Nachweis von N- Acyl-L- homoserin
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Nachweis von N- Acyl-L- homoserin-lactonen bei Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien vorgelegt von Nina Schomacker Bremen, im März 2007 Inhaltsverzeichnis i Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Zellkommunikation („Quorum sensing“)............................................ 4 1.2. Nachweis von N-Acyl-L-homoserin-lactonen mit bakteriellen Biosensoren........................................................................................... 7 1.3. Ziele der Arbeit.......................................................................................9 2. Material/Methoden 2.1. Verwendete Bakterien und ihre Herkunft............................................ 11 2.2. Nährmedium, Anzucht, Stammhaltung................................................12 2.2.1. Nährmedium zur Anzucht von Mikroorganismen..................................... 12 2.2.2. Kultivierung und Zellernte........................................................................ 15 2.3. Nachweis von N-Acyl-L-homoserin-lactonen..................................... 16 2.3.1. Isolierung von AHL- Molekülen aus Zellkulturüberständen.................... 16 2.3.2. Bakterielle Reportersysteme zum Nachweis von N-Acyl-L– homoserin-lactonen................................................................................. 17 2.3.2.1. Chromobacterium violaceum CVO27...................................................... 17 2.3.2.2. Pseudomonas aureofaciens I.................................................................. 17 2.3.2.3. Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)............................................. 18 2.3.3. Detektion von AHL- Molekülen mit Sensorbakterien............................... 18 2.3.3.1. Identifizierung AHL produzierender Bakterien mittels Platten-Tests....... 18 2.3.3.2. Auswertung der Platten-Tests................................................................. 19 2.3.3.3. Identifizierung AHL produzierender Bakterien mittels Medium-Tests...... 19 2.3.3.4. Auswertung des Medium-Tests............................................................... 20 2.3.3.5. Detektion von AHL Molekülen mittels DünnnschichtChromatographie (DC)............................................................................ 20 2.3.3.5.1. Prinzip der Dünnschicht-Chromatographie (DC).................................... 20 2.3.3.5.2. Überschichtung der DC Platten............................................................... 21 2.3.3.6. Auswertung der überschichteten Platten................................................. 22 2.3.5. Ermittlung der Rf- Werte.......................................................................... 22 Inhaltsverzeichnis 3. Ergebnisse 3.1. Bestimmung der Spezifität und Sensitivität der verwendeten AHL i Sensorstämme....................................................................................... 23 3.1.1. Der AHL Sensor C. violaceum CVO26.................................................... 23 3.1.2. Der AHL Sensor P. aureofaciens I...........................................................25 3.1.3. Der AHL Sensor A. tumefaciens pZLR4.................................................. 25 3.2. Die Produktion von AHL Molekülen bei Cyanobakterien................... 27 3.3. Die Produktion von AHL Molekülen bei Heterotrophen Bakterien... 30 4. Diskussion 4.1. Nachweis von AHL Molekülen mit bakteriellen Biosensoren............33 4.2. Vergleich der Biosensoren hinsichtlich ihrer AHL Detektionsfähigkeit................................................................................35 4.3. Vergleich der AHL Produktionen der getesteten Bakterien.............. 36 5. Zusammenfassung................................................................................ 38 6. Ausblick.................................................................................................. 39 7. Literaturverzeichnis...............................................................................40 Abkürzungsverzeichnis ACP Acyl- acyl- Trägerprotein AHL N-Acyl-L-homoserin-lacton APCI- MS atmospheric pressure chemical ionization mass Spectrometrie BHL N-(butanoyl)-L-homosein-lacton bzw. Beziehungsweise °C Grad Celsius DAD UV Photodioden array DC Dünnschicht-Chromatographie DHL N-(decanoyl)-L-homoserin-lacton DNA Desoxy- Ribonukleinsäure Gfp Grün fluoreszierendes Protein h Stunde H20dest destilliertes Wasser HSL N- (hexanoyl)-L-homoserin-lacton l Liter LB Luria-Bertani Lsg. Lösung M Molar MS Massenspektroskopie NMR Nuclear Magnetic Resonance OHHL N- (3-oxohexanoyl)-L-homosein-lacton OHL N-(octanoyl)-L-homosein-lacton PAR Photosynthetically Active Radiation rpm Umdrehungen pro Minute Rf Retentionsfaktor RT Raumtemperatur SAM S- Adenosyl-Methionin TMM Trace-metal-mix t-RNA transfer- Ribonukleinsäure X-GAL 5-Chlor-4-Brom-indolyl-ß-D-galactosid z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil 4 Einleitung 1. Einleitung 1.1. Zellkommunikation („Quorum sensing“) Quorum sensing wird als die Regulation der Genexpression in Antwort auf Schwankungen in der Zellpopulationsdichte beschrieben (MILLER; BASSLER, 2001). Dieser Prozess wird als die wichtigste intrazelluläre Reaktion zwischen Bakterien verstanden. Quorum sensing nutzt ein niedermolekulares chemisches Signal, welches auch als Autoinducer bekannt ist. Beinahe alle Autoinducer gehören der Familie der N-oxo-Acyl-homoserin-lactonen (HSL) an (SZENTHE; PAGE, 2003). Das chemische Signal (Autoinducer) wird in sehr geringen Mengen von einer bakteriellen Zelle abgesondert. Ein Anstieg in der Konzentration der Autoinducer (Autoinducer sind frei diffusionsfähig durch die Zellmembran) spiegelt somit proportional die Dichte an Bakterien in der Umgebung wieder. Mit einer bestimmten „treshold“ Konzentration an Autoinducern wird ein Wechsel in der Genexpression erzielt (MILLER; BASSLER, 2001). Gram-positive sowie Gram-negative Bakterien nutzen Quorum sensing Kommunikation um unterschiedliche physiologische Aktivitäten zu regulieren. Gram-negative Bakterien nutzen Acyl-homoserin-lactone als Autoinducer und Grampositive Bakterien produzieren Oligopeptide zum kommunizieren. Quorum sensing konnte zum ersten Mal vor über 30 Jahren bei den zwei biolumineszenten Bakterien Vibrio fischeri sowie Vibrio harveyi nachgewiesen werden. In beiden Spezies wird das Enzym, das für die Licht Produktion verantwortlich ist, durch das Luciferase operon luxCDABE kodiert. Die Lichtemission wird dabei durch eine hohe Zelldichte ausgelöst in Antwort auf die Anreicherung abgesonderter Autoinducer (MILLER; BASSLER, 2001). Die Quorum sensing Reaktionen beinhalten 2 regulatorische Proteine, die als LuxI und LuxR Proteine bezeichnet werden. Das LuxI Protein ist für die Biosynthese der spezifischen Acyl-homoserinlacton Signal- Molekülen (Autoinducer) verantwortlich. Die LuxR Proteine binden die Autoinducer (AHL) und der LuxR- Autoinducer Komplex aktiviert wiederum die Zielgen- Transkription. 