers.
5.3.2.1 Reduktion von CD133 im Xenograft um über 65%
In diese Kategorie fielen drei Vergleichspaare: CCL/CXF 94L, HT29 und SW480.
Dissertation Meike Schneider
73
Ergebnisse
% positive Zellen
100
94,3
85,9 84,6
86,0
80
60
40
27,9
20
6,0
0,2
3,1
2,3
0,0
0
CCL 94L (n=4)
CXF 94LX/6 (n=2)
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 41: Vergleich CCL 94L und CXF 94LX
95,6 96,0
% positive Zellen
100
85,9
80
60
40
38,0
36,2
20
0,0
6,3
5,3
9,9
0,0
0
CCL HT29 (n=4)
CXF HT29LX/8 (n=1)
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 42: Vergleich CCL HT29 und CXF HT29LX
92,4 97,9
% positive Zellen
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
23,5
0,2
9,6
3,5
0,0
CCL SW480 (n=4)
CD133
9,4
0,9
0,0
CXF SW480LX (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 43: Vergleich CCL SW480 und CXF SW480LX
Dissertation Meike Schneider
74
Ergebnisse
Bei diesen drei Vergleichspaaren zeigte sich bei 12 von 15 Expressionsvergleichen eine
Reduktion der Antigenexpression um mindestens 85%. Bei HT29 und SW480 war die Expressionsrate von CD24 im Xenograft um 58 bzw. 70% geringer. CD133 wurde bei CXF
94L um 68% weniger detektiert. CCL/CXF SW480 sticht durch die nahezu ausschließliche
Expression von CD44 und CD24 sowie durch Expression von CXCR4 bei der Zelllinie heraus.
5.3.2.2 Reduktion von CD133 um weniger als 65%
Bei vier Vergleichspaaren ging die Expression von CD133 um maximal 5-25% zurück
(DLD1, A293, HCT15, LOVO).
95,8 95,5
76,8
% positive Zellen
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
33,2
15,8 19,4
8,6
0,0
8,2
CCL DLD1 (n=4)
CD133
0,0
CXF DLD1LX/2 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 44: Vergleich CCL DLD1 und CXF DLD1LX
Bei DLD1 wurde CD133 in vivo um 5% weniger als in vitro exprimiert, auffallend war auch
die relativ geringere Reduktion des Markers CD24 (um 57%).
100
% positive Zellen
82,2
80
60
41,0
40
25,5
20
3,1
5,4
9,0
2,3
8,1
0,1
0,0
0
CCL A293 (n=4)
CD133
CXF A293LX/3 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 45: Vergleich CCL A293 und CXF A293LX
Dissertation Meike Schneider
75
Ergebnisse
A293 zeichnete sich durch die Expression einer Kombination zweier Antigene aus: CD44
und CXCR4. Mit 41% lag die Expression von CXCR4 im gesamten Zelllinienpanel am
höchsten. Dieses Phänomen trat auch in geringerem Ausmaß im Xenograftpanel auf, in
dem CXF 293LX mit einer Expressionsrate von 8,1% CXCR4 positiver Zellen eine Sonderstellung einnahm.
92,3
% positive Zellen
100
80
60
35,2
40
41,2
27,1
10,9
20
0,0
0,0
4,7
0,0
0,0
0
CCL HCT15 (n=4)
CD133
CXF HCT15LX/7 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 46: Vergleich CCL HCT15 und CXF HCT15LX
Weder die Zelllinie HCT15, noch das Xenograft HCT15LX exprimierte CD133 oder
CXCR4. Bei diesem Vergleichspaar stach die sehr hohe Expression von CDCP1 hervor,
während die Oberflächenmarker CD44 und CD24 in mittlerem Ausmaß vorhanden waren.
% positive Zellen
100
78,3
80
60
40,4
40
20
32,8
32,6
27,8
16,9
5,2
16,7
4,6
0,0
0
CCL LOVO (n=4)
CD133
CXF LOVO LX/5 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 47: Vergleich CCL LOVO und CXF LOVO LX
Dissertation Meike Schneider
76
Ergebnisse
Die CCL/CXF LOVO-Paar war insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass es hier zu
einer Zunahme der CD24- und CXCR4 Expression in vivo kam. CD24 war im Xenograft
über dreimal stärker exprimiert als in der Zelllinie und CXCR4 konnte ausschließlich in vivo
detektiert werden.
5.3.2.3 Zunahme der CD133 Expression im Xenograft
In drei Fällen kam es nach der Implantation der Zelllinie und Passage des Tumors zu einer
Zunahme des Anteils der CD133 exprimierenden Zellen. Dies war bei der KM20LZ, der
KM12 sowie der LS174 T der Fall.
92,9
100
% positive Zellen
82,7
80
60,8
60
40
20
30,1
10,6
6,6
4,2
0,0
9,4
0,0
0
CCL KM20LZ (n=4)
CD133
CXF KM 20LZLX/7 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 48: Vergleich CCL KM20LZ und CXF KM20LZLX
% positive Zellen
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
96,7 95,3
45,6
31,5
14,9
9,1
6,3
0,0
CCL KM12 (n=4)
CD133
13,5
0,0
CXF KM12LX/9 (n=1)
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 49: Vergleich CCL KM12 und CXF KM12LX
Dissertation Meike Schneider
77
Ergebnisse
% positive Zellen
100
92,0 89,3
96,3
80
53,4
60
35,0 32,7
40
20
0,0
0,0
0,2
0,0
0
CCL LS174T (n=4)
CD133
CD24
CXF LS174TLX/9 (n=1)
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 50: Vergleich CCL LS174T und CXF LS174TLX
Weil bei den allermeisten Messungen die Antigene in vivo deutlich niedriger detektiert
wurden, stachen diese drei Paare insbesondere hervor. KM20LZ und KM12 erreichten in
vivo eine Steigerung der Expression um 59% bzw. 63%, während beim Xenograft LS174T
CD133 mit 0,2% positiven Zellen neu exprimiert wurde. Die anderen Antigene waren im
Xenograft deutlich weniger vorhanden, CXCR4 wurde von keinem dieser CCL/CXF
exprimiert.
Dissertation Meike Schneider
78
Ergebnisse
5.3.3
Vergleich der Antigenexpression bei der CCL 269L , dem Zelllinien- sowie dem
direkt vom Patiententumor abgeleiteten Xenograft
120
% positive Zellen
100
97,1
86,0 86,1 83,5
80
60
40
20
11,3 5,8
0,0 3,3 1,2 0,4 0,0
0,0
2,4 2,8 0,0
0
CCL 269L (n=4)
CXF 269LX/4 (n=1)
CD133
CD24
CD44
CXF 269 20N11
(n=2)
CDCP1
CXCR4
Abbildung 51: Vergleich CCL 269L, CXF 269LX und CXF 269 20N11
Abbildung 51 zeigt ein Vergleich zwischen der CCL 269L, dem daraus abgeleiteten, sowie
dem direkt aus dem Patiententumor abgeleiteten Xenograft (siehe auch S. 51).
Vergleicht man diese drei Expressionsmuster, so stellt man auch hier eine deutliche
Abnahme der Expressionsrate in vivo fest. Das Xenograft, das direkt aus dem
Patiententumor wuchs, hatte vor allem eine höhere CD133 Expression. Die anderen
Antigene waren aber auch bis zu 7fach (CDCP1) stärker beim CXF269 20N11 vorhanden.
5.3.4
Statistische Korrelation der Antigene bei den Xenografts
Abbildung 52 zeigt die berechneten Korrelationskoeffizienten nach Spearman bei den Xenografts. Zwei dieser Koeffizienten fielen auf: es bestand ein Zusammenhang zwischen
der Expression von CDCP1 und CD44 (Rs= 0,543, p= 0,0035) sowie zwischen CDCP1
und CD24: bei letzterem zeigte sich der größte Korrelationskoeffizient mit 0,74 bei einem
p-Wert von 0,001. Auch hier diente die Messung von CD133 in zwei unterschiedlichen
Ansätzen als Positivkontrolle mit einem rs= 0,961 und einem p-Wert von 0. Dies zeigte,
dass mit dem CD133-Antikörper zuverlässig in beiden verwendeten Antikörperansätzen
(s.a. 4.6.4 und 5.1.6) gleich hohe Expressionsraten dieses Antigens detektiert wurden.
Dissertation Meike Schneider
79
Ergebnisse
Zellinhalte
Spearman Korrel. Koeff.
