Anna_Bootz_Dissertation_Veröffentlichung - OPUS 4

Die Rolle von Fcγ-Rezeptoren bei der humoralen
Immunantwort gegen das Cytomegalovirus
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Anna Bootz
aus Malapane
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
4. Juni 2014
Vorsitzende/r des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Johannes Barth
Gutachter/in:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Prof. Dr. Thomas Stamminger
Für meine liebe Familie
In Gedenken an Günter
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................. 1
2
SUMMARY .................................................................................................................... 2
3
EINLEITUNG ................................................................................................................. 3
3.1
Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) .................................................................... 3
3.1.1 Klassifizierung und Morphogenese .................................................................... 3
3.1.2 Epidemiologie und Pathogenese........................................................................ 4
3.2 Das Murine Cytomegalovirus (MCMV)....................................................................... 5
3.3
Die humorale Immunantwort...................................................................................... 6
3.3.1 Entstehung von antigenspezifischen Antikörpern ............................................... 6
3.3.2 Eigenschaften und Aufbau eines Antikörpers ..................................................... 8
3.4 Antikörper-vermittelte Immunantwort auf virale Infektionen.......................................10
3.4.1 Antikörper-vermittelte Effektormechanismen gegen freie Viruspartikel ..............10
3.4.2 Antikörper-vermittelte Effektormechanismen gegen viral infizierte Zellen ..........11
3.5 Immunbiologie und Immunmodulation von HCMV und MCMV..................................14
3.5.1 Zelluläre Immunantwort.....................................................................................14
3.5.2 Humorale Immunantwort ...................................................................................16
3.5.3 Immunevasion durch CMV ................................................................................17
3.6 Klinische Relevanz von HCMV und Therapie ...........................................................18
4
ZIEL DER ARBEIT........................................................................................................20
5
MATERIAL ...................................................................................................................21
5.1
Reagenzien, Kits, Plastik- und Verbrauchsmaterialien..............................................21
5.2
Medien .....................................................................................................................22
5.2.1 Medien für Bakterien-Kulturen...........................................................................22
5.2.2 Medien für die Zellkultur ....................................................................................22
5.2.3 Puffer und Lösungen.........................................................................................23
5.3 Biologisches Material................................................................................................25
5.3.1 Versuchstiere ....................................................................................................25
5.3.2 Zellen ................................................................................................................25
5.3.3 Virus..................................................................................................................26
5.3.4 In vivo applizierte Agenzien...............................................................................26
5.4 Nukleinsäuren ..........................................................................................................26
5.4.1 Vektorsysteme und Plasmide ............................................................................26
5.4.2 Oligonukleotide .................................................................................................29
5.5 Enzyme ....................................................................................................................33
5.6
Antikörper .................................................................................................................33
5.7
Geräte ......................................................................................................................35
5.8
Software ...................................................................................................................36
6
METHODEN .................................................................................................................37
6.1
Zellkulturverfahren....................................................................................................37
6.1.1
6.1.2
6.1.3
Zellkultur ...........................................................................................................37
Transfektion von Plasmid-DNA .........................................................................37
In vitro-Amplifikation und Aufreinigung von MCMV-Virionen..............................37
I
II
Inhaltsverzeichnis
6.2
Molekularbiologische Methoden ...............................................................................38
6.2.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ....................................................................38
6.2.2 DNA-Gelelektrophorese ....................................................................................40
6.2.3 DNA-Spaltung mit Hilfe von Restriktionsenzymen .............................................40
6.2.4 Klonierung von DNA-Fragmenten .....................................................................41
6.2.5 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA................................................42
6.2.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien .......................................................42
6.3 Proteinbiochemische Methoden................................................................................43
6.3.1 Herstellung von Zelllysaten ...............................................................................43
6.3.2 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen ......................................43
6.4 Immunbiologische Methoden ....................................................................................44
6.4.1 Enzymgekoppelter Immunoadsorptionstest (ELISA) .........................................44
6.4.2 Indirekte Immunfluoreszenz ..............................................................................45
6.4.3 in vitro- Neutralisationstest muriner Antikörper ..................................................46
6.4.4 Durchflusszytometrie- Analysen ........................................................................47
6.4.5 Komplement-Bindungs-Reaktion zum Komplement-Nachweis in der Maus.......48
6.5 Tierexperimentelle Techniken...................................................................................49
6.5.1
6.5.2
6.5.3
6.5.4
6.5.5
6.5.6
6.6
Infektion und Immunisierung .............................................................................49
Serumgewinnung ..............................................................................................49
in vivo-Biolumineszenz......................................................................................49
Adoptiver Zell- und Serumtransfer.....................................................................49
Bestimmung des viralen Titers in Organen........................................................50
In vivo-Applikation von depletierenden oder blockierenden Antikörpern,
Clodronat-Liposomen und Cobra Venom Faktor ...............................................51
Isolation und Aufreinigung muriner Zellen.................................................................51
6.6.1
6.6.2
7
Aufreinigung und Isolation von Monozyten aus murinen Milzen und Vollblut
von C57BL/6 Rag1-/--Mäusen ............................................................................51
Anreicherung CD115-positiver Zellen aus C57BL/6 Rag1-/--Mäusen mittels
MACS-Technologie ...........................................................................................52
ERGEBNISSE ..............................................................................................................53
7.1
Untersuchung der murinen Antikörperantwort gegen die Glykoproteine von MCMV .53
7.1.1 Eukaryote Expression MCMV-kodierter Glykoproteine ......................................53
7.1.2 Immunogenität MCMV-kodierter Glykoproteine.................................................57
7.2 Charakterisierung von MCMV-spezifischen Serumpools ..........................................61
7.2.1 Erkennung von MCMV-Antigenen .....................................................................61
7.2.2 Verteilung der IgG-Subtypen .............................................................................62
7.2.3 Neutralisationskapazität der Serumpools ..........................................................63
7.2.4 Testung des Serumpools infizierter Donoren in vivo..........................................66
7.3 Rolle der Neutralisation durch MCMV-spezifische Antikörper in vivo ........................68
7.3.1
Vergleich des Schutzes nach Therapie mit polyklonalem Serum aus infizierten
und immunisierten Donoren gleicher in vitro-Neutralisationskapazität ...............68
7.3.2 Schutzversuch mit therapeutischer Gabe von monoklonalen Antikörpern
gegen die nicht-strukturellen Glykoproteine m04 und m153 ..............................71
7.4 Rolle des Komplementsystems beim Antikörper-vermittelten Schutz in vivo.............73
7.5
Einfluss von Fcγ-Rezeptoren auf den Antikörper-vermittelten Schutz gegen MCMV 75
7.5.1
7.5.2
7.5.3
Züchtung von Fcγ-/-x Rag1-/--Mäusen ................................................................75
Schutz nach therapeutischer Gabe von immunem Serum bei Fcγ-/--Mäusen.....77
Überleben von Fcγ-/--Mäusen nach Behandlung mit MCMV-spezifischen
Antikörpern........................................................................................................80
Inhaltsverzeichnis
7.6
Generierung und MCMV-Replikationsanalysen von transgenen Mäusen mit einer
Fcγ-Rezeptordeletion................................................................................................82
Züchtung von Rag1-/--Mäusen mit Deletion eines oder zweier aktivierender FcγRezeptoren in Kombination ...............................................................................82
7.6.2 Replikationsvergleich von MCMV in den transgenen Fcγ-RezeptorMausmutanten ..................................................................................................84
7.7 Rolle individueller Fcγ-Rezeptoren beim Antikörper-vermittelten Schutz gegen
7.6.1
MCMV ......................................................................................................................86
7.8
Kombinierte Inaktivierung zweier aktivierender Fcγ-Rezeptoren und ihr Einfluss auf
den Schutzeffekt durch Antikörper ............................................................................89
Serumtransfer in FcγRI+IV-/--Mäusen ................................................................89
Serumtransfer bei FcγRI-/-- bzw. FcγRIV-/--Mäusen mit zusätzlichem FcγRIIIBlock .................................................................................................................90
7.8.3 Einfluss des CD16/32-Blocks auf den Schutzeffekt von Antikörpern in Rag1-/-Tieren ohne Fcγ-Rezeptordefekt .......................................................................92
7.9 Durchflusszytometrische Analyse der zellulären Expression einzelner Fcγ7.8.1
7.8.2
Rezeptoren...............................................................................................................94
7.10 Einfluss verschiedener Effektorzellen bei der Antikörper-vermittelten Protektion
gegen MCMV ........................................................................................................103
7.10.1 Rolle der Monozyten .......................................................................................103
7.10.2 Rolle der NK-Zellen.........................................................................................108
8
DISKUSSION .............................................................................................................110
8.1
Rolle der Antigenspezifitäten ..................................................................................111
8.2
Antikörper-vermittelte Effektormechanismen ..........................................................112
8.2.1
8.2.2
Neutralisation von MCMV................................................................................113
Die Bedeutung der MCMV-Dissemination für den Antikörper-vermittelten
Schutz.............................................................................................................115
8.2.3 Antikörper-vermittelte Kontrolle von MCMV durch Komplement ......................115
8.2.4 FcγR-abhängige Kontrolle von MCMV durch spezifische Antikörper ...............116
8.3 Rolle von Effektorzellen beim Antikörper-vermittelten Schutz vor MCMV ...............121
8.3.1 NK-Zellen ........................................................................................................122
8.3.2 Monozyten ......................................................................................................123
8.4 Hypothesen zum Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion ...........126
9
LITERATURVERZEICHNIS........................................................................................129
10
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................148
LEBENSLAUF ....................................................................................................................151
PUBLIKATIONEN UND PRÄSENTATIONEN.....................................................................152
DANKSAGUNG..................................................................................................................153
III
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Die Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) ist weltweit verbreitet und verläuft
in immunkompetenten Individuen in der Regel asymptomatisch. In immunsupprimierten
Personen oder kongenital infizierten Neugeborenen kann HCMV einen schweren bis
lebensbedrohlichen Krankheitsverlauf hervorrufen. Das adaptive Immunsystem spielt bei
gesunden Personen für die Kontrolle einer HCMV-Infektion eine tragende Rolle und ist somit
ein wichtiger Ansatzpunkt zur Behandlung einer HCMV-Erkrankung. Die derzeitige Therapie
mit polyklonalen Immunglobulinpräparaten führt nur zu Teilerfolgen. Bisher gibt es keine
Informationen über die Spezifitäten der protektiven Antikörper sowie über deren möglichen
Wirkmechanismus. Mit Hilfe eines Infektionsmodells mit dem Murinen Cytomegalovirus
(MCMV), das als etabliertes Modellsystem für HCMV gilt, wurden in dieser Arbeit die
Antikörperspezifitäten gegen virale Glykoproteine untersucht. Mittels eines ScreeningVerfahrens, das auf der rekombinanten Expression von 39 MCMV-Glykoproteinen basierte,
wurden 15 Antigene identifiziert, die während einer MCMV-Infektion Antikörper induzierten.
In vivo-Therapieversuche mit MCMV-infizierten Mäusen zeigten, dass die Serumantikörper
aus MCMV-infizierten Tieren ein größeres Protektionspotential aufwiesen als die Antikörper
aus Tieren, die mit replikationsunfähigen Viruspartikeln immunisiert wurden. Folglich könnten
nicht-neutralisierende Antikörper, die gegen nicht-strukturelle Glykoproteine auf der
Oberfläche infizierter Zellen gerichtet sind, am Schutz beteiligt sein. Dabei könnte der Schutz
auf
IgG-Fc-vermittelten
Effektormechanismen
wie
ADCC
(Antikörper-abhängige
zellvermittelte Zytotoxizität) beruhen. Zur Untersuchung der Rolle von Fcγ-Rezeptoren
(FcγR) wurden zunächst genetisch FcγR-defiziente Mäuse auf Rag1-/--Hintergrund (Fcγ-/-)
gekreuzt und gezüchtet. Serumtransferversuche in Fcγ-/--Mäusen bestätigten die essentielle
Funktion der aktivierenden Fcγ-Rezeptoren (FcγRI, FcγRIII, FcγRIV) bei der Antikörpervermittelten Protektion. Der Schutz war nicht einem einzelnen Fcγ-Rezeptor zuzuordnen. Die
kombinierte Defizienz von zwei FcγR zeigte einen verminderten Schutzeffekt polyklonaler
Mausseren und ließ damit einen redundanten Effekt der FcγR vermuten. FcγR werden auf
unterschiedlichen Zellen exprimiert und weisen unterschiedliche Affinität zu den einzelnen
IgG-Subtypen auf. Dadurch wird das Fcγ-Rezeptorsystem sehr komplex. Des Weiteren
wurde untersucht, welche Zellen zur Kontrolle einer MCMV-Infektion durch Antikörper
beitragen. Natürliche Killer- (NK-) Zellen waren für den Antikörper-vermittelten Schutz nicht
essentiell, obwohl ihnen in der Literatur eine tragende Rolle bei ADCC zugesprochen wird.
Dagegen besaßen adoptiv transferierte Monozyten das Potential, die Viruslast bei einer
MCMV-Infektion mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern zu senken. Zusammenfassend
sprechen die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse dafür, dass neben der direkten
Neutralisation von Viren das Fcγ-Rezeptorsystem eine wesentliche Funktion beim
Antikörper-vermittelten Schutz während einer MCMV-Infektion besitzt.
1
2
Summary
2 Summary
The infection with the human cytomegalovirus (HCMV) is distributed worldwide and is usually
asymptomatic in immunocompetent individuals. In immunosuppressed individuals or
congenitally infected newborns HCMV can cause serious, even life-threatening disease. The
adaptive immune system plays a major role for the control of HCMV infection in healthy
persons and is therefore an important target for the treatment of HCMV disease. Current
therapy with polyclonal immunoglobulin preparations is only partially successful. Informations
about the specificity of protective antibodies as well as the potential mode of action are
lacking. Using a MCMV (murine cytomegalovirus) infection model, which represents the
established animal model system for HCMV, antibody specificities against viral glycoproteins
were analyzed. Using a screening procedure based on recombinant expression of 39 MCMV
glycoproteins, 15 antigens were identified which induced antibodies during infection. In vivo
therapy studies with MCMV-infected mice showed a more potent protective effect by serum
antibodies derived from MCMV-infected animals compared to animals that were immunized
with replication incompetent virus particles. Thus, non-neutralizing antibodies directed
against non-structural glycoproteins, expressed on the surface of infected cells, could
contribute to the protective potential of serum antibodies via IgG-Fc mediated effector
functions, such as antibody mediated cytotoxicity (ADCC). To investigate the role of Fcmediated effector functions we generated transgenic mice by crossbreeding Fcγ receptor
deficient animals on the Rag1-/- background. Serum transfer experiments in Fcγ receptor
deficient Rag1-/- mice demonstrated an essential role of the activating Fcγ receptors (FcγRI,
FcγRIII, FcγRIV) in antibody-mediated protection. The protection was not resting on a single
Fcγ receptor. Combined deletion of more than one Fcγ receptor was required to demonstrate
a negative effect on antibody protection, presumably as a result of redundancy in the Fcγ
receptor system. Fcγ receptors are differentially expressed on different cell types, and have a
different affinity for each of the IgG subtypes. Thus, the Fcγ receptor system is highly
complex. Furthermore, it was investigated which cells contribute to the antibody-mediated
control of a MCMV infection. Natural killer cells, which are known to have an important
function in ADCC, were not necessary for the antibody-mediated protection. However,
passively transferred monocytes had the potential to reduce the viral load in MCMV infected
mice in the presence of polyclonal antibodies. In summary, these results demonstrate that
besides direct neutralization of viruses the Fcγ receptor system has a vital role in the
protection from MCMV infection by antibodies.
Einleitung
3 Einleitung
3.1 Das Humane Cytomegalovirus (HCMV)
3.1.1 Klassifizierung und Morphogenese
HCMV, auch als humanes Herpesvirus 5 (HHV-5) bezeichnet, ist ein Herpesvirus. Bis heute
wurden in der Natur über 200 human- und tierpathogene Herpesviren identifiziert (Roizman
& Pellet, 2002). Sie sind ubiquitär verbreitet und gehören mit einem Durchmesser von 180
bis 230 nm zu den relativ großen Viren. Die Mitglieder der Familie der Herpesviridae werden
aufgrund ihres Wirtsspektrums, ihrer Replikationsgeschwindigkeit und Pathogenität in drei
Unterfamilien eingeteilt: α-, β- und γ-Herpesviren. HCMV ist mit einem auffällig langsamen
Replikationszyklus und sehr engem Wirtsspektrum der bekannteste Vertreter der βHerpesviren. Die Zytopathologie akut infizierter Zellen zeichnet
sich durch eine
Größenzunahme und die sich bildenden nukleären sowie zytoplasmatischen Einschlüsse
aus, die den Namen der Infektionskrankheit, Zytomegalie, geprägt hat.
Das Cytomegalovirus besitzt ein doppelsträngiges DNA-Genom von 235kb, das für zirka 167
Genprodukte kodiert (Murphy & Shenk, 2008; Cunningham et al., 2010). Es ist somit das am
meisten komplexe humanpathogene Virus. Die virale DNA ist von einem ikosaedrischen
Kapsid in der Größe von 100 bis 110 nm umgeben (Abb. 3.1). Das Nukleokapsid selbst ist in
das Tegument eingebettet, das eine Matrix darstellt, bestehend aus mindestens 27 viral
kodierten Proteinen, kleineren Mengen anderer Proteine sowie Bestandteilen viraler und
zellulärer RNA (Terhune et al., 2004). Das Tegumentprotein pp65 (UL83) ist das
vorherrschende Protein der Matrix und in der klinischen Diagnostik von besonderer
Bedeutung.
Basierend auf den Daten von Proteomanalysen enthält die Virushülle sowohl viral kodierte
als auch zelluläre Glykoproteine, wovon etwa 20 viralkodierte Strukturproteine sind (Varnum
et al., 2004; Liu & Zhou, 2006; Mocarski, 2006). Viele der Glykoproteine der Virushülle
übernehmen wichtige Funktionen für die Adsorption und den Eintritt des Virus in die
Wirtszelle oder sind notwendig für die Bindung von Rezeptoren der Zelle (Keay et al., 1989;
Kari & Gehrz, 1992; Compton et al., 1993; Milne et al., 1998). Als Strukturproteine sind sie
wichtig für die antivirale Immunantwort im Wirtsorganismus (Kap. 3.5).
3
4
Einleitung
(A)
(B)
Abb. 3.1: HCMV
(A) Schematisches Modell eines HCMV-Partikels (modifiziert nach D.Streblow, OHSU, Portland, USA). Das Virus
setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen (von innen nach außen): das Nukleokapsid, das eine
doppelsträngige DNA enthält; das Tegument, bestehend aus einer Proteinmatrix; die Virushülle, in die ein GProtein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) und strukturelle Glykoproteine zum Teil komplexiert (gC I-III) inkorporiert
sind. (B) Dreidimensionale Darstellung der Oberfläche eines intakten HCMV-Partikels (modifiziert nach Chen et
al., 1999). Ein ikosaedrisch angelegter Anteil ist deutlich erkennbar. Auflösung von 18Å. Betrachtung entlang
einer dreifachen Symmetrieachse.
3.1.2 Epidemiologie und Pathogenese
HCMV ist weltweit verbreitet. Die Durchseuchungsrate beträgt in den westlichen Ländern 5070% und in den Entwicklungsländern sogar bis zu 100%, wobei die Durchseuchung
innerhalb der Bevölkerung vom sozioökonomischen Stand abhängig ist (Krech, 1973;
Lamberson & Dock, 1992). Die Übertragung erfolgt durch eine Tröpfchen- oder
Schmierinfektion über Blut, Speichel, Sexualkontakte und Muttermilch bzw. parenteral bei
Bluttransfusionen oder einer Stammzell-/ Organtransplantation. Die Ansteckung findet in den
meisten Fällen in der frühen Kindheit und Pubertät statt, kann aber auch im hohen Alter
erfolgen. Die Inkubationszeit beträgt in der Regel vier bis acht Wochen. Nach einer initialen
Infektion kann HCMV auf dem Blutweg zirkulierende, mononukleäre Zellen sowie eine
Vielzahl anderer Zellen befallen, wie z.B. Endothel- und Epithelzellen, Fibroblasten etc., aber
auch das zentrale Nervensystem (Söderberg et al.,1993; Sinzger & Jahn, 1996). Während
einer Virämie wird das Virus über Körperflüssigkeiten wie Speichel, Sexualsekrete, Urin, Blut
und Muttermilch ausgeschieden und kann somit zu Neuinfektionen führen. Mit Hilfe von
immunevasiven Mechanismen persistiert HCMV im Organismus lebenslang als chronische
Infektion bzw. im latenten Zustand (Kap. 3.5.3). Während der Latenzphase ist eine
Virusreplikation nicht nachweisbar (Sinclair & Sissons, 2006). Ort der Latenz sind v.a.
monozytäre und dendritische Vorläuferzellen, Makrophagen sowie Endothelzellen diverser
Organe (Hahn et al., 1998; Jarvis & Nelson, 2002). HCMV kann allerdings jederzeit durch
endogene
(z.B.
Schwangerschaft)
oder
exogene
Faktoren
(z.B.
HIV-Infektion,
Einleitung
immunsupprimierende Therapie) reaktiviert werden. Dadurch kommt es unter Umständen zu
neuen lytischen Infektionszyklen, die mit Virusfreisetzung verbunden sein können.
3.2 Das Murine Cytomegalovirus (MCMV)
Für HCMV existiert bisher kein Tiermodell, da die Replikation und Dissemination von CMV
im Wirt Spezies-spezifisch ist. Obwohl Experimente mit HCMV in humanisierten SCIDMäusen bereits durchgeführt wurden (Brown et al., 1995; Wang et al., 2005), gilt MCMV als
etabliertes Modellsystem für HCMV, da es vergleichbare Eigenschaften in der Replikation
sowie Pathogenität aufweist. Der Infektionsweg von MCMV unter Freilandbedingungen oder
in Käfighaltung ist nicht vollständig geklärt. Jedoch gelten der Übertragungsweg durch
Speichel (u.a. durch Beißen) sowie die sexuelle Übertragung als die wahrscheinlichsten
Formen der Virusausbreitung. In beiden Fällen erfolgt der Viruseintritt über Epithelien und die
folgende Dissemination hämatogen. Im experimentellen Infektionsverlauf von MCMV spielen
neben der Infektionsdosis und der Applikationsart (intraperitoneal, intravenös oder
intraplantar) die Herkunft des Virus (Aufreinigung aus Zellkulturüberstand oder aus
Speicheldrüsen), das Alter, der Immunstatus und der genetische Hintergrund der infizierten
Maus eine entscheidende Rolle (Krmpotić et al., 2003). Im Tiermodell ist die intraperitoneale
(i.p.) Applikation von MCMV die gängige Infektionsmethode. Die intraperitoneale Gabe einer
subletalen MCMV-Infektionsdosis führt in der murinen Lunge, Leber, Milz, Niere und zuletzt
in den Speicheldrüsen zu einer schnellen Virusausbreitung. Im murinen immunkompetenten
Organismus ist die Infektion, so wie im Menschen, asymptomatisch. Das Virus repliziert aber
noch für mindestens 4 Wochen in den Speicheldrüsen (Manning et al., 1992). In
immunsupprimierten oder -defizienten Mäusen (z.B. durch experimentelle Gabe von
immunsupprimierenden Therapeutika) führen hohe MCMV-Titer, die durch Reaktivierung
vom latenten Virus oder durch eine Primär-/Neuinfektion hervorgerufen werden, in den
Zielorganen zu Pneumonie, Hepatitis und Retinitis. Ein starker MCMV-Befall der Milz oder
Leber kann tödlich wirken (Fitzgerald & Shellam, 1991). Die Morphologie der Virionen
entspricht im Wesentlichen der von HCMV (Mocarski & Courcelle, 2001). Auf genomischer
Ebene besitzt der MCMV Stamm Smith 170 offene Leserahmen (ORF), wovon nur 48,8%
Homologie zu anderen bekannten Proteinen zeigen. 78 der Gene, für die MCMV-Smith
kodiert, sind zu den entsprechenden HCMV-Genen signifikant homolog (Rawlinson et al.,
1996). Sowohl MCMV als auch HCMV verfügen über eine strikt regulierte Genexpression,
die in drei aufeinanderfolgenden Phasen verläuft. Durch die zelluläre Polymerase-II kommt
es zur Transkription der immediate early (IE)-, early (E) und late (L)-Gene, die in einer
zeitlich bestimmten Reihenfolge des Replikationszyklus in der infizierten Zelle exprimiert
werden (Mocarski et al., 2006). Die IE-Proteine sind für die Regulation der E-Proteine sowie
der L-Proteine zuständig. Sie regulieren zudem einige Schritte der Virusvermehrung und
5
6
Einleitung
können ebenfalls die Regulation der Zelle beeinflussen, indem sie z.B. in die Expression und
Erkennung der MHC (major histocompatibility complex) Klasse-I-Proteine eingreifen. Einige
der korrespondierenden E-Genprodukte sorgen für die Initiation der viralen Replikation
(Roizman & Batterson, 1986). Außerdem fungieren die E-Proteine als wichtige Aktivatoren
der L-Phase, in der die viralen Strukturproteine (L-Proteine) für den Zusammenbau des
Viruspartikels exprimiert werden.
3.3 Die humorale Immunantwort
3.3.1 Entstehung von antigenspezifischen Antikörpern
B-Lymphozyten gehören zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen und bilden
die Grundlage für das spezifische humorale Immunsystem. Naive B-Zellen wandern durch
den Körper und können mit ihren membranständigen Immunglobulinen, den sog. BZellrezeptoren (BCR), Antigene im Blut binden, oder sie treten in den peripheren
Lymphorganen (Lymphknoten, Milz) mit freien, durch die Lymphe herbeitransportierten
Antigenen in Kontakt. Nach deren Bindung durch den BCR wird das Antigen
rezeptorvermittelt endozytiert, verdaut und prozessiert als antigenes Peptid auf MHC-IIMolekülen auf der Oberfläche des B-Lymphozyten präsentiert. Mit Hilfe der gekoppelten
Erkennung, bei der CD4+T-Helferzellen (TH-Zelle) die MHC-II-Peptid-Kombination auf den BZellen binden, werden die B-Zellen in den sekundär lymphatischen Geweben aktiviert (Abb.
3.2). Des Weiteren ist das Erkennen von Antigenen auch in Form von Immunkomplexen
möglich, die an der Oberfläche von follikulären dendritischen Zellen fixiert sind. Die
Aktivierung der B-Zelle ist in dem Fall TH-Zell-unabhängig.
Einleitung
Abb. 3.2: T-Zellabhängige BZellaktivierung
Der
B-Lymphozyt
wird
durch
eine
+
CD4 Helfer-T-Zelle aktiviert, nachdem die
B-Zelle ein über den B-Zellrezeptor (BCR)
gebundenes Antigen internalisiert und als
Peptid
über
den
MHC-II-Komplex
präsentiert hat. Die T-Zelle erkennt das
antigene Peptid spezifisch über ihren TZellrezeptor (TCR). Weitere Interaktionen
erfolgen durch CD40 und dessen Ligand
(CD40L), sowie durch Interleukine (IL-)
-2/-4/-5/-6, die die T-Zelle ausschüttet.
Dies führt zur klonalen Expansion der BZellen und schließlich zur Differenzierung
in
langlebige
Plasmazellen
und
Gedächtnis-B-Zellen.
Die Synthese weiterer, kostimulierender Effektormoleküle durch die mit den B-Zellen
interagierenden TH-Zellen, wie der zellgebundene CD40-Ligand (Parker, 1993) und die
sezernierten Zytokine Interleukin (IL)-2,-4,-5, und -6 (Croft & Swain, 1991; Takatsu, 1997),
führt zur Proliferation und klonalen Expansion. Hierbei differenzieren die B-Zellen entweder
in kurzlebige, antikörpersezernierende Plasmablasten (Odendahl et al., 2005) oder sie
initiieren Keimzentrumsreaktionen (Ho et al., 1986; MacLennan, 1994). Zu letzteren gehören
die somatische Hypermutation, die Selektion und die Affinitätsreifung sowie der IgHKlassenwechsel (CSR; class switch recombination). Bei diesen Reaktionen werden die
variablen Regionen der Antikörper verändert, die Selektion und das Überleben hoch-affiner
B-Zellen gesteuert und durch die Produktion unterschiedlicher Antikörper-Isotypen eine
Vielzahl von Effektorfunktionen übernommen (Stavnezer, 1996). Die hoch-affinen BZellmutanten haben weiter die Möglichkeit, zu langlebigen Plasmazellen oder Gedächtnis-BZellen zu differenzieren (Good-Jacobsen & Tarlinton, 2012). Langlebige Plasmazellen
können sich nicht mehr teilen, wandern ins Knochenmark und produzieren dort hochaffine
Antikörper. Gedächtnis-B-Zellen können sich nur sehr langsam teilen, exprimieren
Immunglobulin auf ihrer Oberfläche und sezernieren Antikörper nur in geringen Mengen. Sie
besitzen alle genetischen Veränderungen, die in den Zellen des Keimzentrums stattgefunden
haben, einschließlich der somatischen Mutationen und der Genumordnungen, die zum IgGKlassenwechsel führen. Bei einem erneuten Kontakt des Körpers mit demselben Antigen,
7
8
Einleitung
das für die B-Zellaktivierung verantwortlich ist, können diese Gedächtniszellen viel schneller
zu
Plasmazellen
differenzieren
und
eine
gegen
dieses
Pathogen
hoch-affine
Antikörperreaktion starten (Ahmed & Gray, 1996).
Im Prinzip kann sich der Körper sofort nach einer Infektion und noch bevor sich die
antigenspezifische, humorale Immunantwort entwickelt hat, mit Hilfe von „natürlichen
Antikörpern“ zur Wehr setzen. Natürliche Antikörper sind bevorzugt vom IgM-Isotyp und
werden antigenunabhängig von einer Untergruppe B-Zellen (Casali & Schettino, 1996)
produziert. Sie bilden eine wichtige Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven
Immunsystem,
indem
sie
eine
anfängliche
Virusdissemination
begrenzen
können
(Ochsenbein & Zinkernagel, 2000) und maßgeblich daran beteiligt sind, virale Antigene zu
den sekundären Lymphorganen zu rekrutieren (Ochsenbein et al., 2000). Dennoch handelt
es sich dabei nur um schwach-affine, polyreaktive Immunglobuline, die die spezifische
Antikörperantwort auf ein z.B. virales Antigen unerlässlich machen.
3.3.2 Eigenschaften und Aufbau eines Antikörpers
Antikörper sind die sezernierte Form des B-Zellrezeptors und werden auch als
Immunglobuline (Ig) bezeichnet. Sie zirkulieren als Glykoproteine im Blutplasma und in
bestimmten Körperflüssigkeiten. Immunglobuline werden in insgesamt fünf verschiedene
Isotypen unterteilt: IgM, IgD, IgG, IgA und IgE. Gleichzeitig wird damit die funktionelle
Aktivität eines Antikörpers bestimmt. IgG stellt mit ca. 80% den überwiegenden Anteil der
Immunglobuline im Blutplasma dar. Dies liegt einerseits an der großen Zahl der IgGproduzierenden B-Zellen und andererseits an der langen Halbwertszeit von 23-25 Tagen
(Vieira & Rajewsky, 1988). IgG wird in weitere Subtypen unterteilt: im humanen System in
IgG1, IgG2, IgG3 sowie IgG4 und im murinen System in IgG1, IgG2a/c, IgG2b und IgG3.
Immunglobulin-Moleküle sind symmetrisch aufgebaut. Ein IgG-Molekül besteht aus zwei mal
zwei Polypeptidketten unterschiedlicher Größe. Es gibt zwei schwere Ketten mit einem
relativen Gewicht von ca. 50kDa und zwei leichte mit etwa 25kDa. Die beiden schweren
Ketten eines Immunglobulins sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden und jede
schwere Kette ist zudem über eine weitere Disulfidverbindung mit einer leichten Kette
verknüpft. Die am Fc-Teil gebundenen Polysaccharide machen die Immunglobuline zu
Glykoproteinen. Bei der Betrachtung der Antikörperstruktur im Hinblick auf die strukturelle
Variabilität ergibt sich die Unterscheidung in eine variable (V) und konstante (C) Region. Die
aminoterminalen, variablen V-Regionen der schweren und der leichten Kette verleihen
zusammen dem Antikörper die Fähigkeit, ein spezifisches Antigenepitop zu binden. Es gibt
drei besonders variable Regionen in den V-Domänen, die als hypervariable Domänen
(CDR 1, 2, 3) bezeichnet werden. Die Oberflächenstruktur der zusammengelagerten, hypervariablen Schleifen der leichten und schweren Kette ist dabei komplementär zum Antigen
(Schroeder
&
Cavacini,
2010)
(Abb.
3.3).
Elektrostatische
Wechselwirkungen,
Einleitung
Wasserstoffbrücken, van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Interaktionen können zur
Bindung des Antigens durch den Antikörper beitragen (Braden & Poljak, 1995).
Abb. 3.3: Aufbau und Struktur eines IgG-Immunglobulins
Jede Immunglobulinkette besitzt eine variable Domäne (VL und VH). Die leichten Ketten haben nur eine
konstante Domäne (CL), die schweren Ketten besitzen drei (CH1, CH2, CH3). Die einzelnen Kettenabschnitte
sind über inter- und intramolekulare Disulfidbrücken (-S-S) miteinander verbunden. Die Fab-Fragmente
entsprechen den beiden identischen Armen des Antikörpermoleküls und enthalten die antigenbindende Aktivität.
Das Fcγ-Fragment des Antikörpers interagiert mit Effektormolekülen wie dem Komplement bzw. mit Effektorzellen
über deren Fc-Rezeptoren (FcγRI-IV). Die Gelenkregion, die den Fc- mit dem Fab-Anteil des Antikörpermoleküls
verbindet, ermöglicht eine flexible, unabhängige Bewegung der beiden Fab-Arme. Die hypervariable Region,
CDR (complementarity determining region), ist das Gegenstück zum Epitop eines Antigens.
9
10
Einleitung
3.4 Antikörper-vermittelte Immunantwort auf virale Infektionen
Die Hauptaufgabe von Antikörpern ist es, das pathologische Ausmaß einer viralen Infektion
einzugrenzen bzw. bei wiederholtem Kontakt einer Virusinfektion vorzubeugen. Hierzu
können Antikörper über unterschiedliche Effektormechanismen in vivo agieren. Im
Allgemeinen agieren Antikörper sowohl gegen freies Virus als auch gegen virusinfizierte
Zellen (Abb. 3.4). Welche Relevanz und Bedeutung der jeweilige Effektormechanismus hat,
hängt u.a. von der Zytopathogenität des Virus oder der Art der Virusausbreitung im Wirt ab.
