Der Einfluss von Katecholaminen auf die Cytokinproduktion von

Aus der Klinik für Innere Medizin
der Philipps-Universität Marburg
Geschäftsführender Direktor: Professor Dr. R. Arnold
-Medizinische PoliklinikEhemaliger Direktor: Professor Dr. P. von Wichert
Der Einfluss von Katecholaminen auf die Cytokinproduktion
von mononukleären Zellen des peripheren Blutes in vitro
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Medizin
dem Fachbereich Humanmedizin der
Philipps-Universität Marburg
vorgelegt
von
Roland Paul Neumann
aus Rheinfelden
Marburg 2003
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin
der Philipps-Universität Marburg am 08.05.2003
gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs
Dekan: Professor Dr. B. Maisch
Referent: Professor Dr. med. P. von Wichert
Correferent: Professor Dr. D. Gemsa
Inhaltsangabe
Seite
1.
Einführung
1
2.
Einleitung
2
2.1
Das Immunsystem
2
2.1.1
Th1/Th2-Zellen
3
2.1.1.1 Konzept der Th1/Th2-Zellen
3
2.1.1.2 Entwicklung der Th1/Th2-Zellen
4
2.1.1.3 Effektorfunktionen der Th-Zellen
5
2.1.1.4 Stabilität der Th-Populationen
6
2.1.2
7
Cytokine
2.1.2.1 Interleukin-4
7
2.1.2.2 Interleukin-6
8
2.1.2.3 Interferon-γ
9
2.2
Das Autonome Nervensystem
9
2.2.1
Sympathikus und Parasympathikus
9
2.2.2
Noradrenerge Innervation lymphatischer Organe
10
2.2.3
Adrenerge Rezeptoren
11
2.2.3.1 Allgemeines über adrenerge Rezeptoren
11
2.2.3.2 Der Beta-2-Rezeptor
12
2.2.3.3 Die molekulare Struktur
12
2.2.3.4 Signaltransduktion
12
2.2.3.5 Regulation des Beta-2-Rezeptors
13
2.2.3.6 Adrenerge Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems
14
2.2.3.7 Beta-2-Rezeptor-Dichte auf lymphatischen Zellen
15
2.3
Einfluss von Katecholaminen auf das Immunsystem
17
2.3.1
Einfluss von Katecholaminen auf einzelne Zelltypen
17
2.3.1.1 Einfluss von Katecholaminen auf Granulozyten
17
2.3.1.2 Einfluss von Katecholaminen auf Lymphozyten
18
2.3.1.3 Einfluss von Katecholaminen auf NK-Zellen
und zytotoxische T-Zellen
2.3.1.4 Einfluss von Katecholaminen auf Monozyten/Makrophagen
19
19
2.3.2
In-vivo-Studien über Katecholaminwirkung
auf das Immunsystem
20
2.3.2.1 Sympathische Denervation
20
2.3.2.2 Infusion von Katecholaminen
21
2.3.3
Katecholamine bei Autoimmunerkrankungen
22
2.4
Kommunikation des Immunsystems mit dem ZNS
22
3.
Fragestellung der Arbeit
24
4.
Material und Methoden
25
4.1
Übersicht
25
4.2
Blutgewinnung
25
4.3
Arbeitsmaterial und Chemikalien
25
4.4
PBMC-Isolierung
27
4.5
PBMC-Kultur
28
4.6
Der Radiorezeptorassay
30
4.6.1
Theoretischer Hintergrund
30
4.6.2
Der Radioligand
32
4.6.3
Graphik des Radioliganden
33
4.6.4
Durchführung des Radiorezeptorassays
33
4.6.5
Berechnung der Beta-Rezeptoren-Anzahl
und der Dissoziationskonstante
35
4.7
Bestimmung der Cytokine
36
4.7.1
Arten der Cytokinbestimmung
36
4.7.2
Durchführung der ELISAs
38
4.8
Statistische Auswertung
39
Ergebnisse
40
5.1
Einführung
40
5.2
Stimulationserfolg
40
5.2.1
Ergebnisse der Versuche mit PHA
40
5.
5.2.1.1 PHA und IL-6
41
5.2.1.2 PHA und IL-4
43
5.2.1.3 PHA und Interferon-γ
46
5.2.2
53
Ergebnisse der Versuche mit IL-2
5.2.2.1 IL-2 und IL-6
53
5.2.2.2 IL-2 und IL-4
53
5.2.2.3 IL-2 und Interferon-γ
53
5.2.3
56
Ergebnisse der Versuche mit Tetanus-Toxoid
5.2.3.1 Tetanus-Toxoid und IL-6
56
5.2.3.2 Tetanus-Toxoid und IL-4
56
5.2.3.3 Tetanus-Toxoid und Interferon-γ
57
5.2.4
59
Ergebnisse der Versuche mit Anti-CD3
5.2.4.1 Anti-CD3 und IL-6
59
5.2.4.2 Anti-CD3 und IL-4
60
5.2.4.3 Anti-CD3 und Interferon-γ
60
5.3
Beta-2-Rezeptoren
61
5.3.1
Beta-2-Rezeptoren-Anzahl
61
5.3.2
Korrelation von Beta-Rezeptoren-Anzahl und Katecholaminwirkung auf die Cytokin-Sekretion stimulierter PBMC
62
Diskussion
65
6.1
Methodenkritik
65
6.2
Einfluss der Stimulantien auf den Stimulationserfolg
66
6.2.1
Cytokin-Produktion nach Stimulation mit PHA
66
6.2.2
Cytokin-Produktion nach Stimulation mit IL-2
67
6.2.3
Cytokin-Produktion nach Stimulation mit TT
67
6.2.4
Cytokin-Produktion nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
68
6.3
Einfluss der Katecholamine auf die Cytokin-Produktion
69
6.3.1
Einfluss der Katecholamine auf die Produktion von Interferon-γ
69
6.3.2
Einfluss der Katecholamine auf die Produktion von Interleukin-6 70
6.3.3
Einfluss der Katecholamine auf die Produktion von Interleukin-4 73
6.3.4
Differenzierter Einfluss von Katecholaminen auf Th1/Th2-Zellen 74
6.4
Korrelation von Beta-Rezeptoren-Anzahl und Katecholamin-
6.
wirkung auf die Cytokin-Sekretion stimulierter PBMC
6.5
80
Klinische Bedeutung von Katecholaminwirkungen
auf Th1-/Th2-Zellen
82
7.
Zusammenfassung
85
8.
Literaturverzeichnis
87
9.
Anhang
99
9.1
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
99
9.2
Mittelwerte, Standardfehler und Anzahl der Messungen
101
9.3
Anzahl der gemessenen Beta-Adrenozeptoren
110
9.4
Die akademischen Lehrer
111
9.5
Danksagung
112
1. Einführung
Das Immunsytem und das autonome Nervensystem wurden lange Zeit als funktionell
voneinander unabhängige Systeme betrachtet. Dabei wurden Einflüsse des autonomen
Nervensystems auf das Immunsystem bereits vor fast einem Jahrhundert erstmalig
beschrieben. Nach subkutaner Injektion von Adrenalin beobachteten Loeper und
Crouzon beim Menschen eine Leukozytose (Loeper und Crouzon, 1904).
Erst in den letzten Jahrzehnten sind die komplexen, funktionellen Zusammenhänge
zwischen Nervensystem und Immunsystem wieder vermehrt ins Augenmerk der
Forschung gerückt.
Es wurde gezeigt, dass vor allem das sympathische Nervensystem mit seinen
Neurotransmittern Adrenalin und Noradrenalin die Funktion von Immunzellen
differenziert modifizieren kann; die entsprechenden adrenergen Rezeptoren konnten auf
den Immunzellen nachgewiesen werden. Von Immunzellen sezernierte Cytokine
können hingegen auch Wirkungen auf das Nervensystem entfalten. Es konnte gezeigt
werden, dass eine ausgeprägte noradrenerge Innervation primärer und sekundärer
lymphatischer Organe besteht, bei der Immunzellen einen direkten Kontakt zu
synaptischen Nervenendigungen aufweisen (Felten, 1992).
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von Noradrenalin und
Adrenalin auf die Interleukinproduktion von T-Helfer-Lymphozyten (Th-Zellen), denen
bei der Immunantwort eine Schlüsselfunktion zukommt. Hierbei werden periphere
mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) in Kultur genommen und mit Anti-CD3Antikörpern, Interleukin-2, Tetanus-Toxoid und Phytohämagglutinin-P stimuliert. In
Gegenwart von Katecholaminen und Katecholaminantagonisten wird die Sekretion von
Interleukin-4, Interleukin-6 und Interferon-γ gemessen. Ausserdem wird die Dichte an
β-Rezeptoren auf den PBMC gemessen, um einen mögliche Korrelation zwischen
Katecholaminwirkung und der β-Rezeptordichte zu untersuchen.
Deshalb sollen im weiteren zunächst das Immunsystem und insbesondere die Th-Zellen,
die
von
ihnen
produzierten
Cytokine,
das
autonome
Nervensytem
sowie
Zusammenhänge zwischen dem autonomen Nervensystem und dem Immunsystem
dargestellt werden.
1
2. Einleitung
2.1 Immunsystem
Das Immunsystem ermöglicht es dem Organismus, sich vor viralen, bakteriellen und
parasitären Infektionen zu schützen und sie zu bekämpfen. Es ermöglicht dem Körper
auch, körperfremdes Gewebe, wie z.B. nach einer Transplantation, zu erkennen und mit
einer Abstoßung zu reagieren, sowie anomale körpereigene Zellen, z.B. neoplastisch
veränderte, zu erkennen und zu eliminieren. Für die vielfältigen Funktionen steht ein
komplexes System aus zellulären und humoralen Bestandteilen zur Verfügung. Zu den
humoralen Bestandteilen zählen u.a. das Komplementsystem, die von den Plasmazellen
sezernierten Antikörper (Ak), einige Gerinnungsfaktoren und Substanzen aus dem
Arachidonsäurestoffwechsel. Die Zellen des Immunsystems und ihre Funktionen sollen
im folgenden kurz dargestellt werden. Unter den Zellen des Immunsystems lassen sich
Zellen der angeborenen Immunantwort von Zellen der erworbenen, spezifischen
Immunantwort unterscheiden. Zu den Zellen, die zur angeborenen Immunantwort
befähigt sind, zählen die Granulozyten und die Makrophagen. Sie zeichnen sich dadurch
aus, Mikroorganismen phagozytieren und abtöten zu können, ohne bereits vorher mit
ihnen Kontakt gehabt zu haben. Die Granulozyten lassen sich durch unterschiedlich
anfärbbare Granula unterscheiden. Die neutrophilen Granulozyten bilden den
umfangreichsten Anteil der Zellen der angeborenen Immunität. Sie besitzen die
Fähigkeit
zur
Phagozytose,
Keimabtötung
und
zur
Freisetzung
von
Entzündungsmediatoren. Eosinophile Granulozyten scheinen eine wichtige Rolle bei
parasitären Infektionen zu spielen. Basophile Granulozyten besitzen Mastzell-ähnliche
Funktionen, sind bei Allergien beteiligt und können wie auch eosinophile Granulozyten
Entzündungsmediatoren sezernieren.
Monozyten/Makrophagen sind Zellen, deren Hauptfunktionen neben der Phagozytose
und der Zytotoxizität, in der Immunregulation, Antigen-Präsentation und der Sekretion
von Cytokinen bestehen.
Bei Kontakt des Immunsystems mit Krankheitserregern kann es zu einer spezifischen
Immunantwort kommen. Hierbei erkennt das Immunsystem bestimmte Bestandteile, die
Antigene, und ist in der Lage, z.B. mit Bildung von Antikörpern spezifisch reagieren zu
können. Die Fähigkeit, ein spezielles Antigen wiederzuerkennen und somit eine rasche
und effiziente Immunantwort einzuleiten, kann z.T. lebenslang bestehen bleiben. Die
2
Lymphozyten sind die Zellen der spezifischen Immunantwort und lassen sich in zwei
Klassen einteilen: in die B-Zellen, deren Hauptaufgabe in der Produktion von
Antikörpern besteht, und in die T-Zellen, die für zelluläre Immunreaktionen
verantwortlich sind und über die Freisetzung von Cytokinen die Immunantwort
modulieren können. Ein Teil der Lymphozyten läßt sich jedoch weder den B- noch den
T-Lymphozyten zuordnen, sie werden als Null-Zellen bezeichnet. Sie stellen eine
heterogene Zellpopulation dar, deren Großteil aus Zellen besteht, die man Natürliche
Killer-Zellen (NK-Zellen) genannt hat. NK-Zellen können virusinfizierte und TumorZellen abtöten und besitzen die Fähigkeit zur antikörperabhängigen Zytotoxizität.
Die T-Lymphozyten lassen sich in zytotoxische CD8+-T-Zellen und CD4+-Helfer-TLymphozyten
(Th-Zellen)
einteilen.
Sie
tragen
membrangebundene
Oberflächenproteine, die T-Zell-Rezeptoren, die ähnlich wie Antikörper zur
spezifischen Immunantwort befähigen. Zytotoxische T-Lymphozyten können als
Effektorzellen z.B. virusinfizierte Zellen abtöten. Th-Zellen üben dagegen eine
immunmodulatorische Wirkung aus. Dabei kommt ihnen eine Schlüsselfunktion zu, die
über Art und Verlauf der spezifischen Immunantwort entscheidet (Janeway, 1997).
2.1.1 Th1- und Th2-Zellen
2.1.1.1 Konzept der Th1- und Th2-Zellen
An der Regulation der Immunantwort sind zum einen antigenpräsentierende Zellen
(APC) beteiligt, zu denen Makrophagen/Monozyten, dendritische Zellen und andere
phagozytierende Zellen gehören, die man zur angeborenen Immunität zählt.
Zum anderen erfolgt die Regulation insbesondere der erworbenen Immunität über
CD4+-T-Helfer-(Th)-Zellen. Mosmann et al. berichteten 1986, dass sich murine ThZellen aufgrund eines unterschiedlich sezernierten Cytokin-Profils funktionell in zwei
Klassen einteilen lassen, die man als Th1 und Th2 bezeichnet hat. Spätere
Untersuchungen an humanen Th-Zellen zeigten, dass sich das Konzept der Th1-/Th2Zellen auch beim Menschen bestätigte. Im Gegensatz zu den ersten Untersuchungen an
murinen Zellen, liess sich jedoch eine genaue Zuordnung bei humanen Th-Zellen nicht
immer eindeutig treffen.
Th1-Zellen produzieren Interferon-Gamma (IFN-γ), Interleukin-2 (IL-2) und TumorNekrose-Faktor-β (TNF-β). Sie fördern die zelluläre Immunantwort über Produktion
3
opsonierender und komplementbindender Antikörper, Monozyten/MakrophagenAktivierung,
Antikörper-abhängiger
Zellcytotoxizität
und
der
Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH). Th2-Zellen produzieren im
Gegensatz dazu IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13. Sie unterstützen und fördern
die humorale Immunantwort einschliesslich des Immunglobulinklassen-Switch von
IgG1 und IgE (Mosmann, 1986, Abbas, 1986, Romagnani, 1997).
2.1.1.2 Entwicklung der Th1- und Th2-Zellen
Th1- und Th2-Zellen besitzen eine gemeinsame Vorläuferzelle. Hierbei handelt es sich
um eine naive CD4+-T-Helferzelle, die als Th0-Zelle bezeichnet wird. Durch Art der
Stimulation und der Anwesenheit bestimmter Cytokine entwickeln sich diese naiven THelferzellen entweder zu Th1- oder zu Th2-Zellen.
Eine Induktion zu Th1-Zellen wird vor allem durch das von aktivierten Makrophagen
und dendritischen Zellen gebildete IL-12 hervorgerufen. Eine Vielzahl von Viren,
Bakterien und Protozoen sind in der Lage, die IL-12-Produktion zu stimulieren und
damit die Entwicklung von Th1-Zellen zu fördern. Funktionelle IL-12-Rezeptoren
befinden sich bei T-Helferzellen nur auf den naiven T-Helferzellen (Th0-Zellen) und
den Th1-Zellen. Auf Th2-Zellen hingegen sind sie nicht mehr nachzuweisen. Außerdem
fördert auch IFN-γ die Entwicklung zu Th1-Zellen. Dies geschieht zum einen durch
Stimulation von Makrophagen, was zu einer verstärkten IL-12-Produktion führt, zum
anderen durch vermehrte Expression von IL-12-Rezeptoren auf Th-Zellen.
Die Entwicklung naiver Th-Zellen zu Th2-Zellen scheint vor allem durch IL-4
hervorgerufen zu werden. Hierbei scheint IL-4 die eigene Produktion zu fördern und als
autokriner Wachstumsfaktor auf Th0- und Th2-Zellen zu wirken. Man geht davon aus,
dass auch Th0-Zellen geringe Mengen IL-4 bilden. Sobald Th0-Zellen nach einer
Aktivierung eine bestimmte Menge IL-4 produzieren, kann es zu einem Punkt kommen,
an dem IL-4 die Th1-Antwort unterdrückt und die Differenzierung zu einer Th2Antwort fördert. Die Th2-Differenzierung hängt daher auch von der Häufigkeit der TZell-Stimulation ab. Bei wiederholter Stimulation kommt es zu einer stärkeren IL-4Produktion, so dass eine Th2-Antwort hervorgerufen wird.
Die Differenzierung in Th1- oder Th2-Antwort hängt außerdem von der Konzentration
des stimulierenden Antigens ab. So hat es sich gezeigt, daß niedrige AntigenKonzentrationen eher eine Th1-Antwort hervorrufen, hohe Antigen-Konzentrationen
4
fördern eher die Th2-Antwort. Eine eindeutige Begründung für dieses Phänomen läßt
sich noch nicht mit Sicherheit geben. So kann einerseits die niedrige Antigen-Dosis vor
allem antigen-präsentierende Zellen (APC) aktivieren, die IL-12 sezernieren und somit
die Th1-Antwort fördern. Dagegen können hohe Antigen-Konzentrationen vor allem
APC stimulieren, die kein IL-12 sezernieren und eher die Th2-Differenzierung
unterstützen. Hohe Antigen-Konzentrationen können auch in der Lage sein, auf die ThZellen wie eine wiederholte Stimulation zu wirken und daher die Th2-Antwort zu
fördern. Inwieweit der T-Zell-Rezeptor auf verschiedene Antigen-Konzentrationen
unterschiedlich zu reagieren vermag, läßt sich noch nicht beantworten. Ein sehr
wichtiger Faktor, der die Richtung der Th-Zellentwicklung beeinflußt, ist die
Kostimulation. So gibt es z.B. zwei Proteine, B7-1 und B7-2, die an den CD28Rezeptor der Th-Zellen binden und durch unterschiedliche Stimulation die Richtung der
Th-Differenzierung beeinflussen. Auch andere Membranproteine sind an der ThZellaktivierung beteiligt. Die Interaktion des CD-40-Liganden der Th-Zellen mit dem
CD-40-Rezeptor auf APCs ist für die Differenzierung der Th-Zellen zu ThEffektorzellen obligat. Ob hierbei für Th1- und Th2-Zellen Unterschiede bestehen, ist
noch nicht bekannt. Ebenso unklar ist noch die Bedeutung des Proteins CD-30 für die
Th-Differenzierung, das nur auf Th2-Zellen nachzuweisen ist (Mosmann, 1986, Abbas,
1986, Romagnani, 1997).
2.1.1.3 Effektorfunktionen von Th1- und Th2-Zellen
Nachdem die Th1-/Th2-Zellpopulationen entdeckt wurden, hielt man die Th1-Zellen
nur für die zellvermittelte Immunantwort oder DTH-Reaktion verantwortlich, die Th2Zellen hingegen für die humorale Immunantwort. Durch die Identifikation der
produzierten Cytokine und der Kenntnis ihrer biologischen Wirkung wurde
offensichtlich, daß sich die Effektorfunktionen der Th-Zellen differenzierter darstellen.
Das typische Th1-Cytokin IFN-γ besitzt mindestens zwei wichtige Funktionen. Zum
einen ist es in der Lage Makrophagen zu aktivieren und ihre Mikrobizidie zu steigern.
Andererseits vermag es, die IgG1 und IgG3-Antikörperproduktion zu stimulieren. Diese
Antikörper binden mit hoher Affinität an Fcγ-Rezeptoren und vermitteln dadurch
Opsonierung und Phagozytose. Th1-Zellen fördern durch Sekretion der Cytokine IFN-γ
und IL-2 die Aktivierung von CD8+ T-Zellen zu cytotoxischen T-Zellen.
5
Die typischen Th2-Cytokine sind IL-4 und IL-5. IL-4 scheint für B-Zellen
hauptverantwortlich für die IgE-Produktion zu sein und kann somit für IgE-abhängige
Mastzell-vermitteltete Reaktionen förderlich sein. IL-5 besitzt die Fähigkeit,
Eosinophile zu aktivieren. Man kann daher bei Th2-dominierten Immunreaktionen hohe
IgE-Spiegel und Eosinophilie beobachten, so z.B. bei Helminthen-Affektion oder
Allergie. Th2-Zellen können außerdem B-Zellen zur Produktion von IgM und nichtKomplement-bindendem IgG4 stimulieren. Einige Th2-Cytokine besitzen auch eine
anti-inflammatorische Wirkung: IL-4 und IL-13 antagonisieren die Aktivierung von
Monozyten/Makrophagen durch IFN-γ, IL-10 hemmt auch die Funktion von
Monozyten/Makrophagen, TGF-β wirkt antiproliferativ. Die Th2-Zellen besitzen neben
ihren
Effektorfunktionen
auch
immunregulatorische
Aufgaben
und
wirken
antagonistisch auf Th1-Antworten (Mosmann, 1986, Abbas, 1986, Romagnani, 1997).
2.1.1.4 Die Stabilität von Th1- und Th2-Populationen
Th1- und Th2-Zellen stammen von einer gemeinsamen naiven Th0-Zelle ab, die sich in
beide Richtungen differenzieren kann. Sowohl Th1- als auch Th2-Zellen besitzen
anfänglich noch die Fähigkeit zur Konversion. Diese Eigenschaft scheint aber durch
wiederholte Stimulation verloren zu gehen und die Differenzierung in Th1-/Th2-Zellen
wird irreversibel. Die biochemische Grundlage für Reversibilität oder Stabilität der
Differenzierung scheint die regulierte Transkription der Cytokin-Gene und der
Expression der Cytokin-Rezeptoren zu sein. So lassen sich einmalig stimulierte Th1Zellen in vitro durch Inkubation mit IL-4 zu IL-4-produzierenden Zellen konvertieren.
IL-4 produzierende Th2-Zellen sind dagegen bei Inkubation mit IL-12 stabil und lassen
sich nicht zu Th1-Cytokin produzierenden Zellen umwandeln (Perez, 1995). Murphy et
al. konnten zeigen, dass sich Th1- und Th2-Zellen nach einmaliger Stimulation in
Gegenwart von IL-4 bzw. IL-12 noch in den jeweils anderen Th-Zelltyp umwandeln
lassen. Nach wiederholter und anhaltender Stimulation verlieren die Th-Zellen diese
Fähigkeit, was auch für Th-Zell-Klone gilt (Murphy, 1996). Auch auf molekularer
Ebene konnte gezeigt werden, dass IFN-γ bei Th0-Zellen zu einer Up-Regulation der
IL-12-Rezeptoren führt. Auf Th2-Zellen konnte nur eine der beiden β-Ketten des IL-12Rezeptors nachgewiesen werden, so dass Th2-Zellen keinen funktionsfähigen IL-12Rezeptor besitzen. Andererseits führt IL-4 zu einer Down-Regulation der IL-12-
6
Rezeptoren. Die Festlegung auf Th1- und Th2-Zellen scheint zu einem frühen Zeitpunkt
der Th-Zell-Entwicklung stattzufinden (Szabo, 1997).
2.1.2 Cytokine
Cytokine sind lösliche Proteine, die als Botenstoffe von Immunzellen wirken. Neben
den Interleukinen zählt man Interferone und bestimmte Wachstumsfaktoren zu den
Cytokinen. Sie sind imstande, die Immunantwort auf vielfältige Weise zu modulieren
und zu lenken. Die Cytokine, die in dieser Arbeit in den Kulturüberständen stimulierter
PBMC gemessen wurden, sollen im Folgenden näher beschrieben werden. IL-4 gilt als
typisches Produkt von Th2-Zellen, IFN-γ als Produkt von Th1-Zellen, IL-6 wird sowohl
von Th2-Zellen wie auch von Makrophagen gebildet.
2.1.2.1 Interleukin-4
Interleukin-4 wurde zuerst als eine Substanz beschrieben, die man in Kulturüberständen
von T-Lymphozyten und T-Zellinien der Maus gefunden hat. Sie ist in der Lage, BLymphozyten zu stimulieren, also aus der Ruhephase in die Zellzyklusphase zu
überführen, was zur alten Bezeichnung „B-Zell-stimulierender Faktor 1“ (BSF1) geführt
hat. Es ist ein Polypeptid aus 153 Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von 20
kDa und ist auf dem Chromosom 5 kodiert, in enger Nachbarschaft zu den Genloci für
IL-3, IL-5, GM-CSF und M-CSF. Seine Wirkung auf B-Zellen besteht auch darin, die
Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen zu fördern, wodurch B-Zellen den T-Zellen
Antigene präsentieren können. Auf vorstimulierte B-Zellen wirkt IL-4 steigernd auf die
IgG1 und IgE-Sekretion und scheint einer der wichtigsten Stimulatoren für die IgEProduktion zu sein. Andererseits besteht ein hemmender Einfluß auf IL-2 induzierte BZell-Proliferation.