P-Wert
Anzahl der Proben
cd24
cd44
cdcp1
cxcr4
cd133_a
cd133_b
0,454
0,0861
15
0,74
0,00116
15
-0,254
0,353
15
0,157
0,566
15
0,268
0,325
15
0,543
0,0353
15
0,495
0,0576
15
0,0234
0,923
15
-0,0342
0,893
15
-0,211
0,441
15
-0,0316
0,903
15
0,0911
0,734
15
0,158
0,566
15
-0,0122
0,964
15
cd44
cdcp1
cxcr4
cd133_a
0,961
0
15
Abbildung 52: Statistische Korrelation der Antigene bei den Xenografts
5.3.5
Analyse von doppelt und dreifach positiven Zellen bei den Xenografts
Aufgrund der gleichzeitigen Inkubation mit drei Antikörpern war es möglich, CD133 positive Zellen auf ihre weitere Expression von CD44/CD24 bzw. CDCP1/CXCR4 hin zu analysieren. Bei allen CD133 exprimierenden Xenograftzellen konnten doppelt- und dreifachpositive Zellen identifiziert werden.
Die Ergebnisse werden dargestellt nach dem Anteil an Zellen, die dreifach positiv, d.h.
CD133, CD24 und CD44 exprimierten. Die in % angegebenen Zellzahlen in den Diagrammen beziehen sich auf die gemessene Gesamtzellzahl von 200.000 je Messung.
5.3.5.1 Anteil der dreifachpositiven Zellen im Xenograft <1%
In den Xenografts 1103 sowie 94L war der Anteil an Zellen, die mehr als eines der Antigene exprimierten, prozentual niedrig.
CXF1103 6N1
Anteil in % positive Zellen, n=2
99,63
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
0,05
0,0
0,14
übrige Zellen
0,18
Abbildung 53: Mehrfach positive Zellen im CXF1103 6N1
Dissertation Meike Schneider
80
Ergebnisse
Am wenigsten dreifach positive Zellen waren im CXF 1103 zu detektieren (siehe Abbildung
53): hier exprimierten 0,65% der Zellen die Marker CD133, CD24 und CD44 gleichzeitig.
CXF 94L/6
Anteil in % positive Zellen, n=2
94,34
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
2,59
0,65
0,58
1,84
Abbildung 54: Mehrfach positive Zellen bei CXF94L
Beim CXF 94L waren es 1180 Zellen, die gleichzeitig CD133, CD24 und CD44 exprimierten. Doppelt positive Zellen waren im Bereich zwischen 0,58 bis 2,59% vorhanden (siehe
Abbildung 54).
5.3.5.2 Anteil der dreifachpositiven Zellen im Xenograft bei 1-2%
Bei fünf der untersuchten Xenografts lag der Anteil dreifach positiver Zellen zwischen einem und zwei Prozent.
CXF269 20N11
Anteil in % positive Zellen, n=2
94,94
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
1,82
1,1
0,15
1,99
Abbildung 55: Mehrfach positive Zellen bei CXF 269 20N11
Dissertation Meike Schneider
81
Ergebnisse
CXF HT29LX/8
Anteil in % positive Zellen, n=1
94,14
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
1,35
2,02
0,12
2,36
Abbildung 56: Mehrfach positive Zellen bei CXF HT29LX
CXF243 17N12
Anteil in % positive Zellen, n=2
92,23
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
1,92
2,72
0,0
übrige Zellen
3,13
Abbildung 57: Mehrfach positive Zellen bei CXF 243 17N12
CXF KM20LX/7
Anteil in % positive Zellen, n=1
89,46
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
1,83
2,55
0,04
6,11
Abbildung 58: Mehrfach positive Zellen bei CXF KM20LX
In dieser Gruppe Xenografts war bei jedem der Tumoren die Gruppe der CD133/CD44
exprimierenden Zellen am geringsten (durchschnittlich 0,06%) , während die CD133/CD24
Dissertation Meike Schneider
82
Ergebnisse
bzw. CD133/CDCP1 tragenden Zellen Populationen im Bereich zwischen 1,99-8,7% bzw.
1,1-7,56% hatten.
CXF280 16N8
Anteil in % positive Zellen, n=2
66,51
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
7,56
0,0
1,13
8,7
Abbildung 59: Mehrfach positive Zellen bei CXF280 16N8
5.3.5.3 Anteil der dreifachpositiven Zellen bei 5-6%
Die Xenografts DLD1 und LOVO hatten ca. 5% dreifach positive Zellen, während doppelt
positive Populationen zusätzlich in unterschiedlichem Ausmaß vorhanden waren.
CXF DLD1 LX/2
Anteil in % positive Zellen, n=1
6 6,51
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
5,5
5,92
0,0
2,12
Abbildung 60: Mehrfach positive Zellen bei CXF DLD1LX
CXF LOVO LX/5
Anteil in % positive Zellen, n=1
65,3
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
11,62
5,98
16,11
1
Abbildung 61: Mehrfach positive Zellen bei CXF LOVO LX
Dissertation Meike Schneider
83
Ergebnisse
Von allen untersuchten Xenografts hatte das CXF LOVO den größten Anteil sowohl an
doppelt positiven Zellen für CD133/CD44, als auch für CD133/CDCP1 (16,11 bzw.
11,62%).
5.3.5.4 Anteil dreifachpositiver Zellen im Xenograft liegt bei 10%
Beim CXF KM12 war der Anteil an dreifach positiven Zellen mit 10,04% am höchsten. Neben dieser Population konnte eine weitere Gruppe an CD133/CD24 positiven Zellen entdeckt werden, deren Anteil bei 3,49% bei 200.000 gezählten Zellen lag.
CXF KM12 LX/9
Anteil in % positive Zellen, n=1
86,47
CD133/CD44/CD24
CD133/CD24
CD133/CD44
CD133/CDCP1
übrige Zellen
0,0
3,49
0,0
10,04
Abbildung 62: Mehrfach positive Zellen im CXF KM12 LX
Zusammenfassend ist für die Analyse der doppelt und dreifach positiven Zellen festzuhalten, dass der Anteil jener Zellen, die gleichzeitig mehrere der untersuchten Proteine
exprimierten sehr unterschiedlich war. CD133/CD24/CD44 dreifach positive Zellen hatten
einen Anteil an der Gesamtzellzahl zwischen 0,05-10,4%, der Durchschnitt lag bei 3,03%.
Die Spannbreite der Expressionsrate bei den CD133/CD24 positiven Zellen war mit 0,18
und 8,7% auch groß, der Durchschnitt war bei 3,09%. CD133 und CD44 war durchschnittlich bei 1,71% der Xenograftzellen gleichzeitig vorhanden (0-16,11%). Die Antigenkombination CD133/CDCP1 hatte bei den untersuchten Xenografts einen mittleren Anteil von
4,2%.
5.4
Genexpressionsanalyse mit Affymetrix Genchips ®
Mit Hilfe des Genchips „Human Genome U133 Plus 2.0 Array“ wurde die Expressionsstärke der untersuchten Antigene auf mRNA -Ebene ermittelt. Auf diese Weise konnte eine
Korrelationsanalyse der Antigene auf mRNA-Ebene, analog zu Abschnitt 5.3.4, durchgeführt werden. In dieser Affymetrix Genchip Analyse wurden acht der insgesamt in der vor-
Dissertation Meike Schneider
84
Ergebnisse
liegenden Arbeit untersuchten 15 Xenografts berücksichtigt. Für diese acht Xenografts
wurde zusätzlich der Korrelationskoeffizient auf Proteinebene aus den FACS-Ergebnissen
berechnet.
Tabelle 11 zeigt die ermittelten Zusammenhänge zwischen der mRNA von CD44, CD24
und CD133, wobei sich ein statistisch hoch signifikanter Zusammenhang zwischen der
Expression von CD44 bzw. CD24 und CD133 herausstellte. Der größte Korrelationskoeffizient wurde hierbei für die Expressionsstärke auf mRNA-Niveau zwischen CD44 und
CD133 ermittelt (rs=0,952, p=0). .
Tabelle 11: Korrelation zwischen CD44 bzw. CD24 und CD133
Zellinhalte
Spearmankoeffizient
p-Wert
Anzahl der Proben
CD44 mRNA
CD133 mRNA
0,952
0
8
CD24 mRNA
0,81
0,0096
8
Weiterhin konnte zwischen CD44 und CD24 eine statistisch signifikante Korrelation sowohl
auf mRNA- als auch auf Proteinebene berechnet werden (siehe Tabelle 12).
