Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zur
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zur neuronalen Protektion nach Einsatz lentiviral modifizierter Fibroblasten auf Cochlea-ImplantatOberflächen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Susanne Sasse Meseberg Hannover 2014 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. rer. nat. Karl-Heinz Esser Institut für Zoologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. med. Timo Stöver / Prof. Prof. Dr. med. Th. Lenarz Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover 1. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Karl-Heinz Esser 2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Michael Stern Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2014 Gefördert durch den Sonderforschungsbereich 599 „Biomedizintechnik“, Teilprojekt D2. MEINER FAMILIE INHALTSVERZEICHNIS Verzeichnis eigener Vorträge, Poster und publizierter Vortragskurzfassungen Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG ......................................................................................................................... 1 2 STAND DER FORSCHUNG ................................................................................................. 4 2.1 Das auditorische System der Säugetiere .......................................................................... 4 2.1.1 Anatomie des Hörorgans ....................................................................................... 5 2.1.2 Physiologie des Hörvorgangs................................................................................ 8 2.2 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung .................................................. 10 2.2.1 Pathophysiologie des sensorisch-neuralen Hörverlustes .................................... 11 2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung .................... 14 2.4 Innenohr-Drug-Delivery für auditorische Applikationen ............................................. 15 2.4.1 Methoden zum intracochleären Drug-Delivery .................................................. 16 2.5 Lentivirale Vektoren ..................................................................................................... 19 2.5.1 Green-fluorescent-protein (GFP) ........................................................................ 20 2.6 Neurotrophe Faktoren (NTF) ....................................................................................... 22 2.6.1 Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) ...................................................... 23 2.6.2 Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen ...................................................... 24 3 ZIELSETZUNG .................................................................................................................... 28 4 MATERIAL .......................................................................................................................... 30 4.1 Zelllinien und Primärzellen .......................................................................................... 30 4.1.1 Murine Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3 .............................................................. 30 4.1.2 Spiralganglienzellen ............................................................................................ 30 4.2 Lösungen für die NIH3T3-Zellkultivierung ................................................................. 31 4.3 Lösungen für die Spiralganglienzelldissektion und-Kultivierung ................................ 31 4.4 Lösungen für Markierung/Anfärbung von Neuriten (Histologie der SGZ-Kultur)...... 32 4.5 Lösungen für die Immundetektion ............................................................................... 32 4.6 Modellelektroden .......................................................................................................... 33 4.7 Versuchstiere ................................................................................................................ 34 5 METHODEN ........................................................................................................................ 35 5.1 In vitro .......................................................................................................................... 35 5.1.1 Übersicht über die In-vitro-Versuche ...................................................................... 35 5.1.2 Lentivirale Modifikation von NIH3T3-Zellen .................................................... 36 5.1.3 Kultivierung der NIH3T3-Fibroblasten .............................................................. 38 5.1.4 Aufbringen der NIH3T3/BDNF-Zellen auf die Probekörper (Biofunktionalisierung) ....................................................................................... 40 5.1.5 Untersuchung des Proliferationsverhalten von NIH3T3/BDNF auf Modellelektroden ................................................................................................ 41 5.1.6 Quantifizierung der BDNF-Konzentration biofunktionalisierter Modellelektroden ................................................................................................ 41 5.1.7 Spiralganglienzellpräparation und-kultivierung ................................................. 42 5.1.8 Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen mit NIH3T3/BDNF-besiedelten Modellelektroden ................................................................................................ 43 5.1.9 Immuncytochemische Untersuchung von Überlebensraten und Neuritenwachstum von Spiralganglienzellen...................................................... 45 5.1.10 Statistische Analyse ............................................................................................ 47 5.2 In vivo ........................................................................................................................... 47 5.2.1 Übersicht der In-vivo-Versuche .......................................................................... 47 5.2.2 Tierhaltung .......................................................................................................... 49 5.2.3 Narkose, Vor- und Nachsorge der Tiere ............................................................. 49 5.2.4 Bestimmung des Hörstatus vor Ertaubung ......................................................... 50 5.2.5 Ertaubung (Zerstörung der Haarzellen) .............................................................. 52 5.2.6 Zellaufbereitung für die Applikation als Suspension in das Innenohr ................ 54 5.2.7 Applikation der Zellsuspension in das Innenohr via Cochleostomie .................. 54 5.2.8 Implantation der biofunktionalisierten Modellelektrode ins Innenohr via Cochleostomie..................................................................................................... 57 5.2.9 Gewinnung und Aufarbeitung der implantierten Innenohre ............................... 57 5.2.10 Immunhistologie ................................................................................................. 62 5.2.11 Spiralganglienzell-Auszählung von HE-gefärbten Paraffinschnitten ................. 64 5.2.12 Statistische Analyse ............................................................................................ 67 6 ERGEBNISSE ....................................................................................................................... 68 6.1 In-vitro-Modell der Biofunktionalisierung ................................................................... 68 6.1.1 Generation und Charakterisierung von NIH3T3-Zellen ......................................... 68 6.1.2 Proliferation der NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Modellelektrode ..................... 69 6.1.3 BDNF-Freisetzung der NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Modellelektrode .......... 71 6.1.4 Bioaktiviät von BDNF in Ko-Kultur mit Spiralganglienzellen .......................... 72 6.2 In-vivo-Effekte biofunktionalisierter Modellelektroden............................................... 77 6.2.1 Auswertung der AABR-Messungen ................................................................... 77 6.2.2 Verteilung einer Suspension rekombinanter NIH3T3-Fibroblasten in der Cochlea hörender Versuchstiere ....................................................................................... 80 6.2.3 Detektion rekombinanter Fibroblasten nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden in die Cochlea hörender und ertaubter Tiere ......................... 82 6.2.4 Protektiver Effekt biofunktionalisierter Modellelektroden auf die Spiralganglienzelldichte im Innenohr nach Ertaubung ....................................... 85 7 DISKUSSION ....................................................................................................................... 90 7.1 In-vitro-Modell der Biofunktionalisierung der Modellelektroden ............................... 92 7.1.1 Proliferation der NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Silikonelastomeren und BDNFFreisetzung .......................................................................................................... 92 7.1.2 Biologische Wirkung immobilisierter NIH3T3/BDNF-Zellen auf Silikonelastomeren in Spiralganglienzellkultur ........................................................................................... 93 7.2 Biofunktionalisierte Modellelektroden im In-vivo-Modell .......................................... 95 7.2.2 Biologische Wirkung implantierter biofunktionalisierter Modellelektroden auf Spiralanglienzellen in vivo ........................................................................................... 96 7.3 Zusammenfassende Betrachtung der Methodik in vitro und in vivo .................. 99 7.4 Aktuelle Studien und Zukunftsperspektiven des Drug-Delivery im Innenohr und Nervengewebe ............................................................................................................ 101 8 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 104 9 SUMMARY ........................................................................................................................ 106 10 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................... 108 11 ANHANG.......................................................................................................................... 132 11.1 Reagenzien und Chemikalien................................................................................... 132 11.2 Pharmaka .................................................................................................................... 134 11.3 Kits und Antikörper ................................................................................................. 134 11.4 Geräte ....................................................................................................................... 135 11.5 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien ................................................................. 136 DANKSAGUNG ERKLÄRUNG Verzeichnis eigener Publikationen, Vorträge, Poster und publizierter Vortragskurzfassungen Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits publiziert bzw. in Form von Vorträgen, Postern und Vortragskurzfassungen (Abstracts) auf Kongressen vorgestellt: A. WARNECKE1, S. SASSE1, G.I. WENZEL, A. HOFFMANN, G. GROSS, G. PAASCHE, V. SCHEPER, U. REICH, K.-H. ESSER, T. LENARZ, T. STÖVER, K. WISSEL 1 these authors contributed equally to this work Stable release of BDNF from the fibroblast cell line NIH3T3 grown on silicone elastomers enhances survival of spiral ganglion cells in vitro and in vivo. In: Hearing Research (2012), 289 (1-2): 86-97 S. SASSE, K. WISSEL, A. HOFFMANN, G. GROSS, A. WARNECKE, T. LENARZ, T. STÖVER In-vitro-Studie zur Bioaktivität von BDNF-produzierenden NIH3T3-Fibroblasten auf CI-Elektrodenträgern In: 79. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-OhrenHeilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Bonn, 2008 (Poster, Kurzvortrag) S. SASSE, K. WISSEL, A. HOFFMANN, A. WARNECKE, G. GROSS, T. LENARZ, T. STÖVER Proliferation and bioactivity of BDNF producing fibroblasts grown on the surface of CI-electrode dummies In: 45th Inner Ear Biology Workshop, Ferrara, Italien, 2008 (Poster) S. SASSE, K. WISSEL, A. HOFFMANN, G. PAASCHE, A. WARNECKE, G. GROSS, T. LENARZ, T. STÖVER In vitro evaluation of transfected fibroblasts as drug delivery system on cochlear implant materials In: 3rd International Symposium, Interface Biology of Implants, Rostock, 2009 (Poster) S. SASSE, K. WISSEL, A. HOFFMANN, G. GROSS, A. WARNECKE, T. LENARZ, T. STÖVER Einsatz biofunktionalisierter Elektrodenträgermodelle in Spiralganglienzellkultur und Meerschweinchencochleae In: 80. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-OhrenHeilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Rostock, 2009 (Poster) Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern dargestellten Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt. Verzeichnis der im Text verwendeten wichtigsten Abkürzungen AABR Abb. ABC ABR abs. AEP Ak AP AT Aqua dest. BDNF BERA BSA Bp/bp bzw. ca. °C CCD Ch CI cm DAB DAPI dB DMEM DMSO DNA EDTA ELISA ES et al. etc. ext. FBS FGF g GDA GDNF GFP GFRα-1 h HBSS HS Hz IHC IgG akustisch evozierte auditorische Hirnstamm-Potentiale, acoustically evoked auditory brainstem response Abbildung Avidin-Biotin-Complex auditorische Hirnstammpotentiale, auditory brainstem response Absorption akustisch evozierte Potentiale, auditory evoked potentials Antikörper artifizielle Perilymphe Adenosintriphosphat Aqua destillata, destiliertes Wasser Brain-derived neurotrophic factor Hirnstammaudiometrie, brainstem evoked response audiometry bovines Serum Albumin Basenpaare beziehungsweise zirka Grad Celsius Charge-coupled device channel, Kanal Cochlea-Implantat Zentimeter Diaminobenzidin 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dezibel Zellkulturmedium (Dulbecco´s modified eagle medium) Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat Enzyme-Linked Immunosorbent Assay elektrische Stimulation et alii (und andere) et cetera, und so weiter Extinktion Fetal Bovine Serum Fibroblast Growth Factor Gramm Glutardialdehyd Glial cell line-derived neurotrophic factor grün fluoreszierendes Protein, green-fluorescent protein GDNF Family Receptor α 1 hora (Stunde) Hanks balanced salt solution Hörschwelle Hertz Innere Haarzellen, inner hair cells Immunglobulin G i.m. kg KGW kHz l LAVES μ μl μV m M ME mg min. ml mm mmol mol Mrd. MRT ms MSW mV N. n n NaCl ng NGF NIH/3T3 nm n.s. NS NT-3/4/5 NTF NTR NO OHC p P Pa PBS PBT PCR PEG PFA pH p.o. RNA RNS intramuskulär Kilogramm Körpergewicht Kiloherz Liter Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit mikro (x 106) Mikroliter Mikrovolt milli (x 103) Molekulargewicht Modellelektrode Milligramm Minuten Milliliter Millimeter Millimol Stoffmenge = 6,022137 × 1023 Teilchen Milliarde Magnetresonanztomographie Millisekunde Meerschweinchen Millivolt Nervus nano (x 109) Stichprobenumfang Natriumchlorid Nanogramm Nerve Growth Factor Mausfibroblasten Zelllinie Nanometer nicht signifikant Normalserum Neurotrophin-3, -4, -5 neurotrophe Faktoren Neurotrophinrezeptor Stickstoffmonoxid äußere Haarzellen, outer hair cells Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen) Druck Pascal phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PBS mit TritonX-100 Stammlösung Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) Polyethylenglykol Paraformaldehyd negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration per os ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) reactve nitrogen species ROS rpm s SAP Sc. s.c. SGZ siRNA SP SPL SPF St Std. Tab. TNT Trk-B Trk TSchG u.a. V V. v.a. Z z. B. ZNS reactive oxigen species rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) Sekunde Summenaktionspotential Scala subkutan Spiralganglienzellen kleine inhibitorische Ribonukleinsäure, small interfering ribonucleic acid Schalldruck (sound pressure) Schalldruckpegel (sound pressure level) spezifisch pathogen frei Stimulation Stunden Tabelle Tumor Nekrose Faktor Tyrosinkinase-Rezeptor B Tyrosin Kinase Tierschutzgesetz unter anderem Volt Vena vor allem Zellen zum Beispiel Zentrales Nervensystem Einleitung 1 EINLEITUNG Hörminderung und Taubheit stellen in Deutschland und Europa einen weitverbreiteten Krankheitskomplex dar. Fast jeder vierte Einwohner Deutschlands ist von Hörproblemen betroffen, wie eine Studie des Deutschen Grünen Kreuzes festgestellt hat. Hierbei handelt es sich in zunehmendem Maße um junge Erwachsene. Den größten Teil der Hörschädigungen stellt, neben den erworbenen Ursachen, wie beispielsweise Infektionskrankheiten, Alkohol, Nikotin, ototoxische Medikamente oder Lärm, der „sensorisch-neurale“ Hörverlust dar. Dieser ist oft angeborenen. Bei sensorisch-neuralem Hörverlust bezieht sich der Begriff „sensorisch“ auf das sensorische Hörepithel des Innenohres, auf die Haarzellen, und der Begriff „neural“ auf die Spiralganglienzellen des Innenohres, welche sich zum Hörnerv vereinigen. Nach Angaben des Deutschen Zentralregisters für kindliche Hörstörungen in Berlin ist das Hörvermögen von rund 80.000 Kindern so hochgradig gestört, dass sie spezielle Förderschulen besuchen müssen. Die Ursache von sensorisch-neuralem Hörverlust liegt hauptsächlich in dem Verlust von Haarzellen und der darauf folgenden Degeneration von Spiralganglienzellen (DODSON u. MOHUIDDIN, 2000; SPOENDLIN, 1984; WEBSTER u. WEBSTER, 1981; YAMAGATI et al., 2004). Eine spontane Regeneration des sensorischen Hörepithels von Säugern ist nicht möglich (BRIGANDE u. HELLER, 2009; MATSUI et al., 2005). Aus diesem Grund liegt die einzige therapeutische Möglichkeit für Patienten mit hochgradigem sensorisch-neuralem Hörverlust in einer chronisch-elektrischen Stimulation des Hörnervs mit Hilfe einer Innenohrprothese, dem sogenannten Cochlea-Implantat (CI) (LENARZ et al., 2006; LOIZOU et al., 2003; PETTINGILL et al., 2007). Da das CI darauf ausgerichtet ist den Hörnerv vornehmlich über die Spiralganglienzellen elektrisch zu stimulieren, ist eines der wichtigsten Ziele der Innenohrforschung der Schutz und die Regeneration dieser Zellen (SHIBATA et al., 2011). Auf diesem Weg soll eine Effizienzsteigerung des CIs erreicht werden, welche in einer Steigerung der Hörqualität von betroffenen Patienten resultiert. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass Spiralganglienzellen Rezeptoren zur Interaktion mit dem neurotrophen Wachstumsfaktor Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) exprimieren (TrkB und p75NTR), welcher Schlüsselfunktionen im Mechanismus des 1 Einleitung Zellüberlebens (ALTSCHULER et al., 1999; FRITZSCH et al., 1997) vermittelt. Die externe Applikation von BDNF konnte ein verbessertes Spiralganglienzellüberleben sowohl in vitro als auch in vivo (MCGUINNESS u. SHEPHERD, 2005; MILLER et al., 2007; SONG et al., 2009; WARNECKE et al., 2007) hervorrufen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass extern verabreichtes BDNF den protektiven Effekt von chronisch-elektrischer Stimulation des Hörnervs unterstützt (AGTERBERG et al., 2009; COCO et al., 2007; SHEPHERD et al., 2005; WEFSTEDT et al., 2005; YAMAGATI et al., 2004, SCHEPER et al., 2009). Auch aus diesem Grunde ist es von großer, klinischer Relevanz, nicht nur für den chronischelektrischen Stimulus zu sorgen, sondern gleichzeitig die Interaktion zwischen dem CI und dem Hörnerv positiv zu beeinflussen, indem man ein geeignetes Drug-Delivery-System zur Bereitstellung von neurotrophen Faktoren im Innenohr einsetzt. Faktoren wie die kurze Halbwertszeit von neurotrophen Wachstumsfaktoren im Serum, das Unvermögen die Blut-Cochlea-Schranke zu überwinden und die daraus resultierende Applikation hoher Konzentrationen, gilt es im Hinblick auf eine mögliche systemische Applikation ins Innenohr zu bedenken (KISHINO et al., 2001). Um eine lokale Gabe von neurotrophen Wachstumsfaktoren zu gewährleisten, wurden verschiedene Applikationssysteme getestet, wie beispielsweise Mini-Osmotische Pumpen (BROWN et al., 1993) zur chronischen Infusion von Medikamenten in das Innenohr von ertaubten Meerschweinchen und Mäusen (JOHNSON et al., 2010; RICHARDSON et al., 2009; STEACKER et al., 2010). Neben dem Vorteil der Regulation der abgegebenen Lösungsmenge erhöht diese Art der Medikamentenapplikation allerdings die chirurgische Komplexität, die Gefahr von Infektionen und die Gefahr der Schädigung des bestehenden Resthörvermögens (McCALL et al., 2010). Auch virale Vektoren für die Gentherapie konnten erfolgreich als Transporter für neurotrophe Faktoren eingesetzt werden, wobei sie eine langanhaltende, stabile Expression von therapeutischen Genen aufwiesen (IZUMIKAWA et al., 2005; KANZAKI et al., 2002; NAKAIZUMI et al., 2004; SHIBATA et al., 20010; WANG et al., 2007; WISE et al., 2010). Andererseits bergen diese viralen Vektoren auch hohe potentielle Risiken, betreffend Toxizität und Infektionen (ISHIMOTO et al., 2002 und 2003). Ein Hinüberwandern viraler Vektoren auf die kontralaterale Seite, wie auch ein Einwandern ins Gehirn über den 2 Einleitung Aqueductus cochleae, limitieren den klinischen Einsatz (KHO et al., 2000; LALWANI et al., 2002; STÖVER et al., 2000). Neben dem Einsatz von non-viralem Gentransfer, als weniger toxische Möglichkeit für die cochleäre Medikamentenzufuhr (JERO et al., 2001; STAECKER et al., 2001; WAREING et al., 1999), verspricht eine zellvermittelte Abgabe von bioaktiven Wachstumsfaktoren ins Innenohr eine ernstzunehmende Alternative zu sein (OKANO et al., 2006, PETTINGILL et al., 2008, 2010; WISSEL et al., 2008). Ein auf Zellen basierendes Drug-Delivery-System mit genetisch modifizierten Zellen, könnte eine zukünftige Lösung für ein lokales, beständiges Langzeit-Applikations-System für das Innenohr darstellen. Nach dem gegenwärtigen Erkenntnisstand ist eines der Hauptanliegen der Innenohrforschung ein biofunktionalisiertes Cochleaimplantat zu generieren. Dies soll modifizierten Zellen ermöglichen, auf ihrer Elektrodenoberfläche bioaktive Wachstumsfaktoren bereitzustellen. Diese Form einer Langzeitapplikation hat das Ziel, die Nerven-Elektroden-Interaktion durch ein gezieltes Axonenwachstum in Richtung solcher Elektroden zu optimieren. 3 Stand der Forschung 2 STAND DER FORSCHUNG 2.1 Das auditorische System der Säugetiere Das auditorische System der Säugetiere lässt sich in einen peripheren Anteil, das eigentliche Ohr (Auris, Organum vestibulocochleare), und einen zentralen Anteil, die zentrale Hörbahn, unterteilen. Das Ohr dient als Hörorgan der Wahrnehmung von Schall und als Gleichgewichtsorgan dem Dreh- und Lagesinn. Anatomisch und funktionell lässt sich das Ohr bei Säugetieren in drei Abschnitte untergliedern: das äußere Ohr (Auris externa), das Mittelohr (Auris media) und das Innenohr (Auris interna). Während das Gleichgewichtsorgan allein im Innenohr liegt, sind die dem Hören dienenden Strukturen in allen Abschnitten des Ohres zu finden (NICKEL et al., 2003). Im Folgenden soll näher auf das Hörorgan (Abb. 1) eingegangen werden. Abb. 1: Übersicht über das Hör- und Gleichgewichtsorgan des Menschen (Quelle: BOENNINGHAUS u. LENARZ, 2007). 4 Stand der Forschung 2.1.1 Anatomie des Hörorgans Das äußere Ohr beginnt mit der Ohrmuschel (Auricula), gebildet von einem elastischen Muschelknorpel (Cartilago auriculae), und setzt sich im äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) fort. Dieser besitzt einen knorpeligen und nach medial knöchernen Anteil, der am spangenförmigen Paukenring (Anulus tympanicus) endet, in den das Trommelfell (Membrana tympani) eingespannt ist (SEIFERLE, 1992). An das Trommelfell schließt sich die knöcherne, luftgefüllte Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres an, in der sich die der Schallleitung dienende Gehörknöchelchenkette (Ossicula auditus) befindet. Die Ossikelkette, bestehend aus Hammer (Malleus), Amboss (Incus) und Steigbügel (Stapes) stellt eine bewegliche Verbindung zwischen dem Trommelfell und dem Ovalen Fenster (Fenestra vestibuli) dar. Der Hammerschaft (Manubrium mallei) ist am Umbo membranae tympani mit dem Trommelfell fest verwachsen. Der Steigbügel grenzt mit seiner Fußplatte (Basis stapedis) an das Ovale Fenster. Die Ohrtrompete (Tuba auditiva, Eustachische Röhre) stellt eine Verbindung zum Rachenraum her und dient dem Druckausgleich und Sekretabfluss. Das Innenohr besteht aus einem knöchernen Labyrinth (Labyrinthus osseus) und einem darin liegenden häutigen Labyrinth (Labyrinthus membranaceus). Das häutige Labyrinth besteht aus zwei funktionellen Teilen, die miteinander in Verbindung stehen. Es enthält die Sinnesrezeptoren des Gleichgewichtsorgans (Vestibularapparat) im sogenannten Vorhof (Vestibulum) und den Bogengängen (Canales semicirculares ossei) sowie Sinnesrezeptoren des Gehörorgans in der sich rostroventral anschließenden Hörschnecke (Cochlea). Zwischen knöchernem und häutigem Labyrinth befindet sich ein perilymphatischer Raum (Spatium perilymphaticum), der sowohl über den Aquaeductus vestibuli als auch über den Aquaeductus cochleae (Ductus perilymphaticus) mit dem Cavum leptomeningicum der Schädelhöhle in Verbindung steht und so einen Flüssigkeitsaustausch mit dem Liquor cerebrospinalis ermöglicht. Das häutige Labyrinth selbst ist mit visköser Endolymphe gefüllt. Die Hörschnecke (Cochlea) windet sich um die konusförmige Schneckenspindel (Modiolus) (Abb. 2) und weist beim Menschen ungefähr 2,75 und beim Meerschweinchen 3,5 bis nahezu 4 sich jeweils verjüngende Windungen auf (NADOL, 1988). Im Gegensatz zur anatomischen Situation beim Menschen liegt die Cochlea des Meerschweinchens fast frei im Mittelohr vor und wird hier durch eine dünne Knochenwandung von diesem abgegrenzt. Vom Modiolus 5 Stand der Forschung springt eine ebenfalls spiralförmig verlaufende, dünne Knochenlamelle (Lamina spiralis ossea) in den Schneckengang vor und teilt den Schneckenkanal (Canalis spiralis) in die oberhalb gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) und die unterhalb gelegene Paukentreppe (Scala tympani). Die Scala vestibuli entspringt am Ovalen Fenster und geht an der Schneckenspitze (Cupula cochleae) im Schneckenloch (Helicotrema) in die Scala tympani über, die schließlich am Runden Fenster (Fenestra cochleae) endet, das beim Meerschweinchen eine ungefähr 1,18 mm2 große Membran darstellt (GHIZ et al., 2001). Diese miteinander kommunizierenden Scalen sind perilymphatisch gefüllt, wobei das Gesamtvolumen etwa 15,94 μl (SHINOMORI et al., 2001) beträgt. Der zwischen den beiden Räumen liegende Schlauch des häutigen Labyrinthes (Ductus cochlearis, Scala media) wird durch die Reißnersche Membran (Membrana vestibularis) von der Scala vestibuli und durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) von der Scala tympani getrennt (Abb. 2). Die Basilarmembran stellt die Grundlage des Cortischen Organs dar und weist beim Menschen eine Länge von durchschnittlich 35 mm und beim Meerschweinchen eine Länge von 16,4 ± 1,4 mm (LINSS et al., 2007) auf. Lateral wird die Scala media von der Stria vascularis begrenzt, einem vielschichtigen, gut vaskularisierten Epithel. Es dient der Versorgung der Strukturen mit kaliumreicher Endolymphe. Das Volumen der Scala media beträgt etwa 4,69 μl (SHINOMORI et al., 2001). Das Cortische Organ (Organum spirale), welches das akustische Rezeptorenfeld aus Haarsinneszellen und die sie in ihrer Lage haltenden Stützzellen beinhaltet, befindet sich auf der Basilarmembran (Lamina basilaris), die zwischen einer knöchernen Leiste am Modiolus (Lamina spiralis ossea) und dem Ligamentum spirale lokalisiert ist (Abb. 2). Zu Pfeilerzellen umgewandelte Stützzellen bilden den Cortischen Tunnel, auf dessen axialer Seite sich eine Reihe innerer Haarzellen befindet, während peripher drei bis maximal fünf Reihen äußere Haarzellen vorhanden sind. Jede Haarzelle besitzt an ihrem apikalen Ende Sinneshärchen (Stereovilli), die in die Scala media hineinragen und im Fall der äußeren Haarzellen fest in Verbindung stehen mit der sie bedeckenden Tektorialmembran (Membrana tectoria) während die der inneren Haarzellen frei in die Endolymphe ragen (HOTH u. LENARZ, 1997)(Abb. 3). Die Ansatzstelle für die Tektorialmembran stellt der obere Rand (Labium limbi vestibulare) des Limbus spiralis osseae dar, der das Cortische Organ modiolusseitig begrenzt. Im Gegensatz zu den inneren Haarzellen, die nur passiv auf Schalldruckwellen reagieren, sind 6 Stand der Forschung äußere Haarzellen mittels eines Prestin-basierten Mechanismus aktiv zur Kontraktion befähigt (DALLOS et al., 2008). Abb. 2: Darstellung eines Querschnitts durch eine Windung der Cochlea (Quelle: SEIFERLE, 1992). 7 Stand der Forschung Abb. 3: Bau des Cortischen Organs als akustisches Rezeptorenfeld im Innenohr (Quelle: BOENNINGHAUS u. LENARZ, 2007). 2.1.2 Physiologie des Hörvorgangs Das Hörorgan reagiert auf adäquate akustische Reize in Form von Schallwellen, die sich von einem schwingenden Körper (Schallquelle) ausgehend als Druck- bzw. Dichteschwankungen in elastischen Medien (Gase, Flüssigkeiten, Festkörper) ausbreiten. Physikalisch werden Schallwellen sowohl durch die Amplitude (Schalldruck=Lautstärke) als auch durch die Frequenz (=Tonhöhe) der Druckschwankungen näher definiert (ENGELHARDT u. BREVES, 2000). Die Schallintensität, die vom menschlichen Ohr verarbeitet werden kann umfasst einen so großen Bereich, dass die Verwendung eines Schalldruckpegels (SPL=sound pressure level) als logarithmisches Maß sinnvoll erscheint. Dieser wird in Dezibel (dB) angegeben (ENGELHARDT u. BREVES, 2000). Das menschliche Ohr kann Schallintensitäten von 0 bis 120 dB SPL verarbeiten. 