Bei
Monozyten/Makrophagen,
ruhenden
B-Lymphozyten,
eosinophile Granulozyten und Langhans-Zellen steigert IL-4 die Expression des FcR II
für IgE. Auf T-Zellen und Thymozyten wirkt IL-4 synergistisch mit IL-2. Makrophagen
können durch IL-4 aktiviert werden, die Produktion monozytärer Cytokine (IL-1α und
β, TNF-α) wird jedoch gehemmt. NK-Zellen werden nach Stimulation durch IL-2 von
IL-4 in ihrer Funktion gleichfalls gehemmt. Neben basophilen Granulozyten
produzieren vor allem Th2-Zellen Interleukin-4. IL-4 fördert die Ausbildung einer Th2-
7
Antwort und hemmt die IL-12- und IFN-γ-abhängige Th1-Antwort. Die Wirkung dieses
Cytokins
wird
über
einen
spezifischen
IL-4-Rezeptor
vermittelt,
der
ein
Molekulargewicht von 60 kDa besitzt (Paul, 1991).
2.1.2.2 Interleukin-6
IL-6 besitzt eine Vielfalt von Eigenschaften, was zu vielen Bezeichnungen geführt hat,
bevor molekularbiologische Studien gezeigt haben, daß nur eine Substanz die
verschiedenen Effekte auszulösen vermag. So bezeichnete man IL-6 z.B. als MyelomWachstumsfaktor, Hepatozyten-stimulierenden Faktor, B-Zell-Differenzierungsfaktor,
zytolytischen Differenzierungsfaktor für T-Lymphozyten, IFN-β2, hämatopoetischen
Faktor 309 oder als Makrophagen-Granulozyten-Inducer IIa. Es handelt sich um ein
Protein mit einem Molekulargewicht von 26 kDa, besitzt aber weder antivirale
Aktivität, die zur Bezeichnung IFN-β2 geführt hatte, noch bestehen strukturelle
Ähnlichkeiten zu den Interferonen. IL-6 besteht aus 184 Aminosäuren und wird von
einer
Vielzahl
unterschiedlicher
Zellen
produziert,
vor
allem
von
Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten. Aber
auch Mastzellen, Keratinozyten, Gliazellen und einige Karzinomzellen sind in der Lage,
IL-6 zu produzieren. Der Genlocus befindet sich auf Chromosom 7, seine Sequenzen
zeigen Homologien zu denen von G-CSF. IL-6 ist nicht nur in der Lage, auf andere
Leukozyten zu wirken, sondern hat auch Effekte auf Leber und Teile des Gehirns. In der
Leber induziert es die Produktion zahlreicher Akute-Phase-Proteine wie z.B. des Creaktiven Proteins, im Gehirn besitzt es zusammen mit IL-1 einen pyrogenen Effekt und
steigert
die
ACTH-Freisetzung.
Auf
B-Lymphozyten
wirkt
es
als
Differenzierungsfaktor und fördert die terminale Differenzierung zu Plasmazellen. In
Kombination mit IL-1 aktiviert IL-6 T-Lymphozyten, in Anwesenheit von IL-2 wird die
Differenzierung von T-Lymphozyten zu Zytotoxischen T-Zellen gefördert. Auf
Monozyten und Makrophagen wirkt es aktivierend und steigert vor allem deren
antikörperabhängige, zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC). Es gibt einen spezifischen
IL-6-Rezeptor,
Hepatozyten
der
und
von
einigen
Monozyten/Makrophagen,
Tumorzellen
B-
exprimiert
und
wird.
T-Lymphozyten,
Neben
diesem
membranständigen IL-6-Rezeptor gibt es noch eine lösliche Form des IL-6-Rezeptors,
8
worüber auch Effekte in Zellen ohne IL-6-Rezeptor vermittelt werden können
(Heinrich, 1990, Hirano, 1990).
2.1.2.3 Interferon-γγ
IFN-γ wird von T-Lymphozyten und NK-Zellen nach Stimulation durch Antigene,
Mitogene oder Cytokine wie z.B. IL-2 gebildet. Es besteht aus 143 Aminosäuren und
liegt in zwei Formen vor, die sich nur in ihrer Glykosylierung unterscheiden. IFN-γ
besitzt neben anderen Eigenschaften auch eine antivirale Potenz, was es mit den
Interferonen IFN-α und IFN-β verbindet. Das Wachstum von T- und B-Lymphozyten,
hämatopoetischen Progenitorzellen und Fibroblasten wird gehemmt. Auf Makrophagen
wirkt es jedoch stimulierend und ist imstande ihre Fähigkeit zur Phagozytose, zur
Antigenpräsentierung und ihre Bakterizidie zu steigern. IFN-γ ist im Rahmen der
Immunantwort für Makrophagen eine Art „priming“-Signal und macht sie empfänglich
für ein „Trigger“-Signal, wie z.B. TNF-α, IL-1 oder LPS. Diese zweistufige
Makrophagenaktivierung scheint eines der wirkungsvollsten Effektorsysteme der
Immunantwort zu sein und ist in der Lage, kurzfristig die Makrophagen in einen Grad
erhöhter Aktivität zu versetzen. Als Produkt von Th1-Zellen ist es in der Lage, die IL-4Produktion aus stimulierten Th2-Zellen zu supprimieren und somit die Produktion von
IgG1 und IgE , die durch IL-4 gefördert wird, zu unterdrücken. Die Differenzierung und
Funktion von NK-Zellen wird gesteigert, indem die Expression von MHC-Molekülen
verstärkt und die Bildung cytolytischer Faktoren vermehrt wird. IFN-γ steigert
außerdem die Differenzierung zu cytotoxischen T-Zellen (Pestka, 1987).
2.2 Autonomes Nervensystem
2.2.1 Sympathikus und Parasymphatikus
Das autonome Nervensystem, das auch als vegetatives Nervensystem bezeichnet wird,
innerviert nahezu alle Organe des menschlichen Körpers. Seine Hauptaufgabe besteht
darin, ein inneres Milieu im Organismus konstant zu halten und die Organfunktionen
den wechselnden Umweltbedingungen anzupassen. Um der komplexen Aufgabe der
Regelung der Vitalfunktionen nachzukommen, kommt es zum Zusammenspiel zweier
9
antagonistisch wirkender Teile des autonomen Nervensystems, des Sympathikus und
des Parasympathikus. Die Aufgabe des Sympathikus als ergotrop wirkender Anteil des
autonomen Nervensystems liegt in der Leistungsssteigerung des Organismus. Der
Parasympathikus unterstützt als trophotrop wirkender Anteil den Stoffwechsel, die
Regeneration und den Aufbau körpereigener Reserven. Das wichtigste
Integrationszentrum ist der Hypothalamus, der mit seiner Verbindung zur Hypophyse
endokrine Drüsen und autonomes Nervensystem koordinieren kann. Während im
Sympathikus die Erregungsübertragung in der Regel durch Noradrenalin erfolgt,
geschieht dies beim Parasympathikus durch Acetylcholin. Nachdem sich gezeigt hat,
daß auch das Immunsystem durch das autonome Nervensystem modulierbar ist, wurde
insbesondere auch die sympathische Innervation lymphatischer Organe untersucht: Es
zeigte sich eine ausgeprägte noradrenerge Innervation lymphatischer Organe.
2.2.2 Noradrenerge Innervation lymphatischer Organe
Postganglionären Fasern des sympathischen Nervensystems dient hauptsächlich
Noradrenalin als Transmitter. In der Milz wurde eine ausgeprägte noradrenerge
Innervation vor allem der weissen Pulpa nachgewiesen. Ein Grossteil endet in den periarteriolären, lymphatischen Scheiden. In diesen Zonen befinden sich Pan-T-Zellen, THelferzellen und CD8+-, cytotoxischen T-Zellen. Auch im Bereich von Marginalzone
und des Marginalsinus, wo sich Makrophagen und B-Lymphozyten befinden, sind
noradrenerge Fasern nachweisbar. Elektronenmikroskopische Studien haben einen
direkten Kontakt der Nervenendigungen mit den Lymphozyten und Makrophagen
zeigen können. Hierbei kommt es zu einer Annäherung der Membranen bis zu 6 nm,
ohne dass Schwann-Zellen, interdigitierende Zellen, Basalmembranen o.ä. dazwischen
liegen. Diese direkten Kontaktzonen befinden sich im Bereich der Zentralarterie, der
periarteriolären, lymphatischen Scheiden, der Randsinus und vereinzelt auch im
Randzonenbereich. Durch Diffusion des Noradrenalin von den Nervenendigungen in
das Milzparenchyms ensteht innerhalb der Milz ein breites Spektrum von
Konzentrationen. Daher muß sich der Effekt des Noradrenalin nicht nur auf diese engen
Kontaktbereiche beschränken, da Interaktionen über Adrenozeptoren mit allen
Immmunzellen theoretisch möglich sind (Felten, 1991, 1992).
In Lymphknoten gibt es noradrenerge Innervation im Bereich der subkapsulären, der
parakortikalen und kortikalen Zone und im Bereich der Markstränge. In den Follikeln,
10
die B-Lymphozyten- enthalten, konnten keine noradrenergen Fasern nachgewiesen
werden (Giron, 1980). In Milz und Lymphknoten werden also vor allem Monozytenund T-Lymphozyten-Funktionen direkt durch Noradrenalin beeinflußt. Der Einfluß des
Noradrenalin auf die B-Zellen scheint eher indirekt durch die veränderte CytokinProduktion von T-Zellen und Monozyten und deren Funktionen zu sein. Schließlich legt
die spezifische Verteilung der noradrenergen Fasern den Schluß nahe, daß die Effekte
von einer bestimmten Noradrenalin-Konzentration an den Zielzellen abhängig sind, die
durch den engen Kontakt zwischen Zielzellen und noradrenergen Nervenendigung
erreicht wird. Auch im Knochenmark sowie im Thymus konnte eine noradrenerge
Innervation nachgewiesen werden. Die noradrenergen Effekte auf Immunzellen werden
durch Adrenozeptoren vermittelt, die im weiteren beschrieben werden.
2.2.3 Adrenerge Rezeptoren
2.2.3.1 Allgemeines über adrenerge Rezeptoren
Katecholamine stimulieren ihre Zielzellen, z.B. auch Immunzellen, über Interaktionen
an adrenergen Rezeptoren (Adrenozeptoren) auf der Zelloberfläche. Adrenozeptoren
sind in zwei Klassen aufgeteilt, α und β, die in insgesamt neun Subtypen aufteilbar sind,
wie pharmakologische und molekularbiologische Studien gezeigt haben (Kobilka, 1992,
Kobilka, 1991, Rockman, 2002). Adrenozeptoren wurden klassischer Weise durch die
unterschiedlich agonistische Potenz von Noradenalin, Adrenalin und Isoproterenol
eingeteilt. Noradenalin und Adrenalin binden an α- und β-Rezeptoren mit
unterschiedlich starker Affinität, wohingegen Isoproterenol selektiv an β-Rezeptoren
bindet. Molekularbiologische Studien haben gezeigt, daß den Adrenozeptoren ein
einheitliches Bauprinzip zugrunde liegt und sie zur Superfamilie der G-Proteingekoppelten Rezeptoren gezählt werden können (Strasser, 1992). α1-Rezeptoren
bewirken über G-Proteine eine Aktivierung der Phospholipase C, die über den
Phosphoinositolstoffwechsel freies intrazelluläres Kalzium erhöht. α2-Rezeptoren sind
mit dem Gi-Anteil des Adenylat-Cyclase-Komplexes gekoppelt und bewirken nach
Stimulation ein Abfall von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP). β-Rezeptoren
sind mit dem GTP-bindenden Anteil, Gs, des Adenylat-Cyclase-Komplexes verbunden,
welcher nach Stimulation einen Anstieg von cAMP bewirkt.
11
2.2.3.2 Der Beta-2-Rezeptor
2.2.3.2.1 Die molekulare Struktur
Der humane β2-Rezeptor ist ein 413 Aminosäuren umfassendes Protein mit einem
Molekulargewicht von 65 kDa. Er ist an der Oberfläche der Zielzellen lokalisiert und
besitzt einen extrazellulären, einen transmembranären und einen intrazellulären Anteil.
Das NH2-Ende der Aminosäurenkette ragt in den Extrazellulärraum, das Carboxyl-Ende
in den Intrazellulärraum. Sieben α-Helices stellen den transmembranären, hydrophoben
Anteil des Rezeptors dar und sind durch jeweils drei intrazelluläre und extrazelluläre
Schleifen
miteinander
verbunden.
Die
Bindungsdomäne
ist
gegen
den
Extrazellulärraum gerichtet und liegt in den transmembranären Helices. Aus diesem
Grund besitzen hydrophobe β-Adrenozeptor-Antagonisten eine bis zu 104fach stärkere
Affinität zu den Rezeptoren als hydrophile Katecholamine (Strasser, 1992).
Abb.1: Struktur des β2-Adrenozeptor-Moleküls
2.2.3.2.2 Die Signaltransduktion
Nach Bindung eines Liganden an den Rezeptor wird am intrazellulären Anteil das
stimulatorische G-Protein (Gs) gekoppelt und an der dritten Schleife und dem
Carboxyterminalen Ende des Proteins „fixiert“. Das G-Protein ist aus drei
12
Untereinheiten aufgebaut, einem α- (45 kDa), einem β- (35 kDa) und einem γ-Anteil (7
kDa). Grundsätzlich kann das G-Protein in einer inaktiven GDP-Form und einer aktiven
GTP-Form vorliegen. Wenn kein Hormon an den Rezeptor gebunden ist, liegt der
Großteil der G-Proteine in der GDP-Form vor. Sobald ein Hormon an den Rezeptor
gebunden ist, lagert sich das G-Protein an. GTP wird anstelle von GDP vom G-Protein
gebunden und die α-Untereinheit mit dem gebundenen GTP löst sich von der βγUntereinheit, um an die membranständige Adenylatcyclase zu binden, die dadurch
aktiviert wird. Durch Bindung eines Hormon-Moleküls an einen Rezeptor können viele
G-Proteine aktiviert werden. Die Aktivität der Adenylatcyclase, die ATP zu cAMP
umwandelt, ist zeitlich dadurch begrenzt, daß das G-Protein eine intrinsische GTPaseAktivität besitzt, die das G-Protein nach einer bestimmten Zeit wieder in die inaktive
GDP-Form überführt, welche vom Adenylatcyclase-Molekül dissoziiert. So kommt es
insgesamt zu einer vielfachen Verstärkung der Rezeptorantwort (Lefkowitz, 1983,
1987).
Durch cAMP wird die Proteinkinase A aktiviert: Diacylglycerol führt zur Aktivierung
der Proteinkinase C und Inositoltrisphosphat induziert die Freisetzung von Ca2+ aus
intrazellulären Kalziumspeichern. Die aktivierten Proteinkinasen sind imstande, Serinund Threonin-Reste verschiedener Proteine zu phosphorylieren und so eine Steigerung
oder Abschwächung zellulärer Aktivität zu bewirken. Die Veränderung der zellulären
Aktivität hängt mit einer Veränderung der Genexpression zusammen. So werden
vermehrt insbesondere spezifische Transkriptionsfaktoren wie cAMP response binding
protein u.a. gebildet. (Ruffolo, 1994, Milligan, 1994, Karin, 1992, Rockman, 2002)
2.2.3.2.3 Regulation des β 2-Rezeptors
Die Regulation der β2-Rezeptoren kann auf unterschiedliche Arten erfolgen. So kann
zum einen die Signalübertragung moduliert werden und zum anderen die Dichte an
Rezeptoren auf den Zellen verändert werden im Sinne einer Up- oder Down-Regulation.
Durch Stimulation des Rezeptors kommt es über die aktivierte Adenylatcyclase zu
einem Anstieg an cAMP. Über den erhöhten cAMP-Spiegel kommt es zu einer
Aktivierung der Proteinkinase A. Diese phosphoryliert die Bindungsstellen für das GProtein am β2-Rezeptor und verhindert dadurch eine Kopplung des G-Proteins an den
Rezeptor. Die Aktivität der Adenylatcyclase und ihre Stimulation hängt noch von
13
einigen weiteren Faktoren ab, so kann die Adenylatcyclase auch durch Stimulation
anderer Rezeptoren (wie z.B. für Dopamin (D2), Histamin (H2), Prostaglandin E2,
Glukagon, ACTH etc.) oder rezeptorunabhängig durch bestimmte Substanzen wie das
Forskolin
aktiviert
werden.
Auch
bei
Stimulation
von
Rezeptoren,
deren
Signaltransduktion über Phosphatidylinositol und Proteinkinase C verläuft (z.B. α1R,
Substanz-P-Rezeptor, Acetylcholin-(M1)-Rezeptor, T-Zell-Rezeptor), kann der β2Rezeptor an der G-Protein-Bindungsstelle phosphoryliert werden. Bei höheren
Agonisten-Konzentrationen wird auch eine spezifische Beta-2-Rezeptor-Kinase
aktiviert, die im Gegensatz zu den Proteinkinasen A und C nur den β2-Rezeptor
phosphoryliert. An diese phosphorylierten β2-Rezeptoren kann ein bestimmtes Protein,
das β-Arrestin, binden, welches die Inaktivierung des β2-Rezeptors unterstützt. Zellen
sind auch imstande, β2-Rezeptoren zu internalisieren und sie so der Bindung mit
Katecholaminen zu entziehen. Lipophile Liganden (z.B. ICYP, DHA) sind jedoch
weiterhin imstande, an die internalisierten Rezeptoren zu binden, wodurch diese
nachweisbar bleiben. Nach einer Stimulation mit β-adrenergen Agonisten kann es zu
einer Verminderung der absoluten β2-Rezeptor-Zahl pro Zelle, also zu einer DownRegulation kommen. Vermutlich bewirkt hierbei eine Erhöhung des cAMP eine
verminderte Transkription der mRNA für den β2-Rezeptor. Eine Up-Regulation der β2Rezeptor-Anzahl kann durch kurzfristige Stimulation mit β-adrenergen Agonisten oder
durch längerfristige Blockade mit β-adrenergen Antagonisten hervorgerufen werden.
(Sibley, 1987, Haussdorff, 1991, Caron, 1993, Caron, 991, De Blasi, 1985, Collins,
1989).
2.2.3.6 Adrenerge Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems
Die Nutzung spezifischer Radioliganden hatte es ermöglicht, Adrenozeptoren weiter zu
identifizieren und zu klassifizieren und die zunächst pharmakologischen Hinweise auf
bestimmte Rezeptoren zu verifizieren. Mit Hilfe radioaktiv markierter Agonisten oder
Antagonisten für die verschiedenen Rezeptortypen konnten auf vielen Körpergeweben
Adrenozeptoren nachgewiesen werden. So ließen sich mit β-Adrenozeptor-spezifischen
Radioliganden auf Lymphozyten hochaffine β-Rezeptoren, vornehmlich der β2-Klasse,
nachweisen. Das Vorhandensein von α-Rezeptoren konnte noch nicht eindeutig
bestätigt
werden,
obwohl
es
Berichte
14
über
α-Adrenozeptor-Expression
von
Lymphozyten des Menschen wie auch des Meerschweinchens gibt. Man hält es für
möglich, daß einige Lymphozyten abhängig vom Grad ihrer Aktivität und
Differenzierung α-Rezeptoren tragen, oder daß die Expression auf eine kleine
Zellpopulation immunkompetenter Zellen beschränkt ist (Madden, 1991, Brodde, 1981,
Landmann, 1981, 1985, Loveland, 1981, Titinchi, 1984, McPherson, 1982, Goin, 1991,
Abrass, 1985, Spengler, 1990, Yukawa, 1990, Cremaschi, 1991, Fuchs, 1988, Khan,
1986). Auf aktivierten Monozyten konnten α2- und β-Adrenozeptoren nachgewiesen
werden. α2-Adrenozeptoren fanden sich auf Blutplättchen. β-Adrenozeptoren werden
auch von eosinophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten exprimiert.
2.2.3.7 β 2-Rezeptor-Dichte auf lymphatischen Zellen
Die Dichte der β2-Rezeptoren ist bei den verschiedenen Lymphozyten-Arten
unterschiedlich. Bei Mäusen ist die Zahl der exprimierten β-Adrenozeptoren auf BZellen der Milz doppelt so hoch wie die der T-Zellen (Fuchs, 1988). Auch beim
Menschen ist die β-Adrenozeptordichte auf B-Zellen höher als auf den T-Zellen. Die βAdrenozeptordichte der Monozyten liegt niedriger als die der B-Zellen und höher als die
der T-Zellen. Innerhalb der T-Zell-Klassen ist die höchste β-Adrenozeptordichte auf
CD8+-T-Zellen. CD4+-Th-Zellen besitzen die geringste Dichte an β2-Rezeptoren
(Khan, 1986). Hierbei korrelieren die intrazellulären cAMP-Spiegel, die durch
Stimulation der β2-Rezeptoren ansteigen, mit der β-Adrenozeptordichte (Aarons, 1980,
Motulsky, 1986, Aarons, 1982). Diese Beobachtung legt den Schluß nahe, dass die
unterschiedliche
Rezeptorendichte
mit
der
Konzentration
an
Adrenalin
und
Noradrenalin in der physiologischen Umgebung der Zellen verknüpft ist. Zu einer
Desensitivierung oder Down-Regulation kommt es in Anwesenheit eines Agonisten, bei
langfristiger Exposition mit einem Antagonisten zu einer Up-Regulation. Es sind vor
allem die T-Zell-haltigen Bereiche der Milz noradrenerg innerviert, im Gegensatz zur
geringen Innervation der B-Zell-haltigen Follikel. Zum anderen gibt es auch Hinweise,
daß die unterschiedlich starke Rezeptor-Expression auch durch die Heterogenität der Tund B-Lymphozyten an sich bestimmt wird. Th-Zellen lassen sich in zwei funktionelle
Untergruppen aufteilen, Th1- und Th2-Zellen. Bei Untersuchungen an murinen Th-ZellKlonen zeigte sich, dass Th1- und Th2-Zellen β-Adrenozeptoren in unterschiedlicher
Zahl exprimieren (Sanders, 1994). Man konnte hochaffine β-Adrenozeptoren nur auf
15
murinen Th1-Zellen, nicht dagegen auf Th2-Zellen nachweisen. Auch nach β2adrenerger Stimulation ließ sich ein intrazellulärer cAMP-Anstieg nur in Th1-Zellen
beobachten, nicht hingegen bei den Th2-Zellen. Diese unterschiedliche Expression der
Rezeptoren und das unterschiedliche Verhalten auf Katecholamin-Exposition steht im
Mittelpunkt dieser Arbeit und wird noch weiter diskutiert werden. Die Rezeptorendichte
ist auch von der Entwicklung und Reifung des Organismus abhängig. Es gibt auch
Hinweise darauf, dass die Rezeptorendichte auf Thymozyten stark vom Reifegrad dieser
Zellen abhängig ist. So ist die Rezeptorenzahl pro Zelle auf reifen (cortison-resistenten)
Thymozyten doppelt so hoch wie auf unreifen (cortison-sensitiven) Zellen. Eine
Stimulation von Lymphozyten durch Antigene oder Mitogene vermag auch die βAdrenozeptordichte zu beeinflussen. So fiel deren Dichte bei Mäuselymphozyten aus
der Milz nach intraperitonealer Stimulation mit Schafserythrozyten. Im Gegensatz dazu
stieg die β-Adrenozeptordichte auf Lymphozyten nach Pikrylchlorid-Exposition an. Es
ließ sich auch zeigen, daß die Veränderung der Rezeptorenzahl auf B-Zellen durch
Alloimmunisierung auch von der Anzahl der Stimulationen abhängt, wohingegen TZellen diesbezüglich nicht beeinflußbar scheinen (Genaro, 1989). Auch die
Rezeptorsensitivität veränderte sich nach Alloimmunisierung, was durch intrazelluläre
cAMP gemessen wurde, und schien mit der Veränderung der Rezeptorenzahl
zu
korrelieren. T-Lymphozyten zeigten nach Stimulation mit Concanavalin A (Con A)
einen Anstieg der β-Adrenozeptordichte. Nach Stimulation der T-Zellen über den TZell-Rezeptor mit Phorbolmyristatsäure (PMA) und einem Calcium-Ionophoren nahm
die β-Adrenozeptordichte ab, was mit einer Abnahme an intrazellulärem cAMP nach βadrenerger Stimulation einher ging. Die Zahl an β-Adrenozeptoren und ihre Sensitivität
scheint also von einer Vielzahl von Faktoren abhängig zu sein, von besonderer
Bedeutung ist sowohl der Transduktionsweg als auch die Häufigkeit der Stimulation.
16
2.3 Einfluß von Katecholaminen auf das Immunsystem
2.3.1 Der Einfluß von Katecholaminen auf einzelne Zelltypen
In vitro Experimente zeigten früh, daß sich die Effekte adrenerger Agonisten auf das
Immunsystem über eine weite Bandbreite erstrecken. Anfänglich teilte man die
adrenergen Wirkungen grob in α-Rezeptor- und β-Rezeptor-vermittelte Wirkungen ein.
β-Rezeptor-Stimulation zeigte eine Hemmung der Aktivität von Immunzellen wie z.B.
der Lymphozyten-Proliferation, der Antikörper-Produktion und der Produktion proinflammatorischer
Faktoren.
Die
Stimulation
von
α-Rezeptoren
zeigte
die
entgegengesetzten Effekte (Hadden, 1970, Melmon, 1974, Bourne, 1974). Studien aus
jüngerer Zeit demonstrieren, daß die Einflüsse der Katecholamine auf die Funktion des
Immunsytems sehr viel komplexer sind als anfänglich angenommen.
