Zelluläre Protektion bei Transfektion mit Calciumphosphat/DNA

Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Calcium spielt eine wichtige Rolle für die Homöostase der Zelle, so kann eine erhöhte
intrazelluläre freie Calcium-Ionen-Konzentration ([Ca2+]i) den programmierten Zelltod, die
Apoptose, induzieren [294, 295]. Im Bereich der nicht-viralen Transfektionstechniken werden
häufig Calciumphosphat-DNA-Präzipitate verwendet, um DNA in eine Zelle einzubringen
und damit ein gezieltes Protein zu exprimieren [79]. In jüngster Zeit wurden unter anderem
von
Epple
et
al.
die
Calciumphosphat-DNA-Präzipitate
zu
mehrschaligen
Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln weiterentwickelt [94]. Trotz vieler Untersuchungen
zum Transfektionsmechanismus lagen bislang keine Daten vor, zu welchen Änderungen der
[Ca2+]i es während Calciumphosphat-basierter Transfektion kommt. In der vorliegenden
Arbeit wurden Änderungen der [Ca2+]i mittels radioaktiver Markierung durch das Isotop
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Calcium sowie mittels zeitaufgelöster Videomikroskopie unter Verwendung des Ca2+-Ionen
sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes Fura-2 während der Transfektion mit der StandardCalciumphosphat-Methode sowie mehrschaligen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln an
der humanen Blasenkrebszelllinie T24 untersucht. Während bei der Transfektion mittels der
Standard-Calciumphosphat-Methode ein hoher und spike-artiger Anstieg der [Ca2+]i
beobachtet wurde, der mit verringerten Zellvitalität verbunden war, führte die Transfektion
mittels Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln zu geringen Änderungen der [Ca2+]i ohne
Beeinträchtigung
der
Zellvitalität.
Des
Weiteren
wurden
die
mehrschaligen
Calciumphosphat/DNA-Nanopartikel weiterentwickelt, indem die äußere Schale mit dem
polykationischen Polymer Polyethylenimin (PEI) funktionalisiert wurde. PEI ist ein häufig für
Transfektionen verwendetes Polymer [53]. An drei verschiedenen sekundären Zelllinien (T24,
HeLa, NIH3T3) und unter Verwendung zweier Reportergen-Systeme konnte mit den
PEI/Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln
die
Transfektionseffizienz
gegenüber
den
bisherigen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln gesteigert werden. Die äußere Schale aus
PEI verleiht den Nanopartikeln eine positive Ladung, so dass sie durch die negativ geladene
Zellmembran leichter aufgenommen werden können. Aufgrund der Zytotoxizität des PEIs
muss für jede Zelllinie jeweils ein Kompromiss zwischen hoher Transfektionseffizienz und
geringer Zytotoxizität gefunden werden.
Während im ersten Teil dieser Arbeit geringe Änderungen der [Ca2+]i bei der Transfektion mit
Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln die Zellvitalität nicht beeinträchtigten, wurden im
zweiten Teil an primären Kortex-Kulturen protektive Effekte untersucht. Zur Erforschung der
Funktion von Ras in Neuronen wurde von Heumann et al. das synRas-Mausmodell etabliert,
in dem durch Kontrolle des Synapsin-I-Promotors konstitutiv aktiviertes Val12Ha-Ras in
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postmitotischen Neuronen im Hippocampus und Kortex exprimiert wird [144]. Das konstitutiv aktivierte Ras führt zur Aktivierung des Ras/Raf/MAPK-Signalweges. Eine wesentliche
phänotypische Änderung im synRas-Mausmodell ist Neuroprotektion, an der unter anderem
eine verringerte Expression des voltage-dependent anion channel-1 (VDAC-1) beteiligt sein
könnte. In der Maus führt alternatives Spleißen des VDAC-1 zu seiner Lokalisation in der
äußeren
mitochondrialen
Membran
(mt-VDAC-1)
sowie
in
der
Plasmamembran
(pl-VDAC-1) [263]. Verschiedene Arbeiten zeigten eine erhöhte Expression des pl-VDAC-1
im Zusammen der Alzheimer’schen Krankheit [261], während eine Inhibierung des
pl-VDAC-1 an kultivierten Neuronen durch anti-VDAC-Antikörper neuroprotektiv wirkt
[284]. In dieser Arbeit wurde durch exzitatorische Glutamat-Stimulation der neuroprotektive
Phänotyp an primären Kortex-Kulturen der synRas-Maus bestätigt. Im Einklang damit wurde
in den synRas-Kulturen eine verringerte pl-VDAC-1-Expression auf mRNA- und auf
funktioneller Ebene gefunden. Partielle Inhibierung des MAPK-Signalweges durch U0126 in
primären Kortex-Kulturen der synRas-Maus erhöhte das mRNA-Niveau des pl-VDAC-1 auf
Wildtyp-Niveau. Dies könnte ein Hinweis sein, dass konstitutiv aktiviertes Ras über den
MAPK-Signalweg das Spleißen des VDAC-1 zu Gunsten einer verringerten pl-VDAC-1Expression verändert, die zur Neuroprotektion beiträgt.
Andererseits führte die Überexpression der zu der Ras-Superfamilie gehörenden kleinen
GTPase Rheb (Ras homolog enriched in brain) in primären kortikalen Neuronen in
Kombination mit exzitatorischer Glutamat-Stimulation zu erhöhter Apoptose.
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