Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Alexej Dronov aus Omsk (Russland) Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med.vet. Dr. h.c. W. Leibold Erster Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med.vet. Dr. h.c. W. Leibold Zweiter Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med.vet. M. Hewicker-Trauthwein Tag der mündlichen Prüfung: 25 November 2005 Wenn die Menschen nur über das sprächen, was sie begreifen, dann würde es sehr still auf der Welt sein. Albert Einstein INHALTSVERZEICHNIS GLOSSAR UND VERZEICHNIS DER IN TEXT UND ABBILDUNGEN VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN.................................................................................... 9 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG.................................................................. 13 2 LITERATURÜBERSICHT ................................................................................... 15 2.1 Allergieformen......................................................................................................... 15 2.2 Das Sommerekzem – eine Typ-I-Allergie des Pferdes ......................................... 21 2.3 Das Th1-Th2-Modell............................................................................................... 24 2.3.1 Th1-/Th2- Zellen ............................................................................................................................... 25 2.3.2 Effektor-Funktionen der Th-Zellen-Subtypen ............................................................................... 26 2.4 Entwicklung von Th1- und Th2-Subtypen. .......................................................... 27 2.4.1 Entwicklung von Th1-Subtypen ...................................................................................................... 27 2.4.2 Entwicklung von Th-2 Subtypen ..................................................................................................... 29 2.5 Th1-/Th2- Switch..................................................................................................... 30 2.6 Th1- oder Th2- beeinflussende Faktoren.............................................................. 31 2.7 Klinische Beispiele für Th1- oder Th2- Muster bei humanen Erkrankungen .. 33 2.8 Immunmodulation................................................................................................... 34 2.8.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten .......................................................................................... 35 2.9 Bewertung der Proliferation peripherer Blutlymphozyten (PBL) in vitro........ 36 2.10 Mitogene und mitogene Stimulation...................................................................... 38 2.11 Bakterielle Superantigene ...................................................................................... 40 2.11.1 Bindungsmechanismen an Immunzellen......................................................................................... 40 2.11.2 Konsequenzen der Superantigenbindung ....................................................................................... 42 2.12 Nekrose..................................................................................................................... 44 2.13 Apoptose................................................................................................................... 45 2.13.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose .................................................................... 47 2.14 Der programmierte Zelltod und seine unterschiedlichen Formen ..................... 50 2.15 Bewertung des Zelltodes in vitro ........................................................................... 51 2.15.1 Elektronenmikroskopie .................................................................................................................... 52 2.15.2 Standard-Lichtmikroskopie ............................................................................................................. 53 2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................................................... 53 2.15.4 Durchflusszytometrie........................................................................................................................ 54 2.16 Quantitative RT-PCR ............................................................................................. 54 2.16.1 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription............................................................... 56 2.16.2 PCR-Methoden zur Quantifizierung............................................................................................... 59 2.16.3 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung) .............................................. 61 2.16.4 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR) ................................................... 63 2.16.5 Vergleich real-time RT-PCR und konventionelle RT-PCR .......................................................... 71 3 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................... 73 3.1 Geräte ....................................................................................................................... 73 3.2 Material.................................................................................................................... 74 3.2.1 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................................................... 74 3.2.2 Chemikalien und Reagenzien........................................................................................................... 75 3.2.3 Medien für Zellkulturen................................................................................................................... 77 3.2.4 Material für die Separation und Kultivierung von Leukozyten ................................................... 77 3.2.5 Material für die Durchflusszytometrie............................................................................................ 78 3.2.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter Zellzahlen ........................... 79 3.2.7 Materialien für die Bestimmung der Phagozytosekapazität ......................................................... 79 3.2.8 Material für molekularbiologische Verfahren................................................................................ 80 3.2.9 Tiere ................................................................................................................................................... 83 3.3 Methoden ................................................................................................................. 83 3.3.1 Blutentnahme .................................................................................................................................... 83 3.3.2 Separation equiner Leukozyten ....................................................................................................... 83 3.3.2.1 Hypotone Erythrolyse ............................................................................................................................ 83 3.3.2.2 Percoll® Separation ................................................................................................................................ 84 3.3.2.3 Ficoll Separation..................................................................................................................................... 84 3.3.2.4 Aufreinigung der Granulozyten mittels Transmigrationsverfahren.................................................. 85 3.3.3 Durchflusszytometrie........................................................................................................................ 87 3.3.3.1 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung......................................................................... 88 3.3.3.2 Zellzahlbestimmung ............................................................................................................................... 89 3.3.4 Konventionelle RT-PCR................................................................................................................... 90 3.3.4.6 Synthese der cDNA durch Reverse Transkriptions-(RT-) Reaktion.................................................. 93 3.3.4.8 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................................... 96 3.3.4.9 Semiquantitative RT-PCR..................................................................................................................... 97 3.3.4.10 Fotodokumentation und Quantifizierung............................................................................................. 98 3.3.5 SYBR Green tm real-time PCR ..................................................................................................... 100 3.3.5.1 Auswertung und Quantifizierung der SYBR Green tm real-time PCR ........................................... 101 3.3.6 Bestimmung der Phagozytosekapazität ........................................................................................ 101 3.3.7 Statistische Verfahren..................................................................................................................... 102 3.3.8 Statistische Darstellung als Box Chart .......................................................................................... 103 4 ERGEBNISSE ....................................................................................................... 104 4.1 Methodische Vorarbeiten ..................................................................................... 104 4.1.1 Auswahl eines geeigneten Kulturmediums für die Proliferationstests mit equinen mononukleären Zellen .................................................................................................................... 104 4.1.2 Stimulatorische Potenz von PHA für mononukleäre Zellen unterschiedlicher Individuen ..... 112 4.1.3 Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro ................................................................................ 114 4.2 Etablierung einer RT-PCR zum Nachweis der Transkription equiner Zytokine. ................................................................................................................................. 117 4.2.1 Vergleichende Untersuchung der RNA-Isolierungsmethoden .................................................... 117 4.2.2 Einfluss der Zellseparationstechnik und einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden in vitro auf die Zytokin-mRNA-Expression von equinen MNCs ............................................................. 119 4.3 Immunmodulatorische Einflüsse auf equine Leukozyten in vitro.................... 121 4.3.1 Exemplarischer Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf equine Leukozyten....................................................................................................................................... 122 4.3.1.1 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNCs während 72 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Phythämagglutinin (PHA) ................................................................................... 122 4.3.1.2 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNCs während 36 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylocokken Enterotoxin A (SEA) ................................................................ 124 4.3.1.3 Prüfung des Einflusses eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitro- Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylocokken Enterotoxin A (SEA) in Anwesenheit einer gleichen Anzahl autologer neutrophiler Granulozyten .................................................................................... 126 4.3.1.4 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Wiedergewinnung gereinigter equiner PMN nach 36 stündiger Kultivierung mit und ohne SEA................................................... 128 4.3.1.5 Einfluss des pflanzlichen Immunmodulators auf equine PMN in Kokulturen von PMN und MNC ...................................................................................................................................................... 132 4.3.2 Exemplarischer Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf equine Leukozyten....................................................................................................................................... 136 4.3.2.1 Einfluss eines mikrobiellenen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 72 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Phythämagglutinin (PHA) ................................................................................... 137 4.3.2.2 Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylocokken Enterotoxin A (SEA) ................................................................ 141 4.3.2.3 Überprüfung des Einflusses eines mikrobiellen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylocokken Enterotoxin A (SEA) in Anwesenheit von gleicher Anzahl autologer neutrophiler Granulozyten ................................................................................................. 143 4.3.2.4 Einfluss eines mikrobiellen Iimmunmodulators auf die Wiedergewinnung vitaler equiner PMN nach 36 stündiger Kultivierung mit und ohne SEA................................................................. 146 4.3.2.5 Einfluss des mikrobiellen Immunmodulators auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen mit MNC ............................................................................................................................................... 151 4.3.2.6 Einfluss des mikrobiellen Immunmodulators auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen mit MNC und superantigener Stimulation......................................................................................... 153 4.4 Zytokin-mRNA-Transkription in equinen MNC nach Inkubation mit einem pflanzlichen oder einem mikrobiellen Immunmodulator .................................. 157 4.4.1 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulator (PIM) auf die Zytokinexpression equiner MNC................................................................................................................................................. 158 4.4.2 Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Zytokinexpression equiner MNC................................................................................................................................................. 160 5 Diskussion .............................................................................................................. 163 5.1 Vorbereitende Arbeiten für eine modulatorische Analyse................................ 164 5.1.1 Wahl des Kultursystems für equine Blutzellen ............................................................................ 164 5.1.2 Die Quantifizierung von Proliferationsreaktionen....................................................................... 166 5.1.3 Die Quantifizierung des Zelltodes.................................................................................................. 168 5.2 Einsatz der konventionellen und real-time RT-PCR für Zytokinexpression Untersuchungen .................................................................................................... 169 5.3 Vitalität und proliferative Reaktion mononukleärer Zellen von Pferden mit und ohne Insektenallergie in vitro....................................................................... 170 5.4 Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro...................................................... 171 5.4.1 Superantigene haben im Vergleich zu Mitogenen keinen Vitalitäts-modulierenden Effekt auf reine neutrophile Granulozyten .............................................................................................. 171 5.4.2 Superantigene und Mitogene mindern die Vitalität von Granulozyten im Beisein von mononukleären Zellen .................................................................................................................... 171 5.5 Die modulatorische Analyse - Immunmodulatorische Beeinflussung der Vitalität equiner MNC in vitro ............................................................................ 172 5.5.1 Stimulation mit PHA ...................................................................................................................... 172 5.5.2 Stimulation mit SEA ....................................................................................................................... 173 5.5.3 Koinkubation von MNC mit PMN unter dem Einfluss von Immunmodulatoren - Einfluss auf die MNC .................................................................................................................................... 174 5.5.3.1 Koinkubation von PMN mit MNC unter dem Einfluss der Immunmodulatoren Reaktion der PMN....................................................................................................................... 174 5.6 Immunmodulation als messbare Größe .............................................................. 175 6 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 177 7 SUMMARY ........................................................................................................... 179 8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................. 181 9 ERKLÄRUNG....................................................................................................... 220 Glossar und Verzeichnis der in Text und Abbildungen verwendeten Abkürzungen α anti- (gerichtet gegen) Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper Aliquots aliquote Teile, gleiche Anteile einer Probe Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Bp Basenpaare bzw. beziehungsweise C Cytosin cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) ca. cirka °C Grad Celsius CI Chloroform/Isoamylalkohol Cup Reaktionsgefäß D Dalton (1,66018 x 10-24g) d dies (Tag) d(A,C,G,T) TP desoxy-(Adenin,Cytosin,Guanin,Thymin)-triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DEPC-H2O Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser DMEM-3,-10 Dulbecco’s Modified Eagle Medium. Zellkulturmedium mit Zusatz von Penicillin,Streptomycin und 3, bzw 10% FCS dNTP Nukleotidgemisch aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP DTT Dithiothretiol dl Deziliter (100 ml) DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat “Ekzemer” an Sommerekzem erkrankte Pferde (auch außerhalb der klinisch manifesten Periode) engl. Englisch et al. et alii (und andere) Eq/eq equines, equiner, equine evtl. eventuell Fa. Firma FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg) Fc fragment crystallizable; durch Disulfidbrücken verbundene C-terminale Domänen (C2+C3 bzw. C2 - C4) der konstanten Immunglobulinkette, ein Teilbereich dieses IgFragmentes kann an geeignete Fc-Zellrezeptoren binden. FcεRI Fcε-Receptor I (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgE mit hoher Affinität bindet, Bindungskapazität 10-10 mol / l) FcεRII Fcε-Receptor II (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgE mit niedrigerer Affinität bindet, Bindungskapazität 10-8mol / l) FcγRII Fcγ-Receptor II (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungskapazität 10-7 bis 10-6 mol / l) FcγRIII Fcγ-Receptor III (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungskapazität 10-7 bis 10-6 mol / l) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL-1, -2, -3 Messkanäle FL-1 = des Durchflusszytometers Grünfluoreszenz, 530 ± 15 für nm; emittierte FL-2 = Fluoreszenz Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm) FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), ein Messparameter des FACScan® g Gramm G-CSF Granulocyte-colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF Granulocyte-Monocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Monozyten- Wachstumsfaktor) ggf. gegebenenfalls ggr. geringgradig h hora (Stunde) hgr. hochgradig G Guanin H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulinketten IFN Interferon Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin A IgE Immunglobulin E IgG Immunglobulin G IL Interleukin i.v. intravenös kDa Kilodalton (103 Dalton) kDMEM-3,-10 Konstituiertes Dulbecco’s Modified Eagle Medium Zellkulturmedium mit LGlutamin, 2-Mercaptoethanol und Zusatz von Penicillin,Streptomycin und 3%, bzw 10% FCS kg Kilogramm KGW Körpergewicht l Liter log dekadischer Logarithmus µ mikro (x 10-6) µg Mikrogramm µl Mikroliter m milli (x 10-3) M mol/l mA Milliampere mAk monoklonaler Antikörper mg Milligramm mgr. Mittelgradig MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) Min Minuten ml Milliliter mmol Millimol mRNA Messenger RNA (Boten RNA) Mo. Monate MW Mittelwert (arithmetischer Mittelwert) n Stichprobenumfang „Nichtekzemer“ nicht an Sommerekzem erkrankte Pferde NK-Zellen natürliche Killerzellen ng Nanogramm nm Nanometer (1x10-9m) Nr. Nummer OD Optische Dichte p Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen) PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCI Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PEG Polyethylenglykol Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen oder Partikel PHA Phytohemagglutinin pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration pg Pikogramm (10-12 Gramm) PJ Propidiumjodid PMN Polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) pmol Pico Mol (10-12 Mol) QRT-PCR Quantitative real-time PCR rhIL-8 rekombinantes humanes Interleukin-8 RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Reverse Transkription RT-PCR Polymerasekettenreaktion mit vorgeschalteter reverser Transkription s. s. SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A sek. Sekunden SFM-3,-10 Serum Free Media. Zellkulturmedium SFM mit Zusatz von Penicillin, Streptomycin und 3%, bzw 10% FCS sheath fluid Trägerflüssigkeit für die Durchflusszytometrie spp. species (Arten) SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), ein Messparameter des FACScan® Tab. Tabelle TBE Tris-Borat-EDTA TE Tris-EDTA TH-Zelle T-Helferzelle TH1-, TH2-Zelle Subpopulationen von T-Helfer-Zellen T Thymin TNFα Tumornekrosefaktor alpha U Unit (Einheit) u.a. unter anderem well eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatten V Volt v.a. vor allem vergl. vergleiche Wo. Wochen xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/sek2) z. B. zum Beispiel Einleitung 1 Einleitung und Zielsetzung In der Veterinär- wie auch in der Humanmedizin stoßen Chemotherapeutika zunehmend an ihre Grenzen, insbesondere wegen nachteiliger Nebenwirkungen und Verlust der Wirksamkeit durch unterschiedliche Formen der Resistenzentwicklung gegen solche Medikamente. Man versucht dies durch „Stärkung des Immunsystems“ auszugleichen: Prophylaktisch und therapeutisch einerseits durch Impfungen und andererseits durch Immunmodulation. Da das Immunsystem jedoch kybernetisch reguliert wird, muss seine „generelle Stärkung“ ein viel gehegter Wunschtraum bleiben. Zuverlässig wirksame Immunmodulation kann es nur im Hinblick auf definierte Immunfunktionen geben. Mit zunehmender Kenntnis der Komponenten und Mechanismen des Immunsystems sowie deren Interaktionsmöglichkeiten mit Körperstrukturen, die nicht zum Immunsystem gehören, ist es möglich, aber auch erforderlich, Beeinflussungen des Immunsystems in ihrer Wirkungsweise immer konkreter zu definieren. Dazu sind in vitro Verfahren hilfreich, in denen sich einzelne Funktionen oder Komponenten des Immunsystems gezielt prüfen lassen. Sie sind notwendig, wenn man von Substanzen, bei denen man eine immunmodulatorische Wirkung in vivo vermutet oder anhand klinischer Parameter bereits beobachtet hat, deren exakte Wirkungsweisen analysieren und / oder überwachen möchte. Zum anderen sind solche Verfahren besonders wichtig, wenn man neue und gezielt wirkende Immunmodulatoren entwickeln möchte. Zudem lassen geeignete Verfahren auch erkennen, ob individuell unterschiedliche Wirkungen eines Immunmodulators zu erwarten sind oder ob durch Krankheit oder Vorbehandlung eines Individuums die Wirkung eines Immunmodulators gesteigert oder gehemmt werden kann. Auch können geeignete Verfahren wertvolle Informationen im Hinblick auf Dosis und Wirkung einer Substanz bieten, bevor man in einen Tierversuch geht. Zudem können solche Parameter als wertvolle Überwachungsverfahren dienen, wenn man in vivo-Wirkungen ex vivo überprüfen möchte. Ziel dieser Arbeit war es, bei Pferden mit und ohne Sommerekzem in vitro funktionelle Immunparameter für - gereinigte mononukleäre Leukozyten (MNC), - gereinigte neutrophile Granulozyten (PMN) und - die Interaktion beider Zellarten (MNC & autologe PMN) zu entwickeln. - 13 - Einleitung Parallel dazu sollte die Expression ausgewählter Zytokine in den MNC überprüft werden, um die funktionellen Ergebnisse besser verstehen und interpretieren zu können. Anhand von zwei – vermutlich unterschiedlich wirksamen – Immunmodulatoren sollte exemplarisch die Empfindlichkeit und Aussagefähigkeit molekularbiologischen Immunparameter überprüft werden. - 14 - der funktionellen und Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Allergieformen Sämtliche Immunmechanismen, aus denen sich nach heutigem Verständnis das klinische Bild einer Allergie entwickeln kann, finden im Rahmen physiologischer Prozesse ihre Entsprechung. Die Initiation der jeweiligen Immunmechanismen ist immer Bestandteil einer adaptiven Immunantwort, während die reaktiven, häufig inflammatorischen Prozesse eher dem angeborenen Ast des Immunsystems angehören. Immunmechanismen, die sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen, bezeichnet man daher als Allergien. Sie sind somit Hypersensibilitäts- oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet. Diese Allergene sind zumeist exogene Antigene, deren Herkunft pflanzlicher, tierischer oder, im Einzelfall anorganischer Natur sein kann. Wenn sich die Antwort des Immunsystems gegen körpereigene Antigene richtet, grenzt man die Allergie (exogene Antigene) gegen die Autoagression ab (endogene Antigene). GELL und COOMBS. (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von Antikörper unabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden. Eine Typ V Allergie, deren Antikörper abhängiger Pathomechanismus sich deutlich von den anderen Typen unterscheidet, hat bisher noch keinen allgemein gültigen Eingang ins Schrifttum gefunden. Typ I-Allergien sind die Allergien vom Soforttyp, bei denen die klinischen Symptome in der Regel sehr schnell, meist innerhalb von Minuten (selten Stunden) nach dem Allergenkontakt auftreten. Diesem Mechanismus können protektive, regulatorische aber auch überschießende immunologische Reaktionen zugeordnet werden (COSTA et al. 1997). Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen - 15 - Literaturübersicht (Interleukinen) allergenspezifisches IgE. Dieses IgE wird, im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen, schon in unkomplexierter Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (FcεRI) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Diese zwei Zelltypen exprimieren diesen Rezeptor konstitutiv, während er auf einigen anderen Zellen induziert werden kann (FROESE 1984). Freies Serum-IgE hat eine Halbwertszeit von Wenigen stunden bis Tagen. Ungebunden liegt IgE im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Allerdings ergeben sich hier tierartliche Unterschiede in stärkerem Maße, als bisher vermutet (WAGNER et al. 2002) Ein wesentlicher Grund für den niedrigen IgE Spiegel ist die Bindung an FcεRI, denn frei verfügbares IgE steigert die Expression dieses Rezeptor (FURUICHI et al. 1985; KUBO et al.2001). Durch die Expression neuer Rezeptoren für IgE wird der Serumspiegel an IgE gesenkt. In letzter Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass bereits die Bindung von freiem IgE an seinen Rezeptor eine Signaltransduktion hervorruft (CHARLES et al. 2004). Bereits diese Bindung trägt zur Aktivierung, der Rezeptorexpression sowie zum Überleben der TypI-allergischen Effektorzellen bei (KITAURA et al. 2003). Dieser autokrine Verstärkungsmechanismus der FcεRI Expression ist initial nur vom Isotyp, also dem IgE abhängig. Eine fortgesetzte Präsenz des Antigens (Allergens) kann aber eine positive Rückkopplung des Typ I Immunmechanismus bewirken, indem allergenspezifische B-Zellen iterativ aktiviert werden. Die notwendigen Zytokine werden von Basophilen und/oder Mastzellen selbst zur Verfügung gestellt (GAUCHAT et al. 1993; YANAGIHARA et al. 1998). Als Folge dominieren jene IgE-Idiotypen den Serumpool, deren B-Zellen wiederholt oder dauerhaft aktiviert werden. Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem Allergen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle der sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten; v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber - 16 - Literaturübersicht auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion). Im gesunden Individuum besiedeln die Mastzellen die Lamina propria der Schleimhäute sowie das Korium der Haut. Wie auch der Basophile entstehen die Mastzellen im Knochenmark. Während ihres Aufenthaltes im peripheren Blut beladen sich die Zellen mit monomerem IgE und verlassen derart sensibilisiert die Blutbahn. Dementsprechend werden die Fcε Rezeptoren mit einem zum Zeitpunkt der Beladung repräsentativem Querschnitt aller aktuellen IgE - Idiotypen im Serum ausgestattet. Im Gewebe können diese Zellen dann bei erneutem Kontakt zu einem Antigen, gegen das sie spezifische Immunglobuline gebunden haben, degranulieren. Mastzellen stellen somit einen wesentlichen Anteil der „first line of defense“ dar. Die freigesetzten Mediatoren bewirken im Gewebe eine lokale Begrenzung der Antigenverteilung, indem sich der Blutfluss im irritierten Bereich verlangsamt und die Exsudation von Plasma sich erhöht. Es kommt zur Ödembildung. Im Folgenden werden weitere Leukozyten chemotaktisch angelockt. Es etabliert sich eine Entzündung. Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitäre Infektionen (Helminthen). Er ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt. Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock. Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgEVermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über FcγRI, IIa und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen. Untersuchungen bei allergischen Reaktionen haben bei Maus und Mensch gezeigt, dass hier verschiedene IgG-Isotypen beteiligt sind. Entsprechende Fcγ-Rezeptoren, die die Bindung von IgG-Isotypen auf Mastzellen ermöglichen, konnten auf humanen Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000).Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Maus das IgG1 (DOMBROWICZ et al. 1997) und beim Mensch das IgG4 (KIEKENS et al. 2000) eine modulatorische Rolle bei der Aktivierung der Effektorzellen der Typ I Allergie (Mastzellen, basophile Granulozyten) und damit bei der Freisetzung der allergischen Symptome auslösenden Mediatoren wie z.B. dem Histamin spielt. Nachgewiesen werden - 17 - Literaturübersicht konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994). Im Mausmodell ebenfalls nachgewiesen ist die inhibitorische Wirkung auf die IgE vermittelten allergischen Reaktionen durch FcγRIIb-Rezeptoren nach der Bindung von IgG (UJIKE et al. 1999; KATZ 2002). Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgMIsotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fc -Rezeptoren dazu aktivieren, diese opsonisierten Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese (antikörperabhängige die antikörpermarkierten zelluläre Zytotoxizität Zielzellen (ADCC)). Ein zytotoxisch dritter zerstören IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss. Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt. Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris. - 18 - Literaturübersicht Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden. Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-AntikörperKomplexe aktivieren – wenn komplementbindende Isotypen beteiligt sind - das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert (Komplementrezeptor 1 (CR1)) und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden. Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden diese Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über FcγRIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetzung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die nachfolgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et al. 1999; BAUMANN et al. 2001), da hierdurch Leukozyten in das Entzündungsgebiet gelockt werden. Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus. Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper aus dem Pferdeserum, lösen eine adaptive Immunantwort des Empfängers mit Bildung anti equiner Antikörper aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Immunkomplexbildung mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu autoagressiven Vasculitiden, Glomerulonephritis und Arthritiden. Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre - 19 - Literaturübersicht Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen). Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fcvermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern. Bei einer Typ V Allergie können die im Rahmen von Infektionen gebildeten Antikörper mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B. stimulieren (TSHRezeptoren bei Basedow-Krankheit) oder blockieren (Acetylcholinrezeptoren bei Myasthenia gravis). Auch in der Zellvermittelten Immunantwort (Typ IV Immunmechanismus) kann es, ohne Beteiligung von Immunglobulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen. Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHC-Klasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen. Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in mindestens zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und BZellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2). Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2. Altbekanntes Beispiel einer TZell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B. auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt. Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differenzieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus. Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ). - 20 - Literaturübersicht Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebsschädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden. (JANEWAY & TRAVERS 2002) Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zu Grunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt. 2.2 Das Sommerekzem – eine Typ-I-Allergie des Pferdes Das Interesse an der Typ I Allergie wuchs, als die Häufigkeit dieser Erkrankung beim Menschen zunahm. Lange bevor die immunologischen Grundlagen einer Typ I Allergie erkannt wurden, berichteten französische Pferdehalter um 1840 von einer saisonal auftretenden Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in UNKEL 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in UNKEL 1985). Mittlerweile liegen vergleichbare symptomatische Beschreibungen aus allen Teilen der Welt vor, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde. Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT 1997) sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL 1985). - 21 - Literaturübersicht Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommerekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10% angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer sein soll scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL 1985). Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter blutsaugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp. (Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans und Simuliden spp. (HECK 1991). So wiesen BAKER und QUINN (1978) nach, dass auf die intradermale Applikation von Extrakten aus Culicoides, Stomoxis calcitrans bzw. Tabanidae alle sieben untersuchten Pferde bei Culicoides und drei der Tiere ebenfalls bei Stomoxis calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al. 1986). QUINN et al.. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al. 1997) Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass auch bei Equiden eine phänotypische Differenzierung von TH1 und TH2 Zellen möglich ist, also entsprechend dem humanen System eine Immundeviation mittels Zytokinen auch in vivo als möglich gelten darf (AGGARWAL 1999). - 22 - Literaturübersicht Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommerekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals Symptome. Fohlen allerdings zeigen nahezu nie Anzeichen der Erkrankung, obwohl z.T. schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991). Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht. Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al. 1996). Da das Allergen bisher nicht in aufgereinigter Form vorliegt und die Major Allergens erst bestimmt werden müssen, wird hierzu ein grober Gesamtextrakt der Mücke verwendet. Dieser birgt jedoch das Risiko, dass Immunreaktionen, insbesondere Allergien gegen andere als die spezifischen allergenen Bestandteile des Extraktes durch die Behandlung ausgelöst werden. Zieht man zudem in Betracht, dass ein großer Teil der Allergiker gegen mehr als nur ein Allergen sensibilisiert ist und somit prinzipiell gegen eine Reihe von Allergenen hyposensibilisiert werden müsste, werden die praktischen Grenzen dieser Therapieform deutlich. Einen weiten Überblick über die von Tierärzten und Patientenbesitzern verwendeten (symptomatischen) Therapeutika gibt (RÜSBÜLDT 2001): So werden neben der äußerlichen Anwendung verschiedenster Fette und Öle und Insektenrepellents, u. a. Cortikoide oder Antihistaminika zur Immunsuppression eingesetzt, aber auch Homöopathika, Eigenblutbehandlungen und ihre Variationen, Bioresonanz oder biologisch aktive Peptide. BRÜNNLEIN (2001) konnte in ihren Untersuchungen zum Sommerekzem keinen dauerhaften und zuverlässigen Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop® I (Gegensensibilisierung nach Theurer) oder Insol® Dermatophyton auf die generelle oder Culicoides-spezifische Sensibilisierung nachweisen. Erfolgversprechend bleibt bisher alleine eine möglichst weitreichende Allergenkarenz (Ekzemerdecken, Verbringen der Tiere in mückenfreie, bzw. arme Umgebung). Allerdings bedeutet auch dies keine Heilung der Allergie, sondern nur ein Verhindern der klinischen Symptome. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog -die Gnitzen sind auf den - 23 - Literaturübersicht ostfriesischen Inseln auf Grund der ganzjährigen Westwinddrift nicht endemisch-, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT 2001). Auch nach dieser langen Zeit hätte also ein erneuter Allergenkontakt den klinischen Ausbruch des Sommerekzems zur Folge. 