8 Stand der Forschung Wirbeltiere zeigen artspezifisch sehr unterschiedliche frequenzbezogene Hörbereiche, wobei die für den Menschen wahrnehmbaren Töne ein Spektrum von 20 bis 20.000 Hz umfassen (LEHNHARDT u. LASZIG, 2001). Bei den ursprünglich nachtjagenden Carnivoren ist die Hörfähigkeit besser ausgeprägt, was nicht nur das in den Ultraschallbereich reichende Frequenzmaximum (bis 60 kHz) betrifft, sondern auch die Sensitivität des Hörens. So liegt die Hörschwellenkurve der Katze zwischen 1 und 10 kHz fast 20 dB niedriger als die des Menschen. Spitzenreiter in der Ultraschallwahrnehmung sind Fledermäuse und Delphine, die Frequenzen bis zu 200 kHz wahrnehmen (PENZLIN, 1991). Dahingegen sind einige Vögel (z. B. Tauben) in der Lage, Infraschall von weniger als 1 Hz wahrzunehmen (SCHMIDTNIELSEN, 1999). Meerschweinchen hören in einem Frequenzbereich von 50 Hz bis 50 kHz (FAY, 1988). Der Hörvorgang kann als Ablauf dreier aufeinander folgender Ereignisse beschrieben werden: - Schallantransport (Konduktion) durch Luft oder Flüssigkeiten - Transformation (Transduktion) der mechanischen Schallenergie in neurale Aktivität - Erregungsfortleitung (Transmission) entlang der zentralen Hörbahn zur Verarbeitung und Wahrnehmung von Qualität und Intensität des Schalls. Der Luftschall wird von der Ohrmuschel aufgefangen und durch den äußeren Gehörgang zum Trommelfell geleitet, das von den Schallwellen in Schwingung versetzt wird. Der Hammer ist in das Trommelfell eingelassen und überträgt dessen Schwingungen über den Amboss und den Steigbügel, der mit seiner Fußplatte am Ovalen Fenster befestigt ist, auf das flüssigkeitsgefüllte Innenohr. Die Auslenkung des Ovalen Fensters durch die Steigbügelplatte bewirkt eine Volumenverschiebung der nicht kompressiblen Perilymphe, so dass eine frequenz- und intensitätsabhängige Wanderwelle entsteht, die in der Scala vestibuli entlang der Windungen der Cochlea über das Helicotrema und in der Scala tympani zurück zum runden Fenster läuft. Da die Breite der Basilarmembran trotz enger werdenen Kanals auf Kosten der Lamina spiralis ossea zunimmt, ergibt sich eine um das Vielfache höhere Steifigkeit der Basiliarmembran an der Basis als am Apex. Die Breite nimmt hierbei von ca. 0,04 mm an der Basis bis auf 0,5 mm an der Schneckenspitze zu. Auf ihrem Weg zum Apex wächst die Amplitude der Wanderwelle stetig an. Sie hat ihre maximale Amplitude an einem bestimmten Ort der Basilarmembran. Schwingungen hoher Frequenz haben ihr Amplitudenmaximum in Steigbügelnähe, niederfrequente Töne hingegen werden in der Nähe 9 Stand der Forschung des Helicotremas abgebildet (ALLEN 1980). Tongemische werden an der Basilarmembran aufgespreizt, was auch als Frequenzdispersion bezeichnet wird (LEONHARDT 1990). Durch die Schwingungen der Endolymphe kommt es zu einer Auslenkung der Basilarmembran und einer relativen Verschiebung der Tektorialmembran. Dies wiederum bewirkt eine tangentiale Verschiebung der Stereovilli und damit einen adäquaten Reiz für die Haarzellen. Durch Ablenkung der Stereovilli der Haarzellen werden Ionenkanäle der apikalen Haarzellmembran geöffnet. Es kommt zu einem Einstrom von K+-Ionen aus der Endolymphe und damit zu einer Depolarisation der Zelle, was einen weiteren Einstrom von Ca2+-Ionen aus der Perilymphe bewirkt. Durch Freisetzung von Neurotransmittern an der Haarzellbasis kommt es zum Aufbau eines postsynaptischen Generatorpotentials (ABBAS, 1988). Für die Übermittlung der Sinnesinformationen sind überwiegend die inneren Haarzellen zuständig. Die äußeren Haarzellen besitzen neben der Fähigkeit zur mechano-elektrischen Transduktion auch motorische Eigenschaften durch einen Prestin-basierten Mechanismus. Auf Beschallung reagieren sie mit einer Kontraktion (elektro-mechanische Transduktion), die den Abstand zwischen Basilar- und Tektorialmembran verkürzt, was wiederum die Amplitude der Welle verstärkt und benachbarte Basilarmembranabschnitte dämpft. Als cochleäre Vorverstärker ermöglichen die äußeren Haarzellen so den inneren Haarzellen auch bei sehr schwachen akustischen Reizen sensorisch wirksam zu werden und steigern somit erheblich die Empfindlichkeit des Gehörs. Die Aktionspotentiale der afferenten Fasern der Spiralganglienzellen werden über den Hörnerv weitergeleitet und erreichen letztendlich über die Anteile der zentralen Hörbahn die Hörrinde (ENGELHARDT u. BREVES, 2000). 2.2 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung Hörminderung und Taubheit sind in Deutschland inzwischen ein weit verbreitetes Problem, welches zunehmend an Bedeutung gewinnt. Hierbei lassen sich verschiedene Arten der Schwerhörigkeit unterscheiden. Abhängig von der Lokalisation der Störung unterscheidet man die Schallleitungs- und Schallempfindungsschwerhörigkeit. Bei der Schallleitungsschwerhörigkeit handelt es um eine konduktive Hörstörung mit Ursache im Außen- oder Mittelohr, wohingegen die Schallempfindungsschwerhörigkeit, auch als 10 Stand der Forschung sensorisch-neuraler Hörverlust bezeichnet, cochleär oder retrocochleär bedingt ist. Hierbei können die Sinneszellen (Haarzellen), der Hörnerv oder das zentrale Nervensystem betroffen sein (HOTH u. LENARZ, 1994). Bei einer konduktiven Hörstörung wird weniger Schallenergie über die Gehörknöchelchenkette auf die Cochlea mit ihren Sinneszellen übertragen. Es kommt zu einer Dämpfung des wirksamen Schalldrucks und damit zu einer Verschlechterung des Hörvermögens bei intaktem Innenohr. Ursächlich kommt für die Schallleitungsschwerhörigkeit eine Versteifung, Dämpfung oder Blockierung des konduktiven Systems in Frage. So können beispielsweise eine übermäßige Ansammlung von Cerumen, Fremdkörper oder Gewebsproliferationen im äußeren Gehörgang die Schallwellen daran hindern können, das Trommelfell zu erreichen. Trommelfellrupturen, Mittelohrentzündungen, Tumoren, Otosklerose oder bei der Katze besonders häufig auftretende Mittelohrpolypen können ebenfalls zu einem konduktiven Hörverlust führen (VENKER-VAN HAAGEN, 2006). Auf den sensorisch-neuralen Hörverlust soll im Folgenden genauer eingegangen werden, da sich die vorliegende Arbeit mit viral modifizierten Zellen auf Modellelektroden als lokales Drug-Delivery-System im Innenohr beschäftigt, was einen therapeutischen Einsatz bei Schallempfindungsschwerhörigkeit ermöglichen soll. 2.2.1 Pathophysiologie des sensorisch-neuralen Hörverlustes Die häufigste Form der Schwerhörigkeit beim Menschen ist der sensorische Hörverlust, die sogenannte Innenohrschwerhörigkeit. Diese wird durch den irreversiblen Verlust von Haarzellen im cortischen Organ verursacht. Auch Schädigungen am Hörnerv und zentralen Nervensystem, wie beispielsweise Tumore (Akustikusneurinome), Traumata und entzündliche Veränderungen (Meningitis) können zu Hörminderung und Taubheit führen. Innenohrschäden können zum einen kongenital (angeboren) auftreten, wobei man zwischen heriditären (genetisch bedingten), pränatalen (vor der Geburt erworben) und perinatalen Störungen (während der Geburt erworben) unterscheidet. Sie können aber auch postnatal erworben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ, 2007). Ursachen pränatal erworbener Hörstörungen können Infektionen der Mutter während der Schwangerschaft (z. B. Röteln, Toxoplasmose), Stoffwechselerkrankungen (z. B. Diabetes 11 Stand der Forschung mellitus, Hypothyreose), Medikamenteneinnahme (z. B. Contergan) oder Alkoholmissbrauch sein. Perinatal sind vor allem Geburtstraumen, die mit Hypoxie einhergehen, mögliche Ursachen einer Hörstörung. Bei den heriditären Hörschädigungen unterscheidet man syndromale und nicht-syndromale Ausprägungen, die sowohl rezessiv als auch dominant vererbt werden können. Syndromale Erkrankungen können mit Augensymptomen (z. B. Cogan-Syndrom, Waardenberg-Klein-Syndrom), mit Nierenerkrankungen (z. B. AlportSyndrom) oder mit Schilddrüsensymptomen (z. B. Pendred-Syndrom) vergesellschaftet sein. Bei den nicht-syndromalen Taubheitsursachen stellt die Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31 (LEFEBVRE u. VAN DE WATER, 2000; LIU et al., 2009) eine zentrale Gruppe beim Menschen dar. Auch bei Hunden und Katzen, die taub geboren werden und erst ab dem 5. bis 7. Tag nach der Geburt akustische Reize aufnehmen können, wurden heriditäre Innenohrdefekte untersucht und zum Teil als Tiermodell für das Waardenburg-Syndrom des Menschen genutzt, das durch angeborene Taubheit in Assoziation mit Pigmentierungsstörungen von Haut, Haar und Iris gekennzeichnet ist (WAARDENBURG, 1951). Bei Hunden ist die angeborene Taubheit v.a. bei Dalmatinern sehr gut untersucht (MAIR, 1976; HOLLIDAY et al., 1992), aber auch die Merle-Pigmentierung (z. B. MerleSheltie, Blue-Merle-Collie, Tigerdogge) und das Tragen des Piebald-Gens (z. B. Bullterrier, Samoyede, Greyhound) sind mit Taubheit assoziiert. Auch die Taubheit weißer Katzen ist eingehend studiert worden (MAIR, 1973), wobei die primäre Degeneration der epithelialen und sensorischen Elemente bereits in der ersten Woche nach der Geburt auftritt und sich die sekundäre Degeneration der neuronalen Strukturen erst danach entwickelt (BOSHER u. HALLPIKE, 1965; PUJOL et al., 1977). Postnatal erworbener sensorischer Hörverlust geht mit einer Zerstörung zuvor intakter Haarzellen einher. Eine mechanische Schädigung kann dabei durch akutes oder chronisches akustisches Trauma (PLINKERT u. DE MADDALENA, 1996) oder ein stumpfes Schädeltrauma entstehen, während mit zunehmendem Alter degenerative Prozesse zu Altersschwerhörigkeit (Presbyakusis) führen können. Auch Ototoxine spielen eine wesentliche Rolle bei erworbenen Hörschädigungen. Sie können unterschiedlichen Ursprungs sein, wie beispielweise aus Infektionskrankheiten (z. B. Mumps, Fleckfieber, Borreliose) hervorgehen oder Mittelohrentzündungen entstammen. Auch Stoffwechselprodukte, die bei Schilddrüsen-, Leber- oder Nierenfunktionsstörungen auftreten, können potentiell ototoxisch 12 Stand der Forschung wirken. Exogene Noxen, die neben der Lärmexposition auch in experimentellen Studien Anwendung finden (WEST et al., 1973), stellen ototoxische Medikamente wie beispielsweise Aminoglykosidantibiotika (z. B. Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gentamicin), Diuretika (z. B. Furosemid, Etacrynsäure) und Zytostatika (z. B. Cisplatin, Carboplatin) dar. Dabei ist nicht nur eine lokale Applikation der Substanzen toxisch, wenn diese beispielsweise bei Perforation des Trommelfells die semipermeable Membran des Runden Fensters durchdringen, sondern auch die systemische Verabreichung der Medikamente. Sowohl Lärmexposition als auch Aminoglykoside führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) und reaktiver Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS), die wiederum die Bildung freier Radikale einleiten (OHINATA et al., 2000; YAMASHITA et al., 2004). Auch die Aktivierung der Stickstoffmonoxid-Synthase führt über eine erhöhte NO-Produktion zur Bildung freier Radikale, was die Haarzellschädigung weiter steigert. Über identische Signalwege kommt es so zu einer Haarzellschädigung mit anschließender -apoptose beginnend an der Basis der Cochlea mit fortschreitendem Haarzellverlust nach apikal in Abhängigkeit von Dosis und Dauer der Applikation. Nach initialer Schädigung der Haarsinneszellen kommt es sekundär zu einer Degeneration der nachgeschalteten Spiralganglienzellen (OTTE et al., 1978; SPOENDLIN, 1984), wobei eine Apoptose großer Teile der Spiralganglienzellpopulation bereits innerhalb weniger Stunden nach intracochleärer Aminoglykosidinjektion nachzuweisen ist. Mit dem Verlust der Haarzellen fehlt zum einen der Input der Spiralganglienzellen, zum anderen aber auch die Bildung neurotropher Faktoren durch die Sinneszellen und damit der trophische Effekt auf die Spiralganglienzellen. Mit Verlust der chemischen und neurotrophen Stimulation in Folge des Haarzelluntergangs zeigt sich eine Spiralganglienzelldegeneration, die durch eine exzitotoxischen Wirkung des Neurotransmitters Glutamat auf die afferenten Neuronen noch verstärkt wird. 13 Stand der Forschung 2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung Die einzige therapeutische Möglichkeit für Patienten mit hochgradigem sensorisch-neuralen Hörverlust liegt in einer chronisch, elektrischen Stimulation des Hörnervs mit Hilfe einer Innenohrprothese, dem sogenannten Cochlea-Implantat (CI) (LENARZ et al., 2006; LOIZOU et al., 2003; PETTINGILL et al., 2007). Mit Hilfe des CIs kann das Sprachverständnis wiedererlagt werden was eine erhebliche Steigerung der Lebensqualität betroffener Menschen bewirkt (CLARK et al., 1987; MATSCHKE u. PLATH, 1988). Grundvoraussetzung für die Implantation solch einer Prothese ist eine rein sensorisch bedingte cochleäre Taubheit mit erhaltener Leitfähigkeit des Hörnervs und intakter zentraler Hörbahn. Nur in einem solchen Fall kann das Implantat durch direkte elektrische Reizung der Spiralganglienzellen die Funktion der Haarzellen übernehmen und einen Höreindruck vermitteln (LENARZ, 1998). Das CI setzt sich aus mehreren Einzelkomponenten zusammen. Dazu gehören die eigentliche Cochlea-Implantat-Elektrode, je eine Sende- und Empfangsspule, ein Sprachprozessor und ein Mikrophon. Akustische Informationen werden über das Mikrophon aufgenommen und in Form elektrischer Signale dem Sprachprozessor zugeleitet, der sie nach Filterung, Komprimierung und Entrauschung in entsprechend kodierte Impulse umwandelt. Dieses elektrische Signalmuster wird induktiv von der transkutanen Sendespule auf die subkutane retroauriculär implantierte Empfängerspule übertragen (LEHNHARDT et al., 1986). Schließlich wird die Information an die intracochleär implantierte Mehrkanalelektrode weitergeleitet, die indirekten Kontakt mit dem Spiralganglion hat. Die Reizelektrode wird über das Runde Fenster oder per Cochleostomie in die Scala tympani eingeführt, wobei eine möglichst modiolusnahe Insertion einen engen Nerven-Elektroden-Kontakt sicherstellen soll (SHEPHERD et al., 1993). Die je nach Hersteller bis zu 22 Elektrodenkontakte sind unterschiedlich tief in der Cochlea positioniert und können so verschiedene Abschnitte der Basilarmembran jeweils getrennt voneinander tonotop reizen. Die selektive Stimulation der einzelnen Fasern des Hörnervs bewirkt schließlich analog zum physiologischen Hörvorgang eine Aktivierung der zentralen Hörbahn bis hinauf zum auditorischen Cortex, wo der Höreindruck erzeugt wird (LENARZ, 1997). 14 Stand der Forschung Der Erfolg der Implantation hängt im Wesentlichen von einer guten Nerv-ElektrodenInteraktion ab. Hierzu sind eine möglichst modiolusnahe Insertion der Elektrode sowie eine weitgehende Unterdrückung der Bindegewebsproliferation notwendig. Zusätzlich beeinflusst die Anzahl funktionsfähiger Spiralganglienzellen den späteren Höreindruck und das Sprachverständnis (SUTTON, 1983). Die therapeutischen Maßnahmen beinhalten die Applikation entzündungshemmender Glukokortikoide zur Reduktion des Bindegewebes, aber auch die Intervention mit neurotrophen Faktoren, Genen oder elektrischer Stimulation, um eine fortschreitende Spiralganglienzelldegeneration aufzuhalten (WEFSTAEDT et al., 2006). Um gezielt an bestimmten Zelltypen angreifen und auch einen Langzeiteffekt erzielen zu können, ist es nötig neue Drug-Delivery-Systeme und regenerative Therapien zu entwickeln, die mit dem CI kombinierbar sind. 2.4 In Innenohr-Drug-Delivery für auditorische Applikationen vorangegangenen Studien wurden bereits Möglichkeiten untersucht, die Spiralganglienzelldegeneration nach Ertaubung aufzuhalten bzw. umzukehren. Ein protektiver Effekt auf Spiralganglienzellen konnte für verschiedene neurotrophe Faktoren, wie beispielsweise BDNF, GDNF, FGF und NT-3 (ERNFORS et al., 1996; STAECKER et al., 1998; YAGI et al., 2000; MCGUINNESS u. SHEPHERD, 2005; MARUYAMA et al., 2008) im Innenohr nachgewiesen werden. Sowohl einzelne Faktoren als auch Kombinationen untereinander oder mit elektrischer Stimulation (KANZAKI et al., 2002; SHEPHERD et al., 2005; SHEPHERD et al., 2008, SCHEPER et al., 2009) führten zu einer höheren Spiralganglienzellzahl. Hierbei handelt es sich allerdings nicht um Langzeiteffekte. So sinkt beispielsweise unmittelbar nach dem Einstellen der BDNF-Behandlung die Anzahl der überlebenden Neuronen, die sich dann nicht mehr von der unbehandelten Seite unterscheidet (GILLESPIE et al., 2003). Die Rate der neuronalen Degeneration nimmt im Verhältnis zu ertaubten, unbehandelten Cochleae sogar signifikant zu. Das Ziel einer dauerhaft erfolgreichen Therapie wird nicht erreicht. Hierzu gibt es verschiedene Ansatzmöglichkeiten. Gene neurotropher Faktoren können in die Zellen eingeschleust werden, um Spiralganglien- oder Haarzellen zu protektieren und zu regenerieren. Entsprechende Versuche mit GDNF, BDNF und NT-3, allein oder in 15 Stand der Forschung Kombination mit elektrischer Stimulation, waren bereits erfolgreich (LALWANI et al., 1996; YAGI et al., 2000; REJALI et al., 2007). Eine weitere Möglichkeit ist die Regeneration von funktionellen Haarzellen, indem sie aus Stützzellen transdifferenziert werden, wie es für Atoh1 (Atonal homolog 1 Gene) gezeigt werden konnte, einem Gen, das in der embryonalen Entwicklung des Corti-Organs eine wesentliche Rolle spielt (KAWAMOTO et al., 2003; IZUMIKAWA et al., 2005, CHONKO et al., 2013). Desweiteren könnten Gene, deren Dysfunktion oder Mutation mit Hörverlust assoziiert ist, als Ziel im Mittelpunkt der Gentherapie stehen (LEFEBVRE u. VAN DE WATER, 2000; LIU et al., 2009). Als Beispiel sei das GJB2-Gen genannt, welches das gap-junction Protein Connexin 26 kodiert und dessen Mutation zum angeborenen sensorineuralen Hörverlust führt und damit auch einen Angriffspunkt für eine mögliche Gentherapie darstellt (KUDO et al., 2003; VAN EYKEN et al., 2007). 2.4.1 Methoden zum intracochleären Drug-Delivery Viele Innenohrerkrankungen können über eine systemische Verabreichung von Medikamenten nicht adequat behandelt werden. Die Blut-Cochlea-Barriere limitiert die Konzentration und die Molekülgröße der in das Innenohr applizierbaren Stoffe (KISHINO et al., 2001). Dies bedeutet, dass zum Erreichen der Zellen des Innenohrs eine lokale Therapie mit Pharmaka oft die einzige Interventionsmöglichkeit darstellt. Dabei können die verschiedenen Methoden der Wirkstoffapplikation danach unterschieden werden, ob sie intratympanal, also in das Mittelohr oder intracochleär erfolgen. Bei der intratympanalen Verabreichung müssen die Wirkstoffe durch die Rundfenstermembran diffundieren, um sich danach in der Scala tympani ausbreiten zu können, was zu einem großen Konzentrationsgradienten zwischen Basis und Apex führen kann. Die Rundfenstermembran stellt auch eine physikalische Barriere dar, die in ihrer Dicke und Durchlässigkeit große individuelle Unterschiede aufweisen kann (PLONTKE et al., 2002, BANERJEE u. PARNES, 2004), was eine kontrollierte Dosierung beim einzelnen Patienten deutlich erschwert. Andererseits ist das Mittelohr leicht zugänglich und das entsprechende chirurgische Trauma verhältnismäßig gering. Die intracochleäre Applikation bietet dagegen einen direkten Zugang zu den sensorischen und neuronalen Zellen. Auch die Wirkstoffverteilung in apikale 16 Stand der Forschung Regionen kann besser erfolgen. Durch die direkte Applikation in die Perilymphe ist die Auswahl der Moleküle nicht mehr limitiert und es kann eine wesentlich präzisere Dosierung erfolgen. Andererseits ist die Gefahr eines chirurgischen Traumas größer und in das Innenohr eingebrachte Langzeitkatheter bergen zudem das Risiko einer reaktiven Bindegewebsproliferation in der Scala tympani. Es gibt verschiedene Methoden der intracochleären Dauerapplikation. Die einfachste Möglichkeit direkt eine Substanz in das Innenohr einzubringen, ist eine Bolusapplikation. So kann beispielsweise mit der CochleaImplantation einmalig eine Glukokortikoidapplikation erfolgen, was nachweislich die reaktive Fibrosierung minimiert und damit zu geringeren Elektrodenimpedanzen führt (DE CEULAER et al., 2003; PAASCHE et al., 2006a). Auch die Applikation über Mikrokatheter oder osmotische Pumpen ist möglich und wurde schon in einigen Studien eingesetzt. Dieser Ansatz ist aber nur zeitlich befristet umsetzbar, da das Risiko der Fibrosierung der Hörschnecke besteht (BROWN et al., 1993; CARVALHO u. LALWANI, 1999, RICHARDSON et al., 2009). Die Kombination der Elektrode mit einem Injektionskatheter zur Medikamentenapplikation stellt dennoch einen interessanten Ansatz zur Lokaltherapie des Innenohres dar (PAASCHE et al., 2003; HOCHMAIR et al., 2006; PAASCHE et al., 2006b). Desweiteren konnten virale Vektoren erfolgreich als Transporter für neurotrophe Faktoren eingesetzt werden. Sie versprechen im Vergleich zur systemischen Applikation eine stabile Langzeitexpression der therapeutischen Gene (KANZAKI et al., 2002; NAKAIZUMI et al., 2004; IZUMIKAWA et al., 2005; WANG et al., 2007; SHIBATA et al., 2009). Andererseits bergen diese Vektoren ein hohes Potential an Toxizität und Infektionsrisiko (ISHIMOTO et al., 2002 u. 2003; ITO et al., 2005). Ein Hinüberwandern viraler Vektoren auf die kontralaterale Ohrseite, und somit auch ein Einwandern ins Gehirn über den Aqueductus cochleae limitieren den klinischen Einsatz (KHO et al., 2000; LALWANI et al., 2002; STÖVER et al., 2000). Als erste nicht-virale Vektoren wurden Liposomen untersucht, die sich durch einfache Produktion, geringe Toxizität und fehlende immunologische Effekte auszeichnen. Leider war der Wirkstofftransport nicht zielgerichtet und die Effizienz des Gentransfers nur sehr unzureichend (WAREING et al., 1999; STAECKER et al., 2001), so dass aktuelle Studien versuchen die genannten Eigenschaften in Nanopartikeln zu vereinen. Neben dem Einsatz des nicht-viralen Gentransfers als weniger toxischen Ansatz für die cochleäre Applikation von Pharmaka (WAREING et al., 1999; JERO et al., 2001a; 17 Stand der Forschung STAECKER et al., 2001) ist die zellbasierte Therapie eine mögliche Alternative, um bioaktive Wachstumsfaktoren im Innenohr freizusetzen (OKANO et al., 2006, PETTINGILL et al., 2008; WISSEL et al., 2008). Eine für die Zukunft sehr vielversprechende zellbasierte Therapieoption stellt der Einsatz mesenchymaler Stammzellen dar, die als pluripotente xenogene oder autologe Transplantate in die Cochlea verbracht werden können (LI et al., 2004; NAITO et al., 2004; MATSUOKA et al., 2007). Für die Regeneration der sensorischen Zellen ist es in diesem Fall nicht nur von Bedeutung, die Zellen gezielt an den gewünschten Wirkort zu bringen, sondern sie müssen sich auch zum korrekten Phänotyp ausdifferenzieren und die passende dreidimensionale Gewebestruktur annehmen, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Dieses Entwicklungsfeld ist noch sehr jung, so dass die für die richtige Differenzierung der Stammzellen benötigten Umweltbedingungen noch zu untersuchen sind. In einer Studie von REJALI et al. (2007) wurden viral modifizierte Fibroblasten, die BDNF produzieren, in eine Agarosematrix eingekapselt und über eine modifizierte Elektrode ins Innenohr verbracht, was zu einer verbesserten Spiralganglienzellprotektion führte, die allerdings nach apikal abnahm. Bisher gibt es keine verlässliche Aussage darüber, wie lange die BDNF-Produktion hier anhält und wie sich diese Bindegewebsvorläuferzellen in der Cochlea verhalten. Das Aufbringen von modifizierten Zellen auf das CI als Lieferant von neurotrophen Faktoren, um der Degeneration von Spiralganglienzellen entgegen zu wirken ist ein vielversprechender Ansatz für die anwendungsorientierte Innenohrforschung und daher auch Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. In Zukunft sollen auf diese Weise biofunktionalisierte Elektroden im Tier zum Einsatz kommen, um den Effekt von BDNF, welcher durch die auf den Elektroden fixierten Zellen bereit gestellt wird, durch elektrische Stimulation zu verstärken. 18 Stand der Forschung 2.5 Lentivirale Vektoren Da es in der vorliegenden Arbeit hauptsächlich um Untersuchungen zu lentiviral modifizierten NIH3T3-Mausfibroblasten geht, soll in diesem Abschnitt kurz auf virale Vektoren eingegangen werden. Für einen möglichen Gentransfer, also das Einschleusen von genetischer Information in die Zelle, sind Transfersysteme, sogenannte Vektoren notwendig. Dabei werden nicht-virale von viralen Vektoren unterschieden, wobei letztere eine höhere Effizienz aufweisen, da vor allem bei den Retroviren eine stabile Genom-Integration möglich ist. Der Vektor kann direkt in das Zielgewebe eingebracht werden (In-vivo-Gentherapie), jedoch besteht hierbei die Gefahr, dass nicht-betroffene Zellen ebenfalls transfiziert werden. Größere Sicherheit bietet die Ex-vivo-Gentherapie, bei der dem Patienten Zellen entnommen, in vitro gentechnisch verändert und anschließend retransplantiert werden (BOSCH, 2003). Retrovirale Vektoren sind sowohl wichtige Hilfsmittel für den experimentellen Gentransfer als auch im klinischen Einsatz (DALY u. CHERNAJOVSKY, 2000). Diese Vektoren sind frei von viralen Genen, nicht-immunogen und sie schleusen das therapeutische Gen so in die Chromosomen des Empfängers, dass eine Weitergabe an Tochterzellen gewährleistet ist. Trotz Einsatz des retroviralen Gentransfers gibt es in vielen klinischen Studien signifikante Einschränkungen. Eine davon ist die Möglichkeit, dass sich durch Rekombination in der Verpackungszelllinie ein replikations-kompetentes Virus bilden kann. Weitere Einschränkungen sind unter anderem die insertionale Mutagenese in der Zielzelle (zufälliger Einbau des viralen Gens), Inaktivierung der viralen Partikel durch das humane Komplementsystem und die eingeschränkte Fähigkeit verschiedene Zelltypen und Regionen der Zellchromosomen zu erkennen sowie das Phänomen des stillen Transgens (MILLER et al., 1990, VILLE u. RUSSEL, 1995, KLIMATCHEVA et al., 1999). Lentiviren sind eine Gattung innerhalb der Retroviren. Sie können im Gegensatz zu Gammaretroviren auch ruhende Zellen infizieren und haben daher ein potentiell breiteres Anwendungsspektrum. Die komplexere Biologie der Lentiviren ist der Grund, warum die Entwicklung von Vektoren aus Lentiviren schwieriger ist und weshalb diese Vektoren erst nach längerer Vorlaufzeit brauchbare Ergebnisse, wie beispielsweise hohe Titer lieferten (KAFRI, 2004). Nach einer im November 2006 publizierten ersten klinischen Studie, bei der lentivirale Vektoren zum Einsatz kamen, um die Replikation von HIV-1 in Patienten mit Aids 19 Stand der Forschung zu unterdrücken, wurde eine positive Bilanz gezogen (KOHN et al.,2007). Gene, die Proteine kodieren, können mit Hilfe von viralen Vektoren exprimiert werden, um die Funktion des jeweiligen Proteins zu untersuchen. Vektoren, besonders retrovirale Vektoren, die stabile Markergene, wie das Green-fluorescent-protein (GFP) exprimieren, werden für die permanente Markierung von Zellen eingesetzt, um sie und ihre Nachkommen verfolgen zu können. 2.5.1 Green-fluorescent-protein (GFP) Das grün-fluoreszierende Protein (GFP), ein Protein aus der Qualle Aequorea victoria (SHIMOMURA et al., 1962) (Abb. 4), wird als Reportergen zur Markierung von bestimmten Zielzellen im Gewebe und in der Zellkultur (TSIEN et al., 1998, GONG et al., 2003; TAM u. ROSSANT, 2003, MARUVADA et al., 2003) eingesetzt. Seine unschätzbare Bedeutung in der Biologie, insbesondere der Zellbiologie, liegt in der Möglichkeit, GFP mit beliebigen anderen Proteinen Gen-spezifisch zu fusionieren. Durch die Fluoreszenz des GFP kann so die räumliche und zeitliche Verteilung des anderen Proteins in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen direkt beobachtet werden. So wurden zum Beispiel zellspezifische PromoterGFP-Reporter-Konstrukte eingesetzt um Zellen innerhalb eines definierten Bereiches zu identifizieren. Letzteres war in primärer Zellkultur (KALAJZIC et al., 2003), in Zellen kurz vor der Apoptose (HARVEY et al., 2001) und in sich entwickelnden Embryonen (GRANT et al., 2000; MA et al., 2002; MIGNONE et al., 2004) möglich. In der vorliegenden Studie wurde GFP als Markergen in die mit BDNF transfizierten NIH3T3-Mausfibroblasten eingebracht. Der große Erfolg von GFP basiert mitunter darin, dass man es im lebenden Gewebe oder in Gewebeschnitten, beispielsweise mit Konfokaler Laser Mikroskopie oder herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen sichtbar machen kann (Abb. 5). 20 Stand der Forschung Abb. 4: GFP wurde das erste Mal 1962 aus einem biolumineszenten Meeresorganismus, der Hydromedusa (Qualle) Aequorea victoria gewonnen (SHIMOMURA et al., 1962). 21 Stand der Forschung Abb. 5: Exzitations- und Emissionsspektrum von GFP (Quelle: modifiziert nach www.umbc.edu). 2.6 Neurotrophe Faktoren (NTF) Nervenwachstumsfaktoren, sogenannte neurotrophe Faktoren (NTF= neurotrophic factor), sind Signalstoffe, die an membranständige Rezeptoren binden, welche von allen Nervenzellen im peripheren und zentralen Nervensystem exprimiert werden. Von der Entwicklung bis hin zur Ausreifung und phänotypischen Bestimmung von Neuronen sind sie von entscheidener Bedeutung (STAECKER et al., 2001). Es handelt sich hierbei um endogene, lösliche Proteine, welche das Überleben, das Wachstum sowie die morphologische Plastizität von Neuronen, oder die Synthese von Proteinen für differenzierte Neuronenfunktionen regulieren (LOUGHLIN u. FALLON, 1993). Ausgehend von ihrer nervenernährenden (neurotrophen) Funktion sind sie unentbehrlich für das Überleben von Neuronen (STAECKER et al., 2001). Während der embryonalen und postnatalen Entwicklung regulieren sie die Differenzierung und das Überleben von Neuronen im gesamten Nervensystem. Im adulten Nervensystem 22 Stand der Forschung spielen sie eine wichtige Rolle für die Erhaltung der synaptischen Verbindungsfähigkeit und Plastizität (MANESS et al., 1994). Aufgrund struktureller und funktioneller Homologien sowie spezifischer Affinitäten für bestimmte Rezeptortypen unterteilt man die NTF in mindestens vier verschiedene Familien: - die Neurotrophine, welche die am besten charakterisierte Familie der neurotrophen Faktoren darstellt, - die Fibroblast Growth Factor (FGF)-Familie (acidic und basic fibroblast growth factor, aFGF und bFGF), - die neuropoetischen Cytokine (z.B. ciliary neurotrophic factor, CNTF) und - die GDNF Familie (LIPTON u. KALIL, 1995). Neurotrophe Wachstumsfaktoren spielen eine wichtige Rolle während der Entwicklung des auditorischen Systems, von der morphologischen Ausbildung des endolymphatischen Ganges über die Größe der SGZ-Population bis hin zur neuronalen Verschaltung. Diese Wirkungen führten zu der Hypothese, dass NTF einer traumatisch bedingten SGZ-Degeneration entgegenwirken könnten (GILLESPIE u. SHEPHERD, 2005). Für einige Faktoren wie z.B. GDNF und BDNF konnte im Rahmen von In-vitro und In-vivo-Versuchen eine Protektion der SGZ nach Ertaubung nachgewiesen werden. Im Folgenden soll speziell auf den Brain-derived Neurotrophic Factor eingegangen werden, welcher als Protektor von Spiralganglienzellen einer der Hauptakteure der vorliegenden Arbeit darstellt. 