Human monoclonal antibodies (mAbs) - ETH E

Diss. ETH N° 18856
Human monoclonal antibodies (mAbs): Applications in
cancer and infectious disease
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
DAVID SGIER
Dipl. Pharm. Sciences ETH Zurich
Born on May 29, 1980
Citizen of Switzerland
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Karl-Heinz Altmann, co-examiner
2010
1 SUMMARY
Monoclonal antibodies (mAbs) have proven to be useful as human protein
therapeutics because they bind to drug targets with high affinity and specificity and
exhibit a favorable pharmacokinetic profile. Phage display is a powerful and widely
used technology for the isolation of mAbs. In this thesis we present the use of phage
display for the isolation of monoclonal antibodies for therapeutic applications in
cancer and infectious disease.
The first part of the thesis describes the generation and affinity maturation of a human
monoclonal antibody (termed DS2) against the human urokinase (uPA) capable of
inhibiting its enzymatic activity with an IC50 value in the low nanomolar range. The
novel antibody cross-reacts with murine uPA. It was expressed both as scFv fragment
and in IgG format, allowing a systematic comparative immunofluorescence analysis
of the uPA expression patterns in a large panel of human and murine tumors and of
normal human tissue. While uPA was strongly expressed in virtually all tumor
specimens tested, it only exhibited a weak expression in certain normal tissues
(mainly in colon, lung, spleen and bone marrow). IgG(DS2) was not able to inhibit
cancer growth in immunocompromised mice bearing subcutaneous human MDAMB-231 or DoHH-2 tumors. However, an ex vivo immunofluorescence analysis
confirmed the ability of the DS2 antibody to preferentially localize at the tumor site
compared to normal organs. Collectively, these data suggest that uPA blocking
antibodies may not be indicated for cancer growth inhibition strategies, but may serve
as valuable tools for the implementation of pharmacodelivery strategies against a
variety of different tumors.
The second part of the thesis describes the isolation, affinity maturation and
characterization of a human monoclonal antibody (referred to as E7) specific to a
mycolactone analogue PG-73. Mycolactone is a toxin involved in Buruli ulcer, a
necrotizing skin disease caused by infection with Mycobacterium ulcerans.
Mycolactone is secreted by the bacteria and is considered to have cytotoxic and
immunosuppressive activities. Its mode of action is unclear, but in a guinea pig model
of the disease, purified mycolactone injected subcutaneously reproduces the natural
pathology, and mycolactone negative variants are avirulent, implying a key role for
1
9
the toxin in pathogenesis. The laboratory of K.H. Altmann synthesized the
mycolactone analogue PG-73 containing the macrolide core structure of the native
toxin. We successfully isolated a human monoclonal antibody specific to the PG-73
compound that allowed staining of M. ulcerans cultures in immunofluorescence and
immunohistochemistry assays indicating the binding of the E7 antibody to the native
mycolactone. The clone E7 is the first reported human monoclonal antibody specific
to mycolactone.
1
10
2 ZUSAMMENFASSUNG
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind eine etablierte Klasse von therapeutischen
Proteinen. Sie binden Zielmoleküle selektiv und mit hoher Affinität und zeichnen sich
durch ein vorteilhaftes pharmakokinetisches Profil aus. Phage display ist eine
nützliche und weit verbreitete Technologie für die Isolierung von mAbs. In dieser
Doktorarbeit beschreiben wir die Anwendung von Phage display für die Isolierung
von
monoklonalen
Antikörpern
für
den
therapeutischen
Einsatz
in
den
Indikationsgebieten Onkologie und Infektionskrankheiten.
Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Generation und Affinitätssteigerung eines
humanen Antikörpers (genannt DS2) gegen die humane Urokinase (uPA), der die
Aktivität des Enzyms mit einem IC50-Wert im tiefen nanomolaren Bereich hemmt.
Der neue Antikörper erkennt sowohl humanes als auch murines uPA. Er wurde
sowohl als scFv Fragment als auch im IgG Format produziert und erlaubte eine
systematische Immunfluoreszenzanalyse der uPA Expressionsprofile in einer Vielzahl
von menschlichen und murinen Tumoren und gesundem menschlichem Gewebe.
Während uPA in allen getesteten Tumoren stark exprimiert war, wurde nur in
gewissen gesunden Geweben (hauptsächlich Colon, Lunge, Milz und Knochenmark)
schwache Expression gefunden. Der Antikörper IgG(DS2) konnte das Wachstum von
MDA-MB-231 und DoHH-2 Tumoren in immundefizienten Mäusen nicht hemmen.
Aber eine ex vivo Immunfluoreszenzanalyse bestätigte die Eigenschaft des DS2
Antikörpers sich vornehmlich im Tumorgewebe und nicht in den gesunden Organen
anzureichern. Diese Resultate legen nahe, dass uPA blockierende Antikörper weniger
für die Hemmung von Tumorwachstum angezeigt sind, als mehr als wertvolle
Werkzeuge für die Entwicklung von Drugdelivery-Strategien gegen verschiedene
Tumore dienen können.
Der zweite Teil dieser Doktorarbeit erörtert die Isolierung, Affinitätssteigerung und
Charakterisierung eines humanen monoklonalen Antikörpers (genannt E7), der ein
Mycolactone-Analog PG-73 spezifisch bindet. Mycolactone ist ein Toxin, das mit
Buruli Ulkus in Verbindung gebracht wird, einer nekrotisierenden Hauterkrankung,
die durch Infektion mit Mycobacterium ulcerans verursacht wird. Mycolactone wird
von
1
den
Bakterien
sezerniert
und
steht
im
Verdacht,
zelltoxische
und
11
immunsupprimierende Wirkung zu haben. Der Wirkungsmechanismus ist nicht
geklärt, doch in einem Meerschweinchenmodell der Krankheit, führen Injektionen
von gereinigtem Mycolactone zu Buruli Ulkus-typischer Pathologie. Die Tatsache,
dass Mycolactone-negative Bakterien avirulent sind, unterstützt die Hypothese einer
Schlüsselrolle des Toxins in der Pathogenese von Buruli Ulkus. Das Labor von
Professor K.H. Altmann hat das Mycolactone-Analog PG-73 hergestellt, das die
komplette Macrolid-Kernstruktur des natürlichen Giftstoffes enthält. Es ist uns
gelungen, einen humanen monoklonalen Antikörper zu isolieren, der PG-73
spezifisch bindet. Der neue Antikörper färbte M. ulcerans Kulturen in
Immunfluoreszenz- und Immunhistochemie-Experimenten, was vermuten lässt, dass
der E7 Antikörper das native Mycolactone erkennt. Der Antikörperklon E7 ist der
erste beschriebene monoklonale Antikörper gegen Mycolactone.
1
12