5 Einleitung Aufgrund der Detektion dieser zwei Proteine in V. fischeri wurden Proteine anderer Bakterien mit gleicher Funktion als LuxI bzw. LuxR Homologons bezeichnet (MILLER; BASSLER, 2001). Die Tabelle 1.1. zeigt die für diesen Versuch interessanten Bakterien mit ihren spezifischen LuxI/LuxR Homologons, den produzierten Autoinducern sowie den dadurch regulierten Funktionen. Tab. 1.1.: Bakterien, die LuxI/luxR Homologons aufweisen: die regulatorischen Proteine, die produzierten Autoinducer und die regulierenden Funktionen (modifiziert nach MILLER; BASSLER, 2001) Bakterium Vibrio fischeri LuxI/LuxR Homologons LuxI/ LuxR produzierte Autoinducer Zielgen und Funktion N- (3-oxohexanoyl)- HSL luxICDABE (Biolumineszenz) Violacein Pigment, Chromobacterium violaceum CviI/ CviR N-hexanoyl-HSL Wasserstoffcyanid, Antibiotika, Exoproteasen und chitinolytische Enzyme Pseudomonas aureofaciens Agrobacterium tumefaciens PhzI/ PhzR N-hexanoyl-HSL TraI/ TraR N-(3-oxooctanoyl)-HSL phz (Phenanzin Antibiotika Biosynthese) tra, trb (Ti Plasmid conjungierte Übertragung) Die Bildung von Acyl-homoserin-lactonen erfolgt mit Hilfe zweier Substraten: SAdenosyl-Methionine (SAM) und dem Acyl-acyl-Trägerprotein (Acyl-ACP). SAM dient als Vorläufer für die Membranphospholipid- Phosphatidylcholine und als Donor für Methylgruppen für die Nukleinsäuren und anderen Methylierungsreaktionen. Im Weiteren ist SAM ein Substrat für andere synthetische Reaktionen (Biotin und Polyamine) und für verschiedene ungewöhnliche t-RNA Modifikationen (FUQUA; GREENBERG, 2002). Acyl-ACP ist ein Intermediat der Fettsäure Biosynthese. Die LuxI Proteine binden ein spezifisches Acyl-ACP an SAM über eine Amidbindung zwischen der AcylSeitenkette des Acyl-ACP´s und der Aminogruppe des Homocystein-Restes von SAM. In der anschließenden Lactonisierung der ligierten Intermediate sowie der 6 Einleitung damit einhergehenden Abspaltung von Methylthioadenosin resultiert die Bildung der HSL Autoinducer (Abb.1.1.) (MILLER; BASSLER, 2001). Das LuxR Protein ist ein auf Acyl-HSL reagierender Transkripionsaktivator. Die LuxR Proteine können in zwei funktionelle Domänen untergliedert werden basierend auf sequenzkonservierte Cluster. Ein konservierter Cluster von Resten in dem aminoterminalen Bereich von LuxR Proteinen beinhaltet eine Acyl- HSL- Bindungsregion. Im Weiteren weisen alle funktionellen LuxR Proteine ein helix-turnhelix-motif am Carboxyl-Terminus auf, welches für die DNA Bindung benötigt wird (FUQUA; GREENBERG , 2002). Die Interaktion mit Acyl-AHL`s durch die aminoterminale Domäne löst einen Konformationwechsel aus, der eine Multimerisation sowie die Bindung an die DNA stimuliert. Die multimerischen LuxR Proteine erkennen konservierte DNA Sequenzen upstream der Zielgene (auch lux- box genannt) und aktivieren diese (Abb. 1.1.) (FUQUA; GREENBERG, 2002). Die LuxR-AHL-Komplexe regulieren z.B. die luxI AHL-Synthase-Gene positiv und bildet damit eine positive Induktionsschleife. Abb. 1.1.: Model von Acyl-homoserin-lacton vermitteltem Quorum sensing in einer einzelnen bakteriellen Zelle (FUQUA; GREENBERG, 2002). Die Acyl-AHL`s wurden in vielen verschiedenen Proteobakterien identifiziert. Dabei gibt es eine beträchtliche strukturelle Vielfalt zwischen Acyl-AHL´s von verschiedenen Bakterien und sogar zwischen verschiedenen Acyl-AHL´s, die von 7 Einleitung einem gleichen Bakterium synthetisiert wurden. Die Acyl-Länge kann variieren zwischen 4 und 14 Kohlenstoff Atomen (C4, C6, C8) oder sich durch Modifikation an Position C-3 (3-Oxo oder 3-Hydroxygruppe) unterscheiden (GEISENBERGER, 2000). Die Abbildung 1.2. zeigt die bisher identifizierten Autoinducer mit ihren chemischen Strukturen sowie z.T. mit ihren Strukturformeln: Abb. 1.2.: Strukturformeln und Molekulargewichte bisher identifizierter AHL´s (nach GEISENBERGER, 2000) 1.2. Nachweis von N-Acyl-L-homoserin-lactonen mit bakteriellen Biosensoren Als Biosensoren können biologische Nachweisbakterien für N-Acyl-homoserinlactonen und damit für LuxI homologe Gene eingesetzt werden. Sie haben den Vorteil einer höheren Selektivität sowie Sensibilität gegenüber technischen Verfahren (GEISENBERGER, 2002). Die Biosensoren zeichnen sich im Weiteren durch eine phänotypische Nachweisreaktion aus. Eine positive Reaktion kann durch einen deutlichen Farbumschlag erkennbar werden. Bei C. violaceum CVO26 wird die Anwesenheit von AHL´s durch die Produktion des violetten Violacein detektierbar. Bei A. 8 Einleitung tumefaciens NTL4 (pZLR4) wird der AHL Nachweis durch eine blaue Färbung infolge der Spaltung von X- Gal durch AHL induzierte ß- Galaktosidase identifizierbar. Die verwendeten Biosensoren reagieren dabei auf synthetische AHL´s sowie auf AHL´s, die von anderen Bakterien produziert wurden. Dabei spielt natürlich die Konzentration, Struktur sowie die Größe des zu untersuchenden Acyl-homoserinlactons eine entscheidende Rolle. Der Biosensor C. violaceum CVO26 reagiert z.B. auf AHL´s mit Acyl-Seitenketten von C4-C8, jedoch nicht auf AHL´s mit einer 3Hydroxy Modifikation sowie auf AHL´s mit Seitenketten, die größer als C10 sind (STEINDLER, VENTURI, 2006; MCC LEAN et al., 1997). Der Biosensor A. tumefaciens (pZLR4) reagiert hingegen auf ein breites Spektrum an AHL´s. Er detektiert substituierte 3oxo AHL Derivate mit Acyl-Ketten mit einer Länge von C4-C12 sowie 3-unsubstituierte AHL´s, mit der Ausnahme von C4-AHL´s. Im Weiteren reagiert der Sensor pZLR4 auf 3-Hydroxy-AHL´s (STEINDLER, VENTURI, 2006; FARRAND, 2002). Damit weist jeder Biosensor seine eigene spezifische Sensibilität gegenüber bestimmten AHL´s auf. Da jedoch die verwendeten Biosensoren nicht auf alle AHL´s reagieren, müssen neue Reportersysteme mit Hilfe gentechnischer Methoden konstruiert werden, die je nach Einsatzzweck eine größere Auswahl und damit größere Sensitivität ermöglichen. Es sind bisher neben den schon erwähnten Biosensoren viele weitere Biosensoren konstruiert worden: z.B. bioluminezente Sensorplasmide mit lux basierten Reporter Plasmiden (z.B. pSB403 und pSB1075; pSB536, pSB401) (GEISENBERGER, 2000; WINSON et al., 1998) sowie Reporterstämme, die mit dem Reporterprotein Gfp konstruiert wurden (ANDERSEN et al., 1998, 2000; HONG WU et al., 2000). Neben diesen Neukonstruktionen gibt es noch weitere rekombinierte Sensoren, die z.B. auf eine phzB::inaZ Genfusion in P. aureofaciens (WOOD et al. 1997,1999) oder auf eine SinI::LacZ Fusion in Sinorhizobium meliloti (LLAMAS et al., 2004) beruhen. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden zur AHL Detektion mittels Biosensoren wird in Abbildung 1.3. dargestellt: 9 Einleitung AHL AHL LuxR Platten Test LuxICDABE Dünnschicht-chromatografie Medium Test Abb.1.3.: Konstruktion und Nutzen von bakteriellen Biosensoren. (Im oberen Bereich ist die Struktur eines AHL´s zu sehen. Das AHL reagiert mit dem LuxR Protein innerhalb des Biosensors, wodurch die Transkription des Zielgens aktiviert wird. Der AHL Biosensor wird anschließend im unteren Bereich in a) einem Platten-Test (der Kreis zeigt einen Tropfen Überstand der untersuchten Bakterien an und die blaue Färbung zeigt eine phänotypische positive Reaktion auf AHL´s) b) eine Dünnschicht-Chromatographie mit anschließender Überschichtung mit dem Sensor (Biosensor detektiert phänotypisch die Stellen, an denen AHL´s sind (blaue Färbung)) c) einem Medium-Test (Reporterstamm wird mit Überständen der zu testenden Bakterien inkubiert, blaue Färbung zeigt ein positives Ergebnis) eingesetzt). 1.3. Ziele der Arbeit In der vorliegenden Arbeit sollten ausgewählte Cyanobakterien sowie ausgewählte heterotrophe Bakterien (der Überstand sowie die Biomasse) auf ihre Fähigkeit hin, AHL´s zu produzieren, untersucht werden. 