Tabelle 12: Korrelation zwischen CD44 und CD24
Zellinhalte
Spearmankoeffizient
p-Wert
Anzahl der Proben
CD44 mRNA
CD24 mRNA
0,881
0
8
CD44 Protein
CD24 Protein
0,833
0,00526
8
Wie in Tabelle 13 zu sehen, korrelierte die Expression des CD44-Antigens positiv mit der
des CDCP1-Antigens ( rs= 0,786, p-Wert= 0,0149)
Tabelle 13: Korrelation zwischen CD44 und CDCP1
Zellinhalte
Spearmankoeffizient
p-Wert
Anzahl der Proben
Dissertation Meike Schneider
CD44 Protein
CDCP1 Protein
0,786
0,0149
8
85
Ergebnisse
5.5
Sortierung der CCL SW620 auf CD133
Das Ziel der Arbeit lag unter anderem darin, Stammzellmarker auf Krebszellen des kolorektalen Karzinoms zu identifizieren.
In diesem Teil der Arbeit sollte überprüft werden, ob CD133 exprimierende Zellen der Zelllinie SW620 höhere tumorigene Eigenschaften besitzen, als Tumorzellen, die dieses Antigen nicht besitzen. Mit einem speziellen Zytometer wurden die CD133 exprimierenden
Zellen von denen getrennt, die dieses Antigen nicht auf ihrer Oberfläche tragen. Danach
wurden Zellpopulationen mit jeweils 104 und 105 Zellen subkutan auf jeweils 5 SCID Mäuse implantiert und in ihrer Fähigkeit, einen Tumor zu bilden, beobachtet.
5.5.1
Ergebnis der Wachstumsstudie: SW620
Während aus 104 Zellen bei keinem der Tiere ein Tumor entstand, war dies aber bei 105
Zellen der Fall. In jeder Versuchsgruppe entstanden Xenografts.
In der Kontrollgruppe, in der die Zelllinie mit 105 unsortierten Zellen implantiert wurde, entstand bei drei der fünf Tiere ein Tumor, die Angangsrate war demnach 3/5. Wie in
Abbildung 63 zu sehen, war ein Tumorwachstum primär nach 42 Tagen bei diesen Mäusen zu beobachten.
1200
4566 l
4567 l
4568 l
1000
800
600
4569 l
4570 l
MEDIAN
400
200
88
74
63
56
49
42
36
30
24
18
12
6
0
0
Absolutes
Tumorvolumen [mm3]
Wachstum CD133 unsortierter
SW620 Zellen
Tage nach Implantation
Abbildung 63: Wachstum unsortierter SW620 Zellen
Das größte Tumorvolumen wurde bei Tier Nummer 4570I erreicht: am Tag 56 maß das
Xenograft 538 mm3. Nach Tag 56 überlebten nur jene Tiere, bei denen kein Tumor wuchs.
Abbildung 64 zeigt das Wachstumsverhalten von SW620 Zellen, die den Marker CD133
nicht exprimierten. Die Angangsrate mit 3/5 war hier gleich hoch wie in der Kontrollgruppe.
Dissertation Meike Schneider
86
Ergebnisse
1200
4576 l
4577 l
4578 l
4579 l
4580 l
MEDIAN
1000
800
600
400
200
88
74
63
56
49
42
36
30
24
18
12
6
0
0
Absolutes
Tumorvolumen [mm3]
Wachstum CD133 negativer
SW620 Zellen
Tage nach Implantation
Abbildung 64: Wachstum CD133 negativer Zellen
Die Maus mit der Nummer 4578I brachte den größten Tumor (1736mm3) nach 56 Versuchstagen hervor, während die anderen beiden Tumoren in diesem Zeitraum kleiner als
500mm3 blieben (381 bzw. 499 mm3).
Im Gegensatz zu den beiden oberen Versuchsgruppen entwickelte jedes Versuchstier mit
105 CD133 positiven SW620 Zellen einen Tumor: am Tag 39 war hier ein Xenograft mit
der medianen Größe von 156,8 mm3 zu beobachten (siehe Abbildung 65). In dieser Versuchsgruppe entstanden bis Tag 46 Tumore bis zu einer Größe von 1044 mm3.
1200
4571 l
4572 l
4573 l
4574 l
4575 l
MEDIAN
1000
800
600
400
200
88
74
63
56
49
42
36
30
24
18
12
6
0
0
Absolutes
Tumorvolumen [mm3]
Wachstum CD133 positiver
SW620 Zellen
Tage nach Implantation
Abbildung 65: Wachstum CD133 positiver Zellen
Dissertation Meike Schneider
87
Ergebnisse
5.5.2
Statistische Auswertung der Wachstumsstudie: SW620
Um das Wachstumsverhalten der einzelnen Zellpopulationen besser vergleichen zu können zeigt Abbildung 66 eine Übersicht der Mediane dieser drei Versuchsgruppen.
1200
1000
MEDIAN
CD133+
800
600
MEDIAN
CD133-
400
MEDIAN
UNSORTIERT
200
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
46
49
53
56
60
63
67
74
81
Absolutes Tumorvolumen
[mm3]
Übersicht
Tage nach Implantation
Abbildung 66: Übersicht: Wachstumsverhalten verschiedener SW620Zellpopulationen
Die statistische Analyse ergab einen signifikanten Unterschied im Wachstumsverhalten
der unterschiedlichen Gruppen.
Im t-Test zeigten die Vergleiche CD133+/CD133- und CD133+/unsortiert einen statistisch
signifikanten Unterschied im Wachstumsverhalten der CD133 exprimierenden Zellen: mit
einer Wahrscheinlichkeit von >99% waren CD133+ SW620 Zellen tumorigener (p jeweils
<0,001) als diejenigen Zellen, die das Antigen nicht exprimieren bzw. unsortiert implantierte SW620 Zellen.
Der t-Test für CD133-/unsortierte Zellen ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied
im Wachstumsverhalten (p=0,888) dieser beiden Gruppen.
Die Varianzanalyse bestätigte auf demselben Signifikanzniveau von 5% das signifikant
proliferativere Wachstum der CD133+ Zellen gegenüber den beiden anderen Gruppen.
5.5.3
Expression der Antigene bei den Xenografts aus der Wachstumsstudie
Nachdem aus den 105 implantierten SW620 Zellen Tumore entstanden sind, galt es, diese
wie in Abschnitt 4.6.2 beschrieben auf ihr Stammzellmarkerprofil hin zu analysieren.
Dissertation Meike Schneider
88
Ergebnisse
Die Reproduzierbarkeit dieses Profils war bei Messung mehrerer dieser Xenografts sehr
hoch, denn die Standardabweichung lag in allen Fällen <4%.
Abbildung 67 und Abbildung 68 zeigen die Expression der Antigene CD133, CD24, CD44,
CDCP1 sowie CXCR4 bei den Xenografts, die aus unsortierten SW620 Zellen entstanden.
Knapp 30% der Xenograftzellen exprimierten jeweils CD133, CD24 bzw. CDCP1, während
CD44 nur bei 1,83% der Zellen detektiert wurde. Der Anteil an doppelt positiven Zellen für
CD133/CD24 bzw. CD133/CDCP1 lag für beide Kombinationen hier innerhalb aller in der
vorliegenden Arbeit untersuchten Xenografts am höchsten (16,71 bzw. 19,34%).
% positive Zellen
100
80
60
40
28,91
27,81
20
26,07
1,83
0
0
CXF aus unsortierten SW620 Zellen
n=1
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 67: Einfach positive Zellen im Xenograft aus unsortierten SW620 Zellen
CXF aus unsortierten SW620 Zellen
Anteil in % positive Zellen, n=1
63,95
19,34
16,71
CD133/CD24
CD133/CDCP1
übrige Zellen
Abbildung 68: Doppelt positive Zellen im Xenograft aus unsortierten SW620 Zellen
Abbildung 69 bis Abbildung 72 geben die Antigenexpression bei den Xenografts wieder,
die aus CD133- bzw. CD133+ Zellen gewachsen sind. Das Ergebnis zeigt eine ähnliche
Verteilung der untersuchten Proteine. CD133 und CDCP1 wurde von etwa 15% der Zellen
exprimiert, CD24 von 9%, ein kleiner Anteil von 1-2% trug CD44 auf der Oberfläche.
