Enzymatischer Abbau von Anthocyanen

Die charakteristische Verteilung der Elektronendichten in beiden gegenübergestellten Insektizidgruppen fällt in weiteren, ebenfalls wirksamen Verbindungen auf. Im U.S.-Patent 2 5 0 8 9 1 6 werden
als Insektizide u. a. der 2-Chloräthyl-1.2.2.3-tetrachlorbutyläther
( X V I ) , der
Benzyl-1.2.2.3-tetrachlorbutyläther ( X V I I ) und der Allyl-1.2.2.3-tetrachlorbutyläther ( X V I I I ) genannt.
C 1 C H , - C H , - 0 - C H C1-CC1 2 -CH C1-CH 3
X V I
\
/
—CH,—0—CHC1—CCL—CH
C1-CH 33
X V I I
CH,=CH-CH2-0-CHCl-CCl2-CHCl-CH3
X V I I I
Diese Substanzen sind in ihrem strukturellen Aufbau
und in der Verteilung der Ladungsdichten vergleichbar mit den folgenden, ebenfalls wirksamen Estern
(PERKOW
3
)
:
R O
RO
P — 0 —CHC1—CHC1—CH2C1
;
o
RO
P —O — C H = C C I - CH C I - CH3
RO V
O
RO
P - O - CH C I - C CII — C H C 1 - CH3
I
RO
O
W i r sind also der Ansicht, daß die beschriebene,
charakteristische Verteilung der Ladungsdichten in
den insektiziden Verbindungen der Phosphorsäuren
in erster Stufe die Wechselwirkung mit Fermenten
auf der Basis struktureller und energetischer K o m plementär-Verhältnisse einleitet. Diese Struktur der
intakten Moleküle wird damit zur Voraussetzung
der insektiziden Wirkung. Im weiteren Verlauf des
Vergiftungsprozesses
ist eine
Phosphorylierung
denkbar, wie sie von verschiedenen Autoren an isolierten Fermenten nachgewiesen wurde. Man wird
indessen kaum die Hemmwirkung der Phosphorsäureester auf die Cholinesterase sowohl als Wirkungsprinzip des insektiziden Effektes wie auch der
Warmblüter-Toxizität verallgemeinern dürfen.
Enzymatischer Abbau v o n Anthocyanen
V o n
E. BAYER
u n d
K .
WEGMANN
Aus dem Forschungs-Institut für Rebenzüchtung, Abteilung Biochemie und Physiologie,
Geilweilerhof über Landau/Pfalz
( Z . N a t u r f o r s c h g . 12 b , 3 7 — 4 0 [ 1 9 5 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 17. S e p t e m b e r 1956)
Die Anreicherung und die Eigenschaften eines Enzyms aus Coleus hybridus, das Anthocyane mit
zwei oder mehr benachbarten phenolischen OH-Gruppen oxydativ abbaut, wird beschrieben. Nach
dem Verhalten des Fermentes handelt es sich um eine kupferhaltige o-Phenoloxydase, die nur bei
Gegenwart von o-Phenolen als Aktivatoren Anthocyane abbaut. Die mögliche Beteiligung der Oxydase und der aktivierenden Phenole bei der Entrötung junger Blätter, der Herbst-Rotverfärbung ,
grüner Blätter und bei der genetischen Entstehung der Blutvarietäten wird diskutiert.
Die genetische Entstehung der Blutvarietäten aus
den grünen Pflanzen, z. B. der Blutbuche aus der
normalen Buche, kann man sich nach P A E C H und
E B E R H A R D T 1 durch den mutativen Wegfall eines „Enzyms" deuten, das in den grünen Pflanzen Anthocyane abzubauen vermag. Auch bei den in frühem
Entwicklungsstadium stark anthocyan-haltigen Blättern von Paeonia officinalis 2, Cyclonia maulei 1, Vit is
vinifera3
und Rosa gallica wird das rote Pigment
im Verlauf des weiteren Wachstums zerstört.