10 Einleitung Im Weiteren sollte die Sensitivität sowie Selektivität verschiedener eingesetzter Biosensoren, hinsichtlich ihrer Fähigkeit AHL´s nachzuweisen, untersucht und verglichen werden. Als Methode zur AHL Detektion sollte das Verfahren der Dünnschicht- Chromatographie (DC) nach SAW et al. (1997) sowie der Modifikation nach GEISENBERGER (2000) angewendet werden. Ebenfalls sollten nach GEISENBERGER (2000) Platten-Tests und Medien-Tests durchgeführt werden. Durch die angewandte DC in Verbindung mit den Biosensoren sollten produzierte AHL´s verschiedener Teststämme detektiert und durch Ermittlung der Rf- Werte charakterisiert werden. 11 Material/Methoden 2. Material/Methoden 2.1. Verwendete Bakterien und ihre Herkunft Tab. 2.1.: Darstellung der verwendeten Bakterien mit ihrer Eigenschaft und Herkunft Bakterium Fischerella ambigua Fischerella sp. Eigenschaft Herkunft Abteilung Marine Mikrobiologie, erhalten aus dem Testorganismus Drittmittelprojekt MONA von Fr. Prof. König, Bonn Abteilung Marine Mikrobiologie erhalten aus dem Testorganismus Drittmittelprojekt MONA von Fr. Prof. König, Bonn Oscillatoria limnetica Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Jörg Rethmeier Chromobacterium violaceum CVO26 Biosensor Universität Oldenburg Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) Biosensor FARRAND et al., 2002 Agrobacterium tumefaciens NTL4 Wildtyp FARRAND et al., 2002 Agrobacterium tumefaciens NTL4 ( pTiC58accR) Negativkontrolle FARRAND et al., 2002 Pseudomonas aureofaciens I Biosensor PIERSON III., 2000 Pseudomonas aureofaciens ICE Positivkontrolle PIERSON III., 2000 Pseudomonas aureofaciens Gag Negativkontrolle PIERSON III., 2000 Pseudomonas aureofaciens wt Wildtyp PIERSON III., 2000 Muricauda aquimarina (Bo 10-09) Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Anina Hube Rhodobaca sp. (Bo 10-19) Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Anina Hube Roseobacter sp. (Bo 10-20) Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Anina Hube Porphyrobacter sp. (Bo 53-33) Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Anina Hube noch nicht identifiziert (Bo 53-45) Testorganismus Abteilung Marine Mikrobiologie, isoliert von Anina Hube Vibrio fischeri DSM 2168 Positivkontrolle DSMZ, 2006 Vibrio sp. Positivkontrolle Max- Panck Institut, Bremen 12 Material/Methoden Tab.2.2.: Liste der ausgewählten Cyanobakterien sowie ihre taxonomische Einordnung und ihre Abteilungszugehörigkeit nach RIPPKA et al. (1979) Stamm und Abteilungszugehörigkeit Isolat nach RIPPKA et al. (1979) Ordnung Oscillatoriales (Unterabteilung III) Oscillatoria limnetica Bo 18 Ordnung Stigonematales (Unterordung V) Fischerella ambigua Fischerella sp. Tab.2.3.: Liste der ausgewählten heterotrophen Bakterien und ihre Identifizierung (nach Anina Hube) Stammbezeichnung Identifizierung nach Sequenzierung (Anina Hube) Bo 10-09 Muricauda aquimarina (Bacteroidetes) Bo 10-19 Rhodobaca sp. (alpha-Proteobacteria) Bo 10-20 Roseobacter sp. YS- 57 (alpha-Proteobacteria) Bo 53-33 Porphyrobacter sp. KK 348 (alpha -Proteobacteria) Bo 53-45 ??? (Bacteroidetes) 2.2. Nährmedium, Anzucht, Stammhaltung 2.2.1. Nährmedium zur Anzucht von Mikroorganismen Tab. 2.4.: Zusammensetzung des Luria Bertani (LB)- Mediums (nach BERTANI, 1951) Komponenten Trypton/Pepton Hefeextrakt NaCl Agar Wasserdest pH g/L 10 5 10 14 auf 1000 ml auffüllen 7,4 13 Material/Methoden Tab. 2.5.: Zusammensetzung des Leuchtbakterien (L)- Mediums (nach MPI, Bremen) Komponenten CaCl2 2 H2O Glycerin Hefeextrakt KCl MgSO4 7 H2O NaCl Pepton Agar Wasserdest. g/L 1 3 3 0,5 9 20 5 14 auf 1000ml auffüllen Tab. 2.6.: Zusammensetzung des LB- Softagars Komponenten Hefeextrakt NaCl Pepton Agar Wasserdest. pH g/L 0,75 0,75 1,5 0,6% auf 150 ml auffüllen 7,4 Tab. 2.7.: Zusammensetzung des DSM- Medium Komponenten Fleischextrakt Pepton Agar Seewasser g/L 10 10 16 750 ml Wasserdest. 250 ml 14 Material/Methoden Tab. 2.8.: Zusammensetzung des künstlichen Seewassermediums ASN III/2+ (RIPPKA et al., 1979) Komponenten NaCl MgCl2 6 H2O KCl MgSO4 7 H2O g/l oder ml/ l 12,5 1 0,25 1,75 CaCl2 2 H2O 0,25 NaNO3 0,75 Wasserdest. auf 900 ml auffüllen Na2CO3 (in 100 ml Wasserdest.) K2HPO4 3 H2O (4g/l) Eisen- Ammonium- Citrat (6g/l) 0,75 2,5 ml 0,25 ml Vitamin B12 (0,01g/l) Spurenelement- lsg. 0,5 ml 0,5 ml Tab.2.9.: Zusammensetzung des AB Minimal Mediums (CHILTON et al., 1974) Komponenten CaCl2 2 H2O g/l oder mg/l 0,01 FeSO4 7 H2O Glucose KCl K2HPO4 3 H2O 2,5 mg 0,01 0,15 0,3 MgSO4 7 H2O 3 NaH2PO4 1 NH4Cl 1 Wasserdest. auf 1000 ml auffüllen 15 Material/Methoden Tab. 2.10.: Zusammensetzung des BG-11+ Mediums (RIPPKA et al., 1979) Komponenten g/l K2HPO4 3 H2O 0,04 NaNO3 MgSO4 7 H2O 1,5 0,08 CaCl2 2 H2O Citric acid 0,04 0,006 Fe- NH4- Citrat EDTA 0,006 0,001 Na2CO3 0,002 Wasserdest. TMM A5 + Co* auf 995 ml auffüllen 1ml Tab. 2.11.: Zusammensetzung des Trace metal mix (TMM) Komponenten g/100 ml H3BO4 MnCl2 4 H2O 0,04 1,5 ZnSO4 7 H2O 0,08 NaMoO4 2 H2O 0,04 0,006 CuSO4 5 H2O Co(NO3)2 6 H2O Wasserdest. 0,006 auf 100 ml auffüllen 2.2.2. Kultivierungsbedingungen/ Zellernte Die Cyanobakterien wurden bei 21°C und bei einem konstanten Photonenfluss von 1E m-2 S-1 PAR (Photosynthetically Active Radiation) kultiviert. Die untersuchten Kulturen von Fischerella sp., Fischerella ambigua und Oscillatoria limnetica waren unicyanobakteriell. Die Kulturen von Fischerella sp. sowie Fischerella ambigua wurden in BG-11+ und die Kultur von Oscillatoria limnetica in ASNIII/2+ Medium bei 110 rpm kultiviert. Die Anzucht der Stämme von A. tumefaciens, P.aureofaciens sowie von C. violaceum erfolgte entweder auf agarhaltigen Nährböden in Petrischalen oder als Flüssigkultur auf einem Schüttler in Erlenmeyerkolben. Die eben genannten 16 Material/Methoden Bakterienstämme wurden bei 21°C und 70 rpm kultiviert. Als Medium diente für die A. tumefaciens Stämme LB- oder AB Minimal Medium, für die anderen beiden Bakterien wurde das LB Medium verwendet. Der Stamm von Vibrio fischeri wurde in DSM Medium und der Stamm vom unbekannten Vibrio in Leuchtbakterien Medium bei 4°C kultiviert. Die heterotrophen Bakterien wurden in ASNIII/2+ Medium zuzüglich 1% Hefeextrakt bei 21°C kultiviert. Zur Herstellung zellfreier Kulturüberstände wurden die Flüssigkulturen bei 10000 g für 40 min zentrifugiert und anschließend steril filtriert. 2.3. Nachweis von N-Acyl-L-homoserin-lactonen 2.3.1. Isolierung von AHL- Molekülen aus Zellkulturüberständen Die Gewinnung der AHL Extrakte erfolgte zum einen aus 5 ml (SAW et al., 1974) und zum anderen aus 250 ml Zellkulturüberständen (GEISENBERGER, 2002). Die steril filtrierten 250 ml Überstände wurden dazu in einen 1000 ml Scheidetrichter vorgelegt und mit 2100 ml Dichlormethan versetzt. Die 5 ml Überstände wurden entweder mit 25 ml Ethylacetat (99,8% HPLC grade, Aldrich) (SAW ET AL., 1974) oder mit 25 ml Dichlormethan (Quality upgraded, Fluka) (modifiziert nach GEISENBERGER) in einem Reagenzglas versetzt. Durch kräftiges Schütteln für ca. 2 min (GEISENBERGER, 2002) wurden die Phasen getrennt. Dabei ist zu beachten, dass der Scheidetrichter beim Schütteln ausreichend belüftet werden muss, um einen ausreichenden Druckausgleich zu gewährleisten (sonst Explosionsgefahr!). Nach dem Schütteln wurde so lange gewartet bis sich beide Phasen voneinander deutlich getrennt haben. Die Dichlormethan- oder Ethylacetat-phasen wurden anschließend in einem 250 ml (für die 250 ml Extraktion) bzw. 50 ml Erlenmeyerkolben (für die 5 ml Extraktion) aufgefangen und nach einer zweiten Extraktion mit dem jeweiligen Lösungsmittel vereinigt. Zur Extraktion der bakteriellen Biomasse wurde diese mit etwas Dichlormethan versetzt (10 ml) und in einem Homogenisator (Jürgens, Janke und Kunkel, IKA Werk, Ultra Turax, TR 50) für etwa 2-3 min homogenisiert. Anschließend wurde der Extrakt ebenfalls in einen Scheidetrichter vorgelegt und mit Dichlormethan versetzt und wie die Überstände weiter behandelt. Um zurückgebliebenes Wasser zu entfernen wurde 17 Material/Methoden eine Spatelspitze wasserfreies Natriumsulfat unter kräftigem Rühren zu den Dichlormethan-Wasser-Emulsionen gegeben. Die gefilterten Extrakte (Sartorius 3hw) wurden daraufhin entweder in einem Rotationsevaporator (VV2011, Heidolph) bei einer Wasserbadtemperatur bei 42°C (OB 2001, Heidolph) ohne Anlegen eines Vakuums eingedampft (bei dem Dichlormethanextrakt (200 ml) dauert das Eindampfen ca. 4 h) oder für ca. 1 Woche unter dem Abzug stehen gelassen. Der Rückstand wurde anschließend in 50-100 l (5 ml Extrakte) oder 100- 250l (250 ml Extrakte) Ethylacetat aufgenommen. 