Dissertation Meike Schneider
89
Ergebnisse
% positive Zellen
100
80
60
40
16,35
15,19
20
9,06
1,27
0,00
0
CXF aus CD133+ SW620 Zellen
n=3
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 69: Einfach positive Zellen in Xenografts aus CD133+ SW620 Zellen
CXF aus CD133+ SW620 Zellen
Anteil in % positive Zellen, n=3
81,15
8,81
10,04
CD133/CD24
CD133/CDCP1
übrige Zellen
Abbildung 70: Doppelt positive Zellen in Xenografts aus CD133+ SW620 Zellen
Mit ca. 10% doppelt positiven Xenograftzellen für CD133/CD24 bzw. CD133/CDCP1 hatten diese untersuchten Xenografts im Vergleich zu den anderen Xenografts (siehe auch
5.3.5) einen relativ großen Anteil an doppelt positiven Zellen.
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war sehr hoch mit berechneten Standardabweichungen von <5%.
Dissertation Meike Schneider
90
Ergebnisse
% positive Zellen
100
80
60
40
14,99
14,19
20
9,46
1,50
0,00
0
CXF aus CD133- SW620 Zellen
n=2
CD133
CD24
CD44
CDCP1
CXCR4
Abbildung 71: Einfach positive Zellen bei Xenografts aus CD133- SW620 Zellen
Xenografts aus CD133- SW620 Zellen
Anteil in % positive Zellen, n=2
84,65
8,18
CD133/CD24
CD133/CDCP1
7,17
übrige Zellen
Abbildung 72: Doppelt positive Zellen bei Xenografts aus CD133- SW620 Zellen
Dissertation Meike Schneider
91
Diskussion
6
Diskussion
Obwohl es die Idee der Tumorstammzellen schon seit mehreren Jahrzehnten gibt, wurde
deren tatsächliche Existenz erst in den letzten zehn Jahren bewiesen. Technische Fortschritte wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von FACS-Antikörpern und Xenotransplantationsversuche mit immunsupprimierten Mäusen trugen wesentlich zu dieser Entwicklung
bei. Neben diesen technischen Innovationen gab es viele neue Erkenntnisse in der grundlegenden gewebespezifischen Tumor- und Stammzellbiologie. Zusammen führten beide in
den letzten Jahren zu Meilensteinen der zielgerichteten Tumortherapie.
Die Frage der Stammzellcharakterisierung beim Kolorektalen Karzinom und die damit verbundene Aussicht der Entwicklung zielgerichteter Therapien waren die treibende Kraft für
die Entstehung dieser Arbeit.
6.1
Umsetzung der Fragestellung
Das Ziel der Arbeit war, ein großes Panel von 15 verschiedenen Tumorzelllinien und die
daraus abgeleiteten humanen Xenografts auf das Vorhandensein der Antigene CD133,
CD44, CD24, CDCP1 und CXCR4 hin zu untersuchen. Für diese Fragestellung schien ein
FACS-Gerät das geeignete Untersuchungsinstrument zu sein. Das Cytomics FC500 bot
dabei den Vorteil der gleichzeitig möglichen Detektion von fünf verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen bei zusätzlich einer hohen Zelldurchflussrate (ca. 500 Zellen/s). Auf diese
Weise konnten in relativ kurzer Zeit verschiedene Oberflächenmarker auf einzelnen Zellen
nachgewiesen werden. Dabei bietet die gleichzeitige Messung mehrerer Farben den Vorteil, Zellen auf Doppelt- und Dreifachpositivität hin zu untersuchen. In den beiden Ansätzen
CD133/CD44/CD24 und CD133/CDCP1/CXCR4 wurde jeweils die CD133+ Population
gegatet und für deren Expression der weiteren Marker hin analysiert.
Bei jeder Antikörperfärbung ist die Analyse der Spezifität des Antikörpers erforderlich. Es
muss dabei der Signalanteil bestimmt werden, der nicht durch eine Interaktion von Antigen
und Bindungsstelle des Antikörpers, sondern z.B. durch Interaktion des Fluorochroms oder
Fc-Rezeptorteils mit dem Antigen entsteht. Um diese unspezifische Bindung zu detektieren, kommen klassischerweise Isotypkontrollen zum Einsatz. Ein Isotypantikörper ist ein in
seiner Spezifität irrelevanter Antikörper des gleichen Isotyps (z.B. IgG1, IgG2a, IgG2b).
{70} Durch dessen Verwendung konnte so die unspezifische Bindung detektiert und in der
Auswertung berücksichtigt werden.
Ein nicht geringes Problem bei Mehrfarbenanalysen am Durchflusszytometer stellt die
spektrale Überlappung der Farbstoffe dar. Die eingesetzten Farbstoffe überschneiden sich
in ihren Emissionsspektren, so dass dann in einem einzelnen Kanal jeweils eine Mischung
verschiedener Anteile von Farbstoffen detektiert werden. Die Lösung dieses Problems liegt
Dissertation Meike Schneider
92
Diskussion
in der Kompensation, einer Korrektur dieser spektralen Überlappung. {70} Dazu wurde das
Emissionspektrum jedes einzelnen Fluoreszenzantikörpers einzeln im Gerät gemessen
und hinterher mit den anderen „verrechnet“.
Aus den implantierten Tumorzelllinien entstanden dreidimensionale Xenografts, die erneut
im Zytometer analysiert werden sollten. Die Aufgabe bestand darin, aus einem soliden
Gewebe wieder eine Einzelzellsuspension zu generieren. Der in einem Standardassay in
der Oncotest verwendete Enzymcocktail mit vier Enzymen (DNAse, Hyaluronidase, Proteinase und Kollagenase) stellt zuverlässig die gewünschten Einzelzellen her. Die Inkubation
der Enzyme mit Tumorzelllinien ergab, dass die Antigene zum größten Teil nicht abgebaut
werden, so dass die Enzyme für das Herstellen der Einzelzellsuspension aus den Xenografts geeignet waren. Ein weiterer Punkt bei der Analyse der Xenografts war die Tatsache, dass bei den auf der Maus gewachsenen Tumoren ein geringer Anteil an murinen
Zellen enthalten ist. Der Anteil dieser Zellen beträgt <10%, was sich in anderen Testungen
der Oncotest zeigte. Angesichts des geringen Mauszellanteils und der besseren Vergleichbarkeit mit den Kompensationseinstellungen, die bei den Zelllinien verwendet wurden, verzichtete man auf eine spezifische Anfärbung der murinen Zellen im FACS-Gerät.
Ferner wurden die verwendeten Antikörper als monoklonal und spezifisch für humane Antigene beschrieben.
Neben dem Vergleich des Expressionsprofils in vitro/ in vivo war die Sortierung einer Zelllinie auf einen bestimmten Oberflächenmarker hin angestrebt. Dazu wählte man das Antigen CD133 aus, das etwa auf der Hälfte der SW620 Zellen exprimiert wurde. Das Augenmerk lag bei diesem Versuch in der Beobachtung des Wachstumsverhaltens der unterschiedlichen Zellpopulationen.
6.2
Evaluation der Versuchsergebnisse
Zur Bestätigung der ermittelten Daten wurde die Messung der Zelllinien in mindestens vier,
bei den Xenografts in ein oder zwei zeitlich unabhängigen Messungen bestätigt. Aufgrund
von technischen Schwierigkeiten musste die Farbkompensation des Facs-Protokolls zwischen der zweiten und dritten Zelllinienmessung völlig neu eingestellt werden. Der Vergleich zwischen den beiden ersten und der dritten und vierten Zelllinienmessung zeigte
praktisch keinen Unterschied. Diese Tatsache bestätigte die Genauigkeit der FACSMessung und schloss eine rein „zufällige“ Kompensation aus.
Neben dieser internen Qualitätskontrolle wurde auch eine Vergleichsmessung an einem
FACS-Gerät (des Herstellers Becton Dickinson) in einem anderen Labor durchgeführt.
Dazu wurden die zwei Zelllinien HT29 und HCT116 am gleichen Tag an beiden Geräten
gemessen. Es zeigten sich Unterschiede der Expressionsrate im Bereich von durchschnitt-
Dissertation Meike Schneider
93
Diskussion
lich 7,5%, was bei der Messung an unterschiedlichen Geräten als normal angesehen werden konnte.
Letztendlich konnte durch die Wiederholungsmessungen und die niedrigen Standardabweichungen (<10% bei 108/120 ZL-Messungen und <5% bei den Xenografts) bestätigt
werden, dass jedes der Antigene CD133, CD44, CD24, CDCP1 und CXCR4 konstant auf
den Tumorzellen vorhanden und auch detektierbar war.