Während N O A C K 3 diesen Anthocyanabbau
auf enzymatische Hydrolyse des Glykosids und anschlie1
K . PAECH U. F . EBERARDT, Z . N a t u r f o r s c h g .
2
K . NOACK, Z . B o t . 1 0 , 5 6 1
7 b. 664
[1952].
ßende Oxydation des Aglucons zurückführt, widersprechen P A E C H und E B E R H A R D T 1 dieser Ansicht,
ohne allerdings nähere Aussagen über die Natur des
fraglichen Enzyms machen zu können.
Es wurde nun gefunden, daß die Blattpreßsäfte
von Coleus hybridus in starkem Maße Anthocyane
zu gelbgefärbten Produkten abbauen und daß die
Zerstörung der Pigmente in erhitzten Preßsäften unterbleibt. Vor allen anderen untersuchten Pflanzen
erschien daher Coleus zur Anreicherung und näheren
Charakterisierung des anthocyan-abbauenden
Enzyms der grünen Pflanzen besonders geeignet. Bei
3
G . DE LATTIN,
unveröffentlicht.
[1918].
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Abwesenheit von Sauerstoff unterbleibt die enzymatische Entfärbung von Anthocyan, z. B. Cyanin. Das
Enzym ist demgemäß als Oxydase zu klassifizieren,
die Sauerstoff auf Anthocyane überträgt und diese
zu gelbgefärbten Oxydationsprodukten umsetzt. Für
das Ferment wird der Name Cyaninoxydase in Vorschlag gebracht.
Zur Aktivitätsbestimmung der Cyaninoxydase wird
nach der im methodischen Teil dieser Arbeit gegebenen Vorschrift spektralphotometrisch der Abbau
von Cyanin verfolgt. Man läßt hierzu die Enzymlösung in Puffer vom pn 5,76 auf Cyanin einwirken,
unterbricht die Reaktion durch Zufügen von Salzsäure und mißt bei 510 m// die Extinktion des verbliebenen Cyanins. Der Restgehalt an Cyanin läßt
sich aus der in Abb. 1 wiedergegebenen Eichkurve
ablesen, die wir mit Hilfe von analysenreinem, nach
W I L L S T Ä T T E R und N O L A N 4 gewonnenen Cyanin aufgestellt haben. Die Extinktion von Cyaninlösungen
in Mineralsäuren gehorcht nicht dem L A M B E R T - B E E R schen Gesetz. Die Aktivität der Oxydase wird definiert durch das Verhältnis mg abgebautes Cyanin
zu mg Trockengewicht des Fermentpräparates.
t
7
0
0,01
0,025
0,05
mg Cyanin/ml
0,07
—
A b b . 1. Konzentrations-Abhängigkeit der Extinktion von
Cyaninlösungen.
Bei pH 7,0 — 7,5 erreicht die Cyaninoxydase ihr
Wirkungsoptimum. In Abb. 2 ist die pn-Abhängigkeit der Aktivität mit und ohne Zugabe einiger
Hemmstoffe dargestellt. Das Enzym wird durch
Thioharnstoff, Kaliumcyanid, Kohlenmonoxyd, Natriumnitrid, schweflige Säure, p-Aminobenzoesäure
und Salicylaldoxim gehemmt. Das sind die typischen
Hemmstoffe für die kupferhaltigen Phenoloxydasen.
Obgleich B A Y E R , R E U T H E R und B O R N 5 gezeigt haben, daß substratfreie Lösungen von o-Phenoloxy4
R . WILLSTÄTTER U. T H . J . NOLAN,
[1915],
Liebigs Ann. Chem.
408.
1
dasen keine Anthocyane oxydieren können, legten
die Hemmversuche nahe, daß Kupfer ein wirksamer
Bestandteil der Cyaninoxydase ist. Tatsächlich lassen
sich mit Cyanid oder Thioharnstoff gehemmte Fermentlösungen durch Zusatz von Kupfer reaktivieren.
t
0,10
A
0,05
0
A b b . 2. pH-Abhängigkeit der Aktivität ( A ) von •
• Cyaninoxydase ( I ) , x
x Cyaninoxydase mit 0,03-m. K C N als
Hemmstoff ( I I ) , o
O Cyaninoxydase mit 0,03-j?i. Thioharnstoff als Hemmstoff.