2.3.2. Bakterielle Reportersysteme zum Nachweis von N-AcylL-homoserin-lactonen 2.3.2.1. Chromobacterium violaceum CVO27 Chromobacterium violaceum kommt üblicherweise im Boden oder im Wasser vor. C. violaceum zeichnet sich durch die Produktion eines wasserunlöslichen violetten Pigments mit antimikrobieller Wirkung aus. Die Bildung des Pigmentes hängt von der Zelldichte ab (siehe „Quroum sensing“). Bekannt ist, dass C. violaceun hauptsächlich N- hexanoyl-L-homoserin-lactone (HHL) produziert. Durch eine mini-Tn5 Transposon Mutagenese wurde eine doppelte Tn5 Insertion erreicht und damit eine Mutante generiert, die unfähig ist Violacein zu produzieren (CVO26) (MCCLEAN et al., 1997). Obwohl CVO26 keine eigenen AHL´s produziert, reagiert es auf künstliche oder fremde AHL´s durch Bildung des violetten Violaceins. Damit eignet es sich hervorragend als Biosensor. 2.3.2.2. Pseudomonas aureofaciens I Das Bakterium P. aureofaciens kann aus Weizen isoliert werden. Es schützt Weizen vor allen Schädigungen, die durch den Weizenpathogen Gaeumannomyces graminis var. Tritici ausgelöst wird. Der Schutz rührt von der Produktion des orange farbenden Antibiotikums Phenazin (CHANCEY et al., 1999). Material/Methoden 18 In der Mutante P. aureofaciens 30-84 I ist das phzI Gen (welches für die endogene AHL Synthase kodiert) inaktiviert. Der Mutantenstamm ist somit unfähig seine eigenen AHL´s zu produzieren und erscheint gelblich- weiß. Die exogenen AHL Signale, die durch andere Bakterien produziert wird, führen dazu, dass der Stamm 30-84I wieder Phenazin produzieren kann und sich somit wieder orange färbt. Das hauptsächlich produzierte AHL- Molekül von P. aureofaciens ist Nhexanoyl-L-homoserin-lacton (HHL) (WOOD et al., 1997). 2.3.2.3. Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) A.tumefaciens wird üblicherweise aus Pflanzen isoliert. Es induziert Tumorwachstum in anfälligen Wirtspflanzen durch Übertragung seiner T- DNA. Die genetische Information für die Wurzel- Tumor- Bildung ist in das Pflanzengenom eingefügt. Diese T-DNA (=transferred DNA) liegt nicht auf dem Chromosom der Agrobakterien, sondern auf einem Plasmid (Ti-Plasmid = tumor-induzierendes Plasmid) (FARRAND et al., 2002). Die Mutante NTL4 (pZLR4) ist ein Klon, der Inserts von dem Vektor pTiC58 enthält, die a) eine traG:lacZ fusion und b) traR beinhalten (FARRAND et al., 2002). Um produzierte AHL´s nachweisen zu können, wurde das Gen (lacZ), welches den traI Promoter kodiert mit dem Gen für ß-Galaktosidase fusioniert. Liegen nun AHL Moleküle in einer bestimmten Konzentration vor („treshold“), so führt dies zu einer Expression der ß-Galaktosidase und damit zu der Umsetzung von X- Gal (5-Chlor-4Brom-3-indolyl-ß-D-Galaktosid) zu einem blauen Farbstoff. Hauptsächlich wird von A. tumefaciens N-oxohexanoyl-L-homoserin-lacton (OHHL) produziert. 2.3.3. Detektion von AHL- Molekülen mit Sensorbakterien 2.3.3.1. Identifizierung AHL produzierender Bakterien mittels Platten-Tests 19 Material/Methoden - Mit den Biosensoren C. violaceum CVO26 und P. aureofaciens I: Bei dieser Technik wurde der Biosensor auf eine LB-Medium-Platte ausgestrichen und auf die ausgestrichene Kultur etwa 100 l zellfreier Kulturüberstand des, auf AHL´s zu testenden Bakteriums gegeben. Die Platte wurde dann bei 21°C für etwa 48h inkubiert. - Mit dem Biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4): Bei dieser Technik wurde eine Übernachtkultur des Biosensors mit LB-Softagar (Zugabe 1/3 Kultur) und 60 g/ml X-Gal (Zugabe nach dem Autoklavieren bei etwa 40°C) vereint und in Petrischalen ausgegossen. In die Mitte des Mediums wurde anschließend mit einer sterilen Pasteurpipette ein Loch gebohrt, in das etwa 100 l zellfreier Kulturüberstand, der auf AHL´s zu testenden Bakterien gegeben. 2.3.3.2. Auswertung der Platten-Tests Die Auswertung der Platten-Tests erfolgte je nach verwendetem Reportersystem: - C. violaceum CVO26: Nach Inkubation der Agarplatten bei 21°C für ca. 48 h konnten AHL produzierende Stämme anhand der charakteristischen violetten Pigmentierung des Sensorsstammes nachgewiesen werden. - P. aureofaciens I: Nach Inkubation der Agarplatten bei 21°C für ca. 48 h sollten AHL produzierende Stämme anhand der charakteristischen orange-farbenden Pigmentierung des Sensorsstammes nachgewiesen werden. - A. tumefaciens NTL4 (pZLR4): Nach Inkubation der Agarplatten bei 21°C für ca. 62 h konnten AHL produzierende Stämme anhand der charakteristischen blauen Färbung des Sensorbakterium-Agars nachgewiesen werden Material/Methoden 20 2.3.3.3. Identifizierung AHL produzierender Bakterien mittels Medien-Tests Bei dieser Methode wurde zu einer bestimmten Menge an LB Medium 1/3 einer Übernachtskultur (angesetzt 1 ml Übernachtskultur in 50 Medium) des Biosensors in einen Erlenmeyerkolben gegeben. Zusätzlich wurden 60 g/ml X-Gal sowie 1 ml des zellfreien Kulturüberstandes, des zu testenden Bakteriums zugegeben. Die Erlenmeyerkolben wurden anschließend auf einen Schüttler bei 70 rpm bei 21°C für mindestens 62 h inkubiert. 2.3.3.4. Auswertung der Medien-Tests Nach Inkubation der Kolben für mindestens 62 h wurde die AHL Produktion der getesteten Bakterien durch eine blaue Färbung des Mediums sichtbar. 2.3.3.5. Detektion von AHL Molekülen mittels DünnnschichtChromatographie (DC) 2.3.3.5.1. Prinzip der Dünnschicht-Chromatographie (DC) Die Chromatographie kann als Trennmethode definiert werden, bei der eine gelöste Substanzmischung mit Hilfe eines Flüssigkeitsstromes über eine stationäre Phase geleitet und dabei in die einzelnen Bestandteile der Mischung aufgetrennt wird (LOTTSPEICH; ZORBAS, 1998). Bei der in diesem Versuch angewanden Reversed-phase-Chromagraphie findet eine hydrophobe Wechselwirkung des Analyten mit der unpolaren stationären Phase im polaren, wässrigen Lösungsmittel statt. Als polares Lösungsmittel wurde eine Mischung aus 60% Methanol (Chromanorm for HPLC, Gradient grade VWR, Prolabo) sowie 40% Wasserdest. verwendet. Als stationäre Phase wurde in diesem Fall ein Kieselgel als 21 Material/Methoden Trägersubstanz benutzt, welches mit Alkylresten in der Länge von C18 (n-Octadecyl) substituiert wurde (RP-18 F254s, 2020 cm, Merck, Darmstadt, D). Entlang einer Auftragslinie wurden 1,5 cm vom unteren Rand sowie von den beiden Seitenrändern entfernt im Abstand von etwa 2 cm ca. 1-4 l der Proben aufgetragen und mit einem Fön auf mittlerer Stufe getrocknet. Der Boden der DC-Kammer wurde bis zu einer Höhe von ca. 0,5 cm mit dem polaren Lösungsmittel bedeckt. Die Sättigung der Kammer mit dem Laufmittel konnte anhand von Kondenstropfen am Deckel beobachtet werden. Die Platten wurden anschließend in die Kammer gestellt, wobei zu beachten war, dass die Lösungsmittelfront deutlich über dem Laufmittel lag. Die Lösungsmittelkombination benötigt etwa 4-5 h bis die Lösungsmittelfront ca. 4 cm vom oberen Rand der DC-Platten entfernt ist. Die Platte wurde anschließend aus der Kammer genommen, die Laufmittelfront markiert und unter dem Abzug trocknen lassen. Die Platten konnten zur weiteren Verwendung in Frischhaltefolie eingewickelt werden und bei -20°C gelagert werden. 