6.3
Interpretation der Ergebnisse
Das Konzept der Krebsstammzelle ist sehr ansprechend: sie ist eine Zelle, die den Tumor
bildet und folglich bei der Therapie zerstört werden muss. Um dieses übergeordnete Ziel
zu erreichen, müssen diese Stammzellen zunächst identifiziert und charakterisiert werden.
In der vorliegenden Arbeit konnten zunächst 15 verschiedene Kolontumorzelllinien auf
Oberflächenmarker analysiert werden, die aktuell als Tumorstammzellmarker beim kolorektalen Karzinom diskutiert werden. Jede Zelllinie und auch jedes Xenograft hatte seine
eigene für sich spezifische Kombination der beschriebenen Oberflächenmarker CD133,
CD44, CD24, CDCP1 und CXCR4. In den aus diesen Zelllinien abgeleiteten Tumoren sowie auch in den direkt aus dem Patiententumor etablierten Xenografts wurden diese Antigene in den allermeisten Fällen in deutlich geringerem Ausmaß nachgewiesen. Der potentielle Stammzellanteil ist also in vivo deutlich geringer als in vitro. Warum ist das so?
Es besteht die Hypothese, dass die Tumorzellen der Tumorzelllinie eher Stammzelleigenschaften besitzen und deshalb diese Marker höher exprimieren. Die beiden Oncotestzelllinien exprimierten den in der neueren Literatur gut beschriebenen Stammzellmarker
CD133 im Vergleich zu den kommerziell erworbenen ZL am höchsten. Dies könnte daran
liegen, dass diese ZL in niedrigen Passagen kultiviert werden und somit einen hohen
Stammzellanteil beibehalten. Im Tumor entsteht bei der Ausbildung des dreidimensionalen
Gewebes ein Differenzierungsprozess, bei dem die Tumorstammzellen differenziertere
Nachkommenzellen bilden. Der Vorgang ist mit dem Differenzierungsprozess bei der Hämatopoese vergleichbar und die Anzahl der Stammzellen nimmt bezogen auf die Gesamtzellzahl ab. Diese Vorstellung folgt dem in Abschnitt 2.1 beschriebenen Stammzellmodell
der Tumorentstehung, bei dem davon ausgegangen wird, dass sich Tumorgewebe wie ein
„Organ“ verhält, in dem es unterschiedliche Differenzierungsstufen der Tumorzellen gibt
und der Tumor aus Tumorstammzellen entsteht. Dieses Modell ist mit den Versuchsergebnissen der vorliegenden Arbeit vereinbar. Könnte es sein, dass eine niedrigere Expressionsrate der Antigene vorliegt, weil die restlichen Zellen im Xenograft Mauszellen
sind? Diese Begründung kann im Prinzip ausgeschlossen werden, denn im Xenograft vorkommende Mausstromazellen machen gemessen an der Gesamtzellzahl des Tumors einen sehr geringen Anteil aus (<10%). Wenn die durchschnittliche Expressionsrate der unDissertation Meike Schneider
94
Diskussion
tersuchten Antigene bei den Xenografts also zwischen 0,5% (CXCR4) und 16,2% (CD24)
liegt, sind es nicht die noch im Tumor enthaltenen Mausstromazellen, die den Rest der
gemessenen „negativen“ Zellen ausmachen.
Für hämatopoetische Stammzellen ist bekannt, dass die Umgebung, die sog. „Nische“, die
Fähigkeit zur Reifung und Differenzierung der Stammzellen beeinflusst. Knochenmarkstammzellen benötigen diese Nische für die Bewahrung ihrer Stammzellzellfunktion. {48}
Über die Interaktion von soliden Tumorzellen mit Nischenzellen ist noch weniger bekannt.
Für CD133+ Krebsstammzellen aus Gehirntumoren konnte gezeigt werden, dass diese
einen engen Kontakt mit vaskulären Endothelzellen haben. Im Gegensatz dazu hatten die
CD133- Zellen signifikant weniger Kontakt mit vaskulären Strukturen. Aus diesen Endothelzellen sekretierte Faktoren förderten die Stammzelleigenschaften der CD133+ Zellen.
{20} Dieses Beispiel hebt die Wichtigkeit der Umgebung („Microenviroment“) für das Verhalten von Zellen hervor. Auch beim kolorektalen Karzinom gibt es eine Vielzahl von Interaktionen mit Nischen- und anderen Zellen (siehe auch Abschnitt 1.2.4). Welche Auswirkungen das „Microenvironment“ und die Nischenzellen bei der Histopathogenese des KRK
genau haben, ist noch nicht bekannt. Es darf aber angenommen werden, dass der Beeinflussung durch umliegende Zellen eine hervortretende Bedeutung zukommt und das Microenvironment auch (mit-) verantwortlich dafür sein kann, dass die Antigenexpression bei
den Xenografts in den meisten Fällen niedriger, in manchen Fällen aber auch höher als bei
den Zelllinien ist. (siehe Ergebnisteil Abschnitt 5.3.2) Möglicherweise wäre die Expressionsrate dieser Antigene bei orthotoper Implantation im Vergleich zur subkutanen aufgrund
eines vollkommen andersartigen Microenvironment unterschiedlich. CXCR4 zum Beispiel
spielt in der Tumorprogression und –metastasierung eine Rolle. (siehe auch Abschnitt
1.3.6) Dass die untersuchten Xenografts zum größten Teil kein CXCR4 exprimieren,
könnte daran liegen, dass die Tumore subkutan auf der Maus wuchsen und primär an dieser Stelle kein CXCR4 für das Überleben benötigten. Es ist gut möglich, dass die in der
vorliegenden Arbeit beschriebenen Stammzellmarker im Microenvironment der Histologie
und des Selbsterneuerungsprozesses des Kolons (siehe den Abschnitten 1.2.3 und 1.2.4)
eine bedeutende Rolle spielen und eine entscheidende Funktion in der Tumorigenese haben.
Betrachtet man einen Tumor als ein dreidimensionales „Organ“, das durch Ausdifferenzierung von Stammzellen gebildet wird, so bedeutet dies nicht automatisch, dass der Differenzierungsprozess anhand von Zelloberflächenmarkern verfolgt werden kann.
Diese
spielen zwar in der Organisation der Zelle eine übergeordnete Rolle, aber deren Beschreibung ist eine erste Annäherung zur Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen und in
ihrer Aussage bezüglich Stammzellcharaktereigenschaften beschränkt. Dennoch wurde
die Hypothese, dass es eine Stammzellpopulation gibt, die ausdifferenziert und dabei ihre
Dissertation Meike Schneider
95
Diskussion
Oberflächenantigenstruktur verändert, bereits bei hämatologischen Neoplasien bewiesen.
Das Multiple Myelom (MM) zum Beispiel besteht hauptsächlich aus ausdifferenzierten malignen CD138+ Plasmazellen. Es enthält aber auch eine kleine Subpopulation (<5%) an
CD138- Zellen, die Oberflächenmarker der früheren B-Zellentwicklung exprimieren (CD19,
CD20). CD138- Zellen aus Patientenproben hatten ein höheres proliferatives Potential in
vitro und in vivo in der NOD/SCID-Maus, während CD138+ Zellen kein klonogenes Potential aufwiesen. Dies kann dadurch erklärt werden, dass CD138+ Plasmozytomzellen terminal differenziert und dadurch unfähig sind zu proliferieren. {52} In weiteren Studien konnte
gezeigt werden, dass auch zwei MM-ZL (RPMI 8226, NCI-H929) eine kleine Population an
CD138- Zellen enthält, die bei etwa 0,8-1,9% liegt. Diese Zellen sind „side population cells“
mit bestimmten Effluxtransportern für den Hoechstfarbstoff 33342 und haben eine signifikant höhere Aldehyddehydrogenaseaktivität als die übrigen Tumorzellen der Zelllinien.
Beides sind Eigenschaften, die typisch für Stammzellen sind und diese resistenter gegenüber Chemotherapeutika machen. Die Effluxpumpen transportieren diese Stoffe schneller
wieder aus der Zelle hinaus bzw. inaktivieren diese durch die Aldehyddehydrogenase.