2.3.1.1 Der Einfluss von Katecholaminen auf Granulozyten
Frühe Studien mit Neutrophilen zeigten, daß die Wirkung von Katcholaminen und
Substanzen, die den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöhen, in einer Hemmung der
neutrophilen Phagozytose und der Freisetzung lysosomaler Enzyme aus Neutrophilen
besteht (Zurier, 1974). Andere Studien konnten zeigen, daß der mit einer Degranulation
verbundene
respiratory burst
der
Neutrophilen
und
die
Chemotaxis
durch
Katecholamine gehemmt wird. Außerdem wird die Superoxid-Produktion durch
Stimulation von β-Rezeptoren vermindert und begrenzt (Nielson, 1987, Gibson-Berry,
1993, Harvath, 1991). Katecholamine sind in der Lage die Antikörper-vermittelte
Histaminfreisetzung aus zuvor stimulierten Basophilen zu reduzieren. Dieser Effekt war
proportional zu den intrazellulären cAMP-Spiegeln (Lichtenstein, 1968). Neben der
Abschwächung der IgE-vemittelten Histaminfreisetzung aus Basophilen fand man auch
eine Reduktion der Freisetzung von Histamin und der „slow reacting substance of
anaphylaxis“ (SRS-A) aus anderen Zellen wie Mastzellen und Leukozyten des
peripheren Blutes oder aus Zellen der Lunge (Bourne, 1974, Assem, 1969, Ishizaka,
1971). Bei jeder dieser Studien wurde die Freisetzung inflammatorischer Substanzen
durch den cAMP-Spiegel-erhöhende Substanzen (z.B. Katecholamine, Methylxanthine,
Histamin, Prostaglandine, dbcAMP) gehemmt. Bei Untersuchungen mit adrenergen
17
Substanzen ließ sich eine unterschiedliche Potenz hinsichtlich der hemmenden
Eigenschaften aufstellen (Isoproterenol > Adrenalin > Noradrenalin > Phenylephrin),
welche wiederum mit Propranolol antagonisierbar sind (Bourne, 1974). Dies legt den
Schluß nahe, daß es sich bei dieser Hemmung durch adrenerge Substanzen um einen βRezeptor-vermittelten Effekt handelt. Obwohl auf Eosinophilen β2-adrenerge
Rezeptoren nachgewiesen wurden, konnte noch keine Wirkungen auf die Funktion der
Zellen beschrieben werden (Yukawa, 1990).
2.3.1.2 Der Einfluss von Katecholaminen auf Lymphozyten
Studien über die Wirkung von Katecholaminen auf B-Zellen haben eine komplexe
Wirkung auf Proliferation und Differenzierung zeigen können. Die B-ZellProliferation, die mit LPS stimuliert wurde, konnte durch Noradrenalin verstärkt
werden. Dieser Effekt ließ sich mit Propranolol blocken. Wichtig für die Wirkung des
Noradrenalins war der Zeitpunkt der Zugabe zu den Milzzellen und dem Stimulus
LPS. Bei gleichzeitiger Zugabe konnte der proliferationsfördernde Effekt beobachtet
werden, bei einer Zugabe 2 h nach Beginn der Inkubation konnte keine Beeinflussung
der B-Zell-Proliferation beobachtet werden (Koussi, 1988). Im Gegensatz zu den
Katecholaminen hemmten andere, den cAMP-Spiegel erhöhende Substanzen wie
dbcAMP oder Forskolin die LPS-induzierte Proliferation. Die Wirkung der
Katecholamine hing neben dem Zeitpunkt der Zugabe zu den inkubierten B-Zellen
außerdem von dem Mitogen ab, mit dem die B-Zellen stimuliert wurden. Bei
Stimulation mit einem Membranbestandteil aus Klebsiella pneumoniae steigerte
Noradrenalin die Proliferation, bei Stimulation mit Anti-IgM-Antikörpern hemmten
Katecholamine die Proliferation (Li, 1990). Da Anti-IgM-Antikörper die B-Zellen
über einen anderen intrazellulären Mechanismus aktivieren als LPS, nimmt man an,
daß der Effekt von Katecholaminen auf die Zellen von der Art der intrazellulären
Signaltransduktion abhängt, der nach der Stimulation aktiviert ist und von erhöhtem
cAMP
unterschiedlich
beeinflußt
wird.
Auf
unterschiedliche
Signaltransduktionsmechanismen weisen auch Untersuchungen von B-Zellen nach
Interaktion mit Th-Zellen hin. So wurden geringere Mengen an cAMP in AntiImmunglobulin stimulierten Zellen benötigt um die B-Zell-Aktivierung zu hemmen
als nach Stimulation mit Th-Zellen. (Kawakami, 1993).
18
Die T-Zell-Proliferation wird durch β-Adrenozeptor-Stimulation und auch von anderen
Substanzen, die den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöhen, gehemmt (Hadden, 1970,
Kammer, 1988, Bartik, 1993, Carlson, 1989). Isoproterenol und Prostaglandin E2
(PGE2) hemmten die Anti-CD3-induzierte Proliferation von T-Zellen (Bartik, 1993).
Isoproterenol reduzierte die IL-2-Produktion wenig, hingegen sehr viel stärker die
Proliferation, so daß man vermuten kann, daß auch andere Cytokine in ihrer Produktion
beeinflußt werden. Zwischen den intrazellulären cAMP-Spiegeln und dem Ausmaß der
Proliferationshemmung bestand eine signifikante Korrelation; bemerkenswerter Weise
führten aber äquimolare cAMP-Konzentrationen, die durch Isoproterenol oder PGE2
hervorgerufen waren, nicht zu einer gleichstarken Hemmung der Proliferation, so dass
vermutet werden muss, dassneben der cAMP-Konzentration auch sonstige intrazelluläre
Transduktionsmechanismen auf diesen Effekt einen Einfluss ausüben.
2.3.1.3 Der Einfluss von Katecholaminen auf Natürliche Killerzellen (NKZellen) und cytotoxische T-Zellen (cT-Zellen)
Hemmende Einflüsse von Katecholaminen auf die lytische Aktivität von NK-Zellen
und cT-Zellen sind von einigen Autoren beschrieben (Katz, 1982). Adrenalin führte
konzentrationsabhängig zu einer Hemmung bzw. einer Steigerung der lytischen
Aktivität (Hellstrand, 1985). Eine Hemmung der lytischen Aktivität konnte auch bei
zytotoxischen T-Zellen beobachtet werden (Strom, 1973, Takayama, 1988).
2.3.1.4 Der Einfluss von Katecholaminen auf Monozyten/Makrophagen
Die Zugabe von Katecholaminen zu Monozyten aus dem peripheren Blut und auch der
Monozyten-Zellinie THP-1 führte nach Stimulation durch LPS zu einer verringerten
Freisetzung des Tumor-Nekrose-Faktor β (TNF-β). In Abhängigkeit vom Zeitpunkt
der Katecholaminzugabe konnte jedoch auch eine erhöhte TNF-β-Freisetzung
beobachtet werden (Severn, 1992). Versuche über die Wirkung von Noradrenalin und
dem α2-Agonisten UK-14304 auf Makrophagen, die mit LPS stimuliert wurden,
zeigten eine verstärkte Freisetzung von TNF-β, wohingegen die Zugabe von
Isoproteronol eine Reduktion der TNF-Freisetzung bewirkte (Spengler, 1994).
19
Katecholamine verminderten die Fähigkeit von Makrophagen, Tumorzellen oder mit
dem Herpes simplex -Virus infizierte Zellen zu lysieren (Koff, 1985).
2.3.2 In vivo Studien über Interaktionen zwischen Katecholaminen und
Immunsystem
Um die komplexen Effekte adrenerger Substanzen auf das Immunsystem zu erfassen, ist
es unerläßlich, in vivo Versuche durchzuführen. Mit verschiedenen Ansätzen wurde
versucht, die Wirkung des sympathischen Nervensystems auf das Immunsytem in vivo
zu untersuchen.
2.3.2.1 Sympathische Denervation
Ein Ansatz besteht darin, die sympathische Innervation lymphoider Organe entweder
chemisch oder chirurgisch zu unterbinden und anschließend verschiedenste Funktionen
des Immunsystems in vivo und in vitro zu untersuchen, um mögliche Veränderungen
aufzuspüren.
So fand man bei chemisch sympathektomierten Tieren eine Veränderung der Zellvermittelten und der Antikörper-vermittelten Immunantwort. Die Antikörper-Antwort
auf T-Zell-abhängige Antigene war bei erwachsenen Nagern vermindert, die vor der
Antigen-Exposition
chemisch
sympathektomiert.
Eine
gesteigerte
Antikörper-
Produktion fand sich hingegen bei Tieren, die neonatal sympathektomiert wurden und
bei erwachsenen Tieren, denen die splenischen Nerven chirurgisch durchtrennt wurden.
In anderen Versuchen konnte gezeigt werden, daß die Sympathektomie an erwachsenen
Tieren auf die Antikörper-Antwort auf ein T-Zell-unabhängiges Antigen steigernd
wirkt, während bei Verwendung T-Zell-abhängiger Antigene kein Effekt der
Sympatektomie beobachtet werden konnte. Auch das Alter der Versuchstiere
hinsichtlich der Auswirkung der Sympathektomie scheint von Bedeutung zu sein. So
lassen sich bei jungen Ratten im Gegensatz zu alten nur geringe Steigerungen der
Antikörper-Produktion beobachten, die bei alten Ratten jedoch deutlich gesteigert ist.
Bei Mäusen konnte nach Sympathektomie eine Steigerung der KLH-induzierten IL-2und IL-4-Produktion gefunden werden. Diese Steigerung der Cytokin-Produktion ging
bei C57BL/6 Mäusen, einem Mäusestamm bei der die Th1-Antwort vorherrscht, mit
einer gleichzeitigen Steigerung der Antikörper-Produktion einher. Bei BALB/c Mäusen,
20
einem Mäusestamm bei dem die Th2-Antwort vorherrscht, konnte dies nicht beobachtet
werden. Dies legt den Schluß nahe, daß die Antikörper-Produktion nach einer
Sympathektomie nicht generell verstärkt wird, sondern daß die Dominanz von Th1oder Th2-Zellen von großer Bedeutung für die Auswirkung einer Symphatektomie sind.
Die in vitro Generierung von zytotoxischen T-Lymphozyten durch das die DTHReaktion auslösende Agens war nach Sympathektomie weniger stark zu beobachten
(Lorton, 1990, Ackerman, 1991, Madden, 1994).
2.3.2.2 Infusion von Katecholaminen
Ein anderer experimenteller Ansatz zur Untersuchung von Zusammenhängen zwischen
autonomem Nervensystem und Immunsystem in vivo besteht darin, Katecholamine zu
infundieren und deren Auswirkung auf Immunsystemfunktionen zu messen. Bei
Mäusen zeigte sich, daß sich IgM und IgG bildende Plaques in der Milz nach
Katecholamin-Gabe und Antigen-Gabe rund einen Tag früher bildeten im Vergleich zur
Kontrollgruppe, die keinen Katecholaminen ausgesetzt war (Depelchin, 1981)
In anderen Versuchen wurden Ratten pellets implantiert, die kontinuierlich
Katecholamine abgaben und 20 h nach Implantation einen 10fach erhöhten
Katecholaminspiegel bewirkten. Lymphozyten wurden zu diesem Zeitpunkt entnommen
und hinsichtlich ihrer Stimulierbarkeit durch ConA untersucht. Nur Lymphozyten, die
Noradrenalin ausgesetzt waren, nicht jedoch Adrenalin, zeigten eine um 50%
verminderte Proliferation nach ConA-Stimulation in vitro. Bemerkenswerter Weise ließ
sich der hemmende Effekt durch Zugabe von Propranolol nicht aufheben, sondern
verstärken. In Gegenwart von Phentolamin ließ sich die verminderte Proliferation
jedoch wieder aufheben, was einen α-Rezeptor-vermittelten Effekt annehmen läßt
(Felsner, 1992).
Durch Katecholamine lassen sich auch die Zellverteilung von Zellen des Immunsystems
beeinflussen. So vermochte eine Adrenalin-Injektion beim Menschen eine anhaltende
Erhöhung von Lymphozyten und Monozyten im peripheren Blut zu verursachen. Die
Proliferation der Lymphozyten nach Stimulation mit T-Zell-Mitogenen war vermindert,
gleichzeitig war auch die Zahl der CD4-positiven T-Helferzellen im peripheren Blut
vermindert bei gleichzeitiger Erhöhung an NK-Zellen. Wie Versuche bei Nagetieren
vermuten lassen, scheint die Mobilisation der PBMC nach Katecholaminapplikation
nicht durch einen erhöhten Blutfluss in lymphatischen Organen begründet zu sein,
21
sondern wahrscheinlich durch einen direkten Effekt auf die Immunzellen (Ernström,
1973).
2.3.3 Katecholaminwirkung bei Autoimmunerkrankungen
Der Einfluss von Katecholaminen auf Krankheiten wird besonders deutlich im Rahmen
von Autoimmunerkrankungen. In zahlreichen Experimenten mit Tieren, die an einer
Autoimmunerkrankung litten, konnte die Rolle des sympathischen Nervensystems als
ein wichtiger Regulator bezüglich der Erkrankung erkannt werden. So zeigte sich die
Verstärkung
bestimmter
Autoimmunerkrankungen
nach
Sympathektomie
in
Tierexperimenten. In einem Versuch wurde in Ratten eine experimentelle allergische
Enzephalitis (EAE) ausgelöst. Nach chemischer Sympathektomie beschleunigte sich der
Krankheitsverlauf und man fand mehr Entzündungszeichen im Gehirn. Durch Gabe des
β-Agonisten Isoproterenol ließ sich der Verlauf der EAE stark abschwächen.
Bei einem Versuch mit einer experimentell erzeugten Arthritis wurde eine lokale
sympathische Denervation regionalen Lymphgewebes durchgeführt. Auch bei diesem
Versuch führte die sympathische Denervation zu einem schwereren Verlauf der
Krankheit, die sich früher manifestierte und mit deutlicheren Befunden wie z.B.
Knochenerosionen einherging.
Bei Mäusen mit einem systemischen Lupus erythematodes (SLE) konnte man
beobachten, daß mit dem Auftreten der ersten Krankheitssymptome die noradrenerge
Innervation lymphatischer Organe stark zurückging. Zusammenfassend scheint das
sympathische
Nervensystem
auf
bestimmte
Autoimmunerkrankungen
einen
hemmenden Einfluß auszuüben, wobei dieser Effekt sicher noch näher untersucht
werden muß, um differenziertere Wirkungen nicht zu übersehen.
Bei Patienten mit einer Autoimmunkrankheit wie Morbus Crohn, Rheumatoider
Arthritis, systemischen Lupus erythematodes (SLE) konnte eine erniedrigte Dichte an
β2-Rezeptoren auf PBMC nachgewiesen werden (Baerwald, 1992a, 1992b; Krause,
1992)
2.4 Kommunikation des Immunsystems mit dem ZNS
Neben der Wirkung des ZNS auf das Immunsystem besitzt das Immunsystem
seinerseits auch Einflüsse auf das Nervensystem. So weiß man, daß IL-6 durch seine
22
Wirkung auf Zentren im Hypothalamus die Thermoregulation des Körpers beeinflussen
und Fieber hervorrufen kann. Aber auch auf das sympathische Nervensytem, das ein
Bindeglied zwischen ZNS und Immunsystem darstellt, konnten Einflüsse beobachtet
werden.
So fand man veränderte Noradrenalin- und Dopaminspiegel in der Milz nach
Provokation einer Immunantwort (Fuchs, 1988)
Nach intravenöser IL-1-Injektion bei Ratten beobachtete man eine verminderte
Impulsrate sympathischer Nerven, die Nebenniere und Milz innervieren (Besedovsky,
1983).
Die Wirkung des Immunsystems auf das sympathische Nervensystem scheint über zwei
Wege zu erfolgen. Zum einen werden Zentren im ZNS insbesondere, der
Hypothalamus, direkt beeinflußt, aus denen sympathische Efferenzen hervorgehen. So
konnte man nach Antigen-Exposition und auch nach peripherer Gabe von IL-1 eine
veränderte Impulsrate in Bereichen des Hypothalamus insbesondere auch in CRFenthaltenden Neuronen messen. Zum anderen können Immunzellen auf lokaler Ebene
durch Interaktion mit Nervenfasern oder ganglionären Zellkörpern das sympathische
Nervensystem modulieren. Ergebnisse verschiedener Gruppen zeigen, daß z.B.
bestimmte Cytokine von Monozyten sympathische Nervenzellen in vitro beeinflussen
können (Soliven, 1992).
23
3. Fragestellung der Arbeit
Zwischen dem sympathischen Nervensystem und dem Immunsystem bestehen
komplexe Interaktionen. Außerdem gibt es Hinweise auf das Vorliegen einer
unterschiedlichen β2-Rezeptorendichte auf Th1- und Th2-Zellen. Vor diesem
Hintergrund beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit dem Einfluß von
Katecholaminen auf die Immunantwort der Th1-/Th2-Zellen.
Hierbei werden insbesondere die Cytokine IL-6, IL-4 und IFN-γ als Produkte der ThZellen gemessen, nachdem mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) mit
Tetanus-Toxoid, PHA, Anti-CD3-Antikörpern und IL-2 stimuliert wurden. Außerdem
wird die β2-Rezeptorendichte auf den PBMC gemessen, um einen eventuellen Einfluß
von Katecholaminen auf die Cytokin-Produktion mit der Rezeptorendichte untersuchen
zu können. Durch Zugabe von α- oder β-Rezeptor-Antagonisten soll erkannt werden,
über welchen Adrenozeptor-Typ die Katecholaminwirkung erfolgt.
Folgende Fragen sollen beantwortet werden:
•
Gibt es eine Beeinflussung der Cytokin-Produktion durch Katecholamine?
•
Besteht ein Unterschied der Beeinflussung der Cytokinproduktion zwischen den
Cytokinen, die von Th1-Zellen gebildet werden und denen, die von Th2-Zellen
gebildet werden?
•
Besteht eine Korrelation zwischen der Stärke des Katecholamin-Einflusses und der
β2-Rezeptorendichte?
•
Lassen sich die Katecholamineinflüsse durch α- oder β-Rezeptor-Antagonisten
beeinflussen und erhält man somit einen Hinweis auf den Transduktionsweg der
Katecholamine?
24
4. Material und Methoden
4.1 Übersicht
1.
Blutgewinnung
2.
Isolierung der PBMC mittels Isopaque-Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation
3.
Durchführung des Radiorezeptorassays (RRA) mit radioaktiv markiertem βAntagonisten
4.
Überführung der Zellen in Kultur
5.
Abnahme von Kulturüberständen zu den Zeitpunkten 12, 24, 48 und 72h
6.
Messung der Cytokine IL-6, IFN-γ, und IL-4 in den Kulturüberständen mittels
ELISA
4.2 Blutgewinnung
Für die Versuche werden humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
verwendet. Die Blutbank der Philipps-Universität Marburg stellte buffy-coats zur
Verfügung. Als buffy-coat bezeichnet man den Überstand, der nach der Zentrifugation
bei der Herstellung von Erythrozyten-Konzentraten entsteht und aus Erythrozyten,
Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten besteht. Pro Blutspender fallen ca. 50 ml
buffy-coat an, der in sterile Plastikbeutel gefüllt und am gleichen Tag weiterverarbeitet
wird. Aus den buffy-coats werden im weiteren Verlauf die PBMC isoliert.
4.3 Arbeitsmaterial und Chemikalien
• Anti-human CD3-Antikörper / CBL 150, Cymbus Biotechnology LTD, Hants, UK
• Ascorbinsäure L(+) (M:176,13) /Art. 127, Merck
• Aqua ad iniectabilia / B.Braun Melsungen AG (0986)
• Begasungsbrutschrank / Heraeus, B5060-CO2
• Docitonâ (Propanololhydrochlorid, 1 mg/ml Ampullen) / Rhein-Pharma, Plankstedt,
Germany
• Digital-pH-Meter / Nr.640, Knick
25
• Epinephrinhydrochlorid (Suprareninâ-Ampullen, 1,2 mg/ml, Hoechst AG ,
Frankfurt am Main)
• Falcon-Röhrchen / (PPN-KO-50 ml), Greiner-Labortechnik, Art. 227261
• FCS fetal calf serum (Seromed Biochrom KG, Berlin)
• Ficoll Separating Solution (isotone, density 1,077) / Biochrom KG Seromedâ
(L6115), Berlin, Germany
• Gewebekulturplatten, 24-well / Falcon
• Hanks´ Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium, Magnesium, ohne Phenolrot /
Biochrom KG Seromedâ (L2043), Berlin, Germany
• HCl 1mol/l (1 N) /Merck (9057)
• Hepespuffer 35 g% (N-2 Hydroxyethylpiperazin-N-2-Ethensulfonsäure) / Carl Roth
GmbH (Art. 9105)
• Heraeus Sepatech Varifuge 3,2 RS / Heraeus Holding GmbH
• Human-Interferon-γ-Immunoassay-Kit/
Cytoscreen
KHC
4022,
Biosource
Cytoscreen
KHC
0042,
Biosource
Cytoscreen
KHC
0062,
Biosource
International
• Human Interleukin-2 Recombinant / 202-IL-010, R&D
• Human-Interleukin-4-Immunoassay-Kit/
International
• Human-Interleukin-6-Immunoassay-Kit/
International
• [125-I]-(-)Iodocyanopindolol (2200 Ci/mmol) / DuPont, NEN®, NEX-189, Boston,
MA, USA
• L-Glutamin (200 mM) / Biochrom KG, K 0282
• Membranvakuumpumpe ME4/3,7 / Vacuubrand GmbH
• Mouse Monoclonal Antibody To Human CD3 / CBL 150, Cymbus Biotechnology
Ltd.
• Multi-Crystal Gamma-Counter / LB2103, Fa. Berthold, Wildbad, Germany
• Norepinephrin /Arteronol®-Ampullen, Hoechst AG, Frankfurt am Main
• Penicillin-/Streptomycin-Solution (10000 IE/ml Pen./10000 IE/ml Strept.) / Gibco,
043-05140 H
• Phentolamin / Regitin®, Ciba-Geigy
• PHA-P / Phythämagglutinin P, Sigma Chemicals, L9132
• RMPI 1640 ohne L-Glutamin / Gibco, 041-01870 H
26
• Saugpipette/ Pipettboy plus, Tecnomara
• Tetanus-Toxoid/ 3000 Lf/ml, 13,2g Protein/ml, Behring-Institut, Marburg, Germany
• Trypan-Blue-Stain / Gibco, 043-05250 H
• Urapidil / Ebrantil®, Byk Gulden, Konstanz, Germany
• Whatman Filter FG/B / Whatman Inc., Clifton NY, USA
außerdem Pipettenspitzen, sterile Pipetten, Röhrchen, Reaktionsgefäße: Fa Eppendorf,
Hamburg
4.4 PBMC-Isolierung mit Hilfe der Isopaque-FicollDichtegradientenzentrifugation
Alle folgenden Arbeitsschritte mit Ausnahme des RRA und des ELISA werden unter
dem Flow durchgeführt, um das Risiko einer Kontamination der Zellkulturen gering zu
halten.
Die PBMC werden aus den buffy coats mit Hilfe der von Böyum beschriebenen
Methode der Isopaque-Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert (Böyum, 1968).
Im Gegensatz zur Plasmagel- oder Dextran-Sedimentation soll diese Methode eine
größere Ausbeute und eine bessere Reinheit der PBMC ermöglichen (Ford, 1978).
Zunächst wird der buffy coat mit gleichem Volumenanteil mit HBSS verdünnt, da
hierdurch eine größere Zellausbeute erreicht wird. Dann werden in 50 ml-FalconRöhrchen über 20 ml Ficoll-Separating-Solution je 25 ml der verdünnten buffy-coatLösung geschichtet, ohne daß es zu einer Vermischung kommt. Die Ficoll-SeparatingSolution besteht aus Sodiummetriozat (Isopaque) und dem hochpolymeren Zucker
Ficoll, der die Erythrozyten und Granulozyten aggregieren läßt. Die Dichte der
Trennlösung von 1,077 g/ml liegt höher als die Dichte der PBMC (1,052-1,077 g/ml),
aber niedriger als die Dichte von Granulozyten und Erythrozyten. Daher kommt es nach
einer Zentrifugation bei 2200 U/Min (1050 g) für 20 min zur Ausbildung einer
typischen Schichtung: Oben ist eine Schicht aus Plasma, Thrombozyten und Detritus,
darunter bildet sich eine schmale Schicht aus Lymphozyten und Monozyten aus, die
sich auf einer Schicht Ficoll-Separating-Solution befindet.
Zuunterst ist die Schicht aus aggregierten Granulozyten und Erythrozyten. Die schmale
Schicht aus Lymphozyten und Monozyten wird vorsichtig mit einer sterilen 10ml
27
Pipette entnommen und in ein 50ml Falcon-Röhrchen gegeben, das mit HBSS aufgefüllt
wird. Die Zellsuspension wird bei 1800 U/min (703g) für 10 min zentrifugiert, der
Überstand dekantiert und das Pellet in 50ml HBSS resuspendiert. Dieser Vorgang wird
noch zwei weitere Male wiederholt bei 1500 U/min (488g ) und soll Thrombozyten,
Detritus und Ficoll-Separating-Solution, die zytotoxisch wirken kann, von den PBMC
trennen.
4.5 Lymphozytenkultur
Wegen der begrenzten Haltbarkeit einiger Substanzen in Verbindung mit dem
Nährmedium werden diese erst vor dem Anlegen der Zellkultur zu dem Nährmedium
RMPI 1640 hinzugegeben und ansonsten bei -20°C gelagert. Zu 500 ml RMPI 1640
werden hinzugefügt:
• L-Glutamin, 200 mM, 10 ml
• Hepeslösung, 1,1 M, 5 ml (Endkonzentration 11 mM )
• Penicillin-/Streptomycin-Lösung 5 ml (Endkonzentration 100 IE/ml Penicillin, 100
IE/ml Streptomycin)
• FCS (Fetal Calf Serum) 50 ml
Zur Komplementinaktivierung wird das FCS für 60 min auf 56°C erwärmt, um einer
Ergebnisverfälschung vorzubeugen. Durch die Hepeslösung erhält man eine
ausreichende Pufferung im Bereich zwischen pH 7,0 und pH 8,0.
Die Lymphozyten werden für die Kulturen im Nährmedium auf eine Konzentration von
1*106 Zellen/ml verdünnt. Hierzu wird ein kleiner Teil der Zellsuspension mit TrypanBlue-Stain vermischt und die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Durch
entsprechende Verdünnung der Zellsuspension und erneute Auszählung erhält man die
gewünschte Zellkonzentration. In einer 24-well-Platte werden in 14 wells jeweils 2ml
Zellsuspension gegeben. Hinzu kommen je nach Ansatz der Stimulus, Adrenalin bzw.
Noradrenalin in zwei verschiedenen Konzentationen und außerdem der β-Blocker
Propanolol oder der α-Blocker Urapidil, so daß sich folgende Anordnung ergibt:
28
1.
