Functional characterization of chemoreceptors in human skeletal

Chapter 6 – Conclusion
new mechanism for modulation of cardiac contractility and may also have clinical
implications such as usage of receptor expression to assess progression of heart
failure. Moreover, OR51E1 could also serve as pharmacological target when a decrease
in contraction force and frequency is required (cardiac arrhythmias or high blood
pressure) and thus would fulfill similar functions as β-blockers.
6.2 Zusammenfassung
Die Fähigkeit der Fortbewegung wird durch Skeletmuskeln ermöglicht und ist essentiell
für das Überleben der meisten Tiere, was eine schnelle und effiziente Muskelreparatur
lebensnotwendig macht. Da der Skelettmuskel als terminal differenziertes Gewebe
nicht in der Lage ist selbstständig beschädigte Muskelfasern zu ersetzen, ist die
Aktivierung von zuvor ruhenden Satellitenzellen nötig. Nach einer Muskelverletzung
werden die Satellitenzellen aktiviert, beginnen als so genannte Myoblasten zu
proliferieren, migrieren zum Ort der Verletzung und fusionieren dort in Myotuben, die
im weiteren Verlauf mit schon bestehenden Muskelfasern fusionieren können. Dieser
Prozess umfasst den Einstrom von extrazellulärem Ca2+, die Synthese von
Stickstoffmonoxid (NO), die Aktivierung von Matrix-Metalloprotease 2 (MMP-2) und
die Freisetzung von Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF) aus der Extrazellulärmatrix.
Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal die Expression von transient receptor potential
ankyrin 1 (TRPA1) in humanen Myoblasten und Satellitenzellen. Zudem konnte die
Funktionalität von TRPA1 in humanen Myoblasten mit Hilfe von Ca2+-Imaging und
patch clamp Experimenten überprüft werden. Interessanterweise nahm die Menge an
TRPA1-Transskript
und
Protein
im
Verlauf
der
Differenzierung
humaner
Skelettmuskellen (hSkMZ) ab. Dies ging zudem mit einer Reduktion der durch Thymol
(TRPA1 Agonist) ausgelösten Antworten einher. Weiterhin konnte gezeigt werden,
dass neben Thymol auch der endogene und für die Muskelreparatur bedeutende
TRPA1-Ligand Stickstoffmonoxid in der Lage ist, einen TRPA1-vermittelten Ca2+Einstrom in hSKMZ zu erzeugen. Die physiologische Rolle von TRPA1 für hSkMZ wurde
mit Hilfe von Migrations-, Proliferations- und Fusions-Assays untersucht. Die Migration
von Myoblasten ist ein wichtiger Bestandteil der Muskelreparatur, da diese zunächst
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Chapter 6 – Conclusion
den Ort der Verletzung erreichen müssen, bevor eine effektive Instandsetzung der
Muskelfasern erfolgen kann. Mit Hilfe von Migrations-Assays konnte eine Thymolinduzierte Steigerung der Migration beobachtet werden, die durch Zugabe des TRPA1
Antagonisten HC-030031 inhibiert werden konnte. Ein Einfluss von Thymol auf die
Proliferation der humanen Myoblasten konnte nicht festgestellt werden. Allerdings
wurde durch Thymol-Stimulation eine deutliche Steigerung der Myoblasten-Fusion
ausgelöst, die wiederum durch Zugabe von HC-030031 verhindert werden konnte.
Abschließend konnte die Beteiligung von MMP-2 an der TRPA1-vermittelten
Signalkaskade gezeigt werden, da sowohl inaktive proMMP-2 als auch die aktive Form
nach
Thymol-Applikation
festzustellen,
dass
TRPA1
stärker
ein
exprimiert
neues
wurden.
Schlüsselelement
Zusammenfassend
in
der
ist
komplexen
Muskelreparatur darstellt. TRPA1 dient möglicherweise als Mechanosensor, der durch
Scherkräfte während einer Muskelverletzung aktiviert wird, und ebenso als Detektor
für den wichtigen Regulator der Muskelreparatur, NO. Die TRPA1 Aktivierung könnte
somit die Migration und Fusion in der frühen Phase der Muskelreparatur fördern und
würde in späteren Phasen durch eine Runterregulation deaktiviert.
In einem verwandten Projekt wurde die Beteiligung von olfaktorischen Rezeptoren
(OR) auf hSkMZ untersucht. Die Funktionalität von ORs in anderen Geweben außerhalb
der Nase konnte bereits durch mehrere Studien belegt werden. In Mäusen ist
beispielsweise der olfaktorische Rezeptor mOR23 wichtig für die Migration von
Myoblasten und für die Muskelreparatur. Das menschliche Ortholog zu mOR23,
OR10J5, scheint in hSkMZ jedoch nicht funktionstüchtig zu sein. Daher wurden
großangelegte Screenings mittels DNA Mikrochips, Next Generation Sequencing (NGS),
PCR Analysen und Ca2+-Imaging durchgeführt, um funktionale ORs in hSkMZ zu
identifizieren. Die Expression von OR2H2 konnte durch NGS und PCR belegt werden
und seine Funktionalität, nach der Ermittlung eines Liganden (Aldehyd 13-13), in
hSkMZ durch Ca2+-Imaging Experimente gezeigt werden. Dabei führte die Stimulation
von OR2H2 mit Aldehyd 13-13 zu einem Ca2+-Einstrom und ebenso zur
Phosphorylierung von CREB und p38α sowie zur Dephosphorylierung von PRAS40 und
Lck. Aktivierung von CREB, p38α und die Deaktivierung von Lck fördern die
Differenzierung von Myoblasten in der Maus und sind entscheidend an der
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Chapter 6 – Conclusion
Muskelreparatur beteiligt. Somit scheint Aldehyd 13-13 ein potenter Stimulus zur
Förderung der Differenzierung zu sein, was besonders in der frühen Phase einer
Muskelreparatur nützlich wäre und möglicherweise komplementär zu TRPA1
Signalwegen ablaufen könnte.
In einem letzten Teilprojekt wurde der Einfluss von ORs auf die Kontraktionsfähigkeit
von humanen Herzen untersucht. Der Nachweis essentieller olfaktorischer
Signalkaskaden-Proteine wurde während dieser Arbeit mittels PCR und western blot
erbracht. Zudem wurde im Rahmen von DNA Mikrochip Analysen besonders OR51E1
als hoch exprimiert ermittelt. Eine Charakterisierung der physiologischen Funktion von
OR51E1 wurde mit Hilfe von Trabeculae carneae aus humanen explantieren Herzen
durchgeführt. Mit Hilfe von Organbadexperimenten konnte gezeigt werden, dass unter
Einfluss des OR51E1 Liganden Nonansäure die Kontraktionskraft der Trabeculae
carneae signifikant reduziert wurde. Obwohl eine weitergehende physiologische
Untersuchung der involvierten Signalkaskaden im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr
durchgeführt werden konnte, stellt der Einfluss von OR51E1 einen möglichen, bisher
unbekannten Mechanismus der Modulation der kardialen Kontraktionskraft dar.
Darüber hinaus könnte OR51E1 auch Einfluss auf die klinische Diagnostik und Therapie
haben. Zum einen wäre ein Einsatz als Marker, der sich mit dem Schweregrad einer
Herzinsuffizienz korrelieren lässt, denkbar. Zum anderen könnte OR51E1 ein
potentielles pharmakologisches Ziel darstellen, welches eine gezielte Reduktion der
Herzkontraktionskraft ermöglicht (bei Herzrhythmusstörungen oder Bluthochdruck)
und somit einen ähnlich Zweck wie β-Blocker erfüllen würde.
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