2.6.1 Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) BDNF gehört zusammen mit dem Nerve Growth Factor (NGF), dem Neurotrophin-3 (NT-3) sowie dem Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) zu der am besten charakterisierten Familie der neurotrophen Faktoren, zu den Neurotrophinen (GILLESPIE u. SHEPHERD, 2005). Viele Studien belegen die unterstützenden, trophischen Eigenschaften der Neurotrophine bezüglich des Überlebens von Spiralganglienzellen nach Verletzung oder Trauma (PETTINGILL et al., 2007; YAMAGATA. et al., 2004; WARNECKE. et al., 2007; SHINOHARA et al., 2001). Neurotrophine sind, wie die anderen neurotrophen Faktoren, körpereigene Signalstoffe, welche sich an membranständige Rezeptoren binden. Es gibt für Neurotrophine hoch- und niedrigaffine Rezeptoren. Rezeptoren mit hoher Affinität sind die drei Tyrosinkinase- 23 Stand der Forschung Rezeptoren trkA (NGF), trkB (BDNF) und trkC (NT-3). Sie binden nur bestimmte Neurotrophine spezifisch, wobei TrkB der BDNF-bindende-Rezeptor ist (HUANG u. REICHARDT, 2001). Ein Rezeptor mit vergleichsweise niedriger Affinität ist der p75NTR. Er ist in der Lage alle fünf Neurotrophine zu binden. Die Bindungsaffinitäten der einzelnen Rezeptoren können zum Teil überlappen (STEACKER et al., 2001). Ein Binden an diese Rezeptoren bewirkt durch die Vermittlung einer Reihe von intrazellulären Signalkaskaden, (wie z.B. MAPK pathway, PI-3 Kinase pathway, PLC pathway) positive Signale, welche das Überleben und das Wachstum der Neuronen beeinflussen. Dem niedrigaffinen Rezeptor p75NTR (p75 Neurotrophin-Rezeptor), welcher mit der Fas/TNF-Rezeptorfamilie verwandt ist, wurde hingegen unter bestimmten Umständen eine Beteiligung am programmierten Zelltod zugesprochen (BREDESEN, 1995; BARKER, 1998). Diese Vermittlung von Signalen spielt eine überaus wichtige Rolle für die neuronale Entwicklung und im übergeordneten Sinne für Aktivitäten des Gehirns wie Lernen und Erinnerung. Fritzsch et al., konnten den neurotrophen Faktoren auch bei der Entwicklung des auditorischen Systems eine wichtige Rolle zuweisen, insbesondere während der Innervierung des sensorischen Epithels ausgehend vom Spiralganglion (FRITZSCH et al., 1997; FRITZSCH et al., 1999; GILLESPIE et al., 2003). Mittels In-situ-Hybridisierung konnte die Expression von BDNF und NT-3 sowie deren Rezeptoren trkB und trkC, im Corti-Organ und den afferenten Neuronen bestätigt werden (PIRVOLA et al., 1992; YLIKOSKI et al., 1993). 2.6.2 Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen In der Innenohrforschung gibt es inzwischen viele Studien, die einen protektiven Effekt von BDNF auf das Überleben von SGZ belegen. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass BDNF, im Gegensatz zu Neurotrophin-freien Kontrollkulturen, das SGZ-Überleben signifikant steigert (ZHENG et al., 1995; MALGRANGE et al., 1996; MARZELLA et al., 1999, WEFSTAEDT et al., 2005). Darüber hinaus konnten PIRVOLA et al., (1992) bei der Ratte demonstrieren, dass BDNF sowohl das Überleben als auch das Auswachsen von Neuriten aus kultivierten Spiralganglienzellexplantaten fördern kann. LEFEBVRE et al., (1994) führten Versuche an Kulturen adulter Ratten-SGZ durch und wiesen nach, dass BDNF auch hier zu einem signifikanten Anstieg der SGZ-Überlebensrate führt. 24 Stand der Forschung Andere In-vitro-Studien belegen über die Erhöhung des SGZ-Überlebens hinaus, dass BDNF Spiralganglienzellen vor den ototoxischen Folgen von Aminoglykosiden (LALWANI et al., 2002; GAO, 1999), therapeutischen Medikamenten (GAO, 1999) und Chemotherapeutika (ZHENG u. GAO, 1996; GAO, 1999; DUAN et al., 2002) schützen kann. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten In-vitro demonstrieren, dass BDNF-Konzentrationen von 50 ng im Vergleich zu anderen Konzentrationen, die stärkste SGZ-protektive Wirkung entfalten (ZHENG et al., 1995; HEGARTY et al., 1997; MOU et al., 1997; WEFSTAEDT et al., 2005). WEFSTAEDT et al., (2005) verglichen den SGZ-protektierenden Effekt von 25, 50 und 100 ng/ml BDNF und GDNF auf Kulturen dissoziierter postnataler SGZ (Ratten) und kamen zu dem Ergebnis, dass BDNF in allen getesteten Konzentrationen einen effektiveren SGZ-Schutz gewährleistet als GDNF. In-vivo-Studien demonstrieren, dass die Freisetzung von BDNF im Innenohr die sekundäre Degeneration der Spiralganglienzellen nach Haarzellverlust verringern kann (MCGUINNESS u. SHEPHERD, 2005, SONG et al., 2009). Es zeigte sich, dass eine verzögerte BDNFApplikation protektiv auf SGZ wirkt. An ertaubten Meerschweinchen wurde nachgewiesen, dass intracochleaer verabreichtes BDNF mit einer Konzentration von 50 ng/ml, ab dem siebten Tag nach ototoxischer Behandlung ein verbessertes Haar- und Spiralganglienzellüberleben bewirkt (MILLER et al., 1997, MILLER et al., 2007). Einen Tag nach Ertaubung (LALWANI et al., 2002 (adenoviral)) und fünf Tage nach Ertaubung beginnende vierwöchige (GILLESPIE et al., 2003) und achtwöchige (STAECKER et al., 1996) BDNF-Behandlungen von ototoxisch ertaubten Meerschweinchen führten zu einem entsprechendem Ergebnis. NAKAIZUMI et al., (2004) applizierten BDNF mittels adenoviraler Vektoren 7 Tage nach Ertaubung in die Scala tympani und erzielten damit ein ähnlich gutes Spiralganglienzellüberleben. SHEPHERD et al., (2005) demonstrierten, dass nach Aminoglykosid/Furosemid-induzierter Ertaubung von Meerschweinchen eine BDNFKonzentration von 62,5 μg/ml, ab dem fünften Tag nach Ertaubung für 28 Tage intracochleaer verabreicht, die Anzahl überlebender SGZ, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, signifikant erhöht. In einer Studie von GILLESPIE et al., 2003 wurde nach Abbruch der BDNF-Therapie der Effekt auf die Spiralganglienzellen von ertaubten Meerschweinchen getestet. Hierzu verglich man die unbehandelten, ertaubten Ohren mit den behandelten, ertaubten Ohren. Die Degenerationsrate der zuvor behandelten Chochleae stieg 25 Stand der Forschung schneller als die der unbehandelten. Es wird vermutet, dass die BDNF-Applikation nach Ertaubung nicht nur wichtig für das Spiralganglienzellüberleben ist, sondern gleichzeitig bzw. gleichsam essentiell für das Überleben von „Unterstützungszellen“ ist, welche wiederum den Anteil von endogen-freigesetztem BDNF bestimmen. Demnach ist es maßgeblich die BDNFFreisetzung in der Cochlea nach Ertaubung sowohl exogen durch implantierte Zellen als auch endogen über den Erhalt von „Satellitenzellen“ in der Cochlea nach Ertaubung zu gewährleisten. REJALI et al. (2007) verbrachten transgene Fibroblasten, die BDNF produzieren, in eine Agarosematrix und über eine modifizierte Elektrode ins Innenohr, was zu einer verbesserten Spiralganglienzellprotektion nach 48 Tagen führte. Hierbei verwendeten die Autoren adenoviral transfizierte NIH3T3-Mausfibroblasten. In einer weiteren Studie konnten OKANO et al., (2006) das Überleben von viral modifizierten NIH3T3-Zellen im Innenohr demonstrieren. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit genetisch modifizierter Zellen nach Transplantation im Innenohr zu überleben und dabei auch erfolgreich bioaktive Faktoren abgeben zu können. Die Transplantation genetisch modifizierter Zellen als Drug-DeliverySystem für das Innenohr scheint eine bessere Alternative, als die Applikation von Faktoren in flüssiger Form. Erstens garantieren diese Zellen eine Langzeitapplikation der Faktoren und zweitens wird durch ihren Einsatz eine Expansion des cochleären Flüssigkeitsvolumens umgangen. Nach neueren Studien (EVANS et al., 2008; WARNECKE et al., 2007) scheint eine langsame, kontinuierliche Freisetzung von BDNF in niedriger Konzentration (circa 5ng/ml BDNF) effektiver zu sein, als die exogene Applikation über osmotische Pumpen mit initial höheren Konzentrationen (50-100ng/ml) (MILLER et al., 1997; SHINOHARA et al., 2002; MCGUINNESS et al., 2005; SHEPHERD et al., 2008; AGTERBERG et al., 2009). WARNECKE et al., 2008, konnten in ihrer In-vitro-Studie mit neonatalen Ratten zeigen, dass BDNF, freigesetzt von lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen, nicht nur das Überleben von Spiralganglienzellen unterstützt, sondern auch die Induktion von Neuritenwachstums fördert. Auf diesen Ergebnissen basierend sollen in der vorliegenden Arbeit die Untersuchungen weiter vertieft werden. BDNF-produzierende NIH3T3-Zellen sollen hier auf Modellelektroden aufgebracht und deren Effektivität In-vitro und In-vivo am Modell des Meerschweinchens getestet werden. Die vorliegend dargestellte Biofunktionalisierung einer Modellelektrode mit modifizierten Fibroblasten als Drug-Delivery-System bietet beste 26 Stand der Forschung Voraussetzungen für eine dauerhafte Applikation von BDNF durch proliferierende Zellen und verhindert somit möglicherweise eine plötzliche, rapide Degeneration von SGZ. 27 Zielsetzung 3 ZIELSETZUNG Basierend auf aktuellen Forschungsergebnissen wurde in der vorliegenden Studie die Hypothese aufgestellt, dass die dauerhafte Applikation von Wachstumsfaktoren in das Innenohr zur Verhinderung rapider Spiralganglienzelldegeneration, ein dem Gewebe verwandtes und adaptives Applikationssystem voraussetzt. Aufgrund dieser Hypothese war es naheliegend lebende Zellen einzusetzen. Diese wurden lentiviral modifiziert und auf Silikonelastomeren fixiert, um als Applikationssystem zeitlich nahezu unbegrenzt den Wachstumsfaktor BDNF in das Innenohr abzugeben. Zunächst wurde ein In-vitro-Modell mit lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen, adherierend auf der Oberfläche von Silikonelastomeren, im Folgenden als Modellelektroden bezeichnet, etabliert. Diese biofunktionalisierten Modellelektroden wurden in In-vitro-Versuchsreihen auf drei wichtige Parameter untersucht: - Proliferationsfähigkeit der adherierenden Zellen - Freisetzung des Wachstumsfaktors BDNF in das umgebende Medium - Bioaktivität des Konstrukts in Spiraganglienzellkultur. In anschließenden In-vivo-Experimenten wurde eine mögliche neuroprotektive Wirkung der biofunktionalisierten Modellelektroden auf Spiralganglienzellen in ertaubten Tieren untersucht. Hierbei wurden folgende Schwerpunkte gesetzt: - Nachweis von NIH3T3-Fibroblasten, welche zur BDNF-Produktion lentiviral modifiziert wurden (NIH3T3/BDNF), im Innenohr nach Verabreichung einer Zellsuspension - Nachweis von NIH3T3/BDNF-Zellen im Innenohr und auf dem Trägermaterial nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden im hörenden Tier - Nachweis von NIH3T3/BDNF-Zellen nach Implantation Modellelektroden im ertaubten Tier (Innenohr/Trägermaterial) 28 biofunktionalisierter Zielsetzung - Ermittlung eines biologischen Effektes nach Verabreichung von NIH3T3/BDNF-Zellen als Suspension im ertaubten Tier - Ermittlung eines biologischen Effektes nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden im ertaubten Tier. 29 Material 4 MATERIAL Ein Verzeichnis der verwendeten Reagenzien, Chemikalien, Pharmaka, Kits und Antikörper sowie Verbrauchsmaterialien und Geräte befindet sich in Tabellenform in Kapitel 11. 4.1 Zelllinien und Primärzellen 4.1.1 Murine Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3 Zur Etablierung eines zellbasierten lokalen Drug-Delivery wurde die immortalisierte murine Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3 verwendet. Die Arbeitsgruppe von Dr. Gerhard Groß am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI, Braunschweig) führte die lentivirale Modifikation zur Doxycyclin-induzierten Expression des neurotrophen Faktors (Brainderived neurotrophic factor, BDNF) und des „green fluorescent“-Proteins (GFP, s. Kap. 5.1.2) der Zellen aus. Nicht-infizierte NIH3T3-Zellen wurden als Negativkontrolle im In-vitroModell der Biofunktionalisierung eingesetzt. 4.1.2 Spiralganglienzellen Aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts wurden im Alter von 3-5 Tagen die Spiralganglienzellen aus den Cochleae gewonnen. Die hierfür benötigten Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Vorgaben des deutschen Tierschutzgesetzes (TSchG, §4(3)) und im Einvernehmen mit dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Oldenburg) verwendet. 30 Material 4.2 Lösungen für die NIH3T3-Zellkultivierung NIH3T3-Zellkulturmedium Dulbecco’s modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/l Glukose, 3,7 g/l NaHCO3, Na-Pyruvat und stabilem Glutamin 1,028 g/l (11.1) 10% Fötales Rinderserum (11.1) 1% Penicillin /Streptomycin (11.1) Kryomedium 95% Fötales Rinderserum (11.1) 5% Dimethylsulfoxid (11.1) PBS (Phosphate-buffered Saline) 500 ml Reinstwasser eine Tablette PBS (11.1) 4.3 Lösungen für die Spiralganglienzelldissektion und-Kultivierung Enzymatische Verdauungslösung zur Spiralganglienzell-Vereinzelung 100 ml Hank’s Salzlösung (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+ (11.1) 0,1 g Trypsin (11.1) 0,01 g DNAse I (11.1) 0,01 g Collagenase (11.1) Poly-D/L-Ornithin-Lösung 3 ml PBS 30 µl Poly-D/L-Ornithin 10 mg/ml 31 Material Laminin-Lösung 3 ml PBS 45 µl Laminin 0,67 mg/ml Trypsinlösung (0,124%) 0,62 g Trypsin (11.1) 4 g NaCl (11.1) 0,1 g KCl (11.1) 0,1 g KH2PO4 (11.1) 0,57 g Na2HPO4 x 2H2O (11.1) 0,62 g Titriplex III (11.1) 4.4 Lösungen für Markierung/Anfärbung von Neuriten (Histologie der SGZ-Kultur) Bis auf den Anti-Neurofilament-Antikörper und PBS wurden alle Lösungen, Reagenzien, Brücken-Antikörper aus Kits benutzt (11.1). 4.5 Lösungen für die Immundetektion 20% EDTA-Lösung in Reinstwasser (11.1) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (11.1) 1M Natronlauge zum Klären (11.1) Antigendemaskierung 0,05% Trypsinlösung in PBS (11.1) Blockierung unspezifischer Bindungen 32 Material FBS 1:20 in 0,1% TritonX-100 gelöst in PBT (11.1) PBT (0,1%) 5 ml TritonX-100 Stammlösung (11.1) 995 ml PBS (11.1) Antikörperverdünnungspuffer FBS 1:50 in 0,1% PBT (11.1) 1% Bovines Serum Albumin (BSA) in 0,1% PBT (11.1) 4.6 Modellelektroden Als Modellelektroden für die In-vitro-Versuchsreihen wurden Silikon-Elastomere (MED4234, Laser Zentrum, Garbsen) von 1cm Länge und 0,4 mm Durchmesser verwendet (Abb. 6, A). Für die In-vivo-Versuchsreihen wurden gleichlange Silikon-Elastomere mit einem Durchmesser von 4 mm verwendet, die im Inneren mit Platindrähten verstärkt waren (CTC, Mechelen, Belgien) (Abb. 6 B). Abb. 6: A: REM-Aufnahme einer Modellelektrode aus Silikon-Elastomeren. B: Modellelektrode mit Platindrähten (Details siehe Text). 33 Material 4.7 Versuchstiere Für den tierexperimentellen Teil der Arbeit wurden Meerschweinchen als Versuchstiere gewählt. Die Cochlea von Meerschweinchen ist für otochirurgische Manipulationen besonders gut zugänglich. Zusätzlich lässt die Größe des Versuchstieres die Applikation von Lösungen in die Cochlea mit Hilfe von Applikationsschläuchen und das Einführen von Modellelektroden zu. In der vorliegenden Arbeit wurden pigmentierte Meerschweinchen des BFA-Stammes beiderlei Geschlechts mit einem Ausgangsgewicht von 250 bis 450 g verwendet. Die Tiere stammen aus der Zucht der Firma Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld. Das Tierversuchsvorhaben wurde gemäß § 8 des Deutschen Tierschutzgesetzes durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Oldenburg) unter der Antragsnummer 05/1051 genehmigt. Die Durchführung der Studie erfolgte in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz und mit der EU-Richtlinie 86/609/EWG zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere. 34 Methoden 5 METHODEN 5.1 In vitro 5.1.1 Übersicht über die In-vitro-Versuche Lentiviral modifizierte NIH3T3-Zellen, mit der Fähigkeit den neurotrophen Wachstumsfaktor BDNF zu sezernieren wurden auf Silikonelastomere (als Modell einer CI-Elektrode) aufgebracht und auf a) ihr Proliferationsverhalten, b) BDNF-Freisetzung in das umgebende Medium und c) einen biologischen Effekt auf Spiralganglienzellen in Ko-Kultur untersucht (Abb. 7). Abb. 7: Übersicht über die In-vitro-Versuche (BDNF= Brain-derived neurotrophic factor, SGZ= Spiralganglienzellen, ME= Modellelektroden). 35 Methoden 5.1.2 Lentivirale Modifikation von NIH3T3-Zellen Für die Herstellung einer stabilen, GFP- und BDNF-exprimierenden Fibroblastenzelllinie wurde die murine NIH3T3-Zelllinie lentiviral mit den Vektoren pLOX-TwGFP und pLOXBDNF transfiziert (Abb. 8). Dies erfolgte in der Arbeitsgruppe von Dr. Gerhard Groß am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI, Braunschweig). Hierzu waren die folgenden Arbeitsschritte notwendig: Lentivirale Vektorkonstruktion Mit Hilfe der “Polymerase-Kettenreaktion (PCR= Polymerase Chain Reaction)“ wurde humanes BDNF aus gepoolten, humanen Glioblastoma cDNAs (Zelllinien U251-MG, U-343, A-172, A-582) geklont und in den lentiviralen Expressionsvektor pLOX-TwGFP (SALMON et al., 2000) eingebracht. BDNF cDNA wurde bei einer Temperatur von 54.6°C unter Einsatz des Enzyms “Turbo-Pfu DNA Polymerase” (11.1) vervielfältigt. Nach Anleitung des Herstellers wurden ein vorwärts lesender Primer (5´tataggatccgccaccatgaccatccttttccttactatg) und ein rückwärts lesender Primer (5´-gcgcgtcgacctatcttccccttttaatggtcaatg) eingesetzt. Ein 744 bp-Fragment wurde über Nacht mit Bam HI und Sal I (11.1) zweimal verdaut und ligiert. Die Vollständigkeit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung im ABI Prism 310 Kapillarsequenzierer (BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (11.1)) überprüft. Generierung des lentiviralen Vektors Zur Generierung des Lentivirus wurden humane embryonale Nieren-293T (HEK293T)-Zellen (1x 107Z/145 cm2 Petrischale) in High-glucose Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM, 11.1) mit 10% FBS (11.1), 100 U/ml Penicillin (11.1) und 100 µg/ml Streptomycin (11.1) bei 37°C and 5% CO2 über Nacht kultiviert und anschließend mit den jeweiligen Vektoren pUCL-MIK (Tetracyclin-abhänginger Transaktivator), pLOX-TwGFP oder pLOX-BDNF und pMD.G VSV-G plus pCMVR8.2 mit Hilfe der „Calzium-Phosphat-Technik“ für jeweils 48 und 72 Stunden infiziert. Das vom pUCL-MIK-Plasmid stammende Virus wird im Folgenden als “MIK-Virus” bezeichnet. Entsprechend wird das vom pLOX-TwGFP-Plasmid stammende als “GFP-Virus” und das vom pLOX-BDNF-Plasmid stammende als BDNF-Virus bezeichnet 36 Methoden Titration des Lentivirus Von jedem viralen Überstand wurden jeweils 10 µl (MIK-, GFP- und BDNF-Virus) mit 50 µl eines Trizol-Reagenz zum RNA-Preparieren nach Anleitung des Herstellers (Invitrogen) gemischt sowie mit einem pLOX-reverse Primer (5´-gttaagaataccagtcaatctttcac) transfiziert. Aliquots von cDNA (pur und verdünnt) wurden zusammen mit einer GoTaq-DANNPolymerase (11.1) zur PCR gegeben. Als Standard wurde der Vektor für die Virusproduktion genutzt (10 ng auf 1 pg). Als Primer-Paare für die Titration wurden genutzt: - GFP-Virus (für 5´-ccccatgcccgaaggctacgtcc) in Kombination mit reverser-pLOX, - BDNF-Virus (für 5´-gcctggagacgccatccacgctg) zusammen mit reverser-pLOX, - MIK-Virus (für 5´-ggcggtggtgctttgtc) und (reverse 5´-aactgatgatttgatttc). Die Bedingungen für die PCR waren folgende: - 94°C für 90 Sekunden, gefolgt von 35 Durchläufen bei 94°C für 20 Sekunden und 57°C für 20 Sekunden für das GFP-Virus. - Für das BDNF-Virus 59°C für 30 Sekunden und für das MIK-Virus 50°C für 20 Sekunden. - Sowie jeweils 30 Sekunden bei 72°C und eine finale Verlängerung über 15 Minuten bei 72°C. Generation lentiviral modifizierter NIH3T3-Zellen Die NIH3T3-Zellen (Kultivierung wie für HEK293T-Zellen beschrieben) wurden zu 3.0 x104 Zellen/Vertiefung in eine 6-Multiwell-Platte ausgesät. Für die Infektion wurden 150 µl des MIK- und 75 µl des GFP- und BDNF-Virusüberstandes zu 1,2 ml eines 8 µg/ml polybrenenthaltenden Mediums (11.1) dazugegeben. Das Kulturmedium wurde durch virusenthaltendes Medium ersetzt und über Nacht inkubiert. Durch die Zugabe von 1 µg/ml Doxycyclin (11.1) wurde die Genexpression induziert. Zellkulturen ohne DoxycylinInduktion wurden sowohl hierbei als auch in den folgenden Versuchen als Negativkontrollen genutzt. Sie werden im Folgenden als NIH3T3-Zellen, die native Zelllinie, bezeichnet. Die Zellkulturen mit Genexpression nach Doxycyclin-Induktion werden im weiteren Verlauf der Arbeit als NIH3T3/BDNF-Zellen bezeichnet. Die Expression des GFP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (11.3) bei einer Absorptions-Intensität von 490 nm und einer Extinktion von 520 nm ermittelt. Die Expression des BDNF, welches von den rekombinant 37 Methoden modifizierten NIH3T3-Zellen (NIH3T3/BDNF) ins Medium freigesetzt wurde, wurde mittels ELISA (BDNF Emax Immunoassay Kit, 4.10) nach Herstellerprotokoll gemessen. Abb. 8: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme lentiviral modifizierter NIH3T3/BDNF-Zellen. Die GFP-Expression lässt sich nach der Anregung bei einer Wellenlänge von 490 nm im Emissionsspektrum bei 520 nm darstellen. Vergrößerung: 40-fach. (NIH3T3=murine Fibroblasten-Zelllinie, BDNF= Brain-derived neurotrophic factor, GFP= Green-fluorescent protein). 5.1.3 Kultivierung der NIH3T3-Fibroblasten Die Kultivierung der nativen und lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen erfolgte in NIH3T3Zellkulturmedium (siehe 4.2) unter der Zugabe von Doxycyclin (4.2.) im Brutschrank (11.3) bei 37°C, 5% CO2 und 95% relative Luftfeuchtigkeit. Das Wachstum der Zellen wurde mikroskopisch kontrolliert. Bei Erreichen eines konfluenten Wachstums der Zellen, bei dem circa 80% der Kulturbodenfläche mit Zellen belegt sind, erfolgte das Umsetzen (Passage) in eine neue Kulturflasche (11.4). Hierzu wurde das Medium vorsichtig abgesaugt und die Zellen wurden mit Hanks-Salzlösung gespült. Zum Lösen und Vereinzeln der adhärent wachsenden Zellen wurden 500 µl einer 0,25%-igen Trypsin-/EDTA-Lösung (11.1) dazugegeben und ca. 4 Minuten bei 37°C inkubiert. Eine Kontrolle des Ablösens der Zellen 38 Methoden von der Flaschenoberfläche erfolgte unter mikroskopischer Sicht (11.3). Die Reaktion der Trypsinlösung wurde durch Zugabe von 4 ml Nährmedium gestoppt. Es erfolgte eine gründliche Suspendierung der gelösten Zellen im Medium. Zellzählung Die Anzahl vitaler Zellen wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (11.3) bestimmt. Hierzu wurden 10 μl Zellsuspension mit einer Trypanblau-Lösung im Verhältnis 1:2 verdünnt (11.1) und in eine Neubauer-Zählkammer (0,1 mm Tiefe, 0,0025 mm2 Fläche) gegeben. Anschließend wurden die Zellen unter dem Lichtmikroskop (11.3) ausgezählt. Hierbei wurden die vitalen, hellen und ungefärbten Zellen von den toten, blau gefärbten Zellen differenziert. Nach Bestimmung der Gesamtzellzahl pro Flasche wurde eine definierte Menge zur Aussaat einer Folgekultur in eine neue Zellkulturflasche überführt. Abschließend wurde 5 ml komplementiertes DMEM zugefügt und die Kultur wurde im Brutschrank bis zur nächsten Passage oder Einsaat inkubiert. Verbliebenes Zellmaterial in Form der Zellsuspension konnte für Versuche genutzt werden, während die neu angesetzte Zellkulturflasche dem Erhalt der Zelllinie für einen bestimmten Zeitrahmen im Brutschrank diente. Kryokultur Für den Erhalt der Zelllinie und zur dauerhaften Lagerung wurden die Zellen weiterhin möglichst in ihrer logarithmischen Wachstumsphase eingefroren. Zunächst wurde eine Trypsinierung, wie oben beschrieben durchgeführt, um die Zellen zu lösen, zu vereinzeln und schließlich in frischem Medium zu suspendieren. Vor der Überführung in das Kryomedium (4.2) war eine Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen erforderlich. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurde die Zellsuspension 4 Minuten bei 800 rpm zentrifugiert (11.3) und das Nährmedium abpipettiert. Es erfolgte eine Zugabe von Kryomedium, so dass sich eine Zelldichte von 4 bis 5 x 106 Zellen/ml ergab. Diese Gefrierlösung wurde in die Kryoröhrchen gefüllt in eine Kühlbox (11.1) überführt, um bei -80 °C langsam herunter zu kühlen und schließlich bei -196°C im Stickstofftank gelagert zu werden. 39 Methoden 5.1.4 Aufbringen der NIH3T3/BDNF-Zellen auf die Probekörper (Biofunktionalisierung) Für das Aufbringen der Zellen auf die Modellelektroden („Besiedeln“) wurden zunächst 48er Mikrotiterplatten (11.4) mit einer dünnen Schicht 2%iger Low Melting Agarose (11.1), gelöst in High Glucose DMEM (11.1), beschichtet. In mindestens 8 Vertiefungen jeder Platte wurde je ein Silikonprobekörper (siehe 4.11), welcher als Modellelektrode diente, mit einer Pinzette vorsichtig dazugegeben und leicht angedrückt, um ein Haften auf der Agaroseoberfläche zu erreichen. Diese Art der Fixierung der Probekörper war notwendig, um ein Aufschwimmen dieser im Medium zu verhindern, was die Besiedlung mit Zellen maßgeblich beeinträchtigt hätte. Die mit je einer Modellelektrode bestückten Vertiefungen wurden einmalig mit Medium (High Glucose DMEM, 11.1) gespült und danach mit je 400 µl NIH3T3Zellkulturmedium (High Glucose DMEM, supplementiert mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, (4.2)) belegt. Zur Induktion der GFP- und BDNF Expression in den Zellen wurde 1 µl/ml Doxycyclin dem Medium (4.2) hinzugefügt. Es folgte die Einsaat von 1,75x104 NIH3T3/BDNF Zellen je Vertiefung/Modellelektrode und die Kultivierung für 24 Stunden im Inkubator (11.3) bei 37°C und 5% CO2. Nach 24 Stunden und mikroskopischer Kontrolle wurden die zellbesiedelten Modellelektroden mit Hilfe einer Pinzette (11.3) vorsichtig in je eine neue Vertiefung mit NIH3T3-Zellkulturmedium transferiert und somit von auf dem Boden haftenden Zellen getrennt (siehe Abb. 9 A und B). Die Platten wurden entsprechend den Untersuchungszeitpunkten für 4, 7 und 14 Tage im Inkubator kultiviert. Für jeden Untersuchungszeitpunkt (4, 7 und 14 Tage) wurden mindestens n=4 Platten angesetzt und in unabhängingen Experimenten untersucht. Die BDNF enthaltenden Zellkulturüberstände wurden während der Kultur nicht gewechselt und entsprechend dem Untersuchungsansatz erst nach je 4, 7 bzw. 14 Tagen zur BDNFQuantifizierung entnommen. Mittels eines 0,22 µm großen PVDF-Filters (11.4) wurden die Überstände gefiltert, um Zellen und Zellreste zu entfernen. Unter mikroskopischer Kontrolle mit Hilfe von Fluoreszenz und Durchlicht (abs. 490 nm/ext. 520 nm, 11.3) wurde die Morphologie und GFP-Expression der Zellen auf den Modellelektroden ermittelt. 40 Methoden Abb. 9: Schematische Darstellung der „Zellbesiedlung“ von Modellelektroden. A: Einsaat der Zellen und 24 h Inkubation. B: Transfer der besiedelten Modellelektrode und weitere Inkubation von 4, 7 und 14 Tagen. 5.1.5 Untersuchung des Proliferationsverhalten von NIH3T3/BDNF auf Modellelektroden Zur Bestimmung der Proliferationsaktivität der NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Modellelektroden zu den Zeitpunkten 4, 7 und 14 Tage wurden jeweils mindestens n=32 Proben herangezogen. Die Zellen wurden zunächst von den Trägern abgelöst. Hierzu wurden nach dem Protokoll der Trypsinierung (5.1.3) jeweils 100 µl 0,25%ige Trypsin/EDTA Lösung (11.1) in die Vertiefungen gegeben. Die mit NIH3T3-Zellkulturmedium resuspendierten Zellen wurden mit 0,25%iger Trypanblau-Lösung (11.1) angefärbt und in der NeubauerZählkammer ausgezählt. Die ermittelte Zellzahl pro Vertiefung bzw. Modellelektrode wurde dokumentiert und der Mittelwert für jede Zeiteinheit gebildet. 5.1.6 Quantifizierung der BDNF-Konzentration biofunktionalisierter Modellelektroden Die Konzentration an BDNF, welches von den Zellen auf den Modellelektroden zu den Zeitpunkten 4, 7 und 14 Tage abgegeben wurde, wurde mittels ELISA in den gesammelten Überständen quantifiziert. Hierzu wurde ein BDNF-Emax-Immunoassay-Kit (4.11) verwendet. 41 Methoden Die Quantifizierung erfolgte im 3-fach-Ansatz pro 96er Mikrotiter-Platte (11.4) und wurde mindestens 3-mal wiederholt. Pro Zeiteinheit wurden 12 Proben untersucht. 5.1.7 Spiralganglienzellpräparation und-kultivierung Für die Zellkultur von Spiralganglienzellen und die folgende Ko-Kultivierung mit NIH3T3/BDNF-besiedelten Modellelektroden wurden neonatale Spraque-Dawley-Ratten (P35, n=12) verwendet. Die Dissektion der Tiere erfolgte nach den Angaben des deutschen Tierschutzgesetzes (TSchG, §4(3)). Die Tiere wurden dekapitiert. Nach Entfernen der Mandibula und der umliegenden Haut wurde der Schädel entlang der Mittellinie eröffnet und in zwei Hälften geteilt. Das Gehirn wurde entnommen und die zwei Schädelhälften wurden in eiskalte PBS (4.2) eingetaucht. Die weitere Dissektion erfolgte unter mikroskopischer Kontrolle (11.3, Abb. 10). Um das Corti Organ und die Stria vascularis vom Modiolus zu entfernen wurde zunächst die knöcherne Kapsel der Cochlea eröffnet und entfernt. Letzendlich wurde das gesamte Spiralganglion vorsichtig vom Modiolus abgetrennt und in eine eiskalte Ca2+/ Mg2+-freie Hanks-Salzlösung (HBSS, 4.2) überführt. Zur Gewinnung einzelner Spiralganglienzellen wurden die gewonnenen Spiralganglien zunächst enzymatisch dissoziiert. Die enzymatische Dissoziation der Spiralganglien erfolgte nach Wefstedt et al., (2005). Hierbei wurden die Spiralganglien in 2 ml Ca2+/Mg2+-freie HBSS (4.2) mit 0,1% Trypsin (4.3), 0,01% DNase I (4.3) und 0,1% Kollagenase (4.3) für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Dissoziation wurde durch Zugabe von 200 µl FBS (11.1) gestoppt, der Überstand abgezogen und verworfen. Die verbliebenen Spiralganglien wurden 3-mal mit High Glucose DMEM (11.1.) gewaschen. Durch Auf- und Abpipettieren der Suspension, circa 15-mal, mittels 1000-µl und 200-µl-Pipettenspitzen (11.4), wurden die Zellhaufen vereinzelt. Vor Einsaat der so vereinzelten Spiralganglienzellen wurden 48er-Mikrotiter-Platten (11.4) mit 100 µl Poly-DL-Ornithin/Vertiefung (4.4) für eine Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Nach Entfernen des Poly-DL-Ornithins und anschließendem Waschen mit 100 µl PBS (4.2) wurden die Wells mit 100 µl Laminin/Vertiefung (4.4) bei 37°C für eine weitere Stunde inkubiert. 