Zellsuspension (Leerwert)
2.
Zellsuspension + Stimulus
3.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-5M
4.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-5M + Urapidil
5.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-5M + Propranolol
6.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-9M
7.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-9M + Urapidil
8.
Zellsuspension + Stimulus + Adrenalin 10-9M + Propranolol
9.
Zellsuspension + Stimulus + Noradrenalin 10-5M
10. Zellsuspension
+ Stimulus + Noradrenalin 10-5M + Urapidil
11. Zellsuspension
+ Stimulus + Noradrenalin 10-5M + Propranolol
12. Zellsuspension
+ Stimulus + Noradrenalin 10-9M
13. Zellsuspension
+ Stimulus + Noradrenalin 10-9M + Urapidil
14. Zellsuspension
+ Stimulus + Noradrenalin 10-9M + Propranolol
Als Stimulantien dienen folgende vier Substanzen:
PHA-P:
100 µg/ml
Tetanus-Toxoid:
10 µg/ml
IL-2:
50 U/ml
Anti-CD3-Antikörper:
1 µg/ml
Für Findung geeigneter Konzentrationen der Stimulantien dienten eigene dose responseVersuche mit 3H-Thymidin-Einbau sowie Vergleich mit der Literatur (McHugh, 1996
Kasahara, 1983, Bodnar, 1997, El Ghazali, 1993 Looney, 1994, Kurtzhals, 1992 Pisa,
1992).
Die
Rezeptor-blockierenden
Pharmaka
haben
in
den
Ansätzen
folgende
Konzentrationen:
Propanolol:
100 ng/ml
Urapidil:
1*10-7 M
Die Zellkulturen werden in einem Zellkulturschrank bei 37°C und 5% CO2 aufbewahrt.
29
Zu den Zeitpunkten 12, 24, 48 und 72 h werden jeweils 300 µl Kulturüberstand
abgenommen und bei –20°C tiefgefroren.
4.6 Der Radiorezeptorassay
4.6.1 Theoretischer Hintergrund des Radiorezeptorassays:
Bei einem Radiorezeptorassay (RRA) macht man sich die Tatsache zunutze, über
radioaktiv markierte Liganden zu verfügen. Diese können an spezifische Rezeptoren
binden und über die gemessene Radioaktivität ist es möglich, Rückschlüsse auf die
Anzahl der Rezeptoren zu ziehen. Voraussetzung für die Radioliganden ist, daß durch
die Kopplung mit dem Radionuklid die Konformität nicht dermaßen verändert ist, daß
ihre Spezifität und biologische Aktivität stark abnimmt. Nachdem zunächst versucht
wurde, in RRA adrenerge Rezeptoren mit radioaktiv markierten Katecholaminen zu
messen, waren die Ergebnisse wegen der unspezifischen Bindung an andere
Membranstrukturen nicht verwertbar. Mittels radioaktiv markierter β-Antagonisten
gelang es jedoch, Aussagen über Dichte und Anzahl von β-Rezeptoren auf
verschiedensten Strukturen zu treffen. Bei der Ligand-Rezeptor-Bindung bestehen
bestimmte Interaktionen, die sich wie folgt beschreiben lassen: Ein Ligand kann nicht
nur an einen Rezeptor binden, sondern auch von diesem dissoziieren. Aufgrund der
Reversibilität der Bindung stellt sich nach einer bestimmten Zeit ein Gleichgewicht ein.
Zu Beginn einer Reaktion binden jedoch erstmal mehr Liganden an die Rezeptoren als
von ihnen dissoziieren, was man folgendermassen veranschaulichen kann
(1)
[L] + [R]
[LR]
[L] bedeutet Ligand, [R] bedeutet unbesetzter Rezeptor und [LR] steht für den LigandRezeptor-Komplex.
Zu einem bestimmten Zeitpunkt ist ein Gleichgewichtszustand erreicht, an dem die Zahl
der Liganden, die vom Rezeptor dissoziieren, und die, die an den Rezeptor binden,
aneinander angeglichen sind.
30
(2)
[L] + [R]
[LR]
Sobald dieser Gleichgewichtszustand erreicht ist, ist das Verhältnis aus dem Produkt
aus
Liganden-
und
Rezeptorkonzentrationen
und
den
entstanden
Komplexkonzentrationen gemäß dem Massenwirkungsgesetz konstant. Es läßt sich die
sogenannte Dissoziationskonstante (KD) berechnen:
(3)
KD =
[ L] * [ R ]
[ LR ]
Je größer die Dissoziationskonstante, desto kleiner ist die Affinität des Liganden zum
Rezeptor und umgekehrt, was sich aus Gleichung (3) ableiten läßt. Da die Gesamtzahl
der Rezeptoren bei den Messungen begrenzt ist, gilt für die maximale Konzentration an
spezifischen Rezeptoren (Bmax):
(4)
Bmax = [LR] +[R]
Nach Umformung von (4) in
(5)
[R] = Bmax – [LR]
Und Einsetzen in (3) erhält man
(6)
KD =
[ L] * (Bmax - [LR])
[ LR ]
31
Nach Multiplikation mit [LR] und Division mit KD und [L] ergibt sich:
(7)
[ LR]
L
=
Bmax - [LR]
KD
Durch Ersetzen von [LR] durch [B] als gebundenen Liganden und [L] durch [F] als
freien Liganden erhält man die Scatchard-Gleichung [Scatchard, 1949]:
(8)
B
F
=
Bmax - B
KD
Mithilfe dieser Gleichung lassen sich die maximale Rezeptorenzahl (Bmax) und die
Dissoziationskonstante (KD) berechnen. Voraussetzung dafür ist die Kenntnis der
Konzentration von gebundenem und ungebundenem Liganden. Über die Messung der
Radioaktivität im γ-Counter läßt sich die Zahl der gebundenen Liganden errechnen. Da
in den Versuchen weit mehr als 90% der Liganden in ungebundener Form vorliegen,
also ein sogenanntes Zone-A-Verhalten vorliegt, kann die Konzentration der
ungebundenen Liganden näherungsweise der Gesamtkonzentration gleichgesetzt
werden.
4.6.2 Der Radioligand
Die Voraussetzungen, die an den Radioliganden gestellt werden, sind vielfältig, um den
RRA aussagekräftig durchzuführen. So muß eine hohe Spezifität für den Rezeptor
vorliegen und die unspezifische Bindung an Nicht-Membranstrukturen gering sein. Für
den Rezeptor muß eine hohe Affinität bestehen, um sowohl den Zelleinsatz als auch die
Menge des Radioliganden gering halten zu können. Der Ligand soll stabil sein, eine
reversible Bindung mit dem Rezeptor eingehen und von der Zelle weder internalisiert
noch metabolisiert werden. Um die Dichte von β-Rezeptoren zu messen, hat sich nach
früheren Versuchen mit ³H-markierten β-Agonisten und
32
125
Iodohydroxybenzylpindolol
vor allem
125
Iodocyanopindolol (ICYP) als geeignet dargestellt. Es entspricht
weitgehend oben genannten Anforderungen und besitzt ähnliche biologische
Eigenschaften wie der unkonjugierte β-Blocker. Das ICYP besitzt eine hohe spezifische
Aktivität von 2200 Ci/mmol (81 TBq/mmol), aber mit einer Halbwertszeit von 60
Tagen steht sie nur zeitlich begrenzt zur Verfügung. Die Dissoziationskonstante liegt im
Bereich zwischen 10 und 100 pM, so daß die Affinität sehr hoch ist.
Das ICYP wird in einer Lösung von 1 ml aus Propanol, H2O und Phenol (50:50:1,2) auf
Trockeneis
gekühlt
geliefert.
Die
radiochemische
Reinheit
beträgt
nach
Herstellerangaben mehr als 99%, die Konzentration liegt von Charge zu Charge
unterschiedlich zwischen 160 bis 180 µCi/ml (6000-6500 KBq/ml). Um das ICYP für
die Bindungsstudie aufzubereiten, wird zunächst die Flüssigkeit unter leichter
Stickstoffgasströmung verdampft; daraufhin wird das ICYP in 1 ml Inkubationspuffer*
aufgelöst, aliquotiert und bis zum weiteren Gebrauch bei -18°C eingefroren.
4.6.3 Graphik des ICYP (125Iodohydroxybenzylpindolol)-Moleküls
CH3
O
OH
HN
CH3
NH
CH3
125
I
CN
4.6.4 Durchführung des Radiorezeptorassays
Zur Durchführung der Bindungsstudie werden Verdünnungsreihen erstellt, in denen das
ICYP in verschiedenen Konzentrationen vorliegt. Über das Verhältnis von gebundenen
Liganden zu freien Liganden können später die Rezeptorendichte und die
Dissoziationskonstante errechnet werden. Da das ICYP auch unspezifische Bindungen
eingeht, muß diese im RRA ermittelt werden, um nur die spezifische Bindung in die
33
spätere Berechnung einfließen zu lassen. Hierfür wird ein nicht-radioaktiv markierter βAntagonist mit einer hohen Affinität im Überschuß (100-1000*KD der Substanz) hinzu
gegeben, um so den Radioliganden kompetitiv von den β-Rezeptoren, aber nicht aus
den unspezifischen Bindungen zu verdrängen. Durch Differenz der unspezifischen
Bindung von der Gesamtbindung erhält man die spezifische Bindung. Als β-Antagonist
wird Propanolol verwendet. Für die ICYP-Verdünnungsreihe werden 15 µl des
aliquotierten ICYP mit Inkubationspuffer so verdünnt, daß man eine 500 pM Lösung
erhält. Die Menge des hinzugegebenen Inkubationspuffers liegt bei ca. 2150 µl, muß
aber von Charge zu Charge neu berechnet werden, da sich die Konzentration von
Charge zu Charge wie oben beschrieben leicht unterscheidet. Von der 500 pM Lösung
werden fünf weitere Verdünnungen durchgeführt, so daß man 6 verschiedene
Konzentrationen erhält. Neben der 500 pM Lösung erhält man Konzentrationen von 375
pM, 250 pM, 125 pM, 62,5 pM und 31,25 pM. Zunächst gibt man 1000 µl der 500 pM
Lösung zu 1000 µl Inkubationspuffer und erhält so die 250 pM Lösung. Durch Mischen
von 500 µl der 500 pM und 500 µl der 250 pM Lösung erhält man die 375 pM Lösung.
500 µl der 250 pM Lösung und 500 µl Inkubationspuffer ergeben die 125 pM Lösung.
500 µl der 125 pM Lösung und wiederum 500 µl Inkubationspuffer ergeben die 62,5
pM Lösung. 500 µl der 62,5 pM Lösung und 500 µl Inkubationspuffer ergeben
letztendlich die 31,25 pM Lösung. Die PBMC werden in Inkubationspuffer auf eine
Konzentration von 6*106 Zellen/ml eingestellt. Daraufhin gibt man in 6 Röhrchen je 50
µl Inkubationspuffer und in weitere 6 je 50 µl 50 µM Propanolol-Lösung. Die Röhrchen
werden beschriftet. In die Reihe mit vorgelegter Propanolol-Lösung und in die mit
vorgelegtem Inkubationspuffer kommen je 100 µl ICYP-Lösung in absteigender
Konzentration, obiger Verdünnungsanleitung folgend. Außerdem werden in jedes der
insgesamt 12 Röhrchen je 100 µl Zellsuspension pipettiert. Durch die Verdünnung der
ICYP-Lösung um den Faktor 2,5 erhält man Lösungen, in denen mit Zellsuspension und
Propanolol-Lösung bzw. Inkubationspuffer ICYP-Endkonzentrationen von 200 pM, 150
pM, 100 pM, 50 pM und 25 pM vorhanden sind. Die zwölf Röhrchen werden in einem
37°C warmen Wasserbad bei leichter Bewegung für 60 min inkubiert. Nach 60 min
werden die Röhrchen aus dem Wasserbad entnommen und die Inkubation mit 4 ml
37°C
warmen
Stoppuffers
(*)
unterbrochen.
Die
Zellsuspensionen
werden
vakuumfiltriert, die Zellen werden auf Glasfaserfiltern gesammelt und es wird noch
einmal mit je 4 ml Stoppuffer gespült, um nicht gebundene Radioliganden abzuspülen.
34
Die Glasfaserfilter werden in γ-Counter-Röhrchen gegeben und anschließend im γCounter gemessen.
(*) Inkubationspuffer:
• 154 mM
NaCL
• 12 mM
Tris-Aminomethan
• 30 µg
Phentolamin (Regitin®)
• 0,55 mM
Ascorbinsäure
• Aqua ad iniectabilia ad 1000 ml
• Titration bei 22°C mit 1 M HCl auf pH 7,2
(*) Stoppuffer:
• 154 mM
NaCl
• 10 mM
Tris-Aminomethan
• Aqua ad iniectabilia ad 1000 ml
• Titration bei 37°C mit 1 M HCl auf pH 7,4
4.6.5 Berechnung der β -Rezeptorenzahl und der Dissoziationskonstante
Die im γ-Counter gemessene Aktivität wird in Zerfällen pro Minute (cpm) angegeben.
Da die Effektivität des γ-Counters 75% beträgt, werden die gemessenen Werte
rechnerisch korrigiert. Die korrigierten Werte werden als „desintegrations per minute“
bezeichnet und dienen als Grundlage weiterer Berechnungen. Da die Menge der Zerfälle
pro Minute einer bestimmten Menge ICYP entspricht, kann man, da die Aktivität des
ICYP mit 2200 Ci/mmol bekannt ist, die Menge an spezifischen Ligand-RezeptorBindungen errechnen. Hierzu müssen zunächst die Meßwerte aus der Reihe der
unspezifischen Bindung von den Meßwerten aus der Reihe der Gesamtbindung
substrahiert werden. Da ein Curie 3,7*1010 Zerfällen pro Sekunde entsprechen, ergeben
sich bei der Aktivität des ICYP von 2200 Ci/mmol also 8140*1010 Zerfälle pro Sekunde
und 4884*1012 Zerfällen pro Minute.
So lassen sich die Mengen in den Ansätzen (M1-M6) an spezifisch gebundenem ICYP
ableiten.
35
Da pro Ansatz 100 µl der Zellsuspension der Konzentration 6*106 Zellen gegeben
wurde, befinden sich also im kompletten Ansatz in 250 µl (also inklusive ICYP-Lösung
und Inkubationspuffer bzw. Propanolol-Lösung) 6*105 Zellen. Die Radioaktivität
beträgt nur am ersten Tag 2200 Ci/mmol und nimmt dann stetig ab. So muß die aktuelle
Aktivität
berechnet
werden,
indem
man
die
Ausgangsaktivität
mit
einem
entsprechenden Tagesfaktor multipliziert, den man aus einer Decay-Chart-Tabelle
entnehmen kann. Hierdurch erhält man die B-Werte der Scatchard-Gleichung (s.o.).
Diese Werte werden nach Umrechnen von mmol in mol durch die Werte der freien
Aktivität F1-F6 (F1=200 pM bis F6=12,5 pM) dividiert. So erhält man die B/F-Werte
der Scatchard-Gleichung. Die B-Werte werden auf der Abszisse gegen die B/F-Werte
auf der Ordinate aufgetragen. In diesem sogenannten Scatchard-Plot kann man die
Werte mit einer Geraden verbinden, deren Gleichung sich aus der Scatchard-Gleichung
ableiten läßt.
Die Dissozationskonstante entspricht dem negativen Kehrwert der Steigung oder auch
dem Verhältnis aus dem Schnittpunkt der x-Achse (Spx) und dem Schnittpunkt der yAchse (Spy). Aus dem Schnittpunkt mit der x-Achse läßt sich die maximale Menge
ICYP, das an die vorgegebene Zellzahl binden kann (Bmax), ablesen und sich die
Anzahl an Rezeptoren für die einzelne Zelle berechnen.
4.7 Bestimmung der Cytokine
4.7.1 Arten der Cytokinkinbestimmung
Um Cytokine nachzuweisen, stehen prinzipiell viele verschiedene Methoden zur
Verfügung wie z.B. folgende:
• Immunhistochemie
• FACS
• rt-PCR
• Bioassays
• Immunoassays
Bei der Immunhistochemie lassen sich die intrazellulären Cytokine anfärben und so
Aussagen über Vorhandensein und bedingt über Quantität angefärbter Cytokine treffen.
36
Wesentlich genauere Aussagen über intrazelluläre Cytokinproduktion lassen sich durch
den Nachweis spezifischer mRNA machen. Durch Umschreiben mittels der ReversenTranskriptase und Amplifikation via PCR kann man mit einer hohen Spezifität und
Sensitivität die gebildete mRNA quantitativ und qualitativ nachweisen. Der Nachteil
dieser Methode ist jedoch, daß der Nachweis von spezifischer mRNA nicht immer mit
dem Nachweis des auch tatsächlich sezernierten Cytokins korreliert (Tang, 1994). Bei
den Bioassays macht man sich die Kenntnis zunutze, dass spezifische Cytokine auf
bestimmte Immunzellen wirken. Hierbei arbeitet man mit bestimmten Zellklonen, die
auf ein bestimmtes Cytokin spezifisch reagieren. Mit einer bestimmten Menge eines
spezifischen monoklonalen Antikörpers lassen sich Reaktionen antagonisieren und so
indirekt Aussagen über die Quantität treffen. Ein Nachteil besteht darin, daß
Kreuzreaktionen zwischen den Cytokinen bestehen und diese so das Ergebnis
verfälschen können. Vorteilhaft ist die zum Teil hohe Sensitivität. Um Cytokine in
Zellkulturüberständen zu messen, bieten sich vor allem Immunoassays an, da sie die
translatierten und sezernierten Produkte nachweisen und eine hohe Sensitivität und
Spezifität besitzen. Dem Prinzip der Immunoassays liegt die Antigen-AntikörperBindung zugrunde, das heißt, ein spezifischer Antikörper bindet an das zu bestimmende
Molekül. Das zu messende Cytokin wird in eine mit spezifischen Antikörpern
beschichtete Microtiterplatte pipettiert. Nach einer Inkubationszeit hat sich ein
Gleichgewicht in der Antigen-Antikörper-Bindung gebildet. Das ungebundene Cytokin
wird ausgewaschen und spezifischer Antikörper, der nun mit einem Enzym (ELISA)
oder einer radioaktiven Substanz
(RIA) gekoppelt ist, wird hinzugegeben.
Überschüssiger Antikörper wird ausgewaschen, und dann entweder die Radioaktivität
gemessen (RIA) oder zunächst ein Chromogen hinzugegeben (ELISA). Das an den
Antikörper gekoppelte Enzym ist in der Lage, das Chromogen in einen Farbstoff
umzuwandeln. Es wird um so mehr Farbstoff gebildet, desto mehr Antikörper mit
Enzym gebunden ist, was im Photometer gemessen wird. Durch eine parallel
durchgeführte Eichung mit Standards lassen sich die Ergebnisse quantifizieren. Wegen
der leichten Durchführbarkeit, der fehlenden Strahlenbelastung und der guten
Aussagekraft haben wir uns für die Bestimmung der Cytokine mittels ELISA
entschieden.
37
4.7.2 Durchführung des ELISA
Für die Durchführung der ELISA-Bestimmungen der Cytokine IL-4, IL-6 und IFN-γ
dienen
Immunoassay-Kits
der
Firma
Biosource
International.
In
96-well-
Microtiterplatten werden als Doppelbestimmung zunächst jeweils 50 µl der Standards
hinzugegeben, die bei den einzelnen Cytokinen in unterschiedlichen Konzentrationen
vorliegen. Dann werden als Doppelbestimmungen jeweils zweimal 50 µl der Proben auf
die Microtiterplatte pipettiert. Zu Standards und Proben werden je well 50 µl Biotinkonjugierter Antikörper gegeben. Nach einer Inkubationszeit, die von dem zu
messenden Cytokin abhängt (IL-4: 120 min, IL-6: 120 min, IFN-γ: 90 min), haben sich
Antigen-Antikörper-Bindungen ausgebildet. Dann werden die Microtiter-Platten mit
Waschpuffer sorgfältig gewaschen, um ungebundene Cytokine und ungebundene
Biotin-konjugierte Antikörper zu entfernen. Daraufhin folgt die Hinzugabe von 100 µl
Streptavidin-Peroxidase pro well, die sich an die Biotin-konjugierten Antikörper bindet.
Nach einer weiteren Inkubationszeit (IL-4: 30 min, IL-6: 60 min, IFN-γ: 30 min) wird
die ungebundene Streptavidin-Peroxidase ausgewaschen und in jedes well 100 µl
stabilisiertes Chromogen pipettiert. Dieses Chromogen wird als Substrat von der
Peroxidase in einen blauen Farbstoff umgewandelt. Nach einer bestimmten
Reaktionszeit (IL-4: 30 min, IL-6: 20 min, IFN-γ: 30 min) wird der Substrat-Umbau
durch Zugabe von je 100 µl Stoppuffer gestoppt, der blaue Farbstoff wird in einen
gelben umgewandelt und die Absorption in einem Photometer bei 450 nm gegen den
Standard gemessen.
4.8 Statistische Auswertung
Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente wurden mit Hilfe verschiedener
statistischer Verfahren des Programms StadAdvisor ausgewertet. Bei grosser Streubreite
der erhobenen Ergebnisse werden nicht die Absolutwerte miteinander verglichen,
sondern es werden die Ergebnisse der Versuche als Prozentwerte vom Stimulationswert,
der mit 100% festgesetzt wird, statistisch miteinander verglichen. Neben parametrischen
Tests bei Normalverteilung der Werte und gleichen Varianzen kommt die ANOVAVarianzanalyse zur Anwendung. Die Irrtumswahrscheinlichkeit kann auch als „p-Wert“
angegeben werden:
38
•
p < 0,1
marginal signifikanter Unterschied
•
p < 0,05
signifikanter Unterschied
•
p < 0,01
sehr signifikanter Unterschied
•
p < 0,001
hochsignifikanter Unterschied
Bei Signifikanz (p<0,05) kommt es zu weiterer Verarbeitung der Werte durch den
Fisher-least-significant-difference-(LSD)-Test. Signifikant unterschiedliche Werte zum
Stimulationswert sind in den Diagrammen mit einem Stern gekennzeichnet.
Desweiteren wird untersucht, ob ein signifikanter Zusammenhang zwischen
Katecholamineinflüssen und der β-Rezeptoren-Dichte besteht.
39
5. Ergebnisse
5.1 Einführung
PBMC werden durch Tetanus-Toxoid, PHA-P, Anti-CD3-Antikörper und IL-2
stimuliert. Die Cytokine IL-4, IL-6 und IFN-γ werden zu den Zeitpunkten 12h, 24h, 48h
und 72h in Gegenwart von Katecholaminen, α- und β-Adrenozeptorantagonisten
bestimmt. Hierbei sollen durch die Versuche folgende Fragestellungen untersucht und
mögliche Zusammenhänge beschrieben werden:
•
Ist die Cytokinproduktion durch Katecholamine beeinflussbar?
•
Inwieweit
lassen
sich
die
Katecholamineffekte
durch
α-
oder
β-
Adrenozeptorantagonisten aufheben oder verstärken?
•
Bestehen Unterschiede der Beeinflussbarkeit der Cytokinproduktion bezüglich der
verschiedenen Stimulantien?
•
Lässt sich eine Korrelation zwischen der β-Rezeptorendichte und dem Ausmass der
Katecholamineffekte aufzeigen?
Aufgrund einer grossen Streubreite der Cytokinwerte werden nicht nur die
Absolutwerte sondern auch Prozentwerte miteinander verglichen. Hierbei wird jeweils
der Stimulationswert mit 100% festgesetzt. Für die anderen Werte wird in Abhängigkeit
vom Stimulationswert der Prozentwert berechnet.
5.2 Stimulationserfolg
5.2.1 Ergebnisse der Stimulationsversuche mit PHA-P
Phytohaemagglutinin-P (PHA-P) kommt bei den PBMC von 15 verschiedenen
Probanden zur Anwendung (n=15). Nach Stimulation mit PHA-P kommt es nach 48h zu
einer gesteigerten IL-6-Produktion, die im Vergleich zum Leerwert signifikant ist. IL-4
lässt sich zu den Zeitpunkten 12h und 48h signifikant erhöht messen. Die IFN-γ-
40
Produktion ist ab Zeitpunkt 12h signifikant erhöht messbar mit einem Höhepunkt zum
Zeitpunkt 72h. Ein Effekt von Katecholaminen auf die Cytokinproduktion lässt sich bei
allen drei untersuchten Cytokinen mehr und weniger ausgeprägt zeigen.
5.2.1.1 PHA-P und IL-6
Zu den Zeitpunkten 12h und 24h kommt es noch zu keiner durch die Stimulation
signifikant gesteigerten IL-6-Produktion. Katecholamineinflüsse auf die IL-6Produktion lassen sich zu diesen Zeitpunkten nicht beobachten. Zum Zeitpunkt 48h
kommt es zu einer signifikanten Mehrproduktion um mehr als das 2fache des Leerwerts.
Noradrenalin in der Konzentration 10-9 M (59,4+/-9,9%) sowie Noradrenalin 10-5 M mit
Propranolol (53,1+/-10,5%) haben einen signifikant hemmenden Effekt auf die IL-6Produktion um 40,6% bzw. 46,9%. Urapidil (95,8+/-25,2%) vermindert den
hemmenden Einfluss von Noradrenalin 10-9 M.
41
Einfluss von Noradrenalin auf die IL-6-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 48h
IL-6 %
140
120
100
*
*
80
60
40
20
+
N
E9
+
N
E9
N
E5
N
E5
Pr
op
U
ra
p
N
E9
+
Pr
op
U
ra
p
+
N
E5
St
im
0
Abb. 1: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-6 nach Stimulation mit
PHA-P nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Nach 72h ist eine signifikante Mehrproduktion von IL-6 im Vergleich zum Leerwert um
mehr als das 2,5fache zu verzeichnen. Es lassen sich hemmende Einflüsse von
Noradrenalin 10-9 M mit Urapidil (59+/-13,3%), Adrenalin 10-5 M (64,7+/-17,6%) und
Adrenalin 10-9 M (64+/-13,3%) beobachten.