Abb. 3.4: Antikörperantwort auf virale Glykoproteine
Dargestellt sind die möglichen Zielantigene für Immunglobuline auf freiem Viruspartikel (linke Abb.) und auf einer
virusinfizierten Zelle (rechte Abb.). Strukturelle Virusproteine auf dem Virion oder auf der Membran der infizierten
Zelle sind grau dargestellt. Strukturproteine können sowohl neutralisierende als auch nicht-neutralisierende
Antikörper induzieren (Burton et al., 2001). Nicht-strukturelle, virale Glykoproteine (pink) werden auf der
Oberfläche der infizierten Zelle exponiert, wo sie als Angriffspunkt für Antikörper fungieren können.
3.4.1 Antikörper-vermittelte Effektormechanismen gegen freie Viruspartikel
Die spezifische Bindung eines Antikörpers an ein freies Virus kann die Infektion von
Zielzellen auf unterschiedliche Weise verhindern und wird im Allgemeinen als Neutralisation
bezeichnet (Dimmock, 1995). Bis heute werden unterschiedliche Hypothesen zu den
möglichen Mechanismen der Neutralisation aufgestellt. Die Wichtigsten sind folgende: die
Hemmung der Virus-Zellbindung durch Blockierung von spezifischen Rezeptoren; Inhibition
des viralen Zelleintritts durch Hemmung der viralen Fusion mit der Zielzelle; Hemmung der
Einleitung
Virusausbreitung über Zell-Zell-Kontakte; Veränderung der Konformation von Proteinen der
Hülle oder des Kapsids; Blockierung der Freisetzung der viralen Nukleinsäure aus der
Kapsidhülle nach Eindringen des Virus in die Wirtszelle; Aggregation von Virionen;
Absättigung mehrerer viraler Strukturproteine durch einen oder mehrere Antikörper
(Dimmock, 1993; Parren & Burton, 2001; Burton, 2002; Reading & Dimmock, 2007). Dabei
können die jeweiligen Mechanismen einzeln, simultan oder aufeinanderfolgend ablaufen
(Dimmock, 1993) und sind für verschiedene Viren und Zelltypen unterschiedlich.
Der Effekt der Neutralisation kann zusätzlich mit Hilfe des Komplementsystems verstärkt
werden. Das Komplementsystem besteht aus einer Reihe von löslichen Proteinen im Serum
und aus Rezeptoren auf Zelloberflächen, deren Funktion die spezifische und unspezifische
Immunabwehr ist. Eine Möglichkeit, die Neutralisation zu verbessern, ist die Bindung der
Komplementkomponenten an den Fc-Teil eines virusgebundenen Immunglobulins. Dadurch
wird die Virusoberfläche zusätzlich mit Komplementproteinen vernetzt und das Virus
gehemmt (Yoshino et al., 1977). Eine Antikörper-vermittelte Komplementaktivierung kann
außerdem zur direkten Virolyse führen, wie erstmals durch Berry und Almeida (1968) gezeigt
wurde. Zuletzt kann das mit Immunglobulinen und/oder Komplementproteinen opsonisierte,
extrazelluläre Virus über Fc- und Komplementrezeptoren von phagozytierenden Zellen
aufgenommen und inaktiviert werden (Hirsch, 1982; Lachmann, 1985; Stoermer & Morrison,
2011).
3.4.2 Antikörper-vermittelte Effektormechanismen gegen viral infizierte Zellen
Wie schon bei der Inaktivierung freier Viruspartikel kann eine infizierte Zelle mit Hilfe
spezifischer Immunglobuline und mittels unterschiedlicher Effektorvorgänge gehemmt und
eliminiert werden. Die Bindung von Antikörpern an virusinfizierte Zellen kann einerseits die
lytische Freisetzung des Virus hemmen (Gerhard, 2001) und/oder andererseits die
Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle unterbinden (Burioni et al., 1994).
Eine besonders wichtige Rolle bei der Beseitigung virusinfizierter Zellen spielen jedoch die
IgG-bindenden
Fcγ-Rezeptoren
(FcγR),
die
von
unterschiedlichen
Effektorzellen
hämatopoetischen Ursprungs als Transmembranproteine exprimiert werden. Durch die
Kreuzvernetzung von FcγR mit IgG-Immunkomplexen oder antigengebundenem IgG wird
eine Reihe von Effektorfunktionen durch Zellen des angeborenen Immunsystems induziert.
Dabei kommt es zur Phosphorylierung des auf der γ-Kette gelegenen ITAM-Motivs (engl.
immunoreceptor tyrosine-based activation motif) (Wirthmueller et al., 1992), das die
Signalkaskade u.a. zur Antikörper-vermittelten zellulären Toxizität (ADCC; engl. antibodydependent
cellular
cytotoxicity),
complement-dependent
Komplement-abhängigen
cytotoxicity),
Phagozytose,
Zytotoxizität
Endozytose
mit
(CDC;
engl.
anschließender
Antigenpräsentation sowie der Freisetzung von Zytokinen und pro-inflammatorischen
Mediatoren (Burton & Woof, 1992; Ravetch & Bolland, 2001) aktiviert.
11
12
Einleitung
Da die vorliegende Arbeit auf dem Mausmodell basiert, werden an dieser Stelle
insbesondere die murinen Fcγ-Rezeptoren erläutert.
Es werden vier Klassen von Fcγ-Rezeptoren (FcγR) unterschieden (Abb. 3.5): FcγRI (CD64),
FcγRIIB (CD32), FcγRIII (CD16) und FcγRIV, der zuletzt entdeckt wurde und in allen
Säugetierspezies konserviert ist (Nimmerjahn et al., 2005). Funktionell kann man die FcγRezeptoren in zwei Gruppen einteilen: die aktivierenden (FcγRI/ FcγRIII/ FcγRIV) und den
inhibierenden Rezeptor (FcγRIIB), die von unterschiedlichen Zelltypen exprimiert werden
(Tab. 3.1).
Alle aktivierenden Rezeptoren haben eine nicht-kovalent assoziierte γ-Kette gemeinsam
(Abb. 3.5), die das Aktivierungsmotiv ITAM besitzt und über einen Src-Kinase-abhängigen
Signalweg für die weitere Zellaktivierung notwendig ist (Nimmerjahn & Ravetch, 2008). Der
FcγRIIB induziert inhibitorische Signalkaskaden über das ITIM-Motiv (engl. immunoreceptor
tyrosine-based inhibitory motif), das auf der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors
gelegen ist (Ravetch & Lanier, 2000).
Aktivierende und inhibierende Fc-Rezeptoren werden gleichermaßen von einer Zelle
exprimiert und sind für eine ausgeglichene Antikörperantwort zur Vermeidung von
Autotoxizität und unkontrollierten Entzündungsreaktionen wichtig. Zusätzlich hat die Arbeit
von Nimmerjahn und Kollegen (2005) gezeigt, dass die einzelnen Fcγ-Rezeptoren
Unterschiede in ihrer Affinität zu den einzelnen IgG-Subtypen (Abb. 3.5) aufweisen, was die
Komplexität des Fc-Rezeptorsystems deutlich verstärkt. Der FcγRI ist der einzige Rezeptor,
der neben Immunkomplexen auch monomeres IgG bindet, was sich auf seine hohe Affinität
zum IgG durch insgesamt drei extrazelluläre, globuläre Domänen zurückführen lässt (van der
Poel et al., 2011).
Einleitung
13
Abb. 3.5: Familie muriner Fc-Rezeptoren für IgG
Unterscheidung von vier murinen Fcγ-Rezeptoren mit unterschiedlichen Affinitäten zu den verschiedenen IgGSubtypen. Ausschließlich FcγRI kann monomeres IgG binden. Ein Fcγ-Rezeptor besteht aus einem α-Polypeptid,
dessen extrazelluläre Domänen für die Bindung der Immunkomplexe bzw. des IgGs zuständig ist. Die intrazellulär
als Dimer vorliegende γ-Kette findet sich nur auf den aktivierenden Rezeptoren und enthält ein ITAM-Motiv. Der
einzige inhibitorische Rezeptor, FcγRIIB, trägt ein ITIM-Motiv intrazellulär auf der α-Kette.
Tab. 3.1: Expression von Fcγ-Rezeptoren auf hämatopoetischen Zellen
(Ravetch & Kinet, 1991; Nimmerjahn et al., 2005; Nimmerjahn & Ravetch, 2008; Biburger et al., 2011)
MФ
Monozyten
DC
NK
Neutrophile
B-Zellen
T-Zellen a
FcγRI
+
+
+
-
(+)
-
-
FcγRIIB
+
+
+
-
+
+
-
FcγRIII
(+)
+
+
+
+
-
+
FcγRIV
+
+b
(+)
-
+
-
-
MФ: Makrophagen; +: Expression nachgewiesen; (+): nur schwache Expression detektierbar
+
a: Untergruppe von T-Zellen; CD3 γδ-T-Zellen
b: nur residente, Gr-1 -Monozyten
14
Einleitung
3.5 Immunbiologie und Immunmodulation von HCMV und MCMV
Die Kontrolle von CMV im immunkompetenten Wirt erfolgt in den verschiedenen Stadien der
Infektion durch unterschiedliche Komponenten des Immunsystems. Die erste Abwehr gegen
eine HCMV-Infektion wird durch die betroffene Zelle selbst, durch ihre intrinsische Immunität,
durchgeführt (Tavalai & Stamminger, 2011). Die intrinsischen Abwehrmechanismen werden
durch zelluläre Restriktionsfaktoren moduliert, die konstitutiv von der Zelle exprimiert werden
und schon vor dem Eintritt eines Pathogens aktiv sind (Bieniasz, 2004). Zudem wird in der
frühen Phase der CMV-Infektion die Expression und Sekretion von löslichen Immunmediatoren, z.B. Chemokine, Zytokine, antimikrobielle Proteine, Komplementfragmente und
Stickstoffoxid, eingeleitet. Die wesentlichen Zytokine sind Interferone (IFN-α, -β, -γ)
(Isaacson et al., 2008) und der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) (Pavić et al., 1993). Für die
Kontrolle
einer
CMV-Infektion
werden
letztendlich
die
zellulären
und
humoralen
Komponenten des innaten bzw. adaptiven Immunsystems benötigt. Das Immunsystem kann
im gesunden Organismus die CMV-Infektion jedoch nicht eliminieren. Ursache sind
Immunevasionsmechanismen (Kap. 3.5.3), die sich im Laufe der Koevolution von Virus und
Wirt entwickelt haben. Vermutlich soll die Immunmodulation dem Virus helfen, Latenz zu
etablieren und eine Reaktivierung angesichts einer voll ausgeprägten Immunantwort zu
ermöglichen.
3.5.1 Zelluläre Immunantwort
Die zelluläre Immunantwort spielt bei der Kontrolle einer CMV-Primärinfektion, bei der
Etablierung der Latenz sowie bei der Prävention einer neuen, reaktivierten Virusausbreitung
eine bedeutende Rolle (Koszinowski et al., 1993; Reddehase, 2002). Während der ersten
Tage nach Infektion sind die Natürlichen Killer-Zellen (NK-Zellen) als Effektorzellen der
angeborenen Immunität entscheidend. NK-Zellen gehören zur Familie der Lymphozyten und
können über antigenunabhängige Rezeptoren virusinfizierte Zellen töten. In der Maus tragen
NK-Zellen im Wesentlichen dazu bei, die MCMV-Infektion der frühen Phase in diversen
Organen der Maus zu kontrollieren (Bukowski et al., 1984; Welsh et al., 1991; Tay & Welsh,
1997). Einige Inzucht-Mausstämme, wie C57BL/6-Mäuse, zeigen im Gegensatz zu den
MCMV-empfänglichen Mausstämmen, wie BALB/c, eine erhöhte Resistenz gegenüber einer
MCMV-Infektion (Allan & Shellam, 1984). Diese Suszeptibilität für MCMV korreliert mit einer
wirkungsvollen Ly49H-vermittelten NK-Zellantwort im jeweiligen Mausstamm. Verantwortlich
dafür ist ein genetischer Unterschied in der cmv-1-Resistenzregion, dessen dominantes
cmv-1r-Allel in den resistenten Mausstämmen für den Ly49H-NK-Zellrezeptor kodiert (Abb.
3.6). Ly49H erkennt das m157-Genprodukt von MCMV direkt auf der Oberfläche infizierter
Zellen und induziert folglich die Apoptose der Zelle (Scalzo, 2002; Smith et al., 2002).
Einleitung
Abb. 3.6: NK-Zellabhängige Suszeptibilität von
MCMV
(modifiziert nach Krmpotić et al., 2003).
Die natürliche Resistenz gegen Wildtyp MCMV
beruht auf dem Vorhandensein des aktivierenden
NK-Zellrezeptors
Ly49H.
(A)
Im
C57BL/6-
Mausstamm bindet Ly49H an das MCMV-m157Genprodukt
und
induziert
somit
die
NK-
Zellantwort, die zur Perforinausschüttung und
darauffolgener Eliminierung der MCMV-infizierten
Wirtszelle führt.
(B) Das Fehlen des Ly49H-Rezeptors in BALB/cMäusen verhindert die NK-Zellaktivierung und
beeinträchtigt somit die Viruskontrolle in vivo.
Im Menschen gibt es nur wenige Hinweise auf die mögliche Funktion von NK-Zellen während
einer
HCMV-Infektion.
In
den
seltenen
Fällen
einer
Erkrankung
mit
einem
zugrundeliegenden NK-Zelldefekt kommt es jedoch zu ungewöhnlich schweren HCMVInfektionen und -Verläufen (Biron et al., 1989; Gazit et al., 2004).
Eine weitere Zellpopulation von enormer Bedeutung sind die T-Lymphozyten. In einem
adoptiven Transferexperiment in suszeptiblen BALB/c-Mäusen wurde festgestellt, dass TLymphozyten die Virusreplikation kontrollieren sowie die pathologischen Folgen einer
Infektion verhindern können (Reddehase et al., 1985). Der schützende Effekt wird durch
zytotoxische CD8+T-Zellen (CTLs) der adaptiven Immunantwort vermittelt. Durch die
Erkennung des MHC-I-gebundenen viralen Peptids durch den T-Zellrezeptor wird die CTL
aktiviert und tötet aktiv die betreffende infizierte Zelle. Die dominanten MCMV-Epitope, die
von einem Großteil von CTLs erkannt werden, sind die der viralen IE-Proteine, v.a. das pp89
(Reddehase & Koszinowski, 1984; Koszinowski et al., 1987; Del Val et al., 1988). Bei HCMV
scheinen die Matrixproteine, insbesondere das Matrixphosphoprotein pp65, als Hauptepitope
für CTLs zu fungieren (McLaughlin-Taylor et al., 1994). Ein anderes Bild ergibt sich
allerdings, wenn die CD8+T-Zellen im Mausmodell in vivo durch Depletion oder durch
genetische CD8-Deletion entfernt werden. Offenbar sind in diesem Fall die verbleibenden
Zellen in der Lage, die CMV-Infektion zu kontrollieren (Jonjić et al., 1990). Weitere
Untersuchungen zeigten, dass die MHC-II-abhängigen CD4+Helfer-T-Zellen u.a. dafür
verantwortlich sind, Zytokine zu produzieren, die wiederum Antikörper-produzierende BZellen aktivieren. Sie sind ebenfalls notwendig, um die CMV-Beseitigung durch CTLs zu
initiieren und aufrechtzuerhalten (Jonjić et al., 1990; Gamadia et al., 2003; Ludwig et al.,
2006). Darüber hinaus scheint in den Speicheldrüsen des murinen Systems die Kontrolle des
MCMV von CD4+T-Zellen und IFN-γ abhängig zu sein (Jonjić et al., 1989). Trotzdem sind
15
16
Einleitung
CD4+Helfer-T-Zellen nicht in der Lage, eine fehlende CD8+CTL-Funktion, wie im murinen
Transplantationsmodell gezeigt, zu kompensieren (Podlech et al., 1998). Basierend auf den
Studien am Mausmodellsystem wird deshalb versucht, in der Klinik bei immunsupprimierten
Personen im Zustand nach Knochenmarks- oder Stammzelltransplantation (SCT) einen
adoptiven Transfer von HCMV-spezifischen CD8+T-Zellen bzw. T-Zellklonen als präventive
Zytotherapie durchzuführen (Riddell et al., 1992; Walter et al., 1995; Kapp et al., 2007).
Weiterhin schreiben neuere Arbeiten auch einer Untergruppe von T-Lymphozyten, den γδ-TZellen, eine antivirale Funktion infolge einer CMV-Infektion oder -Reaktivierung zu (Knight et
al., 2010; Fornara et al., 2011).
3.5.2 Humorale Immunantwort
Die humorale Immunantwort stellt eine zweite Ebene des adaptiven Immunsystems zum
Schutz vor HCMV dar. Während die zelluläre Immunabwehr offensichtlich für die Kontrolle
einer HCMV-Infektion verantwortlich ist, scheint das humorale Immunsystem eine wichtige
Rolle bei Sekundärinfektionen sowie bei der Begrenzung der Schwere der Erkrankung zu
spielen (Snydman, 1990; Fowler et al., 1992; Boppana & Britt, 1995). Zusätzlich konnte im
Mausmodell gezeigt werden, dass Antikörper vor einer tödlichen CMV-Infektionsdosis
schützen und die Virusausbreitung begrenzen können (Rapp et al., 1992; Jonjić et al., 1994;
Klenovsek et al., 2007). Die Antikörperantwort scheint gegen eine Reihe von Struktur- und
Nicht-Strukturproteine gerichtet zu sein (Landini et al., 1985; Landini & La Placa, 1991).
Dabei wurden die Phosphoproteine, insbesondere das Phosphoprotein pp150, als starkes
Immunogen für die humorale Immunantwort gegen HCMV identifiziert (Jahn et al., 1987;
Landini & La Placa, 1991; Kropff et al., 1993). Antikörper gegen diese Antigene sind jedoch
nicht neutralisierend und dürften somit nur wenig zur Kontrolle der systemischen
Virusdissemination beitragen (Spaete et al., 1994). Als Zielstrukturen für neutralisierende
Antikörper konnten v.a. virale Hüllproteine wie das Glykoprotein B (gB), der gH/gLProteinkomplex (Britt et al., 1990; Urban et al., 1996; Britt & Mach, 1996) sowie der
Glykoproteinkomplex gM/gN (Shimamura et al., 2006) oder gN allein (Pati et al., 2012)
charakterisiert werden. Der Großteil neutralisierender Antikörper ist gegen gB gerichtet
(Gönczöl et al., 1991; Marshall et al., 1992). Ein hohes Neutralisationspotential wird dem gHPentamer-Komplex (gH/gL/UL128-131) zugeschrieben (Lilleri et al., 2012). Der PentamerKomplex wird für die HCMV-Infektion von endothelialen und epithelialen Zellen benötigt. Die
Neutralisationskapazität der gegen den Pentamerkomplex gerichteten Antikörper ist
hundertfach höher auf Endothel- und Epithelzellen als auf Fibroblasten (Gerna et al., 2008).
Die Bedeutung neutralisierender Antikörper wurde schon früher in einer Studie mit
pädiatrischen Patienten gezeigt. Sie stellte heraus, dass vorhandene neutralisierende
Antikörper das Ausmaß HCMV-bedingter klinischer Manifestationen deutlich verringerte
Einleitung
(Yeager et al., 1981). Bei immundefizienten Patienten wird die Rolle von neutralisierenden
HCMV-spezifischen Antikörpern zum Teil immer noch kontrovers diskutiert (Sokos et al.,
2002; Bonaros et al., 2008). Klenovsek et al. (2007) zeigten später im murinen System, dass
der
adoptive
Transfer
von
MCMV-spezifischen
CD19+
Gedächtnis-B-Zellen
in
immundefiziente Mäuse einen Schutz vor einer letalen MCMV-Infektion vermitteln kann. Der
Schutz korrelierte mit dem virusspezifischen Antikörpertiter, und die Therapie mit MCMVspezifischem Serum schützte vor einer Primärinfektion (Abb. 3.7). Die Infektion mit einer
MCMV-m157-Deletionsmutante (MCMV∆m157luc) schloss in diesen Versuchen einen
Ly49H-vermittelten Schutz durch NK-Zellen aus (Abb. 3.6). Die Hilfe von T-Zellen ist für die
Reaktivierung von Gedächtnis-B-Zellen und somit zur spezifischen Antikörperantwort
ebenfalls nicht notwendig (Hebeis et al., 2004; Klenovsek et al., 2007).
Abb. 3.7: Therapeutische Gabe von Serum in MCMV-infizierten Mäusen
-/-
5
Immundefiziente RAG1 -Mäuse wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert. Drei Tage nach Infektion (p.i.)
wurden die Tiere mit naivem bzw. immunem MCMV-spezifischem Serum (250µl pro Rezipient) intraperitoneal
(i.p.) behandelt. Der Infektionsverlauf wurde mit Hilfe von in vivo Biolumineszenz-Analysen überprüft und
dokumentiert. Die in vivo-Imaging-Bilder stellen die relativen Intensitäten des transmittierten Lichts in
Falschfarben dar und sind über die entsprechenden Hellfeldaufnahmen gelegt. Die Falschfarbenskala zeigt die
Korrelation zwischen relativem Photonenflux jeder Mausaufnahme und Viruslast (Abb. entnommen aus
Klenovsek et al., 2007).
3.5.3 Immunevasion durch CMV
Mit Hilfe verschiedener immunevasiver Mechanismen schafft es CMV, die Eliminierung aus
dem Wirt durch das Immunsystem zu umgehen.
Die Aktivierung zytotoxischer CD8+T-Zellen wird sowohl im humanen als auch im murinen
System durch die Interferenz von viralen Regulatoren mit der Antigenpräsentation über die
MHC-I-Moleküle beeinflusst. MCMV besitzt drei Genprodukte, m04, m06 und m152, die die
Funktion von MHC-I negativ beeinflussen können (Hengel et al., 1999). Zudem kann CMV
auch die NK-Zellantwort im Wirt modulieren. In der Maus ist das Glykoprotein gp40
(Genprodukt von m152) für die Herunterregulierung von CMV-spezifischen NK-Zellliganden
für den aktivierenden NK-Zellrezeptor NKG2D verantwortlich (Krmpotić et al., 2002). In den
MCMV-suszeptiblen Mausstämmen kann somit keine effektive NK-Zellabwehr aufgebaut
17
18
Einleitung
werden. Für HCMV sind ebenfalls ähnliche Evasionsmechanismen beschrieben worden
(Prod´homme et al., 2010; Jackson et al., 2011).
Neben der Modulation der zellulären Immunantwort werden auch Komponenten des
humoralen Systems beeinflusst. HCMV induziert die Expression von viralen Fcγ-Rezeptoren
auf unterschiedlichen Zelltypen (Xu-Bin et al., 1989; Atalay et al., 2002), die sich jedoch von
den zellulären FcγR unterscheiden (MacCormac & Grundy, 1996). In MCMV-infizierten
Zellen wird ebenfalls ein viraler FcγR, das Genprodukt von m138 (fcr-1), exprimiert, der eine
starke Bindung zum Fc-Fragment von murinem IgG aufbaut (Thäle et al., 1994). Vermutlich
versucht das Virus, auf diese Weise der Antikörperantwort des Wirtes zu entkommen, indem
es die Immunglobuline über die viralen Fc-Rezeptoren abfängt. Jedoch zeigte die Arbeit mit
einer m138-MCMV-Deletionsmutante zwar einen attenuierten Phänotyp in vivo auf, konnte
aber
in
einem
Antikörper-defizienten
Mausmodell
nicht
auf
die
Funktion
von
Immunglobulinen zurückgeführt werden (Crnković-Mertens et al., 1998). Des Weiteren
werden sowohl für HCMV als auch MCMV Mechanismen beschrieben, die dazu beitragen,
die Virusbeseitigung durch das Komplementsystem zu vermeiden (Spiller et al., 1996;
Nomura et al., 2002).
3.6 Klinische Relevanz von HCMV und Therapie
Die Primärinfektion bei gesunden und immunkompetenten Menschen verläuft in der Regel
asymptomatisch. Nur in seltenen Fällen kann es zum fieberhaften Krankheitsbild einer
Mononukleose kommen. Eine HCMV-Infektion kann jedoch beim Neugeborenen schwere
Erkrankungsbilder hervorrufen. Jedes Jahr werden über 17000 Neuerkrankungen allein in
den USA und Europa gemeldet (Plotkin, 1999). Die sogenannte kongenitale Infektion ergibt
sich meist aus einer HCMV-Infektion der Mutter während der Schwangerschaft, während der
Geburtsphase oder post-natal durch Übertragung über die Muttermilch. Sie führt bei etwa 7
bis 10% der Säuglinge zu einer manifesten Erkrankung mit Ikterus, Hepatosplenomegalie
und Chorioretinitis. Zum Teil kann es auch zu schwersten und bleibenden neurologischen
Störungen kommen wie zur geistigen Retardierung, Schwerhörigkeit bis Gehörverlust und zu
motorischen Defiziten, an deren Folgen etwa 10% der Erkrankten versterben (Nassetta et
al., 2009; Plosa et al., 2012). Für immunsupprimierte Personen (z.B. nach Stammzell-/
Organtransplantation, AIDS) stellt eine HCMV-Infektion oder die Reaktivierung einer
bestehenden HCMV-Infektion eine der größten Komplikationen dar. Die HCMV-Erkrankung
ruft dann meist eine schwere Symptomatik wie Hepatitis, Gastroenteritis, Enzephalitis,
Myokarditis, etc. hervor (Ljungman et al., 2010; Boeckh & Geballe, 2011). Bei AIDSPatienten wird sehr häufig Retinitis beobachtet. Die schwerste Form der HCMV-Erkrankung
betrifft die interstitielle Pneumonie, die unbehandelt mit einer 70%igen Letalitätsrate
Einleitung
verbunden ist (Reusser, 1991; Ljungman et al., 2010). Im Falle einer Organtransplantation
besteht das höchste Risiko einer HCMV-assoziierten Erkrankung, wenn der Spender
seropositiv für HCMV ist (D+), der Rezipient dagegen negativ (R-) ist (Cope et al, 1997; Sia
et
al.,
2000).
Unter
immunsupprimierenden
Bedingungen
startet
die
produktive
Virusreplikation im transplantierten infizierten Organ und kann sich systemisch über das
ganze Organsystem ausbreiten (Tolkoff-Rubin & Rubin, 1994). Bei der allogenen StammzellTransplantation verläuft die Virustransmission über die Blutprodukte eines seropositiven
Donors. Zur Verminderung des Infektionsrisikos wird versucht, seronegative Spender zu
finden, oder die zu transplantierenden Blutprodukte werden von den potentiellen zellulären
HCMV-Überträgern, den Leukozyten, mittels gezielter Depletion befreit (Bowden et al.,
1995). Bei seropositiven Stammzell-Rezipienten werden HCMV-Erkrankungen v.a. auf die
Reaktivierung des latenten Virus zurückgeführt (Ghandi et al., 2003).
Derzeit werden zur Prävention einer Infektion bei Risikopatienten oder für die Behandlung
einer manifesten Erkrankung Chemotherapeutika wie Ganciclovir bzw. Valganciclovir,
Cidofovir, Foscarnet oder Maribavir eingesetzt, die jedoch stark myelo- und nephrotoxische
Nebenwirkungen hervorrufen können (Prichard & Kern, 2011). Zudem kann eine längere
Exposition mit den antiviralen Substanzen zur Resistenzentwicklung der Viren führen, was
eine weitere Behandlung erschwert (Scott et al., 2007). Die Kontrolle einer HCMV-Infektion
über einen längeren Zeitraum kann allerdings nur mit Hilfe einer funktionierenden
Immunantwort gewährleistet werden. Deshalb wird vermehrt daran gearbeitet, die
immunologischen Effektorfunktionen der zellulären Immunantwort als Therapieansatz v.a.
bei Transplantationspatienten zu nutzen (Moss & Rickinson, 2005; Kapp et al., 2007).
Speziell der adoptive Transfer von polyklonalen, antigenspezifischen CD4+ und CD8+TZellen zeigte ein vermindertes Vorkommen einer HCMV-Reaktivierung nach einer
Stammzelltransplantation
(Peggs
et
al.,
2003).
Die
Wirksamkeit
von
intravenös
applizierbaren Immunglobulinen (IVIG) ist dagegen immer noch umstritten (Guglielmo et al.,
1994; Ljungman P. et al., 1998). Eine effektive Impfung steht bisher nicht zur Verfügung,
obwohl intensiv an der Entwicklung von Vakzinierungsstrategien gegen HCMV gearbeitet
wird (Wloch et al., 2008; Bernstein et al., 2009; Pass et al., 2009; Griffiths et al., 2011;
Hartikka et al., 2012). Die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCMV wurde vom
medizinischen Institut der nationalen Akademie für Wissenschaft in den USA sogar als
höchste Priorität eingestuft (Stratton et al., 2001).
19
20
Ziel der Arbeit
4 Ziel der Arbeit
Die Ergebnisse der Vorarbeit von Klenovsek et al. (2007) haben im Mausmodell klar gezeigt,
dass MCMV-spezifische Gedächtnis-B-Zellen (GBZ) zum Schutz vor einer disseminierten
und progressiven MCMV-Infektion in der Maus beitragen. Die protektive Wirkung lässt sich
auf die Antikörper-vermittelte Immunantwort zurückführen. Bisher ist jedoch noch unklar,
welche Antigen-Spezifität die schützenden Antikörper gegen das Virus besitzen und über
welche Effektormechanismen der Schutz gewährleistet wird.
Antikörper können Viren auf verschiedenen Wegen bekämpfen. Neben der direkten
Neutralisation freier Viruspartikel und der Komplement-abhängigen Lyse sind auch FcRezeptor-vermittelte Mechanismen möglich. Hierbei können infizierte Zellen oder AntigenAntikörper-Komplexe von Effektorzellen direkt lysiert oder phagozytiert werden. Die
vorangegangenen Experimente von Klenovsek und Kollegen (2007) haben bereits gezeigt,
dass die Neutralisationskapazität der protektiven MCMV-spezifischen Antikörper mit dem in
vivo-Schutz nur bedingt korreliert. So soll in der vorliegenden Arbeit die Rolle der FcRezeptor-vermittelten Effektormechanismen protektiver Antikörper genauer untersucht
werden. Dieses Effektorsystem basiert nicht nur auf Antikörpern, die die Strukturproteine der
Virushüllmembran erkennen, sondern inbegriffen sind auch Antikörper gegen virale NichtStrukturproteine, die auf der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Diese
Antikörper sind nicht fähig, freie Viruspartikel zu neutralisieren. Da in der Literatur bisher
wenig über die Antikörperspezifitäten bekannt ist, sollen diese ebenfalls genauer analysiert
werden. Hierzu sollen die viralen Antigene identifiziert werden, die eine spezifische
Antikörperantwort induzieren können. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Immunogenität
viraler Antigene und über die Effektorfunktionen antigenspezifischer Antikörper könnten in
Zukunft dazu beitragen, die Therapieansätze mit Immunglobulinen oder die VakzineEntwicklung gegen HCMV in der Klinik zu verbessern.
Material
5 Material
5.1 Reagenzien, Kits, Plastik- und Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien und Glaswaren
Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Plastik- und Verbrauchsmaterialien sowie
Glaswaren von den Firmen A. Hartenstein GmbH (Würzburg/Versbach), Becton, Dickinson
und Co. (BD, Heidelberg), Carl Roth GmbH & Co.KG (Karlsruhe), Corning Incorporated
(Corning, NY, USA), Eppendorf AG (Hamburg), Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen),
Karl Hecht KG (Sondheim), Knittel Glasbearbeitungs-GmbH (Braunschweig), Millipore GmbH
(Schwalbach),
Miltenyi
Biotec
(Bergisch-Gladbach),
Nunc
(Wiesbaden),
Peqlab
Biotechnologie GmbH (Erlangen), Ratiolab GmbH (Dreieich), Sarstedt AG & CO.
(Nümbrecht), Schott DURAN (Mainz), Thermo Fisher Scientific (Bonn) und VWR
International GmbH (Darmstadt) verwendet.
Chemikalien und Reagenzien
Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden, soweit nicht anders
vermerkt, von folgenden Firmen bezogen: Becton, Dickinson und Co. (BD, Heidelberg), Carl
Roth GmbH & Co.KG (Karlsruhe), Invitrogen (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Promega
(Mannheim), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Sigma-Aldrich Chemie GmbH
(Steinheim), SERVA Electrophoresis GmbH (Heidelberg), Thermo Fisher Scientific (Bonn).
Als DNA-Standard diente der GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Fermentas GmbH, St.LeonRot).
Reagenz
Ampicillin
BD FACS™ Lysing Solution (1:10 in H2O)
Cedarlane Lympholyte-M Cell Separation
Media (Ficoll)
Glo Lysis Buffer
D-Luziferin
Lipofectamin 2000
Liquemin N 2500 (Heparin-Natrium)
Vectashield® Mounting Medium mit DAPI
Hersteller
Gerbo Biotechnik GmbH, Gaiberg
Becton, Dickinson und Co, Heidelberg
CEDARLANE Laboratories USA Inc., USA
Promega, Mannheim
P.J.K., Kleinblittersdorf
Invitrogen, Karlsruhe
Roche, Mannheim
Vector Laboratories, Inc., USA
21
22
Material
Kits
Kit
BigDyeR Terminator v3.1 CycleSequencing
Kit
Hersteller
Applied Biosystems, Inc., USA
ExpandTM High Fidelity PCR System
dNTPack
DNeasy Blood& Tissue Kit
DreamTaqTM DNA Polymerase Kit
PureLinkTM PCR Purification Kit
PureLinkTM Plasmid Mini/Midi/Maxiprep Kit
QIAquickR Gel Extraction Kit
Micro BCATM Protein Assay
Mouse Immunoglobulin Isotype Panel
Roche, Mannheim
Qiagen, Hilden
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Qiagen, Hilden
Pierce, Rockford, USA
Southern Biotech, Birmingham, USA
5.2 Medien
Alle Mengenangaben beziehen sich auf ein Endvolumen von einem Liter.
5.2.1 Medien für Bakterien-Kulturen
LB-Medium
pH 7,2 mit NaOH
10 g Bacto Trypton
5 g Bacto Yeast Extract
5 g NaCl
ggf. Zugabe von:
100mg Ampicillin
LB-Agar
15g Bacto Agar in LB-Medium
SOC-Medium
20g Bacto Trypton
5g Bacto Hefeextrakt
2,5mM NaCl
10mM MgCl2
10mM MgSO4
20mM Glukose
5.2.2 Medien für die Zellkultur
Die angegebenen Fertigmedien wurden von der Firma Gibco BRL (Glasgow, Schottland)
verwendet. Die Zusätze Glutamin und Gentamycin bzw. Penicillin/Streptomycin wurden von
Fluka (Buchs, Schweiz) bezogen. Die Anzucht aller Zellen erfolgte unter Zugabe von fetalem
Kälberserum (FKS) der Firma PAN™ Biotech (Aidenbach).