Von der Cyaninoxydase werden diejenigen Anthocyane abgebaut, welche zwei oder mehr freie, in
o-Stellung stehende OH-Gruppen aufweisen, also
vorwiegend die Derivate des Cyanidins und Delphinidins. Während also Delphinidin enzymatisch zu
gelbgefärbten Produkten oxydiert werden kann,
werden die Syringidin-Derivate, wie z. B. das Oenin,
die sich vom Delphinidin durch Methylierung zweier
OH-Gruppen unterscheiden, nicht mehr oxydiert.
Dies spricht dafür, daß das beschriebene Enzym
o-Phenolgruppierungen in Anthocyanen zu o-Chinonen oxydiert. Ob darüber hinaus noch weitere Veränderungen im Anthocyanmolekül verursacht werden, bedarf der weiteren Untersuchung. Manometrische Messungen der im Verlauf der Einwirkung des
Enzyms aufgenommenen Menge Sauerstoffs zeigen,
daß mehr Sauerstoff verbraucht wird, als dem Übergang o-Phenolgruppierung zu o-Chinon entsprechen
würde.
Die Anreicherung des als Cyaninoxydase bezeichneten Enzymkomplexes aus Coleus bereitete anfänglich große Schwierigkeiten, da innerhalb von 2 bis
3 Stdn. nach Beginn der Aufarbeitung die Aktivität
vollständig verloren geht. Auch wenn die Arbeitsoperationen in der Kälte bei + 2 ° C durchgeführt
werden oder wenn man das Enzym lediglich bei
5
E . B A Y E R , K . - H . REUTHER U. F . BORN. Z .
u. -Forschg.. im Druck.
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Lebensmittel-Unters,
+ 2 C stehen läßt, verschwindet die CyaninoxydaseAktivität in kurzer Zeit. Auf der Suche nach den
Faktoren, die zur Zerstörung der Enzymwirkung
führen, konnte beobachtet werden, daß die Oxydase
wirksam bleibt, wenn deren Lösungen unter peinlichem 0 2 -Ausschluß, z. B. in einer C0 2 -Atmosphäre,
aufbewahrt werden. Das Ferment selbst oder ein
Aktivator desselben ist alo oxydations-empfindlich.
Da kupferhaltige Oxydasen gegenüber Oxydationseinflüssen beständig sind und vor allem die Aktivität
des Enzyms auch bei Abwesenheit von Sauerstoff
nach längerem Dialysieren verloren geht, muß ein
niedermolekularer, oxydations-empfindlicher Aktivator vorhanden sein. Auf der Suche nach dieser Substanz gewann die Beobachtung Bedeutung, daß der
Verlust an Enzymtätigkeit immer von einer graduellen Verringerung der bei Zugabe von Eisen ( I I I ) chlorid eintretenden Dunkelfärbung begleitet wird.
Da Phenole und insbesondere o-Phenole mit Eisen(III)-salz dunkelgefärbte Komplexverbindungen ergeben, war zu vermuten, daß o-Phenole für die Tätigkeit der Cyaninoxydase notwendig sind. Wenn
dies richtig ist, sollten also Phenole, wie Brenzkatechin, inaktive Fermentlösungen wieder reaktivieren
können. Dies ist auch tatsächlich der Fall. Selbst
nach tagelangem Stehen an der Luft wird noch eine
anthocyan-abbauende Wirkung von wäßrigen Coleusblätter-Extrakten gefunden, wenn bei der Aktivitätsprüfung Brenzkatechin zugesetzt wird, wie dies
im methodischen Teil beschrieben ist. Es sind also
zwei verschiedene Faktoren bei dem enzymatischen
Anthocyanabbau in grünen Blättern unerläßlich: Ein
hitzelabiles, hochmolekulares Enzym mit Kupfer als
wirksamem Bestandteil und ein niedrigmolekulares
o-Phenol.
