Veränderung der Anzahl und Verteilung von Plasmazellen und
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Aus dem Institut für Pathologie und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover ___________________________________________________________________ Veränderung der Anzahl und Verteilung von Plasmazellen und Lymphozytenpopulationen in der Darmschleimhaut des Schweines nach Applikation von Probiotika INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Claudia van Briel aus Hannover Hannover 2002 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio 1. Gutachter: PD Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio 2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Leibold Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2002 Gewidmet meinen Eltern und Großeltern Inhaltsverzeichnis 1. 2. Einleitung .................................................................................................................................................................1 Literaturübersicht .....................................................................................................................................................3 2.1. Das Darmschleimhautimmunsystem ................................................................................................................3 2.1.1. Aufnahme von Antigen............................................................................................................................3 2.1.2. Immunreaktion in den schleimhautassoziierten Lymphknötchen ............................................................5 2.1.3. Rezirkulation von Immunzellen aus den schleimhautassoziierten Lymphknötchen in die Schleimhaut .............................................................................................................................................6 2.1.4. Immunreaktion in der Schleimhaut..........................................................................................................6 2.2. Die Morphologie des Darmschleimhautimmunsystems beim Schwein ...........................................................7 2.2.1. Afferenter Anteil des Darmschleimhautimmunsystems: Peyersche Platten im Dünndarm und lymphoglanduläre Komplexe im Dickdarm.............................................................................................7 2.2.1.1. Anatomie .........................................................................................................................................7 2.2.1.2. Histologie ........................................................................................................................................9 2.2.1.2.1. Lymphfollikel...............................................................................................................................9 2.2.1.2.2. Interfollikularzone......................................................................................................................10 2.2.1.2.3. Domes/subepithelialer Bereich ..................................................................................................10 2.2.1.2.4. Das follikelassozierte Epithel (FAE)..........................................................................................11 2.2.2. Efferenter Anteil des Darmschleimhautimmunsystems .........................................................................12 2.2.2.1. Plasmazellen..................................................................................................................................12 2.2.2.2. CD4+T-Lymphozyten ....................................................................................................................13 2.2.2.3. Intraepitheliale Lymphozyten........................................................................................................14 2.3. Differenzierungsantigene des Schweines .......................................................................................................16 2.3.1. CD6 Antigen..........................................................................................................................................17 2.3.2. CD4 Antigen..........................................................................................................................................17 2.3.3. CD8 Antigen..........................................................................................................................................18 2.3.4. Simultane Expression von CD4 und CD8 Antigen................................................................................18 2.3.5. CD4-CD8-T-Lymphozyten (γδ-T-Lymphozyten)..................................................................................20 2.4. Probiotika .......................................................................................................................................................22 2.4.1. Definitionen ...........................................................................................................................................22 2.4.1.1. Probiotika ......................................................................................................................................22 2.4.1.2. Prebiotika ......................................................................................................................................22 2.4.1.3. Symbiotika ....................................................................................................................................23 2.4.2. Einsatzgebiet von Probiotika .................................................................................................................23 2.4.2.1. Tiermedizin ...................................................................................................................................24 2.4.2.1.1. Landwirtschaftliche Nutztiere ....................................................................................................24 2.4.2.1.2. Andere Tierspezies.....................................................................................................................26 2.4.2.2. Humanmedizin ..............................................................................................................................27 2.4.3. Übersicht über die Wirkungsweise verschiedener Probiotika................................................................28 2.4.3.1. Wirkung auf (pathogene) Mikroorganismen im Darmlumen ........................................................29 2.4.3.2. Wirkung der Probiotika auf den Wirtsorganismus ........................................................................30 2.4.3.2.1. Unterstützung der Reaktionen des unspezifischen Immunsystems ............................................30 2.4.3.2.2. Verstärkung der spezifischen Immunantwort.............................................................................31 2.4.4. Die verwendeten Probiotika und ihr Einsatzgebiet ................................................................................32 2.4.4.1. Saccharomyces boulardii...............................................................................................................32 2.4.4.1.1. Anwendung ................................................................................................................................32 2.4.4.1.2. Charakterisierung .......................................................................................................................32 2.4.4.1.3. Wirkungsweise auf Mikroorganismen im Darmlumen ..............................................................33 2.4.4.1.4. Wirkungen auf den Wirtsorganismus.........................................................................................34 2.4.4.2. Bacillus cereus varietas toyoi ........................................................................................................38 2.4.4.2.1. Anwendung ................................................................................................................................38 2.4.4.2.2. Charakterisierung .......................................................................................................................38 2.4.4.2.3. Auswirkung auf Leistungsparameter..........................................................................................39 2.4.4.2.4. Wirkungsmechanismen ..............................................................................................................40 3. Material und Methoden ..........................................................................................................................................42 3.1. Versuchstiere..................................................................................................................................................42 3.2. Fütterung und Haltung ...................................................................................................................................43 3.3. Probengewinnung, -aufbereitung und -aufbewahrung ...................................................................................44 3.4. Immunhistologische Untersuchungen ............................................................................................................46 3.4.1. Prinzip....................................................................................................................................................46 3.4.2. Primäre Antikörper zur Darstellung von Leukozytenantigen ................................................................49 3.4.3. Darstellung von IgA+Plasmazellen, CD6+, CD8+T-Lymphozyten und des γδ-T-Zellrezeptors mit der APAAP-Methode ......................................................................................................................50 3.4.4. Darstellung der CD4+T-Lymphozyten mit der Streptavidin-Biotin-Methode........................................53 3.5. Immunhistochemische Kontrollen .................................................................................................................53 3.6. Morphometrische Auswertung der histologischen Schnitte ...........................................................................54 3.6.1. Messgerät...............................................................................................................................................54 3.6.2. Zählung der dargestellten Zellen ...........................................................................................................54 3.6.2.1. Allgemein gültige Messkriterien ...................................................................................................54 3.6.2.2. Kriterien zur Auszählung der Plasmazellen sowie der CD4+- und CD6+T-Lymphozyten.............55 3.6.2.3. Kriterien zum Auszählen der CD8+T-Lymphozyten im Epithel....................................................56 3.6.2.4. Zählung der γδ-T-Lymphozyten....................................................................................................57 3.6.2.5. Bestimmung der Größe und Auszählung der CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten in den Lymphfollikeln der ilealen Peyerschen Platte ....................................................................57 3.7. Statistische Auswertung .................................................................................................................................58 4. Ergebnisse ..............................................................................................................................................................59 4.1. Verteilung der IgA+Plasmazellen ...................................................................................................................59 4.1.1. Kontrolltiere...........................................................................................................................................59 4.1.2. Saccharomyces boulardii .......................................................................................................................59 4.1.3. Bacillus cereus var. toyoi.......................................................................................................................60 4.2. Verteilung der CD6+T-Lymphozyten .............................................................................................................66 4.2.1. Kontrolltiere...........................................................................................................................................66 4.2.2. Saccharomyces boulardii .......................................................................................................................66 4.2.3. Bacillus cereus .......................................................................................................................................67 4.3. Verteilung der CD4+T-Lymphozyten .............................................................................................................74 4.3.1. Kontrolltiere...........................................................................................................................................74 4.3.2. Saccharomyces boulardii .......................................................................................................................74 4.3.3. Bacillus cereus .......................................................................................................................................75 4.4. Verteilung der CD8+T-Lymphozyten .............................................................................................................81 4.4.1. Kontrolltiere...........................................................................................................................................81 4.4.2. Saccharomyces boulardii .......................................................................................................................81 4.4.3. Bacillus cereus .......................................................................................................................................82 4.5. Verteilung der γδ-T-Lymphozytensubpopulation, die durch die mAks 86D und 320 dargestellt wurden............................................................................................................................................................88 4.5.1. Kontrolltiere...........................................................................................................................................88 4.5.2. Saccharomyces boulardii .......................................................................................................................88 4.5.3. Bacillus cereus .......................................................................................................................................89 4.6. Größe und Zellzusammensetzung der Lymphfollikel in der ilealen Peyerschen Platte (iPP).........................96 5. Diskussion ..............................................................................................................................................................99 6. Zusammenfassung ................................................................................................................................................107 7. Summary ..............................................................................................................................................................109 8. Literaturverzeichnis ..............................................................................................................................................111 9. Anhang .................................................................................................................................................................146 10. Erklärung ..........................................................................................................................................................148 Abkürzungen Abb. Abbildung APAAP-Methode Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode Aqua dest. Aqua destillata B.c. Bacillus cereus varietas toyoi BrdU Bromodeoxyuridine BSA bovines Serumalbumin CD cluster of differentiation (Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene) CMIS common mucosal immune system (allgemeines Schleimhautimmunsystem) DSIS Darmschleimhautimmunsystem Ec. Enterococcus E.coli Escherichia coli Fa. Firma FAE follikelassoziiertes Epithel FDC(S) follikuläre dendritische Zelle(n) GALT gut associated lymphoid tissue (darmschleimhautassoziiertes lymphatisches Gewebe) IEL intraepitheliale Lymphozyten IFN (γ) Interferon (gamma) IFZ Interfollikularzone Ig Immunglobulin(e) IL Interleukin Jej. Jejunum iPP ileale Peyersche Platten jPP jejunale Peyersche Platten KbE koloniebildende Einheiten kg Kilogramm Lac. Lactobacillus LGK lymphoglanduläre Komplexe Lp Lamina propia mAK monoklonaler Antikörper MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) mit. mittleres ml Milliliter M-Zelle microfold bearing bzw. membranous cell (Membranzelle) µg Mikrogramm µm Mikrometer NaCl (0,9 %ige) Natriumchloridlösung PBS phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PP Peyersche Platten PolyIgRez. Polyimmunglobulinrezeptor prox. proximal ® eingetragenes Warenzeichen S. b. Saccharomyces boulardii S. cer. Saccharomyces cerevisiae SPF spezifisch pathogenfrei SWC swine leucocyte workshop cluster (porzine Differenzierungsantigene) Tab. Tabelle Tc T-cytotoxische-Lymphozyten TcR T-Zellrezeptor TH-Lymphozyten T-Helfer-Lymphozyten TS/C T-suppressor/cytotoxische-Zellen u.a. unter anderem z.T. zum Teil Einleitung 1 1. Einleitung Jahrzehnte nach ihrem ersten medizinischen Einsatz erfahren Probiotika in den letzten Jahren aufgrund des sich wandelnden Gesundheitsbewusstseins ein zunehmendes Interesse und ein immer breiteres Einsatzgebiet vor allem als Alternative oder Ergänzung zu Antibiotika (STAVRIC u. KORNEGAY 1995; HUIS IN´T VELD 1998). Zusätzlich zu therapeutischen Indikationen werden Probiotika in Human- und Veterinärmedizin auch in Nahrungsmitteln, insbesondere fermentierten Milchprodukten, und in der Tierernährung sowohl im Heimtier- als auch im Nutztierbereich verwendet (FOX 1988; IBEN u. LEIBETSEDER 1989; GEDECK 1991; WILLIAMS 1991; BARROW 1992; NEWBOLD 1995; ZENTEK et al. 1998; ANNON 1999; HARTMANN 2000). Unter dem Begriff Probiotika werden lebende mikrobielle Zusätze zur Nahrung mit positivem Effekt auf den Wirtsorganismus durch Verbesserung der intestinalen mikrobiellen Balance verstanden (FULLER 1989). Es handelt sich hierbei um eine Vielzahl sehr unterschiedlicher Mikroorganismen (NOGOSSEK 2001). Ihr Einsatz erfolgt häufig empirisch aufgrund ihrer Wirkung auf klinische Parameter oder Leistungsparameter bei Nutztieren. Man geht davon aus, dass Probiotika zu einer metabolischen oder kompetitiven Antagonisierung der Intestinalflora führen (GEDEK 1986; FOX 1988; SISSONS 1989; VANBELLE et al. 1990; MONTES u. PUGH 1993; STAVRIC u. KORNEGAY 1995; JIN et al. 1997; CASTAGLIUOLO et al. 1999; GEDEK 1999). Die genauen Wirkungsmechanismen sind aufgrund der komplexen Interaktionen zwischen Mikroorganismen im Darminhalt und gastrointestinaler Barriere des Wirtsorganismus noch unvollständig aufgeklärt. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Probiotika die Enzymausstattung, Durchlässigkeit und Transportfunktionen des Darmepithels, die Morphologie der Darmschleimhaut und die Muzinbeschaffenheit modifizieren (BUTS et al. 1986; JAHN et al. 1996; BREVES et al. 1997; WINCKLER et al. 1998; GÖRKE 2000) Die Mikroflora des Darmes spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Darmschleimhautimmunsystems (DSIS) (BARMAN et al. 1997). Veränderungen der physiologischen Flora, wie sie z.B. bei Gnotobioten oder keimarm gehaltenen Tieren vorliegen, führen zu Veränderungen in Ausdehnung, Zellgehalt und Zellzusammensetzung des DSIS (PABST 1988; ROTHKÖTTER u. PABST 1989; ROTHKÖTTER 1994; BARMAN et al. 1997). 2 Einleitung Aus diesem Grund ist es sehr wahrscheinlich, dass die Gabe von Probiotika, bei denen es sich um lebende Mikroorganismen handelt, die physiologische Flora und hierdurch das DSIS beeinflusst. In der vorliegenden Untersuchung wurde diese Hypothese an klinisch gesunden Schweinen getestet. Als Probiotika wurden zwei verschiedene Mikroorganismen, Saccharomyces boulardii (S.b.) und Bacillus cereus var. toyoi (B.c.), verabreicht. Hierdurch sollte abgeklärt werden, ob es Hinweise auf gemeinsame bzw. unterschiedliche Wirkungsmechanismen bei probiotischen Mikroorganismen gibt. Als Messparameter zur Charakterisierung des DSIS wurden Anzahl und Verteilung der Effektorzellen, d.h. der Plasmazellen und T-Lymphozytensubpopulationen, in der Darmschleimhaut gewählt. Es wurden mehrere Lokalisationen aus dem Dünn- und Dickdarm in die Untersuchung miteinbezogen, um lokale Unterschiede in der Beeinflussung des DSIS entlang des Darmes zu erfassen. Literaturübersicht 3 2. Literaturübersicht 2.1. Das Darmschleimhautimmunsystem Das Darmschleimhautimmunsystem (DSIS) ist ein wichtiger Bestandteil der gastrointestinalen Barriere. Über das DSIS können Antigene aus dem Darminhalt aufgenommen werden (WAKSMAN u. OZER 1976; HUSBAND 1987) und abhängig von der Art des Antigens eine entsprechende Immunantwort in Form einer Abwehr- oder einer Toleranzreaktion erfolgen (CRAIG u. CEBRA 1971; HUSBAND u. GOWANS 1978; BIENENSTOCK u. BEFUS 1980; KEREN 1988; WINNER et al. 1991). Das DSIS ist Teil des „common mucosal immune system“ (=CMIS), das in den verschiedenen Schleimhäuten des Organismus existiert und diese verbindet (BIENENSTOCK u. BEFUS 1980; MCNABB u. TOMASI 1981; MCDERMOTT et al. 1982; BIENENSTOCK 1984; HUSBAND 1987). Die morphologischen Anteile des DSIS, die darmschleimhautassoziierten lymphatischen Gewebe („gut associated lymphoid tissue“=GALT) sind entlang des gesamten Darms verteilte Lymphknötchen in der Schleimhaut, die den afferenten Anteil des DSIS bilden und eine wichtige Kontaktfläche zwischen luminalen Antigenen, Infektionserregern und dem Körperinneren sind, und Immunzellen in der Schleimhaut, die den efferenten Anteil darstellen und eine lokale, sekretorische und/oder zellvermittelte Immunantwort in der Schleimhaut ermöglichen. Im folgenden sollen die Schritte, die zum Entstehen einer Immunantwort im DSIS führen, dargestellt werden. Sie lassen sich unterteilen in • Aufnahme von Antigen • Immunreaktion in den schleimhautassoziierten Lymphknötchen • Rezirkulation von Immunzellen aus den schleimhautassoziierten Lymphknötchen in die Schleimhaut • Immunreaktion in der Schleimhaut 2.1.1. Aufnahme von Antigen Um eine Immunantwort auf Antigene aus dem Darminhalt induzieren zu können, müssen diese aufgenommen werden und mit Zellen des Immunsystems in Kontakt gebracht werden. Nach Schluss der Darmbarriere beim Neugeborenen erfolgt die Aufnahme von Makromolekülen (schwerer als 60 Kilo Dalton) unter physiologischen Bedingungen vorrangig im Bereich der 4 Literaturübersicht schleimhautassoziierten Lymphfollikel (PABST u. ROTHKÖTTER 1999). Das Epithel im Bereich der schleimhautassoziierten Lymphfollikel, das als follikelassoziiertes Epithel (FAE) bezeichnet wird, ist aufgrund seiner morphologischen Besonderheiten hierfür besonders geeignet (WALKER 1981; WALKER u. BLOCH 1983), s. 2.2.1.2.4. Eine Aufnahme konnte für eine Vielzahl inerter Substanzen und immunogener Marker gezeigt werden: • Tusche und Latexpartikel als inerte Substanzen (JOEL et al. 1970; BOCKMAN u. COOPER 1973; LEFEVRE et al. 1978; REYNOLDS u. MORRIS 1983; ROSNER u. KEREN 1984; SASS et al. 1987; LANDSVERK 1988) • Ferritin und Meerrettichperoxydase als immunogene Marker ohne selektiven Transport (BOCKMAN u. COOPER 1973; BOCKMAN u. STEVENS 1976; OWEN 1977; VON ROSEN et al 1981; BLAND u. BRITTON 1984; LANDSVERK 1987; LEMKE 1990, LIEBLER et al. 1991, PAAR et al. 1992) • Lektin-Ferritin-Konjugate und polykationisches Ferritin als immunogene Marker mit selektivem Transport (BYE et al. 1984; NEUTRA et al. 1997). Auch Infektionserreger können über das FAE eine Eintrittspforte in den Körper finden (WOLF u. BYE 1984; WICK et al. 1991; Gebert et al. 1996) und zu einer Aktivierung oder Schädigung des DSIS führen (BUTCHER et al. 1982; CEBRA et al. 1991). Die Aufnahme erfolgt insbesondere über spezialisierte Epithelzellen im FAE, die als M-Zellen bezeichnet werden. M-Zellen haben eine Schleusenfunktion. Sie nehmen Antigene aus dem Darmlumen auf, transportieren sie durch die Zelle und geben sie weitgehend unverändert an der basolateralen Seite in den Interzellularraum wieder ab (LANDSVERK 1981a; OWEN 1982; EGBERTS et al. 1985; OWEN et al. 1986). Aufgrund des Fehlens von MHC (major histocompatibility complex) Klasse II auf der basolateralen Oberfläche der M-Zellen nimmt man an, dass sie im Epithel lediglich eine Transportfunktion haben und keine Antigene präsentieren (BJERKE u. BRANDTZAEG 1988). Literaturübersicht 5 2.1.2. Immunreaktion in den schleimhautassoziierten Lymphknötchen Nach ihrer Aufnahme durch die M-Zellen kommen die Antigene zunächst mit den in großer Anzahl im FAE vorhandenen intraepithelialen Zellen in Berührung (OWEN 1977). Aufgrund der Porosität der Basalmembran des FAE (MCCLUGAGE et al. 1986) ist auch ein enger Kontakt mit subepithelial gelegenen Makrophagen und dendritischen Zellen möglich. Diese Zellen können Antigene aufnehmen, transportieren und den Lymphozyten präsentieren (LEFEVRE et al. 1979; LAUSE u. BOCKMANN 1981; OWEN 1982; WILDERS et al. 1983). Die dendritischen Zellen wandern vor allem in die T-zellabhängigen Interfollikularzonen ein und aktivieren TLymphozyten, zu proliferieren und Zytokine freizusetzen (MCGHEE et al. 1989). In den Lymphfollikeln kann durch die Interaktion von Antigen mit B-Lymphozyten, TLymphozyten und follikulären dendritischen Zellen (FDCs) die Proliferation und Selektion antigenspezifischer B-Zellen, sowie der Wechsel von einer Immunglobulin (Ig) M zu einer IgAExpression ausgelöst werden (CEBRA et al. 1988). Auf den im Keimzentrum der Follikel gelegenen FDCs erfolgt die Anheftung von Antigenen und Antigen/Antikörperkomplexen (BRANDTZAEG 1985; OWEN 1988) und sie geben Iccosomen, das sind mit Immunkomplexen ummantelte Partikel, ab (SZAKAL et al. 1988; TEW et al. 1989). Diese antigenhaltigen Partikel werden von den in den Keimzentren der Follikel gelegenen B-Lymphozyten endozytiert. Diese BLymphozyten erhalten dadurch ihre erste Aktivierung (TEW et al. 1989; BRANDTZAEG et al. 1992). Antigenaktivierte B-Lymphozyten werden durch T-Helfer-Lymphozyten (TH- Lymphozyten) mit Hilfe von Interleukin 2 (IL 2) zur Proliferation gebracht (BRANDTZAEG et al. 1992). Mit Hilfe der von den TH-Lymphozyten produzierten Zytokinen kommt es zum „switch“, d.h. zur Umwandlung der B-Zellen vom Isotyp von IgM u.a. zu IgA (KAWANISHI et al. 1983; ELSON 1985). 