Material
RPMI-1640-Kulturmedium für ST-2-Zellen, M2-Zellen, MEFs
350 mg Glutamin
100mg Gentamycin
10% FKS
RPMI-1640-Kulturmedium für mIEND-1-Zellen
350 mg Glutamin
100mg Penicillin/Streptomycin
1% HEPES pH 7,3
0,5% 50mM ß-Mercaptoethanol
5% FKS
DMEM-Kulturmedium für Cos7-Zellen
350 mg Glutamin
100mg Gentamycin
10% FKS
DMEM-Transfektionsmedium
350 mg Glutamin
5.2.3 Puffer und Lösungen
Alle Puffer, Lösungen und Verdünnungen wurden insofern nicht anders angegeben, da sie
ausschließlich mit destilliertem Wasser angesetzt wurden. Prozentuale Angaben bestimmter
Zusätze verstehen sich als Volumenprozent.
1x PBSo (phosphate buffered saline)
pH 7,3
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
4,3 mM Na2HPO4
1,4 mM KH2PO4
ERB A (Endotoxin Removal Buffer A)
pH 7.0 mit NaOH
50mM MOPS
750mM NaCl
10% (w/v) Triton X 100
20% (v/v) Isopropanol
ERB B (Endotoxin Removal Buffer B)
pH 5.0 mit Essigsäure
100 mM Na-Acetat
750 mM NaCl
1% (w/v) Triton X 100
Standard- Waschpuffer (ELISA, Immunfluoreszenz, Western Blot)
PBSo
0,1% Tween20
23
24
Material
1x TBE- Puffer (Agarosegel-Elektrophorese)
90 mM Tris
90 mM Borsäure
2,5 mM EDTA
VSP (Virusstandardpuffer):
pH 7,8
1 M Tris
1 M KCl
0,1 M EDTA
1x LAP (Luziferase Assay Puffer):
15 mM KH2PO4, pH 7,8
25 mM Diglycin (Gly-Gly)
15 mM MgSO4
4 mM EGTA
kurz vor Gebrauch frisch zugeben:
5 mM ATP
1 mM DTT
1x LS (Luziferin Lösung)
25 mM Diglycin (Gly-Gly)
15 mM MgSO4
4 mM EGTA
kurz vor Gebrauch frisch zugegeben:
0,05 mM D-Luziferin
2 mM DTT
Luziferinlösung für in vivo Applikation
20% PBSo/ 0,5M NaOH pH 8,5
80% PBSo/ 0,5M NaHCO3 pH 8,0
FACS/MACS-Puffer
pH 7,4
1x PBSo
2% FKS
2 mM EDTA
Erythrozyten-Lysepuffer
155 mM NH4Cl
10 mM KHCO3
1 mM EDTA
ELISA- Kopplungspuffer
pH 9,6
15 mM NaCO3
35 mM NaHCO3
10x T4-Puffer
pH 7,4
330 mM Tris-Acetat
600 mM Kaliumacetat
100 mM MgCl2
5 mM DTT
3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidin (TMB)- Substrat-Lösung (für ELISA)
1:1 Mischung von TMB-Peroxidase Substrate und Peroxidase Substrate Solution B (KPL
Inc., Gaithersburg, USA)
Material
5.3 Biologisches Material
5.3.1 Versuchstiere
Alle verwendeten Versuchstiere wurden im Biologisch Technischen Entwicklungsgebäude
(BTE, Erlangen) in IVC-Käfigen (isolated ventilated cages) unter SPF-Bedingungen (specific
pathogen free) vermehrt und gehalten. Für die Versuche wurden sowohl männliche als auch
weibliche Tiere mit einem Mindestalter von 8 Wochen eingesetzt. Es wurde ausschließlich
mit dem C57BL/6-Mausstamm gearbeitet. Tiere in laufenden Experimenten wurden
entsprechend § 17 TierSchG euthanasiert.
Rag1-/--Mäuse (Mombaerts et al., 1992) wurden von Irmgard Förster (Universität München)
erhalten. Fcγ-/-- (Takai et al., 1994), FcγRI-/--, FcγRIII-/-- (Hazenbos et al., 1996), FcγRIV-/-sowie FcγRI+IV-/--Mäuse wurden von Prof. Dr. F. Nimmerjahn (Lehrstuhl für Genetik,
Department für Biologie, Universität Erlangen-Nürnberg) erhalten und auf Rag1-/--Mäuse
gekreuzt. Genotypisierungen erfolgten mittels durchflusszytometrischer Analysen oder
mittels
PCR.
Für
die
PCR
wurde
das
zu
genotypisierende
DNA-Material
aus
Schwanzbiopsien oder Ohrstanzen mit Hilfe des DNeasy Blood& Tissue Kit (Quiagen,
Hilden) isoliert.
5.3.2 Zellen
Eukaryote Zellen
Zellen
Beschreibung
Herkunft
Referenz
MEF
(Mouse Embryonic
Fibroblasts)
ST-2
Embryonale Fibroblasten
Murine Embryos
Murine Stromazellen
BC8, Knochenmark
Isoliert von J.
Horlitz, BTE
Erlangen
Ogawa et al.
(1988)
Cos7
Nierengewebszellen,
transformiert mit SV40
Grüne Meerkatze
Gluzman (1981)
mIEND
Murine Endothelzellen
M2-10B4
Murine Fibroblasten
Mesenteriale
Lymphknoten der
Maus
Stroma,
Knochenmark
Erhalten von
Prof. Bogdan,
Erlangen
Erhalten von
Dr. L. Dölken,
Cambridge
Prokaryote Zellen
E.coli
DH10B
Eigenschaft
F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC),
Φ80dlacZ∆M15, ∆lacX74, deoR,
recA1, endA1, araD139,
∆(ara,leu)7697, galU, galKλ-rpsL,
nupG (Life Technologies GmbH)
Firma
Invitrogen, Karlsruhe
25
26
Material
5.3.3 Virus
MCMV∆m157luc: erhalten von Prof. Dr. M. Messerle (Abteilung Virologie, Medizinische
Hochschule Hannover); die Konstruktion ist bei Klenovsek et al., 2007, Blood, als onlinesupported-material beschrieben.
5.3.4 In vivo applizierte Agenzien
Agens
ClodronatLiposomen
Cobra venom
Faktor
Hersteller
Dr. N. van Rooijen
(Department of
Molecular Cell Biology,
Amsterdam)
TECOmedical GmbH,
Buende Westfalen
Applizierte Menge
pro
Maus
75-100µl
Applikation
Alle 3 Tage i.p.
8 Units
Alle 4 Tage i.p.
i.p.= intraperitoneal
5.4 Nukleinsäuren
5.4.1 Vektorsysteme und Plasmide
Vorhandene Vektoren
Vektor
pcDNA3.1.
pcDNA3.1-HAMHB
pcUL132-sigHA
Beschreibung
Expressionsvektor für die heterologe Expression von Proteinen
unter der Kontrolle eines CMV-Promotors in eukaryoten Zellen;
enthält ein Ampicillin-Resistenzgen, eine „Multiple Cloning Site“
(MCS) und eine Polyadenylierungssequenz (Life Technologies
GmbH)
von pcDNA3 abgeleiteter Expressionsvektor, der zusätzlich die
Nukleotidsequenz für Hämagglutinin (HA) enthält (freundlicherweise
erhalten von Prof. Dr. A. Ensser, Klinische Virologie, Uniklinikum
Erlangen)
von pcDNA3 abgeleiteter Expressionsvektor, der zusätzlich die
Nukleotidsequenz für ORF UL132 von HCMV AD169 und für
Hämagglutinin (HA) enthält (Ködel, 2005)
Vorhandene Plasmide
Plasmid
pcDNAtag-m60
pcDNAtag-m73.5
Beschreibung
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für m60 und
für ein myc-Epitop (freundlicherweise erhalten von A.A. Scalzo,
University of Western Australia, Nedlands, Australia).
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für m73.5
und für ein myc-Epitop (freundlicherweise erhalten von A.A. Scalzo,
University of Western Australia, Nedlands, Australia).
Material
Erstellte Plasmide
Plasmid
pcUL132-sigHA m02
pcUL132-sigHA m03
pcUL132-sigHA m04
pcUL132-sigHA m05
pcUL132-sigHA m06
pcUL132-sigHA m07
pcUL132-sigHA m08
pcUL132-sigHA m09
pcUL132-sigHA m10
pcUL132-sigHA m11
pcUL132-sigHA m12
pcDNA3.1.-HAMHB m13
pcUL132-sigHA m14
pcUL132-sigHA m15
pcUL132-sigHA m16
pcUL132-sigHA m17
pcDNA3.1.-HAMHB m42
pcDNA3-m55
pcUL132-sigHA m73
pcUL132-sigHA m74
pcUL132-sigHA m75
pcUL132-sigHA m90
pcDNA3.1.-HAMHB m100
pcDNA3.1.-HAMHB m104
Beschreibung
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m02 AS 64-326; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m03 AS 34-288; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m04 AS 24-266; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m05 AS 30-341; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m06 AS 43-345; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m07 AS 24-314; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m08 AS 25-356; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m09 AS 22-293; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m10 AS 20-291; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m11 AS 29-299; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m12 AS 26-272; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m13 AS 2-133; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m14 AS 20-301 ; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m15 AS 24-326 ; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m16 AS 37-210; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m17 AS 27-400; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m42 AS 2-163; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m55 AS 1-937; Vektor pcDNA3
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m73 AS 50-139 ; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m74 AS 16-438 ; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m75 AS 20-725; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m90 AS 42-318; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m100 AS 2-371; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m104, AS 1-311; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
27
28
Material
pcUL132-sigHA m115
pcUL132-sigHA m116
pcDNA3.1.-HAMHB m119.1
pcUL132-sigHA m121
pcUL132-sigHA m137
pcUL132-sigHA m138
pcUL132-sigHA m144
pcUL132-sigHA m145
pcUL132-sigHA m146
pcDNA3.1.-HAMHB m147
pcUL132-sigHA m150
pcUL132-sigHA m151
pcDNA3.1.-HAMHB m152
pcUL132-sigHA m153
pcUL132-sigHA m154
pcUL132-sigHA m155
pcUL132-sigHA m157
pcUL132-sigHA m158
pcUL132-sigHA m159
pcUL132-sigHA m160
pcUL132-sigHA m161
pcDNA3.1.-HAMHB m162
pcUL132-sigHA m163
pcUL132-sigHA m164
pcUL132-sigHA m165
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m115 AS 22-274; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m116 AS 17-645; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m119.1, AS 1-311; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m121; AS 26-698; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m137, AS 22-334; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m138, AS 18-569; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m144, AS 20-383; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m145, AS 19-487; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m146, AS 29-377; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m147, AS 1-145; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m150, AS 41-388; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m151, AS 20-389; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m152, AS 1-378; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m153, AS 23-405; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m154, AS 24-368; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m155, AS 18-377; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m157, AS 22-329; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m158, AS 22-356; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m159, AS 21-398; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m160, AS 21-308; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m161, AS 24-225; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m162, AS 2-159; Vektor pcDNA3.1.-HAMHB
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m163, AS 29-179; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m164, AS 13-427; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m165, AS 23-322; Vektor pcUL132-sigHA
Material
pcUL132-sigHA m166
pcUL132-sigHA m167
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz für
m166, AS 38-382; Vektor pcUL132-sigHA
Expressionsplasmid mit zusätzlicher Nukleotidsequenz
für m167, AS 40-436; Vektor pcUL132-sigHA
5.4.2 Oligonukleotide
Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net aus Ulm/Donau in
Deutschland synthetisiert (www.biomers.net). Die Sequenzen sind jeweils in 5’
3’ Richtung
angegeben.
Primer für Genotypisierung neu generierter Mäuse
Name des Primers
Sequenz
Orientierung
FcgR1 F1
accatccgttctgctgctgcttgact
foward
amplifziertes Gen/
Genabschnitt
FcγRI
FcgR1 R1
ttgccgaaaatccactctaaatacag
reverse
FcγRI
Fcg Neo C F1
gattcgcagcgcatcgccttctatcg
forward
FcγRI
FcRIII Neo
atagtgctttacggtatcgcc
forward
FcγRIII
Ec1 5’
tccgaaggctgtggtgaaact
reverse
FcγRIII
Ec1 3’
actcccagatctacagggtcg
forward
FcγRIII
FcRIV ko
gagccgagtgactgtgaaatg
forward
FcγRIV
FcRIV wt
ccaaacagcggtcctcct
forward
FcγRIV
FcRIV com
ccttatcaccttgcctccttag
reverse
FcγRIV
Fcγ Neo
ctcgtgctttacggtatcgcc
forward
γ-Kette von FcγRezeptor
gamma1
accctactctactgtcgactcaag
forward
γ-Kette von FcγRezeptor
gamma2
tcacgcctggctatagctgcctt
reverse
γ-Kette von FcγRezeptor
Rag Mutant f
tggatgtggaatgtgtgcgag
forward
Rag1
Rag WT fw
gaggttccgctacgactctg
forward
Rag1
Rag common
ccggacaagtttttcatcgt
reverse
Rag1
29
30
Material
Primer für Klonierung der MCMV-Glykoproteine
Name des
Primers
Sequenz
Orientierung
m02 fw
tattgaattcgcgccgctgccggggtac
forward
amplifziertes
Gen/
Genabschnitt
m02 – ab
m02 rev
gacgtctagatcaaccgtctcgagcgtag
reverse
Signalschnittstelle
m03 fw
gccagaattccaagaatgtcccaattac
forward
m03 – ab
m03 rev
gacgtctagatcagagcggctgacgatc
reverse
Signalschnittstelle
m04 fw
gccagaattccgtaatgacaatgaatg
forward
m04 – ab
m04 rev
gacgtctagattagttactcttaagcgg
reverse
Signalschnittstelle
m05 fw
gccagaattcgattcatcgcacagatc
forward
m05 – ab
m05 rev
gacgtctagattagtctaagatctcgatg
reverse
Signalschnittstelle
m06 fw
gccagaattcctaataccaataatacc
forward
m06 – ab
m06 rev
gacgtctagattatttggtaagcaagg
reverse
Signalschnittstelle
m07 fw
gccagaattcgtggaatctaaggctaac
forward
m07 – ab
m07 rev
gacgtctagattacatactcaccgcag
reverse
Signalschnittstelle
m08 fw
gccagaattcatgatctgcgatacgaatg
forward
m08 – ab
m08 rev
gacgtctagattaagacgcaggagagg
reverse
Signalschnittstelle
m09 fw
gccagaattcaaatcgctgatcacttc
forward
m09 – ab
m09 rev
gacgtctagattaagacgcacgagatg
reverse
Signalschnittstelle
m10 fw
acttgatatccgccccacttagtgatc
forward
m10 – ab
m10 rev
gacctctagatcacaacacactggttg
reverse
Signalschnittstelle
m11 fw
tattgaattcgcgcgtgctccagctcc
forward
m11 – ab
m11 rev
gacgtctagattatgcagcactggttg
reverse
Signalschnittstelle
m12 fw
gccagaattcgaagacattatacgcgccgaaatg
forward
m12 – ab
m12 rev
gacgtctagatcatttgaagcggtcgaaac
reverse
Signalschnittstelle
m13 fw
aaagggatcccggacgatgtctttgtcgaag
forward
m13 – nach
m13 rev
tattggtaccctagcggttgcggattgcgg
reverse
Startkodon
m14 fw
cggagaattcacagagacagagtgtg
forward
m14 – ab
m14 rev
cctttctagattatgacgaatgctgac
reverse
Signalschnittstelle
m15 fw
gtcgatatccgacgaactgccaaagccc
forward
m15 – ab
m15 rev
ccggtctagattagatgaatatatagatcc
reverse
Signalschnittstelle
m16 fw
ggtcgaattcgcgaaatgtagagaatacgac
forward
m16 – ab
m16 rev
gacgtctagattatgataaaagtattgcgtataag
reverse
Signalschnittstelle
m17 fw
actcgaattccagaactgcggcgtcag
forward
m17 – ab
m17 rev
aaacctcgagtcagacttggggcagacgctg
reverse
Signalschnittstelle
Material
m42 fw
atatggatccacttcttccgaaccgg
forward
m42 – nach
m42 rev
atatggtaccctaatcgtctccgccacc
reverse
Startkodon
m55 fw
gattgcggccgccggcgagtacaccaggtac
forward
m55
m55 rev
gattgcggccgctcagtactcgaaatcgg
reverse
m73 fw
gattgaattctcctcgtcgtcgccttc
forward
m73 – ab
m73 rev
atcttctagatcaatatcctttagccgtg
reverse
Signalschnittstelle
m74 fw
gattgaattcgcgaaagtgaacagctc
forward
m74 – ab
m74 rev
gattgcggccgctcagacacggctaaagg
reverse
Signalschnittstelle
m75 fw
gattgcggccgccggctggggccgaggcac
forward
m75 – ab
m75 rev
gattgcggccgcttatcttttttgccggcac
reverse
Signalschnittstelle
m90 fw
aattgaattcggcacggcggacttatatac
forward
m90 – ab
m90 rev
ggcctctagatcagtctttgtacatg
reverse
Signalschnittstelle
m100 fw
atatggatccctctcactatttgacccgcc
forward
m100 – nach
m100 rev
atatggtacctcactctgcgtcgcttcgcagg
reverse
Startkodon
m104 fw
ctaaggtacctggcggaaccagtccttg
forward
m104 – nach
m104 rs
gtgtggtaccctaaccattaaggtgctgg
reverse
Startkondon
m115 fw
gattgaattccaggagtcgccggtcgcc
forward
m115 – ab
m115 rev
atcttctagatcacggtctctttcgttg
reverse
Signalschnittstelle
m116 fw
ttgggaattcgtatacataacaccgg
forward
m116 – ab
m116 rev
ccttggtacctcatatgaagtctgcggg
reverse
Signalschnittstelle
m119.1 fw
gggggaattcatggtttattctctgcttc
forward
m119.1
m119.1 rev
tcagtctagatcagagtcgcacgacag
reverse
m121 fw
tgaagatatccggcagagagtgccgctc
forward
m121 – ab
m121 rev
aacgtctagatcagtagacagaacgcgtc
reverse
Signalschnittstelle
m137 fw
atatgaattcctgatagccccggggggg
forward
m137 – ab
m137 rev
gccgtctagatcacagttcttgtaaatc
reverse
Signalschnittstelle
m138 fw
ggggatatccgcatcaattacctgcgtg
forward
m138 – ab
m138 rev
ttgaaaaagcggccgcttacgtgtgacgtac
reverse
Signalschnittstelle
m144 fw
attagaattccgccacgggacagagg
forward
m144 – ab
m144 rev
aatttctagatcaaatgctgggatccggg
reverse
Signalschnittstelle
m145 fw
tagtgaattcagctacgatcaacgtacc
forward
m145 – ab
m145 rev
tcagtctagatcacgcctctatcgtc
reverse
Signalschnittstelle
m146fw
atatgaattccaggatgtctctttcgtcgtacgcagcag
forward
m146 – ab
m146 rev
agcgtctagattacacgcacacgcaag
reverse
Signalschnittstelle
m147 fw
aaaggatccatgtttgctaatctatatg
forward
m147
m147 rev
cccggtaccttattcatcgtcgggac
reverse
31
32
Material
m150 fw
ataagaattcgtcgcgttagtcttc
forward
m150 – ab
m150 rev
taattctagatcacacgtccgtgctcgac
reverse
Signalschnittstelle
m151 fw
aacagatatccgtctgtgtgtgagtcgccgg
forward
m151 – ab
m151 rev
ctcgtctagattatcgaaagctgagctcgctg
reverse
Signalschnittstelle
m152 fw
aaaggatccatgctgggcgctatcac
forward
m152
m152 rev
aaaggtacctcaccacacgcggcagttg
reverse
m153 fw
aaaagaattcgaggtcgtgcggcccgaag
forward
m153 – ab
m153 rev
tgaactcgagtcacaccacattctcc
reverse
Signalschnittstelle
m154 fw
ccccgaattcttgggtcgtttagag
forward
m154 – ab
m154 rev
cccctctagatcacacataagactcgtc
reverse
Signalschnittstelle
m155 fw
tgatgcggccgccgtacatcgatttacaag
forward
m155 – ab
m155 rev
tctctagatcatttgtagacgggcgg
reverse
Signalschnittstelle
m157 fw
ttaagatatccgattttcaatcctgatcc
forward
m157 – ab
m157 rev
agagctcgagtcaaacgaccagacgcataaatac
reverse
Signalschnittstelle
m158 fw
ccccgatatccggaattcattctcagcaaac
forward
m158 – ab
m158 rev
ccctctagatcagattctcctgcgtttc
reverse
Signalschnittstelle
m159 fw
ccccgaattccaggagtgtctatacatg
forward
m159 – ab
m159 rev
cctctagatcagagatcagagcac
reverse
Signalschnittstelle
m160 fw
ctgagaattcgactaccaagttcatc
forward
m160 – ab
m160 rev
ccgttctagattagcgtgttattagg
reverse
Signalschnittstelle
m161 fw
cagtgaattcagacacgtctgttccc
forward
m161 – ab
m161 rev
ggggtctagattaatttgtatcaggtatc
reverse
Signalschnittstelle
m162 fw
cgggggatcctatctctataataacacc
forward
m162 nach
m162 rev
attgggatccctactcgttagattcc
reverse
Startkodon
m163 fw
attagaattcagtgtatcgggaacgcc
forward
m163 – ab
m163 rev
cctttctagattatacccggttataggg
reverse
Signalschnittstelle
m164 fw
tatagaattcgctaccgtctccctggcagg
forward
m164 – ab
m164 rev
cctttctagatcatgacgaacgtcc
reverse
Signalschnittstelle
m165 fw
gcggcgaattcggacggccatccgtcctg
forward
m165 – ab
m165 rev
ccggtctagatcatgcagttatctgag
reverse
Signalschnittstelle
m166 fw
tggagaattcgcgctcgtagactgtagcaaac
forward
m166 – ab
m166 rev
aatttctagatcacgccgtctcctcgttc
reverse
Signalschnittstelle
m167 fw
aggagaattcgattggagcgtcgatagcgttc
forward
m167 – ab
m167 rev
tctttctagatcaatggcgactgttgcgg
reverse
Signalschnittstelle
Material
Sequenzierprimer
Name des
Primers
pcDNA s
Sequenz
Orientierung
taatacgactcactataggg
forward
pcDNA as
tagaaggcacagtcgagg
reverse
HA-Linker
Bam
m37 fw2
gatcctatccttatgacgtccctgactacgcgg
forward
acagccctccatcatcgtcgg
forward
amplifziertes Gen/
Genabschnitt
ab bp 864 (im
pcUL132-sigHAVektor)
ab bp 1124 (im
pcUL132-sigHAVektor)
ab 982 (im pcUL132sigHA-Vektor)
ab bp 303
m104 fw2
ggagcccacgatcctcgagg
forward
ab bp 801
m104 fw3
gacctgcagaccctgg
forward
ab bp 1378
m116 fw2
atgaaccatcatcatcatc
forward
ab bp 701
m121 fw2
ctgaggagcgtcgctg
forward
ab bp 523
m121 rs2
tgtcgcgggcccggtg
reverse
ab bp 1475
m121-fw3
ccctatcatccgtgg
forward
ab bp 1182
m138seq-1
tcctctctcgtgcgttcc
forward
ab bp 592
m138seq-2
gtctctctagacctctcac
forward
ab bp 494
m145 rs2
tagtagtcgagagcgccgtg
reverse
ab bp 910
5.5 Enzyme
Enzym
diverse Restriktionsenzyme
„Shrimp alkaline phosphatase“ (SAP)
Ligase
Hersteller
New England Biolabs® Inc., Ipswich, MA,
USA
USB Europe GmbH, Staufen
Invitrogen, Karlsruhe
5.6 Antikörper
in vivo applizierte Antikörper
Zielantigen
Wirt
Klon
Hersteller
m CD16/32
Ratte
IgG2b
2.4G2
BioXcell
(West Lebanon, USA)
m NK1.1.
Maus
IgG2a
PK136
BioXcell
(West Lebanon, USA)
MCMV m04
MCMV m153
Maus
Maus
IgG
Hamster
IgG
m04-KAC.10
m153.16
Prof. Dr. S. Jonjić
(Universität Rijeka,
Kroatien)
Prof. F. Nimmerjahn
(Universität ErlangenNürnberg)
m FcγRIV
9E9
Menge/ Häufigkeit
der Applikation
300µg/Maus;
Alle 2 Tage
500µg/Maus;
Alle 7 Tage
je 250µg/Maus
400µg/Maus;
Alle 7 Tage
33
34
Material
Primärantikörper
Zielantigen
Wirt
Hämagglutinin
(HA)
Spezies
Konjugat Klon
myc
MCMV gB
CD11b
Maus
Maus Maus
Maus Ratte
AF700
CD11b
CD16/32
CD64 a/b allo
Maus Ratte
Maus Ratte
Maus Maus
PE-Cy7
PE
PE
CD115
Maus Ratte
bio
CD115
Maus Ratte
APC
FcγRIIB
Maus Hamster unkonj.
FcγRIV
Maus Hamster PE
Gr-1
Maus Ratte
PE
Ly6G
NK1.1.
Maus Ratte
Maus Ratte
FITC
FITC
NKp46
(CD335)
Maus Ratte
FITC
Firma
Sigma Aldrich
Chemie GmbH,
Steinheim
Hybridom- Überstand
97.3
Hybridom- Überstand
M1/70 ebioscience,
Frankfurt
M1/70 BD, Heidelberg
2.4G2 BD, Heidelberg
X54Biolegend, London/
5/7.1
United Kingdom
AFS98 ebioscience,
Frankfurt
AFS98 ebioscience,
Frankfurt
Ly17.2 PD M. Biburger
(Universität
Erlangen-Nürnberg)
9E9
Prof. F. Nimmerjahn
(Universität
Erlangen-Nürnberg)
RB6ebioscience,
8C5
Frankfurt
1A8
BD, Heidelberg
PK136 ebioscience,
Frankfurt
29A1.4 ebioscience,
Frankfurt
IF
1:1000
IF
IF
FC
1:5
1:5
1:800
FC
FC
FC
1:2000
1:1000
1:1000
MC 1:400
FC
1:400
FC
1:1000
FC
1:1500
FC
1:5000
FC
FC
1:1000
1:200
FC
1:300
(Anwendung: IF: Immunfluoreszenz; FC: FACS; MC: Antikörper für MACS-Aufreinigung; zusätzlich
angegeben: eingesetzte Verdünnung)
Sekundärantikörper
Enzym- und Fluorenszenzfarbstoff-konjugierte Sekundärantikörper wurden von den Firmen
DAKO Deutschland GmbH (Hamburg), Dianova GmbH (Hamburg) und Sigma Aldrich
Chemie GmbH (Steinheim) bezogen. Es wurden jeweils die vom Hersteller empfohlenen
Verdünnungen benutzt.
Material
5.7 Geräte
Gerät
Bio Photometer
Zentrifugen
Zentrifuge 5424 (Tischzentrifuge)
Galaxy Mini Star (Tischzentrifuge)
Rotina 420R (Zentrifuge für Zellkultur)
Sorvall® RC-5B (gekühlte
Hochgeschwindigkeits- Zentrifuge)
Universal 30RF (Kühlzentrifuge)
L7-55 (Vakuum Ultrazentrifuge)
Dark Reader® Transluminator DR88M
Membran Vakuumpumpe
Charge-coupled device (CCD)
Kamerasystem
LAS-1000
C4742-98
Elektrophorese Power Supplies
Power Pac 300 (Agarosegel)
Power Pac basic (PAA-Gel)
Emax Mikroplatten-Reader (ELISA, BCA
Assay)
Geldokumentation Easy Win 32
Geltrockner Model 583
Gene Pulser™ (Elektroporation)
Inkubatoren
B 5050 E (Prokaryote Kulturen)
B 5060 (Prokaryote Kulturen)
CO2-Inkubator (Eukaryote Kulturen)
Unitron Schüttler (Prokaryote Kulturen)
Isofluranverdampfer HNG6
Sicherheitswerkbank
Lumineszenz Bildanalysesystem LAS1000
Magnetrührer MR 3000
Mastercycler Personal (PCR)
Mikroskope
Axioplan 2 (Fluoreszenzmikroskop)
Axiovert 135 (optische Mikroskopie)
Axiovert 200 (Fluoreszenzmikroskop)
Diavert (optische Mikroskopie)
Multikanal Pipette
Transferpette® S12 (20-200µl)
Transferpette® S12 (5-50µl)
Transferpette® S12 (elektrisch, 5-300µl)
Orion II Mikroplatten Luminometer
Hersteller
Eppendorf AG, Hamburg
Eppendorf AG, Hamburg
VWR International GmbH, Darmstadt
Andreas Hettich GmbH & Co.KG, Tuttlingen
Andreas Hettich GmbH & Co.KG, Tuttlingen
Beckmann Coulter GmbH, Krefeld
Clare Chemical Research, USA
Vacuubrand GmbH & Co.KG, Wertheim
Fuji Photo Film, Düsseldorf
Hamamatsu Photonics, Okayama City,
Japan
Bio Rad, USA
Bio Rad, USA
Eurofins MWG Operon, Ebersberg
Herolab GmbH, Wiesloch
Bio Rad, USA
Bio Rad, USA
Haraeus Holding GmbH, Hanau
Haraeus Holding GmbH, Hanau
Sanyo E & E Europe BV, England
Infors AG, Bottmingen
Hölzel GmbH, Woerth
The baker company, Inc., USA
Fuji Photo Film, Düsseldorf
Heidolph Instruments GmbH &Co.KG,
Schwabach
Eppendorf AG, Hamburg
Carl Zeiss GmbH, Jena
Carl Zeiss GmbH, Jena
Carl Zeiss GmbH, Jena
Leica Microsystems Vertrieb GmbH, Wetzlar
Brand GmbH & Co.KG, Wertheim
Brand GmbH & Co.KG, Wertheim
Brand GmbH & Co.KG, Wertheim
Berthold Detection Systems, Bad Wildbad
35
36
Material
Pipetten: Gilson 2µl, 10µl, 20µl, 100µl, 200µl,
1000µl
Pipetboy comfort
Precellys 24 (Homogenisator)
QuadroMACS™ Separator mit LS Säulen
Waagen
3719MP
R160P
Spot-Kamera (am Axioplan2-Mikroskop)
Sequenziergerät ABI PRISM® 3100
Thermomixer 5436
Vortexer
Wasserbad WNB 22
Durchflusszytometer
BD™ LSRII
Calibur
Gilson Inc., USA
Integra Biosciences GmbH, Fernwald
Peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen)
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
Sartorius AG, Göttingen
Sartorius AG, Göttingen
Diagnostic Instruments Inc., Sterling
Heights, USA
Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt
Eppendorf AG, Hamburg
Heidolph Instruments GmbH, Co.KG,
Schwabach
Memmert GmbH & Co.KG, Schwabach
Becton, Dickinson und Co., Heidelberg
Becton, Dickinson und Co., Heidelberg
5.8 Software
Software
Adobe Photoshop CS3
AlignX (DNA-Sequenz Alignment)
CorelDraw 12
FACS Express4
FACSDiva
GrapPad Prism 5
ImageJ
MetaVue (Fluoreszenzmikroskopie)
Microsoft Office (Powerpoint, Excel, Word)
Sequence analysis
Simple PCI (Biolumineszenz in vivoBildaufnahme Software)
Simplicity 4 (Luminometer Software)
Vector NTI 9.1.0 (Vektor Design)
Wsoftmax ( Mikroplatten-Reader Software)
Hersteller
Adobe Systems, Inc., USA
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Corel Corporation, USA
De Novo Software, Inc., USA
Becton, Dickinson und Co., Heidelberg
GraphPad Software, Inc., USA
Wayne Rasband; National Institutes of
Health, USA
Molecular Devices Corporation, USA
Microsoft Corporation, USA
Applied Biosystems, Inc., USA
Hamatsu Corporation, USA
Berthold Detection Systems, Pforzheim
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Molecular Devices Corporation, USA
Methoden
6 Methoden
6.1 Zellkulturverfahren
6.1.1 Zellkultur
Alle bei den Untersuchungen für diese Arbeit verwendeten Zellstöcke zeichneten sich durch
ein adhärentes Wachstum aus. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Zellkulturflaschen bei
37°C, 5% CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit. Durch sterile Arbeitsmaterialien und -bedingungen
wurden bei der Kultivierung Kontaminationen vermieden. Alle benötigten Lösungen und
Medien wurden vor Gebrauch im Wasserbad auf ca. 37°C vorgewärmt.
Eine Teilung, auch Passagierung genannt, wurde bei einer 90-100%igen Konfluenz der
Zellen vorgenommen. Hierzu wurde der Zellkulturüberstand verworfen, und die Zellen
wurden ein Mal mit 5ml 1fach-konzentrierter Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco BRL, Glasgow,
Schottland) gewaschen. Schließlich wurden die adhärenten Zellen mit der Trypsin-EDTALösung gelöst, indem die Zell-Zell-Kontakte durch eine kurzzeitige Inkubation in der Lösung
zerstört
wurden.
Die
Zellsuspension
wurde
daraufhin
je
nach
Bedarf
in
den
Verdünnungsstufen 1:2 bis 1:10 in neue Zellkulturflaschen ausgesät und in dem jeweiligen
Kulturmedium weitergezogen.
6.1.2 Transfektion von Plasmid-DNA
Am Vortag einer Transfektion wurden Cos7-Zellen in 24-Loch- (1x105 Zellen pro Vertiefung)
bzw. 96-Loch (2x104 Zellen pro Vertiefung)-Flachboden-Platten ausgesät. In einer 24-LochPlatte wurde zuvor ein steriles Deckgläschen pro Loch vorgelegt, auf dem das Zellwachstum
stattfand. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Lipofectamin 2000-Reagent (Invitrogen,
Karlsruhe) und wurde nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Bei Kotransfektionen
wurden die jeweiligen Plasmide ins Verhältnis 1:1 zueinander gebracht. Die End-DNAMenge
entsprach
den
Angaben
von
Invitrogen.
Nach
24
Stunden
wurde
das
Transfektionsmedium durch das Kultivierungsmedium ersetzt. Die transfizierten Zellen
wuchsen weiter für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen, bevor die Zellen für eine weitere
Immunfluoreszenz (Kap. 6.4.2) verwendet wurden.