Außer beim Plasmozytom konnte eine phänotypisch unterschiedliche Krebsstammzellpopulation auch bei der CML, der AML, der ALL und beim myelodysplastischen Syndrom
nachgewiesen werden. {53} Wie auch schon im Abschnitt 2.1 beschrieben waren es ursprünglich die hämatologischen Erkrankungen (AML), bei denen Krebsstammzellen zuerst
identifiziert wurden und möglicherweise gilt dieses Konzept auch für solide Tumoren.
Neben dem Vergleich der Antigenexpression in vitro/in vivo standen noch weitere Aspekte
im Mittelpunkt. In der Arbeit untersucht werden sollte auch, ob die einzelnen Antigene etwas miteinander zu tun haben könnten. Dazu wurde für die Antigene eine Korrelationsanalyse nach Spearman auf Proteinebene für die Zelllinien und Xenografts durchgeführt. Für
einige Xenografts konnte weiterhin nach der Affymetrix-Analyse der mRNA-Level in Zusammenhang gestellt werden.
Während die Korrelationsanalyse nach Spearman bei den Zelllinien keinen signifikanten
Zusammenhang bei der Expression der einzelnen Marker ergab, zeigte sich dieser bei den
Xenografts: tendenziell zeigen sich höhere Korrelationskoeffizienten und durchschnittlich
niedrigere p-Werte (0,45 versus 0,55) als bei den Zelllinien. Dies zeigt, dass bei den Xenografts prinzipiell eine höhere Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Expression einzelner
untersuchter Antigene miteinander zusammenhängt. Einerseits sind die Tumorzellen im
Gegensatz zu den Zellkulturbedingungen in vivo einer völlig unterschiedlichen Umgebung
ausgesetzt, andererseits kann es durch Ausdifferenzierung des Stammzellen zu dieser
beschriebenen Korrelation kommen.
Die größte Korrelation auf Proteinebene wurde in der Expression zwischen CD24 und
CDCP1 ermittelt (rs= 0,74, p= 0,001). CD24 einerseits ist ein Oberflächenprotein, das in
Dissertation Meike Schneider
96
Diskussion
der Zelladhäsion eine Rolle spielt: die Tumorzelle bindet mittels CD24 an P-Selektin (zum
Beispiel an Endothelzellen) und kann so in ein Gewebe „einwandern“ (siehe auch Abschnitt 1.3.4). CDCP1 andererseits wird von src-Kinasen phosphoryliert, die insbesondere
bei Tumorzellen wichtig für Proliferation und Migration sind. Durch die erhöhte Phosphorylierung von CDCP1 erhält die Krebszelle die Fähigkeit, unabhängig eines Zellverbandes zu
existieren (siehe auch Abschnitt 1.3.5). Man könnte sich vorstellen, dass die Tumorzelle
durch CDCP1 alleine „lebensfähig“ wird und mit Hilfe von CD24 über die Endothelzelle ins
Gewebe übertreten kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass src-Kinasen nicht nur in
der Signaltransduktion von CDCP1, sondern auch des aktivierten CD24 involviert sind.
{72} Es könnten daher Src-Kinasen sein, die eine gleichsinnige Beziehung zwischen CD24
und CDCP1 bedingen und diese Hypothese wird durch die positive Korrelation der beiden
Expressionsmuster unterstützt.
Neben der Korrelation auf Proteinebene wurden auch positive Korrelationen auf mRNAEbene mit Hilfe des Affymetrix-Genchips nachgewiesen. Es gab einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der mRNA von CD24 bzw. CD44 und dem mRNA-Level
von CD133. Auf der einen Seite konnte für CD133+ Zellen gezeigt werden, dass sie auf
Wnt-Signale reagieren und es bei bestimmten Wnt-Faktoren zu einer Anhäufung von ßCatenin im Zytoplasma und Zellkern kommt. ({57}, siehe auch Abschnitt 1.3.2) Dies zeigt,
dass es einen Zusammenhang zwischen dem für das Kolonkarzinom bedeutenden WntSignalweg und der Expression von CD133 gibt. Auf der anderen Seite wurde auch ein
Zusammenhang zwischen dem Wnt-Signalweg und der Expression von CD44 nachgewiesen: die Blockade dieses Signalweges führt zu einer Abwesenheit dieses Antigens. {88}
Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass die Wnt-Signalkaskade sowohl mit der Expression
von CD133, als auch mit CD44 in Verbindung steht und es möglicherweise einen gemeinsamen Regulationsmechanismus gibt. Diese Hypothese wird zum einen durch den positiven Korrelationskoeffizienten (rs= 0,905, p= 0) der beiden Antigenen unterstützt. Zum anderen konnten weiterhin bei der Analyse von doppelt und dreifach positiven Tumorzellen
durchschnittlich 1,71% Zellen identifiziert werden, die gleichzeitig CD133 und CD44 exprimieren. Zusammengefasst sprechen für einen Zusammenhang einzelner Antigene, die als
statistisch signifikant berechneten Korrelationskoeffizienten, aber auch molekulare Signalwege, die bei beiden betroffenen Antigenen zentral involviert sind.
Möglicherweise sind die innerhalb der Xenografts gefundenen kleinen doppelt- und dreifach positiven Zellpopulationen diejenigen Zellen, die nach dem in Abschnitt 1.2.4 beschriebenen „Bottom up“ Modell am Kryptengrund sitzen und von denen die Tumorigenese
ausgeht: CD133 positive Zellen reagieren wie oben beschrieben auf Wnt-Signale mit einer
Anhäufung von ß-Catenin, das für die Zellproliferation und demnach auch die Entstehung
von malignen Neoplasien fördert.
Dissertation Meike Schneider
97
Diskussion
Neben der deskriptiven Analytik von Tumorzelllinien und Xenografts konnte die Wachstumsstudie zeigen, dass sich verschiedene Subpopulationen in vivo unterschiedlich verhalten.
Für die CD133+ Zellen der CCL SW620 konnte mit gezeigt werden, dass diese ein statistisch signifikant höheres tumorigenes Potential haben als die entsprechend negative Population bzw. die implantierte unsortierte Zelllinie. Dieses Ergebnis deckt sich mit anderen in
der Literatur beschriebenen Ergebnissen.{50} {58} . CD133 verhilft den Zellen zu einem
schnelleren und größeren Tumorwachstum, was mit einem gewissen Stammzellcharakter
in Einklang zu bringen ist. Untersuchungen haben bereits gezeigt, dass CD133 die Blutversorgung des Tumors durch Förderung der Vaskularisation verbessert. Beim Nierenzellkarzinom differenzierten CD133+ Vorläuferzellen in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren
des Tumors zu Endothelzellen und bildeten in der Maus Gefäße aus. Aus diesem Ergebnis kann abgeleitet werden, dass CD133+ Nierenkarzinomzellen die Tumorigenese fördern, indem sie die Vaskularisation und damit die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung in
die Wege leiten. {17} Ob CD133 positive Zellen das Tumorwachstum durch Differenzierung in Endothelzellen, besondere Stammzelleigenschaften oder einen noch nicht bekannten Mechanismus fördern, bleibt weiterhin offen. Das Ergebnis der FACS-Analyse der aus
den unterschiedlichen Populationen entstandenen Xenografts zeigte jedenfalls keinen Unterschied im Expressionsmuster. Es erzeugten also prinzipiell sowohl die CD133+, die
CD133- sowie auch die unsortierte ZL denselben Tumor, was die Expression von CD133,
CD24, CD44, CDCP1 und CXCR4 angeht.
Zusammenfassend ist für die Interpretation der Ergebnisse zu sagen, dass die untersuchten Xenografts im Vergleich zur entsprechenden Zelllinie eine deutlich niedrigere Expressionsrate der Antigene hatten und bei den Tumoren statistische Korrelationen zwischen
einzelnen Antigenexpressionen festgestellt werden konnten (insbesondere zwischen
CD44/CD24 und CD133). Die unterschiedliche Expression der Antigene in vitro und in vivo
zeigt, dass etablierte Tumorzelllinien biologisch zwar von dem Tumor abstammen, aber in
Bezug auf die Antigenexpression doch Unterschiede aufweisen. Es ist dabei naheliegend,
dass die Zellen sich nicht nur in der Expression der potentiellen Stammzellantigene unterscheiden, sondern auch in anderen biochemischen Eigenschaften. Dies hat zum Beispiel
Bedeutung für die Übertragbarkeit von Wirksamkeitsstudien neuer Chemotherapeutika, die
an Tumorzelllinien oder Xenografts durchgeführt werden und auf den Menschen übertragen werden. Ist das neue Therapeutikum in klinischen Studien weniger erfolgreich als erwartet, könnte dies mit doch unterschiedlichen (Stammzell-) Biologie zu tun haben.