6 Literaturübersicht 2.1.3. Rezirkulation von Immunzellen aus den schleimhautassoziierten Lymphknötchen in die Schleimhaut Antigenspezifische IgA-Vorläuferzellen und T-Lymphozyten verlassen die Peyerschen Platten (PP) über die Lymphsinus, die die Lymphfollikel umgeben, und die efferenten Lymphgefäße und gelangen in die Mesenteriallymphknoten (GUY-GRAND et al. 1974; PARROT u. ROSE 1978). Dort gelangen sie beim Schwein über spezialisierte Venulen in die Blutbahn (BENNEL u. HUSBAND 1981; BINNS u. LICENCE 1985, 1986; BINNS u. PABST 1988; PABST u. BINNS 1989). Bei den Nagetieren und den Wiederkäuern verlassen sie die Mesenteriallymphknoten über efferente Lymphgefäße, die in den Ductus thoracicus münden, der seinerseits in die Vena cava mündet (CRAIG u. CEBRA 1971; REYNOLDS u. PABST 1984; BRANDTZAEG 1985). Die Lymphozyten aus den Peyerschen Platten rezirkulieren aus dem Blutstrom in die Schleimhäute des Gastrointestinal-, Respirations-, und weiblichen Genitaltrakts sowie in die Milch-, Tränenund Speicheldrüsen (ROUX et al. 1977; MESTECKY et al. 1978; MCDERMOTT u. BIENENSTOCK 1979; WEISZ-CARRINGTON et al. 1979; MCDERMOTT et al. 1980). Dabei erfolgt beim überwiegenden Teil der Lymphozyten eine selektive Rückkehr zum Ausgangsorgan, d.h. die aus dem GALT stammenden Lymphozyten kehren bevorzugt zur Darmschleimhaut zurück (PIERCE u. CRAY 1982; BIENENSTOCK u. BEFUS 1983). Dieser Vorgang wird als „migration and homing“ bezeichnet (HUSBAND u. GOWANS 1978; BUTCHER et al. 1982). 2.1.4. Immunreaktion in der Schleimhaut In der Schleimhaut verteilen sich die rezirkulierenden Lymphozyten, die aus den Peyerschen Platten stammen, selektiv in bestimmten Kompartimenten. B-Lymphoblasten, die sich unter dem Einfluss der TH-Lymphozyten in der Lamina propria der Darmschleimhaut zu IgA-sezernierenden Plasmazellen differenzieren (MESTECKY u. MCGHEE 1987; BRANDTZAEG et al. 1992), finden sich insbesondere in der Lamina propria der Krypten. Als Effektorzellen der humoralen Immunantwort sezernieren die Plasmazellen in der Darmschleimhaut überwiegend IgA und IgM. Diese werden an den Polyimmunglobulinrezeptor, der auf der basolateralen Oberfläche der Enterozyten in den Krypten ausgebildet ist, gebunden und selektiv ins Darmlumen transportiert (BRANDTZAEG 1988). Erste antikörperproduzierende Zellen wurden 7 Tage nach oraler Vakzination mit Choleratoxin im Blut des Menschen festgestellt (QUIDING-JÄRBRINK et al. 1997). Literaturübersicht 7 Die T-Lymphozyten sind Effektorzellen der zellvermittelten Immunantwort. TH-Lymphozyten, bei denen es sich aufgrund funktioneller Studien überwiegend um durch CD 25 aktivierte Zellen handelt (SELBY et al. 1983), findet man in allen Teilen der Lamina propria. TS/C-Lymphozyten (suppressor/cytotoxische T-Lymphozyten) und Lymphozyten, die den γδT-Zellrezeptor exprimieren, zeigen eine Präferenz für das Epithel. Die intraepithelialen Lymphozyten haben sowohl regulatorische als auch zytotoxische Funktionen (Guy-Grand et al. 1991). 2.2. Die Morphologie des Darmschleimhautimmunsystems beim Schwein Wie bereits unter 2.1. ausgeführt besteht das GALT aus schleimhautassoziierten Lymphknötchen im Dünn- und Dickdarm und Effektorzellen in der Lamina propria und im Epithel. Die schleimhautassoziierten Lymphknötchen setzen sich aus Lymphfollikel, Interfollikularzone, subepithelialem Lymphgewebe und FAE zusammen. 2.2.1. Afferenter Anteil des Darmschleimhautimmunsystems: Peyersche Platten im Dünndarm und lymphoglanduläre Komplexe im Dickdarm 2.2.1.1. Anatomie Ansammlungen von schleimhautassoziierten Lymphfollikeln im Dünndarm werden als Peyersche Platten (PP) bezeichnet. Sie kommen in speziesspezifisch und individuell unterschiedlicher Anzahl und Verteilung vor. Beim Schwein sind im vorderen und mittleren Dünndarm multiple kleine Peyersche Platten (jejunale Peyersche Platten = jPP) vorhanden, die bei Ferkeln etwa 2,5 % der Jejunalschleimhaut einnehmen (SAHLENDER 1989), und im terminalen Ileum eine besonders lange, durchgehende Peyersche Platte (ileale Peyersche Platte = iPP), die sich über das Ostium ileale ins Kolon hinein fortsetzt (CARLENS 1928; REYNOLDS u. MORRIS 1983; POHLENZ u. LIEBLER 1987; POHLENZ et al. 1989). Die PP liegen antimesenterial in der Darmwand, parallel zur Längsachse des Darmes (ELLENBERGER u. GÜNTHER 1908; DOUGHRI et al. 1972). PP sind beim Schwein bereits vor der Geburt vorhanden (CARLENS 1928; CHAPMAN et al. 1974). Das Auszählen und Vermessen aller PP im Dünndarm von zwei Monate alten Schweinen und die Nachuntersuchung derselben Schweine im Alter von einem Jahr zeigten, dass alle PP an ihrem ursprünglichen Platz bleiben und nach der Geburt keine neuen PP angelegt werden 8 (ROTHKÖTTER Literaturübersicht u. PABST 1989). Die Größe der PP wird dagegen von den Haltungsbedingungen und der Erregerexposition beeinflusst und unterscheidet sich bei spezifisch pathogenfrei, keimfrei oder konventionell gehaltenen Tieren (BARMAN et al. 1997). Bei konventionell gehaltenen Schweinen verdreifachte sich die Länge der jPP und iPP von der Geburt bis zum 38. Lebenstag, während sich bei keimfrei gehaltenen Tieren die Länge der iPP verdoppelte und es zu keiner Längenzunahme bei den jPP kam (PABST et al. 1988). Auch die zelluläre Zusammensetzung der jPP und iPP unterscheidet sich bei konventionell und keimfrei gehaltenen Tieren: Bei den konventionell gehaltenen Schweinen überwiegen B-Lymphozyten, während bei den keimfrei gehaltenen Tieren mehr T-Lymphozyten vorhanden sind. Daraus lässt sich schließen, dass mikrobielles Antigen wichtig ist für die Entwicklung von aktiven Follikeln in den PP (ROTHKÖTTER u. PABST 1989). Es zeigt aber auch, dass die jPP und iPP in unterschiedlichem Ausmaß dem Einfluss der Darmflora unterliegen. Einen weiteren Unterschied zwischen den jPP und der iPP stellt ihr Involutionsverhalten dar (BINNS u. LICENCE 1985; ROTHKÖTTER u. PABST 1989). Während die iPP sich in erwachsenen Schweinen mehr oder weniger zurückbildet, unterliegen die jPP keiner Involution (PABST 1988). Im Dickdarm des Schweines sind plattenartige Ansammlungen von Lymphknötchen im Bereich des Ostium ileale zu finden. Das lymphatische Gewebe kann auf den Ileocaecalzapfen beschränkt sein, es kann aber auch bis zu zehn Platten im Anfangsteil des Kolons umfassen (CARLENS 1928; WILKENS 1987; BINNS u. PABST 1988). Im weiteren Verlauf des Dickdarms einschließlich des Rektums sind beim Schwein einzelne Lymphknötchen zu finden (CARLENS 1928; BISWAL et al. 1953; ORTMANN 1960; INOUE u. SUGI 1978; MORFITT u. POHLENZ 1989). Diese werden als lymphoglanduläre Komplexe (LGK) bezeichnet, da sie sich häufig aus mehreren Lymphfollikeln und Epithelanteilen zusammensetzen. LGK kommen in großer Anzahl in der Darmschleimhaut vor. Im Kolon von 5-13 Wochen alten Schweinen gibt es durchschnittlich 1231 LGK (MORFITT u. POHLENZ 1989). Mit zunehmendem Alter und damit einhergehender Ausreifung der Darmproportionen wird die Verteilung der LGK gleichmäßiger (MORFITT u. POHLENZ 1989). Die Verteilung der Lymphknötchen in der Dickdarmschleimhaut beim Schwein ähnelt der beim Menschen (LAUFER u. DESA 1978; O`LEARY u. SWEENY 1986; MORFITT u. POHLENZ 1989; SAHLENDER 1989) und unterscheidet sich von der bei anderen Spezies wie Wiederkäuer, Maus und Ratte, bei denen plattenartige Ansammlungen in Kolon und Rektum vorkommen (CARLENS 1928; ORTMANN 1960; LIEBLER et al. 1988; BLAND u. BRITTON 1984; ALEKSANDERSEN 1989; LIEBLER et al. 1991). Literaturübersicht 2.2.1.2. 9 Histologie Schleimhautassoziierte Lymphknötchen bestehen aus drei Kompartments: • Lymphfollikeln • Interfollikularzonen (IFZ) • Domes/subepithelialem Bereich • Follikelassoziertes Epithel (FAE) Dome mit FAE IFZ Lymphfollikel Abb. 1: Schemazeichnung der Struktur der Peyerschen Platten modifiziert nach Pabst (1987) 2.2.1.2.1. Lymphfollikel Die Lymphfollikel der Peyerschen Platten liegen in der Lamina propria und/oder Submukosa (LANDSVERK 1984, LIEBLER 1985). Die Lymphfollikel der LGK befinden sich überwiegend in der Submukosa. Wie in anderen Lymphgeweben bestehen auch die Lymphfollikel der PP und LGK überwiegend aus B-Lymphozyten und zum geringen Teil aus T-Lymphozyten (ROTHKÖTTER u. PABST 1989). Der hohe Prozentsatz an IgA+B-Lymphozyten im Gegensatz zu Follikeln in den Lymphknoten ist kennzeichnend für das sekretorische Immunsystem des Darmes (MOWAT 10 Literaturübersicht 1987). Die Lymphozyten liegen eingebettet in einem Netz von FDCs (BRANDTZAEG 1989). Weiterhin sind Makrophagen, die untergehende Lymphozyten phagozytieren, zu finden. Innerhalb der Lymphfollikel lassen sich verschiedene Bereiche unterscheiden. Es gibt einen peripheren Bereich mit hoher Proliferationsrate, entsprechend der dunklen Zone der Lymphfollikel in den Lymphknoten, einen zentralen Bereich mit geringerer Proliferationsrate, entsprechend der hellen Zone der Lymphfollikel in den Lymphknoten, und eine zelldichtere Corona aus kleinen Lymphozyten, entsprechend der Mantelzone der Lymphfollikel in den Lymphknoten. Während im peripheren Bereich vorwiegend die Lymphozytenproliferation stattfindet, ist der zentrale Bereich zusätzlich auch für die Selektion antigenspezischer, hochaffiner B-Lymphozyten von Bedeutung (CARLSON u. OWEN 1987). 2.2.1.2.2. Interfollikularzone Das lymphatische Gewebe zwischen den Lymphfollikeln wird als Interfollikularzone bezeichnet. Die Interfollikularzonen stellen T-Zellareale dar, in denen TH-Zellen deutlich überwiegen (CARLSON et al. 1985; PARSONS et al. 1989). Weiterhin sind B-Lymphozyten, interdigitierende Zellen und Makrophagen zu finden. Die Interfollikularzonen stellen den Bereich dar, in dem B- und T-Lymphozyten in die schleimhautassoziierten Lymphknötchen einwandern. Diese Einwanderung geschieht durch Bindung an Rezeptoren in den „high endothelial venules“ (ABE u. ITO 1977), die durch ein pflastersteinartiges Endothel gekennzeichnet sind (MAMAGUCHI u. SCHOEFL 1983). 2.2.1.2.3. Domes/subepithelialer Bereich Oberhalb der Lymphfollikel der PP befindet sich die zellreiche Domregion. Domes sind laut TORRES-MEDINA (1981) Projektionen der Follikel ins Darmlumen. Der Name leitet sich von ihrer zylindrischen bis stumpfkegeligen Form ab (ABE u. ITO 1977; TORRES-MEDINA 1981). In den Domes befindet sich eine Mischung aus T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (PABST 1987). Das Epithel im Bereich der Domes wird als follikelassoziiertes Epithel bezeichnet (s. 2.2.1.2.4.). Der subepitheliale Bereich der LGK zeigt Besonderheiten, da LGC dadurch gekennzeichnet sind, dass sich Epithel von der Oberfläche in das Lymphgewebe einsenkt (GRAU u. WALTER 1958). Literaturübersicht 11 Beim Schwein ziehen mehrere Epithelschläuche von der Oberfläche zwischen die in der Submukosa gelegenen Lymphfollikel (BISWAL et al. 1953; MORFITT u. POHLENZ 1989). 2.2.1.2.4. Das follikelassozierte Epithel (FAE) Das Epithel im Bereich der Domes/des subepithelialen Bereichs wird als FAE bezeichnet (BOCKMAN u. COOPER 1973). Das FAE weist folgende morphologische Besonderheiten auf gegenüber dem absorptiven Epithel des Darmes: a) Im FAE ist die Anzahl an Becherzellen im Vergleich zum absorptiven Epithel vermindert (DOUGHRI et al. 1972; BOCKMANN u. COOPER 1973; OWEN u. NEMANIC 1978; CHU et al. 1979; TORRES-MEDINA 1981). b) Zwischen den hochprismatischen enteroabsorptiven Epithelzellen liegen M-Zellen, wobei das „M“ für „microfold bearing“ oder „membranous“ steht (OWEN u. JONES 1974; OWEN 1977). c) Es sind zahlreiche intraepitheliale Lymphozyten vorhanden (GEBERT et al. 1993). Die für das FAE charakteristischen M-Zellen besitzen eine unregelmäßig gefaltete luminale Plasmamembran und ein unvollkommen ausgebildetes Schlussleistennetz. Durch die zahlreichen in ihr Zytoplasma eingestülpten intraepithelialen Zellen ist von den M-Zellen häufig nur eine dünne apikale Zytoplasmamembran zu erkennen, wodurch diese Zelle ihren Namen erhalten hat (OWEN u. JONES 1974; Review bei: WOLF u. BYE 1984; EGBERTS et al. 1985). Die MZellen besitzen keinen Mikrovillus-Saum wie die enteroabsorptiven Epithelzellen sondern kurze Mikrofalten (LANDSWERK 1981b; WOLF u. BYE 1984). Sie sind durch „tight junctions“ und Desmosomen mit den angrenzenden Epithelzellen verbunden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Anzahl und Verteilung der M-Zellen im FAE bei verschiedenen Spezies und von Lokalisation zu Lokalisation unterschiedlich ist (WOLF u. BYE 1984; HOGENESCH u. FELSBURG 1990). Im FAE findet sich regelmäßig ein hoher Anteil an B-Lymphozyten, während es sich bei den intraepithelialen Zellen im Zottenepithel überwiegend um TS/C-Zellen handelt (BHALLA u. OWEN 1983; ERMARK u. OWEN 1986; RELL et al. 1987; JARRY et al. 1989; PRESS et al. 1991). 12 Literaturübersicht 2.2.2. Efferenter Anteil des Darmschleimhautimmunsystems 2.2.2.1. Plasmazellen Im Darm von neugeborenen Ferkeln kommen Ig-enthaltende Zellen selten oder gar nicht vor (BROWN u. BOURNE 1976b; BUTLER et al. 1981; BIANCHI et al. 1992). Bereits 6 bis 8 Tage nach der Geburt ist in der Lamina propria eine signifikante Anzahl an IgA- und IgM- enthaltenden Zellen zu finden, während IgG-enthaltende Zellen erst später vorkommen. In den ersten 4 Lebenswochen überwiegen die IgM-enthaltenden Zellen. BROWN und BOURNE (1976b) fanden einen Anstieg von IgA+Lymphozyten in der Lamina propria vom 6 Tag (20 pro Flächeneinheit) bis zum Alter von 28 Tagen (264 pro Flächeneinheit). Danach gab es keine großen Veränderungen mehr. Beim adulten Schwein überwiegen in der Lamina propria mit 90 % die IgA+Plasmazellen (BROWN u. BOURNE 1976b; ALLEN u. PORTER 1977; BUTLER et al. 1981; BIANCHI et al. 1992). Die höchste Dichte an IgA+- und IgM+Plasmazellen findet sich im Dünn- und Dickdarm beim Schwein in der Lamina propria zwischen den Krypten. In der Kryptregion des Dünndarms kommen beim Schwein 10fach mehr IgA+- und IgM+Plasmazellen vor als zwischen den Krypten des Dickdarms. IgA und IgM wird von den Plasmazellen abgegeben, bindet an den Polyimmunglobulinrezeptor (PolyIgRez.) an der basolateralen Seite der Enterozyten und Becherzellen, der im Kryptbereich exprimiert wird, und wird durch die Enterozyten und Becherzellen hindurch ins Darmlumen transportiert. In den Kryptepithelien des Schweines lassen sich dementsprechend IgA und IgM nachweisen (ALLEN u. PORTER 1970; VAERMAN 1970; ALLEN u. PORTER 1973; BROWN u. BOURNE 1976a; BUTLER et al. 1981; ROTHKÖTTER et al. 1989). IgA wird nicht sofort ins Darmlumen abgegeben, sondern bleibt zunächst an die luminale Oberfläche der Enterozyten gebunden (GELZAYD et al. 1968). Daher ist eine intensive Markierung für IgA und IgM im apikalen Zytoplasma der Kryptepithelzellen zu finden (ALLEN u. PORTER 1973). Die ins Darmlumen sezernierten Immunglobuline sind besonders wichtig für den Schutz von Schleimhautoberflächen. Erreger, gegen die der Körper Antikörper besitzt, werden von Substanzen im Schleim, die Rezeptoren auf Enterozyten initiieren und von proteaseresistenten Immunglobulinen, bes. sekretorischem IgA und IgM gebunden (FORSTNER 1978; MCNABB u. TOMASI 1981; ALLEN et al. 1990). Literaturübersicht 13 2.2.2.2. CD4+T-Lymphozyten Die T-Lymphozyten der Lamina propria sind hochspezialisierte Effektorzellen (ZEITZ et al. 1988). Bei Schwein, Mensch und Rind überwiegen in der Lamina propria TH-Zellen (CERFBENSUSSAN et al. 1983; SELBY et al. 1983; HIRATA et al. 1986; MATSUEDA et al. 1991; RÖTHKÖTTER et al. 1991). Es sind altersabhängige Schwankungen zu beobachten. Bei der Zählung der T-Lymphozytensubpopulationen beim Schwein war ein Anstieg der CD2+Zellen vom 1. Lebenstag bis zum 40. Lebenstag von 100/mm2 auf 1500/mm2 zu finden Vor dem 5. Lebenstag exprimierten diese CD2+Zellen weder CD4 noch CD8. Vom 12. Lebenstag an war die Anzahl an CD4+ und CD8+Zellen mit der Anzahl von CD2 vergleichbar (ROTHKÖTTER et al. 1994). Ein Fehlen des Anstieges an CD4+- und CD8+Zellen wurde bei keimfrei gehaltenen Tieren beobachtet. Obwohl Nahrungsantigene vorhanden waren, verhinderte das Fehlen an mikrobiologischen Stimuli den Anstieg der reifen T-Lymphozytensubpopulation. Die Untersuchungen humaner Lamina propria T-Lymphozyten weisen diese als aktivierte Zellen aus (SELBY et al. 1983), die außerdem Marker exprimieren, die typisch sind für Gedächtniszellen (ZEITZ et al. 1988; SCHIEFERDECKER et al. 1990). SELBY und Mitarbeiter (1983) fanden durch Immunmarkierungen an isolierten Lymphozyten aus der Dünndarmschleimhaut von Kälbern heraus, dass es sich auch beim Rind bei den TH-Zellen zu 95% um Gedächtniszellen handelt. Aktivierte TH-Zellen produzieren viele Zytokine, die andere Zellen rekrutieren und aktivieren können (CROOK 1990). Murine TH-Zellen können anhand ihrer Zytokinproduktion in zwei Gruppen eingeteilt werden: TH1- und TH2-Zellen (MOSMANN et al. 1986a, 1986b; CHERWINSKI et al. 1997). Die TH1-Zellen sind primär für die zellvermittelte Immunität zuständig. Diese wird von Interferon gamma (IFNγ) dominiert. Die TH2-Zellen sind zuständig für die Antikörper-vermittelte Immunität, die v.a. von IL 4 dominiert wird (MOSMANN u. COFFMAN 1989). In der Lamina propria des Schweines überwiegen die TH-Zellen (ROTHKÖTTER et al. 1991). Durch die Lymphozyten der Schleimhaut wird auch ein regulativer Einfluss ausgeübt auf Schleimhautwachstum und Transformation (WALKER 1984). MCDONALD u. SPENCER 1988 fanden nach in vivo Aktivierung der Darmschleimhautlymphphozyten mit einem Mitogen eine deutliche Krypthyperplasie und Zottenatrophie. 14 Literaturübersicht 2.2.2.3. Intraepitheliale Lymphozyten Zwischen den Enterozyten des Darmepithels sind Lymphozyten zu finden, die als intraepitheliale Lymphozyten (IEL) bezeichnet werden. Bis zu 15% aller Zellen im Darmepithel von Säugetieren sind IEL, und damit ist das Darmepithel das größte lymphoide Organ des Körpers (MOWAT 1987). IEL stehen in engem Kontakt zu Epithelzellen, ohne jedoch Desmosomen oder „tightjunctions“ mit ihnen zu bilden (CERF-BENSUSSAN et al. 1983; DOBBINS 1986). IEL wandern aus der Lamina propria durch die Basalmembran in das Epithel ein (MARSH 1975). Beim Schwein erhöht sich die Anzahl an IEL von 2,6 pro 100 Enterozyten am 1. Lebenstag auf 30 pro 100 Enterozyten nach 2 Monaten (ROTHKÖTTER et al. 1999). Bei keimfrei gehaltenen Schweinen lag die Anzahl wesentlich darunter: 2,28 IEL pro 100 Enterozyten im 1. Monat und 5,75 im 2. Monat (BARMAN et al. 1997). Die Anzahl an IEL war bei 45 Tage alten keimfreien Schweinen ähnlich der Situation wie in 5 Tage alten konventionell gehaltenen Tieren. Die Autoren schlossen hieraus, dass das Fehlen von Mikroorganismen im Darminhalt das Ansteigen von IEL verhindert. Auch bei anderen Spezies konnte gezeigt werden, dass die Art und Menge an luminalem Antigen die Anzahl an IEL beeinflusst: Antigene im Darmlumen führen zu einer Erhöhung der Anzahl an IEL bei der Maus (GLAISTER 1973), beim Kaninchen, beim Huhn und bei der Ente (GUAOXIONG u. XIAOPING 1991). Untersucht wurden Kaninchen, die mit Monensin, bakterienfreie Kaninchen, kommerzielle Kaninchen, Hühner, die mit Eimeria tenella infiziert wurden, Enten, die mit Kokkzidien infiziert wurden und Hühner, die über den Gastrointestinaltrakt mit NEWCASTLE disease Vakzine behandelt wurden. In den ersten Tagen nach Antigenkontakt steigt die Zahl an IEL bei Lämmern deutlich an (REYNOLDS u. MORRIS 1983; PRESS et al. 1991). ROTHKÖTTER und Mitarbeiter (1994) fanden im Dünndarm von 5 Tage alten Schweinen bei der Untersuchung der IEL 20 % CD8+, 7 % CD4+ und 60 % CD2+-Zellen. Bei 9 Monate alten Tieren exprimierten dagegen nur sehr wenig der CD2+ IEL kein CD4 oder CD8. In der Fraktion der IEL finden sich B-Lymphozyten nur zu einem geringen Teil (NAGI u. BABINK 1987; CLOUGH u. DEAN 1988). Bei der Maus bestehen die IEL zu 40 % aus Zellen, die nicht im Thymus selektiert wurden, und zu 60 % aus Zellen aus dem Thymus. Die IEL, die nicht im Thymus selektiert wurden, sind potentiell autoreaktiv und scheinen bei Autoimmunerkrankungen bedeutsam zu sein (ROCHA et al. 1992). Literaturübersicht 15 GUY-GRAND und Mitarbeiter (1978) zeigten bei der Maus eine geringe Mitoserate bei den IEL. Die IEL des Schweines proliferieren in situ, wie von ROTHKÖTTER und Mitarbeitern (1999) durch die Aufnahme von Bromodeoxyuridine (BrdU) gezeigt werden konnte Funktionell handelt es sich bei den IEL zum größten Teil um zytotoxische Zellen und Suppressorzellen (CERF-BENSUSSAN u. GUY-GRANT 1991). In vitro entfalten die IEL zytotoxische Aktivität, welche auf Perforin zurückzuführen ist, welches sich in den Granula der IEL befindet (GUY-GRAND et al. 1991). Isolierte IEL aus dem Huhn zeigen gegenüber Tumorzellen funktionelle Eigenschaften von natürlichen Killerzellen (CHAY u. LILLEHOJ 1988). Aktivierte IEL beeinflussen das Wachstum von Epithelzellen (CERF-BENSUSSAN et al. 1984). 16 Literaturübersicht 2.3. Differenzierungsantigene des Schweines Differenzierungsantigene, die auf humanen Lymphozytenpopulationen exprimiert werden, erhalten eine „cluster of differentiation“ (CD)-Nummer, wenn sie zumindest von zwei monoklonalen Antikörpern (mAK) erkannt werden und ihr Molekulargewicht bekannt ist (BODMER et al. 1984; SCHLOSSMANN et al. 1994). Analog dazu werden die Differenzierungsantigene des Schweines, die mit den entsprechenden humanen CD in diesen Eigenschaften weitgehend übereinstimmen, benannt (LUNNEY u. PESCOVITZ 1988). Die SWC (swine leucocyte workshop cluster)-Bezeichnung für die Oberflächenantigene wird angewendet, wenn es sich um Oberflächenantigene handelt, die keine Analogien zu den humanen CDMolekülen aufweisen (LUNNEY 1993; BOEKER et al. 1999). Im folgenden sollen die porzinen Differenzierungsantigene, deren Verteilung in dieser Arbeit untersucht wurde, erörtert werden. Tab. 1: T-Lymphozytensubpopulationen beim Schwein Expression von T-Zell- Vorkommen im Rezeptor CD6 CD2 CD4 CD8 86D Lymphgewebe - - + - low*1 - +/++ 2 α/β γ/δ + + - high* - ++ + + + - - ++ 1 + + + low* - ++ - + - - + - - + - - - ++ - - - - + - *1 CD8 low = natürliche Killerzellen *2 CD8 high = zytotoxische T-Lymphozyten Literaturübersicht 17 2.3.1. CD6 Antigen Da weder auf natürlichen Killerzellen noch auf der Fraktion der CD4-CD8- T-Zellrezeptor (TcR) γδ exprimierenden T-Lymphozyten das CD6-Antigen coexprimiert wird, stellt der mAk a38b2 derzeit den spezifischsten mAK für die Detektion der TcR αβ-T-Lymphozyten dar (SAALMÜLLER et al. 1994). Aufgrund durchflußzytometrischer Analysen und Vergleich der Daten anderer Tierspezies konnte das Antigen, das mit dem mAK a38b2 auf porzinen T-Lymphozyten nachgewiesen wurde, als CD6 Analog definiert werden (BERNARD und BOUMSEL 1984; YSSEL et al. 1987; BALDWIN et al.1988; LETESSON u. BENSAID 1991; SAALMÜLLER et al. 1994). Der mAK a38b2 reagiert in hohem Maße T-Zell-spezifisch und zeigt weder Reaktivität mit B-Zellen noch Zellen der myeloischen Linie. Im Thymus exprimieren etwa 95% der T-Lymphozyten CD6 außer den CD4-CD8-T-Lymphozyten (1,5 %). In der Peripherie findet man CD6 auf 39-76% der TZellen des peripheren Blutes, 53-70% der T-Zellen in der Milz und 84-95% der T-Zellen in den Lymphknoten. Alle CD4+T-Lymphozyten coexprimieren auch das CD6 Antigen (s. Tab. 1). Die Subpopulation der CD4-CD8+T-Zellen lässt sich aufgrund der Expression von CD6 in zwei weitere Untergruppen gliedern: 1. die Fraktion der CD4-CD8+T-Zellen mit hoher Expression von CD8, die gleichzeitig CD6 coexprimiert und 2. die Fraktion der CD4-CD8+T-Zellen mit niedriger Expression von CD8, die kein CD6 exprimiert. 