6.1.3 In vitro-Amplifikation und Aufreinigung von MCMV-Virionen
Dicht gewachsene MEF-Kulturen (entsprechen etwa 3,5x107 Zellen/175 cm2) wurden mit
jeweils 1x105 PFU (plaque forming units) MCMV in einem Volumen von jeweils 30ml
Medium infiziert. Nach sechs bis sieben Tagen, wenn mindestens 90% zytopathischer Effekt
zu beobachten war, wurde der Kulturüberstand bei 3000rpm für 20min abzentrifugiert. Der
Virusüberstand wurde anschließend bei 14000rpm (26000xg) und 4°C für drei Stunden in der
37
38
Methoden
Ultrazentrifuge pelletiert. Der Überstand wurde nun verworfen, und die Pellets wurden in den
Mediumrückständen resuspendiert und vereint. Nach mehrmaligem Scheren (mindestens
10x) der Viruspellets mit einer 5ml-Spritze wurde je 1ml Virussuspension auf eine 9ml-Säule
aus 15% Saccharose in Virus-Standardpuffer (VSP) aufgetragen. Die Virus-Abtrennung von
Zelltrümmern und Restmedium erfolgte bei 20000rpm (52800xg) und 4°C in der
Ultrazentrifuge für 1 Stunde. Es folgte ein Waschschritt der Viruspellets mit kaltem PBSo.
sowie eine erneute Zentrifugation (20000rpm, 4°C, 1 Stunde), um Restbestände des
Saccharosekissens
zu
entfernen.
Zuletzt
wurden
die
pelletierten
Virionen
in
Virusstandardpuffer (VSP) aufgenommen und in Eppendorfgefäßen aliquotiert. Die Viren
wurden bei -80°C gelagert und wurden bei Bedarf bis zu zwei Mal aufgetaut.
6.2 Molekularbiologische Methoden
6.2.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR zur Genotypisierung und Amplifikation viraler Gene
Die Amplifikation von DNA-Fragmenten für Genotypisierungen oder Klonierungen erfolgte
mit Hilfe der Polymerasen-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction; PCR) nach der
Methode von Saiki (Saiki et al., 1988). Ein typischer PCR-Verlauf bestand in der Regel aus
drei unterschiedlichen Temperaturstufen. Hierfür wurde mit dem Thermocycler Eppendorf
(Eppendorf, Hamburg) gearbeitet. Tab. 6.1 zeigt im Überblick die wesentlichen Reaktionen
und die jeweilige Dauer der einzelnen Schritte.
Tab. 6.1: Zyklusbedingungen einer PCR
Zyklenzahl
Schritt
Temperatur
Dauer
I
1
Initiation
95°C
5 min
II
30
Denaturierung
95°C
30 sek
Annealing
45°C
60 sek
Elongation
72°C
2 min
Finale Elongation
72°C
5 min
III
1
Methoden
Ein PCR-Reaktionsansatz sah folgendermaßen aus:
Template DNA (50-100ng)
x µl
10 x PCR-Reaktionspuffer
(1/10 des Gesamtvolumens)
5 µl
Desoxynukleotide-Mix
8 µl
(ddNTPs: ddATP, ddTTP, ddGTP,
ddCTP; je 1,25 mM)
5´ spezifischer Primer (20 µM)
1 µl
3´ spezifischer Primer (20 µM)
1 µl
Taq-Polymerase (2,5 U/ml)
x µl
ddH2O
X µl
Gesamt
50µl
Bei der Amplifizierung von Fragmenten, die anschließend kloniert werden sollten, wurden die
High Fidelity-Polymerase mit Proofreading-Aktivität und der zugehörige High Fidelity-Puffer
verwendet, um die Mutationswahrscheinlichkeit zu verringern. Für die Genotypisierungen
oder zur Überprüfung von Bakterienklonen wurde die DreamTaq-Polymerase (Fermentas,
St. Leon-Rot) mit dem dazugehörigen Puffer eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle diente jeweils
ein Ansatz ohne DNA, um eine mögliche DNA-Kontamination in den Ansätzen ausschließen
zu können. Zur Überprüfung der DNA-Amplifikation wurden 5µl des PCR-Produktes auf ein
Agarosegel
aufgetragen
und
mittels
Gelelektrophorese
(Kap.
6.2.2)
kontrolliert.
Anschließend wurde der komplette PCR-Ansatz unter Einsatz des PureLink® PCR
Purification Kits (Life TechnologiesTM) nach Angaben des Herstellers von Salzen,
Nukleotiden und Enzymen befreit.
Kolonie-PCR
Zur schnellen Überprüfung von Bakterienklonen wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt.
Hierzu wurde der komplette Reaktionsansatz der PCR (50µl) vorgelegt. Als DNA-Vorlage
wurde mit einem sterilen Zahnstocher ein kleiner Teil einer Bakterieneinzelkolonie
abgenommen und in den PCR-Reaktionsansatz überführt.
Sequenzier-PCR
Die DNA-Sequenzierungen wurden nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode nach
Sanger mit fluoreszenzmarkierten Didesoxy-Nukleotiden durchgeführt. Die Sequenzierungen
erfolgten mit dem ABI-PRISM 377 DNA-Sequenzer (Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt)
mit Hilfe der „Dye-Terminator Thermocycler Sequenzierreaktion“. Sie wurden durch
39
40
Methoden
technische Assistenten des Hauses nach Angaben des Herstellers vorgenommen. Es
wurden alle viralen Gene sequenziert, die in einen Plasmidvektor kloniert wurden (Kap.
6.2.4). Die DNA-Sequenz des klonierten Gens wurde vom 5‘- und vom 3‘-Ende her
sequenziert, bis sich der sequenzierte Bereich zum Teil überlappte. Die Sequenzdaten
wurden mit der Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems analysiert und mit
dem VektorNTI9 Programm ausgewertet.
6.2.2 DNA-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Verfahren zur analytischen und
präparativen Auftrennung der DNA-Stränge ihrer Größe nach. Ein elektrisches Feld wird
verwendet, um die negativ geladenen DNA-Moleküle durch die Gelmatrix in die Richtung der
Anode zu ziehen.
Bei den DNA-Analysen zu dieser Arbeit wurden 0,5 bis 1,5%ige Agarosegele verwendet. Je
größer das aufzutrennende DNA-Fragment desto geringer der Agaroseanteil im Gel. Der in
1x TBE-Puffer aufgekochten, flüssigen Agarose wurde 1µg/ml Ethidiumbromid zugesetzt,
das aufgrund seiner planaren Struktur in die DNA interkaliert und durch UV-Licht angeregt
werden kann. Die DNA-Proben wurden mit 6fach-Auftragspuffer versetzt und in die
eingesetzten Geltaschen des Agarosegels pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 bis
150Volt für ca. 1,5 Stunden. Als Laufpuffer diente 1x TBE-Puffer. Nach der Elektrophorese
wurden die DNA durch UV-Licht (254nm) im Agarosegel sichtbar gemacht, fotografiert und
ausgewertet. Mit Hilfe einer mitgeführten 1kb DNA-Markerbande (Gibco BRL; Glasgow
Schottland) konnte die Größe des DNA-Produktes bestimmt werden.
6.2.3 DNA-Spaltung mit Hilfe von Restriktionsenzymen
Der Verdau von DNA mit spezifischen Restriktionsenzymen wurde im hauseigenen 10x T4Puffer bei 37°C für ca. 1,5 Stunden durchgeführt. Im Sonderfall wurde der Verdau in dem für
das jeweilige Enzym geeigneten NEB-Puffer bei der vom Hersteller angegebenen
Temperatur und Dauer angesetzt.
Bei analytischen Spaltungen wurden 1-2µg DNA mit 1 Unit Enzym in 20µl Gesamtvolumen
(ad T4-Puffer und ddH2O) verdaut. Präparative Spaltungen wurden mit 3-5µg DNA mit 510Units pro Enzym pro µg DNA in einem Gesamtvolumen von 100µl (ad T4-Puffer und
ddH2O) vorgenommen. Zum Stoppen der Enzymreaktion wurde der Restriktionsansatz für
20min bei 65°C inkubiert und anschließend sofort auf Eis gestellt. Dadurch wurde die
Denaturierung der abgespaltenen Endstücke gesichert. Das Ergebnis der DNA-Spaltung
wurde mittels Gelelektrophorese geprüft.
Methoden
6.2.4 Klonierung von DNA-Fragmenten
Für die Klonierung bestimmter MCMV-Genomabschnitte in eukaryote Plasmidvektoren
wurden zunächst die gewünschten MCMV-Genabschnitte mittels PCR amplifiziert (Kap.
6.2.1). Die dafür verwendeten Primer enthielten an ihren 3´-bzw. 5´- Enden die Information
einer Restriktionsschnittstelle, die von spezifischen Restriktionsenzymen erkannt und
geschnitten wurden. Mittels dieser Schnittstellen konnte das PCR-Produkt über die multiple
Klonierungsstelle in den Expressionsvektor eingefügt werden, der mit denselben
Restriktionsenzymen gespalten wurde.
Aufreinigungsmethoden von DNA-Fragmenten
Einleitend wurden die PCR-Produkte bestimmter MCMV-Genomabschnitte durch die
Gelelektrophorese überprüft und der komplette PCR-Ansatz (in der Regel ein Doppelansatz
pro MCMV-DNA-Abschnitt) unter Einsatz des PureLink® PCR Purification Kits (Life
TechnologiesTM) nach Angaben des Herstellers gereinigt.
Ergab die PCR bestimmter MCMV-DNA-Bereiche in der analytischen Gelelektrophorese
nachweislich nur wenig PCR-Produkt, wurden mehrere PCR-Läufe für dieses DNA-Fragment
wiederholt durchgeführt, die PCR-DNA vereinigt und einer präparativen Gelelektrophorese
auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen. Die entsprechende DNA-Bande wurde daraufhin
unter Sichtbarmachung durch UV-Licht mit einem Skalpell herausgeschnitten und die DNA
mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen, Hilden) anhand des Protokolls des Herstellers
isoliert und aufgereinigt. Zur weiteren Klonierung des erhaltenen DNA-Fragments wurde
dieses mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut (Kap. 6.2.3) und nachfolgend
erneut mit dem PureLink® PCR Purification Kit (Life TechnologiesTM) aufgereinigt.
Dephosphorylierung und Ligation
Damit eine Insertion und Ligation des MCMV-Fragments in den Zielvektor möglich wurde,
musste das 5´- Ende des nach dem präparativen Verdau linearisierten Vektors
dephosphoryliert werden. Die Dephosphorylierung verhindert, dass die Vektorenden mit sich
selbst interagieren und es zu Religationen kommt. Zur Entfernung der endständigen 5´Phosphatreste wurde in den präparativen, vektoriellen Restriktionsansatz 1Unit SAP
(Schrimps-Alkaline-Phosphatase) gegeben und für weitere 30min bei 37°C inkubiert. Wie
unter 6.2.3. beschrieben, wurde die Enzymaktivität gestoppt, indem der Ansatz für 20min auf
65°C gesetzt und anschließend sofort auf Eis verwahrt wurde. Die Aufreinigung des Vektors
erfolgte mittels der Reinigungssäulen des PureLink® PCR Purification Kits (Life
TechnologiesTM) (Kap. 6.2.4). In der nachfolgenden Ligation wurden die PCR-Fragmente und
die Vektor-DNA miteinander verknüpft. Die PCR-Fragmente und der Plasmidvektor wurden
im Verhältnis 5:1 eingesetzt. Die Reaktion wurde für mindestens 12 Stunden bei 14-16°C
41
42
Methoden
durchgeführt und setzte sich folgendermaßen zusammen: 50-100ng DNA (DNA-Fragment
und Vektor), 1µl 10mM ATP, 2µl 100mM DTT, 4µl 5x Ligase-Puffer und 1µl T4-DNA-Ligase
(1U/µl). Dieses Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20µl
gebracht.
6.2.5 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
Die Übertragung freier Plasmid-DNA in kompetente E.coli-Bakterien erfolgte mittels
Elektroporation. 10µl frisch auf Eis aufgetaute, kompetente DH10B®-Bakterien (Invitrogen/
Life Technologies) wurden mit 18µl kaltem ddH20 und 2µl des Ligationsansatzes (Kap. 6.2.4)
in
einer
auf
Eis
vorgekühlten
ElektroMax
Elektroporationsküvette
pipettiert.
Als
Religationskontrolle wurden die kompetenten Bakterien mit 1µl Leervektor-Ligationsansatz
vermischt. Die Transformation wurde anschließend unter den Bedingungen vorgenommen,
die für die bakterielle Aufnahme der Plasmid-DNA notwendig waren (200Ώ, 25 µF, 2.5 kV).
Nach der Elektroporation wurden die Ansätze in 1ml SOC-Medium aufgenommen und etwa
eine Stunde bei 37°C in einem Heizblock geschüttelt. Zuletzt wurden die transformierten
Bakterien auf Ampicillin-LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert, bis deutlich
erkennbare Bakterien-Kolonien auf den Platten gewachsen waren. Zur schnellen Testung
der Bakterienklone wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt (Kap. 6.2.1).
6.2.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Für die analytische Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli- Bakterien wurden einzelne
Bakterienklone mit einem sterilen Zahnstocher von Agarplatten gepickt und in 4ml LBSelektionsmedium über Nacht bei 37°C in einem Falcon-Reaktionsgefäß angezogen. Die
Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte nach dem Protokoll des PureLink™ Quick Plasmid Mini
Kits von Invitrogen. Für die Elution der Plasmid-DNA wurde jedoch anstatt des spezifischen
Invitrogen-Elutionspuffers destilliertes Wasser verwendet. Zur Überprüfung der gewonnenen
Plasmid-DNA wurden 4µl des Minipräp-Produktes in eine Testspaltung eingesetzt. Die
Konzentration und Reinheit der Plasmid-DNA wurde photometrisch mittels eines BioPhotometers (Eppendorf AG, Hamburg) bei einer Wellenlänge von 260nm und 280nm in
einer Eppendorf-Küvette bestimmt. Ca. 200ng Plasmid-DNA wurden in eine Sequenzier-PCR
(Kap. 6.2.1) eingesetzt.
Waren größere Mengen an Plasmid-DNA mit höherer Reinheit erforderlich, wie z.B. für
Transfektionen, wurde eine endotoxinfreie Plasmid-Präparation mit Hilfe des PureLink™
Quick Plasmid Maxi Kits von Invitrogen vorgenommen. Die Isolierung der DNA erfolgte nach
Angaben des Herstellers bis auf folgende Modifikationen:
Nach der Bakterienzelllyse wurde der gewonnene Zellüberstand, der die Plasmid-DNA
enthielt, mit 3ml Endotoxin Removal Buffer A pro 50ml Überstand versehen. Dieser musste
für 15min auf Eis inkubieren. Danach wurde der Überstand auf die DNA-Bindesäulen des
Methoden
Plasmid Maxi-Kits gegeben und die DNA-gebundene Säule ein Mal mit 30ml Endotoxin
Buffer B gespült. Das weitere Vorgehen zur Aufreinigung der Plasmid-DNA entsprach dem
Protokoll des PureLink™ Quick Plasmid Maxi-Kits.
6.3 Proteinbiochemische Methoden
6.3.1 Herstellung von Zelllysaten
Die dicht gewachsenen MEF-Zellen einer 175cm2-Zellkulturflasche wurden mit Hilfe eines
Zellschabers vom Flaschenboden entfernt, in einem Falcon-Röhrchen gesammelt und für
5min bei 1500rpm zentrifugiert. Das gewonnene Zellpellet wurde anschließend in 250µl
PBSo/2% TritonX-100 aufgenommen und in Eppendorf-Gefäße überführt. Es folgte eine 30minütige Inkubation auf Eis, wobei die Suspension alle 10min gemixt wurde. Danach wurden
750µl PBSo zugegeben, um eine 0,5%ige Endkonzentration an TritonX-100 zu erhalten.
Nach einem Zentrifugationsschritt bei 13000rpm für 5min in der Eppendorf-Zentrifuge wurde
der Überstand abgenommen und dessen Proteinkonzentration bestimmt.
Zur Herstellung von Lysaten infizierter MEF wurde eine konfluente MEF-Kultur einer 175cm2Zellkulturflasche mit 5x105 PFU MCMV infiziert und die infizierten Zellen 96 Stunden später,
wie oben beschrieben, lysiert. Die Lagerung der Lysate erfolgte bei -20°C.
6.3.2 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Der Proteingehalt von Lösungen, wie z.B. Organhomogenaten, wurde mit Hilfe des BCA Kits
der Firma Pierce in 96-Loch-Rundbodenplatten bestimmt. Das zu testende Probenmaterial
und ein Albumin-Standard (Pierce, Rockford, USA) wurden zunächst in Zweierschritten in
25µl Verdünnungsmedium titriert. Die Verdünnungsreihen wurden in dem Puffer angelegt,
der das Proteingemisch enthielt. Zur Proteinbestimmung wurde standardmäßig 1x PBSo als
Verdünnungsmedium verwendet. Organhomogenate wurden für die Konzentrationsbestimmung in Glo Lysis-Puffer verdünnt. Die angesetzten Proben wurden anschließend mit
200µl working solution (50 Anteile Reagenz A mit 1 Anteil Reagenz B gemischt) pro
Vertiefung versehen und für 30min bei 37°C inkubiert. Die Absorption wurde bei einer
Wellenlänge von 562nm am Emax-Mikroplatten-Reader gemessen. Die Proteinkonzentration
der Proben wurde zuletzt mittels der Eichgeraden im Programm Wsoftmax (Molecular
Devices Corporation, USA) berechnet.
43
44
Methoden
6.4 Immunbiologische Methoden
6.4.1 Enzymgekoppelter Immunoadsorptionstest (ELISA)
Antikörper-ELISA
Die
ELISA-Tests
(enzyme-linked
immunosorbent
assay)
wurden
in
96-Loch-
Rundbodenplatten (F96 Maxi Sorp Immunplatten von der Firma Nunc (Wiesbaden))
durchgeführt. Zwischen den Inkubationsphasen wurden die ELISA-Platten jeweils dreimal für
5min mit 200µl ELISA-Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen.
Die 96-Loch-Platten wurden zunächst mit 50µl in ELISA-Kopplungspuffer verdünntem
Antigen bei 4°C im Kühlschrank über Nacht beschichtet (MEF-Lysat: 1µg/Loch, Virionen:
75ng/Loch). Nach einem Waschschritt wurden unspezifische Bindungsstellen mit 200µl
PBSo/5% FKS pro Loch bei 37°C für eine Stunde blockiert. Die Blockierlösung wurde
danach ohne Waschschritt entfernt. Das zu testende Probenmaterial, meist Serum von
Versuchstieren,
wurde
zunächst
in
Zweierschritten
in
einem
speziellen
Probenverdünnungspuffer (Biotest, Dreieich) verdünnt und auf die mit Antigen beschichteten
ELISA-Platten übertragen. Bei Mausseren wurde eine Ausgangsverdünnung von 1:20
gewählt. Die Platten wurden für 2 Stunden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt folgte die Detektion mit einem Peroxidasegekoppelten, gegen Maus-IgG gerichteten Sekundärantikörper. Dieser wurde in der vom
Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBSo/1% FKS eingesetzt. Nach einstündiger
Inkubation der Platte bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer wurden die
überschüssigen Antikörper mit einem wiederholten Waschschritt entfernt. Zuletzt wurden
100µl
einer
TMB-Substratlösung
pro
Vertiefung
pipettiert.
Nach
Beurteilung
der
Farbentwicklung in einem Referenzansatz wurde die Enzymreaktion mit 100µl 1M
Phosphorsäure gestoppt und mit einem Emax-Photometer bei 450nm ausgewertet.
Sandwich-ELISA
Die IgG-Konzentrationsbestimmung sowie IgG-Subtypbestimmung von Antikörpern in
Mausseren
erfolgte
mittels
eines
sog.
Sandwich-ELISAs.
Das
Prinzip
und
die
Vorgehensweise entsprachen dem oben beschriebenen Antikörper-ELISA.
Zunächst wurden ELISA-Platten mit 100ng anti-Maus-IgG pro Vertiefung über Nacht bei 4°C
gekoppelt, um am nächsten Tag die zu testenden Proben nach Blockierung in
Zweierschritten zu titrieren. Als Standardreihe wurde ein unkonjugiertes Maus-IgG bzw. ein
spezifischer Maus-IgG-Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) mit einer definierten Konzentration
eingesetzt. Mit einer Anfangskonzentration von 500ng/ml wurde der Standard ebenfalls
seriell verdünnt. Als Sekundärantikörper wurden Peroxidase-konjugiertes, Fcγ-Fragment
spezifisches anti-Maus-IgG bzw. für den jeweiligen Isotyp spezifisches anti-Maus-IgG
Methoden
verwendet. Nach der Substratreaktion und Auswertung der ELISA-Platte am EmaxPhotometer erfolgte die Konzentrationsbestimmung der einzelnen Proben anhand der
Immunglobulin-Standardkurve mit der Wsoftmax-Software.
6.4.2 Indirekte Immunfluoreszenz
Bei den Versuchen zu dieser Arbeit wurde die Methode der Immunfluoreszenz zum
Nachweis bestimmter Proteine nach Transfektionen (Kap. 6.1.2) oder bei Titerbestimmungen von Viruspräparationen angewandt.
Zunächst wurde das Zellkulturmedium transfizierter oder infizierter Zellen entfernt und die
Zellen zwei Mal mit gekühltem PBSo gewaschen. Anschließend folgte das Blocken
unspezifischer Bindestellen mit PBSo/5% FKS für 10-15min bei 4°C.
Für den Nachweis intrazellulärer Proteine wurden die Zellen nun mit eiskaltem Methanol für
exakt 4min permeabilisiert und gleichzeitig fixiert. Nach dreimaligem Spülen der Zellen mit
PBSo/0,1% FKS wurde der Primärantikörper in PBSo/1% FKS verdünnt und für 1 Stunde bei
37°C in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend fünf Mal mit PBSo/0,1% FKS
gewaschen. Für die Färbung von Proteinen auf der Zelloberfläche wurden die Zellen sofort
nach dem Blockierungsschritt mit dem Primärantikörper versehen und für 1 Stunde auf 4°C
gestellt. Erst nach der Detektion mit dem Primärantikörper und mehrmaligem Waschen
wurden die Zellen mit Methanol behandelt.
Als Sekundärantikörper wurde ein mit einem Farbstoff-gekoppelter anti-Maus-IgG eingesetzt
und in PBSo/1% FKS verdünnt. Es folgte eine 45minütige Inkubation bei 37°C in einer
abgedunkelten Kammer. Ungebundene Antikörper wurden nach der Inkubationszeit durch
mehrmaliges Waschen der Zellen entfernt. Handelte es sich bei der Immunfluoreszenz um
eine Färbung von Zellen in einer 96-well-Platte, fand die daraufolgende Auswertung am
Invers-Fluoreszenzmikroskop statt.
Zellen für Transfektionen in 24-Loch-Platten wurden, wie in Kap. 6.1.2 beschrieben, auf
sterilen Deckgläschen herangezogen. Die Deckgläschen wurden bei der Immunfluoreszenz
nach der Färbung der Zellen mit dem Primär- und Sekundärantikörper mit einer Pinzette
entnommen, indem die Böden der 24-Loch-Platte mit einer heißen Kanüle durchstochen
wurden. Diese Deckgläschen wurden anschließend in 4´,6-Diamidino-2-phenylindol-haltiger
Lösung (DAPI) auf Objektträgern eingedeckelt und mit Nagellack luftdicht verschlossen. Die
Zellen wurden zuletzt am Fluoreszenzmikroskop untersucht und mit Hilfe einer am Mikroskop
integrierten Foto-Kamera dokumentiert.
45
46
Methoden
Titerbestimmung von Viruspräparationen
Der Virustiter wurde durch Endpunkttitrationen mittels indirekter Immunfluoreszenz bestimmt.
Hierzu wurden 12000 MEF-Zellen pro Vertiefung einer 96-Loch-Flachbodenplatte ausgesät
und ca. 24 Stunden später mit seriellen Verdünnungsreihen der jeweiligen Viruspräparation
infiziert. Nach 2 bis 3 Tagen erfolgte eine spezifische intrazelluläre Detektion des viralen
immediate early Protein 1 von MCMV (Trgovcich et al., 2000) mit dem monoklonalen Antikörper Croma101. Als Nachweis-Antikörper wurde ein Cy3-gekoppelter anti-Maus-IgG
eingesetzt und die Färbung an einem Invers-Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Die
Berechnung des Virustiters erfolgte nach Reed und Münch, 1938.
6.4.3 in vitro- Neutralisationstest muriner Antikörper
Mit Hilfe des Neutralisationstests (NT) kann die Neutralisationskapazität muriner Antikörper
gegen MCMV in vitro bestimmt werden. Für den Test wurde das MCMV∆m157luc verwendet,
das unter dem CMV Immediate-Early-Promotor ein Luziferase-Gen trägt und nach Infektion
der Zelle Luziferase exprimiert. Die Luziferase-Aktivität und demnach auch die Infektion der
Zellen kann unter Zugabe des Substrates Luziferin in Form absorbierter relativer
Lichteinheiten (engl. relative light units, RLU) mittels eines Luminometers quantifiziert
werden.
Das zu testende Probenmaterial, meist Seren aus Versuchstieren, wurde zunächst in
Zweierschritten,
beginnend
mit
einer
Ausgangsverdünnung
von
1:2,
in
15µl
Verdünnungsmedium in einer 96-well-Platte titriert. Als Verdünnungsmedium diente Serum
aus RAG1-/--Mäusen. Das verdünnte Testmaterial wurde anschließend mit 1200 PFU des
MCMV∆m157luc in einem Mischverhältnis von 1:1 versehen und für 60min bei 37°C
inkubiert. In dieser Phase sollte die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes stattfinden.
Danach wurden 25µl des Inkubats auf die am Vortag ausgesäten
ST-2-Stromazellen
(1,2x104 Zellen pro Loch) bzw. mIEND-1-Zellen (2x104 Zellen pro Loch) pipettiert und für 4
Stunden im Zellkulturbrutschrank (37°C / 5%CO2 / 100%RH) stehen gelassen.
Nach dieser vierstündigen Inkubationsphase erfolgte ein Mediumwechsel (RPMI-Vollmedium
mit 10% FKS (v/v)), um sekundäre Infektionen zu minimieren, welche sich durch die
Auflösung von Antigen-Antikörper-Komplexen ereignen können. Die Infektion bzw. die
Luziferaseexpression infizierter Zellen wurde nach weiteren 20 Stunden Inkubation nachgewiesen. Dafür wurden die vom Zellmedium befreiten Zellen mit 100µl Glo Lysis-Puffer
(Promega, Mannheim) versehen und durch heftiges Auf-Ab-Pipettieren lysiert. Anschließend
wurden jeweils 30µl Zelllysat von jedem Ansatz in eine lichtundurchlässige 96-Loch-Platte
(Lumitrac 200) übertragen, in die zuvor Luziferase-Assay-Puffer vorgelegt wurde (50µl/Loch).
Unter automatischer Zugabe des Substrates Luziferin (50µl pro Vertiefung) wurden die
absorbierten Lichtquanten nach einer Messdauer von 10sek im Luminometer quantifiziert.
Methoden
Als Kontrollwerte wurden die RLUs der Zellen herangezogen, die nur mit Virus (PositivKontrolle) bzw. nur mit RAG1-/--Serum (Negativ-Kontrolle) versehen wurden. Die RLU-Werte
der Positiv-Kontrolle entsprechen einer 0%igen Neutralisation, die der uninfizierten Zellen,
die Negativ-Kontrolle, einer 100%igen Neutralisation.
Daraus lässt sich die Neutralisationskapazität der Seren wie folgt berechnen:
[(RLU-Werte der Testseren) – (Negativ-Kontrolle)]
100% -
x 100 = %-Neutralisation
[(Positiv-Kontrolle) – (Negativ-Kontrolle)]
Die Auswertung des Tests erfolgte mit Hilfe von Microsoft Excel und Graph-Pad Prism5.
6.4.4 Durchflusszytometrie- Analysen
Die Durchflusszytometrie (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting) wurde für die
Analysen von murinen Splenozyten und von murinem Vollblut angewendet. Alle
Inkubationsschritte wurden, sofern nicht anders angegeben, im Dunkeln bei 4°C für 20min
durchgeführt. Die Antikörperverdünnungen erfolgten im FACS-Puffer und bezogen sich auf
eine Zellkonzentration von 1x107 Zellen pro ml. Zwischen den einzelnen Färbeschritten
wurden
die
Zellen
durch
Auffüllen
des
Reaktionsgefäßes
mit
FACS-Puffer
und
anschließender Zentrifugation (1500rpm, 6min) gewaschen, um überschüssige und nicht
gebundene Antikörper zu entfernen.
Durchflusszytometrie von murinen Splenozyten
Nach dem Töten der Versuchstiere wurden den Tieren die Milzen entnommen und in PBSo
auf Eis bis zur weiteren Aufbereitung aufbewahrt. Die Herstellung der Einzelzellsuspension
erfolgte wie in Kap. 6.6 beschrieben. Nach der Erythrozytenlyse oder in weiteren
Aufreinigungsschritten wurden die Zellen zunächst mit 1:20 verdünntem naivem Mausserum
oder Kaninchenserum für 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschschritt
wurden die Primärantikörper der jeweiligen Färbung in der angegebenen Verdünnung (Kap.
5.6) den Zellen zugegeben. Die Färbung und Inkubation eines Sekundärantikörpers erfolgte
in gleicher Weise. Nach Beendigung der Färbung wurden die Zellen durch Pre-SeparationFilter von Zellaggregaten befreit und auf eine Zellkonzentration von 5x106 Zellen eingestellt.
Die Analyse und Akquirierung erfolgte am FACS-Calibur oder LSRII mit der Software FACS
Diva. Die graphische Darstellung der Messdaten und statistische Auswertung wurde mit der
FACS Express3-Software durchgeführt.
47
48
Methoden
Durchflusszytometrie von murinem Vollblut
Für die durchflusszytometrische Analyse von murinem Vollblut wurden 50-100µl Blut eines
Versuchstieres benötigt. Die Blutentnahme erfolgte nach einer kurzen Betäubung der
Versuchsmäuse mit Isofluran retrobulbär. Das Blut wurde sofort in Reaktionsgefäßen
aufgefangen und mit 20µl Na-Heparin versehen.
Für die jeweilige FACS-Färbung wurde dem Blut das gleiche Volumen einer doppeltkonzentrierten Mischung aller Primärantikörper in FACS-Puffer zugegeben. Nach dem
Färbeschritt wurde jeder Färbeansatz mit 1ml BD FACS™ Lysing Solution versetzt. Dies
führte nach einer Inkubation von 10min bei Raumtemperatur zur Lyse der Erythrozyten und
gleichzeitig zur Fixierung der Blutzellen. Falls notwendig, wurden die Zellen anschließend
nach einem Waschschritt zusätzlich mit Sekundärantikörpern versehen. Die Zellen wurden
zuletzt nochmals gewaschen und zentrifugiert, in ca. 300µl FACS-Puffer aufgenommen und
am FACS-Calibur oder LSRII analysiert.
6.4.5 Komplement-Bindungs-Reaktion zum Komplement-Nachweis in der Maus
Die Komplementbindungsreaktion (KBR) ist eine klassische serologische Methode zum
Antikörpernachweis gegen eine große Anzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren,
Pilze und Parasiten.
In dieser Arbeit wurde die KBR genutzt, um die Aktivität des murinen Komplements im
Serum nach in vivo-Gabe des Cobra Venom Faktors zu überprüfen. Als Indikatorsystem
wurden Hammelerythrozyten und ein Ambozeptor verwendet. Beim Ambozeptor handelt es
sich um ein gegen die Schafserythrozyten gerichtetes und hämolysierendes Serum.
Alle für den Komplement-Nachweis benötigten Reagenzien wurden vom Institut Virion/Serion
GmbH (Würzburg) bezogen. Die zu testenden Mausseren wurden zunächst 1:2 in KBRPuffer (VolEnd: 50µl) in einer Vertiefung einer 96-Loch-U-Boden-Platte angesetzt und für
30min bei 37°C erwärmt. Eine 1%ige Hammelerythrozytensuspension wurde 1:32 und der
Ambozeptor 1:2500 in KBR-Puffer verdünnt. Die Erythrozyten und der Ambozeptor wurden
anschließend in einem Mischverhältnis von 1:1 für 30min bei 37°C in einem Wasserbad
inkubiert, was zur Bindung des Ambozeptors an die Oberfläche der Erythrozyten führte.
Nach der Inkubationszeit wurden 50µl der Ambozeptor-Erythrozyten-Suspension auf die
Testseren pipettiert und nochmals bei 37°C für 30min stehen gelassen. Zuletzt wurde die
Mikrotiterplatte bei 2000rpm für 5min zentrifugiert und unter dem Mikroskop ausgewertet. Bei
Anwesenheit von Komplement im Mausserum bewirkte dieses über die Bindung an den
Ambozeptor eine Lyse der Schafserythrozyten. War kein aktives Komplement im Mausserum
vorhanden, blieben die Erythrozyten intakt und es kam zur Sedimentierung der Erythrozyten
am Boden der Mikrotiterplatte.
Methoden
6.5 Tierexperimentelle Techniken
6.5.1 Infektion und Immunisierung
Für die Generierung MCMV-spezifischer Antikörper wurden CD8-/--Mäuse verwendet. Bei
einer Infektion wurde den Versuchstieren 1x105 PFU MCMV∆m157luc in 200µl PBSo
intraperitoneal injiziert. Diese Mäuse wurden frühestens 60 Tage nach Infektion für
Experimente eingesetzt. Bei einer Immunisierung erfolgte eine 2malige intraperitoneale
Applikation von je 5µg viralem Gesamtprotein (UV-inaktivierte Virionen) in einem zeitlichen
Abstand von 6 Wochen. Die dritte Antigengabe (2µg Gesamtprotein) einer Immunisierung
wurde intravenös verabreicht. Die Versuchstiere wurden frühestens 4 Wochen nach der
letzten Immunisierung für Experimente eingesetzt.
6.5.2 Serumgewinnung
Zur Serumgewinnung wurden die Versuchstiere kurzzeitig mit Isofluran betäubt und
retrobulbär mit Hilfe einer Glaskapillare geblutet. Das Blut wurde in Microtainer-SSTSerumröhrchen
aufgefangen
und
bei
Raumtemperatur
und
9000rpm
für
10min
abzentrifugiert. Die Lagerung der Seren erfolgte bei -20°C.
6.5.3 in vivo-Biolumineszenz
Den Versuchstieren wurden zunächst ventral die Tierhaare mit einer Enthaarungscreme
entfernt. Danach wurden 0,5mg D-Luziferin in 200µl PBSo intraperitoneal appliziert. Die
Mäuse wurden anschließend sofort durch Isofluran mit Hilfe eines Isofluranverdampfers
narkotisiert und in Rückenlage auf einem Objekttisch in der Dunkelkammer fixiert. Mittels
eines gekühlten CCD-Kamerasystems wurde die in vivo-Biolumineszenz über einen
Zeitraum von exakt 120 Sekunden aufgenommen, währenddessen die Mäuse über einen
Atemtrichter
kontinuierlich
mit
Isofluran
betäubt
wurden.