2.3.3.5.2. Überschichtung der DC Platten Zur Detektion der verschiedenen AHL´s auf der DC-Platte, wurden diese mit einer etwa 0,5 cm hohen Schicht Softagar überschichtet. Der Softagar beinhaltete den Biosensor. Zur Überschichtung Plexiglasrahmen wurde gelegt, der die DC-Platte zuvor mit in einen Frischhaltefolie selbst konstruierten ausgelegt wurde. Anschließend wurden dem Softagar nach dem Abkühlen auf etwa 40°C entweder 50 ml einer Übernachtskultur von A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) oder 10 ml einer Übernachtskultur von C. violaceum CVO26 zugegeben. Zusätzlich wurde dem Softagar mit A. tumefaciens pZLR4 noch 60 g/ml X-Gal hinzugefügt. Der Softagar wurde anschließend vorsichtig von der Seite aus auf die Platte gegossen, um zu vermeiden, dass sich Kieselgel von der Platte löst. Die Bildung von Luftblasen muss so weit wie möglich vermieden werden. 22 Material/Methoden Nach etwa 10 min wurde die Platte aus dem Plexiglasrahmen genommen und in eine luftdichte, mit Küchenpapier befeuchtete Box gelegt und in einem Brutschrank bei 27°C für etwa 3-4 Tage im Dunkeln inkubiert. 2.3.3.6. Auswertung der überschichteten Platten Die Lokalisierung der AHL Moleküle auf den überschichteten Platten erfolgte anhand gefärbter Spots. - C. violaceum CVO26: Nach Inkubation für etwa 3-4 Tage konnten die AHL- Moleküle anhand der violetten Pigmentflecke identifiziert werden. - A. tumefaciens NTL4 (pZLR4): Nach Inkubation für etwa 3-4 Tage konnten die AHL- Moleküle anhand der blauen Spots durch die ß-Galaktosidase Aktivität identifiziert werden. - P. aureofaciens: Nach Inkubation für etwa 3-4 Tage sollten die AHL-Moleküle anhand der orangefarbenden Pigmentflecke identifiziert werden. 2.3.3.7. Ermittlung der Rf- Werte Der Rf-Wert wir anhand des Laufverhaltens der verschiedenen Proben ermittelt. Er ergibt sich als Quotient aus Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke des Laufmittels vom Startpunkt aus (LOTTSPEICH, ZORBAS, 1998). Der Rf- Wert wird nach folgender Formel berechnet: Rf=sx/sf sx = Strecke zwischen Startlinie und Substanzzone sf = Strecke zwischen Startlinie und Fließmittelfront 23 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Bestimmung der Spezifität und Sensitivität der verwendeten AHL Sensorstämme Zum Nachweis der AHL-Molekülen wurden Biosensoren verwendet. Die verwendeten Biosensoren eignen sich zur Detektion von AHL´s, da sie kein AHLSynthase Gen (LuxI Homologon) besitzen und somit auch keine AHL´s produzieren können. Die Sensoren können jedoch konstitutiv einen Transkriptionsaktivator (LuxR Homologon) exprimieren. Das LuxR Homologon kann auf synthetische oder von anderen Bakterien produzierten AHL´s reagieren, diese binden und damit die Expression eines bestimmten Gens positiv beeinflussen. Das Besondere an den Biosensoren ist, dass die Durchführung des AHL Nachweises relativ schnell innerhalb von 3 Tagen durchgeführt werden kann. Im Weiteren ist der Nachweis sensitiv und in Abhängigkeit zu den einzelnen Biosensoren sehr spezifisch. 3.1.1. Der AHL Sensor C. violaceum CVO26 Der Sensor CVO26 ist eine spezielle Mutante, bei der die AHL-Synthase, die beim Wildtyp die Produktion von HHL´s katalysiert, ausgeschaltet wurde (MCCLEAN et al., 1997). Daraus folgend produziert CVO26 zwar keine AHL´s mehr, reagiert aber höchst sensitiv auf fremde HHL´s. Die Detektionsfähigkeit dieses Biosensors wurde im Folgenden im Rahmen zweier Methoden bestimmt: anhand der Dünnschichtchromatographie sowie des Platten-Test. Anhand beider Methoden sollte die Qualität des AHL Nachweises untersucht werden. In beiden Methoden wurden die drei synthetischen AHL´s: HHL, OHL und BHL mit einer Konzentration von 100 mol eingesetzt. Deutlich wurde, dass CVO26 bei beiden Methoden auf alle drei AHL´s mit der 100 molaren Konzentration reagiert, jedoch am stärksten auf 24 Ergebnisse HHL (Tab.3.1.). Dies bestätigt die Aussage von MCCLEAN (1997), dass C. violaceum selbst HHL´s produziert und damit auch am stärksten auf diese reagiert. Laufmittelfront Startpunkt Abb. 3.1.: Detektion ausgewählter synthetischer AHL- Moleküle nach DünnschichtChromatographischer Auftrennung und Visualisierung mit dem Sensor C. violaceum CVO26. Von den verschiedenen synthetischen AHL Molekülen (1) N-octanoylDL-homoserin-lacton, 100 mol, (2) N- hexanoyl-DL-homoserin-lacton, 100 mol, (3) Nbutyryl-DL-homoserin-lacton, 100 mol wurden 1-4 l auf die DC- Platte gegeben. Tab. 3.1. Detektierbare Mengen ausgewählter AHL-Moleküle unter Verwendung des Sensors C. violaceum CVO26 AHL Molekül Formel Eingesetzte Konzentration Detektionsfähigkeit nach 24 h nach 100 h OHL C12H21NO3 1 mmol 100 mol 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol + + - +++ + + - 0,41 HHL C10H17NO3 1 mmol 100 mol 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol + + - +++ +++ ++ - 0,58 BHL C8H13NO3 1 mmol +++ +++ 100 mol + 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol ( + = schwache Farbreaktion, ++ = mittlere Farbreaktion, +++ = starke Farbreaktion) Rf-Werte 0,78 25 Ergebnisse 3.1.2. Der AHL Sensor P. aureofaciens I Der Biosensor P. aureofaciens I eignete sich nicht zum Nachweis von AHL´s. Der Wechsel von der gelben Mutante zum orange-farbenden Wildtyp in Anwesenheit von AHL´s war bei der Methode der Dünnschicht-Chromatographie sowie der PlattenTests nicht nachvollziehbar. Damit schied dieser Biosensor für die weiteren Detektionen von AHL´s aus und wurde nicht weiter behandelt. 3.1.3. Der AHL Sensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) Der Biosensor A. tumefaciens NTL1 (pZLR4) beruht auf eine traR und ßGalaktosidase Fusion, wodurch die AHL-Synthase inaktiviert wurde und der Biosensor nicht mehr in der Lage ist OHHL´s zu produzieren. Bei Anwesenheit fremder AHL´s wird ß-Galaktosidase exprimiert, deren Aktivität durch die Spaltung von X-Gal nachgewiesen wird. Der Biosensor wurde in drei methodischen Varianten: der Dünnschicht-Chromatographie, den Platten-Tests sowie den Medien-Tests auf seine Detektionsfähigkeit untersucht. In der Dünnschicht-Chromatographie sowie in den Platten-Tests wurden von den drei verschiedenen AHL´s: BHL, HHL und OHL jeweils 100 mol eingesetzt. Deutlich wurde, dass die Detektionsfähigkeit für das AHL OHL bei der Dünnschicht-Chromatographie am spezifischsten war. Bei den Platten-Tests konnten für alle drei synthetischen AHL´s (100 mol) eine gleich hohe Detektionsspezifität nachgewiesen werden (siehe Tabelle 3.2). Damit konnte gezeigt werden, dass der Sensor pZLR4 zwar ein großes Nachweisspektrum besitzt, jedoch immer noch sehr spezifisch auf die, von ihm produzierten OHHL´s (bzw. in diesem Versuch OHL´s) reagiert. Anhand der dritten Methode, den Medien-Tests, wurde untersucht wie stark bzw. unterschiedlich die blaue Färbung durch die Spaltung von X-Gal auftreten kann. Durch die Abb. 3.3. wird deutlich, dass die Färbung des Mediums nach Zugabe von synthetischen OHL´s (mit einer Konzentration von 100 mol) und 60 g/ml X- Gal sehr unterschiedlich aussehen kann. Im Weiteren konnte auch nachgewiesen verschiedenen Minimalmedium, werden, Medien dass ausgeprägt Ergebnisse nicht die ist blaue Färbung (verwendete