2.3 Das Th1-Th2-Modell Naive T-Zellen können sich nach einer Aktivierung entweder zu einer Th1-oder zu einer Th2 –Zelle entwickeln, die unterschiedliche Zytokine synthetisieren und sich daher in ihrer Funktion unterscheiden (ABBAS et al. 1994).Von dieser Differenzierung der T-Helfer-Zellen, die unterschiedliche Zytokine ausschütten, ist eine adäquate und effektive Immunantwort abhängig. So beruht die Immunantwort gegen extrazelluläre Parasiten vor allem auf komplementbindenden Antikörpern, während intrazellulär vermehrende Viren oder Tuberkelbakterien durch eine T-Zell-Antwort bekämpft werden (PICHLER et al. 1996). Das Immunsystem hat folglich verschiedene Möglichkeiten zu reagieren. Dabei reagiert es normalerweise passend auf eine entsprechende Infektion, d.h. gegen einen intrazellulären Parasiten wird mit einer makrophagenaktivierenden Immunantwort reagiert und nicht mit einer (ineffektiven) Antikörperbildung. Nach und nach wird verständlich, daß gerade in der Wahl der Immunantwort Fehler auftreten können. Klinisch können diese Erkrankungen an einen Immundefekt erinnern, allerdings kann dennoch eine sehr starke, jedoch nicht passende und somit ineffiziente Immunantwort vorliegen. Krankheiten können somit Ausdruck einer nicht passenden Immunabwehr sein. T-Lymphozyten können in verschiedene Subgruppen unterteilt werden: erstens basierend auf der Expression von unterschiedlichen Oberflächenmolekülen CD4 und CD8 (KUPFER & SINGER 1989), zweitens auf unterschiedlicher T-Zell-Rezeptoren (γδ-TCR oder β-TCR) (ALLISON & HAVRAN 1991), drittens auf unterschiedlicher Antigenerkennung/MHCRestriktion (KUPFER & SINGER 1989) und viertens auf unterschiedliche Zytokinsekretionsmuster (MOSMANN et al. 1986). Als T-Lymphozyten besitzen sie alle als gemeinsame Oberflächenstruktur das CD3. Aktivierte T-Lymphozyten setzen zur Regulierung der Immunantwort eine Reihe von Zytokinen frei. Angesichts der großen Anzahl verschiedener Zytokine könnte man, je nach Dominanz des einen oder anderen Zytokins, viele unterschiedliche T-Lymphozyten- - 24 - Literaturübersicht Subpopulationen (Th1, Th2, Th3, Th4) postulieren. Gut nachgewiesen sind allerdings nur Th1- und Th2-Lymphozyten. Diese Dichotomie der T-Helfer-Zellen wurde zuerst bei der Maus (MOSMANN et al. 1986) später beim Menschen (ROMAGNANI 1996) und Pferd (AGGARWAL & HOLMES 1999) entdeckt. Dies trifft sowohl für CD4+- als auch für CD8+T-Lymphozyten zu, ist aber bei CD4+-T-Zellen besser untersucht. Im Wesentlichen werden, wenn man Th0-Zellen als eigenständige Subpopulation betrachtet, 3 Subtypen unterschieden. 2.3.1 Th1-/Th2- Zellen Chronische Stimulationen bewirken bei kürzlich aktivierten, unbeteiligten Vorläufer-CD4+T- Helfer-Lymphozyten (pTh) ein Ausreifen dieser zu T-Zellen, welche ein eingeschränktes Zytokinmuster sezernieren. Diese weiter differenzierten T-Lymphozyten können nach Aktivierung in der Regel hohe Konzentrationen bestimmter Zytokine sezernieren. Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (pTh) mit IL-12, IFNγ oder TGFβ (Transforming growth factor) inkubiert, resultieren Th1-Zellen, die viel IFN , IL-12, IL-2, TNF-β und TGF-β freisetzen, aber nur wenig bis kein IL-4, IL-5 (MAGGI et al. 1992, PARRONCHI et al. 1992). Werden kürzlich aktivierte, unbeteiligte Vorläufer-CD4+-T-Helfer- Lymphozyten (pTh) dagegen mit IL-4 inkubiert, entwickeln sich Th2-Zellen, die mehr IL-4, IL-6 und wenig bis kein IL-2, IL-12 synthetisieren (MAGGI et al. 1992; PARRONCHI et al 1992; ABEHSIRA-AMAR et al. 1992; MANETTI et al. 1993; HSIEH et al. 1993). Bei Kostimulation mit IL-4 und IL-12 dominiert die Wirkung des IL-4 (PEREZ et al. 1995; SCHMITT et al. 1994). Ähnlich ist es beim Th2-Zytokin IL-6, das in hohen Konzentrationen trotz Vorhandensein von IL-12 die Generierung von Th1-Zellen aus naiven T-Zellen verhindert (RINCON et al. 1997). Mäuse, die ein genetisches Expressionsdefizit für IL-12- oder IL-12Rβ1-Ketten haben, generieren keine Th1-Zellen (MAGRAM et al. 1996; WU et al. 1997). Ebenso bilden sich keine Th2-Zellen bei Mäusen, die keine IL-4- oder IL-4R-Ketten exprimieren können (KUHN et al. 1991; KOPF et al. 1993). Eine Zusammenfassung des Th1-/Th2-Konzepts ist in Abbildung 1 dargestellt. Wichtig ist, dass die gebildeten Zytokine wie IL-4 oder IL-12 nicht nur das eigene Milieu stimulieren und amplifizieren (LICHTMAN et al. 1987), sondern auch die Entwicklung des anderen Milieus (Th1 bzw. Th2) unterdrücken. So hemmt die Zugabe von IL-4 die Ausreifung zu Th1 oder die Zugabe von IL-12 die Reifung von Vorläufer-CD4+-T-HelferLymphozyten zu Th2 (MAGGI et al. 1992; PARRONCHI et al 1992; MANETTI et al. 1993; - 25 - Literaturübersicht HSIEH et al. 1993). Insofern sind entsprechende Zytokine bzw. zytokinproduzierende Zellen suppressiv für die Entwicklung der anderen Art der Immunreaktion. Dieser Grundsatz ist jedoch nicht einfach auf bereits polarisierte Th2-Zell-Klone übertragbar, da man durch IL-12 bei diesen T-Zellen in vitro eine Steigerung der IL-4-Produktion herbeiführen kann (SCHMITT et al. 1994; JEANNIN et al. 1995). IL-12 während einer Inokulation von Leishmania-Parasiten gegeben, bewirkt in Balb/c-Mäusen eine IFN-γProduktion und hemmt die IL-4-Bildung. Gibt man IL-12 jedoch zwei Wochen nach der Infektion, so kommt es zu einer erhöhten IL-4- Produktion (WANG et al. 1994). Außer diesen beiden Subpopulationen existieren auch sogenannte Th0- und Th3-Zellen.Th0 Zellen sind in der Lage, sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zu sezernieren (FIRESTEIN et al. 1989). Th3-Zellen sezernieren große Mengen des Transforming Growth Factor ß (TGFß) (CHEN et al. 1994). 2.3.2 Effektor-Funktionen der Th-Zellen-Subtypen Insgesamt sollte man sich vergegenwärtigen, daß die Unterscheidung Th1/Th2 nicht immer ganz strikt ist und oft eher ein tendenzieller denn absoluter Unterschied der Zytokinproduktion zu messen ist. Besonders bei Menschen wird deshalb häufig der Begriff Th1- oder Th2-ähnlich (engl. Th1-like, Th2-like) verwendet. Dennoch ist diese Unterteilung konzeptionell sehr wertvoll, da sie unterschiedliche Immunreaktionen und somit unterschiedliche Krankheitsmanifestationen erklärt. Die klassische Einteilung in humorale und zellulär-vermittelte Immunität findet sich auf der Th-Zellebene in Th2- bzw. Th1vermittelter Antworten wieder (MOSMANN et al. 1996; ABBAS et al. 1996). Th1-Zellen repräsentieren die „zellvermittelte Immunität“. IFNγ, als Haupteffektorzytokin der Th1-Zellen, aktiviert Makrophagen und steigert deren mikrobioziden Angriff, stimuliert die Produktion von komplementbindendem und Phagozyten-Fc-Rezeptor-bindendem IgG (ABBAS et al. 1994). Zusätzlich fördern Th1-spezifische Zytokine die Differenzierung von CD8+-Lymphozyten zu zytotoxischen Zellen und aktivieren Neutrophile und natürliche Killerzellen (NK-Zellen), d.h. sie sind für die Vernichtung von Bakterien (TRINCHIERI 1995), die Elimination von intrazellulären Erregern wie Bakterien, Viren und Parasiten (ABBAS et al. 1996) zuständig. Th2-Zellen vermitteln in erster Linie humorale Immunantworten. IL-4 und IL-5 fördern die Produktion von IgE und die Differenzierung und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten (ABBAS et al. 1994). Außerdem verhelfen Th2- - 26 - Literaturübersicht Zellen B-Lymphozyten zur Produktion von großen Mengen an IgM und nichtkomplementbindenden IgG-Isotypen. Eine wichtige Rolle der Th2-Zellen scheint in der Regulation der zellvermittelten Immunantwort zu liegen. IL-4 und IL-13 antagonisieren die makrophagenaktivierende Wirkung von IFNγ. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, daß Th1-Zytokine wie IFNγ, IL-12 und IL-2 und die Generierung einer CD8+-zytotoxischen T-Zell-Antwort für die Bekämpfung einer Virusinfektion nötig sind (KARUPIAH 1998). Das Th2-Zytokin IL-4 wird dabei ebenfalls produziert, um wahrscheinlich zusätzlich die humorale Immunantwort über Antikörper in Wege zu leiten (KARUPIAH 1998). Th1-Zellen triggern DTH-Reaktionen (Delayed-Type-Hypersensitivity) und bewirken bei der Maus einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG2a, während Th2-Zellen Hypersensitivitätsreaktionen vom Typ I triggern und einen Immunglobulinklassen-Switch zu IgG1 bewirken (ABBAS et al. 1996). Neuere Publikationen zeigen eine unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit von Th1- bzw. Th2-Zellen. Diese unterschiedliche Gewebemigrationsfähigkeit beruht auf einer unterschiedlichen Expression von Zelloberflächenrezeptoren. Th1-Zellen von Mäusen, aber nicht Th2-Zellen, können an P- und E-Selektin binden (AUSTRUP et al. 1997) und somit in inflammatorisches Gewebe eindringen und dort eine DTH-Reaktionen (Delayed-TypeHypersensitivity) auslösen. Die Migration von Th1-Zellen in inflammatorisches Gewebe kann durch Antikörper gegen P- und E-Selektin blockiert werden. Humane Th2-Zellen exprimieren für das Chemokin Eotaxin einen Eotaxin-Rezeptor, genannt CCR3, der ursprünglich auf Eosinophilen und Basophilen beschrieben wurde (SALLUSTO et al. 1997). Somit können CCR3-exprimierende Th2-Zellen in allergisch entzündliches Gewebe eindringen und durch die Produktion von IL-4 und IL-5 Basophile und Eosinophile aktivieren.aktivieren. 2.4 2.4.1 Entwicklung von Th1- und Th2-Subtypen. Entwicklung von Th1-Subtypen Neuere Arbeiten haben zu einem besseren Verständnis der Entwicklung naiver CD4+-TLymphozyten zu Th1- und Th2-Subtypen geführt. Th1- bzw. Th2-Zellen entwickeln sich von einer Vorläuferzelle, nämlich dem naiven CD4+-T-Lymphozyten (HSIEH et al. 1992; - 27 - Literaturübersicht SEDER, R. A. & PAUL, W. E. 1994). Während ihrer Begegnung mit Antigenen produzieren naive CD4+-T-Lymphozyten (entspricht Th0-Zellen) initial geringe Mengen IL-2, IL-4 und IFN-γ (NAKAMURA et al. 1997). Die Entscheidung, in welchen Th-Subtypen sie sich entwickeln, scheint in hohem Maße von Zytokinen abzuhängen, denen sie bei der primären Aktivierung auf der Ebene der TCR-Bindung ausgesetzt sind (ABBAS et al. 1996; SEDER R. A. & PAUL W. E. 1994). IL-12, rasch nach dem Kontakt von aktivierten Makrophagen mit mikrobiellen Produkten, Lipopolysacchariden, Viruskomponenten, intrazellulären Bakterien (Listeria monocytogenes und Mykobakterien) und Protozoen (TRINCHIERI 1997) und dem Kontakt mit antigenpräsentierenden Zellen (=APC, z.b. dendritischen Zellen) (MACATONIA et al. 1995) produziert, ist das bedeutendste Th1-induzierende Zytokin, während IL-4 (SWAIN et al. 1990) das wichtigste Th2-induzierende Zytokin zu sein scheint (Abb.1) Abbildung 1: Differenzierung von CD4+-T-Helfer-Subtypen zu Th1- bzw. Th2-Zellen (APC=antigenpräsentierende Zelle) (Modifiziert nach MURAILLE & LEO 1998; PICHLER 1997) Mikroorganismen, wie z.B. Listerien und Mykobakterien, die Makrophagen und NK-Zellen aktivieren, stimulieren die Produktion von IL-12 und IFNγ (HSIEH et al. 1993; TRINCHIERI 1995; GAZZINELLI et al. 1993). IL-12 aktiviert zudem auch bei NK-Zellen die IFN-γProduktion (GAZZINELLI et al. 1993). IFN-γ wiederum bewirkt eine erhöhte Ausschüttung von IL-12 bei Makrophagen. Kürzlich aktivierte, unbeteiligte CD4+-Vorläufer- Lymphozyten - 28 - Literaturübersicht (pTh) bilden Rezeptoren für IL-12 und bekommen eine erhöhte Ansprechbarkeit auf IL-12 (WENNER et al. 1996), da IFN-γ eine Aufregulation der β2-Untereinheit des IL-12Rezeptors bewirkt (ROGGE et al. 1997). Der IL-12-Rezeptor besteht aus einer β1- und einer β2-Kette. Während die β1-Kette von Th1und Th2-Zellen gebildet werden kann, wird die signalweitergebende β2-Kette nicht von Th2Zellen exprimiert (SZABO et al. 1997). Bindet sich IL-12 an diesen Rezeptor, so werden mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich STAT1, STAT2 und STAT4, aktiviert. Dabei ist von den drei aufgezählten STAT4 der wichtigste Transkriptionsfaktor, der zur Produktion von IFNγ führt (JACOBSON et al. 1995). In Tierversuchen mit genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT4 (KAPLAN et al. 1996; THIERFELDER et al. 1996) oder IL-12 (MAGRAM et al. 1996) exprimieren können, findet keine Th1-Entwicklung statt. IFNγ fördert im Anschluß daran die Th1Differenzierung, indem die IL-12-Sekretion durch Makrophagen gesteigert wird und zusätzlich die IL-12-Rezeptor-Expression auf den T-Zellen beibehalten wird (TRINCHIERI 1995; SZABO et al. 1997). IL-12 und IFNγ wirken zusammen auf Makrophagen und Lymphozyten im Sinne der Generierung einer Th1-Population 2.4.2 Entwicklung von Th-2 Subtypen Die Effekte von IL-4 bei der Induktion der Th2-Entwicklung dominieren über Th1polarisierenden Zytokine (HSIEH et al. 1993; SEDER RA & PAUL WE 1994), so dass sich bei Erreichen einer bestimmten IL-4- Schwelle bei Beginn der Immunantwort Th2-Zellen differenzieren und hohe Mengen an IL-4 produzieren. IL-4, als Anstoß für die Entwicklung des Th2-Musters, kann nicht nur von differenzierten THelfer-Zellen, sondern, in der frühen Immunantwort auch von einigen anderen Zellen gebildet werden. Dazu gehören Nicht-T- bzw. Nicht-B-Zellen aus dem Knochenmark, die der Mastzell- bzw. Basophilenabstammung angehören (PICCINNI et al. 1991), Mastzellen (BRADDING et al. 1992), Basophile (BRUNNER et al. 1993) und Eosinophile (MOQBEL et al. 1995). Kürzlich wurde auch gezeigt, daß wahrscheinlich von APC (antigenpräsentierende Zellen) stammendes IL-6 in der Lage ist, CD4+-T-Zellen zur initialen Produktion von IL-4 zu bewegen, so dass naive CD4+-T-Zellen sich zu Th2-Zellen entwickeln können (RINCON et al. 1997). - 29 - Literaturübersicht Bindet IL-4 an seinen Rezeptor an kürzlich aktivierten unbeteiligten CD4+-Lymphozyten, so wird über STAT6 die Produktion von mehr IL-4 angeregt, was dann in autokriner Weise auf die Lymphozyten wirken kann (SEDER & PAUL 1994; SHIMODA et al. 2003). In genetisch veränderten Mäusen, die kein STAT6 (KAPLAN et al. 1996; SHIMODA et al. 2003) oder IL4 (KUHN et al. 1991; LICHTMAN et al. 1987) exprimieren, findet keine Generierung einer Th2-Antwort statt, was wiederum zeigt, dass IL-4 selbst für die Th2-Entwicklung nötig ist. Neuere Untersuchungen zeigen, bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen, die mit IL-4 behandelt wurden, einen Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch negative Regulation der β2-Kette des IL-12-Rezeptors, wobei jedoch viel von der β1-Kette des IL-12-Rezeptors exprimiert wird, um eine gewisse Empfindlichkeit für IL-12 beizubehalten (SZABO et al. 1997). Durch die Runterregulation der β2-Kette wird bei einer Kostimulation mit IL-4 und IL12 das Th2- Zellmuster bevorzugt. Eine IFNγ-Behandlung bei sich gerade entwickelnden Th2-Zellen führt zu einem Weiterbestehen der Expression der IL-12-Rezeptor-β2Untereinheit (SZABO et al. 1997). 2.5 Th1-/Th2- Switch Eine generierte Th-Zell-Population kann sich bedingt in die andere Th-Zell-Population umwandeln. Dies wurde gezeigt, indem Populationen, die in Zellkulturen bereits in Richtung eines bestimmten Th-Subtyps stimuliert worden waren, anschließend in Richtung des anderen Th-Subtyps stimuliert werden konnten und in denen nach einigen Tagen die Zytokinproduktion gemessen wurde. Es zeigte sich, dass Th1-Zellen, stimuliert mit IL-4, sich in Th2-Zellen umwandeln lassen können, während umgekehrt durch Stimulierung von Th2Zellen mit IL-12 der Switch nicht erfolgte (PEREZ et al. 1995; NAKAMURA et al. 1997). Dies läßt sich wie bereits erwähnt durch den Verlust der Ansprechbarkeit auf IL-12 durch Herabregulation der β2-Kette des IL-12- Rezeptors erklären (SZABO et al. 1997). Stimuliert man jedoch Th2-Zellen mit IFNγ und IL-12, so ist ein Switch zu Th1-Zellen möglich (NAKAMURA et al. 1997), da IFNγ das IL-4-Signal antagonisiert. Nach einer Langzeitstimulation von bereits polarisierten Th1-Populationen mit IL-4 und Th2Populationen mit IL-12 konnten MURPHY et al. (1996) keine Reversibilität in die eine oder in die andere Richtung mehr beobachten. Die Beobachtung, dass IL-12 bei bereits polarisierten Th2-Zell-Klonen sogar in vitro zu einer Steigerung der IL-4-Produktion führt(SCHMITT et al. 1994; JEANNIN et al. 1995). Diese - 30 - Literaturübersicht Beobachtung wurde durch in vivo Versuche bestätigt (BLISS et al. 1996). Wie auch in Abb. 1 zu sehen ist, kann demnach ein vorhandenes Th1-Zellmuster über die Produktion von IL-12 bereits polarisierte Th2-Zell- Klone (auch wenn es verhältnismäßig wenige sind) zur Steigerung der IL-4-Produktion anregen, wodurch eine Limitierung des Th1-Zellmusters erfolgt (IL-4 hemmt das Th1- Muster). Ein vorhandenes Th2-Zellmuster kann nach bisherigem Wissen sich selbst zu Gunsten des Th1-Zellmusters nicht limitieren. In den Fällen, wo das Th1-Muster nicht schnell und effektiv genug bestimmte Krankheitserreger eliminieren kann, kann es zu einem Switch zum Th2-Zellmuster kommen. Dies würde die mögliche entzündliche Gewebsschädigung durch das Th1-Zellmuster verringern, aber auch eine Erregerpersistenz unterstützen. Das Persistieren eines Erregers wiederum kann, möglicherweise über die antigenpräsentierenden Zellen (APC), die über eine IL-12Produktion ein chronisches Bestehen des Th1-Zellmusters bewirken können, eine entzündliche Gewebsschädigung unterhalten. Zwei Arbeitsgruppen haben beschrieben, daß Th2-Klone nach Stimulation mit IL-12 vorübergehend IFNγ bilden können, ohne jedoch dabei die Expression ihres typischen Th2Zytokin-Profils aufzugeben (MANETTI et al. 1993; YSSEL et al. 1994). 2.6 Th1- oder Th2- beeinflussende Faktoren Ob sich eine Th1- oder Th2-Antwort entwickelt, hängt von verschiedenen Faktoren ab, die zur Zeit der beginnenden Immunantwort vorherrschen. Dazu gehören die Antigendosis (HOSKEN et al. 1995), die Natur des Immunogens, die Zytokine, die während der AntigenPräsentation vorhanden sind, die Kostimulation der T-Zellen (Review in KELLY et al. 1998), der Typ der antigenpräsentierenden Zellen (APC), der Weg des Antigeneintritts (MEEUSEN 1998), das Vorhandensein bestimmte Hormone und auch bisher undefinierte individuelle Faktoren wie der genetische Hintergrund des Wirts (ABBAS et al. 1996; HSIEH et al. 1995; CONSTANT & BOTTOMLY 1997). Diese Faktoren können die Produktion oder die Präsenz von IL-12 und IL-4 während der primären Stimulation von naiven CD4+-T-Zellen beeinflussen. Viele anti-inflammatorische Substanzen wirken über die Induktion der IL-10-Produktion und/oder Hemmung der IL-12-Produktion immunsuppressiv und können Einfluß auf das Th1Th2-Zellmuster nehmen. Dazu gehören Substanzen, die die intrazelluläre cAMPKonzentration erhöhen, wie Prostaglandine (PGE2) (VAN DER POUW KRAAN et al. 1995), - 31 - Literaturübersicht β2-Rezeptor-Agonisten (PANINA-BORDIGNON et al. 1997) und PhosphodiesteraseInhibitoren (z.B. Pentoxyfillin) (MOLLER et al. 1997). Prostaglandin E2 (PGE2) inhibiert zusätzlich die IFNγ-Produktion mitogenstimulierter peripherer Blutlymphozyten. Unbeeinflußt bleibt dabei die IL-4-Produktion (SNIJDEWINT et al. 1993). UV-Strahlen regen in Keratinozyten die Produktion von IL-10 an (ULLRICH 1994). Dehydroepiandrosteronsulfat verstärkt die Th1-Antwort, während Glukokortikosteroide, Progesteron und 1,25(OH)2Vitamin D3 die Th2-Aktivität intensivieren (ROMAGNANI 1996). Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kommt bei der Th-Zelldifferenzierung ebenfalls eine Funktion zu: Normale, ruhende T-Lymphozyten differenzieren in IL-2- und in IFNγsezernierende Zellen, wenn das Antigen von Makrophagen präsentiert wird. Fungieren BZellen als APC, entwickeln sich IL-2-produzierende T-Lymphozyten, die nach Restimulation ein Th2-Muster entwickeln können (SCHMITZ et al. 1993). Die Zytokinproduktion im humanen Blut scheint einen tageszeitlichen Rhythmus zu zeigen. Ein Peak in der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IFNγ, TNFα, IL-1 und IL-12 wird zur Nachtzeit sowie am frühen Morgen erreicht. Dieser Rhythmus scheint im Zusammenhang mit der rhythmischen Ausschüttung von körpereigenem Kortisol zu stehen (PETROVSKY & HARRISON 1998). - 32 - Literaturübersicht 2.7 Klinische Beispiele für Th1- oder Th2- Muster bei humanen Erkrankungen Bei einer großen Anzahl von Krankheiten kann man eine physiologische bzw. pathophysiologische Th1- oder Th2-Immunantwort beobachten (Tabelle 2). Th1 Th0 Th2 Helicobacter –pyloriinduzierte Gastritis1 Lyme Arthritis 2 Morbus Crohn3 Akute Nierenabstossung4 Multiple Sklerose5 Typ 1 Diabetes mellitus6 Hashimoto Thyreoiditis7 Habituelle Aborte8 Hepatitis-C-Virus induzierte akute Hepatitis9 Morbus Basedow mit Augenbeteiligung10 Rheumatoide Arthritis11 Progression zu AIDS bei HIV-Infektion12 Systemischer Lupus erythematodes13 Hypereosinophilie Syndrom14 Chron. Hepatitis-C15 Erfolgreiche Schwangerschaft16 Frühlingskonjunctivitis17 Allergische Erkrankungen18 Helminthen-Infektion19 - 33 - Literaturübersicht Tabelle 1: Das Überwiegen des Th1- oder Th2-Musters bei humanen Erkrankungen (nach 1: (DELIOS et al. 1997b);2: (YSSEL et al. 1991);3: (PARRONCHI et al. 1997);4: (DELIOS et al. 1997a);5: (VOSKUHL et al. 1993);6(ZIPRIS 1996);7(DEL PRETE et al. 1989);8: (PICCINNI & ROMAGNANI 1996);9: (SARIH et al. 2000; FAN et al. 1998; PENNA et al. 1997);10: (DE CARLI et al. 1993);11:(DOLHAIN et al. 1996);12: (CLERICI & SHEARER 1993);13 (CALIGARIS-CAPPIO et al. 1995);14:(COGAN et al. 1994);15: (SARIH E et al. 2000; FAN et al. 1998; PENNA et al. 1997);16: (PICCINNI & ROMAGNANI 1996); 17: (MAGGI et al. 1991);18: (ROBINSON & KAY 1996);19: (SCOTT & KAUFMANN 1991). Das Th1-Muster scheint bei der Entstehung von organspezifischen Autoimmunerkrankungen wie z.B. des insulin-abhängigen Diabetes mellitus eine dominierende Rolle zu spielen (ZIPRIS 1996). Die nasale Gabe von Glutamat-Decarboxylase induziert eine Th2-Antwort und verhindert bei Mäusen einen insulin-abhängigen Diabetes mellitus (TIAN et al. 1996). Ebenso läuft bei Patienten mit Autoimmunthyreoiditis (DEL PRETE et al. 1989), Multipler Sklerose (VOSKUHL et al. 1993) die Immunantwort im Sinne eines überwiegenden Th1Zytokinmusters ab. Ein Überwiegen des Th1-Zellmusters mit einer IL-12-Expression konnte auch im Darm von Patienten mit Morbus Crohn nachgewiesen werden (PARRONCHI et al. 1997). Ebenso sind spezifische Th1-Zellen im Antrum von Patienten mit peptischem Geschwür gefunden worden (DELIOS et al. 1997b). Eine akute Hepatitis-C-Infektion, mit Kontrolle der Virusreplikation, geht mit einem Th1-Zytokinmuster (IFNγ) einher, während eine Persistenz des Virus mit Ausbildung einer chronischen Hepatitis-C-Infektion mit einem Überwiegen des Th2-Zytokinmusters assoziiert ist (SARIH et al. 2000; FAN et al. 1998; PENNA et al. 1997). Bei der rheumatischen Arthritis kann man in der Synovialflüssigkeit eine Imbalanz zwischen Th1- und Th2-Zytokinen zugunsten des Th1-Zytokinmusters finden (DOLHAIN et al. 1996). Das Th1/Th2-Zellmuster spielt auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von allogene Toleranz und von Abstoßungsreaktionen. Bei der akuten Abstoßungsreaktion von transplantierten Nieren konnte eine Rekrutierung und Aktivierung von Allotransplantat spezifischen und nichtspezifischen Th1-Zellen mit einer hohen IFN-γProduktion gezeigt werden (DELIOS et al. 1997a). In ähnlicher Weise nimmt das Th1/Th2-Zytokinmusters bei der Schwangerschaft eine wichtige Rolle ein. Eine Abstoßung fetalen Gewebes wird lokal an der materno-fetalen Grenzfläche über einen Switch zur Th2-Dominanz und eine Inhibierung von Th1-Antworten verhindert. Bei Frauen mit habituellen Aborten wurden in der Dezidua höhere Proportionen von Th1-Produzierenden Zellen gefunden (PICCINNI & ROMAGNANI 1996). Im Sinne der Aufrechterhaltung einer Schwangerschaft bewirkt Progesteron bevorzugt die Entwicklung eines Th2-Zellmusters, während Relaxin (ein Hormon des Corpus luteum) die Entwicklung - 34 - Literaturübersicht Th1-Zytokin-produzierender T-Zellen begünstigt (PICCINNI & ROMAGNANI 1996; PICCINNI et al. 1995). 2.8 Immunmodulation 2.8.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten Das Konzept der Immunstimulation erstellte Dr. William B. Coley 1907. Er bemerkte spontane Tumorregressionen bei einigen seiner Patienten nach Septikämie. Aus dieser Beobachtung heraus entwickelte er ein Gemisch von Bakterientoxinen (Coley´s Toxin), welches er zur Krebstherapie einsetzte (RUSH 2001). A. MAYR (ROLLE & MAYER 1993) führte den Begriff der „Paramunisierung“ ein. Damit bezeichnete er zunächst begleitende, Antigen unspezifische Wirkungen von Schutzimpfungen, deren funktionelle Mechanismen er fast durchweg den angeborenen Immunmechanismen (Phagozytose, ADCC, Bildung von Interferon, Aktivierung des Komplementsystems, hormonelle Interaktionen) zurechnete. Die „Paramunisierung“ sei allerdings auf die „noch vorhandene Funktionsfähigkeit des Immunsystems und seiner Zellen angewiesen“. Es soll durch die Paramunität ein schnell einsetzender (wenige Stunden), aber nur kurz anhaltender (einige Tage) Schutz des Individuums erreicht werden; ein Boostereffekt soll nicht zustande kommen. TIZARD (1993) definiert Immunstimulanzien durch ihre Fähigkeit, nicht-antigenspezifische humorale und auch zellvermittelte Abwehrmechanismen zu fördern. Dies wird seiner Ansicht nach durch Makrophagen vermittelt, die durch die Phagozytose der Immunstimulanspartikel aktiviert werden und daraufhin bestimmte Zytokine (Interferon, Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin 6 freisetzen und so zu einer Steigerung der Phagozytoseaktivität, der Antikörperproduktion und der Zytotoxizität führen. RUSH (2001) postuliert, dass immunstimulatorische Therapien v.a. bei chronischen oder rezidivierenden Infektionen wirken, da hier eine Immunsuppression oder –toleranz vorläge. Für wenig sinnvoll hält er ihren Einsatz bei akuten Infektionen, da dort das Immunsystem schon maximal stimuliert sei. - 35 - Literaturübersicht 2.9 Bewertung der Proliferation peripherer Blutlymphozyten (PBL) in vitro Die Expansion antigenspezifischer Lymphozyten infolge ihrer Aktivierung und Proliferation stellen die initialen Ereignisse einer spezifischen Immunreaktion auf ein Antigen dar. Für Untersuchungen in diesem Bereich ist die Quantifizierung der Aktivierung/Proliferation von Zellen unabdingbar. Die offensichtlichste, bereits lichtmikroskopisch erkennbare Veränderung eines aktivierten Lymphozyten ist die mit dem Eintritt in die Synthese-Phase des Zellzyklus einsetzende Zunahme seiner Größe bis zum doppelten Ausgangswert in der eigentlichen Teilungsphase. Die Gesamtheit der damit einhergehenden zellulären Veränderungen wird auch als blastische Transformation bezeichnet, an deren Ende die Teilung in zwei Zellen, also eine Vermehrung der Zellen steht. Die erhebliche Variabilität und Mühe der lichtmikroskopischen Quantifizierung über die Zahl der Lymphoblasten führte bereits zu Beginn der sechziger Jahre zu ihrer Verdrängung durch die Messung des Einbaus eines radioaktiv markierten Nukleotids, 3H-Thymidin, in neu synthetisierte DNA. Es ist allgemein bekannt, daß dieses Maßnur bedingt quantitativ mit der DNA-Synthese in Beziehung steht und das Ausmaß der Zellproliferation nur unter streng kontrollierten Bedingungen wiedergibt. Der 3H-Thymidin-Einbau stellt zudem immer ein summarisches Maß für eine Zellkultur dar. Die Mehrheit der Untersucher bedient sich bis heute der 3H-Thymidin-Inkorporation zur Evaluierung der proliferativen Reaktion von Lymphozyten. Eine nicht-radioaktive 3H-Thymidin-Alternative sind die inzwischen weit verbreiteten BrdUAssays: 5-Bromo-2’-deoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidin-Analogon, welches zwar nicht identisch, aber immerhin auf sehr ähnliche Weise wie die herkömmliche Base in DNA eingebaut wird. Detektiert und quantifiziert werden solchermaßen markierte DNA-Moleküle über monoklonale Antikörper (mAbs). Diese binden spezifisch an die eingebauten BrdUAnaloga, welche anschließend über eine Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Reaktion detektiert werden können. Ein großer Vorteil von BrdU-Assays ist deren weitgehende Automatisierbarkeit: Die Tests können in Mikrotiterplatten fließbandartig ausgeführt und anschließend im ELISA-Lesegerät automatisch ausgewertet werden. Ein entscheidender - 36 - Literaturübersicht Nachteil ist die begrenzte Anwendbarkeit bei heterogenen Zellkulturen, somit beschränken sich sinnvolle BrdU-Assays nur auf einheitliche Zellkulturen (z.b. Zellinien) Eine weitere, weit verbreitete, ohne radioaktive Substanzen auskommende Methode zur Messung von Proliferation beschrieb MOSMANN et al. (1986). Diese Methode bedient sich der Eigenschaft lebender Zellen, mit Hilfe ihrer mitochondrialen Dehydrogenasen ein Tetrazolium-Salz, MTT, zu Formazan zu spalten, dessen Menge photometrisch gemessen werden kann. Das so erhaltene Signal spiegelt die Zahl lebender Zellen wider und ist abhängig vom Aktivierungsgrad der Zellen. Der Einbau von 3H-Thymidin und die Werte des einfacher durchzuführenden MTT-Tests korrelieren sehr gut, die Sensitivität ist ebenfalls vergleichbar (HEEG et al. 1985) Seit kurzem sind auch ATP-Assays auf dem Markt. In diesem Test wird mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion, die durch das von aktiven Zellen produzierte ATP (adenosine 5'triphosphate) stattfinden kann, eine dabei entstehende Lumineszenz gemessen. Auf diese Weise lässt sich eine Aussage über die Menge vorhandener ATP-Moleküle treffen, welche mit dem Metabolismus der Zellen korreliert. Gemessen wird das energiereiche Molekül meist über Methoden, welche auf der allgemein bekannten Luciferin-Luciferase-Biolumineszenz beruhen. Luciferase katalysiert die Bildung von Licht aus ATP und Luciferin (dieses wird im Luminometer oder Beta-Counter gemessen (KÖPPELE 2002). Die Technik der Durchflußzytometrie erlaubt, anhand der Lichtstreueigenschaften von Zellen solche unterschiedlicher Größe und morphologischer Komplexität voneinander zu unterscheiden. Bereits 1978 bedienten sich SHU et al. dieser Methode, um den Anteil blastisch transformierter Zellen sowie die Entwicklung der Zellzahl in einer Kultur als Parameter der Proliferation zu bestimmen. Die Untersucher stellten beim Vergleich dieser Methode mit dem 3H-Thymidin-Einbau fest, dass der steile Abfall der Einbauraten von 3HThymidin nach dem Zeitpunkt des Maximalwertes allerdings von einer weiteren Zunahme der Zellzahl begleitet wird. Im Hinblick auf die Erkenntnis, dass in Abhängigkeit vom Stimulus ein Teil der reaktiven Lymphozyten als Folge der Aktivierung abstirbt (aktivierungsinduzierter Zelltod, AICD), weisen auch KABELITZ et al. (1994) auf die Bedeutung der Erfassung der absoluten Zahl vitaler Zellen in einer Lymphozytenkultur nach Stimulation hin und stellen dazu eine Methode zur Anwendung für die moderne Durchflußzytometrie vor, die von PECHHOLD et al. (1994) entwickelt wurde. - 37 - Literaturübersicht 2.10 Mitogene und mitogene Stimulation Lektine (legere: nehmen) (LIS & SHARON 1998; SHARON 1983) sind Proteine, die mit unterschiedlicher Selektivität reversibel Mono- und Oligosaccharide binden, sowie Polysaccharide und Glykoproteine präzipitieren können. Zellen, die „passende“ Zuckerreste an ihrer Oberfläche Tragen, können duch Lektine Agglutiniert und auch aktiviert werden. Die agglutinierenden und präzipitierenden Eigenschaften ähneln denen von Antikörpern. Wichtiger Unterschied zwischen Antikörpern und Lektinen ist, dass Lektine leicht durch Antagonisierung mit Zuckern wieder ablösbar sind, und die Zellen volle Funktion behalten. Zudem werden Lektine nicht nur durch menschliche und tierische, sondern durch Zellen von allen Klassen lebender Organismen produziert. Biologische Aufgaben der Lektine sind die Entfernung von Glykoproteinen aus der Zirkulation, die Adhäsion infektiöser Agentien, die Rekrutierung von Leukozyten und die Zell-Zell-Interaktion im Immunsystem. Lektine stimulieren etwa 70-80% der peripheren Lymphozyten unabhängig von der Antigenspezifität (Antigene stimulieren etwa 0,02%). Nach der Entdeckung der Lektine 1888 wurde das Hauptaugenmerk auf deren Fähigkeit zur Bindung und damit zur Klassifizierung von Blutgruppenantigenen gerichtet. 1960 berichtete Nowell (NOWELL 1960) erstmals über die mitogenen Eigenschaften von PHA und zeigte, dass ruhende Lymphozyten keine enddifferenzierten Zellen, sondern sehr wohl proliferationsfähig sind. 1976 entdeckte Gallo Interleukin-2 im Kulturmedium PHA-stimulierter Lymphozyten (CRUSE & LEWIS 1995). SHARON nutzte Lektinrezeptoren als Lymphozyten Oberflächenmarker (SHARON 1983). Lektine sind oligomere Proteine. Die größte und am besten untersuchte Familie ist die der Leguminose-Lektine, zu der Concanavalin A (ConA; aus der Jackbean (Canavalia ensiformis)), Phytohämagglutinin (PHA; aus der Kidney Bean (Phaseolus vulgaris)), sowie Lektine der Sojabohne (SBA) und der Erdnuss (PNA) gehören. Leguminose-Lektine bestehen aus zwei oder vier identischen 25-30 kD-Untereinheiten, von denen jede eine eigene Kohlenhydratbindungsstelle identischer Spezifität besitzt. Prominente Ausnahme ist das PHA, welches aus fünf tetrameren Glykoproteinen besteht mit Zusammensetzung jedes Glykoproteins aus 2 verschiedenen Untereinheiten: E oder L. E4 (E-PHA) ist ein potentes Hämagglutinin, L4 (L-PHA) ein Leukoagglutinin mit mitogenen Eigenschaften. Die gemischten Formen (z.B. L2E2) sind weniger wirksam. PHA-P ist die Proteinform des Lektins vor Auftrennung in L- und E-Formen. Lektine werden nach ihrer Spezifität für verschiedene Kohlenhydrate klassifiziert: Mannose, Galaktose, N- Acetylglucosamin, L- - 38 - Literaturübersicht Fucose, N-Acteyl-Neuraminsäure. Die Lektine innerhalb einer Gruppe können sich beträchtlich bezüglich ihrer Spezifität unterscheiden (verschiedene Zuckerderivate, Monosaccharide versus Di-, Tri-, Tetrasaccharide). Die Bindung zwischen den LektinProteinen und den Zuckern erfolgt durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen, sowie wahrscheinlich über Koordination mit Metallionen. Innerhalb einer Familie sind die Bindungen strukturell einheitlich, so in der Leguminose-Familie (unabhängig von der Spezifität) durch drei Bindungsstellen, ein Aspartatrest, ein Asparaginrest und eine aromatische Aminosäure. Im Gegensatz zu PWM (pokeweed mitogen, das B- und T-Zellen stimuliert) gelten PHA und ConA als spezielle T-Zellstimulatoren. Mitogene Lektine sind polyklonale Aktivatoren, die Lymphozyten, inklusive Gedächtniszellen, unabhängig von der Antigenspezifität stimulieren. Die T-Zellen proliferieren aber nur, wenn gleichzeitig Monozyten als akzessorische Zellen anwesend sind. B- Zellen proliferieren nicht (ARALACHAVES et al. 1978; CRUSE & LEWIS 1995). PHA bindet an einen Bestandteil des CD3Komplex und an CD2. Weitere Bindungsstellen existieren, sind aber nicht bekannt. Wahrscheinlich ist es ein "cross-linking" zwischen CD3 und anderen T-Zellmarkern (CD2, CD4, CD8, CD11a/CD18, MHC-I), welches für die Aktivierung speziell der T-Zellen verantwortlich ist. Die Rolle der notwendigen akzessorischen Zellen ist unklar. Einerseits könnte es zum "cross-link" zwischen Monozyt und T-Zelle kommen, wodurch die T-Zellen im Microenvironment des Makrophagen (IL1, TNFα) wären. Andererseits ist anzunehmen, dass Mechanismen wie bei Antikörpern, nämlich die Bildung einer Art zellulären Matrix, eine Rolle spielen. In Anwesenheit mitogener Lektine sind CTL in der Lage, eine Großzahl antigenetisch unterschiedlicher Zielzellen zu lysieren, was als lektinabhängige Zytotoxizität bezeichnet wird (analog zur antigenabhängigen Zytotoxizität). Zu diesem Phänomen gehört auch die Tumorzell-Lyse durch Makrophagen. ConA-aktivierte, nicht jedoch PHA-aktivierte, CD4+ T-Zellen supprimieren die Ig-Bildung durch B-Zellen (SLEASMAN et al. 1991), dies jedoch nicht direkt, sondern nur in Anwesenheit von CD8+ T-Zellen. Bei ConA-Aktivierung entstehen also CD4+ Suppressor-Inducer- Zellen, die CD8+ Suppressor-Effektor-Zellen induzieren können, welche wiederum die Ig-Bildung autologer B-Zellen hemmen. Dennoch haben die ConA-aktivierten CD4+ T-Zellen auch potente Helferaktivität für autologe BLymphozyten. Somit findet man in der Population der ConA- aktivierten T-Zellen mindestens zwei Subpopulationen; die Suppressor-Inducer-Zellen und die Helper-Inducer-Zellen, welche sich auch phänotypisch unterscheiden (CD45RA bzw. CDw29) (CRUSE & LEWIS 1995). Hilfe und Suppression beziehen sich dabei auf die Fähigkeit zur Modulation einer B- - 39 - Literaturübersicht Zellantwort. ConA stimuliert vorwiegend die CD45RA-Expression auf CD4-Lymphozyten und verschiebt damit das Gleichgewicht zwischen CD45RA- und CDw29-Expression zugunsten der Suppressor-Inducer- Zellen. Bei PHA hingegen kann man eine Abhängigkeit von der T-Zellkonzentration beobachten. Bei (zunächst) geringer Zelldichte in der Kultur zeigt sich bei PHA-Stimulation eine starke Helferfunktion. Bei hoher Zellkonzentration verlassen die meisten T-Zellen den proliferativen Zellzyklus und entwickeln Suppressorfunktion. Wahrscheinlich ist dies ein natürliches Prinzip, das essentiell für eine physiologische Regulation der Immunantwort und auf eine Großzahl verschiedener Immunreaktionen anwendbar ist. Hauptaufgabe der Lektine ist die Zellerkennung, sowie die Erkennung von Viren (Influenzavirus-Hämagglutinin spezifisch für N- Acetylneuraminsäure) und Bakterien. So kann es z.B. durch Bindung der Pathogene an Makrophagen und andere Immunzellen des Wirtes zur Initiierung einer Immunreaktion ohne klassische Opsonisierung kommen. In Anlehnung zur Opsonophagozytose nennt man diesen Prozeß Lektinophagozytose. Andererseits finden pathogene Mikroorganismen auf diesem Wege ihre Zielzellen. Auch konnte die Adhäsionsfunktion bei der Metastasierung menschlicher Tumoren nachgewiesen worden. Über dies gibt es lösliche Lektine, die - auf Mikroorganismen gebunden - Komplement aktivieren und damit die Lyse einleiten. Mehrere dieser "nicht-immunologischen" Abwehrstrategien gegen Mikroorganismen sind erforscht. 2.11 Bakterielle Superantigene Der Begriff „Superantigene“ bezeichnet eine heterogene Gruppe von Proteinmolekülen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten interagieren. Hierzu ist nicht die intrazelluläre Prozessierung, die üblicherweise für ein Antigen typisch ist, erforderlich (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988), sondern die Aktivierung erfolgt nach Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Molekül der Antigen-präsentierenden Zelle und der VβRegion des T-Zellrezeptors von T-Lymphozyten (GASCOIGNE 1993). Durch diese Interaktion sind Superantigene in der Lage, eine deutlich höhere Prozentzahl des TZellrepertories des Wirtes zu aktivieren als durch die Präsentation eines, auf herkömmliche Weise prozessierten, Antigens erfolgt. In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die - 40 - Literaturübersicht Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993). Die Konsequenzen dieser Art von Interaktion sind vielfältig. Auf der Seite der T Zellen kann dies zu polyklonaler Proliferation, zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991; HUANG & CRISPE 1993). Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei Superantigen-präsentierenden Zellen (MHC-Klasse-II-positiven Makrophagen und deren Varianten; B-Zellen) gemacht werden (AOUDJIT et al. 1995): Auch diese Zellen können nach Superantigenkontakt aktiviert oder getötet werden. 2.11.1 Bindungsmechanismen an Immunzellen Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle Die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle ist unabdingbar für Superantigen-induzierte zelluläre Reaktionen. Untersuchungen mit Staphylokokken-Superantigenen konnten die direkte Bindung an Regionen des Klasse-II-Moleküls außerhalb der Antigenbindungsstelle demonstrieren (DELLABONA et al. 1990). Im Gegensatz zu konventionellen Antigenen müssen Superantigene nicht erst prozessiert werden, um über MHC-Klasse-II-Moleküle den T-Zellen präsentiert werden zu können (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988). Die Bindung der Superantigene an Regionen außerhalb der Antigenbindungsstelle ermöglicht zudem ein breites Spektrum an Bindungsspezifität für verschiedene allele Formen von MHCKlasse-II-Molekülen, da sich die polymorphen Sequenzen der MHC-Klasse-II-Allele vorwiegend im Bereich der Antigenbindungsgrube finden. In Abhängigkeit von der Art des Toxins werden unterschiedliche Bindungsstellen besetzt. Während z.B. SEA und SEE zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf dem Klasse-IIMolekül aufweisen, existiert für SEB und TSST-1 nur je eine Stelle, die im ersten Fall auf eine Domäne der α-Kette beschränkt ist, sich im zweiten Fall jedoch über beide Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls erstreckt. Verschiedene Superantigene unterscheiden sich zudem in ihrer Affinität, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden (CHINTAGUMPALA et al. 1991; LABRECQUE et al.1993). - 41 - Literaturübersicht Bindung an den T-Zellrezeptor Strukturell liegen der Antigenspezifität eines αβ T-Zellrezeptors drei hypervariable Regionen innerhalb der variablen Elemente von α- und β-Kette zugrunde. Superantigene binden außerhalb der Antigenbindungsstelle an allotypische Sequenzen der β-Kette (Vβ-Regionen). Damit überwinden Superantigene die Antigenspezifität der verschiedenen T-Zellrezeptoren, indem sie an eine exponierte und nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligte Stelle im variablen Bereich der β-Kette des Rezeptors binden. 