IL-6 %
Einfluss von Adrenalin auf die IL-6-Produktion nach Stimulation
mit PHA-P nach 72h
150
*
*
100
50
op
p
+
9
E-
+
9
E-
Pr
U
ra
E-
Pr
+
5
E-
+
5
E-
9
op
p
U
ra
5
E-
St
im
0
Abb. 2: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-6 nach Stimulation mit
PHA-P nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
42
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Einfluss von Noradrenalin auf die IL-6-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 72h
IL-6 %
120
*
100
80
60
40
20
+
N
E9
+
N
E9
N
E5
Pr
op
U
ra
p
N
E9
Pr
op
+
U
ra
p
N
E5
+
N
E5
St
im
0
Abb. 3: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-6 nach Stimulation mit
PHA-P nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
5.2.1.2 PHA-P und IL-4
Nach 12h steigert sich die IL-4-Produktion signifikant um mehr als das 7fache.
Adrenalin 10-5 M hemmt die IL-4-Sekretion signifikant um 25,8% (74,2+/-6,1%).
Dieser Einfluss kann nicht durch die Adrenozeptorenblocker antagonisiert werden.
Auch Noradrenalin 10-5 M reduziert die IL-4-Produktion um 37,9% (62,1+/-6,3%).
Dieser Effekt kann teilweise, aber nicht signifikant durch Propranolol antagonisiert
werden (80,2+/-6,6%); Urapidil bleibt ohne Einfluss. Sowohl Adrenalin 10-9 M als auch
Noradrenalin 10-9 M modulieren die IL-4-Produktion zum Zeitpunkt 12h nicht.
43
Einfluss von Adrenalin auf die IL-4-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 12h
IL-4 %
150
*
*
*
100
50
Pr
op
ra
p
E9
+
U
+
E9
E5
E5
+
+
E9
Pr
op
ra
p
U
E5
St
im
0
Abb. 4: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-4 nach Stimulation mit
PHA-P nach 12h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Einfluss von Noradrenalin auf die IL-4-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 12h
IL-4 %
120
100
*
*
*
80
60
40
20
N
E9
+
Pr
op
U
ra
p
N
E9
N
E5
+
+
N
E9
Pr
op
U
ra
p
N
E5
+
N
E5
St
im
0
Abb. 5: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-4 nach Stimulation mit
PHA-P nach 12h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
44
Nach 24h ist die IL-4-Produktion mit einer zum Leerwert mehr als 10fachen Produktion
signifikant gesteigert. Sowohl Adrenalin 10-5 M (75,4+/-3,6%) als auch Noradrenalin
10-5 M (71,8+/-5,5%) führen zu einer signifikanten Verminderung der IL-4-Produktion.
Weder α- noch β-Rezeptor-Antagonisten beeinflussen diesen Effekt.
Einfluss von Adrenalin auf die IL-4-Produktion nach Stimulation
mit PHA-P nach 24h
IL-4 %
150
*
100
*
*
50
E9
p
+
E9
+
U
Pr
o
ra
p
E9
p
+
E5
E5
+
U
Pr
o
ra
p
E5
St
im
0
Abb. 6: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-4 nach Stimulation mit
PHA-P nach 24h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (NE-5) und Adrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
45
Einfluss von Noradrenalin auf die IL-4-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 24h
IL-4 %
120
*
100
*
*
80
60
40
20
Pr
op
ra
p
+
U
N
E9
N
N
E9
+
+
E5
+
E5
N
N
E9
Pr
op
ra
p
U
N
E5
St
im
0
Abb. 7: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IL-4 nach Stimulation mit
PHA-P nach 24h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
5.2.1.3 PHA-P und IFN-γγ
Nach Stimulation mit PHA-P kommt es bereits nach 12h zu einer signifikanten IFN-γProduktion um mehr als das 8fache des Leerwerts (p<0,001). Zu diesem Zeitpunkt
hemmen sowohl Adrenalin 10-5 M (19,2+/-5,9%) als auch Noradrenalin 10-5 M (26,6+/6%) die IFN-γ-Produktion. Dieser Effekt lässt sich nur bei Noradrenalin 10-5 M durch
Propranolol (82+/-10,8%) signifikant beeinflussen. Die Wirkung von Adrenalin 10-5 M
lässt sich leicht, aber nicht signifikant durch den β-Rezeptor-Antagonisten (36+/-7,7%)
beeinflussen (p<0,1). Auch Adrenalin 10-9 M mit Urapidil vermindert die IFN-γProduktion signifikant (60,7+/-13,2%).
46
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion
nach Stimulation mit PHA-P nach 12h
IFN-Gamma %
140
*
120
100
80
*
60
*
40
20
Pr
op
N
E9
+
N
E9
N
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+
U
ra
p
N
E9
Pr
op
+
U
ra
p
N
E5
+
N
E5
St
im
0
Abb. 8: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 12h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Nordrenalin 10-5 M (NE-5) und Nordrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
47
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 12h
IFN-Gamma %
150
*
100
*
*
50
*
Pr
op
ra
p
E9
+
U
E9
E5
+
+
E9
Pr
op
ra
p
E5
+
U
E5
St
im
0
Abb. 9: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 12h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Nach 24h ist IFN-γ im Vergleich zum Leerwert um mehr als das 70fache signifikant
erhöht (p<0,001). Sowohl Adrenalin 10-5 M (30,3+/-10,5%) als auch Noradrenalin 10-5
M (17,2+/-5,9%) vermindern signifikant die IFN-γ-Produktion. Während Propranolol
den Katecholamineffekt bei Noradrenalin 10-5 M (78,8+/-12,7%) aufhebt, tritt bei
Adrenalin 10-5 M weder durch Urapidil noch durch Propranolol eine signifikante
Modulation des Katecholamineffekts auf. Weder Adrenalin noch Noradrenalin in der
Konzentration 10-9 M vermögen die IFN-γ-Produktion signifikant zu beeinflussen.
48
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 24h
IFN-Gamma %
150
100
*
*
*
50
p
E9
+
+
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o
ra
p
9
EE9
E5
E5
+
+
U
Pr
o
p
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p
5
E-
St
im
0
Abb. 10: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 24h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 24h
IFN-Gamma %
120
100
80
60
*
*
40
20
Pr
op
ra
p
+
U
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N
N
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+
+
E5
+
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N
E9
Pr
op
ra
p
U
N
E5
St
im
0
Abb. 11: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 24h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
49
Nach 48h ist IFN-γ im Vergleich zum Leerwert um mehr als das 30fache signifikant
erhöht. Adrenalin 10-5 M (15,3+/-4%) und Noradrenalin 10-5 M (23,4+/-3,9%) hemmen
signifikant die IFN-γ-Produktion. Weder durch Urapidil noch durch Propranolol kommt
es in Gegenwart von Adrenalin 10-5 M zu einer signifikanten Aufhebung des
Katecholamineffekts. Propranolol (74+/-9%) kann jedoch dem hemmenden Effekt von
Noradrenalin 10-5 M signifikant entgegenwirken. Weder Adrenalin und Noradrenalin in
der Konzentration 10-9 M noch die Adrenozeptorantagonisten vermögen zum Zeitpunkt
48h die IFN-γ-Produktion signifikant zu beeinflussen.
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 48h
IFN-Gamma %
150
100
*
*
50
*
E9
p
+
E9
+
U
Pr
o
ra
p
E9
p
+
E5
E5
+
U
Pr
o
ra
p
E5
St
im
0
Abb. 12: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
50
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 48h
IFN-Gamma %
120
100
*
80
60
*
*
40
20
Pr
op
ra
p
N
E9
N
N
E9
+
+
U
E9
+
E5
+
E5
N
N
Pr
op
ra
p
U
E5
N
St
im
0
Abb. 13: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Mit einer im Vergleich zum Leerwert fast 70fach gesteigerten Produktion kommt es
zum Zeitpunkt 72h zu einer signifikanten Stimulation. Adrenalin 10-5 M (23,8+/-4,2%)
und Noradrenalin 10-5 M (29,7+/-7%) hemmen wiederum signifikant die IFN-γProduktion. Nur bei Noradrenalin 10-5 M kann Propranolol dem hemmenden Effekt
signifikant entgegenwirken (86,5+/-12%). Auf den hemmenden Einfluss von Adrenalin
10-5 M haben zum Zeitpunkt 72h weder α- noch β-Rezeptor-Antagonisten einen
signifikanten Einfluss. Weder Adrenalin und Noradrenalin in der Konzentration 10-9 M
noch die Adrenozeptorantagonisten verändern zum Zeitpunkt 72h die IFN-γ-Produktion
signifikant.
51
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 72h
IFN-Gamma %
150
100
*
*
50
*
p
+
U
E9
E9
+
+
E5
E5
Pr
o
ra
p
E9
p
Pr
o
ra
p
U
+
St
im
E5
0
Abb. 14: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit PHA-P nach 72h
IFN-Gamma %
120
100
80
*
60
*
40
20
Pr
op
ra
p
N
E9
N
N
E9
+
+
U
E9
+
E5
+
E5
N
N
Pr
op
ra
p
U
E5
N
St
im
0
Abb. 15: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit PHA-P nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
52
5.2.2 Ergebnisse der Stimulationsversuche mit IL-2
Nach Stimulation mit IL-2 kommt es erst nach 24h bis 48h zur Produktion von IFN-γ,
die erst nach 72h signifikant erhöht ist (p<0,01). Weder für IL-6 noch für IL-4 lässt sich
eine signifikante Produktion durch die IL-2-Stimulation nachweisen. Mit IL-2 werden
die PBMC von 5 Probanden stimuliert (n=5).
5.2.2.1 IL-2 und IL-6
Zu keinem der vier Messzeitpunkte ist eine statistisch signifikante Steigerung der IL-6Produktion durch IL-2 zu verzeichnen. In Gegenwart der Katecholamine lässt sich keine
Beeinflussung erkennen.
5.2.2.2 IL-2 und IL-4
Durch IL-2 kommt es zu keiner bzw. einer nicht nachweisbaren IL-4-Produktion, so
dass eine Aussage über einen Katecholamineffekt auch auf die Basissekretion nicht
getroffen werden kann.
5.2.2.3 IL-2 und IFN-γγ
48h nach Stimulation kommt es zu einer gegenüber dem Leerwert über 20fach erhöhten
IFN-γ-Produktion, die aufgrund der Streubreite innerhalb der Versuche nicht signifikant
ist. Ein signifikanter Unterschied ist aber zwischen der IFN-γ-Produktion in Gegenwart
von Adrenalin 10-5 M (45+/-10,9%) und 10-9 M (133,4+/-38,7%) zu beobachten.
53
Einfluss Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Interleukin-2 nach 48h
IFN-Gamma %
200
150
100
50
E9
p
+
E9
+
U
Pr
o
ra
p
E9
p
+
E5
E5
+
U
Pr
o
ra
p
E5
St
im
0
Abb. 16: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit IL-2 nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Zum Zeitpunkt 72h führt Adrenalin 10-5 M zu einer deutlichen Hemmung der
Cytokinproduktion (43,2+/-14,8%). Diese ist weder durch Urapidil noch durch
Propranolol zu beeinflussen. Eine signifikante Reduktion der IFN-γ-Produktion ist auch
in Gegenwart von Noradrenalin 10-5 M (53,4+/-6,2%) festzustellen. Diese Reduktion
lässt sich teilweise durch Propranolol, nicht jedoch durch Urapidil aufheben (63,7+/6,2%). Weder Adrenalin noch Noradrenalin in der Konzentration 10-9 M haben einen
signifikanten Effekt auf die Ergebnisse.
54
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Anti-IL-2 nach 72h
IFN-Gamma %
120
100
*
80
*
60
40
20
Pr
op
ra
p
+
N
E9
+
E9
N
N
N
E5
E5
+
+
N
U
E9
Pr
op
ra
p
U
E5
N
St
im
0
Abb. 17: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit IL-2 nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Interleukin-2 nach 72h
IFN-Gamma %
150
*
100
*
*
50
E9
p
+
E9
+
U
Pr
o
ra
p
E9
p
+
E5
E5
+
U
Pr
o
ra
p
E5
St
im
0
Abb. 18: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit IL-2 nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
55
5.2.3 Ergebnisse der Stimulationsversuche mit Tetanus-Toxoid
Tetanus-Toxoid gelangt in bei den PBMC von 7 Probanden zur Anwendung (n=7).
Sowohl für IL-6 als auch für IFN-γ ist erst nach 48h eine im Vergleich zum Leerwert
signifikant gesteigerte Produktion nachzuweisen. IL-4 ist durch Stimulation mit TT in
unseren Versuchen nicht signifikant stimulierbar bzw. nicht nachweisbar.
5.2.3.1 Tetanus-Toxoid und IL-6
Nach 48h ist im Vergleich zum Leerwert eine mehr als 3fach angestiegene IL-6Produktion zu verzeichnen (p<0,001). Auch die fast 4fach angestiegene Produktion
nach Stimulation im Vergleich zum Leerwert ist signifikant (p<0,001). Es lässt sich zu
allen vier Zeitpunkten kein Einfluss von Katecholaminen auf die IL-6-Produktion
beobachten.
5.2.3.2 Tetanus-Toxoid und IL-4
Zu allen vier Messzeitpunkten tritt IL-4 entweder nicht messbar oder nicht signifikant
zum Leerwert erhöht auf. Über einen Katecholamineinfluss auf die IL-4-Produktion
nach Stimulation mit TT können keine Aussagen getroffen werden.
56
5.2.3.3 Tetanus-Toxoid und IFN-γγ
Die IFN-γ-Produktion ist nach 48h mit im Vergleich zum Leerwert mehr als 7fach
erhöhten Werten signifikant gesteigert. Adrenalin 10-5 M führt zu einer deutlichen
Hemmung der Cytokinproduktion (57,5+/-8,7%). Diese lässt sich nur durch Propranolol
signifikant antagonisieren (74,1+/-8,7%).
Auch Noradrenalin 10-5 M reduziert die Produktion signifikant (65,9+/-7,6%). Urapidil
hat keinen Effekt, Propranolol hebt die Noradrenalinwirkung nur leicht und nicht
signifikant auf (78,8+/-9,1%).
Einfluss Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Tetanus-Toxoid nach 48h
IFN-Gamma %
150
*
*
100
*
50
op
Pr
ra
p
+
E9
E9
E5
+
+
U
E9
op
Pr
ra
p
E5
+
U
E5
St
im
0
Abb. 19: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit TT nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
57
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Tetanus-Toxoid nach 48h
IFN-Gamma %
120
100
*
80
*
*
60
40
20
Pr
op
p
N
N
E9
N
E9
+
+
U
ra
N
+
E5
+
N
E5
E9
Pr
op
p
U
ra
E5
N
St
im
0
Abb. 20: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit TT nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter Koinkubation
mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert
sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
Nach 72h lässt sich eine signifikante IFN-γ-Produktion um fast das 6fache des
Leerwerts beobachten (p<0,001). Adrenalin 10-5 M vermindert die Produktion
signifikant (73,8+/-5,7%). Der Einfluss kann mit Propranolol aufgehoben werden
(82,3+/-7,4), nicht jedoch mit Urapidil (68,6+/-8,8%). Noradrenalin 10-5 M und 10-9 M
hat keinen signifikanten Effekt auf die IFN-γ-Produktion.
58
Einfluss von Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Tetanus-Toxoid nach 72h
IFN-Gamma %
150
*
100
*
50
p
Pr
o
ra
p
+
E9
E9
E5
+
+
U
E9
p
Pr
o
ra
p
E5
+
U
E5
St
im
0
Abb. 21: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit TT nach 72h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten unter
Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
5.2.4 Ergebnisse der Stimulationsversuche mit Anti-CD3-Antikörpern
Die PBMC von 5 verschiedenen Probanden werden mit Anti-CD3-Antikörpern
stimuliert (n=6). Nach Stimulation mit Anti-CD3-Antikörpern kann für IL-6 und IFN-γ
nach 24h eine im Vergleich zum Leerwert signifikant gesteigerte Produktion
nachgewiesen werden. Nach 12h sind für beide Cytokine noch keine Erhöhung im
Vergleich zum Leerwert nachweisbar. Zu allen vier Bestimmungszeitpunkten kann nach
Anti-CD3-Ak-Stimulation kein Stimulationserfolg für IL-4 beobachtet werden. Sowohl
für IFN-γ als auch für IL-6 ist zum Zeitpunkt 48h die höchste Cytokin-Produktion zu
verzeichnen.
5.2.4.1 Anti-CD3-Ak und IL-6
In der Varianzanalyse ist die IL-6-Produktion 24h nach Stimulation mit einem p < 0,001
bzw. p = 0,05 nach 48h signifikant im Vergleich zum Leerwert erhöht. Es ist kein
Effekt von Katecholaminen oder Adrenozeptorantagonisten auf die IL-6-Produktion
messbar.
59
5.2.4.2 Anti-CD3-Ak und IL-4
Nach Anti-CD3-Ak-Stimulation kommt es an keinem der vier Zeitpunkte zu einer im
Vergleich zum Leerwert signifikant erhöhten IL-4-Produktion.
5.2.4.3 Anti-CD3-Ak und IFN-γγ
Ab 24h nach Anti-CD3-Ak-Stimulation kommt es zu einer deutlich messbaren IFN-γProduktion. Zum Zeitpunkt 24h kann zwischen den stimulierten Zellen noch kein
Katecholamineffekt nachgewiesen werden. 48h nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
besteht ein hemmender Einfluss (p < 0,001) von Adrenalin 10-5 M (26,8+/-8,5%),
Noradrenalin 10-5 M (43,2+/-14,2%) und Noradrenalin 10-9 M (60,9+/-11,3%).
Einfluss Adrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Anti-CD3-Ak nach 48h
IFN-Gamma %
200
150
*
100
*
50
E9
p
+
E9
+
U
Pr
o
ra
p
E9
p
+
E5
E5
+
U
Pr
o
ra
p
E5
St
im
0
Abb. 22: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit Anti-CD3-Ak nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten
unter Inkubation mit Adrenalin 10-5 M (E-5) und Adrenalin 10-9 M (E-9) sowie unter Koinkubation mit
Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum Stimulationswert sind
mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
60
Der hemmende Effekt von Adrenalin 10-5 M ist durch Propranolol signifikant
antagonisierbar (91,1+/-18,7%). Urapidil vermag den Effekt nicht zu beeinflussen.
Adrenalin 10-9 M beeinflusst die IFN-γ-Produktion nicht.
Einfluss von Noradrenalin auf die IFN-Gamma-Produktion nach
Stimulation mit Anti-CD3-Ak nach 48h
IFN-Gamma %
120
*
100
*
80
*
60
40
20
Pr
op
ra
p
E9
N
N
N
E9
E5
+
+
U
N
E9
Pr
op
+
U
N
E5
+
St
im
N
E5
ra
p
0
Abb. 23: Die Abbildung stellt die statistische Auswertung der Prozentwerte von IFN-γ nach Stimulation
mit Anti-CD3-Ak nach 48h dar. Der mit 100% festgesetzte Stimulationswert (Stim) wird mit den Werten
unter Inkubation mit Noradrenalin 10-5 M (NE-5) und Noradrenalin 10-9 M (NE-9) sowie unter
Koinkubation mit Propranolol (Prop) und Urapidil (Urap) verglichen. Signifikante Unterschiede zum
Stimulationswert sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
5.3 Beta-Rezeptoren
5.3.1 Anzahl an Beta-Rezeptoren
Es wurde parallel zu jedem Stimulationsversuch auf den PBMC, die von einem Spender
stammen, die Anzahl an β-Adrenozeptoren Radioligandenassay bestimmt. Bei
insgesamt
34
Bestimmungen
ergeben
sich
durchschnittlich
2733+/-874
β-
Adrenozeptoren auf den PBMC mit einem Maximum von 4363 und einem Minimum
von 1244 β-Adrenozeptoren. Die Durchschnittswerte der β-Adrenozeptoren liegen bei
den Versuchen mit dem Stimulus PHA-P bei 2708 (+/-952), bei den Versuchen mit IL-
61
2-Stimulation im Durchschnitt bei 2468 (+/-838), bei den Anti-CD3-Versuchen bei
2510 (+/-682) und bei den TT-stimulierten PBMC bei 3206 (+/-850).
5.3.2 Korrelation zwischen β -Adrenozeptoren und Katecholamineinfluss
Um eine mögliche Korrelation zwischen der Anzahl an β-Adrenozeptoren und dem
Katecholamineinfluss zu erkennen, wird die Rang-Korrelation nach Spearman
berechnet. Neben der Anzahl an β-Adrenozeptoren gehen die Prozentwerte der CytokinKonzentrationen bezogen auf den Stimulationswert als 100% nach Zugabe von
Adrenalin beziehungsweise Noradrenalin ein.
Die Berechnung ergiebt einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Rezeptorzahl
pro Zelle und dem Einfluss von Katecholaminen bei den mit PHA-P stimulierten
PBMC.
Für IL-6 zeigt sich eine signifikante Korrelation zwischen Rezeptoranzahl und
hemmendem Einfluss von Adrenalin 10-5 M (-0,581, Sig. 0,001), von Adrenalin 10-9 M
(-0,724, Sig. 0,000), von Noradrenalin 10-5 M (-0,672, Sig. 0,000) und von Noradrenalin
10-9 M (-0,822, Sig. 0,000) bei den mit PHA-P stimulierten PBMC.
Auch für IFN-γ zeigt sich bei den mit PHA-P stimulierten PBMC eine signifikante
Korrelation zwischen Rezeptoranzahl und hemmenden Einfluss von Adrenalin 10-5 M (0,547, Sig. 0,001), von Adrenalin 10-9 M (-0,500, Sig. 0,003), von Noradrenalin 10-5 M
(-0,498, Sig. 0,004) und von Noradrenalin 10-9 M (-0,481, Sig. 0,005).
Für IL-4 kann bei keinem Versuch eine Korrelation zwischen Rezeptoranzahl und
Katecholamineinfluss gezeigt werden.
Bei den Versuchen mit TT, Anti-CD3 und IL-2 kann ebenso keine signifikante
Korrelation zwischen Rezeptoranzahl und Katecholaminwirkung nachgewiesen werden.
62
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
Beta-2-Rezeptor
g
8
R
an
g
R
an
8
Noradrenalin 10-5 M
Abb. 24: Die Abbildung stellt die Korrelation der Ränge des Katecholamineinflusses auf die IFN-γProduktion nach Stimulation mit PHA-P in Gegenwart von Noradrenalin 10-5 M mit der Anzahl an β2-
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
g
8
R
an
R
an
g
Adrenozeptoren dar.
0
Beta-2-Rezeptor
Adrenalin 10-5 M
Abb. 25: Die Abbildung stellt die Korrelation der Ränge des Katecholamineinflusses auf die IFN-γProduktion nach Stimulation mit PHA-P in Gegenwart von Adrenalin 10-5 M mit der Anzahl an β2Adrenozeptoren dar.
63
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
Beta-2-Rezeptor
g
8
R
an
g
R
an
8
Noradrenalin 10-5 M
Abb. 26: Die Abbildung stellt die Korrelation der Ränge des Katecholamineinflusses auf die IL-6Produktion nach Stimulation mit PHA-P in Gegenwart von Noradrenalin 10-5 M mit der Anzahl an β2-
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
g
7
an
8
R
8
R
an
g
Adrenozeptoren dar.
Beta-2-Rezeptor
Adrenalin 10-5 M
Abb. 27: Die Abbildung stellt die Korrelation der Ränge des Katecholamineinflusses auf die IL-6Produktion nach Stimulation mit PHA-P in Gegenwart von Adrenalin 10-5 M mit der Anzahl an β2Adrenozeptoren dar.
64
6. Diskussion
6.1 Methodenkritik
Im Rahmen der Untersuchungen wurden zum einen die β-Rezeptorendichte auf den
PBMC und zum anderen der Einfluß der Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin
auf die Produktion bestimmter Cytokine bestimmt.
Für die Versuche wurden buffy coats aus der Blutbank des Uniklinikums Marburg
verwendet, die bei der Herstellung von Erythrozytenkonzentraten anfallen, und aus
denen die PBMC isoliert wurden. Aus Datenschutzgründen war es nicht möglich, die
Identität des Spenders zu verfolgen, um Einflußmöglichkeiten hinsichtlich der
Untersuchungen abzuklären. Wie schon dargestellt, ist die β-Rezeptorendichte auf
humanen PBMC von einer Vielzahl an Faktoren beeinflußbar wie durch bestimmte
Krankheiten, Medikamente, Hormone aber auch durch physiologische Einflüsse wie
Stress,
körperliche
Aktivität
und
das
Lebensalter.
Eine
Beeinflussung
des
Spenderkollektivs gab es bei der vorliegenden Arbeit insofern, dass nur gesunde
Spender zur Blutspende zugelassen werden. Andere Einflußgrößen entzogen sich der
Kenntnis und der Kontrolle des Untersuchers. Interindividuelle Einflüsse, die durch
Festlegung eines bestimmten Spenderprofils und Spendeprotokolls eliminiert werden
könnten, wurden hinsichtlich der Auswahl der Zellen nicht berücksichtigt.
Die Verwendung von PBMC für die vorliegende Arbeit ist durch verschiedene Vor- und
Nachteile geprägt. Vorteilhaft wirkt sich die kurze Bearbeitungszeit der Zellen aus, da
so das Risiko einer Beeinflussung der Zellen hinsichtlich der β-Rezeptorendichte und
einer Stimulation durch den Separationsvorgang gering gehalten werden kann. Mit
weiteren Separationsschritten, durch die man einzelne Zellfraktionen erhalten könnte,
würde dieses Risiko stetig steigen und sich von den Zuständen in vivo stärker
unterscheiden. Insbesondere könnte sich die β-Rezeptorendichte und der Einfluss von
Katecholaminen auf die Zellen stark verändern.
65
6.2 Einfluss der Stimulantien auf den Stimulationserfolg
Es kommen zur Stimulation der PBMC vier unterschiedliche Substanzen zur
Anwendung: Phytohaemagglutinin-P (PHA-P), Interleukin-2 (IL-2), Tetanus-Toxoid
(TT)
und
Anti-CD3-Antikörper
(Anti-CD3-Ak).