2.3.2. CD4 Antigen Porzine CD4+T-Lymphozyten sind wie bei Mensch und Ratte zum einen beteiligt an der Antwort auf MHC-gebundene Antigene, zum anderen fungieren sie mit ihren Zytokinen als Helfer bei der Antikörperproduktion (LUNNEY u. PESCOVITZ 1988). Während bei den meisten Spezies TLymphozyten außerhalb des Thymus entweder CD4 oder CD8 exprimieren, treten beim Schwein physiologischerweise doppeltexprimierende CD4+CD8+T-Lymphozyten auf. Hierauf wird unter 2.3.4. näher eingegangen. Entwickelt wurden bisher vier Antikörper, die mit CD4 des Schweines reagieren und die wahrscheinlich alle dasselbe oder ein eng verwandtes Epitop auf CD4 erkennen (PESCOVITZ et 18 Literaturübersicht al. 1994a). Mit dem in der vorliegenden Untersuchung verwendeten mAK 74-12-4 reagieren im peripheren Blut 20-40 % der mononukleären Zellen und 30-70 % der T-Lymphozyten. Im Thymus reagieren mit dem mAK 74-12-4 fast alle kortikalen Thymozyten, aber nur 20-30 % der medullären Thymozyten (LUNNEY u. PESCOVITZ 1988). THIELKE und Mitarbeiter (1999) fanden bei durchflußzytometrischen Untersuchungen in der intestinalen Lymphe 39,5 % und im Blut 25,8 % CD4+ Zellen. 2.3.3. CD8 Antigen Funktionelle Analysen, die von PESCOVITZ und Mitarbeitern (1984) und JONJÌC und KOSZINOWSKI (1984) durchgeführt wurden, weisen darauf hin, dass auch beim Schwein die CD8+T-Lymphozyten zytotoxisch wirken und eine Rolle bei der T-Zell-vermittelten Zytotoxizität spielen. Sechs mAKs wurden bislang entwickelt, die gegen das porzine CD8 Antigen gerichtet sind. Sie erkennen zwei verschiedene Epitope (PESCOVITZ et al. 1994b). Mittels durchflußzytometrischer Analysen mit den mAK 76-2-11, 295/33 und 122/28 konnte gezeigt werden, dass 24-38 % der Lymphozyten des peripheren Blutes und 40-60 % der T-Zellfraktion CD8 Antigen exprimieren (JONÍC und KOSZINOWSKI 1984; PESCOVITZ et al. 1984). THIELKE und Mitarbeiter (1999) fanden mittels durchflußzytometrischer Untersuchung in der intestinalen Lymphe 30,2 % CD8+ Zellen und im Blut 31,1 %. 2.3.4. Simultane Expression von CD4 und CD8 Antigen Generell gilt für die Entwicklung der T-Lymphozyten, dass sich während der Ontogenese des Thymus CD4-CD8-Vorläuferzellen zu CD4+CD8+Thymozyten differenzieren, die im Laufe einer weiteren Differenzierung entweder das CD4 oder das CD8 Antigen verlieren und sich somit zu den ausgereiften CD4-CD8+- oder CD4+CD8-Phänotypen entwickeln (REINHERZ u. SCHLOSSMAN 1980; REINHERZ et al. 1980). Daher werden beim Menschen und bei der Maus außerhalb des Thymus fast ausschließlich entweder CD4 oder CD8 auf den T-Lymphozyten exprimiert (REINHERZ u. SCHLOSSMAN 1980; LANIER et al. 1986). Weniger als 3 % doppelt positive T-Lymphozyten sind im peripheren Blut bei gesunden Menschen zu finden (ZUCKERMANN 1999). Literaturübersicht 19 PESCOVITZ und Mitarbeiter (1985) und SAALMÜLLER und Mitarbeiter (1987b) konnten mittels durchflußzytometrischer Analysen mit den mAKs, die gegen das CD4 und CD8 Antigen des Schweines gerichtet sind, zeigen, dass beim Schwein in der Peripherie bis zu 60 % doppelt exprimierende T-Lymphozyten vorkommen (s. Tab. 1). Diese Zellen sind vom CD4+CD8lowPhenotyp, denen das CD1-Glykoprotein fehlt (SAALMÜLLER et al. 1989, PESCOVITZ et al. 1990), die aber CD3, das charakteristisch ist für reife T-Lymphozyten, exprimieren (YANG u. PARKHOUSE 1996). THIELKE und Mitarbeiter (1999) fanden durch doppelte Immunfluoreszenzfärbung bei 4,8 % der Zellen in der intestinalen Lymphe und bei 8,8 % der Zellen im Blut die simultane Expression von CD4 und CD8. Es gibt verschiedene Hypothesen über die Entstehung und Funktion der doppelt exprimierenden T-Lymphozyten. Eine Möglichkeit besteht nach SAALMÜLLER und Mitarbeitern (1987b) darin, dass die doppelt positiven T-Lymphozyten des Schweines unreife Vorläuferzellen darstellen, die den Thymus ohne weitere Differenzierung verlassen haben. Diese Hypothese wurde sowohl durch SAALMÜLLER und Mitarbeiter (1989) als auch PESCOVITZ und Mitarbeiter (1990) widerlegt. Beide konnten zeigen, dass kortikale Thymozyten das CD4 und CD8 Antigen simultan exprimieren und dazu noch das CD1 Antigen. Auf peripheren doppelt positiven T-Zellen konnte das CD1 Antigen aber nie nachgewiesen werden. Eine weitere Möglichkeit ist, dass es sich bei diesen Zellen um Gedächtnis-T-Helferzellen handelt, die das CD8 Antigen nach vorheriger Sensibilisierung erhalten, nach Rückbildung zu kleinen T-Lymphozyten aber nicht wieder verloren haben (SAALMÜLLER et al. 1987b). Schweine wurden mit 8-10 Wochen thymektomiert und zeigten danach dennoch einen Anstieg von CD4+CD8+T-Lymphozyten im peripheren Blut (ZUCKERMANN u. HUSMANN 1996b). Dieses deutet darauf hin, dass diese Subpopulation nicht durch das Vorhandensein des Thymus beeinflusst wird. BEVAN und Mitarbeiter (1986) brachten die doppelte Expression von CD4 und 8 mit Aktivierung dieser Zellen in Verbindung, da beim Menschen, die in der Peripherie vereinzelt vorkommenden doppelt positiven T-Lymphozyten in aktiviertem Zustand vorliegen (BLUE et al. 1985) und manche CD4+CD8-T-Lymphozyten nach in vitro Aktivierung CD8 exprimieren (PATEL et al. 1989; SAALMÜLLER et al. 1989). Die Untersuchung des Aktivierungszustandes der doppelt exprimierenden peripheren T-Lymphozyten des Schweines zeigte, dass sie nicht aktiviert sind, da sie zusätzlich noch das Differenzierungsantigen 8/1 exprimieren 20 Literaturübersicht (SAALMÜLLER et al. 1987b), ein Antigen, dessen Expression generell nach einer Aktivierung deutlich abnimmt (SAALMÜLLER et al. 1987a). PESCOVITZ und Mitarbeiter (1994b) zeigten, dass es sich bei diesen Zellen um Memory-THelferzellen handelt, die durch Vakzination induziert werden können (OBER et al. 1998). Es wird diskutiert, ob das CD8-Molekül in den CD4+Zellen die Bindung von T-Zellen an ihr Ziel vergrößert (ZUCKERMANN u. HUSMANN 1996b). Die Mehrheit CD4+CD8+T-Lymphozyten im peripheren Blut des Schweines exprimieren viel CD29, welches charakteristisch ist für humane (SANDERS et al. 1988) und Schweine(ZUCKERMANN u. HUSMANN 1996a) Memoryzellen. Die Anzahl dieser Zellen steigt im Alter (ZUCKERMANN u. HUSMANN 1996a), was dafür spricht, dass es sich um Memory-TH-Zellen handelt. Bei neugeborenen Schweinen finden sich so gut wie keine CD4+CD8+T-Lymphozyten in der Tonsille und den Peyerschen Platten. Bei 5 Monate alten Tieren repräsentieren diese Zellen schon ein Drittel der CD4 und/oder CD8 positiven Zellen in diesen sekundären lymphatischen Organen (ZUCKERMANN u. GASKINS 1996). Dieser Anstieg ist durch das Vorhandensein von Antigenstimulation zu erklären, sowie durch virale oder bakterielle Infektion (ZUCKERMANN 1999). Memory-TH-Zellen haben die Fähigkeit, auf Antigene durch Produktion von Zytokinen, wie z.B. IFNγ, zu reagieren und so den B-Lymphozyten zu helfen, Antikörper zu produzieren. CD4+CD8+T-Lymphozyten von Pseudowutvirus immunisierten Schweinen produzieren viel IFNγ als Antwort auf das virale Antigen, mehr als die CD4+CD8-T-Lymphozyten und die CD4-CD8+TLymphozyten (ZUCKERMANN u. HUSMANN 1996b; ZUCKERMANN 1999). Das CD8 Molekül existiert als dimeres Membranglykoprotein, zusammengesetzt aus zwei Untereinheiten, entweder als Homodimer mit zwei α-Ketten oder als Heterodimer mit einer αund einer β-Kette. Diese sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Die CD8+ cytotoxischen T-Lymphozyten weisen das CD8αβ-Heterodimer auf, während die CD4+CD8+TLymphozyten nur als CD8αα-Homodimer vorliegen (ZUCKERMANN 1999). 2.3.5. CD4-CD8-T-Lymphozyten (γδ-T-Lymphozyten) Die Funktion der γδ-T-Lymphozyten ist noch weitgehend unbekannt. MAC320+γδ-T-Lymphozyten zeigen sich unempfindlich für Mitogen (OUTERIDGE et al. 1982) und zeigen keine natürliche Killerzellaktivität (DUNCAN et al. 1989). Es besteht die Vermutung, dass diese Zellen am Schutz gegen Infektionen an äußeren und inneren Oberflächen beteiligt sind (JANEWAY Literaturübersicht 21 1988). BORST und Mitarbeiter (1987) wiesen bei Untergruppen der γδ-T-Lymphozyten die Fähigkeit zur Zellysis nach. WHYTE und Mitarbeiter (1994) fanden die Fraktion der MAC319+γδ-T-Lymphozyten vermehrt bei einigen Formen der Dermatitis vor. Auch bei mehreren Autoimmunkrankheiten, sowie bei chronisch verlaufenden bakteriell und Protozoen bedingten Erkrankungen scheinen γδ-T-Lymphozyten involviert zu sein (ALLISON u. HAVRAN 1991; DOHERTY et al. 1992). BINNS und Mitarbeiter (1992) stellten die γδ-T-Lymphozyten des Schweines erstmals 1985 mit dem mAK MAC 320 aus der Ratte eindeutig dar. Außerdem gelangen SAALMÜLLER und Mitarbeitern (1990) und BINNS und Mitarbeitern (1992) die Darstellung einer 86D+ Untergruppe mittels des mAK MAC319. Mit den mAks MAC 320 (SWC6) und 86D ist es möglich, funktionell unterschiedliche γδ-T-Lymphozytensubpopulationen darzustellen. Der MAC 320 erkennt γδ-TLymphozyten, die zusätzlich weder CD2, noch CD8 exprimieren (BINNS et al. 1992; BINNS 1994; DAVIS et al. 1998) (s.Tab. 1). Beim Schwein sind die beiden 86D+Untergruppen sehr selten und kommen im lymphatischen Gewebe fast nicht vor. Die beiden 86D-Untergruppen sind annähernd gleichmäßig auf die Blutbahn und das lymphatische Gewebe verteilt und machen den Hauptteil der im Lymphgewebe vorkommenden CD2-CD4-CD8-T-Lymphozytenfraktion aus (REDDEHASE et al. 1991). Beim Schwein gibt es einen großen Pool an peripheren γδ-T-Lymphozyten, die aufgrund der zusätzlichen Expression weiterer CD Antigene (CD2, CD8) in verschiedene Subpopulationen unterteilt werden können, die beide im lymphatischen Gewebe vorkommen (SAALMÜLLER et al. 1989). In der Milz und den Lymphknoten akkumulieren die CD2+CD4-CD8-T-Lymphozyten, während sie im peripheren Blut selten angetroffen werden. Dieses könnte bedeuten, dass dem CD2 Antigen eine helfende Funktion beim „homing“ zukommt, die zumindest beim Schwein aber nicht essentiell ist (SAALMÜLLER et al. 1989). Die γδ-T-Lymphozyten machen nach durchflußzytometrischen Analysen im porzinen Thymus 19 %, im peripheren Blut 15 % und in der Milz 63 % aus. THIELKE und Mitarbeiter (1999) fanden mittels doppelter Immunfluoreszenzfärbung in der intestinalen Lymphe 10 % und im Blut 27,9 % γδ-T-Lymphozyten. Beachtliche Populationsanteile werden in den mesenterialen Lymphknoten und den Tonsillen beschrieben (SAALMÜLLER et al. 1987b). BINNS (1994) konnte zeigen, dass die Anzahl der MAC320+γ/δ-T-Lymphozyten nach einer Thymektomie innerhalb von 5 Wochen deutlich abnimmt; dieses deutet auf ihre Abstammung aus dem Thymus hin. 22 Literaturübersicht 2.4. Probiotika Bei den Substanzen, die in dieser Untersuchung bezüglich ihrer Wirkung auf das DSIS getestet wurden, handelt es sich um Probiotika. Daher soll im folgenden ein Überblick über die Definition der Probiotika mit Abgrenzung gegenüber Prebiotika und Symbiotika, das Einsatzgebiet der Probiotika und Erkenntnisse zur Wirkungsweise der verwendeten Probiotika, Saccharomyces boulardii (S.b.) und Bacillus cereus (B.c.), gegeben werden. 2.4.1. Definitionen 2.4.1.1. Probiotika Mit dem Begriff Probiotikum bezeichneten LILLEY und STILWELL (1965) eine Substanz des Ciliaten Colpidium campylum, die das Wachstum eines anderen Protozoen stimuliert. Diese Definition ist für das heutige Verständnis zu eng gefasst. Die derzeit allgemein akzeptierte Definition stammt von FULLER (1989). Sie lautet: „Ein Probiotikum ist ein lebender mikrobieller Futterzusatz, der eine vorteilhafte Wirkung auf das Wirtstier hat, indem er das intestinale mikrobielle Gleichgewicht verbessert.“ Um die Lebensfähigkeit der probiotischen Keime herauszustellen, vermeidet FULLER (1989) in seiner Begriffsbestimmung das Wort Substanz. In den letzten Jahren gibt es mehrere Ansätze diese Definition zu präzisieren. KAHRS (1991a) bezeichnet als Probiotika „Stoffe zur intestinalen Milieustabilisierung mit sekundärer Wachstumsoder Entwicklungsförderung“. In der Humanmedizin wird der Begriff „Biotherapeutikum“ benutzt. ANNON (1999) bezeichnet Probiotika als „Bioregulatoren und Darmflorastabilisatoren“ im Hinblick auf ihre Wirkungsweise. Der offizielle Terminus der Europäischen Gemeinschaft für Probiotika ist „ecological health control product (EHCP)“. In den USA müssen Produkte, die Probiotika enthalten, laut Vorschrift der Food and Drug Administration mit „direct-fed microbial“ gekennzeichnet werden (STAVRIC und KORNEGAY 1995). 2.4.1.2. Prebiotika Prebiotika sind laut GIBSON und MCCARTNEY (1998) „Substanzen, deren Verabreichung bestimmte erwünschte Mikroorganismengruppen zu Lasten pathogener Keime fördern sollen“. Dadurch soll die Gesundheit des Wirtes verbessert werden (GIBSON und ROBERFROID 1995). Literaturübersicht 23 Es sind keine lebenden Organismen, sondern unverdauliche Kohlenhydrate (Oligosaccharide), wie z.B. Inulin oder Oligofructose, die zu einer Erhöhung der Zahl an Bifidobakterien im Colon führen. Diese Stoffe können nur durch Enzyme von Bakterien verdaut werden, nicht aber durch körpereigene Enzyme (IJI und TIVEY 1998, 1999). 2.4.1.3. Symbiotika Sie stellen eine Kombination aus einem Probiotikum und einem Prebiotikum dar, d.h. sie bestehen aus einem Mikroorganismenstamm und einem von ihm verwertbaren Substrat. Durch die zusätzliche Gabe des Substrates wird das Überleben und das Ansiedeln von lebenden mikrobiellen Nahrungsmittelzusätzen im Magen-Darm-Trakt verbessert und selektiv das Wachstum und der Stoffwechsel einer begrenzten Anzahl an „gesundheitsfördernden“ Bakterienstämmen stimuliert (GIBSON u. ROBERFROID 1995). 2.4.2. Einsatzgebiet von Probiotika Probiotika werden bei der Herstellung von Nahrungs- und Genussmitteln sowie Futtermitteln verwendet und in der Medizin als Therapeutikum und zur Prophylaxe eingesetzt. Ausgewählte Stämme von Saccharomyces cerevisiae (S. cer.) werden als Backhefe und zur Produktion von alkoholischen Getränken genutzt (GEDECK 1991; ANON 1999). Zudem finden Mikroorganismen Anwendung für die Herstellung von Sauerkraut und Sauermilchprodukten, wie Joghurt, Quark und Kefir, sowie von Silage. In der Medizin gibt es einen Trend zum alternativen Einsatz von Probiotika an Stelle von Antibiotika, der durch Resistenzentwicklung, Rückstandsproblematik und Patientenbewusstsein beeinflusst wird. Mit den Probiotika ist es zwar möglich, die Mikroflora des Darmes positiv zu beeinflussen (STAVRIC u. KORNEGAY 1995). Zu bedenken ist dabei allerdings, dass Antibiotika in der Lage sind, schnell pathogene Keime zu eliminieren, die Wirkung der Probiotika dagegen nur auf lange Sicht Erfolg zeigt (HUIS IN´T VELD 1998). 24 Literaturübersicht 2.4.2.1. Tiermedizin 2.4.2.1.1. Landwirtschaftliche Nutztiere Geflügel: Durch die getrennte Haltung von Tieren unterschiedlichen Alters in modernen Haltungsformen ist es für die Küken nicht mehr möglich, den Kot der Elterntiere aufzunehmen und eine normale und stabile Darmflora aufzubauen (BARROW 1992; STAVRIC u. KORNEGAY 1995; JADAMUS et al. 1999). Dadurch entsteht die sogenannte verminderte Kolonisationsresistenz, d.h. eine geringere Widerstandsfähigkeit gegen die Besiedlung mit pathogenen Keimen, wie Salmonellen und Campylobacter (KURZAK et al. 1998; WEBER 2000). Um diesen Mangel auszugleichen, verfütterten NURMI und RANTALA (1973) Darminhalt von erwachsenen Tieren an Broilerküken. Die darauffolgende Applikation von Salmonella infantis führte bei 70-80% der Tiere zu keiner Besiedlung mit dem pathogenen Keim. In der Kontrollgruppe dagegen wurde mindestens eine Lokalisation des Magen-Darmtraktes zu 100% kolonisiert. Auf dieser Beobachtung basiert das Konzept der kompetitiven Exklusion (CE): durch Verabreichung einer Mischung verschiedener Bakterienstämme an Junggeflügel wird eine Besiedlung mit pathogenen Keimen, vor allem Salmonellen und Campylobacter verhindert. Dieses gilt auch heute noch als Möglichkeit zur Reduzierung der Salmonellenprävalenz in Geflügelschlachtkörpern (BLANKENSHIP et al. 1993). Um eine stabile protektive Intestinalflora aufzubauen, eignen sich besonders aus dem Kot adulter Tiere gewonnene undefinierte Mischkulturen (BARROW 1992). Durch den bioregulativen Effekt der Probiotika sollen sich anfallende toxische Stoffwechselprodukte und Krankheitserreger vermindern (GEDEK 1991). Neben undefinierten Mischkulturen wurden einzelne Mikroorganismen oder definierte Mischkulturen auf Wirksamkeit getestet. Laktobazillen zeigen eine inhibierende Wirkung auf Enterobakteriazeen im Geflügel. Lac. salivarius und Lac. delbrueckii delbrueckii-Stämme reduzieren die Anheftung von Salmonella thyphimurium an caecalen Mucus (CRAVEN u. WILLIAMS 1997). Laktobazillen produzieren im Kropf große Mengen an Milchsäure, wodurch es zu einer Absenkung des pH-Wertes kommt und das Wachstum von Escherichia coli (E. coli) verhindert wird (FULLER 1977). KRÜGER und Mitarbeiter (1977) fanden durch Laktobazillen eine erhöhte Eiproduktion bei Legehennen. Bei Masthähnchen konnten durch die Verabfolgung einer Mischung aus Lactobacillus acidphilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Aspergillus oryzae und Torulopsis höhere Tageszunahmen und ein Anstieg der Literaturübersicht 25 Stickstoffretention, sowie eine Abnahme des Serumcholesterinspiegels erreicht werden (MOHAN et al. 1996). Durch die Verfütterung derselben Mischung an Legehennen kam es zu einer vermehrten Eiproduktion, einer Zunahme der Schalendicke und einer Erniedrigung der Dotterund Serumcholesterolkonzentration (MOHAN et al. 1995). Durch Fütterung von S. cer. konnte eine protektive Wirkung gegen die durch Aflatoxinkontamination des Futters bewirkte Leberschädigung bei Broilern erreicht werden (STANLEY et al. 1993). Schwein: Beim Schwein werden probiotische Einzelpräparate, wie Milchsäurebakterien bei Sauen und Ferkeln v.a. in Perioden von verminderter Widerstandsfähigkeit (FOX 1988) und Sporenbildner in der Säuge- und Aufzuchtsperiode (IBEN u. LEIBETSEDER 1989), als Prophylaktika eingesetzt. Die Verabreichung von Lactobacillus- oder Streptococcus faecium-Präparaten hatten keinen Einfluss auf die experimentell induzierte Colienterotoxämie: eine Gruppe von Absetzferkeln, die zwei Tage nach probiotischer Supplementierung mit dem E. coli-Stamm O141 K85 infiziert wurde, zeigte dieselbe Mortalität wie die Kontrollgruppe, die ohne Probiotika geblieben war. Auch zeigte sich kein Unterschied hinsichtlich der klinischen Symptome und der Erregerausscheidung (DECUPERE et al. 1992). Als weiteres werden Probiotika beim Schwein als Leistungsförderer eingesetzt. Bei Läufern wird Bacillus cereus var. caron angewendet, um die Stickstoffretention zu erhöhen. Es kommt dadurch tendenziell zu einer Erhöhung der täglichen Gewichtszunahmen (SCHEUERMANN 1993). Bei derselben Altersgruppe führt S. cer. zu einer Erhöhung der täglichen Futteraufnahme und der Tageszunahme, allerdings nicht signifikant (MATHEW et al. 1998). Nach der Verabfolgung von Lactobacillus acidophilus und fermentum konnte NOVSIAINEN (1991) hinsichtlich dieser Parameter keine Veränderung beobachten. POLLMANN und Mitarbeiter (1980) fanden sogar tendenziell eine Erniedrigung der täglichen Zunahmen nach Gabe von Lactobacillus acidophilus. Keine Veränderungen der postprandialen porto-arteriellen Konzentrationsdifferenzen von Glucose, Galaktose, L-Laktat und Aminstickstoff wurden nach Applikation von B.c. oder einem Gemisch aus Lactobacillus-Arten wie acidophilus, fermentum und brevis gefunden (RYCHEN u. SIMOES NUNES 1995). Nach Gabe des Erdkeimes Sporobacillus P44 kam es zu einer signifikanten Zunahme der Amin-Stickstoff-Absorption (RYCHEN u. SIMOES NUNES 1995). 26 Literaturübersicht Milchkühe: WILLIAMS und Mitarbeiter (1991) und NEWBOLD (1995) fanden nach Applikation von S. cer. sowohl eine Zunahme um bis zu 17% als auch eine Abnahme der Milchleistung um bis zu 6%. Bei den mit S. cer. gefütterten Tieren wurde der Abbau von Cellulose im Vergleich zu den Kontrolltieren verlangsamt. Schafe und Ziegen: Die Abbaurate rohfaserreicher Futtermittel, die in einem Nylonbeutel im Pansen inkubiert wurden, wurde nach Verfütterung von zwei verschiedenen S. cer.-Präparaten untersucht (FLACHOWSKY et al. 1992). Durch den einen Stamm erhöhte sich die Abbaurate, während der andere Stamm keinerlei Einfluss hatte. Bei beiden Stämmen blieben der pH-Wert und die Konzentration flüchtiger Fettsäuren im Pansen unverändert. Kaninchen: Die für das Kaninchen als Futterzusatzstoffe zugelassenen Probiotika sind Bacillus cereus und Sacchromyces cerevisiae (HARTMANN 2000). Durch Toyocerin® (B.c.) verminderte sich die Verlustrate der Jungkaninchen um ein Drittel und es gab um 12% höhere Tageszunahmen bei den Masttieren (KAHRS 1991b). 2.4.2.1.2. Andere Tierspezies Hund und Katze: Bei ihnen werden Probiotika vorwiegend bei Durchfallerkrankungen und zur Stabilisierung der Darmflora eingesetzt. Enterococcus (Ec.) faecium, der bei Hund und Katze die Passage des Gastro-Intestinaltraktes überlebt und sich vermehrt (VORBERG 1994; MOLITOR 1996; ZENTEK et al. 1998), sowie Bacillus subtilis-Sporen (BAROWS u. DEAM 1985) wurden verwendet. Fische: Bei jungen Zahnbrassen (Dentex dentex) verlief die Infektion mit Protozoen günstiger, d.h. die Mortalität war geringer, nach Gabe des Präparates Macrogard®, ein Glukan (EFTHIMIOU 1996). Durch Pseudomonas fluorescens konnten die durch die nachfolgende Exposition mit Vibrio anguillarum verurachten Verluste bei Regenbogenforellen verringert werden (GRAM et al. 1999). Literaturübersicht 27 Ziervögel: EICHINGER-LEIN (1992) untersuchten 29 verschiedene Arten der Ordnung Psittaciformes nach der einmaligen Fütterung eines speziellen Lactobacillus-Stammes und fanden dadurch eine komplette Verdrängung von Enterobacteriazeen im Kot bei 51,7% der untersuchten Vögel. NOGOSSEK (2001) verfütterte an Kanarienvögel verschiedene Pro- und Prebiotika und untersuchte, inwieweit sich dadurch die Ausscheidung eines fakultativ-pathogenen E. coli-Isolates verändert. Die Ausscheidung war bei drei der getesteten Probiotika und bei den Prebiotika etwas geringer als bei der Kontrollgruppe. Die Unterschiede waren statistisch allerdings nicht signifikant. 2.4.2.2. Humanmedizin SPILLMANN (1997) sieht den kommerziellen Einsatz der Probiotika auf zwei Gebieten: zum einen im Lebensmittelsektor zur Herstellung von Milcherzeugnissen und zum anderen im Arzneiund Heilmittelsektor als Antidiarrhoica. Wichtigstes Einsatzgebiet als Arzneimittel ist die Vorbeuge und Behandlung von Durchfallerkrankungen, wie die Reisediarrhöe (Traveler´s Diarrhoe), die Antibiotika-assoziierte Diarrhöe, die Säuglingsenteritis und die Diarrhöe in Zusammenhang mit AIDS (SISSONS 1989; GOLDIN u. GORBACH 1992; KIRCHHELLE et al. 1996; SIEBER 1996; GOLDIN 1998; ROLFE 2000; SANDERS 2000). Zum Einsatz kommen Saccharomyces boulardii, Lactobacillus (Lac.) casei und acidophilus, Bifidobacterium longum und bifidum, sowie Streptococcus thermophilus und Enterococcus (Ec.) faecium. Ein weiteres Einsatzgebiet liegt in der Humanmedizin in der Anwendung von Probiotika zur Senkung des Cholesterinspiegels, wobei der Wirkungsmechanismus nicht geklärt ist. Diese Wirkung wird vor allem nach Gabe von Lactobacillen beobachtet (MONTES u. PUGH 1993; HOLZAPFEL et al. 1998; SANDERS 2000). Studien in Dänemark und den USA sprechen für eine cholesterinsenkende Wirkung von Ec. faecium und Lactobacillus-Species (SIEBER 1996). Diese Wirkung lässt sich auch mit Joghurt beim Kaninchen und beim Menschen erreichen (GOLDIN u. GORBACH 1992). Vor allem die Lactobacillus-Species sollen die Entstehung von Tumoren verhindern (FULLER 1989; GOLDIN u. GORBACH 1992; SPILLMANN 1997; GOLDIN 1998; HOLZAPFEL et al. 1998; KASPER 1998; BRADY et al. 2000; ROLFE 2000; SANDERS 2000). Durch die Gabe der Prebiotika Oligofructose und Inulin, welche zu den Fructooligosacchariden gehören, ließ sich die 28 Literaturübersicht Anzahl an Bifidobakterien im Darm erhöhen und dadurch wirkten sie einer Entstehung von Tumoren entgegen (GIBSON et al. 1995; REDDY 1998). BRADY und Mitarbeiter (2000) fanden einen hemmmenden Effekt auf die Entstehung von Tumoren durch die Gabe von Probiotika (Bifidobakterien) mit oder ohne Zusatz von Prebiotika (Fructooligosaccharide). Ein sicherer Beweis für eine antitumorale Aktivität oder eine Hemmung von Tumoren steht noch aus, es besteht allerdings die Möglichkeit, dass unter bestimmten Bedingungen einige Bakterienstämme in der Lage sind, eine schützende Wirkung aufzubauen, indem sie kanzerogene Substanzen aus der Nahrung binden oder abbauen. 