Durch Acetonfällung und Dialyse konnte ein Präparat gewonnen werden, welches das Enzym gegenüber der Ausgangslösung um das 40-fache angereichert enthielt. In allen Eigenschaften stimmen solche Cyaninoxydase-Lösungen mit o-Phenoloxydase
überein, so daß geschlossen werden konnte, daß sich
der als Cyaninoxydase bezeichnete Enzymkomplex
aus der bekannten o-Phenoloxydase zuzüglich einem
aktivierenden o-Phenol zusammensetzt. W i r haben
dies experimentell bestätigt. Denn eine nach K U B O W I T Z 6 aus Kartoffeln angereicherte o-Phenoloxydase
vermag nach Zusatz von Brenzkatechin Anthocyane
ebenso zu zerstören, wie die Coleusblätter-Extrakte,
obgleich weder Brenzkatechin allein, noch o-Phenol8
F . KUBOWITZ, B i o c h e m . Z . 2 9 2 . 2 2 1
[1937] ; 299. 32
[1938].
oxydase allein eine derartige Wirkung besitzen. Die
anthocyan-abbauende Aktivität der o-Phenoloxydase
in Abhängigkeit von der zugesetzten Brenzkatechinmenge ist in A b b . 3 aufgetragen.
0,008
t
A
0,00V
0
5
fj.Mot Brenzkatechin
70
A b b . 3. Aktivierung der Cyaninoxydase-Aktivität ( A ) von
Polyphenoloxydase aus Kartoffeln durch steigende Mengen
Brenzkatechin.
Diese Befunde lassen sowohl den Anthocyanabbau
im frühen Entwicklungsstadium der Blätter, als auch
den Anthocyan-Stoffwechsel in den Blutvarietäten in
neuem Licht erscheinen. Denn es muß nicht unbedingt
ein Enzym beim Entröten der jungen Blätter gebildet
werden oder ein Enzym beim Übergang von der
grünen Pflanze zur Blutvarietät verloren gehen, da
sich die gleichen Erscheinungen auch durch Bildung
oder Wegfall eines aktivierenden o-Phenols erklären
lassen. Der Verlust an o-Phenol und damit an
Cyaninoxydase-Wirkung könnte einerseits durch
Unterbindung der o-Phenolsynthese in den Pflanzenzellen oder andererseits durch eine (oxydative) Zerstörung der o-Phenole bewirkt werden. Auch bei der
auf Anthocyanbildung zurückgehenden Rotverfärbung von Blättern im Herbst, die nach den eingehenden Untersuchungen von L I P P M A A 7 nur in den
Pflanzen auftritt, deren junge Blätter zunächst rotgefärbt sind, könnte der Verlust eines als Aktivator
wirkenden o-Phenols die Anthocyanausbildung ermöglichen.
Beschreibung der Versuche
1. A u f s t e l l u n g d e r E i c h k u r v e z u r s p e k t r a l photometrischen
Cyaninbestimmung
Das für die Aufstellung der Eichkurve verwendete
Cyanin wurde nach der Vorschrift von W I L L S T Ä T T E R und
NOLAN4 aus Rosenblättern hergestellt. 1 0 0 m g analysen-
reines Cyanin werden in 100 ml halbkonzentrierter Salz7
P . LIPPMAA. B e r . d t s c h . b o t . G e s . 4 6 . 2 6 7
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[1928].
säure gelöst und daraus durch Verdünnung mit halbkonzentrierter HCl eine Konzentrationsreihe aufgestellt.
Die Extinktionen der Lösungen werden im Maximum
der Lichtabsorption, bei 510 m//, mit einem Spektralphotometer (Zeiß PMQ II) gemessen und in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration aufgetragen, wie
dies in Abb. 1 dargestellt ist. Das LAMBERT — BEERsche
Gesetz ist nicht erfüllt.