Die
Stimulantien
ergeben
unterschiedliche Effekte bezüglich Zeitpunkt und Produktion der untersuchten
Cytokine.
6.2.1 Stimulation mit PHA-P
6.2.1. Cytokin-Produktion nach Stimulation mit PHA-P
Nach Stimulation mit PHA-P kommt es erst nach 48h zu einer signifikanten Produktion
von IL-6 mit einem Höhepunkt zum Zeitpunkt 72h. Diese Beobachtung der IL-6Produktion mit einem Anstieg zum Zeitpunkt 48h und einem Höhepunkt zum Zeitpunkt
72h nach Stimulation der PBMC mit 10 µg/ml PHA stimmen mit den Arbeiten von
McHugh et al. überein (McHugh, 1996). Als Hauptquelle von IL-6 in den PBMC gelten
Monozyten/Makrophagen. IL-6 wird aber auch von Th2-Zellen produziert (Kishimoto,
1989).
Die Produktion von IL-4 ist nach 12h und 24h signifikant im Vergleich zum Leerwert
erhöht. Zu den Zeitpunkten 48h und 72h kann IL-4 nicht mehr signifikant erhöht
gemessen werden. Im Gegensatz dazu finden McHugh et al. einen Peak der IL-4Produktion nach 48h. In seinen Untersuchungen kam allerdings auch ein anderes Lektin
von Phaseolus vulgaris, nämlich PHA-L, zur Anwendung. Doch auch er findet einen
steilen An- und Abstieg der IL-4-Konzentration in den Kulturen. PHA-P führt zu einem
deutlich früheren IL-4-Peak als PHA-L, so dass zu den Zeitpunkten 48h und 72h IL-4
nicht mehr ausgewertet werden kann.
IFN-γ liegt in den höchsten Konzentrationen zum Zeitpunkt 72h nach PHA-PStimulation vor. McHugh et al. beschreiben einen Peak der IFN-γ-Produktion nach 6084h nach Stimulation, was den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung weitgehend
entspricht (McHugh, 1996). Für alle drei Cytokine werden nur monophasiche Verläufe
der Cytokinproduktion nach Stimulation mit PHA-P beschrieben.
66
6.2.2 Stimulation mit Interleukin-2
IL-2 stimuliert PBMC über Bindung an seinen spezifischen IL-2-Rezeptor. Nach
Stimulation mit IL-2 konnte weder für IL-6 noch für IL-4 ein signifikanter Anstieg der
Produktion im Vergleich zum Leerwert beobachtet werden. Lediglich die Produktion
von IFN-γ konnte durch IL-2 signifikant stimuliert werden, was auch Kasahara in seiner
Arbeit beschreibt (Kasahara, 1983). Ab 48h war die Produktion im Vergleich zum
Leerwert signifikant gesteigert, ein Höhepunkt wurde zum Zeitpunkt 72h erreicht. Die
Basissekretion an IL-4 und IL-6 liess sich nicht steigern.
6.2.3 Stimulation mit Tetanus-Toxoid
Nach Stimulation mit Tetanus-Toxoid kommt es nach 48h zu einer signifikanten IL-6Produktion mit einem Peak zum Zeitpunkt 72h.
IL-4 konnte zu keinem der vier Zeitpunkte nach Stimulation mit TT signifikant erhöht
gemessen werden. Bei Untersuchungen mit PBMC nach Stimulation mit TT konnten
Bodnar et al. eine deutliche Zunahme der mRNA für IL-4 demonstrieren. Trotz der vor
allem
bei
TT
ausgeprägten
IL-4-mRNA-Zunahme
konnte
IL-4
in
den
Zellkulturüberständen durch ELISA nicht nachgewiesen werden (Bodnar, 1997, El
Ghazali, 1993), was mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit übereinstimmt.
Andere Arbeiten beschreiben im Gegensatz dazu eine deutlich messbare IL-4-Sekretion
(Looney, 1994, Kurtzhals, 1992). Der wahrscheinlichste Grund für das nicht messbare
IL-4 kann die niedrige Produktion sein, aber auch ein Cytokinabbau oder die Bindung
an lösliche oder zellmembrangebundene IL-4-Rezeptoren. In einer anderen Arbeit
führte erst wiederholte TT-Stimulation zu einer signifikanten IL-4-Erhöhung (Marshall,
1993). Insgesamt finden sich in der Literatur sehr unterschiedliche Angaben über den
IL-4-Nachweis mittels ELISA mit zum Teil erhöhter IL-4-Sekretion bei Atopikern ohne
vorherige Stimulation und nicht nachweisbarer IL-4-Produktion trotz Stimulation von
PBMC gesunder Probanden (Fargeas, 1992).
67
Nach TT-Stimulation konnte nach 48h und 72h eine signifikante Erhöhung an IFN-γ
gemessen werden. Bodnar beobachtete bereits nach 24h eine signifikante IFN-γErhöhung (Bodnar, 1997). Auch in der vorliegenden Arbeit war eine vermehrte wenn
auch nicht signifikante Produktion nach 24h auch zu beobachten.
6.2.4 Stimulation mit Anti-CD3-Antikörpern
Der murine Anti-CD3-Ak aktiviert PBMC durch direkte Bindung an den T-ZellRezeptor/CD3-Komplex. Die Aktivierung der Zellen mit Anti-CD3-Ak entspricht mehr
einer
Antigen-spezifischen
Stimulation
als
z.B.
Lektine,
Phorbolester
oder
Calciumionophoren. Nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak konnte IL-6 signifikant erhöht
zum Leerwert nach 24h und 48h gemessen werden. In der Arbeit von Pisa gelang der
Nachweis von IL-6-mRNA nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak bereits nach 4h mit
einer zunehmenden Steigerung der mRNA bis zum Zeitpunkt 22h (Pisa, 1992), was mit
den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit gut vereinbar ist, da der IL-6-Nachweis über
den Nachweis der mRNA wesentlich sensitiver ist und mittels ELISA erst grössere
Mengen im Überstand gemessen werden können.
IL-4 konnte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak zu keinem der vier Messzeitpunkte
gemessen werden. Frühere Arbeiten zeigten ausschliesslich einen transienten mRNANachweis nach 4-7h (Pisa, 1992). Lewis et al. halten die transiente IL-4-Produktion nur
für das Produkt einer kleinen Th-Zellpopulation, die bei wesentlich höherer Produktion
von IL-2 und IFN-γ deshalb im Verlauf kein IL-4 mehr bildet (Lewis, 1988).
Eine im Vergleich zum Leerwert signifikant erhöhte IFN-γ-Produktion nach Anti-CD3Stimulation lässt sich in der vorliegenden Arbeit nach 24h zeigen. Ein Peak konnte zum
Zeitpunkt 72h gemessen werden. Pisa zeigte in einer Arbeit einen IFN-γ-mRNANachweis bereits 4h nach Stimulation, der bis zum Ende des Untersuchungszeitpunkts
22h nach Stimulation positiv war (Pisa, 1992). Bei methodisch bedingter früherer
Nachweisbarkeit der mRNA sind die Untersuchungen gut mit der vorliegenden Arbeit
zu vereinbaren.
68
6.3 Einfluss der Katecholamine auf die Cytokin-Produktion
6.3.1 Einfluss von Katecholaminen auf die Produktion von IFN-γγ
Nach Stimulation mit PHA-P, IL-2, TT und Anti-CD3-Ak konnte bei allen vier
Stimulantien eine im Vergleich zum Leerwert signifikant gesteigerte Produktion von
IFN-γ hervorgerufen werden. Ebenso lassen sich bei allen vier Stimulantien Einflüsse
der Katecholamine auf die Cytokin-Produktion beobachten. Diese Einflüsse treten bei
IFN-γ im Vergleich zu den anderen untersuchten Cytokinen am deutlichsten zutage.
Nach Stimulation mit PHA-P reduzieren sowohl Adrenalin 10-5 M als auch
Noradrenalin 10-5 M die IFN-γ-Produktion signifikant. Dieser Effekt lässt sich teilweise
durch Propranolol antagonisieren, während α-Rezeptor-Blockade sowie Katecholamine
in der Dosierung 10-9 M keinen signifikanten Einfluss auf die IFN-γ-Produktion
ausüben.
Auch nach Stimulation mit den Substanzen Anti-CD3-Ak, Tetanus-Toxoid und IL-2
kommt es nur in Gegenwart der Katecholamine Adrenalin 10-5 M als auch Noradrenalin
10-5 zu einer signifikanten Hemmung der IFN-γ-Produktion. Der hemmende Einfluss
lässt sich wiederum nur durch Propranolol aufheben.
Katecholamine in der niedrigmolaren Dosierung 10-9 M führen in keinem der Versuche
zu einer Beeinflussung der IFN-γ-Produktion. Die Katecholaminwirkung kann durch
Propranolol antagonisiert werden, nicht jedoch durch Urapidil, was auf einen βAdrenozeptor-vermittelten Wirkmechanismus schliessen lässt.
Der in den vorliegenden Ergebnissen beobachtete, hemmende Einfluss der
Katecholamine stimmt mit den Beobachtungen verschiedener Publikationen überein.
Andrade-Mena konnte zeigen, dass murine Immunzellen der Milz nach Stimulation
durch PHA sowohl in Gegenwart von Adrenalin als auch Noradrenalin weniger IFN-γ
produzierten. Die Hemmung war dosisabhängig; so führte Koinkubation mit
Katecholaminen in der Dosierung 10-7 M noch zu einer signifikanten Hemmung
(Anrade-Mena, 1997). Der Katecholamineffekt war auch in dieser Untersuchung durch
Propranolol antagonisierbar. Auch Holen et al. beobachteten eine Hemmung der IFN-γSynthese stimulierter T-Zellen in Gegenwart von β2-Adrenozeptor-Agonisten
(Salbutamol, Salmeterol, Terbutalin, Fenoterol) (Holen, 1998). Der inhibitorische Effekt
auf die IFN-γ-Synthese kommt durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP
69
zustande. So konnte gezeigt werden, dass auch Prostaglandin E2 die Cytokinproduktion
in gleicher Weise wie die β2-Adrenozeptor-Agonisten beeinflusst. Prostaglandine
führen wie auch β2-Adrenozeptor-Agonisten zu einer nur geringen Beeinflussung der
Th2-Cytokine IL-4 und IL-5, inhibieren aber die Produktion von IL-2 und IFN-γ (Betz,
1991, Snijdewint, 1993). Die inhibitorischen Effekte durch Prostaglandin E2
korrelierten mit der Menge an intrazellulärem cAMP.
Diese Ergebnisse belegen die Annahme, dass die Katecholamin-Wirkung auf Th-Zellen
β2-Adrenozeptor-vermittelt ist.
Die Beeinflussung der IFN-γ-Produktion durch Katecholamine war unabhängig von
dem verwendeten Stimulus.
Sowohl für Adrenalin als auch für Noradrenalin können signifikante Einflüsse auf die
IFN-γ-Produktion nur in der Dosierung 10-5 M beobachtet werden. Diese in vitro
verwendeten Konzentrationen entsprechen denen, den Lymphozyten auch in vivo
ausgesetzt sein können. Auch exogen verabreichte β2-Adrenozeptor-Agonisten wie
Terbutalin, die z.B. bei der Behandlung von Bronchokonstriktion verabreicht werden,
können Plasma-Konzentrationen im Bereich 10-5 M bis 10-7 M erreichen (Fuchs, 1988,
Kohm, 2000). Niedrigere Konzentrationen, wie in der vorliegenden Arbeit verwendet,
haben keinen Einfluss gezeigt. Es ist anzunehmen, dass der komplexe Einfluss der
Katecholamine auf die Th-Zellen v.a. im Bereich der lymphatischen Organe stattfindet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stimmen mit den Ergebnissen verschiedener
Arbeiten mit humanen Th-Zellen überein; Katecholamine bzw. eine intrazelluläre
cAMP-Erhöhung vermindern v.a. die Produktion der Th1-Cytokine wie IFN-γ,
wohingegen die Th2-Cytokine in ihrer Produktion nur wenig oder gar nicht beeinflusst
werden (Mohede, 1996, Yoshimura, 1998).
6.3.2 Einflüsse von Katecholaminen auf die IL-6-Produktion
Nach Stimulation mit PHA-P, TT und Anti-CD3-Ak kann eine signifikant gesteigerte
Produktion von IL-6 erreicht werden, während IL-2 diesen Effekt nicht bewirkt. Nur bei
den Versuchen mit PHA-P kann eine signifikante Hemmung der IL-6-Produktion durch
Katecholamine beobachtet werden. Auch Katecholamine in der niedrigen Dosierung
10-9 M führen z.T. zu einer signifikanten Cytokinreduktion. Diese Hemmung der
70
Cytokin-Produktion ist weder durch α- noch β-Rezeptorantagonist signifikant
aufzuheben.
Auch van der Poll beobachtete einen hemmenden Effekt von Noradrenalin auf die IL-6Produktion von Vollblut-Kulturen nach Stimulation mit LPS. Die hemmende
Noradrenalin-Wirkung liess sich nur durch β-Antagonisten, nicht jedoch durch αAntagonisten aufheben. β-adrenerge Stimulation mit Isoprenalin entsprach der
Noradrenalinwirkung, während α-adrenerge Stimulation durch Phenylephrin keine
Änderung der IL-6-Produktion zur Folge hatte (van der Poll, 1994).
Bei PHA-stimulierten Vollblutkulturen führte Noradrenalin zu einer signifikanten
Verminderung von IL-6 und TNF-α. Die Produktion von TNF-α konnte auch durch α2Adrenozeptor-Stimulation reduziert werden (Maes, 2000).
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, die mit denen von Maes und
van der Poll gut vereinbar sind, gibt es einige Berichte über Untersuchungen an
Nagetieren, dass Noradrenalin IL-6-mRNA und Protein induzieren kann (Burysek,
1997, von Patay, 1999, Norris, 1993, Huang, 1997). Bei den Untersuchungen mit den
konträren Ergebnissen wurden z.T. andere IL-6-sezernierende Zelltypen untersucht wie
Adipozyten, Astrozyten u.a.; z.T. wurde der Einfluss auf unstimulierte Zellen
untersucht. Den Untersuchungen von Maes und van der Poll liegen ähnliche Materialien
und Methoden zugrunde wie in der vorliegenden Arbeit, in der vergleichbare Ergebnisse
erhoben werden konnten. Entgegen anderer Berichte scheinen sowohl Noradrenalin als
auch Adrenalin die IL-6-Produktion humaner PBMC in vitro negativ zu beeinflussen.
Diese Beobachtung kann z.B. helfen, den immunmodulatorischen Einfluss von
Katecholaminen bei einer Sepsis zu verstehen. Sowohl bei einer Sepsis als auch in
Gegenwart von LPS können sowohl eine erhöhte, systemische Katecholamin- wie auch
IL-6- und TNF-α-Freisetzung beobachtet werden (van der Poll, 1994). So können
Katecholamine möglicherweise einem negativen Feedback-Mechanismus für die IL-6
und
TNF-α-Freisetzung
dienen.
Katecholamine
können
so
eventuell
eine
überschiessende Immunantwort supprimieren. Diese Hypothese wird auch durch die
Ergebnisse von de Luigi et al. unterstützt. Nach sympathischer Denervation in Ratten
konnte nach LPS-Stimulation eine verstärkte IL-6-Produktion beobachtet werden, was
für eine tonisch inhibitorische Kontrolle des sympathischen Nervensystems spricht (de
Luigi, 1998).
71
Aus den Ergebnissen in der vorliegenden Arbeit lassen sich die adrenergen Effekte nicht
ebenso eindeutig zuordnen. Bemerkenswerter Weise führen zum Zeitpunkt 48h nur
Noradrenalin 10-9 M und Noradrenalin 10-5 M mit Propranolol zu einem Effekt auf die
IL-6-Produktion. Die hemmende Wirkung durch das niedrig molare Noradrenalin lässt
sich durch Koinkubation mit Urapidil aufheben. β-Adrenozeptorblockade ruft keine
Änderung hervor. Das könnte zum einen bedeuten, dass der Effekt α-Adrenozeptorvermittelt ist. Zum anderen kann durch α-Adrenozeptor-Blockade auch ein relatives
Überwiegen der β-Adrenozeptor-Wirkung zum Ausdruck kommen. Dagegen spricht
jedoch, dass Noradrenalin 10-5 M mit Propranolol einen hemmenden Einfluss auf die
IL-6-Produktion ausübt. Verschiedene Arbeitsgruppen haben zeigen können, dass die
Wirkung der Katecholamine über einen erhöhten cAMP-Spiegel vermittelt wird
(Madden, 1995). Jedoch wurde deutlich, dass neben dem cAMP-Spiegel eine Reihe
begleitender Faktoren auf die durch cAMP veränderte Immunantwort wirken. So ist
zum einen der Zeitpunkt der Adrenozeptor-Stimulation im Vergleich zur Stimulation
der
Immunzellen
von
Bedeutung.
Auch
die
Art
des Stimulus kann die
Katecholaminwirkung beeinflussen; so zeigten B-Zellen abhängig vom Stimulus eine
unterschiedliche Adrenozeptorantwort (Kouassi, 1990, Li, 1990). Der Effekt
äquimolarer cAMP-Spiegel ist auch von der cAMP-erhöhenden Substanz abhängig.
Isoproterenol und Prostaglandin E2 hatten bei äquimolaren cAMP-Spiegeln eine
unterschiedliche Wirkung auf die Proliferation stimulierter T-Zellen (Bartik, 1993).
Katecholamine können anscheinend durch unterschiedlich lang anhaltende cAMPSpiegel
oder
andere
begleitend
aktivierte
Signaltransduktionsmechanismen
differenzierte Wirkungen ausüben. Zum Zeitpunkt 48h scheint niedrigmolares
Noradrenalin über eine α-Adrenozeptor-Stimulation einen Effekt auf die IL-6Produktion auszuüben. Hinweise auf Beeinflussung der Immunantwort über αAdrenozeptoren gibt es von einigen Arbeitsgruppen. So beobachteten Heijnen et al.,
dass PBMC von Patienten mit juveniler rheumatoider Arthritis (JRA) auf die Zugabe
eines α1-Adrenozeptor-Agonisten in vitro mit einer verstärkten IL-6-Produktion
reagieren (Heijnen et al., 1996). Roupe van der Voort zeigte, dass Stress bei JRAPatienten in vivo zu einer vermehrten IL-6-Produktion führt, und dass bei diesen
Patienten mRNA für α1-Adrenozeptoren nachgewiesen werden konnte (Roupe van der
Voort, 2000). Felsner et al. zeigten, dass die T-Zell-Reaktivität bei Ratten durch αAdrenozeptor-Stimulation supprimiert wurde (Felsner, 1992).
72
72h nach Stimulation PHA-P ist die IL-6-Produktion bei Koinkubation mit Adrenalin
10-5 M und Adrenalin 10-9 M sowie Noradrenalin 10-9 M mit Urapidil erniedrigt. Diese
Einflüsse sind weder durch Urapidil noch durch Propranolol aufzuheben. Da in
Gegenwart von Noradrenalin 10-9 M und Urapidil auch die Erniedrigung beobachtet
wird, scheint der Effekt am ehesten β-Adrenozeptor-vermittelt zu sein, wodurch auch
van der Poll in seiner Arbeit den hemmenden Einfluss auf die IL-6-Produktion
vermittelt
sieht.
Interessanterweise
haben
weder
niedrig-
noch
hochmolares
Noradrenalin einen signifikanten Einfluss auf die IL-6-Produktion. Dies kann durch die
im Vergleich zu Adrenalin unterschiedliche Affinität zu Adrenozeptoren begründet sein.
6.3.3 Einflüsse von Katecholaminen auf die IL-4-Produktion
Nach Stimulation mit PHA-P, TT, IL-2 und Anti-CD3-Ak konnte eine signifikante
gesteigerte Produktion von IL-4 nur in den Versuchen mit PHA-P erreicht werden. Zu
den Zeitpunkten 12h und 24h kann ein deutlicher Einfluss auf die IL-4-Produktion der
PHA-P-stimulierten PBMC beobachtet werden. Nur die Katecholamine in der hohen
Dosierung Adrenalin 10-5 M als auch Noradrenalin 10-5 M reduzieren die IL-4Produktion
signifikant.
Weder
α-
noch
β-Rezeptorantagonist
heben
die
Katecholaminwirkung signifikant auf. Im Vergleich zum Katecholamineinfluss auf die
IL-6- (bis -46,9%) und IFN-γ- (bis –80,8%) Produktion ist der Einfluss auf die IL-4Produktion am wenigsten stark ausgeprägt (bis –37,9%). Dieser differenzierte Einfluss
auf die Th1-/Th2-Cytokin-Produktion ist schon von mehreren Arbeitsgruppen
beobachtet worden. Insbesondere zeigten Versuche mit unterschiedlichen cAMPerhöhenden Substanzen, dass insbesondere cAMP-Spiegel-Erhöhungen auf Th1- und
Th2-Zellen unterschiedlich wirken, wobei vor allem die Th1-Cytokin-Produktion
gehemmt wird.
In der vorliegenden Arbeit liegt auch ein hemmender Einfluss von Katecholaminen auf
die IL-4-Produktion der Th2-Zellen vor, der jedoch deutlich geringer ausgeprägt ist, als
auf IFN-γ und IL-6.
In humanen PBMC zeigte sich nach Stimulation bei Koinkubation mit Theophyllin und
einem Phosphodiesterase-Hemmer eine Hemmung der Proliferation sowie eine
dosisabhängige Verminderung der IL-4- und IL-5-Sekretion durch die cAMP-
73
erhöhenden Substanzen. Dies liess sich auch an humanen Th-Zell-Linien beobachten
(Crocker, 1996).
Eine verminderte IL-4-Produktion konnte auch durch Theophyllin bei PBMC
atopischer Patienten nach Stimulation mit spezifischem Antigen gezeigt werden (Tohda,
1998). Bei einer cAMP-Erhöhung in murinen Th-Zell-Linien, die durch einen
Phosphodiesterase-Hemmer ausgelöst wurde, zeigte sich sogar ein stimulierender Effekt
auf die Produktion des Th2-Cytokins IL-5, während IL-4 unbeeinflusst blieb (Schmidt,
1995).
6.3.4 Differenzierter Einfluss von Katecholaminen auf Th1- und Th2-Zellen
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind mit den Ergebnissen anderer Arbeiten gut
zu vergleichen. Entgegen einer deutlichen Hemmung der Produktion von Th1Cytokinen wie z.B. des IFN-γ, sind Th2-Cytokine deutlich weniger beeinflussbar
(Mohede, 1996, Yoshimura, 1998). Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden
konnte, ist dieser Mechanismus β2-Adrenozeptor-vermittelt. An der Erklärung für die
differenzierte Katecholaminwirkung auf Th1-/Th2-Zellen scheinen verschiedene
Faktoren beteiligt zu sein.
Ein Grund für die unterschiedliche Katecholaminempfindlichkeit der Th-Zellen kann in
einer unterschiedlichen β2-Adrenozeptorexpression liegen. Ramer-Quinn et al.
untersuchten die unterschiedliche Expression von β2-Adrenozeptoren auf murinen ThZell-Klonen. Es konnte gezeigt werden, dass die β2-Adrenozeptoren nur auf Th1Zellen, jedoch nicht auf Th2-Zellen nachweisbar waren. Nach Stimulation mit AntiCD3-Ak führten Terbutalin und Noradrenalin zu einer Abnahme der IL-2-Produktion,
wohingegen die IFN-γ-Produktion nicht signifikant beeinflusst wurde. Der Effekt liess
sich durch β-Adrenozeptor-Antagonisten wieder aufheben (Ramer-Quinn, 1997). Das
vermeintliche Fehlen von β-Adrenozeptoren auf Th2-Zellen wurde an murinen ThZellen untersucht. So ist es möglich, dass bei humanen Th2-Zellen eventuell β2Adrenozeptoren vorliegen, was von Aktivierungsgrad und Differenzierungsgrad
abhängig sein kann. Es ist noch nicht bekannt, wann Th0-Zellen bei ihrer
Differenzierung zu Th2-Zellen die β2-Adrenozeptoren nicht mehr exprimieren. Eine
unterschiedliche Expression der β2-Adrenozeptoren auf Th1- und Th2-Zellen kann
jedoch erklären wie die unterschiedliche Wirkung der Katecholamine auf die Zellen und
74
die Cytokin-Produktion zustande kommt. So scheint die selektive Modulation der
Cytokin-Produktion der Th1-und Th2-Zellen teilweise durch die unterschiedliche
Dichte der Zellen an β2-Adrenozeptoren erklärbar zu sein. Gegen ein völliges Fehlen an
β2-Adrenozeptoren auf humanen Th2-Zellen sprechen die vorliegenden Ergebnisse.
Auch die IL-4-Produktion liess sich durch Katecholamine hemmend beeinflussen.
Ein weiterer Grund für die unterschiedliche Katecholaminwirkung auf Th-Zellen liegt
an einer unterschiedlich starken Empfindlichkeit der Cytokin-Produktion auf die second
messenger. β2-Adrenozeptor-Stimulation führt zu einer Erhöhung an cAMP. Es zeigte
sich, dass auch Substanzen, die das intrazelluläre cAMP unabhängig von β2Adrenozeptoren erhöhen, die Produktion von Th-1-Cytokinen z.B. IFN-γ hemmen,
während auf Th2-Cytokine z.B. IL-4, IL-5 kein oder nur ein geringgradiger Einfluss
besteht (Snijdewint, 1993, Munoz, 1990, Novak, 1990, Betz, 1991).