2.4.3. Übersicht über die Wirkungsweise verschiedener Probiotika Der Wirkungsmechanismus der Probiotika ist Gegenstand aktueller Forschung. Folgende Wirkungsmechanismen und Angriffspunkte probiotischer Mikroorganismen werden diskutiert (Übersicht in GÖRKE und LIEBLER-TENORIO, 2001): Wirkung auf (pathogene) Mikroorganismen im Darmlumen: - Konkurrenz um Nährstoffe - Konkurrenz um Bindungsstellen - Agglutination von pathogenen Keimen - Veränderung des intestinalen Milieus - Produktion antimikrobieller Substanzen - Neutralisation von Toxinen Wirkung auf den Wirtsorganismus: - Förderung des unspezifischen Immunsystems - Verstärkung der spezifischen Immunantwort - Beeinflussung der Schleimhautpermeabilität - Beeinflussung von zellulären Transportmechanismen - Anabole Wirkung auf den Gesamtstoffwechsel - Förderung der Schleimhautdifferenzierung. Literaturübersicht 29 2.4.3.1. Wirkung auf (pathogene) Mikroorganismen im Darmlumen Probiotische Mikroorganismen keimen im Intestinaltrakt aus und/oder vermehren sich. Durch ihre Stoffwechselaktivität erreichen sie, dass für nützliche Mikroorganismen ein günstiges Milieu geschaffen wird, welches wiederum ungünstig für bestimmte pathogene Keime sein kann. Dadurch tragen sie zur Stabilisierung der Darmflora bei. NURMI und Mitarbeiter (1992) prägten den Begriff der competitiven Exclusion. Darunter verstehen die Autoren die Konkurrenz der Probiotika um Nährstoffe und Bindungsstellen. Durch die Verabfolgung von Mikroorganismen aus der Darmflora adulter Tiere an junge Tiere wurde deren noch nicht ausgereifte Darmflora ergänzt und stabilisiert, um so den Schutz gegen pathogene Keime zu verbessern. Es kommt zur Verdrängung der unerwünschten Bakterien von den Bindungsstellen durch zahlenmäßigen Überschuss an probiotischen Bakterien (GEDEK 1986; FOX 1988), so dass den pathogenen Keimen der Zutritt zum Darmepithel erschwert bzw. verwehrt wird (FULLER 1989; SISSONS 1989; MONTES u. PUGH 1993; STAVRIC u. KORNEGAY 1995). Außerdem herrscht im Darm eine Konkurrenzsituation um die Nährstoffe, die für das Wachstum sowohl der pathogenen als auch der probiotischen Keime notwendig sind (STAVRIC u. KORNEGAY 1995; GEDEK 1999). Probiotika erhalten auf diese Weise die Eubiose im Darm aufrecht (ROLFE 2000). Einige Probiotika sind in der Lage, bestimmte Enzyme zu bilden, zu aktivieren oder zu hemmen. Lactobazillen produzieren u.a. die Verdauungsenzyme Amylase, Lipase und Protease (MONTES u. PUGH 1993; JIN et al. 1997). Dadurch unterstützen sie die natürlichen Verdauungsvorgänge. Bei der Laktoseintoleranz, einem Mangel an ß-Galaktosidase, werden Probiotika eingesetzt, die dieses Enzym synthetisieren und so die Aufgabe des sonst wirtseigenen Enzyms übernehmen (FULLER 1989; GOLDIN u. GORBACH 1992). Auf der anderen Seite können bestimmte Probiotika Enzyme hemmen (FULLER 1989). Lac. acidophilus senkte die Aktivität von ßGlukuronidase, Nitroreduktase und Azoreduktase bei Mensch und Ratte (GOLDIN u. GORBACH 1992). Dieses Enzym spielt eine Rolle bei der Tumorentstehung. Einige Probiotika sind in der Lage, antimikrobiell wirksame Substanzen zu bilden, so dass andere Keime in ihrem Wachstum gehemmt werden (FULLER 1989, VANBELLE et al. 1990; FULLER 1992). Als hemmende Substanzen wurden organische Säuren, Wasserstoffperoxyd und Bakteriozine gefunden (HAVENAAR et al. 1992; JIN et al. 1997; ROLFE 2000). Durch die Absenkung des pH-Wertes aufgrund der Produktion von organischen Säuren (Milch-, Essig-, Ameisen-, Butter-, Propion- und Benzoesäure sowie andere kurzkettige Fettsäuren) wird vor 30 Literaturübersicht allem für gram-negative Keime ein ungünstiges Milieu geschaffen (FOX 1988; MONTES u. PUGH 1993; STAVRIC u. KORNEGAY 1995; GEDEK 1999). Ein weiteres Wirkungsprinzip der Probiotika liegt in der Neutralisierung von Toxinen entweder durch Bildung bestimmter Substanzen oder durch das Verhindern ihrer Entstehung (SISSONS 1989; VANBELLE et al. 1990; MONTES u. PUGH 1993; JIN et al.1997). Lac. bulgaricus ist in der Lage, die Wirkung eines Neurotoxins von coliformen Keimen bei Schweinen zu neutralisieren (SISSONS 1989). Bestimmte Probiotika, v.a. Lactobazillen sollen in der Lage sein, der Entstehung von Tumoren entgegenzuwirken (SPILLMANN 1997; GOLDIN 1998; HOLZAPFEL et al. 1998; KASPER 1998; FULLER 1989; BRADY et al. 2000; ROLFE 2000; SANDERS 2000). GOLDIN und GORBACH (1992) weisen auf Untersuchungen hin, in denen es durch die Fütterung von Joghurt an erwachsene Mäuse zu einer Reduktion um 28-35% in der Anzahl an EhrlichAscitestumorzellen im Vergleich mit den Kontrollgruppen, die Milch erhalten hatten, kam. L. acidophilus führte bei Ratten zur Verzögerung der Entstehung von Kolontumoren nach Applikation von 1,2-Dimethylhydrazine, einem chemischen Karzinogen. Von MONTES u. PUGH (1993), FULLER (1989) sowie ROLFE (2000) werden folgende Wirkungsmechanismen der Probiotika bei der Hemmung der Tumorentstehung diskutiert: Die Probiotika sollen zum einen die Tumorzellen direkt hemmen und zum anderen Bakterien unterdrücken durch die Enzyme produziert werden, die Karzinogene freisetzen können. Als letzte Möglichkeit erwähnen sie die Zerstörung von Karzinogenen, wie z.B. Nitrosaminen, und von Enzymen, die an der Entstehung der Karzinogene beteiligt sind. 2.4.3.2. Wirkung der Probiotika auf den Wirtsorganismus 2.4.3.2.1. Unterstützung der Reaktionen des unspezifischen Immunsystems Die orale Verabreichung von Lac. casei oder Lac. bulgaricus führte bei Mäusen zu einer erhöhten Phagozytoseaktivität von Peritonealmakrophagen in vitro ab dem zweiten Applikationstag (PERDIGON et al. 1986). Die Autoren fanden außerdem in vivo sowohl nach oraler Gabe, als auch nach intraperitonealer Verabfolgung des Probiotikums eine raschere Clearance des Blutes von injiziierten Kohlepartikeln. Literaturübersicht 2.4.3.2.2. 31 Verstärkung der spezifischen Immunantwort TEJADA-SIMON und Mitarbeiter (1998) fanden bei einem Versuch mit Mäusen, die oral mit Choleratoxin immunisiert wurden, signifikant mehr spezifisches IgA in Serum und Kot, wenn sie zusätzlich zu den traditionellen Joghurtbakterien Lac. bulgaricus und Streptococcus thermophilus weitere Bakterien, wie Lac. acidophilus, Bifidobacterium bifidum und Bifidobacterium infantis erhalten hatten, als wenn nur die Joghurtbildner oder nur Magermilchpulver gegeben wurden. Keinen Unterschied zwischen den behandelten und den Kontrolltieren gab es hinsichtlich des Gehaltes an spezifischem IgG in Serum und Kot. Die Beeinflussung der Schleimhautpermeabilität wurde von WINCKLER und Mitarbeitern (1998) durch die Veränderung des Kurzschlussstromes, welche als Messgröße für alle elektrogenen Transportprozesse gilt, und die Messung der unidirektionalen Fluxraten von Mannit untersucht. Die Ergebnisse sind für S.b. unter dem Punkt 2.4.4.1.4. und für B.c. unter 2.4.4.2.4. beschrieben. Die Beeinflussung von zellulären Transportmechanismen wurde für S.b. und B.c. in der Untersuchung von BREVES und Mitarbeitern (1997) durch die Aufnahme von Glucose und Alanin in jejunale Enterozyten beim Schwein bewiesen. Die Versuchsdurchführung und die Ergebnisse sind unter 2.4.4.1.4. für S.b. und 2.4.4.2.4. für B.c. aufgeführt. Die anabole Wirkung auf den Gesamtstoffwechsel wurde für B.c. anhand des Effektes auf den Glutathionstatus der Leber untersucht (SCHOLE et al. 1994) und ist unter 2.4.4.2.4. beschrieben. Zur Förderung der Schleimhautdifferenzierung untersuchte GÖRKE (2000) die Auswirkung der Applikation von sowohl S.b. als auch B.c. auf die Zottenlänge und die Anzahl an Becherzellen und die Muzinzusammensetzung. Die Ergebnisse sind unter 2.4.4.1.4. für S.b. und unter 2.4.4.2.4. für B.c. aufgeführt. 32 Literaturübersicht 2.4.4. Die verwendeten Probiotika und ihr Einsatzgebiet 2.4.4.1. Saccharomyces boulardii 2.4.4.1.1. Anwendung Saccaromyces boulardii wird in der Humanmedizin therapeutisch bei der Antibiotika-assoziierten Diarrhöe, bei der Diarrhöe nach Fernreisen (Reisediarrhöe), bei der akuten Diarrhöe bei Kleinkindern und bei der Diarrhöe in Zusammenhang mit AIDS eingesetzt. In diesen Einsatzgebieten wurde die Wirksamkeit der Hefe S.b. in klinischen plazebokontrollierten Versuchen nachgewiesen (ELMER et al. 1996). Weiterhin können durch die Gabe von S.b. die Symptome in bestimmten Stadien von Morbus Crohn gemildert werden. Bei mit S.b. behandelten Patienten treten signifikant weniger Residualbeschwerden auf (PLEIN u. HOTZ 1993). Der Vorteil des Einsatzes dieser Hefe als Probiotikum gegenüber einem Bakterium liegt in ihrer Resistenz gegen eventuell zur gleichen Zeit durchgeführter Behandlung mit Antibiotika. Besonders wichtig ist diese Tatsache beim Einsatz der Hefe als Prophylaktikum zur Vermeidung der Antibiotika-assoziierten Diarrhöe. Beim Geflügel konnte durch die Supplementierung von S.b. eine geringere Kolonisierungshäufigkeit des Caecums durch Salmonella typhimurium, nicht aber durch Campylobacter jejuni erreicht werden (LINE et al. 1997, 1998). 2.4.4.1.2. Charakterisierung Die Eigenschaften der Hefe S.b. sind detailliert untersucht. Das Synonym für S.b. ist Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS5926. Der französische Mykologe Boulard, nach dem dieser S.-Stamm benannt wurde, brachte ihn in den 20er Jahren des 20 Jahrhunderts aus Indochina mit nach Europa. Die dortige Bevölkerung nutzte diesen Stamm als Mittel gegen Durchfall, indem sie die mit dieser Hefe bewachsenen Lychee-Schalen aßen (RIECKHOF 1998). Es ist umstritten, ob es sich bei S.b. wirklich um eine eigene Hefeart handelt. Aufgrund der Untersuchung mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus konnten keine genomischen Unterschiede zwischen S.b. und S. cer. (der Bäcker- und Bierhefe) festgestellt werden. Daher wird S.b. als asporogener Stamm von S. cer. betrachtet (MCCOULLOUGH et al. 1998). Die Hersteller der S.b.-Präparate bestehen aber auf der taxonomischen Eigenständigkeit dieser Isolate, und begründen dies mit der fehlenden Sporenbildung und dem Unvermögen, Galactose als Kohlenhydratquelle zu nutzen (MCFARLAND 1996). Literaturübersicht 33 Im allgemeinen sind sowohl S.b. als auch S. cer. apathogen. Es gibt jedoch Fallberichte, in denen von Hefe-Fungämien bei immunsupprimierten Patienten berichtet wird, nachdem sie eine Behandlung mit S.b. erhalten hatten (BASSETTI et al. 1998). Auch ist nach Applikation von S.b. eine Besiedlung des Darmes mit Saccharomyces spp. beschrieben (MILNER et al. 1997). 2.4.4.1.3. Wirkungsweise auf Mikroorganismen im Darmlumen Agglutination von Keimen S.b. ist in der Lage, an der Zellwand einen enteropathogenen Escherichia coli (E.coli)-Stamm und einen Salmonella typhimurium-Stamm zu agglutinieren (GEDEK u. AMSELGRUBER 1990). Man nimmt an, dass dies durch einen mannosehaltigen Rezeptor auf der Zellwand der Hefe geschieht. Produktion antimikrobieller Substanzen S.b. soll antibiotisch wirksame Stoffe gegen gramnegative Keime abgeben (GEDEK 1975), wobei das bei anderen Hefestämmen gefundene Malucidin eine Rolle spielen soll (GEDEK 1987). Es ließ sich bisher nicht beweisen, dass ein solches von S.b. produziertes Antibiotikum in ausreichender Konzentration hergestellt wird, um im Darm eine Wirkung zu entfalten (FRIEDLAND u. SEIFERT 1990). Neutralisation von Toxinen S.b. bindet die Untereinheit B des Choleratoxins an seiner Oberfläche. Dies wird von BRANDAO und Mitarbeitern (1998) als Hinweis auf die Existenz eines Toxinrezeptors auf der Oberfläche der Hefe gedeutet. Im Medium von Kulturen von S.b. fanden CZERUCKA und Mitarbeiter (1994) ein Protein, welches den sekretagogischen Effekt von Choleratoxin, Escherichia (E.) coli-Toxin und Forskolin auf eine Zellkultur verringerte. CASTAGLIUOLO und Mitarbeitern (1996) gelang die Antagonisierung des Toxins A von Clostridium difficile durch eine aus S.b. extrahierte Serumprotease, die in Zellkultur auch das Toxin B von Clostridium difficile neutralisiert (CASTAGLIUOLO et al. 1999). Die Vorinkubation mit S.b. senkte die Menge des Toxins A von Clostridium difficile, die sich an isolierte Membranfragmente aus dem Bürstensaum des Ileums von Ratten heftete. Es kam durch S.b. in vivo zur Verminderung der sonst durch das Toxin A ausgelösten Hypersekretion in Ileum 34 Literaturübersicht und Caecum. Außerdem war der Anstieg der parazellulären Durchlässigkeit des Ileums, nicht aber des Caecums geringer (POTHOULAKIS et al. 1993; IZADNIA et al. 1998). Einfluss auf die Fermentation im Darm BREVES und Mitarbeiter (2000) verfütterten einer Gruppe von Schweinen 5 Tage Clindamycin und der anderen Gruppe 5 Tage Clindamycin und S.b.. Die Gabe von Clindamycin führte zu einem signifikanten Abfall an Produktionsraten von kurzkettigen Fettsäuren im Darm. Dieser Effekt wurde durch die gleichzeitige Gabe von S.b. z.T. kompensiert, indem die Acetat- und Proprionat-Fermentation gesteigert wurde. Dies deutet darauf hin, dass S.b. helfen kann, den Wechsel der mikrobiologischen Fermentation im Darmlumen zu kompensieren, der durch Antibiotikagabe hervorgerufen wird. 2.4.4.1.4. Wirkungen auf den Wirtsorganismus Förderung des unspezifischen Immunsystems PETZOLD u. MÜLLER (1986) zeigten im Chemilumineszenztest, dass die Applikation von S.b. die Phagozytoseaktivität neutrophiler Granulozyten steigert. Hierbei hatten abgetötete Zellen der Hefe einen stärkeren Effekt als lebende. Dieser Effekt auf neutrophile Granulozyten wird vermutlich durch das Polysaccharid ß-1,6-Glucan, einen Bestandteil der Hefezellwand, verursacht (RIGGI u. DI LUZIO 1961). BURGALETA u. GOLDE (1977) konnten zeigen, das dieses Glukosepolymer einen koloniestimulierenden Effekt auf Granulozyten und Makrophagen ausübt. Möglicherweise ist hierdurch auch der Anstieg der Leukozytenzahl beim Menschen nach oraler Verabreichung von lebenden S.b. zu erklären (MACHADO u. CAETANO 1986). Die Autoren fanden außerdem eine erhöhte Erythrozytenzahl und ein Anstieg der Komplementfaktoren im Blut. Verstärkung der spezifischen Immunantwort Durch die orale Verabreichung von S.b. an Ratten kam es zu einem erhöhten Gehalt an sekretorischem IgA im Darmlumen und an sekretorischer Komponente im Darmepithel (BUTS et al. 1990). Nach dreiwöchiger Behandlung von gesunden Freiwilligen mit S.b. wurde eine verstärkte Expression des IL 2-Rezeptors auf CD4+Blutlymphozyten festgestellt. Dies ist als Aktivierung dieser Lymphozytenpopulation zu werten (JAHN et al. 1996). Literaturübersicht 35 Förderung der Schleimhautdifferenzierung Eine höhere Aktivität der Bürstensaumenzyme Laktase, α-Glukosidase und alkalische Phosphatase wurde nach dreiwöchiger Einnahme von S.b. bei gesunden Freiwilligen im Duodenalepithel festgestellt (JAHN et al. 1996). BUTS und Mitarbeiter (1986) stellten eine erhöhte Aktivität von Saccharase, Maltase und Laktase bei Mensch und Ratte im proximalen Jejunum fest. Die Untersuchung der Schleimhautmorphologie ergab nach Gabe von S.b. weder am Übergang zwischen Duodenum und Jejunum beim Menschen noch an verschiedenen Lokalisationen des Jejunums bei der Ratte Veränderungen hinsichtlich der Zottenlänge und Krypttiefe. Auch das Gewicht der isolierten Dünndarmschleimhaut war bei der Ratte nicht signifikant beeinflusst (BUTS et al. 1986). Eine tendenzielle Vergrößerung der Schleimhautoberfläche wurde nach Applikation von S.b. beim Menschen im distalen Duodenum gefunden, wobei diesem Befund die verlängerten Zotten bei gleichbleibender Krypttiefe zu Grunde lag. Dieses war aber nicht signifikant (JAHN et al. 1995). Beim Schwein verursachte S.b. im Jejunum tendenziell längere Zotten (Görke 2000). Im proximalen Jejunum war eine geringere Anzahl an Becherzellen mit neutralen Muzinen zu finden. Die Gesamtbecherzellzahl lag bei den mit S.b. behandelten Tieren im Caecum höher als bei den Kontrolltieren. Als Ursache diskutiert die Autorin eine stärkere Ausreifung der intestinalen Schleimhaut unter dem Einfluss von S.b. 36 Literaturübersicht Erklärung für die trophische Wirkung von S.b. In der Hefezelle kommen in großer Menge Polyamine vor. Polyamine sind kleine aliphatische Verbindungen mit mindestens zwei Aminogruppen, die in allen Körperzellen nachzuweisen sind. Zu den Polyaminen gehören Ornithin, das durch Dekarboxylierung daraus hervorgehende Putrescin, aus dem das Spermidin entsteht und das aus diesem synthetisierte Spermin (PEGG u. MCCANN 1982). Bei der Adaptation des Darmes an veränderte Stoffwechselsituationen spielen die Polyamine eine besondere Rolle (LUK u. YANG 1988). Die Synthese von Polyaminen, die intrazellulär vom Wirtsorganismus selbst synthetisiert oder von der Darmflora gebildet werden (BLACHIER 1997), ist essentiell für die mit der Laktation verbundene Proliferation der Darmschleimhaut (YANG et al. 1984). Die Polyamine sind auch in vielen Nahrungsmitteln enthalten (BLACHIER 1997). Eine weitere Funktion der Polyamine ist ihre Beteiligung an der Zellerneuerung und der Regeneration nach Schädigung der Schleimhaut (LUK u. BAYLIN 1983). Sie sind dabei Induktoren von Hormonen und Wachstumsfaktoren und sie stabilisieren t-RNA und DNA (BARDOCZ et al. 1995). Spermin und Spermidin erhöhen die DNA-Bindungsaktivität des Vitamin D-Rezeptors in der Darmschleimhaut des Schweines. Zudem haben sie einen sekretagogischen Effekt auf die Freisetzung des Gastrointestinalhormons Cholecystokinin. In den Enterozyten des Schweines ist vor allem Spermin vorhanden (BLACHIER 1997). Studien an Membranvesikeln zeigten, dass die maximale Glukoseresorption nur in Anwesenheit von Polyaminen erreicht wird (JOHNSON et al. 1995). Die intrazelluläre Konzentration der Polyamine ist reguliert und abhängig von der Zellproliferation. Durch die Fütterung des Polyamins Spermin an neugeborene Ratten wurde die Schleimhaut dahingehend beeinflusst, dass sie im Vergleich zu Kontrolltieren eine größere Masse aufwies und das Enzymmuster des Bürstensaumes früher dem adulter Tiere entsprach (BUTS et al. 1993). Bei den Studien von BUTS und Mitarbeitern (1994) an Ratten hatte die Applikation von Polyaminen alleine in der in 100 mg lyophilisierterter Hefen enthaltenen Konzentration dieselben Auswirkungen auf die Aktivität der Bürstensaumenzyme Saccharase und Maltase wie die Verabreichung der gesamten Hefekultur. Die Vermutung der Autoren ist, dass die in der Hefe enthaltenden Polyamine, Spermin und Spermidin, für die trophische Wirkung von S.b. verantwortlich sind. Sie gehen davon aus, dass die Freisetzung dieser Substanzen vor allem über den Abbau der Hefezellen durch die Darmflora erfolgt und weniger durch die Sekretion, denn es wurden weniger als 3% der verabfolgten Hefen lebend im Kot gefunden. STEIN und Mitarbeiter (1999) fanden allerdings nur einen Anstieg der Polyamine mit der Kolonstimulationstechnik beim Literaturübersicht 37 Einsatz von lebenden Hefezellen. Sie gehen daher davon aus, dass die Polyamine im Darm produziert und sezerniert werden. Durch die Fütterung einer polyaminarmen Diät kommt es zu einem niedrigeren Darmgewicht und DNA-Gehalt in der Darmschleimhaut (LÖSER et al. 1999). Beeinflussung der Schleimhautpermeabilität: WINCKLER und Mitarbeiter (1998) untersuchten in vitro in der Ussingkammer die Wirkung von S.b. auf das Gewebe des mittleren Jejunums beim Schwein. Die Veränderung des Kurzschlussstromes, welche als Messgröße für alle elektrogenen Transportprozesse gilt, wurde nach Zugabe von Theophyllin, einem klassischen Sekretagogum, gemessen. Der Anstieg des Kurzschlussstromes war in der mit S.b. behandelten Gruppe signifikant. Die Autoren interpretieren dieses als reduzierte Sensitivität des jejunalen Epithels auf das Sekretagogon. Die Behandlung mit S.b. könnte daher einen antisekretorischen, antidiarrhoischen Effekt haben. Dieser Effekt mag seine Ursache durch einen Wechsel im epithelialen Ionentransport und/oder durch gesteigerte Dichtigkeit des jejunalen Epithels haben. Außerdem untersuchten die Autoren die parazelluläre Permeabilität in Kurzschlussstromkammern. Als Marker der parazellulären Barriere gilt Mannit, das nur para- und nicht transzellulär transportiert werden kann. Durch die Gabe von S.b. kam es zu einer Reduktion der unidirektionalen Fluxraten von Mannit im Vergleich mit der unbehandelten Kontrollgruppe. Diese Abnahme war bei den mit S.b. behandelten Tieren statistisch signifikant. Dieses Ergebnis könnte ebenfalls durch eine erhöhte Dichtigkeit des Epithels zu Stande gekommen sein. Die Autoren vermuten, dass das Zytoskelett der Enterozyten an diesen Änderungen mitbeteiligt sein könnte. Beeinflussung von zellulären Transportmechanismen: BREVES und Mitarbeiter (1997) untersuchten den Einfluss von S.b. auf die intestinale Glukoseund Alaninaufnahme in jejunale Enterozyten beim Schwein. Dazu wurden aus einem Segment des oberen Jejunums Vesikel der Bürstensaummembran dargestellt. Die natriumabhängige Aufnahme von Glukose und die Aufnahme von Alanin war bei den mit S.b. behandelten Tieren zeitabhängig signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Diese Befunde lassen einen möglichen stimulierenden Einfluss von S.b. auf die intestinalen Transportsysteme vermuten. 38 Literaturübersicht 2.4.4.2. Bacillus cereus varietas toyoi 2.4.4.2.1. Anwendung Bacillus cereus varietas toyoi ist im Handel als Toyocerin® erhältlich. Das Präparat enthält lebende B.c.-Keime in versporter Form. Der Einsatz der Subspezies toyoi ist in Europa derzeit beschränkt auf den Bereich der Tierernährung. Toyocerin® ist laut Hersteller einsetzbar bei Schweinen (Sauen, Ferkel, Mastschweine), Rindern (Kälber, Mastvieh), Kaninchen, Masthühnern, Truthühnern und Junghennen und soll bestimmte Leistungen, wie z.B. die Wurfgröße und die Mastergebnisse, verbessern. Studien an Absetzferkeln, bei denen das Präparat zur Leistungssteigerung eingesetzt wurde, ergaben kein einheitliches Bild über seine Wirksamkeit (ROTH u. KIRCHGESSNER 1988; IBEN u. LEIBETSEDER 1989). 2.4.4.2.2. Charakterisierung B.c. gehört wie alle Bacillus-Arten zu den gram-positiven aeroben Sporenbildnern, wobei einige Stämme beweglich sind (HAHN u. VOIGT 1994). B.c. kommt ubiquitär in der Erde und im Staub vor. Die bekanntesten Vertreter führen zu Lebensmittelvergiftungen, aufgrund der Bildung von Enterotoxinen (FEHLHABER u. JANETSCHKE 1992). Dazu gehören B. subtilis und B. cereus, da ihre Sporen die Pasteurisierung der Milch überleben und dann zum Verderb von Milch und Milchprodukten führen können (ROLLE u. MAYR 1993). B. cereus verursacht Meningitis, Pleuritis sowie Endocarditiden beim Menschen und führt zur Mastitis beim Rind (BISPING u. AMTSBERG 1988). Als Probiotika werden nur Stämme von B.c. eingesetzt, die apathogen sind und kein Toxin bilden (ROLLE u. MAYR 1993; GEDEK 1999). Durch die Sporenbildung ist B.c. unempfindlicher gegen extreme pH-Wertschwankungen und übersteht die Magenpassage besser als Mikroorganismen, die ausschließlich vegetative Stadien ausbilden. In diesem widerstandsfähigen Dauerstadium ist die Lagerung der Präparate unproblematisch und eine Pelletierung unter Erhitzung auf 60°C möglich. Literaturübersicht 2.4.4.2.3. 