dargestellt). Die unterschiedlich Medien: LB- Unterschiede Farbentwicklung werden an späterer Stelle nochmals aufgegriffen. in und AB in der 26 Ergebnisse Laufmittelfront Startpunkt Abb. 3.2.: Detektion ausgewählter synthetischer AHL- Moleküle nach DünnschichtChromatographischer Auftrennung und Visualisierung mit dem Sensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). Von den verschiedenen synthetischen AHL Molekülen (1) N-octanoyl-DL-homoserin-lacton, 100 mol, (2) N-hexanoyl-DL-homoserin- lacton, 100 mol, (3) N-butyryl-DL-homoserin-lacton, 100 mol wurden 1-4 l auf die DC- Platte gegeben. Tab. 3.2.: Detektierbare Mengen ausgewählter AHL- Moleküle unter Verwendung des Sensors A. tumefaciens pZLR4 AHL Molekül Formel Eingesetzte Konzentration Detektionsfähigkeit nach 100 h Rf-Werte OHL C12H21NO3 1 mmol 100 mol 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol + + - 0,4 HHL C10H17NO3 1 mmol 100 mol 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol + + - 0,57 BHL C8H13NO3 1 mmol 100 mol 10 mol 1 mol 100 nmol 10 nmol 1 nmol + + - 0,73 ( + = Detektion) Ergebnisse 27 Abb. 3.3.: Detektion von synthetischen AHL´s (100 mol) in Flüssigkulturen von A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). 30 ml LB- Medium wurde mit 15 ml einer Übernachtkultur (Verhältnis 1:3), 1 ml OHL´s sowie 60 g/ml X- Gal bei 20 °C für 100 Std. inkubiert. 3.2. Die Produktion von AHL Molekülen bei Cyanobakterien Die drei untersuchten Stämme der Cyanobakterien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit AHL´s zu produzieren untersucht. Die Untersuchung erfolgte über Platten-, Medien-Tests und über die Dünnschicht-Chromatographie. Die verschiedenen Methoden wurden zum einen mit dem Biosensor C. violaceum CVO26 und zum anderen mit dem Biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) durchgeführt, um ein möglichst großes Spektrum an AHL´s zu detektieren. Der Nachweis mit dem Biosensor P. aureofaciens I ergab keine Ergebnisse (Siehe 3.1.2.), weshalb mit diesem Biosensor nicht weiter gearbeitet wurde. Alle in dieser Arbeit angewandten Methoden lieferten für alle drei untersuchten Cyanobakterien positive Ergebnisse hinsichtlich ihrer AHL Produktion. Der Platten-Test mit A. tumefaciens pZLR4 zeigte für Oscillatoria limnetica die stärkste AHL Produktion gefolgt von Fischerella ambigua und Fischerella sp. (siehe Abb. 3.4.). Der Platten-Test lieferte mit dem Biosensor C. violaceum CVO26 nur negative Ergebnisse hinsichtlich der AHL Bildung durch Cyanobakterien. Der Sensor konnte die von den Cyanobakterien produzierten AHL´s nicht detektieren. 28 Ergebnisse Abb. 3.4.: Detektion von AHL´s durch Platten-Tests mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). 100 ml LB- Medium wurde nach dem autoklavieren mit 60 g/ml X-Gal und mit 50 ml einer Übernachtskultur von A. tumefaciens (pZLR4) versetzt, in Petrischalen gegossen und mit Überständen der untersuchten Bakterien versetzt (siehe 2.3.3.1.) Von links nach rechts: Überstände von Oscillatoria limnetica, Fischerella sp. und Fischerella ambigua. Alle drei untersuchten Überstände führen zu einer grünlichen Färbung des Mediums. Der AHL Medium-Test mit A. tumefaciens pZLR4 zeigte für alle untersuchten Cyanobakterien eine vergleichbare hohe AHL Produktion an, da die Intensität der Farbentwicklung durch Spaltung von X-Gal in Anwesenheit von AHL´s, nicht zu unterscheiden war (siehe Abb. 3.5.). Abb. 3.5.: Detektion von AHL´s durch Medien-Tests mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). 30 ml LB- Medium wurde mit 15 ml einer Übernachtkultur von pZLR4, 60 g/ml XGal und mit 1 ml Überstand, der auf AHL zu testenden Überstände versetzt. Inkubation erfolgte bei 20°C für 3-7 Tage. Von links nach rechts: Überstande von Fischerella sp., Fischerella ambigua und Oscillatoria limnetica. Die Dünnschicht-Chromatographie wies Unterschiede in der AHL Produktion bei den Cyanobakterien auf, die jedoch schwer zu reproduzieren waren. Die Überstände der untersuchten Cyanobakterien lösten alle eine positive Reaktion der Biosensoren aus. Innerhalb der aufgeschlossenen bakteriellen Biomassen der untersuchten 29 Ergebnisse Cyanobakterien konnten zum Teil AHL-Molekül-Spots nachgewiesen werden, die jedoch sehr verschwommen waren (Abb. 3.6. F 4). Die Unterschiede in der AHL Detektion durch A. tumefaciens pZLR4 liegen vor allem an der Fähigkeit des Sensors auf AHLs zu reagieren. Die „Fitness“ des Biosensors war zu jedem Zeitpunkt unterschiedlich, da nicht immer eine neue Kultur aus dem -80 °C Schrank aufgetaut wurde. Im Weiteren konnten keine Rf-Werte bestimmt werden, um daraus die Charakterisierung der produzierten AHL´s anhand der Referenz-Moleküle durchzuführen. Die blauen Färbungen in den Überschichtungen mit den Biosensoren waren nicht nur verschieden in der Quantität der „Spots“ (siehe Abb. 3.6.: A3 im Vergleich zu F5) sondern auch bezogen auf die Lokalisation (siehe Abb. 3.6.: F5 und F3). Die Spots waren bei jeder Durchführung an unterschiedlichen Stellen auf den Platten zu sehen (siehe Abb. 3.6.: A3 und B1). Im Weiteren waren die Spots sehr weit verteilt und zeigten oft nur einen blauen Schleier auf der Platte (siehe Abb. 3.6.: B1, 2, 3 und E1, 2). Laufmittelfront Startpunkt A B D E C F Abb. 3.6.: Dünnschichtchromatographische Auftrennung und Detektion von AHLMolekülen, die von verschiedenen Cyanobakterien stammen. 30 Ergebnisse Durchführung siehe Material/Methoden (S.16: 3.2.1; S.20: 2.3.3.5.) A (1) Isolat Fischerella sp. (PCC 8703), Dichlormethan, (2) F.a., Ethylacetat, (3) F.a.., Dichlormethan; B (1): F.a. groß, Dichlormethan, (2): Oscillatoria limnetica (Flo1) groß, Dichlormethan, (3): Fischerella sp. (PCC 8703) groß, Dichlormethan; C: (5) Fischerella ambigua, Dichlormethan; D: Oscillatoria limnetica (Flo1), Dichlormethan, (8): Fischerella sp. (PCC 8703) Ethylacetat, (9): Fischerella sp. (PCC 8703) Dichlormethan; E: (1): Oscillatoria limnetica (Flo1), Dichlormethan, (2): Fischerella sp. (PCC 8703) groß, Dichlormethan, F: (3): Fischerella ambigua, Groß, Dichlormethan, (4): Fischerella ambigua, Biomasse, Dichlormethan, (5): Fischerella sp. (PCC 8703), Ethylacetat, alle DC- Platten wurden mit dem Biosensor A. tumefaciens pZLR4 überschichtet. 3.3. Die Produktion von AHL Molekülen bei heterotrophen Bakterien Die in dieser Projektarbeit untersuchten heterotrophen Bakterien liegen als Begleitflora vieler Cyanobakterien vor. Cyanobakterien können nur schwer in Reinkultur (= axenisch) ohne ihre „begleitenden“ heterotrophen Bakterien gebracht werden. Die hier untersuchte heterotrophe Begleitflora wurde von Annina Hube im Rahmen ihrer Doktorarbeit isoliert. Daher wurde in dieser Projektarbeit neben den Cyanobakterien auch mit einigen isolierten heterotrophen Bakterien gearbeitet. Auch die heterotrophen Bakterien wurden wie die Cyanobakterien auf ihre Fähigkeit zur AHL Bildung untersucht. Dazu wurden die schon beschriebenen Methoden eingesetzt. Die verschiedenen Methoden wurden zum einen mit dem Biosensor C. violaceum CVO26 und zum anderen mit dem Biosensor A. tumefaciens pZLR4 durchgeführt, um ein möglichst großes Spektrum an AHL´s zu detektieren. Der Platten-Test mit dem Biosensor CVO26 lieferte wie bei den Cyanobakterien nur negative Ergebnisse hinsichtlich der AHL Produktion der heterotrophen Bakterien. Die Detektion beim Platten-Test durch A. tumefaciens pZLR4 lieferte für die heterotrophen Bakterien positive Ergebnisse. Alle untersuchten heterotrophen Bakterien produzieren demnach AHL´s. Die Quantität der AHL Produktion war bei jedem der untersuchten heterotrophen Stämme unterschiedlich. Die Farbintensität konnte bei den Stämmen Bo 53-33 sowie Bo 53-45 am stärksten nachgewiesen werden. Am schwächsten war die Reaktion beim Stamm Bo 10-20 (siehe Abb.3.7.). Durch den sog. Medium-Test (siehe Material/Methoden, S. 20) konnten ebenfalls bei allen heterotrophen Bakterien 31 Ergebnisse eine AHL Produktion nachgewiesen werden (siehe Abb.3.8.). Die Reaktion im Medium-Test war bei Bo 10-20 sehr gering und bei den Stämmen Bo 53-33 und Bo 53-45 sehr stark. B A Abb. 3.7.: Detektion von AHL´s durch Platten-Tests mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). 