Dissertation Meike Schneider
98
Diskussion
6.4
Klinischer Ausblick
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der zielgerichteten Therapie und die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bleibt zum Schluss die spannende Frage zu erörtern, ob die
untersuchten Antigene (bereits) klinische Relevanz aufweisen.
Für jedes der untersuchten Antigene CD133, CD44, CD24, CDCP1 und CXCR4 gibt es
gegenwärtig schon therapeutische Erfolge. Für die zielgerichtete Therapie könnte man
nach dem Vorbild zum Beispiel des Rituximab monoklonale Antikörper entwickeln, die gegen die Antigene gerichtet sind. In diesem Zusammenhang ist es aber auch wichtig, die
Oberflächenproteine nicht nur isoliert zu betrachten, sondern auch in den Kontext einer
Signaltransduktionskaskade zu stellen, die ebenfalls Ziele für therapeutische Zwecke bieten. {73} In Abschnitt 1.2.4 wurde erläutert, welch große Bedeutung der kanonische wntSignalweg in der Karzinogenese des kolorektalen Karzinoms hat. Es ist deshalb durchaus
denkbar, dass ein Zusammenhang zwischen der Antigenexpression und diesem Signalweg existiert. Und tatsächlich: die Expression von CD44 wird durch den β -Catenin/Tcf-4
Signalweg reguliert. Die Blockade dieses Weges führte zu einer kompletten Abwesenheit
des CD44 Antigens. Da die Überexpression von CD44 bereits in frühen kleinen Adenomen
festgestellt wurde, legt dies die Vermutung einer kausalen Beziehung zwischen dem Verlust des Tumorsuppressorproteins APC und der vermehrten Expression dieses Antigens
nahe. Der β -Catenin/Tcf-4-Signalweg könnte direkt mit Promotorsequenzen des CD44Gens interagieren oder über z.B. c-myc, ein weiteres Zielprotein des Signalweges, die
CD44-Transkription regulieren. Die Überexpression von CD44 spiegelt die Persistenz der
proliferierenden Eigenschaft der Tumorzellen wieder. {88} Die Krebszellen könnten spezifisch in ihrem mutierten Wnt-Signalweg und damit in ihrer besonderen Proliferationsfähigkeit attackiert werden. Der konstitutiv exprimierte Wnt/β -Catenin-Signalweg, wie er bei
malignen Stammzellen vorkommt, scheint für die normale hämatopoetische Stammzellfunktion schädlich zu sein. Mit dem neuen Inhibitor des Wnt/ β -Catenin Weges (PKF115584) konnte die Wnt-Zielgenexpression reduziert werden. PKF115-584 induzierte in vitro
die Zytotoxizität bei Multiplen Myelom-ZL, gleichzeitig bestand ein verlängertes Überleben
der Mäuse im Xenograft in vivo Versuch. {45} Diese Untersuchungen zeigen, dass der
Wnt-/β -Catenin Weg ein potentielles Target der zielgerichteten Therapie sein kann und
auch für die Therapie des KRK interessant sein könnte. In wieweit CD44 als Zielprotein
der Wnt-Kaskade durch Inhibitoren des Signalweges beeinflusst wird, ist noch nicht geklärt. Für das CD44-Antigen selbst gibt es auch schon Versuchsansätze: die Blockade von
CD44 hat das Einwandern und Anwachsen von leukämischen Stammzellen im Knochen
im Mausmodell verhindert. John Dick und Kollegen injizierten den gegen CD44 gerichteten
monoklonalen Antikörper H90 in NOD/SCID Mäuse, die mit humanen AML-Zellen trans-
Dissertation Meike Schneider
99
Diskussion
plantiert worden waren. Die Manipulation der CD44 Funktion führt zu einer Reduktion der
Leukämielast in diesen Mäusen. Es zeigte sich, dass CD44 Schlüsselfunktion bei den
leukämischen Stammzellen der AML hat: es ist einerseits wichtig für das „Microenvironment“ in Nischen, andererseits aber auch für die Beibehaltung des primitiven Differenzierungsstatus der Zellen. Die Therapie mit diesem Antikörper ist dabei sehr spezifisch und
nutzt spezielle molekulare Eigenschaften der AML Stammzellen aus, die bei normalen
HSZ nicht beobachtet wurden. Es ist ein gutes Beispiel dafür, dass Krebsstammzellen mit
ihren charakteristischen Eigenschaften spezifische Angriffspunkte für die Antitumortherapie bieten. {38}
Die Expression des Zelloberflächenproteins CD24 ist mit einer schlechten Prognose bei
diversen Tumoren, zum Beispiel beim Harnblasenkarzinom, verbunden. Die Überexpression dieses Antigens fördert sowohl die Invasion, als auch die Metastasierung im tierexperimentellen Modell. Dies konnte anhand zweier Blasenkarzinomzelllinien gezeigt werden,
die subkutan in die Maus implantiert wurden: die eine war in der Maus nicht metastasierend und CD24-/low (UM-UC-3), die andere wurde aus der ersten entwickelt, war dann
aggressiver, metastasierend und CD24+(Lul2). Mäuse mit implantierten Lul2-Zellen wurden mit monoklonalem Antikörper gegen CD24 behandelt. Tatsächlich führte diese Behandlung zu einem verminderten Tumorwachstum. Dieses Ergebnis impliziert die mögliche
therapeutische Konsequenz für CD24 als spezifisches Target. {78}
Die SDF-1/CXCR4-Achse kann auch als Angriffspunkt der zielgerichteten Therapie dienen. Die Applikation eines des CXCR4-Rezeptorantagonisten verminderte in vivo das
Wachstum von gastrointestinalen Tumoren durch Suppression der Tumorneoangiogenese.
Bei der ALL förderte dieser Antagonist die Mobilisierung von leukämischen Stammzellen
ins Blut und verminderte ein Anwachsen dieser Zellen im Knochenmark. Durch Gabe dieses Medikamentes könnte der therapeutische Effekt der Chemotherapie noch zusätzlich
potenziert werden. {33} {39}
CDCP1 ist Substrat für die Phosphorylierung durch Src-Kinasen. Src-Kinasen spielen eine
wichtige Rolle bei der Zellproliferation und werden bei vielen Tumoren überexprimiert.
(siehe auch 1.3.5) Phosphoryliertes CDCP1 verleiht der Zelle Eigenständigkeit und Unabhängigkeit von einem Gewebe, dies ist für die Metastasierung einer Zelle wichtig. Der für
die Src-Familie spezifische Tyrosinkinaseinhibitor PD173955 verhindert die Phosphorylierung von CDCP1. Das Wachstum des Prostatatakarzinoms und dessen Metastasierung
konnte mit src-Kinase-Inhibitoren im Mausxenograftmodell erfolgreich reduziert werden. In
einer neuen Studie wurde ein neuer Antikörper 25A11 entwickelt, der ähnlich wie die SrcKinasen CDCP1 blockiert und die Krebszellmigration und –invasion in vitro inhibiert. Gekoppelt an ein Immunotoxin zeigte anti-CDCP1 ebenfalls signifikante Inhibition des primären Tumorwachstums und der Metastasierung in vivo. Da der Eintritt von Tumorzellen in
Dissertation Meike Schneider
100
Diskussion
die Kreislaufzirkulation der kritische erste Schritt im Metastsierungsprozess ist und das
Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen im Blut mit einer kurzen Überlebenszeit
verbunden ist, hat eine (Antikörper-) Therapie, die auf die Funktion von CDCP1 gerichtet
ist, klinische Relevanz. CDCP1 wurde allerdings nicht nur auf primären Prostatatumoren
detektiert, sondern auch in gleicher Häufigkeit auf normalen epithelialen Prostatatzellen.
Diese Tatsache zeigt die Schwierigkeit der Anwendbarkeit von zunächst sehr guten Ergebnissen im in-vivo Versuch auf den Menschen. Wenn auch nur geringe Mengen des
Targets, gegen das sich z.B. eine Immunotoxingekoppelte Antikörpertherapie richtet, auf
normalem Gewebe vorkommt, kann dies zu schwerwiegenden Problemen bezüglich der
Kreuzreaktivität und Toxizität führen. {77}
Nachdem nun experimentelle Fortschritte für CD44, CD24, CXCR4 und CDCP1 beschrieben wurden, soll auch CD133 diesbezüglich beleuchtet werden.