39 Auswirkung auf Leistungsparameter Beim Schwein verbesserte die Gabe von Toyocerin® die Aufzuchtsleistung gemessen an der Anzahl der aufgezogenen Ferkel und deren täglichen Gewichtszunahme (AHRENS 1990; KAHRS 1991a, b; HARTJEN 1994). Es kam zur Reduzierung der schädlichen Keime und damit zur Senkung des Keimdruckes auf die Ferkel. Bei Absetzferkeln wurde durch Toyocerin eine bessere tägliche Gewichtszunahme und ein reduzierter Futteraufwand erreicht (KAHRS 1986; AHRENS 1990; KAHRS 1991b; HARTJEN 1994; KIRCHGESSNER et al. 1993; KÜHN 2000; SIMON u. KÜHN 2000). Derselbe Erfolg stellte sich beim Kalb ein (AHRENS 1990; KAHRS 1991b; HARTJEN 1994; KÜHN 2000). Mit Toyocerin® konnte die Mortalität bei spezifisch pathogenfreien (SPF) Schweinen signifikant gesenkt werden (IBEN u. LEIBETSEDER 1989). ROTH und KIRCHGESSNER (1988) fanden allerdings keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Futterverwertung und der täglichen Zunahmen zwischen Kontrolltieren und den mit B.c. behandelten Aufzuchtsferkeln. IBEN und LEIBETSEDER (1989) fanden im Hinblick auf diese Kriterien keine Verschlechterung der Leistung im Vergleich von mit Virginiamycin oder mit Virginiamycin und dem Probiotikum behandelten Tieren. Eine Kontrollgruppe gab es bei diesem Versuch nicht. Die Applikation von B.c. sowohl im Ferkelaufzucht- als auch im Sauenfutter führte zu signifikant höheren Ferkelgewichten im Alter von 3-5 Wochen (TOSSENBERGER et al. 1994). Durch die Supplementierung von Ferkeln mit B.c. konnte die Durchfallhäufigkeit um 50% gesenkt werden, was als Hinweis auf die protektive Wirkung des Probiotikums gegen darmpathogene Erreger gedeutet werden kann (IBEN u. LEIBETSEDER 1989). Die Gabe von B.c. bei Ferkeln führte zu einer niedrigeren Konzentration an E. coli im Duodenum und im Jejunum, aber zu einer erhöhten in den distalen Darmabschnitten (GEDEK et al. 1993). Der Einsatz von Toyocerin® beim Bullen führte zu einer erhöhten Gewichtszunahme und einer besseren Futterverwertung. Die Mastdauer war gegenüber der Kontrollgruppe um 15 Tage kürzer und die tägliche Gewichtszunahme war um 5% höher durch das Probiotikum (HARTJEN 1994). ROTH und KIRCHGESSNER (1988) fanden bei Mastkälbern durch B.c. signifikant höhere tägliche Zunahmen und einen niedrigeren Futteraufwand als bei den Kontrolltieren. Im Vormagen von Wiederkäuern führte Toyocerin® zur Änderung der Fettsäurezusammensetzung (AHRENS 1990). 40 Literaturübersicht Auch Masthühner und Puten zeigten nach Applikation sowohl von Toyocerin® als auch von Paciflor® 1 (Bacillus cereus var. caron) eine erhöhte Gewichtszunahme und eine verbesserte Futterverwertung. Die Untersuchungen von JADAMUS (1999), RICHTER (1999) und KÜHN (2000) bestätigen diese Ergebnisse und fanden zusätzlich noch geringere Verlustraten. Durch den Einsatz von Toyocerin® bei Masthühnern kam es zu einer verbesserten Immunantwort durch die Senkung unerwünschter Keime im Verdauungstrakt (KHAJARERN u. RATANASETHAKUL 1998). Sie fanden außerdem bei Broiler-Elterntieren eine erhöhte Schlupfrate und vermehrt große Eier. 2.4.4.2.4. Wirkungsmechanismen Bezüglich der Wirkungsmechanismen von B.c. liegen wesentlich weniger Untersuchungen vor als für S.b. Vorraussetzung für eine optimale Wirkung versporter Probiotika ist eine schnelle Auskeimung im Verdauungstrakt. SIMON und KÜHN (2000) fanden nach einmaliger Gabe von Toyocerin® über das Futter nach 30 Minuten 90% der Sporen im Kropf von Broilern ausgekeimt. Bei Ferkeln war nach 16-42 Stunden eine ähnliche Auskeimungsrate feststellbar. Die Untersuchung der Dünndarmschleimhaut von Schweinen, die 3 Wochen lang mit B.c. behandelt wurden, zeigte, dass es durch die Gabe von B.c. zu einer Beeinflussung der Schleimhautpermeabilität und der zellulären Transportprozesse kommt, die der durch S.b. weitgehend entspricht (BREVES et al. 1997; WINCKLER et al. 1998). Der Anstieg des Kurzschlussstroms, der Messgröße für elektrogene Transporte, war niedriger als bei der Kontrollgruppe, unterschied sich im Gegensatz zu S.b. aber nicht signifikant. Wie durch Gabe von S.b. so wurde auch durch B.c. die parazelluläre Permeabilität, die als unidirektionale Fluxrate von Mannit gemessen wurde, verringert. Im Gegensatz zu S.b. wurde durch B.c. nur die Aufnahme von Glukose und nicht die von Alanin gesteigert. Die Gabe von B.c. führte beim Schwein zu Veränderungen der Schleimhautmorphologie, die den durch S.b. ausgelösten vergleichbar waren (GÖRKE 2000). Die Zunahme der Zottenlänge im Jejunum war bei den mit B.c. behandelten Tieren ausgeprägter. 1 Fa. Prodeta, Frankreich: Sporen vom Bacillusstamm CIP 5832 Literaturübersicht 41 Für B.c. wurde eine anabole Wirkung auf den Gesamtstoffwechsel gezeigt. B.c. führt zur Förderung der Mastleistung durch den Einfluss auf Wachstumsparameter ebenso wie die Leistungsförderer Carbadox, Flavomycin oder aber Kupfersulfat bei Ratten. Es wurden anabole Effekte auf den Glutathionstatus der Leber festgestellt (SCHOLE et al. 1994). Die Wirkung führen die Autoren auf die Abgabe bakterieneigener, für die Sporulation notwendiger Substanzen durch B.c. zurück. 42 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1. Versuchstiere Die Untersuchungen wurden an 15 klinisch gesunden Hybridschweinen durchgeführt. Die Tiere wurden nach dem Absetzen erworben und stammten aus der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig. Angaben zum Gewicht und Geschlecht finden sich in Tabelle 2. Tab. 2: Übersicht über die Tiere des Versuches Gruppe Geschlecht Absetzgewicht Behandlungs- Gewicht bei in kg dauer Tötung in kg 2399/98 M1 8,70 3 Wochen 31,5 2 2400/98 M 7,86 8 Tage 28,2 3 2401/98 M 7,26 3 Wochen 31,0 4 2407/98 W2 9,50 3 Wochen 33,0 5 2408/98 W 7,58 8 Tage 26,0 6 2402/98 W 9,04 8 Tage 32,0 7 2403/98 W 8,32 8 Tage 31,5 8 2404/98 M 8,68 8 Tage 32,0 9 2405/98 M 11,74 8 Tage 28,5 10 2406/89 M 8,28 8 Tage 25,0 11 2409/98 M 8,94 3 Wochen 40,0 12 2410/98 W 8,06 3 Wochen 35,0 13 2411/98 M 7,38 3 Wochen 32,5 14 2412/98 W 7,42 3 Wochen 31,0 15 2413/98 W 8,10 3 Wochen 32,5 Tier Sektions- Nr. Nr. 1 Kontrolle S. boulardii Bac. cer. toyoi 1 M = männlich 2 W = weiblich Material und Methoden 3.2. 43 Fütterung und Haltung Die Tiere wurden im Tierstall des Physiologischen Institutes der Tierärztlichen Hochschule Hannover untergebracht und sofort nach ihrer Ankunft per Zufallsprinzip in drei Gruppen zu je 5 Tieren aufgeteilt. Die Tiere, die Probiotika erhalten sollten, wurden einzeln aufgestallt. Die Tiere der Kontrollgruppe wurden gemeinsam aufgestallt. Die Boxen waren mit Stroh eingestreut. Wasser stand zur freien Aufnahme zur Verfügung. Während der Fütterungsperiode wurde die Rationsgröße von 500 auf 1000g der in Tab. 3 charakterisierten Mastmischung pro Tier und Tag gesteigert. Die Schweine wurden zweimal täglich gefüttert. Die ersten zwei Wochen dienten der Adaption der Tiere an das Mastfutter. Im Anschluss daran erhielt eine Gruppe für die Dauer von acht Tagen zusätzlich ein Gramm des Präparates Perenterol®2 pro Tier und Tag. Dabei handelt es sich um ein Lyophilisat der Hefe Saccharomyces boulardii. Die Applikation erfolgte vor der morgendlichen Fütterung zusammen mit einer kleinen Menge des Mastfutters. Die zweite Gruppe erhielt pro kg Futter 109 KbE (Kolonie bildende Einheiten) Bacillus cereus var. toyoi in Sporenform (Toyocerin®3) über drei Wochen. Die Applikation erfolgte eingemischt in das Mastfutter. Die dritte Gruppe diente als Kontrollgruppe. 2 3 Fa. Thiemann, Waltrop Fa. Lohmann, Cuxhaven 44 Material und Methoden Tab. 3: Charakterisierung des Mastfutters nach Komponenten und Rohnährstoffen Futtermittel: Anteil: Ursprüngliche TrockenSubstanz: Gerste 40 % Weizen 35 % Rohprotein: Sojaschrot 15 % Weizenkleie 5% substanz: 16,37 % 18,61 % Rohfett: 3,36 % 3,81 % Rohfaser: 4,84 % 5,50 % 58,06 % 65,97 % Sojaöl 1,50 % N-freie Vaumin 14 C 2,50 % Extraktstoffe: Futterkalk 0,20 % Stärke: 41,77 % 47,46 % Lysin 0,40 % Zucker: 4,46 % 5,07 % DL-Methionin 0,10 % ME: 12,92 MJ 14,69 MJ L-Threonin 0,10 % 3.3. Probengewinnung, -aufbereitung und -aufbewahrung Nach Abschluss der Probiotikaapplikation, d.h. bei der S.b.-Gruppe nach mindestens acht Tagen, bei der B.c.-Gruppe nach mindestens drei Wochen, wurden die Schweine durch Bolzenschuss betäubt und durch Entbluten getötet. Zwei Tiere der Kontrollgruppe (2, 5) wurden zeitgleich mit den mit S.b. behandelten und drei (1, 3, 4) zeitgleich mit den mit B.c. behandelten Schweinen getötet. Unmittelbar nach der Tötung erfolgte die mediane Eröffnung der Bauchhöhle und die Entnahme des Magendarmtraktes. Wie in Abb. 1 dargestellt, wurden jeweils etwa 10 cm lange Proben aus Duodenum, proximalem und mittlerem Jejunum, Ileum, Caecum und proximalem Colon entnommen. Die Darmstücke wurden vom Mesenterium gelöst und mesenterial eröffnet. Falls Ingesta enthalten waren, wurden sie vorsichtig abgespült. Material und Methoden 45 Duodenum Prox. Jejunum 40 cm Mittl. Jejunum 4m Prox. Colon Ileum Caecum Abb. 2: Darstellung der Entnahmestellen der Gewebeproben Anschließend wurde jede Probe in drei Teile geteilt, die nach verschiedenen Verfahren asserviert wurden: • Ein Teil wurde für Kunstharzeinbettung in Glutaraldehyd fixiert. • Ein anderer Teil wurde in 5% neutral gepuffertem Formalin aufbewahrt. • Der für die im folgenden beschriebenen Untersuchung verwendete Teil wurde schockgefroren. Hierzu wurde die Gewebeprobe sofort nach der Entnahme mit der Schleimhautseite auf die Serosa eines dünnen Leberstückes des entsprechenden Schweines gelegt und in Isopentan4 bei –70°C tiefgefroren. Die Aufbewahrung erfolgte bei –80°C. Für die Herstellung der Kryostatschnitte wurden die eingefrorenen Proben auf eine Temperatur von –20°C gebracht und mit einem Skalpell quer zur Darmrichtung in ca. 2 cm lange und 0,7 cm breite Stücke geteilt. Diese wurden mit Hilfe von Gefriermedium5 auf einen Objekthalter des Kryostaten6 aufgefroren. Es wurden 5 µm dicke Konsekutivschnitte hergestellt, die auf mit 0,25%iger Chromalaungelatine (s. Anhang) beschichtete Objektträger aufgezogen wurden. Nachdem die Schnittpräparate mindestens eine Stunde an der Luft getrocknet waren, wurden sie bis zur Durchführung der immunhistochemischen Untersuchung bei –80°C gelagert. 4 5 2-Methylbutan, Fa. Fluka, Neu-Ulm Fa Jung, Einbettmedium für Gefrierschnitte, Kat. Nr. 020108926, Leica Instruments GmbH 46 Material und Methoden 3.4. Immunhistologische Untersuchungen 3.4.1. Prinzip Immunhistologische Methoden dienen dem Nachweis von Antigenen in Geweben mittels immunologischer Methoden, das heißt durch die spezifische Bindung von Antikörpern an das Antigen im Gewebe. Die Sichtbarmachung der Bindung des Antikörpers an das Antigen erfolgt durch Markierung des Antikörpers mit Fluorochromen, Enzymen, Isotopen oder Partikeln (FRIEMEL 1991). Man unterscheidet direkte und indirekte Nachweismethoden, sowie EnzymImmunkomplex- und die Avidin-Biotin-Methoden (BOENISCH 1989). Die folgen zwei Methoden fanden bei meiner Untersuchung Anwendung: 1. Die Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP) -Methode, eine Enzym-anti-Enzymkomplex-Methode (Abb. 3): Sie zählt zu den empfindlichsten immunhistologischen Methoden, da durch den Einsatz stabiler Immunkomplexe die natürliche hohe Affinität von Antikörpern gegenüber ihrem Antigen genutzt und das relativ unsanfte Verfahren der chemischen Konjugation umgangen wird. Immunkomplexmethoden werden nach dem jeweils verwendeten Enzym-Immunkomplex benannt. Bei der APAAP-Methode ist ein APAAP-Komplex aus jeweils zwei Molekülen alkalischer Phosphatase und einem dagegen gerichteten Antikörper aufgebaut. Bei den Immunkomplexmethoden wird ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet, der an das Antigen im Gewebe bindet. Anschließend wird ein zweiter unkonjugierter Sekundärantikörper, der gegen das Fc-Fragment des Primärantikörpers gerichtet ist, aufgetragen. Dieser Antikörper muss im Überschuss vorliegen, damit der eine Fab-Arm an den Primärantikörper binden kann, der andere Fab-Arm aber noch zur Anlagerung für den Antikörper aus dem Enzym-Immunkomplex verfügbar ist. Im dritten Reaktionsschritt werden lösliche Enzym-anti-Enzymkomplexe hinzugegeben. Der Antikörper des Enzym-Immunkomplexes muss von derselben Spezies stammen, wie der Primärantikörper, damit der Sekundärantikörper, seiner Funktion entsprechend auch als Brückenkörper bezeichnet, diese beiden miteinander verbinden kann. Die Reaktion wird mit einer Substrat-Chromogen-Reaktion abgeschlossen. 6 Kryostat HM 500, Fa. Microm, Heidelberg Material und Methoden 47 alkalische Phosphatase APAAP-Komplex Sekundär (=Brücken)Antikörper Primärantikörper Gewebsantigen Abb. 3: Darstellung der APAAP-Methode 48 Material und Methoden 2. Die Streptavidin-Biotin-Methode (Abb. 4): Bei der Streptavidin-Biotin-Methode wird die überaus starke Affinität von Avidin gegenüber Biotin und die Möglichkeit, das Streptavidin mit mehreren Enzymmolekülen zu beladen, genutzt, um eine höhere Sensitivität im Vergleich zur vorher beschriebenen Methode zu erreichen. Auch bei der Streptavidin-Biotin-Methode wird ein unmarkierter Primärantikörper eingesetzt. An diesen bindet ein biotinylierter Sekundärantikörper. Die Spezifität des Sekundärantikörpers konnte durch den Einsatz eines isotypspezifischen biotinylierten Antikörpers erhöht werden. An den biotinylierten Sekundärantikörper binden die mit Alkalischer Phosphatase markierten Streptavidinmoleküle. Die Reaktion wird mit einer Substrat-Chromogen-Reaktion abgeschlossen. mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin biotinylierter Sekundärantikörper Primärantikörper Gewebsantigen Erläuterung Streptavidin alkalische Phosphatase Abb. 4: Darstellung der Streptavidin-Biotin-Methode Biotin Material und Methoden 49 3.4.2. Primäre Antikörper zur Darstellung von Leukozytenantigen Zur Darstellung der Plasmazellen und T-Lymphozytensubtypen wurden monoklonale Antikörper eingesetzt. Die verwendeten monoklonalen Antikörper (mAKs) sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Tab. 4: Tabellarische Darstellung der verwendeten primären mAKs: Bezeichnung, Konzentration, in der er verwendet wurde, Antigen, gegen das er gerichtet ist, Zelltyp, der dargestellt wird, sowie Herkunft mAK Antigen Zelltyp Herkunft / Literatur CD 4 T-Helferzellen VMRD, USA (Konzentration) 74-12-4 (1:30) a38b2 (Pescovitz et al. 1984, 1985) CD 6 αβ-T-Lymphozyten (1:20) 11-295-33 (Saalmüller et al. 1994) CD 8 Zytotoxische Tübingen, Deutschland T-Lymphozyten (Jonjíc u. Koszinowski 1984) B-Lymphozyten, Lelystad, Niederlande Plasmazellen (Van Zaane u. Hulst 1987) B-Lymphozyten, Lelystad, Niederlande Plasmazellen (Van Zaane u. Hulst 1987) γδ−TCR γδ-T-Lymphozyten Mackey et al., 1985 γδ−TCR γδ-T-Lymphozyten Serotec, Nord Amerika (1:20) 27.9.1 IgA (1:60000) 28.4.1 IgM (1.20000) 86 D Tübingen, Deutschland (1:20) Mac 320 (1:20) (Binns et al. 1992, 1994) 50 Material und Methoden 3.4.3. Darstellung von IgA+Plasmazellen, CD6+, CD8+T-Lymphozyten und des γδ-TZellrezeptors mit der APAAP-Methode Nach Entnahme aus der Tiefkühltruhe wurden die Kryostatschnitte insgesamt 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Der Gewebebereich auf dem Objektträger wurde nach 15 Minuten Trocknungszeit mit einem Fettstift7 umrandet. Die Schnittpräparate wurden 90 Sekunden lang bei 4°C in einer frisch zubereiteten Aceton8-Methanol9-Lösung fixiert, die in einem Verhältnis von 1:1 angesetzt war. Danach wurden die Schnitte in Tween-TBS (s. Anhang) sorgfältig (3 x 5 Minuten) gespült, um jegliche Fixierungsmittelreste zu entfernen. Um eine Anlagerung des Primärantikörpers an elektrisch geladene Kollagen- und Bindegewebselemente und somit eine unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden, wurde vor Zugabe des Primärantikörpers eine neutrale Proteinlösung, die auch als Blockserum bezeichnet wird, aufgetragen. Hierfür verwendet man inaktiviertes Serum derselben Spezies, aus der der Sekundärantikörper stammt. Somit wird auch eine Bindung des Brückenantikörpers an Komponenten der Proteinlösung und damit eine weitere Möglichkeit der unspezifischen Anfärbung verhindert. Im vorliegenden Falle wurden die Schnitte für 20 Minuten mit hitzeinaktivierten Kaninchenserum in einer Verdünnung von 1:10 mit Tween-TBS bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei wurden die Schnitte in einer feuchten Kammer mit jeweils 100 µm Serum überschichtet, das nach Ablauf der Inkubationszeit vorsichtig dekantiert wurde. Es schloss sich die Inkubation der Schnitte mit jeweils 100 µl des jeweiligen primären mAKs verdünnt in 1%igem bovinen Serumalbumin10 (BSA) in PBS (s. Anhang) an. Die Konzentration, in der die primären mAKs verwendet wurden, ist in Tabelle 4 angegeben. Diese Inkubation wurde wie alle weiteren in feuchten Kammern durchgeführt. Der mAK 27.9.1 wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf den Schnitten belassen. Bei den übrigen mAKs wurde eine Inkubation über Nacht bei 4°C im Kühlschrank durchgeführt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Antikörperlösung vorsichtig mit Tween-TBS aus der Spritzflasche abgespült, gefolgt von drei weiteren Spülschritten in Tween-TBS (3 x 5 Minuten). Als Sekundärantikörper wurde ein AntiMaus-Ig Antikörper aus dem Kaninchen11 in einer Verdünnung von 1:50 in PBS, dem 5% hitzeinaktiviertes Schweinenormalserum zugesetzt war, eingesetzt. Die Inkubationszeit betrug 30 7 PAP-Pen, Science Services Art. 2401, Fa. Riedel-de-Haen, Seelze 9 Art.6008, Fa. Merck, Darmstadt 10 Art. 11930, Fa. Serva, Heidelberg 11 Code-Nr. 315-005-003, Fa. Dianova 8 Material und Methoden 51 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Auch diese Antikörperlösung wurde nach Ablauf der Inkubationszeit sorgfältig mit Tween-TBS aus der Spritzflasche abgespült, gefolgt von drei weiteren Spülschritten in Tween-TBS (3 x 5 Minuten). Dann wurden 100µl des APAAP-Komplexes aus der Maus12 in einer Verdünnung von 1:50 in PBS, dem 5% hitzeinaktiviertes Schweinenormalserum zugesetzt war, aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Es erfolgte wiederum die Spülung mit TBS (3 x 5 Minuten). Dann wurden zur Verstärkung der Reaktion wiederholt der Sekundärantikörper und der APAAP-Komplex, wie beschrieben, aufgetragen, wobei hierbei die Inkubationszeit für beides jeweils nur noch 20 Minuten betrug. Nach der Spülung in TBS (3 x 5 Minuten) wurden die Schnitte in Aqua dest. gründlich gespült. Nun erfolgte die Durchführung der Enzym-Substrat-Reaktion mit der farbintensiven NeufuchsinMethode. Hierzu sind folgende Lösungen notwendig: Lösung 1: A) 0,53g 2-Amino-methyl-1,3-propandiol13 in 25 ml Aqua dest. lösen. Es entsteht eine 0,2 M Aminomethylpropandiol-Lösung. B) 6,057g Tris-hydroxymethyl-aminomethan14 in 1 l Aqua dest. lösen. Es entsteht ein 0,05 M Trispuffer, dessen pH-Wert auf 9,7 eingestellt wird. C) Nun werden zu 25 ml der Aminomethylpropandiol-Lösung (s. A) und 75 ml Trispuffer (s. B) 675 mg Natriumchlorid15 dazu gegeben. In dieser unter C) beschriebenen Lösung werden 40 mg Levamisol16 gelöst. Somit erhält man die Lösung 1. 12 Kat.-Nr. M 800, Fa. Dianova Art. A-9074, Fa. Sigma, St. Louis 14 Art. 8386, Fa. Merck, Darmstadt 15 Art. 6404, Fa. Merck, Darmstadt 16 Art. L-9756, Fa. Sigma, St. Louis 13 52 Material und Methoden Lösung 2: 50 mg Naphtol AS-BI Phosphat17 werden in 600 µl N, N-Dimethylformamid18 in einem Glasgefäß gelöst. Lösung 3: A) 0,5g Neufuchsin19 werden in 10 ml einer 2 N Salzsäure20 gelöst, so dass eine 5%ige Neufuchsinlösung entsteht. B) 40 mg kristallines Natriumnitrit21 werden in 1 ml Aqua dest. gelöst. Es entsteht eine 4%ige Natriumnitritlösung. Nun werden 200 µl der 5%igen Neufuchsinlösung (s. A) mit 500 µl der 4%igen Natriumnitritlösung (s. B) gemischt. Dieses lässt man 60 Sekunden unter Schütteln miteinander reagieren. Im folgenden wurden nun zuerst Lösung 1 mit Lösung 3 gemischt. Anschließend wurde Lösung 2 hinzugegeben. Durch Zugabe von 1 N Salzsäure22 wurde der pH der erhaltenen Lösung auf 8,7 eingestellt und anschließend die fertige Lösung in Glasküvetten filtriert. Die Schnitte wurden dann für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, wobei die Farbintensität mikroskopisch mehrfach kontrolliert wurde. Um die Reaktion zu beenden, wurden die Schnitte in Aqua dest. verbracht und noch zweimal in Aqua dest. gespült (2 x 5 Minuten). Die Gegenfärbung der Schnittpräparate wurde mit 2%iger Methylgrün-Lösung23 in Aqua dest. für 10 Minuten durchgeführt. Nach erfolgter Gegenfärbung wurden die Schnittpräparate erneut in Aqua dest. gespült und mit DAKO Glycergel24 eingedeckt. 17 Art. N-2250, Fa. Sigma, St. Louis Art. 3034, Fa. Merck, Darmstadt 19 Art. N-0638, Fa. Sigma, St. Louis 20 Art. 316, Fa. Merck, Damstadt 21 Art. 6549, Fa. Merck, Darmstadt 22 Art. 9057, Fa. Merck, Darmstadt 23 Art. 29295, Fa. Serva, Feinbiochemika, Heidelberg 24 Art. C 563, Fa. DAKO, Hamburg 18 Material und Methoden 53 3.4.4. Darstellung der CD4+T-Lymphozyten mit der Streptavidin-Biotin-Methode Bei der zur Darstellung der CD4+T-Zellen verwendeten Streptavidin-Biotin-Methode wurden die im folgenden beschriebenen Reaktionsschritte gegenüber der APAAP-Methode verändert: • Als Blockserum wurde hitzeinaktiviertes Ziegennormalserum eingesetzt. • Der Primärantikörper (mAK 74-12-4) wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur auf den Schnitten belassen • Als zweiter Antikörper wurde der biotinylierte Goat-anti-Mouse Ig2b Antikörper25 in einer Verdünnung von 1:50 in PBS mit Zusatz von 5% Schweinenormalserum aufgetragen und für 45 Minuten auf den Schnitten belassen. • Anschließend wurden die Schnitte mit Streptavidinkomplex26 in einer Verdünnung von 1:50 in PBS für 20 Minuten inkubiert. Die Darstellung der alkalischen Phosphatase erfolgte wie für die APAAP-Methode beschrieben. 3.5. Immunhistochemische Kontrollen Bei jeder immunhistochemischen Reaktion wurden Kontrollschnitte mitgeführt, bei denen anstatt des primären Antikörpers nur das entsprechende Verdünnungsmedium (1%iges bovines Serumalbumin in PBS) aufgetragen wurde. Auf diese Weise konnten gegebenenfalls auftretende unspezifische Färbungen durch die Sekundärantikörper, den APAAP-Komplex oder den Streptavidinkomplex ausgeschlossen werden. Die Isotypkontrollen für IgG1 (86D, CD6) und IgG2a (mAk 320, CD8) waren negativ. 25 26 Kat. Nr. 1090-08, Fa. Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham Kat. Nr. 7100-04, Fa. Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham 54 Material und Methoden 3.6. Morphometrische Auswertung der histologischen Schnitte 3.6.1. Messgerät Die Messungen erfolgten unter Verwendung des halbautomatischen Bildanalysegerätes ASM 68 K27.Hierbei handelt es sich um ein computergestütztes Bildanalysesystem, an das zwei Monitore und ein Messtablett mit Cursor angeschlossen sind. Die Informationen werden über ein Lichtmikroskop mit aufgesetzter Videokamera eingegeben. Das ASM 86 K ermöglicht dem Benutzer zwei Arten der Messung bzw. Zählung. Das mikroskopische Bild kann auf dem angeschlossenen Monitor wiedergegeben werden, dann werden die Messungen mit dem Cursor auf dem Messtablett durchgeführt. Das Monitorbild des Analyseprogramms kann aber auch mit Hilfe eines Einspiegelmodus mit Monitor28 in das mikroskopische Bild eingeblendet und die Messungen im Mikroskop durchgeführt werden. Da die Auflösung durch das Mikrovid wesentlich besser ist, wurde das zuletztgenannte System für die Messungen verwendet. Die Messergebnisse wurden auf Diskette gespeichert und ausgedruckt. 3.6.2. Zählung der dargestellten Zellen 3.6.2.1. Allgemein gültige Messkriterien Folgende Kriterien wurden in allen Darmlokalisationen und für alle ausgewerteten Zelltypen zur Auswahl des Messrahmens, der Messlokalisationen und der Messhäufigkeit angewendet: - Die Schnittpräparate wurden zur Auswertung kodiert und blind ausgezählt. - Der ins mikroskopische Bild eingespielte rechteckige Rahmen des Bildanalyseprogramms diente als Messrahmen. - Mindestens 5 Lokalisationen wurden pro Schnitt ausgezählt. - Nur Mukosa, die der Tunica muscularis parallel anlag (zwischen den Plicae), wurde erfasst. - Die Messung wurde in jedem Areal in der Mitte zwischen den Plicae durchgeführt. - Falls ein Schnitt keine deutlichen Plicae besaß, wurde mit Hilfe der Kreuztischkoordinaten die Länge des Schnittes ermittelt, in 5 Sektoren unterteilt und jeweils in der Mitte der ermittelten Abschnitte die Messungen vorgenommen. 27 28 Fa. Leika, Wetzlar Microvid, Fa. Leika, Wetzlar Material und Methoden - 55 Zwischen den ausgezählten Flächen musste mindestens ein Abstand von einem Messrahmen liegen. - War in dem gewählten Schnittbereich wegen des Auftretens von Schnittartefakten eine Zählung nicht möglich, wurde das nächste rechts liegende Sichtfeld als Messbereich gewählt. Für die Messungen im Kryptbereich der Darmschleimhaut mussten zusätzlich folgende Kriterien erfüllt sein, und der Messrahmen wurde wie folgt festgelegt: - Die Krypten mussten überwiegend in ihrem Längsverlauf angeschnitten sein. - Die kurze Seite des rechteckigen Messrahmens wurde an die Lamina muscularis mucosae angelegt. - Die Höhe des Messrahmens wurde variabel so gewählt, dass sie am Übergang der Krypten zu den Zotten abschloss. Dadurch konnten die Krypten jeweils in ihrer gesamten Länge erfasst werden. Für die Messungen im Zottenbereich der Darmschleimhaut mussten zusätzlich folgende Kriterien erfüllt sein, und der Messrahmen wurde wie folgt festgelegt: - Der rechteckige Messrahmen wurde mit der kurzen Seite am Übergang von der Krypt- zur Zottenregion angelegt. - Die Höhe des Messrahmens wurde so gewählt, dass 50% der Zotten im Messrahmen in ihrer gesamten Länge erfasst wurden. 