100 ml LB- Medium wurde nach dem autoklavieren mit 60 g/ml X-Gal und mit 50 ml einer Übernachtskultur von A. tumefaciens (pZLR4) versetzt, in Petrischalen gegossen und mit Überständen der untersuchten Bakterien versetzt (siehe Material/Methoden: 2.3.3.1.) A: von links oben: Überstände von Bo 10-19, Bo 10-09, Bo 53-33; links unten: Negativkontrolle ASNIII/2+, Negativkontrolle BGII+; B: oben: Überstand: Bo 10-20, unten: Überstand Bo 53-45. Alle drei untersuchten Überstände führen zu einer grünlichen Färbung des Mediums. A B Abb. 3.8.: Detektion von AHL´s durch Medien-Tests mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). 30 ml LB- Medium wird mit 15 ml einer Übernachtkultur von A. tumefaciens pZLR4, 60 g/ml X- Gal und mit 1 ml Überstand der auf AHL zu testenden Überstände versetzt. Inkubation erfolgte bei 20°C für 3-7 Tage. A: Von links: Überstande von Bo 53-33, Bo 10-19, Bo 10- 20; B: Überstände von Bo 10-20, Bo 10-09 32 Ergebnisse Die Detektion mittels Dünnschicht-Chromatographie erzielte die gleichen positiven Ergebnisse wie die Versuche zuvor. Alle heterotrophen Bakterien weisen die Produktion von AHL´s auf. Der Nachweis per Dünnschicht-Chromatographie zeigte jedoch auch die gleichen Schwierigkeiten wie der Nachweis von AHL´s bei den Cyanobakterien (siehe 3.2.). Damit konnten wieder keine Rf-Werte der produzierten AHL´s ermittelt werden. Laufmittelfront Startpunkt A B C D Abb. 3.9.: Dünnschicht-Chromatographische Auftrennung und Detektion von AHL- Molekülen, die von heterotrophen Bakterien stammen. Durchführung siehe Material/Methoden (S.16: 3.2.1; S.20: 2.3.3.5.) A: (1) Isolat Bo 53- 45, Ethylacetat, (2) Bo 53- 45, Dichlormethan, (3) Bo 53- 33, Ethylacetat, (4) Bo 53-33, Dichlormethan; B: (4): Bo 10- 19 klein, Ethylacetat, (5): Bo 10- 19 klein, Dichlormethan, C: (1) Isolat Bo 1009, Ethylacetat, (2) Bo 10- 09, Dichlormethan, (3) Bo 10- 20, Ethylacetat, (4) Bo 10- 20, Dichlormethan; D: (1): Bo 53-33, alle DC- Platten wurden mit dem Biosensor A. tumefaciens überschichtet. 33 Diskussion 4. Diskussion 4.1. Nachweis von AHL Molekülen mit bakteriellen Biosensoren Nachweisverfahren für AHL-Moleküle mit Biosensoren bieten eine günstige und schnelle Methode ohne großen apparativen Aufwand. Durch den Einsatz verschiedener Tests wie Platten-Tests, Medien-Tests sowie vor allem in der Kombination der Dünnschicht-Chromatographie mit der Detektionsfähigkeit von Biosensoren kann eine quantitative und qualitative Analyse produzierter AHL Moleküle aus Überständen bzw. den Biomassen getroffen werden. Dabei ist die Spotgröße proportional zu der Menge an Signalen entlang eines großen Konzentrationsangebots. Biosensoren unterscheiden sich hinsichtlich ihres Spektrums AHL-Moleküle unterschiedlicher Kettenlänge zu erkennen und eine Farbreaktion auszulösen. Der Nachweis von AHL-Molekülen nach der Methode von SHAW (1997) und der Modifikation nach GEISENBERGER (2000) bietet durch die Berechnung der Rf-Werte eine einfache Methode, um die AHL´s von verschiedenen Bakterien anhand synthetischer Referenz-Moleküle zu bestimmen und zu vergleichen. Jedes AHL-Molekül wandert dabei mit einer charakteristischen Mobilität auf der C18 Platte und zeigt schließlich einen für das AHL Molekül erkennbaren Spot. 3-oxoacyl-AHL´s produzieren tränenförmige Spots, alkanoyl- und 3-hydroxy-AHL´s produzieren hingegen gut definierte Kreise (FARRAND et al, 2002). Die Technik der DünnschichtChromatographie kann weiterhin als präparativer Schritt verstanden werden für weitere strukturelle und analytische Methoden. Für eine Analyse der produzierten AHL´s kann man AHL Moleküle aus dem Trennschichtmaterial der präparativen Dünnschicht-Chromatographie abkratzen und extrahieren. Die aufgereinigte Probe kann dann in einer Tandem Massenspektroskopie (MS) mit synthetischen Referenzen verglichen werden (SWIFT ET AL., 1997). Moleküle Im Weiteren kann eine eindeutige stereochemische Analyse der AHL mittels 3 H-Protonen- durchgeführt werden (BAINTON ET AL., und 13 1992). Von MICHELS (2000) wurde ebenfalls noch C-Kernresonanzspektroskopie (NMR) eine AHL Detektion über UV Photodioden array (DAD) Spektroskopie und 34 Diskussion „atmospheric pressure chemical ionization mass Spectrometrie“ (APCI- MS) publiziert. Bei der Auswertung von AHL Nachweismethoden durch Biosensoren anhand der hier dargestellten Methoden müssen jedoch einige Aspekte bei der Auswertung beachtet werden. Wenn eine positive Reaktion durch die Biosensoren zu erkennen ist, dann kann man davon ausgehen, dass der untersuchte Bakterienstamm AHL´s produziert. Wenn jedoch keine positive Reaktion zu erkennen ist, kann daraus nicht geschlossen werde, dass der untersuchte Stamm keine AHL-Moleküle produziert. Hierfür können drei Gründe vorliegen: 1. Der untersuchte Stamm produziert AHL-Moleküle nur unter sehr speziellen Bedingungen, die im Versuchsansatz nicht realisiert sind; 2. Der untersuchte Stamm produziert AHL-Moleküle, die strukturell unterschiedlich von den AHL-Molekülen sind, die der Biosensor detektieren kann; 3. Der untersuchte Stamm produziert zwar AHLMoleküle, jedoch nicht in detektierbaren Mengen unter den gehaltenen Versuchsbedingungen (FARRAND et al. 2002). Ein weiterer Aspekt, der behandelt werden muss, ist die Durchführung der Tests ohne Biosensoren. Vor allem bei der Verwendung von A. tumefaciens pZLR4 wird die positive Reaktion anhand der Spaltung von X-Gal getroffen. Daher müssen zusätzlich alle Versuche ohne Biosensoren durchgeführt werden, um ausschließen zu können, dass die untersuchten Stämme extrazelluläre Substanzen produzieren, die X- Gal spalten können (FARRAND et al. 2002). Ebenfalls muss bei der Arbeit mit klonierten Bakterien berücksichtigt werden, dass die Bakterien von Zeit zu Zeit unter nicht geklärten Umständen ihre Plasmide „verlieren“ können, was zu falsch negativen Ergebnissen führt. Daher ist bei der Arbeit mit Biosensoren wichtig, immer – 80°C Kulturen anzulegen. Für die Detektion von AHL-Molekülen ist im Weiteren der pH-Wert des Mediums zu berücksichtigen, da unter basischen Bedingungen die AHL- Moleküle hydrolysiert werden können (STEINDLER et al., 2006). 