Für CD133 wurde zum Beispiel untersucht, wie empfindlich diese Zellen gegenüber Chemotherapeutika sind. CD133+ waren gegenüber Oxaliplatin und 5-Fluoruracil deutlich weniger sensibel als CD133- Tumorzellen. {80} Darüber hinaus waren CD133+ Zellen auch
resistenter gegenüber Radiotherapie. {45} Diese Studien bestätigten die Annahme, dass
tumorinitiierende Zellen eine Resistenz gegenüber Krebstherapien besitzen (siehe auch
Abschnitt 2.1) und verdeutlichen den Einsatz zielgerichteter (Stammzell-) Therapien.
Wnt-Signalling und die damit erhöhte Zellproliferation können durch Knochenmorphogenetisches Protein (BMPs) inhibiert werden. BMPs werden von perikryptischen mesenschymalen Zellen im Gastrointestinaltrakt produziert und die Unterbrechung der BMPSignalkaskade resultiert in einer Expansion der Stamm- und Vorläuferzellpopulation. Es
entsteht ein klinisches Bild mit vielen Adenomen, das dem der juvenilen Polyposis ähnelt.
{9} BMP-Proteine könnten demnach evtl. therapeutisch gegen eine erhöhte Zellproliferation eingesetzt werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass diese Proteine Differenzierung fördern und somit evtl. auf diese Weise die Entstehung einer Neoplasie verhindern:
CD133+ Stammzellen beim humanen Glioblastom exprimieren Rezeptoren für Knochenmorphogenetisches Protein (BMP). Durch Bindung von BMP4 an diesen Rezeptor wird
eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die letztendlich zu einer Reduktion des CD133+ Zellpools führt, weil sich die Zellen zu Astroztyten, Oligodendrozyten und anderen Zellen ausdifferenzieren. Die Induktion der Differenzierung von Krebsstammzellen ist der Hauptmechanismus des antitumoralen Effektes des BMP4. {59} Dieses Beispiel zeigt, dass sich
zielgerichtete Therapie auch auf die Differenzierung von Krebsstammzellen richten kann.
Klassisches Beispiel hierfür ist die Therapie der akuten Promyelozytenleukämie, bei der
die Gabe von All-trans-Retinolsäure Differenzierung induziert und die Krankheit damit erfolgreich behandelt werden kann. {14}
Dissertation Meike Schneider
101
Diskussion
Studien, die CD133 als Stammzellmarker identifizieren, machen diesen Marker natürlich
auch zu einem attraktiven Angriffspunkt der zielgerichteten Therapie.
Es konnte gezeigt werden, dass CD133+ Kolontumorstammzellen IL-4 als autokrinen
Wachstumsfaktor produzieren. IL-4 wirkt auf die produzierende Zelle zurück und fördert
das Überleben der Zelle durch Hochregulierung von antiapoptotischen Genen. CD133+
Kolontumorstammzellen schützen sich folglich durch den selbst produzierten Wachstumsfaktor IL-4 vor dem programmierten Zelltod und überleben länger. Im in vivo Versuch
konnte bereits beim humanen kolorektalen Karzinom durch Gabe eines IL-4 neutralisierenden Antikörpers bzw. eines Antagonisten gegen den IL-4-Rezeptor die Wirkung konventioneller Chemotherapeutika erhöht werden. {80}
Die dargestellten Beispiele geben Einblicke, wie tieferes Verständnis der Tumorbiologie
therapeutisch nutzbar gemacht werden kann. Die Therapieansätze mit CD44, CD24,
CXCR4, CDCDP1 und CD133 zeigen einerseits erste Erfolge, aber andererseits auch die
Grenzen der möglichen Therapie auf. Es ist wichtig, Unterschiede zwischen Krebsstammzellen und normalen Gewebestammzellen herauszufinden, um spezifisch die malignen
Zellen angreifen zu können und die gesunden Zellen dabei nicht zu treffen. Zum Beispiel
wird CDCP1 in niedrigem bis mäßigem Ausmaß von einigen essentiellen normalen humanen Geweben exprimiert und macht die Anwendbarkeit in der zielgerichteten Therapie
schwierig. {77}
Die Ähnlichkeiten der Krebsstammzelle mit der eigentlichen Gewebestammzelle und das
Vorkommen der Antigene an anderen Stellen des Körpers werden sicher eine schwierige
Herausforderung in der Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien werden. Möglicherweise ist auch das einzigartige Microenvironment der Krebsstammzellen der Schlüssel für
eine effektive Krebstherapie.
Dissertation Meike Schneider
102
Zusammenfassung der Ergebnisse
7
Zusammenfassung der Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wurden 15 Kolontumorzelllinien, 11 von diesen Zelllinien abgeleitete Xenografts und 4 direkt vom Patiententumor abgeleitete Xenografts mit der Durchflusszytometrie auf die Expression von CD133, CD24, CD44, CDCP1 und CXCR4 hin untersucht. Bei einigen der Xenografts konnte zusätzlich die Genexpression dieser Antigene
auf mRNA-Level analysiert werden. Darüber hinaus wurde eine Wachstumsstudie mit der
Zelllinie CCL SW620 durchgeführt: CD133 exprimierende Zellen wurden von den negativen separiert und die unterschiedlichen Zellpopulationen in vivo bezüglich ihrer Fähigkeit
zur Ausbildung eines Tumors beobachtet.
Jede Zelllinie wie auch jedes Xenograft zeigte ein eigenes spezifisches Expressionsmuster
der untersuchten Antigene. Die sehr hohe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zeigte
sich in wiederholten unabhängigen Messungen: bei den Zelllinien lag die Standardabweichung <10% in 108/120 Messungen, bei den Xenografts lag sie bei <5%.
Die aus den Zelllinien abgeleiteten Xenografts unterschieden sich nicht signifikant in der
Expression der untersuchten Antigene von denen, die direkt aus dem Patiententumor
etabliert wurden. Der Vergleich zwischen den Tumorzelllinien und den Xenografts zeigte
ein deutlich geringerer Anteil antigenpräsentierender Zellen in vivo: für CD133 ergab sich
eine durchschnittliche Reduktion um 11,5%, bei CD24 um 44,8%, bei CD44 um 64%, bei
CDCP1 um 65,5% und bei CXCR4 eine Reduktion um 3,5% positive Zellen. Während diese deutlich niedrigere Expression der Antigene bei den Xenografts im Vergleich zu den
Zelllinien in den meisten Fällen zu beobachten war, gab es ebenfalls Versuchspaare, bei
denen es in vivo zu einer Zunahme der Antigenexpression kam. Eine dieser Ausnahmen
war die CCL/CXF LOVO: CD24 und CXCR4 waren in vivo stärker vorhanden. Bei drei
weiteren Zelllinien (LS174T, KM20LZ, KM12) wurde das CD133-Antigen in vivo in der Expression hochreguliert.
Für die Xenograftzellen wurde weiterhin analysiert, ob CD133+ Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche weitere der untersuchten Antigene exprimierten. Es zeigte sich, dass es kleine
Tumorzellpopulationen mit einem Anteil zwischen 1,71 und 4,2% gab, die mehr als eines
der Antigene gleichzeitig exprimierten. Für einzelne Antigenkombinationen konnte dabei
sowohl auf Proteinniveau, aber auch mit Genexpressionsanalysen auf mRNA-Niveau gezeigt werden, dass eine statistisch signifikante Korrelation in deren Expression bestand.
Die Wachstumsstudie der CCL SW620 ergab, dass CD133+ Zellen im Vergleich zu den
CD133- Zellen und der unsortierten Zelllinie statistisch signifikant schneller in vivo das
Tumorwachstum initiierten und auch größere Tumore hervorbrachten. Dieses Ergebnis
charakterisierte CD133 als potentiellen Stammzellmarker beim Kolorektalen Karzinom.
Dissertation Meike Schneider
103
Anhang
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:
The XXIII Symposium of the International Association for Comparative Research on
Leukemia and Related Diseases, 7.-11. 09. 2007 in Freiburg
Schneider M, Tetling E, Wagner M, Fiebig HH, Schüler JB:
Characterization of different stem cell markers in a panel of human colon carcinoma cell
lines
Annual Meeting of the American Association of Cancer Research 2008 in San Diego,
CA:
Schneider M, Tetling E, Wagner M, Fiebig HH, Schüler JB:
Characterization of different stem cell markers in a panel of human colon carcinoma cell
lines and their corresponding human xenografts
Dissertation Meike Schneider
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