Zelluläre Protektion bei Transfektion mit Calciumphosphat/DNA
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Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Calcium spielt eine wichtige Rolle für die Homöostase der Zelle, so kann eine erhöhte intrazelluläre freie Calcium-Ionen-Konzentration ([Ca2+]i) den programmierten Zelltod, die Apoptose, induzieren [294, 295]. Im Bereich der nicht-viralen Transfektionstechniken werden häufig Calciumphosphat-DNA-Präzipitate verwendet, um DNA in eine Zelle einzubringen und damit ein gezieltes Protein zu exprimieren [79]. In jüngster Zeit wurden unter anderem von Epple et al. die Calciumphosphat-DNA-Präzipitate zu mehrschaligen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln weiterentwickelt [94]. Trotz vieler Untersuchungen zum Transfektionsmechanismus lagen bislang keine Daten vor, zu welchen Änderungen der [Ca2+]i es während Calciumphosphat-basierter Transfektion kommt. In der vorliegenden Arbeit wurden Änderungen der [Ca2+]i mittels radioaktiver Markierung durch das Isotop 45 Calcium sowie mittels zeitaufgelöster Videomikroskopie unter Verwendung des Ca2+-Ionen sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes Fura-2 während der Transfektion mit der StandardCalciumphosphat-Methode sowie mehrschaligen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln an der humanen Blasenkrebszelllinie T24 untersucht. Während bei der Transfektion mittels der Standard-Calciumphosphat-Methode ein hoher und spike-artiger Anstieg der [Ca2+]i beobachtet wurde, der mit verringerten Zellvitalität verbunden war, führte die Transfektion mittels Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln zu geringen Änderungen der [Ca2+]i ohne Beeinträchtigung der Zellvitalität. Des Weiteren wurden die mehrschaligen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikel weiterentwickelt, indem die äußere Schale mit dem polykationischen Polymer Polyethylenimin (PEI) funktionalisiert wurde. PEI ist ein häufig für Transfektionen verwendetes Polymer [53]. An drei verschiedenen sekundären Zelllinien (T24, HeLa, NIH3T3) und unter Verwendung zweier Reportergen-Systeme konnte mit den PEI/Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln die Transfektionseffizienz gegenüber den bisherigen Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln gesteigert werden. Die äußere Schale aus PEI verleiht den Nanopartikeln eine positive Ladung, so dass sie durch die negativ geladene Zellmembran leichter aufgenommen werden können. Aufgrund der Zytotoxizität des PEIs muss für jede Zelllinie jeweils ein Kompromiss zwischen hoher Transfektionseffizienz und geringer Zytotoxizität gefunden werden. Während im ersten Teil dieser Arbeit geringe Änderungen der [Ca2+]i bei der Transfektion mit Calciumphosphat/DNA-Nanopartikeln die Zellvitalität nicht beeinträchtigten, wurden im zweiten Teil an primären Kortex-Kulturen protektive Effekte untersucht. Zur Erforschung der Funktion von Ras in Neuronen wurde von Heumann et al. das synRas-Mausmodell etabliert, in dem durch Kontrolle des Synapsin-I-Promotors konstitutiv aktiviertes Val12Ha-Ras in 118 Zusammenfassung postmitotischen Neuronen im Hippocampus und Kortex exprimiert wird [144]. Das konstitutiv aktivierte Ras führt zur Aktivierung des Ras/Raf/MAPK-Signalweges. Eine wesentliche phänotypische Änderung im synRas-Mausmodell ist Neuroprotektion, an der unter anderem eine verringerte Expression des voltage-dependent anion channel-1 (VDAC-1) beteiligt sein könnte. In der Maus führt alternatives Spleißen des VDAC-1 zu seiner Lokalisation in der äußeren mitochondrialen Membran (mt-VDAC-1) sowie in der Plasmamembran (pl-VDAC-1) [263]. Verschiedene Arbeiten zeigten eine erhöhte Expression des pl-VDAC-1 im Zusammen der Alzheimer’schen Krankheit [261], während eine Inhibierung des pl-VDAC-1 an kultivierten Neuronen durch anti-VDAC-Antikörper neuroprotektiv wirkt [284]. In dieser Arbeit wurde durch exzitatorische Glutamat-Stimulation der neuroprotektive Phänotyp an primären Kortex-Kulturen der synRas-Maus bestätigt. Im Einklang damit wurde in den synRas-Kulturen eine verringerte pl-VDAC-1-Expression auf mRNA- und auf funktioneller Ebene gefunden. Partielle Inhibierung des MAPK-Signalweges durch U0126 in primären Kortex-Kulturen der synRas-Maus erhöhte das mRNA-Niveau des pl-VDAC-1 auf Wildtyp-Niveau. Dies könnte ein Hinweis sein, dass konstitutiv aktiviertes Ras über den MAPK-Signalweg das Spleißen des VDAC-1 zu Gunsten einer verringerten pl-VDAC-1Expression verändert, die zur Neuroprotektion beiträgt. Andererseits führte die Überexpression der zu der Ras-Superfamilie gehörenden kleinen GTPase Rheb (Ras homolog enriched in brain) in primären kortikalen Neuronen in Kombination mit exzitatorischer Glutamat-Stimulation zu erhöhter Apoptose. 119