4.2. Vergleich der Biosensoren hinsichtlich ihrer AHL Detektionsfähigkeit In dieser Projektarbeit sollte durch die Verwendung verschiedener Biosensoren ein möglichst großes Spektrum an AHL-Molekülen aus Cyanobakterien sowie heterotrophen Bakterien detektiert und charakterisiert werden. Es wurden die 35 Diskussion Biosensoren A. tumefaciens pZLR4, Pseudomonas aureofaciens I und C. violaceum CVO26 angewendet und ihre Detektionsfähigkeit für AHL-Moleküle untereinander verglichen. Deutlich wurde, dass der Biosensor P. aureofaciens I nicht als AHL Detektor verwendet werden kann. Der Biosensor zeigt keine eindeutige phänotypische Reaktion bei der Anwesenheit von AHL´s. Die Mutante I weist eine gelbe Färbung auf, die sich bei Anwesenheit von AHL´s gemäß dem Wildtyp orange färbt. Dieser Farbwechsel von gelb zu orange ist jedoch schlecht zu verfolgen und zu bewerten. Aus diesem Grund wurde der Biosensor P. aureofaciens I nicht für die Auswertung verwendet. Im Weiteren wurde mit dem Biosensor C. violaceum CVO26 gearbeitet. Dieser Biosensor ist sehr spezifisch für bestimmte AHL-Moleküle. Der CVO26 Biosensor reagiert auf AHL Moleküle mit einer Seitenkette C-4- C-8 (MCCLEAN et al., 1997). Dieser zeigte für die synthetischen AHL´s eine gute Detektion (siehe 3.1.1), jedoch nicht für die getesteten Bakterien. Damit würde man auf ein falsch negatives Ergebnis hinsichtlich der AHL Produktion der untersuchten Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien schließen. Schließlich sollten die vermutlich negativen Ergebnisse nochmals anhand des Biosensors A. tumefaciens pZLR4 überprüft werden. Neben den synthetischen AHL´s zeigte A. tumefaciens pZLR4auch eine Detektionsfähigkeit für die untersuchten heterotrophen Bakterien und Cyanobakterien. Der Biosensor reagiert auf eine große Anzahl von AHL Molekülen, jedoch unsensibel auf Signale mit einer Seitenkette von C-4 (FARRAND et al., 2002). Daher sollten alle angewendeten Verfahren auch mit dem Biosensor C. violaceum CVO26 überprüft werden, um AHL-Moleküle mit einer Seitenkette von C-4 auszuschließen. Je näher ein von den untersuchten Bakterien produziertes AHLMolekül dem eigenen AHL Molekül des Biosensors verwandt ist, desto stärker ist die Detektionsfähigkeit des jeweiligen Biosensors (siehe 3.1.1., 3.1.3.). Je weniger Ähnlichkeit die AHL Moleküle mit dem für den Rezeptor optimal passenden Molekül aufweisen, desto unempfindlicher ist der Nachweis. In dieser Arbeit konnte die größte Nachweisempfindlichkeit bei A. tumefaciens pZLR4 nachgewiesen werden (3.1.3.). Bei der DC hat sich dieser Sensor wegen seiner hohen Sensitivität als sehr nützlich zur Detektion von AHL´s erwiesen. Um mit diesem Sensor optimale Ergebnisse zu erzielen, ist allerdings ein spezielles Nährmedium und eine sorgfältige zweitägige Vorkultivierung nötig, die den Einsatz dieses Sensors im Vergleich zu C. 36 Diskussion violaceum etwas aufwendiger macht (GEISENBERGER, 2000). Dafür kann jedoch auch ein größeres Spektrum an AHL´s detektiert werden. 4.3. Vergleich der AHL Produktionen der getesteten Bakterien Bei allen untersuchten Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien konnte in den Überständen eine AHL- Produktion nachgewiesen werden. Die Analyse von AHLMolekülen in der Biomasse verschiedener Bakterien verlangt ein großes Volumen. Da Cyanobakterien nur sehr langsam wachsen, fiel es schwer eine große Biomasse zu gewinnen. Die extrahierten Biomassen der Cyanobakterien- Stämme zeigten zwar eine positive Reaktion, die jedoch schwer zu reproduzieren war und ein nur schwaches Farbsignal ergab. Die Extraktion der AHLs mit Ethylacetat lieferten keine positiven Ergebnisse, zusätzlich erwies sich die Extraktion als ungeeignet, da anscheinend viele Kultur- Bestandteile mit Ethylacetat extrahiert werden und diese schlecht im Scheidetrichter getrennt werden können. Ebenfalls verlief die Extraktion kleiner Volumina der Überstände (nach SAW et al., 1997) erfolglos. Da in dieser Arbeit nicht mit überprüften axenischen Cyanobakterien gearbeitet wurde, können auch keine direkten Cyanobakterien Rückschlüsse getroffen auf werden. die Da AHLdie Produktion untersuchten der verwendeten Cyanobakterien höchstwahrscheinlich noch mit anderen heterotrophen Bakterien assoziiert waren, kann die nachgewiesene AHL-Produktion auch auf die Begleitflora zurück zu führen sein. Diese Begleitflora könnte demnach die AHL-Moleküle produzieren. Dafür könnte sprechen, dass bei allen isolierten untersuchten heterotrophen Bakterien AHL-Moleküle nachgewiesen wurden. Bisher ist nur sehr wenig über die AHL Produktion von Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien bekannt. Der in dieser Arbeit untersuchte Bo 10-20 Stamm, alias Roseobacter sp. (nach Annina Hube), konnte als positiver AHL Produzent identifiziert werden. Bei diesem Bakterium wurde auch schon in einer älteren Arbeit die Produktion von AHL Molekülen nachgewiesen (GRAM et al., 2002). Über die anderen untersuchten heterotrophen Stämme ist über eine mögliche AHL Produktion noch nichts bekannt. Über die AHL-Produktion bei Cyanobakterien ist ebenfalls sehr wenig bekannt. In einer Arbeit von GRAM et al. (2002) konnten keine reproduzierten positiven Ergebnisse Diskussion 37 für Synechocystis PCC 6803 erlangt werden. Damit könnte man zu der Überlegung kommen, dass Cyanobakterien vielleicht nur unter ganz bestimmten Bedingungen AHL´s produzieren. ROMERO et al. (2006) konnte in einer noch nicht veröffentlichten Arbeit bei dem Cyanobakterium Nostoc PCC7120 langkettige AHL-Moleküle nachweisen. Er wies darauf hin, dass die AHL-Moleküle nur bei diazotroph gehaltenen Cyanobakterien nachgewiesen werden konnten. Er geht davon aus, dass die AHL- Produktion die Heterocysten- Entwicklung beeinflusst, reguliert oder vielleicht sogar auslöst. Dieser Aspekt wäre selbstverständlich sehr interessant zu untersuchen. Dafür müssten die untersuchten Cyanobakterien vergleichsweise mit Nitrat und Nitrat- freien Bedingungen kultiviert werden, um anschließend die AHLProduktionen zu testen. Zusammenfassung 38 5. Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden die Spezifitäten und Sensitivitäten der AHL-Sensoren A. tumefaciens NTL1 (pZLR4), C. violaceum CVO26 sowie P. aureofaciens I in Kombination mit der von SHAW et al. (1997) und modifiziert nach GEISENBERGER (2000) entwickelten Methoden gegenüber AHL-Moleküle ermittelt und verglichen. Die Ergebnisse wiesen erhebliche Unterschiede in der Sensitivität und Spezifität der einzelnen Sensorsysteme auf. Es wurde die Produktion von AHL-Molekülen bei den Cyanobakterien: Oscillatoria limnetica, Fischerella sp. und Fischerella ambigua sowie bei den heterotrophen Bakterien: Bo 10-09, Bo 10- 19, Bo 10-20, Bo 53- 33 und Bo 53-45 analysiert. Die Untersuchungen ergaben, dass alle untersuchten Bakterienstämme mit hoher Wahrscheinlichkeit AHL- Moleküle produzieren. Ausblick 39 6. Ausblick Für zukünftige Untersuchungen müssten alle Cyanobakterien in axenischer Form vorliegen, um eindeutige Ergebnisse hinsichtlich ihrer AHL Produktion treffen zu können. Des Weiteren müssten die Kultivierungsbedingungen konstant und gleich gehalten werden bei der Untersuchung verschiedener Bakterienstämme. Die Bedingungen können anschließend variiert werden, um die Bedingungen zu analysieren, bei denen die Bakterien AHL- Moleküle produzieren. Damit könnten dann Aussagen hinsichtlich ihrer Funktionen getroffen werden. Für genauere Analysen der AHL- Moleküle müssten weitere Biosensoren in Betracht gezogen werden, die sich z.B. auf der Basis von Reportergenen für das grün- fluoreszierende protein (Gfp) gründen. Mit diesen Biosensoren könnte man besser langkettige AHLMoleküle detektieren, die höchstwahrscheinlich von Cyanobakterien produziert werden (nach ROMERO et al. (2006). Des Weiteren müssten für eine exakte Analyse der AHL- Moleküle andere Untersuchungen durchgeführt werden wie z.B. MS- und NMR-Methoden. Literaturverzeichnis 40 7. Literaturverzeichnis ANDERSEN JB, HEYDORN A, HENTZER M, EBERL L, GEISENBERGER O, CHRISTENSEN BB, MOLIN S, GIVSKOV M. (2001) gfp-based N-acyl homoserine-lactone sensor systems for detection of bacterial communication. Appl Environ Microbiol. 67:575-85. 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