Die
Dokumentation
des
transmittierten Lichts erfolgte mit der Software Simple PCI. Die aufgenommenen Bilder
wurden in Falschfarben mit dem Programm ImageJ dargestellt und entsprechende Hellfeldund Fluoreszenzbilder mit Adobe Photoshop übereinander gelagert.
6.5.4 Adoptiver Zell- und Serumtransfer
Der adoptive Transfer muriner Zellen erfolgte intravenös in 200µl PBSo/0,5% FKS. Bei
einem Monozytentransfer wurden den Versuchstieren 1-4x106 CD115-positive Zellen injiziert.
Der Transfer von murinen Zellen wurde einige Tage nach Applikation durchflusszytometrisch
in Blutproben von Rezipienten-Tieren überprüft.
Für den Transfer von MCMV-spezifischem Serumpool wurde zunächst das Serum von mehr
als 20 infizierten bzw. immunisierten CD8-/--Tieren gesammelt und gemischt. Das Serum
49
50
Methoden
wurde kurz vor dem Transfer mit PBSo auf ein Endvolumen von 200µl versetzt und den
Mäusen intraperitoneal verabreicht.
Nicht behandelte, naive Donortiere wurden in den Experimenten sowohl beim Zell- als auch
Serumtransfer als Negativkontrollen herangezogen.
6.5.5 Bestimmung des viralen Titers in Organen
Alle Versuchstiere wurden durch kraniale Dislokation getötet. Die Speicheldrüsen, Milz,
Niere, Leber und Lunge wurden anschließend herauspräpariert. Bis zur weiteren
Untersuchung wurden die Organe auf -80°C gelagert. Für die Virustiterbestimmung wurde
die Luziferaseaktivität von 30µg Gesamtprotein aus den Organhomogenaten bestimmt. Die
Luziferaseaktivität korreliert mit den viralen DNA-Kopien aus Organen infizierter Tiere
(Klenovsek et al., 2007; Supplemental methods).
Alle weiter aufgeführten Arbeitsschritte fanden, soweit möglich, auf Eis statt. Zur Herstellung
von Organhomogenaten wurden die Organstücke zunächst jeweils mit 1ml Glo Lysis-Puffer
in speziellen 2ml-Reaktionsgefäßen (Peqlab, Erlangen) versetzt, die mit Keramikkügelchen
gefüllt waren (Keramikkügelchen: Ø 1,4mm; für Speicheldrüsen Ø 2,8mm). Die Organe
wurden anschließend mit Precellys 24 Homogenisator nach folgenden Angaben zerkleinert:
Organ
Dauer in sek
Drehzahl in rpm
Milz
1x 20
6500
Leber
1x 15
5000
Lunge
1x 20
6500
Niere
1x 20
6000
Speicheldrüsen
2x 30
6500
Nach der Homogenisierung wurden die großen Gewebsreste und die Keramikkügelchen in
einer Kühlzentrifuge bei 4°C, 13000 rpm und 10min pelletiert. Die Proteinkonzentration des
Homogenatüberstandes wurde anschließend proteinbiochemisch mittels BCA-Test (Kap.
6.3.2) bestimmt. Für die anschließende Luziferase-Aktivitätsbestimmung wurden 30µl
Organhomogenat mit einer eingestellten Proteinkonzentration von 1µg/µl in eine Vertiefung
einer weißen Costar 96-Loch-Platte pipettiert. In der Costar-Platte waren bereits 50µl LAP
pro Vertiefung vorgelegt. Die weitere Messung erfolgte wie beim in vitro-Neutralisationstest
(Kap. 6.4.3) am Luminometer. Die Messdaten in Form von RLUs wurden mithilfe des Graph
Pad Prism5-Programms analysiert und ausgewertet. Dargestellt wurde jeweils der Mittelwert
eines gemessenen Doppelansatzes Organhomogenat.
Methoden
6.5.6 In vivo-Applikation von depletierenden oder blockierenden Antikörpern,
Clodronat-Liposomen und Cobra Venom Faktor
Alle Agenzien wurden in vorexperimentellen Versuchen getestet und die optimale
Applikationsdosis und Häufigkeit der Verabreichung in Versuchstieren vorab bestimmt.
Hierfür wurden durchflusszytometrische Analysen von Vollblut vorgenommen. Die in vivoEffizienz des Cobra Venom Faktors wurde im Mausserum mittels KBR (Kap. 6.4.5) ermittelt.
Alle Antikörper bzw. Substanzen wurden intraperitoneal in 200µl PBSo 1 Tag vor der MCMVInfektion injiziert. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung findet sich in Kap. 5.3.4.
6.6 Isolation und Aufreinigung muriner Zellen
Alle Versuchstiere wurden durch kraniale Dislokation getötet. Soweit nicht anders vermerkt,
erfolgten alle Reinigungsschritte in MACS-Puffer bei 4°C. Alle Zentrifugationsschritte wurden
bei 4°C und 1500rpm für 1min pro 2ml Volumen durchgeführt.
6.6.1 Aufreinigung und Isolation von Monozyten aus murinen Milzen und Vollblut von
C57BL/6 Rag1-/--Mäusen
Die entnommenen Milzen wurden mit einem Skalpell zerkleinert und vorsichtig in MACSPuffer mit dem Stempel einer 1ml-Spritze durch ein Zellsieb (Cell Strainer, 70µm; BD Falcon)
gedrückt. Die erhaltene Einzelzellsuspension wurde in 15ml-Rundbodengefäße überführt
und zentrifugiert. Die Pellets wurden in 500µl MACS-Puffer resuspendiert und mit 5ml
Erythrozyten-Lysepuffer versetzt. Nach 5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die
Reaktion durch Zugabe von 10ml MACS-Puffer abgestoppt und die Zellen über Pre
Separation-Filter (30µm; Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) von Zell-GewebeAggregaten befreit. Nach Bestimmung der Zellzahl mittels Hämozytometer wurden pro
Ansatz etwa 2,5x107 Zellen zentrifugiert und die erhaltenen Pellets in je 5ml 1640-Medium
resuspendiert.
Zur Gewinnung von Vollblut wurden die Versuchstiere zunächst mit Isofluran betäubt.
Anschließend wurden ca. 1ml Vollblut retrobulbär mit Hilfe einer Kapillare abgenommen und
mit 50µl Na-Heparin versehen, um eine Koagulation zu verhindern. Die Tiere wurden danach
sofort getötet.
Zur weiteren Aufreinigung der Monozyten wurde das Vollblut mit ca. 5ml RPMI-Medium
versetzt, mit 2ml Ficoll-Lympholyte M®-Lösung unterschichtet und bei Raumtemperatur für
20min bei 2000rpm ohne Bremse zentrifugiert. Der entstandene Leukozytenring wurde an
der Grenze zwischen Medium und Ficoll abgezogen und enthielt vor allem Monozyten,
Makrophagen und eine ca. 30%ige Verunreinigung von Granulozyten. Nach einem
Waschschritt wurde zusätzlich eine Erythrozyten-Lyse durchgeführt, wie oben beschrieben,
51
52
Methoden
um die restlichen Erythrozytenverunreinigungen zu beseitigen. Nach der Erythrozyten-Lyse
wurden die Zellen gezählt und zur Färbung mit einem anti-CD115-Antikörper vorbereitet.
6.6.2 Anreicherung CD115-positiver Zellen aus C57BL/6 Rag1-/--Mäusen mittels
MACS-Technologie
Die in 6.6.1. aufbereiteten Zellen wurden anschließend mit einem biotinylierten anti-CD115Antikörper für 15-20min bei 4°C gefärbt. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen
gezählt. Pro 1x107 gezählter Zellen wurden 10µl Streptavidin-Microbeads (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach) in 90µl MACS-Puffer und resuspendiert.
Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 4°C wurden überschüssige Microbeads durch einen
Waschschritt entfernt und die Zellen in 1ml MACS-Puffer resuspendiert. Ca. 1x108 Zellen
wurden auf mit MACS-Puffer vorequilibrierte MACS-LS-Separation-Säulen im Magnetfeld
des VarioMACS aufgetragen. Nach mehreren Waschschritten wurden die Säulen aus den
Magneten genommen, auf neue Auffangröhrchen gesetzt und die verbliebenen Zellen unter
leichtem Druck mit 5ml MACS-Puffer ausgespült und gezählt. Zur Überprüfung der
Aufreinigung CD115-positiver Zellen wurden durchflusszytometrische Analysen durchgeführt.
Ergebnisse
7 Ergebnisse
7.1 Untersuchung der murinen Antikörperantwort gegen die Glykoproteine
von MCMV
In der vorliegenden Arbeit sollte die humorale Immunantwort gegen MCMV charakterisiert
werden. Bisher existieren nur wenige Informationen über die Spezifitäten der Antikörper, die
während einer MCMV-Infektion entstehen. Das MCMV-Genom kodiert für etwa 170 Proteine,
wovon 55 die Merkmale von Glykoproteinen besitzen (Rawlinson et al., 1996). Die humorale
Immunantwort ist u.a. gegen virale Glykoproteine gerichtet. Es sollte im Folgenden ein
umfassendes Bild über die Immunogenität aller viralen Glykoproteine generiert werden, da
diese antigenspezifischen Antikörper unter Umständen an der Kontrolle einer MCMVInfektion beteiligt sind.
7.1.1 Eukaryote Expression MCMV-kodierter Glykoproteine
Für die Analyse der einzelnen Glykoproteine wurden die Vorhersagen der Arbeit von
Rawlinson und Kollegen (1996) herangezogen. 51 der insgesamt 55 erfassten Glykoproteine
wurden in einen eukaryoten Expressionsvektor kloniert und anschließend transient
exprimiert.
Klonierungsstrategie
Die Sequenzen aller von Rawlinson et al. (1996) vorhergesagten Glykoproteine wurden ab
deren Signalpeptid-Schnittstelle entnommen und in den eukaryoten Expressionsvektor
pcUL132sig-HA kloniert. Dieser Vektor war so konzipiert, dass die exprimierten Proteine für
die Translokation in das endoplasmatische Retikulum eine Signalsequenz des HCMVGlykoproteins UL132 besaßen und zur Detektion mit einem N-terminalen Hämagglutinin
(HA)-Epitop markiert waren. Eine Ausnahme stellte das Protein M55, gB, dar, das in voller
Länge und ohne zusätzliche Sequenzen in den pcDNA3.1-Vektor kloniert wurde
(durchgeführt von B. Kropff). Bei den zu analysierenden MCMV-Glykoproteinen handelte es
sich vorwiegend um Transmembranproteine vom Typ I, so dass der N-Terminus des
Proteins an der Oberfläche der Plasmamembran nachweisbar sein sollte.
Zur Vorhersage der Transmembrandomänen bzw. -Helices der MCMV-Glykoproteine wurde
der TMHMM Server v. 2.0. des CBS (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) verwendet (Abb.
7.1 A). Die Analyse der möglichen Signalpeptid-Schnittstellen erfolgte mit Hilfe des SignalP
3.0 Servers des CBS (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/). Signalsequenzen weisen drei
unterschiedliche Bereiche auf: 1. die N-terminal lokalisierte, positiv geladene Region (nRegion), 2. die zentrale, hydrophobe Region (c-Region), 3. die C-terminal gelegene,
hydrophile Region (h-Region) (Paetzel et al., 2002). SignalP 3.0 macht Vorhersagen über
53
54
Ergebnisse
diese drei Regionen und gibt, falls im jeweiligen Protein vorhanden, die mutmaßliche
Spaltstelle an (Abb. 7.1 B). Ergaben die eben genannten Programme keine eindeutige
Aussage zur Lokalisation der Transmembranbereiche und zur Schnittstelle des untersuchten
MCMV-Glykoproteins, wurde dieses in voller Länge in den pcDNA3.1.HAMHB-Vektor
kloniert, der ebenfalls für ein N-terminales HA-Epitop kodiert. Insgesamt wurden 51 DNASequenzen der MCMV-spezifischen Glykoproteine in den Expressionsvektor inseriert, die
weiter auf ihre zelluläre Expression überprüft werden sollten.
(A)
(B)
Abb. 7.1: Computer-basierte Vorhersage der Transmembranregionen und Signalpeptid-Schnittstelle am
Beispiel von m04
(A) Ergebnis von TMHMM. Die y-Achse gibt die jeweilige Wahrscheinlichkeit der vorhergesagten
Transmembrandomäne des untersuchten Proteins an. Die errechneten Transmembrandomänen sind rot
dargestellt. Die dicke blaue Linie gibt die Proteinbereiche an, die sich in Bezug auf die Plasmamembran innen
befinden, die dicke rosa Linie gibt die Bereiche an, die außerhalb liegen.
(B) Ergebnis von SignalP. Die y-Achse gibt die jeweilige Wahrscheinlichkeit der vorhergesagten Schnittstelle in
der Signalsequenz des untersuchten Proteins an. Die rote Linie gibt die Wahrscheinlichkeit für die Spaltstelle an,
die grüne Linie die Wahrscheinlichkeit der n-Region, die dunkelblaue Linie die der h-Region und die hellblaue
Linie die der c-Region.
Analyse der zellulären Expression der MCMV-Glykoproteine mittels Transfektion
Zunächst wurden die Oberflächenexpression und die intrazelluläre Lokalisation der
klonierten Proteine analysiert. Hierzu wurden die generierten Expressionsplasmide in Cos7Zellen transfiziert und die Expression mittels indirekter Immunfluoreszenz über das Nterminal vorliegende HA-Epitop nachgewiesen (Abb. 7.2). Das Protein M55 wurde nach der
Transfektion
mit
einem
gegen
gB
gerichteten,
monoklonalen
Antikörper
(97.3)
nachgewiesen. Insgesamt 50 der 51 transfizierten Plasmide zeigten eine intrazelluläre
Expression des jeweiligen Proteins (Tab. 7.1). Nur das Protein m104 konnte weder auf der
Oberfläche noch intrazellulär nachgewiesen werden. Bei 35 Proteinen war ein deutlicher
Nachweis der Expression auf der Zelloberfläche möglich. Die positiv getesteten
Glykoproteine wurden anschließend für weitere immunologische Analysen eingesetzt.
Ergebnisse
(A) intrazellulär
(B) Oberfläche
Abb. 7.2: Zelluläre Lokalisation von ausgewählten MCMV-Glykoproteinen
(A+B) Indirekte Immunfluoreszenz von Cos7-Zellen nach Transfektion der entsprechenden Plasmid-DNA der
oben gezeigten Glykoproteine. Als Positivkontrolle diente das transient exprimierte UL132 Protein von HCMV, als
Negativkontrolle ein transfizierter Leervektor (mock). Der Nachweis der Expression erfolgte über einen anti-HAAntikörper. M55 wurde mit dem monoklonalen Antikörper 97.3 detektiert. Die Visualisierung erfolgte über einen
FITC-gekoppelten Ziege-anti-Maus-Sekundärantikörper. Zellkerne wurden mit dem blau fluoreszierenden DNAFarbstoff DAPI gefärbt. (A) intrazelluläre Färbung permeabilisierter Zellen, (B) Oberflächenfärbung;
55
56
Ergebnisse
Tab. 7.1: Übersicht über die zelluläre Lokalisation aller exprimierten MCMV-Glykoproteine
MCMV gps
intrazellulär
Oberfläche
MCMV gps
intrazellulär
m02
m119.1*
m03
m121
m04
m137*
m05
m138*
m06
m144
m07
m145
m08
m146
m147*
m09
m150
m10
m151
m11
m12
m152*
m13
m153*
m14
m154*
m15
m155*
m16
m157
m17
m158*
m42
m159*
M55*
m160
M73*
m161*
M74*
m162
M75*
m163
m90
m164
M100
m165
m104
m166
M115*
m167
M116
MCMV gps: MCMV-Glykoproteine, auf intrazelluläre und Oberflächenexpression analysiert;
dunkelgraue Felder: positiv getestete Expression; weiße Felder: keine Expression detektiert;
M: Homologie zum entsprechenden HCMV-Protein bekannt; m: keine Homologie bekannt;
kursiv dick: als Strukturprotein von Kattenhorn et al. (2004) identifiziert
* : Klonierung und Charakterisierung in Zusammenarbeit mit B. Kropff und F. Sprater
Oberfläche
Ergebnisse
7.1.2 Immunogenität MCMV-kodierter Glykoproteine
Zur weiteren Identifizierung der Spezifitäten der gegen die unterschiedlichen MCMVGlykoproteine gerichteten Antikörper sollten Seren von zwei Gruppen verglichen werden:
Serum von MCMV-infizierten Mäusen und von MCMV-immunisierten Tieren.
Herstellung polyklonaler Mausseren
Immunkompetente Mäuse wurden mit MCMV infiziert oder mit UV-inaktivierten, zur
Replikation unfähigen MCMV-Partikeln immunisiert (Abb. 7.3). Als Donoren wurden CD8-/-Mäuse gewählt, da diese gegenüber den Wildtypmäusen eine stärkere humorale
Immunantwort
gegen
MCMV
herbeiführen
können
(Dissertation
Monika
Dietz,
http://opus4.kobv.de/opus4-fau/files/2437/Monika_Dietz_Dissertation.pdf).
Eine Immunisierung induziert vorwiegend Antikörper gegen virale Strukturproteine. Bei einer
Infektion werden Antikörper gebildet, die neben den Strukturproteinen auch nicht-strukturelle
virale Antigene auf der Oberfläche infizierter Zellen binden können.
UV-inaktiviertes MCMV
MCMV
3-malige
Immunisierung
einmalige
Infektion
CD8-/-
CD8-/-
>12 Wochen p.a.:
Serumgewinnung
Abb. 7.3: Herstellung polyklonaler Serumantikörper
-/-
Eine Gruppe von CD8 -Mäusen wurde in einem Abstand von 4 Wochen insgesamt 3x mit UV-inaktivierten
MCMV-Partikeln (5µg/ 5µg/ 2µg pro Maus) intraperitoneal (i.p.) immunisiert. Die zweite Gruppe von Mäusen
6
wurde einmalig mit 1x10 PFU MCMV i.p. infiziert. Mindestens 12 Wochen nach der letzten viralen Applikation
(p.a.) wurden die Tiere geblutet und Serum gewonnen.
Analyse der Immunogenität der viral kodierten Glykoproteine
Die Seren der zwei Mausgruppen wurden auf ihre Erkennung unterschiedlicher MCMVAntigene hin getestet. Für die immunologischen Analysen wurden die Methoden ELISA und
indirekte Immunfluoreszenz eingesetzt. Mittels ELISA wurden die Seren zunächst auf eine
57
58
Ergebnisse
Antikörperantwort gegen MCMV getestet. Hierbei dienten MCMV-infizierte Zelllysate als
Antigen. Das Ergebnis dieser Analysen zeigte, dass alle Seren Antikörper gegen virale
Antigene enthielten (Daten nicht gezeigt).
Für die Analysen mittels Immunfluoreszenz wurden alle 34 rekombinanten Glykoproteine von
MCMV eingesetzt, die auf der Oberfläche transfizierter Zellen nachgewiesen wurden (Tab.
7.1). Diese wurden in Cos7-Zellen transient exprimiert und anschließend in der
Immunfluoreszenz auf ihre Erkennung mit den zu testenden Seren hin untersucht. Für
HCMV ist bekannt, dass die Proteine UL73 (gN) und UL100 (gM) (Mach et al., 2000) bzw.
UL75 (gH) und UL115 (gL) (Kaye et al., 1992) als Komplex auf der Oberfläche exprimiert
werden und eine antivirale Antikörperantwort hervorrufen. Daher wurden für MCMV
zusätzlich die entsprechenden Homologen M73 und M100 bzw. M75 und M115 kotransfiziert
und ebenfalls auf Erkennung durch immune Seren getestet. Darüber hinaus gingen ebenfalls
die MCMV-Proteine m60 und m73.5 in unsere Analysen mit ein. Bei diesen Antigenen
handelt es sich um Strukturproteine, die durch alternatives Spleissen entstehen und deren
Expressionsplasmide uns freundlicherweise von A.A.Scalzo (Universität Western Australia,
Nedlands, Australien) zur Verfügung gestellt wurden. Bei der Immunfluoreszenz wurden die
Seren
1:100
verdünnt
und
mit
einem
mausspezifischen,
Farbstoff-gekoppelten
Sekundärantikörper nachgewiesen (Tab. 7.2). Als Negativ-Kontrolle wurde ein Serumpool
aus
naiven
CD8-/--Mäusen
mitgeführt,
um
eine
unspezifische
Bindung
mit
den
Glykoproteinen auszuschließen.
Die Untersuchung der Seren aus infizierten Mäusen zeigte, dass 15 der insgesamt 39
getesteten Glykoproteine von den einzelnen Seren auf der Oberfläche erkannt wurden (Abb.
7.4 und Tab. 7.2; blaue Markierung). Auffallend immunogen (mind. 50% aller getesteten
Seren waren positiv auf der Oberfläche) schienen die Proteine m02, m04, m07, m08, m14,
gB (M55), gH/gL (M75/M115) zu sein.
Die Analyse der Seren aus immunisierten Tieren (Tab. 7.2; lila Markierung) zeigte dagegen,
dass nur acht der auf der Oberfläche exprimierten Proteine (m07, m10, gB, m60, gH, m159,
m160, gH/gL) erkannt wurden, wobei die Proteine m07, gB und gH/gL mit über 50% positiv
getesteten Seren eine höhere Immunogenität in diesem Testsystem aufwiesen. Da es sich
bei m60 (Scalzo et al., 2004), gB und gH/gL um bekannte Strukturproteine handelt, ist die
hohe Erkennungsrate durch Seren aus immunisierten Mäusen gut nachvollziehbar. Im
humanen System werden außerdem die Strukturproteine gB und gH/gL als stark immunogen
beschrieben (Britt et al., 1990; Kaye et al., 1992), was sich für die entsprechenden
homologen Proteine des murinen CMV ebenfalls bestätigen lässt. Das strukturelle Protein
m02 (Kattenhorn et al., 2004) wurde nur von Seren infizierter Tiere erkannt und induzierte
nach einer Immunisierung mit Viruspartikeln keine Antikörperantwort.
Ergebnisse
Das Protein m138 wurde sowohl durch immunes als auch naives Serum erkannt (Bilder nicht
gezeigt). Da es sich bei m138 um einen viralen Fc-Rezeptor handelt (Thäle et al., 1995), ist
die Detektion dieses Proteins durch unspezifische Antikörper ebenfalls verständlich.
Abb. 7.4: Nachweis von Antikörpern gegen die MCMV-Glykoproteine aus Seren von infizierten Tieren
Indirekte Immunfluoreszenz der Expression ausgewählter MCMV-Glykoproteine nach Transfektion von Cos7Zellen mit der entsprechenden Plasmid-DNA. Dargestellt ist die Oberflächenfärbung mit vier (S1-S4) von
insgesamt 15 getesteten Seren. Als Negativ-Kontrolle wurde naives Serum bei der Färbung eingesetzt. Der
Nachweis der gebundenen Mausantikörper (Verdünnung der Seren 1:100) erfolgte durch einen FITC-gekoppelten
Ziege-anti-Maus-Sekundärantikörper. Zellkerne wurden mit dem blau fluoreszierenden DNA-Farbstoff DAPI
gefärbt.
Zusammenfassend kann man sagen, dass sich, entsprechend der Theorie, nach einer
Immunisierung ein Antikörperrepertoire vorwiegend gegen strukturelle Antigene entwickelt.
Eine Infektion scheint Antikörper gegen eine größere Anzahl an Glykoproteinen zu
induzieren, die sowohl auf der viralen Hülle verankert als auch nicht-struktureller Natur sind.
Unter den immunogenen Glykoproteinen befinden sich auch Proteine, die in der Literatur
noch nicht charakterisiert sind, wie z.B. das Protein m07, m08 oder m14. Da das Protein
m07 sowohl von Seren infizierter als auch immunisierter Tiere erkannt wird, könnte es sich
dabei um ein noch nicht charakterisiertes Strukturprotein von MCMV handeln.
59
60
Ergebnisse
Tab. 7.2: Immunogenität von MCMV-Glykoproteinen (MCMV gps)
MCMV gps
m02
m03
m04
m05
m06
m07
m08
m09
m10
m11
m12
m14
m15
m17
M55 (gB)
m60
M73 (gN)
m73.5
M74 (gO)
M75 (gH)
m90
M100 (gM)
M115 (gL)
m138
m144
m145
m146
m151
m153
m155
m157
m158
m159
m160
m162
m163
m167
M73/100
M75/115
MCMV infiziert
n=10 (*n=15; **n=7)
i
O
10/10
8/10
2/10
1/10
10/10
8/10
0/10
0/10
10/10
0/10
10/10
8/10
9/10
6/10
1/10
0/10
1/10
0/10
2/10
1/10
0/10
0/10
9/10
7/10
4/10
4/10
0/10
0/10
7/10
5/10
7/10
0/10
5/10
0/10
*8/15
*5/15
10/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
*14/15
*5/15
1/10
0/10
0/10
0/10
1/10
0/10
1/10
0/10
*4/15
*4/15
*0/15
*0/15
**3/7
n.d.
*2/15
*2/15
*7/15
*6/15
4/10
1/10
0/10
0/10
9/10
0/10
3/10
0/10
0/10
0/10
10/10
9/10
MCMV immunisiert
n=6
i
O
4/6
0/6
0/6
0/6
2/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
3/6
3/6
0/6
0/6
0/6
0/6
1/6
1/6
0/6
0/6
0/6
0/6
6/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
5/6
5/6
4/6
2/6
1/6
0/6
3/6
0/6
1/6
0/6
1/6
1/6
0/6
0/6
2/6
0/6
2/6
0/6
6/6
0/6
0/6
0/6
1/6
0/6
2/6
0/6
1/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
n.d.
n.d.
0/6
0/6
3/6
1/6
3/6
1/6
0/6
0/6
6/6
0/6
2/6
0/6
1/6
0/6
6/6
4/6
Seren nach Infektion (blau), nach
Immunisierung (lila).
i= intrazelluläre Färbung;
O= Oberflächenfärbung;
n= Anzahl der getesteten Seren.
kursiv: in der Literatur beschriebene,
mCMV-assoziierte Strukturproteine
(Kattenhorn et al.,2004; Scalzo et al.,
2004)
Aufgrund ihrer hohen Erkennungsrate durch die Serumantikörper infizierter Mäuse eigneten
sich die Proteine m07 und m08 als Antigen für die Herstellung monoklonaler Antikörper.
DNA-Vakzinierungsversuche mit den hergestellten Expressionsplasmiden für m07 und m08
induzierten keine bzw. nur eine schwache Antikörperantwort (Daten nicht gezeigt). Die
Herstellung monoklonaler m07- bzw. m08- Antikörper war mit Hilfe der Hybridomtechnik
bisher ebenfalls nicht erfolgreich.
Ergebnisse
7.2 Charakterisierung von MCMV-spezifischen Serumpools
Im Gegensatz zu den Versuchen in 7.1.2. wurden für die weiteren Experimente Serumpools
verwendet. Diese wurden aus Seren infizierter (Pool inf.) bzw. immunisierter Tiere (Pool
imm.) hergestellt (Abb. 7.3). Beide Serumpools wurden hinsichtlich einer unterschiedlichen
Antigenerkennung
und
ihrer
IgG-Subklassenzusammensetzung
charakterisiert.
Des
Weiteren wurde die biologische Aktivität eines Serumpools gegen MCMV sowohl in vitro als
auch im lebenden Mausorganismus geprüft.
7.2.1 Erkennung von MCMV-Antigenen
Zur Analyse der MCMV-spezifischen Antikörper wurden in einem konventionellen ELISA
MCMV-Virionen bzw. Lysate MCMV-infizierter MEFs als Antigen verwendet.
(A)
(B)
Abb. 7.5: Nachweis von MCMV-spezifischem IgG im Serumpool
mittels ELISA
(A+B)
Getestet
wurde
der
Serumpool
infizierter
(●)
bzw.
immunisierter (■) Tiere. Als Negativkontrolle diente das Serum
naiver Mäuse (▲). (A) Reaktivität der Seren gegen Lysate infizierter
bzw. naiver MEFs (1µg Protein/ ELISA-Plattenvertiefung).
(B) Reaktivität der Seren gegen Virionen (75ng Protein/ Vertiefung).
Der Nachweis der MCMV-spezifischen IgG-Bindung erfolgte mit
Hilfe
eines
Sekundärantikörpers.
HRP-gekoppelten
Die
dargestellten
Kaninchen-anti-MausErgebnisse
sind
repräsentativ für drei unabhängige ELISA-Tests (n=3).
Die Analysen mit infizierten Zelllysaten (Abb. 7.5 A) zeigten bei beiden Serumpools
vergleichbar hohe IgG-Titer. Offenbar besteht bei beiden Seren auch eine Reaktivität gegen
naive Zelllysate, die jedoch deutlich schwächer ausfällt als gegen die infizierten Lysate.
61
62
Ergebnisse
Daher kann von einer spezifischen Erkennung der Serumantikörper gegen MCMV-Proteine
ausgegangen werden.
Im ELISA mit Virionen als Antigen (Abb. 7.5 B) wiesen beide Serumpools eine ähnliche
Bindungsreaktion auf, wobei der Serumpool imm. tendenziell eine höhere Antikörperbindung
zeigte. In beiden ELISA-Analysen (Abb.7.5 A und B) reagierte das Kontroll-Serum
unbehandelter Mäuse (graue Markierung) nur sehr schwach bis gar nicht, was die
spezifische Erkennung der MCMV-Proteine durch den jeweiligen Serumpool nochmals
bestätigt.
7.2.2 Verteilung der IgG-Subtypen
Mit
Hilfe
der
sog.
Sandwich-ELISA-Technik
Subtypenzusammensetzung
der
Serumpools
(Kap.
6.4.1)
charakterisiert
und
wurde
die
die
IgG-
Konzentration
berechnet. Die Abb. 7.6 zeigt die Verteilung der IgG-Subklassen in den verschiedenen
Seren.
Abb. 7.6: Verteilung der IgG-Subtypen in unterschiedlichen Serumpools
Gezeigt sind die Ergebnisse eines durchgeführten Sandwich-ELISAs. Getestet wurde der Serumpool infizierter
Tiere (infiziert), MCMV-immunisierter (immunisiert) Tiere sowie von naiven Mäusen. Der Nachweis erfolgte über
einen Subtyp-spezifischen, gegen Maus-IgG gerichteten und HRP-gekoppelten Tertiärantikörper (anti-IgG1,
-IgG2a, -IgG2b, -IgG3). Die IgG-Konzentration (µg/ml) wurde über einen mitgeführten Standard des spezifischen
IgG-Subtyps mit einer definierten Konzentration berechnet. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für
drei unabhängige ELISA-Tests (n=3).
Das Serum naiver Mäuse enthielt alle IgG-Subtypen von etwa gleicher Konzentration (100300µg/ml). Eine virale Infektion oder Immunisierung erhöhte den Titer der Subtypen
signifikant gegenüber dem einer naiven Maus. IgG2c schien dabei die dominante Subklasse
zu sein, die nach einer Immunisierung stärker induziert wurde als nach einer Infektion. Die
IgG1-Antwort war nach einer Immunisierung ebenfalls stärker als nach einer Infektion,
Ergebnisse
obwohl der Unterschied nicht signifikant war. IgG2b und IgG3 zeigten nach Infektion und
Immunisierung keinen wesentlichen Unterschied in ihrer Konzentration untereinander.
Zusammenfassend ergibt sich nach einer Immunisierung die folgende Hierarchie der
Subtypen: IgG2c>>IgG1>IgG2b>IgG3. Das Subklassenprofil nach einer Infektion zeichnet
sich durch IgG2c>>IgG1=Ig2b=IgG3 aus.
7.2.3 Neutralisationskapazität der Serumpools
Neutralisationsaktivität der polyvalenten Serumantikörper bei unterschiedlichen
Zielzellen
Für HCMV gibt es in der Literatur bereits Hinweise, dass sich die in vitroNeutralisationskapazität von spezifischen Antikörpern gegen eine HCMV-Infektion zwischen
verschiedenen Zelltypen stark unterscheiden kann (Gerna et al., 2008). Dieser Befund lässt
sich vermutlich auf die unterschiedlichen Penetrationsmechanismen in verschiedenen
Zielzellen durch HCMV zurückführen (Hahn et al., 2004; Gerna et al., 2005; Wang & Shenk,
2005). Bei einer MCMV-Infektion wurde diese Beobachtung bisher nicht beschrieben. Aus
diesem Grund wurde der in vitro-Neutralisationstest (Kap. 6.4.3) auf unterschiedlichen, aus
der Maus stammenden Zelltypen durchgeführt, wie den Stromazellen (ST-2), embryonalen
Fibroblasten (MEF), Endothelzellen (mIEND) und einer murinen Fibroblastenzelllinie (M2).
Als Virusstamm wurde ein rekombinantes MCMV (MCMV∆m157luc) verwendet, das ein
Luziferase-Reportergen im Genom integriert hat. Das Luziferase-Gen steht unter der
Kontrolle des HCMV-MIE-Promotors und ermöglicht durch die zelluläre Expression der
Luziferase den Nachweis MCMV∆m157luc-infizierter Zellen (Klenovsek et al., 2007). Da die
Infektiösität des Virus bei den unterschiedlichen Zelltypen divergent sein kann, wurden
zunächst Infektionsanalysen durchgeführt und anhand der Ergebnisse ein Infektionsprotokoll
für die Neutralisationstests erarbeitet. Die Verdünnung der Serumpools wurde im Serum
naiver Rag1-/--Mäuse vorgenommen, das unbehandelt war und somit murines Komplement
enthielt. Da Rag1-/--Tiere über keine T- und B-Zellen verfügen, konnte bei diesem Serum ein
Einfluss von unspezifischen und natürlichen Immunglobulinen bei der antiviralen Aktivität
ausgeschlossen werden. Nach der Verdünnung des jeweiligen Serums wurde das Virus
zugegeben und das Antikörpergemisch des Serums mit dem Virus für eine Stunde inkubiert
und anschließend für vier Stunden auf die Zielzellen gegeben. Nach einem Mediumwechsel
wurden die Zellen nach weiteren 20 Stunden geerntet und lysiert. Die Infektionsrate wurde
über
die
Detektion
von
Biolumineszenzen
gemessen
und
darüber
die
Neutralisationskapazität in % berechnet (Abb. 7.7).
Bei den ST-2-Zellen (Abb. 7.7 A) inhibieren die Antikörper des Serums aus infizierten
Donoren die Infektion etwa zwei Titrationsstufen besser als die Antikörper aus immunisierten
Tieren (Tab. 7.3). Bei embryonalen Fibroblasten (Abb. 7.7 B) neutralisieren die
Serumantikörper immunisierter Mäuse etwa eine Titrationsstufe besser als die Antikörper
63
64
Ergebnisse
nach einer Infektion. In murinen Endothelzellen wie in der Fibroblastenzelllinie zeigten beide
Serumpools vergleichbare Neutralisationskapazitäten (Abb. 7.7 C-D). Die Ergebnisse dieser
Tests deuten darauf hin, dass die Neutralisationsaktivität der beiden zu vergleichenden
Serumpools in vitro zelltypspezifisch ist.