Mit PHA stimulierte PBMC bildeten nach Zugabe eines Phosphodiesterase-Hemmers
als cAMP-erhöhende Substanz deutlich weniger Th1-Cytokine wie IL-2 und IFN-γ, die
Th2-Cytokine IL-4 und IL-5 wurden weniger stark inhibiert (Yoshimura, 1998). Nur
höchste Konzentrationen eines Phosphodiesterasehemmers Typ IV hemmten die
Produktion der Th2-Cytokine. Die Zugabe eines β-Adrenozeptoragonisten verstärkte
den Einfluss der Phosphodiesterase-Hemmer. Untersuchungen über das Vorliegen von
β2-Adrenozeptoren auf Th-Zellen zeigten, dass diese nur auf Th1-, nicht jedoch auf
Th2-Zellen nachgewiesen werden konnten (Sanders, 1997). Mohede et al. (1996)
beobachteten hingegen, dass der lang wirkende β2-Agonist Salmeterol in PBMC, die
mit PHA stimuliert wurden, die Produktion sowohl von IL-4 als IFN-γ hemmend
beeinflusste. Salmeterol in niedriger Dosierung (<10-9 M) vermochte die IL-4-, jedoch
nicht die IFN-γ-Produktion hemmend zu beeinflussen. Untersuchungen zeigten, dass
β2-Adrenozeptor-Agonisten in der Konzentration <10-9 M keine messbar erhöhten
cAMP-Spiegel mehr bewirken (Feldmann, 1987). Miura konnte einen Effekt niedrig
dosierter
β-Adrenozeptor-Agonisten
auf
Ca2+-abhängige
K+-Kanäle
glatter
Atemwegsmuskelzellen zeigen (Miura, 1992). Diese Kanäle konnten auch auf
Lymphozyten nachgewiesen werden, woraus sich ein möglicher Katecholamineffekt auf
die Th1-/Th2-Cytokin-Produktion über die Ca2+-abhängigen K+-Kanäle vermuten liesse.
In Untersuchungen mit einem K+-Kanal-Blocker konnte die Katecholaminwirkung auf
die IL-4-Produktion aber nicht beeinflusst werden (Mohede et al., 1996).
75
Eine sehr differenzierte Wirkung von Prostaglandin E2 als cAMP-erhöhende Substanz
auf die Th-Cytokin-Produktion konnte auch Snijdewint in seiner Arbeit demonstrieren
(Snijdewint, 1993). Während die Produktion von IFN-γ und IL-2 durch Prostaglandin E2
gehemmt wurde, zeigte sich eine sehr viel weniger starke Reduktion für IL-4 und IL-5.
Für IL-5 konnte in Gegenwart von Prostaglandin E2 in niedriger Dosierung sogar eine
Steigerung der Produktion beobachtet werden. Dies könnte in einer unterschiedlich
starken Empfindlichkeit der Expression der Th1- bzw. Th2-Cytokine gegenüber cAMP
liegen.
Munoz zeigte in einer Arbeit den Einfluss von Cholera-Toxin und Forskolin auf murine
Th-Zellen. Beide Substanzen führten in Th1- und Th2-Zellen zu einem signifikanten
cAMP-Anstieg. Nur die Th1-Zellen aber nicht die Th2-Zellen wurden in ihrer
Proliferation gehemmt. Während die IL-2-Produktion in den Th1-Zellen deutlich
gehemmt wurde, fand sich kein Einfluss auf die IL-4-Produktion der Th2-Zellen. Auch
Novak und Rothenberg (1990) konnten den differenzierten Einfluss auf die Th1-/Th2Cytokin-Produktion durch cAMP-Analoga demonstrieren, wobei nur Th-1-Cytokine
betroffen waren. Gajewski et al. konnten zeigen, dass Katecholamine über einen cAMPAnstieg zwar nicht die Cytokin-Produktion der Th2-Zellen beeinflussen, aber die
Proliferation gehemmt wird (Gajewski, 1990). Vorstellbar ist daher, dass neben der
Proliferation auch andere cAMP-abhängige Th2-Zell-Effektor-Funktionen beeinflusst
werden können.
In humanen T-Zell-Linien wies Holen eine signifikante Hemmung der IL-4- und IL-5Produktion in Gegenwart von β2-Adrenozeptoragonisten nach. Insgesamt konnten
starke individuelle Unterschiede der Beeinflussung nachgewiesen werden. So zeigte
sich einmalig auch eine Verstärkung der IFN-γ-Produktion. (Holen, 1998).
In Untersuchungen von Ramer-Quinn et al. zeigte sich, dass der Einfluss von
Katecholaminen und auch cAMP-erhöhender Substanzen auf die Cytokinproduktion
von Th1-/Th2-Zellen auch stark vom Differenzierungs- und Aktivierungsgrad der
Zellen abhängt. Wobei in den meisten Arbeiten murine T-Zell-Linien untersucht
wurden, um Aufschlüsse über die Reaktivität der Th-Zellen auf Katecholamine zu
bekommen, dienten hierzu Ramer-Quinn naive und primäre CD4+-Effektorzellen. Im
Gegensatz zu Arbeiten mit Th-Zelllinien zeigte sich, dass sowohl primäre Effektor-Th1als auch -Th2-Zellen in ihrer Cytokinproduktion nicht durch Noradrenalin, Terbutalin
oder cAMP-Analoga beeinflusst werden konnten. Da kein Ansprechen auf cAMP-
76
Analoga vorlag, scheint weniger eine verminderte β2-Adrenozeptorexpression
vorzuliegen, sondern eine unterschiedlich starke Empfindlichkeit bezüglich cAMP,
abhängig von der Zelldifferenzierung (Ramer-Quinn, 2000). So muss bei allen
Untersuchungen stets der Differenzierungs- und Aktivierungsgrad der Zellen in
Zusammenhang mit der Katecholamin-Exposition bewertet werden.
Lacour et al. fanden entgegen der Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und auch der
vorliegenden Arbeit eine Steigerung von IL-4 und IL-5 in aktivierten Th-Zellen durch
Gegenwart von cAMP (Lacour, 1994).
Wie obige Untersuchungen zeigen, muss man als Erklärung für die differenzierte
Katecholaminwirkung
auf
Th1-/Th2-Zellen
auch
die
Interaktion
der
Transduktionsmechanismen über second messenger von T-Zell-Stimulation und
Adrenozeptor-Stimulation heranziehen. Stimulation von T-Zellen über den T-ZellRezeptor/CD3-Komplex
(TCR)
führt
zu
einem
gesteigerten
Phosphoinositolstoffwechsel mit Bildung zweier Reaktionsprodukte mit second
messenger-Funktion: Zum einen wird Diacylglycerol (DAG) gebildet, zum anderen
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). DAG stimuliert die Proteinkinase C (PKC), über IP3
kommt es zu einer Erhöhung an freien, intrazellulären Ca2+-Ionen. Dies führt dann u.a.
zu einer verstärkten Expression an IL-2-Rezeptor- und IL-2-mRNA sowie weiterer
Cytokine (Nel, 1987). Eine volle Aktivierung von T-Zellen benötigt mindestens zwei
Signale; zum einen vom T-Zell-Rezeptor (TCR) zum anderen vom kostimulatorischen
Rezeptor CD28 (Lenschow, 1996). An der Transduktion der extrazellulären Signale in
die Zelle sind verschiedene Protein-Kinasen u.a. aus der Familie der Mitogenaktivierten-Protein-Kinasen (MAPK) beteiligt. Nach Aktivierung des TCR und
Kostimulation über CD28 kommt es zur Aktivierung bestimmter Protein-Kinasen, der
extracellular-signal-related kinase (ERK) und der c-Jun N-terminal kinase (JNK).
Eine β2-Adrenozeptor-Stimulation führt G-Protein-vermittelt über eine Aktivierung der
Adelylatcyclase zu einem Anstieg des intrazellulären cAMP.
Eine intrazelluläre cAMP-Erhöhung bei T-Zellen führt zu einer Down-Regulation der
Kinasen JNK und ERK. Untersuchungen mit spezifischen Protein-Kinase-Antagonisten
zeigten, dass diese hauptsächlich für die Th1-Cytokin-Gen-Expression bedeutend sind
und für die Th2-Cytokin-Gen-Expression eine untergeordnete Rolle spielen. Chen et al.
konnten zeigen, dass bei Th2-Zellen eine andere Kinase, die p38-MAPK, in Gegenwart
von cAMP stimuliert wird. Bei Th1-Zellen konnte nach cAMP-Erhöhung keine
77
Steigerung der Aktivität der p38-MAPK beobachtet werden. Durch Untersuchungen mit
einem spezifischen p38-Inhibitor konnte gezeigt werden, dass sowohl die Produktion
von Th1- als auch von Th2-Cytokinen von dieser Kinase abhängt (Chen, 2000).
Dies kann z.B. die Beobachtung erklären, dass in einigen Arbeiten eine Erhöhung an
intrazellulärem cAMP die Cytokin-Produktion von IL-5 sogar gesteigert hat, während
Th1-Cytokine supprimiert wurden (Gajewski, 1990, Snijdewint, 1993).
Eine weitere Erklärung für die unterschiedliche Katecholaminwirkung bei Th1/Th2Zellen scheint in der Wirkung von cAMP auf Transkriptionsfaktoren zu liegen. So führt
cAMP
über
p38-MAPK
zu
einer
verstärkten
Phosphorylierung
des
Transkriptionsfaktors GATA3, der einen wichtigen Regulator der Th2-Cytokin-GenExpression darstellt (Chen, 2000).
PHA wird zu den Lektinen gezählt, die eine T-Zell-Aktivierung und Proliferation
bewirken können. Die Wirkung auf T-Zellen erfolgt über Bindung an bestimmte
Oberflächenmoleküle, zu denen unter anderem der CD3/T-Zell-Rezeptor-Komplex
(TCR) sowie CD2 gehören. Auch die Stimulation mit Anti-CD3-Ak sowie die
Stimulation mit TT erfolgt über den TCR. IL-2 stimuliert die PBMC über Bindung an
den spezifischen IL-2-Rezeptor. Die Signaltransduktion erfolgt über die Proteinkinase
C, was zu einer T-Zell-Aktivierung mit Cytokin-Sekretion und Proliferation führt. Vor
diesem Hintergrund lassen sich auch die Ergebnisse der vorliegenden Versuche über ein
unterschiedliches Ansprechen von bestimmten Protein-Kinasen v.a. p38-MAPK auf
cAMP erklären (Tamura, 1993, Chen, 2000).
78
ß2
_
NK-
Noradrenalin
Zelle
_
_
_
_
ß2
ß2
Makrophage
APC
IFN-γ
ß2
Th1-
IL-12
ß2
IL-2
IFN-γ
TNF-ß
Tc
Zelle
??
_
Th0Zelle
Th2Zelle
_
ß2
IL-4
IL-10
IL-13
ß2
B-Zelle
PlasmaZelle
ß2
Mono-
IL-6
IL-10
zyt
?
+
+
+
Noradrenalin
Abb.28:
Darstellung des Einflusses von Katecholaminen z.B. Noradrenalin auf Th1- und Th2-Zellen
Noradrenalin hemmt die Produktion von Th1-Cytokinen und somit die Effektorzellen der zellulären
Immunität. Dagegen werden Monozyten, Plasmazellen und B-Zellen durch Katecholamine
stimuliert. Durch die fehlende Hemmung der Th1-Cytokine wird vielleicht ein Th2-Shift begünstigt.
Ob Th0-Zellen und Th2-Zellen Adrenozeptoren tragen ist noch unklar. Auf Th2-Zellen scheint eine
niedrige Dichte vorzuliegen, eventuell fehlen sie sogar.
[APC-Antigen-präsentierende Zelle, Tc-Zytotoxische T-Zelle, NK-Natürliche Killerzelle.]
79
6.4 Korrelation von β -Adrenozeptoren und Katecholaminwirkung auf die
Cytokin-Sekretion stimulierter PBMC
Bei der statistischen Auswertung lässt sich allein bei den Versuchen mit PHA als
Stimulus eine signifikante Korrelation zwischen der Katecholaminwirkung und der
Anzahl an β-Adrenozeptoren sowohl für das Cytokin IFN-γ wie auch für IL-6
nachweisen. Für IL-4 besteht keine signifikante Korrelation. In den Versuchen mit den
Stimulantien IL-2, TT und Anti-CD3-Ak korrelieren die Anzahl der β-Adrenozeptoren
nicht mit der Katecholaminwirkung auf die Cytokin-Sekretion.
Bei den Versuchen mit PHA besteht eine deutliche Korrelation zwischen β2Adrenozeptoren-Anzahl und IFN-γ sowie auch IL-6. Dies legt den Schluss nahe, dass
die Katecholaminwirkung auf die Th-Zellen über β-Adrenozeptoren vermittelt wird.
Wie gezeigt werden konnte, ist die Katecholaminwirkung durch Propranolol nicht
jedoch durch Urapidil antagonisierbar, was ebenso für einen β-Adrenozeptorvermittelten Wirkmechanismus spricht.
In Versuchen mit Substanzen, die intrazelluläres cAMP erhöhen, konnte eine
dosisabhängige Korrelation mit der Hemmung der Cytokin-Sekretion für IFN-γ wie
auch für IL-6 gezeigt werden. Die IL-4-Sekretion liess sich nur leicht beeinflussen
(Yoshimura, 1998). Wenn man davon ausgeht, das die Menge an gebildetem cAMP mit
der Dichte an β-Adrenozeptoren korreliert, lassen sich die in der vorliegenden Arbeit
erhobenen Daten im selben Sinne wie die Ergebnisse der Arbeit von Yoshimura
interpretieren.
Eine dosisabhängige Katecholaminwirkung kann auch in der vorliegenden Arbeit
gezeigt werden: Während sowohl Adrenalin wie auch Noradrenalin in der Dosierung
10-5M eine Hemmung der Cytokin-Sekretion bewirkten, kann in der Dosierung 10-9M
durch keines der beiden Katecholamine ein signifikant nachweisbarer Effekt beobachtet
werden. Ein ausreichend hoher cAMP-Spiegel für einen Effekt auf die CytokinSekretion scheint über die β-Adrenozeptoren in der niedrigen Dosierung nicht gebildet
werden zu können.
80
Dieses unterstreicht die Hypothese, dass die Katecholaminwirkung auf Lymphozyten
vornehmlich in lymphatischen Organen zur Wirkung kommt. Nur dort können über
noradrenerge Synapsen Katecholaminkonzentrationen in einer Dosierung von bis zu
10-5M auftreten (Felten, 1992). In dieser hohen Dosierung liessen sich auch in der
vorliegenden Arbeit Katecholaminwirkungen nachweisen.
Wie Baerwald et al. zeigen konnten, liessen sich bei Patienten mit Rheumatoider
Arthritis eine erniedrigte Dichte an β2-Adrenozeptoren auf PBMC nachweisen
(Baerwald, 1992b). Ebenso konnte ein verminderter Einfluss von Katecholaminen auf
Lymphozyten von Patienten mit Rheumatoider Arthritis beobachtet werden (Baerwald,
1997). Die vorliegenden Ergebnissen nach Stimulation mit PHA-P zeigen, dass eine
signifikante Korrelation zwischen der β-Adrenozeptoren-Dichte auf PBMC und dem
Katecholamineinfluss besteht, was so bisher nicht gezeigt werden konnte. Diese
Beobachtung bestätigt die Ergebnisse, dass der verminderte Katecholamineinfluss auf
PBMC von Patienten mit Rheumatoider Arthritis aller Wahrscheinlichkeit nach mit
einer verminderten β-Adrenozeptoren-Dichte zusammenhängt.
In den Versuchen mit den Stimulantien IL-2, TT und Anti-CD3-Ak konnte eine
signifikante Korrelation nicht nachgewiesen werden. Dafür können verschiedene
Ursachen als Erklärung herangezogen werden.
Die Methode der β-Adrenozeptor-Messung mithilfe eines Radioligandenbindungsassays
kann leicht beeinflusst werden. Abweichungen von der für den Assay benötigten
Zellkonzentration können das Ergebnis deutlich beeinflussen. Trotz genauem Einstellen
der Zellkonzentration sowie sorgfältigem Durchmischen der Zellsuspension vor dem
Anlegen des Assays kann dies als Fehlerquelle einen bedeutenden Einfluss auf die
Messung haben. Aus methodischen Gründen kann eine signifikante Korrelation mit der
gemessenen β-Adrenozeptoren-Zahl eventuell nur schwer nachzuweisen sein, z.B. mit
einer höheren Fallzahl.
Von vielen Substanzen ist bekannt, dass sie die β-Adrenozeptoren-Dichte auf
Lymphozyten beeinflussen können. Mit IL-2 und IL-1 β stimulierte PBMC zeigten eine
Änderung der β-Adrenozeptoren-Dichte. Ramer-Quinn konnte zeigen, dass ruhende und
81
durch Anti-CD3-Ak stimulierte Th-Zellen β-Adrenozeptoren unterschiedlich stark
exprimieren (Ramer-Quinn, 1997).
Auch spontan zeigten stimulierte PBMC im Zeitverlauf eine Abnahme der βAdrenozeptoren-Dichte (Krause, 1995).
Die Rezeptordichte muss nicht mit der Rezeptorfunktion zusammenhängen. Über βAdrenozeptoren ist bekannt, dass sie innerhalb von Stunden ihre Ansprechbarkeit auf
Stimulantien verändern können. Rezeptoren können internalisiert werden und sich
damit der Stimulation durch Katecholamine entziehen. Ausserdem kann die
Rezeptorzahl innerhalb von Stunden durch eine verminderte mRNA-Synthese und
erhöhten Abbau reduziert werden. Über eine Entkopplung des Rezeptors von dem
stimulatorischen G-Protein (Gαs) ist innerhalb von Sekunden bis Minuten eine
Modulation der Rezeptor-Funktion möglich (Rockmann, 2002).
Ramer-Quinn
et al. konnten zeigen, dass Th-Zellen abhängig von ihrem
Differenzierungsgrad unterschiedlich auf Katecholamine ansprechen. So fanden sich
Hinweise, dass frisch generierte Th-Effektor-Zellen initial, trotz intrazellulär hoher
cAMP-Spiegel, keine Änderung der Cytokin-Produktion zeigten (Ramer-Quinn, 2000).
Man kann annehmen, dass auch durch die verwendeten Stimulantien die βAdrenozeptoren-Dichte verändert wird, und somit die Ansprechbarkeit auf die
Katecholamine moduliert wird. Da in der vorliegenden Arbeit Stimulantien verwendet
wurden, die über unterschiedliche Aktivierungswege wirken, könnte dies auch die
Ursache für eine niedrige Korrelation bei den oben aufgeführten Stimulantien sein. Da
die β-Adrenozeptoren nur zu Beginn der Zellkulturanlage auf den PBMC gemessen
wurde, kann eine Veränderung der β-Adrenozeptoren-Dichte im Laufe der Versuche
nicht ausgeschlossen werden. Zusätzliche Messungen wären nötig, um einen
Zusammenhang zu untersuchen.
6.5 Klinische Bedeutung von Katecholaminwirkungen auf Th1/Th2-Zellen
Der Verlauf einer Infektion ist stark durch die Art der Immunantwort geprägt, die Th1oder Th2-dominiert ablaufen kann (Abbas et al., 1996, Mosmann et al., 1996). Sie
entscheidet u.a. über Ausmass und Dauer einer Infektion. Katecholamine können die
82
Auslenkung einer Th-Zell-Antwort in Richtung Th1 oder Th2 beeinflussen. Über
mykobakterielle Infektionen beim Menschen ist bekannt, dass deren Verlauf von der
zellulären Immunität, im speziellen von der IL-12 abhängigen IFN-γ-Sekretion,
bestimmt ist. Stress vermag das Risiko einer mykobakteriellen Infektion zu erhöhen
(Lerner, 1996). Eine Erklärung kann der erhöhte Spiegel an „Stresshormonen“ wie
Katecholaminen und Kortikoiden sein: Durch Hemmung der IL-12-abhängigen IFN-γSekretion ist die zelluläre Immunität reduziert, durch die Th2-Praedominanz scheint die
Progression der Infektion begünstigt. So kann durch ein Überwiegen des Sympathikus
über erhöhte Katecholaminspiegel eine Th1-Antwort unterdrückt und in die Richtung
einer Th2-Antwort gelenkt werden.
Bei Polytraumen und grossflächigen Verbrennungen stellt die Immunsuppression der
Patienten ein grosses Problem dar. Es kann eine Freisetzung an Katecholaminen und
eine Stimulation der hypothalamisch-hypophysär-adrenalen Achse beobachtet werden,
die mit dem Schweregrad des Traumas und der Prognose einhergeht (Jarek, 1993,
Rothwell, 1996). Untersuchungen an Patienten und im Tiermodell zeigten, dass Th1Cytokine wie IFN-γ und IL-12 vermindert produziert werden, die IL-10-Produktion
jedoch gesteigert ist (O´Sullivan, 1995, Woiciechowsky, 1998). Es ist wahrscheinlich,
dass Katecholamine über eine Th2-Praedominanz zur Immunsuppression bei schweren
Traumen beitragen.
Die Einfluss von Katecholaminen auf Krankheiten wird besonders deutlich im Rahmen
von Autoimmunerkrankungen. In zahlreichen Experimenten mit Tieren, die an einer
Autoimmunerkrankung litten, konnte die Rolle des sympathischen Nervensystems als
ein wichtiger Regulator bezüglich der Erkrankung erkannt werden. Bei vielen
Autoimmunerkrankungen lässt sich eine charakteristische Th-Zell-Praedominanz
beobachten. So herrscht eine Th1-Praedominanz bei der Rheumatoiden Arthritis (RA),
Morbus Crohn, Typ-1-Diabetes und Multipler Sklerose vor. Diese ist verbunden mit
einer gesteigerten TNF-α und IL-12-Produktion, während die Th2-Antwort und die IL10-Produktion vermindert ist (Mosmann, 1996, Elenkov, 2000). Die Th-Zell-Balance
bestimmt den Verlauf der Autoimmunerkrankungen. Im Gegensatz zu den genannten
Krankheiten herrscht beim systemischen Lupus erythematosus (SLE) eine Th2Praedominanz mit einer gesteigerten IL-10-Produktion vor (Maini, 1994).
Bei Patienten mit multipler Sklerose lassen sich auf Lymphozyten eine erhöhte βRezeptoren-Anzahl
nachweisen.
Bei
83
der
experimentellen
allergischen
Enzephalomyelitis (EAE), der Modellkrankheit für Multiple Sklerose, scheinen
Katecholamine einen protektiven Effekt zu besitzen. Wiegmann berichtete über einen
milderen Verlauf der EAE bei Ratten nach Gabe von β-Rezeptor-Agonisten
(Wiegmann, 1995). Nach chemischer Sympthektomie nahm die EAE bei Ratten einen
schwereren Verlauf (Chelmicka-Schorr, 1988). Muthyala zeigte darüber hinaus, dass bei
Ratten mit EAE β-Rezeptor-Agonisten eine Reduktion der IFN-γ-Produktion und eine
Verminderung der β-Rezeptoren-Anzahl bewirkten (Muthyala, 1995).
Bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA) konnte eine erniedrigte Dichte an β2Rezeptoren auf PBMC nachgewiesen werden (Baerwald, 1992a, 1992b; Krause, 1992).
Ebenso zeigte sich ein reduzierter Katecholamineffekt auf OKT3-aktivierte PBMC bei
Patienten mit RA (Baerwald, 1997). Wahle et al. konnten einen Zusammenhang
zwischen der Krankheitsaktivität und der Katecholaminwirkung auf Lymphozyten bei
Patienten mit Rheumatoider Arthritis nachweisen (Wahle et al., 1999). Im Tiermodell
der Arthritis führte die Sympathektomie zu einem schwereren Verlauf der Erkrankung
(Felten, 1992).
Der Einfluss von Katecholaminen auf Th1/Th2-Zellen kann sowohl in vivo als auch in
vitro gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit hemmen die Katecholamine v.a. die
IFN-γ-Produktion. Die IL-4-Produktion wird zwar signifikant aber in deutlich
geringerem Ausmass gehemmt. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass
Katecholamine vor allem die Th1-Zellen hemmend beeinflussen. Man muss postulieren,
dass Katecholaminen bei der Entstehung von Krankheiten sowie dem Krankheitsverlauf
eine unterschätzte Bedeutung zukommt. Es wird angenommen, dass bei einem
erniedrigten Sympathikotonus eine Th1-Praedominanz und das Entstehen einer
Autoimmunerkrankung begünstigt sein kann. Pharmakologische Beeinflussungen der
Th1/Th2-Balance können unter Umständen bei bestimmten Krankheitsbildern von
therapeutischem Nutzen sein.
84
7. Zusammenfassung
Das Immunsystem wurde lange Zeit als ein autonomes, sich selbst regulierendes System
betrachtet. In den letzten zwei bis drei Jahrzehnten fand man zunehmend Hinweise auf
funktionelle
Zusammenhänge
zwischen
sympathischem
Nervensystem
und
Immunsystem. Es zeigte sich, dass Katecholamine das Immunsystem in seiner Funktion
differenziert modulieren können.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von Noradrenalin und Adrenalin auf die
Cytokin-Produktion von PBMC, nach Stimulation mit TT, PHA-P, Anti-CD3-Ak und
IL-2. Gemessen werden die Cytokine IL-4, IFN-γ und IL-6 sowie die Anzahl an β2Rezeptoren auf den PBMC. Durch Zugabe von α- oder β-Rezeptor-Antagonisten soll
erkannt werden, über welchen Adrenozeptor-Typ die Katecholaminwirkung erfolgt. Es
wird untersucht, ob die Katecholaminwirkung mit der Anzahl an β2-Rezeptoren
korreliert.
Nach der Separation der PBMC mittels Isopaque-Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation
werden die Zellen in Kultur genommen und mit TT, PHA-P, Anti-CD3-Ak und IL-2.
stimuliert. Gleichzeitig werden Adrenalin und Noradrenalin in den Dosierungen 10-5M
und 10-9M sowie die α- oder β-Rezeptor-Antagonisten
Urapidil und Propranolol
hinzugegeben. Zu Beginn der Zellkultur wird die Anzahl an β2-Rezeptoren über einen
Radiorezeptorassay mit dem Radioliganden
125
Iodocyanopindolol bestimmt. Zu den
Zeiten 12h, 24h, 48h und 72h werden die Cytokine IL-4, IFN-γ und IL-6 in den
Zellkulturüberständen mittels ELISA gemessen.