2.11.2 Konsequenzen der Superantigenbindung Im physiologischen Fall werden durch konventionelle Antigene zwischen 0,001% und 0,01% der T-Zellen aktiviert. Superantigene hingegen stimulieren bis zu 25% aller T-Zellen (HERMAN et al. 1991). Die Frequenz Superantigen-reaktiver T-Zellen hängt von der VβSpezifität des jeweiligen Superantigens und von dessen Konzentration ab (FLEISCHER et al. 1991; MOLLICK et al. 1991; IRWIN & GASCOIGNE 1993; SCHUBERTH 1997). Die in vivo Wirkungen von Superantigenen wurden im wesentlichen anhand von Injektionen unterschiedlicher Dosen von Superantigenen- in Mäusen untersucht. Dabei stellte die Modulation bestimmter Zelloberflächenantigene, wie L-Selektin, IL-2- und TransferrinRezeptoren, die zuerst erkennbare Veränderung der reaktiven T-Zellfraktion dar (MIETHKE et al. 1993). Die Aktivierung führt in vivo und in vitro zunächst zu einer Expansion reaktiver T Zellen. Aktivierte T-Zellen können anergisch werden (Reaktionslosigkeit nach erneutem Antigenkontakt) oder eliminiert werden (Induktion von Apoptose) (HERMAN et al. 1991; HUANG & CRISPE 1993). Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T Zellklone. Ein begrenztes Vβ-Spektrum autoreaktiver T-Zellen bzw. eine selektive Expansion bestimmter TZellen wurde in der Tat bei einigen Autoaggressionserkrankungen (z.B. der Rheumatoiden Arthritis und dem Typ I Diabetes mellitus) beobachtet (CONARD et al. 1994, GORONZY et al. 1994). Dies läßt die Beteiligung von Superantigenen in der Pathogenese solcher Erkrankungen zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen. - 42 - Literaturübersicht In Folge der T-Zellaktivierung kommt es zur Produktion und Freisetzung einer Reihe von Zytokinen, die wiederum kaskadenartig zur Aktiverung und Ausdifferenzierung funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen. So können bspw. zytotoxische T-Zellen ausdifferenzieren, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-positive Zielzellen in Anwesenheit von Superantigenen zu töten. Diese sehr potente Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) wird von einem großen Teil CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeübt. Die bereits von ruhenden T-Zellen ausgeführte Zytotoxizität, läßt sich durch Vorinkubation mit Superantigenen noch potenzieren und erstreckt sich u.a. auch auf autologe B-Zellen, Monozyten und aktivierte MHC-Klasse-II-positive T Lymphozyten (HEDLUND et al. 1990). Bei B-Lymphozyten kann die durch Superantigen-vermittelte Interaktion mit T-Zellen zu Proliferation und Differenzierung in Immunglobulin-sezernierende Zellen, aber auch zum Tod führen (MOURAD et al. 1989). HENDRICKS. (1998) fand diese dichotome Reaktionsweise ebenfalls bei bovinen B-Zellen; entscheidend für das Schicksal der B-Zellen war dabei die eingesetzte Konzentration der Superantigene, wobei interessanterweise keine lineare Dosisabhängigkeit bestand. Die Zytokin-induzierende Potenz verschiedener Superantigene, sowie das Spektrum induzierter Zytokine in vivo und in vitro, wurde von verschiedener Seite für Mensch und Maus gezeigt. Allerdings sind die Berichte schwer vergleichbar und kaum zu generalisieren. Zum Teil wurden die Daten nach systemischer Verabreichung von Superantigenen in vivo gewonnen (BETTE et al. 1993; LITTON et al. 1994) oder die Daten beziehen sich selektiv auf einzelne Antigen-präsentierende Zellen (PALKAMA & HURME 1993; CHAPES et al. 1994) oder T-Zellen (KRISTENSSON et al. 1992; DAMLE et al. 1993; LAGOO et al. 1994). Bei menschlichen Monozyten können Superantigene z.B. die Funktion von LFA-1 (MOURAD et al. 1990) sowie die Produktion verschiedener Monokine, z.B. IL-1β und TNFα (TREDE et al. 1991) heraufregulieren. Für das Rind gibt es Berichte über die Induktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in Superantigen-stimulierten monoukleären Zellen des Blutes (YOKOMIZO et al. 1995; SCHUBERTH 1997). In anderen Untersuchungen konnte als Folge der Bindung von Superantigenen an MHC-Klasse-II-Moleküle die Synthese von Stickstoffmonoxid (FAST et al. 1991; CUNHA et al. 1993; HAUSCHILDT et al. 1993; HENDRICKS (1998)) ebenso wie die Induktion Cyclooxigenase-abhängiger ArachidonsäureMetaboliten wie PGE2 (MEHINDATE et al. 1995), HENDRICKS. (1998) demonstriert werden. - 43 - Literaturübersicht Im Unterschied zu den immunologischen Konsequenzen von systemisch wirkenden Superantigenen, wurden die Effekte nach lokalem Kontakt mit Superantigenen bisher erst wenig untersucht. HERZ et al. (1999) studierten die Wirkung von inhaliertem SEB auf die Atemwegsschleimhaut von Mäusen. Niedrig dosiertes SEB provozierte einen Influx von Lymphozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, sowie meßbare Konzentrationen von IL-4, aber nicht IFN-γ, in der bronchialen Lavageflüssigkeit. Diese Ergebnisse lassen u.a. vermuten, dass nach lokalem Kontakt der Mukosa mit Superantigenen eine entzündliche Immunantwort ausgelöst wird, die dem nicht-allergischen Asthma gleicht (HERZ et al. 1999). 2.12 Nekrose Im Gegensatz zur Apoptose ist der Vorgang der Nekrose durch ein Anschwellen der Zelle charakterisiert. Dies führt zur Zerstörung der Plasmamembran und zur Freisetzung des zytoplasmatischen Inhalts in den interzellulären Raum. Eine inflammatorische Reaktion mit einhergehenden Gewebeschädigungen ist die Folge. Die Zellorganellen schwellen ebenfalls an und platzen anschließend, während der Zellkern meistens intakt bleibt (SCHWEICHEL & MERKER 1973). Hauptsächlich tritt Nekrose in den Geweben entweder in Fällen von akutem Sauerstoff- oder Nährstoffentzug oder in Folge von extremer physiologischer Schädigung durch Hitze, Detergenzien oder Radioaktivität auf. Neueste Studien zeigen dagegen, dass der nekrotische Zelltod ebenfalls sowohl während der normalen Physiologie der Zelle als auch während der Entwicklung eines Organismus erscheint (KITANAKA & KUCHINO 1999; CHAUTAN et al. 1999). Unter einigen pathologischen Umständen, wie z. B. bei einem Schlaganfall oder bei durch Zytokine und Toxine induzierter Leberschädigung kann der Zelltod in apoptotischer sowie in nekrotischer Form auftreten (BEILHARZ et al. 1995; CHARRIAUT-MARLANGUE et al. 1996; LEIST et al. 1996). Demzufolge wurde die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodsignalwegs angenommen, der durch ein eingebautes Todesprogramm reguliert wird und von der Apoptosemaschinerie unabhängig ist (KITANAKA u. KUCHINO, 1999). Obwohl erste in vitro-Modelle für einen nekrotischen Zelltod ohne Capasenaktivität beschrieben sind, blieb der molekulare Mechanismus der nekrotischen Form des Zelltods in seiner Gesamtheit weitestgehend unverstanden (DAUGAS et al. 2000; SARIN et al. 1997; TRAPANI et al. 1998; HEIBEIN et al. 1999; WOODLE 1997). - 44 - Literaturübersicht 2.13 Apoptose Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und beschreibt eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert oder einen Baum, der seine Blätter abwirft. Dies gleicht dem Abschnüren von Membranvesikeln, was bei einer besonderen Form des Zelltodes auftritt; deshalb wurde der Begriff Apoptose für diese Art des Todes übernommen. Apoptose oder auch programmierter Zelltod ist ein Vorgang, der physiologischerweise im Körper vorkommt. JACOBSON et al. (1997) teilen die Aufgaben der Apoptose in fünf Gruppen ein: Erstens das Formen von Gewebsstrukturen, zweitens das Zerstören von nicht benötigten Gewebsstrukturen, drittens die Kontrolle der Zellzahl, viertens die Elimination von nicht normalen, nicht funktionierenden oder potentiell schädlichen Zellen bzw. von Zellen, die am falschen Ort sind und fünftens die Produktion von differenzierten Zellen ohne Organellen (z.B. Keratinozyten, Linsenepithel). Als Beispiel für die vierte Funktion kann die Kontrolle sich entwickelnder T- und B-Lymphozyten dienen, von denen die potentiell gefährlichen (autoreaktiven) eliminiert werden müssen (JACOBSON et al. 1997). Die Apoptose ist ein fein regulierter, komplizierter Mechanismus, was auf die große Bedeutung dieses Prozesses für den Organismus schließen läßt. Im Rahmen der Apoptose wird -im Gegensatz zur Nekrose- kein Inhalt der sterbenden Zelle freigesetzt, was z.B. bei der Elimination von im Gewebe befindlichen Neutrophilen sehr wichtig ist, damit es durch die Vielzahl der in ihnen enthaltenden Enzyme nicht zu einer unnötigen Schädigung des umliegenden Gewebes kommt (COHEN 1993). Der Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung von Lebewesen. Er tritt in vielen sich entwickelnden Geweben von Invertebraten und Vertebraten auf (Übersicht bei: GLUCKSMANN 1951; CLARKE & CLARKE 1996). Der Begriff „programmierter Zelltod“ wurde zunächst benutzt, um einen Zelltod zu beschreiben, der an vorhersagbaren Orten und zu vorhersagbaren Zeiten während der Entwicklung auftrat, um zu verdeutlichen, daß der Tod zum programmierten Entwicklungsplan von Organismen gehört (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964). Es war ebenfalls bekannt, daß ein Teil dieser Zelltode durch von anderen Geweben produzierte Substanzen verhindert werden kann. Daraus kann man schließen, daß der Tod nicht unabdingbar ist und durch Signale von anderen Zellen unterdrückt werden kann (SAUNDERS 1996). - 45 - Literaturübersicht Wenn Zellen während der normalen Entwicklung, der Gewebehomöostase oder in der Peripherie von akuten Läsionen sterben, verkleinern sie sich, kondensieren, und die Organellen und die Plasmamembranen behalten ihre Integrität. Diesen Prozeß betitelten (KERR et al. 1974) als Apoptose. Die toten Zellen oder ihre Fragmente werden schnell von residenten Makrophagen phagozytiert, bevor Zellinhalte austreten können. Damit werden Entzündungsreaktionen vermieden. Auf Grund der Tatsache, daß die Morphologie apoptotischer Zellen in allen Geweben und bei allen Tieren sehr ähnlich ist, behaupteten KERR et al. (1974), daß dieser Tod das Spiegelbild eines aktiven, intra-zellulären Todesprogramms sei, das durch eine Vielzahl physiologischer oder pathologischer Stimuli induziert oder verhindert werden kann. Heutzutage ist mit dem Begriff Apoptose jeder Zelltod gemeint, der durch ein intrazelluläres „Todesprogramm“ vermittelt wird, unabhängig davon, wodurch der Tod induziert wird und ob alle charakteristischen Anzeichen der Apoptose gezeigt werden (JACOBSON et al. 1997). Eine Zelle, die dem programmierten Zelltod anheim fällt, wird so schnell entfernt (häufig in einer Stunde oder weniger), daß sogar bei hohen Sterberaten nur wenige tote Zellen zu sehen sind (JACOBSON et al. 1997). Der programmierte Zelltod kann in allen kernhaltigen Zellen ablaufen, beginnend mit der Zygote (WEIL et al. 1996). Durch genetische Studien, besonders in dem Nematoden Caenorhabditis elegans, kam es zur Identifizierung von Genen, die dem Todesprogramm und seiner Kontrolle gewidmet sind (HORWITZ et al. 1982; ELLIS & HORWITZ 1986), später auch zu der Erkenntnis, daß einige dieser Gene homolog zu denen von Säugetieren sind (YUAN et al. 1993). Das zuerst identifizierte, sog. ced-3 Gen, kodiert für eine Cystein-Protease, die homolog zu dem Interleukin-1β-converting enzyme (ICE) ist (YUAN et al. 1993). Das ICE ist eine CysteinProtease bei Säugetieren, die aus Vorstufen das proinflammatorische Zytokin IL-1 produziert wird. Inzwischen sind mehrere dieser Proteasen identifiziert, und sie werden auf Grund ihrer Spaltungsstelle heute einheitlich als Caspasen bezeichnet. Da spezifische Proteine oder Caspase-Inhibitoren die Apoptose verhindern können, scheint klar zu sein, dass Caspasen der zentrale Teil des Todesprogramms sind, obwohl einige von ihnen, so wie der Prototyp dieser Familie, IL-1β-converting enzyme (ICE), auch noch andere Funktionen wahrnehmen (JACOBSON et al. 1997). - 46 - Literaturübersicht 2.13.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose In der ersten Phase der Apoptose verliert die Zelle zunächst den Kontakt zu ihren Nachbarzellen. Das Chromatin des Zellkerns wird stark verdichtet und zu diesem Zeitpunkt durch aktivierte Endonukleasen zuerst in große Fragmente von etwa 50 bis 300 kbp (Kilobasenpaaren) und anschließend in kleinere Fragmente bestehend aus Multimeren von ungefähr 180 bp internukleosomal gespalten. Die kleine Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors DFF40 ist eine solche spezifische Nuklease, die nach gängiger Vorstellung inaktiv als Komplex mit ihrem Inhibitor, der anderen Untereinheit des DNA Fragmentierungsfaktors, im Zytosol vorliegt (LIU et al. 1997; ENARI et al. 1998; SUSIN et al. 1999; SAHARA et al. 1999; ZAMZAMI et al. 2000). Die Aktivierung der nukleolytischen Untereinheit erfolgt über die Abspaltung des Inhibitors durch eine Aspartat- spezifische Cystein-Protease, kurz Caspase genannt. Die übrigen Zellorganellen verbleiben zunächst überwiegend intakt. Die zweite Phase der Apoptose ist gekennzeichnet durch eine Auffaltung der Zellmembran und die Separation zellulärer, insbesondere nukleärer Fragmente. Am Schluss werden die verbliebenen Zellreste durch Phagozytose von Nachbarzellen oder Makrophagen aufgenommen und endgültig abgebaut. Der entscheidende Unterschied zur Nekrose besteht darin, dass die schrumpfende Zelle und die apoptotischen Körperchen von den Phagozyten an den Membranveränderungen, wie z. B. der Umlagerung von Phosphatidylserin von der Innen- auf die Außenseite der Plasmamembran erkannt und beseitigt werden, bevor die Integrität der Zellmembran endgültig verloren geht (REN & SAVILL 1998; FADOK et al. 2000). Dadurch wird eine inflammatorische Reaktion mit einer nachfolgenden Schädigung der Nachbarzellen und eine Aktivierung neutrophiler Granulozyten und Makrophagen vermieden. Die Zellfragmente werden dabei innerhalb von Vesikeln (Phagolysosomen) der phagozytierenden Zelle abgebaut. Um die Phagozytose zu erleichtern, reduzieren apoptotische Zellen ihr Volumen. Sie pumpen Ionen, vor allem K+ Clund organische Osmolyte, nach außen und kontrahieren ihr Zytoskelett (BORTNER & CIDLOWSKI 1999; HUG 2000). Lange Zeit wurde das Ausbleiben einer Entzündungsreaktion als eines der wichtigen Charakteristika des apopotischen Prozesses angesehen. Einige Faktoren wie die Produktion der immunsuppressiven Zytokine Interleukin (IL)-10 und transformierender Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor-beta, TGF-β) sprechen auch für diese - 47 - Literaturübersicht Theorie (RONCHETTI et al. 1999). Je nach Stimulus lassen sich apoptotische Veränderungen bereits nach einigen Minuten oder erst nach Stunden nachweisen. Ob eine Apoptose eingeleitet wird, hängt nicht nur vom Zelltyp ab, sondern auch vom Differenzierungszustand, der Position im Zellzyklus oder der Genaktivierung. Es können sowohl chemische Substanzen wie Glukocorticoide, freie Radikale, Wasserstoffperoxid und Glutamat, wie auch physikalische Schädigungen, bedingt durch UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Gamma- und Beta-Strahlen sowie Hitzeschock, Apoptose einleiten.. Dazu kommen noch sogenannte Todesfaktoren, die Apoptose initiieren können, wie z. B. Fas Ligand (FasL), Tumor Nekrose Faktor (TNF) und der TNF-verwandte Apoptose-induzierende Faktor (TRAIL). Nach der Bindung dieser Todesfaktoren an ihre entsprechenden Rezeptoren wird die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose ausgelöst. Todesrezeptoren weisen eine C-terminale intrazelluläre Todesdomäne (DD) auf, welche als Protein-Protein-Interaktionsmotiv in verschiedenen Rezeptoren, wie z. B. TNF-R1 oder Fas, vorzufinden ist. Mittels der Todesdomäne werden Adapterproteine, die ebenfalls eine Todesdomäne enthalten, an den Rezeptor rekrutiert. Dazu gehören das Fas-assoziierte Protein mit Todesdomäne (FADD), das TNF-R1-assoziierte Protein mit Todesdomäne (TRADD) sowie das Rezeptor-interagierende Protein (RIP). Einige dieser Adapterproteine, wie z. B. FADD, besitzen zusätzlich eine weitere Portein-Protein-Interaktionsdomäne, die Todeseffektordomäne (DED), über die wiederum die Procaspase-8, die ebenfalls eine Todeseffektordomäne aufweist, rekrutiert und durch Autoprozessierung aktiviert wird. Die aktivierte Caspase-8 initiiert eine proapoptotische Signal-Kaskade durch nachfolgende Prozessierung der Effektor-Caspase-3, welche neben der Spaltung von Strukturproteinen auch die ebenfalls ausführenden Caspasen6 und -7 aktivieren kann. Durch zusätzliche Caspase-6-vermittelte Prozessierung der Caspase8 wird ein signalverstärkender Rückkopplungskreislauf eingeleitet. Diese Form der durch Caspasen vermittelten Apoptose wird entweder als Typ I-Apoptose oder als extrinsischer Signalweg zur Apoptose bezeichnet (SCAFFIDI et al. 1998). Im Vergleich dazu wird die Typ- II-Apoptose oder auch intrinsischer Signalweg zur Apoptose unter mitochondrialer Beteiligung initiiert. Auch hier wird durch die Oligomerisierung des Rezeptors Caspase-8 aktiviert. Im nächsten Schritt fragmentiert diese das zytosolische Protein BID, dessen carboxyterminales Spaltprodukt nach seiner Translokation zu den Mitochondrien die Freisetzung von Cytochrom C aus der inneren Mitochondrienmembran in das Zytoplasma vermittelt (LUO et al. 1998; LI et al. 1998). Cytochrom C bindet im Komplex mit dATP an Apaf-1 (Apoptotischer Protease-aktivierender - 48 - Faktor-1), wodurch eine Literaturübersicht Konformationsänderung bewirkt wird, so dass nachfolgend durch homophile Interaktionen der CARD-Domänen von Apaf-1 und Procaspase-9 diese aktiviert wird (LI et al. 1998). Caspase-9 fungiert nun als Initiator-Caspase und prozessiert die Effektor-Caspase-3 und nachfolgend Caspase-6 und -7. Die Signalverstärkung innerhalb der Caspase-Kaskade wird bei diesem Apoptosetyp durch Caspase-7-vermittelte Caspase-9-Prozessierung und durch zusätzliche Aktivierung weiterer Caspase-8-Moleküle erreicht. Dieser Signalweg scheint in Zellen eine Rolle zu spielen, die z. B. durch einen geringen Gehalt an Pro-Caspase-8 die Effektorcaspasen nicht in ausreichendem Umfang direkt aktivieren können. Außerdem beinhaltet er die Grundlage für nicht Rezeptor-vermittelte Apoptoseprozesse, die beispielsweise durch Behandlung mit Chemotherapeutika induziert werden (Übersicht in LOS et al. 1999). Auf welche Weise der intrinsische Signalweg zur Apoptose durch derartige Chemotherapeutika ausgelöst wird, ist bisher nicht vollständig verstanden. Die Hauptbestandteile des Apoptosenetzwerks stellen demnach die Caspasen dar. Diese Enzyme gehören der Familie der Aspartat-spezifischen Cystein-Proteasen an, da sie ihre Substrate nach einem Aspartatrest spalten und sich in dem aktiven Zentrum ein Cystein befindet (TALANIAN et al. 1997). Die Caspasen sind Komponenten der Signalkaskade und werden als Zymogene synthetisiert. Die Primärstruktur der inaktiven Procaspasen besteht aus einer N-terminalen Prodomäne sowie der großen, das aktive Zentrum (p20) und der kleinen (p10) Untereinheit. Die Procaspasen aktivieren sich gegenseitig in einer intrazellulären Caspase-Kaskade mittels Spaltung. Alternativ werden sie über die Wechselwirkung mit Adapterproteinen durch eine Nachbarschafts-induzierte Autoproteolyse aktiviert (THORNBERRY 1997). Durch proteolytische Spaltung werden die große und die kleine Untereinheit von der N-terminalen Prodomäne freigesetzt und setzen sich daraufhin zu einem aktiven Heterotetramer zusammen. Die so gebildete Caspase ist nun aktiv und kann weitere Procaspasen in der Signalkette aktivieren. Die Erkennungssequenzen für die gegenseitige Prozessierung der Caspasen und der Spaltung von Substratproteinen basiert auf einem Motiv von vier Aminosäuren, das jeweils spezifisch für die bestimmte Caspase ist und immer einen Aspartatrest an der vierten Position aufweist (THORNBERRY 1997; TALANIAN et al. 1997). Carboxyterminal dieses Aspartatrestes werden die Substrate dann fragmentiert. Die Funktionsweise der synthetischen Peptid-Inhibitoren (Ac-DEV-CHO oder zVAD-fmk) und der fluorogenen Substrate für die Aktivitätsmessung der Caspasen basiert ebenfalls auf dem Vorhandensein dieser Erkennungssequenzen. Man teilt die an der Apoptose beteiligten Caspasen in zwei Unterfamilien ein. Caspasen mit langen Pro-Domänen, wie z. B. Caspase-8 - 49 - Literaturübersicht und -9, sind meistens in der initialen Aktivierung der apoptotischen Kaskade involviert (Initiatorcaspasen), während Caspasen mit kurzen Prodomänen, wie z. B. Caspase-3, das Apoptoseprogramm zu Ende führen (Effektorcaspasen), indem sie zelluläre Substrate spalten. Die Spaltung dieser zellulären Substrate bestimmt das morphologische und biochemische Bild der Apoptose. Zu diesen Substraten gehören viele Proteine, unter anderem Proteine des Zellgerüsts wie Aktin und Plectin. 2.14 Der programmierte Zelltod und seine unterschiedlichen Formen Der Begriff "programmierter Zelltod" verweist inzwischen auf jede Art von Zelltod, der durch ein intrazelluläres Todesprogramm ungeachtet von seinem Auslöser vermittelt wird. Die Morphologien können entweder Apoptose, Nekrose oder eine Mischung aus beiden Phänotypen sein (SCHWEICHEL & MERKER 1973). Mittlerweile existieren unterschiedliche Bezeichnungen für die verschiedenen Ausprägungen und Morphologien des Zelltods. Es kristallisieren sich jedoch vier Hauptgruppen heraus, in die man die beobachteten Zelltode einordnen kann (LEIST & JAATTELA 2001). (i) Zunächst die klassische Apoptose mit den schon beschriebenen morphologischen und biochemischen Charakteristika, wie das Schrumpfen des Zytoplasmas, ChromatinKondensation, Abschnürung von apoptotischen Körperchen und die Exposition von Phophatidylserin (KERR et al. 1972). Wichtig ist zudem die Aktivierung der Caspasen im Rahmen der apoptotischen Zelltodmaschinerie, deren Inhibition zu einer Blockierung des Zelltods führt. (ii) Daran schließt sich der Apoptose-ähnliche programmierte Zelltod (apoptosis-like programmed cell death) an. Die Chromatin-Kondensation ist hier weniger dicht als bei der klassischen Apoptose. Ebenfalls werden Phagozytose-erkennende Moleküle auf der Zellmembran gezeigt, bevor sich die apoptotischen Körperchen abschnüren. Andere apoptotische Merkmale unterscheiden sich in ihrer Ausprägung und Kombination von denen der klasssischen Apoptose, wobei nicht immer alle Hauptmerkmale zu beobachten sind. Die meisten beschriebenen Modelle der "Caspase-unabhängigen Apoptose" gehören in diese Klasse (BORNER & MONNEY 1999; KITANAKA & KUCHINO 1999; WOODLE et al. 1997). - 50 - Literaturübersicht (iii) Der Nekrose-ähnliche programmierte Zelltod (necrosis-like programmed cell death) wird dagegen definiert über die fehlende Kondensation des Chromatins in der sterbenden Zelle. Verschiedene apoptotische Merkmale können in einem gewissen Grad noch festgestellt werden. Insgesamt unterscheiden sich die auftretenden Morphologien schon beträchtlich von denen der klassischen Apoptose. So laufen die Signalwege des Nekrose-ähnlichen Zelltods Caspase-unabhängig ab, was diese Form des programmierten Zelltods auch ausmacht. Eine Untergruppe dieser Form des Zelltods wird als abgebrochene Apoptose bezeichnet und meint eine induzierte Apoptose, die in dem Bereich der Caspaseaktivierung inhibiert und über einen alternativen, Caspase-unabhängigen Signalweg beendet wird (NICOTERA et al. 1998; HOLLER et al. 2000). (iiii) Im Gegensatz zu den angesprochenen Formen des Zelltodes steht die pathologische Form des Zelltodes, die reine Nekrose, welche in der Vergangenheit eher als passive Form des Zelltodes angesehen wurde, für die jedoch mittlerweile ebenfalls ein eigener Signalweg angenommen wird. 2.15 Bewertung des Zelltodes in vitro Die sicherste Methode stellt die in Routinestudien allerdings nicht praktizierbare Elektronenmikroskopie dar (GOLDSWORTHY et al. 1996 a, b). Zusätzlich wird seit kurzer Zeit auch die fluoreszierende Eigenschaft der kondensierten und damit stärker eosinophilen apoptotischen Körperchen sowie der Nachweis von TGF-ß1 und TGF-ß-“latent associated protein” (TGF-ß-LAP) für die Detektion genutzt (GOLDSWORTHY et al. 1996 b). Mit der Markierung des Phospholipids Phosphatidylserin, das während der Apoptose hauptsächlich an der Zelloberfläche lokalisiert ist, wurde eine weitere Nachweismethode aufgezeigt, die seit kurzem nicht nur in der Durchflusszytometrie eingesetzt werden kann (KOOPMAN et al. 1994; VAN ENGELAND et al. 1998). Mit diesen Nachweismethoden werden apoptotische Zellen und Körperchen über unterschiedlich lange Zeitspannen während des Apoptoseprozesses (GOLDSWORTHY et al. 1996b; LABAT-MOLEUR et al. 1998). - 51 - erfasst Literaturübersicht 2.15.1 Elektronenmikroskopie Am sichersten ist es, die Apoptose ultrastrukturell mit dem Elektronenmikroskop (EM) von Zellzuständen wie der Nekrose, der Mitose und den Zytoplasmaeinschlüssen, abzugrenzen (KERR 1971; WYLLIE et al. 1980; FEHSEL et al. 1994; GOLDSWORTHY et al. 1996b) Anhand des elektronen- und lichtmikroskopischen Bildes wurden die morphologischen Kriterien der Apoptose definiert und die einzelnen Reaktionsschritte der Apoptose erfasst (KERR 1971; KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980): Bei den überwiegend einzeln liegenden apoptotischen Zellen aggregiert zunächst ein Großteil des Chromatins in kompakten granulären Massen halbmond- oder sichelförmig an der Kernmembran. Die zunächst abnorm gewellte Kernmembran kerbt sich zunehmend ein, bis schließlich einzelne Kernfragmente präsent werden. Die Zellen schrumpfen und runden sich ab, so dass in soliden Geweben häufig ein elektronendurchgängiger Hof, ein sogenannter “Halo”, sichtbar wird. Die Schrumpfung resultiert zum großen Teil aus der Abgabe von Wasser an die Umgebung über das dilatierte endoplasmatische Retikulum (ER), dessen Membran zum Teil mit der Plasmamembran verschmilzt. Fortschreitende Kondensation des Zytoplasmas führt zu einer Zusammenballung der langzeitig funktionsfähigen Organellen. Ohne Synthese neuer Membranabschnitte bilden sich infolge der Zytoplasmaverdichtung Plasmamem- branausstülpungen, die sich abschnüren und schließlich Membran-umschlossene apoptotische Körperchen mit oder ohne Kernfragmente bilden. Durch weitere Schrumpfung der apoptotischen Körperchen sind auch diese häufig von einem “Halo” umgeben. Meist übernehmen angrenzende Epithelzellen oder Makrophagen die Aufgabe einer raschen Phagozytose. In Tumoren sind auch die neoplastischen Nachbarzellen an diesem Prozess beteiligt (BURSCH et al. 1990). Bei tubulärer Gewebestruktur werden die Zellen dagegen in das angrenzende Lumen abgegeben und “abgeschwemmt”. Die aufgenommenen apoptotischen Körper werden durch das lysosomale System der “Wirtszelle” abgebaut, was als “sekundäre Nekrose” bezeichnet wird. Zurück bleibt eine kleine Menge nicht verdaubaren Materials, der sogenannte “Restkörper”. In der Regel sind keine Anzeichen einer exsudativen Entzündung zu beobachten, wie sie beim nekrotischen Zelltod zu erwarten sind. Kommt es in der Embryogenese zum Absterben einer großen Gruppe von apoptotischen Zellen, treten zahlreiche Phagozyten auf, bei denen es sich nicht um zirkulierende Monozyten aus dem Blut handelt (SAUNDERS 1996; KERR 1971; WYLLIE et al. 1980). Es sind entweder Gewebemakrophagen oder benachbarte Parenchymzellen (SAUNDERS 1996). - 52 - Literaturübersicht Mittels der Elektronenmikroskopie sind quantitative Auswertungen in einem größeren Studienumfang, wie er in Routinestudien notwendig ist, allerdings aufgrund der Kosten und Zeitaufwandes nicht praktikabel. 2.15.2 Standard-Lichtmikroskopie Der morphologische Nachweis der Apoptose an Standard-H&E-gefärbten Zellen gilt als Standardmethode zum Apoptosenachweis (GOLDSWORTHY et al. 1996 a, b; SLOOP et al. 1999). Im Vergleich zur Elektronenmikroskopie können in der Standard-Lichtmikroskopie nicht alle unter Kapitel 2.15.1 beschriebenen Veränderungen erkannt werden (KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980; GOLDSWORTHY et al. 1996 b; RAY & JENA 2000). Die durch Fragmentierung entstehenden apoptotischen Körperchen (AB) haben unterschiedliche, meist glattrandige Formen und Größen und enthalten keine bis mehrere basophile Chromatinreste. Kleine apoptotische Körperchen werden bei der lichtmikroskopischen Betrachtung häufig nur erkannt, wenn sie derartige Chromatinreste enthalten.Im Verlauf des Prozesses liefern die intrazellulären Ansammlungen zahlreicher Kernfragmente das Bild einer Karyorrhexis (KERR et al. 1972; WYLLIE et al. 1980; GOLDSWORTHY et al. 1996 b). Die geschilderten Veränderungen können nicht bei allen Zelltypen beobachtet werden. Kortikale Thymozyten fragmentieren ebenso wie ihre Kerne sehr begrenzt (WYLLIE et al. 1980; CHAPMAN et al. 1995). Humane lymphatische Leukämiezellen (MOLT-4 Zellen) bilden keine apoptotischen Körperchen, humane promyelozytische Leukämiezellen (HL60Zellen) dagegen schon (CHAPMAN et al. 1995). Bei Skelettmuskelzellen wird die Fragmentierung wahrscheinlich verhindert, indem bei der engen Packung der Myofilamente Verstrebungen entstehen (KERR et al. 1974). Die Tonofilamente der Keratinozyten unterbinden ausgeprägte Oberflächenveränderungen, so dass nur kleine Protuberanzen zu beobachten sind (WEEDON et al. 1979). 2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie Die Fluoreszenzmikroskopie wird vor allem als Auflichtmethode betrieben (BUCHER & WARTENBERG 1991). Die Fluorochrome leuchten auf dunklem Hintergrund auf (BURCK et al. 1988; BUCHER & WARTENBERG 1991). Eosin (Tetrabromfluoreszein-Natrium) gehört physikalisch-chemisch wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin in die Gruppe der - 53 - Literaturübersicht Xanthen-Derivate und wie Brillantsulphoflavin zu den anionischen oder sauren Fluorochromen (BURCK et al.1996). Bei der Fluoreszenzmikroskopie nutzt man zum Nachweis der Apoptose die Eigenschaft von Eosin, das von ihm absorbierte Licht in einer anderen Wellenlänge wieder abzustrahlen sowie die Tatsache, dass apoptotische Körperchen eine deutlich höhere Eosinophilie als vollständige Zellen aufweisen. Hierbei ist zu beachten, dass auch andere Zytoplasmaeinschlüsse (z.B. Proteintropfen) durch ihre Eosinophilie eine fluoreszierende Eigenschaft aufweisen können (ESPADA et al. 1993; STINCHCOMBE et al. 1995; GOLDSWORTHY et al. 1996 a,b). Mit zunehmendem Gehalt an Kernfragmenten wird die Fluoreszenz der apoptotischen Körperchen maskiert (STINCHCOMBE 1996). 2.15.4 Durchflusszytometrie Die Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen war eine der ersten Anwendungen für die Durchflußzytometrie in den frühen 70-iger Jahren. Man hatte erkannt, dass sich bestimmte Fluorochrome wie BrDU, oder Propidiumiodid stöchiometrisch an die DNA anlagern (SHAPIRO 2003).Über den Gehalt des Farbstoffes konnte dann der Gehalt an DNA errechnet werden. Zurzeit ist eine Vielzahl von DNA-Farbstoffen auf dem Markt. Grob kann man sie nach folgenden Kriterien unterscheiden: Lebend- und Totfarbstoffe: Lebendfarbstoffe lassen Untersuchungen an lebenden Zellen zu, sie werden über aktive Transportmechanismen in die Zelle transportiert. Desweiteren unterscheidet man DNA-spezifische Farbstoffe, die sich an die AT- oder GC- Bindung der DNA anlagern, von unspezifischen Farbstoffen die sowohl DNA als auch RNA anfärben und eine Vorbehandlung mit RNA-se nötig machen. Die ältesten Vertreter sind zum einen Propidiumiodid, ein mit Bindung an RNA/ DNA Fluoreszenz entwickelnder Farbstoff. Zum anderen wird das Bis-Benzimidazol HOECHST 33342 benutzt, ein DNA- spezifischer Lebendfarbstoff, der allerdings einen UV-Laser zur Exzitation braucht. Die Mycine wie z. B. Chromomycin 3, ein grünes Fluorochrom, oder Actinomycin D, ein rotes Fluorochrom, sind durch ihre GC-Bindung DNA-spezifisch, benötigen aber fixierte und permeabilisierte Zellen. Die Cyan-Farbstoffe benötigen ebenfalls permeabilisierte Zellen, und, je nach Ausführung (Blau/ Grün/ Rot) entsprechende Lichtquellen wie Argon-UV- oder Neodymlaser oder Quecksilberdampflampen zur Anregung. - 54 - Literaturübersicht Relativ neu sind die SYTO-Farbstoffe, die es als Totfarbstoff (CYTOX) oder als Lebendfarbstoff (SYTO) gibt (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), die jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt werden können (grün, blau, orange, rot). Diese Farbstoffe sind nicht DNA-spezifisch und erreichen nicht die stöchiometrische Zuverlässigkeit wie HOECHST 33342 oder Propidiumiodid. Sie sind daher nicht zur quantitativen DNA-Analyse geeignet, können aber zur Totfärbung genutzt werden. Ein neuer Farbstoff ist das deep-red-anthraquinone (DRAQ5), der DNA-spezifisch ist und sich innerhalb von Sekunden in lebenden Zellen verteilt. Es ist keine weitere Vorbehandlung nötig, und er lässt sich sowohl von Argon- als auch Diodenlaser anregen. Das Emissionsspektrum liegt bei 670 nm, weit vom Spektrum des GFP entfernt. DRAQ5 erreicht dabei die gleiche stöchiometrische Genauigkeit wie Propidiumiodid und ist damit sehr gut zur quantitativen DNA-Bestimmung geeignet (SMITH et al. 1999; WILTSHIRE et al.2000; PAUL et al. 2000). Eine weitere Möglichkeit, die oft in der Durchflusszytometrie eingesetzt wird, ist die Markierung von Membranbestandteilen durch Annexin V. Das anionische Phospholipid Phosphatidylserin ist zu etwa 95% in der zytosolischen Schicht der Doppelmembran der äußeren Zellmembran lokalisiert. Mit der Einleitung des programmierten Zelltodes kommt es durch noch nicht genau geklärte Reaktionsmechanismen zu einer Umverteilung dieses Membranbausteins an die Außenseite der Plasmamembran (DIAZ & SCHROIT 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a,b; VAN ENGELAND et al. 1998). Auch bei Insekten- und Pflanzenzellen kann dieser Wechsel der Lokalisation des PS beobachtet werden (VAN ENGELAND et al. 1998). Nur durch die hauptsächliche Orientierung des Phosphatidylserins zur Zellumgebung ist eine Verschmelzung der Membranabschnürungen und die Bildung apoptotischer Körperchen möglich (DIAZ & SCHROIT 1996). Phosphatidylserin fungiert gleichfalls als Rezeptor für die Phagozyten - speziell für Makrophagen aus der Peritonealhöhle. Durch die schnelle Phagozytose wird ein Austritt chemotaktischer Substanzen mit nachfolgender entzündlicher Reaktion verhindert (DIAZ & SCHROIT 1996; VAN DEN EIJNDE et al., 1997a, b). Eine Sichtbarmachung des nach außen verlegten PS wird durch die Anlagerung des Antikoagulans Annexin V (Synonyme: “Placental Protein 4” (PP4), “Vascular- Anticoagulant-a”) ermöglicht, welches an Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC) oder Biotin gekoppelt ist, wodurch der direkte oder indirekte Nachweis möglich wird (KOOPMAN et al. 1994; VAN ENGELAND et al. 1998). - 55 - Literaturübersicht Da bei der Nekrose ein Verlust der Plasmamembranintegrität innerhalb weniger Minuten eintritt, resultiert bei diesen Zellen eine Farbreaktion an der Membraninnenseite. Eine Zusatzfärbung mit Vitalfarbstoffen (z.B. Propidiumjodid) bietet eine zusätzliche Unterscheidungsmöglichkeit der Annexin-positiven Zellen, da bei apoptotischen Zellen die Vitalfarbstoffe nicht durch die langzeitig unversehrte Membran eindringen können. Bei nekrotischen Zellen wird dagegen der Zellkern angefärbt. Lebende unveränderte Zellen weisen weder die eine, noch die andere Markierung auf (KOOPMAN et al. 1994; MARTIN et al. 1995; VERMES et al. 1995; VAN ENGELAND et al. 1998). Ein Vorteil dieser leicht durchführbaren Nachweismethode ist, dass die Verlagerung von Phosphatidylserin frühzeitig während der Apoptose stattfindet, wenn sonst noch keine bzw. nur sehr feine Abweichungen von der normalen Zellmorphologie zu erkennen sind (MARTIN et al. 1995; VERMES et al. 1995; VAN DEN EIJNDE et al. 1997b; VAN ENGELAND et al. 1998). Die internukleosomale Degradierung der DNS setzt gleichfalls später ein, weshalb einige Zellen Annexin-positiv sind bevor Strangbrüche der DNS mit der TUNEL-Methode aufgezeigt werden können (VAN ENGELAND et al. 1998). 2.16 Quantitative RT-PCR 2.16.1 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS & FALOONA 1987). Immer günstigere Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar. Die PCR ist eine in vitro-Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA-Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Die PCR ermöglicht die Amplifikation sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS & FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb.2): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA- - 56 - Literaturübersicht abhängigen DANN Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNADoppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb.2). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA-Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS & FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002). Abbildung 2: Schematische Darstellung der PCR. Die doppelsträngige DNA α mit der Zielsequenz wird durch Hitzeeinwirkung in die Einzelstränge aufgeschmolzen.Durch Absenken der Temperatur hybridisieren die Primer mit den zu ihnen komplementären Abschnitten.Während der anschließenden , durch thermostabile DNA-Polymerase katalysierten Polymerisationsreaktion bei einer Temperatur zwischen 65-72°C werden die Primer verlängert und es entstehen wieder doppelsträngige Produkte . Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar 1012 Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche Multiplikationsfaktor (bezogen auf - 57 - Literaturübersicht die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000). Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb.3). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abbildung 3; nach KAINZ 2000 modifiziert). Abbildung 3: Grafische Darstellung einer idealisierten PCR (nach KAINZ 2000 modifiziert). Schematische halblogarithmische Darstellung des Verlaufes der Produktakkumulation einer beliebigen Menge Ausgangsfragment versus Zyklenzahl. Eingezeichnet sind die Detektionsgrenze der DNA durch konventionelle Agarosegelelektrophorese und Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, sowie der Messwertbereich und die Plateauphase der PCR, in welcher die Reaktion nicht mehr exponentiell verläuft. Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; (MÜLHARDT 2002)) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000). Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNAStrang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR. Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch - 58 - Literaturübersicht Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000). Soll RNA in der PCR amplifiziert werden, muss mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RNA-ahängige-DNA-Polymerase) zuerst eine komplementäre DNA synthetisiert werden, da RNA nicht als Matrize für die Polymerase geeignet ist. Die dabei entstehenden RNA-DNAHeteroduplexe dienen als Ausgangsmatrize für eine Amplifikation mittels PCR. Als Primer für die Reverse Transkription kann man Oligo-dT-Primer, Hexamere oder spezifische Primer verwenden („spezifisches Priming“). Bei den Oligo-dT-Primern handelt es sich um kurze Nukleotide, die ausschließlich aus der Base Thymidin bestehen. Sie binden an den Poly-ASchwanz von zellulären mRNAs und ermöglichen so eine gezielte Amplifikation der mRNAs. Die Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ist ein wichtiger Teilschritt in der Amplifizierung der gewünschten Zielsequenz. Die Effizienz der cDNASynthese liegt zwischen 5 und 90 %, je nach Optimierung des Protokolls im Labor (RAPPOLEE 1990). Mit der Einführung der PCR in die molekularbiologischen Techniken stand zum erstenmal eine dynamische Methode der DNA-Vermehrung zur Verfügung. 