(A)
(B)
(C)
(D)
-/-
Abb. 7.7: Neutralisationskapazität des Serums aus infizierten bzw. immunisierten CD8 -Mäusen
Die Neutralisationskapazität der murinen Serumpools gegen MCMV wurde auf (A) Stromazellen (ST-2), (B)
embryonalen Mausfibroblasten (MEF), (C) Endothelzellen (mIEND) und (D) einer murinen Fibroblastenzelllinie
(M2) bestimmt. Die Messung erfolgte über die Detektion von Biolumineszenzen und wurde anschließend in %Neutralisation umgerechnet. (A-D) (■): Serumpool nach Immunisierung; (●): Serumpool nach Infektion;
gestrichelte Linie gibt die 50%-Neutralisationsgrenze an. Markiert ist zusätzlich der Schnittpunkt (vertikale Linien)
der 50%-Neutralisationsgrenze der jeweiligen Serumkurve. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Fehlerbalken der in
Duplikaten angelegten Serumproben. Die Abbildungen entsprechen einem repräsentativen Ergebnis mehrfach
unabhängig voneinander durchgeführter Tests.
Ergebnisse
Tab. 7.3: Durchschnittliche 50%-Neutralisation der immunen Serumpools auf unterschiedlichen Zelltypen
ST-2
n=4
MEF
n=2
mIEND
n=3
M2
n=1
Serumpool inf.
1:4000
1:1000
1:1000
1:700
Serumpool imm.
1:1500
1:2000
1:2000
1:850
n= Anzahl der unabhängig voneinander durchgeführten Tests.
Einfluss des Komplementsystems auf die Neutralisationsaktivität vom immunen
Serum in vitro
Vertreter der Familie der Herpesviren wie z.B.: HSV-1 und HSV-2 (McNearney et al., 1987),
EBV (Mold et al., 1988), aber auch HCMV und MCMV (Spiller et al., 1997; Nomura et al.,
2002) haben im Laufe der Evolution Mechanismen entwickelt, mit denen man das
Komplementsystem regulieren kann. Dies ermöglicht dem Virus, latent oder persistent mit
dem Wirtsorganismus zu koexistieren. Zahlreiche Arbeiten haben ebenfalls postuliert, dass
durch die Zugabe von exogenem Komplement oder durch das intrinsische Komplement per
se die virale Neutralisation durch Antikörper in vitro verstärkt wird (Rundell & Betts, 1982;
Lewis et al., 1986; Britt et al., 1988). Der Einfluss von Komplement auf die
Neutralisationsaktivität von anti-MCMV IgG ist bisher kaum untersucht. Und obwohl die in
vitro-Daten keine Rückschlüsse auf die Pathogenese von MCMV in vivo erlauben, geben sie
einen guten Hinweis auf einen möglichen Wirkmechanismus der Antikörper-vermittelten
Komplementfunktion im lebenden Organismus. Zur Untersuchung eines durch das
Komplement
verstärkten
Neutralisationseffektes
der
murinen,
MCMV-spezifischen
Serumpools, wurden Neutralisationstests in der Zellkultur durchgeführt (Abb. 7.8).
Als Verdünnungsmedium für die zu analysierenden Mausseren wurde Serum naiver Rag1-/-Mäuse verwendet. Das Rag1-/--Serum enthält murines Komplement in Mengen, die denen im
Mausorganismus
entsprechen.
Durch
Hitzeinaktivierung
wurde
das
intrinsische
Serumkomplement deaktiviert.
Die Ergebnisse der Tests zeigten deutlich, dass das Vorhandensein von Komplement die
Neutralisationsaktivität der polyvalenten Serumantikörper des Pools inf. und des Pools imm.
um ein Vielfaches verbessert (zusammengefasst in Tab. 7.4). Als Kontrolle für die antivirale
Aktivität der immunen Serumantikörper wurden Seren naiver CD8-/--Mäuse in die Tests mit
einbezogen. Die Seren besitzen in diesen Testansätzen kaum oder keine messbare
Neutralisationsaktivität gegenüber MCMV.
Zusammenfassend kann man sagen, dass das Komplementsystem für die antivirale Wirkung
von Antikörpern, zumindest in vitro, eine große Rolle spielt. Jedoch können diese Ergebnisse
nicht auf die in vivo-Situation übertragen werden, so dass weitere Untersuchungen direkt am
Mausmodell durchgeführt wurden.
65
66
Ergebnisse
Abb. 7.8: Einfluss von Komplement auf die Neutralisationsaktivität in vitro
Die Neutralisationskapazität der murinen Serumpools gegen MCMV wurde auf ST-2-Zellen analysiert. Als
Verdünnungsmedium für den zu testenden Serumpool inf. (●), Serumpool imm. (■) sowie das Kontroll-Serumpool
-/-
-/-
naiver CD8 -Mäuse (▼) wurde das Serum naiver Rag1 -Mäuse eingesetzt. Das Serum enthält physiologische
Mengen an Komplement (+Komplement). Zur Inaktivierung des Komplements wurde das Serum 30min bei 56°C
inkubiert (-Komplement). Die Messung erfolgte über die Detektion von Biolumineszenzen und wurde
anschließend in %-Neutralisation umgerechnet. Gestrichelte Linie: 50%-Neutralisationsgrenze. Markiert ist
zusätzlich der Schnittpunkt (vertikale Linien) der 50%-Neutralisationsgrenze der jeweiligen Serumkurve. Gezeigt
sind die Mittelwerte mit Fehlerbalken der in Duplikaten angelegten Serumproben. Die Abbildungen entsprechen
einem repräsentativen Ergebnis zweier unabhängig voneinander durchgeführter Neutralisationstests (n=2).
Tab. 7.4: Übersicht über die Neutralisationskapazitäten der immunen Seren mit und ohne Komplement
+
-
Faktor (n)
Serumpool inf.
~1:5200
~1:700
7,4
Serumpool imm.
~1:1500
~1:500
3
Gezeigt ist die ungefähre Verdünnungsstufe des jeweiligen immunen Serums, die für die 50%ige Neutralisation
von MCMV notwendig ist;
+ = mit Komplement; - = ohne Komplement; Faktor (n) = n-fache Verbesserung der 50%- Neutralisationsaktivität
durch das Komplement;
7.2.4 Testung des Serumpools infizierter Donoren in vivo
In der Arbeit von Klenovsek et al. (2007) wurde gezeigt, dass Serum von MCMV-infizierten
Donor-Mäusen einen Schutz in immundefizienten Rag1-/--Mäusen vor einer letalen MCMVInfektion bewirken kann. In den Versuchen dieser Publikation wurde das Serum mit 250µl
pro Maus eingesetzt. Für die folgenden Mausexperimente war es interessant, die minimale
Menge an immunem Serum infizierter Mäuse zu bestimmen, die für einen ausreichenden
Schutz nach einer MCMV-Infektion sorgt. Hierfür wurden Rag1-/--Tiere mit 1x105 PFU des
rekombinanten MCMV∆m157luc infiziert. Der Infektionsverlauf wurde mit Hilfe des in vivoImagings dokumentiert. Drei Tage nach Infektion wurden die Mäuse mit immunem
Serumpool behandelt. Für die Bestimmung der Minimalmenge wurden unterschiedliche
Ergebnisse
Serummengen intraperitoneal (i.p.) appliziert und die Schutzwirkung mittels in vivoBiolumineszenzen an Tag 7 und 10 nach Serumgabe bestimmt (Abb. 7.9).
Bei einer Applikation von 200µl Serum sind an Tag 7 und 10 nach IgG-Gabe keine bis kaum
Biolumineszenz-Signale zu erkennen. Dies bedeutet, dass diese Dosis den Schutz nach der
Infektion gewährleisten konnte. Nach einer Gabe von 70 bzw. 100µl Serum sind im in vivoImaging nur schwache Signale zu detektieren. Diese Dosis scheint ebenfalls ausreichend,
um eine progressive Virusdissemination zu inhibieren. Alle darunter liegenden, applizierten
Serummengen reichten für eine Kontrolle der Virusausbreitung nicht mehr aus, was die
starken Biolumineszenz-Signale deutlich zeigen. Die Verteilung der Biolumineszenz-Signale
der nicht therapierten Kontrollmaus (PBS) war charakteristisch für eine systemische MCMVInfektion eines immundefizienten Wirtes. Für alle weiteren in vivo-Experimente dieser
vorliegenden Arbeit wurde daher mit einer Serumdosis von 100µl pro Maus gearbeitet.
Abb. 7.9: In vivo-Biolumineszenzen des Infektionsverlaufs nach Gabe unterschiedlicher Mengen des
Serumpool inf.
-/-
5
Rag1 -Tiere wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Mäuse mit
unterschiedlichen Serummengen behandelt (n=2) und der Infektionsverlauf an Tag 7 und 10 via in vivo -Imaging
kontrolliert. Als Kontrolle diente ein infiziertes und nur mit PBS behandeltes Tier. Die in vivo-Imaging Bilder stellen
die relativen Intensitäten des transmittierten Lichts in Falschfarben dar und sind über die entsprechenden
Hellfeldaufnahmen gelegt. Die Falschfarbenskala zeigt die Korrelation zwischen relativem Photonenflux jeder
Mausaufnahme und Viruslast.
67
68
Ergebnisse
7.3 Rolle der Neutralisation durch MCMV-spezifische Antikörper in vivo
Im Folgenden wurde am MCMV-Infektionsmodell getestet, ob das Antikörperrepertoire nach
einer Immunisierung den gleichen Schutzeffekt in vivo erzielt wie nach einer Infektion.
7.3.1 Vergleich des Schutzes nach Therapie mit polyklonalem Serum aus infizierten
und immunisierten Donoren gleicher in vitro-Neutralisationskapazität
Nach
einer
Immunisierung
mit
inaktivierten
Viren
werden
Antikörperspezifitäten
hauptsächlich gegen strukturelle Proteine induziert, die sowohl neutralisierend als auch nicht
neutralisierend
wirken
können.
Nach
einer
Infektion
werden
zusätzlich
zu
den
Strukturproteinen der Virushülle auch Immunglobuline gegen virale Proteine hergestellt, die
auf der Oberfläche von infizierten Zellen exponiert werden. Diese nicht-strukturellen
Glykoproteine rufen Antikörper hervor, die ausschließlich nicht-neutralisierend sind. Zum
Vergleich der schützenden Wirkung des Antikörperrepertoires nach Immunisierung und nach
Infektion wurde zuerst in den bereits beschriebenen Neutralisationstests (Abb. 7.7, Tab. 7.3;
ST-2-Zellen) die Neutralisationskapazität beider Serumpools auf eine gleiche 50%Neutralisationsaktivität normiert. Seren nach einer Immunisierung erreichten im Durchschnitt
eine 50%-Neutralisation bei einer Verdünnung von ca. 1:1500. Die Seren nach einer
Infektion erzielten diese bei einer durchschnittlichen Verdünnungsstufe von ca. 1:4000. So
wurde insgesamt ein Unterschied von etwa einer Titrationsstufe zwischen beiden
Serumpools angenommen. Für den Serumpool inf. wurde bereits eine Minimaldosis von
100µl (Kap. 7.2.4) festgestellt, die in vivo einen Schutz vor einer MCMV-Infektion bewirken
kann. Um die gleiche neutralisierende Wirkung, die in vitro gemessen wurde, im folgenden
Tierexperiment sicherzustellen, wurde von dem Serum aus immunisierten Tieren die
doppelte Dosis, nämlich 200µl, eingesetzt.
Ergebnisse
In vivo- Schutz durch immunes Serum infizierter und immunisierter Donoren
Die Untersuchung der Schutzwirkung beider Serumpools in der Maus wurde nach dem
0
3
p.i.
7
p.IgG
10
p.IgG
Organentnahme
+ Bestimmung
der Viruslast
in vivo Imaging
in vivo Imaging
Rezipienten
-/Rag1
IgG-Therapie
+ in vivo Imaging
5
10 PFU
MCMV i.p.
Protokoll, wie in Abb. 7.10 beschrieben, durchgeführt.
14
p.IgG
Tage
Abb. 7.10: Experimentelles Protokoll zur Therapie mit Immunglobulinen
5
Die Rezipienten-Tiere wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc intraperitoneal (i.p.) infiziert. Drei Tage nach
Infektion (p.i.) wurde den Tieren 100µl Serum infizierter Donoren, 200µl Serum immunisierter Tiere bzw. 100µl
naives Serum i.p. verabreicht. Der Infektionsverlauf wurde an Tag 3 nach Infektion (p.i.) sowie Tag 7 und 10 nach
therapeutischer Antikörpergabe (p.IgG) mittels des in vivo-Biolumineszenz-Systems überwacht. An Tag 14 wurde
der Versuch beendet, und es wurden Organe für die Viruslastbestimmung entnommen.
An Tag 3 nach Infektion stellten die in vivo-Biolumineszenzen sicher, dass die Mäuse aller
Gruppen einheitlich infiziert waren (Abb. 7.11 A). Wie bereits mehrmals bestätigt, zeigten die
Mäuse, die den Serumpool inf. erhielten, an Tag 7 und 10 nach Therapie nur schwache bis
keine Signale. Dagegen unterlag die Gruppe, der naives Serum appliziert wurde, einer
progressiven Infektion. Eine Maus der mit naivem Serum behandelten Gruppe musste
zwischen Tag 3 und 7 nach Immunglobulingabe euthanasiert werden, da sie vermutlich an
einem schweren MCMV-Krankheitsverlauf litt. Die Gruppe der mit Serumpool imm.
therapierten Mäuse schien die Infektion etwas schlechter zu kontrollieren als die Gruppe, die
den Serumpool inf. erhielt. Bei der Tiergruppe Serumpool imm. wurden etwas stärkere
Biolumineszenzen gemessen.
Die Bestätigung der Imaging-Daten erfolgte durch die Viruslastbestimmung in den Organen
der Mäuse (Abb. 7.11 B). Hierfür wurden zwei Wochen nach Therapie die Tiere getötet und
Lunge, Milz, Leber, Niere und Speicheldrüsen entnommen. Die anschließend hergestellten
Organhomogenate wurden danach in einem Testverfahren, wie in Kap. 6.5.5. beschrieben,
auf ihre Luziferase-Aktivität hin analysiert.
Die Mäuse, denen der Serumpool infizierter Donoren appliziert wurde, zeigten in allen
Organen eine drastische Verringerung der Viruslast im Vergleich zu der Gruppe von
Mäusen, die naives Serum erhalten hatte. Die Tiere, die mit Serum immunisierter Mäuse
behandelt wurden, wiesen dagegen signifikant höhere Organtiter auf im Vergleich zur
Serumpool inf.-Gruppe. In der Lunge, Milz und den Speicheldrüsen wurde ein Unterschied
von etwa 2-log Stufen, in der Leber und der Niere ein Unterschied von einer 1-log Stufe
69
70
Ergebnisse
gemessen. So schien es, dass die Antikörper immunisierter Tiere eine primäre Virusinfektion
schlechter kontrollierten. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis könnte eine
Beteiligung von nicht-neutralisierenden Antikörpern sein, die gegen virale Glykoproteine auf
der Oberfläche infizierter Zellen gerichtet sind. Um diese Theorie zu überprüfen, wurde im
folgenden Versuch der Schutzeffekt nicht-neutralisierender Antikörper untersucht.
(A)
(B)
● Serumpool imm.
▲ Serumpool inf.
□ naiv
Abb. 7.11: In vivo-Schutz nach Therapie mit Antikörpern aus immunisierten vs. infizierten Mäusen
-/-
5
Rag1 -Tiere (n=5) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Mäuse
mit 100µl Serum infizierter Donoren, 200µl Serum immunisierter Tiere bzw. 100µl naivem Serum i.p. behandelt.
(A) Biolumineszenz-Untersuchung des Infektionsverlaufs wie in Abb. 7.9. beschrieben. (B) Virustiter in den
Organen der Versuchstiere. Gezeigt wird die gemessene Luziferaseaktivität in den Organen der verschiedenen
Mausgruppen (Serumpool imm. (●); Serumpool inf. (▲); naives Serum (□). Die Luziferaseaktivität ist in relativen
Lichteinheiten (RLU) pro 30µg Protein der Organhomogenate angegeben. Die gestrichelte Linie gibt das
Detektionslimit der Luziferaseaktivität an, das durch Messung naiver Mausorgane ermittelt wurde. Statistik: MannWhitney-Test; * p < 0.05, ** p < 0.005, n.s.: nicht signifikant; gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse eines
von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Ergebnisse
7.3.2 Schutzversuch mit therapeutischer Gabe von monoklonalen Antikörpern gegen
die nicht-strukturellen Glykoproteine m04 und m153
Bisher ist die Anzahl der erhältlichen monoklonalen Antikörper gegen MCMV-Glykoproteine,
die auf der Oberfläche infizierter Zellen exprimiert werden, sehr begrenzt. Für das folgende
Experiment wurden von Prof. Dr. S. Jonjić (Universität Rijeka, Kroatien) die monoklonalen
Antikörper anti-m04 und anti-m153 zur Verfügung gestellt, die im experimentellen Ansatz als
Therapeutikum verwendet wurden. Bei m04 und m153 handelt es sich um nicht-strukturelle
MCMV-Glykoproteine, die von infizierten Zellen auf der Oberfläche präsentiert werden. Das
Protein m04 ist ein Immunevasionsprotein, das während der Infektion eine wichtige Rolle
spielt (Kavanagh et al., 2001). Das m153-Protein weist eine ähnliche Struktur und Faltung
wie ein MHC-I-Molekül auf und könnte auch eine Funktion bei der Immunevasion haben
(Mans et al., 2007). Beide Antikörper wirken nicht neutralisierend, was nochmals durch einen
in vitro Neutralisationstest bestätigt wurde (Daten nicht gezeigt).
Immundefiziente Rag1-/--Tiere wurden mit 1x105 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage
später mit den monoklonalen Antikörpern anti-m04 und -m153 in Kombination (250µg pro
Antikörper/Maus) behandelt. Zur Kontrolle wurde sowohl der Serumpool inf. als auch ein
entsprechender nicht MCMV-spezifischer Isotyp (IgG) verabreicht. Der Versuchsverlauf
entsprach dem bereits beschriebenen Protokoll (Abb. 7.10).
Die Biolumineszenz-Bilder (Abb. 7.12 A) von Tag 3 nach Infektion stellten sicher, dass die
Mäuse aller Gruppen einheitlich infiziert waren. Die Therapie mit immunem Serum bewirkte
im weiteren Infektionsverlauf einen schützenden Effekt. Es wurden kaum bis keine
Biolumineszenz-Signale detektiert. Im Gegensatz dazu konnten die mit den monoklonalen
Antikörpern behandelten Mäuse die Infektion nicht kontrollieren, da sie vergleichbar starke
Biolumineszenzen zeigten wie die Tiere aus der IgG Isotyp-Kontrollgruppe.
Mit Hilfe des Luziferasetests wurde der Virustiter der nach Versuchsende entnommenen
Organe bestimmt (Abb. 7.12 B).
Die Kontrollgruppe der Tiere, die den Serumpool inf. erhielt, zeigte eine reduzierte
Virusbeladung, wohingegen die IgG Isotyp-Kontrollen signifikant höhere Titer in allen
Organen aufwiesen. Nach Therapie mit den nicht-neutralisierenden Antikörpern antim04/anti-m153 wurden, verglichen mit der Serumpool-Kontrolle, ebenfalls erhöhte
Luziferasewerte gemessen. Diese waren jedoch in Lunge und Milz signifikant und in der
Leber tendenziell niedriger als in den entsprechenden Organen der unspezifischen IsotypTiergruppe. So schien es, dass die Kombination der beiden Antikörper anti-m04 und antim153 durchaus antivirales Potential besitzen und Einfluss auf den MCMV-Ttiter in
bestimmten Organen nehmen.
71
72
Ergebnisse
(A)
(B)
♦ anti-m04/anti-m153
● Serumpool inf.
□ Isotyp
Abb. 7.12: In vivo-Schutz nach Therapie mit nicht-neutralisierenden, monoklonalen Antikörpern
-/-
5
Rag1 -Tiere (n=5) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Mäuse
jeweils mit 250µg monoklonalen Antikörpern (anti-m04 + anti-m153 in Kombination), 100µl Serumpool inf. bzw.
250µg IgG Isotyp i.p. behandelt. (A) Biolumineszenz-Untersuchung des Infektionsverlaufs (vgl. Abb. 7.9).
(B) Organtiter der Versuchstiere (vgl. Abb. 7.11 B). Gezeigt wird die gemessene Luziferaseaktivität in den
Organen der verschiedenen Mausgruppen (Kombination der monoklonalen Antikörper (♦); Serumpool inf. (●)
Isotyp (□). Die dargestellten Daten entsprechen dem Ergebnis eines durchgeführten Versuchs (n=1).
Ergebnisse
7.4 Rolle des Komplementsystems beim Antikörper-vermittelten Schutz in
vivo
Das Komplementsystem ist ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunantwort und
bildet eine Verbindung zwischen der innaten und adaptiven Immunität. Eine virale Infektion
kann alle drei vorhandenen Komplementkaskaden, den klassischen, den alternativen und
den Lektin-Weg aktivieren (Blue et al., 2004). Bisher fehlte die Untersuchung der Funktion
des Komplementsystems beim Antikörper-vermittelten Schutz während einer MCMVInfektion.
Es gibt Arbeiten, die dem Komplement eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung der
humoralen Immunantwort bei einer viralen Infektion in vivo zuschreiben (Feng et al., 2002;
Cohen et al., 2011). Um die Bedeutung des Komplements bei der Antikörper-vermittelten
Protektion vor einer MCMV-Infektion in der Maus herauszustellen, wurde ein experimentelles
Protokoll zur Depletion des Komplementsystems erarbeitet. Hierbei kam der Cobra Venom
Faktor (CVF) zum Einsatz, der ein Komplement-aktivierendes Protein aus dem Gift der
Kobra-Spezies Naja, Ophiophagus und Hemachatus ist (Vogel et al., 1996). CVF weist eine
funktionelle und strukturelle Analogie zum C3b-Faktor des Komplementsystems auf. Durch
Zugabe von CVF zum Serum erfolgt durch die Aktivierung von Konvertasen ein permanentes
In-Kraft-Treten des alternativen Weges des Komplementsystems. Dies zieht eine weitere
Prozessierung von Komplement-Proteinen nach sich. Die hohe Stabilität der CVFabhängigen C3/C5-Konvertase und die daraus folgende kontinuierliche Proteolyse von C3
und C5 führen zu einer vollständigen Dekomplementierung des Serums abwärts der
Faktoren C3 und C5 (Vogel & Fritzinger, 2010).
In unserem experimentellen Ansatz wurde nach Verabreichung des CVF die vollständige
Dekomplementierung im Mausorganismus mittels einer Komplement-Bindungs-Reaktion im
murinen Serum verifiziert (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurden die Rag1-/--Mäuse mit
1x105 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage später mit immunem Serumpool aus
infizierten Donor-Tieren therapiert. Zwei Wochen nach Serumgabe wurden die Mäuse
getötet und der virale Titer der entnommenen Organe bestimmt (Abb. 7.13). Zu diesem
Zeitpunkt waren bereits zwei Mäuse aus der Gruppe naives Serum + CVF-Gabe wegen
eines schweren Krankheitsverlaufes getötet worden.
Die gemessene Viruslast in den Organen der Mäuse, die mit naivem Serum behandelt
wurden,
unterschied
sich
nicht
von
den
Gruppen
mit
Komplement
bzw.
nach
Komplementdepletion. Die Mäuse litten, entsprechend der gemessenen hohen Virustiter, an
einer progressiven MCMV-Infektion. Die Therapie mit immunem Serum konnte in beiden
Versuchstiergruppen (+/- Komplementdepletion) den Virustiter reduzieren, und es zeigte sich
kein signifikanter Unterschied im Titer zwischen den Mäusen nach bzw. ohne CVFBehandlung. In den Organen Lunge und Leber der mit immunem Serum und CVF
73
74
Ergebnisse
behandelten Mausgruppe wurde ein tendenziell höherer Virustiter gemessen im Vergleich zu
der Immunserum-Gruppe ohne Komplementdepletion. Dies könnte auf eine organspezifische
Wirkung des Komplements hindeuten.
● Serumpool inf. + CVF ○ Serumpool inf.
▲ naiv + CVF
∆ naiv
Abb. 7.13: Einfluss vom Komplement auf die Virusbeladung nach Antikörpertherapie
-/-
Rag1 -Tiere (n=5) wurden einen Tag vor Infektion und anschließend alle 6 Tage mit Cobra Venom Faktor (+CVF;
8Units/ Maus i.p.) behandelt. Den Kontroll-Mäusen (keine CVF- Gabe, n=5) wurde PBS gespritzt. Alle Tiere
5
wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage später mit 100µl Serumpool inf. (●: +CVF; ○: PBS)
oder 100µl naivem Serum (▲: +CVF; ∆: PBS) therapiert. Gezeigt wird die gemessene Luziferaseaktivität wie in
Abb. 7.11 B beschrieben. Statistik: Mann-Whitney-Test; * p < 0.05, ** p < 0.005, n.s.: nicht signifikant; gezeigt
werden die repräsentativen Ergebnisse eines von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Ergebnisse
7.5 Einfluss von Fcγ-Rezeptoren auf den Antikörper-vermittelten Schutz
gegen MCMV
Neben Neutralisation und der Antikörper-vermittelten Komplementaktivierung können
Antikörper auch über Fc-Rezeptor-vermittelte Effektorfunktionen wie z.B. Phagozytose,
ADCC oder CDC agieren. Für die Beseitigung virusinfizierter Zellen sind die aktivierenden,
IgG-bindenden Fcγ-Rezeptoren entscheidend, die auf unterschiedlichen Effektorzellen
hämatopoetischen Ursprungs exprimiert werden. Eine genetische Deaktivierung relevanter
Fcγ- Rezeptoren in Mäusen ermöglicht es, die Rolle der unterschiedlichen murinen FcγRezeptoren in vivo zu untersuchen. Die in den folgenden Versuchen verwendeten FcRezeptor-deletierten C57BL/6-Mäuse wurden uns freundlicherweise von Prof. Dr. F.
Nimmerjahn (Universität Erlangen) zur Verfügung gestellt. Für unseren experimentellen
Versuchsaufbau am Mausmodell war es wichtig, die entsprechenden Fc-RezeptorMausmutanten auf den Rag1-/--Hintergrund zu kreuzen. Damit wurde die notwendige B- und
T-Zelldefizienz in den transgenen Mäusen sichergestellt.
7.5.1 Züchtung von Fcγ-/-x Rag1-/--Mäusen
Zu Beginn wurden Mäuse generiert, bei denen die γ-Kette der Fc-Rezeptoren genetisch
ausgeschaltet war (Fcγ-/-). Die γ-Kette wird von allen aktivierenden Fc-Rezeptoren der Maus
(FcγRI, FcγRIII, FcγRIV) für ihre Expression auf der Oberfläche diverser Zellen benötigt
(Nimmerjahn & Ravetch, 2006). In Fcγ-/--Mäusen ist somit jede Effektorfunktion gestört, die
von aktivierenden Fc-Rezeptoren abhängig ist.
Für die Kreuzung wurden Wildtyp-Fcγ-/--Tiere (C57BL/6) mit Rag1-/--Mäusen (C57BL/6)
verpaart. Die ersten Nachkommen dieser Verpaarung (F1-Generation) waren entsprechend
den Mendel´schen Gesetzen alle heterozygot für das Gen der γ-Kette sowie für das Rag1Gen (Daten nicht gezeigt). Die Genotypisierung der Nachkommen erfolgte mittels PCR mit
den entsprechenden Primern für das Rag1-Gen bzw. für das Gen der γ-Kette. Die
Verpaarung und Züchtung der Tiere verlief über vier Generationen und verlangte die
Genotypisierung von <100 Tieren. Standen ein als homozygot getestetes Männchen und ein
Weibchen zur Verfügung, wurden sie verpaart und ihre Nachkommen wiederholt
genotypisiert (Abb. 7.14). Die Deletion und damit fehlende Expression der Fcγ-Rezeptoren
auf verschiedenen Zellen wurde mit Hilfe von FACS-Analysen bestätigt (Daten nicht gezeigt).
75
76
Ergebnisse
Fcγ-Primer
Rag1-Primer
KO1: Wildtyp C57BL/6
KO2: Rag1-/- (C57BL/6)
KO: Wildtyp C57BL/6
-/-
-/-
Abb. 7.14: Genotypisierung der F5-Generation der Fcγ x Rag1 -Mäuse
Die DNA der neu generierten Mausstämme wurde aus Schwanzbiopsien extrahiert. Aus 5µl DNA-Präparation
wurde eine für Rag1 bzw. Fcγ genotypische PCR angefertigt. 10µl des PCR-Produktes wurden im Agarosegel mit
Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Größe der PCR-Amplifikate wurde auf einem Agarosegel visualisiert. Die
zu erwartenden DNA-Banden des entsprechenden Genotyps wurden über die verwendeten Genotyp-spezifischen
Primer berechnet und mit den PCR-Amplifikaten der Genotypisierung verglichen (Tab. 7.6). Als Kontrolle wurde
TM
die entsprechende DNA von Wildtyp-Mäusen eingesetzt. M: GeneRuler DNA Ladder Mix
Tab. 7.5: Größe der zu erwartenden PCR-Amplifikate für das Rag1- und γ-Kettengen
Genotyp γ-Kette
+/+
+/-/Genotyp Rag1
+/+
+/-/-
Größe der DNA-Fragmente
200 bp
200 / 290 bp
290 bp
Größe der DNA-Fragmente
474 bp
474 / 530 bp
530 bp
bp= Basenpaare;
+/+: Wildtyp homozygot; +/-: heterozygot; -/-: homozygote Deletion
Ergebnisse
7.5.2 Schutz nach therapeutischer Gabe von immunem Serum bei Fcγ-/--Mäusen
In einem ersten experimentellen Ansatz sollte das Schutzpotential polyklonaler Antikörper
aus Seren MCMV-infizierter Mäuse untersucht werden. Hierfür wurde ein therapeutischer
0
3
p.i.
7
p.IgG
10
p.IgG
Organentnahme
+ Bestimmung der
Viruslast
in vivo Imaging
in vivo Imaging
Rezipienten
-/Fcγ
Serumpool inf. Therapie
+ in vivo Imaging
5
10 PFU
MCMV i.p.
Serumtransfer durchgeführt, wie in Abb. 7.15. beschrieben.
14
p.IgG
Tage
Abb. 7.15: Experimentelles Protokoll zur Therapie mit Serum
-/-
-/-
-/-
5
Die Fcγ x Rag1 (Fcγ ) -Rezipienten wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc intraperitoneal (i.p.) infiziert. Drei
Tage nach Infektion (p.i.) wurde den Tieren 100µl Serum infizierter Donoren bzw. 100µl naives Serum i.p.
verabreicht. Der Infektionsverlauf wurde an Tag 3 nach Infektion (p.i.) sowie Tag 7 und 10 nach
Serumantikörpertherapie (p.IgG) mittels des in vivo-Biolumineszenz-Systems überwacht. An Tag 14 wurde der
Versuch beendet und Organe für die Viruslastbestimmung entnommen.
Fcγ-/--Mäuse wurden mit MCMV infiziert und drei Tage später mit immunem Serum aus
infizierten Donormäusen behandelt. Der schützende Effekt während des Versuchverlaufs
wurde mit Hilfe der in vivo-Biolumineszenz kontrolliert (Abb. 7.16). An Tag 3 nach Infektion
wurde im in vivo-Imaging sichergestellt, dass alle Mäuse ähnlich infiziert waren. Ab Tag 7
nach Therapie mit Immunserum wiesen die Fcγ-/--Mäuse höhere Biolumineszenz-Intensitäten
auf als die Wildtyp-Rag1-/- (Fcγ+/+) -Kontrollmäuse. Wie schon mehrmals gezeigt, verlief die
Infektion in den Mausgruppen, die mit naivem Serum therapiert wurden, progressiv. Eine
Fcγ-/--Maus dieser Gruppe wurde aufgrund schwerer pathologischer Symptome vorzeitig
zwischen Tag 7 und 10 euthanasiert.
77
78
Ergebnisse
-/-
Abb. 7.16: In vivo-Imaging von Fcγ -Mäusen vor einer MCMV-Infektion nach Therapie mit polyklonalem
Mausserum aus infizierten Donoren
-/-
+/+
5
Fcγ -Tiere (n=6) und Fcγ -Mäuse (n=5) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage nach
Infektion (p.i.) mit 100µl Serumpool inf. (immun) bzw. Serumpool naiv therapiert. Dargestellt ist die
Biolumineszenz der viralen Dissemination in der Maus. Der Infektionsverlauf wurde an Tag 3 p.i. sowie an Tag 7
-/-
und 10 nach Antikörpergabe (p.IgG) kontrolliert. An Tag 10 p.IgG war bereits eine Fcγ -Maus nach Gabe von
naivem Serum getötet worden.
14 Tage nach Therapie wurden die Tiere getötet und die Virusbeladung in den
entnommenen Organen mit Hilfe des Luziferasetests bestimmt (Abb. 7.17). Zu diesem
Zeitpunkt waren zwei weitere Fcγ-/--Mäuse, denen naives Serum appliziert wurde, wegen
erheblicher Krankheitssymptome getötet worden. Die Fcγ-/--Tiere konnten die Viruslast nach
Gabe von immunem Serum in allen untersuchten Organen vermindern (Abb. 7.17 A). Die
gemessenen RLU-Werte waren im Vergleich zu der Fcγ-/--Gruppe, die unspezifische
Antikörper naiver Mäuse erhielt, signifikant niedriger. Vergleicht man diese Ergebnisse
jedoch mit den Organtitern der Fcγ+/+-Mäuse, ist es offensichtlich, dass Fcγ-/--Mäuse die
virale Dissemination in den Organen nicht vollständig kontrollieren konnten. Allerdings
scheinen die Fcγ-/--Mäuse für eine MCMV-Infektion auch suszeptibler zu sein, da sie ohne
den Schutz Virus-spezifischer Antikörper höhere Viruslasten erreichten als die Fcγ+/+- Mäuse.
Aus diesem Grund wurde das Ausmaß der Reduktion des viralen Titers nach ImmunserumTherapie für beide Rezipientengruppen (Fcγ-/-- und Fcγ+/+-Mäuse) ermittelt (Abb. 7.17 B). Die
Viruslast der entsprechenden Mausgruppe, die den Serumpool naiv erhielt, wurde ins
Verhältnis zu den mit Serumpool inf. behandelten Tieren gesetzt. Das Ergebnis zeigt eine
verminderte Protektion der MCMV-spezifischen Antikörper in den Fcγ-Rezeptor-defizienten
Mäusen nochmals deutlich. In Fcγ+/+-Tieren, die Serum aus infizierten Donoren erhielten,
wurde eine signifikant höhere Reduktion des Virustiters in Lunge, Milz und Speicheldrüsen
ermittelt. In der Leber und Niere wurde kein signifikanter Effekt erzielt. Das Ausmaß der
Reduktion scheint folglich organspezifisch zu sein.