42 Methoden Das Laminin wurde wiederum entfernt und die Vertiefungen wurden noch einmal mit 100 µl PBS sowie mit NIH3T3-Zellkulturmedium (High Glucose DMEM, komplementiert mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (4.2)) gewaschen. Abb. 10: Darstellung der mikroskopischen Dissektion der Cochlea. Nach Freipräparation des Felsenbeins und der knöchernen Schnecke wird der cochleäre Anteil des häutigen Labyrinths freigelegt (A, Vergr.: 36-fach). Das Corti Organ wird mitsamt Stria vascularis vom Modiolus entwunden (B, Vergr.: 36-fach) und nachfolgend das Spiralganglion separiert (C, Vergr.: 40-fach). 5.1.8 Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen mit NIH3T3/BDNF-besiedelten Modellelektroden Die Belegung der 48er Mikrotiter-Platten für die Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen mit NIH3T3/BDNF-Zellen auf Modellelektroden erfolgte anhand folgender Schritte gleichermaßen für jede Platte (n=5; siehe Abb. 11): Aussaat von SGZ Pro Vertiefung wurden in insgesamt 16, der zuvor beschichteten und mit 200 µl NIH3T3 Zellkulturmedium (4.2) versehenen Platten (n=5), 3x104 dissoziierte Spiralganglienzellen eingesät. Fünf Vertiefungen mit SGZ dienten hierbei als Probe (P). In vier Vertiefungen wurden zusätzlich 50 ng/ml BDNF (11.1) hinzugegeben. Diese Vertiefungen dienten als Positivkontrolle (PK) für das Spiralganglienzellüberleben. In 4 weiteren Vertiefungen wurden Spiralganglienzellen in NIH3T3-Zellkulturmedium ohne den Zusatz von Wachstumsfaktoren kultiviert, wobei zwei dieser Vertiefungen als Einsaatkontrolle (EK) und weitere zwei als Negativkontrolle (NK2) für das SGZ-Überleben dienten. Eine zusätzliche Negativkontrolle 43 Methoden (NK1) für die BDNF-Bioaktivität wurde in 3 anderen Vertiefungen angesetzt. Die Zellen in der Einsaatkontrolle wurden nach 4 Stunden Kulturdauer mit einer 1:1 Aceton/MethanolLösung (4.7) fixiert, um bei der Evaluierung der jeweiligen Überlebensraten die Anzahl der Zellen in der Einsaatkontrolle mit der in den Proben ins Verhältnis setzen zu können. Zugabe biofunktionalisierter Modellelektroden In die Proben (n=5) wurden jeweils eine zellbesiedelte Modellelektrode (NIH3T3/BDNF/ME) gegeben. Zur Negativkontrolle 1 (n=3) wurden nicht modifizierte NIH3T3-Zellen (native, NIH3T3) auf Modellelektroden (NIH3T3/ME), ohne die Fähigkeit der Faktorproduktion, als Negativkontrolle für die Bioaktivität von BDNF hinzugegeben. Die biofunktionalisierten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME und NIH3T3/ME) wurden für 7 Tage vor ihrer KoKultivierung mit Spiralganglienzellen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert und 4 Stunden nach Einsaat der Spiralganglienzellen mit einer feinen Pinzette (11.4) vorsichtig in die Vertiefungen überführt. Die Platten wurden bei 37°C und 5% CO2 für 72 Stunden kultiviert bevor sie mit einer 1:1 Aceton/Methanol-Lösung fixiert wurden. Das Experiment der Ko-Kultur wurde in der beschriebenen Form 5-mal wiederholt (Tab. 1). Tab. 1: Die Tabelle stellt den Belegungsplan der 48er Mikrotiter-Platte der Ko-Kultur von SGZ mit biofunktionalisierten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) dar. P=Probe, PK=Positivkontrolle, NK1=Negativkontrolle 1, NK2=Negativkontrolle 2, EK=Einsaatkontrolle. P (NIH3T3/BDNF/ME) PK (50 ng BDNF) NK1 (NIH3T3/ME) NK2 (Kulturmedium) EK (4 h) well1 x x x x x well2 x x x x x 44 well3 x x x well4 x x well5 x Methoden Abb. 11: Schematische Darstellung der „Zell-Besiedlung“ von Modellelektroden mit anschließender Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen (SGZ). A+B: Besiedlung der Modellelektroden, C: Ko-Kultur mit SGZ. 5.1.9 Immuncytochemische Untersuchung von Überlebensraten und Neuritenwachstum von Spiralganglienzellen Für die Bestimmung der Überlebensraten und des Neuritenwachstums der fixierten Spiralganglienzellen wurden immunhistochemische Untersuchungen mittels eines monoklonalen Anti-Maus-Neurofilament-Antikörper (4.6; WEFSTEDT et al., 2005) durchgeführt. Hierzu wurden die fixierten Spiralganglienzellen mit einer 1:500 Lösung des Primärantikörpers Anti-Neurofilament in 1,5% Pferdeserum in PBS für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach wurde 3-mal mit PBS gewaschen, um anschließend mit einem biotinylierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (4.6) bei einer Verdünnung von 1:2000 in 1,5% Pferdeserum in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach einem weiteren Waschvorgang mit PBS (wie oben beschrieben) wurden die Spiralganglienzellen in einer ABC-Komplex-Lösung (Vectastain Elite ABC-Kit, 4.6) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (nach Herstellerprotokoll) inkubiert. Die so vollzogene Markierung der Zellen wurde mittels Peroxidase-Diaminobenzidin-Substrat (“Peroxidase Substrate Kit DAB”, 4.6) nach einer 10minütigen Einwirkzeit bei Raumtemperatur und folgendem Waschvorgang mit PBS sichtbar gemacht. Die angefärbten Somata und Neuriten der Spiralganglienzellen wurden mittels Durchlicht mikroskopisch dargestellt (11.3.). Mit Hilfe einer CCD-Kamera (11.3.) wurden Digitalaufnahmen gemacht und mit dem Analyseprogramm Analysis Version 3.0 (SIS) 45 Methoden ausgewertet. Hierbei wurden alle positiv gefärbten Spiralganglienzellen pro Vertiefung gezählt und Neuriten mit einer Länge des 3-fachen Somadurchmessers in die Auswertung mit einbezogen (Abb. 12). Die Überlebensraten (in %) wurden ermittelt, indem die Anzahl posivtiv gefärbter Spiralganglienzellen in der Einsaatkontrolle (EK, Abb. 11) nach 4 Stunden und die Anzahl positiv gefärbter Spiralganglienzellen in der Probe (P, NIH3T3/BDNF/ME) nach 72 Stunden Kultivierungsdauer miteinander verglichen wurden. Die Auswahl der Neuriten zur statistischen Bestimmung des Neuritenwachstum erfolgte nach GILLESPIE et al. (2001). Es wurden nur Neuriten mit einer Mindestlänge des dreifachen Somadurchmessers ausgewählt. In jeder Experimentalgruppe wurden pro Vertiefung 5 Regionen festgelegt, indem um die Mitte der Vertiefung als fünfte Region 4 weitere Regionen, oberhalb, unterhalb, links und rechts fotografiert wurden. Die Spiralganglienzelle mit dem längsten Neuriten pro Region wurde vermessen und für die statistische Analyse ausgewählt. Abb. 12: Beispielhafte Darstellung vereinzelter, immunhistochemisch markierter Spiralganglienzellen mit Neuritenaussprossungen nach einer Kultivierungsdauer von 72 h (Ko-Kultur mit NIH3T3/BDNF/ME).100-fache Vergrößerung, Durchlicht. 46 Methoden 5.1.10 Statistische Analyse Die statistische Auswertung der Proliferationsaktivität von NIH3T3/BDNF/ME und deren BDNF-Expression erfolgte mittels GraphPad Prism®. Hierzu wurden die nicht parametrische, einfache Varianzanalyse (ANOVA) und der Newman-Keuls-Test herangezogen. Basierend auf der Normalverteilung der Parameter wurde, zum Vergleich des Überlebens und der Neuritenlängen von Spiranglienzellen in Ko-Kultur, ein gemischtes Modell mit Messwiederholungen herangezogen. Als Kovarianzstruktur wurde die Compound Symmetry Structure gewählt, da davon ausgegangen werden konnte, dass alle Ansätze auf einer Platte zum selben Zeitpunkt gleiche Bedingungen hatten. In dem Modell für das logarithmierte Zellüberleben wurden die Plattennummer als Zufallsfaktor und die dazugehörigen Vertiefungen als variable Wiederholungen modelliert. 5.2 In vivo 5.2.1 Übersicht der In-vivo-Versuche Bevor die zellbesiedelten Modellelektroden aus den In-vitro-Versuchen im Tier getestet wurden, wurde zunächst eine Tierversuchsreihe zum Nachweis der Zellen nach Applikation einer Zellsuspension im Innenohr durchgeführt. Hierbei war die Überlegung, das Verhalten der Zellen nach Applikation in das Innenohr zunächst zu charakterisieren und geeignete Nachweismethoden zu ermitteln, um die Auswertung der folgenden Versuche mit zellbesiedelten Modellelektroden zu erleichtern. Die Tierversuche umfassten insgesamt 56 Tiere, die in zwei Hauptgruppen für jeweils normalhörende (A) und ertaubte Tiere (B) eingeteilt wurden (Tab. 2). Die Ertaubung der Tiergruppe B war für die Untersuchung eines protektiven Effekts von BDNF auf das Spiralganglienzellüberleben notwendig. Gleichzeitig wurden die Tiere nach Art ihrer Behandlung im Versuchsverlauf jeweils einer Gruppe, 1, 2 oder 3 zugewiesen: - Den Tieren der Versuchsgruppe 1 (1A, 1B, n=28) wurde eine Suspension von NIH3T3/BDNF-Zellen in das linke Innenohr appliziert (1=Zelltransplantation). 47 Methoden - Den Tieren der Versuchsgruppe 2 (2A, 2B, n=29) wurden mit NIH3T3/BDNF-Zellen besiedelte Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) in das linke Innenohr implantiert (2=Implantation ME). - Gruppe 3 diente als Kontrollgruppe zu Gruppe 2 und erhielt Modellelektroden ohne Zellen (3=Kontroll/ME, n=3). Die jeweils kontralateralen, rechten Cochleae aller Versuchstiere dienten als Kontrolle zu den behandelten, linken Cochleae. Die Spalte Zeit gibt Auskunft über den Behandlungszeitraum der entprechenden Tiergruppe, dargestellt in Stunden (h) und Tagen (d). Hierbei bezieht sich der Behandlungszeitraum auf die Zeit zwischen der Zellimplantation bwz. Implantation der Modellelektrode und dem Tag der Tötung der Tiere. Die Tiere der Gruppe 1A wurden nach Implantation der Zellsuspension zu unterschiedlichen Zeiten auf das Überleben von transplantierten Zellen in der Cochlea untersucht. In der Versuchsgruppe 2A erfolgte die Untersuchung zellbesiedelter Modellelektroden auf den Verbleib und das Überleben der Zellen nach Implantation und folgender Explantation. In den Gruppen 1B, 2B und 3B (ertaubt) wurden die Tiere nach Applikation einer Zellsuspension (1B), als auch nach Implantation der Zellen auf Modellelektroden (2B, 3B) auf einen protektiven Effekt dieser Zellen auf das Spiralganglienzellüberleben untersucht. Tab. 2: Zeit 48h 72h 7d 14d 21d Gesamt Übersicht über die Versuchsgruppen der In-vivo-Versuche (n=Anzahl der Tiere, NIH3T3/BDNF/ME= biofunktionalisierte Modellelektrode (NIH3T3= murine Mausfibroblasten Zelllinie, BDNF= Brain-derived neurotrophic factor). Zelltransplantation (1) normalhörend (A) n= 8 n= 2 n= 8 n= 4 ertaubt (B) Implantation NIH3T3/BDNF/ME (2) normalhörend (A) n= 2 n= 7 n= 6 n= 28 n= 25 48 Implantation Kontroll/ME (3) ertaubt (B) ertaubt (B) n= 16 n= 3 n= 3 Methoden 5.2.2 Tierhaltung Die Haltung der Meerschweinchen entsprach der EU-Richtlinie 86/609/EWG und erfolgte in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover unter identischen Bedingungen für alle Tiere. Die Unterbringung erfolgte in Gruppen von jeweils drei Tieren in Käfigen des Typs 4-Makrolon®- (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Niederlande) bei 20°C bis 24°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 bis 60%, und einem elektronisch gesteuerten Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 h (LD) beginnend mit einer Hellphase um 7:00 Uhr. Als Einstreu wurde entkeimte Weichholzfaser verwendet, während sich das Angebot an Nahrung aus Trockenpellets (Ssniff® Spezialdiäten GmbH, Soest) und Heu zusammensetzte. Trinkwasser stand den Meerschweinchen ad libitum zur Verfügung. 5.2.3 Narkose, Vor- und Nachsorge der Tiere Chirurgische Eingriffe und elektro-physiologische Messungen an den Meerschweinchen wurden unter Allgemeinanästhesie durchgeführt. Die Tiere erhielten initial 40 mg Ketamin/kg Körpergewicht (KGW) in Kombination mit 10 mg Xylazin/kg KGW (11.2) intramuskulär verabreicht, wobei je nach Narkosedauer und –tiefe zur Erhaltung die halbe Ursprungsdosis nachgegeben wurde. Parasympatische Effekte wurden durch eine subkutane Injektion des Anticholinergikum Glycopyrroniumbromid (11.2) in einer Dosierung von 0,05 mg/kg KGW subkutan gemildert. Zur Analgesie wurde den Tieren 5 mg des nicht-steroidalen Entzündungshemmers Carprofen/kg KGW (11.2) subkutan appliziert und eine Lokalanästhesie mit ca. 0,5 ml Prilocain (11.2) an der Schnittstelle vorgenommen. Zur Erhaltung des Flüssigkeitshaushaltes wurden den Tieren 15 ml Ringer-Acetat-Lösung/kg KGW (11.2) subkutan appliziert. Eine Dexpanthenolhaltige Augensalbe (11.2) wurde zum Schutz der Hornhaut bei fehlendem Lidreflex der in Narkose befindlichen Tiere aufgebracht. Eine antibiotische Abdeckung erfolgte mit einem Kombinationspräparat aus Trimethoprim und Sulfamethoxazol (11.2), das von einem Tag vor dem chirurgischen Eingriff bis 2 Tage post operationem über das Trinkwasser verabreicht wurde (1,875 ml Cotrim K/500 ml Wasser). Um gastrointestinalen Komplikationen wie einer Tympanie vorzubeugen, wurde den 49 Methoden Meerschweinchen am Tag der Operation sowie einen Tag davor und danach je 0,5 g Bird Bene Bac® (11.2) zur Stabilisierung der Darmflora oral eingegeben. Für die gesamte Narkosedauer wurden die Tiere auf ein Wärmebett (11.3) oder eine Wärmematte (11.3) gelegt um die Körpertemperatur konstant zu halten. Für die Cochleostomie erfolgte eine chirurgische Vorbereitung des Operationsgebietes. Der postaurikuläre Bereich wurde mit der Haarschneidemaschine (11.3) so kurz wie möglich geschoren und mit Braunoderm (11.3) gründlich desinfiziert, um das Infektionsrisiko so gering wie möglich zu halten. Die Tiere wurden ab dem ersten Tag nach der Operation unter Gabe von 5,6 mg Cyclosporin A /kg KGW, intra-peritoneal, zur Immunsuppression gehalten, um eine Abstoßung der implantierten Zellen zu verhindern. Ab dem ersten Tag post operationem wurden den Meerschweinchen 2,4 mg Doxycyclin /kg KGW, intraperitoneal, verabreicht, um somit die GFP und BDNF-Expression der implantierten Zellen aufrecht zu erhalten. 5.2.4 Bestimmung des Hörstatus vor Ertaubung Zur Ermittlung eines protektiven Effekts von exogenem BDNF auf Spiralganglienzellen nach einer Zerstörung der Haarzellen im Innenohr der Meerschweinchen wurden die Tiere der Versuchsgruppen B (1B, 2B und 3B) fünf Tage vor der Implantation ertaubt. Um sicher zu stellen, dass in die betreffende Gruppe nur normal hörende Meerschweinchen integriert wurden, wurde jeweils am Tag der Ertaubung (d0), wie auch am Tag der Implantation (d5), über eine Messung akustisch-evozierter Hirnstammpotentiale (AABRMessung) die frequenzspezifische Hörschwelle der Tiere bestimmt. Die Ausgangshörschwellen und die Hörschwellen nach Ertaubung wurden jeweils für alle Tiere gemittelt und zusammengefasst dargestellt. Für die Ableitung der akustisch-evozierten auditorischen Hirnstammpotentiale wurde das System von Tucker-Davis-Technologies (TDT) eingesetzt Es besteht aus einer Basisstation (Abb. 13). dem Multifunktionsprozessor und dem Mikrostimulator (11.3). Für die Durchführung der Messung wurden die anästhesierten Meerschweinchen jeweils auf einer Wärmematte (11.3) in einem schalldichten Raum (11.3) platziert. Die akustischen Stimuli wurden den Tieren über elektrostatische Lautsprecher (11.3) und als „Ohrhörer“ 50 Methoden umfunktionierte und in der Größe angepasste 200-μl-Pipettenspitzen (11.4) präsentiert. Diese Lautsprecher-Spitzen-Kombination wurde zuvor mittels eines 0,25-Inch-Druckfeld- empfängers (11.3) für diesen Zweck kalibriert und dann in den äußeren Gehörgang des jeweiligen Tieres eingeführt. Die elektrophysiologische Ableitung der Potentiale geschah über subdermale Nadelelektroden (11.3), die so angebracht wurden, dass sich der positive Pol am Vertex, der negative Pol am linken und rechten Mastoid und die Erdungselektrode im Nacken des Meerschweinchens befanden. Über einen 1,5-mm-Sicherheitsverbindungsstecker wurden die Ableitelektroden mit der Niedrig-Impedanz-Headstage (11.3) verbunden, die die Signale über einen Vorverstärker (11.3) und ein Glasfaserkabel weiter zur Basisstation leitete. Die verschiedenen Hardware-Komponenten der Messeinheit wurden über einen Computer angesteuert, was zum einen über die TDT-Software (11.3) geschah, zum anderen aber auch über die anwendungsspezifische Software HughPhonics (LIM u. ANDERSON, 2006). Dabei handelt es sich um eine in MATLAB Schreibweise (11.3) erstellte, maßgeschneiderte Software zur AABR-Messung und späteren Auswertung der Daten. Vor der Messung war es nötig über einen Vortest mittels Breitbandrauschen bestimmte Parameter festzulegen. Dieser Vortest erlaubte die Festlegung des Grades der Artefaktunterdrückung, der in Abhängigkeit von den umgebenden Störsignalen zwischen 100 und 500 μV lag. Je nach Hörvermögen des Tieres wurde der Schalldruckpegel festgelegt, in dem in Schritten von jeweils 10 dB die AABR gemessen wurde, wobei die Frequenzen von 1, 4, 8, 16, 32 und 40 kHz standardisiert eingehalten wurden. Als Grenzfrequenzen des Bandpassfilters wurden 300 und 3000 Hz gewählt, um die Aufnahme von Hintergrundfrequenzen zu unterdrücken. Im Anschluss an diese Vorabkonfiguration wurde ein Kanal zur Stimulation eines Ohres gewählt. Die verschiedenen Frequenzen und Schalldruckpegel wurden dem Tier randomisiert präsentiert. Die generierten Töne hierzu hatten eine Dauer von 10 ms mit einer Anstiegs- und Abfallzeit von jeweils 1 ms. Der verwendete Digital-Analog (D/A)-Wandler hatte eine Wandlungsrate von 200 kHz und eine Amplituenauflösung von 24-bit. Die erfassten neuronalen Signale wurden schließlich mit einer Rate von 25 kHz (16-bit) digitalisiert. Pro Frequenz und SPL-Level wurden 200 bis 250 Durchläufe gemittelt. Die über die TDT- und HughPhonics-Software (11.3) erfassten Rohdaten wurden zunächst in ein anderes Format konvertiert, bevor die Auswertung über die MATLAB-Software (11.3) erfolgte. 51 Methoden Für eine möglichst objektive Interpretation der Daten ermittelte das Programm aus den Signalen, die ohne akustische Stimulation abgeleitet wurden, den Mittelwert und die Standardabweichung. Als Hörschwelle für eine bestimmte Frequenz wurde der Schalldruckpegel definiert, bei welchem der dritte Peak der AABR die doppelte Standardabweichung der Amplitute der Grundaktivität noch überschreitet. Entsprechende Werte wurden für alle Frequenzen für jedes Tier erhoben und anschließend innerhalb einer Tiergruppe für jeden Messtag (d0 und d5) gemittelt und die Standardabweichung bestimmt. Bei einem Hörschwellenverlust von über 50 db zwischen Tag 0 (vor der Ertaubung) und Tag 5 (nach der Ertaubung) kann von einem erfolgreichen Ertaubungsvorgang gesprochen werden. Zur Beurteilung wurden die Hörschwellen der Tiere pro Frequenz an Tag 0 mit denen von Tag 5 verglichen und tabellarisch zusammengefasst. Die durch AABR-Messung bestimmte Ausgangshörschwelle musste am Tag 0 vor der Ertaubung ≤ 50 dB SPL betragen (KANO u. STARR, 1987; MITCHELL et al., 1997) Abb. 13: Aufbau der AABR-Messeinheit von Tucker-Davis-Technologies. Unter A ist die computergesteuerte Basisstation abgebildet. B zeigt schematisch die Ableitung der evozierten Potentiale von den Nadelelektroden bis zum Glasfaserkabel, dass dann mit der Basisstation verbunden ist. Unter C ist ein anästhesiertes Meerschweinchen abgebildet, dem über Lautsprecher akustische Stimuli präsentiert werden, so dass evozierte Potentiale über Nadelelektroden abgeleitet werden können. 5.2.5 Ertaubung (Zerstörung der Haarzellen) Die Ertaubung erfolgte unter den in 5.2.3 bereits beschriebenen Bedingungen. Um eine gezielte Zerstörung der Haarzellen im Versuchstier zu gewährleisten, wurde Kanamycin, ein Aminoglykosidantibiotikum mit hohem ototoxischem Potential, in Verbindung mit dem 52 Methoden Schleifendiuretikum Ethacrynsäure eingesetzt (WEST et al., 1973). Für die Ertaubung der Tiere wurden 400 mg Kanamycin/kg KGW subkutan injiziert. Nach einer Stunde wurden die Tiere narkotisiert (5.2.3), die akustischen Hörschwellen bestimmt (4.2.4) und die Tiere für die Operation vorbereitet. Zunächst wurde ein linksseitiger, paramedianer Hautschnitt an der ventralen Halsseite vorgenommen, die Halsmuskulatur den anatomischen Strukturen folgend stumpf durchtrennt und die externe Vena (V.) jugularis vorgelagert. Um das Gefäß wurden drei Schlaufen aus resorbierbarem Nahtmaterial gelegt. Der in Richtung Herz gelegene Faden wurde legiert während die zwei übrigen locker als Schlaufen um das Gefäß verblieben. Mit Hilfe eines Mikroskops (11.3) wurde mit einer feinen chirurgischen Schere (11.3) oberhalb der Legierung eine feine Venotomie durchgeführt, durch welche ein Silikonschlauch (11.4) ca. 1,5 cm in craniale Richtung in die V. jugularis eingeführt und mit Hilfe der Ligatur fixiert wurde. Durch Aspiration von Blut in den Schlauch und Injektion einer geringen Menge von NaCl wurde die optimale Lage des Schlauches im Gefäß ermittelt. Anschließend wurde die Natrium-Chlorid-Spritze durch die Ethacrynsäure enthaltende Spritze ersetzt und es wurden 40 mg/kg KGW des Diuretikums langsam intra venös appliziert. Abschließend wurde wiederum eine geringe Menge NaCl appliziert, um den Schlauch frei von Ethacrynsäure zu spülen und damit zu gewährleisten, dass die vollständige Menge in die Vene abgesetzt wurde. Nach erfolgter Applikation wurde der Schlauch etwas zurückgezogen bis eine Öffnung zwischen mittlerer und cranialer Schlaufe lag. Die oberste Schlinge wurde nun straff zugezogen und der Schlauch vollständig entfernt. Anschließend wurde auch die mittlere Ligatur entfernt, das Gefäß unter Sichtkontrolle zurückgelagert, die Muskulatur mit resorbierbarem Nahtmaterial (11.4) mit Einzelheften verschlossen und die Haut mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial (11.4) adaptiert. 53 Methoden 5.2.6 Zellaufbereitung für die Applikation als Suspension in das Innenohr Vor der Implantation wurden die Zellen nach Protokoll (siehe 5.1.2) passagiert und anschließend in einer Neubauer-Zellzählkammer gezählt (5.1.2). Die Zellzahl wurde auf 1x104 Zellen/µl Suspension eingestellt und davon wurden circa 100 µl in ein EppendorfRöhrchen überführt. Dieses wurde anschließend in einer Styroporbox in den Operationsbereich gebracht. Dort wurden die Zellen innerhalb einer Stunde ins Tier implantiert. 5.2.7 Applikation der Zellsuspension in das Innenohr via Cochleostomie Für die Injektion von Lösungen in die Scala tympani via Cochleostomie wurde ein sehr kleiner Katheter benötigt, der auf eine Hamiltonspritze aufgesetzt werden konnte. Dazu wurde ein Silikonschlauch (11.4) mit einem Innendurchmesser von 0,3 mm und einem Außendurchmesser von 0,7 mm auf ca. 20 cm Länge zurechtgeschnitten und bis zum Konus über das stumpfe Ende einer 27G-Präzisionskanüle (11.4) geschoben. Über das andere Ende des Silikonschlauches wurde ein ca. 3 cm langer Polyimidschlauch (11.4) mit einem Innendurchmesser von 0,12 mm bis zur Hälfte hineingeschoben. Beide Enden wurden abschließend mit dem Sofortklebstoff Loctite 4061 (11.4) dicht verschlossen, so dass nach erfolgter Aushärtung eine Sterilisation mit Gas durchgeführt werden konnte. Durch eine postaurikuläre Inzision wurden Haut und Platysma durchtrennt. Die Muskulatur wurde stumpf präpariert und nach kaudal verlagert und der mastoidale Anteil des Musculus sternocleidomastoideus von seinem Ursprung entfernt, bis die Bulla tympanica freigelegt war. Das Periost wurde entfernt und die Mittelohrkavität mit Hilfe einer 11er-Skalpellklinge (11.3) eröffnet, so dass die Cochlea unter dem Mikroskop (11.3) dargestellt werden konnte. Mit einer kleinen, spitzen Sonde (11.3) wurde dann in der basalen Windung nahe der Rundfenstermembran eine Cochleostomie durchgeführt und somit ein Zugang zum perilymphatischen Raum der Scala tympani geschaffen. Dort wurde das Polyimidende des zuvor präparierten und mit der Zellsuspension gefüllten Injektionsschlauches mit aufgesetzter Hamiltonspritze (11.4) unter mikroskopischer Kontrolle vorsichtig inseriert. Anschließend wurden 5 μl der Flüssigkeit bei möglichst gleichmäßigem Druck über 3 bis 5 Minuten 54 Methoden injiziert. Auf diese Weise wurde der entsprechenden Tiergruppe 5 µl einer Zellsuspension mit 1x104 Zellen/µl Zellsuspension in die linke wie auch in die rechte Cochlea appliziert. Der Kontrollgruppe wurde anstelle von Zellsuspension PBS in die Cochlea appliziert. Sowohl die Cochleostomie als auch der Bulladefekt wurden anschließend mit Karboxylatzement (11.4) verschlossen. Die Wunde wurde in zwei Schichten mit Einzelheften adaptiert, wobei für die Muskulatur eine absorbierbare Nadel-Faden-Kombination verwendet wurde, während die Haut mit nicht-resorbierbarem Nylon-Nahtmaterial (11.4) verschlossen wurde (Abb. 14). 55 Methoden Abb. 14: Fotoserie zur Illustration der Applikation der Zellen via Cochleostomie in die Scala tympani eines Meerschweinchens. A: Freilegung der Bulla tympanica und Tympanotomie; B: Orientierung im Mittelohr und Auffinden der Cochlea anhand des Runden Fensters. C: Cochleostomie in der basalen Windung nahe des Runden Fensters; D: Insertion des Injektionskatheters mit Zellen/ Vergrößerung der Cochleostomie für die Insertion der Modellelektrode in die Scala tympani. E: Sicht von der Seite auf die Cochlea und die inserierte ME nach Präparation der Bulla tympanica. F: Sicht von oben auf die ME nach Erweitetung der Cochleostomie und des runden Fensters nach Präparation des Felsenbeins vor Explantation der ME. 56 Methoden 5.2.8 Implantation der biofunktionalisierten Modellelektrode ins Innenohr via Cochleostomie Die biofunktionalisierten Modellelektroden wurden wie unter 5.1.4 beschrieben mit Zellen besiedelt und 7 Tage im Brutschrank bei 37°C kultiviert. Eine 48er Mikrotiter-Platte mit den Probekörpern wurde anschließend in den Operationsbereich überführt und dort bei 37°C bis zur Implantation temperiert. Die Tiere wurden für die Implantation, wie unter 5.2.3 beschrieben, vorbereitet und der Zugang zur Cochlea wurde entsprechend geschaffen (5.2.5). Anders als bei der Zellapplikation durch die Cochleostomie mittels Suspension in einem Schlauch wurde hierbei das Loch um wenige Millimeter vergrößert (Abb. 14 D). Dies sollte beim Einführen der Modellelektrode ein mögliches Abstreifen der Zellen von der Elektrodenoberfläche durch Reibung am knöchernen Cochleostomierand auf ein Minimum beschränken. Mit einer feinen Pinzette wurde jeweils ein Probekörper vorsichtig aus den mit Medium gefüllten Vertiefungen der 48er Mikrotiter-Platte entnommen und unverzüglich unter mikroskopischer Sichtkontrolle in die Cochleostomieöffnung eingebracht. Hierbei wurde versucht den Probekörper so weit wie möglich, d.h. etwa 4 mm tief, in die Scala tympani einzuführen. Anschließend wurde der Silikon-Probekörper mit Karboxylatzement an der Cochleostomie befestigt. Sowohl die Cochleostomie als auch der Bulladefekt wurden dann mit Karboxylatzement (11.4) verschlossen. Die Wunde wurde in zwei Schichten mit Einzelheften adaptiert, wobei für die Muskulatur eine absorbierbare Nadel-FadenKombination verwendet wurde, während die Haut mit nicht-resorbierbarem NylonNahtmaterial (11.4) verschlossen wurde. 5.2.9 Gewinnung und Aufarbeitung der implantierten Innenohre Tötung der Tiere durch transkardiale Perfusion Vor der Tötung wurden die Tiere in Narkose gelegt. Zusätzlich wurde nach Lokalanästhesie mit 5 ml Prilocain s.c. (11.4) eine weitestgehende Schmerzfreiheit entlang der Schnittlinie gewährleistet, bevor die Meerschweinchen transkardial perfundiert wurden, um einen gleichmäßigen Strukturenerhalt und eine blutfreie Cochlea zu erreichen. Fünf Minuten nach 57 Methoden Applikation des Lokalanästhetikums wurde zunächst eine Thorakotomie durchgeführt, das Herz freigelegt und der Herzbeutel eröffnet. Ein Schnitt in den rechten Vorhof ermöglichte den Abfluss von Blut und Perfusionslösung aus dem Körperkreislauf. In den linken Ventrikel wurde eine Kanüle eingeführt, welche über ein angeschlossenes Infusionsbesteck (11.3) dem Herzen zunächst 200 ml PBS (4.2) zum Ausspülen des Blutes zuführte. Daraufhin erfolgte eine Fixierung des Tierkörpers durch die Zufuhr von 200 ml 4%igem PFA (4.2) unter dem Abzug. Präparation der Cochlea Nach der Fixierung folgte die Dekapitation des Tierkörpers mit anschließender Präparation der Schädelhaut. Die Schädeldecke wurde durch zwei Scherenschläge (11.3) vom Hinterhauptsloch in Richtung temporaler Augenwinkel durchtrennt, nach rostral umgeklappt und schließlich entfernt. Nach Entfernen des Gehirns wurden die Felsenbeine manuell aus dem Schädel herausgebrochen und nach Entfernung anhaftender Muskel- und Sehnenanteile in PBS überführt. Desweiteren wurden die Felsenbeine mit der Spitze einer Augenpinzette (11.3) eröffnet und die Bullawand wurde mit Hilfe einer Ohrpolypenzange (11.3) großflächig entfernt, so dass die weitere Dissektion in einer PBS-gefüllten Petrischale (11.4) unter dem Auflichtmikroskop (11.3) mittels feiner Präzisionspinzetten (11.3) erfolgen konnte. Dabei wurden sowohl das Runde als auch das Ovale Fenster eröffnet. Zusätzlich wurde eine Öffnung in den knöchernen Apex der Cochlea gebohrt. Explantation der Probekörper In der Versuchstiergruppe 2B (ertaubt, implantierte MSW) wurden die zellbesiedelten Modellelektroden nach Präparation der Cochlea (siehe oben) explantiert. Hierzu wurde die Cochleostomie mit einer Präzisionspinzette (11.3) geringfügig vergrößert und der Probekörper vorsichtig herausgezogen. Dabei wurde mit Hilfe des Auflichtmikroskopes (11.3) darauf geachtet, dass der Probekörper nicht seitlich die Ränder der Cochleostomieöffung berührte. Der explantierte Probekörper wurde danach in eine Petrischale mit PBS überführt und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. 