2.16.2 PCR-Methoden zur Quantifizierung Kinetische PCR Für das Design der PCR stehen verschiedene theoretische Ansätze zur Verfügung. Die einfachste Methode ist, die PCR in mehreren Ansätzen getrennt und mit variierenden Zyklenzahlen durchzuführen, die Produkte aufzutrennen und zu quantifizieren. Beim Plotting mehrerer Zyklen versus der Produktmenge kann man auf die Menge an gesuchter DNA (target-DNA) zurückzuschließen. Diese Methode wird auch als kinetische qPCR bezeichnet (KÖHLER et al. 1995) Kompetitive PCR Die kompetitive PCR ist eine der älteren etablierten Methoden in der Reihe der qPCRs. Einen Erstbeschreiber festzulegen, ist nicht ohne weiteres möglich. Die ersten Publikationen zu diesem Thema erschienen 1989. BECKER-ANDRE und HAHLBROCK 1989, koamplifizierten ein um ein Basenpaar verändertes DNA-Fragment. Sie führten damit eine neue Restriktionsschnittstelle ein, welche im Wildtyp nicht vorhanden war. Damit konnten sie die entstandenen Produkte über eine Restriktionsendonukleasebehandlung eindeutig als Standard oder Wildtyp identifizieren. KELLOGG et al., (1990), quantifizierten HIV I-DNA - 59 - Literaturübersicht durch Koamplifikation mit einer Sequenz des DQ alpha locus der HLA-Region. Es ist nicht von Relevanz, ob es sich ursprünglich um RNA oder DNA handelt, denn RNA muß praktisch immer zuerst durch reverse Transkription (RT) in DNA umgewandelt werden, um eine PCR durchzuführen. Bei einer kompetitiven PCR gibt es zusätzlich zur target-DNA-Region eine zweite DNA-Sequenz (der sogenannte Standard), welche gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsansatz amplifiziert wird. In den frühen Arbeiten über qPCR wurde oft ein endogenes housekeeping gene (Referenzgen) koamplifiziert. Später ging man meist zu künstlich hergestellten Fragmenten über. Man amplifiziert eine target-DNA gleichzeitig mit einem Standard. Dieser Standard muß gut von den Produkten der target-DNA separierbar sein. Dies wird meistens durch eine identische Sequenz mit einer künstlich eingebauten Deletion oder Insertion von einigen Basenpaaren erreicht. Dann lassen sich die DNAFragmente z.B. über ein Gel durch Laufzeitunterschiede auftrennen. Die Menge der zugesetzten Standard-DNA kann dann so variiert werden, daß in etwa gleiche Mengen an target-Produkt als auch Standard-Produkt entstehen. Unter der Voraussetzung, daß beide nur geringfügig unterschiedliche Fragmente mit einer vergleichbaren Effektivität amplifiziert werden, kann man sagen, dass beide in dergleichen Menge vor der PCR vorhanden waren. Diese Aussagen müssen mit Plotmethoden überprüft werden, damit man von einer gewissen Zuverlässigkeit dieser Methode ausgehen kann. Zu diesem Thema wurde mittlerweile eine Anzahl von theoretischen Ansätzen publiziert (RAEYMAEKERS 1993; CONNOLLY et al. 1995). Limiting dilution PCR Die PCR ist unter extrem optimierten Bedingungen fähig einzelne DNA-Moleküle zu Signal zu amplifizieren. 1992 wurde von SYKES et al. die Idee zur Quantifizierung unter dem Stichwort limiting dilution qPCR genutzt. Im Prinzip wird die zu quantifizierende Menge an target-DNA in entsprechend kleinen Schritten verdünnt und mit PCR amplifiziert. Bei einem oder auch mehr vorhandenen target-DNA-Molekülen wird ein PCR-Produkte erhalten. Ist die Verdünnung jedoch so stark, dass statistisch gesehen kein einziges DNA-Molekül vorhanden ist, gibt es keine PCR-Produkte mehr. Die Messergebnisse dieser Methode sind also diskrete Alles-oder-Nichts-Werte. Um diese Alles-oder-Nichts-Werte in reale Mengen umzuwandeln, verwendet man eine statistische Methode, die sogenannte Poisson-Verteilung. Die PoissonVerteilung wird bei sehr seltenen, asymmetrischen und diskreten Ereignissen angewendet (Wissenschaftliche Tabellen. Geygy,1985, S.225). - 60 - Literaturübersicht 2.16.3 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung) Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden. Radioaktivität Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (SEIBEL et al. 1991). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen die umständliche Handhabung sowie die Entsorgung. ELISA ALARD stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten IL2 mRNA aus 40 Jurkat Zellen quantifizieren. Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe und densitometrische Analyse Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragmente mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (CHEHADEH et al. 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden. Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, - 61 - Literaturübersicht führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Probe A mit einer geringeren Menge an Nukleinsäure aufgrund einer höheren Effektivität der PCR als Probe B bei der Auswertung eine stärkere Bande zeigt als Probe B (Abbildung 4). Abbildung 4: Problem der Endpunktquantifizierung in der PCR: Trotz einer größeren Menge an Ausgangsnukleinsäure wird am Ende der PCR für Probe B eine schwächere Bande im Agarose-Gel sichtbar als für Probe A. Eine nahezu korrekte Quantifizierung der Ausgangsmenge ist daher nur in einer real-time Auswertung möglich, da die Kinetik der PCR hier direkt verfolgbar ist. - 62 - Literaturübersicht 2.16.4 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (QRT-PCR) Einleitung Die quantitative real-time PCR ist eine relativ neue Technik, die zu Beginn der 1990er Jahre entwickelt wurde und seit ca. acht Jahren für den kommerziellen Markt verfügbar ist. Einen starken Anstieg der Nutzung dieser Methode gab es in den letzten drei Jahren. Während die Anzahl der Veröffentlichungen in der internationalen Datenbank Medline 1996 19, 1997 28 und 1998 52 betrug, stieg die Zahl 1999 auf 157, 2000 auf 409 und im Jahre 2001 sogar auf 551 (SCHMITTGEN 2001). Die Technologie kombiniert die DNA Amplifikation (PCR) mit der Detektion des Produktes in einem einzigen Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung. Durch das Wegfallen der zeitaufwendigen Auswertung mittels AgaroseGelelektrophorese bietet diese Methode ferner eine beachtliche Zeitersparnis. Bei der Entwicklung dieser Technik war die Grundidee der Versuch, die Amplifikation des PCR Produktes „live“ zu beobachten. Die ersten Ansätze bestanden darin, die PCR alle fünf Zyklen zu stoppen, ein Aliquot zu entnehmen und auszuwerten (GINZINGER 2001). Dieser Ansatz war, insbesondere bei hohem Probenaufkommen, sehr zeit- und arbeitsaufwendig und barg zudem ein hohes Kontaminationsrisko. Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich mit der Markierung der DNA-Fragmente während der Reaktion. Anfang der 1990er wurde festgestellt, dass man über die 5` - 3`Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase eine indirekte Aussage über die Zunahme der Amplifikate während der PCR machen kann. Zu diesem Zweck wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet, die mit den Amplifikaten hybridisierten und durch die Taq-Polymerase enzymatisch gespalten wurden (HOLLAND et al. 1991). Vier Jahre später konnten die radioaktiv markierten Sonden durch Fluorochrommarkierte Sonden ersetzt werden (LEE et al. 1995). Zur selben Zeit zeigte eine andere Forscher, dass auch eine direkte Messung der entstehenden Produkte während der PCR mittels Verwendung interkalierender Farbstoffe möglich ist (HIGUCHI et al.1992, 1993). Bei beiden Entwicklungen erfolgte die Auswertung durch Messung der Fluoreszenz vor und nach der PCR-Reaktion in einem separaten Gefäß. Durch die Kombination eines Thermocyclers mit einer Lichtquelle in Form einer Halogenlampe, eines Lasers oder LEDs (Licht emittierende Diode) sowie eines optischen Detektionsmoduls, konnte nur wenige Jahre später, die Fluoreszenz auch während der laufenden PCR gemessen werden. Eine Auswertung in - 63 - Literaturübersicht Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997). Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: Einem nicht spezifischen Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifischen Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001). Detektionssystem mit interkalierenden Farbstoffen Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb.5). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). - 64 - Literaturübersicht Abbildung 5:Schematische Darstellung der PCR mit DNA interkalierendem Farbstoff CYBR Green. Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002). Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb.6): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb.6). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abbildung 6). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den - 65 - Literaturübersicht Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6). Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Produkt von Artefakten zu unterscheiden (RIRIE et al. 1997). Andererseits ist eine Quantifizierung mittels eines SYBR Green™ Protokolls nur dann möglich, wenn es keine Artefakte oder Primerdimer gibt. Abbildung 6: Darstellung einer Schmelzpunktanalyse Nach der eigentlichen PCR wird das Produkt von 50 °C an in 1 °C Temperaturschritten für jeweils 30 sek bis zu einer Endtemperatur von 95 °C erhitzt. Bei einer für das Produkt spezifischen Temperatur denaturiert der Doppelstrang. Es kommt zu einem Abfall der Fluoreszenz (Peak) 2. Die zwei PCRProdukte (A,B) mit unterschiedlicher Länge schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen. Auswertung der quantitativen real-time Polymerasekettenreaktion Die real-time PCR ermöglicht eine zeitgleiche Auswertung der Reaktion während des eigentlichen Amplifikationsprozesses. Die Auswertung erfolgt in der real-time RT-PCR durch die Messung der emittierten Fluoreszenz eines Farbstoffs. Emittierte Fluoreszenz und - 66 - Literaturübersicht entstehendes Amplifikat sind linear proportional. Durch diese Verhältnismäßigkeit lässt sich über die Messung der Fluoreszenz auf die entstehende Menge an Produkt schließen. Grundsätzlich lassen sich zwei Auswertungsmöglichkeiten bei real-time PCR-Systemen unterscheiden: Die Endpunktmessung und die Echtzeitmessung. Bei der Endpunktmessung, die alle zurzeit erhältlichen Geräte anbieten, werden die Fluoreszenzwerte der Probe zu Beginn (bei einigen Geräten auch zusätzlich einmal in der Mitte der Zyklenanzahl) und am Ende gemessen. Mit dieser Art der Messung ist nur eine qualitative Aussage (Ja/NeinAussage) möglich, da nur ermittelt wird, ob es während der PCR-Reaktion zu einem Anstieg der Fluoreszenz gekommen ist. Eine Beobachtung der Ergebnisse während des Amplifikationsprozesses und eine Quantifizierung sind hier nicht möglich. Bei der Echtzeitmessung wird die Fluoreszenz während jedes einzelnen Zyklus gemessen. Die während des Amplifikationsprozesses gemessene native Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs wird als R bezeichnet. Wird die gemessene Fluoreszenz um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, so wird dieser Wert als dR bezeichnet (Tab.3). Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die gemessene Fluoreszenz mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes abzugleichen (Rn). Der Referenzfarbstoff –meist ROX oder HEX– ist ein fluoreszierender Farbstoff, der allen Reaktionsansätzen in konstanter Menge zugegeben wird. Er dient zur Abgleichung möglicher Fluoreszenzunterschiede der Sonde, die aufgrund von unterschiedlichen Volumina (Pipettierfehlern) in den einzelnen Reaktionsgefäßen entstehen. Des Weiteren dient der Referenzfarbstoff zum Abgleich variierender Fluoreszenzwerte, die dadurch entstehen, dass die optische Detektionseinheit von Reaktionsgefäß zu Reaktionsgefäß fährt und so unterschiedliche Aberrationen des Lichtes entstehen können. Wird die gemessene Fluoreszenz mit Basislinie und Referenzfarbstoff korrigiert, so entsteht der Wert dRn (Tab.3). RReporter = native Fluoreszenz dR = RReporter – Basislinie Rn = RReporter – RReferenzfarbstoff dRn = RReporter – RReferenzfarbstoff – Basislinie Tabelle 2: Die während einer real-time PCR gemessene native Fluoreszenz (RReporter) wird im Folgenden an die Fluoreszenz der Basislinie und der des Referenzfarbstoffs angepasst. Das real-time System erzeugt aus den ermittelten Fluoreszenzwerten eine grafische Darstellung, die als Amplifikationsgrafik bezeichnet wird. Zur veranschaulichenden - 67 - Literaturübersicht Darstellung wird die gemessene Fluoreszenz auf der Ordinate gegen die Zyklenanzahl, auf der Abszisse aufgetragen (Abb.7) Abbildung 7: Darstellung einer Amplifikationsgrafik. Die gemessene Fluoreszenz (Ordinate) wird gegen die Zyklenzahl (Abszisse) aufgetragen. Dabei zeigt der Reaktionsansatz schon eine gewisse Grundfluoreszenz (GF), bevor es zur Amplifikation gekommen ist. Aus der Standardabweichung der Fluoreszenz zwischen Zyklus 3 und 15 multipliziert mit dem Faktor zehn, wird ein Fluoreszenzwert errechnet, der zur Grundfluoreszenz der Proben addiert wird. So ergibt sich der Schwellenwert (Threshold). Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Schwellenwert wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet. Er markiert einen Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert. Die bei der real-time PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine gewisse Grundfluoreszenz auf. Ferner haben auch die verschiedenen verwendeten Materialien, wie z.B. die Plastikreaktionsgefäße, bei Anregung eine gewisse Hintergrundfluoreszenz. Der Fluoreszenzwert, gemessen beim Start der Reaktion, ist daher nicht gleich Null. Im Falle einer negativen QRT-PCR verbleibt die gemessene Fluoreszenz unter dem Schwellenwert und verläuft in einer geraden Linie bis zum Ende (Tabelle 2). Im Falle einer positiven Reaktion kommt es zur Amplifikation des Produkts und damit zum Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Reaktion. Vor dem Anstieg der Fluoreszenz verbleibt die gemessene Fluoreszenz für eine gewisse Anzahl an Zyklen unverändert und verläuft als gerade Linie parallel zur Abszisse. Dieser Bereich wird als Basislinie bezeichnet. In diesem Bereich der PCR kommt es zwar schon zur Produktsynthese, die entstehenden Produktmengen sind jedoch so gering, dass es noch nicht zum Anstieg der meßbaren Fluoreszenz kommt (Abb. 8). - 68 - Literaturübersicht Abbildung 8: Relation der gemessenen Fluoreszenz zum entstehenden Produkt in einer real-time PCR. Während schon in den ersten Zyklen PCR-Produkte entstehen, reicht die dabei entstehende Fluoreszenz nicht aus, um ein messbares Signal zu erzeugen. Im Bereich der Basislinie kommt es immer zu leichten Schwankungen in der gemessenen Fluoreszenz. Diese beruhen auf Schwankungen der Fluoreszenz in der Probe (Abb.7). Es muss nun ein Punkt definiert werden, ab dem eine gemessene Fluoreszenz einer Probe klar von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden und als positiv zu werten ist. Hierfür wird ein Schwellenwert gesetzt (Threshold; Abbildung 7). Er stellt eine Trennlinie zur Unterscheidung zwischen Hintergrundfluoreszenz dar. signifikanter Er wird Zunahme definiert als der Fluoreszenz und die Standardabweichung der der Hintergrundfluoreszenz -gemessen zwischen Zyklus drei und 15- multipliziert mit dem Faktor 10. Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz und dem Schwellenwert projiziert auf die Abszisse wird als Zyklen-Schwellenwert (Cycle-threshold (CT)) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert einer QRT-PCR dar. Der CT-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der CT-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion. Quantifizierung Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von - 69 - Literaturübersicht Pathogenesestudien (BUSTIN 2000; FREEMAN et al. 1999; HALFORD 1999; HEID et al. 1996). Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RTPCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen. Dies beruht auf unterscheidlichen Prinzipien des verwendeten Standards. Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die StandardkurvenMethode und die ∆∆Ct-Methode (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine „endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Somit lässt sich anhand der m-RNA des Referenzgens die relative Menge an m-RNA des Zielgenes in einer RT-PCR Probe bestimmen. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Die Verwendung z.B. von GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar. Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist, - 70 - Literaturübersicht das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen. Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren. 1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode: Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander. 2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ∆∆Ct-Methode bezeichnet (LIVAK & SCHMITTGEN 2001). Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der ZielsequenzPCR. Die Formel für die Berechnung lautet: 2-∆∆Ct ∆∆CT = ∆Ctq – ∆Ctcb ∆Ctq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für die Probe ∆Ctb = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe 2.16.5 Vergleich real-time RT-PCR und konventionelle RT-PCR Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Durch das Entfallen der Agarose-Gel-Auswertung nach der PCR sowie das verkürzte Thermoprofil (Zwei-Schritt- anstatt Drei-Schritt-Programme), werden der - 71 - Literaturübersicht Zeit- und Arbeitsaufwand sowie das Kontaminationsrisiko für die Proben und für das Labor reduziert. Die Agarose-Gelelektrophorese braucht nicht automatisiert werden, denn sie ist bei den real-time PCRs nicht notwendig. Viele der zurzeit erhältlichen real-time PCR-Systeme bieten zudem einen hohen Probendurchsatz. So können in den meisten Geräten 96 Proben, in einigen auch 384 Proben auf einmal analysiert werden. Dies bedeutet wiederum eine Zeitersparnis gegenüber der Standard PCR. Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates im Agarose-Gel bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002 ). Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur Standard PCR im exponentiellen Bereich der Reaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR. Als nachteilig gestaltet sich die Inkompatibilität einiger real-time PCR Geräte für die Verwendung bestimmter Sondensysteme, sowie die noch stark eingeschränkte Multiplexfähigkeit der meisten Geräte (MACKAY 2002). Ein weiterer Nachteil sind die Programme, die für die Auswertung der real-time PCR verwendet werden. So wird auf den derzeit erhältlichen Geräten unterschiedlichste Software mit unterschiedlichen Betriebssystemen genutzt. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse, im Speziellen der gemessenen Fluoreszenzdaten und der CT-Werte. Die zur Kalkulation der Werte verwendeten Algorithmen sind einheitlich und standardisiert, doch werden die ermittelten Daten unterschiedlich präsentiert und aufgearbeitet. In diesem Zusammenhang gestaltet sich auch die klare Definition des Schwellenwertes (Threshold) schwierig. Derzeit ist nur definiert, dass die zur Berechnung des Schwellenwertes genutzte Fluoreszenz zwischen Zyklus 3-15 gemessen werden muss. Die derzeitige Definition lässt durchaus Spielraum für Modifikationen. - 72 - Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Geräte 10-Well-Transmigrationskammer 400 µl/285 µl (Fa. Cytogen (442000), OberMörlen) Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser (Wasser und Regenerierstation, System Typ SG-RS90-4 UF“ Barsbüttel) Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden) (Heraeus, Hanau) Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen) Centricon®– Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA) CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel (Alloy Products pressure vessel“ (XX670053)Wisconsin, USA) ® Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan , (Becton Dickinson, Heidelberg) mit angeschlossener Computereinheit Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und (Zeiss (476250-9901), Oberkochen) Phasenkontrasteinrichtung Gelektrophoresekammer BioRad Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau) Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen) Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, (Heraeus Instruments, Osterode) Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz) Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin) Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen) Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen) Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader (Dynatech, Denkendorf, Kontakt: Dynatech MR 5000 Dynex Technologies, USA) Photometer (Eppendorf, Hamburg) Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand (26404), Wertheim) Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel) Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Christ. Osterode) Real-time PCR Gerät „MX 4000 Multiplex (Stratagene (401260) Quantitative PCR System” ,Kalifornien,USA) Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau) Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ (ASID, Unterschleißheim) Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ (ASID, Unterschleißheim) Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ (Dynatec, Zug/Schweiz) Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten (Heidolph (52100), Schwabach) - 73 - Material und Methoden „Rumo100“ Thermozyklerm „Tgradient“ Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Biometra, Göttingen) (Wifug (10209), Bradford/England) (Hermle, Gosheim) Transformator für Elektrophorese „Herkules 200“ UV-Bestrahlungsbox Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ Zählkammer nach Bürker (BioRad) (Kloos,Langenhagen) (GFL, Hannover) (Brand, Wertheim) 3.2 Material 3.2.1 Verbrauchsmaterialien BD Vakutainer® CAT, 10 ml Becton Dickinson, Heidelberg BD Vakutainer® K2E 18 mg,10 ml Becton Dickinson, Heidelberg BD Vakutainer® K2E 18 mg, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg BD Vakutainer® CAT, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg Deckgläser Roth, Karlruhe Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,55 x 25 mm, Terumo Corporation, Leuven, pyrogenfrei Belgien Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,9 x 25 mm, Terumo Corporation, Leuven, pyrogenfrei Belgien Eppendorf-Reaktionsgefässe, 1,5 ml Greiner, Frickenhausen Injektionsspritzen, 2 ml, 5 ml, 10 ml Braun Melsungen AG, Melsungen Mikrotiterplatten Nunc-Immuno-Plate Maxisorb, Nunc, Wiesbaden F 96 Objekträger Roth, Karlsruhe Papier, saugfähig Einzelhandel Pipettenspitzen, blau und gelb Sarstedt, Nürnbrecht - 74 - Material und Methoden RS-Röhrchen (RIA), 5 ml Greiner, Frickenhausen Sterilfilter, 0,45µm, 0,2 µm Renner, Dannstadt Vacutainer Systems Precision Glide, 0,9 x 38 mm Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer Systems, Halter Becton Dickinson, Heidelberg Zentrifugenröhrchen, 50 ml, steril Corning Inc., NY, USA 3.2.2 Chemikalien und Reagenzien Agarose Aqua Dest molekularbiologisch rein AccustainTM, Wright Stain, modified Acridinorange Ammoniumchlorid (NH4Cl) Brilliant Sybr Green® Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) Chloroform (CHCl3) Citronensäure Monohydrat Concanavalin A D(+)-Glukose (wasserfrei) Desoxyribonuclease I, RNase-Free Diethylpyrocarbonat Dimethylsulfoxid (DMSO) DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM, schwere und leichte Ketten dNTP 10 (Nukleotidgemisch) Ethanol 641 (absolut, vergällt) Ethanol, absolut Ethidiumbromid Ethylendiamine-Tetraacetat (EDTA) Fetales Kälberserum (FCS) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Formaldehyd 37%, Rotipuran® Isoamyl Alcohol ((CH3)2CHCH2CH2OH) Interleukin-8, human, rekombinant (72a.a.) Kaliumchlorid (KCl), kristallin Kaliumhydrogencarbonat, reinst (KHCO3) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat L-Glutamin Lymphozytenseparationsmedium Fa.GIBCO BRL(15510-027)Eggenstein Fa. Sigma-Aldrich (W4502), Steinheim Fa. Sigma Diagnostics, St. Louis/USA Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (A4514), Steinheim Fa. Stratagene (600548),Kalifornien, USA Fa. Sigma-Aldrich (C-3881), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (C-7559), Steinheim Fa. Roth (5110.1), Karlsruhe Fa. Amersham Biosc. (17-0450-01) Fa. Fluka (49140), Buchs/Schweiz Fa Sigma (D-7291) Deisenhofen Fa. Sigma-Aldrich (D-5758), Steinheim Fa. Baker (7033), Deventer/Holland Fa.Dianova (115-015-068) Fa. Invitrogen (18427-013) Fa. CG Chemikalien, Laatzen Fa. J.T. Baker (8228), Deventer/Holland Fa. Sigma-Aldrich (E8751), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin; Fa. Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim Fa. Roth (49794.1), Karlsruhe Fa. Sigma-Aldrich (W205702), Steinheim Fa. Pepro Tech (200-08M), Rocky Hill, NJ/USA Fa. Sigma-Aldrich (P-4504), Steinheim Fa. Merck (4852), Darmstadt Fa. Roth (8175.1), Karlsruhe Fa. Biochrom (K0283), Berlin Fa. PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich - 75 - Material und Methoden Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) Mikrobieller Immunmodulator (MIM) 2-Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH) N-(2-Hydroxylethyl)piperazin-N’ (-ethansulfonsäure) „Hepes dry substance“ (HEPES) Natriumazid (NaN3), 10%ig Natriumbicarbonat (NaHCO3) Natriumchlorid (NaCl) Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei Natriumhypochlorit-Lösung 12% Pansorbin®cells (inaktivierte Staphylokokken sp.) Paraformaldehyd PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/L, phosphatgepufferte Salzlösung) Penicillin(-G)-Streptomycin (10.000 U/ml und 10.000 µg/ml) PercollTM Pflanzlicher Immunmodulator (PIM) Phenol (C6H5OH) Phytohemagglutinin (PHA) Polyethylenglycol 8000 (PEG) Propidiumjodid (PJ) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) Staphylococcus aureus-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert Streptomycin (-Sulfat) SuperScript® II RT Taq DNA Polymerase, recombinant Tri-Natriumcitrat (2 x H2O) Trisma® Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) Triton X (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Türk’sche Lösung (Essigsäure-GentianaViolettlösung) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Fa. Sigma-Aldrich (M-0250), Steinheim Private Abgabe, (s. 9) Fa. Sigma-Aldrich (M-3148), Steinheim Fa. Biochrom (L-1603), Berlin Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim Fa. Biochrom (L1703), Berlin Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe Fa. Sigma-Aldrich (S-5881), Steinheim Fa. Roth (9062), Karlsruhe Fa. Calbiochem-Novabiochem (507867), Bad Soden i. Taunus Fa. Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin Fa. Biochrom (A2213), Berlin Fa. Amersham Biosciences (17-0891-01), Uppsala/Schweden Private Abgabe, (s. 9) Fa. Sigma-Aldrich (P-1037), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (L-2769), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (P-2139), Steinheim, Fa. Calbiochem-Novabiochem (537059), Bad Soden im Taunus Fa. J.T. Baker (6081), Deventer/Holland Fa. Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim Fa. Biochrom (A331-27), Berlin Fa. GibcoBRL (1090531) Fa. Invitrogen (10342-12) Fa. Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (T-1503), Steinheim Fa. Sigma-Aldrich (X-100), Steinheim Fa. Merck (1.09277.0500), Darmstadt Fa. Sigma-Aldrich (P-1379), Steinheim - 76 - Material und Methoden 3.2.3 Medien für Zellkulturen Fetales Kälberserum (FCS) Zellkulturmedium kDMEM10 Zellkulturmedium kDMEM3 Zellkulturmedium DMEM10 Zellkulturmedium DMEM3 Zellkulturmedium SFM3 Zellkulturmedium SFM0 FCS wurde bei 56°C für 60 Minuten im Wasserbad komplement- und mykoplasmeninaktiviert. Die Lagerung von sterilen aliquoten Teilen erfolgte bei -20°C. DMEM (Iscove®-Trockenmedium nach Herstellerangaben in 10 L Aqua tridest. gelöst) und komplementiert mit L-Glutamin 4 mmol/L, 50 µmol/L 2-Mercaptoäthanol, hitzebehandelten (s. oben) FCS 10% (v/v) und mit Zusatz von Streptomycin und Penicillin(100 µg Streptomycin,100 IU Penicillin/ ml Medium) Wie kDMEM10, aber mit 3%(v/v) hitzebehandelten (s. oben) FCS Wie kDMEM10, aber ohne Zusatz von 2Mercaptoethanol Wie DMEM10, aber mit 3%(v/v) hitzebehandelten (s. oben) FCS Hybridoma SF Medium mit hitzebehandelten (s. oben) FCS 3% (v/v) und mit Zusatz von Streptomycin und Penicillin(100 µg Streptomycin,100 IU Penicillin/ ml Medium) Wie SFM3, aber ohne Zusatz von FCS 3.2.4 Material für die Separation und Kultivierung von Leukozyten Lymphozytenseparationsmedium (Ficollpräparation) Das Lymphozytenseparationsmedium Ficoll® (s. 3.2.2) ist Lösung eines hochmolekularen Zuckers. Bei 10°C weist das kommerzielle Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml auf. In dieser Arbeit wurde diese Ficollpräparation unverdünnt verwendet. PercollTM Dieses synthetische hypotone Sol, bestehend aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikatpartikeln, hat bei 20°C ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/ml. In dieser Arbeit wurde 100%iges PercollTM (s. 3.1.2) durch Zugabe von kristallinem NaCl (s. 3.2.2; 0,9 g/100 ml PercollTM) in einen isotonen Zustand gebracht und durch Zugabe von 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.2.2) zu 76% bzw 58%igem PercollTM verdünnt Rekombinantes humanes Interleukin-8 (rhIL8) - 77 - Material und Methoden Interleukin-8 übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, s. 3.2.2), das in PBS (3.2.2) mit 0,1% BSA (3.2.2) auf 1 µg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (0,1 µg/ml) mit PBS eingestellt. Natriumchloridlösung, 0,9% NaCl Aqua tridest. ad 8,77 g 1000 ml Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA Die PBS-Trockensubstanz (3.2.2) wurde in Aqua tridest (3.2.2). gelöst. Die Bestandteile (3.2.2) lagen in den folgenden Konzentrationen vor. NaCl 8,0 g KCl 1,24 g Na2HPO4 0,2 g KH2PO4 0,2 g Aqua tridest. ad 1000 ml Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIFPuffer) bovines Serumalbumin 5,0 g Natriumazid 0,1 g PBS ad 1000 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.5 Material für die Durchflusszytometrie Aqua tridest. und Natriumhypochlorit Sterilfiltriertes Aqua tridest. (s3.2.2) und 1%ige Natriumhypochlorit-Lösung (hergestellt durch 12fache Verdünnung der 12%igen Natriumhypochlorit-Lösung (3.2.2) mit Aqua tridest.) wurden zur Spülung und Reinigung des Messkanal- und Schlauchsystems innerhalb des Durchflusszytometers verwendet. Propidiumjodid (PJ) - 78 - Material und Methoden Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ, s. 3.2.2) gelangt nur bei Membrandefekten ins Innere der Zelle und interkaliert dort mit der doppelsträngigen DNA, so dass es nicht mehr aus der Zelle austreten kann. Folglich diente Propidiumjodid als Hilfsmittel zur Beurteilung der morphologischen Integrität der untersuchten Zellen und damit ihrer Vitalität. Aus der kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS (3.2.2) die Gebrauchslösung (100 µg/ml) hergestellt, die in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Bei durchflusszytometrischen Messungen wurden jeder 20 µl PJ-Gebrauchslösung pro ml Untersuchungssuspension zugesetzt, was einer Endkonzentration von 2 µg PJ/ml entsprach. Trägermedium (sheath fluid) zur Einzelzellanalyse Bei dem Trägermedium handelte es sich um PBS (s. 3.2.4) mit Zusatz von Natriumazid (final 1,5 mmol/L, s. 3.2.2). Das Gemisch wurde mit Hilfe des Filters „Sartobran“ (Porenweite 0,2 µm, s. 3.2.1) sterilfiltriert und diente anschließend als Trägermedium für alle Messproben. 3.2.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter Zellzahlen Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung Verwendung fanden bovine, mononukleäre Zellen (MNC), die gemäß der unter 0 zur Gewinnung mononukleärer Zellen beschriebenen Methode mit einer Reinheit von über 98% gewonnen wurden. Nach dem dritten Waschgang wurde die Zellsuspension mit dem monoklonalen Antikörper (mAk) Bo1 (500 µl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 Minuten, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.2.4) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 Minuten mit dem konjugierten Antikörper (DTAF - ZgαM – IgG + M (H + L), 500 µl, 1:100 verdünnt, s. 3.2.2). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit Paraformaldehyd (4% in PBS, s. 3.2.4) 12–24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 3 bis 6 x 104 Zellen/50 µl Sheath fluid-Propidiumjodid-Lösung (2 µg PJ/ml Sheath fluid(3.2.5), bei 4°C lichtgeschützt gelagert. 3.2.7 Materialien für die Bestimmung der Phagozytosekapazität FITC-markierte Mikroben - 79 - Material und Methoden Die Erfassung der Fähigkeit von Leukozyten zu phagozytieren, erfordert für die durchflusszytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 1,5 ml mikrobieller Partikel Suspension (MIM) mit 3,5 ml FITC-Puffer (FITCEndkonzentration 0,00066%) und 50 µl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%,) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s.3.2.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS (3.2.4) bei 14.000 x g für 1 Minute gewaschen und dann auf ca 2 x 108 Mikroben/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürker (3.1), Fluoreszenzmikroskop (3.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert. Serum zur Opsonisierung der Mikroben Zur Opsonisierung der mikrobiellen Partikel wurde natives gepooltes Pferdeserum verwendet, das von 3 gesunden Pferden unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, 3.2.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen für 15 Min mit 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 Min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100 µl, 200 µl und 1 ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS (3.2.4) verdünnte Gebrauchslösung. 3.2.8 Material für molekularbiologische Verfahren Diethylpyrocarbonat-(DEPC-) H2O (1%ig) 2 ml DEPC (s. 3.2.2) Ad 2000 ml Aqua tridest (s.3.2.2) Diese Lösung wurde für mehrere Stunden zur Zerstörung der RNAse inkubiert. Um eine Verunreinigung mit RNAsen auszuschließen, wurde für die DNAse-Behandlung der isolierten RNA sowie für alle Puffer zur Behandlung von RNA und DNA DEPC-H2O verwendet. Vor Gebrauch wurden die DEPC –H2O-haltigen Puffer zur Zerstörung des DEPC 30 min bei 121°C autoklaviert. Tris/NaCl-Lösung - 80 - Material und Methoden Trizma Base 1,00 mol/l (s. 3.2.2) NaCl 0,05 mol/l (s. 3.2.2) ad 500 ml RNAse-freien DEPC-H2O (s.3.2.8). Der pH-Wert wird mit konz. HCl (3.2.2) auf 7,5 eingestellt.Anschließend wurde die Lösung 30 min bei 121°C autoklaviert Tris-EDTA-(TE) Puffer Trizma Base 0,01 mol/l (s. 3.2.2) EDTA 0,001 mol/l (s. 3.2.2) In RNase-freiem DEPC-H2O (3.2.8) gelöst. Anschließend wurde der Puffer autoklaviert . Durch den Zusatz von EDTA werden Mg-abhängige Nukleasen inhibiert. MgCl2/Dithiothretiol-(DTT-) Stock MgCl2 0,1 mol/l (s. 3.2.2) DTT 0,01 mol/l (s. 3.2.2) In RNase-freiem DEPC-H2O (3.2.8) aufgenommen und bei 121°C autoklaviert. DNAse-Mix Für 50 Ansätze wurden benötigt 500µl MgCl2/DTT (s. 3.2.2) 3,6 µl RNAse-freie DNAse (s. 3.2.2) 1996 µl TE (pH 7,4) (s. 3.2.2) Die Lösung wurde auf Eis angesetzt und zu je 50 µl in 1,5-ml Probengefäße aliquotiert und bei -20°C gelagert. DNAse-Stop-Mix EDTA 0,05 mol/l (s. 3.2.2) Na-Acetat 1,5 mol/l (s. 3.2.2) SDS 1% (s. 3.2.2) In RNAse-freiem autoklavierten DEPC-H2O(s.3.2.2) gelöst. Die fertige Lösung wurde in 1,5-ml Probengefäßen zu je 500 µl aliquotiert und bei -20°C gelagert. Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI) Phenol (s.3.2.2) lag in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von 6,7 vor. Es wurde vor der Verwendung mit dem von der Firma mitgelieferten Equilibrierungspuffer auf pH 7,9 eingestellt und in 2,5 ml aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. - 81 - Material und Methoden Für die Herstellung der verwendeten PCI-Lösung werden die 3 Bestandteile in einem Verhältnis P:C:I = 25:24:1 gemischt, bei 4°C gelagert und maximal 4 Wochen verwendet. Chloroform/Isoamylalkohol (CI) Für die Herstellung der verwendeten CI-Lösung werden die 2 Bestandteile (s. 3.2.2) in einem Verhältnis C:I=24:1 gemischt, bei 4°C gelagert und maximal 4 Wochen verwendet. Desoxyribonukleotidtriphosphat-Mix (dNTP-Mix) (10mM) dATP 10 mmol/l (s. 3.2.2) dGTP 10 mmol/l (s. 3.2.2) dCTP 10 mmol/l (s. 3.2.2) dTTP 10 mmol/l (s. 3.2.2) In autoklaviertem DEPC-H2O (s. 3.2.2) aufgenommen. Die Lösung wurde bei -20°C gelagert. TBE-Puffer. 10-fach konzentriert, pH 8,0 Trizma Base 90 mmol/l (s. 3.2.2) Borsäure 90 mmol/l (s. 3.2.2) Na2EDTA 2,5 mmol/l (s. 3.2.2) Ad 1000 ml Aqua tridest Der pH-Wert wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt.Als Gebrauchspuffer wird das Konzentrat 1:10 mit Aqua tridest. verdünnt. Der 1-fach Puffer wird sowohl als Lösungspuffer für Agarose zur Herstellung analytischer Gele (3.3.4.8)als auch als Lösungspuffer für Agarose zur Herstellung analytischer Gele als auch als Laufpuffer für die Gelelektrophorese (3.3.4.8) verwendet. Blaumarker Bromphenolblau 0,01% (s. 3.2.2) Xylene cyanole FF 0,01% (s. 3.2.2) Ficoll 5,0% (s. 3.2.2) Na2EDTA 10 mmol/l (s.3.2.2) Als fertige Gebrauchslösung werden 4 ml der Farbstofflösung mit 6 ml Glycerin (s.3.2.2) vermischt. Zur Kennzeichnung der Lauffront in der Gelelektrophorese werden ca. 1 µl dieser Gebrauchlösung für jede Probe verwendet. Die fertige Gebrauchslösung wurde in einem 15ml Polypropylenröhrchen (s.3.2.1) bei Raumtemperatur (RT) gelagert. - 82 - Material und Methoden 3.2.9 Tiere Für die Untersuchungen standen neben Einsendungen von Blutproben von Patientenbesitzern eine Herde aus 37 Isländerstuten im Alter zwischen 3 und 11 Jahren zur Verfügung. Unter gleichen Haltungsbedingungen waren 14 an Sommerekzem erkrankte, 9 gesunde und 3 Jungtiere mit noch unbekanntem Status untergebracht. An den Probanden wurde eine Beurteilung der vorgenommen. klinischen Zu den Symptome Arbeiten und am Tier deren Entwicklung gehören die im Jahresverlauf Herdenkontrolle des Gesundheitszustandes, sowie die regelmäßige Entnahme von Blutproben. 3.3 Methoden 3.3.1 Blutentnahme Die Blutentnahme zur Gewinnung und Untersuchung von Leukozyten in vitro erfolgte unter keimarmen Bedingungen mit einem Vacutainersystem (s.3.2.1) durch Punktion der rechten oder linken Vena jugularis. Das Blut wurde in Vacutainerröhrchen aufgenommen und bis zur Verarbeitung, die maximal 24 Stunden nach Entnahme erfolgte, bei Raumtemperatur gelagert. 3.3.2 Separation equiner Leukozyten 3.3.2.1 Hypotone Erythrolyse Die Elimination der Erythrozyten aus einer gerinnungsgehemmten Blutprobe wurde entweder durch Dichtegradienten (s. 3.3.2.2) oder durch eine selektive hypotone Lyse ohne Schädigung der Leukozyten erzielt. Zur Vorbereitung der Erythrolyse wurde das gerinnungsgehemmte Vollblut ca. 30 Min bei Raumtemperatur spontan sedimentieren gelassen. Nach Gewinnung von 10 ml des leukozytenreichen Überstandes, welcher immer noch Erythrozyten enthält, wurden diesem zur Erythrolyse zunächst 20 ml kaltes Aqua tridest. (4°C) (s. 3.2.2) zugesetzt und exakt 10 Sekunden durch Zugabe von 20 ml doppelt konzentriertem PBS (4°C; 3.2.4) wieder Isotonie hergestellt. Es schloß sich eine 8-minütige Zentrifugation der Zellsuspension - 83 - Material und Methoden an (220 x g, 4°C). Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in dem verbleibenden Rest des Überstands resuspendiert, in 50 ml PBS (4°C) (s.3.2.4) aufgenommen und erneut zentrifugiert (8 Min, 140 x g, 4°C). Wenn erforderlich wurde nach Zentrifugation und Entfernen des Überstandes der Vorgang der Erythrozytolyse wiederholt (s. oben). Es schlossen sich 2 weitere Waschgänge mit PBS (s.3.2.4), Zentrifugation (8 Min, 140 x g, 4 °C) und Resuspension der Erythrozyten freien Leukozyten in 50 ml PBS an. Am Ende erfolgte die Bestimmung der Leukozytenzahl (s.3.3.3.2) und die Einstellung der erforderlichen Zelldichte. 3.3.2.2 Percoll® Separation Für die Gewinnung von PMN in hoher Reinheit folgte der 30-minütigen ErythrozytenSedimentation eine Percoll®-Dichtegradienten-Zentrifugation. Bei Raumtemperatur wurde Percoll® unterschiedlicher Dichte (55% und 78%; s. 3.2.4) in einem 50-ml- Polypropylenröhrchen (s. 3.2.1) übereinander geschichtet: Zunächst wurden 10 ml des 55%igen Percolls® in das Röhrchen gegeben. Diese Lage wurde mit Hilfe einer 10 ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (0,8 x 50 mm) durchstochen und mit dem 78%igen Percoll® (10 ml) behutsam unterschichtet. Ebenfalls mit Spritze und Kanüle sind vorsichtig und langsam 10 ml des leukozytenreichen Überstandes über die obere Percoll®-Lage geschichtet worden. Anschließend wurde das Röhrchen zentrifugiert (1.000 x g, 20 min, 20°C). Bevor die PMNhaltige Interphase zwischen den zwei Percoll®-Schichten gewonnen werden konnte, wurde der Überstand über der oberen Percoll®-Schicht mit den mononukleären Zellen abpipettiert und 2 mal in PBS gewaschen (1. Zentrifugation: 220 x g, 10 min, 4°C; 2. Zentrifugation: 140 x g, 8 min, 4°C). Letztendlich wurden die PMN 2mal in PBS gewaschen (1. Zentrifugation: 220 x g, 10 min, 4°C; 2. Zentrifugation: 140 x g, 8 min, 4°C). 