Katecholamine wirken bei allen vier Stimulantien signifikant hemmend auf die
Produktion von IFN-γ. Dieser Effekt kann durch Propranolol signifikant antagonisiert
werden, Urapidil zeigt keinen Einfluss. Die Katecholaminwirkung wird somit über β2Rezeptoren vermittelt. Eine Beeinflussung über α-Adrenozeptoren lässt sich nicht
beobachten. Sowohl Adrenalin als auch Noradrenalin wirken hemmend auf die IFN-γProduktion, jedoch nur in der Dosierung 10-5M.
Nur bei den Versuchen mit PHA-P zeigt sich eine signifikante Hemmung der IL-6Produktion; die IL-6-Produktion nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak und TT lässt sich
85
nicht signifikant hemmen. Nach IL-2-Stimulation wird keine signifikante IL-6Produktion beobachtet. Zu einer Hemmung der IL-6-Produktion kommt es in
Gegenwart von Noradrenalin und Adrenalin sowohl in der Dosierung 10-5M wie auch
10-9M. Eine signifikante Antagonisierung durch Urapidil und Propranolol lässt sich
nicht beobachten.
Zu einer deutlichen IL-4-Produktion kommt es nur in den Versuchen nach Stimulation
mit PHA-P. Sowohl Adrenalin als auch Noradrenalin in der Dosierung 10-5M hemmen
die IL-4-Produktion signifikant. Dieser Einfluss lässt sich durch Propranolol teilweise,
jedoch nicht signifikant antagonisieren. Die Hemmung der Cytokine IFN-γ und IL-6
durch Katecholamine ist wesentlich ausgeprägter als die von IL-4.
Die supprimierende Wirkung der Katecholamine auf die IFN-γ-Produktion korreliert in
den PHA-P-Versuchen signifikant mit der Anzahl an β2-Rezeptoren. Dies spricht neben
der antagonisierenden Wirkung von Propranolol dafür, dass die in der vorliegenden
Arbeit nachgewiesenen Katecholamineffekte β-Rezeptor-vermittelt sind.
Über eine unterschiedlich stark ausgeprägte Inhibition der Th-Zellen mit einer stärkeren
Hemmung des Th1-Cytokins IFN-γ und einer deutlich geringeren Hemmung des Th2Cytokins IL-4, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, können Katecholamine die
Immunantwort modulieren. Weitere Studien sind notwendig, um die Wirkung des
sympathischen Nervensystems auf die Th-Zellen zu klären. Pharmakologische
Beeinflussungen der Th1/Th2-Balance können unter Umständen bei bestimmten
Krankheitsbildern von therapeutischem Nutzen sein.
86
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98
9. Anhang
9.1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ACTH
Adrenocortikotropisches Hormon
Ak
Antikörper
AMP
Adenosinmonophosphat
Anti-CD3-Ak
Anti-CD3-Antikörper
ATP
Adenosintriphosphat
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
CD
Cluster of differentiation
cpm
counts per minute
CRH
Cortikotropine releasing hormone
DAG
Diacylglycerol
dpm
Desintegrations per minute
E
Epinephrin (Adrenalin)
ELISA
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
FACS
Fluorescence-Activated-Cell-Sorting
FSS
Ficoll-Separating-Solution
G-Protein
Guanin-Nukleotid-bindendes Protein
GTP
Guanosin-Triphosphat
GDP
Guanosin-Diphosphat
HBSS
Hank´s Balanced Salt Solution
ICYP
125 Iodocyanopindolol
IFN-γ
Interferon-γ
IL
Interleukin
Ig
Immunglobulin
IP3
Inositol-1,2,3-trisphosphat
Kd
Dissoziationskonstante
LPS
Lipopolysaccharid
MHC
Major histocompatibility complex
NE
Norepinephrin (Noradrenalin)
NK
Natürliche Killer-Zellen
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
PHA-P
Phythaemagglutinin-P
99
Prop
Propranolol
RIA
Radioimmunoassay
Stdabw.
Standardabweichung
Th-Zellen
T-Helfer-Zellen
TT
Tetanustoxoid
Tc
zytotoxische T-Zelle
TCR
T-Zell-Rezeptor
Urap
Urapidil
ZNS
Zentrales Nervensystem
100
9.2 Mittelwerte, Standardfehler (standard error of the mean) und Anzahl
der Messungen
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 12h
Adrenalin
Stim E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
69,2
72,3
74,6 85,8
68,8
77,6
SF
0
15,8
13,3
10,6 14,4
10,6
18,6
Mittelwert
938,6 721,4
757,1
744,3 842,9
677,1
720
[pg/ml]
SF
187 254,4
270,9
224,5 235,9
197,6
220,8
N
7
7
7
7
7
7
7
Noradrenalin Stim NE-5 NE-5+α
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
93,4
93,4
101,4 112,8
110,5
101,4
SF
0
15,7
15,7
18,9 21,4
18,7
14,2
Mittelwert
938,6 862,8
825,7
978,6 1055, 1065,7
934,2
[pg/ml]
7
SF
N
7
7
7
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 24h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
100
81,1
94,1
110,6 125
117
114,5
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
0
20,9
1604, 1114,2
2
587,1 347,8
7
7
Stim NE-5
100
74,9
0
8,3
1604, 1278,6
2
587,1 434,6
7
7
25
941,4
280,2
7
NE-5+α
77,1
12,4
1342,9
556,3
7
20,7 35,4
19,7
25,1
1560 1698, 1631,4 1547,1
6
525,1 646,7
517,2
530,1
7
7
7
7
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
117,9 119,3
105,7
97,7
23,5
28
15,5
17,3
1561,4 1572, 1637,1 1561,4
8
540,2 594,3
660
647,4
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 48h
Stim
E-5
E-9
Adrenalin
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
100
73,5
0
6,1
1397, 1077,1
1
320,2 287,7
7
7
Stim NE-5
100
83,3
0
6,8
1397, 1208,6
77,4
14,3
1074,2
287,1
7
NE-5+α
79
4,9
1057,1
101
90,1 86,9
78,6
76,2
16,2
9,5
10
10,2
1114,2 1145, 1165,7 1045,7
7
278,2 280,5
346,8
280,3
7
7
7
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
53,1 59,4
95,8
89,9
10,5
9,9
25,2
19,1
842,9 914,2 1112,8
1160
[pg/ml]
SF
n
1
320,2
7
310,6
7
221,3
7
294,4
7
290
7
265,8
7
273,8
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 72h
Stim
E-5
E-9
Adrenalin
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
100
64,7
0
17,6
1861,
1340
4
269,2 466,5
7
7
Stim NE-5
100
86,7
0
5,8
1861, 1658,6
4
269,2 321,9
7
7
74,8
14
1514,2
393,1
7
NE-5+α
85,6
6,3
1595,7
289,7
7
70,7
64
8,6 13,3
1350 1250
71,1
11,6
1374,2
71,3
11
1338,6
252,3 345,8
345,6
309,0
7
7
7
7
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
69,6 72,6
59
72,5
14,4 15,2
13,3
15,5
1251,4 1354, 1222,8 1508,6
2
285,7 357,3
396,6
490,4
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-4-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 12h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
74,3
67,3
70,6 89,9
89,8
89,7
SF
0
6,1
6,8
6,1
6,2
6,2
6,4
Mittelwert
78,6
55,3
50,8
51,7 69,1
71,1
68,8
[pg/ml]
SF
16,9
13,1
12,9
11,4 16,4
17
14,7
n
15
15
15
15
15
15
15
Noradrenalin Stim NE-5
NE-5+α
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
100
0
78,6
62,1
6,3
43,4
70,9
7
47,1
80,2
6,6
55,8
89,3
5,6
67,9
90,5
5,2
69,9
92,3
6,4
69,1
16,9
15
9,8
15
10,4
15
11,3
15
14,2
15
15,1
15
14,5
15
Einfluss der Katecholamine auf die IL-4-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 24h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
75,4
73,5
78 87,2
91,5
88,5
SF
0
3,6
4,4
4,9
5
4,7
5,2
Mittelwert
73,2
54,6
52,3
54,1 62,6
66,9
65,5
[pg/ml]
SF
12,7
9,8
9,3
9,6 11,4
11,7
12,1
n
15
15
15
15
15
15
15
Noradrenalin Stim NE-5
NE-5+α
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
71,8
71,7
78,7 89,3
88,7
89,1
SF
0
5,5
5,9
4,8
6,1
5
5,6
102
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
73,2
47,6
46,3
54,2
63,6
63,6
62,4
12,7
15
8,1
15
7,5
15
9,3
15
11,7
15
11,1
15
10,7
15
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 12h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
611,4
E-5
19,2
5,9
102,8
E-5+α
9,1
3,6
60
110,7
7
Stim
100
0
611,4
378,4
7
NE-5
26,6
6
142,9
338,1
7
NE-5+α
28
5,6
162,8
110,7
7
35,2
7
40,9
7
E-9
E-5+β
35,9 87,6
7,7
7
254,3 545,7
E-9+α
60,7
13,2
367,1
E-9+β
73,3
13,4
431,4
740,9 126,6
123,4
127,8
7
7
7
7
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
81,9 91,9
93,5
103,7
10,8 13,6
16,2
13,3
467,1 562,8
582,8
581,4
94,7 109,3
7
7
122,1
7
100,9
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 24h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
2175,
7
526,3
7
Stim
100
0
2175,
7
526,3
7
E-5
30,3
10,5
442,8
E-5+α
20,6
6,2
402,8
135,3
7
NE-5
17,2
5,9
332,8
113,4
7
NE-5+α
16,2
6,7
317,1
100,1
7
116,9
7
E-9
E-5+β
E-9+α
E-9+β
30,5 94,7
87,6
89,2
7,9
8
11,5
9,6
705,7 2252, 2202,8 2081,4
8
191,4 673,1
697,3
612,1
7
7
7
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
78,8 93,5
88,3
85,6
12,7
7,5
5,1
9,6
1551,4 1937, 1918,6 1735,7
1
404,9 433,1
496,9
411,2
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 48h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
4901,
4
1209,
9
7
E-5
15,3
4
695,7
E-5+α
16,6
3,5
737,1
194,8
207,7
7
7
103
E-9
E-5+β
34 93,3
7,6
8,2
1535,7 4608,
6
503,5 1211,
5
7
7
E-9+α
83,7
6,9
4408,6
E-9+β
80,7
9,2
4348,6
1311,6
1354,5
7
7
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim NE-5
100
23,4
0
3,9
4901, 1127,1
4
1209, 319,7
9
7
7
NE-5+α
25,3
3,7
1037,1
291,9
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
74 79,5
98,8
98,6
9,4 14,5
11,5
14,4
3571,4 3957, 4741,4 4668,6
1
1079,9 1327, 1303,3 1256,8
7
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit PHA-P nach 72h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
E-5
100
23,8
0
4,2
5334, 1178,6
2
1483, 378,3
9
7
7
Stim NE-5
100
29,7
0
7
5334, 1715,7
2
1483, 648,9
9
7
7
E-5+α
21,9
5,4
1164,2
475,9
7
NE-5+α
26,6
6,3
1582,9
652,4
7
E-9
E-5+β
E-9+α
E-9+β
43,2 106,2
93,6
89,6
9,9
7,3
4,3
4,1
2252,9 5482, 5141,4 5042,9
8
869,2 1439, 1501,1
1508
7
7
7
7
7
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
86,5 94,3
97,6
92,9
12
8,1
8,7
10,5
4914,2 5225, 5335,7 5182,9
7
1464,3 1522 1509,7 1463,3
7
7
7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit IL-2 nach 12h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
15,6
E-5
121,4
47,8
8,8
E-5+α
95,9
30,7
6,6
8,3
5
Stim
100
0
15,6
4,1
5
NE-5
206,9
62,8
15,4
3,6
5
NE-5+α
110,5
23,2
12,6
8,3
5
5,7
5
5,7
5
E-5+β
57,3
23,2
9
E-9
81,8
10,3
10,8
E-9+α
346,8
208
14,6
E-9+β
232,4
119,1
17,2
4,8
5,5
5,7
8,2
5
5
5
5
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
219,4 195,8
83,4
84,3
76,5 78,9
24,1
27,1
15,2 15,8
17
15
5,8
5
7,5
5
10
5
8,3
5
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit IL-2 nach 24h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Stim
100
0
E-5
117,3
65,9
E-5+α
64,5
24,7
104
E-5+β
83,8
18,1
E-9
92,1
15,2
E-9+α
105,3
55,5
E-9+β
91,9
40,8
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
74
39,4
34,2
48,3
5
Stim
100
0
74
21,8
5
NE-5
60,4
18,2
47,6
21,5
5
NE-5+α
60
12,7
32,6
48,3
5
36,6
5
20,7
5
46,8
63,8
59,8
65,6
30,9 40,2
42,8
48
5
5
5
5
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
91,7 100,9
96,8
100,6
24,7 36,2
26,9
18,1
49,4 62,2
48,4
59,8
31,1
5
45,4
5
30,3
5
38,9
5
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit IL-2 nach 48h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
198,8
E-5
44,9
10,9
97,4
E-5+α
44,1
14,2
79,6
115,2
5
Stim
100
0
198,8
60,8
5
NE-5
50,7
11,6
112,6
42,6
5
NE-5+α
52,1
14,4
82
115,2
5
79,7
5
45,9
5
E-9
E-5+β
107,7 133,3
50,8 38,7
126,2 169
E-9+α
88,4
26
148,8
E-9+β
75,2
12,6
157,4
75 78,9
99,6
108,9
5
5
5
5
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
71,7 107,5
138,4
111,2
13 41,4
75,2
36
132,8 154,8
134,2
151,8
78,8
5
97,6
5
70,5
5
83,7
5
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit IL-2 nach 72h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
303,2
E-5
43,2
14,8
148,4
E-5+α
39
12,8
111,4
142,4
5
Stim
100
0
303,2
86,9
5
NE-5
53,4
6,2
177,4
53,4
5
NE-5+α
38,5
6,4
126,8
142,4
5
104,6
5
69
5
E-9
E-5+β
43,1 100,9
14,2
17
146,2 240,4
E-9+α
87,9
20,3
217,4
E-9+β
84,3
15,4
203,6
85,6 89,3
99,8
81
5
5
5
5
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
63,7
72
73,5
76,1
6,2 15,7
17,6
8
203,4 252,8
208,6
227,2
105,6 140,8
5
5
90,9
5
102,1
5
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit TT nach 48h
Adrenalin
Mittelwert %
Stim
100
E-5
57,5
E-5+α
56,3
105
E-5+β
74,1
E-9
83
E-9+α
84,5
E-9+β
88,4
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
0
166,4
8,7
95,1
9
91,7
31
7
Stim
100
0
166,4
25,3
7
NE-5
65,9
7,6
106,3
25,3
7
NE-5+α
65
9,6
107,9
31
7
23,5
7
28,7
7
8,7
120,3
4,9
138
3,9
141,7
6,2
145
27,8 28,2
27,2
27,8
7
7
7
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
78,8 93,1
88,1
89,5
9,1
8,3
6
7,2
127,1 146,1
141,6
141,4
29
7
25,7
7
24,9
7
24,7
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit TT nach 72h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
271,4
E-5
73,8
5,7
195,3
E-5+α
68,6
8,8
179,4
39,2
7
Stim
100
0
271,4
30
7
NE-5
81,1
3,7
214,7
33,2
7
NE-5+α
85,7
3,3
225,7
39,2
7
28,3
7
26,1
7
E-9
E-5+β
82,3 94,6
7,4
4,4
219,6 252,1
E-9+α
107,1
11,8
293,1
E-9+β
98,1
2,7
265,1
37,9 35,6
55,2
37,4
7
7
7
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
89,1 110,5
99,6
85,4
6,7 13,2
2,4
10,2
232 304,3
269,7
226,3
29,3
7
59,1
7
39
7
42,5
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit TT nach 48h
Adrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Stim
100
0
179,7
E-5
94,7
2,5
170
E-5+α
93,6
2,8
167,3
20,9
7
Stim
100
0
179,7
19,6
7
NE-5
102,9
4,6
182
17,9
7
NE-5+α
101,1
5,6
176,3
20,9
7
18,2
7
16,5
7
E-9
E-5+β
93,8 97,7
3,2
3,2
168,4 173,1
E-9+α
96,4
4,3
170,6
E-9+β
94,8
4,3
168,6
20,1
22
17,7
18,5
7
7
7
7
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
96,2 98,3
89,3
91,3
2,6
5,1
4,3
5,6
171,3 175,4
156,3
165,7
19,1
7
20
7
13,6
7
22,2
7
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit TT nach 72h
Adrenalin
Stim
E-5
E-5+α
106
E-5+β
E-9
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
100
0
211
96,1
2,2
201,9
94,5
0,7
199,8
17,7
7
Stim
100
0
211
16,6
7
NE-5
96,7
5
205,6
17,8
7
NE-5+α
88,8
2,9
188,3
17,7
7
22,9
7
18,5
7
97
93
3
3,9
202,4 193,1
92,9
3,4
195,3
86,1
2,9
181,4
14,4 15,6
17
16,9
7
7
7
7
NE-9
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
98,2 96,1
94,9
96
3,2
3,1
4,1
3,9
206,9 201
200,4
200,3
18,8
7
15,4
7
19,6
7
15,6
7
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 12h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
60
48,5
74,7 90,5
54,4
66,1
SF
0
10,2
12,9
10,7
7,2
13
11,1
Mittelwert
410 181,7
123,3
241,7 378,3
233,3
285
[pg/ml]
SF
136,1 457,1
290,6
639,5 146,5
109,6
120
n
6
6
6
6
6
6
6
Noradrenalin Stim NE-5
NE-9
NE-5+α
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
67
77,6
83,1 80,2
93,8
81,6
SF
0
9,8
11,2
3,8
6
6,4
4,4
Mittelwert
410
222
248,3
325 318,3
356,7
326,7
[pg/ml]
SF
136,1
59,6
58,8
108 115,3
111
114,7
n
6
6
6
6
6
6
6
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 24h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100 132,5
233,9
154,6 151,1
217,3
202,1
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
Noradrenalin
Mittelwert %
SF
Mittelwert
[pg/ml]
SF
n
0
735
62,9
190
145,7
275
340
6
Stim
100
0
735
46,4
6
NE-5
85
35,3
148,3
68,7
6
NE-5+α
84,5
29,6
271,6
340
6
44,5
6
127,4
6
107
67,8 33,9
398,3 761,6
167,5
6
NE-5+β
189,2
102,3
715
87,9
758,3
66,4
845
326,6
298,2
359
6
6
6
NE-9 NE-9+α NE-9+β
215,7
183,9
189
123,7
97
95,9
783,3
761,7
798,3
314,1 342,5
6
6
349,4
6
363,8
6
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 48h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
26,8
30,5
91,1 122,1
87,6
71,7
SF
0
8,5
7,4
18,7 21,7
15,7
15,8
Mittelwert
2290 316,6
433,3
1566,6 2441,
2560 1936,7
[pg/ml]
7
SF
952,1 113,4
176,6
688,4 1051, 1124,5
1091
1
n
6
6
6
6
6
6
6
Noradrenalin Stim NE-5
NE-5+α
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
43,2
52
63,1 60,9
84,3
82
SF
0
14,2
9,2
12,3 11,3
9,2
10,8
Mittelwert
2290
605
900
1973,3 1813, 2033,3
2150
[pg/ml]
3
SF
952,1 246,7
404,1
862 850,6
985,1 1016,4
n
6
6
6
6
6
6
6
Einfluss der Katecholamine auf die IFN-γ-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 72h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
11,7
10,4
20,7 51,5
62,7
64
SF
0
2,7
1,9
7,8 20,9
24,7
25
Mittelwert
3155
345
300
660 1590 1861,7
1905
[pg/ml]
SF
962,5
92,5
86,3
294 706,7
821,4
837,6
n
6
6
6
6
6
6
6
Noradrenalin Stim NE-5
NE-5+α
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
14,9
15,7
45,4 51,7
48,5
51,8
SF
0
4,8
5,3
17,8 20,1
20,5
21,7
Mittelwert
3155
450
468,3
1383,3 1533,
1480
1600
[pg/ml]
3
SF
962,5
178
177,8
621,3 650,1
684,6
760,4
n
6
6
6
6
6
6
6
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 24h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
86,2
86,7
86,3 90,2
88,1
85,3
SF
0
3,3
3,2
4,2
4,4
2,4
8,9
Mittelwert
2675
2325
2328,3
2321,7 2391,
2355
2315
[pg/ml]
7
SF
282 284,4
266,2
282,9 237,5
255,8
332,8
n
6
6
6
6
6
6
6
Noradrenalin Stim NE-5
NE-9
NE-5+α
NE-5+β
NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
85,3
93
87,9 93,1
96,4
93,4
SF
0
2,6
9,3
4,2
6,4
6,7
4
Mittelwert
2675 2307,7
2553,3
2333,3 2433 2518,3 2468,3
108
[pg/ml]
SF
n
282
6
296,1
6
449,3
6
234,4 200,9
6
6
206,3
6
224,9
6
Einfluss der Katecholamine auf die IL-6-Werte nach Stimulation mit Anti-CD3-Ak
nach 48h
Adrenalin
Stim
E-5
E-9
E-5+α
E-5+β
E-9+α
E-9+β
Mittelwert %
100
87
90,9
87,7 98,7
101,5
90
SF
0
5,9
7,8
4,3
6,3
5
2,8
Mittelwert
3368, 2951,7
3040
2935 328,3
3400
3030
[pg/ml]
3
SF
179 278,4
274
163,3 178,3
205,2
186
n
6
6
6
6
6
6
6
Noradrenalin Stim NE-5
NE-5+α
NE-5+β NE-9 NE-9+α NE-9+β
Mittelwert %
100
91,1
87,7
84,6 92,3
92,2
90,4
SF
0
4,3
5,2
4,4
4,7
7
3,7
Mittelwert
3368, 3076,7
2950
2855 3091,
3090 3038,3
[pg/ml]
3
7
SF
179 230,2
228,6
221,7 183,7
257,6
190,3
n
6
6
6
6
6
6
6
109
9.3 Anzahl der gemessenen β -Adrenozeptoren
PHA 1
PHA 2
PHA 3
PHA 4
PHA 5
PHA 6
PHA 7
PHA 8
PHA 9
PHA 10
PHA 11
PHA 12
PHA 13
PHA 14
PHA 15
β-AdrenozeptorenAnzahl
3736
3906
1667
2101
3893
4194
2285
1919
1789
3456
1893
2856
3045
1244
2638
IL-2 1
IL-2 2
IL-2 3
IL-2 4
IL-2 5
IL-2 6
1996
3576
3282
2352
1300
2304
Anti-CD3-Ak 1
Anti-CD3-Ak 2
Anti-CD3-Ak 3
Anti-CD3-Ak 4
Anti-CD3-Ak 5
Anti-CD3-Ak 6
1470
2202
2955
2183
2915
3338
TT 1
TT 2
TT 3
TT 4
TT 5
TT 6
TT 7
1828
3591
4363
2759
3670
3630
2603
Mittelwert
Min
Max
Stdabw.
n
2733,5
1244
4363
873,8
34
Versuch
110
9.4 Die akademischen Lehrer
Amon, Arnold, Aumüller, Aurich, Barth, Basler, Bauer, Baum, Baumgaertel, Beato,
Berger, Bertalanffy, Bien, Blankenburg, Braasch, Brilla, Daume, Daut, Doss,
Drenckhahn, Effendy, Egbring, Eichborn, Eisele, Elsässer, Eschenbach, Feddersen,
Feuser, Fruhsdorfer, Fuhrmann, Ganz, Garten, Geks, Gemsa, Geus, Gieler, Göke,
Golenhofen, Gotzen, Gressner, Griss, Happle, Hartmann, Jonas, Joseph, Jungclas,
Kaffarnik, Katschinski, Kern, Klein, Kleinsasser, Klenk, Klose, Klotter, Knaepler,
Koecke, Koolmann, Koop, v. Kraft, Kraus, Krause, Kretschmer, Krieg, Kroll, Kuni,
Kußmann, Küster, Lang, Lange, Lauer, Lernberg, Lennartz, Leppek, Lill, Loberth,
Lorenz, Lütcke, Maisch, Mannheim, Massarat, Mennell, Moll, Moog, Moosdorf,
Mueller, Mutters, Netters, Neubauer, Neumann, Neurath, Nies, Noll, Oepen, Oertel,
Orth, Peter, Petermann, Pfab, Podszus, Radsak, Rager, Remschmidt, Renz, Richter,
Riedmiller, Rinze, Rieger, Rodeck, Rothmund, Rüschoff, Schachtschabel, Schäfer,
Schlenzka, Schmidt, Schmidt-Rohde, Schmitz-Moormann, Schneider, Schnorpfeil,
Schüffel, Schu, Schuler, Schulz, Schulze, Schwarz, Schwerk, Seyberth, Siegrist,
Slenzka, Sprenger, Steiniger, Steinmetz, Stiletto, Straub, Strauer, Strempel, Sturm,
Thomas, Unsicker, Vohland, Voigt, Wagner, Walthers, Welcke, Weihe, Werner,
Westermann, v. Wichert, Willenbockel, Wolf, Zwiorek.
111
9.5 Danksagung
Mein allergrösster Dank gilt meinen Eltern für die Ermöglichung des Studiums und
stete Unterstützung.
Herrn Professor Dr. P. von Wichert danke ich für die Überlassung des Themas der
Dissertation, Ermöglichung dieser Arbeit sowie für die Übernahme des Referates.
Herrn Professor Dr. med. Christoph Baerwald gilt ein besonders herzlicher Dank für die
methodische Anleitung, inhaltliche Unterstützung und freundliche Betreuung.
Herrn Dr. med. M. Wahle danke ich für zahlreiche Gespräche und insbesondere für
hilfreiche Hinweise zur praktischen Durchführung.
Mein Dank gilt ausserdem den Mitarbeitern des Rheumalabors der Universität Marburg
für ihr Entgegenkommen.
Herzlich möchte ich auch meinem Mitdoktoranden Herrn Dr. med. Jakob von
Engelhardt für die ausserordentlich freundliche Arbeitsatmosphäre danken.
112