3.6.2.2. Kriterien zur Auszählung der Plasmazellen sowie der CD4+- und CD6+T-Lymphozyten Da diese Zellen im Krypt- und Zottbereich in unterschiedlicher Zahl vorkommen, wurden diese Bereiche getrennt ausgezählt, d.h. diese Zelltypen wurden im Duodenum, prox. Jejunum, mittl. Jejunum, Caecum und prox. Colon im Bereich der Krypten und im Duodenum, prox. Jejunum und mittl. Jejunum zusätzlich im Bereich der Zotten ausgezählt. Alle positiven Zellen innerhalb des wie oben für die Krypt- und Zottenbereiche ausgewählten Messrahmens wurden gezählt. - Positive Zellen auf dem Messrahmen und Reaktionsprodukte, die nicht einer bestimmten Zelle zuzuordnen waren, blieben unberücksichtigt. - Für jede Messung wurden die Fläche und die Zellzahl gespeichert und die Anzahl positiver Zellen pro µm2 Schleimhautfläche berechnet. 56 Material und Methoden Um in die Zählung einbezogen zu werden, musste - sich das Zytoplasma der Plasmazellen bei der gewählten Darstellung dunkelrot anfärben, - die Anfärbung die Zelle zu mindestens zwei Dritteln umgeben, - sich die Zellmembran der CD4+- und CD6+T-Lymphozyten bei der gewählten Darstellung dunkelrot anfärben, - die Anfärbung die Zelle zu mindestens drei Vierteln umgeben. 3.6.2.3. Kriterien zum Auszählen der CD8+T-Lymphozyten im Epithel Die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten wurde auf die Länge des Epithels, in dem sie gefunden wurden bezogen und nicht auf die Mukosafläche. Um der unterschiedlichen Häufigkeit dieser Zellen im Zotten- und Kryptenepithel gerecht zu werden, wurden diese Bereiche getrennt ausgezählt, d.h. die Zellen wurden im Duodenum, prox. Jejunum, mittl. Jejunum, Caecum und prox. Colon im Bereich des Kryptepithels und im Duodenum, prox. Jejunum und mittl. Jejunum zusätzlich im Bereich des Zottenepithels ausgezählt. Alle positiven Zellen innerhalb des wie oben für die Krypt- und Zottenbereiche ausgewählten Messrahmens wurden gezählt. Die Wahl der Messlokalisation erfolgte wie unter 3.6.2.1. beschrieben. Vom Zentrum des eingestellten Messbereiches aus wurde die nächste rechts davon liegende längste Zotte aufgesucht, die zentral angeschnitten und in ihrer ganzen Länge sichtbar war, bzw. die längste Krypte, die nicht mehr als eine Kryptbreite von der Lamina muscularis entfernt begann und nicht mehr als eine Kryptbreite unterhalb des Epithels endete. Von den ausgewählten Krypten und Zotten wurde mindestens eine Seite ausgezählt, so dass mindestens ein Epithelabschnitt von 200µm Länge erfasst wurde. Mindestens fünf Lokalisationen pro Schnitt wurden ausgezählt. Um in die Zählung einbezogen zu werden, musste - sich die Zellmembran der CD8+T-Lymphozyten bei der gewählten Darstellung dunkelrot anfärben und - diese Anfärbung musste die Zelle zu mindestens drei Vierteln umgeben. Material und Methoden 57 3.6.2.4. Zählung der γδ-T-Lymphozyten Da dieser Zelltyp nur sehr vereinzelt in der Lamina propria vorkam, wurde zur Auswertung von der bisher beschriebenen Zählweise abgewichen und ein größerer Bereich des Schleimhautbereichs in die Auswertung einbezogen. Die allgemein gültigen Messkriterien zur Auswahl (siehe 2.6.2.1.) fanden auch hier Anwendung. Der Messrahmen wurde für die Auszählung der γδ-T-Lymphozyten an der Lamina muscularis mucosae angelegt und umfasste im Duodenum, prox. und mittl. Jejunum den Bereich bis zur Zottengrenze und im Caecum und prox. Colon den Bereich bis zum Oberflächenepithel. Die Vergrößerung wurde so gewählt, dass die gesamte Lamina propria zwischen den Plicae mit der Messung erfasst wurde. Diese Fläche wurde einzeln ausgemessen und die darin enthaltenen γδTLymphozyten registriert. Um in die Zählung einbezogen zu werden, musste - sich die Zellmembran der γδ-T-Lymphozyten bei der gewählten Darstellung dunkelrot anfärben und - diese Anfärbung musste die Zelle zu mindestens drei Vierteln umgeben. 3.6.2.5. Bestimmung der Größe und Auszählung der CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten in den Lymphfollikeln der ilealen Peyerschen Platte Die Größe der Lymphhfollikel in der Peyerschen Platten im Ileum (iPP) wurde bei den Schnitten der Kontollgruppe, der S.b.- und der B.c.-Gruppe nach Darstellung von IgM bestimmt. Dabei wurde jeder Lymphfollikel der iPP, der vollständig angeschnitten war und von der Tunica muscularis bis zur Lamina muscularis mucosae reichte, zur Auswertung herangezogen. Mit dem Cursor des Microvid wurde der jeweilige Follikel umfahren und dadurch seine Fläche bestimmt. Für die Bestimmung der Anzahl an CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten, sowie der IgM+BLymphozyten, wurde jeder Lymphfollikel der iPP, der vollständig angeschnitten war und von der Muscularis bis zur Lamina muscularis mucosae reichte, zur Auswertung herangezogen. Über den jeweiligen Follikel wurde mit Hilfe eines Okularrasters (10x10 in 0,1mm) und des Cursors drei Quadrate auf einer Diagonalen definiert. Bei jeder Messung wurden auf diese Weise eine Fläche von 20546µm2 bei den CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten und eine Fläche von 5075µm2 58 Material und Methoden bei den IgM+B-Lymphozyten definiert. Die Auszählung der jeweiligen Zellfraktionen erfolgte in diesem Messrahmen. 3.7. Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der gezählten Zellen erfolgte mit dem Computer-Programm „statistic analysis system“ (SAS). Da nicht alle Messwerte normal verteilt waren, wurde der WilkoxonTwo-Sample-Test verwendet (SACHS 1984). Aus diesem Grunde sind die Ergebnisse in den Diagrammen als Medianwerte der jeweiligen Gruppe dargestellt. Als signifikant angesehen wurden p-Werte von weniger als 0,05. Ergebnisse 59 4. Ergebnisse Verteilung der IgA+Plasmazellen 4.1. 4.1.1. Kontrolltiere Die IgA+Plasmazellen in der Lamina propria verteilten sich in allen Darmabschnitten, sowohl im Bereich der Krypten als auch im Bereich der Zotten. Im Kryptbereich waren viele Plasmazellen vorhanden, im Zottenbereich waren sie nur sehr spärlich anzutreffen. Aufgrund dieser ungleichmäßigen Verteilung zwischen Krypten und Zotten wurden die IgA+Plasmazellen in beiden Bereichen getrennt ermittelt (Abb. 5 a, b). In der Submukosa waren nur sehr vereinzelt IgA+Plasmazellen zu finden. Intraepithelial waren weder im Oberflächen- noch im Kryptepithel IgA+Plasmazellen vorhanden. Im luminalen Saum der Krypten war mehr oder weniger intensiv eine Ablagerung von IgA darstellbar. Zwischen den Darmlokalisationen gab es Unterschiede in der Anzahl der Plasmazellen in der Lamina propria, die im folgenden getrennt für den Krypt- und Zottenbereich dargestellt werden sollen: Im Kryptbereich des Duodenums waren die meisten IgA+Plasmazellen (17,3 Zellen/105µm2) zu finden. Im proximalen Jejunum ging die Anzahl dieser Zellen auf ein Minimum von 11,6 Zellen/105µm2 zurück, während sie im mittleren Jejunum (13,8 Zellen/105µm2), Caecum (12,5 Zellen/105µm2) und proximalen Colon (12 Zellen/105µm2) wieder geringgradig vermehrt auftraten. In den Zotten waren wesentlich weniger IgA+Zellen vorhanden als in den Krypten. Im Duodenum lag die Anzahl der positiven Zellen mit 1,1 Zelle/105µm2 am höchsten. Bis zum mittleren Jejunum nahm sie auf 0,24 Zellen/105µm2 ab. 4.1.2. Saccharomyces boulardii Bei den mit S.b. behandelten Schweinen war eine den Kontrolltieren entsprechende Verteilung der IgA+Plasmazellen in der Mukosa zu finden. Auch die Schwankungen zwischen den verschiedenen Lokalisationen entlang des Darmes entsprach den Kontrolltieren. Es waren in allen Lokalisationen des Dünndarms mehr und in den Dickdarmlokalisationen weniger IgA+Plasmazellen als bei den Kontrolltieren vorhanden (Abb. 5a, b). 60 Ergebnisse Im Kryptbereich des Duodenums, in dem die meisten IgA+Plasmazellen zu finden waren, lag ihre Anzahl bei 22,4 Zellen/105µm2, im proximalen Jejunum ging ihre Zahl auf 12,1 Zellen/105µm2 zurück und im mittleren Jejunum stieg sie wieder auf 17 Zellen/105µm2 an. Im Dickdarm waren bei den mit S.b. behandelten Schweinen weniger IgA+Plasmazellen zu finden als bei den Kontrolltieren. Im Caecum waren mit 10,6 Zellen/105µm2 weniger IgA+Plasmazellen vorhanden als im proximalen Colon (11,8 Zellen/105µm2). Im Zottenbereich wurden im Duodenum 2,4 Zellen/105µm2 ermittelt, im proximalen und mittleren Jejunum nahm ihre Zahl auf 0,6 Zellen/105µm2 ab. Durch die Behandlung mit S.b. kam es in der Lamina propria des Dünndarms sowohl im Bereich der Krypten als auch der Zotten zu einer Zunahme der Anzahl der IgA+Plasmazellen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikant war diese Zunahme nur im Bereich der Zotten des Duodenums. Im Dickdarm war die Anzahl der IgA+Plasmazellen bei den mit S.b. behandelten Tiere geringer als bei der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied war nicht signifikant. 4.1.3. Bacillus cereus var. toyoi Die Verteilung der IgA+Plasmazellen in der Mukosa entsprach der bei den anderen beiden Gruppen. Die meisten IgA+Plasmazellen waren auch hier in der Lamina propria im Kryptbereich des Duodenums zu finden (18,7 Zellen/105µm2). Ihre Zahl nahm auf 13,5 Zellen/105µm2 im proximalen Jejunum und 13,3 Zellen/105µm2 im mittleren Jejunum ab. Die wenigsten IgA+Plasmazellen waren wie bei den mit S.b. behandelten Tieren im Caecum mit 8,7 Zellen/105µm2 und im proximalen Colon mit 9,3 Zellen/105µm2 zu finden. Im Zottenbereich führte die Gabe von B.c. zu einer Zunahme der IgA+Plasmazellen. Ihre Anzahl war im Duodenum mit 2,1 Zellen/105µm2 am höchsten; im proximalen und mittleren Jejunum waren mit 0,4 Zellen/105µm2 weniger IgA+Plasmazellen zu verzeichnen. Auch durch die Gabe von B.c. kam es in der Lamina propria der Krypten und Zotten des vorderen Dünndarms (Duodenum und proximales Jejunum) und der Zotten des mittleren Jejunums zu einer Zunahme der Anzahl der IgA+Plasmazellen (Abb. 5a, b). Diese Zunahme war im Zottenbereich des Duodenums signifikant gegenüber den Kontrolltieren. Im Dickdarm war die Anzahl der IgA+Plasmazellen bei den mit B.c. behandelten wie bei den mit S.b. behandelten Tiere geringer als bei den Kontrolltieren. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Ergebnisse 61 Diese Ergebnisse könnten ein Hinweis sein auf das Vorhandensein eines dichteren Epithels oder einen veminderten Antigenstimulus aus dem Darmlumen. 62 Ergebnisse 25 IgA+Plasmazellen/105 µm2 20 15 10 5 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox.Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 5a: Anzahl der IgA+Plasmazellen in der Lamina propria im Bereich der Krypten des Dünn- und Dickdarms Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der IgA+Plasmazellen mit dem monoklonalen Antikörper 27.9.1 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). Ergebnisse 63 2,5 IgA+Plasmazellen/105 µm2 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 5b: Anzahl der IgA+Plasmazellen in der Lamina propria im Bereich der Zotten des Dünndarms : mit p<0,05 von Kontrolle verschieden Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der IgA+Plasmazellen mit dem monoklonalen Antikörper 27.9.1 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 64 Ergebnisse Abb. 6: Vergleichende Darstellung der IgA+Plasmazellen in der Mukosa des Duodenums bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). A: Kontrolltier (S 2399/98): In der Lamina propria im Kryptbereich (K) sind viele (Pfeile exemplarisch), im Zottenstroma (Z) vereinzelte IgA+Plasmazellen zu finden. Eichstrich=50µm B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2404/98): Im Vergleich zu dem Kontrolltier sind mehr IgA+Plasmazellen, besonders in den Zotten, aber auch in der Lamina propria im Bereich der Krypten zu erkennen. Eichstrich=100µm Abb. 7: Vergleichende Darstellung der IgA+Plasmazellen in der Mukosa des proximalen Colons bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). A: Kontrolltier (S 2400/98): IgA+Plasmazellen sind vor allem in der Lamina propria in der unteren Hälfte der Krypten zu finden (Pfeile exemplarisch). Ihre Anzahl ist geringer als im Dünndarm (Abb. 6A). Neben dem intrazellulären Immunglobulin stellen sich die Kryptlumina (L) positiv dar. B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2404/98): Es sind nur einzelne IgA+Plasmazellen in der Lamina propria zwischen den Krypten zu erkennen. Ihre Anzahl ist geringer als bei dem Kontrolltier (Abb. 7A). Eichstrich=50µm Ergebnisse 65 66 Ergebnisse Verteilung der CD6+T-Lymphozyten 4.2. 4.2.1. Kontrolltiere CD6+T-Lymphozyten waren in der Lamina propria der Krypten und der Zotten zu finden. Die Verteilung war zum einen diffus, zum anderen waren multiple Ansammlungen von CD6+TLymphozyten in unmittelbarer Nähe der Lamina muscularis mucosae und am Übergang von den Krypten zu den Zotten zu finden. Viele CD6+T-Lymphozyten lagen intraepithelial, vor allem im Zottenepithel, so dass dieser Bereich in die Messung einbezogen wurde. Im Zottenbereich waren mehr CD6+T-Lymphozyten zu finden als im Kryptbereich. Daher wurde die Zählung getrennt im Bereich der Krypten und der Zotten vorgenommen. Vereinzelt kamen CD6+T-Lymphozyten in der Submukosa vor. Anzahl und Verteilung der CD6+T-Lymphozyten in den verschiedenen Darmabschnitten sind in Abbildung. 8 a und b dargestellt: Im Bereich der Krypten waren im Dünndarm die meisten CD6+T-Lymphozyten mit 58,8 Zellen/105µm2 im proximalen Jejunum zu finden und die wenigsten mit 43,6 Zellen/105µm2 im mittleren Jejunum. Das Duodenum lag mit 50,3 Zellen/105µm2 dazwischen. Im Dickdarm waren im Caecum geringgradig mehr CD6+T-Lymphozyten (44,9 Zellen/105µm2) zu finden als im proximalen Colon (40,9 Zellen/105µm2). Die Unterschiede in der Anzahl der CD6+TLymphozyten zwischen den verschiedenen Darmlokalisationen waren im Kryptbereich nicht sehr ausgeprägt. Im Zottenbereich waren mehr CD6+T-Lymphozyten als im Kryptbereich zu finden. Die meisten wurden mit 92,9 Zellen/105µm2 im proximalen Jejunum gezählt; die wenigsten mit 68,8 Zellen/105µm2 im mittleren Jejunum. 4.2.2. Saccharomyces boulardii Das Verteilungsmuster der CD6+T-Lymphozyten war bei den mit S.b. behandelten Schweinen dasselbe wie bei den Kontrolltieren. Auch hier waren im Zottenbereich mehr CD6+TLymphozyten zu finden als im Kryptbereich (Abb. 8a, b). Im Kryptbereich wies das proximale Jejunum mit 61,7 Zellen/105µm2 die meisten CD6+TLymphozyten auf und das mittlere Jejunum mit 44,3 Zellen/105µm2 die wenigsten. Im Dickdarm Ergebnisse 67 waren im Caecum mit 53,8 Zellen/105µm2 mehr Zellen als im proximalen Colon (41,6 Zellen/105µm2) vorhanden. Im Zottenbereich lagen im Duodenum mit 86,7 Zellen/105µm2 die meisten CD6+T-Lymphozyten und im mittleren Jejunum mit 81,9 Zellen/105µm2 die wenigsten. Mit Ausnahme der Zotten des proximalen Jejunums kam es durch die Gabe von S.b. in allen Darmlokalisationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer Zunahme der Anzahl der CD6+TLymphozyten. In den Zotten des mittleren Jejunums war diese Zunahme der CD6+TLymphozyten bei den mit S.b. behandelten Schweinen gegenüber den Kontrolltieren signifikant. 4.2.3. Bacillus cereus Bei den mit B.c. behandelten Schweinen zeigten die CD6+T-Lymphozyten dasselbe Verteilungsmuster wie bei den Kontrolltieren und den mit S.b. behandelten Tieren (Abb. 8a, b). Im Bereich der Krypten waren im Duodenum mit 66,5 Zellen/105µm2 die meisten CD6+TLymphozyten des Dünndarms zu finden. Im proximalen Jejunum und im mittleren Jejunum befanden sich mit 56,9 Zellen/105µm2 und 54,3 Zellen/105µm2 deutlicher weniger CD6+TLymphozyten. Im proximalen Colon waren mit 39,1 Zellen/105µm2 mehr Zellen zu finden als im Caecum 33,1 Zellen/105µm2. In den Zotten waren wieder mehr CD6+T-Lymphozyten vorhanden als im Bereich der Krypten. Die Schwankungen zwischen den einzelnen untersuchten Lokalisationen waren gering. So fanden sich im Duodenum mit 102,9 Zellen/105µm2 die meisten und im proximalen Jejunum mit 86,7 Zellen/105µm2 die wenigsten CD6+T-Lymphozyten. Durch die Gabe von B.c. kam es im Duodenum und mittleren Jejunum sowohl im Krypt- als auch im Zottenbereich zu einer tendenziellen Zunahme an CD6+T-Lymphozyten im Vergleich zu den Kontrolltieren. Im Bereich der Krypten gab es keine signifikanten Unterschiede zu den beiden anderen Gruppen. In den Zotten des mittleren Jejunums lag die Zahl der CD6+T-Lymphozyten bei den mit B.c. behandelten Tieren signifikant über der der Kontrolltiere. D6+T-Lymphozyten/105 µm2 68 Ergebnisse 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox.Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 8a: Anzahl der CD6+T-Lymphozyten in der Lamina propria im Bereich der Krypten im Dünn- und Dickdarm Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD6+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper a38b2 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). Ergebnisse 69 12 CD6+T-Lymphozyten/105 µm2 10 8 6 4 2 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 8b: Anzahl der CD6+T-Lymphozyten in der Lamina propria im Bereich der Zotten des Dünndarms : mit p<0,05 von Kontrolle verschieden Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD6+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper a38b2 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 70 Ergebnisse Abb. 9: Vergleichende Darstellung der CD6+T-Lymphozyten in der Mukosa des mittleren Jejunums bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2400/98): CD6+T-Lymphozyten sind in der Lamina propria (Pfeile exemplarisch) und im Epithel (Pfeile exemplarisch), vor allem im Zottenbereich (Z), und weniger im Kryptbereich (K) zu finden. Es sind weniger CD6+T-Lymphozyten zu finden als bei den mit S.b. behandelten Tieren. B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2404/98): Die Anzahl der CD6+T-Lymphozyten ist vor allem im Zottenbereich erhöht im Vergleich zum Kontrolltier (Abb. 9A). CD6+T-Lymphozyten bilden z.T. kleine Zellansammlungen (siehe Sternchen) in der Lamina propria. Ergebnisse 71 72 Ergebnisse Abb. 10: Vergleichende Darstellung der CD6+T-Lymphozyten im Caecum bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2400/98): CD6+T-Lymphozyten liegen überwiegend einzeln, gleichmäßig verteilt in der Lamina propria (Pfeile exemplarisch) und im Epithel (Pfeilspitzen exemplarisch). Multifokal sind kleine Zellansammlungen (siehe Sternchen) in der Lamina propria zu erkennen. B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2404/98): Die Anzahl der CD6+T-Lymphozyten ist im Vergleich zum Kontrolltier erhöht. In der Lamina propria sind mehrere größere Zellansammlungen (siehe Sternchen), vor allem lumennah, erkennbar. Ergebnisse 73 74 Ergebnisse 4.3. Verteilung der CD4+T-Lymphozyten 4.3.1. Kontrolltiere Bei allen Tieren der Kontrollgruppe waren CD4+T-Lymphozyten vorwiegend in der Lamina propria zu finden, in der sie gleichmäßig verteilt lagen. Im Zottenbereich waren mehr CD4+TLymphozyten als im Kryptbereich vorhanden. Daher wurden diese beiden Bereiche getrennt ausgezählt. Intraepithelial waren, sowohl im Oberflächen- als auch im Kryptepithel wenige, subepithelial vereinzelte CD4+T-Lymphozyten zu finden. Bei der Auswertung wurden im Epithel und in der Submukosa gelegene CD4+T-Lymphozyten nicht berücksichtigt. Zwischen den verschiedenen Darmlokalisationen traten Schwankungen in der Zahl der CD4+TLymphozyten auf (Abb. 11a, b): In der Lamina propria des Kryptbereichs war die Anzahl der CD4+T-Lymphozyten im Dünndarm in der Duodenumlokalisation mit 38 Zellen/105µm2 am geringsten. Im proximalen Jejunum erreichte sie mit mit 45,7 Zellen/105µm2 den Maximalwert und im mittleren Jejunum lag sie bei 43,7 Zellen/105µm2. Im Dickdarm waren im Caecum mit 38,4 Zellen/105µm2 geringfügig mehr CD4+T-Lymphozyten vorhanden als im proximalen Colon (37 Zellen/105µm2), in dem die wenigsten CD4+T-Lymphozyten im gesamten Darm gefunden wurden. Die Schwankungen der Anzahl der CD4+T-Lymphozyten zwischen den untersuchten Darmlokalisationen waren im Bereich der Krypten nicht sehr ausgeprägt. In der Lamina propria der Zotten waren mehr CD4+T-Lymphozyten zu finden als im Kryptbereich. Die höchsten Zellzahlen wurden mit 51,3 Zellen/105µm2 im Duodenum gefunden, während ihre Zahl im proximalen Jejunum bei 46,6 Zellen/105µm2 und im mittleren Jejunum bei 48,4 Zellen/105µm2 lag. 4.3.2. Saccharomyces boulardii Bei den mit S.b. behandelten Schweinen waren die CD4+T-Lymphozyten wie bei den Kontrolltieren in der Mukosa verteilt und auch die Schwankungen der Zellzahlen zwischen den Darmabschnitten entsprachen denen der Kontrolltiere (Abb. 11a, b). In der Lamina propria des Kryptbereichs waren im Dünndarm die wenigsten CD4+TLymphozyten mit 35,3 Zellen/105µm2 im Duodenum zu finden. Es erfolgte eine Zunahme auf 48 Zellen/105µm2 im proximalen Jejunum, der Lokalisation mit der höchsten Zahl CD4+T- Ergebnisse 75 Lymphozyten im Kryptbereich des gesamten Darms. Die Anzahl an CD4+T-Lymphozyten lag im mittleren Jejunum mit 40,5 Zellen/105µm2 zwischen der im Duodenum und dem proximalen Jejunum. Im Caecum waren 42,6 Zellen/105µm2 vorhanden. Ihre Zahl nahm auf 30,6 Zellen/105µm2 im proximalen Colon ab. In der Lamina propria der Zotten waren im Duodenum 43,2 Zellen/105µm2 zu finden. Von 54,2 Zellen/105µm2 im proximalen Jejunum war ein Anstieg auf 58,8 Zellen/105µm2 im mittleren Jejunum zu verzeichnen. Im Bereich der Krypten gab es keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl an CD4+TLymphozyten zwischen der mit S.b. behandelten Tiergruppe und den mit B.c. behandelten Tieren oder der Kontrollgruppe. Es wurden jedoch nach Gabe von S.b. im proximalen Jejunum und im Caecum eine erhöhte Anzahl von CD4+T-Lymphozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden. In den Zotten waren bei den mit S.b. behandelten Tieren im proximalen und mittleren Jejunum mehr CD4+T-Lymphozyten zu finden. Die Anzahl der CD4+T-Lymphozyten im Zottenbereich war im mittleren Jejunum gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. 4.3.3. Bacillus cereus Bei allen Tieren dieser Gruppe lag ein Verteilungsmuster der CD4+T-Lymphozyten wie bei den Kontrolltieren und den mit S.b. behandelten Tieren vor (Abb. 11a, b). In der Lamina propria im Bereich der Krypten waren in allen drei Lokalisationen des Dünndarms mehr CD4+T-Lymphozyten zu finden als im Dickdarm. Die meisten CD4+T-Lymphozyten fanden sich im proximalen Jejunum mit 49,5 Zellen/105µm2, die wenigsten im mittleren Jejunum mit 43,9 Zellen/105µm2. Die Zellzahlen des Duodenums lagen mit 47,6 Zellen/105µm2 dazwischen. Im Dickdarm waren im Caecum mit 39,1 Zellen/105µm2 mehr Zellen vorhanden als im proximalen Colon mit 28,7 Zellen/105µm2. In der Lamina propria im Bereich der Zotten war wie bei den mit S.b. behandelten Tieren ein Anstieg der Anzahl der CD4+T-Lymphozyten vom Duodenum (45,3 Zellen/105µm2) auf das proximale Jejunum (56,3 Zellen/105µm2) auf die maximale Zellzahl im mittleren Jejunum (58,8 Zellen/105µm2) zu finden. Im Duodenum und proximalen Jejunum waren bei den mit B.c. behandelten Schweinen geringgradig mehr CD4+T-Lymphozyten zu finden als bei denen mit S.b. behandelten Tieren. Nach der Gabe von B.c kam es zu vergleichbaren Veränderungen der Anzahl der CD4+TLymphozyten wie nach der Gabe von S.b. Im Zottenbereich lag die Anzahl der CD4+T- 76 Ergebnisse Lymphozyten bei den mit B.c. behandelten Tieren im mittleren Jejunum signifikant über der der Kontrolltiere. Die erhöhte Anzahl an CD4+T-Lymphozyten könnte eine mögliche Ursache für die gestiegene Anzahl an IgA+Plasmazellen in der Lamina propria sein und hierdurch zum Schutz der Schleimhaut beitragen. Ergebnisse 77 60 50 CD4+T-Lymphozyten/105 µm2 40 30 20 10 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox.Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 11a: Anzahl der CD4+T-Lymphozyten in der Lamina propria im Bereich der Krypten im Dünn- und Dickdarm Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD4+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 74-12-4 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Streptavidin-Biotin-Methode (s. 3.4.4), einer Enzym-AntiEnzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 78 Ergebnisse 70 60 D4+T-Lymphozyten/105 µm2 50 40 30 20 10 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 11b: Anzahl der CD4+T-Lymphozyten in der Lamina propria im Bereich der Zotten im Dünndarm : mit p<0,05 von Kontrolle verschieden Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD4+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 74-12-4 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Streptavidin-Biotin-Methode (s. 3.4.4), einer Enzym-AntiEnzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). Ergebnisse 79 Abb. 12: Vergleichende Darstellung der CD4+T-Lymphozyten in den Zotten des mittleren Jejunums bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit B.c. behandelten Tier (B). Eichstrich=50µm A: Kontrolltier (S 2407/98): Die CD4+T-Lymphozyten liegen überwiegend in einer oder mehreren Lagen subepithelial.. B: Mit B.c. behandeltes Tier (S 2413/98): Es finden sich Ansammlungen (siehe Sternchen) von CD4+T-Lymphozyten in den Zotten. Ihre Anzahl ist im Vergleich zum Kontrolltier höher. Abb. 13: Vergleichende Darstellung der CD4+T-Lymphozyten in der Mukosa des Caecums bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier: (S 2401/98): Beim Kontrolltier finden sich einzeln in der Mukosa liegende CD4+T-Lymphozyten B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2402/98): Neben den gleichmäßig in der Mukosa verteilt liegenden CD4+T-Lymphozyten sind mehrere Ansammlungen (siehe Sternchen) dieser Zellen im lumennahen Bereich zu erkennen. 