Ergebnisse
Zusammen beweisen diese Resultate, dass die aktivierenden Fcγ-Rezeptoren für den
Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion entscheidend sind.
(A)
-/-
+/+
● Fcγ + Serumpool inf. ○ Fcγ + Serumpool inf.
-/+/+
▲ Fcγ + Serumpool naiv ∆ Fcγ + Serumpool naiv
(B)
-/-
Abb. 7.17: Viruslast in den Organen von Fcγ -Mäusen nach adoptivem Transfer von immunem Serum
-/-
+/+
5
Fcγ -Tiere (n=6) und Kontroll-Mäuse (Fcγ ; n=5) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage
nach Infektion (p.i.) mit Serumpool inf. bzw. naivem Serum (100µl/Maus) behandelt. 14 Tage nach Therapie
wurden die oben genannten Organe entnommen und die daraus hergestellten Homogenate auf ihre
Luziferaseaktivität untersucht. (A) Viruslastbestimmung (wie in Abb. 7.11 B beschrieben). Gezeigt ist die
gemessene Luziferaseaktivität in den Organen der oben angegebenen Mausgruppen. (B) Reduktion der
Virusbeladung nach Transfer von immunem Serum. Der Mittelwert der ermittelten Luziferasewerte in den
-/+/+
Mausorganen (Fcγ bzw. Fcγ ) der Gruppe, die naives Serum erhielt, wurde jeweils ins Verhältnis gesetzt zu
den Werten der entsprechenden Mausgruppe nach Therapie mit dem Serumpool inf.. Der Quotient ergibt die nfache Reduktion des Organtiters nach Behandlung mit MCMV-spezifischen Serumantikörpern. Statistik (A+B):
Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s.: nicht signifikant; gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse
eines von drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
79
80
Ergebnisse
7.5.3 Überleben von Fcγ-/--Mäusen nach Behandlung mit MCMV-spezifischen
Antikörpern
Der Verlauf von Überlebenskurven sollte nochmals die Wichtigkeit von aktivierenden FcRezeptoren
beim
Antikörper-vermittelten
Schutz
belegen.
Hierfür
wurden
zwei
experimentelle Ansätze gewählt: die prophylaktische sowie die therapeutische Behandlung
mit immunem Serum. Die Versuchsmäuse wurden während des gesamten experimentellen
Zeitverlaufs
engmaschig
überwacht
und
im
fortgeschrittenen
Krankheitsstadium
euthanasiert.
Der Transfer des Serumpool inf. erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bei der Therapie
wurde das Serum drei Tage nach Infektion (Abb. 7.18 A) und im prophylaktischen Ansatz
wurden die Serumantikörper einen Tag vor Infektion (Abb. 7.18 B) intraperitoneal den
Rezipiententieren verabreicht.
Die Ergebnisse der Kaplan-Meier-Kurven bestätigten die Relevanz der aktivierenden FcRezeptoren beim Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion. Die Fcγ-/--Mäuse,
denen das Serum therapeutisch transferiert wurde (Abb. 7.18 A), hatten ein signifikant
kürzeres Überleben als die Kontroll-Mäuse (Fcγ+/+). Die Mäuse der Fcγ-/--Gruppe wurden
zwischen Tag 15 und 30 nach Infektion getötet. Somit verhielt sich die Infektion ähnlich
progressiv wie bei den Mausgruppen, die mit naivem Serum behandelt wurden und einer
fortschreitenden Virusdissemination unterlagen. In den Fcγ+/+- Tieren konnte der Schutz
durch den einmalig verabreichten Pool inf. bis etwa Tag 40 nach Infektion aufrechterhalten
werden. Zu diesem Zeitpunkt war der MCMV-Krankheitsverlauf soweit fortgeschritten, dass
die Tiere getötet werden mussten. Grund für die MCMV-Erkrankung dieser Tiere ist
vermutlich die Halbwertszeit der murinen polyvalenten Antikörper.
Nach einer prophylaktischen Gabe von Immunserum wurden ähnliche Sterbekinetiken
beobachtet (Abb. 7.18 B). Die Fcγ+/+-Tiere, die mit Serumpool inf. therapiert wurden, hatten
ein signifikant längeres Überleben gegenüber den Tieren mit defekter Fc-Rezeptorfunktion.
In den Fcγ-/--Mäusen verlängerte das MCMV-spezifische Serum das Überleben um lediglich
etwa 10 Tage gegenüber den Fcγ-/--Tieren, denen naive Serumantikörper verabreicht worden
waren.
Die
Überlebenskurven
bestätigten
die
Daten
der
Kurzzeitversuche
(Kap.
7.5.2).
Zusammenfassend kann gefolgert werden, dass die Deletion der Fcγ-Kette einen
signifikanten Einfluss auf die protektive Wirkung der MCMV-spezifischen Serumantikörper
hat.
Ergebnisse
(A)
(B)
-/-
Abb. 7.18: Überleben von Fcγ -Mäusen nach Gabe von MCMV-spezifischen Antikörpern
-/-
+/+
5
Kaplan-Meier-Kurve von Fcγ - bzw. Fcγ -Tieren (n= 5/ Gruppe), die mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert
wurden und Serum aus infizierten Donoren (durchgezogene Linie) oder naiven Donoren (gestrichelte Linie)
erhalten hatten. Blau markiert ist der Zeitpunkt des Serumtransfers. Den Versuchstieren wurden drei Tage nach
Infektion (A) und einen Tag vor Infektion (B) 100µl Serumpool inf. bzw. naives Serum intraperitoneal appliziert.
Statistik: Log-rank-Test, nicht signifikant: p > 0.05.
81
82
Ergebnisse
7.6 Generierung und MCMV-Replikationsanalysen von transgenen Mäusen
mit einer Fcγ-Rezeptordeletion
Die bisherigen Ergebnisse demonstrierten die essentielle Bedeutung aktivierender FcγRezeptoren beim Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion. Ziel weiterer
Versuche war es, den Beitrag der individuellen Fcγ-Rezeptoren beim Schutz nach
Immunserumtherapie zu untersuchen. Hierzu wurden transgene Mäuse auf Rag1-/-Hintergrund gekreuzt, in denen die relevanten aktivierenden Fcγ-Rezeptoren einzeln
eliminiert waren (erhalten von Prof. Dr. F. Nimmerjahn, Universität Erlangen). Da in den
Experimenten mit Fcγ-/--Mäusen festgestellt wurde, dass diese unterschiedlich suszeptibel
für MCMV sind (Abb. 7.17 A), wurde zusätzlich die Virusreplikation in den Mäusen mit einer
Fcγ-Rezeptordefizienz in vivo überprüft und mit den Wildtyp-Rag1-/--Tieren verglichen.
7.6.1 Züchtung von Rag1-/--Mäusen mit Deletion eines oder zweier aktivierender FcγRezeptoren in Kombination
Es wurden eine Reihe von transgenen Rag1-/--Mäusen gezüchtet, die eine Mutation in einem
der aktivierenden Rezeptoren FcγRI (FcγRI-/-), FcγRIII (FcγRIII-/-) bzw. FcγRIV (FcγRIV-/-)
aufwiesen. Zudem wurde zusätzlich ein Mausstamm auf Rag1-/- gekreuzt, dessen Gene für
FcγRI und FcγRIV (FcγRI+IV-/-) deletiert waren. Alle Tiere waren vom C57BL/6-Mausstamm.
Die Verpaarung und Züchtung entsprach dem Vorgehen wie in Kap. 7.5.1. beschrieben. Abb.
7.19 zeigt die Ergebnisse der Genotypisierung mittels PCR der F5-Generation des jeweiligen
Mausstammes. Homozygote Nachkommen wurden in den folgenden Versuchen eingesetzt.
-/-
-/-
(A) FcγRI x Rag1
FcγRI-Primer
KO: Rag1-/- (C57BL/6)
Rag1-Primer
KO: Rag1-/- (C57BL/6)
Ergebnisse
-/-
-/-
(B) FcγRIII x Rag1
FcγRIII-Primer
Rag1-Primer
KO: Rag1-/- (C57BL/6)
KO: FcγRIII+/- (C57BL/6)
-/-
-/-
(C) FcγRIV x Rag1
FcγRIV-Primer
Rag1-Primer
KO1: FcγRIV-/- (C57BL/6)
KO2: Rag1-/- (C57BL/6)
-/-
KO: Wildtyp C57BL/6
-
(D) FcγRI+IV x Rag1
//-
FcγRI-Primer
FcγRIV-Primer
Rag1-Primer
KO: FcγRI+/- x Rag1+/- (C57BL/6)
KO: FcγRIV+/- x Rag1+/- (C57BL/6)
-/-
Abb. 7.19: Genotypisierung der F5-Generation der Rag1 -Mäuse mit einer FcγR-Defizienz
(A-D) Dargestellt sind die Ergebnisse der Genotypisierungs-PCR der neu generierten, transgenen Mäuse. Die
Durchführung entsprach dem Vorgehen wie in Abb. 7.14 beschrieben. 10µl der PCR-Produkte wurden im
Agarosegel mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Größe der zu analysierenden DNA-Fragmente der
Genotypisierungs-PCR wurde mit der errechneten Größe der DNA für den jeweiligen Fcγ-Rezeptor verglichen
(Tab. 7.6); +/-: heterozygot; -/-: homozygote Deletion
83
84
Ergebnisse
Tab. 7.6: Größe der zu erwartenden PCR-Amplifikate für das Gen des jeweiligen Fcγ-Rezeptors und des
Rag1-Gens
Genotyp FcγRI
+/+
+/-/Genotyp FcγRIII
+/+
+/-/Genotyp FcγRIV
+/+
+/-/Genotyp Rag1
+/+
+/-/-
Größe der DNA-Fragmente
360 bp
360 / 300 bp
300 bp
Größe der DNA-Fragmente
250 bp
250 / 310 bp
310 bp
Größe der DNA-Fragmente
619 bp
619 / 901 bp
901 bp
Größe der DNA-Fragmente
474 bp
474 / 530 bp
530 bp
bp= Basenpaare;
+/+: Wildtyp homozygot; +/-: heterozygot; -/-: homozygote Deletion
7.6.2 Replikationsvergleich von MCMV in den transgenen Fcγ-RezeptorMausmutanten
Die Versuchstiere wurden mit MCMV infiziert. 10 Tage nach Infektion wurde die Viruslast in
den entnommenen Organen mittels Luziferaseanalysen untersucht (Abb. 7.20). In der Lunge
und den Speicheldrüsen der transgenen FcγRI-/-x Rag1-/- (FcγRI-/-)- und FcγRIII-/-x Rag1-/(FcγRIII-/-)- Mäusen (Abb. 7.20 A, B) war die Viruslast in beiden Tiergruppen vermindert. In
den restlichen Organen (Milz, Niere, Leber) verhielt sich die MCMV-Infektion größtenteils
ähnlich zu den Organen der Wildtyp-Rag1-/--Tiere.
Bei den FcγRIV-/-x Rag1-/- (FcγRIV-/-)- Mäusen (Abb. 7.20 C) war der Virustiter in allen
Organen vermindert. Die Infektionsanalysen von FcγRI+IV-/-x Rag1-/- (FcγRI+IV-/-)- Tieren
(Abb. 7.20 D) zeigten in allen Organen signifikant niedrigere Virustiter als in den Rag1-/-Kontrollmäusen.
Insgesamt war in allen transgenen Mäusen mit Deletion eines Fcγ-Rezeptors kaum ein oder
nur ein geringer Unterschied in der in vivo-Replikation von MCMV zu den Wildtyp-Rag1-/-Tieren zu erkennen. Die biologischen Schwankungen des Virustiters lagen innerhalb der
experimentell bedingten Grenzen. Lediglich die Fcγ-/--Mäuse zeigten eine erhöhte und die
FcγRI+IV-/--Tiere eine verminderte Suszeptibilität für MCMV gegenüber den Wildtyp-Rag1-/-Mäusen.
Ergebnisse
Abb. 7.20: Replikationsvergleich von MCMV in Fcγ-Rezeptor-defizienten Mäusen
-/-
(A-D) Transgene Fcγ-Rezeptor-Mäuse (●) und Rag1 -Tiere (○) (n=4-5) wurden jeweils mit 1x10
5
PFU
MCMV∆m157luc infiziert. 10 Tage nach Infektion wurden die Organe entnommen.Gezeigt wird die gemessene
-/-
Luziferaseaktivität in den Organen der jeweiligen Fc-Rezeptormutante im Vergleich zu den Rag -Wildtyptieren,
wie in Abb. 7.11 B schon beschrieben. Statistik: Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s.: nicht signifikant;
gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse eines von zwei unabhängig voneinander durchgeführten
Versuchen.
85
86
Ergebnisse
7.7 Rolle individueller Fcγ-Rezeptoren beim Antikörper-vermittelten Schutz
gegen MCMV
In den folgenden Serumtransferversuchen wurden die neu gezüchteten Rag1-/--Mäuse
verwendet, denen ein Defekt in der zellulären Expression der Rezeptoren FcγRI (FcγRI-/-),
FcγRIII (FcγRIII-/-) bzw. FcγRIV (FcγRIV-/-) zugrunde liegt. Die Versuchstiere wurden nach
Protokoll (Abb. 7.15) mit MCMV infiziert und nach drei Tagen mit dem Serumpool infizierter
Donoren therapiert. Der Schutzeffekt in den transgenen Mäusen wurde durch Bestimmung
der Viruslast in den Organen mittels Luziferaseanalysen ermittelt. Bei den FcγRIII-/--Tieren
wurden zusätzlich Überlebensanalysen durchgeführt.
Defizienz des FcγRI
Der FcγRI zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu monomerem IgG v.a. IgG2a aus (Abb.
3.5) und wird auf verschiedenen Zellen wie den Monozyten, Makrophagen und DCs (Tab.
3.1) exprimiert. Unter physiologischen Bedingungen ist der Rezeptor durch Serumantikörper
abgesättigt (Nimmerjahn & Ravetch, 2008), die jedoch durch Immunkomplexe verdrängt
werden können.
In unserem Versuchsaufbau zeigte die Therapie mit immunem Serum in den FcγRI-/--Mäusen
eine signifikante Verringerung der Virusbeladung im Vergleich zu den Mäusen, die mit
naivem Serum behandelt wurden. Zwischen den FcγRI-/-- und Fcγ+/+-Kontrolltieren wurde
kein Unterschied nach Immunserumgabe festgestellt (Abb. 7.21 A).
Defizienz des FcγRIV
Der FcγRIV wird auf der Zelloberfläche von Makrophagen, Monozyten sowie neutrophilen
Granulozyten exprimiert, die an der Antikörper-vermittelten Protektion in der MCMV-Infektion
beteiligt sein könnten.
Die Deletion dieses Rezeptors hatte in unserem Versuchsaufbau keinen Einfluss auf die
Schutzfunktion der immunen Serumantikörper (Abb. 7.21 B). Der Level des Organtiters in
den FcγRIV-/--Mäusen war ähnlich niedrig wie bei den Fcγ+/+-Tieren und signifikant verringert
gegenüber der Gruppe, die mit naivem Serum behandelt wurde.
Ergebnisse
(A)
-/-
● FcγRI + Serumpool inf.
-/▲ FcγRI + Serumpool naiv
+/+
○ Fcγ + Serumpool inf.
+/+
∆ Fcγ + Serumpool naiv
(B)
-/-
● FcγRIV + Serumpool inf.
-/▲ FcγRIV + Serumpool naiv
+/+
○ Fcγ + Serumpool inf.
+/+
∆ Fcγ + Serumpool naiv
-/-
Abb. 7.21: Viruslast in den Organen von Rag1 -Mäusen mit Deletion eines einzelnen Fcγ-Rezeptors
+/+
5
(A+B): Die angegebenen transgenen FcγR-Tiere (n=5-6) und Kontroll-Mäuse (Fcγ ; n=5) wurden mit 1x10 PFU
MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage nach Infektion (p.i.) mit Serumpool inf. bzw. Serumpool naiv (100µl/Maus)
behandelt (Abb. 7.15). 14 Tage nach Therapie wurden die oben genannten Organe entnommen und die daraus
hergestellten Homogenate auf ihre Luziferaseaktivität untersucht, wie in Abb. 7.11 B beschrieben. Statistik (A+B):
Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s.: nicht signifikant; gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse
eines von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Defizienz des FcγRIII
Der FcγRIII wird ebenfalls auf verschiedenen Zelltypen (z.B. Monozyten, DCs, Neutrophile,
NK-Zellen) exprimiert. Im Gegensatz zu FcγRI und FcγRIV ist der FcγRIII der einzige FcγRezeptor, den NK-Zellen auf ihrer Oberfläche tragen. Die Organtiter in den FcγRIII-/--Mäusen
waren
nach
Immunserumbehandlung
signifikant
reduziert
im
Gegensatz
zu
den
entsprechenden Mäusen nach Serumpool naiv- Gabe. Der schützende Effekt des MCMVspezifischen Serums war nicht vermindert (Abb. 7.22 A). So scheint auch dieser Rezeptor
innerhalb der Versuchsdauer keine Auswirkungen auf den Schutz durch polyklonale
87
88
Ergebnisse
Serumantikörper zu haben. Gleichzeitig stellt dieses Ergebnis auch die schützende Funktion
von NK-Zellen in Frage.
Zur weiteren Bestätigung dieses Ergebnisses wurde eine Überlebenskinetik erstellt (Abb.
7.22 B). Die Kaplan-Meier-Kurve bestätigte die Ergebnisse des Kurzzeitversuches (Abb. 7.22
A) dahingehend, dass der FcγRIII keinen Einfluss auf den Schutz durch Antikörper einer
MCMV-Infektion hat. Die FcγRIII-/--Mäuse konnten die Infektion nach der Gabe von Pool inf.
länger kontrollieren als nach Applikation von naivem Serumpool. Es wurde kein Unterschied
in der Überlebensdauer zwischen FcγRIII-/-- und Fcγ+/+-Mäusen nach Immunserum-Gabe
beobachtet.
(A)
-/-
● FcγRIII + Serumpool inf.
-/-
▲ FcγRIII + Serumpool naiv
+/+
+ Serumpool inf.
+/+
+ Serumpool naiv
○ Fcγ
∆ Fcγ
(B)
Abb. 7.22: Rolle des FcγRIII beim Antikörper-vermittelten Schutz
-/-
+/+
5
FcγRIII - und Fcγ -Tiere (n= 5/ Gruppe) wurden jeweils mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage
nach Infektion mit 100µl Mausserum behandelt. (A) Viruslastbestimmung (vgl. Abb. 7.11 B): Gezeigt wird die
gemessene Luziferaseaktivität in den getesteten Organen 14 Tage nach Serumgabe wie oben beschrieben. (B)
Kaplan-Meier-Kurve: Blau markiert ist der Zeitpunkt des Serumtransfers. Statistik: Log-rank-Test, nicht signifikant:
p > 0.05. Gezeigt ist die Überlebenskurve eines durchgeführten Versuchs.
Ergebnisse
7.8 Kombinierte Inaktivierung zweier aktivierender Fcγ-Rezeptoren und ihr
Einfluss auf den Schutzeffekt durch Antikörper
Der Antikörper-vermittelte Schutz vor einer MCMV-Infektion ist den letzten Ergebnissen
zufolge nicht auf die Effektorfunktion eines einzelnen Fcγ-Rezeptors zurückzuführen. Daraus
ergab sich die Hypothese, dass die Effektorfunktionen der Fcγ-Rezeptoren redundant sein
könnten. Zur Klärung dieser Vermutung wurden Serumtransferversuche in Mäusen
durchgeführt, bei denen zwei Fcγ-Rezeptoren in Kombination ausgeschaltet sind.
Der Versuchsablauf entsprach dem experimentellen Protokoll von Abb. 7.15. Der
Schutzeffekt der verabreichten Serumantikörper wurde durch Bestimmung der Viruslast
mittels Luziferaseanalysen in den untersuchten Organen quantifiziert.
7.8.1 Serumtransfer in FcγRI+IV-/--Mäusen
Durch Kreuzung des FcγRI+IV-/--Wildtypstamms (C57BL/6) mit Rag1-/--Mäusen (C57BL/6)
wurde der neue Genotyp FcγRI+IV-/- x Rag1-/- (FcγRI+IV-/-) hergestellt (Kap. 7.6.1). Die
MCMV-Suszeptibilität
dieser
transgenen
Mäuse
wurde
anhand
von
in
vivo-
Infektionsanalysen charakterisiert (Abb. 7.20 D). Durch die Deletion beider Rezeptoren
(FcγRI und FcγRIV) wird bei diesen transgenen Mäusen ausschließlich der FcγRIII als
aktivierender Fcγ-Rezeptor auf Monozyten, DCs, Neutrophilen und NK-Zellen (Tab. 3.1)
exprimiert.
-/-
+/+
● FcγRI+IV + Serumpool inf.
○ Fcγ + Serumpool inf.
-/+/+
▲ FcγRI+IV + Serumpool naiv ∆ Fcγ + Serumpool naiv
-/-
Abb. 7.23: Viruslast in FcγRI+IV -Mäusen nach Therapie mit MCMV-spezifischen Antikörpern
-/-
+/+
5
Die FcγRI+IV -Tiere (n=5) und Kontroll-Mäuse (Fcγ ; n=5) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und
drei Tage nach Infektion (p.i.) mit Pool inf. bzw. Pool naiv (100µl/Maus) entsprechend dem Protokoll behandelt.
14 Tage nach Therapie wurden die oben genannten Organe entnommen und die Viruslastbestimmung, wie in
Abb. 7.11 B beschrieben, vorgenommen. Statistik: Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s.: nicht
signifikant; gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse eines von zwei unabhängig voneinander
durchgeführten Versuchen.
89
90
Ergebnisse
Nach Gabe des polyvalenten Serumpool inf. wurde in den FcγRI+IV-/--Mäusen eine
signifikante Verminderung der Virusbeladung gegenüber den mit naivem Serum behandelten
FcγRI+IV-/--Mäusen beobachtet (Abb. 7.23). Zudem wurde kein Unterschied zu den Fcγ+/+Kontrolltieren festgestellt. Das bedeutet, dass der Schutz durch Antikörper nach der MCMVInfektion in den FcγRI+IV-/--Mäusen über die Effektorfunktion des FcγRIII uneingeschränkt
vermittelt wurde.
7.8.2 Serumtransfer bei FcγRI-/-- bzw. FcγRIV-/--Mäusen mit zusätzlichem FcγRIIIBlock
Bisher standen für die kombinierte Deletion von FcγRI+III keine genetisch veränderten Tiere
zur Verfügung. Die genetische Deletion für die Kombination von FcγRIII+FcγRI ist dagegen
nicht möglich, da das Gen für FcγRIV mit dem Gen für FcγRIII bzw. FcγRIIB verlinkt ist
(Mechenita et al., 2002; Nimmerjahn et al., 2005). Aus diesem Grund wurde zum Inaktivieren
der FcγRIII-Funktion ein blockierender Antikörper in den transgenen FcγRI-/-- bzw. FcγRIV-/-Mäusen eingesetzt. Der verwendete Antikörper ist sowohl gegen den FcγRIII als auch gegen
den FcγRIIB der Maus (anti-CD16/32; Klon: 2.4G2) gerichtet. Zunächst wurde in Vorarbeiten
ein Protokoll für den CD16/32-Block in vivo etabliert und der Block mittels Blut-FACSAnalysen verifiziert. Im folgenden Versuch wurden 300µg des Antikörpers einen Tag vor
Infektion und anschließend alle 2 Tage intraperitoneal verabreicht. Zur Bestätigung des
Blocks wurden FACS-Analysen von mononukleären Blutzellen (PBMC; Peripheral Blood
Mononuclear Cell) der behandelten Mäuse durchgeführt. Hierfür wurden alle CD11b+-Zellen,
zu denen u.a. NK-Zellen, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten und DCs zählen, mit antiCD16/32 (2.4G2) gefärbt und analysiert (Abb. 7.24).
Abb. 7.24: FACS-Analyse des CD16/32-Blocks
Die Versuchstiere wurden zwei Tage nach der anti-CD16/32 (2.4G2) in vivo-Applikation geblutet und die PBMCs
mit einem gegen die Maus gerichteten, PE-gekoppelten anti-CD16/32 (2.4G2) und AF700-gekoppelten antiCD11b markiert. Die Kontrolle entspricht einer unbehandelten Maus. Das dargestellte Ergebnis des CD16/32Blocks ist repräsentativ für die mit dem Block-Antikörper behandelten Mäuse. Die Quadranten-Auswertung der
+
DotPlot-Analyse zeigt den erfolgreichen Block der CD16/32-Rezeptoren auf allen CD11b -Zellen.
Ergebnisse
Die Infektion mit MCMV sowie der Transfer der Serumpools basierten auf dem
experimentellen Protokoll, wie in Abb. 7.15 beschrieben. Der Infektionsverlauf wurde mit
Hilfe von Biolumineszenzanalysen an Tag 3 nach Infektion sowie an Tag 7 und 10 nach
Serumtherapie dokumentiert (Daten nicht gezeigt). Zum Versuchsende an Tag 14 mussten
im jeweiligen Experiment bereits einzelne Tiere mit Fc-Blockbehandlung wegen eines
progressiven Krankheitsverlaufs durch die MCMV-Infektion getötet werden. Zuletzt wurden
die Organe der Versuchstiere entnommen und die Viruslast mittels des Luziferasetests
quantifiziert (Abb. 7.25).
In den FcγRI-/--Tieren mit CD16/32-Block wurde der Virustiter nach Immunserumgabe zwar
signifikant verringert, jedoch war die Kontrolle der Virusdissemination deutlich schlechter als
bei den FcγRI-/--Tieren ohne Behandlung mit dem Block-Antikörper. Die FcγRI-/-+ CD16/32Block- Mäuse hatten nach der Applikation von Serumpool inf. in allen Organen signifikant
höhere Virustiter als die FcγRI-/--Tiere (Abb. 7.25 A).
Ein ähnliches Ergebnis wurde bei den FcγRIV-/--Mäusen mit CD16/32-Behandlung erzielt
(Abb. 7.25 B). Der zusätzliche CD16/32-Block in den FcγRIV-/--Mäusen rief nach
Immunserumtherapie gegenüber den FcγRIV-/--Mäusen ohne CD16/32-Block signifikant
höhere Virustiter in allen Organen (Ausnahme Niere) hervor. Bei den FcγRIV-/--Mäusen mit
CD16/32-Behandlung war die Virusbeladung nach Erhalt des naiven Serums höher als bei
den FcγRIV-/--Mäusen. Die Blockade des CD16/32 schien eine erhöhte MCMV-Suszeptibilität
dieser Tiere herbeizuführen.
In einem weiteren Versuchsansatz wurden FcγRIII-/--Mäuse mit einem monoklonalen
Antikörper 9E9 (freundlicherweise erhalten von Prof. Dr. F. Nimmerjahn, Universität
Erlangen) behandelt, der gegen den FcγRIV gerichtet ist (Nimmerjahn et al., 2005). Die
Therapie mit MCMV-spezifischem Serum führte zu signifikant höheren Titern in allen
Organen, verglichen mit den FcγRIII-/-- Tieren, die den FcγRIV-blockierenden Antikörper
nicht erhalten hatten (Daten nicht gezeigt). Dieser Versuch bestätigte nochmals die Daten
der vorangegangenen Versuche.
Folglich schien die CD16/32-Blockade in Kombination mit der jeweiligen genetischen FcγRezeptordeletion einen verminderten Schutz durch MCMV-spezifische Antikörper zu
bewirken. Inwiefern die erhöhte Suszeptibilität von CD16/32-Antikörper-behandelten Tieren
eine Rolle spielt, die v.a. in den FcγRIV-/--Tieren zu beobachten war (Abb. 7.25 B), müsste in
weiteren Versuchen erforscht werden.
91
92
Ergebnisse
(A)
-/-
CD16/32-Block in FcγRI -Tieren
-/-
● FcγRI + CD16/32-Block + Serumpool inf.
-/▲ FcγRI + CD16/32-Block + Serumpool naiv
-/-
○ FcγRI + Serumpool inf.
-/∆ FcγRI + Serumpool naiv
(B)
-/-
CD16/32-Block in FcγRIV -Tieren
-/-
● FcγRIV + CD16/32-Block + Serumpool inf.
-/▲ FcγRIV + CD16/32-Block + Serumpool naiv
-/-
-/-
○ FcγRIV + Serumpool inf.
-/∆ FcγRIV + Serumpool naiv
-/-
Abb. 7.25: Viruslast in FcγRI - bzw. FcγRIV -Mäusen mit zusätzlichem CD16/32-Block
-/-
-/-
Die FcγRI - (n=5; A) bzw. FcγRIV - (n=6; B) Tiere wurden einen Tag vor Infektion und anschließend alle 2 Tage
mit 300µg anti-CD16/32 (Klon 2.4G2) intraperitoneal (i.p.) behandelt. Als Kontroll-Mäuse dienten die
-/-/unbehandelten FcγRI - bzw. FcγRIV -Tiere (je n=5). Entsprechend dem Protokoll wurden die Versuchsmäuse
infiziert und mit Serumpool inf. bzw. naivem Serum (100µl/Maus i.p.) behandelt. 14 Tage nach Therapie wurden
die oben genannten Organe entnommen und die daraus hergestellten Homogenate auf ihre Luziferaseaktivität
hin untersucht (wie in Abb. 7.11 B beschrieben.). Zum Zeitpunkt des Versuchendes waren vereinzelte Mäuse, die
mit naivem Serum behandelt worden waren, bereits euthanasiert. Gezeigt werden die repräsentativen Ergebnisse
(A) eines Versuches und (B) eines von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
7.8.3 Einfluss des CD16/32-Blocks auf den Schutzeffekt von Antikörpern in Rag1-/-Tieren ohne Fcγ-Rezeptordefekt
Die Gabe von Antikörpern zur Blockade von Fc-Rezeptoren unterscheidet sich von der
genetischen Deletion dadurch, dass durch den Fc-Teil der verabreichten Antikörper FcRezeptoren
besetzt
Kombinationseffekte
werden
auftreten.
können
Zur
(z.B.
FcγRI).
Untersuchung
-/-
des
Auf
diese
Einflusses
Weise
der
können
CD16/32-
+/+
Antikörpergabe wurden ebenfalls Rag1 -Tiere ohne Fcγ-Rezeptordefekt (Fcγ ) mit diesem
Antikörper behandelt. Die Tiere wurden entsprechend dem experimentellen Protokoll mit
Ergebnisse
MCMV infiziert und mit dem Serumpool aus infizierten bzw. naiven Donoren behandelt. An
Tag 14 nach Therapie wurde der Organtiter dieser Versuchsmäuse bestimmt (Abb. 7.26).
(A)
+/+
● Fcγ + CD16/32-Block + Serumpool inf.
+/+
▲ Fcγ + CD16/32-Block + Serumpool naiv
+/+
○ Fcγ + Serumpool inf.
+/+
∆ Fcγ + Serumpool naiv
(B)
+/+
Abb. 7.26: Einfluss des CD16/32-Blockantikörpers auf die Viruslast in Fcγ -Tieren nach Immunserumtherapie
Entsprechend dem Protokoll wurden die Versuchsmäuse (n= 5/ Gruppe) infiziert und mit Serumpool inf. bzw.
naivem Serum (100µl/Maus i.p.) behandelt. 14 Tage nach Therapie wurden die oben genannten Organe
entnommen und die daraus hergestellten Homogenate auf ihre Luziferaseaktivität hin untersucht (vgl. Abb. 7.11
+/+
B). (A) Viruslastbestimmung in den Fcγ -Mäusen nach anti-CD16/32-Behandlung. Der blockierende CD16/32-/Antikörper wurde, wie in Abb. 7.25 beschrieben, verabreicht. (B) Vergleich der Virusbeladung in FcγRIV - (n=6)
+/+
und Fcγ - (n=4) Mäusen nach Gabe des blockierenden anti-CD16/32 und nach Transfer von Serumpool inf..
Gezeigt ist der Median der ermittelten Luziferasewerte mit der dazu errechneten Standardabweichung. Statistik
(A+B): Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s. nicht signifikant; dargestellt werden die repräsentativen
Ergebnisse eines von drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Die Virustiter der CD16/32-Antikörper-behandelten Fcγ+/+-Tiere waren signifikant höher als
bei den unbehandelten Fcγ+/+-Tieren. Gleichzeitig wurde nur ein geringer, nicht signifikanter
Unterschied in der Virusbeladung zu den Tieren beobachtet, die den naiven Serumpool
erhalten hatten (Abb. 7.26 A). Die Infektion konnte unter den Bedingungen des CD16/32Blocks durch MCMV-spezifische Serumantikörper nicht kontrolliert werden. Der Effekt des
CD16/32-Antikörpers scheint sich jedoch auf die Mäuse mit genetischem Fcγ-Rezeptordefekt
unterschiedlich auszuwirken. So ist nach CD16/32- Behandlung und Immunserumtherapie
93
94
Ergebnisse
der Virustiter z.B. in den FcγRIV-/-- Tieren signifikant niedriger als in den Fcγ+/+-Tieren (Abb.
7.26 B). Die Ergebnisse verdeutlichen die Komplexität dieses biologischen Systems. Zur
genaueren Analyse der Beobachtung müssten weitere Experimente durchgeführt werden.
7.9 Durchflusszytometrische Analyse der zellulären Expression einzelner FcγRezeptoren
Die Expression von Fcγ-Rezeptoren auf Zellen des innaten Immunsystems ist für naive
Wildtypmäuse bereits beschrieben (Biburger et al., 2011; Biburger & Nimmerjahn, 2012). Die
Auswirkungen einer MCMV-Infektion auf die Expression der Fcγ-Rezeptoren bei Rag1-/-Mäusen sind bisher nicht untersucht. Es ist jedoch bekannt, dass MCMV die zelluläre
Oberflächenexpression eines viralen Fc-Rezeptors, das Protein m138, initiieren kann (Thäle
et al., 1994). Dieser virale Fc-Rezeptor hat eine starke Bindung zum Fc-Fragment muriner
IgG
und
kann
darüber
Immunglobuline
abfangen.
Zur
Untersuchung
der
Fcγ-
Rezeptorexpression wurden FACS-Analysen von PBMCs aus Rag1-/--Mäusen sowie aus den
transgenen Rag1-/--Tieren mit einer Fcγ-Rezeptordeletion (FcγRI-/-, FcγRIII-/-, FcγRIV-/-,
FcγRI+IV-/-, Fcγ-/-) durchgeführt. Hierzu wurde die Expression der aktivierenden Rezeptoren
FcγRI, FcγRIII, FcγRIV sowie des einzigen inhibitorischen Rezeptors, des FcγRIIB, auf
unterschiedlichen Zelltypen (NK-Zellen, Monozyten, neutrophile Granulozyten) analysiert.