2. A k t i v i t ä t s b e s t i m m u n g v o n
oxydase-Präparaten
Cyanin-
a) ohne Zusatz eines Aktivators: Als Substratlösung
werden 2 ml einer 0,1-proz. Cyaninlösung in Wasser
verwendet, der man 1 ml Citronensäure-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 5,76 nach M C I L O A I N E 8 zusetzt. Hierzu
gibt man 0,1 ml der auf Cyaninoxydase-Aktivität zu
testenden Lösung und läßt bei Zimmertemperatur
(20 ~ C) im offenen Reagenzglas unter gelegentlichem
Schütteln das Ferment genau 15 Min. einwirken. Danach unterbricht man die Reaktion durch Zugabe von
2 ml konz. HCl und mißt spektralphotometrisch bei
510 m// die Extinktion des verbliebenen Cyanins. Aus
der Eichkurve wird die Cyaninmenge ermittelt und die
Menge des zerstörten Cyanins berechnet. Die Fermentaktivität wird definiert: abgebautes Cyanin in mg pro
Trockensubstanz des Fermentpräparates in mg.
b) mit Zusatz von Brenzkatechin als Aktivator: zu
1 ml einer 0,2-proz. Cyaninlösung gibt man 1 ml 0,01m. Brenzkatechinlösung und 1 ml Puffer vom p\i 5,76
nach M C I L O A I N E 8 . Die Aktivitätsbestimmung wird dann
weiterhin durchgeführt, wie unter 2 a beschrieben wurde.
3.
B e s t i m m u n g der p n - A b h ä n g i g k e i t
und
der H e m m u n g von C y a n i n o x y d a s e
Zur Bestimmung der pH-Abhängigkeit wird wie unter 2 b verfahren. Es werden lediglich an Stelle des
Puffers von pn 5,76 jeweilig 1 ml Citronensäure-Phosj>hat-Puffer 8 zwischen pu 2,38 und 7,8 verwendet. Wegen der Labilität des Cyanins in alkalischem pn-Bereich
kann die Cyaninoxydase-Aktivität nicht bei höheren
PH-Werten als 7,8 gemessen werden.
Die Hemmungen des Fermentes wurden mit frischen,
ohne Zusatz eines Aktivators noch wirksamen Enzymlösungen nach dem Verfahren 2 b durchgeführt. Es
werden lediglich an Stelle von 1 ml der BrenzkateehinLösung je 1 ml Lösung der im theoretischen Teil dieser
Arbeit angeführten Hemmstoffe zugesetzt.
4.
I s o l i e r u n g der
Coleus
Cyaninoxydase
hybridus
aus
250 g frische, möglichst weitgehend grüngefärbte
Blätter von Coleus hybridus werden unter einer C0 2 Atmosphäre im Homogenisator zerkleinert, mit 150 ml
dest. Wasser aufgeschlämmt und von den festen Bestandteilen 5 Min. bei 7500 U/ min zentrifugiert.
Die nach dem unter 2 b angegebenen Verfahren bestimmte Aktivität der klaren, rotbraunen Lösung beträgt 0,0123. Durch Zusatz eines gleichen Volumens
Aceton (ca. 180 cm 3 ) zu dieser Lösung wird das Enzym
ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren wird der Niederschlag 2-mal mit je 10 ml dest. Wasser gewaschen und
anschließend in 20 ml dest. Wasser suspendiert. Enzymaktivität ist 0,403. Nach dreitägigem Dialysieren gegen
6-mal 5 / dest. Wasser beträgt die Aktivität der Enzymsuspension 0,385.
Herrn Prof. Dr. H U S F E L D danken wir sehr für das
wohlwollende Interesse an dieser Arbeit. Herrn Dr.
G E I S L E R verdanken wir die freundliche Überlassung und
Auswahl der geeigneten Coleuspflanzen.
Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t
danken wir für die Gewährung einer Sachbeihilfe.
8
J. D'ANS u. E. LAX. Taschenbuch f. C h e m . u. Phys. Springer,
Berlin 1943. S. 1592.
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