80 Ergebnisse Ergebnisse 4.4. 81 Verteilung der CD8+T-Lymphozyten 4.4.1. Kontrolltiere CD8+T-Lymphozyten waren gleichmäßig verteilt in der Lamina propria, besonders gehäuft aber im Zotten- und Kryptepithel zu finden. Die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Zottenepithel war größer als im Kryptepithel. Daher wurde eine Zählung dieser Zellen getrennt für die Zotten und Krypten vorgenommen. Vereinzelte CD8+T-Lymphozyten gab es in der Submukosa. Die Zellzahlen sind in Abbildung 14 a, b und c zusammengefasst. Im Kryptepithel befanden sich besonders viele CD8+T-Lymphozyten im Duodenum (16,2 Zellen/106µm) und proximalen Jejunum (16,6 Zellen/106µm), und weniger im mittleren Jejunum (10,3 Zellen/106µm). Wesentlich mehr Zellen waren im Kryptepithel des Dickdarmes zu finden. Im Caecum war 0,9 Zelle/102µm Epithellänge zu verzeichnen, während im proximalen Colon 1,3 Zellen/102µm Epithellänge zu finden waren. Im Bereich des Zottenepithels waren wesentlich mehr CD8+T-Lymphozyten als im Kryptepithel des Dünndarmes vorhanden. Ihre Anzahl betrug im Duodenum 7,5 Zellen/102µm Epithellänge, im proximalen Jejunum 12 Zellen/102µm Epithellänge und im mittleren Jejunum 9,1 Zellen/102µm Epithellänge. 4.4.2. Saccharomyces boulardii Die Verteilung der CD8+T-Lymphozyten war wie bei den Kontrolltieren beschrieben. Die Zellzahlen sind in Abbildung 14 a, b und c zusammengefasst. Im Kryptepithel des Dünndarms gab es eine Zunahme der CD8+T-Lymphozyten vom Duodenum mit 9,4 Zellen/106µm Epithellänge über das proximale Jejunum mit 13,9 Zellen/106µm Epithellänge zum mittleren Jejunum auf 14,1 Zellen/106µm Epithellänge. Im Dickdarm lag ihre Zahl bei 0,9 Zellen/102µm Epithellänge im Caecum und 1,4 Zellen/102µm Epithellänge im proximalen Colon. Im Bereich des Zottenepithels waren die wenigsten CD8+T-Lymphozyten mit 6,7 Zellen/102µm Epithellänge im Duodenum zu finden. Im proximalen Jejunum waren mit 10,9 Zellen/102µm Epithellänge die meisten Zellen zu finden und im mittleren Jejunum fanden sich 9,9 Zellen/102µm Epithellänge. 82 Ergebnisse Während bei den mit S.b. behandelten Schweinen die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Duodenum und proximalen Jejunum unter der der Kontrolltiere lag, wurde im mittleren Jejunum sowohl im Krypt- als auch im Zottenepithel, sowie im Kryptepithel des proximalen Colons eine Erhöhung der Anzahl der CD8+T-Lymphozyten beobachtet. Die beschriebenen Unterschiede waren nicht signifikant. 4.4.3. Bacillus cereus Das Verteilungsmuster der CD8+T-Lymphozyten bei den mit B.c. behandelten Schweinen entsprach dem der beiden Vergleichsgruppen. Die Zellzahlen sind in Abbildung 14 a, b und c zusammengefasst. Im Kryptepithel gab es im Dünndarm einen Anstieg der CD8+T-Lymphozyten von 8,5 Zellen/106µm Epithellänge im Duodenum über 11,3 Zellen/106µm Epithellänge im proximalen Jejunum auf 15,8 Zellen/106µm Epithellänge im mittleren Jejunum. Im Dickdarm lag die Zahl der CD8+T-Lymphozyten wie bei den anderen Gruppen auch sehr viel höher als im Dünndarm. Im Caecum gab es 1 Zelle/102µm Epithellänge und im proximalen Colon 1,1 Zellen/102µm Epithellänge. Im Zottenepithel waren im Duodenum mit 8,8 Zellen/102µm Epithellänge die wenigsten CD8+TLymphozyten vorhanden. Die meisten fanden sich im proximalen Jejunum mit 10,9 Zellen/102µm Epithellänge. Im mittleren Jejunum waren mit 9,7 Zellen/102µm Epithellänge wieder weniger Zellen zu finden. Nach Gabe von B.c. kam es zu Veränderungen der Zahl der CD8+T-Lymphozyten im Epithel, die denen nach der Gabe von S.b. entsprachen, wobei die Abweichungen von den Zahlen der Kontrolltiere größtenteils deutlicher ausgeprägt waren. Die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Die Erhöhung dieser Zellfraktion könnte zu einer besseren Reaktion auf eindringende Antigene führen, da sie die vorderste Abwehrlinie des DSIS darstellen. Ergebnisse 83 22 20 18 CD8+T-Lymphozyten/106 µm 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 14a: Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Kryptepithel des Dünndarms Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Auf Grund stark differierender Dimensionen wird die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Kryptepithel des Dickdarms in einem gesonderten Diagramm dargestellt (s. Abb. 14b). Darstellung der CD8+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 11-295-33 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 84 Ergebnisse 1,6 1,4 D8+T-Lymphozyten/102 µm 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox. Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 14b: Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Kryptepithel des Dickdarms Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Auf Grund stark differierender Dimensionen wird die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Kryptepithel des Dünndarms in einem gesonderten Diagramm dargestellt (s. Abb. 14a). Darstellung der CD8+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 11-295-33 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). Ergebnisse 85 D8+T-Lymphozyten/102 µm 10 5 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 14c: Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Zottenepithel des Dünndarms Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD8+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 11-295-33 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 86 Ergebnisse Abb. 15: Vergleichende Darstellung der CD8+T-Lymphozyten in den Zotten des mittleren Jejunums bei einem Kontrolltier (A), bei einem mit S.b. behandelten Tier (B) und bei einem mit B.c. behandelten Tier (C). Eichstrich=50µm A: Kontrolltier (S 2407/98): Im Zottenepithel (Pfeilspitzen exemplarisch) sind viele CD8+T-Lymphozyten zu erkennen. Einige CD8+T-Lymphozyten befinden sich im Zottenstroma (Pfeile exemplarisch). B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2403/98): Die Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Epithel und in der Lamina propria ist im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 15A) erhöht. C: Mit B.c. behandeltes Tier (S 2413/98): Im Vergleich zu dem mit S.b. behandelten Tier liegt eine weitere Zunahme der CD8+TLymphozyten, insbesondere im Epithel vor. Abb. 16: Vergleichende Darstellung der CD8+T-Lymphozyten im proximalen Colon bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2400/98): CD8+T-Lymphozyten sind vor allem im Epithel (Pfeilspitzen exemplarisch), aber auch in der Lamina propria (Pfeile exemplarisch) zu finden. B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2403/98): Die Zahl der CD8+T-Lymphozyten im Epithel und in der Lamina propria ist im Vergleich zum Kontrolltier erhöht. Ergebnisse 87 88 Ergebnisse 4.5. Verteilung der γδ-T-Lymphozytensubpopulation, die durch die mAks 86D und 320 dargestellt wurden 4.5.1. Kontrolltiere Die γδ-T-Lymphozyten, die durch die mAks 86D und 320 markiert wurden, kamen nur sehr spärlich in der Mukosa der einzelnen Darmabschnitte vor. Aus diesem Grunde wurde die ausgewertete Fläche der Mukosa größer gewählt als bei den anderen untersuchten Subpopulationen und die Anzahl der positiven Zellen/0,5 mm2 angegeben. Die γδ-T-Lymphozyten befanden sich vorwiegend in der Lamina propria. In der Submukosa waren nur sehr vereinzelt Zellen zu finden. Da die γδ-T-Lymphozyten gleichmäßig auf Krypt- und Zottenbereich verteilt waren, wurden diese Bereiche nicht getrennt ausgezählt. Anzahl und Verteilung der Zellen sind in Abbildung 17 a, b dargestellt. Bei der Untersuchung mit dem mAK 86D waren durchschnittlich weniger Zellen darstellbar als mit dem mAk 320. Die meisten 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten befanden sich mit 6,6 Zellen/0,5mm2 im mittleren Jejunum; die geringste Anzahl war mit 0,2 Zellen/0,5mm2 im proximalen Jejunum zu finden. Im Dickdarm wies das Caecum mit 3,1 Zellen/0,5mm2 mehr 86Dpositive γδ-T-Lymphozyten auf als das proximale Colon mit 1,7 Zellen/0,5mm2. Die meisten γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAk 320 markiert wurden, kamen mit 15,8 Zellen/0,5mm2 im proximalen Jejunum vor; die wenigsten waren mit 5,7 Zellen/0,5mm2 im mittleren Jejunum zu verzeichnen. Im Dickdarm kamen die meisten im Caecum vor mit 9 Zellen/0,5mm2, worauf eine Abnahme auf 8 Zellen/0,5mm2 im proximalen Colon erfolgte. 4.5.2. Saccharomyces boulardii Die für die Kontrolltiere beschriebene Verteilung der γδ-T-Lymphozyten war auch bei den mit S.b. behandelten Schweinen zu finden. Auch bei dieser Gruppe waren die meisten 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten mit 11,3 Zellen/0,5mm2 im mittleren Jejunum und die wenigsten mit 3,3 Zellen/0,5mm2 im proximalen Jejunum darstellbar. Das Caecum wies mit 6 Zellen/0,5mm2 mehr 86D-positive γδ-TLymphozyten auf als das proximale Colon mit 4,7 Zellen/0,5mm2. Ergebnisse 89 Die meisten γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAk 320 erkannt wurden, waren mit 21 Zellen/0,5mm2 im proximalen Jejunum zu finden, die geringste Zellzahl war im mittleren Jejunum zu finden mit 10 Zellen/0,5mm2. Im Caecum lag ihre Zahl bei 9,2 Zellen/0,5mm2 und im proximalen Colon bei 11,4 Zellen/0,5mm2. Die Anzahl der γδ-T-Lymphozyten, die durch die mAks 86D und 320 erkannt wurden, war bei den mit S.b. behandelten Schweinen in allen Darmlokalisationen höher als bei den Kontrolltieren. Die erhöhte Anzahl der 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten im proximalen Jejunum und im proximalen Colon bei den mit S.b. behandelten Tieren unterschied sich signifikant von den Kontrolltieren. 4.5.3. Bacillus cereus Auch bei den mit B.c. behandelten Tieren war ein mit den Kontrolltieren vergleichbares Verteilungsmuster der γδ-T-Lymphozyten zu finden. Auch hier waren im mittleren Jejunum mit 7,2 Zellen/0,5mm2 die meisten 86D-positiven γδ-TLymphozyten des Darmes zu finden. Die Zellzahlen der übrigen Lokalisationen wichen nur geringgradig voneinander ab. Sie lagen im Duodenum und proximalen Colon bei 2,5 Zellen/0,5mm2 und im proximalen Jejunum und Caecum bei 2,6 Zellen/0,5mm2. Wie bei der Kontrollgruppe und der mit S.b.-behandelten Gruppe waren die meisten γδ-TLymphozyten, die durch den mAk 320 erkannt wurden, mit 18 Zellen/0,5mm2 im proximalen Jejunum zu finden und die wenigsten mit 11,9 Zellen/0,5mm2 im mittleren Jejunum. Im Dickdarm fanden sich meisten Zellen im proximalen Colon (13,1 Zellen/0,5mm2). Durch die Gabe von B.c. kam es zu einer im Vergleich zu den Kontrolltieren höheren Anzahl an 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten im proximalen und mittleren Jejunum sowie im proximalen Colon und zu einer erhöhten Anzahl an γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAK 320 erkannt wurden im gesamten Darm. Die Zunahme der 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten im proximalen Jejunum war signifikant gegenüber den Kontrolltieren. Die erhöhte Anzahl an γδ-T-Lymphozyten könnte für einen verbesserten Schutz der Schleimhaut sprechen. 90 Ergebnisse 16 14 86D+T-Lymphozyten/0,5 mm2 12 10 8 6 4 2 0 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox.Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 17a: Anzahl der 86D-positiven γδ-T-Lymphozyten in der Mukosa des Dünn- und Dickdarmes : mit p<0,05 von Kontrolle verschieden Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der γδ-T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 86D (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). mAK 320+T-Lymphozyten/0,5 mm2 Ergebnisse 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 91 Duodenum Prox. Jej. Mit. Jej. Caecum Prox.Colon Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 17b: Anzahl der durch den mAK 320 markierten γδ-T-Lymphozyten in der Mukosa des Dünn- und Dickdarms Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der γδ-T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper Mac320 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-Enzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). 92 Ergebnisse Abb. 18: Vergleichende Darstellung der γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAk 86D markiert werden, im mittleren Jejunum bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit B.c. behandelten Tier (B). Dieser Zelltyp ist im gesamten Darm sehr selten anzutreffen. Eichstrich=50µm A: Kontrolltier (S 2399/98): Einzelne γδ-T-Lymphozyten finden sich in der Lamina propria (Pfeile exemplarisch). B: Mit B.c. behandeltes Tier (S 2410/98): Die Anzahl der γδ-T-Lymphozyten ist im Vergleich zum Kontrolltier geringgradig erhöht. Abb. 19: Vergleichende Darstellung der γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAk 86D markiert werden, im Caecum bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2407/98): Einzelne γδ-T-Lymphozyten finden sich in der Mukosa (Pfeile exemplarisch). B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2402/98): Im Vergleich zum Kontrolltier ist die Anzahl der γδ-T-Lymphozyten geringgradig erhöht. Ergebnisse 93 94 Ergebnisse Abb. 20: Vergleichende Darstellung der γδ-T-Lymphozyten, die durch mAk 320 markiert werden, im Duodenum bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit S.b. behandelten Tier (B). Dieser Zelltyp ist im gesamten Darm spärlich vertreten. Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2399/98): Einzelne γδ-T-Lymphozyten finden sich in der Mukosa (Pfeile exemplarisch). Ihre Anzahl ist höher als die der γδ-T-Lymphozyten, die durch den mAk 86D markiert werden (Abb. 18A). B: Mit S.b. behandeltes Tier (S 2402/98): Im Vergleich zum Kontrolltier ist die Anzahl der γδ-T-Lymphozyten geringgradig erhöht. Abb. 21: Vergleichende Darstellung der γδ-T-Lymphozyten, die durch mAk 320 markiert werden, im proximalen Colon bei einem Kontrolltier (A) und bei einem mit B.c. behandelten Tier (B). Eichstrich=100µm A: Kontrolltier (S 2399/98): Vereinzelt liegen γδ-T-Lymphozyten in der Mukosa (Pfeile exemplarisch). Ihre Anzahl ist geringer als im Duodenum (Abb. 20A). B: Mit B.c. behandeltes Tier (S 2412/98): Im Vergleich zum Kontrolltier ist die Anzahl der γδ-T-Lymphozyten geringgradig erhöht. Ergebnisse 95 96 Ergebnisse 4.6. Größe und Zellzusammensetzung der Lymphfollikel in der ilealen Peyerschen Platte ´ (iPP) Die Größe der Lymphfollikel in der iPP wurde in den Schnitten ausgewertet, bei denen die IgM+B-Lymphozyten dargestellt wurden. Die größten Lymphfollikel fanden sich mit durchschnittlich 0,7mm2 Fläche bei den mit S.b. behandelten Tieren und die kleinsten mit durchschnittlich 0,61mm2 bei den Kontrolltieren. Die Größenunterschiede zwischen den drei untersuchten Gruppen waren geringgradig und nicht signifikant. Die Mehrzahl der Zellen in den Lymphfollikeln waren IgM+B-Lymphozyten (s. Abb. 22). Die größte Zelldichte an IgM+Lymphozyten gab es bei den Kontrolltieren mit 8,7 Zellen/103µm2. Die geringste Zelldichte fand sich bei den mit B.c. behandelten Tieren mit 7,6 Zellen/103µm2. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den mit S.b.- und B.c. behandelten Tieren. In den Lymphfollikeln waren sehr viel weniger T-Lymphozyten als B-Lymphozyten vertreten (s. Abb. 22): Die Zellzahlschwankungen der CD6+T-Lymphozyten zwischen den drei untersuchten Gruppen waren gering. Die geringste Zelldichte an CD6+T- Lymphozyten fanden sich bei der mit B.c. behandelten Tiergruppe mit 8 Zellen/104µm2, die höchste bei der mit S.b. behandelten Gruppe mit 8,6 Zellen/104µm2. Es gab keine signifikanten Unterschiede. Bei den CD4+T-Lymphozyten war die höchste Zelldichte mit 11,7 Zellen/104µm2 bei der Kontrollgruppe zu finden und die geringste bei der mit B.c. behandelten Gruppe (10,7 Zellen/104µm2). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Bei den CD8+T-Lymphozyten war die geringste Zelldichte bei der S.b. behandelten Gruppe mit 13,6 Zellen/105µm2 und die höchste bei den Kontrolltieren (19,5 Zellen/105µm2) zu finden. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. B- und T-Lymphozyten/104 µm2 Ergebnisse 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 97 CD 4 CD 6 CD8 IgM Kontrolle Saccharomyces boulardii Bacillus cereus var. toyoi Abb. 22: Anzahl der B- und T-Lymphozyten in der ilealen Peyerschen Platte Prox. Jej. = proximales Jejunum, Mit. Jej. = mittleres Jejunum, Prox. Colon = proximales Colon Darstellung der CD4+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 74-12-4 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Streptavidin-Biotin-Methode (s. 3.4.4), einer Enzym-AntiEnzymkomplex-Methode (s. 3.4.1). Darstellung der CD6+T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper a38b2, der CD8+TLymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 11-295-33 und der IgM+B-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper 28.4.1 (s. Tabelle 4 unter 3.4.2) mit Hilfe der Alkalische- 98 Ergebnisse Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode (s. 3.4.3), einer Enzym-Anti-EnzymkomplexMethode (s. 3.4.1). Das Säulendiagramm zeigt die Medianwerte, die mit Hilfe des SAS-Computerprogramms erstellt wurden (s. 3.7). Diskussion 99 5. Diskussion Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, welchen Einfluss zwei verschiedene Probiotika auf die Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation und Plasmazellen in der Darmschleimhaut gesunder Schweine haben, und ob durch die Applikation der Probiotika die Darmschleimhautbarriere optimiert und so ein besserer Schutz der Schleimhaut gegen Krankheitserreger erreicht werden kann. Unter dem Begriff Probiotika wird eine Gruppe verschiedenster Mikroorganismen zusammengefasst, denen gemeinsam ist, dass sie nach oraler Applikation eine „vorteilhafte“ Wirkung auf den Wirtsorganismus haben (FULLER 1989; VANBELLE et al. 1990). In der vorliegenden Studie wurden eine Hefe und ein Sporenbildner als Probiotika eingesetzt, um abzuklären, ob es ein gemeinsames Wirkungsprinzip gibt, oder ob diese sehr unterschiedlichen Mikroorganismen verschiedene Wirkungsprinzipien haben. Die vorteilhafte Wirkung der Probiotika kommt durch verschiedene nebeneinander ablaufende Wirkungsmechanismen zustande, die nicht alle im einzelnen genau aufgeklärt sind (THELEN 1997; FULLER 1989; GÖRKE u. LIEBLER-TENORIO 2001). Bisherige Untersuchungen konnten zeigen, dass Probiotika u.a. auch das Immunsystem beeinflussen können. Dieses ist nicht ungewöhnlich, da bekannt ist, dass Mikroorganismen vom Darmlumen aus das Darmschleimhautimmunsystem (DSIS) aktivieren oder schädigen können. Die vorliegende Studie wurde am Verdauungstrakt von Schweinen durchgeführt, da diese als Omnivoren einerseits eine höhere Vergleichbarkeit mit dem Verdauungstrakt des Menschen aufweisen als beispielsweise Nager oder Wiederkäuer, und da sie aufgrund ihrer Größe ausreichende Gewebemengen liefern. Um Unterschiede durch genetische Variation zwischen den einzelnen Tieren möglichst gering zu halten, wurden Tiere aus demselben Herkunftsbetrieb verwendet. Das Darmschleimhautimmunsystem wird beim gesunden Schwein neben den Mikroorganismen im Darmlumen von verschiedenen Faktoren, wie Alter, Futtermittelantigenen, Haltungsbedingungen (Stallhygiene) beeinflusst (KAHRS 1986; HIUS IN’T VELD 1998; FULLER 1989, 1992; ROTHKÖTTER et al. 1994; STAVRIC u. KORNEGAY 1995; JIN et al. 1997; ROTHKÖTTER et al. 1999; KAHRMAN et al. 2000). Um einen möglichst einheitlichen Einfluss dieser Faktoren zu erzielen, wurden Tiere gleichen Alters verwendet, die vor Beginn der Probiotikumapplikation für 2 Wochen im gleichen Stall unter einheitlichen Bedingungen gehalten 100 Diskussion wurden und das gleiche Futter erhielten. Die entlang des Darmes auftretenden regionalen Unterschiede des DSIS und die möglicherweise unterschiedliche Aktivität der Probiotika in verschiedenen Darmabschnitten, wurde durch eine repräsentative Probenentnahme entlang des Darmes berücksichtigt. Die Gabe der Probiotika erfolgte täglich über mehrere Tage bzw. Wochen, da Probiotika erst nach einer zeitlichen Verzögerung im Zusammenhang mit der Einstellung des ökologischen Gleichgewichtes im Darm ihre Wirkung entfalten können (HUIS IN´T VELD 1998). Die Zeitdauer, über die die beiden Probiotika verabreicht wurden, wurde so gewählt, dass bei beiden Präparaten ein Wirkplateau erreicht wurde. Die Verabfolgung von Bacillus cereus var. toyoi (B.c.) erfolgte laut der Empfehlung des Herstellers über drei Wochen. Saccharomyces boulardii (S.b.) wurde acht Tage lang gegeben, da Untersuchungen von WINCKLER (1997) gezeigt haben, dass nach diesem Zeitraum die maximale Wirkung auf transportphysiologische Parameter der Darmschleimhaut erreicht ist. Um die verschiedenen Anteile Lymphozytensubpopulationen und des DSIS Plasmazellen zu erfassen, immunhistologisch wurden verschiedene dargestellt und in Konsekutivschnitten ausgewertet. Die CD6+T-Lymphozyten geben einen Überblick über alle in der Schleimhaut vorhandenen αβ-T-Lymphozyten (SAALMÜLLER et al. 1994), die CD4+TLymphozyten über T-Helferzellen vor allem in der Lamina propria (ROTHKÖTTER et al. 1991; JANEWAY 1995), die CD8+T-Lymphozyten über intraepitheliale Lymphozyten (CERFBENSUSSAN u. GUY-GRAND et al. 1991; ROTHKÖTTER et al. 1991, 1994) und die mAk320+- und 86D+T-Lymphozyten über die γδ-T-Lymphozyten in der Schleimhaut (GUYGRAND et al. 1991). Durch Darstellung der IgA+Plasmazellen wurde der humorale Anteil des DSIS erfasst. Die quantitative Auswertung wurde mit einem halbautomatischen Bildanalysesystem durchgeführt. Werden Zählungen mit diesem System ausgeführt, muss generell die individuelle Bewertung, und damit der individuelle Fehler berücksichtigt werden (COLLAN et al. 1987). Da im vorliegenden Fall sämtliche Messungen von einem Untersuchenden durchgeführt wurden, und da es sich um eine vergleichende Zählung handelte, kann der individuelle Fehler vernachlässigt werden. Auch andere Fehlerquellen, die die Zählung beeinflussen können, wie beispielsweise unterschiedliche Schnittdicke oder Gewebeschrumpfung durch Einfrieren, können vernachlässigt werden, da es sich um eine vergleichende Zählung handelte und die Probenbearbeitung bei allen Tiergruppen identisch war (RÜSCHOFF 1989). Um eine Erwartungshaltung der zählenden Person im Hinblick auf die zu erwartenden Zellzahlen bei den unterschiedlichen Tiergruppen im Diskussion 101 Vorfeld auszuschalten, wurden die Schnitte kodiert und blind ausgezählt. Die Zellzahlen, die mit dieser Methode ermittelt wurden, lassen einen Vergleich zwischen den Kontrolltieren und den Tieren, die Probiotika erhalten hatten, zu. Ein Vergleich der absoluten Zahlen mit denen anderer Autoren ist nur bedingt möglich. Durch die Gabe der beiden Probiotika kam es sowohl zu Veränderungen der Anzahl der IgA+Plasmazellen, als auch der verschiedenen T-Lymphozytensubpopulationen, deren Bedeutung im folgenden im einzelnen besprochen werden soll. Bei dieser Besprechung wird neben den signifikanten Unterschieden auch auf tendenzielle Veränderungen eingegangen, da vermutlich ein Teil der tendenziellen Veränderungen das Signifikanzniveau aufgrund der relativ geringen Tierzahl pro Gruppe nicht erreicht hat. IgA+Plasmazellen sind neben IgM+Plasmazellen der repräsentative Zelltyp für die humorale Immunantwort in der Darmschleimhaut. Beim adulten Schwein sezernieren bis zu 90% der Plasmazellen in der Darmschleimhaut IgA (BROWN und BOURNE 1976 b; ALLEN und PORTER 1977; BUTLER et al. 1981; BIANCHI et al. 1992). Die IgA+Plasmazellen in der Darmschleimhaut stammen von B-Zellen aus den Peyerschen Platten ab, die in die Schleimhaut einwandern, und dort mit Hilfe von CD4+T-Lymphozyten zu IgA-sezernierenden Plasmazellen ausdifferenzieren (SCICCHITANO et al. 1988; PHILLIPS-QUAGLIATA u. LAMM 1988; MCGHEE et al. 1989; BRANDTZAEG et al. 1992). Anzahl und Verteilung der IgA+Plasmazellen bei den Kontrolltieren entsprachen den aus der Literatur bekannten Befunden: im Kryptbereich waren wesentlich mehr IgA+Plasmazellen zu finden als in den Zotten. Dieses