58 Methoden Fixierung und Entkalkung zur Herstellung von Paraffinschnitten Nach der Präparation wurden die Cochleae, die für Paraffinschnitte vorgesehen waren in 4%igen Paraformaldehyd (4.2) für ca. 12 Stunden bei 4°C fixiert. Im Anschluss an die Fixierung wurden die Cochleae für 30 Minuten auf einem Schwingtisch (11.3) bei Raumtemperatur mit PBS gespült. Daraufhin wurden sie in 20%ige EDTA-Lösung (4.8) überführt und, abhängig vom Verknöcherungsgrad, für 3-4 Wochen bei 37°C im Wärmeschrank (11.3) entkalkt. Die Lösung wurde alle 2 Tage gewechselt. Die nativen, nicht dekalzifizierten Präparate, welche für die Präparation der Basilarmembran und der Stria vascularis vorgesehen waren, wurden im Anschluss an die Dissektion in der PBS gefüllten Petrischale weiter präpariert. Herstellung der Paraffinschnitte Erneute Zugabe von Spülpuffer und eine Inkubation von 30 Minuten auf dem Schwingtisch beendeten die Entkalkung der Cochleae. Die Entwässerung erfolgte durch eine aufsteigende Alkoholreihe (50%, 70%, 90% und 100% Ethanol) mit einer Inkubationszeit von jeweils 2 Stunden. Über Nacht erfolgte die Inkubation der Cochleae in reinstem Methylbenzoat (11.1). Am nächsten Tag wurde das Methylbenzoat verworfen und die Einbettung der Präparate in Paraffin erfolgte. Hierzu wurden die Cochleae mit flüssigem Paraffin durchtränkt und über Nacht im 65°C warmen Trockenschrank (11.3) belassen. Nachfolgend wurden sie mit senkrecht stehender Schneckenachse in Einbettschälchen gestellt, welche mit Paraffin ausgegossen wurden. Die Paraffin-Cochlea-Blöcke erkalteten bei Zimmertemperatur und wurden bei –21°C gelagert. Zur Herstellung der Schnitte wurden die Paraffin-Cochlea-Blöcke schließlich aus ihren Schälchen herausgelöst, auf kleine Holzklötze aufgeschmolzen und in die Präparathalterung eines Mikrotoms (11.3) eingesetzt. Serienschnitte mit einer Stärke von 5 μm wurden angefertigt. Die Schnittrichtung wurde senkrecht zur Modiolus-Achse gewählt. Alle Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Präparation der Basilarmembran und Stria vascularis Die nativen, nicht dekalzifizierten Präparate wurden im Anschluss an die Dissektion in der PBS-gefüllten Petrischale weiter präpariert (Abb. 15). Hierzu wurde unter einem 59 Methoden Auflichtmikroskop mit Hilfe von feinsten Präzisionspinzetten (11.3) die knöcherne Wand der Hörschnecke beginnend von den apikalen Windungen bis zur Basis entfernt. Daraufhin konnte die Stria vascularis mit dem dazugehörigen Spiralligament vorsichtig abgezogen und auf einen Objektträger (11.4) plaziert werden. Anschließend wurde die knöcherne Verbindung zwischen der Basilarmembran mit aufsitzendem Corti-Organ und dem Modiolus getrennt. Für die weitere Bearbeitung und Auswertung wurden die Membranen in Teilstücke von jeweils einer halben Windung vereinzelt. Von den Teilstücken wurden überschüssiger Knochen sowie Reißner- und Tektorialmembran entfernt, bevor auch diese in entsprechender Reihenfolge von apikal nach basal auf Objektträger überführt und für die Kernfärbung und gegen Ausbleichen mit ProLong®-Gold-Antifade-Reagent mit DAPI (11.1) eingedeckelt wurden. Nach einer 24stündigen Trocknungsdauer wurden die Deckgläschen mit Nagellack auf den Objektträgern fixiert und bis zur Auswertung dunkel gelagert. 60 Methoden Abb. 15: Präparation der Basilarmembran: A: Die Bullawand wurde großflächig abgetragen und die knöcherne Cochlea freigelegt. B: Die knöcherne Cochleawand wurde vorsichtig abgetragen. C: Das Spiralligament mit der Stria vascularis wurde abgezogen, so dass die Basilarmembran frei zugänglich war. D: Vom Modiolus abpräpariertes Teilstück der Basilarmembran von der Länge einer halben Windung (hier apikale Windung sichtbar). 61 Methoden 5.2.10 Immunhistologie Im Hinblick auf die unterschiedlichen Vorgehensweisen in der Auswertung wurden die Proben (Praffinschnitte, Basilarmembranpräparate) verschiedenen immunhistologischen Verfahren unterzogen. HE-Färbung der Paraffinschnitte Zum Auszählen von Spiralganglienzellen mit folgender Zelldichtebestimmung zur Untersuchung eines biologischen Effekts in der Versuchsgruppe mit ertaubten Meerschweinchen wurden die Paraffinschnitte einer Hämalaun-Eosin-Färbung (11.1) unterzogen. Hierzu wurden die Schnitte für zweimal 5 Minuten in Xylol getaucht und im Anschluss in eine absteigende Alkoholreihe überführt: (100%, 90%, 70% und 50% Ethanol; je 5 min). Anschließend wurden die Schnitte für 5 Minuten in destilliertem Wasser gespült bevor die Färbung mit Hämalaun für 1 Minute folgte. Hiernach erfolgte wiederum ein Waschvorgang in destilliertem Wasser für ca. 5 Minuten. Anschließend wurde für 45 Sekunden in Eosin-Lösung gefärbt, wiederum gefolgt von 5minütigem Waschen in Aqua dest. Mit einer aufsteigenden Alkoholreihe über 70%, 90% und 100% und 2-maligem Eintauchen in Xylol für je 5 Minuten wurde der Färbevorgang abgeschlossen. Die Schnitte wurden noch feucht mit Entellan® eingedeckelt und für mindestens 24 Stunden zum Trocknen unter einen Abzug gestellt. Vorbereitung für die Inkubation mit Antikörpern Zur Zelldetektion wurden die Paraffinschnitte der mit Zellsuspension behandelten Meerschweinchen-Cochleae für die folgende fluoreszenzmikroskopische Untersuchung mit verschiedenen Antikörpern behandelt. Zum Entparaffinieren wurden die Schnitte 2-mal für 5 Minuten in Xylol getaucht und, wie oben beschrieben, in die absteigende Alkoholreihe gegeben. Nach einem 5 minutigen Spülvorgang mit PBS wurden die Schnitte demaskiert, um ein Anhaften der Antikörper an spezifische Bindungsstellen zu gewährleisten. Hierzu wurden die Schnitte für 15 Minuten bei 37°C in 0,05%iger Trypsinlösung (4.8) in PBS inkubiert und abschließend 3 mal in PBS gewaschen. Zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen wurden die Schnitte für 60 Minuten in einer Blockierlösung aus 1 ml FCS und 19 ml 62 Methoden 0,1%igem PBT (4.5) bei Raumtemperatur inkubiert und abschließend dreimal für je 3 Minuten mit PBS (4.8) gewaschen. Inkubation mit spezifischen Antikörpern Für den spezifischen Nachweis von NIH3T3-Maus-Fibroblasten im Innenohrgewebe des Meerschweinchens wurde das Zelloberflächen-Antigen CD90 genutzt. Bei dem verwendeten Antikörper handelte es sich um einen Anti-Maus-CD90.2-Antikörper (Thy-1.2, Ratte-IgG2b; 3.9). Der Antikörper wurde in den Konzentrationen 1:500, 1:250, 1:100 und 1:50 eingesetzt. Als Kontrolle dienten Präparate, die nicht mit dem primären Antikörper inkubiert worden waren. Bei Vorhandensein des Oberflächen-Antigens CD90 kommt es zu einer deutlichen Braunfärbung der Antigen-exprimierenden Zellen. Hierzu wurde das Anti-rat-Ig-HRPDetection-Kit (4.10) zur Anfärbung spezifischer, zuvor Primärantikörper-markierter Zellen, eingesetzt. Ein weiterer Primärantikörper, Anti-GFP, zum Nachweis von exprimiertem GFP in den implantierten Zellen wurde in einer Konzentration von 1:100 eingesetzt. Die Primärantikörperlösungen wurden im entsprechenden Mischverhältnis mit Antikörperverdünnungspuffer (4.9) gemischt und über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer mit den Schnitten inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Schnitte 3x5 Minuten mit PBT gewaschen. Die Schnitte, welche mit CD90.2-Antikörper markiert worden waren wurden anschließend mit Hilfe des Anti-rat-Ig-HRP-Detection-Kit angefärbt und unter dem Durchlichtmikroskop (11.3) ausgewertet. Die mit Anti-GFP behandelten Schnitte wurden mit dem Cy5-konjugierten Sekundärantikörper fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet (Abb. 16). 63 Goat-Anti-Rabbit-IgG angefärbt und Methoden Abb. 16: In-vitro-Tests: A: NIH3T3/BDNF-Fibroblasten markiert durch CD90 (braune Färbung), Durchlicht, 40-fache Vergrößerung. B: NIH3T3/BDNF-Fibroblasten markiert durch AntiGFP, Multilabel (Cy5-Fluoreszenz+Alexa 488), 100-fache Vergrößerung. 5.2.11 Spiralganglienzell-Auszählung von HE-gefärbten Paraffinschnitten Zur Bestimmung der Spiralganglienzelldichte in der Versuchsgruppe der ertaubten Meerschweinchen (siehe 5.2.1) mussten die zuvor in Paraffin eingebetteten und HE-gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop untersucht werden. Hierbei wurde ein midmodiolarer Schnitt zufällig ausgewählt und jeder fünfte nachfolgende Schnitt analysiert. Insgesamt wurden pro Cochlea 5 Schnitte mit je 7 Querschnitten des Rosenthal‘schen Kanals (siehe 2.1.1 Anatomie des Hörorgans) für die quantitative Analyse der SGZ herangezogen. Die Rosenthal‘schen Kanäle wurden entlang der Windung von basal nach apikal als untere basale und obere basale Windung, als erste, zweite, dritte und vierte mittlere Windung sowie als apikale Windung bezeichnet (Abb. 17). In jedem Paraffinschnitt wurden alle Querschnitte des Rosenthal‘schen Kanals beurteilt. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung eines Mikroskops (11.3) und einer CCD-Camera (11.3) mit angeschlossenem rechnergestütztem Bildbearbeitungssystem (Analysis®, 11.3). Zunächst erfolgte eine digitale Aufnahme jedes Rosenthalschen Kanals. Die Konturen der Kanäle wurden jeweils mittels des Bildverarbeitungsprogramms nachgezogen und die zugehörige Fläche computergestützt berechnet. Nachfolgend wurde die SGZ-Zahl pro Querschnitt bestimmt. Kriterien für den 64 Methoden Einschluss von SGZ in die Zählung waren ein Neuronendurchmesser von ca. 12 μm und ein sichtbarer Nucleus, wobei keine Differenzierung zwischen Typ I- und Typ II-SGZ (SPOENDLIN, 1975) vorgenommen wurde. Aus der Fläche eines Rosenthalschen Kanals und der sich darin befindenden SGZ-Anzahl wurde die SGZ-Dichte berechnet, welche als Spiralganglienzellen pro 10.000 μm2 (SGZ/10.000 μm2) angegeben wurde. Auf Grund von Variabilitäten beim Schneidevorgang waren im apikalen Bereich der Cochlea nicht immer zuverlässige Flächenbestimmungen und Messungen der SGZ-Zahl möglich. Daher wurden diese Werte mit denen der vierten mittleren Windung kombiniert. 65 Methoden Abb. 17: Beispielhafte Darstellung einer Meerschweinchencochlea (midmodiolares Schliffbild) zur Erläuterung der Benennung der Rosenthal‘schen Kanäle. 1: untere basale Windung; 2: obere basale Windung; 3: erste mittlere Windung; 4: zweite mittlere Windung; 5: dritte mittlere Windung; 6: vierte mittlere Windung; 7: apikale Windung; Sc. t. Scala tympani; Sc. v.: Scala vestibuli; M: Modiolus. 66 Methoden 5.2.12 Statistische Analyse Die statistische Auswertung der SGZ-Dichten erfolgte mittels GraphPad Prism®. Zunächst wurde eine Prüfung der Daten auf Normalverteilung durchgeführt. Nachfolgend wurde der tTest für abhängige Stichproben für die Analyse der SGZ-Dichten-Differenz zwischen den ertaubten, behandelten linken und den ertaubten, aber ansonsten unbehandelten rechten Cochleae innerhalb der Tiere einer Gruppe herangezogen. Für den Vergleich der Spiralganglienzelldichte der basalen Windungen zu der, der mittleren/apikalen Windungen wurden die nicht parametrische, einfache Varianzanalyse (ANOVA) und der Newman-KeulsTest herangezogen. 67 Ergebnisse 6 ERGEBNISSE 6.1 In-vitro-Modell der Biofunktionalisierung 6.1.1 Generation und Charakterisierung von NIH3T3-Zellen Die NIH3T3-Zellen wurden jeweils mit zwei Lentiviren, kodierend für BDNF und GFP, infiziert. Das Kulturmedium mit den viralen Überständen wurde nach Inkubation über Nacht durch frisches Medium mit 1µg Doxycyclin /ml ersetzt (siehe Kap.5.1.2). Dies induzierte die Expression von GFP innerhalb von 24 Stunden, was als leuchtend grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop auszumachen war (Abb. 18, a). Nach Beurteilung von Intensität und Menge der GFP Fluoreszenz zeigten mindestens 90% der Zellen eine hohe GFP-Expression (Abb. 18, b). Eine Selektion von GFP-exprimierenden Zellen war nicht nötig, da kein beachtenswerter Abfall der GFP-Expression während der Studie vorlag. Im Vergleich dazu wurde in der Kontrollgruppe mit lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen ohne Doxycyclin Induktion keine GFP-Expression festgestellt (Abb. 18, c, d). Vor der Etablierung des In-vitro-Modells mit zellbesiedelten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) wurde die Freisetzung von BDNF über 16 Passagen in den Kulturüberständen der NIH3T3/BDNF-Zellen überprüft. Die Ergebnisse zeigten eine stabile BDNF-Expression während aller Passagen. In Anbetracht einer potentiellen BDNFExpression von nativen NIH3T3-Zellen, wurden diese nach Einsaat von 3x105 Zellen und Kultivierung für 24 und 48 Stunden unter den beschriebenen Konditionen (siehe 5.1.3) untersucht. Mit Hilfe eines ELISA konnte eine BDNF-Konzentration von 0,056 ± 0,017 ng/ml in den Kulturüberständen ausgemacht werden. 68 Ergebnisse Abb. 18: Lentivirale Modifikation der NIH3T3-Zelllinie zur Synthetisierung von GFP und BDNF. a: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen nach 24 Stunden Kultivierungsdauer von NIH3T3/BDNF unter Zugabe von Doxycyclin zeigten eine starke GFP-Expression. b: Die Phasenkontrast–Transmissionslicht-Mikroskopie ergab eine 90%ige-Expressionsrate der lentiviral modifizierten Zellen. c: NIH3T3/BDNF Zellen ohne Doxycyclinzugabe unter Fluoreszenzlicht und im Phasenkontrast-Transmissionslicht (d). Vergrößerung 40-fach (ac) und 100-fach (d). 6.1.2 Proliferation der NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Modellelektrode Die NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Oberfläche der Modellelektroden wurden für 4, 7 und 14 Tage kultiviert, um anhand der ermittelten Zellzahlen das Wachstumsverhalten dieser Zellen im Hinblick auf ein funktionsfähiges Drug-Delivery-System evaluieren zu können. Die Integrität des rekombinanten GFP-BDNF-Expressions-Systems wurde hierbei fluoreszenzmikroskopisch dokumentiert. Bereits nach 24 Stunden Kultivierungszeit konnte man vereinzelt Zellen auf der Elektrodenoberfläche sowohl unter Durchlicht als auch unter 69 Ergebnisse Fluoreszenzlicht ausmachen. Nach 4 Tagen war die Oberfläche zur Hälfte mit Zellen besiedelt. 7 Tage nach Kultivierung war die Oberfläche der Modellelektroden fast vollständig mit NIH3T3/BDNF-Zellen bedeckt (Abb. 19). Die in der Zählkammer ermittelten Zellzahlen zeigten einen signifikanten Anstieg des Zellwachstums auf der Modellelektrode zwischen Tag 4 (19.563 ± 1604 NIH3T3/BDNFZellen, n = 32) und Tag 7 (40.371 ± 3.529 Zellen, n = 32; p < 0,05). Im Gegensatz dazu waren die Zellzahlen mit einem 5-fachen Anstieg zwischen Tag 4 und 14 (100.375 ± 9840 Zellen; p < 0,001; n = 32) höchst signifikant. Auch zwischen Tag 7 und 14 wurden entsprechend erhöhte NIH3T3/BDNF-Zellzahlen auf den Modellelektrodenoberfläche ermittelt (p < 0,001; Abb. 20). Abb. 19: Darstellung proliferierender NIH3T3/BDNF-Fibroblasten, lentiviral modifiziert mit GFP und BDNF, auf der Oberfläche einer Modellelektrode nach 7tägiger Kultivierung (Fluoreszenzmikroskopie, A: 40-fache Vergrößerung, B: 100-fache Vergrößerung). 70 Ergebnisse Abb. 20: Vergleich der Zellanzahl proliferierender NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Oberfläche von Modellelektroden in einem Kultivierungszeitraum von 14 Tagen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert und Standardfehler von NIH3T3/BDNF-Zellen nach 4 (n = 32), 7 (n = 32) und 14 (n = 32) Kulturtagen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels einer nicht parametrischen, einfachen Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Newman-Keuls Test (*** = p < 0,001, * = p < 0,05). 6.1.3 BDNF-Freisetzung der NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Modellelektrode Während der Kultivierung der NIH3T3-Zellen auf den Modellelektroden, wurden die Überstände nach 4, 7 und 14 Tagen entnommen, um die Konzentrationen an potentiell vorhandenem BDNF mittels ELISA im Dreifachansatz (4 d, n = 12; 7 d, n = 12; 14 d; n = 12) zu bestimmen. Für die statistische Analyse wurde jeder Test dreimal wiederholt. In den Proben mit 4 Tagen Kultivierungsdauer wurden sehr niedrige Konzentrationen an BDNF ermittelt (0,4 ± 0,03 ng/ml). Im Gegensatz dazu stieg die Konzentration nach 7 und 14 Tagen signifikant auf 4,67 ± 0,62 ng/ml bzw. auf 9,09 ± 1.97 ng/ml an (p<0,05). Im Vergleich der Konzentrationen von 4 Tagen bis zu 14 Tagen gab es einen höchst signifikanten Anstieg (p<0,001; Abb. 21). Vergleicht man die Zahlen der Zellen auf den Modellelektroden mit der ermittelten BDNF-Expression während der Kulturdauer, so scheinen diese im Zusammenhang zu stehen. Die BDNF Konzentration war in Relation zur ermittelten Zellzahl an Tag 4 (0,02 71 Ergebnisse pg/Zelle) sehr gering, gefolgt von einer deutlich gesteigerten Ausschüttung an Tag 7 (0,11 pg/Zelle), welche sich letztendlich auf ein Level von 0,09 pg/Zelle bis Tag 14 erhöhte. Abb. 21: Darstellung der freigesetzten BDNF-Konzentrationen, von den NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Modellelektrodenoberflächen über einen Kultivierungszeitraum von 14 Tagen. Die Daten repräsentieren den jeweiligen Mittelwert und Standardfehler der freigesetzten BDNF-Konzentration, ermittelt durch ELISA im Dreifachansatz (4 d, n = 12; 7 d, n = 12; 14 d; n = 12; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001). 6.1.4 Bioaktiviät von BDNF in Ko-Kultur mit Spiralganglienzellen Die Bioaktivität von BDNF, welches von den NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) freigesetzt wurde, konnte anhand seiner Wirkung auf die Spiralganglienzellen in Ko-Kultur, wie in Abschnitt 5.1.8 erläutert, ermittelt werden. Hierbei wurden mittels immuncytochemischer Untersuchungen die Überlebensraten, und das Neuritenwachstum der Spiralganglienzellen untersucht (Abb. 22 A-D). 72 Ergebnisse Abb. 22: Immuncytochemische Untersuchungen der Wirkung zellbesiedelter Modellelektroden auf Spiralganglienzellen (SGZ): Mikroskopische Darstellung von Spiralganglienzellen und ihrer Neuritenaussprossungen nach Ko-Kultivierung mit A: NIH3T3/BDNF/ME, B: NIH3T3/ME, C: SGZ im Medium mit BDNF-Zugabe, D: SGZ im Medium ohne BDNFZugabe. 100-fache Vergrößerung. 73 Ergebnisse Überlebensraten von Spiralganglienzellen Das Anfärben der Zellen mit Anti-Neurofilament-Anikörper ergab die Anzahl eingesäter Neuronen zum Zeitpunkt 0 (Einsaatkontrolle, siehe 5.1.8) von 612,2 ± 183,6 Neuronen pro Vertiefung (Mittelwert ± Standardfehler). Durch den Vergleich der im Versuchsverlauf verbliebenen Neuronen mit denen der Einsaatkontrolle, konnten die Überlebensraten der Spiralganglienzellen in den Experimental- und Kontrollgruppen ermittelt werden. Zur Auswertung der Daten wurde ein gemischtes Modell mit Messwiederholungen herangezogen (5.1.10). Die Überlebensraten dienen hierbei als Indikator für die biologische Aktivität des von NIH3T3-Zellen sezernierten BDNF im Hinblick auf das Überleben der Spiralganglienzellen (Abb. 23). Die Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen und den mit Zellen besiedelten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) resultierte in höchst signifikant gesteigerten Überlebensraten der Spiralganglienzellen, bis zu 33,01% ± 5,33% (entspricht 202,1 ± 32,6 Neuronen) im Vergleich zu den Überlebensraten von Spiralganglienzellen, welche ausschließlich im Medium (9,09% ± 5,54%, 55,7 ± 33,9 Neuronen; p < 0,001), oder mit nicht modifizierten NIH3T3/ME (17,09% ± 5,44%,104,6 ± 33,3 Neuronen; p < 0,01) kultiviert wurden. Spiralganglienzellen, deren Kulturmedium rekombinantes, humanes BDNF als Positivkontrolle für das Spiralganglienzellüberleben zugesetzt wurde, zeigten mit 32,01% ± 5,38% (196 ± 32,9) Neuronen ähnlich hohe Überlebensraten, wie die Ko-Kultur mit NIH3T3/BDNF/ME. Geringfügig, aber nicht signifikant erhöhte Überlebensraten wurden in Ko-Kultur von Spiralganglienzellen mit NIH3T3/ME im Vergleich zu Spiralganglienzellen im reinen Kulturmedium festgestellt (Abb. 23). 74 Ergebnisse Abb. 23: Darstellung der Überlebensraten von Spiralganglienzellen in Ko-Kultur mit NIH3T3/BDNF-Zellen auf Modellelektrodenoberflächen (NIH3T3/BDNF/ME, n = 25) im Vergleich zu Spiralganglienzellen in Ko-Kultur mit nicht modifizierten NIH3T3-Zellen auf Modellelektroden (NIH3T3/ME, n = 15) sowie zu Spiralganglienzellen, kultiviert in Kulturmedium (n = 10) und zu Spiralganglienzellen, kultiviert in Kulturmedium mit humanem, rekombinanten BDNF Zusatz (50 ng/ml BDNF, n = 20). Die Daten repräsentieren den Mittelwert und den Standardfehler (n.s. = nicht signifikant, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Neuritenaussprossung von Spiralganglienzellen Zur Charakterisierung der Neuritenaussprossung wurden für jede Probe und Kontrollgruppe fünf zufällig ausgesuchte Spiralganglienzellen herangezogen, deren Neuritenlängen mindestens dem 3-fachen Somadurchmesser entsprachen. Die weitere Auswertung erfolgte nach Hegarty et al. (1997) und Warnecke et al. (2007) (5.1.9). Zur statistischen Auswertung der Daten wurde ein gemischtes Modell mit Messwiederholungen, wie für das Spiralganglienzellüberleben, herangezogen (5.1.10). Nach Ko-Kultur mit Modellelektroden, welche mit BDNF-produzierenden Zellen besiedelt waren, zeigten die Spiralganglienzellen ein höchst signifikant erhöhtes Neuritenwachstum (Länge: 660 ± 43,96 µm; p < 0,001; Abb. 24). Im Vergleich war das durchschnittliche Neuritenwachstum von nicht modifizierten NIH3T3/ME (Negativkontrolle 1) mit 374,25 µm ± 43,96 und Kulturmedium alleine (374,2 µm ± 43,9; Negativkontrolle 2), nach 72 Stunden 75 Ergebnisse Kulturdauer um fast die Hälfte geringer. Spiralganglienzellen, kultiviert mit NIH3T3/BDNF/ME, zeigten im Vergleich zur Positivkontrolle, die 50 ng BDNF /ml im Kulturmedium enthielt, keine signifikanten Unterschiede in der Länger ihrer Neuriten (579,68 µm ± 44,24). Die Spiralganglienzellen, die im Medium mit rekombinanten BDNF kultiviert wurden, wiesen im Vergleich zu beiden Negativkontrollen (NIH3T3/ME, Kulturmedium) ein statistisch signifikant höheres Neuritenwachstum (p < 0,001) auf. Innerhalb der beiden Negativkontrollen (nicht modifizierte NIH3T3/ME, Kulturmedium) wurde keine statistische Signifikanz festgestellt. Abb. 24: Darstellung des Neuritenwachstum von SGZ (nach 72 Stunden), ko-kultiviert mit NIH3T3/BDNF-Zellen (n = 25) auf Modellelektrodenoberflächen im Vergleich zu Spiralganglienzellen, ko-kultiviert mit nicht modifizierten NIH3T3-Zellen auf Modellelektroden (NIH3T3/ME, n = 15) sowie Spiralganglienzellen, kultiviert im Kulturmedium allein und zu Spiralganglienzellen, kultiviert in Kulturmedium (n = 10) mit humanem, rekombinanten BDNF-Zusatz (50 ng BDNF /ml, n = 20). Die Daten repräsentieren den Mittelwert und den Standardfehler (*** = p < 0,001, n.s. = nicht signifikant). 76 Ergebnisse 6.2 In-vivo-Effekte biofunktionalisierter Modellelektroden 6.2.1 Auswertung der AABR-Messungen Um sicher zu stellen, dass in die Versuchsgruppen mit ertaubten Meerschweinchen (1B und 2 B) vor Versuchsbeginn nur normalhörende Meerschweinchen integriert wurden, wurden bei diesen Tieren frequenzspezifische, akustisch-evozierte Hirnstammpotentiale (AABR) vor der Ertaubung (Tag 0) gemessen (Abb. 25). Zur Verifizierung einer erfolgreichen Ertaubung wurde bei den Tieren an Tag 5 vor der Implantation nochmals der Hörstatus geprüft (Abb. 26). Die Ausgangshörschwellen und die Hörschwellen nach Ertaubung wurden jeweils für, alle Tiere gemittelt und sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefasst dargestellt. An Tag 0 wurden die Ausgangshörschwellen aller Tiere vor dem Ertaubungseingriff bestimmt. Die höchste gemessene Hörschwelle lag bei 40 dB SPL und wurde bei Frequenzen von 1kHz und 40 kHz bestimmt. Die niedrigste wurde mit 20 dB SPL bei 40 kHz gemessen. Der Durchschnitt für alle Frequenzen betrug 32 dB SPL auf der linken Ohrseite und 35 dB SPL auf der rechten Ohrseite. Somit galten alle Experimentaltiere als normal hörend und konnten in den Versuch einbezogen werden (KANO u. STARR, 1987). Der Erfolg der Ertaubung wurde am 5. Versuchstag vor der Implantation an allen Tieren verifiziert. Bei allen untersuchten Meerschweinchen erhöhte sich die Hörschwelle bis zu diesem Zeitpunkt (Tab. 4). Die geringste Zunahme betrug 59 dB SPL, die höchste 80 dB SPL. Im Mittel lag die Hörschwellenzunahme bei 67 dB SPL. Somit galten alle Tiere als ertaubt und konnten in die Versuchsauswertung einbezogen werden (MITCHELL et al., 1997). 77 Ergebnisse Abb. 25: Auswertung der konvertierten Messdaten mit der MATLAB-Software (Beispiel: hörendes Meerschweinchen, Tag 0, Stimulusfrequenz = 8 kHz). In 10-dB-Schritten wurden die auditorischen Hirnstammpotentiale von 0 bis 70 dB SPL abgeleitet (206 bis 215 Mittelungen pro Durchlauf, Schwankungen wegen randomisierter Stimulation). Die waagerechten Linien symbolisieren die einfache und doppelte Standardabweichung der Amplitute der Grundaktivität, die bis 30 dB SPL vom dritten Peak noch überschritten wird, so dass dort die frequenzspezifische Hörschwelle festgesetzt werden kann. 78 Ergebnisse Abb. 26: Auswertung der konvertierten Messdaten mit der MATLAB-Software (Beipiel: ertaubtes Meerschweinchen, Tag 5, Stimulusfrequenz = 8 kHz). In 10-dB-Schritten wurden die auditorischen Hirnstammpotentiale von 0 bis 100 dB SPL abgeleitet. Tab. 3: Übersicht über die Mittelwerte der frequenzspezifischen Hörschwellen der Tiere an Tag 0. Tag 0 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 36 32 20 32 33 38 rechtes Ohr (dB SPL) 40 36 24 31 36 40 Tab. 4.: Darstellung der Mittelwerte der frequenzspezifischen Hörschwellen ertaubter Tiere an Tag 5 vor der Implantation. Tag 5 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 98 100 100 99 100 99 rechtes Ohr (dB SPL) 100 99 100 100 100 100 79 Ergebnisse 6.2.2 Verteilung einer Suspension rekombinanter NIH3T3-Fibroblasten in der Cochlea hörender Versuchstiere Vor dem Einbringen zellbesiedelter Modellelektroden aus den In-vitro-Versuchen in die Cochleae der Versuchstiere, wurde zunächst eine Tierversuchsreihe zum Nachweis der Zellen nach Applikation einer Zellsuspension im Innenohr durchgeführt. Hierbei war die Überlegung das Verhalten der Zellen nach Applikation in das Innenohr zunächst zu charakterisieren und geeignete Nachweismethoden zu ermitteln, um die Auswertung der folgenden Versuche mit zellbesiedelten Modellelektroden zu erleichtern (siehe 5.2.7). Die implantierten NIH3T3/BDNF-Fibroblasten konnten nach Basilarmembran- und Striavascularis-Präparation in 5 von insgesamt 18 untersuchten Tieren fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden (Abb. 27). Die Zellen waren bei allen fünf Tieren unterschiedlich diffus in der Cochlea verteilt. Sie waren entweder vereinzelt oder als Zellhaufen auf der Oberfläche der präparierten Strukturen zu finden. Hierbei handelte es sich vornehmlich um die Basilarmembran mit knöchernem Anteil des Modiolus und die Stria vascularis. Die Fluoreszenzintensität und die Anzahl der Zellen war bei den Tieren am höchsten (n = 2), die nach 48 Stunden getötet und untersucht wurden. In den Tieren, die 72 Stunden nach der Implantation getötet wurden, waren bereits weniger Zellen zu detektieren. Eine Quantifizierung wurde hierbei nicht vorgenommen. In den Cochleae der Tiere, welche nach 7 Tagen getötet wurden (n = 2) waren nur sehr vereinzelt schwachfluoreszierende Zellen zu finden. Ein Nachweis der Zellen in Paraffinschnitten mittels Immundetektion mit den Antikörpern CD90.2(Thy.1.2), und Anti-GFP konnte nicht erbracht werden. Weder bei fluoreszenzmikroskopischer Untersuchung der antikörpermarkierten Paraffinschnitte mit den Filtern für Cy5 (Anti-GFP sekundär konjugiert) noch bei lichtmikroskopischer Untersuchung von CD90-markierten Schnitten konnten Zellen detektiert werden. 80 Ergebnisse Abb. 27: Darstellung der Basilarmembran (im Hintergrund leicht durchschimmernd) mit GFPmarkierten NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Oberfläche, 48 Stunden nach Implantation. Die Pfeile kennzeichnen jeweils einzelne Zellen innerhalb des Zellhaufens. Aufnahme: 100 ms Belichtungszeit, 40-fache Vergrößerung. 81 Ergebnisse 6.2.3 Detektion rekombinanter Fibroblasten nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden in die Cochlea hörender und ertaubter Tiere Für den Nachweis der auf den Modellelektroden fixierten Zellen (NIH3T3/BDNF/ME) in der Meerschweinchen-Cochlea, wurden diese zunächst in hörende Tiere implantiert. Die Zellen konnten zunächst 48 Stunden (n = 2) und 7 Tage (n = 9) nach der Implantation fluoreszenzmikroskopisch auf der Oberfläche und in dem Raum zwischen Platindraht und Silikonmantel der Modellelektroden nachgewiesen werden (Abb. 29). In dieser Untersuchungsgruppe waren die Zellen nur vereinzelt auf der Modellelektrodenoberfläche wieder zu finden. Die Zellen waren nach Explantation hauptsächlich zwischen Platindraht und Silikonmantel zu detektieren Meerschweincheninnenohr (Abb. wurden die 30A). Vor Zellen In dem vitro Implantieren für 7 Tage in das auf der Modellelektrodenoberfläche kultiviert. Im Abstand von jeweils 2 Tagen wurde jede Modellelektrode unter dem Fluoreszenzmikroskop in der 40er und 100er Vergrößerung begutachtet. In vitro konnte bereits nach 2 Tagen ein Einwandern der Zellen entlang der Platindrähte in den Raum zwischen den Drähten und dem Silikonmantel der ME beobachtet werden (Abb. 28). Nach 7 Tagen war eine deutliche Menge von Zellen im Inneren der ME zu ermitteln. Nach Explantation der biofunktionalisierten Modellelektrode und folgender Untersuchung der Cochlea unter dem Auflichtmikroskop (siehe 4.2.9) sowie dem Auswerten immunhistologischer Cochleaschnitte (5.2.10) konnte kein Abwandern der Zellen in das umliegende Cochleagewebe nach der Implantation festgestellt werden. Nun konnten die biofunktionalisierten Modellelektroden in einer weiteren Tiergruppe (n = 16) auf das Vorhandensein von NIH3T3/BDNF-Zellen nach einer Implantationszeit von 3 Wochen in ertaubten Tieren untersucht werden. Für die Auswertung wurden die Proben von 13 Tieren herangezogen, nachdem 3 Tiere im Versuchsverlauf verstorben waren. Die Tiere wurden an Tag 26 getötet und die biofunktionalisierten Modellelektroden vorsichtig aus der Cochlea entfernt. In den zu untersuchenden Tieren konnten die Zellen nach Explantation fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Auch in dieser Untersuchungsgruppe waren die Zellen hauptsächlich in dem Raum zwischen Platindraht und Silikonmantel wiederzufinden und nur sehr vereinzelt auf der Oberfläche der Implantate (Abb. 30B). An der Eintrittsstelle der Elektrode in die Scala tympani der Cochlea konnte in ca. 30% der Tiere 82 Ergebnisse vermehrt fibrinöses Wachstum (Anhäufung von Fibroblasten am Rande der cochleären Strukturen) im Lumen der Scala beobachtet werden. Abb. 28: Die Abbildungen (A und B) demonstrieren das Einwandern der Zellen entlang der Platindrähte in das Innere der Modellelektrode innerhalb der Kultivierungszeit von 7 Tagen. A: Durchlicht, 40-fache Vergrößerung. Die Zellen sind im Raum zwischen Platindraht und Silikonmantel, wie auch auf dem Boden der Platte sichtbar. B: Korrespondierende Fluoreszenzaufnahme, 40-fache Vergrößerung. Die Zellen befinden sich auf dem Platindraht ausserhalb des Silikonmantels, innerhalb des Silikonmantels und auf dem Boden der Platte. 