3.3.2.3 Ficoll Separation Zur Gewinnung mononukleärer Zellen wurde Vollblut mit Natrium-Heparin-Zusatz gewonnen (s.3.2.1). Dieses wurde dann im Verhältnis 1:2 mit 4°C-kaltem PBS in einem 50 ml-Falcon verdünnt. Anschließend wurden 30 ml dieser Suspension mit einer Saugpipette (s.3.2.1) über 15ml Ficollpräparation (s.3.2.4) in einem 50ml -Zentrifugationsgefäss geschichtet. Dieses wurde anschließend für 30 Minuten bei 700 x g und 10°C ungebremst zentrifugiert Anschließend wurde der zellfreie Überstand abgesogen und die darunter liegende - 84 - Material und Methoden MNC-reiche Interphase mit einer sterilen Einmal-Pasteurpipette (s.3.2.1) in ein mit 40 ml PBS gefülltes Falcon überführt und gut vermischt, um das abgeheberte Ficoll zu gleichmäßig zu verdünnen. Nach Auffüllen des Röhrchens mit PBS auf 50 ml wurde es bei 500 x g für 10 Min bei 10°C zentrifugiert. Zum Entfernen von Thrombozyten und Resten von Ficoll aus der Suspension folgten 2 Waschschritte (s. oben), der erste bei 250 x g und der zweite bei 80 x g (ungebremst). Hiernach wurde der Überstand abgesogen und die das Pellet bildenden Zellen im gewünschten Puffer oder Medium auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt. Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. 3.3.2.4 Aufreinigung der Granulozyten mittels Transmigrationsverfahren Für die Gewinnung von PMN in sehr hoher Reinheit folgte der 30-minütigen ErythrozytenSedimentation und anschließender hypotoner Erythrolyse (s.3.3.2.1) eine selektive Transmigration equiner PMN auf rhIL-8 nach FRANK (2000). In vivo führen chemotaktische Stimuli zum Anhaften der zirkulierenden PMN an Gefäßendothelzellen und zur Diapedese. Diese Durchwanderung der Kapillarwand soll hier durch eine künstliche Barriere in Form einer Polycarbonatmembran mit 3 µm großen Poren (s.3.2.1) simuliert werden. Reinigung der Transmigrationskammer (s.3.1) Vor der Testdurchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxid-Lösung (s.3.2.2) und die Silikondichtungsmatte (s.3.1) in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Danach wurden sie dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann für 30 min zum Trocknen in einen Brutschrank (37°C) gestellt. Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile zweimal mit Aqua tridest. gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie mit Papiertüchern abgetrocknet und trocken gelagert. Aufgrund von möglichen Veränderungen in Struktur und Oberfläche der Transmigrationskammer empfiehlt der Hersteller keine Autoklavierung derselben durchzuführen. Auch viele Reinigungs- und Desinfektionsmittel sollten nicht verwendet werden (s. Produktinformationen vom Hersteller). Beschicken der Kammer Als Orientierungspunkte dienten das aufgestanzte Zeichen „np“ auf den Acrylanteilen der Kammer und die abgeschnittene Ecke der Silikonmatte (s.3.1). Sie befanden sich immer übereinander in der rechten oberen Ecke der Kammer. In die Vertiefungen der Bodenplatte wurden 300µl SFM3 Medium (s.3.2.3) mit Zusatz von 100ng/ml rhIL-8 (s.3.2.4) blasenfrei - 85 - Material und Methoden einpipettiert. Diese Flüssigkeit wurde mit 115 µl unverdünntem Percoll® (s.3.2.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 µl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s.3.2.1) muß beachtet werden, dass diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigte die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s.3.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Zuletzt wurde die Zellsuspension (200 µl, meist 2 x 107 Zellen/ml SFM10 (s.3.2.3)) in die obere Vertiefung gegeben. Inkubation Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s.3.1) und diese für den gewünschten Zeitraum, meist für 3 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert. Gewinnung der PMN Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen und dann vollständig entnommen, ohne dabei die Membran zu beschädigen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde verworfen und die Membran mit einem sterilen Wattetupfer vorsichtig getrocknet. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Kammerteil möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (=gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde jede der Vertiefungen der unteren Platte geleert. Die Zellsuspension (435 µl, etwa 15 µl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min - 86 - Material und Methoden zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment resuspendiert. Anschliesend wurde Reinheit durchflusszytometrisch kontrolliert (s.3.3.3.1). 3.3.3 Durchflusszytometrie In einem Durchflusszytometer (s.3.1) werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden von Photomultiplieren aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert. Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (s. 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) zusätzlich Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm; Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jedes Partikel wird als Messereignis festgehalten und insgesamt durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ erfolgte die Computer gestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. - 87 - Material und Methoden 3.3.3.1 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung Die einzelnen Leukozyzenpopulationen unterscheiden sich in ihrer Größe und Komplexität. Die im peripheren Blut vorliegenden monozytoiden Zellen sowie deren Vorläufer erscheinen im Durchflusszytometer als die größten Zellen (höchster Wert im FSC). Demgegenüber nehmen Lymphozyten und Granulozyten einen ähnlichen Wert im FSC an. Diese beiden Populationen kann man über die innere Beschaffenheit der Zellen, also ihre Komplexität oder Diversität, gemessen im SSC, voneinander abgrenzen (s. Abbildung 9) Abbildung 9: Leukozytendifferenzierung mit dem Durchflusszytometer: Darstellung equiner Leukozyten links als Punktdiagramm („Dot Plot“) und rechts als Konturdiagramm („Contour Plot“) (ROHWER 2004). In den hier gewählten Darstellungen werden die morphologischen Eigenschaften einer gemischten Leukozytenpopulation dargestellt. Der forward scatter (FSC) Wert ist ein (relatives) Maß für die Zellgröße, der side scatter (SSC) entspricht dem Grad der Zellkomplexität (äußere sowie innere Strukturvielfalt). Die Größe der Werte wird mit „height“ angegeben und ist dimensionslos. In der linken Abbildung werden die Zellen als Punktdiagramm dargestellt. Die Wolke mit dem höchsten Wert für SSC entspricht polymorphkernigen Granulozyten (PMN), diejenige mit dem höchsten Wert für FSC den monozytoiden Zellen. Unten links in der Darstellung befinden sich eingekreist lymphoide mononukleäre Zellen (MNC). Die nicht eingekreisten Punkte ganz links unten stehen für Zellfragmente (Zelldetritus). Jeder Punkt im Diagramm entspricht einem Messereignis im Durchflusszytometer. Die rechte Abbildung zeigt ein Konturdiagramm der identischen Leukozytenpopulation. Jede Linie umfasst einen Bereich definierter, farblich codierter Zelldichte. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. So wurden bspw. in Mischungen aus - 88 - Material und Methoden PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSCPunktediagramm identifiziert (Abbildung 10 R1: Region 1) und im FL-3/SSCPunktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN (Abbildung 10). Abbildung 10: Logische Verknüpfung durchflusszytometrischer Daten am Beispiel vitaler equiner PMN (ROHWER 2004). Im ersten Fenster links sind die morphologisch trennbaren Populationen kernhaltiger Zellen aus dem peripheren Blut von Pferden dargestellt (s 3.2.9). Über eine Software gestützte Markierung werden in diesem Beispiel nur die PMN ausgewählt. Das mittlere Bild differenziert zwischen Zellen, deren DNA Propidiumjodid eingelagert haben (membrandefekte Zellen, rechte Hälfte des mittleren Bildes) und vitalen Zellen (linker Rand). Im Fenster rechts werden nur noch die lebenden PMN morphologisch dargestellt und können so qualitativ und quantitativ (s.3.3.3) ausgewertet werden. 3.3.3.2 Zellzahlbestimmung Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut In einem Probenröhrchen wurden 20 µl gerinnungsgehemmtes Blut 1:10 mit Türk’scher Lösung (s.3.2.2) versetzt. Diese Lösung enthält Essigsäure, die eine Lyse der Erythrozyten bewirkt, und Gentianaviolett, das Zellkerne anfärbt. Nach guter Durchmischung und dreiminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine Bürker-Zählkammer (s.3.1) befüllt und mindestens 100 kernhaltige Zellen mikroskopisch ausgezählt. Um durchflusszytometrisch nicht nur relative sondern auch absolute Zellzahlen bestimmen zu können, wurden Referenzzellen nach der Methode von HENDRICKS (1998) eingesetzt. Der Messprobe mit unbekannter Zellmenge wurde eine bekannte Anzahl von fluorochrommarkierten bovinen mononukleären Zellen (s.3.2.6) zugegeben, die sich durch ihre Grünfluoreszenz in Verbindung mit hoher Rotfluoreszenz von anderen Zellen differenzieren lassen. Der Messprobe wurden je nach deren Zelldichte so viele Referenzzellen - 89 - Material und Methoden zugesetzt, dass das Verhältnis von untersuchten Zellen zu Referenzzellen zwischen 3 zu 1 bis 1:3 lag. Über folgende Formel konnte unabhängig vom untersuchten Volumen die absolute Zellzahl in einer Probe bestimmt werden: Zellzahl absolut = Anzahl Leukozyten gemessen × Anzahl R eferenzzellen der P robe zugesetzt Anzahl R eferenzzellen gemessen 3.3.4 Konventionelle RT-PCR 3.3.4.1 Präparation der RNA Die Präparation der RNA erfolgte mit Hilfe drei Total-RNA-Isolierungs-Kits.Hierbei wurde die gesamte RNA von 4 x103 Zellen, die unmittelbar nach Gewinnung bei -80°C eingefroren wurden, isoliert. Die Präparation erfolgte nach den Angaben des Herstellers. 3.3.4.2 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit Invisorb RNA Kit 1 Die auf Eis (4°C) aufgetauten Zellen wurden zunächst im 1,5-Probengefäss mit 200 µl des Lysispuffer (R-Puffer) aufgebrochen und 5 Minuten bei RT inkubiert. R-Puffer enthält stark denaturierendes Guanidium-Isothiocyanat zur unmittelbaren Inaktivierung von RNasen. Zur vollständigen Lyse wurden zusätzlich 300 µl R-Puffer hinzugefügt und auf einem Rüttler geschüttelt, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar waren. Nach der Lyse wurden 15µl einer zuvor gründlich resuspendierten InViSorb 50™ Carrier Suspension zum Lysat hinzugefügt, auf einem Rüttler geschüttelt und 5 Min inkubiert. Die gesamte Probe wurde 1 sec bei 8.000 x g. abzentrifugiert und Überstand dekantiert. Es folgten nun drei Waschschritte mit eiskaltem Waschpuffer für 5 sec bei 8.000 x g, um DNA zu entfernen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der restliche Waschpuffer sehr sorgfältig entfernt. Das InViSorb 50™ Carrier Pellet wurde im Vacuum Dessicator (s.3.1) lyophilisiert und anschließend in 25 µl DEPC-H2O (s. 3.2.8 ) resuspendiert. Um RNA zu eluieren wurde InViSorb 50™ Carrier Suspension bei 65°C für 5 Min inkubiert und anschließend 5 Min bei 10.000 x g abzentrifugiert. 20 µl des Überstandes wurden sehr vorsichtig, um einen Übertrag von Silikon-Partikeln zu vermeiden, - 90 - Material und Methoden in ein 1,5 ml Probengefäß transferiert. Dort wurde die so gewonnene RNA bei -20°C gelagert oder sofort in cDNA umgeschrieben (s.3.3.4.6). 3.3.4.3 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit dem Machery&Nagel Nucleo Spin RNA KitDas beim Machery & Nagel Nucleo Spin RNA Kit eingesetzte Prinzip nutzte die Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaseroberflächen, wie bei den Kits der Firma Qiagen (s.unten) besprochen. Das Machery&Nagel Nucleo Spin RNA II Kit enthielt zusätzlich DNase I und den dazugehörigen Reaktionspuffer. 400 µl Puffer RA1 (Kitbestandteil) und 4 µl ß Mercaptoäthanol wurden in einem 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und zur 4 x 103 Zellen wurden hinzugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut gemischt. Anschließend wurden 250 µl 96 % Äthanol hinzugefügt und der Isolierungsansatz auf einem Schüttler gut durchmischt. Die Nucleo Spin Säule (Kitbestandteil)wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gestellt, mit 750 µl RNA-Isolierungsansatz beladen und für 1 Min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Nucleo Spin Säule in ein neues Auffanggefäß überführt und für 1 Min bei 8000 g zentrifugiert. 10 µl rekonstitutierter DNase I (Kitbestandteil) und 90 µl DNase-Reaktionspuffer (Kitbestandteil) wurden miteinander gemischt und davon 95 µl direkt auf die Nucleo Spin Säulchen-Membran pipettiert und 15 min bei 24 °C inkubiert. Anschließend wurden 500 µl Puffer RA2 (Kitbestandteil) auf die Nucleo-Spin Säule gegeben. Es folgte 1 min Zentrifugation bei 8.000 x g. Danach wurden Durchfluß und Auffanggefäß verworfen und die Nucleo Spin Säule in ein neues 2 ml Auffanggefäß umgesetzt. 600 µl Puffer RA3 (Kitbestandteil) wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 1 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluß wurde entsorgt. 250 µl Puffer RA3 wurden auf die Nucleo Spin Säule pipettiert und 2 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Danach wurde die Nucleo Spin Säule vorsichtig in ein neues 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und 50 µl RNase freies Wasser (s.3.2.8) dazugegeben. Die RNA wurde durch 1 min Zentrifugation bei 10.000 x g eluiert. 3.3.4.4 Präparation der RNA aus equinen Leukozyten mit RNeasy Kit der Firma Quiagen - 91 - Material und Methoden Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropen Salzes an Glasoberflächen binden. Ein anschließender Waschvorgang entfernt die Verunreinigungen. (VOGELSTEIN & GILLESPIE 1979; BOOM et al. 1990; COLPAN 1992). In Anlehnung an die Originalanleitung des RNeasy Mini Kits wurde RNA folgendermaßen isoliert: 400 µl Puffer RLT und 4 µl ß-Mercaptoethanol wurden in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 4 x 103 Zellen zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Danach wurden 400 µl 70 % Äthanol zur Probe hinzugefügt und alles durch starkes Schütteln mit einem elektrischen Schüttler gut gemischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 µl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7.500 x g für 15 sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend wurde der verbliebene Rest an Probenansatz auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederum 15 sek bei 7.500 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. 700 µl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy-Säule aufgebracht und bei 7.500 x g 15 sek zentrifugiert. Durchfluss und Auffanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 µl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7.500 x g für 15 sek zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 µl Puffer RPE. Danach wurde 2 Min bei 17.000 x g. zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 µl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 Min bei 10.000 g. zentrifugiert. 3.3.4.5 DNAse-Behandlung der aus equinen Leukozyten mittels RNeasy Kit der Firma Quiagen isolierten RNA Die isolierte RNA enthielt noch Reste von DNA, die bei der PCR als genomisches Template mit der cDNA um Primer und Nukleotide konkurrieren können und eine Verfälschung des Ergebnisses hervorrufen können. Zur Eliminierung der DNA wurden die Proben nach dem Protokoll von SAMBROOK et al. (1989) nach Zugabe von 20 µl TE-Puffer (pH 7,4 s.3.2.8) mit 50 µl DNAse Mischung (s.3.2.8) versetzt und anschließend 15 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 µl DNAse-Stop-Mischung (s.3.2.8) beendet. Nach Zugabe von 125 µl Phenol-Chloroform–Isoamylalkohol (s.3.2.8), gründlichem Mischen und anschliessender 10 sec Zentrifugation bei 1.000 x g entstanden zwei Phasen, von denen die - 92 - Material und Methoden obere, wässrige die RNA in gelöster Form enthielt. Diese wurde in ein weiteres autoklaviertes 1,5 ml-Gefäß überführt. Durch Zusatz von 125 µl Chloroform-Isoamylalkohol (s.3.2.8) und erneuter kurzer Zentrifugation wurden Reste von Phenol herausgewaschen. Die obere, wässrige Phase enthielt auch hier die RNA-Fraktion und wurde vollständig in ein weiteres autoklaviertes 1,5 ml-Gefäß überführt. Durch Zugabe von 325 µl kaltem 96%igem Äthanol (s.3.2.2) und Inkubation für 45 Min bei -20°C präzipitierte die RNA, die danach bei 11.000 x g (4°C, 15 Min) zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde mit Hilfe einer Vakuumpumpe (s.3.1) abgesaugt. Die Proben wurden mit 375 µl kalten Ethanols (96%) mit Zusatz von 125 µl Na-Acetats (0,1 M) erneut gewaschen und bei einer Zentrifugeneinstellung von 11.000xg und (4°C, 15 Min) zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder abgesaugt, das Restäthanol wurde bei RT verdampft und die RNA in 30 µl RNAse-freien Wassers aufgenommen. Sie wurde bei -70 °C gelagert oder sofort in cDNA umgeschrieben (s.3.3.4.6). 3.3.4.6 Synthese der cDNA durch Reverse Transkriptions-(RT-) Reaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein molekularbiologisches Verfahren, das die selektive in vitro-Amplifikation einer speziellen DNA-Region ermöglicht. Sie wurde von Karry Mullis 1985 entwickelt (SAIKI et al.1988). Als Template diente in dieser Arbeit komplementäre DNA (cDNA), die durch Umschreiben von mRNA durch eine Reverse Transkriptase (RT-) Reaktion erhalten wird. Die reverse Transkription wurde mit Superscript Reverser Transkriptase (s.3.2.2) nach Angaben des Herstellers (Invitrogen) durchgeführt. Die mRNA wurde durch das Enzym reverse Transkriptase in einzelsträngige cDNA umgeschrieben. Für jeden Ansatz wurden 1µl Oligo(dT)-Primer (500 ng/µl) (Invitrogen, s. 3.2.2) 1µl steriles destilliertes DEPC-H2O (s.3.2.8) und 10µl Gesamt-RNA (s.3.3.4.1) in ein autoklaviertes 200µl-PCR-Reaktionsgefäss (s.3.2.1) mit Deckel pipettiert und durch wiederholtes Aufziehen in der Pipette vorsichtig durchmischt. Die Ansätze wurden zur Denaturierung evtl. gebildeter RNA-Hybride 10 Minuten auf 70°C erhitzt und anschliessend auf 4°C abgekühlt, kurz zentrifugiert, auf 42°C erhitzt.Die Proben wurden 2 Minuten bei 42°C inkubiert, bevor ein sogenannter „Hot start“ beginnt und dann zu jedem Ansatz 8µl eines Reaktionsgemisches aus je: - 93 - Material und Methoden 1µl Superscript (Invitrogen, s. 3.2.2) 4µl 5X First Strand Buffer (Invitrogen, s. 3.2.2) 2µl 0,1 M DTT (Invitrogen, s. 3.2.2) und 1 µl 10 mM dNTP-Mix (Invitrogen, s. 3.2.2) hinzugefügt. Nun inkubierten die Ansätze 50 Minuten bei 42°C im Thermoblock (s.3.1). Die reverse Transkriptase wurde durch Erhitzen für 15 min auf 70°C denaturiert und die Reaktion dadurch gestoppt. Gelagert wurden die cDNA-Proben bei -20°C. 3.3.4.7 Amplifikation der cDNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) Starthilfe für die PCR sind Oligonukleotidprimer, die zu den Enden der zu amplifizierenden Sequenz der DNA-Matrize komplementär sind. Eine thermostabile DNA-Polymerase (taqpolymerase s.3.2.2) verlängert in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) die Primer entlang der einzelsträngigen denaturierten DNA-Matrize (Elongation) und synthetisiert auf diese Weise neue DNA-Stränge, deren Sequenz komplementär zur Matrize ist. Am Ende der Reaktion liegen Doppelstränge vor, die zur Wiederholung der Synthese durch Hitze aufgeschmolzen werden (Denaturierung). Nach Abkühlung der Mischung können sich die Primer wieder anlagern (Annealing) und nach Erreichen der richtigen Temperatur für die Enzymreaktion kann die Polymerase die Primer erneut verlängern. Bei jeder weiteren Runde dienen auch die neu gebildeten DNA-Stränge als Matrize. Ab dem vierten Zyklus vermehrt sich die Ziel-Sequenz unter optimalen Bedingungen exponentiell. Nach 25-30 Runden vermindert sich die Effizienz zunehmend, da die Ziel-Sequenzen untereinander hybridisieren, so dass die Primer mit diesen konkurieren müssen. In der Regel werden 20 bis 40 Zyklen verwendet. Die bei der PCR entstehenden Produkte umfassen nicht immer das vollständige Gen, sondern können auch lediglich einen Teil der Gensequenz darstellen, je nachdem, wie die beiden verwendeten Primer gewählt wurden. Mit Hilfe der PCR wurde cDNA für equines Interleukin-4, Interferon-gamma, Interleukin-10, TNF-alpha sowie Glycerinaldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als sogenanntes „house keeping gene“ nachgewiesen. GAPDH wird in jeder Zelle laufend synthetisiert, so dass sichergestellt war, dass bei der RNA-Präparation mRNA bzw. bei der Reverse-Transkriptase-Reaktion cDNA syntethisiert worden war. - 94 - Material und Methoden Die Polymerase Kettenreaktion wurde in Anlehnung an das Protokoll von SAMBROOK et al. (1989) durchgeführt. Pro Ansatz wurden 1µl cDNA (s.3.3.4.6) 5µl 10x Taq-Polymerase-Puffer (Invitrogen, s.3.2.2) X µl (s.Tabelle 4) MCl2 (50 mM/µl) (Invitrogen, s.3.2.2) 16 µl dNTPs (12,5 mM) (Invitrogen, s.3.2.2) 20 pmol Primer sense (Tabelle 4) 20 pmol Primer antisense (Tabelle 4) 0,5µl Taq-Polymerase (Invitrogen, s.3.2.2) ad 49 µl H2O in ein 200µl-PCR-Probengefaess pipettiert Anschliessend wurden die Ansätze zur Denaturierung der DNA in Thermo-Cycler für 5 Minuten auf 94°C erhitzt. Nun wurde 40 Sekunden die Annealing-Temperatur für das entsprechende Primerpaar (s. Tabelle 4), 60 sec die Elongationstemperatur (72°C) und danach wieder 1 Minute die Denaturierungstemperatur (94°C) gehalten. Dieser Zyklus lief weitere 35 mal ab. Die letzte Elongationsphase erfolgte über insgesamt 7 Minuten, um die Verlängerung der Produkte zu vervollständigen. Nach Beendigung des Programms wurden die Proben bis zum Auftrag auf Agarose-Gel (s.3.3.4.8) bei 4°C aufbewahrt. Tabelle 3: PCR-Bedingungen:Magnesiumchlorid, Annealing-Temp., Zykluszahl GAPDH MgCl2-Konz. IFN-γ IL-4 TNF-α IL-10 1,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 56°C 56°C 60°C 56°C 57°C 39 39 39 39 39 Anneling-Temp. Zykluszahl Tabelle 4:Verwendete Primersequenzen, erhaltene PCR-Produkte sowie Referenzhinweise zu GAPDH, equinem Interleukin-4 (IL-4), equinem Interferon-γ (IFN- γ), Interleukin 10 (IL-10), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) Produkt- GAPDH Primer sense Primer antisense 5`→3` Sequenz 5`→3` Sequenz GAGATGATGACC GTGAAGGTCGGA CTTTTGGC GTCAACG - 95 - länge Referenz 356bp TSO et al.1985 Material und Methoden IL-4 IFN-γ IL-10 TCCAGCTCTGGT CTCATGATCGTCT CTGCTTACTAG TTAGCCTTTCC GAGCCAAATCGT GATTCTGACTCCT CTCCTTCTACTT CTTCCGCTTCCT GCCTTSAGCAGA CCAGGTAAAACTG GTGAAGACTTTC GATCATCTCAGAC TTTC AAGGC GTCTGTGATAGC TACTTGCTATAAT VANDERGRIFFT & 351bp HOROHOV 1993 267bp Eigenes Design 136bp Eigenes Design 152bp Eigenes Design TTTCCGTCATCTA GCTAGGTCAGGG TNF-α 3.3.4.8 G T Agarose-Gelelektrophorese Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in einer Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Im elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente abhängig von ihrer Grösse, der Stromstärke und der Spannung, den Pufferbedingungen und der Agarose-Konzentration im Gel unterschiedlich schnell und weit. Je kleiner die aufzutrennenden Fragmente sind, desto schneller bewegen sie sich im elektrischen Feld. Doppelsträngige DNA-Fragmente können im Gel durch Zusatz von Ethidiumbromid (s.3.2.8) sichtbar gemacht werden. Ethidiumbromid interkaliert in die doppelsträngige DNA. Dadurch kommt es zu einer Änderung seines UV-Spektrums, so dass die DNA-Banden im UV-Licht sichtbar werden. In dieser Arbeit wurde mit 0,8%-igen Agarose-Gelen (s.3.2.8) in 1 x TBE-Laufpuffer (s. 3.2.8) gearbeitet. Dazu wurden 0,8 g Agarose in 100 ml 1 x TBE-Laufpuffer in der Mikrowelle geschmolzen, anschliessend wurden 4µl Ethidiumbromid (s.3.2.8) hinzugefügt und vorsichtig gemischt. 20 ml des noch flüssigen Gels wurden in eine Gelelektophoresekammer (s.3.1) gegossen, in die ein Kamm für die Probetaschen gesteckt war. Nach Erkalten des Agarose-Gels wurde der Kamm gezogen. 8µl der PCR-Probelösung wurden herauspipettiert und mit ca. 1µl Blaumarkerlösung (s. s.3.2.8) auf einem Stück Parafilm® (s3.2.1) gemischt. Nun wurden 25 ml 1 x TBE Laufpuffer auf das erkaltete Gel gegossen. Der Proben-Blaumarker-Mix wurde gesamthaft in die Probentaschen pipettiert. Das in ihm enthaltene Glycerin beschwerte die Probe, so dass diese beim Einbringen in die Geltaschen auf den Boden sank. Durch Ausbildung von zwei farbigen Lauffronten durch die Bestandteile Bromphenolblau (s.3.2.2) und Xylene Cyanol (s.3.2.2) - 96 - Material und Methoden konnte jederzeit kontrolliert werden, wie weit die PCR-Proben im Gel gelaufen waren. In eine Tasche wurden 1 µl eines DNA-Längenstandards (s.3.2.8) zur Bestimmung der Größe zusammen mit 1µl Blaumarker pipettiert. Die Proben wurden bei 60 Volt in 50 Minuten auf einer Laufstrecke von etwa 8 cm aufgetrennt und danach im UV-Licht (s.3.1) auf die gesuchten spezifischen Banden kontrolliert. Zur Dokumentation und Auswertung wurden die Gele mit einer Digitalkamera (s.3.1) fotografiert. 3.3.4.9 Semiquantitative RT-PCR Die Menge der vorhandenen mRNA von GAPDH, IL4, IL10, IFN γ und TNFα in equinen MNC vor und nach der Stimulation mit Immunmodulatoren wurde mit einer semiquantitativen RT-PCR untersucht . Bei diesem Ansatz geht man davon aus, dass zu Beginn der PCR die Menge der Amplifikate exponentiell zunimmt und somit direkt von der Ausgangsmenge der untersuchten RNA abhängig ist. Nach 25–30 Amplifikationszyklen schließt sich dieser exponentiellen Phase eine Plateauphase an, in der die Produktmenge weniger von der ursprünglichen Anzahl der RNA Kopien vor der PCR als vielmehr von den PCR Bedingungen abhängig ist. Zunächst wird mit Hilfe einer Verdünnungsreihe und unterschiedlichen Zyklenzahlen (22, 25, 28, 31, & 35 Zyklen) die optimale DNA Amplifikationsphase gewählt, um nicht in die Sättigung der Reaktion zu gelangen. Hierzu wird das RT-Produkt Verdünnung von [unverdünnt=100]; [10-2]; [10-3] und [10-4] bei unterschiedlicher Zyklenzahl (22, 25, 28, 31, und 35) amplifiziert. Die Durchführung der RTPCR erfolgt wie unter 3.3.4.7 beschrieben. Anhand einer Kurve, in der die Bandenstärke des Produktes in einem Agarose-Gel gegen die Verdünnung eingesetzter DNA-Menge aufgetragen wird, wird die optimale Zyklenzahl bestimmt, bei der ein linearer Zusammenhang zwischen eingesetzter DNA-Menge und dem erzeugten Produkt besteht. Die Auswertung der digitalen Fotografien efolgte mit dem Programm Gel-Pro Analyzer. Diese Anwendung erlaubt einen relativen Vergleich der einzelnen Banden im Gel, eine semiqantitative Bestimmung der Zytokinexpression ist möglich . Um Missverständnisse auszuschließen, sei erwähnt, dass dieses Verfahren nicht mit der serial dilution PCR (syn. limiting dilution PCR) identisch oder auch nur ähnlich ist, bis auf die Tatsache, dass in beiden Methoden DNA-Verdünnungen eingesetzt werden. Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte - 97 - Material und Methoden mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-NeinEreignissen über eine Poisson-Verteilung. 3.3.4.10 Fotodokumentation und Quantifizierung Zur Quantifizierung von PCR-Produkten werden digitale Aufnahmen von Agarosegelen verwendet. Das Programm „Gel-Pro Analyzer“ ermöglicht eine Quantifizierung von eindimensionalen Gelaufnahmen und die Darstellung der Bandenintensität In OD (Optische Dichte, oder Extinktion in der Photometrie). Optische Dichte ist die logarithmische Funktion der Transmission. Während bei der Photometrie direkt die OD bestimmt wird (z.B. bei der photometrischen Quantifizierung der DNA), ist dies bei einer Kamera oder einem Scanner nicht möglich. Alle erhaltenen Werte sind relative Aussagen, weil es sich sehr schwierig gestaltet, ein Aufnahmesystem optimal einzustellen und zu kalibrieren, um die Absolutmengen berechnen zu können. Die Aufnahmen zeigten oft geringfügig dunklere Werte im Außenbereich als in der Mitte. Dieser Fehler ist wahrscheinlich von den optischen Linsen erzeugt, da er radiär erscheint. Diese Inhomogenität würde einen systematischen, leicht zu umgehenden Fehler erzeugen. Banden in der Mitte hätten andere Werte als die gleiche DNA-Menge in einer Randzone. Deswegen wurden die Agarosegele mehrmals so umpositioniert und aufgenommen, dass man alle DNA Banden in der Mitte des helleren Aufnahmefeldes dokumentiert hat. Alle Aufnahmen von Gelen haben neben den fluoreszierenden DNA-Banden auch einen nicht ganz schwarzen Hintergrund durch die unspezifische Fluoreszenz der verwendeten Farbstoffe. Dieser Hintergrund muß optisch oder rechnerisch entfernt werden, um die DNA-Banden eines Gels auswerten zu können. Der Hintergrund einer Aufnahme läßt sich mit Gel-Pro Analyzer automatisch subtrahieren. Dabei wird ein sogenanntes „Join Valleys“ Tool mit einem vorher bestimmten Durchmesser über das Bild gefahren und aus diesen Daten der Hintergrund von den Bandenintensitäten unterschieden und gleichzeitig subtrahiert. Bei der Quantifizierung großer DNA-Mengen auf einem Gel zeigt sich oft ein sogenannter Halo. Um die eigentliche Bande herum befindet sich ein Lichthof in der Aufnahme. Dieser entsteht, besonders bei dickeren Gelen, durch Streustrahlung der gefärbten DNA horizontal in das Gel. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich sowohl auf der Aufnahme als auch auf dem Quantifizierungsplot. Eine theoretische Lösung dieses Problems konnte nicht gezeigt werden. - 98 - Material und Methoden In dieser Arbeit wurde es als Artefakt gewertet und zusammen mit dem sonstigen Hintergrund geometrisch in dem Quantifizierungsplot abgetrennt. Abbildung 11: Vorgehen bei der Auswertung der Gelbanden nach Aufnahme mit einer digitalen Kamera und Anwendung des Programmes Gel-Pro Analyzer. Die einzelnen Banden wurden von dem Programm automatisch erkannt und markiert (A). Mit dem „Join Valleys“ Tool wurde mit einem Ausschnitt eines zuvor bestimmten Durchmessers über das Bild gefahren und so aus den Daten gleicher Flächen der Hintergrund von der Bandenintensitäten unterschieden und subtrahiert (B) und anschließend die optische Dichte einer Bande errechnet (C). Die Abb. A,B,C stellen eine logarithmische Verdünnungsreihe dar, die nach der Auswertung einen Zusammenhang zwischen eingesetzter DNA-Menge und dem erzeugten Produkt nach 25 Zyklen zeigen. Die gleiche Verdünnungsreihe (A1, B1, C1) erlaubte nach 31 Zyklen keinen Zusammenhang zwischen eingesetzter DNA-Menge und erzeugten Produkten mehr, da sich der PCR Ansatz bereits in der Plateauphase befand und somit keine quantitative Aussage mehr ermöglichte. Die Quantifizierung stützt sich auf die Annahme, dass GAPDH-mRNA in allen equinen MNC gleich stark exprimiert wird. Deshalb wurde in der Gelelektrophorese die Stärke der Banden - 99 - Material und Methoden der equinen Zytokine ins Verhältnis zu den entsprechenden GAPDH-Banden gesetzt und in % davon ausgedrückt, entsprechend der Formel: Zytokintranskription (%) ≈ Zytokin(OD) × 100% GAPDH (OD) Um den Einfluss eines Immunmodulators auf die Expression der Zytokin-mRNA Transkription zu bewerten, wurde ein „Induktionsfaktor“ oder „Induktion fold“ entsprechend folgender Formel errechnet: Induktion fold= Zytokin transkription nach Inkubation (%) Zytokin transkription am Tag 0(%) 3.3.5 SYBR Green TM real-time PCR Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (s.3.2.2) verwendet. Die Synthese der cDNA erfolgte nach gleichem Protokoll (s.3.3.4.6) wie für konventionelle PCR. Für die SYBR Green™ PCR wurden 4 µl der synthetisierten cDNA mit 25 µl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 µl eines Primers (10 pmol), 0,75 µl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 18,25 µl sterilen Wassers (s.3.2.2) vorsichtig in einem 0,5 ml QRT-PCR Reaktionsgefäß (s.3.2.1) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgendes: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht. Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; s.3.1) überführt und folgendes Programm gestartet: Temperatur Dauer 95°C 10 min 95°C 30 sec 56°C 1 min 72°C 1 min Anzahl der Zyklen 1 40 - 100 - Material und Methoden Während des Programms erfolgte die Auswertung anhand einer Schmelzpunktanalyse. Dazu wurde das PCR-Produkt von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz in 1 °C Schritten (30 sec. je 1 °C) gemessen. 3.3.5.1 Auswertung und Quantifizierung der SYBR Green tm real-time PCR Die Anregung des SYBR Greens™ erfolgte bei 497 nm, die Anregung des Referenzfarbstoffs ROX bei 584 nm. Die emittierte Fluoreszenz des SYBR Greens™ wurde während des Annealingschritts bei 520 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des Referenzfarbstoffs ROX wurde ebenso während des Annealingschritts bei 612 nm gemessen. Die Auswertung des Laufs wurde mittels eines Dell Computers (Microsoft Windows 98 als Betriebssystem) mit der Software Mx4000 v3.00 Build 95, Schema 38 der Fa. STRATAGENE durchgeführt. Für die Auswertung wurde die Berechnung über eine Standardkurven-Methode angewendet und die erzielten Ergebnisse als „induktion fold“ ausgedrückt, entsprechend der konventionellen PCR (s.3.3.4). Auch die SYBR GreenTM real–time PCR Quantifizierung stützt sich auf die Annahme, dass GAPDH-mRNA in allen equinen MNC gleich stark exprimiert wird. 3.3.6 Bestimmung der Phagozytosekapazität Zur Bestimmung der Phagozytosekapazität kam ein von ZERBE (1994) etabliertes durchflusszytometrisches Verfahren in modifizierter Form zur Anwendung. Es ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden Leukozyten einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der Phagozytose-positiven Zellen als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel als Ausdruck der Phagozytosestärke. Testdurchführung Als Phagozytosepartikel kamen die in (s.3.2.7) beschriebenen FITC-markierten Mikroben zum Einsatz. Die Mikrobensuspension (2 x 108 mikrobelle Partikel/ml PBS) in den Vorratsröhrchen wurden nach dem Auftauen resuspendiert und auf zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße (Cups) verteilt. Diese wurden dann bei 14.800 x g für 60 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert, ohne das kaum sichtbare Pellet mit der Pipettenspitze zu berühren. Zu die Hälfte der Cups wurden zwecks Opsonisierung 50 µl equines Poolserum (s. 3.2.7) und 450 µl PBS zu den Mikroben hinzugegeben, während in die andere Hälfte der Cups nur mit - 101 - Material und Methoden 500 µl PBS aufgefüllt wurden, um nicht-opsonisierte Mikroben zu erhalten. Dann wurde das Pellet kräftig resuspendiert. Diese Ansätze wurden anschließend für 45 Min im Brutschrank inkubiert (37°C, 5% CO2). Nach Resuspension wurden die Wells einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.2.1) mit je 50 µl dieser Mikrobensuspensionen beschickt. Diesen Ansätzen wurden je 150 µl einer Zellsuspension mit einer Dichte von 0,66 x 106 Leukozyten/ml PBS hinzugegeben. Somit lag ein Zellen zu mikrobiellen Partikel-Verhältnis von ca 1:100 vor. Die Probensuspensionen wurden 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler durchmischt und dann für 30 Min in einer feuchten Kammer (s. 3.1) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert(s. 3.1). Nach erneuter Durchmischung auf dem Plattenrüttler, um optimale Zell-Mikroben-Kontakte zu gewährleisten, wurde die 30minütige Inkubation fortgesetzt. Abschließend wurde die Platte für 10 Min auf Eis gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden dann in 100 µl Sheath fluid-PJ-Gemisch (s.3.2.5) in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt. Auswertung Pro Ansatz wurden 10.000 Partikel durchflusszytometrisch gemessen. Unter ihnen befanden sich neben Leukozyten auch Mikrobenaggregate, die mit gemessen wurden. Diese Bakterienaggregate werden bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI© (TROTTER 1999) aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL1 (Abbildung 9) und ihrer FSC-SSC Werte (Abbildung 9) erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Es wurden nur PJnegative Leukozyten bewertet. Es wurde ermittelt, welcher Prozentsatz der Zellen phagozytierte. 3.3.7 Statistische Verfahren Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der Dunnett's Multiple Comparison Test genutzt oder der Tukey's Multiple Comparison Test eingesetzt. Die Inter-assay-varianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System in vitro, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Die angegebenen Fehlerbalken entsprechen dem SEM (standard error of mean). - 102 - Material und Methoden 3.3.8 Statistische Darstellung als Box Chart Im Ergebnisteil werden einige Daten in Form von Box Charts dargestellt. Der Box Chart dient der Darstellung statistischer Auswertungen der Verteilung von Messwerten (SACHS 1997). In Abbildung 12 ist ein symbolischer Box Chart zur Erläuterung dargestellt. Auf der linken Seite der Abbildung sind die Einzelwerte dargestellt, die in dem Box Chart zusammengefasst sind. Der Stern unter dem Box Chart zeigt den minimalen Messwert, die untere horizontale Linie die 5% Grenze. In der Box selbst liegen 50% aller Messwerte. Zusätzlich kann an der Box das arithmetische Mittel aller Messwerte abgelesen werden (kleines Quadrat in der Box). Das obere Ende der vertikalen Linie entspricht der Grenze, die 95% aller Ereignisse beinhaltet. Der obere Stern entspricht schließlich dem maximalen Messwert. Anhand der 50% Linie kann bereits abgeschätzt werden, ob sich die Population normal verteilt (50% Marke liegt mittig in der Box), oder ob eine Schiefe zu erwarten ist (symbolisch dargestellt ist eine Rechtsschiefe in der Population). 100 Funktionswerte des Ereignisses zu den einzelnen Freiheitsgraden 90 80 95% 75% 70 50% 60 25% 50 40 5% 30 20 10 Ereignis Ereignisstrahl Abbildung 12: Symbolischer Aufbau eines Box Charts (ROHWER 2004) Dargestellt ist die Form eines Box Charts sowie die statistischen Angaben, die ihm zu entnehmen sind. - 103 - Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 4.1.1 Methodische Vorarbeiten Auswahl eines geeigneten Kulturmediums Proliferationstests mit equinen mononukleären Zellen für die Zur Beurteilung immunmodulatorischer Einflüsse müssen die zu prüfenden Zellen unter optimierten Bedingungen gehalten werden. Dazu war es erforderlich, für mononukleäre Zellen von Pferden (eqMNC) optimierte Proliferationsbedingungen zu ermitteln. Zu diesem Zweck wurden von drei gesunden Pferden (s.3.2.9) aus heparinisiertem Blut (3.3.1) die MNC über Dichtegradienten in einer Reinheit von >90 % und hoher Vitalität isoliert. In 2 Konzentrationen (1x105 und 2x105 MNC) und in 4 verschiedenen Zellkulturmedien (s.3.2.3) wurden sie für 72 h, 96 h und 120 h bei 37°C und 5 % CO2 in Luft ohne und mit unterschiedlichen Mitogenen (2.11) in Mikrotiterplatten für die Zellkultur (s.3.2.1) kultiviert. Direkt im Anschluss erfolgte die qualitative (lebend / tot sowie kleine Lymphozyten / Blasten) und quantitative (mittels Referenzzellverfahren (s.3.3.3.2)) Auswertung im Durchflusszytometer (s.3.1). Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 13 bis 15 dokumentiert. - 104 - Ergebnisse Abbildung13: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion equiner mononukleärer Zellen ohne und mit Stimulation durch die Mitogene ConA und PHA in vier verschiedenen Medien nach 72h Inkubationszeit Aufgereinigte eqMNC (1x105 und 2x105 pro well) aus heparinisiertem Blut 3 gesunder Pferde wurden je in Triplikaten über 3-5 Tage alleine oder mit ConA (1,0 und 3,0 µg/ml) oder PHA (0,3 µg/ml) (s.3.2.2) in 96 well-Platten (s.3.2.1) kultiviert. Als Kulturmedium wurde kDMEM10 (s.3.2.3), kDMEM3 (s.3.2.3), SFM3 (s.3.2.3) oder SFMMedium ohne FCS (s.3.2.3) eingesetzt. Die Zahl vitaler mononukleärer Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt (s.3.3.3.2) und morphologisch nach kleinen Lymphozyten sowie nach blastoiden Zellen differenziert (s.3.3.3.2). Dargestellt sind für jede Zellfraktion die Mittelwerte dreier Tiere. Zur besseren Vergleichbarkeit der Zellen verschiedener Spender wurde für jedes Tier die Zahl vitaler mononukleärer Zellen im Kontrollansatz am Tag 0 = 100% gesetzt. Die Variationskoeffizienten der Replikate des Einzeltieres lagen unter 10%. - 105 - Ergebnisse Abbildung 14: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion equiner mononukleärer Zellen ohne und mit Stimulation durch die Mitogene ConA und PHA in vier verschiedenen Medien nach 96h Inkubationszeit Legende: wie Abbildung13, jedoch Auswertung nach 96h Kultivierung - 106 - Ergebnisse Abbildung 15: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion equiner mononukleärer Zellen ohne und mit Stimulation durch die Mitogene ConA und PHA in vier verschiedenen Medien nach 120h Inkubationszeit. Legende: wie Abbildung13 , jedoch Auswertung nach 120h Kultivierung Nach 3-, 4- und 5-tägiger Kultivierung zeigten sich erhebliche Unterschiede im Zellverhalten in Abhängigkeit von den Zellkulturmedien wie den Stimulantien: Die relative Gesamtzahl vitaler mononukleärer Zellen (rechte Spalte) ohne Mitogenzusatz (Medienkontrolle) war unabhängig vom Medium oder der eingesetzten Zellzahl (1x105 oder 2x105 pro well). Nach 72h waren noch ca. 90 % wiederzugewinnen. Dies reduzierte sich auf ca. 60 % nach 96h und auf etwa 20 % nach 5 Tagen Kultivierung. Da zu allen Zeiten der Anteil blastoider Zellen (mittlere Spalte) in den Mediumkontrollen auf dem Niveau der an d0 eingesetzten eqMNC (unter 10 %) blieb, erlebten die Zellen in allen hier geprüften Medien alleine keine erkennbare - 107 - Ergebnisse Stimulation, sondern lediglich einen physiologischen zeitabhängigen Zelltod. Deutlich anders verhielten sich die eqMNC in Anwesenheit von pflanzlichen Mitogenen: Der Anteil kleiner Lymphozyten (linke Spalte) war bereits nach 72h Inkubation (Abbildung13) gegenüber den Mediumkontrollen deutlich reduziert. Dies beruhte teils auf einer Vermehrung der blastoiden Zellen (mittlere Spalte) und teils auf vermehrtem Zellverlust (Differenz der Gesamtzahl mononukleärer Zellen -rechte Spalte - mit Mitogenstimulation im Vergleich zu den entsprechenden Medienkontrollen). Somit erlaubt diese Art der Zellbeurteilung (qualitative und quantitative Durchflusszytometrie (s.3.3.3) für jeden einzelnen Zellkulturansatz eine Beurteilung der Zellaktivierung, die eine Blastenbildung bewirkt und solche, die zum Zelltod führt. Nimmt man eine Zeitkinetik hinzu, so ist zu erkennen, dass die Blastenbildung eine Verzögerung des Zelltodes als auch eine Übergangsform zum Zelltod darstellen kann: Ein Vergleich der jeweils 4 Säulen von links (in kDMEM 10 und kDMEM 3 Medium) der 3 oberen Spalten (ConA 1µg/ml & 3µg/ml, PHA 0,3µg/ml) zu den 3 Kultivierungszeiten (72h, 96h & 120h) zeigt, dass der Verlust der kleinen Lymphozyten (linke Spalte) mit einer Zunahme der blastoiden Zellen (mittlere Spalte) einhergeht, von 72 h auf 96h ansteigt und selbst nach 120h nur teilweise wieder abfällt. Dadurch bleibt die Gesamtzahl stimulierter mononukleärer Zellen selbst an d5 noch deutlich über der in den unstimulierten Medienkontrollen. Die zunehmende Differenz zu den 100 % der Ausgangszellzahl belegt auch das teilweise Absterben der blastoiden Zellen. Bei dieser differenzierten Analyse der stimulierten Zellen wird die Eignung der einzelnen Medien sehr deutlich: Während das serumfreie Medium (SFM0) lediglich bei PHA-Stimulation in den ersten 72h eine geringe Blastenbildung erlaubt, lässt es dies bei ConA-Stimulation erst gar nicht zu, sondern fördert einen beschleunigten und verstärkten Zelltod (Jeweils 5. und 6. Säule von links). Der Zusatz von fötalem Kälberserum (s.3.2.3) förderte die Zellvitalität und Blastenbildung in allen mitogenstimulierten Ansätzen. Dabei zeigten die eqMNC in den beiden kDMEM-Medien (mit 10 % und 3 % FCS) etwas bessere Vitalität und Blastenbildung als in SFM3-Medium, insbesondere nach 120h Kultivierung. Diese Unterschiede wurden stärker bei der PHAStimulation (dritte Zeile) als bei den ConA-Stimulationen (die beiden oberen Zeilen) deutlich. Da zwischen 10 % u. 3 % FCS im kDMEM-Medium kein zuverlässiger Unterschied erkennbar war und ein möglichst gut definiertes Medium (wenig Zusatz an undefinierten Komponenten wie FCS) zur Prüfung einer Immunmodulation zu finden war, wurden zur besseren Beurteilung die Ergebnisse für die Medien kDMEM3 und SFM3 aus den Abbildung13, 14, und 15 in Abb.16 zusammengefasst. - 108 - Ergebnisse Abbildung 16: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion equiner mononukleärer Zellen ohne und mit Stimulation durch die Mitogene ConA und PHA in zwei verschiedenen Medien nach 0h,72h, 96h &120h Inkubationszeit Aufgereinigte eqMNC (2x105 pro well) aus heparinisiertem Blut 3 gesunder Pferde wurden je in Triplikaten über 3, 4 & 5 Tage alleine oder mit ConA (1,0 und 3,0 µg/ml) oder PHA (0,3 µg/ml) (s.3.2.2) in 96 well-Platten (s.3.2.1) kultiviert. Als Kulturmedium wurde kDMEM3 (s. 3.2.3) oder SFM3 (s.3.2.3) eingesetzt. Die Zahl vitaler mononukleärer Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt (s.3.3.3.2) und morphologisch nach kleinen Lymphozyten sowie nach blastoiden Zellen differenziert. Dargestellt sind für jede Zellfraktion die Mittelwerte dreier Tiere. Zur besseren Vergleichbarkeit der Zellen verschiedener Spender wurde für jedes Tier die Zahl vitaler mononukleärer Zellen im Kontrollansatz am Tag 0 = 100% gesetzt. Die Variationskoeffizienten der Replikate des Einzeltieres lagen unter 10%. Man beachte die unterschiedliche Skalierung der Ordinate (links: Kleine Lymphozyten bzw. alle vitalen mononukleären Zellen (MNC), rechts: Blastoide Zellen). - 109 - Ergebnisse Die Gesamtzahl der vitalen mononukleären Zellen (MNC, gestrichelte Linie = Summe der kleinen Lymphozyten und blastoiden Zellen) nimmt in Anwesenheit aller hier eingesetzter Stimulantien in den ersten drei Tagen der Kultivierung deutlich stärker ab als bei den unstimulierten Zellen im Medium (oberste Zeile). Da dies trotz deutlicher Zunahme der blastoiden Zellen durch die Mitogene geschieht, müssen durch ihre Aktivierung mehr Zellen absterben als neue (durch Zellteilung) gebildet werden. Dieser Trend ändert sich mit fortschreitender Kultivierung: Der Anteil der Blasten nimmt von d3 zu d4 in allen Mitogenansätzen deutlich zu, was den Abfall der MNC gegenüber der Medienkontrolle mindert oder aufhebt. Mit Ausnahme von ConA 1,0 µg/ml in kDMEM3 fällt von d4 zu d5 auch die Anzahl der Blasten und somit die der MNC wieder deutlich ab, was für die Blastenbildung als Übergang zum Zelltod spricht. Somit erfasst dieses Verfahren der funktionellen Beurteilung mononukleärer Zellen sowohl ihre Aktivierung zu Blasten, ihre Aktivierung zum Zelltod sowie ihre Aktivierung zur Verminderung des Zelltodes. Diese sind wesentliche Parameter für die Bewertung modulatorischer Einflüsse auf mononukleäre Zellen. Da sich die equinen MNC in beiden Medien tendenziell ähnlich verhalten, wird für alle weiteren Untersuchungen das SFM3-Medium (s.3.2.3) eingesetzt, da es im Gegensatz zum kDMEM-Medium (s.3.2.3) ohne Zusatz von Mercaptoäthanol auskommt, das selbst über immunmodulatorische Eigenschaften verfügt (s.4.1.1). Zur Prüfung costimulatorischer Einflüsse auf MNC ist eine suboptimale Vorstimulation erforderlich, die über einen möglichst weiten Zeitraum eine gleichmäßige Aktivierung der Zellen ermöglicht. Diese Bedingung erfüllt von den hier geprüften Mitogenen am besten das PHA (s.3.2.2). Welche Konzentration an PHA für eqMNC optimal ist, zeigt die Abbildung 17. - 110 - Ergebnisse - 111 - Ergebnisse Abbildung 17: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion equiner mononukleärer Zellen ohne und mit Stimulation durch unterschiedliche Konzentrationen an PHA in vier verschiedenen Medien nach 72h & 96h Inkubationszeit. Aufgereinigte eqMNC (2x105 pro well) aus dem heparinisierten Blut 3 gesunder Pferde wurden je in Triplikaten über 3 & 4 Tage alleine oder mit unterschiedlichen Konzentrationen an PHA (0,003 bis 30 µg/ml) (s.3.2.2) in 96 well-Platten (s.3.2.1) kultiviert. Als Kulturmedium wurde kDMEM3 mit 50µmol/L Mercaptoethanol (s.3.2.3), DMEM ohne Mercaptoethanol (s.3.2.2), SFM0 (s.3.2.3) oder SFM3 (s.3.2.3) eingesetzt. Die Zahl vitaler mononukleärer Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt und morphologisch nach kleinen Lymphozyten sowie nach blastoiden Zellen differenziert (s.3.3.3.2). Dargestellt sind für jede Zellfraktion die Mittelwerte dreier Tiere. Zur besseren Vergleichbarkeit der Zellen verschiedener Spender wurde für jedes Tier die Zahl vitaler mononukleärer Zellen im Kontrollansatz am Tag 0 = 100% gesetzt. Die Variationskoeffizienten der Replikate des Einzeltieres lagen unter 10%. Man beachte die unterschiedliche Skalierung der Ordinate (links: Vitale kleine Lymphozyten, rechts: Blastoide Zellen). Equine MNC lassen sich unter den hier gewählten Kultivierungsbedingungen am deutlichsten mit 0,3 & 3,0 µg/ml zu Blasten aktivieren. Dies gelingt jedoch nur wenn dem DMEM3Medium (ohne Mercaptoäthanol-2. Zeile von oben) die costimulatorische Substanz 2Mercaptoäthanol zugesetzt ist (im kDMEM3 - oberste Zeile). SFM-Medium erlaubt die Blastenentwicklung auch ohne Mercaptoäthanol, benötigt aber – wie auch kDMEM (in hier nicht gezeigten Vorversuchen ermittelt) - einen Zusatz von 3 % FCS (vgl. die beiden unteren Zeilen). Da bei 0,3 µg/ml - im Vergleich mit 3,0 µg/ml – PHA mehr MNC zu Blasten und weniger in den Zelltod „aktiviert“ wurden, war mit SFM3-Medium und einer bedarfsweisen Vorstimulation durch PHA 0,3µg/ml ein optimiertes Verfahren zur Prüfung immunmodulatorischer Einflüsse auf eqMNC gefunden. Für all diese Untersuchungen wurden Zellen von gesunden Pferden geprüft. Sind die dort ermittelten Bedingungen auch für Pferde gültig, die an einer Typ I allergischen Insektendermatitis („Sommerekzem“) leiden? 4.1.2 Stimulatorische Potenz von PHA für mononukleäre Zellen unterschiedlicher Individuen Um zu prüfen, ob die unter 4.1.1 an MNC von gesunden Pferden ermittelten optimierten Kultivierungs- und Vorstimulationsbedingungen auch für MNC von Typ I allergisch erkrankten Pferden gelten, wurden unter identischen Bedingungen vergleichende Untersuchungen über 12 h bis 120 h Kultivierungszeit an MNC von 4 gesunden und von 4 an allergischer Insektendermatitis (Sommerekzem) erkrankten Pferden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 18 dokumentiert. - 112 - Ergebnisse In der Literatur wird über eine verminderte Vitalität der MNCs von atopischen Spendern berichtet (GRZEGORCZYK et al. 2002). Wenn das gleiche Phänomen auch bei equinen MNCs bestehen sollte, könnte dies zu einer Beeinträchtigung der gewonnenen Daten führen. Aus diesem Grunde wurde überprüft, ob sich die in vitro- Lebensfähigkeit equiner MNCs die aus Pferden mit und ohne Sommerekzem gewonnen wurden nach einer PHA-Stimulation von einer Kultivierung ohne Stimulation unterscheidet. Abbildung 18: Vergleich der Überlebensrate und der Proliferationsreaktion mononukleärer Zellen von gesunden Pferden und solchen mit Typ I allergischer Insektendermatitis (Sommerekzem) ohne und mit PHA-Stimulation für 12h bis 120h Inkubation in SFM3-Medium. Aufgereinigte MNC (2x105 pro well) aus heparinisiertem Blut von 4 gesunden Pferden und von 4 Pferden mit Sommerekzem wurden je in Triplikaten über 12h bis 120h alleine oder mit PHA (0,3 µg/ml) (s.3.2.2) in 96 well-Platten (s.3.2.1) kultiviert. Als Kulturmedium wurde SFM3 (s.3.2.3) eingesetzt. Die Zahl vitaler mononukleärer Zellen wurde vor (0h) und zu jedem angegebenen Zeitpunkt der Kultivierung durchflusszytometrisch bestimmt und morphologisch nach kleinen Lymphozyten sowie nach blastoiden Zellen differenziert (s.3.3.3.2). Dargestellt sind die Mittelwerte der vier Tiere ohne (durchgezogene Linien) und mit Sommerekzem (gestrichelte Linien). Zur besseren Vergleichbarkeit der Zellen verschiedener Spender wurde für jedes Tier die Zahl vitaler mononukleärer Zellen im Kontrollansatz am Tag 0 = 100% gesetzt. Die Variationskoeffizienten der Replikate des Einzeltieres lagen unter 10%. Man beachte die unterschiedliche Skalierung der Ordinate (links: Vitale kleine Lymphozyten, rechts: Blastoide Zellen). Zu keinem Zeitpunkt, bei keinem der untersuchten Tiere und in keinem Parameter war ein Unterschied zwischen gesunden und an allergischer Insektendermatitis erkrankten Pferden zu beobachten. Damit waren die unter 4.1.1 erarbeiteten optimierten Kultivierungs- und Vorstimulationsbedingungen für MNC gesunder Pferde und solchen mit Sommerekzem geeignet. - 113 - Ergebnisse 4.1.3 Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro Um einer Immunodulation in vivo möglichst nahe zu kommen, sollen in dem hier beschriebenen Analyseverfahren nicht nur MNC, sondern auch Granulozyten (insbesondere neutrophile Granulozyten: PMN) und die Interaktion zwischen MNC und PMN zu untersuchen und zu bewerten sein. Deshalb war zu prüfen, wie sich equine PMN (eqPMN) unter den für eqMNC optimierten Medien- (SFM3) und Vorstimulationsbedingungen (0,3 µg/ml PHA) (s.4.1.1) im Hinblick auf ihre Vitalität verhalten. Da auf Grund des breiten Zuckerbindungsvermögens des Lektins PHA auch eine direkte Wirkung von PHA auf eqPMN zu erwarten war, sollte eine weitere vorstimulierende Substanz einbezogen werden, die vermutlich PMN nicht direkt aktivieren kann, sondern dies möglicherweise nur über den „Umweg“ der Aktivierung von eqMNC vermag. Dazu wurde das Superantigen Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) (s.3.2.2) in einer Konzentration von 1 ng/ml in die Vitalitätsprüfung von eqPMN einbezogen. Zur Aufreinigung eqPMN sind 2 Verfahren gut geeignet: Die Anreicherung über einen optimierten Percoll®-Dichtegradienten (s.3.3.2.2) oder durch selektive Chemotaxis der eqPMN im Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4). Die Ergebnisse zur Vitalitätsprüfung gereinigter PMN von 6 gesunden Pferden nach Kultivierung in SFM3 ohne und mit PHA oder SEA sind in den Abbildungen 19 und 20 dargestellt. Abbildung 19: Beeinflussung der Vitalität equiner PMN nach aufreinigung im Transmigrationsverfahren und in vitro Kultivierung ohne und mit PHA oder SEA - 114 - Ergebnisse Equine neutrophile Granulozyten (eqPMN) wurden aus heparinisiertem Blut von 6 gesunden Pferden (s.3.2.9) mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) in hoher Reinheit (>99%) isoliert und in SFM3 Medium (s.3.2.3) (200.000 Zellen/200 µl und well) in 96 well-Platten (s.3.2.1) bei 37°C und 5% CO2 in Luft alleine (Mediumkontrolle) oder mit 0,3 µg/ml PHA oder 1,0 ng/ml SEA im Reaktionsansatz inkubiert. In Abständen von jeweils 6 Stunden wurde die Anzahl wiedergewonnener vitaler Zellen (bezogen auf die Ausgangszellzahl) durchflusszytometrisch (s.3.3.3.2) unter Einsatz von Propidiumjodid (2 µg/ml) (s.3.2.2) im Referenzzellverfahren (s.3.3.3.2) bestimmt. Mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) war es möglich, Neutrophile mit über 99 % Reinheit zu gewinnen. Eine Inkubation über 48h mit Zwischenmessungen alle 6h zeigte schon nach 6h in der Mediumkontrolle einen Rückgang an wiedergewonnenen Zellen um 10%. Nach 36h konnte nur noch die Hälfte der eingesetzten Neutrophilen geerntet werden. Ein Zusatz von 1,0 ng/ml Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) beeinträchtigte die Vitalität der PMN nicht mehr als ihre alleinige Kultivierung im Medium (SFM3). Dies sprach für die Reinheit der PMN, da SEA - bei anderen Spezies - nur in Anwesenheit von MNC Auswirkungen auf die Vitalität von PMN zeigt. Im Gegensatz dazu führte die Anwesenheit von 0,3µg/ml PHA zu stärkeren Zellverlusten, so dass schon nach 18h Kulturdauer nur noch 45% der eingesetzten Zellen wiedergewonnen werden konnten. Da es sich hier um PMN in hoher Reinheit handelt, dürfte der vermehrte Zellverlust auf eine direkte Einwirkung von PHA auf eqPMN hinweisen. In allen drei in Abbildung 19 dargestellten Ansätzen fiel nach einer Inkubationsdauer von 48h die Zahl vitaler geernteter Zellen auf 14-19% der eingesetzten Zellen ab. Diese Verluste an vitalen wiedergewinnbaren PMN muss keineswegs ein Verlust durch Zelltod bedeuten. Auch verstärkte Adhärenz vitaler PMN als Ausdruck der Aktivierung durch Kultivierung alleine und verstärkt durch PHA-Stimulation ist zu bedenken. Zum Vergleich wurden im gleichen Ansatz die Zellen derselben 6 Pferde allein über einen geeigneten Dichtegradienten aufgereinigt und ansonsten identisch behandelt und kultiviert (Abbildung 20). - 115 - Ergebnisse Abbildung 20: Beeinflussung der Vitalität equiner PMN nach Aufreinigung durch Percoll® und in vitro Kultivierung ohne undmit PHA oder SEA Legende entspr. Abbildung 19 jedoch Aufreinigung der eqPMN mittels Percoll®-DichtegradientenZentrifugation (s.3.3.2.2) zu einer Reinheit von 89-95%. Die Aufreinigung durch Percoll®-Dichtegradienten-Zentrifugation erlaubte eine maximale Aufreinigung der Neutrophilen von 89%-95% Reinheit. Eine Inkubation über 48h mit Zwischenmessungen alle 6h zeigte in der zeitabhängigen Kinetik der Verluste an wiedergewinnbaren vitalen PMN eine vergleichbare Tendenz wie bei den hochreinen PMN (Abbildung 19). Das Ausmaß der Verluste war bereits in der Mediumkontrolle und erst recht bei den stimulierten Kulturen stärker. Hier bewirkte auch SEA einen stärkeren Rückgang der wiedergewonnenen Zellen als die alleinige Kultivierung. Dies mag der Beitrag einiger MNC sein, die wegen geringerer Reinheit noch in der PMN-Fraktion zu finden waren. Auch hier verusachte PHA die stärkste Zellabnahme. Ob durch Zelltod oder vermehrte Adhärenz, war hier nicht zu klären. Auf jeden Fall waren Kultivierungsansätze mit PMN über 48h wenig sinnvoll, da dann nur noch unter 20 % der eingesetzten PMN der Analyse zugänglich waren. Im Hinblick auf die untersuchten Aufreinigungsverfahren, bietet sich das Transmigrationsverfahren für die Gewinnung und Analyse hochreiner PMN an. Nimmt man geringe Kontaminationen anderer - 116 - Ergebnisse Zellen, insbesondere MNC in Kauf, bietet die weniger aufwendige Percoll®- Dichtegradienten-Zentrifugation bereits eine hohe PMN-Anreicherung. 4.2 Etablierung einer RT-PCR Transkription equiner Zytokine zum Nachweis der Immunmodulation geht oft mit einer sehr empfindlichen Änderung der Zytokinproduktion der modulierten Zellen einher. Zytokine lassen sich als Protein mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachweisen. Wo diese fehlen (wie für die meisten Zytokine des Pferdes) oder wenn man die Frühform einer veränderten Genexpression im Zuge einer Immunmodulation erfassen will, kann man die Transkription der mRNA mittels reverser Transkription zur cDNA und anschließender Amplifikation in einer Polymerasekettenreaktion nachweisen (RTPCR). 4.2.1 Vergleichende Untersuchung der RNA-Isolierungsmethoden Zwecks einer geeigneten RNA Isolierung aus equinen MNC wurden 4 kommerzielle Verfahren geprüft: Von der Fa. Invitek der Invisorb RNA Kit 1 (s.3.3.4.2), von Macherei & Nagel: NucleoSpin RNAII und von der Firma Quiagen der RNeasy mini Kit (s.3.3.4.4) ohne und mit anschließender DNAse Behandlung (s.3.3.4.5). Alle Verfahren wurden nach Herstellerprotokoll (s.3.3.4.1) durchgeführt. Dabei sollte ein Kit ausgewählt werden, der die Isolierung reproduzierbarer Menge RNA aus equinen MNC gewährleistet. Auch sollte möglichst keine Verunreinigung an genomischer DNA in der RNA-Präparation zurückbleiben, was durch eine PCR ohne vorausgehende reverse Transkription kontrolliert werden kann. Dazu wurden aus heparinisiertem Vollblut von 8 gesunden Pferden (Nr.1 – 8) mittels FicollDichtegradient-Separation MNC aufgereinigt, auf die gleiche Zellzahl eingestellt und alle drei Kits parallel zur RNA-Aufreinigung eingesetzt. Danach wurde zur Prüfung restlicher DNA in den RNA-Proben ohne reverse Transkription (-RT) eine PCR mit spezifischen Primern für das in jeder Zelle vorkommende Referenzgen für GAPDH durchgeführt (s.3.3.4.7). Die Menge an isolierter RNA wurde nach reverser Transkription (+RT) in einer GAPDH-PCR annäherungsweise in einer PCR quantifiziert. Dazu wurden die gewonnenen PCR Produkte - 117 - Ergebnisse auf 0,8% Agarose-Gele (s.3.3.4.8) aufgetragen und nach Gelelektrophorese densitometrisch ausgewertet (s.3.3.4.10). Die Ergebnisse zeigt Tabelle 5 Invisorb RNA Kit 1 Pferd № +RT -RT +RT -RT RNeasy +RT Rneasy+DNAse -RT +RT -RT 1 258 - 270 - 280 120 267 - 2 263 - 265 - 293 110 265 - 3 270 - 234 - 276 45 259 - 4 255 - 286 - 269 0 255 - 5 269 - 195 - 282 96 269 - 6 270 - 238 - 279 64 271 - 7 254 - 240 - 281 32 280 - 8 275 - 276 - 290 132 276 - 264 - 251 - 281 75 268 - 8 - 30 - 8 47 8 - 3% - 12% - 3% 63% 3% - MW STABW VK% NucleoSpin RNA II Tabelle 5: Reproduzierbarkeit der gewonnener RNA Menge abhängig vom angewendeten RNAIsolierungs Kit und Überprüfung möglicher Kontamination mit genomischer DNA. Aus heparinisiertem Blut (s.3.3.1) von 8 gesunden Pferden (s.3.2.9) wurden MNC über einen diskontinuierlichen Ficoll-Dichtegradienten aufgereinigt und auf 1 x 105 / ml SF10 (s.3.2.3) eingestellt. Alle RT- & PCR-Schritte erfogten nach Herstellerangaben (s.3.3.4). Nach Flachbett-Gelelektrophorese (s.3.3.4.8) der amplifizierten cDNA im 0,8 % Agarosegel (s.3.2.2) wurden die Ethidiumbromid markierten (s.3.2.2) und unter UV-Licht fotografierten Banden densitometrisch ausgewertet (s.3.3.4.10) (Bandendichte in OD). -RT=PCR ohne vorausgegangene reverse Transkription (RT), +RT= PCR nach RT, MW=Mittelwert, STABW=Standardabweichung, VK=Variationskoeffizient in Prozent. DNA-freie RNA aus MNC von 8 Pferden ließ sich mit 2 der 3 geprüften Kits isolieren. Dies war mit dem RNeasy mini Kit von Quiagen erst nach anschließender DNAse-Behandlung zu erzielen. Da der Invisorb RNA Kit 1 der Fa. Invitek zur Reinheit noch die geringsten Schwankungen in der RNA-Ausbeute zeigte, wurde er für alle weiteren RT-PCR Untersuchungen eingesetzt. - 118 - Ergebnisse 4.2.2 Einfluss der Zellseparationstechnik und einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden in vitro auf die Zytokin-mRNA-Expression von equinen MNCs Vor einer gezielten Immunmodulation war zu prüfen, ob bereits die Isolierung und Aufreinigung equiner MNC mittels Dichtegradientenzentrifugation und eine anschließende in vitro-Inkubation ohne Zusatz eines Stimulus einen Einfluss auf die Expression von ZytokinmRNA haben. Dafür wurden aus heparinisiertem Blut von 5 Pferden mittels Dichtegradientenzentrifugation über Ficoll oder Percoll (s.3.3.2.2) die MNC aufgereinigt und in SFM3 Medium (s.3.2.3) bis zu 72h bei 37°C und 5 % CO2 in Luft kultiviert. Unmittelbar nach Aufreinigung (0h) sowie nach 24h, 36h und 72h Kultivierung wurde der Gehalt an mRNA für die equinen Zytokine IL4, IL10, TNFα und IFNγ mittels RT-PCR (s.3.3.4) untersucht (Abbildung 21 & 22). Abbildung 21: Zeitabhängige Transkription der mRNA für die equinen Zytokine IL4 und IL10 in eqMNC während 72 stündiger Inkubation in SFM3 Medium ohne Zusatz eines Stimulus. Aus heparinisiertem Blut (s.3.3.1) von 5 gesunden Pferden (s.3.2.9) wurden MNC über diskontinuierliche Dichtegradienten von Ficoll oder Percoll® (s3.3.2.2) aufgereinigt und auf 2 x 105 / ml in SFM3 Medium (s.3.2.3) eingestellt. Unmittelbar nach Isolierung der eqMNC (0h) sowie nach 24h, 36h und 72h ihrer Kultivierung in SFM3 Medium ohne Zusatz einer zellstimulierenden Substanz bei bei 37°C und 5 % CO2 in Luft wurden aus 2 x 105 MNC die RNA isoliert. Nach RT in cDNA (s.3.3.4.6) wurden mit Hilfe geeigneter Primer (Tabelle 4) die DNA-Sequenzen für die equinen Zytokine IL4 und IL10 amplifiziert (s.3.3.4.7) und nach Flachbett-Gelelektrophorese (s.3.3.4.8) im 0,8 % Agarosegel (s.3.2.2) mit Ethidiumbromid markiert (s.3.2.2), ihre Banden unter UV-Licht fotografiert und densitometrisch ausgewertet (s.3.2.2). Die optische Dichte (OD) der Banden aus eqMNC vor Kultivierung (0h) wurde zu 1 normiert und die OD der entsprechenden Banden zu den jeweiligen Kultivierungszeitpunkten dazu ins Verhältnis gesetzt („induction fold“). Angegeben sind die Mittelwerte samt SD. - 119 - Ergebnisse Abbildung 22: Konstante Transkription der mRNA für die equinen Zytokine TNFα und IFNγ in eqMNC während 24,36 und 72 stündiger Inkubation in SFM3 Medium ohne Zusatz eines Stimulus. Legende entsprechend Abbildung 21, jedoch für die equinen Zytokine TNFα und IFNγ. Allein durch eine Kultivierung eqMNC in SFM3 Medium ohne Zusatz einer zellstimulierenden Substanz wurde die Transkription der mRNA für IL4 und IFNγ um mehr als das Doppelte der Ausgangszellen verstärkt (Abb. 21), augenscheinlich unabhängig von der Aufreinigung der MNC über einen Ficoll- (A) oder Percoll-Dichtegradienten (B). Unter identischen Bedingungen blieb die Transkription der mRNA für TNFα und IFNγ konstant (Abb. 22 A & B). Eine „Spontanaktivierung“ der Transkription von Zytokin mRNA ist somit unter den jeweiligen Bedingungen bei jeder Immunmodulation zu prüfen, sobald Zytokine als Modulationskriterium bewertet werden. Im Vergleich dazu wurde die Transkription der mRNA für eqIL4, eqIL10 und eqTNFα und eqIFNγ in MNC von 5 Pferden nach Aufreinigung über einen Ficoll-Dichtegradienten und nach 72h Kultivierung in SFM3 Medium (s.3.2.3) ohne und mit Zusatz des mitogens PHA (s.3.2.2) untersucht (Abbildung 23). - 120 - Ergebnisse Abbildung 23: Transkription der mRNA für eqIL4, eqIL10 und eqTNFα und eqIFNγ in eqMNC vor und nach 72h Kultivierung in SFM3 Medium ohne und mit Zusatz von 0,3 µg/ml PHA. Legende: entsprechend Abbildung 21 und mit MNC von 5 Pferden, jedoch für die equinen Zytokine IL4, IL10, TNFα und IFNγ und nur für über Ficoll separierte MNC sowie nur vor und nach 72h Kultivierung ohne (Mediumkontrolle) und mit Zusatz von 0,3 µg/ml PHA (s.3.2.2). Im Vergleich zu unstimulierten Kulturen (Mediumkontrolle), die für IL4 und IL10 wiederum eine Zunahme der mRNA gegenüber der MNC vor Kultivierung (normiert auf 1) zeigten, stieg nach PHA-Stimulation die mRNA-Transkription für IL4 und IL10 immer noch etwa zehn mal stärker an. Für TNFα und IFNγ war der Anstieg gegenüber der Medienkontrolle sogar 20-30fach, da sie keine „Spontanaktivierung“ erlebten (vgl. Abbildung 22). Da PHA eine relativ starke Zellaktivierung bewirkt, ist bei empfindlicher Immunmodulation die „Spontanaktivierung“ der zu prüfenden Zellpopulation stets zu berücksichtigen. 4.3 Immunmodulatorische Einflüsse auf equine Leukozyten in vitro Zur Überprüfung der Sensitivität und Aussagefähigkeit der unter 4.1 optimierten Immunmechanismen wurde versucht, modulatorische Wirkungen auf diese Immunmechanismen von einem pflanzlichen und einem bakteriellen veterinärmedizinischen Immunmodulator exemplarisch und vergleichend zu erfassen. - 121 - Ergebnisse 4.3.1 Exemplarischer Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf equine Leukozyten 4.3.1.1 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNCs während 72 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Phythämagglutinin (PHA) Um zu prüfen, ob der hier exemplarisch eingesetzte pflanzliche Immunmodulator (PIM) einen Einfluss auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner mononukleärer Zellen (MNC) in vitro hat, wurden gereinigte MNC von 10 Pferden für 72h mit und ohne PHAStimulation in Ab- und Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen des Immunmodulators in vitro kultiviert und ihre Vitalität sowie blastogene Transformation durchflusszytometrisch quantitativ und qualitativ (s.3.3.3.2) bewertet (Abbildung 24). - 122 - Ergebnisse Abbildung 24: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten gereinigter equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) ohne und mit PHA-Stimulation für 72h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von 10 Pferden (s.3.2.9) wurden mittels Ficoll-DichtegradientenZentrifugation MNC isoliert (Reinheit>95%) und in SFM3 Medium (s.3.2.3) in Hexaplikaten (je 200.000 Zellen / 200 µl) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 72h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne pflanzlichen Immunmodulator (PIM) in angegebener Endverdünnung der Ausgangskonzentration und mit und ohne PHA (0,3 µg/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.3.3.3) wurde der Anteil vitaler kleiner Lymphozyten und blastoider Zellen (bezogen auf die eingesetzten MNC) ermittelt. Die nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wiedergewonnenen vitalen eqMNC nach solitärer Inkubation ohne und mit - 123 - Ergebnisse unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die gefüllten Box-Diagramme dokumentieren die wiedergewonnen vitalen eqMNC nach Inkubation mit 0,3 µg/ml PHA ohne und zusätzlich mit unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden PIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wiedergewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der MNC in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der MNC von 10 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett’s Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen, wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7). Teil A dokumentiert die Ergebnisse der kleinen Lymphozyten, Teil B die der blastoiden Zellen. Über einen breiten Konzentrationsbereich (10-3 bis 10-6, Optimum bei 10-5) verbessert der pflanzliche Immunmodulator (PIM) gegenüber der Medienkontrolle (MK) die Anzahl wiedergewonnener eqMNC nach 72h Inkubation in vitro. Dies wird besonders deutlich bei den mit PHA stimulierten Zellen. Hier wird im Vergleich zur Medienkontrolle die Anzahl vitaler Lymphozyten um bis zu 20 % und die der blastoiden Zellen um bis zu 40% (durch 10-5 PIM) gesteigert. Da eine direkte blastogene Wirkung des PIM in den PHA freien Ansätzen (nicht gefüllte Box-Diagramme) deutlich geringer ist als in den PHA haltigen Kulturen, könnte eine immunmodulatorische Wirkung dieses PIM costimulatorischer oder antiapoptotischer Art oder auch beides sein. Bei einem entsprechenden Versuchsansatz mit MNC von 5 Pferden mit Typ I allergischer Insektendermatitis (Sommerekzem) und von 5 Pferden ohne klinische Krankheitssymptome war zwischen den beiden Gruppen kein Unterschied zu sehen (ohne Dokumentation, da repetitiv zu Abbildung 24). 4.3.1.2 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNCs während 36 stündiger in vitroKultur mit und ohne Stimulation durch Staphylocokken Enterotoxin A (SEA) Da zur Prüfung equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) nicht nur eine Stimulation mit PHA sondern auch mit dem Superantigen SEA erfolgen soll (vgl. Abbildung 19 & 20), wurde der Einfluss des pflanzlichen Immunmodulators auf eqMNC ohne und mit Stimulation durch SEA in 36 stündigen Kultivierungsansätzen geprüft (Abbildung 25). - 124 - Ergebnisse Abbildung 25: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten gereinigter equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 24, jedoch wurden hier eqMNC von 8 Pferden und nur für 36h in vitro kultiviert. Statt PHA wurde hier das Superantigen SEA (Endkonzentration 1,0 ng/ml) eingesetzt. - 125 - Ergebnisse Im Vergleich zur Kultivierung für 72h (Abbildung 24) zeigte der PIM alleine nach 36h Kultivierung noch keine erkennbare Wirkung auf unstimulierte eqMNC (nicht gefüllte BoxDiagramme). In Anwesenheit von 1 ng/ml SEA bewirkte PIM jedoch eine signifikant verbesserte Wiedergewinnung vitaler kleiner Lymphozyten (gefüllte Box-Diagramme in Teil A der Abb.) und eine vermehrte Blastenbildung (gefüllte Box-Diagramme in Teil B der Abb.). Dies unterstützt die vermutete costimulatorische und/oder antiapoptotische Wirkung des PIM auf eqMNC (vgl. Abbildung 24). Sie scheint bei unterschiedlichen Stimulationsmechanismen (MHC-unabhängig bei PHA und MHC II & T-Zellrezeptor abhängig bei SEA) effektiv zu sein. Auffällig ist jedoch, dass hier die optimale Wirkung des PIM bei 10-4 (gegenüber 10-5 bei 72h Kultivierung) liegt, was für eine zeitabhängige längerfristige Wirkung des PIM spricht. 4.3.1.3 Prüfung des Einflusses eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitro- Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) in Anwesenheit einer gleichen Anzahl autologer neutrophiler Granulozyten Die Wirkung eines Immunmodulators kann sich an einer gereinigten Zellpopulation anders darstellen als bei Zellinteraktionen. Zu diesem Zweck wird die Wirkung des Immunmodulators nicht nur an isolierten eqMNC sondern auch in Cokultur von MNC und autologen PMN untersucht. Um möglichst definiert nur die Interaktion dieser Zellpopulationen zu untersuchen, wurden beide erst in hoher Reinheit isoliert und anschließend zu gleichen Teilen wieder gemischt. Damit sollen unterschiedliche Zellzusammensetzungen als zusätzliche Variable vermieden werden. Die Einflüsse unterschiedlicher Konzentrationen des pflanzlichen Immunmodulators in 36h Cokultur gleicher Teile an autologen MNC und PMN ohne und mit dem Superantigen SEA als Stimulator wurde hier im Hinblick auf die Reaktionen der MNC an Zellen von 8 Pferden untersucht (Abbildung 26). - 126 - Ergebnisse Abbildung 26: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) in Cokultur mit autologen Granuozyten (eqPMN) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von 8 Pferden wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation MNC (Reinheit>95%) und mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) PMN (Reinheit >99%) isoliert. In SFM3 Medium (s.3.2.3) wurden sie zu gleichen Teilen gemischt und in Hexaplikaten (je 200.000 - 127 - Ergebnisse Zellen insgesamt / 200 µl SFM3) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 36h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne pflanzlichen Immunmodulator (PIM) in der angegebenen Endverdünnung der Ausgangskonzentration und mit und ohne SEA (1,0 ng/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.3.3.3) wurde der Anteil vitaler kleiner Lymphozyten und blastoider Zellen (bezogen auf die eingesetzten MNC) ermittelt. Die nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wiedergewonnenen vitalen eqMNC nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die gefüllten Box-Diagramme dokumentieren die wiedergewonnen vitalen eqMNC nach Inkubation mit 1,0 ng/ml SEA ohne und zusätzlich mit unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden PIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wiedergewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der MNC in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der MNC von 8 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett’s Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen, wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7).Teil A dokumentiert die Ergebnisse der kleinen Lymphozyten, Teil B die der blastoiden Zellen. Es wurde kein direkter einfluss neutrophiler Granulozyten auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten eqMNC fesgestellt. Auch in den Ansätzen mit SEA und PIM bleiben die zuvor definierten einflüsse des pflanzlichen Immunmodulators gültig. Nach 36h wurde keine Aktivierung mononukleärer Zellen durch den pflanzlichen immunmodulator festgestellt. Eine deutliche Verbesserung der Zellfunktion durch PIM in hinsicht auf die blastogene Transformation unter dem einfluss de Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) konnte nachgewiesen werden. Auch in der Koinkubation mit PMN kann der Einfluss des PIM bezüglich der zellprotektiven Eigenschaften nur durch immunmodulatorische Wirkung, nicht aber auf Grund einer durch ihn ausgelösten Aktivierung der MNC oder PMN erklärt werden. 4.3.1.4 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Wiedergewinnung gereinigter equiner PMN nach 36 stündiger Kultivierung mit und ohne SEA Nachdem keine indirekte Beeinflussung der Vitalität und Proliferation mononukleärer Zellen durch neutrophile Granulozyten in Cokulturen beobachtet werden konnte (s.Abbildung 26), sollte untersucht werden, ob equine neutrophile Granulozyten (eqPMN) überhaupt von dem hier eingesetzten pflanzlichen Immunmodulator (PIM) beeinflusst werden. Dazu wurden zunächst mit Transmigrationsverfahren hoch aufgereinigte Granulozyten von 8 Pferden mit und ohne dem Superantigen SEA, ohne und mit Zusatz unterschiedlicher - 128 - Ergebnisse Konzentrationen an PIM für 36h in vitro kultiviert (s. Abbildung 27). Abbildung 27: Konzentrationsabhängige Zellreduktion equiner PMN durch einen pflanzlichen Immunmodulator in vitro mit und ohne 1,0 ng/ml SEA Zusatz. Aus heparinisiertem Blut von 8 Pferden wurden mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) PMN (Reinheit >99%) isoliert. In SFM3 Medium (s.3.2.3) wurden sie in Hexaplikaten (200.000 Zellen / 200 µl) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 36h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne pflanzlichen Immunmodulator (PIM) in den angegebenen Endverdünnungen der Ausgangskonzentration und mit und ohne SEA (1,0 ng/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.2.15.4) wurde der Anteil wieder gewonnener vitaler PMN (bezogen auf die eingesetzten PMN) ermittelt. Die nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wieder gewonnenen vitalen eqMNC nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen PIMKonzentrationen. Die gefüllten Box-Diagramme dokumentieren die wieder gewonnen vitalen eqPMN nach Inkubation mit 1,0 ng/ml SEA ohne und zusätzlich mit unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden PIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wiedergewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der PMN in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der PMN von 8 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett's Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7). Allein die Kultivierung (MK) hochreiner eqPMN für 36h führte zu einem Verlust von ca. 50% der eingesetzten Zellen. Dies bedeutet keineswegs nur Verlust durch Zelltod, sondern kann auch ein Zeichen besonders starker Adhärenz vitaler und durch die Kultivierung aktivierter PMN an die Plastikoberfläche der Mikrotiterplatten bedeuten, wenn sie in dafür geeignetem Medium wie SFM3 kultiviert werden. Somit kann der Zusatz von PIM in - 129 - Ergebnisse Verdünnungen von 10-3 und 10-4 sowohl eine positive Aktivierung zu vermehrter Adhärenz als auch eine negative Aktivierung in Form der Induktion gesteigerten Zelltodes bedeuten. In jedem Fall ist eine sehr deutliche, hochsignifikante und dosisabhängige Einwirkung dieses Immunmodulators an den Parameter Wiedergewinnung vitaler eqPMN zu erfassen. Sehr deutlich wird aus diesen Ergebnissen auch, dass 1,0 ng/ml SEA keinerlei erkennbaren Einfluss auf diesen Zellparameter – und damit möglicherweise auf eqPMN überhaupt – hat. Die sichtbaren Wirkungen dürften alleine vom PIM und unabhängig vom SEA ausgehen. Die erforderlichen PIM-Konzentrationen für eqPMN liegen um den Faktor 10 bis 100 über denen für eqMNC (vgl. Abbildung 25 & Abbildung 26). Bleibt zu untersuchen, ob der PIM in der Zellkultur eqPMN eher positiv oder negativ beeinflusst. Zu diesem Zweck wurden von den Kultivierungsansätzen mit hochreinen eqPMN (Abbildung 27) nicht nur die vitalen sondern alle wiedergewinnbaren eqPMN quantifiziert (Abbildung 28). Abbildung 28: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Wiedergewinnung aller (vitaler und membrangeschädigter) equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 27: jedoch wurden hier in den Kulturansätzen nicht nur die vitalen (Propidiumjodid [PJ] negativen), sondern auch die membrangeschädigten (PJ positiven) Zellen gemeinsam quantifiziert und als prozentualer Anteil wieder gewonnener eqPMN bezogen auf die eingesetzte Anzahl PMN zu Kulturbeginn ausgedrückt (Ordinate). Die schwarze Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. - 130 - Ergebnisse Insgesamt wurden von den eingesetzten hochreinen eqPMN nach 36h wesentlich mehr als PMN im Durchflusszytometer erkennbare Zellen wieder gefunden, als wenn man nur die vitalen (Propidiumjodid [PJ] negativen) berücksichtigt wie in Abbildung 27. Hiernach lagen die tatsächlichen Zellverluste (durch Adhärenz oder Zelltod?) nur bei 30% bis maximal 40% der eingesetzten eqPMN. Verantwortlich für den Zellverlust war allein der pflanzliche Immunmodulator. SEA dürfte weder direkt noch indirekt daran eine Mitschuld haben. Auch bestand hier im Gegensatz zu Abbildung 27 kein Unterschied im Zellverlust durch PIMVerdünnungen von 10-3 und 10-4. Die Erklärung dafür bietet der Anteil an membrangeschädigten (PJ positiven) eqPMN, der in Abbildung 29 dargestellt ist. Abbildung 29: Konzentrationsabhängige zellmembranschädigende Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators auf gereinigte equine PMN während in vitro Kultivierung für 36h ohne und mit dem Superantigen SEA. Legende wie Abbildung 27, jedoch wurden hier von der Anzahl aller wieder gewonnener eqPMN in den Kulturansätzen (Abbildung 28) nur der darauf bezogene Anteil an membrangeschädigten (PJ positiven) Zellen dargestellt. Die schwarze Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. Hier zeigt sich, dass der vermehrte Verlust an eqPMN nach Kultivierung mit einer PIMVerdünnung von 10-3 sicher auf eine vermehrte Zellschädigung zurückzuführen ist (Steigerung der PJ positiven eqPMN gegenüber der Medienkontrolle von 35% auf ca. 50% in - 131 - Ergebnisse Abbildung 29). Nimmt man die verminderte Wiedergewinnung aller PMN (von 70% in der Medienkontrolle auf 60% unter dem Einfluss der PIM-Verdünnung von 10-3 in Abbildung 28 hinzu, so ist zu vermuten, dass PIM in dieser Konzentration eher schädlich denn positiv aktivierend auf eqPMN wirkt. Da es sich um hochreine eqPMN handelt, dürfte diese Wirkung eher direkt als indirekt sein. Diese Überlegungen werden unterstützt von der Dosisabhängigkeit der PIM-Wirkung: Weniger PJ positive eqPMN (Abbildung 29) bei mehr vitalen eqPMN (Abbildung 27) erklärt den gleich bleibenden Gesamtverlust (Abbildung 28) für die 10-3-10-4 Verdünnung von PIM. Bei alledem hat SEA keinen Einfluss auf eqPMN. Somit hat der hier geprüfte pflanzliche Immunmodulator eine positiv aktivierende zeitabhängige Wirkung auf eqMNC in Verdünnungen von 10-4 bis 10-6 unabhängig von der Anwesenheit autologer PMN. Auf eqPMN hingegen wirkt er in Verdünnungen von 10-3 bis 10-4 eher schädigend. Bleibt noch zu prüfen, wie er auf eqPMN wirkt, wenn sie gemeinsam mit autologen MNC kultiviert werden. 