deckt sich mit den Befunden von ROTHKÖTTER u. Mitarbeiter (1989), der beim Schwein im Kryptbereich 10x mehr IgA+ und IgM+Plasmazellen fand als im Zottenbereich. Nach Gabe sowohl von S.b. als auch B.c. waren unterschiedliche Veränderungen der Plasmazellzahlen in den verschiedenen Darmabschnitten zu finden. Im Dünndarm kam es im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einer Zunahme an IgA+Plamazellen, sowohl in der Lamina propria der Zotten als auch in der Lamina propria der Krypten. Die Zunahme dieser Zellen war bei Gabe von S.b. deutlicher als bei B.c., was auf einen unterschiedlichen Wirkungsgrad der Probiotika auf das DSIS hindeutet. In den beiden Dickdarmlokalisationen waren weniger IgA+Plasmazellen nach Probiotikagabe zu finden als bei den Kontrolltieren. Die IgA-Sekretion findet in den Krypten statt, so dass dieses dadurch zu erklären ist. 102 Diskussion Die beobachtete Zunahme an IgA+Plasmazellen durch die Probiotika erklärt Befunde von BUTS und Mitarbeitern (1990), die nach Gabe von S.b. einen erhöhten IgA-Gehalt im Darmlumen von Ratten nachweisen konnten. Diese Zunahme an IgA+Plasmazellen kann als positiver Effekt auf das DSIS gewertet werden, da sekretorisches IgA für den Schutz von Schleimhautoberflächen verantwortlich ist. Nach seiner Freisetzung aus den Plasmazellen in der Lamina propria wird das dimere IgA von den Polyimmunglobulinrezeptoren, die sich auf der basolateralen Oberfläche der Kryptepithelzellen befinden, gebunden und selektiv ins Darmlumen transportiert (MESTECKY u. MCGHEE 1987; BRANDTZAEG 1989; MESTECKY et al. 1991; MOSTOV u. KAETZEL 1999). Dort bindet und neutralisiert es Antigene. IgA verhindert die Anheftung pathogener Mikroorganismen, verursacht aber keine Komplementaktivierung und ist hierdurch nicht entzündungsauslösend. Unklar ist, ob die erhöhte Zellzahl durch eine vermehrte Einwanderung von Plasmazellen aus den Peyerschen Platten verursacht wird, oder ob durch die vermehrte T-Zellhilfe in der Schleimhaut eine Reifung der Plasmazellvorläufer gefördert wird. Auch die Untersuchung der ilealen Peyerschen Platte (iPP) ergab keine eindeutigen Hinweise, da es durch die Gabe der Probiotika nur zu einer geringgradigen Zunahme der Follikelgröße kam. Der einzige Bereich, in dem eine signifikante Zunahme der IgA+Plasmazellen zu beobachten war, waren die Zotten im Duodenum. Da die Epithelzellen im Bereich der Zotten keine Rezeptoren für polymeres IgA besitzen und es daher auch nicht selektiv ins Darmlumen sezernieren können, ist die funktionelle Bedeutung der Zunahme von Plasmazellen in der Lamina propria unklar. Da IgA auch im Zottenstroma Antigene binden und neutralisieren kann, könnte dies auf eine bessere Eliminierung aufgenommener Antigene aus dem Darmlumen hindeuten. Im Dickdarm waren durch die Gabe der Probiotika weniger IgA+Plasmazellen zu finden im Vergleich mit den Kontrolltieren. Dies kann ein Hinweis auf ein dichteres Epithel oder einen verminderten Antigenstimulus aus dem Darmlumen sein. Generell spricht es jedoch für einen herabgesetzten Schutz der Schleimhaut. Für die zelluläre Abwehr spielen die T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. Durch die Auszählung der CD6+T-Lymphozyten wurde ein Überblick über die Veränderungen der Anzahl der αβ-T-Lymphozyten, deren wichtigste funktionelle Subtypen die CD4+- und CD8+T-Lymphozyten sind, gewonnen. Wie bei den Plasmazellen, so kam es auch bei den CD6+TLymphozyten durch die Gabe von S.b. und B.c. zu unterschiedlichen Veränderungen der Zellzahlen im Dünn- und Dickdarm. Im Dünndarm waren vermehrt CD6+T-Lymphozyten im Diskussion 103 Krypt- und Zottenbereich zu finden, im Kolon kam es zu keinen Veränderungen gegenüber den Kontrolltieren. Die Zunahme der CD6+T-Lymphozyten war im Duodenum und mittleren Jejunum besonders ausgeprägt. Eine signifikante Steigerung gab es durch beide Probiotika in den Zotten des mittleren Jejunums. Im Gegensatz zur Zahl der Plasmazellen, die insbesondere nach Gabe von S.b. zunahm, war die Anzahl der CD6+T-Lymphozyten insbesondere nach Gabe von B.c. erhöht. Dies deutet auf eine unterschiedliche Aktivierung der humoralen und zellulären Komponenten des DSIS durch die beiden Probiotika hin. Im folgenden sollen die beiden funktionellen T-Lymphozytensubpopulationen, die den größten Teil der CD6+T-Lymphozyten ausmachen, getrennt betrachtet werden: die CD4+- und die CD8+TLymphozyten. Die Verteilung und Anzahl der CD4+T-Lymphozyten in der Schleimhaut entsprach weitgehend den Befunden anderer Untersucher (ROTHKÖTTER et al. 1991, VEGA-LOPEZ et al. 1993; OLIVIER et al. 1994; ROTHKÖTTER et al. 1994). Im Unterschied zu den Befunden aus der Literatur fanden sich in der vorliegenden Untersuchung auch intraepithelial wenige CD4+TLymphozyten. Durch die Verabreichung der Probiotika kam es im Dünndarm zu einer Erhöhung der Anzahl der CD4+T-Lymphozyten. Diese war besonders deutlich im Zottenbereich zu erkennen: in den Zotten des mittleren Jejunums war ihre Anzahl sowohl nach Gabe von S.b. als auch von B.c. signifikant erhöht. Diese Zunahme ist vermutlich durch lokale Expansion der CD4+T-Lymphozyten in der Lamina propria verursacht, da die zahlenmäßige Zunahme auf das vermehrte Auftreten von Zellansammlungen zurückzuführen war. Andererseits kann eine vermehrte Produktion in den PP oder eine vermehrte Einwanderung in die Schleimhaut nicht ausgeschlossen werden. Im proximalen Kolon kam es im Gegensatz zum Dünndarm durch beide Probiotika zu einem Rückgang der Anzahl der CD4+T-Lymphozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Funktionell handelt es sich bei den CD4+T-Lymphozyten um T-Helferzellen (JANEWAY 1995). Aufgrund ihres Zytokinsekretionsmusters lassen sich TH1-Lymphozyten, die IL 1 und IFNγ sezernieren, und TH2-Lymphozyten, die überwiegend IL 4 und IL 5 abgeben, unterscheiden (MOOSMANN u. COFFMAN 1987). In der Darmschleimhaut sind besonders häufig TH2Lymphozyten zu finden (CROOK 1990), die insbesondere für die Differenzierung der Plasmazellvorläufer zu sezernierenden Plasmazellen wichtig sind (MOOSMANN u. COFFMAN 1987, 1989). Die erhöhte Anzahl an CD4+T-Lymphozyten könnte eine mögliche Ursache für die 104 Diskussion gestiegene Anzahl an IgA+Plasmazellen in der Lamina propria sein und hierdurch zum Schutz der Schleimhaut beitragen. CD4+T-Lymphozyten üben auch einen regulativen Einfluss auf Wachstum und Differenzierung der Schleimhaut aus (WALKER et al. 1984). Dazu passen die Befunde von GÖRKE (2000), die durch S.b. und B.c. längere Zotten im Jejunum fand. Eine mögliche Erklärung für die längeren Zotten ist ein verringerter Zellverlust. Die andere Fraktion der αβ-T-Lymphozyten wird durch die CD8+T-Lymphozyten dargestellt. Wie in der Literatur beschrieben, ist die Mehrzahl der CD8+T-Lymphozyten im Epithel zu finden. Im Gegensatz zu den Befunden von ROTHKÖTTER und Mitarbeitern (1991), die keine Unterschiede in der Verteilung der T-Lymphozytensubtypen zwischen der Zotten- und Kryptregion bei den untersuchten Schweinen aus der frühen postnatalen Periode bis zum Alter von 91 Tagen fanden, waren bei den hier untersuchten Absatzferkeln wesentlich mehr CD8+TLymphozyten im Zottenepithel als im Kryptepithel vorhanden. Dies ist ein weiterer Hinweis auf altersabhängige Unterschiede im DSIS. Bei den CD8+T-Lymphozyten waren nach Gabe der Probiotika im vorderen Dünndarm weniger und im mittleren Jejunum und proximalen Kolon mehr Zellen im Epithel zu finden. Diese Abweichungen waren jedoch nicht signifikant. Aufgrund der gegensätzlichen Zahlenentwicklung der CD8+T-Lymphozyten und CD4+T-Lymphozyten im Kolon, waren bei der Auswertung der CD6+T-Lymphozyten keine Veränderungen erkennbar, obwohl sich das Verhältnis der Subpopulationen verschoben hatte. Dies zeigt, dass nur eine detaillierte Untersuchung der Subpopulationen die Wirkung der Probiotika erfassen kann. Funktionell handelt es sich bei den CD8+T-Lymphozyten um Zellen mit zytotoxischer Aktivität oder suppressiver Wirkung (JONJÍC u. KOSZINOWSKI 1984; PESCOVITZ et al. 1984). Aufgrund ihrer Lage im Epithel stellen sie die vorderste Abwehrlinie des DSIS dar. Sie können infizierte oder transformierte Epithelzellen über MHC1-Moleküle erkennen und eliminieren (CROOK 1990). Im Darm soll die suppressive Wirkung der CD8+T-Lymphozyten von besonderer Bedeutung sein, d.h. es werden Reaktionen auf eindringende Antigene unterdrückt (DOBBINS 1986). Dieser Effekt soll für die Verhinderung überschießender Immunreaktionen, Reaktionen auf Nahrungsmittelantigene und die Verhinderung allergischer Reaktionen von Bedeutung sein. Die vermehrte Anzahl von CD8+T-Lymphozyten könnte diesen Effekt verstärken. Auch bei den γδ-T-Lymphozyten kam es durch die Probiotika zu zahlenmäßigen Veränderungen. Aufgrund ihrer bevorzugten Lage in der Haut und den Schleimhäuten, wird angenommen, dass sie Diskussion 105 am Schutz gegen Infektionen an äußeren und inneren Oberflächen beteiligt sind (JANEWAY 1988). Im Vergleich zu den αβ-T-Lymphozyten war ihre Anzahl in der Schleimhaut wesentlich geringer. Durch beide Probiotika kam es in allen untersuchten Lokalisationen des Dünn- und Dickdarmes zu einer Erhöhung der Zellzahl. Diese war für die mit dem mAK320 markierten γδT-Lymphozyten nicht signifikant, für die Untergruppe der durch den 86D markierten γδ-TLymphozyten waren im proximalen Jejunum nach Gabe beider Probiotika und im proximalen Kolon nach Gabe von S.b. signifikant mehr Zellen zu finden. Diese Zunahme ist besonders unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die durch den mAk 320 markierten γδ-T-Lymphozyten sich unempfindlich gegen mitogene (OUTERRIDGE et al. 1982) und antigene Stimuli (BINNS 1982) zeigen, interessant. Die genaue funktionelle Bedeutung der γδ-T-Lymphozyten ist noch nicht aufgeklärt. Bei Untergruppen konnte die Fähigkeit zur Zelllysis nachgewiesen werden (BORST et al. 1987). Weiterhin sollen intraepitheliale Zellen mit γδ-TcR für den Erhalt eines normalen Epithelzellverbandes von Bedeutung sein (JANEWAY 1988). Die Erhöhung der Zellzahl durch die Probiotika ist daher als günstig für den Schleimhautschutz zu bewerten. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es durch die Probiotikaapplikation zu komplexen Veränderungen des DSIS kommt, die als Optimierung der humoralen und zellulären Anteile des DSIS interpretiert werden können. Die beiden verwendeten Probiotika hatten meist eine gleichartige Wirkung auf das DSIS, die jedoch graduell unterschiedlich war. S.b. führte zu einer ausgeprägteren Zunahme der IgA+Plasmazellen und der γδ+T-Lymphozyten, B.c. zu einer deutlicheren Zunahme der CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten. Eine Zunahme der Zellzahlen war bei beiden Probiotika vor allem im Dünndarm zu beobachten. Bei allen untersuchten Subpopulationen war die Zunahme der Zellzahl im Zottenbereich besonders ausgeprägt. Dies traf nicht nur für die in diesem Schleimhautkompartiment besonders häufig vorhandenen CD4+-, CD6+- und CD8+T-Lymphozyten zu, sondern auch für die in diesem Bereich eher seltenen Plasmazellen. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass es durch die verwendeten Probiotika zu einer lokalisierten Aktivierung dieser Zellen und möglicherweise zur Induktion der Proliferation in den Zotten kommt. Diese könnte durch die von den Probiotika verursachten Veränderungen im Transportverhalten des Zottenepithels ausgelöst werden. 106 Diskussion Die vorliegende Untersuchung konnte zeigen, dass die verabreichten Probiotika das Darmschleimhautimmunsystem beeinflussen. Weitere funktionelle Untersuchungen notwendig, um die Immunantwort und ihre Auslösung genauer zu charakterisieren. sind Zusammenfassung 107 6. Zusammenfassung Claudia van Briel: Veränderungen der Anzahl und Verteilung von Plasmazellen und Lymphozytensubpopulationen in der Darmschleimhaut des Schweines nach Applikation von Probiotika. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, welchen Einfluss die Probiotika, Saccharomyces boulardii (S.b.) und Bacillus cereus varietas toyoi (B.c.), auf die Zusammensetzung der Lymphozytensubpopulationen und der Plasmazellen in der Darmschleimhaut klinisch gesunder Schweine haben. In die Untersuchung wurden 15 klinisch gesunde Hybridschweine einbezogen. Jeweils 5 Schweine erhielten zusätzlich zum Mastfutter 1 g eines Lyophilisats der Hefe S.b (Perenterol®) pro Tier und Tag oder 2 g B.c. in Sporenform (Toyocerin®) pro kg Futter. Fünf Schweine dienten als Kontrollen und wurden nur mit Mastfutter gefüttert. Die Probiotika wurden täglich verabreicht bis sie ihre maximale Wirkung erreicht hatten. Die Zeitspanne betrug eine Woche bei S.b., wie aus vorangegangenen Untersuchungen bekannt war, und 3 Wochen bei B.c. laut Angaben des Herstellers. Nach Abschluss der Fütterungsphase wurden die Tiere getötet. Repräsentative Gewebeproben wurden aus Duodenum, proximalem und mittlerem Jejunum, Ileum, Caecum und proximalem Colon entnommen und schockgefroren. In konsekutiven Kryostatschnitten wurden IgA+Plasmazellen, CD6+-, CD4+-, CD8+- und γδ-T-Lymphozyten mit den entsprechenden monoklonalen Antikörpern (mAk 27.9.1, mAk a38b2, mAk 74-12-4, mAk 11-295-33, mAk 86D, mAk Mac320) mit der Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Methode bzw. mit der Streptavidin-Biotin-Methode dargestellt. Im Bereich der Peyerschen Platte des Ileums wurden zusätzlich die IgM+B-Lymphozyten (mAk 28.4.1) markiert. Verteilung und Anzahl der markierten Zellen wurde mittels eines halbautomatischen computergestützten Bildanalysesystems erfasst und mit dem Wilkoxon-Two-Sample-Test statistisch ausgewertet. Die Verteilung der Plasmazellen und T-Lymphozytensubpopulationen in der Darmschleimhaut der Kontrolltiere entsprach den Untersuchungsergebnissen anderer Autoren. Sowohl nach Gabe von S.b., als auch B.c. kam es zu einer tendenziellen Zunahme der IgA+Plasmazellen im Kryptund Zottenbereich des Dünndarms und einer tendenziellen Abnahme im Dickdarm. Diese Veränderungen waren bei den Tieren, die S.b. erhalten hatten, ausgeprägter und in den Zotten des Duodenums signifikant. Bei den CD6+T-Lymphozyten, durch die αβ-7/\PSKR]\WHQ HUIDVVW 108 Zusammenfassung werden, war eine tendenzielle Zunahme im Jejunum, insbesondere im Zottenbereich nach Applikation von S.b. und B.c. zu beobachten. Diese war nach Gabe von B.c. ausgeprägter und im Zottenbereich des mittleren Jejunums signifikant. Die Zahl der CD4+T-Lymphozyten war nach Gabe von S.b. und B.c. im Jejunum tendenziell erhöht und im Dickdarm erniedrigt. Die Zunahme im Zottenbereich des mittleren Jejunums war bei beiden Probiotika signifikant. Die Veränderung in der Anzahl der CD8+T-Lymphozyten im Epithel war nach Gabe der Probiotika im Vergleich zu den anderen Lymphozytensubpopulationen am geringsten. Tendenziell war sowohl nach Gabe von S.b. als auch B.c. eine Zunahme der CD8+T-Lymphozyten im Epithel des mittleren Jejunums und proximalen Kolons zu beobachten. Nach Gabe beider Probiotika waren in allen Darmlokalisationen mehr γδ-T-Lymphozyten zu finden. Im proximalen Jejunum und proximalen Kolon war die Anzahl der 86D+ γδ-T-Lymphozyten nach Gabe von S.b. signifikant erhöht. Das Ausmessen der Lymphfollikel in der ilealen Peyerschen Platte ergab eine geringgradige, nicht signifikante Zunahme der Follikelfläche und eine weniger dichte Lagerung der B-Lymphozyten in den Lymphfollikeln in den beiden Gruppen, die S.b. oder B.c. erhalten hatten. Die Änderungen der Zellzahlen waren bei S.b. und B.c. gleichsinnig, jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt. Nach Gabe von S.b. kam es zu einer deutlicheren Zunahme der IgA+Plasmazellen und der γδ-T-Lymphozyten, nach Gabe von B.c. war die Zunahme der CD6+-, der CD4+- und der CD8+T-Lymphozyten besonders ausgeprägt. Dünn- und Dickdarmschleimhaut wurden sehr unterschiedlich beeinflusst. Durch diese Ergebnisse wird deutlich, dass es auch bei gesunden Tieren zu Veränderungen der Anzahl der T-Lymphozytensubpopulationen und der Plasmazellen durch die Gabe von Probiotika Darmschleimhautimmunsystems. kommt und damit zu einer Beeinflussung des Summary 109 7. Summary Claudia van Briel: Changes in number and distribution of plasma cells and lymphocyte subpopulations in the intestinal mucosa of pigs after application of probiotics. The objective of this study was to determine how the probiotics, Saccharomyces boulardii (S.b.) and Bacillus cereus varietas toyoi (B.c.), influence the number composition of lymphocyte subpopulations and plasma cells in the intestinal mucosa of clinically healthy pigs. Fifteen clinically healthy hybrid pigs were included in this study. Five pigs each received in addition to their fattening ratio 1 g of lyophilized S.b. (Perenterol®) per animal and day or 2 g spores of B.c. (Toyocerin®) per kg feed. Five pigs served as controls and were fed the standard fattening ratio without additions. The animals received the probiotics daily until they had reached their maximal effect. This time span was one week for S.b., as determined in preceding experiments and three weeks for B.c. as indicated by the manufacturer. At the end of the feeding period, animals were slaughtered. Representative tissue samples were collected from duodenum, proximal and mid jejunum, ileum, cecum and proximal colon and snap frozen. IgA+plasma cells, CD6+-, CD4+-, CD8+- and γδ-T lymphocytes were labelled in consecutive cryostat sections by the respective monoclonal antibodies (mab 27.9.1, mab a38b2, mab 74-12-4, mab 11-295-33, mab 86D, mab Mac320) using either the alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase method or the streptavidin biotin method. In addition IgM+B-lymphocytes (mab 28.4.1) were labelled in the ileal Peyer´s patch. The number and distribution of labelled cells were evaluated using a semi automatic image analysis system. The Wilcoxon-Two-Sample test was used for statistical comparisons. The distribution of plasma cells and T lymphocyte subpopulations in the intestinal mucosa was as reported by other authors. A tendency of increase was seen in the IgA+ plasma cells in the crypt and villus region of the small intestine and a tendency of decrease in the large intestine after application of either S.b. or B.c. This change was more pronounced in pigs which had received S.b. and was significant in the villi of the duodenum in this group. An increased number of CD6+ T-lymphocytes, which represent the αβ-T-lymphocytes, was found in the jejunum especially in the villus compartment after application of S.b. and B.c. This increase was more pronounced in the pigs which had received B.c.; it was significant in this group in the villi of the mid jejunum. The number of CD4+T-lymphocytes was mildly increased in the jejunum and decreased in the 110 Summary large intestine after application of S.b. as well as of B.c. The increase in the villus compartment of the mid jejunum was significant in both probiotics. The changes in the number of CD8+Tlymphocytes in the epithelium after feeding of the probiotics were less pronounced than those of the other lymphocyte subpopulations. There was a tendency of increase of CD8+T-lymphocytes in the epithelium of the mid jejunum and proximal colon after application of S.b. as well as of B.c. Increased numbers of γδ-T-lymphocytes were found in all sites of the intestine after application of both probiotics. 86D+γδ-T-lymphocytes were significantly increased in the proximal jejunum and proximal colon of pigs treated with S.b. After treatment with either S.b. or B.c., the size of the lymphoid follicles in the ileal Peyer’s patch was mildly increased and the B lymphocytes within the lymphoid follicles were less densely packed. After application of S.b. or B.c., changes in cell numbers had a comparable pattern, but different degree. S.b. induced a more pronounced increase of IgA+plasma cells and γδ-T-lymphocytes, B.c. a more pronounced increase of CD6+-, CD4+- and CD8+T-lymphocytes. The effects were very different in small versus large intestinal mucosa. These findings indicate that application of probiotics changes the numbers of T-lymphocyte subpopulations and plasma cells even in healthy animals and thus influences the intestinal immune system. Literaturverzeichnis 111 8. Literaturverzeichnis Abe, K., u. T. Ito (1977): A qualititative and quantitative morphologic study of Peyer`s patches of the mouse. Arch. Histol. Jpn. 40, 407-420 Agarwal, N., D.N. Kamara, L.C. Chandhary, A. Sahoo, u. N.N. Pathak (2000): Selection of Saccharomyces cerevisiae strains for use as a microbial feed additive. Lett. Appl. Microbiol. 31, (4) 270-273 Ahrens, F. (1990): Zur Wirkung von Toyocerin. Lohmann Information, Februar/März, 1-7 Aleksandersen, M. (1989): Organized lymphoid tissue in the large intestine of sheep. Diss. 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Gaskins (1996): Distribution of porcine CD4/CD8 double-positive T lymphocytes in mucosa-associated lymphoid tissues. Immunology 87, 493-499 Zuckerman, F.A., u. R.J. Husmann (1996a): Functional and phenotypic analysis of porcine peripheral blood CD4/CD8 double positive T cells. Immunology 87, 500-512 Zuckerman, F.A., u. R.J. Husmann (1996b): The human and swine CD4/CD8 double positive T-lymphocyte. In: M.E. Tumbleson, u. L.B. Schook (eds.): Advances in swine in biomedical research. Plenum, New York, pp 311-343 Anhang 145 9. Anhang Chromalaungelatine Gelatinepulver (Art. 4070, Fa. Merck, Darmstadt) Aqua dest. 0,625 g 250 ml Chromalaun (Art. 31246, Fa. Riedel - de Haen, Seelze) 0,063 g Thymol (Art. 16254, Fa. Riedel - de Haen, Seelze) 1 Korn 4 %iges neutralgepuffertes Formalin (5 l) 37 %ige Formaldehydlösung (Formalin) 500 ml NaH2PO4 x H2O (Art. 04270, Fa. Riedel - de Haen, Seelze) 20 g NaH2PO4 32,5 g Aqua dest. 4,5 l Phosphatgepufferte NaCl-Lösung (PBS) Stammlösung: Natriumchlorid (Art. 6404, Fa. Merck, Darmstadt) NaH2PO4 x H2O (Art. 04270, Fa. Riedel - de Haen, Seelze) 40 8,8 auf 1 l Aqua dest., pH-Wert mit 1 N NaOH (Art. 3136, Fa. Merck, Darmstadt) auf 6,8 einstellen Gebrauchslösung: 1 Teil Stammlösung + 4 Teile Aqua dest. ergibt 0,15 M PBS; den pH auf 7,1 einstellen g g 146 Anhang Tween-TBS Stock-TBS: Tris-aminomethan (Art. 8386, Fa. Merck, Darmstadt) 24,23 g Natriumchlorid (Art. 6404, Fa. Merck, Darmstadt) 34,44 g In 0,35 l Aqua dest. lösen, mit konzentrierter Salzsäure (Art. 316, Fa. Merck, Darmstadt) den pH auf 7,6 einstellen und mit Aqua dest. auf 0,4 l auffüllen Stock-Tween: Tween 20 (Fa. Serva, Feinbiochemica, Heidelberg) in Aqua dest. lösen 5 ml 100 ml 100 ml 20 ml 900 ml Gebrauchslösung: Stock-TBS Stock-Tween Aqua dest. Verdünnermedium des Primärantikörpers (1 %iges BSA in PBS) Albumin bov. (Art. 11930, Fa. Serva, Feinbiochemica, Heidelberg) PBS 1 100 Verdünnermedium des Sekundärantikörpers und des APAAP-Komplexes 5 %iges hitzeinaktiviertes Schweinenormalserum in PBS g ml Erklärung 147 Hannover, 27.02.2002 10. Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel Veränderungen der Anzahl und Verteilung von Plasmazellen und Lymphozytenpopulationen in der Darmschleimhaut des Schweines nach Applikation von Probiotika selbständig am Institut für Pathologie und Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover verfasst habe. Hilfsmittel, außer den angegebenen, wurden nicht in Anspruch genommen. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorliegenden Angaben nach bestem Wissen und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. 148 Danksagung Meiner Doktormutter, Frau Priv.-Doz. Dr. E. Liebler-Tenorio, danke ich ganz herzlich für die Überlassung des Themas und die freundliche Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. J. Pohlenz und Herrn Prof. Dr. G. Breves möchte ich für die vielen Anregungen zum Thema danken. Herrn Prof. Dr. H.-J. Rothkötter sei herzlich für die Hilfestellung bei methodischen Schwierigkeiten gedankt. Herrn Prof. Dr. A. Saalmüller gilt mein Dank für die Bereitstellung des monoklonalen Antikörpers zur Darstellung der CD6 positiven T-Lymphozyten. Ein herzliches Dankeschön an Frau P. Grünig für die Anfertigung der Paraffinschnitte und Färbungen. Für die Abzüge der Fotos danke ich Frau Behrens. Bei den Mitarbeitern des Instituts für Biometrie und Epidemiologie, insbesondere Herrn Dr. Beyerbach, bedanke ich mich für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Versuchsergebnisse. Über die gesamte Zeit stand mir Frau Dr. B. Baum stets hilfsbereit mit Rat und Tat zur Seite. Dafür meinen herzlichen Dank. Meiner Familie gilt besonderer Dank für die Ermöglichung des Studiums und der Promotion. Ein besonders liebevolles Dankeschön an Dich, lieber Christian, für Deine Unterstützung und immer hilfreiche Hand.
