Abstract - ETH E
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DIS8: ETH ~. A Diss. ETH Nr. 11012 Multivalent and bispecific antibody fragments from E.coli New strategies for antibody-based diagnostics and therapeutics frorn bacteria Abhandlung zur Erlangung des Titels DOKTOR der NATURWISSENSCHAFfEN der Eidgenössischen Technischen Hochschuhle Zürich vorgelegt von Philipp Holliger Dipl. Natvviss. ETH geboren am 13.5. 1966 von Bonisvvil AG Angenommen auf Antrag von: Prof. T. Richmond, Referent Prof. S.A. Benner, Korreferent 1994 Abstract New ways of producing antibodies continue to emerge. Phage antibody technology and expression of antibody fragments are two relatively new technologies that appear to be set to replace hybridomas as the main source of antibodies for research and medicine. Antibody fragments have a number of advantages over whole antibodies. They can then be produced cheaply in bacteria, and because of their small size they penetrate more effectively into tissues such as solid tumor nodules. However, they lack the effector functions and multivalency of whole antibodies. This thesis examines new strategies to re-equip antibody fragments with the features of whole antibodies, i.e. multivalent binding of antigen and antibody effector functions. The concept is extended to the introduction of novel effector functions that natural antibodies do not possess, such as recruiting cytotoxic T-cells. In first part, as a point in case, the isolation of a human anti-CD4 antibody fragment is described. Antibodies directed against the bodies own proteins have considerable potential in therapy, but are accessible only through phage technology because of tolerance mechanisms in the immune system. Antibody fragments derived from phage libraries or hybridomas can be reengineered to become multivalent or acquire immune effector functions. Genetic fusion of the antibody fragments to naturally oligomeric proteins produces oligomeric, multivalent antibody fragments mimicking natural antibodies such as IgM. Because of the avidity effect in interaction with solid antigen, these constructs were termed "avibodies". In the main part of the work, a novel design for bivalent and bispecific antibody fragments is introduced: "diabodies". Diabodies efficiently recruit antibody effector functions such as complement to lyse red blood cells. But they can also be engineered to recruit T-cells to kill tumor cells. 50% of mice treated with a bispecific diabody directed against lymphoma appeared to be free of disease 30 days after treatment. It is anticipated that as hybridoma technology is superseded by phage technology and bacterial fermentation becomes the method of choice for large-scale antibody production, the novel designs described in this thesis, avibodies and diabodies, will provide a useful source of antibody-based reagents for applications in research, diagnosis and therapy. Publications from this thesis "Human anti-self antibodies with high specificity from phage display libraries" Griffiths, A. D., Malmqvist, M., Marks, 1.D., Bye, J.M., Embleton, MJ., McCafferty, 1., Baier, M., Holliger, P., Gorick, B.D., Hughes-Jones, N.C., Hoogenboom, H.R. and Winter, G. (1993) EMBO J. 12,725-734 Zusammenfassung Die Phagen-Antikörper Technologie und die Expression von Antikörperfragmenten in Bakterien sind zwei relativ neue technische Entwicklungen. Schon jetzt aber scheint sich abzuzeichnen, dass Antikörperfragmente Hybridomas als die Hauptquelle von Antikörpern für medizinische und wissenschaftliche Anwendungen ersetzen werden. Antikörperfragmente haben einige Vorteile gegenüber vollständigen Antikörpern, z. B. die billige Produktion in Bakterien und auf Grund eines geringeren Molekulargewichts eine bessere Penetration von Körpergeweben und Tumoren. Leider fehlen aber Antikörperfragmenten die Immuneffektorfunktionen und die Multivalenz ganzer Antikörper. In dieser Arbeit wurden neue Methoden entwickelt, um Antikörperfragmenten die Immuneffektorfunktionen und die Multivalenz ganzer Antikörper zurückzugeben. Das entwickelte Konzept erlaubt zudem auch die Einführung von neuen, normalerweise nicht mit Antikörpern assozierten Immuneffektorfunktionen in Antikörperfragmenten wie Z.B. die Rekruitierungm von Killer T-zellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Isolierung eines humanen anti-CD4 Antikörperfragments beschrieben. Antikörper, die sich gegen korpereigene Proteine richten haben ein grosses Potential in der medizinischen Anwendung, können aber wegen Toleranzmechanismen des Immunsysytems nur mittels Phagen-Antikörper Technologie in effizienter Weis isoliert werden. So erhaltene Antikörperfragmente können dann durch gentechnische Methoden umgebaut werden, so dass sie Multivalenz und Immuneffektorfunktionen erhalten. Durch Fusion mit natürlich oligomeren Proteinen auf genetischer Ebene wurden oligomere, multivalente Antikörperfragmente erhalten, die natürlich multivalente Antikorper wie IgM nachahmen. Wegen des Aviditätseffekts, der bei der Interaktion mit oberflächengebundenem Antigen auftritt, wurden diese Konstrukte "Avibodies" genannt. Im Haupteil dieser Arbeit wird ein neues Designkonzept für bivalente und bispezifische Antikörperfragmente beschrieben: "Diabodies". Diabodies können nicht nur Antikörper Immuneffektor Funktionen wie Komplement besitzen, sondern auch Killer T-zellen dazu bringen Tumor Zellen spezifisch abzutöten. 50% von Mäusen, die mit einem bispezifischen gegen Lymphoma Tumor Zellen gerichteten Diabody behandelt wurden, waren 30 Tage nach der Behandlung frei von Tumoren. Wenn in der nahen Zukunft Hybridomas durch die Phagen-Antikörper Technologie ersetzt werden, und bakterielle Fermentation die Methode der Wahl für die Produktion von Antikörpern wird, wird sich die Nützlichkeit der neuen, im Verlauf dieser Arbeit entwickelten Antikörperfragment-Designkonzepte, d.h. Avibodies und Diabodies, für Anwendungen in Forschung und Medizin erweisen.