4.3.1.5 Einfluss des pflanzlichen Immunmodulators auf equine PMN in Kokulturen von PMN und MNC Die unter 4.3.1.3 und in Abbildung 26 beschriebenen definierten Kokultivierungsansätze von zuerst isolierten eqMNC und hochreinen autologen PMN von 8 Pferden wurden nun nach dem Verhalten der eqPMN ausgewertet (Abbildung 30). Nachdem eine direkte Beeinflussung der Vitalität neutrophiler Granulozyten durch den PIM beobachtet werden konnte, sollte untersucht werden, ob in Cokulturen mit mononukleären Zellen eine Modulation der Granulozytenvitalität, abhängig von der Konzentration des pflanzlichen Immunmodulators zu beobachten ist. Dazu wurden zunächst mittels Transmigration aufgereinigte Granulozyten in Anwesenheit von Ficoll-separierten mononukleären Zellen, einem Superantigen (SEA) und Zusatz von PIM inkubiert. - 132 - Ergebnisse Abbildung 30: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Wiedergewinnung equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) nach Cokultur mit autologen mononukleären Zellen (eqMNC) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von 8 Pferden wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation MNC (Reinheit>95%) und mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) PMN (Reinheit >99%) isoliert. In SFM3 Medium (s.3.2.3) wurden sie zu gleichen Teilen gemischt und in Hexaplikaten (je 200.000 Zellen insgesamt / 200 µl SFM3) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 36h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne pflanzlichen Immunmodulator (PIM) in der angegebenen Endverdünnung der Ausgangskonzentration und mit und ohne SEA (1,0 ng/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie wurde der Anteil vitaler PMN (bezogen auf die eingesetzten PMN) ermittelt. Die nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wieder gewonnenen vitalen eqMNC nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen PIMKonzentrationen. Die gefüllten Box-Diagramme dokumentieren die wieder gewonnen vitalen PMN nach Inkubation mit 1,0 ng/ml SEA ohne und zusätzlich mit unterschiedlichen PIM-Konzentrationen. Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden PIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wieder gewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der PMN in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der PMN von 8 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett's Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7). - 133 - Ergebnisse Im Vergleich zu hochreinen eqPMN Kulturen (Abbildung 27) stellt sich die Wirkung des PIM auf eqPMN in Cokultur mit autologen MNC quantitativ und qualitativ deutlich anders dar: Der Verlust an vitalen eqPMN ist nicht nur bei der Kultivierung mit einer PIM-Verdünnung von 10-3 stärker (Wiedergewinnung im Median unter 24%) als bei reinen eqPMN (im Median über 30%), er ist auch noch in einer Verdünnung von 10-5 signifikant nachweisbar. In Anwesenheit von MNC tritt nun auch allein durch 1,0 ng/ml SEA ein massiver Zellverlust ein (gefülltes Box-Diagramm bei MK). Dennoch ist der pflanzliche Immunmodulator in Verdünnungen von 10-3 bis 10-5 in der Lage, den PMN-Verlust noch weiter zu erhöhen. Das spricht dafür, dass zusätzlich zu dem direkten PMN-Verlust durch den PIM auch noch ein indirekter durch PIM aktivierte MNC hinzukommt. Auch die alleinige Wirkung von SEA auf den PMN-Verlust ist gerade durch den Vergleich mit der Wirkungslosigkeit von SEA auf gereinigte eqPMN (Abbildung 27 & Abbildung 29) nur durch eine indirekte Wirkung über SEA aktivierte MNC zu erklären. Für die Empfindlichkeit dieser funktionellen Analyse spricht, dass man auch noch die zusätzliche Wirkung des PIM über die SEA-Wirkung hinaus erfasst. Dies lässt an eine costimulatorische Wirkung oder auch an unterschiedliche Aktivierungswege von SEA und PIM denken. Hinweise, wie die vermehrten eqPMN-Verluste in der Cokultur mit autologen MNC zu erklären sind, gibt die Analyse aller (nicht adhärenter PJ negativer und PJ positiver) wieder gewonnener eqPMN (Abbildung 31) und die Betrachtung des Anteils PJ positiver eqPMN daran (Abbildung 32). - 134 - Ergebnisse Abbildung 31: Konzentrationsabhängige Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators (PIM) auf die Wiedergewinnung aller (vitaler und membrangeschädigter) equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) in Cokultur mit gleicher Anzahl autologer MNC ohne und mit SEA-Stimulation für 36 h in vitro. Legende wie Abbildung 30, jedoch wurden hier in den Kulturansätzen nicht nur die vitalen (Propidiumjodid [PJ] negativen) (s.3.3.3), sondern auch die membrangeschädigten (PJ positiven) (s.3.3.3) Zellen gemeinsam quantifiziert (s.3.3.3) und als prozentualer Anteil wieder gewonnener eqPMN bezogen auf die eingesetzte Anzahl PMN zu Kulturbeginn ausgedrückt (Ordinate). Die schwarze Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach solitärer Inkubation mit autologen MNC sowie ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach Inkubation mit autologen MNC und SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. Abbildung 32: Konzentrationsabhängige zellmembranschädigende Wirkung eines pflanzlichen Immunmodulators auf equine PMN in Cokultur mit gleicher Anzahl autologer MNC für 36 h ohne und mit dem Superantigen SEA. Legende wie Abbildung 30, jedoch wurden hier von der Anzahl aller wieder gewonnener eqPMN in den Kulturansätzen (Abbildung 31) nur der darauf bezogene Anteil an membrangeschädigten (PJ positiven) Zellen dargestellt. Die schwarze Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach solitäre Inkubation mit autologen MNC sowie ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach Inkubation mit autologen MNC und SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. Obwohl die Verluste an vitalen eqPMN nach Cokultur mit autologen MNC deutlich größer sind (Abbildung 30) als bei eqPMN alleine (Abbildung 27), zeigt die Wiedergewinnung aller eqPMN nach Cokultur mit MNC ein deutlich anderes Bild (Abbildung 31) als eqPMN alleine (Abbildung 28). - 135 - Ergebnisse Unter dem Einfluss von PIM alleine werden trotz weniger vitaler eqPMN (Abbildung 30) deutlich mehr Gesamt-PMN wieder gewonnen (ca. 80% der eingesetzten eqPMN) (Abbildung 31) als bei den reinen eqPMN (maximal 70%) (Abbildung 28). Auch bewirkt nur die höchste Konzentration an PIM (Verdünnung 10-3) einen stärkeren PMN-Verlust (Wiedergewinnung nur 60% statt 80%) (Abbildung 31), der jedoch nicht stärker ist, als bei den reinen eqPMN (Abbildung 28). Obwohl PIM-Verdünnungen von 10-4 und 10-5 noch signifikante Verluste an PMN in Anwesenheit von MNC bewirken (Abbildung 30), haben sie auf die Wiedergewinnung der Gesamt-PMN keinen erkennbaren Einfluss (Abbildung 31). Zwar ist der Anteil PJ positiver PMN in Cokultur von PMN, MNC und PIM drastisch höher (Abbildung 32), als bei reinen eqPMN (Abbildung 29), in Anbetracht der weit höheren Wiedergewinnung an Gesamt-PMN (Abbildung 31) dürfte der negative Einfluss von PIM auf reine PMN (Abbildung 28 & Abbildung 29) durch die Anwesenheit von MNC zumindest abgemildert werden. Es ist aber auch ein anderer Wirkmechanismus von PIM auf eqPMN in Anwesenheit von MNC denkbar. Das andere Einflussmechanismen bei diesem Analyseverfahren erfassbar sind, dokumentiert die Wirkung von SEA in den Zellkulturen: Während SEA auf reine eqPMN keinerlei Wirkung erkennen ließ (Abbildung 27 bis Abbildung 29) wirkte es eindrucksvoll via MNC (Abbildung 30). Während es bei der Wiedergewinnung der Gesamt-PMN hauptsächlich für die deutlich stärkeren PMN-Verluste verantwortlich war (Abbildung 31), reduzierte es eher noch die Anzahl membrangeschädigter PMN (Abbildung 12). Das spricht für PMN-Verluste durch stärkere Adhärenz (positive Aktivierung von eqPMN. Auf jeden Fall dürften der Einwirkung von SEA auf eqPMN in Anwesenheit von MNC ein oder mehrere andere Mechanismen zugrunde liegen als bei der Einwirkung des pflanzlichen Immunmodulators alleine. Somit haben diese funktionellen analytischen Beispiele erste Hinweise auf die enormen Möglichkeiten differenzierter Beurteilung eines pflanzlichen Immunmodulators beim Pferd gegeben. 4.3.2 Exemplarischer Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf equine Leukozyten - 136 - Ergebnisse Bei Verwendung eines pflanzlichen Immunmodulators konnten modulatorische Effekte aufgezeigt werden, die nur auf Grund der in dieser Arbeit erfassten Parameter und der sich anschließenden Auswerteverfahren ersichtlich wurden (s.4.3.1). Erweiternd sollte nun überprüft werden, ob die entwickelten Techniken ebenfalls in der Lage sind, einen vermutlich differenten Immunmodulator zu charakterisieren. Dazu wird in den folgenden Kapiteln exemplarisch ein mikrobieller Immunmodulator eingesetzt. 4.3.2.1 Einfluss eines mikrobiellenen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 72 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Phythämagglutinin (PHA) Um zu prüfen, ob der hier exemplarisch eingesetzte mikrobielle Immunmodulator (MIM) (3.2.2) einen erkennbaren Einfluss auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) in vitro hat, wurden gereinigte MNC für 72h mit und ohne PHA-Stimulation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des mikrobiellen Immunmodulators in vitro kultiviert und ihre Vitalität (s.3.3.3.1) sowie blastogene Transformation (s.3.3.3.1) durchflusszytometrisch quantitativ (s.3.3.3) und qualitativ (s.3.3.3) bewertet. Als Messgrößen sollten wieder die Verlustraten an kleinen Lymphozyten und an blastoiden Zellen erfasst werden (Abbildung 33). - 137 - Ergebnisse Abbildung 33: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität gereinigter equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) ohne und mit PHAStimulation für 72 h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von jeweils 9 Pferden mit und ohne Insektenallergie (Sommerekzem) wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation MNC isoliert (Reinheit>95%) und in SFM3 Medium (s.3.2.3) in Hexaplikaten (je 200.000 Zellen / 200 µl) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 72h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne mikrobiellem Immunmodulator (MIM) (3.2.2) in angegebener Endverdünnung der Ausgangskonzentration und mit und ohne PHA (0,3 µg/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.3.3.3) wurde der Anteil vitaler kleiner Lymphozyten und blastoider Zellen (bezogen auf die eingesetzten MNC) ermittelt. Die - 138 - Ergebnisse nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wiedergewonnenen vitalen kleinen Lymphozyten von Pferden ohne Allergie (Nichtallergiker) und die gefüllten Box-Diagramme diejenigen von Pferden mit Allergie (Insektenallergiker) nach solitärer Inkubation (Teil B) oder Inkubation mit 0,3 µg/ml PHA (Teil A), beide ohne und mit unterschiedlichen MIM-Konzentrationen.Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden MIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wiedergewonnener vitaler kleiner Lymphozyten (100% = Anzahl der MNC in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der MNC von je 9 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett's Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7). Im Gegensatz zu dem pflanzlichen Immunmodulator (PIM) (Abbildung 24) zeigte der hier eingesetzte mikrobielle Immunmodulator (MIM) in den Verdünnungen 10-3 und 10-4 sowohl alleine (Teil B) als auch in Anwesenheit von 0,3 µg/ml PHA (Teil A) signifikante Verminderungender der wiedergewinnbaren Zellen. Unerwartet waren die Verluste an kleinen Lymphozyten der nicht allergischen Pferden (nicht gefüllte Box-Diagramme) unter dem Einfluss von 10-3 MIM signifikant geringer als die der Nichtallergikern (gefüllte BoxDiagramme). Da diese Differenz zwischen Insekten allergischen und nicht allergischen Pferden nur bei der höchsten MIM-Konzentration und auch da nur im Beisein von PHA gemessen wurde, sind daraus noch keine weiterführenden Schlussfolgerungen zu ziehen. Ab der MIM-Verdünnung von 10-5 war kein signifikanter Einfluss auf kleine Lymphozyten mehr zu sehen. Und wie reagierten die blastoiden MNC unter diesen Bedingungen? (Abbildung 34) - 139 - Ergebnisse Abbildung 34: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten gereinigter equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) ohne und mit PHA-Stimulation für 72h in vitro. Legende wie Abbildung 33, jedoch wurden hier in denselben Kulturansätzen wie in Abbildung 33 die blastoiden MNC statt der kleinen Lymphozyten beobachtet. Entgegen der Wirkung auf die kleinen Lymphozyten (Abbildung 33), bewirkte der MIM signifikante Zunahmen bei der Blastenbildung, die die Verluste der kleinen Lymphozyten - 140 - Ergebnisse jedoch keineswegs ausglichen. Somit war eine modulierende Wirkung des MIM nur in seinen beiden höchsten Konzentrationen zu sehen. Sie war weder toxisch (Förderung der blastoiden Zellen), noch costimulierend, sondern bewirkte eher einen deutlichen Lymphozytenverlust eventuell mit einer temporäre Blastenbildung als Übergangsstadium. Ein vergleichbares Bild zeigte sich auch bei 36h Kultivierung gereinigte MNC mit dem Superantigen SEA statt PHA als definierter Stimulator (Abbildung 34). 4.3.2.2 Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitroKultur mit und ohne Stimulation durch Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) Für vergleichende Untersuchungen mit neutrophilen Granulozyten (PMN) wurde das Verhalten equiner MNC in Kultivierungen über 36h ohne und mit dem Superantigen SEA gegenüber dem mikrobiellen Immunmodulator an insgesamt 10 Pferden untersucht (Abbildung 35). - 141 - Ergebnisse Abbildung 35: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten gereinigter equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 33, jedoch wurden hier in denselben Kulturansätzen mit insgesamt 10 Pferden von nur 36h sowohl die kleinen Lymphozyten (Teil A) als auch die blastoiden MNC (Teil B) dargestellt. Es bestätigte sich die Abnahme der kleinen Lymphozyten ohne ausgleichende Zunahme der blastoiden Zellen. In der verkürzten Kultivierungszeit von 36 h war nur für die höchste MIM- - 142 - Ergebnisse Konzentration eine signifikante Wirkung zu sehen, was für einen zeitabhängigen Einfluss des MIM auf gereinigte eqMNC sprach. 4.3.2.3 Überprüfung des Einflusses eines mikrobiellen Immunmodulators auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner MNC während 36 stündiger in vitro-Kultur mit und ohne Stimulation durch Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) in Anwesenheit von gleicher Anzahl autologer neutrophiler Granulozyten Wurden eqMNC nicht in gereinigter Form sondern gemeinsam mit gleicher Anzahl hochreiner autologer PMN dem mikrobiellen Immunmodulator ohne und mit dem Superantigen SEA für 36h in Cokulturen ausgesetzt, so zeigte sich ein wesentlich anderes Bild (Abbildung 36) als bei dem pflanzlichen Immunmodulator (Abbildung 26). - 143 - Ergebnisse Abbildung 36: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten equiner mononukleärer Zellen (eqMNC) in Cokultur mit autologen Granulozyten (eqPMN) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von 10 Pferden wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation (s.3.3.2.3.) MNC (Reinheit >95%) und mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) PMN (Reinheit >99%) isoliert. In SFM3 Medium (s.3.2.3) wurden sie zu gleichen Teilen gemischt und in Hexaplikaten (je 200.000 Zellen insgesamt / 200 µl SFM3) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für - 144 - Ergebnisse 36h bei 37°C und 5% CO2 in Luft mit und ohne bakteriellem Immunmodulator (MIM) (s.3.2.2) in der angegebenen Endverdünnung der Ausgangskonzentration und mit und ohne SEA (1,0 ng/ml) (s.3.2.2) kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.3.3.3) wurde der Anteil vitaler kleiner Lymphozyten und blastoider Zellen (bezogen auf die eingesetzten MNC) ermittelt. Die nicht gefüllten Box-Diagramme beschreiben die wiedergewonnenen vitalen eqMNC nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen MIM-Konzentrationen. Die gefüllten Box-Diagramme dokumentieren die wieder gewonnen vitalen eqMNC nach Inkubation mit 1,0 ng/ml SEA ohne und zusätzlich mit unterschiedlichen MIM-Konzentrationen.Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse angegeben neben der entsprechenden MIM freien Medienkontrolle (MK). Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wieder gewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der MNC in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der MNC von 10 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett's Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7).Dokumentiert sind die Ergebnisse der kleinen Lymphozyten (oben) und der blastoiden Zellen (unten). In Kokulturen von MNC und PMN konnte für keine Konzentration des MIM einen Einfluss auf die MNC festgestellt werden, weder auf die Lymphozyten, noch auf die blastoiden Zellen. InAnwesenheit der PMN schien die zufor beobachtete Wirkung auf gereinigte MNC aufgehoben zu sein. Da in dem eingesetzten MIM korpuskuläre Strukturen enthalten waren, könnte durch ihre Phagozytose die Modulationsvermittlung beeinträchtigt worden sein. Daher wurden mit Fluorochrom gefärbte Mikroben (s.3.2.2) in nicht opsonisierter und in opsonisierter Form (s.3.3.6) hochreinen PMN von 6 Pferden zugegeben. Die Ergebnisse des Phagozytosetests zeigt Abbildung 37. Abbildung 37: Anteil phagozytierender equiner PMN nach Zugabe von nicht opsonisierten und opsonisierten Mikroben eines mikrobiellen Immunmodulators. - 145 - Ergebnisse Equine Granulozyten wurden aus heparinisiertem Blut 6 gesunder Pferde, mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) isoliert (Reinheit >99%) und in SFM3 Medium (s.3.2.3) in Quadruplikaten (je 200.000 Zellen insgesamt / 200 µl) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) jeweils mit ca 100 FITC-markierten (s.3.2.7) nicht opsonisierten oder opsonisierten Mikroben (s.3.2.7) pro PMN für 60 Min bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Auswertung geschah durchflusszytometrisch (s.3.3.3.1). Dargestellt ist Anteil der vitalen eqPMN, die FITC-markierte Mikroben phagozytiert hatten. Mittelwert und Standardabweichung der Replikate von 6 Tieren. 13,5% hochreiner eqPMN hatten nicht opsonisierte Mikroben, so wie sie im mikrobiellen Immunmodulator (MIM) vorlagen, opsonisiert. Dies könnte die „verschwundene“ Wirkung des MIM in Abbildung 36 erklären. Sollte dieser Immunmodulator auf ein Tier treffen, das durch vorausgegangene Behandlungen oder kreuzreaktiv (z. B. durch Infektionen) über opsonisierende Antikörper verfügt, so wäre die phagozytotische „Inaktivierung“ noch effizienter. Hier haben ca. 26% der eqPMN die opsonisierten Mikroben aufgenommen. 4.3.2.4 Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators auf die Wiedergewinnung vitaler equiner PMN nach 36 stündiger Kultivierung mit und ohne SEA Da der mikrobielle Immunmodulator (MIM) aus offensichtlich leicht phagozytierbaren Mikroben und löslichen Komponenten bestand, wurde untersucht welchen Einfluss die einzelnen Fraktionen (gereinigte Mikroben bzw. mikrobenfreier Überstand) im Vergleich zum kompletten MIM auf die Wiedergewinnung hochreiner PMN von 9 Pferden nach 36h Cokultur haben (Abbildung 38). - 146 - Ergebnisse Abbildung 38: Konzentrationsabhängiger Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) im Vergleich zu seinen Fraktionen: gereinigten Mikroben und mikrobenfreien Überstand auf die gereinigte PMN des Pferdes. Aus heparinisiertem Blut von 9 Pferden wurden mittels Transmigrationsverfahren PMN isoliert (Reinheit>98%) und in SFM3 Medium (200.000 Zellen/200 µl) in einer 96-LochRundbodenmikrotiterplatte bei 37°C und 5% CO2 in Luft über 36h in vitro mit und ohne mikrobiellem Immunmodulator bzw. seinen getrennten Fraktionen in angegebener Dosierung kultiviert. Der Anteil zurückgewonnener vitaler Zellen (bezogen auf die PMN im Ansatz) wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Die orange gefüllten Box-Diagramme beschreiben jeweils die vitalen PMN nach Inkubation mit dem kompletten mikrobiellen Immunmodulator. Die blau gefüllten Box-Diagramme beschreiben jeweils die vitalen PMN nach Inkubation mit gereinigten Mikroben. Die grün gefüllten Box-Diagramme beschreiben jeweils die vitalen PMN nach Inkubation mit mikrobenfreiem Überstand. Das grau gefüllte Box-Diagramm stellt die vitalen PMN nach Inkubation in SFM3 Medium alleine dar. Die Konzentrationen des Immunmodulators und seiner Fraktionen finden sich auf der Abszisse des Diagramms. Skalierung der Ordinate entspricht dem Prozentsatz wiedergewonnenen Zellen (100% = PMN im Ansatz). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf 9 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett's Multiple Comparison Test genutzt. Es zeigt sich für alle Fraktionen des MIM eine dosisabhängige Wirkung im Sinne einer verminderten Wiedergewinnung von eqPMN. Sie ist beim kompletten MIM eindeutig stärker als bei den gereinigten Mikroben und erst recht beim mikrobenfreien Überstand. Somit ist die „verschwundene“ Wirkung des MIM auf eqMNC in Anwesenheit von eqPMN zwar durch - 147 - Ergebnisse Phagozytose zu erklären. Eine modulierende Wirkung auf eqPMN bleibt aber deutlich erhalten. Lässt sich diese MIM-Wirkung auf eqPMN durch Cokultivierung mit dem Superantigen beeinflussen? Dazu wurden hochreine PMN von 9 Pferden wie im Ansatz zu Abbildung 38 jedoch mit Zusatz von SEA für 36h kultiviert (Abbildung 39). Abbildung 39: Konzentrationsabhängiger Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) im Vergleich zu seinen Fraktionen: gereinigten Mikroben und mikrobenfreien Überstand auf die gereinigten PMN des Pferdes während 36h Kultivierung mit dem Superantigen SEA. Legende wie Abbildung 38, jedoch mit Anwesenheit von 1,0 ng/ml SEA. Das grau gefüllte BoxDiagramm stellt die vitalen PMN nach Inkubation in SFM3 Medium mit SEA jedoch ohne MIM dar. Im Vergleich zu Abbildung 38 wird deutlich, dass SEA keinen Einfluss auf hochreine eqPMN oder ihre Modulation durch MIM hatte. Blieb zu prüfen, worauf der MIM bedingte erhöhte Verlust gereinigter eqPMN beruhte. Dazu wurden in dem Kultivierungsansatz mit gereinigten eqPMN Abbildung 39 die Gesamtzahl wieder gewinnbarer PMN (PJ negative = vitale und PJ positive = - 148 - Ergebnisse membrangeschädigte) ermittelt (Abbildung 40) und davon der Anteil membrangeschädigter (PJ positiver) PMN bestimmt (Abbildung 41). Abbildung 40: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Wiedergewinnung aller (vitaler und membrangeschädigter) equiner neutrophilen Granulozyten (eqPMN) ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 39, jedoch wurden hier in den Kulturansätzen nicht nur die vitalen (Propidiumjodid [PJ] negativen) (s.3.3.3.1), sondern auch die membrangeschädigten (PJ positiven) (s.3.3.3.1) Zellen gemeinsam quantifiziert (s.3.3.3.1) und als prozentualer Anteil wieder gewonnener eqPMN bezogen auf die eingesetzte Anzahl PMN zu Kulturbeginn ausgedrückt (Ordinate). Die schwarze Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. - 149 - Ergebnisse Abbildung 41: Konzentrationsabhängige zellmembranschädigende Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators auf gereinigte equine PMN während in vitro Kultivierung für 36h ohne und mit dem Superantigen SEA. Legende wie Abbildung 39, jedoch wurden hier von der Anzahl aller wieder gewonnenen eqPMN in den Kulturansätzen (Abbildung 40) nur der darauf bezogene Anteil an membrangeschädigten (PJ positiven) (s.3.3.3.1) Zellen dargestellt. Die schwarze Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. Wie bei dem pflanzlichen Immunmodulator (PIM) (Abbildung 28 & Abbildung 29) ist auch hier die Analyse aller wieder gewinnbaren eqPMN (Abbildung 40) und der Anteil PJ positiver Zellen (Abbildung 41) sehr informativ: Während sich die dosisabhängige Wirkung von MIM auf die Anzahl wiedergewonnener vitaler eqPMN (Abbildung 39) parallel zur Wiedergewinnung aller eqPMN (Abbildung 40) darstellt, hat der MIM keinen Einfluss auf den Anteil membrangeschädigter eqPMN (Abbildung 41). Somit kann MIM gereinigte eqPMN sehr wirkungsvoll beeinflussen - hier vermutlich in Form von Aktivierung zu verstärkter Adhärenz - ohne sie dabei mehr zu schädigen als die Kultivierung alleine. Bei alle dem bleibt SEA bei gereinigten eqPMN ohne Einfluss. Was aber geschieht, wenn eqPMN gemeinsam mit autologen MNC unter den Einfluss von MIM oder SEA geraten? - 150 - Ergebnisse 4.3.2.5 Einfluss des mikrobiellen Immunmodulators Granulozyten in Cokulturen mit MNC auf neutrophile Wie bei dem pflanzliche Immunmodulator (Abbildung 30 bis Abbildung 32) ist auch beim mikrobiellen Immunmodulator (MIM) erforderlich, seine Wirkung auf eqPMN in Anwesenheit autologer MNC zu prüfen. Auf Grund der Erfahrung aus dem Vergleich von komplettem MIM mit seinen Fraktionen (Abbildung 38 & Abbildung 39) wurden bei der Cokultivierung von eqPMN von 9 Pferden mit autologen MNC sowohl der komplette MIM als auch die gereinigten Mikroben (wirkungsvoller als der mikrobenfreie Überstand s. Abbildung 38 und Abbildung 39 daraus vergleichend untersucht (Abbildung 42). - 151 - Ergebnisse Abbildung 42: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Wiedergewinnung gereinigter equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) alleine und nach Cokultur ohne und mit autologen mononukleären Zellen (eqMNC) für 36h in vitro. Aus heparinisiertem Blut von 9 Pferden wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation MNC (Reinheit>95%) und mittels Transmigrationsverfahren (s.3.3.2.4) PMN (Reinheit >99%) isoliert. In SFM3 Medium (s.3.2.3) wurden die reinen PMN alleine (200.000 Zellen / 200 µl SFM3) oder zu gleichen Teilen mit reinen autologen MNC gemischt und jeweils in Hexaplikaten (je 200.000 Zellen insgesamt / 200 µl SFM3) in einer 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatte (s.3.2.1) für 36h bei 37°C und - 152 - Ergebnisse 5% CO2 in Luft mit und ohne mikrobiellen Immunmodulator (MIM) (3.2.2)oder seiner gereinigten Mikrobenfraktion in den Endverdünnung 10-3 und 10-4 der Ausgangskonzentration kultiviert. Mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie (s.3.3.3) wurde der Anteil vitaler PMN (bezogen auf die eingesetzten PMN) ermittelt. Die orange gefüllten Box-Diagramme beschreiben jeweils die vitalen PMN nach Inkubation mit dem kompletten mikrobiellen Immunmodulator. Die blau gefüllten BoxDiagramme beschreiben die vitalen PMN nach Inkubation mit gereinigten Mikroben. Die grau gefüllten Box-Diagramme stellen die vitalen PMN nach Inkubation in SFM3 Medium alleine dar.Die Endkonzentrationen des Immunmodulators sind auf der Abszisse der obern und der unteren Darstellung angegeben. Die Ordinate zeigt den Prozentsatz wiedergewonnener vitaler Zellen (100% = Anzahl der PMN in der Ansatzkontrolle). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Reaktion der PMN von 9 Individuen mit jeweils 6 Bestimmungen. Zur Auswertung wurde der Dunnett’s Multiple Comparison Test (s.3.3.7) genutzt. Um die dosisabhängige Wirkung statistisch zu belegen wurde Tukey's Multiple Comparison Test angewendet (s.3.3.7). Die aktivierende Wirkung von MIM und - etwas geringer - von seiner gereinigten Mikrobenfraktion auf eqPMN führt durch die Anwesenheit autologer MNC zu noch stärkerer Reduktion der wiedergewinnbaren PMN. Sie erreicht jedoch bei keiner der hier geprüften MIM-Konzentration einen derartigen Verstärkungseffekt wie der alleinige Kultivierungseinfluss (vgl. die grauen Box-Diagramme: 10% Differenz). Das bestätigt, die anfänglichen Ergebnisse mit gereinigten eqMNC (Abbildung 34 & Abbildung 35) bei denen MIM nur bescheidenen aktivierenden Einfluss demonstrierte. Die stärkste Wirkung von MIM auf kleine Lymphozyten (Abbildung 33) wurde als „schnelle Elimination“ von Lymphozyten ohne erkennbare – auch nur temporäre - positive Aktivierung. Dieser Vermutung wird auch durch diese Ergebnisse nicht widersprochen. Somit scheint der MIM bevorzugt eine direkte aktivierende Wirkung auf eqPMN als eine indirekte über Aktivierung der MNC zu haben. Gilt dies auch für SEA? 4.3.2.6 Einfluss des mikrobiellen Immunmodulators auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen mit MNC und superantigener Stimulation - 153 - Ergebnisse Abbildung 43: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Wiedergewinnung gereinigte equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) alleine und nach Cokultur mit autologen mononukleären Zellen (eqMNC) ohne und mit SEAStimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 42, nur dass die Kultivierung sowohl der gereinigten eqPMN alleine (PMN) als auch die Cokultur mit autologen MNC (PMN+MNC) in Anwesenheit von 1,0 ng/ml SEA erfolgte. Entsprechend stellen die grau gefüllten Box-Diagramme jeweils die vitalen PMN nach Inkubation in SFM3 Medium mit SEA dar. - 154 - Ergebnisse Während SEA auf die gereinigten eqPMN wiederum keinen erkennbaren Einfluss hatte (linke Darstellung: PMN), war er massiv in Anwesenheit autologer MNC (rechts: PMN+MNC). Diese SEA und MNC bedingte Reduktion wieder gewinnbarer eqPMN wurde lediglich von der höchsten MIM-Konzentration (10-3) noch etwas verstärkt, von 10-4 aber nicht mehr. Das zeigt, daß der MIM über seine eigenständigen Mechanismen verfügt, eqPMN erfolgreich zu aktivieren. Cooperative Wirkung mit SEA oder SEA induzierten Mechanismen sind bisher nicht zu erkennen. Lediglich über - relativ geringe - MIM induzierte eqMNC Aktivierung mögen noch gewisse Einflüsse auf eqPMN möglich sein. Zur weiterführenden Analyse wurden in den Kultivierungsansätzen zu Abbildung 43 mit 9 Pferden die Gesamtzahl der PMN (PJ negative = vitale und PJ positive = membrangeschädigte PMN, Abbildung 44) und daran der Anteil PJ positiver (membrangeschädigter) eqPMN ermittelt (Abbildung 45). Abbildung 44: Konzentrationsabhängige Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Wiedergewinnung aller (vitaler und membrangeschädigter) equiner neutrophiler Granulozyten (eqPMN) in Anwesenheit autologer MNC ohne und mit SEA-Stimulation für 36h in vitro. Legende wie Abbildung 43, jedoch wurden hier in den Kulturansätzen nicht nur die vitalen (Propidiumjodid [PJ] negativen) (s.3.3.3.1), sondern auch die membrangeschädigten (PJ positiven) (s.3.3.3.1) Zellen gemeinsam quantifiziert und als prozentualer Anteil wieder gewonnener eqPMN bezogen auf die eingesetzte Anzahl PMN zu Kulturbeginn ausgedrückt (Ordinate). Die schwarze Linie beschreibt alle wiedergewonnenen eqPMN nach solitäre Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt alle wieder gewonnenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. - 155 - Ergebnisse Abbildung 45: Konzentrationsabhängige zellmembranschädigende Wirkung eines mikrobiellen Immunmodulators auf equine PMN in Cokultur mit autologen MNC während in vitro Kultivierung für 36h ohne und mit dem Superantigen SEA. Legende wie Abbildung 43, jedoch wurden hier von der Anzahl aller wiedergewonnener eqPMN in den Kulturansätzen (Abbildung 44) nur der darauf bezogene Anteil an membrangeschädigten (PJ positiven) (s.3.3.3.1) Zellen dargestellt. Die schwarze Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach solitärer Inkubation ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Immunmodulators. Die graue Linie beschreibt den Anteil PJ positiver an den insgesamt wieder gefundenen eqPMN nach Inkubation mit SEA sowie ohne und mit dem Immunmodulator. Die Vermutung, dass MIM eher direkt als indirekt auf eqPMN wirkt, ohne sie mehr zu schädigen als die alleinige Kultivierung bestätigt der horizontale Kurvenverlauf in Abbildung 45. Auffällig waren die geringeren Verluste an Gesamt-PMN in Anwesenheit autologer MNC (Abbildung 44) gegenüber gereinigten eqPMN (Abbildung 40), obwohl in Gegenwart autologer MNC MIM stärkere Verluste an vitalen eqPMN bewirkte als bei reinen eqPMN (Abbildung 42). Das bestätigt eine noch effizientere Aktivierung von eqPMN durch MIM im Beisein (und vermutlich auch etwas “Mittun“) von MNC. Wie schon in Abbildung 31 & Abbildung 32 verhelfen eqMNC dem SEA zur starken Aktivierung von eqPMN ohne sie wesentlich zu schädigen. - 156 - Ergebnisse 4.4 Zytokin-mRNA-Transkription equiner MNC nach Inkubation mit einem pflanzlichen oder einem mikrobiellen Immunmodulator In funktionellen Immunmodulationsansätzen mit MNC und, oder PMN vom Pferd hatten ein pflanzlicher (PIM - 4.3.1) und ein mikrobieller Immunmodulator (MIM - 4.3.2) sehr unterschiedliche modulatorische Wirkungsweisen erkennen lassen. Hier sollte nun orientierend mittels RT-PCR (s.3.3.4) geprüft werden, ob sich Immunmodulator assoziierte Zytokininduktionen anhand der Transkription von Zytokin-mRNA nachweisen lassen. Dazu wurden aus heparinisiertem Blut von 5 Pferden reine MNC Präparationen isoliert und für 72h in SFM3 Medium (s.3.2.3) ohne und mit unterschiedlichen PIM (s.3.2.2)- oder MIM (s.3.2.2) -Konzentrationen bei 37° C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Induktion von Zytokin-mRNA Transkription wurde relativ zum mRNA-Gehalt der individuellen MNC-Präparation vor Inkubation als „Induktionsfaktor“ (induction fold) (s.3.3.4.10) angegeben. Nach Isolierung der RNA (3.3.4.2) aus den zu prüfenden Zellen wurde sie mittels reverser Transkription (s.3.3.4.6) in cDNA umgeschrieben. Eine Amplifikation der zu untersuchenden Zytokingene wurde mittels geeigneter Primerpaare (s.3.2.8) sowohl in der konventionellen PCR (s.3.3.4), als auch in der SYBR Green Real time PCR (s.3.3.5) durchgeführt. - 157 - Ergebnisse 4.4.1 Einfluss eines pflanzlichen Immunmodulator (PIM) auf die Zytokinexpression equiner MNC Abbildung 46: Induktion der Zytokin-mRNA-Transkription in equinen MNC durch einen pflanzlichen Immunmodulator (PIM) während 72 h Inkubation in vitro, quantifiziert mittels konventioneller PCR Aus heparinisiertem Blut von 5 Pferden wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation MNC (Reinheit>95%) isoliert und in SFM3 Medium in (s.3.2.3) Hexaplikaten (je 200.000 Zellen insgesamt / 200 µl) für 72h in vitro mit und ohne pflanzlichem Immunmodulator (s.3.2.2) in den angegebenen Konzentrationen bei 37°C und 5% CO2 in Luft kultiviert. Die anschließend aus je 4 x 103 Zellen isolierte RNA (s.3.3.4.2) wurde mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben (s.3.3.4.6). Mit geeigneten Primern (s.3.2.8) wurden für jeden Kultivierungsansatz die cDNA für die Zytokine IL4, IL10, IFNγ und TNFα in einer konventionellen PCR amplifiziert (s.3.3.4). Die Produkte wurden nach Agarose-Flachbettgelelektrophorese (s.3.3.4.8) und Ethidiumbromidinterkalierung unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Das gleiche Verfahren wurde unter identischen Bedingungen mit der Ausgangspräparation an gereinigten MNC eines jeden Tieres vor in vitro Inkubation durchgeführt (Ansatzkontrolle). Zur Quantifizierung einer Zunahme der mRNA-Transkription durch die Kultivierung bzw. durch die unterschiedlichen Konzentrationen an Immunmodulator, wurde die optische Dichte (s.3.3.4.10) der jeweiligen Zytokinbande nach der Kultivierung mit derjenigen in der Ansatzkontrolle verglichen und als „induction fold“ (Induktionsfaktor) dargestellt. Die Konzentrationen des Immunmodulators finden sich als logarithmische Verdünnungsreihe auf der Abszisse des Diagramms. MK = Medienkontrolle (ohne Immunmodulator). - 158 - Ergebnisse Abbildung 46 dokumentiert die Informationen, die man aus der Prüfung hochreiner eqMNC nach 72 h Kultivierung ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen eins pflanzlichen Immunmodulators erhalten kann: Bezogen auf die entsprechende Zytokin-mRNA in der Ausgangskontrolle war bei allen 5 Pferden für IL10 zwar eine sehr geringe Zunahme der mRNA gegenüber den Ausgangszellen alleine durch Kultivierung festzustellen. Jedoch hatte der Immunmodulator in keiner der hier geprüften Konzentrationen weder eine Induktionsnoch eine Hemmwirkung. Im Gegensatz dazu war deutlich eine dosisabhängige Induktionen an mRNA für IL4, IFNγ und TNFα durch den Immunmodulator nachweisbar. Besonders informativ waren die dosisabhängigen Zytokinprofile: Während IFNγ von der höchsten Konzentration des PIM (10-3) maximal induziert wurde und anschließend abfiel, zeigten IL4 und TNFα ihr Induktionsoptimum bei der PIM-Konzentration, bei der auch die relativ stärkste MNC-Aktivierung nach 72 h Kultivierung gesehen wurde (Abbildung 24). Damit kann ein Aktivierungsoptimum von eqMNC bei einer verdünnteren PIM-Konzentration als Ausdruck empfindlicher Zytokinregulation angesehen werden, da hier toxische Einwirkungen ausgeschlossen sind. Zum anderen ist gerade im Vergleich von Zellfunktion und Zytokinexpression zu klären, wie und in welchem Umfang ein Immunmodulator wirkt: Hier eine IFNγ dominierte Zytokininduktion bei hoher PIM-Konzentration, die keine erkennbar MNC-Aktivierung zulässt. Dagegen ein IL4- und TNFα-dominiertes Zytokinprofil bei einem Hundertstel und einem Tausendstel der PIM-Konzentration, das zudem mit dem Aktivierungsmuster der eqMNC übereinstimmt. Da eine Quantifizierung der mRNA-Transkription in der real-time PCR empfindlicher und zuverlässiger möglich ist, wurden die Ergebnisse in Abbildung 46 überprüft, indem die gleichen cDNA Proben in der real-time PCR amplifiziert und quantifiziert wurden (Abbildung 487). - 159 - Ergebnisse Abbildung 47: Induktion der Zytokin-mRNA-Transkription in equinen MNC durch einen pflanzlichen Immunmodulator (PIM) während 72 h Inkubation in vitro. Nachweisvergleich zwischen konventioneller und real-time PCR. Legende wie Abbildung 46, jedoch wurde die cDNA für die Zytokine IL4 und IFN-γ in jedem Kulturansatz und für jedes der 5 Tiere mittels Real-Time SYBR Green™ PCR amplifiziert und quantitativ mit der Ansatzkontrolle verglichen (induction fold). Die schwarze Linie beschreibt jeweils die dosisabhängige Zytokin-mRNA-Transkription für IL4 und die graue für IFNγ. Bei der direkten Gegenüberstellung beider PCR-Verfahren zeigt sich für jedes der beiden Zytokine (IL4 und IFNγ) die gleiche Tendenz, jedoch bei deutlich verbesserter Empfindlichkeit der real-time PCR (linke Darstellung: Optima der Zytokine bei 200 bis über 400 facher Steigerung gegenüber dem Niveau der Ausgangszellen = 1) im Vergleich zu 20 bis 25 fache Steigerung (induction fold) bei klassischer PCR. Die obigen Aussagen werden dadurch nicht verändert. 