83 Ergebnisse Abb. 29: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Modellelektroden (ME) nach 7tägiger Kultivierungsdauer am Tag der Implantation (d5). Die Zellen befinden sich sowohl auf der Oberfläche der ME als auch im Zwischenraum zwischen Platindraht und Silikonmantel. Visualisierung der Zellen auf der ME-Oberfläche in 40-facher Vergrößerung (A) und 100-facher Vergrößerung (B): Visualisierung der Zellen auf dem Platindraht in 40-facher Vergrößerung (C) und 100-facher Vergrößerung (D). 84 Ergebnisse Abb. 30: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von NIH3T3/BDNF-Fibroblasten in dem Raum zwischen Platindraht und Silikonmantel nach Entnahme aus hörenden Tieren nach 7tägiger Versuchsdauer (A) und nach Entnahme aus ertaubten Tieren nach 21tägiger Versuchsdauer (B). 40-fache Vergrößerung. 6.2.4 Protektiver Effekt biofunktionalisierter Modellelektroden auf die Spiralganglienzelldichte im Innenohr nach Ertaubung Protektiver Effekt nach Applikation einer Suspension aus modifizierten NIH3T3-Fibroblasten Zur Untersuchung eines protektiven Effekts auf das Spiralganglienzellüberleben durch die Freisetzung von BDNF, von viral modifizierten Zellsystemen als mögliches Drug-DeliverySystem, wurden die in dieser Studie verwendenten lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen (NIH3T3/BDNF) zunächst in Form einer Zellsuspension in ertaubte Tiere appliziert. Die bilaterale Ertaubung der Tiere ermöglichte hierbei einen Vergleich der Spiralganglienzelldichten der mit NIH3T3/BDNF-Zellen behandelten linken Ohren und der unbehandelten rechten Ohren. Die vergleichsweise geringe Anzahl an Tieren in dieser Versuchsgruppe resultiert aus der Überlegung, die entsprechenden Experimente als Vorversuche zu den Implantationsversuchen mit zellbesiedelten Modellelektroden anzusehen. Die Tiere wurden 21 Tage nach Zelltransfer getötet, die Cochleae entkalkt, in Paraffin eingebettet und geschnitten (siehe 5.2.9). Danach wurden die Spiralganglienzellen in allen cochleären Windungen ausgezählt und die Spiralganglienzelldichte (SGZ/10.000µm2) pro Cochlea bestimmt (siehe 5.2.11). Die statistische Auswertung dieser Versuchsgruppe ergab 85 Ergebnisse keinen signifikanten Unterschied in der Spiralganglienzelldichte behandelter und unbehandelter Ohren (Abb. 31B). Demnach konnte kein Effekt der Applikation freier NIH3T3/BDNF-Zellen hinsichtlich der Überlebensrate der Spiralganglienzellen nachgewiesen werden. Protektiver Effekt nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden Zur Charakterisierung der BDNF-Bioaktivität nach Implantation biofunktionalisierter Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) und Kontrollmodellelektroden (Kontroll/ME) in ertaubte Meerschweinchen (n = 11), wurde die Spiralganglienzelldichte an Tag 21 nach der Implantation untersucht. Die kontralateralen Cochleae, die nicht implantiert wurden, dienten als interne Kontrolle zum Nachweis des ototoxisch induzierten Spiralganglienzellrückgangs. Nach Entnahme der Modellelktroden aus den Cochleae wurden diese entkalkt, in Paraffin eingebettet, geschnitten und die Spiralganglienzellen, wie in 5.2.11 beschrieben, ausgezählt (Abb. 34). Unter mikroskopischer Sicht konnten mehr Spiralganglienzellen im Rosenthalschen Kanal einzelner Windungen in den behandelten Cochleae ausgemacht werden als in den kontralateralen, unbehandelten Cochleae. Die statistische Analyse der Mittelwerte der SGZ-Dichte ergab einen deutlich signifikanten Unterschied zwischen den Cochleae implantiert mit biofunktionalisierten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME, 6,16 ± 0,43 SGZ/10.000 µm2) und den kontralateralen, unbehandelten Cochleae (NIH3T3/BDNF/ME-kontra, 4,33 ± 0,34; p < 0,01; Abb. 31A, Abb. 32) der jeweiligen Tiere. Der Unterschied zu der Versuchstiergruppe mit implantierten Kontrollmodellelektroden (Kontroll/ME, 1,05 ± 0,28) ist höchst signifikant (p < 0,001; Abb. 32). Es zeigte sich, dass die mit NIH3T3/BDNF/ME behandelten Cochleae ein deutlich gesteigertes Spiralganglienzellüberleben aufwiesen, als die unbehandelten jeweils kontralateralen Cochleae. Auch der Vergleich zwischen den unbehandelten, kontralateralen Seiten beider Tierversuchsgruppen (NIH3T3/BDNF/ME-kontra vs. Kontroll/ME-kontra) zeigte einen signifikanten Unterschied in der SGZ-Dichte (p < 0,01). Desweiteren konnte ein signifikanter Unterschied (p < 0,01) der Spiralganglienzelldichte der Kontrollgruppe im Vergleich zu den kontralateralen Cochleae der Experimentalgruppe festgestellt werden (Kontroll/ME vs. NIH3T3/BDNF/ME-kontra; Abb. 32). 86 Ergebnisse Der protektive Effekt auf die SGZ-Dichte konnte sowohl in den basalen Windungen als auch in den mittleren und apikalen Windungen der behandelten Cochleae ausgemacht werden (Abb. 33). Im Vergleich zu den basalen Windungen (7,01 ± 0,55 SGZ/10.000 μm2) war die Spiralganglienzelldichte der mittleren und apikalen Windungen (5,74 ± 0,23 SGZ/10.000 μm2) signifikant niedriger (p < 0,05), wohingegen der Unterschied im Spiralganglienzellüberleben zwischen der basalen Windung und den mittleren/apikalen Windungen auf der kontralateralen Seite statistisch nicht signifikant war. Abb. 31 : Vergleichende Darstellung der Mittelwerte der SGZ-Dichte aller bilateral ertaubten und einseitig implantierten Tiere mit A: biofunktionalisierter Modellelektrode (NIH3T3/BDNF/ME) und B: Zellsuspension (NIH3T3/BDNF/Susp.). Die kontralaterale, unbehandelte Seite (kontra) diente jeweils als Kontrolle zur behandelten, implantierten (implant) Seite. Die Daten repräsentieren jeweils den Mittelwert und den Standardfehler. Für die statistische Auswertung wurde der t-Test herangezogen (*** = p < 0,001, n.s. = nicht signifikant). 87 Ergebnisse Abb. 32: Zusammenfassende Darstellung der Mittelwerte der SGZ-Dichte bilateral ertaubter und einseitig implantierter Tiere mit biofunktionalisierten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME) und Kontrollmodellelektroden (Kontroll/ME). Die kontralaterale, unbhandelte Seite diente jeweils als interne Kontrolle (NIH3T3/BDNF/ME-kontra, Kontroll/ME-kontra). Die Daten repräsentieren jeweils den Mittelwert und den Standardfehler. Die einfache Varianzanalyse (ANOVA) und der Newman-Keuls-Test wurden für die statistische Auswertung herangezogen (n.s. = nicht signifikant, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Abb. 33: Vergleichende Darstellung der SGZ-Dichte im Rosenthalschen Kanal der basalen und mittleren/apikalen Windungen nach Implantation der biofunktionalisierten Modellelektroden (NIH3T3/BDNF/ME, p < 0,05) und der kontralateralen, unbehandelten Cochleae (p < 0,001). Die einfache Varianzanalyse (ANOVA) und der Newman-KeulsTest wurden für die statistische Auswertung herangezogen. 88 Ergebnisse Abb. 34: Aufnahmen der Rosenthalschen Kanäle (untere Windung) eines ertaubten Tieres, welches über 3 Wochen linksseitig mit NIH3T3/BDNF-Zellen behandelt wurde. A: linke Seite, die Pfeile markieren einige der intakten SGZ. B: rechte Seite, die Pfeile markieren degenerierte SGZ. Die Mehrzahl der Spiralganglienzellen ist linksseitig, also auf der behandelten Seite auszumachen. 100-fache Vergrößerung. 89 Diskussion 7 DISKUSSION Für zahlreiche Wachstumsfaktoren (z.B. BDNF, NT-3, NT-4, GDNF) wurde ein protektiver Effekt auf Spiralganglienzellen in vitro als auch in vivo nachgewiesen (ALTSCHULER et al., 1999; FRITZSCH et al., 1997; MCGUINNESS u. SHEPHERD, 2005; MILLER et al., 2007; SONG et al., 2009; WARNECKE et al., 2007). Einzeln, oder kombiniert verabreicht könnten diese Faktoren den Therapieerfolg, der mit einem CI erzielt werden kann, die Vermittlung eines Höreindruckes durch Stimulation von Fasern des Hörnervs, positiv beeinflussen. Hierbei ist der Erhalt des nervalen Hörepithels, der Spiralganglienzellen, als Ansatzpunkt elektrischer Stimulation von maßgeblicher Bedeutung. Einige Tierversuchsstudien zeigen, dass Wachstumsfaktoren, wenn sie in Kombination mit chronischer, elektrischer Stimulation verabreicht werden, die Interaktion zwischen Neuronen und Cochlea-Implantat (CI) optimieren und die Hörschwelle verbessern können (AGTERBERG et al., 2009; COCO et al., 2007; SCHEPER et al., 2009; SHEPHERD et al., 2005; WEFSTEDT et al., 2005; YAMAGATI et al., 2004). Allerdings ist die Applikation von Medikamenten in das Innenohr aus otologischer Sicht sehr anspruchsvoll. Medikamente lassen sich entweder systemisch oder lokal in das Innenohr applizieren, wobei bei der systemischen Gabe zwei Aspekte beachtet werden müssen: - Die Innenohr-Blutschranke limitiert als Barriere den Transport vom Serum in das umliegende Gewebe und in die Flüssigkeitsräume (KISHINO et al., 2001). - Die systemische Applikation und ein zunehmend breiteres Wirkspektrum der Medikamente führt zu umfangreicheren Nebenwirkungen (JERO et al., 2001; SHEPHERD et al., 2005; ISHIMOTO et al., 2003; ITO et al., 2005). Die Vermittlung eines neuroprotektiven Effekts durch Wachstumsfaktoren ist auf die Dauer ihrer Gabe beschränkt. Unmittelbar nach dem Einstellen der BDNF-Behandlung sinkt die Anzahl der überlebenden Neuronen, die sich dann nicht mehr von der unbehandelten Seite unterscheidet (GILLESPIE et al., 2003). Die Rate der neuronalen Degeneration nimmt im Anschluß an eine BDNF-Behandlung im Verhältnis zu ertaubten, unbehandelten Cochleae sogar signifikant zu. Daher werden Strategien entwickelt, die eine lokale Langzeitapplikation ermöglichen. Aus diesem Grund war es das maßgebliche Ziel der vorliegenden Arbeit, ein auf 90 Diskussion Zellen basierendes lokales Drug-Delivery-System für das Innenohr zu entwickeln und den biologischen Effekt solch eines Systems in Zellkultur sowie im Tiermodell zu untersuchen. Der wesentliche Vorteil bei der Verwendung von Zellen für eine Wachstumsfaktorfreisetzung besteht in der potentiellen Langzeitapplikation dieser Faktoren in Kombination mit chronischelektrischer Stimulation (EVANS et al., 2009; HUANG et al., 2009; RICHARDSON et al., 2009). Hierbei kann in optimaler Weise das Implantat als Zellträgermaterial genutzt werden. Virale Vektoren ermöglichen im Vergleich zur systemischen Applikation eine Langzeitapplikation über eine entsprechende Gen-Expression (KESSER u. LALWANI, 2009; LUEBKE et al., 2009). Allerdings stellen virale Vektoren nach wie vor eine potentielle Quelle für Toxizität und Infektionen dar, und es ist nur bedingt möglich, den Typus und die Anzahl infizierter Zellen zu bestimmen (ISHIMOTO et al., 2002, 2003). Ein Hinüberwandern viraler Vektoren auf das kontralaterale Ohr, und somit ein mögliches Einwandern ins Gehirn über den Aqueductus cochleae limitieren den klinischen Einsatz (COLEMAN et al., 2006; KHO et al., 2000; LALWANI et al., 2002; STÖVER et al., 2000). Aus diesen Gründen ist es notwendig, bessere Techniken für ein beständiges und vor allem gewebespezifisches Drug-Delivery für das Innenohr zu entwickeln. Die vorliegende Studie zeigt, dass Adhäsion und Proliferation von genetisch modifizierten Zellen auf der Oberfläche von Modellelektroden erzielt werden können. Somit kommt auch die Biofunktionalisierung von CI-Elektroden zur Expression von Wachstumsfaktoren wie BDNF als eine neuartige vielversprechende Methode der Wachstumsfaktorapplikation in der klinischen Anwendung in Frage. Hierbei ermöglicht die Immobilisation der Zellen eine beständige lokale Abgabe von Wachstumsfaktor. Neben einem Spiralganglienzellüberleben kann so ein Wachstum der Neurite in Richtung der Elektrode induziert werden, mit dem Ziel, die Nerven-Elektroden-Schnittstelle zu optimieren. In der vorliegenden Untersuchung wurde ein In-vitro-Modell zur Charakterisierung des Adhäsions- und Proliferationsverhaltens der (Silikonelastomere mit und ohne Platin) etabliert. 91 Zellen auf dem Trägermaterial Diskussion 7.1 In-vitro-Modell der Biofunktionalisierung der Modellelektroden 7.1.1 Proliferation der NIH3T3/BDNF-Zellen auf den Silikonelastomeren und BDNFFreisetzung Im Gegensatz zu einer Studie von REJALI et al. (2007), in der BDNF-produzierende NIH3T3-Fibroblasten in Agarose eingebettet auf die Elektrodenspitze aufgebracht wurden, wurden die Zellen in der vorliegenden Studie direkt auf den Modellelektroden (ME) kultiviert. Diese Vorgehensweise erlaubte es den NIH3T3-Zellen, auf der Oberfläche zu adhärieren und proliferieren, und somit einen nahezu vollständigen Bewuchs des Trägers mit Zellen zu erreichen. So war man erstens in der Lage, eine möglichst große Anzahl Zellen aufzubringen, zweitens das Zellwachstum in den Zeiträumen 4, 7, und 14 Tage zu charakteriesieren und drittens die freigesetzte Menge an Faktor (BDNF) zu ermitteln. Im Ausblick auf eine zukünftige Standardisierung der Biofunktionalisierung von Modellelektroden kann man hierbei von einem schnellen und aussagekräftigen Basismodell sprechen. Es vereinigt die Untersuchung von Zellwachstum auf Polymeren, die Untersuchung der Wachstumsfaktorfreisetzung der entsprechenden Zellen und die Bioaktivität des Konstrukts in der Ko-Kultur. Die Ergebnisse belegen nicht nur einen fünffachen Anstieg der Zellzahl auf der ME-Oberfläche, sondern auch eine 23-fach hochregulierte BDNF-Expression (bis zu einem Durchschnittswert von 9,09 ng/ml innerhalb der Kultivierungsdauer). Dies indiziert eine effektive BDNF-Freisetzung der immobilisierten Zellen in das umliegende Gewebe bzw. Zellkulturmedium. Im Vergleich mit dem nahezu linearen Anstieg der Zellzahl von Tag 4 bis Tag 14 der Kultivierung, ist der Anstieg der BDNF-Konzentration im Medium innerhalb der ersten 7 Tage eher exponentiell (Anstieg um Faktor 12: 0,116 pg/Zelle). Gefolgt von einer weniger schnell ansteigenden Expressionsrate zwischen dem 7. und 14. Tag (Anstieg um Faktor 2: 0,09 pg/Zelle). Der vergleichsweise weniger schnelle Anstieg der Expressionsrate zwischen dem 7. und 14. Tag resultiert möglicherweise aus dem steigenden Nährstoffbedarf der proliferierenden NIH3T3/BDNF-Fibroblasten, und/oder aus dem Anstieg toxischer Stoffwechselprodukte im Medium, denen die Zellen ausgesetzt sind. Die Degradation von 92 Diskussion BDNF oder eine Interaktion von BDNF mit anderen Komponenten im Zellkulturmedium, welches sich dadurch der Konzentrationsbestimmung mittels ELISA entzieht, stellen weitere mögliche Gründe für den geringen Anstieg der Expressionsrate von BDNF zwischen dem 7. und 14. Tag der Kultivierung dar. Vermutlich spiegeln die vorliegenden Ergebnisse daher nicht das absolute Potential der BDNF-Expression der rekombinanten Fibroblasten wieder. 7.1.2 Biologische Wirkung immobilisierter NIH3T3/BDNF-Zellen auf Silikonelastomeren in Spiralganglienzellkultur Die biologische Wirkung von BDNF wurde vorliegend in der Ko-Kultur von biofunktionalisierten Silikonelastomeren (NIH3T3/BDNF/ME) mit isolierten Spiralganglienzellen aus neonatalen Ratten demonstriert. Mittels immunhistochemischer Färbung wurden hierbei signifikant erhöhte Überlebensraten der Spiralganglienzellen und ein gesteigertes Aussprossen von Neuriten im Vergleich zu Spiralganglienzellen im Kulturmedium allein festgestellt. Damit konnte demonstriert werden, dass die immobilisierten Zellen eine hohe protektive Wirkung auf neuronale Zellen haben. Im Gegensatz dazu zeigten die Modellelektroden, die mit nicht modifizierten NIH3T3-Fibroblasten besiedelt waren sowie die Negativkontrolle (Spiralganglienzellen im Medium allein), jeweils keine signifikante Wirkung auf die Spiralganglienzellüberlebensraten und Neuritenaussprossung. Geringfügig, aber nicht signifikant erhöhte Überlebensraten wurden in Ko-Kultur von Spiralganglienzellen mit NIH3T3/ME im Vergleich zu Spiralganglienzellen im reinen Kulturmedium festgestellt. Diese Beobachtung wirft die Frage auf, ob möglicherweise noch andere Wachstumsfaktoren, wie CNTF, FGF1/2, GDNF, NGF, NT3, NT4 und NT5 sowohl in den genetisch modifizierten als auch in den nativen NIH3T3-Zellen exprimiert worden waren. In den bisherigen Studien konnte dies nicht bestätigt werden. Vielmehr wird diese Fibroblastenzelllinie als besonders geeignet für genetische Modifikationen beschrieben, um beispielsweise die Art der Rezeptorenbindung, die Bioaktivität von Wachstumsfaktoren sowie das neuronale Überleben zu untersuchen (DAZERT et al., 1998; FRYER et al., 1997; GLASS et al., 1991, JERREGARD et al., 2001; JIANG et al., 1999; LI et al., 2002; WISSEL et al., 2008). Aus diesem Grund kann man 93 vermuten, dass die Unterschiede im Diskussion Spiralganglienzellüberleben zwischen den zwei Negativkontrollen und der Einsaatkontrolle aus dem Vorhandensein geringer Mengen an endogenem BDNF resultieren. Dieses endogene BDNF wird von „Bystander“ Zellen, wie Glia-, Satelliten- und Bindegewebszellen, die in dem verwendeten In-vitro-Modell vorhanden sind exprimiert, da es sich bei der Spiralganglienzellkultur um eine Mischkultur handelt. Es ist bekannt, dass diese Zelltypen Wachstumsfaktoren freisetzen und damit Spiralganglienzellen vor Degeneration schützen und das Aussprossen von Neuriten induzieren können. Insbesondere unter Stresssituationen, wie bei der Isolation und Dissoziation des Spiralganglions. Vielversprechender scheint das Ergebnis, dass die Ko-Kultivierung von Spiralganglienzellen mit biofunktionalisierten Modellelektroden zu ähnlich hohen Überlebensraten führt wie die externe Gabe von humanem rekombinanten BDNF (WARNECKE et al., 2007; WEFSTAEDT et al., 2005) bei einer Spiralganglienzellkultur. Neuriten aus der Ko-Kultur mit zellbesiedelten Modellelektroden waren sogar signifikant länger, als diejenigen der Positivkontrolle. Die BDNF-Konzentration im Ko-Kultur-Assay mit biofunktionalisierten Modellelektroden betrug im Durschnitt 9,09 ± 1,97 ng/ml. Es ist wahrscheinlich, dass eine kontinuierliche Freisetzung von BDNF durch die immobilisierten Fibroblasten einen stärkeren biologischen Effekt hat, als eine einmalige Applikation von BDNF. Ferner scheint es eine wichtige Rolle zu spielen, ob Spiralganglienzellen synthetisch hergestelltes BDNF zugesetzt wird, oder von Zellen exprimiert, welche sich in ihrer Wirkung möglicherweise voneinander unterscheiden. Auch könnte hierbei die Applikation von aufgereinigtem, lyophilisiertem, rekombinanten BDNF eine andere Wirkung hervorrufen, als direkt von den Zellen in das Medium freigetztes BDNF. Nimmt man die Bioaktivität von BDNF als Maß für die zur Induktion neuronaler Prozesse benötigte Konzentration, dann waren knapp 5 ng von den Zellen freigesetztes BDNF je Milliliter ausreichend, um ein Neuritenwachstum zu induzieren (vorliegende Arbeit). Bei der Applikation von BDNF via Infusionssystem oder dem System mit Mini-osmotischen-Pumpen benötigt man dagegen mit 50 ng/ml (MILLER et al., 1997) und 100 ng/ml (AGTERBERG et al., 2009; MCGUINNESS et al., 2005; SHEPHERD et al., 2008; SHINOHARA et al., 2002) vergleichsweise hohe Konzentrationen um ein Überleben von Spiralganglienzellen zu gewährleisten. Diese Aussage wird unterstützt durch eine Studie von EVANS et al., (2009), in der kovalent gebundenes BDNF mit Hilfe von Polypyrolen auf Cochlea-Elektroden 94 Diskussion aufgebracht wurde. Ein gesteigertes Neuritenwachstum konnte hier bei einer Freisetzung von 5 ng BDNF/ml und einer Kulturdauer von 3 Tagen beobachtet werden. 7.2 Biofunktionalisierte Modellelektroden im In-vivo-Modell 7.2.1 Zellnachweis und biologische Wirkung von NIH3T3/BDNF-Zellen im Innenohr nach Transfer von Zellsuspension Bevor die biofunktiontionalisierten Modellelektroden aus den In-vitro-Versuchen auf ihre chirurgische Praktikabilität getestet werden konnten, wurden in einem Vorversuch zunächst die NIH3T3-Fibroblasten als Suspension in das Innenohr injiziert. Dieser Ansatz diente dazu geeignete Nachweismethoden zu ermitteln und die Auswertung der folgenden Versuche mit zellbesiedelten Modellelektroden zu erleichtern. Nach Injektion der Zellen als Suspension gelang deren Nachweis ausschließlich bis maximal 7 Tage nach Applikation. In der Mehrzahl der Tiere, in denen die transferierten Zellen fluoreszenzmikroskopisch in der Cochlea dargestellt wurden, konnten diese bis maximal Tag 2 nachgewiesen werden. Insgesamt waren die Zellen, nach direktem (Basilarmembranpräperation) und indirektem Detektionsverfahren (Immunhistologie von Paraffinschnitten) nur vereinzelt in den Tieren nachzuweisen, so dass eine statistische Auswertung dieses Vorversuchs ausblieb. Ein biologisch wirksamer Effekt auf die Spiralganglienzellen konnte in dieser Vorversuchsreihe ebenfalls nicht nachgewiesen werden (siehe 6.2.4). Im Folgenden werden mögliche Gründe für diese Beobachtung aufgezeigt. Trotz täglicher Immunsuppression mit Ciclosporin, welches intraperitoneal über den gesamten Versuchszeitraum verabreicht wurde, kann eine Abstoßung der Zellen durch das Immunsystem des Empfängertiers nicht ausgeschlossen werden. Als Begleiterscheinung einer Immunreaktion im Innenohr, möglicherweise hervorgerufen durch den Insertionsprozess, formiert sich eine extrazelluläre Matrix, die in eine Fibrose übergehen kann. Nährstoffmangel, eingeschränkte Adhäsionsfähigkeit durch cochleäre Strukturen wie Knochen und Membranen, eingeschränkte Integration in bestehende Zellverbände und immunologische Reaktionen induzieren möglicherweise eine Apoptose der transplantierten Zellen. Ein weiterer wichtiger 95 Diskussion Aspekt bei der Applikation von Zellen oder Pharmaka in das Innenohr ist deren Verteilung innerhalb der cochleären Strukturen. In Studien zu Pharmakaapplikation ins Innenohr, (z.B. Gentamycin und Dexamethason; BORKHOLDER, 2008, PLONTKE et al., 2007), konnte nach Rundfensterapplikation ein Konzentrationsgradient von basal nach apikal gemessen werden. SALT et al. (2005) beschreiben in ihrer pharmakokinetischen Studie des Innenohrs den Austausch von Substanzen zwischen den Scalen, den verschiedenen Lymphen und dem vaskulären System. Ein Abbau implantierter Zellen ist demnach innerhalb weniger Tage möglich, so dass die Zellen sich der Detektion entziehen und damit keine Rückschlüsse auf deren vorherige In-vivo-Aktivität im Innenohr erlauben. Neben Apoptose und Degradation kann eine weiträumige Verteilung der Zellen im Innenohr und auf die kontralaterale Seite in Betracht gezogen werden. Auch der Verlust von GFP- und BDNF-Produktion können mögliche Ursachen für die erschwerte Detektion und den ausbleibenden biologischen Effekt sein. 7.2.2 Biologische Wirkung implantierter biofunktionalisierter Modellelektroden auf Spiralanglienzellen in vivo Nach erfolgreicher Etablierung des In-vitro-Modells mit biofunktionalisierten Modellelektroden wurden diese im In-vivo-Versuch in das Innenohr von Meerschweinchen implantiert. Die Untersuchung der Spiralganglienzelldichte an Tag 21 nach der Implantation ergab eine höhere Überlebensrate für die behandelten Innenohre im Vergleich zu der jeweils unbehandelten Seite, wie auch im Vergleich zu den Tieren mit Kontroll-Modellelektroden. Die Ergebnisse deuten auf eine hohe BDNF-Bioaktivität in vivo 3 Wochen nach Implantation hin und zeigen die Möglichkeiten einer zellbasierten Wachstumsfaktorapplikation. Ein protektiver Effekt auf die Spiralganglienzelldichte konnte sowohl in den basalen Windungen als auch in den mittleren und apikalen Windungen der Cochleae ausgemacht werden. Der Vergleich des protektiven Effekts von BDNF auf die Spiralganglienzellen innerhalb der einzelnen Windungen zeigt eine Abstufung von basal nach apikal (siehe 6.2.3). Diese Beobachtung resultiert vermutlich einerseits aus der begrenzten Insertionstiefe der Modellelektrode, andererseits aus dem Anstieg der Gefahr des Abstreifens der Zellen von der Oberfläche der Modelleleketrode mit zunehmender 96 Insertionstiefe. Eine höhere Diskussion Überlebensrate von SGZ in den basalen Windungen wurde auch in Studien mit viralem Gentransfer in das Innenohr beobachtet (CHIKAR et al., 2008; KILPATRICK et al., 2011; LALWANI et al., 2002; WISE et al., 2010). Als eine der Ersten demonstrierten Okano et al. (2006) den Transfer von BDNFproduzierenden NIH3T3-Zellen in das Innenohr von Mäusen und wiesen das Zellüberleben bis zu 4 Wochen nach Implantation nach. In einer weiteren Studie (Rejali et al., 2007) wurde gezeigt, dass in Agarose eingebettete, auf die Modellelektrodenspitze aufgebrachte NIH3T3Zellen, mit der Fähigkeit BDNF zu produzieren, zu höheren Überlebensraten bis zu 48 Tage nach Implantation in vivo führten. Diese Studie unterstützt die in der vorliegenden Arbeit aufgestellte These, dass die Immobilisation der Zellen hinsichtlich des BDNF-Transportes ein effizienteres Ergebnis hervorbringt, als der reine Zelltransfer. Das Immobilisieren der Zellen diente dem Ziel, sie verstärkt zu Adhäsion, Proliferation und Nutzung der gesamten Modellelektrodenoberfläche zu veranlassen und somit über deren BDNF-Sekretion eine möglichst hohe Spiralganglienzellüberlebensrate in allen cochleären Windungen zu erreichen. In einer Studie von GILLESPIE et al. (2003) wurde bei ertaubten Meerschweinchen nach einem Abbruch der BDNF-Therapie der Effekt auf die Spiralganglienzellen untersucht und mit Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen ohne vorherige pharmakologische Intervention verglichen. Hier stieg die Degenerationsrate der zuvor protektierten SGZ schneller, als die der unbehandelten Ohren. Es wird vermutet, dass die BDNF-Applikation nach Ertaubung nicht nur eine wichtige Ursache für das Spiralganglienzellüberleben darstellt, sondern auch essentiell für das Überleben von Mantelzellen, auch Satellitenzellen oder Amphizyten genannt, ist. Sie umgeben das Perikaryon der Nervenzellen im Ganglion und dienen deren Stoffwelchsel. Über die Langzeitapplikation von BDNF durch proliferierende Zellen soll eine plötzliche, rapide Degeneration von Spiralganglienzellen verhindert werden. Die vorliegende Studie beschreibt die mögliche Anwendung eines solchen Systems in vivo über einen Zeitraum von 3 Wochen. Vergleicht man die Ergebnisse nach Immobilisation der Fibroblasten auf Modellelektrodenträger mit denen des Zelltransfers, dann scheint der BDNFTransport in Richtung der Zielzellen nach Immobilisation der Fibroblasten effizienter. Diese Wertung birgt großes Potential für die Anwendung biofunktionalisierter Elektroden im Bereich der Langzeittherapie von Hörminderung und Taubheit. 97 Diskussion In fortlaufenden Studien muss nun dieses Konzept anhand größerer Zeiträume im Tier getestet werden, um die Verfügbarkeit des von immobilisierten Fibroblasten freigesetzten BDNF und die damit verbundene Protektion der Spiralganglienzellen nach Ototrauma über einen längeren Zeitraum zu evaluieren. Auch die verzögerte Applikation von Wachstumsfaktoren bei einer Langzeitertaubung sollte in Betracht gezogen werden und unter Anwendung des vorliegenden Modells untersucht werden. Bisher konnten in vorangegangen Studien Effekte auf das Überleben von Spiralganglienzellen von Meerschweinchen und Ratten nach verzögerter Applikation von Wachstumsfaktoren, wie BDNF, FGF und GDNF, bis zu 6 Wochen nach Ertaubung demonstriert werden (FRANSON et al., 2010; GLUECKER et al., 2008; MILLER et al., 2007; SCHEPER et al., 2009; SONG et al., 2008, 2009; JAMAGATA et al., 2004). Ein verzögerter Einsatz eines auf Zellen basierendem DrugDelivery-System ist daher möglicherweise in der Lage Vorgänge für das Spiralganglienzellüberleben zu induzieren. Ein wichtiger Aspekt, der in weiterführenden Versuchen geklärt werden sollte betrifft die Adhäsion der NIH3T3/BDNF-Zellen auf der Modellelektrodenoberfläche. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie wurde festgestellt, dass sich ein großer Teil der Zellen im Raum zwischen Platindraht und Silikonmantel befand und ein weitaus geringerer Teil auf der Modellelektrodenoberfläche. Hierfür gibt es folgende mögliche Gründe. Reich et al. (2008) zeigten in vitro ein gesteigertes Wachstum von Fibroblasten (NIH3T3) auf Platinoberflächen im Vergleich zur Wachstumsrate auf Silikonoberflächen. Aufgrund einer starken Affinität von Fibroblasten zu Platin (REICH et al., 2008) wanderten die Zellen entlang der Platindrähte in das Innere der Modellelektrode. Interessanterweise waren die Zellen in der Lage die GFPund BDNF-Expression über drei Wochen nach Implantation aufrecht zu erhalten .Wie die Zellen in dieser Zeit mit Nährstoffen und Doxycyclin versorgt wurden ist nicht bekannt. Folgend bleibt es zu klären, in welchem Ausmaß das Spiralganglienzellüberleben mit der Wachstumsfaktorproduktion der Zellen im Silikon-Platin-Zwischenraum zusammenhängt und ob, und in welchem Umfang, die Zellen in der Lage sind in diesem sehr kleinen Zwischenraum zu proliferieren. Eine stabile Langzeitexpression von bioaktivem Wachstumsfaktor durch die immobilisierten Fibroblasten muss in vitro, wie auch in vivo über den Zeitraum von 21 Tagen hinaus untersucht werden. Desweiteren sollte die erforderliche Dauer der Wachstumsfaktorgabe ermittelt werden, die nötig ist, um einen protektiven Effekt 98 Diskussion auf das Spiralganglienzellüberleben zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Vor einer möglichen klinischen Anwendung muss in weiteren Versuchsreichen die Frage geklärt werden, ob und in welchem Umfang implantierte Zellen Ursache für exponentielles Wachstum sind. Darüberhinaus ist es erforderlich an alternativen Methoden zum Aufbringen von Zellen auf auditorischen Elektrodenträgern zu arbeiten. In Anbetracht einer möglichen Bewachsung der Elektrodenträger mit körpereigenem Bindegewebe muss evaluiert werden inwieweit dies die Abgabe von Wachstumsfaktoren an die neuronalen Zielzellen beeinflussen kann. Die Elektrostabilität der lentiviral modifizierten Zellen und der Wachstumsfaktorexpression sollte in Kombination mit chronisch-elektrischer Stimulation in In-vivo-Untersuchungen ermittelt werden. 7.3 Zusammenfassende Betrachtung der Methodik in vitro und in vivo Im In-vitro-Modell dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Abgabe von BDNF über einen längeren Zeitraum, produziert von Zellen, ein effizientes Drug-Delivery-System darstellt. Dieses kommt im Vergleich zu rekombinantem BDNF (WARNECKE et al., 2007) mit wesentlich geringeren Konzentrationen aus. Das Verfahren zur Besiedlung von Silikonelastomeren mit lentiviral modifizierten Fibroblasten als BDNF-Lieferanten für das Innenohr kann anhand der vorliegenden Ergebnisse als erfolgreich und für die Zukunft vielversprechend gewertet werden. Hierbei konnten durch die Besiedlung von Silikonelastomeren einerseits, und die genetische Modifikation von Fibroblasten zum BDNFLieferanten andererseits, zwei wichtige Aspekte zur Schaffung biofunktionalisierter Elektroden vereint werden. Die Immobilisierung der Zellen ermöglichte es das Proliferationsund Adhäsionsverhalten dieser auf den Silikonelastomeren sowie die Wirksamkeit dieser biofunktionalisierten Modellelektroden auf Spiralganglienzellen als vereinheitlichte Verfahrensweise zu untersuchen. Es erschließen sich daraus weiterführende Arbeitsschritte in vitro. Dies sind zum einen Untersuchungen zur Langzeitexpression von BDNF durch NIH3T3-Fibroblasten über einen Zeitraum von 21 Tagen hinaus und zum anderen Untersuchungen zur Elektrostabilität der Zellen und ihren Wachstumsfaktoren allein und in Kombination mit chronisch-elektrischer Stimulation. Das im In vitro-Modell angewandte Verfahren der Zellbeschichtung von Modellelektroden muss hinsichtlich einer klinischen 99 Diskussion Anwendung auf die Zuverlässigkeit der Beschichtung und die Reproduzierbarkeit und Stabilität der BDNF-Abgabe weiter untersucht und optimiert werden. Neben den Aspekten einer durch die Aufreinigung von lyophilisiertem, rekombinantem BDNF unterschiedlichen Wirkungsweise ist es auch denkbar, dass die in diesem Versuch eingesetzten Fibroblasten neben BDNF weitere Metaboliten produzieren, welche das Spiralganglienzellüberleben positiv beeinflussen. Das in dieser Studie etablierte In-vitro-Modell zur zellbasierten Wachstumsfaktorapplikation beweist die prinzipielle Machbarkeit eines solchen DrugDelivery-Systems. Es stellt ein schnelles und aussagekräftiges Basismodell, zur Untersuchung von Zellwachstum auf Polymeren, Abgabe von Wachstumsfaktoren und deren Bioaktivität in Kokultivierungsexperimenten dar. Darauf aufbauend erfolgte die In-vivo-Applikation. Zur Testung chirurgischer Praktikabilität der biofunktionalisiertenen Modellelektroden in vivo und um eine gewisse Stabilität beim Inserieren zu gewährleisten, wurden hierbei ausschließlich Silikonelastomere mit Platindrähten verwendet. Die Steigerung von Spiralganglienzellüberleben in allen cochleären Windungen deutet auf das Potential des beschriebenen Drug-Delivery-Systems in vivo hin. Die eingeschränkte Insertionstiefe, bedingt durch die Größe der Modellelektrode sowie ein Abstreifen von Zellen beim Inserieren, sind möglicheweise die Ursache für das graduierte Auftreten des neuronalen Effekts von basal nach apikal. Die im Vorversuch angewandte Methode der Basilarmembranpräparation ist eine standardisierte Methode zur Auszählung von Haarzellen. Nach Wachstumsfaktorapplikation mittels Zelltransfer in Form einer Suspension wurde diese Methode eingesetzt, um die Entkalkung der Cochlea zu umgehen, welche ein langwieriger Prozess ist und möglicherweise nicht-adhärierte, transferierte Zellen ausgewaschen hätte. Anhand einer Einteilung in die Bereiche apikale-, mittlere- und basale Windungen war eine grobe Übersicht über präparierte Strukturen, wie die Basilarmembran und die Stria Vascularis möglich. Die immunhistochemische Detektion an Paraffinschnitten erlaubt eine Lokalisierung der implantierten Strukturen durch eine Übersicht über die gesamte Cochlea. In einzelnen Tieren konnten die Zellen mittels Basilarmembranpräparation bis zu 7 Tage nach Implantation unter Immunfluoreszenz detektiert werden. Hierbei stellte sich heraus, dass sie auf den knöchernen Strukturen als auch auf der Basilarmembran, hauptsächlich aber im basalen Bereich der Cochlea zu finden waren. Anhand der Ergebnisse kann man vermuten, dass die Zellen in Suspension nach Transfer unter Verwendung eines Injektionsschlauchs zufällig, je nach 100 Diskussion ausgeübten Insertionsdruck (1 µl/min), in die Scala Tympani gespült wurden und sich dort diffus innerhalb der cochleären Kompartimente verteilt haben. Zum weiteren Verbleib der Zellen nach Transfer gibt es in dieser Studie keine aufschlußreiche Erklärung (7.2.1). REJALI et al. (2007) waren die Ersten, die zeigen konnten, dass ein Überziehen der Elektrodenspitze mit in Agarose eingebetten, BDNF-produzierenden Fibroblasten, ein gesteigertes neuronales Überleben, 48 Tage nach der Implantation in vivo bewirkt. Diese Studie und die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass eine Immobilisation der Zellen auf der Elektrode hinsichtlich des BDNF-Transports und der Detektierbarkeit der Zellen ein effizienteres Ergebnis hervorbringt, als der reine Zelltransfer. 7.4 Aktuelle Studien und Zukunftsperspektiven des Drug-Delivery im Innenohr und Nervengewebe Für zellbasierte klinische Therapien gibt es verschiedene Ansätze. Dazu gehören, wie der in der vorliegenden Arbeit beschriebene Ansatz, Zellen als Sekretionseinheiten für Wachstumsfaktoren zu nutzen, so genannte Drug-Delivery-Systeme. Strategien des Tissue Engineering und der Zellersatz bei genetischen Defekten gehören ebenfalls dazu. Dabei werden an die Trägersubstanzen hohe Erwartungen gestellt. Sie müssen hinsichtlich der Zellbesiedlung und -aktivität sowie der Integration in das spätere Zielgewebe Kriterien wie Biokompatibilität, Abbaubarkeit und Aktivierung spezifischer Zell-Material-Interaktionen erfüllen (CAPLAN, 2005; GRAFAHREND et al., 2011). Es werden hauptsächlich bioaktive Konstrukte eingesetzt, die aus Komponenten wie Fibronektin, Kollagen Typ I oder verschiedenen Polymeren auf Proteinbasis aufgebaut sind (BOSCH, 2003, RICHARDSON et al., 2009). Die Kollagen-Gele sind in der Lage zu kontrahieren, ähnlich der Kontraktion von Wunden bei der Wundheilung. Dies führt zu einer Änderung der Zellorientierung und –form. Die Aktivität der Zellen ist sowohl von der Matrix als auch von dem entsprechenden Zelltyp und deren Interaktion abhängig (BOSCH, 2003). In einer Studie von HUANG et al. (2009) konnte gezeigt werden, dass die Proliferation von Schwann-Zellen, adherierend auf leitfähigen Polymeren, durch chronische elektrische Stimulation gesteigert werden kann. Biologisch abbaubare Matrizes, wie beispielsweise Hydrogele aus Chitosan-Glycerinphosphat eignen sich sehr gut für ein lokales Drug-Delivery 101 Diskussion (PAULSON et al., 2008). INAOKA et al. (2009) konnten zeigen, dass Gelatine-Hydrogele, die in der Lage sind den Hepatocyten-Wachstumsfaktor (hepatocyte growth factor) abzugeben, eine Reduzierung von lärminduzierter Hörschwellenänderung bei Meerschweinchen bewirken und somit als otoprotektive Therapie wirken. Klinische Studien können erst im Menschen erfolgen, wenn die Stabilität der exogen applizierten Substanzen über einen definierten Zeitraum gewährleistet ist. BELLAMKONDA et al. (2006) befürworten die Strategie den Nerven zur Elektrode zu bringen, um die Nerven-ElektrodenSchnittschnelle zu optimieren. Dazu bedienen sie sich Axonen-leitender Techniken (axonguidance techniques), welche mit Hilfe von topographischen Einsätzen im Elektrodenkontakt die Axone in Richtung der Elektrode leiten und somit regenerative Elektrodenmodelle darstellen können. Axonen-ausgerichtete Nanofasern zeigten sich dabei am effektivsten in dem Bestreben, Nerven zur Regeneration zu bewegen (BELLAMKONDA et al., 2008, 2012), so dass Nerven potentiell dichter an die Elektroden herangeführt werden können. SHOICHET et al. (2004) demonstrierten in ihrer Studie den Einsatz einer 3D-Hydrogel-Matrix mit einem adhesiven Fibronektin-Peptid-Fragment (glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine, GRGDS) für ein gerichtetes dreidimensionales Zellwachstum und -migration. Diese Komponenten sind potentiell einsetzbar zur Verbesserung der peripheren Nerven-ImplantatStabilität und haben möglicherweise einen positiven Einfluss auf die Signalübertragung. In einer Studie von JUN et al. (2008) wurden BDNF-sezernierende Hydrogele auf Mikroelektrodenarrays (MEAs) aufgebracht. Neuronen, die man auf der Hydrogeloberfläche ausgesät hatte, zeigten gesteigerte, spontane Aktivität als Antwort auf die BDNF-Freisetzung. Eine weitere Möglichkeit eines nicht-viralen Drug-Delivery-Systems für das Innenohr ist der Einsatz von diversen Nanopartikeln (PANYAM u. LABHASETWAR, 2003; PARKER et al., 2003; SAKAMOTO et al., 2010; CHEN et al., 2010). Hierzu wurden Liposomen untersucht, die sich durch einfache Produktion, geringe Toxizität und fehlende immunologische Effekte bewährten. Nanopartikel zeichnen sich durch stetig verbesserte Biokompatibilität, In-vivoStabilität, und Zielspezifität aus, was in geringeren Wirkstoffdosen und weniger Nebeneffekten resultiert (CHEN et al., 2010). Auch der Einsatz von Stammzellen gilt als aussichtsreich bei der Behandlung von vielen Krankheiten (SATIJA et al., 2009). Hierbei erhofft man sich eine kontrollierte Regeneration von Geweben. Es sind bei weitem noch nicht alle Mechanismen, die die Aktivität dieser 102 Diskussion Zellen steuern aufgeklärt. Zelluläre Therapien werden zum Teil im klinischen Alltag genutzt. Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) zeigen unteranderem immunsuppressive Eigenschaften (LE BLANC u. RINGDÉN, 2007). Sie werden bei KnochenmarkTransplantationen zusammen mit hämatopoetischen Stammzellen verabreicht und schwächen dabei eine Graft-versus-host-Reaktion ab oder verhindern diese zum Teil (FRASSONI, 2002). Desweiteren erleichtern sie das Anwachsen der hämatopoetischen Stammzellen, da sie eine Wiederherstellung der Mikroumgebung des Stromas unterstützen und somit das blutzellbildende System beim Empfänger etablieren (KOC et al., 2000; LAZARUS et al., 1993). Humane adulte Stammzellen besitzen die Fähigkeit in vitro und in vivo über Gewebegrenzen hinweg zu differenzieren (WAGERS u. WEISSMAN, 2004; GROVE et al., 2004). Die regenerativen Eigenschaften dieser Stammzellen bezüglich der Gewebereparatur und Wundheilung verdeutlichen ihr großes Potential zur Selbstregeneration von Geweben und Zellen und versprechen breitgefächerte Einsatzmöglichkeiten in der regenerativen Medizin. MSCs haben durch ihre Sekretion von Zytokinen oder Wachstumsfaktoren einen großen therapeutischen Nutzen (CAPLAN, 2005). In der Kombination aus BDNF-Lieferant für Spiralganglienzellen und dem Potential der Regenerierung könnten sie im Innenohr ein DrugDelivery-System in Verbindung mit dem Cochlea-Implantat darstellen. Wo Studien das unkontrollierte Wachstum und Verklumpen von NIH3T3-Zellen beispielsweise innerhalb alginater Mikropartikel aufzeigen, konnte bei humanen MSCs kein solcher Effekt, sondern eine gleichmäßige Verteilung demonstriert werden (GOREN et al., 2010). Perspektivisch wäre so auch eine gemeinsame Gabe von Wachstumsfaktor-produzierenden Zellen und neuronalen Vorläuferzellen denkbar. Diese könnten möglicherweise zu einem direkten Nerven-Elektrodenkontakt führen und durch Differenzierung in verschiedene Zelltypen zur Regeneration der Zielzellen beitragen. Eine Kombination aus sorgfältig und kritisch ausgewählten Zellen und lentiviralem Vektor sowie der Art der Applikation, ist für ein zellbasiertes Langzeit-Drug-Delivery im Menschen bestimmend. 103 Zusammenfassung 8 ZUSAMMENFASSUNG Susanne Sasse (2014) „Untersuchungen zur neuronalen Protektion nach Einsatz lentiviral modifizierter Fibroblasten auf Cochlea-Implantat-Oberflächen“ In früheren Studien wurde der protektive Effekt von neurotrophen Faktoren wie dem BrainDerived Neurotrophic Factor (BDNF) auf das Überleben von Spiralganglienzellen (SGZ) belegt. Hierzu konnte ein protektiver Effekt durch BDNF-produzierende Zellen auf SGZ gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit ist es, die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für modifizierte Cochlea-Implantat (CI) Oberflächen zu zeigen, um eine Steigerung der Effizienz des CI zu erreichen und somit die Hörqualität von betroffenen Patienten maßgeblich zu verbessern. Dazu wurden in der vorliegenden Studie als Modellelektroden dienende Silikonelastomere mit lentiviral modifizierten, BDNF-produzierenden Fibroblasten (NIH3T3) besiedelt. Dieses Modell wurde im Hinblick auf den Einsatz als zellbasiertes Drug-Delivery-System im Innenohr getestet. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu folgenden Schwerpunkte festgelegt: 1. Etablierung eines In-vitro-Modells mit lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen adherierend auf der Oberfläche von Silikonelastomeren. Diese biofunktionalisierten Modellelektroden wurden auf drei wichtige Parameter untersucht: a. Bestimmung der Proliferationsfähigkeit der adherierenden Zellen. Anhand von Zellkultur und anschließendem Auszählen der Zellen auf den Elektronenträgern sowie Durchlicht-und Fluoreszenzmikroskopie wurde die Proliferarationsfähigkeit der NIH3T3/BDNF-Zellen nach 4, 7 und 14 Tagen ermittelt. b. Quantifizierung der Freisetzung des Wachstumsfaktors BDNF in das umliegende Medium. Hierzu wurde anhand von Quantifizierung der Konzentrationen in den gesammelten Überständen mit Hilfe von ELISA die Freisetzung von BDNF aus zellbesiedelten Modellelektroden bestimmt 104 Zusammenfassung c. Nachweis der Bioaktivität des Konstrukts auf Spiralganglienzellexplantate. Die mit NIH3T3/BDNF-Zellen besiedelten Modellelektroden wurden in Ko-Kultivierung mit Spiralganglienzellen von neonatalen Ratten gegeben und für 7 Tage kultiviert. Darauf folgten immuncytochemische Untersuchungen von Überlebensraten und Neuritenwachstum der Spiralganglienzellen. Ein signifikanter Anstieg der Proliferationsrate konnte ab Tag 7 (40.371 ± 3.521 Zellen) ermittelt werden. In Korrelation dazu stieg die BDNF-Produktion zwischen Tag 4 (0,4 ± 0,05 ng/ml), 7 (4,7 ± 0,55 ng/ml) und 14 (9,1 ± 1,64 ng/ml) an. Die SGZ zeigten eine signifikant hohe Überlebensrate sowie gesteigertes Neuritenwachstum in Ko-Kultivierung mit den biofunktionalisierten Modellelektroden. 2. Nach erfolgreichem Abschluss der In-vitro-Versuche wurden die biofunktionalisierten Modellelektroden im In-vivo-Experiment in die Innenohren von systemisch ertaubten Meerschweinchen implantiert und dort hinsichtlich ihres Effektes auf Spiralganglienzellen untersucht. Die Tiere wurden 21 Tage nach der Implantation getötet, die Modellelektroden entfernt und die Cochleae hinsichtlich der SGZ-Dichte histotologisch untersucht. Eine signifikant erhöhte SGZ-Dichte auf der implantierten Seite (6,16 ± 0,43 SGZ/10.000 µm2, p < 0,001) im Vergleich zur kontralateralen, unbehandelten Seite (4,33 ± 0,34) sowie im Vergleich zu den Tieren implantiert mit Kontrollmodellelektroden (1,05 ± 0,28) wurde ermittelt. Die Ergebnisse lassen die Schlußfolgerung zu, dass immobilisierte, genetisch modifizierte Zellen auf Modellelektroden, als BDNF-Lieferant für ein gesteigertes Spiralganglienzellüberleben ein geeignetes Drug-Delivery-System für das Innenohr darstellen. 105 Summary 9 SUMMARY Susanne Sasse (2014) “Investigations of neural protection on cochlea implant surfaces using lentivirally modified cells” Many studies have shown the protective effect on spiral ganglion neurons (SGN) by neurotrophic factors as the brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Also it was possible to proof the biological effectiveness of BDNF-producing fibroblasts on the activity of SGN. The aim of this study was to proof the capability of this approach regarding cell-modified cochlea implant surfaces in order to improve the performance of the CI and to enhance hearing quality of patients decisively. Therefore silicone elastomeres were seeded with lentival-modified, BDNF-producing fibroblasts (NIH3T3). This model of a biofunctionalized electrode was studied in accordance to be used as a cell-based drug-delivery system in the inner ear. In this study we focused on the following aspects: 1. Establishing an in vitro-model using lentivirally modified NIH3T3 cells attached to the surface of silicone elastomeres and investigation of three main parameters: a. Capability of proliferation of adherent cells. Using cell culture techniques and counting of cells adherent on the surface of the elastomeres followed by fluorescence microscopy, it was possible to determine the proliferation of NIH3T3/BDNF cells following 4, 7 and 14 days. b. Quantification of BDNF release. Using ELISA the concentration of BDNF expression of cells adherend on the elastomeres were quantified in order to reveal the releasing rate. c. Bioactivity of model on spiralganglion neuron explants. Silicone elastomeres covered with NIH3T3/BDNF-cells were co-cultured with spiral ganglion neurons of 106 Summary neonatal rats for 7 days, followed by immunohistochemical investigations of survival rates und neurite outgrowth. A significant increase in proliferation was revealed up from day 7 (40,371 ±3,529 cells). BDNF-production increased up from day 4 (0.4 ±0.05 ng/ml), 7 (4.7 ±0.55ng/ml) and day 14 (9.1 ±1.64 ng/ml). Spiralganglion neurons revealed a significantly higher survival rate as well as an increased neurite outgrowth when co-cultured with biofunctionalized model electrodes. 2. To investigate a potential neuroprotective effect of such modified model electrodes in vivo the cell-coated model electrodes were then implanted into the left ears of systemically deafened guinea pigs. Animals were sacrificed 21 days after implantation, electrodes were explanted and cochleae were histologically evaluated for SGN density. A significant increase in SGN density in the implanted side (6.16 ±0.43, SGC/10,000 µm2 p< 0.001; mean values ± standard error of mean) compared to the contralateral untreated side (4.33 ±0.34) and animals implanted with control model electrodes (1.05 ±0.28) was observed The results lead to the conclusion that immobilized, genitically modified cells covering model electrodes, to release BDNF for an increased SGN survival after deafness seem to be a promising drug delivery system to the inner ear. 107 Literaturverzeichnis 10 LITERATURVERZEICHNIS ABBAS, P. J. (1988) Electrophysiology of the auditory system. Clin Phys Physiol Meas 9, 1-31 AGTERBERG, M.J., H. VERSNEL, L.M. VAN DIJK, J.C. DE GROOT, S.F. KLIS (2009) Enhanced survival of spiral ganglion cells after cessation of treatment with brain-derived neurotrophic factor in deafened guinea pigs. J Assoc Res Otolaryngol. 10, 355-367 ALLEN, J. B. (1980) Cochlear micromechanics- a physical model of transduction. J Acoust Soc Am 68, 1660-1670 ALTSCHULER, R. A., Y. CHO, J. YLIKOSKI, U. PIRVOLA, E. MAGAL u. J. M. MILLER (1999) Rescue and regrowth of sensory nerves following deafferentation by neurotrophic factors. Ann N Y Acad Sci 884, 305-311 BANERJEE, A. u. L.S. PARNES (2004) The biology of intratympanic drug administration and pharmacodynamics of round window drug absorption. Otolaryngol Clin North Am 37, 1035-1051 BARKER, P.A. (1998) p75NTR: A study in contrasts. Cell Death Differ 5, 346-356 BOSHER, S. K. u. C. S. HALLPIKE (1965) Observations on the histological features, development and pathogenesis of the inner ear degeneration of the deaf white cat. Proc R Soc Lond B Biol Sci 162, 147-170 108 Literaturverzeichnis BOENNINGHAUS, H.-G. u. T. LENARZ (2007) Hals-Nasen-Ohrenheilkunde. Springer-Verlag, Berlin BREDESEN, D.E. (1995) Neural apoptosis. Ann Neurol 38, 839-851 BRIGANDE, J.V. u. S. HELLER (2009) Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci 12, 679-685 BORKHOLDER, D.A. (2008) State-of-the-art mechanisms of intracochlear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 16, 472-477 BROWN, J. N., J. M. MILLER, R. A. ALTSCHULER u. A. L. NUTTALL (1993) Osmotic pump implant for chronic infusion of drugs into the inner ear. Hear Res 70, 167-172 CARVALHO, G.J. u. A.K. LALWANI (1999) The effect of cochleostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am J Otol 20, 87-90 CHONKO K.T., I. JAHAN, J. STONE, M.C. WRIGHT, T. FUJIYAMA, M. HOSHINO, B. FRITZSCH u. S.M. MARICICH (2013) Atoh1 directs hair cell differentiation and survival in the late embryonic mouse inner ear. Dev Biol 381, 401-410 CLARK, G.M., P.J. BLAMEY, A.M. BROWN, P.A. GUSBY, R.C. DOWELL, B.K. FRANZ, B.C. PYMAN, R.K. SHEPHERD, Y.C. TONG, R.L. WEBB ET AL. (1987) The University of Melbourne-nucleus multi-electrode cochlear implant. Adv Otorhinolaryngol 38, V-IX, 1-181 COCO, A., S.B. EPP, J.B. FALLON, J. XU, R.E. MILLARD u. R.K. SHEPHERD (2007) Does cochlear implantation and electrical stimulation affect residual hair cells and spiral ganglion neurons? Hear Res 225, 60-70 109 Literaturverzeichnis DALLOS P., X. WU, M.A. CHEATHAM, J. GAO, J. ZHENG, C.T. ANDERSON, S. JIA, X. WANG, W.H.CHENG, S. SENGUPTA, D.Z. HE u. J. ZUO (2008) Prestin-based outer hair cell motility is necessary for mammalian cochlear amplification. Neuron 58, 333-339 DALY, G. u. Y. CHERNAJOVSKY (2000) Recent developments in retroviral-mediated gene transduction. Mol Ther 2, 423-434 DE CEULAER, G., S. JOHNSON, M. YPERMAN, K. DAEMERS, F.E. OFFECIERS, G.M. O'DONOGHUE u. P.J. GOVAERTS (2003) Long-term evaluation of the effect of intracochlear steroid deposition on electrode impedance in cochlear implant patients. Otol Neurotol 24, 769-774 DODSON, H.C. u. A. MOHUIDDIN (2000) Response of spiral ganglion neurons to cochlear hair cell destruction in the guinea pig. J Neurocytol 29, 525-537 DUAN, M. L., M. ULFENDAHL, G. LAURELL, A.S. COUNTER, I. PYYKKO, E. BORG u. U. ROSENHALL (2002) Protection and treatment of sensorineural hearing disorders caused by exogenous factors: experimental findings and potential clinical application. Hear Res 169, 169-178 DUAN, M., F. VENAIL, N. SPENCER u. M. MEZZINA (2004) Treatment of peripheral sensorineural hearing loss: gene therapy. Gene Ther 11, Suppl 1, 51-56 ENGELHARDT, W. V. u. G. BREVES (2000) Physiologie der Haustiere. Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart ERNFORS, P., M.L. DUAN, W.M. ELSHAMY u. B. CANLON (1996) Protection of auditory neurons from aminoglycoside toxicity by neurotrophin-3. Nat Med 2, 463-467 110 Literaturverzeichnis EVANS, A.J., B.C. THOMPSON, G.G. WALLACE, R. MILLARD, S.J. O'LEARY, G.M. CLARK, R.K. SHEPHERD u. R.T. RICHARDSON (2009) Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNFcoated electrodes. J Biomed Mater Res A 91, 241-250 FAY, R.R. (1988) Hearing in vertebrates: a psychophysics databook. Hill-Fay Verlag, Winnetka, Il. FRITZSCH, B., I. FARINAS u. L.F. REICHARDT (1997) Lack of Neurotrophin 3 causes losses of both classes of spiral ganglion neurons in the cochlear in a region specific fashion. J Neurosci 17, 6213–6225 FRITZSCH, B., U. PIRVOLA u. J. YLIKOSKI (1999) Making and breaking the innervation of the ear: neurotrophic support during ear development and its clinical implications. Cell Tissue Res 295, 369-382 GAO, W.Q. (1999) Role of neurotrophins and lectins in prevention of ototoxicity. Ann NY Acad Sci 884, 312-327 GARCÍA BERROCAL, J.R., u. R. RAMÍREZ-CAMACHO (2000) Immune response and immunopathology of the inner ear: an update. J Laryngol Otol 114, 101-107 GHIZ, A.F., A.N. SALT, J.E. DEMOTT, M.M. HENSON, O.W. HENSON, JR. u. S.L. GEWALT (2001) Quantitative anatomy of the round window and cochlear aqueduct in guinea pigs. Hear Res 162, 105-112 GILLESPIE, L.N., G.M. CLARK, P.F. BARTLETT u. P.L. MARZELLA (2003) BDNF-induced survival of auditory neurons in vivo: Cessation of treatment leads to accelerated loss of survival effects. J Neurosci Res 71, 785-790 111 Literaturverzeichnis GILLESPIE, L.N. u. R.K. SHEPHERD (2005) Clinical application of neurotrophic factors: the potential for primary auditory neuron protection. Eur J Neurosci 22, 2123-2133 GOREN, A., N. DAHAN, E. GOREN, L. BARUCH u. M. MACHLUF (2010) Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for longterm cellular therapy. The FASEB J 24, 22-31 GRAFAHREND, D., K.H. HEFFELS, M.V. BEER, P. GASTEIER , M. MÖLLER, G. BOEHM, P.D. DALTON u. J. GROLL (2011) Degradable polyester scaffolds with controlled surface chemistry combining minimal protein adsorption with specific bioactivation Nat Mater 10, 67-73 HAN, J.J., A.N. MHATRE, M. WAREING, R. PETTIS, W.Q. GAO, R.N. ZUFFEREY, D. TRONO u. A.K. LALWANI (1999) Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther 10, 1867-1873 HARVEY K.J., D. LUKOVIC, D.S. UCKER (2001) Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry 43, 273-278 HEGARTY, J.L., A.R. KAY u. S.H. GREEN (1997) Trophic support of cultured spiral ganglion neurons by depolarization exceeds and is additive with that by neurotrophins or cAMP and requires elevation of [Ca2+]i within a set range. J Neurosci 17, 1959-1970 HOCHMAIR, I., P. NOPP, C. JOLLY, M. SCHMIDT, H. SCHOSSER, C. GARNHAM u. I. ANDERSON (2006) MED-EL Cochlear implants: state of the art and a glimpse into the future. Trends Amplif 10, 201-219 112 Literaturverzeichnis HOLLIDAY, T.A., H.J. NELSON, D.C. WILLIAMS u. N. WILLITS (1992) Unilateral and bilateral brainstem auditory-evoked response abnormalities in 900 Dalmatian dogs. J Vet Intern Med 6, 166-174 HOTH, S. u. T. LENARZ (1994) Elektrische Reaktionsaudiometrie. Springer-Verlag, Berlin HOTH, S. u. T. LENARZ (1997) Otoakustische Emissionen. Thieme Verlag, Stuttgart HU, Z., M. ULFENDAHL u. N.P. OLIVIUS (2004) Survival of neuronal tissue following xenograft implantation into the adult rat inner ear. Exp Neurol 185, 7-14 HUANG, E.J. u. L.F. REICHARDT (2001) Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu Rev Neurosci 24, 677-736 HUANG, J., X. HU, L. LU, Z. YE, Q. ZHANG u. Z. LUO (2010) Electrical regulation of Schwann cells using conductive polypyrrole/chitosan polymers. JBiomed Mater Res A 93, 164-174 IGARTUA, M., P. SAULNIER, B. HEURTAULT, B. PECH, J.E. PROUST, J.L. PEDRAZ u. J.P. BENOIT (2002) Development and characterization of solid lipid nanoparticles loaded with magnetite. Int J Pharm 233, 149-157 ISHIMOTO, S., K. KAWAMOTO, S. KANZAKI u. Y. RAPHAEL (2002) Genetransfer into supporting cells of the organ of corti. Hear Res 173, 187-197 ISHIMOTO, S., K. KAWAMOTO, T. STÖVER, S. KANZAKI, T.YAMASOBA, u. Y. RAPHAEL (2003) A glucocorticoid reduces adverse effects of adenovirus vectors in the cochlea. Audiol Neurootol 8, 70-79 113 Literaturverzeichnis IZUMIKAWA, M., R. MINODA, K. KAWAMOTO, K.A. ABRASHKIN, D.L. SWIDERSKI, D.F. DOLAN, D.E. BROUGH u. Y. RAPHAEL (2005) Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med 11, 271-276 JERO, J., C.J. TSENG, A.N. MHATRE, u. A.K. LALWANI (2001) A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res 121, 437-447 JOHANNSEN, M., A. JORDAN, R. SCHOLZ, M. KOCH, M. LEIN, S. DEGER, J. ROIGAS, K. JUNG u. S. LOENING (2004) Evaluation of magnetic fluid hyperthermia in a standard rat model of prostate cancer. J Endourol 18, 495-500 JORDAN, A., R. SCHOLZ, K. MAIER-HAUFF, M. JOHANNSEN, P. WUST, J. NADOBNY, H. SCHIRRA, H. SCHMIDT, S. DEGER, S. LOENING, W. LANKSCH u. R. FELIX (2001) Presentation of a new magnetic field therapy system for the treatment of human solid tumors with magnetic fluid hyperthermia. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 225, 118-126 KAFRI, T. (2004) Gene delivery by lentivirus vectors. An overview. Methods Mol Biol 246, 367-390 KALAJZIC I., Z. KALAJZIC, M.M. HURLEY, A.C. LICHTLER u. D.W. ROWE (2003) Stage specific inhibition of osteoblast lineage differentiation by FGF2 and noggin. J Cell Biochem 88, 1168-1176 KANO, Y. u. A. STARR (1987) Temporal relationship between single unit activity in superior olivary complex and scalpderived auditory brainstem response in guinea pig. Brain Res 419, 262-271 114 Literaturverzeichnis KANZAKI, S., T. STÖVER, K. KAWAMOTO, D.M. PRIESKORN, R.A. ALTSCHULER, J.M. MILLER u. Y. RAPHAEL (2002) Glial cell line-derived neurotrophic factor and chronic electrical stimulation prevent VIII cranial nerve degeneration following denervation. J Comp Neurol 454, 350-360 KAWAMOTO, K., S. ISHIMOTO, R. MINODA, D.E. BROUGH u. Y. RAPHAEL (2003) Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo. J Neurosci 23, 4395-4400 KESSER, B.W. u. A.K. LALWANI (2009) Gene therapy and stem cell transplantation: strategies for hearing restoration. Adv Otorhinolaryngol 66, 64-86 KHALIL, I.A., K. KOGURE, H. AKITA u. H. HARASHIMA (2006) Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. Pharmacol Rev 58, 32-45 KHO, S. T., R.M. PETTIS, A.N. MHATRE u. A.K. LALWANI (2000) Safety of adeno-associated virus as cochlear gene transfer vector: analysis of distant spread beyond injected cochleae. Mol Ther 2, 368-373 KISHINO, A., N. KATAYAMA, Y. ISHIGE, Y. YAMAMOTO, H. OGO, T. TATSUNO, T. MINE, H. NOGUCHI u. C. NAKAYAMA (2001) Analysis of effects and pharmocokinetics of subcutaneously administered BDNF. Neuroreport 12, 1067-1072 KLIMATCHEVA, E., J.D. ROSENBLATT u. V. PLANELLES (1999) Lentiviral vectors and gene therapy. Front Biosci 4, 481–496 KOHN, D.B (2007) Lentiviral vectors ready for prime-time. Nat Biotechnol 25, 65-66 115 Literaturverzeichnis LALWANI, A.K., B.J. WALSH, P.G. REILLY, N. MUZYCZKA u. A.N. MHATRE (1996) Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther 3, 588-592 LALWANI, A.K., J. JERO u. A.N. MHATRE (2002) Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol 7, 146-151 LEFEBVRE, P.P. u. T.R. VAN DE WATER (2000) Connexins, hearing and deafness: clinical aspects of mutations in the connexin 26 gene. Brain Res Brain Res Rev 32, 159-162 LEHNHARDT, E., R.D. BATTMER, K. NAKAHODO u. R. LASZIG (1986) Cochlear implants. Hno 34, 271-279 LEHNHARDT, E. u. R. LASZIG (2001) Praxis der Audiometrie. Thieme Verlag, Stuttgart LENARZ, T. (1997) Cochlear implants: what can be achieved? Am J Otol 18, 2-3 LENARZ, T. (1998) Cochlear implants: selection criteria and shifting borders. Acta Otorhinolaryngol Belg 52, 183-199 LENARZ, T., T. STÖVER, A. BUECHNER, G. PAASCHE, R. BRIGGS, F. RISI, J. PESCH u. R.D. BATTMER (2006) Temporal bone results and hearing preservation with a new straight electrode. Audiol Neurootol 11, 34-41 LEONHARDT, H. (1990) Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen. Thieme Verlag, Stuttgart, New York 116 Literaturverzeichnis LI, H., C.E. CORRALES, A. EDGE u. S. HELLER (2004) Stem cells as therapy for hearing loss. Trends Mol Med 10, 309-315 LIM, H.H. u. D.J. ANDERSON (2006) Auditory cortical responses to electrical stimulation of the inferior colliculus: implications for an auditory midbrain implant. J Neurophysiol 96, 975-988 LINSS, V., W. LINSS, E. EMMERICH u. F. RICHTER (2007) The cochleogram of the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol 264, 369-375 LIPTON, P. u. R. KALIL (1995) Neurotrophic factors-an overview. Promega Notes 50, 18-22 LIU, H. u. T.J. WEBSTER (2006) Nanomedicine for implants: A review of studies and necessary experimental tools. Biomaterials 28, 354-369 LIU, X.Z., Y. YUAN, D. YAN, E.H. DING, X.M. OUYANG, Y. FEI, W. TANG, H. YUAN, Q. CHANG, L.L. DU, X. ZHANG, G. WANG, S. AHMAD, D.Y. KANG, X. LIN u. P. DAI (2009) Digenic inheritance of non-syndromic deafness caused by mutations at the gap junction proteins Cx26 and Cx31. Hum Genet 125, 53-62 LOIZOU, P.C., A. MANI u. M.F. DORMAN (2003) Dichotic speech recognition in noise using reduced spectral cues. J Acoust Soc Am 114, 475-483 LOUGHLIN, S.E. u. J.H. FALLON (1993) Neurotrophic Factors. Verlag Academic Press, Inc., San Diego, CA 117 Literaturverzeichnis LOUSTEAU, R.J. (1987) Increased spiral ganglion cell survival in electrically stimulated, deafened guinea pig cochleae. Laryngoscope 97, 836-842 LUEBKE, A.E., C. ROVAB, P.G. VON DOERSTEN u. D.J. POULSEN (2009) Adenoviral and AAV-mediated gene transfer to the inner ear: role of serotype, promoter and viral load on in vivo and in vitro infection efficiencies. Adv Otorhinolaryngol 66, 87-98 LUNDBERG, C., T. BJÖRKLUND, T. CARLSSON, J. JAKOBSSON, P. HANTRAYE, N. DÉGLON u. D. KIRIK (2008) Applications of lentiviral vectors for biology and gene therapy of neurological disorders. Curr Gene Ther 8, 461-473 MACDONALD, G.H. u. E.W. RUBEL (2008) Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hear Res 243, 1-10 MAIR, I.W. (1973) Hereditary deafness in the white cat. Acta Otolaryngol Suppl 314, 1-48 MAIR, I.W. (1976) Hereditary deafness in the dalmatian dog. Arch Otorhinolaryngol 212, 1-14 MALGRANGE, B., P. LEFEBVRE, T.R. VAN DE WATER, H. STAECKER u. G. MOONEN (1996) Effects of neurotrophins on early auditory neurones in cell culture. Neuroreport 7, 913–917 MANESS, L.M., A.J. KASTIN, J.T. WEBER, W.A. BANKS, B.S. BECKMAN u. J.E. ZADINA (1994) The neurotrophins and their receptors: structure, function, and neuropathology. Neurosci Biobehav Rev 18, 143-159 118 Literaturverzeichnis MARUYAMA, J., J.M. MILLER u. M. ULFENDAHL (2008) Glial cell line-derived neurotrophic factor and antioxidants preserve the electrical responsiveness of the spiral ganglion neurons after experimentally induced deafness. Neurobiol Dis 29, 14-21 MARUVADA, P., C.T. BAUMANN, G.L. HAGER u. P.M. YEN (2003) Dynamic shuttling and intranuclear mobility of nuclear hormone receptors. J Biol Chem 278, 12425-12432 MARZELLA, P.L., L.N. GILLESPIE, G.M. CLARK, P.F. BARTLETT u. T.J. KILPATRICK (1999) The neurotrophins act synergistically with LIF and members of the TGF-beta superfamily to promote the survival of spiral ganglia neurons in vitro. Hear Res 138, 73–80 MATSCHKE, R.G. u. P. PLATH (1988) Cochlear implant for children? Possibilities-risks-prerequisites. Laryngol Rhinol Otol 67, 84-87 MATSUI, J.I., M.A. PARKER, B.M. RYALS u. D.A. COTANCHE (2005) Regeneration and replacement in the vertebrate inner ear. Drug Discov Today 10, 1307-1312 MATSUOKA, A.J., T. KONDO, R.T. MIYAMOTO u. E. HASHINO (2007) Enhanced survival of bone-marrow-derived pluripotent stem cells in an animal model of auditory neuropathy. Laryngoscope 117, 1629-1635 MCCALL, A.A, E.E. SWAN, J.T. BORENSTEIN, W.F. SEWELL, S.G. KUJAWA u. M.J. MCKENNA (2010) Drug delivery for treatment of inner ear disease: current state of knowledge. Ear Hear 31, 156-165 MCGUINNESS, S.L. u. R.K. SHEPHERD (2005) Exogenous BDNF rescues rat spiral ganglion neurons in vivo. Otol Neurotol 26, 1064-1072 119 Literaturverzeichnis MILLER, A.D. (1990) Retrovirus packaging cells. Hum Gene Ther 1, 5–14 MILLER, J.M., C.G. LE PRELL, D.M. PRIESKORN, N.L. WYS u. R.A. ALTSCHULER (2007) Delayed neurotrophin treatment following deafness rescues spiral ganglion cells from death and promotes regrowth of auditory nerve peripheral processes: effects of brain-derived neurotrophic factor and fibroblast growth factor. J Neurosci Res 85, 1959-1969 MITCHELL, A., J.M. MILLER, P.A. FINGER, J.W. HELLER, Y. RAPHAEL u. R.A. ALTSCHULER (1997) Effects of chronic high-rate electrical stimulation on the cochlea and eighth nerve in the deafened guinea pig. Hear Res 105, 30-43 MOU, K., C.L. HUNSBERGER, J.M. CLEARY u. R.L. DAVIS (1997) Synergistic effects of BDNF and NT-3 on postnatal spiral ganglion neurons. J Comp Neurol 386, 529–539 NADOL, J.B., JR. (1988) Comparative anatomy of the cochlea and auditory nerve in mammals. Hear Res 34, 253-266 NADOL, J.B., JR. (1990) Synaptic morphology of inner and outer hair cells of the human organ of Corti. J Electron Microsc Tech 15, 187-196 NAIR, L.S. u. C.T. LAURENCIN (2008) Nanofibers and nanoparticles for orthopaedic surgery applications. J Bone Joint Surg Am 90, Suppl 1, 128-131 NAITO, Y., T. NAKAMURA, T. NAKAGAWA, F. IGUCHI, T. ENDO, K. FUJINO, T.S. KIM, Y. HIRATSUKA, T. TAMURA, S. KANEMARU, Y. SHIMIZU u. J. ITO (2004) Transplantation of bone marrow stromal cells into the cochlea of chinchillas. Neuroreport 15, 1-4 120 Literaturverzeichnis NAKAGAWA, T. u. J. ITO (2004) Application of cell therapy to inner ear diseases. Acta Otolaryngol Suppl 551, 6-9 NAKAGAWA, T. u. J. ITO (2005) Cell therapy for inner ear diseases. Curr Pharm Des 11, 1203-1207 NAKAIZUMI, T., K. KAWAMOTO, R. MINODA u. Y. RAPHAEL (2004) Adenovirus-mediated expression of brain-derived neurotrophic factor protects spiral neurons from ototoxic damage. Audiol Neurootol 9, 135-143 NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (2003) Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. Parey Verlag OKANO, T., T. NAKAGAWA, T. KITA, T. ENDO u. J. ITO (2006) Cell-gene delivery of brain-derived neurotrophic factor to the mouse inner ear. Mol Ther 14, 866-871 OLIVIUS P., L. ALEXANDROV, J. MILLER, M. ULFENDAHL, D. BAGGER-SJÖBÄCK u. E.N. KOZLOVA (2003) Allografted fetal dorsal root ganglion neuronal survival in the guinea pig cochlea. Brain Res 25, 1-6 OHINATA, Y., J.M. MILLER, R.A. ALTSCHULER, u. J. SCHACHT (2000) Intense noise induces formation of vasoactive lipid peroxidation products in the cochlea. Brain Res 878, 163–173 OTTE, J., H. F. SCHUNKNECHT u. A.G. KERR (1978) Ganglion cell populations in normal and pathological human cochleae. Implications for cochlear implantation. Laryngoscope 88, 1231-1246 121 Literaturverzeichnis PAASCHE, G., F. BOCKEL, C. TASCHE, A. LESINSKI-SCHIEDAT u. T. LENARZ (2006a) Changes of postoperative impedances in cochlear implant patients: the short-term effects of modified electrode surfaces and intracochlear corticosteroids. Otol Neurotol 27, 639-647 PAASCHE, G., L. BOGEL, M. LEINUNG, T. LENARZ u. T. STÖVER (2006b) Substance distribution in a cochlea model using different pump rates for cochlear implant drug delivery electrode prototypes. Hear Res 212, 74-82 PAASCHE, G., P. GIBSON, T.A.VERBECK, H. BECKER, T. LENARZ u. T. STÖVER (2003) Technical report: modification of a cochlear implant electrode for drug delivery to the inner ear. Otol Neurotol 24, 222-227 PANYAM, J. u. V. LABHASETWAR (2003) Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv Drug Deliv Rev 55, 329-347 PARKER, A.L., C. NEWMAN, S. BRIGGS, L. SEYMOUR u. P.J. SHERIDAN (2003) Nonviral gene delivery: techniques and implications for molecular medicine. Expert Rev Mol Med 5, 1-15 PENZLIN, H. (1991) Informationsaufnahme und Verarbeitung. In: Lehrbuch der Tierphysiologie Fischer Verlag, Jena, 429-449 PETTINGILL, L.N., R.T. RICHARDSON, A.K. WISE, S. O'LEARY u. R.K. SHEPHERD (2007) Neurotrophic factors and neural prostheses: potentialclinical applications based upon findings in the auditory system. IEEE Trans Biomed Eng 54, 1138-1148 122 Literaturverzeichnis PETTINGILL, L.N., R.L. MINTER u. R.K. SHEPHERD (2008) Schwann cells genetically modified to express neurotrophins promote spiral ganglion neuron survival in vitro. Neuroscience 152, 821-828 PICKLES, J.O. u. D.P. COREY (1992) Mechanoelectrical transduction by hair cells. Trends Neurosci 15, 254-259 PINCHA, M., B.S. SUNDARASETTY u. R. STRIPECKE (2010) Lentiviral vectors for immunization: an inflammatory field. Expert Rev Vaccines 9, 309-321 PIRVOLA, U., J. YLIKOSKI, J. PALGI, E. LEHTONEN, U. ARUMAE u. M. SAARMA (1992) Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin 3 mRNAs in the peripheral target fields of developing inner ear ganglia. Proc Natl Acad Sci USA 89, 9915–9919 PISON, U., T. WELTE, M. GIERSIG u. D.A. GRONEBERG (2006) Nanomedicine for respiratory diseases. Eur J Pharmacol 533, 341-350 PLATH, P. (1981) Das Hörorgan und seine Funktion. Einführung in die Audiometrie. Marhold Verlag, Berlin PLINKERT, P.K. u. H. DE MADDALENA (1996) Recording otoacoustic emissions in expert evaluation of chronic noise-induced hearing loss. HNO 44, 313-318 PLONTKE, S.K., N. SIEDOW, R. WEGENER, H.P. ZENNER u. A.N. SALT (2007) Cochlear pharmacokinetics with local inner ear drug delivery using a three.dimensional finiteelement computer model. Audiol Neurotol 12, 37-48 PLONTKE S.K., A.W. WOOD u. A.N. SALT (2002) Analysis of gentamicin kinetics in fluids of the inner ear with round window administration. Otol Neurotol 23, 967-974 123 Literaturverzeichnis PRAETORIUS, M., C. BRUNNER, B. LEHNERT, C. KLINGMANN, H. SCHMIDT, H. STAECKER u. B. SCHICK (2007) Transsynaptic delivery of nanoparticles to the central auditory nervous system. Acta Otolaryngol 127, 486-490 PUJOL, R., M. REBILLARD u. G. REBILLARD (1977) Primary neural disorders in the deaf white cat cochlea. Acta Otolaryngol 83, 59-64 QUN, L.X., U. PIRVOLA, M. SAARMA u. J. YLIKOSKI (1999) Neurotrophic factors in the auditory periphery. Ann N Y Acad Sci 884, 292-304 RAPHAEL, Y., J.C. FRISANCHO u. B.J. ROESSLER (1996) Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci Lett 207, 137-141 REJALI, D., V.A. LEE, K.A. ABRASHKIN, N. HUMAYUN, D.L. SWIDERSKI u. Y. RAPHAEL (2007) Cochlear implants and ex vivo BDNF gene therapy protect spiral ganglion neurons. Hear Res 228, 180-187 RICHARDSON, R.T., A.K. WISE, B.C. THOMPSON, B.O. FLYNN, P.J. ATKINSON, N.J. FRETWELL, J.B. FALLON, G.G. WALLACE, R.K. SHEPHERD, G.M. CLARK u. S.J. O'LEARY (2009) Polypyrrole-coated electrodes for the delivery of charge and neurotrophins to cochlear neurons. Biomaterials 30, 2614-2624 SALMON, P., J. OBERHOLZER, T. OCCHIODORO, P. MOREL, J. LOU u. D. TRONO (2000) Reversible immortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer of specific genes. Mol Ther 2, 404-414 SANTINI, M.T., C. CAMETTI, P.L. INDOVINA, G. MORELLI u. G. DONELLI (1997) Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells. J Biomed Mater Res 35, 165-174 124 Literaturverzeichnis SCHEPER, V., G. PAASCHE, J.M. MILLER, A. WARNECKE, N. BERKINGALI, T. LENARZ u. T. STÖVER (2009) Effects of delayed treatment with combined GDNF and continuous electrical stimulation on spiral ganglion cell survival in deafened guinea pigs. J Neurosci Res 87, 1389-1399 SCHMIDT-NIELSEN, K. (1999) Information und Sinne. In: Physiologie der Tiere Akademischer Verlag Spektrum, Heidelberg, Berlin, 462-466 SCHOLL, M., T.Q. NGUYEN, B. BRUCHMANN u. H.A. KLOK (2007a) The thermal polymerization of amino acids revisited; synthesis and structural characterization of hyperbranched polymers from lysine. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 45, 5494-5508 SCHOLL, M., T.Q. NGUYEN, B. BRUCHMANN u. H.A. KLOK (2007b) Controlling polymer architecture in the thermal hyperbranched polymerization of L-lysine. Macromolecules 40, 5726-5734 SEIB, F.P., A.T. JONES u. R. DUNCAN (2007) Comparison of the endocytic properties of linear and branched PEIs, and cationic PAMAM dendrimers in B16f10 melanoma cells. J Control Release 117, 291-300 SEIFERLE, E. (1992) Gleichgewichts- und Gehörorgan, Organum vestibulocochleare. In: Lehrbuch der Anatomie der Haustiere Band IV Paul Parey Verlag, Berlin, Hamburg, 444-472 SHEPHERD, R.K., A. COCO u. S.B. EPP (2008) Neurotrophins and electrical stimulation for protection and repair of spiral ganglion neurons following sensorineural hearing loss. Hear Res 242, 100-109 SHEPHERD, R.K., A. COCO, S.B. EPP u. J.M. CROOK (2005) Chronic depolarization enhances the trophic effects of brain-derived neurotrophic factor in rescuing auditory neurons following a sensorineural hearing loss. J Comp Neurol 486, 145-158 SHEPHERD, R.K., S. HATSUSHIKA u. G.M. CLARK (1993) 125 Literaturverzeichnis Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res 66, 108-120 SHIBATA, S.B., G. DI PASQUALE, S.R. CORTEZ, J.A. CHIORINI u. Y. RAPHAEL (2009) Gene transfer using bovine adeno-associated virus in the guinea pig cochlea. Gene Ther 16, 990-997 SHINOHARA, T., G. BREDBERG, M. ULFENDAHL, I. PYYKKÖ, N.P. OLIVIUS, B. KAKSONEN, B. LINDSTRÖM, R. ALTSCHULER u. J.M. MILLER (2002) Neurotrophic factor intervention restores auditory function in deafened animals. Proc Natl Acad Sci USA 99, 1657-1660 SHIMOMURA, O., F.H. JOHNSON u. Y. SAIGA (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. J Cell Comp Physiol 59, 223-239 SHINOMORI, Y., D.S. SPACK, D.D. JONES u. R.S. KIMURA (2001) Volumetric and dimensional analysis of the guinea pig inner ear. Ann Otol Rhinol Laryngol 110, 91-98 SINGH, N., C.A. COHEN u. B.A. RZIGALINSKI (2007) Treatment of neurodegenerative disorders with radical nanomedicine. Ann N Y Acad Sci 1122, 219-230 SMALL, J., K. ROTTNER, P. HAHNE u. K.I. ANDERSON (1999) Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech 47, 3-17 SONG, B.N., Y.X. LI u. D.M. HAN (2009) Delayed electrical stimulation and BDNF application following induced deafness in rats. Acta Otolaryngol 129, 142-154 SPOENDLIN, H. (1984) Factors inducing retrograde degeneration of the cochlear nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 112, 76-82 126 Literaturverzeichnis SPOENDLIN, H. (1975) Retrograde degeneration of the cochlear nerve. Acta Otolaryngol 79, 266-275 SPOENDLIN, H. u. A. SCHROTT (1988) The spiral ganglion and the innervation of the human organ of Corti. Acta Otolaryngol 105, 403-410 STAECKER, H., D.E. BROUGH, M. PRAETORIUS u. K. BAKER (2004) Drug delivery to the inner ear using gene therapy. Otolaryngol Clin North Am 37, 1091-1108 STAECKER, H., R. GABAIZADEH, H. FEDEROFF u. T.R. VAN DE WATER (1998) Brain-derived neurotrophic factor gene therapy prevents spiral ganglion degeneration after hair cell loss. Otolaryngol Head Neck Surg 119, 7-13 STAECKER, H., D. LI, B.W. O'MALLEY, JR. u. T.R. VAN DE WATER (2001) Gene expression in the mammalian cochlea: a study of multiple vector systems. Acta Otolaryngol 121, 157-163 STEISS, J. E., N. R. COX u. J. T. HATHCOCK (1994): Brain stem auditory-evoked response abnormalities in 14 dogs with confirmed central nervous system lesions. J Vet Intern Med 8, 293-298 STÖVER, T., V. SCHEPER, M. DIENSTHUBER, T. LENARZ u. P. WEFSTAEDT (2006) In vitro neurite outgrowth induced by BDNF and GDNF in combination with dexamethasone on cultured spiral ganglion cells. Laryngorhinootologie 86, 352-357 STÖVER, T., M. YAGI u. Y. RAPHAEL (1999) Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res 136, 124-130 STÖVER, T., M. YAGI u. Y. RAPHAEL (2000) Transduction of the contralateral ear after adenovirus-mediated cochlear gene transfer. Gene Ther 7, 377-383 127 Literaturverzeichnis SUTTON, D. (1983) Cochlear implant effects on the spiral ganglion. Ann Otol Rhinol Laryngol 92, 316 SUZUKI, M., T. YAMASOBA, K. SUZUKAWA u. K. KAGA (2003): Adenoviral vector gene delivery via the round window membrane in guinea pigs. Neuroreport 14, 1951-1955 TAM, P.P. u. J. ROSSANT (2003) Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development 130, 6155-6163 TAKEMURA, K., M. KOMEDA, M. YAGI, C. HIMENO, M. IZUMIKAWA, T. DOI, H. KURIYAMA, J.M. MILLER u. T. YAMASHITA (2004) Direct inner ear infusion of dexamethasone attenuates noise-induced trauma in guinea pig. Hear Res 196, 58-68 TSIEN, R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67, 509-544 VAN EYKEN, E., L. VAN LAER, E. FRANSEN, V. TOPSAKAL, J. J. HENDRICKX, K. DEMEESTER, P. VAN DE HEYNING, E. MAKI-TORKKO, S. HANNULA, M. SORRI, M. JENSEN, A. PARVING, M. BILLE, M. BAUR, M. PFISTER, A. BONACONSA, M. MAZZOLI, E. ORZAN, A. ESPESO, D. STEPHENS, K. VERBRUGGEN, J. HUYGHE, I. DHOOGE, P. HUYGEN, H. KREMER, C. CREMERS, S. KUNST, M. MANNINEN, I. PYYKKO, E. RAJKOWSKA, M. PAWELCZYK, M. SLIWINSKA-KOWALSKA, M. STEFFENS, T. WIENKER u. G. VAN CAMP (2007) The contribution of GJB2 (Connexin 26) 35delG to age-related hearing impairment and noiseinduced hearing loss. Otol Neurotol 28, 970-975 VENKER-VAN HAAGEN, A. J. (2006) HNO bei Hund und Katze. Schlütersche Verlagsgesellschaft, Hannover VILLE u. RUSSEL (1995) Retroviruses as vectors. Br Med Bull 51, 12–30 WAARDENBURG, P. J. (1951) 128 Literaturverzeichnis A new syndrome combining developmental anomalies of the eyelids, eyebrows and nose root with pigmentary defects of the iris and head hair and with congenital deafness. Am J Hum Genet 3, 195-253 WANG, J., B. LI, C. CAI, Y. ZHANG, S. WANG, S.HU, X. TIAN u. M. ZHANG (2007) Efficient transduction of spiral ganglion neurons in vitro by baculovirus vectors. Neuroreport 18, 1329-1333 WAREING, M., A.N. MHATRE, R. PETTIS, J.J. HAN, T. HAUT, M.H. PFISTER, K. HONG, W.W. ZHENG u. A.K. LALWANI (1999) Cationic liposome mediated transgene expression in the guinea pig cochlea. Hear Res 128, 61-69 WARNECKE, A., K. WISSEL, A. HOFFMANN, N. HOFMANN, N. BERKINGALI, G. GROSS, T. LENARZ u. T. STÖVER (2007). The biological effects of cell delivered brain-derived neurotrophic factor on cultured spiral ganglion cells. Neuroreport 18,1683-1686 WEBSTER, M. u. D. B. WEBSTER (1981) Spiral ganglion neuron loss following organ of Corti loss: a quantitative study. Brain Res 212, 17-30 WEFSTAEDT, P., V. SCHEPER, H. RIEGER, T. LENARZ u. T. STÖVER (2006) Neurotrophic factors of the GDNF family and their receptors are detectable in spiral ganglion cells of normal hearing as well as of deafened rats. Laryngorhinootologie 85, 802-808 WEFSTEDT, P., V. SCHEPER, T. LENARZ u. T. STÖVER (2005) Brain-derived neurotrophic factor/glial cell line-derived neurotrophic factor survival effects are not limited by dexamethasone. Neuroreport 16, 2011-2014 WEST, B. A., R.E. BRUMMETT u. D.L. HIMES (1973) Interaction of kanamycin and ethacrynic acid. Severe cochlear damage in guinea pigs. Arch Otolaryngol 98, 32-37 WISSEL, K., T. STÖVER, N.S. HOFMANN, Y. CHERNAJOVSKY, G.DALY, S. SASSE, A. WARNECKE, T. LENARZ, G. GROSS u. A. HOFFMANN (2008) Fibroblast-mediated delivery of GDNF induces neuronal-like outgrowth in PC12 cells. 129 Literaturverzeichnis Otol Neurotol 29, 475-481 YAGI, M., S. KANZAKI, K. KAWAMOTO, B. SHIN, P.P. SHAH, E. MAGAL, J. SHENG u. Y. RAPHAEL (2000) Spiral ganglion neurons are protected from degeneration by GDNF gene therapy. J Assoc Res Otolaryngol 1, 315-325 YAMAGATI, T., J.M. MILLER, M. ULFENDAHL, N.P. OLIVIUS, R.A. ALTSCHULER, I. PYYKKO u. G. BREDBERG (2004) Delayed neurotrophic treatment preserves nerve survival and electrophysiological responsiveness in neomycin-deafened guinea pigs. J Neurosci Res 78, 75-86 YAMASHITA, D., H.Y. JIANG, J. SCHACHT u. J.M. MILLER (2004) Delayed production of free radicals following noise exposure. Brain Res 1019, 201-209 YANG, W.P., D. HENDERSON, B.H. HU u. T.M. NICOTERA (2004) Quantitative analysis of apoptotic and necrotic outer hair cells after exposure to different levels of continuous noise. Hear Res 196, 69-76 YLIKOSKI, J., U. PIRVOLA, J. VIRKKALA, P. SUVANTO, X.Q. LIANG, E. MAGAL, R. ALTSCHULER, J.M. MILLER u. M. SAARMA (1998) Guinea pig auditory neurons are protected by glial cell line-derived growth factor from degeneration after noise trauma. Hear Res 124, 17-26 ZHENG, J.L., R.R. STEWART u. W.Q. GAO (1995) Neurotrophin-4/5, brain-derived neurotrophic factor, and neurotrophin-3 promote survival of cultured vestibular ganglion neurons and protect them against neurotoxicity of ototoxins. J Neurobiol 28, 330-40 130 Literaturverzeichnis ZHENG, J.L. u. W.Q. GAO (1996) Differential damage to auditory neurons and hair cells by ototoxins and neuroprotection by specific neurotrophins in rat cochlear organotypic cultures. Eur J Neurosci 8, 1897-1905 Gesetze 1998 Tierschutzgesetz (TierschG §4(3)). Vom 25. Mai 1998, zuletzt geändert 21. Juni 2005 Bundesgesetzbl. I S. 1005, 1818, 1666 131 Anhang 11 ANHANG 11.1 Reagenzien und Chemikalien Aceton Baker, Deventer, Holland BDNF „recombinant human“ R&D Systems, Wiesbaden Collagenase „Typ IA“ Sigma, St. Louis, USA Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt Deoxyribonuclease I (DNase I) „from bovine Roche, Mannheim pancreas, grade II“ (Zellkultur) Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Invitrogen, GibcoTM, Karlsruhe Dulbecco’s modified Eagle Medium (High-glucose) Sigma D-7777, Taufkirchen (DMEM) Essigsäure Merck, Darmstadt EDTA (20g) Pulver Sigma, Taufkirchen Doxycyclin (Hydroxy-Tetracyclin) Sigma, Taufkirchen Ethanol für die Molekularbiologie Merck, Darmstadt Ethanol, vergällt 70% zur Desinfektion Medizinische Hochschule, Hannover Fötales Rinderserum (FBS) hitzeinaktiviert Biochrom AG, Berlin Formaldehyd Merck, Darmstadt GoTaq DNA Polymerase Promega, Mannheim Hanks' gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca2+ Invitrogen, GibcoTM, Karlsruhe und Mg2+ Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) z.A. Merck, Darmstadt Kalziumchlorid (CaCl2) Merck, Darmstadt Laminin „Natural Mouse“ Invitrogen, Karlsruhe Low Melting Agarose 2% (Agarose MS) Roche, Mannheim Methanol Baker, Deventer, Holland Natronlauge 10 mol/l, reinst Merck, Darmstadt Natriumchlorid (NaCl) z.A. Merck, Darmstadt Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), 7,5%-ig Biochrom, Berlin 132 Anhang Poly-DL-Ornithin Sigma, St. Louis, USA Polybren-enthaltendes Medium Sequa-brene, Sigma t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt Penicillin (10.000 IE/ml)/ Streptomycin (10.000 Biochrom AG, Berlin μg/ml) Invitrogen, GibcoTM, Karlsruhe Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Tabletten ProLong® Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregan, USA Streptomycin Serva, Heidelberg Trypanblau 0,5% Biochrom AG, Berlin Trypsin/EDTA, 0,05% in PBS ohne Ca2+ und Mg2+ Bichrom AG, Berlin Trypsin-/ EDTA, 0,25% in PBS ohne Ca2+ und Biochrom AG, Berlin Mg2+ Trypsin (1:250) aus Rinderpankreas (4 U/ml) SERVA, Heidelberg “Turbo-Pfu DNA Polymerase” Stratagene, LaJolla, CA, US) Bam HI und Sal I New England Biolabs, Ipswich, MA Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Applied Biosystems, Darmstadt Reaction Mix v.1.1 133 Anhang 11.2 Pharmaka Carprofen (50 mg/ml), Rimadyl®, 20 ml Pfizer GmbH, Karlsruhe Ciclosporin A, Sandimmun, 50 mg/ml Injektionslsg. Novartis Pharma GmbH, Nürnberg Doxycyclin Ratiopharm SF, 100mg/5ml Injektionslsg. Ratiopharm GmbH, Ulm Glycopyrroniumbromid (0,2 Mg/ml), Robinul®, 1 ml Riemser Arzneimittel AG, Greifswald Lactobacillen (L. Fermentum, L. Casei, L. Plantarum, L. A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf Acidophilus, Je 60 mg) Und Streptococcus Faecium (60 mg), Bird Bene-Bac® Ketamin (100 mg/ml), Ketamin Gräub® 10%, 10 ml A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf Polyvinylpyrrolidoniod (Povidon-Iod), Braunoderm, 500 Fa. B. Braun Melsungen AG, ml Melsungen Prilocainhydrochlorid (20 mg/ml), Xylonest® 1%, 10 ml Astrazeneca GmbH, Plankstadt Ringer Acetat Infusionslösung, 1000 ml Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen Sulfamethoxazol (200 mg) und Trimethoprim (40 mg), Ratiopharm GmbH, Ulm Cotrim K-Ratiopharm® Saft, 250 ml Xylazin (20 mg/ml), Rompun®2%, 20 ml Bayer Vital GmbH, Leverkusen 11.3 Kits und Antikörper Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit Mouse IgG Vector Lab., Burlingame, USA Peroxidase Substrat Kit DAB Vector Lab., Burlingame, USA Anti-Neurofilament 200kD, 1:500 in 1,5% Pferde-NS Vector Lab., Burlingame, USA Monoklonal Maus IgG, Clone RT97 Novocastra, Newcastle, UK Rat Anti-Mouse CD90.2 (Thy-1.2) monoklonaler BD Biosciences, Heidelberg Antikörper Rabbit Anti-Green Fluorescent Protein (GFP) polyklonaler Millipore, Schwalbach Antikörper Goat Anti Rabbit IgG (Cy5 konjugierter) Antikörper Dianova, Hamburg BDNF Emax Immunoassay Kit Promega, Mannheim Anti-rat Ig HRP Detection Kit BD Biosciences, Heidelberg 134 Anhang 11.4 Geräte Co2-Inkubator Mco-20aic Sanyo, Japan CCD-Kamera (colorview xs) SIS, Münster Flüssigstickstoffbehälter "Euro-Cyl" German-Cryo, Jüchen Inkubationsbad 1002 Gesellschaft Für Labortechnik Mbh, Burgwedel Leica Mz-6 Leica, Bensheim Lichtmikroskop Olympus Ckx31 (Invers) Olympus, Hamburg Olympus Ix81, Abs. 490 nm/Ext. 520 nm Olympus, Hamburg Olympus CKX 41 Olympus, Hamburg Kühlgefrierkombination "Typ 56134", 4 °C, -20°C Liebherr, Bieberach Magnetrührer mit Heizplatte "K-Ret Basic" Ika-Werke Gmbh & Co. Kg, Staufen Multifuge 1s, Hereaus Thermo Fisher Scientific Gmbh, Bremen Neubauer-Zählkammer Omnilab, Bremen Pinzette "Dumont Nr. 5" Carl Roth Gmbh & Co. Kg, Karlsruhe Olympus Ix81, , Germany Olympus Deutschland Gmbh, Hamburg Pipette, Einstellbar "Pipetman" (1-10 Μl, 20-200 Μl, 100- Gilson, Villers Le Bel/Frankreich 1000μl) Pipettierhelfer "Accu-Jet® Pro" Brand Gmbh & Co. Kg, Wertheim Präzisionswaage "Cp64" Sartorius, Göttingen Reinstwasseraufbereitung: Milli-Q Biocel System Gard 2 Millipore Gmbh, Schwalbach Sicherheitswerkbank Herasafe 343 Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau Thermomixer Compact Eppendorf Ag, Hamburg 135 Anhang 11.5 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien Deckgläser 22 X 22 Mm Menzel-Gläser, Braunschweig Gefrierröhrchen "Nalgene", 1,8 Ml Nalge Co., Rochester, Usa Handschuhe Aus Latex Safeskin Satin Plus Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Laborglaswaren (Erlenmeyerkolben, Flaschen, Omnilab, Gehrden / Vwr, Darmstadt Bechergläser, Etc.) 0,22 µm PVDF FILTER Millipore, Schwalbach Multiwell-Zellkulturplatte 96, Transparent Nunc, Langenselbold Multiwell-Zellkulturplatte 96, Schwarz Nunc, Langenselbold Multiwell-Zellkulturplatte 48, Transparent Nunc, Langenselbold Objektträger Superfrost® Plus Menzel-Gläser, Braunschweig Pasteurpipetten, 22,5 Mm Aus Glas Brand, Wertheim Pipetten Zum Einmalgebrauch, Serologisch, 2 Ml, 5 Ml, Sarstedt, Nürnbrecht 10 Ml 1000µl und 200µl Pipettenspitzen Starlab, Ahrensburg Pipettenspitzen, 1-10 Μl, 1-200 Μl, 101-1000 Μl Tipone, Starlab, Ahrensburg Reaktionsgefäß "SAFE-LOCK", 2 ML Omnilab, Gehrden Sterilfilter Zum Einmalgebrauch, 0,2 Μm "Minisart®" Sartorius, Göttingen Zellkulturflasche, 25 Cm2 Biochrom Ag, Berlin Zentrifugenröhrchen, 15 Ml, Konisch Biochrom Ag, Berlin Zentrifugenröhrchen, 50 Ml, Konisch Biochrom Ag, Berlin 136 DANKSAGUNG An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Timo Stöver für die Betreuung meiner Doktorarbeit und die Bereitstellung dieses äußerst interessanten Themas danken. Er ließ mir viel Freiheit zur Entwicklung und Verwirklichung eigener Ideen, an denen das Projekt und ich wachsen konnten. Herrn PD Dr. Karl Heinz Esser, meinem Doktorvater an der Tierärztlichen Hochschule Hannover, möchte ich ganz herzlich für die Übernahme der Betreuung meiner Doktorarbeit danken. Seine herzliche und unkomplizierte Art waren mir sehr angenehm. Herrn Prof. Prof. Dr. T. Lenarz, dem Leiter der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover, gilt mein besonderer Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Arbeitsmittel sowie der abschließenden Begutachtung meiner Arbeit. Vielen Dank der Arbeitsgruppe von Dr. Gerhard Groß am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI, Braunschweig) für die Herstellung und Bereitstellung der lentiviral modifizierten NIH3T3-Fibroblasten Zelllinie. Insbesondere danke ich hierbei Dr. Andrea Hoffmann für die inspirierende Zusammenarbeit. Ich danke Stefanie Ernst, vom Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover für ihre Unterstützung bei der statistischen Auswertung einzelner Daten. Mein besonderer Dank gilt Dr. Kirsten Wissel und Dr. Athanasia Warnecke für ihre engagierte Unterstützung während meines gesamten Projektes. Kirsten danke ich im speziellen für ihre Geduld, die anregenden fachlichen, wie auch persönlichen Gespräche. Athanasia danke ich für ihre unermüdliche Art mich zu motivieren und mein Projekt voran zu treiben. Meinen Kollegen im dritten Stock möchte ich für die hervorragende Arbeitsatmosphäre und die kollegiale und freundschaftliche Zusammenarbeit danken. Dr. Verena Scheper danke ich für die nette, unkomplizierte Einarbeitung in die Tierversuche und ihre vielen Ratschläge. Dr. Gerritt Paasche danke ich für die nette Zusammenarbeit und Bereitstellung der Probekörper. Roger und Hubert danke ich für die Einführung in TDT, MATLAB und HughPhonics. Mein besonderer Dank gilt Melli, Eve, Anke, Ronni und Souvik für die tolle Zeit als gemeinsame Doktoranden, nicht nur im Arbeitsalltag, sondern auch nach Feierabend. Ich danke meiner tollen Familie für ihre Unterstützung, Motivation und Geduld, die mich durch Freud und Frust dieser Arbeit begleitet haben. 137 138 ERKLÄRUNG Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zur neuronalen Protektion nach Einsatz lentiviral modifizierter Fibroblasten auf Cochlea-Implantat-Oberflächen“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: Die Materialien und Geräte wurden von der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Dr. Th. Lenarz) zur Verfügung gestellt. Die Zellkulturarbeiten wurden in den Räumlichkeiten des TransplantationsForschungszentrums der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Pflege der für diese Arbeit verwendeten Tiere sowie die Bereitstellung der Operationsräume erfolgte durch das Zentrale Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Dr. H. J. Hedrich). Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- oder Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation bei folgender Institution angefertigt: Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 22.10.2014 Susanne Sasse 139