4.4.2 Einfluss eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) auf die Zytokinexpression equiner MNC In Analogie zur Prüfung des pflanzlichen Immunmodulators (4.4.1) wurde exemplarisch geprüft, ob und welche Zytokine durch die Kokultivierung gereinigter eqMNC von 5 Pferden ohne und mit unterschiedlichen Konzentrationen eines mikrobiellen Immunmodulators (MIM) während 72 h in vitro in Form erhöhter Transkription ihrer mRNA induziert werden (Abbildung 48 & Abbildung 49). - 160 - Ergebnisse Abbildung 48: Induktion der Zytokin-mRNA-Transkription in equinen MNC durch einen mikrobiellen Immunmodulator während 72 h Inkubation in vitro, quantifiziert mittels konventioneller PCR. Legende wie Abbildung 46, jedoch wurde statt des pflanzlichen ein mikrobieller Immunmodulator (MIM) in den angegebenen Verdünnungen eingesetzt. Abbildung 49: Induktion der Zytokin-mRNA-Transkription in equinen MNC durch einen mikrobiellen Immunmodulator während 72 h Inkubation in vitro. Nachweisvergleich zwischen konventioneller und real-time PCR. Legende wie Abbildung 46 & Abbildung 47, jedoch statt pflanzlichem wurde hier ein mikrobieller Immunmodulator (MIM) eingesetzt. - 161 - Ergebnisse Entsprechend dem funktionellen Verhalten der eqMNC (Abbildung 33 bis Abbildung 35) zeigte sich auch bei der Zytokinexpression eine deutlich andere Wirkung des MIM als bei dem pflanzlichen Immunmodulator (Abbildung 46): IL4 wurde nicht, dafür jedoch IL10 induziert. Übereinstimmend zeigten sich MIM und PIM, indem beide in beachtlichem Maße die Transkription für IFNγ und TNFα induzierten. Doch selbst darin unterschied sich der hier eingesetzte MIM von dem PIM: Während der PIM bei hoher Konzentration IFNγ und erst mit abnehmender Konzentration TNFα induzierte, tat dies der MIM im Konzentrationsbereich von 10-3 bis 10-5 nahezu parallel, exakt in dem Bereich, in dem auch eine funktionelle Modulation bei eqMNC mit den hier vorgestellten Verfahren nachweisbar waren. Somit bietet die Kombination Zytokininduktion von eine zellulärer Funktionsprüfung empfindlichere und mit der verständlichere dabei ablaufenden Interpretation von immunmodulatorischen Einflüssen. Abbildung 49 bestätigt in der empfindlicheren real-time PCR, dass tatsächlich von MIM keine nennenswerte IL4 expression induziert wurde. Hingegen wurde die Empfindlickeit des IFNγ-Nachweises um etwa den Faktor 10 (300 gegenüber 30 „induction fold“) verstärkt, bei gleich bleibendem dosisabhängigem Verlauf und somit gleicher Aussage im Hinblick auf die Modulationswirkung des MIM. - 162 - Diskussion 5 Diskussion Heute finden bereits Immunmodulatoren pflanzlicher und mikrobieller Herkunft Einsatz in der Medizin. Es existieren aber nur spärliche Studien über ihre Wirkmechanismen. Die Durchführung solcher Untersuchungen wird erschwert durch die komplexe Zusammensetzung von angeblich immunmodulierenden Substanzen. Über den Einsatz von Immunmodulatoren und ihre Wirkmechanismen beim Pferd ist bisher sehr wenig bekannt, obwohl der Bedarf an Immunmodulatoren in der Pferdemedizin bei Krankheitsbildern, denen die „klassische Schulmedizin“ hilflos gegenüber steht, wächst. Ein Beispiel ist hier das Sommerekzem, eine saisonal allergische Dermatitis. Wiederholt kommt es zu Spontanheilungen nach Applikation von immunologisch aktiven Substanzen - ohne den Kausalzusammenhang zwischen der Erkrankung und dem Erfolg nach Therapie zu erkennen. Zudem eignet sich diese Erkrankung besonders als speziesübergreifendes Modell für Allergien vom Typ I, für die bisher keine guten natürlichen Tiermodelle zur Verfügung stehen. Ziel dieser Arbeit war es, Techniken zu entwickeln, die in vitro Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen von immunmodulatorischen Substanzen bezüglich der Beeinflussung der Vitalität und Proliferation equiner Leukozyten erlauben. Ein weiteres Ziel war die Überprüfung der möglichen zellulären Reaktionsunterschiede in vitro bei Pferden mit und ohne Sommerekzem auf die Stimulation mit Immunmodulatoren. Entscheidend für die Diskriminierung einer stimulatorischen Substanz von einer immunmodulatorischen sollte die Eigenschaft des Modulators sein, nicht (zwingend) selbst eine Reaktion hervorzurufen, sondern eine solche (vom Stimulator) zu verändern. Reaktionen eines Immunmodulators sind in dieser Arbeit demzufolge die positive oder negative Beeinflussung von Proliferation und Apoptose – ausgelöst durch einen definierter Stimulator. Um diesen grundlegenden Überlegungen Rechnung zu tragen, sollten zuerst die Wahl der Kultivierung sowie die Erfassung der Reaktionsparameter einer Leukozytenfunktion bestimmt werden. Darauf folgend wurden exemplarisch zwei vermutlich differente Immunmodulatoren eingesetzt und die Ergebnisse einer modulatorischen Analyse unterzogen. - 163 - Diskussion 5.1 5.1.1 Vorbereitende Arbeiten für eine modulatorische Analyse Wahl des Kultursystems für equine Blutzellen Zur Verbesserung der Vitalität und der zellulären Reaktionen ist es üblich, Zellkulturmedien für Funktionstests mit Lymphozyten oder mononukleären Zellen 2-Mercaptoethanol und fetales Kälberserum zuzusetzen (SODERBERG & YEH 1983; AIDOO et al. 1989; LUTJE & BLACK 1992, LARSSON et al. 1992). In eigenen Untersuchungen konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass der Zusatz von 2-Mercaptoethanol dazu führte, dass Superantigene bei equinen mononukleären Zellen in einem solchen Zellkulturmedium deutliche proliferative Reaktionen hervorriefen - ohne 2-Mercaptoethanol konnte kaum eine Reaktion beobachtet werden (4.1.1). In einem eigentlich speziell für Hybridoma-Zelllinien entwickelten Grundmedium, SFM Medium mit Zusatz von 3% fetalem Kälberserum (SFM3), wurde eine deutliche Proliferation auch ohne den Zusatz von 2-Mercaptoethanol erreicht. Ein Verzicht des Zusatzes von FCS zu SFM-Medium führte zur verminderten Vitalität der unstimulierten sowie stimulierten kleinen Lymphozyten und einer schwachen Proliferationsreaktion in den mit PHA stimulierten Zellkulturen (4.1.1). Daraus lässt sich schließen, dass FCS für die Proliferationsreaktion und die Vitalität ruhender equiner Zellen von wichtiger Bedeutung ist. Proliferationsfördernde Effekte des 2-Mercaptoethanol wurden für mitogen stimulierte Lymphozyten anderer Spezies, wie der Maus, der Ratte und dem Meerschweinchen, beobachtet und auf antioxidative Eigenschaften, die Förderung der Cystinaufnahme in die Zellen sowie der Proteinsynthese und diverser Enzymaktivitäten zurückgeführt (HASLOV et al. 1983; PRUETT et al. 1989; AIDOO et al. 1996). 2-Mercaptoethanol allein war dabei nicht mitogen für die Lymphozyten (AIDOO et al. 1989). Für murine T Zellen konnte jedoch eine direkte Aktivierung der Proteinkinase C durch 2-Mercaptoethanol nachgewiesen werden (ASHENDEL 1985; FONG & MAKINODAN 1989). Diese Untersuchungen unterstreichen somit das komitogene Potential dieser Substanz. Darüber hinaus rief 2-Mercaptoethanol bei murinen und humanen B Zellen deren Differenzierung zu immunglobulinsezernierenden Zellen hervor (FUJIWARA & KARIYONE 1984; SODERBERG & YEH 1983; PISKO et al. 1983). Dass 2-Mercaptoethanol nicht nur Lymphozyten, sondern auch Makrophagen funktionell beeinflusst sowie die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen auf Langerhanszellen fördert, demonstrierten PROKIC & VILIC (1985) sowie BELSITO et al. (1989). - 164 - Diskussion 2-Mercaptoethanol wirkt also in vielfältiger Weise aktivierend auf die Funktionen verschiedener Arten mononukleärer Zellen. Dass dabei Speziesunterschiede bestehen können, verdeutlichen die Studien von MESSINA et al. (1992). Sie zeigten, dass - im Gegensatz zu Mäuselymphozyten - die Proliferation humaner T Zellen durch 2-Mercaptoethanol normalerweise gehemmt und nur in einer Zystin-Mangelsituation gefördert wurde. Zudem scheint das Alter der Spender für die Wirkungsausprägung von 2-Mercaptoethanol bedeutsam zu sein (BELSITO et al. 1989). Für bovine mononukleäre Zellen des peripheren Blutes demonstrierten LARSSON et al. (1992) eine große Variabilität der Wirkung von 2Mercaptoethanol auf verschiedene Zellfunktionen. Insbesondere konnten sie individuell sehr unterschiedliche Effekte auf die spontane und die durch Mitogen induzierte Proliferation der mononukleären Zellen feststellen. Für die in vitro-Untersuchungen der Wirkung verschiedener Immunmodulatoren sollte ein Zellkulturmedium zur Verfügung gestellt werden, das einerseits möglichst optimale Kultivierungsbedingungen equiner mononukleärer Zellen ermöglicht, andererseits aber durch das Fehlen komitogener Faktoren als Bestandteile des Zellkulturmediums spontane Proliferationsreaktionen der untersuchten Zellen weitgehend ausschließt. Zahlreiche Literaturstellen berichten über die erfolgreiche Durchführung eines Lymphozytenproliferationstests mit Zellen unterschiedlicher Spezies in Serum-freiem Medium (KONISKI & COHEN 1992; JOUISHOMME & RIGAL 1991; BLAER & LADEFOGET 1988), aber es wird auch referiert über eine starke Hemmung der Proliferationsreaktion in Serum-freien Medien (BLAER & LADEFOGET 1988; SLUNT et al. 1997;CAUSEY et al. 1994). Es fällt auf, dass für die Bewertung der proliferativen Reaktion in Publikationen, die über die Eignung serumfreier Medien für die Proliferationstests berichten, die 3H-Thymidin-Inkorporation oder BrdU Test (2.9) zur Evaluierung der proliferativen Reaktion von Lymphozyten benutzt wurden. Veröffentlichungen, die über eine starke Hemmung der Proliferationsreaktion in Serum-freien Medien berichten, analysierten die zelluläre Reaktion mittels der Durchflusszytometrie (2.9). Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen zeigten für die equinen MNCs, die mit SFM3 ohne den Zusatz von 2-Mercaptoethanol kultiviert wurden, deutliche proliferative Reaktionen, die denen der Kulturen in DMEM3 mit 2-Mercatoethanol entsprachen (4.1.1). Aufgrund dieser Eigenschaften stand mit dem SFM3 Medium ein Zellkulturmedium zur Verfügung, das unter Verzicht auf das Komitogen 2-Mercaptoethanol für die folgenden Untersuchungen eingesetzt werden konnte. - 165 - Diskussion 5.1.2 Die Quantifizierung von Proliferationsreaktionen Voraussetzung für die in vitro Untersuchungen der pro- oder antiproliferativen Wirkung von Immunmodulatoren war neben der Wahl eines geeigneten Kultursystems (s. 4.1.1) die Etablierung einer Methode zur Quantifizierung der proliferativen Reaktion stimulierter mononukleärer Zellen. Sie sollte der Tatsache Rechnung tragen, dass es unter Superantigenoder Mitogen- Einfluß neben der blastischen Transformation und Zellvermehrung auch zu massiven Zellverlusten kommen kann. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine von PECHHOLD et al. (1994) veröffentlichte durchflußzytometrische Methode zur Quantifikation lebender Kulturzellen modifiziert und für die Anwendung beim Pferd als „Referenzzellmethode“ (s.3.3.3.2) etabliert. Diese Methode stellte sich als schnell und unkompliziert in der Durchführung heraus und erlaubte durch die simultane Bestimmung des Anteils blastisch transformierter Zellen parallel die Erfassung des Parameters Zahl vitaler Blasten. Dass die Aussagekraft der Quantifizierung des 3H-Thymidineinbaus und verschiedener damit korrelierender Methoden, wie der MTT- (HEEG et al. 1985) oder der BrdU-Test (RAZA et al. 1985), hinsichtlich der Einschätzung der zellulären Reaktionen auf Stimuli eingeschränkt sein kann, lässt sich darauf zurückführen, dass sie nur Informationen über die proliferative Reaktion ganzer Zellpopulationen erwarten lassen. Dies bedeutet, dass im Extremfall einzelne stark proliferierende Zellen unter vielen toten Zellen dieselbe Signalstärke hervorrufen können wie eine große Zahl lebender, aber nur schwach proliferativer Zellen. Zwar korreliert die Menge aufgenommenen 3H-Thymidins i.d.R. gut mit dem Zellwachstum durch eine Zunahme der Zellzahl, doch COLIGAN et al. (1992) räumen ein, dass dieser Wert je nach „Toxizität“ des Stimulus eher einen Eindruck der initialen Zellaktivierung als Schlüsse über die absolute Zunahme der Zellzahl zulässt. KABELITZ et al. (1994) konnten in diesem Zusammenhang sogar eine deutliche Diskrepanz zwischen der Entwicklung der Zahl vitaler Zellen und des 3H-Thymidin-Einbaus nach allogener Restimulation von T Zellen aufzeigen. Die Bedeutung dieses Aspekts wurde erst in den letzten Jahren klar. Neben Proliferation und Differenzierung der Zellen sowie der Anergie wurde der aktivierungsinduzierte Zelltod (engl. activation induced cell death, AICD) als drittes Reaktionsmuster reifer, peripherer T Zellen auf die unterschiedlichsten Stimuli (Mitogene, monoklonale Antikörper, konventionelle Antigene und Superantigene) in vivo und in vitro anerkannt (Übersicht bei KABELITZ et al. (1994). Proliferation und AICD scheinen dabei durchaus simultan ablaufen zu können, wie - 166 - Diskussion KABELITZ & WESSELBORG (1992) für Staphylokokken-Superantigene zeigten. Sie berichten, dass trotz eines signifikanten Zellsterbens hohe Einbauraten von 3H-Thymidin vorlagen. Umgekehrt unterscheidet ein niedriger 3H-Thymidin-Einbau nicht zwischen Wachstumsstillstand aufgrund von Suppression / Anergie der Zellen und Zelltod (BREITMEYER et al. 1987). Demgegenüber erlaubt die durchflußzytometrische Bestimmung der absoluten Zahl lebender Zellen einer Kultur durch die Referenzzellmethode (3.3.3.2) diese Differenzierung, so dass die dynamische Entwicklung der Zellantwort auf Stimuli wie Mitogene, die neben einer Zellexpansion auch zu Zelltod unterschiedlichen Ausmaßes führen, hinsichtlich dieser beiden Aspekte untersucht werden konnte (4.1.2). Mit Hilfe parallel erfolgter Phänotypisierung konnte daraufhin auf die Entwicklung der Zellzahl einzelner Subpopulationen mononukleärer Zellen geschlossen werden. Diese überaus wichtige Information, wie viele lebende Zellen einer bestimmten Subpopulation, kleine Lymphozyten oder Lymphoblasten, zu einem gegebenen Zeitpunkt des Stimulationsansatzes noch vorhanden sind, ist nicht durch die Anwendung einer Methode zu erhalten, die einen summarischen Wert für die Proliferationsreaktion einer ganzen Kultur angibt. Dieselbe Einschränkung gilt für die durchflußzytometrische Bestimmung des Aktivierungsgrads der mononukleären Zellen allein über die Blastentransformation, d.h. die Bestimmung des relativen Anteils blastisch transformierter Zellen an der Gesamtzahl vitaler Zellen. Zwar kann eine Aussage über die relative phänotypische Zusammensetzung der Blastenpopulation getroffen werden (LANGE 1995), nicht aber darüber, aufgrund welcher zellulären Reaktionen (Zellvermehrung oder -Tod) ein bestimmtes Verhältnis von Subpopulationen zustandekommt. Nichtsdestoweniger stellt der durchflußzytometrisch gleichzeitig erfassbare, prozentuale Anteil an Blasten in Bezug auf die Ansatzkontrolle einen ergänzenden Parameter für die in vitro Aktivierung equiner mononukleärer Zellen dar. Als Kritik der Methode sei erwähnt, dass auf diese Weise nicht alle aktivierten Zellen erfasst werden. Zum Beispiel zeigten KÜHN et al. (1995), dass nach Stimulation proliferationsassoziierte Antigene auch bei einem Teil der morphologisch kleinen Zellen gefunden werden, die sich im Durchflußzytometer nicht von ruhenden Lymphozyten unterscheiden lassen; sehr frühe Aktivierungsvorgänge können somit nicht erfaßt werden. Zwar eignet sich der prozentuale Anteil an Blasten durch die „natürliche“ obere Begrenzung dieses Parameters nicht gut zur quantitativen Differenzierung von Proliferationsreaktionen im - 167 - Diskussion Bereich maximaler Stimulation; im Bereich submaximaler Stimulation scheint er aber sensitiver als die absolute Zahl vitaler Blasten sowie der 3H-Thymidin-Einbau zu sein. 5.1.3 Die Quantifizierung des Zelltodes Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-beeinflussende Effekte auf Zellen in vitro? Unterstellt man, dass in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (FADOK et al. 2000). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVISTGUSTAFSSON & BENGTSSON. (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen. Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, dass apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose in den verschiedenen Ansätzen in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar. Solche noch als Zellen zu identifizierende Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente) (KRÜGER 2001), so dass auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod von PBL in vivo und in vitro generell die Induktion - 168 - Diskussion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998). 5.2 Einsatz der konventionellen und real-time RT-PCR für Zytokinexpression Untersuchungen Die Erfassung der Induktion von Apoptose oder Proliferation beinhaltet nur zwei Formen der Aktivierung von Leukozyten. In einigen Fragestellungen sollte über diese Reaktionen hinaus eine Modulation der Leukozyten untersucht werden. Daher wurden auch Zytokininduktionen untersucht. Da einerseits für die veterinärmedizinisch relevanten Spezies ELISA Tests, welche zur Quantifizierung der Zytokine in der humanen und murinen Immunologie verwendet werden, weitgehend fehlen, jedoch auf der andern Seite die Nukleotidsequenzen von zahlreichen equinen Zytokinen bekannt sind, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Quantifizierung der mRNA mittels quantitativer RT-PCR für die Untersuchung der Beeinflussung einer Zytokinexpression anwendbar sei. Der Nachweis der Expression der mRNA von Zytokinen lässt allerdings nur die Vermutung zu, dass auch eine entsprechende Translation stattgefunden hat und bioaktives Protein gebildet wurde. In zahlreichen Untersuchungen hat sich die Immunhistochemie als Nachweis der Proteinexpression bei gleichzeitiger Identifikation der Protein-exprimierenden Zelle bewährt (PIQUETTE et al. 1994; KONDO et al. 2001; ZHAO et al. 1997). Zur Darstellung der zellulären Proteinsynthese von Zytokinen beim Pferd liegen bisher allerdings keine Untersuchungen vor. Weiterhin handelt es sich bei den Zytokinen um Substanzen mit einer sehr kurzen Halbwertszeit im Bereich von wenigen Minuten, was einen zuverlässigen immunhistochemischen Nachweis der Proteinexpression (selbst bei zur Verfügung stehenden Antikörpern) schwer duchführbar erscheinen lässt. Die quantitative real-time PCR beinhaltet zunächst alle Vorteile einer konventionellen PCR, nämlich die Schnelligkeit der Durchführung, die Sensitivität und die Nutzbarkeit einer Reihe von Ausgangsmaterialien. Die Sensitivität der QRT-PCR ist laut BUSTIN und MACKAY 100 bis 1000-fach höher als in der konventionellen PCR. So liegt die Nachweisgrenze eines Amplifikates bei der konventionellen PCR (Agarose-Gel) bei 2 bis 4 ng, während in der real-time PCR (rt-PCR) Nachweisgrenzen von 2 bis 20 pg postuliert werden (BUSTIN 2000; MACKAY et al. 2002). - 169 - Diskussion Die Real-time PCR ermöglicht eine exaktere Quantifizierung des Ausgangsproduktes als die konventionelle PCR, da im Gegensatz zur konventionellen PCR im exponentiellen Bereich der Amplifikationsreaktion gemessen wird. Dies ermöglicht zudem eine Quantifizierung in einem weiteren Bereich als bei der konventionellen PCR (Endpunktmethode, Vergleich der Bandenstärke). In dieser Arbeit wurden equine mRNAs für Zytokine nachgewiesen, für die aus anderen Spezies bekannt ist, einer TH1 oder TH2 Dominanz zugehörig zu sein (s. 2.5). Bereits während der Etablierung der rt PCR konnte gezeigt werden, dass die Vorbereitung der Proben (Separation, Aufreinigung) das induzierte Zytokinspektrum ex vivo in Richtung einer TH2 Polarisierung veränderte (4.2.2). Nach Stimulation (PHA) verlor sich diese Unterscheidung, da dieser äußerst potente Aktivator sämtliche Voraktivierungen in vivo dominierte, alle untersuchten Zytokine wurden heraufreguliert (4.2.2). Differenzierter wurde dieses Bild erst durch den solitären Einsatz der Immunmodulatoren. Während der MIM eine klare, dosisabhängige Aktivierung im Sinne einer TH1 Polarisierung induzierte (4.4.2), finden sich bei der Inkubation mit dem PIM widersprüchliche Induktionsmuster: in den hohen Konzentrationen des PIM konnte eine starke mRNA Induktion nur für IFNγ gezeigt werden. Bei Ausverdünnung des Modulators verschiebt sich dieses Bild: die IFNγ Antwort schleicht sich aus, während die Induktion von Interleukin 4 erst bei einer Verdünnung des Immunmodulators von 10-5 sein Maximum erreicht (4.4.1). Allerdings folgt TNFα, ein TH1 Zytokin von monozytoiden Zellen, der gleichen Kinetik und widerspricht damit der klassischen Dominanz einer Th-Zell Antwort. Ob und inwieweit diese z.T. antagonistischen Reaktionen in vivo eine modulatorische Rolle spielen, bleibt hier unbeantwortet. 5.3 Vitalität und proliferative Reaktion mononukleärer Zellen von Pferden mit und ohne Insektenallergie in vitro In eigenen Untersuchungen wurden nur geringe Unterschiede in der Vitalität und proliferativen Reaktion bei Pferden mit und ohne Insektenallergie während Kultivierung mit und ohne Zusatz von PHA nachgewiesen. Da diese Differenz zwischen Insekten allergischen und nicht allergischen Pferden nur bei der höchsten MIM-Konzentration und auch da nur im Beisein von PHA gemessen wurde, sind daraus noch keine weiterführenden Schlussfolgerungen zu ziehen. In einer ähnlichen in vitro Studie im humanen System wurde - 170 - Diskussion aber über spontan erhöhte Apoptoseraten alleine durch Kultivierung ex vivo berichtet (GRZEGORCZYK et al. 2002). 5.4 5.4.1 Modulation der Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro Superantigene haben im Vergleich zu Mitogenen keinen Vitalitäts-modulierenden Effekt auf reine neutrophile Granulozyten SEA (Superantigen) beeinflusste nicht die Absterbekinetik von gereinigten equinen Granulozyten (s.Abbildung 27). Dieses eindeutige Resultat schließt nicht aus, dass Superantigene dennoch Liganden auf der Zelloberfläche dieser Zellen besetzen, sie kreuzvernetzen und die Zellen darüber in anderen Funktionen modulieren, - denn im humanen System konnte gezeigt werden, dass Neutrophile und Eosinophile nach Stimulation MHCKlasse-II-Moleküle exprimieren können (GOSSELIN et al. 1993; WELLER et al. 1993; GUIDA et al. 1994) und über diese sogar Superantigene „präsentieren“. Ein in eigenen Untersuchungen nachgewiesener durch PHA (Mitogen) hervorgerufener vitalitätsmindernder Effekt auf die aufgereinigten PMN wurde auch im humanen Modell als Mitogen-induced cell-mediated cytotoxicity (MICC) beschrieben (YUE et al. 1981). Die Ursache von MICC bleibt aber unklar, obwohl CAPSONI et al. (1981) es gelungen ist, diesen Effekt durch Hydrocortison zu inhibieren. 5.4.2 Superantigene und Mitogene mindern die Granulozyten im Beisein mononukleärer Zellen Vitalität von Die Kokultivierung von equinen Granulozyten sogar nur mit einer geringen Anzahl von mononukleären Zellen führte in vitro zu einem beschleunigten Absterben der neutrophilen Granulozyten (s.Abbildung 21). Im Beisein von SEA und PHA war dieser Vitalitätsmindernde Effekt dramatisch verstärkt (s.Abbildung 30). Die einzige vergleichbare Studie im humanen System kam zu exakt gegenteiligen Resultaten. Dort hemmte SEB in Kokulturen von PMN und MNC die Apoptose von Granulozyten (MOULDING et al. 1999). Ohne die präsentierten Daten als solche in Zweifel zu ziehen, könnte der Grund für diese Diskrepanz im Analyseverfahren zu finden sein: Dort wurde - 171 - Diskussion mikroskopisch der Anteil an Zellen mit apoptotischer Morphologie beurteilt, während hier die Zahl vitaler Zellen bestimmt wurde. Aus den unter (s.2.15) genannten Gründen (u.a. Sekundärnekrose von Granulozyten in vitro und schnelle Desintegration nekrotischer Zellen) könnte somit der von MOULDING et al. (1999) beschriebene Anteil an apoptotischen Zellen fälschlicherweise zu niedrig liegen. Der hier beim Pferd zu beobachtende Effekt einer Vitalitätsminderung, auf Grund reduzierter Zahlen vitaler Zellen im Durchflusszytometer, könnte darauf beruhen, dass in vitro aktivierte Zellen stark an Plastikoberflächen der Mikrotiterplatten u.ä. adhärieren. Allerdings konnte dies mit Hilfe von Kontrolluntersuchungen ausgeschlossen werden: Zwar adhärierten durchaus Zellen an der Plattenoberfläche (im stimulierten Ansatz sowie in der Kontrolle), jedoch blieb das Faktum einer insgesamt verringerten Zahl vitaler Granulozyten nach Kokultur mit mononukleären Zellen im Beisein von Superantigenen immanent. 5.5 5.5.1 Immunmodulatorische Beeinflussung equiner MNC in vitro Stimulation mit PHA Der exemplarisch eingesetzte pflanzliche Immunmodulator (PIM) ist möglicherweise in der Lage, Apoptosemechanismen während einer 72 stündigen Inkubation von eqMNC antiapoptotisch zu beeinflussen (s.Abbildung 37). Besonders auffällig wird diese Eigenschaft bei der Zugabe von 0,3 µg/ml PHA. In diesem Falle ist eine statistisch signifikante Erhöhung der Überlebensrate bis zur Verdünnung 10-6 des PIM zu beobachten. Dieser Effekt kann durch triviale PHA Inaktivierung nicht erklärt werden, weil die maximale antiapoptotische Wirkung bei der Konzentration 10-5 und nicht bei 10-3 erreicht wird, wodurch die Wirkungsdynamik die Form einer Glockenkurve einnimmt (s.4.3.1). Vergleichbare Prozonenphänomene in der Wirkungsdynamik von pflanzlichen Präparaten in vitro wurden von POROZOV et al. (2004) beobachtet. Möglicherweise beruht dieser antiapoptotische Effekt auf der Wechselwirkung zwischen Bestandteilen vom pflanzlichen Immunmodulator und Fas, der vor allem auf aktivierten Lymphozyten exprimiert wird, und (oder) der Aktivierungskaskade von Caspasen. Im Vergleich zur initial eingesetzten Zellzahl finden sich nach 72h in der Summe aus - 172 - Diskussion blastisch transformierten Zellen und kleinen Lymphozyten mehr als 100%. Dies spricht für eine morphologische Veränderung der proliferierten Zellen aus dem morphologischen Fenster der Blasten in Richtung der kleinen, reiferen Lymphozyten, weil insbesondere in den Ansätzen ohne PHA der Anteil an blastisch transformierten Zellen unabhängig von der Konzentration des eingesetzten Modulators relativ konstant (niedrig) bleibt, die Gesamtzahl wiedergewonnener Zellen im Vergleich zur Mediumkontrolle aber steigt. Im Gegensatz dazu konnten bei dem eingesetzten mikrobiellen Immunmodulator (MIM) bereits direkte proapoptotische Effekte beobachtet werden, die sich durch Stimulation mit PHA noch verstärkten. 5.5.2 Stimulation mit SEA Der pflanzliche Immunmodulator zeigte bei der Zugabe von SEA stimulierten MNC, eine starke Blastogenese fördernde Wirkung (s.Abbildung 26). Das hier angewandte Verfahren erlaubt eine dosisabhängige zellverlustprotektive Wirkung und hinsichtlich einer Proliferation eine verbesserte Zellfunktion im Vergleich zur Mediumkontrolle nachzuweisen. Auch ohne SEA Zusatz ist der pflanzliche Immunmodulator in der Lage, kleine Lymphozyten zu aktivieren und dadurch den Anteil blastisch transformierter an den lebenden Zellen zu erhöhen – allerdings ist diese stimulatorische Wirkung des Modulators statistisch nicht signifikant. Nach 36 h Inkubation ist der pflanzliche Immunmodulator nur in Ansätzen, mit einer Stimulation mit 1,0 ng/ml SEA, in der Lage, Apoptosemechanismen von eqMNC in einer Monokultur antiapoptotisch zu beeinflussen. Parallel konnte die blastogene Wirkung von SEA verstärkt werden. Damit konnte eine deutliche Verbesserung der Zellfunktion durch den pflanzlichen Immunmodulator in Hinsicht auf die blastogene Transformation und zellprotektive Eigenschaften unter dem Einfluss des Staphylokokken Enterotoxin A auf eine immunmodulierende und nicht stimulierende Wirkung zurückgeführt werden. In Zellkulturen ohne superantigene Stimulation konnte nach 36h keine Wirkung des pflanzlichen Immunmodulators durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Höchstwahrscheinlich ist der pflanzliche Immunmodulator nicht in der Lage, die Ausschüttung antiapoptotischer Mediatoren von der Zelle hervorzurufen, sondern kann dies nur verstärken, wenn die Zelle auf ein proapoptotisches Signal von außen (SEA) mit Auschüttung (autologer) schützender - 173 - Diskussion Mediatoren beginnt. Allerdings kann der hier gewählte Ansatz keinen Aufschluss über diese Mediatoren liefern. Der mikrobielle Immunmodulator hingegen zeigte bereits ohne Zusatz von SEA eine im Vergleich zur Mediumkontrolle verstärkte Blastogenese, sowie eine verstärkte Zellreduktion – die gleichzeitige Stimulation mit SEA verdeutlichte die durch den Immunmodulator hervorgerufenen Reaktionen (s.Abbildung 34) 5.5.3 Koinkubation von MNC mit PMN unter dem Einfluss von Immunmodulatoren - Einfluss auf die MNC Es wurde kein direkter Einfluss neutrophiler Granulozyten auf die Vitalität und das Proliferationsverhalten eqMNC festgestellt. Auch in den Ansätzen mit SEA und pflanzlichem Immunmodulator bleiben die zuvor definierten Einflüsse von dem pflanzlichen Immunmodulator gültig. Nach 36h wurde keine Aktivierung mononukleärer Zellen durch den pflanzlichen Immunmodulator festgestellt. Eine deutliche Verbesserung der Zellfunktion durch PIM in Hinsicht auf die blastogene Transformation unter dem Einfluss des Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) konnte nachgewiesen werden (s.4.3.1.3). Auch in der Koinkubation mit PMN kann der Einfluss des PIM bezüglich der zellprotektiven Eigenschaften nur durch immunmodulatorische Wirkung, nicht aber auf Grund einer durch ihn ausgelösten Aktivierung der MNC oder PMN erklärt werden. Die Wirkung des mikrobiellen Immunmodulators wurde durch die Anwesenheit der PMN vollständig aufgehoben – ursächlich für diese Reaktion ist vermutlich die Phagozytose der korpuskulären Anteile des Modulators (s.4.3.2.3). Es wird also nur durch den Vergleich der Versuche MNC und Modulator sowie MNC & PMN und Modulator möglich, die modulatorische Potenz zu erfassen: die beschriebene Zellreduktion im Ansatz ohne PMN durch den mikrobiellen Immunmodulator ist nicht auf einen direkten zytotoxischen Effekt zurückzuführen, da in Anwesenheit der PMN kein zytoreduktiver Effekt bei den MNC beobachtet werden kann. 5.5.3.1 Koinkubation von PMN mit MNC Immunmodulatoren - Reaktion der PMN - 174 - unter dem Einfluss der Diskussion Eine Kultivierung von reinen Neutrophilen mit dem pflanzlichem sowie dem mikrobiellen Immunmodulator führte zu statistisch signifikanten dosisabhängigen Zellverlusten (s.4.3.1.5 & s.4.3.2.5). Beim pflanzlichen Immunmodulator korreliert die Erhöhung des Anteils propidiumiodidpositiver Zellen mit dem Rückgang -3 des prozentuellen Anteils -4 wiedergewonnener Zellen in den Verdünnungen 10 und 10 , was für Zellverluste durch Desintegration der Zellmembran spricht. Bei dem mikrobiellen Immunmodulator veränderte sich der Anteil PJ positiver PMN an allen zurückgewonnenen Zellen in keinem der gewählten Ansätze, obwohl bis zu 70% der eingesetzten PMN nicht zurück gewonnen werden konnten. Die Frage, warum sich diese Unterschiede nicht auf das Verhältnis vitaler zu PJ positiver PMN auswirkt, kann mit dem durchgeführtem Versuch nicht eindeutig beantwortet werden. Damit wurde ein dosisabhängiger zytoreduktiver Einfluss nur für den pflanzlichen Immunmodulator auf die PMN festgestellt. Aufgrund der Verminderung des Anteils vitaler PMN in den zurückgewonnenen Zellen kann geschlossen werden, dass der PIM dosisabhängig einen zytotoxischen Einfluss auf die PMN bedingt. Eine Beeinflussung der Vitalität der PMN durch SEA konnte für keinen der Modulatoren festgestellt werden. 5.6 Immunmodulation als messbare Größe Als abschließende Betrachtung soll diskutiert werden, inwieweit eine Immunmodulation messbar sein kann und warum die gewählten Analyseverfahren Informationen bereitstellen, die bei bisher publizierten Ansätzen nicht erkenntlich werden. Wie eingangs definiert kann eine modulatorische Wirkung nur dann erfasst werden, wenn eine bereits bestehende, messbare Reaktion qualitativ oder quantitativ verändert wird. (In dieser Arbeit: s.4.3.1, 4.3.2, 4.4.1 und 4.4.2) Dies bedeutet aber nicht, dass eine Substanz, die auch allein eine Wirkung entfalten kann, in einem anderen Kontext als Modulator auftaucht. (In dieser Arbeit: s. , 4.4.1 und 4.4.2) Um diesem Konzept Rechnung zu tragen, wurden die hier dargestellten Analysen der Proliferations- sowie Apoptosereaktion redundant interpretiert: eine Proliferation mit begleitender Apoptose kann nur dann quantitativ ermittelt werden, wenn beide Parameter, bezogen auf eine inhärente Referenz, jeweils ermittelt werden. Weiterhin wurden exemplarisch die Einflüsse einzelner Subpopulationen von PBL auf die Ausprägung der Reaktion ermittelt. (In dieser Arbeit: s. 4.3.1.3, 4.3.1.5, 4.3.2.3 und 4.3.2.5) Dabei wird deutlich, dass eine Novellierung bisheriger Methoden zur Bestimmung dieser essentiellen - 175 - Diskussion Parameter der Lymphozytenfunktionen notwendig ist – nicht zuletzt als Folge auf die neueren Erkenntnisse der Zellphysiologie. Insbesondere die Erkenntnisse der Polarisierung phänotypisch identischer Subpopulationen aus PBL in funktionell unterschiedliche Effektorzellen, sowie das zunehmend ubiquitäre Phänomen des dual receptor messaging (OLAS et al. 2005) führen zu der Notwendigkeit einer differenzierten Betrachtung auch solch basis-immunologischer Nachweisverfahren wie der Proliferation oder dem Zelltod. Letztlich unterstützen auch die Ergebnisse der RT-PCR mit ihren teils widersprüchlichen Zytokininduktionen diese Schlussfolgerung, auch wenn im equinen System vieles noch einer erweiterten Betrachtung unterzogen werden muss, da ein Homologieschluss aus anderen Säugerspezies letztlich erst durch einen Nachweis der Gültigkeit für die equine Spezies an Aussagekraft gewinnt. - 176 - Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Alexej W. Dronov: Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem Immunmodulation zur gezielten Beeinflussung des Immunsystems wird als prophylaktische und als therapeutische Maßnahme an Bedeutung gewinnen, je effizienter und nebenwirkungsfreier sie durchgeführt werden kann. Dazu ist es erforderlich, die qualitative und quantitative immunmodulatorische Wirkungsweise von Substanzen zu kennen, die als Immunmodulatoren eingesetzt werden sollen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro-Verfahren erarbeitet, die eine differenzierte funktionelle Analyse immunmodulatorischer Wirkungen auf equine mononukleäre Zellen (eqMNC) und auf equine neutrophile Granulozyten (eqPMN) erlauben. Dazu wurden aus dem Blut von gesunden Pferden und von solchen, die an einer Typ I allergischen Insektendermatitis (Sommerekzem) litten, gereinigte MNC (Reinheit >95%) oder gereinigte PMN (Reinheit >99%) isoliert und unter optimierten in vitro Bedingungen unterschiedlich lange (meist 36 bis 72 Stunden) alleine oder gemeinsam kultiviert. Vor und nach Kultivierung wurde jede Zellpopulation mittels qualitativer und quantitativer Durchflusszytometrie bewertet: Anzahl vitaler kleiner Lymphozyten und blastoider eqMNC sowie die Anzahl vitaler und membrangeschädigter eqPMN. Diese funktionellen Parameter wurden ergänzt durch den molekularbiologischen Nachweis der modulierten Expression ausgewählter equiner Zytokine ( IL4, IL10, IFNγ und TNFα) anhand der Transkription ihrer mRNA in eqMNC. Zur exemplarischen Prüfung der Aussagefähigkeit dieser Verfahren im Hinblick auf immunmodulatorische Wirkungsweisen wurden zwei in ihrer Ausgangssubstanz unterschiedliche Immunmodulatoren eingesetzt, ein pflanzlicher (PIM) und ein mikrobieller Immunmodulator (MIM), um vermutete unterschiedliche immunmodulatorische Einflüsse zu erfassen. Dabei wurden beide Immunmodulatoren in einem breiten Konzentrationsbereich (Endverdünnung der Ausgangssubstanz von 10-3 bis 10-6 bzw 10-8) untersucht. Und es zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den beiden Immunmodulatoren in ihrer direkten aber auch in ihrer indirekten Wirkung auf eqMNC und auf eqPMN. Die divergenten - 177 - Zusammenfassung Wirkungsweisen von PIM und MIM wurden besonders deutlich, wenn ihr Einfluss auf eqMNC oder eqPMN nicht nur in getrennten Kulturen hochreine Einzelpopulation an eqMNC oder an eqPMN sondern auch in Cokulturen gleicher Anteile aus eqMNC und autologen eqPMN untersucht wurde. Hierdurch waren besonders indirekte immunmodulatorische Wirkungen zu erfassen. Sehr informativ war zudem der unterschiedliche Einfluss der beiden Immunmodulatoren auf eine Vorstimulation equiner Zellen mit dem pflanzlichen Mitogen PHA (Phythämagglutinin) oder dem Superantigen SEA (Staphylokokken Enterotoxin A). Allein daraus ergaben sich Hinweise auf eine Reihe immunmodulatorischer, teils dosisabhängiger Wirkungsweisen, die sonst verborgen geblieben wären. Erst auf der Basis der funktionellen Ergebnisse, trugen die unterschiedlichen Induktionsmuster an Zytokinen in den eqMNC durch PIM oder MIM zum besseren Verständnis ihrer immunmodulatorischen Wirkungen bei. Somit haben die beiden unterschiedlichen Immunmodulatoren die Kapazitäten eines derartigen analytischen Systems aus Zellfunktionen und Zytokinexpression erst deutlich gemacht. Damit wurde ein Weg zur Erfassung und Bewertung immunmodulatorischer Wirkungen aufgezeigt, der noch ausbaufähig ist. - 178 - komplexer Summary 7 Summary Alexej W. Dronov: Functional and molecular biological parameters suitable for monitoring immunomodulatory modes of action: Examplified with different cell populations of horses with and without clinical symptoms of summer eczema. Prophylactic and therapeutic immunomodulation will advance with improved efficiency and reduced adverse effects of immunomodulators. These will be achieved with increased knowledge about their qualitative and quantitative modes of immunmodulatory action. Within the framework of this thesis in vitro systems have been developed permitting functional analyses of immunomodulatory actions on equine mononuclear cells (eqMNC) and on equine polymorpohnuclear granulocytes (eqPMN). Peripheral blood was harvested from healthy horses and such suffering from summer eczema, a type I allergic dermatitis triggered by insects. Highly purified MNC (purity >95%) or PMN (purity >99%) were cultured alone or in cocultures under optimized conditions for various time periods (usually for 36 or 72 hours). Pre and post cultivation each cell population was qualitatively and quantitatively evaluated by means of flow cytometrical criteria such as the number of vital small lymphocytes and blastoid eqMNCs as well as the amount of vital and subvital eqPMN. These functional parameters were complemented by molecular biological monitoring of modulated expression of selected equine cytokines such as IL4, IL10, IFNγ, and TNFα by means of their mRNA transcription in eqMNCs. In order to exemplify how informative these analytical parameters are two substantially different immunomodulators were applied, a herbal (PIM) and a microbiological one (MIM) suspecting different immunomodulatory influences. Both of these were tested in a wide range of concentrations ( in final dilutions of 10-3 up to 10-6 or 10-8). Indeed, remarkable differences between these two immunomodulators showed up, in their direct as well as their indirect actions on eqMNC or eqPMN. Their divergent immunomodulatory capacities, particularly indirect ones, became most obvious when tested not only on purified eqMNC or eqPMN alone but in cocultures of equal parts of both autologous populations. Highly informative about differing modes of immunomodulation, including dose dependent ones, were - 179 - Summary prestimulations of eqMNC, eqPMN, or cocultures of both with the mitogen PHA (phythemagglutinin) or the superantigen SEA (Staphylococcal enterotoxin A). Due to these functional results discordant expression data on cytokine pattern induced by these two immunomodulators contributed substantially to the understanding of their immunomodulatory modes of action. Thus, the wealth of informative which can be provided by such an analytical system comprising cell functions and cytokine expression became obvious by application of two different immunomodulators. This may be a good way to assess and to evaluate complex immunomodulatory modes of actions – but we have just started it. - 180 - Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis ABBAS AK, MURPHY KM & SHER A. (1996) : Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature ,383, 3-54 ABBAS AK, LICHTMANN AHT & POBER JS. (1994) : Cytokines. Cellular and molecular immunology, 2nd Saunders ABEHSIRA-AMAR O, GIBERT M, JOLIY M, THEZE J & JANKOVIC D L. (1992) : IL-4 plays a dominant role in the differential development of Tho into Th1 and Th2 cells. J. Immunol. ,148, 3820-9 AGGARWAL N & HOLMES MA. 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