Für die Untersuchung der Rezeptor-expression nach einer Virusinfektion wurden die
Versuchstiere mit 1x105 PFU MCMV∆m157luc intravenös infiziert und nach 7 Tagen für die
FACS-Tests geblutet. Bei den Analysen von Monozyten musste bedacht werden, dass
MCMV diese Zellen infiziert und in ihnen persistiert (Pollock et al., 1997).
FcγRI-Expression
FcγRI (CD64) wird konstitutiv auf Monozyten/ Makrophagen und Dendritischen Zellen
exprimiert (zusammengefasst in Tab. 3.1). Eine Expression dieses Rezeptors ist bisher
weder auf humanen noch auf murinen neutrophilen Granulozyten nachgewiesen worden
(Shen et al., 1987; Biburger et al., 2011). Unsere Analysen mit PBMCs von naiven Tieren
konnten die fehlende Expression von FcγRI bestätigen (Abb. 7.27 obere Reihe). Die
Neutrophilen sowohl von naiven Rag1-/--Tieren als auch von transgenen Mäusen mit einer
Fcγ-Rezeptordeletion exprimierten keinen FcγRI. Auf humanen Neutrophilen wird die
Expression des FcγRI als physiologische Antwort auf z.B. bakterielle Lipopolysaccharide
(LPS), Interferon-γ (IFN-γ) sowie G-CSF (Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor)
induziert (Buckle et al., 1989). Die neutrophile FcγRI-Expression wurde auch als Folge viraler
Infektionen beschrieben (Leino et al., 1997). In unseren Versuchstieren konnte nach einer
MCMV-Infektion ebenfalls kein CD64 auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten
nachgewiesen werden (Abb. 7.27 untere Reihe).
Ergebnisse
Fcg
FcR1
100
60
10
-/-
Fcγ
100
80
80
60
60
60
FcγRI
FcγRIII
-/-
FcγRIV
-/-
60
FcγRI/IV
40
5
100
20
100
20
100
20
100
20
100
20
80
00
80
0
80
0
80
0
100
40
0
10
1
2
98.3
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
100
40
10
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
20
0
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
0
10
1
40
0
10
99.1
98.2
60
0
20
0
3
10
10
4
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
10
10
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
3
10
10
4
100
40
10
10
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
10
10
FL2-H: CD64-PE
10
10
4
10
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
100
80
99.4
98.5
60
60
40
20
0
4
10
99.3
98.8
60
0
4
20
3
3
10
100
40
99.5
98.5
2
2
98.5
10
FL2-H: CD64-PE
0
0
40
10
1
20
80
60
1
10
40
100
0
0
60
80
20
100
99.6
60
0
4
0
2
2
98.5
10
FL2-H: CD64-PE
0
20
1
1
40
40
0
10
99.7
98.6
0
10
0
-/-
80
0
0
60
20
10
% of Max
% of Max
10
10
80
60
20
1
10
100
40
0
4
100
60
0
98.5
98.3
20
10
80
20
CD64-PE
80
40
3
10
0
99.8
98.7
60
0
2
98.6
10
FL2-H: CD64-PE
100
40
40
100
80
1
20
10
100
10
80
20
% of Max
99.9
97.9
60
0
% of Max
80
20
0
60
% of Max
10
60
% of Max
4
4
10
10
% of Max
3
% of Max
2
98.7
102
103
10
10
FL2-H: CD64-PE
CD64-PE
FL2-H:
% of Max
1
% of Max
1
10
10
% of Max
100
10
60
10
% of Max
-/-
40
% of Max
% of Max
naiv
% of Max
100
80
40
40
infiziert
100
80
40
80
20
neutrophils
100
+
40
0
monocytes
CD115pos
FcR1/4
% of Max
%# of
Max
Cells
NK
FcR4
% of Max
, Ly6G
% of Max
high
15
80
% of Max
Gate: SSC
FcR3
95
10
0
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
10
0
10
1
2
10
FL2-H: CD64-PE
3
10
10
4
CD64-PE
Abb. 7.27: FcγRI-Expression auf neutrophilen Granulozyten nach einer MCMV-Infektion
Gezeigt ist das Histogramm der FACS-Analyse der maximal gemessenen Anzahl (Y-Achse, Angaben in %) an
Granulozyten aus PBMCs naiver bzw. MCMV-infizierter Versuchstiere. Neutrophile Granulozyten wurden als
+
high
Ly6G SSC
-Population definiert. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen Ly6G (FITC) sowie CD64 (PE)
-/-
markiert. Dargestellt ist die Überlagerung der PE-Fluoreszenzkanäle von neutrophilen Granulozyten von Rag1 Tieren (rot) und den jeweiligen FcγR-Mausmutanten (blau). Die Ergebnisse sind repräsentativ für eine Maus vom
jeweiligen Genotyp.
CD115+- Monozyten zeigten eine deutliche Expression dieses Rezeptors in naiven Rag1-/-Tieren, die nach einer MCMV-Infektion signifikant zunimmt (Abb. 7.28 A). Verglichen mit den
naiven Rag1-/--Monozyten ist die FcγRI-Expression auf naiven FcγRIII-/--Monozyten
signifikant und bei FcγRIV-/- tendenziell, wenn auch nicht signifikant, erniedrigt (Abb. 7.28 B
und Tab. 7.8). In FcγRIII-/-- und FcγRIV-/--Mäusen wird die FcγRI-Expression nach Infektion
ebenfalls erhöht (Abb. 7.28 B). Möglicherweise wird die α-Kette der Fcγ-Rezeptoren, v.a.
FcγRI, allein auf der Oberfläche exprimiert. Die Expression der α-Kette wäre nicht dauerhaft
und nicht funktionell. Dies würde erklären, warum in der Fcγ-/--Gruppe (graue Balken) die
CD64-Expression nach der Infektion zunimmt.
Ergebnisse
(A)
low
-
+
Gate: SSC , NKp46 ,CD11b
104
102
46.6
1
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
10
102
14.4
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
104
#1
45.5
101
10
4
3
10
102
13.6
54.2
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
0
10
3
10
102
16.3
44.1
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
#4
3
102
16
41.1
101
100
0
28.7
104
#3
101
10
41.3
1
100
10
104
#2
102
10
0
100
0
50.3
1
10
101
100
19.1
100
0
#4
103
102
10
10
3
10
1
4
FL2-H: CD64-PE
FL2-H: CD64-PE
CD64-PE
d7
36.7
100
0
104
10
36.8
10
100
10
102
FL2-H: CD64-PE
10
24.6
104
#3
103
FL2-H: CD64-PE
103
FL2-H: CD64-PE
d0
FL2-H: CD64-PE
naiv
103
104
#2
FL2-H: CD64-PE
#1
FL2-H: CD64-PE
104
infiziert
96
100
0
10
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
0
10
10
1
2
10
10
FL4-H: CD115 APC
3
10
4
CD115-APC
(B)
Abb. 7.28: FcγRI-Expression auf Monozyten nach einer MCMV-Infektion
Gezeigt ist die FACS-Analyse der am LSRIII untersuchten Monozyten aus PBMCs naiver bzw. MCMV-infizierter
+
+
+
hoch
Versuchstiere. NK-Zellen (CD11b , NKp46 ) und Granulozyten (Ly6G , SSC
+
) wurden in der Testung
+
ausgegrenzt. Monozyten wurden als eine CD11b CD115 -Population definiert. Die Zellen wurden mit Antikörpern
-/-
gegen NKp46 (FITC), NK1.1. (FITC; nur bei Fcγ ), CD11b (PE-Cy7), CD115 (APC), Ly6G (FITC) sowie CD64
-/-
(PE) markiert. (A) Analyse von naiven und infizierten Rag1 -Mäusen. Dargestellt ist die DotPlot-Auswertung der
monozytären FcγRI-Oberflächenexpression von vier naiven (obere Reihe) und vier MCMV-infizierten (untere
Reihe)
-/-
Rag1 -Mäusen
unterschiedlichen
(Maus
Mausstämmen.
#1-4).
Zu
(B)
Mittlere
sehen
ist
Fluoreszenzintensität
das
Balkendiagramm
der
der
FcγRI-Expression
gemessenen
bei
CD64-
Fluoreszenzintensität (Mittlere Fluoreszenzintensität, MFI). Farbig ausgefüllte Balken: naive Mäuse; farbiggestreifte Balken: 7 Tage nach MCMV-Infektion. Statistik: T-Test mit Welch-Korrektur.
Ergebnisse
97
FcγRIIB- und FcγRIII-Expression
Der murine FcγRIII (CD16) wird auf fast allen Zellen des hämatopoetischen Systems
exprimiert (Tab. 3.1.). Auf NK-Zellen ist es der einzige Fcγ-Rezeptor, der jedoch nur
schwach exprimiert wird (Biburger & Nimmerjahn, 2012). Für die Untersuchung der FcγRIIIExpression wurde der CD16/32-Antikörper in den FACS-Analysen eingesetzt. Dieser bindet
neben dem FcγRIII auch den inhibitorischen FcγRIIB (CD32). Der FcγRIIB ist auf diversen
Zelltypen, einschließlich den B-Zellen, präsent (Tab. 3.1) und wurde in die folgenden
Analysen mit einbezogen.
Die Expression von CD16/32 war auf den Neutrophilen von naiven Rag1-/--Tieren und naiven
Fcγ-Rezeptormausmutanten ähnlich (Tab. 7.8). Nur in den FcγRI-/--Mäusen schien die
Expression verringert zu sein (Daten nicht gezeigt). Nach Infektion wurde, im Gegensatz zu
den infizierten Rag1-/--Mäusen, auf den FcγRIV-/-- und FcγRI/IV-/--Neutrophilen ein tendenziell
stärkerer Oberflächennachweis gemessen (Abb. 7.29 A und Tab. 7.8).
Die Betrachtung der Monozyten ergab, dass die FcγRIII- und FcγRIIB-Expression nach einer
MCMV-Infektion in Rag1-/--Tieren signifikant gesteigert wurde (Abb. 7.29 B). Mit diesen
Mäusen verglichen, war die CD16/32-Expression in FcγRIV-/--Tieren signifikant erhöht, in
FcγRI-/--Mäusen dagegen erniedrigt (Abb. 7.29).
Auffällig war die gesteigerte Expression von CD16/32 in den FcγRIII-/--Mäusen, die aufgrund
der genetischen FcγRIII-Deletion CD16 nicht exprimieren können. Da der CD16/32Fcg
FcR1
FcR3
FcR4
FcR1/4
Antikörper neben dem FcγRIII auch den FcγRIIB (CD32) bindet, könnte es sich auch um die
Erkennung des inhibitorischen FcγRIIB in den FcγRIII-/--Mäusen handeln.
100
80
80
60
60
60
20
% of Max
# Cells
NK
97.8
94.7
96.4
% of Max
100
80
% of Max
100
80
% of Max
100
30
96.2
60
98.9
40
40
40
40
20
20
20
20
0
0
0
10
10
0
10
1
2
-/-
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
Fcγ
3
10
4
10
1
2
-/-3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
FcγRI
10
4
10
10
1
2
-/-3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
FcγRIII
10
4
10
60
0
0
10
1
2
3
-/-
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
FcγRIV
10
4
100
80
100
% of Max
60
0
100
80
100
% of Max
10
60
60
40
40
40
40
20
20
20
20
0
0
0
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
100
100
100
100
80
80
80
80
100
% of Max
% of Max
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
40
40
20
20
20
20
20
0
0
0
0
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
CD16/32-PE
10
1
10
4
2
3
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
100
40
10
0
60
40
0
4
80
60
40
10
10
100
100
60
-/-3
100
100
60
2
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
0
0
% of Max
100
60
1
60
20
0
10
FcγRI/IV
80
100
40
10
0
100
80
99.9
% of Max
% of Max
0
100
80
% of Max
neutrophils
Neutrophile
monocytes
CD115pos
CD115+ Monozyten
100
10
% of Max
0
% of Max
(A)
10
0
0
10
1
2
3
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
10
0
10
1
10
10
FL2-H: CD16/32-PE
10
4
98
Ergebnisse
(B)
Abb. 7.29: FcγRIIB/III-Expression auf Monozyten und Neutrophilen nach einer MCMV-Infektion
Die Zelltypen wurden, wie in Abb. 7.28 beschrieben, definiert und gefärbt. Der Nachweis des FcγRIIB und FcγRIII
erfolgte mit einem CD16/32-PE (Klon: 2.4G2)- Antikörper. (A) Dargestellt sind die Histogramme mit der maximal
gemessenen Anzahl (Y-Achse, Angaben in %) an Monozyten (obere Reihe) und Neutrophilen (untere Reihe) aus
PBMCs MCMV-infizierter Versuchstiere. Dargestellt ist die Überlagerung der PE-Fluoreszenzkanäle von
-/-
Monozyten bzw. neutrophilen Granulozyten von Rag1 -Tieren (rot) und den jeweiligen FcγR-Mausmutanten
(blau). Die Ergebnisse sind repräsentativ für eine Maus vom jeweiligen Genotyp. (B) Gezeigt ist die FACSAnalyse von Monozyten aus PBMCs naiver bzw. MCMV-infizierter Versuchstiere. Das Balkendiagramm gibt die
gemessene CD16/32-Fluoreszenzintensität (MFI) an. Farbig ausgefüllte Balken: naive Mäuse; farbig-gestreifte
Balken: 7 Tage nach MCMV-Infektion. Statistik: T-Test mit Welch-Korrektur.
NK-Zellen exprimieren laut Literatur ausschließlich den FcγRIII (Ravetch, 2003). Die Analyse
der
CD16/32-Expression
auf
NK-Zellen
ergab
entsprechend
der
niedrigen
Fluoreszenzintensitäten nur eine schwache CD16/32-Expression, die nach der MCMVInfektion unverändert blieb. Die NK-Zellen von naiven FcγRIII-/--Mäusen ergaben keinen
CD16/32-Nachweis. Nach der MCMV-Infektion wurden dagegen erhöhte Fluoreszenzsignale
detektiert (Abb. 7.30 A und B). Da eine FcγRIII-Expression gemäß dem Mausgenotyp
ausgeschlossen werden konnte, wäre eine Oberflächenexpression des FcγRIIB auf den NKZellen denkbar. Zur Verifizierung dieser Annahme wurden die NK-Zellen mit einem
spezifischen, gegen den FcγRIIB gerichteten monoklonalen Antikörper (erhalten von M.
Biburger, Universität Erlangen) gefärbt (Abb. 7.30 C). Die Untersuchungen ergaben sehr
deutlich, dass die FcγRIIB-Expression auf NK-Zellen nach einer Infektion induziert und
hochreguliert wurde. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits bei einer Untergruppe von
humanen NK-Zellen gemacht, die jedoch nur etwa 1% aller NK-Zellen betraf (Dutertre et al.,
2008).
Ergebnisse
(A)
(B)
100
% of M ax
80
60
91.8
40
20
0
0
10
1
10
2
3
10
10
FL2-H:
CD16/32-PE
CD16/32-PE
FcγRIII-/- naiv
Rag1-/- naiv
4
10
FcγRIII-/- inf. #1
FcγRIII-/- inf. #2
FcγRIII-/- inf. #3
(C)
Abb. 7.30: FcγRIIB-Expression auf NK-Zellen
Blut-FACS-Analysen von NK-Zellen; Antikörper wurden, wie in Abb. 7.28 beschrieben, verwendet.
-/-
-/-
(A) CD16/32-Expressionsanalyse in naiven und infizierten Versuchstieren (Rag1 , FcγRIII ). Der Nachweis des
FcγRIIB und FcγRIII erfolgte mit einem gegen die Maus gerichteten anti-CD16/32-PE (Klon: 2.4G2) -Antikörper.
(B) Histogramm mit der maximal gemessenen Anzahl (Y-Achse, Angaben in %) an NK-Zellen. Dargestellt ist die
Überlagerung der PE-Fluoreszenzkanäle der CD16/32-Expression von NK-Zellen von naiven und infizierten
-/-
-/-
-/-
Rag1 - und FcγRIII -Tieren. Rot gefüllt: FcγRIII
naiv; dunkelblau: Rag1
-/-
naiv; hellblaue, dunkelgrüne,
-/-
hellgrüne Kurve: FcγRIII infiziert (inf.), Maus #1-3. (C) Balkendiagramm der FcγRIIB-Expression auf NK-Zellen
mit einem gegen FcγRIIB (Klon: Ly17.2) gerichteten, FITC-gekoppelten Antikörper. Farbig ausgefüllte Balken:
naive Mäuse; farbig- gestreifte Balken: 7 Tage nach MCMV-Infektion. Als Positiv-Kontrolle diente der FcγRIIBNachweis auf B-Zellen einer Wildtyp-Maus; Statistik: T-Test mit Welch-Korrektur.
FcγRIV-Expression
Der FcγRIV wird auf Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, Monozyten und in geringem
Ausmaß auf DCs exprimiert (Tab. 3.1).
In unseren Analysen exprimierten die neutrophilen Granulozyten diesen Fcγ-Rezeptor
deutlich. Die Expressionsrate erhöhte sich auf diesen Zellen nach der MCMV-Infektion
signifikant
(Abb.
7.31).
Die
Betrachtung
der
Neutrophilen
der
einzelnen
Fcγ-
Rezeptormutanten ergab ebenfalls einen erhöhten Nachweis der FcγRIV-Expression auf der
99
100
Ergebnisse
Oberfläche neutrophiler Granulozyten nach Infektion. Dabei schien dieser Fcγ-Rezeptor in
den FcγRIII-/--Mäusen im Vergleich zu den Rag1-/--Tieren sowohl im naiven als auch
infizierten Zustand signifikant hochreguliert zu sein.
Abb. 7.31: FcγRIV-Expression auf neutrophilen Granulozyten
Gezeigt ist die FACS-Analyse der untersuchten Neutrophilen (Färbung wie in Abb. 7.28 beschrieben) aus den
PBMCs naiver bzw. MCMV-infizierter Versuchstiere. Gezeigt ist ein Balkendiagramm der gemessenen antiFcγRIV-Fluoreszenzintensität (MFI). Der Nachweis der FcγRIV-Expression erfolgte mit einem anti-FcγRIV (Klon:
9E9), PE-gekoppelten Antikörper. Farbig ausgefüllte Balken: naive Mäuse; farbig-gestreifte Balken: 7 Tage nach
MCMV-Infektion. Statistik: T-Test mit Welch-Korrektur.
Monozyten können in zwei Subpopulationen auftreten, als inflammatorische und als
residenten Monozyten (Geissmann et al., 2003). Beide Populationen können u.a. durch ihre
FcγRIV-Expression phänotypisch unterschieden werden. Residente Monozyten exprimieren
diesen Rezeptor, wohingegen bei den inflammatorischen ein Nachweis dieses Rezeptors
nicht möglich ist (Biburger et al., 2011). Unsere Analysen aus PBMCs von naiven Rag1-/-Mäusen bestätigten diese Befunde. Der Nachweis des FcγRIV war auf residenten
Monozyten sehr prägnant, wohingegen die Detektion auf den inflammatorischen Zellen kaum
möglich oder sehr schwach war (Tab. 7.7).
Nach
einer
MCMV-Infektion
kam
es
zu
einer
auffälligen
Veränderung
der
Monozytenpopulation in den Rag1-/--Mäusen (Tab. 7.7). In den FACS-Analysen wies die
Monozytenpopulation eine intermediäre FcγRIV-Expression (FcγRIVint) auf und war weder
den residenten (FcγRIVhigh) noch inflammatorischen (FcγRIVlow) Monozyten zuzuordnen
(Daten nicht gezeigt). Bei den FcγRI-/-- und FcγRIII-/--Monozyten war die FcγRIV-Expression
eher unauffällig. Residente Monozyten der FcγRI-/--Tiere schienen den FcγRIV schwächer zu
exprimieren (Tab. 7.8).
Ergebnisse
Tab. 7.7: Übersicht der Fcγ-Rezeptor-Expression auf möglichen Effektorzellen von naiven und MCMV-/-
infizierten Rag1 -Mäusen
FcγRI
NK-Zellen
d0
d7p.i.
-
Monozyten
d0
d7p.i.
++
++++
Neutrophile
d0
d7p.i.
-
FcγRIIB
-
+
++
+++
-/+
-/+
FcγRIII
+
+
++
+++
+
+
FcγIV
-
-
res.: ++
*
++
+++
inflamm.: +/-
d0= uninfiziert; d7 p.i.= 7 Tage nach MCMV-Infektion; Änderung der Expression nach Infektion ist rot markiert;
Unterteilung der Monozyten in: residente (res.) und inflammatorische (inflamm.) Monozyten
* Auftreten einer FcRIV
int
Monozytenpopulation nach Infektion
Expressionsraten: ≥ ++ stark exprimiert; + exprimiert; +/- : schwach exprimiert bis keine Expression;
-: keine Expression
Tab. 7.8: Zusammenfassung der Fcγ-Rezeptor-Expression auf möglichen Effektorzellen von naiven und
-/-
MCMV-infizierten Fcγ-Rezeptormausmutanten, verglichen mit Rag1 -Mäusen
Genotyp
Maus
FcγRExpression
FcγRI
-/-
-/-
FcγRI
neg.
FcγRIII
Monozyten
Monozyten
Monozyten
Monozyten
Monozyten
FcγRIIB+
FcγRIII
neg.
Neutrophile
Monozyten
Neutrophile
-/-
FcγRIV
erhöhte
Expression von
CD16/32 auf
Neutrophilen +
Monozyten (pos.
für FcγRIIB?)
-/-
FcγRI/IV
neg.
Fcγ
-/-
(neg.)
erhöhte Expression
auf Neutrophilen
Monozyten
Monozyten
Neutrophile
Neutrophile
(neg.)
Monozyten
Monozyten
(pos. für FcγRIIB?)
Neutrophile
Neutrophile
NK
(pos. für FcγRIIB)
Monozyten
(res.)
Monozyten
Neutrophile
FcγRIV
Neutrophile
Monozyten n.d.
neg.
Monozyten n.d.
neg.
neg.
nachweisbare
Expression auf
Neutrophilen
Neutrophile
Neutrophile
-/Pfeile geben die gemessene Expressionsrate verglichen mit den Rag1 -Mäusen an: →: keine Veränderung;
↓:erniedrigte Expression; ↑: erhöhte Expression; n.d.: nicht eindeutig definierbar; neg.: keine nachweisbare
Expression; rot markiert: Zustand nach 7-tägiger MCMV-Infektion;
101
102
Ergebnisse
Zusammenfassend ergaben die Fcγ-Rezeptoranalysen in den verschiedenen Mausstämmen
ein sehr komplexes Bild (Tab. 7.7 und Tab. 7.8).
Eine MCMV-Infektion ruft in Rag-/--Tieren Veränderungen der Fcγ-Rezeptorexpression auf
unterschiedlichen Zelltypen hervor. Besonders auf Monozyten wurde auf allen untersuchten
Zellen eine erhöhte FcγR-Expression beobachtet (Tab. 7.7). Durch die Deletion der
einzelnen Fcγ-Rezeptoren in den transgenen Mäusen kommt es zu weiteren Variationen in
der FcγR-Expression, die sich auf den verschiedenen Zelltypen unterscheiden (Tab. 7.8).
Eine MCMV-Infektion induziert neben der veränderten Expression von Fcγ-Rezeptoren auch
phänotypische Veränderungen. Insbesondere bei den CD115+-Monozyten aller transgenen
FcγR-Mausstämme zeigte sich im Forward Scatter eine Größenzunahme der Zellen sowie
eine verminderte Granularität im Side Scatter (Daten nicht gezeigt). Vermutlich handelt es
sich bei diesem Phänotyp vorwiegend um monozytäre CD115+-Vorläuferzellen. In den
MCMV-infizierten Fcγ-/--Tieren wurde trotz der genetisch deletierten γ-Kette die Expression
der Fcγ-Rezeptoren nachgewiesen. Obwohl bei der FACS-Färbung der Fcγ-Rezeptoren die
durch MCMV induzierten viralen Fc-Rezeptoren durch Kaninchen-Serum abgeblockt wurden,
ist eine unvollständige Absättigung der viralen Rezeptoren nicht auszuschließen. In diesem
Falle würde es sich um unspezifische Bindungen des Fc-Teils der Fcγ-RezeptorNachweisantikörper mit den viralen Fc-Rezeptoren handeln. Den potentiellen Einfluss von
viralen Fcγ-Rezeptoren müssen weitere Analysen klären.
Ergebnisse
7.10 Einfluss verschiedener Effektorzellen bei der Antikörper-vermittelten
Protektion gegen MCMV
Verschiedene
Fc-Rezeptoren
werden
auf
verschiedenen
potentiellen
Effektorzellen
exprimiert (Nimmerjahn & Ravetch, 2006). Nachdem die einzelnen Fcγ-Rezeptoren in
unserem
Infektionsmodell
in
vivo
bereits
untersucht
waren,
wurde
der
Beitrag
unterschiedlicher Zelltypen am Antikörper-vermittelten Schutz vor MCMV bestimmt. Hierfür
sollte der Infektionsverlauf in Fcγ+/+-Tieren nach entsprechender Zelldepletion bzw. einem
Zelltransfer geprüft werden.
7.10.1 Rolle der Monozyten
Monozyten und Makrophagen können Fc-Rezeptor-abhängig virale Pathogene über
Immunkomplexe effizient phagozytieren und zerstören. Gleichzeitig ist es die Zellpopulation,
die von MCMV latent infiziert wird und in der die virale Replikation stattfindet (Collins et al.,
1994). Den Monozyten und Makrophagen werden während einer MCMV-Infektion zwei
Rollen zugesprochen: 1.) Sie sind für die virale Dissemination verantwortlich (Stoddart et al.,
1994) und 2.) üben sie eine Schutzfunktion aus, indem sie permissive Zelltypen vor einer
Neuinfektion bewahren (Hanson et al., 1999) und antivirale Zytokine ausschütten (Lucin et
al., 1994). Monozyten exprimieren alle Fcγ-Rezeptoren, die für einen Antikörper-vermittelten
Schutzeffekt
in
unserem
MCMV-Infektionsmodell
notwendig
sind
(Kap.
7.9).
Zur
Untersuchung der Rolle der Monozytenpopulation wurden Depletions- und Transferversuche
durchgeführt.
Depletion von Monozyten/Makrophagen
Die spezifische Depletion verschiedener Monozyten- und Makrophagenpopulationen erfolgte
mittels Clodronat-Liposomen. Liposomen sind künstlich hergestellte Lipidvesikel, die z.B.
Biphosphonate (Clodronate) enthalten können. Die Verabreichung von Clodronat-Liposomen
führt zu deren intrazellulärer Aufnahme durch phagozytierende Zellen und zur intrazellulären
Freisetzung der Clodronate. Clodronate wirken toxisch, und die Zelle geht in die Apoptose
(van Rooijen, 1989).
Monozyten sind kurzlebige Zellen (2-4 Tage), die durch neue, aus dem Knochenmark
kommende Monozyten abgelöst werden (Geissmann et al., 2010). Aus diesem Grund
musste die Clodronatgabe in kurzen Abständen wiederholt werden. In einem Vorversuch
wurde zunächst die optimale Clodronatdosis für die Depletion in Rag1-/--Mäusen bestimmt
(75-100µl/ Maus; Daten nicht gezeigt), um anschließend die Wirkungsdauer der Liposomen
mit Hilfe von Blut-FACS-Analysen zu überprüfen. Residente Monozyten besitzen alle FcγRezeptoren, wohingegen inflammatorische Monozyten den FcγRIV nicht exprimieren.
Deshalb wurde die Applikation der Clodronate speziell auf die Depletion der residenten
103
104
Ergebnisse
Monozyten ausgerichtet. Es war deutlich zu erkennen, dass inflammatorische Monozyten im
murinen Blut bereits 24 Stunden nach intraperitonealer Verabreichung von 75µl Clodronaten
vollständig nachweisbar waren. Etwa 85% residente Monozyten wurden mit den Clodronaten
für 3 Tage depletiert, bevor sie an Tag 4-5 nach Applikation im Blut-FACS wieder sichtbar
wurden (Daten nicht gezeigt). Entsprechend dieser Vorversuche wurden den Tieren einen
Tag vor Infektion 100µl Clodronate und anschließend alle drei Tage 75µl intraperitoneal
verabreicht. Die Depletion wurde mittels Blut-FACS-Analysen überprüft (Abb. 7.32 A).
Kontrolltiere (nicht infizierte Rag1-/-), die Clodronate erhielten, zeigten während des
Beobachtungszeitraums keine pathologischen Auffälligkeiten. Da Mäuse nach einer
Clodronatbehandlung suszeptibler für eine MCMV-Infektion sind (Hamano et al., 1998,
Hanson et al., 1999), wurden die Versuchstiere im laufenden Experiment bereits einen Tag
nach der MCMV-Infektion mit Serumantikörpern behandelt. Der weitere Infektionsverlauf
wurde über Biolumineszenz-Analysen (Abb. 7.32 B) und die Mortalität der Versuchsmäuse
festgestellt (Abb. 7.32 C). Als Kontrolltiere dienten in diesem Versuch nicht-depletierte
Rag1-/--Mäuse, die ebenfalls mit Serum therapiert wurden. Diese Tiere überlebten nach
Serumpool inf.-Therapie bis max. 60 Tage nach Infektion, wohingegen die Tiere nach Gabe
des naiven Pools bereits zwischen Tag 20-25 der MCMV-Infektion unterlagen. Die
Überlebenskurve zeigte deutlich, dass die Clodronat-behandelten Mäuse im Vergleich zu
den Kontrollgruppen ein verkürztes Überleben aufwiesen. Dies lässt sich auf die erhöhte
Suszeptibilität dieser Mäuse für MCMV zurückführen, die Auswirkungen auf die
Überlebensdauer dieser Mäuse hatte. Die Monozyten-depletierten Tiere, die mit naivem
Serum behandelt worden waren, mussten bereits zwischen Tag 1 und 5 nach Infektion
getötet werden. Die Clodronat-behandelten Mäuse, die den Serumpool inf. erhielten, wurden
zwischen Tag 5 und 30 euthanasiert. Tendenziell schienen die polyvalenten Serumantikörper
infizierter Donoren das Überleben der Clodronat-behandelten Mäuse gegenüber den
Mäusen, die naives Serum erhielten, zu verlängern. Der Unterschied ist jedoch nicht
signifikant (p= 1,0000). Ein Vergleich zu den nicht-depletierten Kontrolltiergruppen ist wegen
der deutlich unterschiedlichen Suszeptibilität für MCMV nicht möglich.
In einem weiteren Experiment wurden die Tiere wegen der erhöhten Suszeptibilität nach
Clodronat-Applikation mit einer niedrigeren Dosis (1x104 PFU/ Maus) infiziert. Der Virustiter
in den Organen (Abb. 7.32 D) bestätigte die Beobachtung des Überlebensversuches.
Monozyten-depletierte Tiere, die den Serumpool inf. erhielten, zeigten eine niedrigere
Virusbeladung in den Organen als die Gruppe von Mäusen, die naives Serum bekommen
hatten.
Ergebnisse
(A)
(B)
-
-
Gate: Ly6G , NKp46 ,CD11b
+
(C)
(D)
Abb. 7.32: Schutz vor einer MCMV-Infektion durch polyklonales Mausserum nach Monozytendepletion
-/-
Rag1 -Tiere (n=5) wurden einen Tag vor und anschließend alle drei Tage nach intraperitonealer Infektion mit
5
1x10 PFU MCMV∆m157luc mit 75µl Clodrononaten i.p. behandelt. Einen Tag nach Infektion wurde den
-/-
Versuchstieren 100µl Serumpool inf. bzw. naives Serum appliziert. Als Kontrolltiere dienten Rag1 -Mäuse, die
keiner Monozytendepletion unterzogen worden waren. (A) Analyse der Monozytendepletion mittels Blut-FACSAnalysen an Tag 3 nach Clodronatgabe: Gezeigt ist die DotPlot-Auftragung der PBMCs der Versuchstiere.
hoch
Granulozyten (SSC
+
, Ly6G ) wurden im Side Scatter und über Ly6G ausgegrenzt. Monozyten wurden unter
+
+
+
-
-
Ausschluss von NK-Zellen (CD11b , NKp46 ) als eine CD11b NKp46 Ly6G -Population definiert. Monozyten
+
-
-
+
wurden in inflammatorische (Gr-1 , FcγRIV ) und residente (Gr-1 , FcγRIV ) Zellen unterteilt. Die Zellen wurden
mit einem Antikörper gegen NKp46 (FITC), CD11b (AF700), Gr-1 (PE), Ly6G (FITC) und FcγRIV (Klon: 9E9;
-/-
APC) markiert. Die Kontrolle entspricht einer unbehandelten Rag1 -Maus. Das dargestellte Ergebnis der
Monozytendepletion ist repräsentativ für die mit Clodronat-Liposomen behandelten Mäuse. Die FACS-Analyse
zeigt die erfolgreiche Depletion von durchschnittlich 83-87% der residenten Monozyten. (B) In vivo-Imaging (wie
in Abb. 7.9 beschrieben): Gezeigt sind die repräsentativen Biolumineszenzen der Versuchsmäuse (n=5) 3 Tage
nach Serumpool inf.-Therapie. Die Clodronat-behandelten Mäuse zeigen starke Biolumineszenz-Signale (C)
Kaplan-Meier-Kurve: Blau markiert ist der Zeitpunkt des Serumtransfers (1 Tag nach Infektion), grün markiert ist
die erste i.p.-Gabe von 100µl Clodronaten (1 Tag vor Infektion). Danach erfolgte die Clodronatbehandlung (75µl/
Maus) jeden 3. Tag. Als Kontrolle dienten Clodronat-unbehandelte Mäuse, die mit Serum therapiert wurden.
Statistik: Log-rank-Test, nicht signifikant: p > 0.05. Gezeigt ist die repräsentative Überlebenskurve eines von zwei
durchgeführten Versuchen. (D): Gemessene Virusbeladung (wie in Abb. 7.11 B beschrieben) in den Organen von
Clodronat-behandelten Mäusen 10 Tage nach Therapie mit Serum. Die Versuchstiere wurden wegen der
4
erhöhten Suszeptibilität nur mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert. Zum Zeitpunkt des Versuchsendes waren
bereits einzelne Mäuse wegen eines schweren Krankheitsverlaufs euthanasiert worden.
105
Ergebnisse
Transfer von Monozyten in Fcγ-Rezeptor-defiziente Mäuse
Da die Depletion von Monozyten die MCMV-Suszeptibilität enorm verstärkt und die Mäuse
innerhalb weniger Tage an der Infektion versterben, wurde ein Versuchsprotokoll für den
Transfer von Monozyten etabliert (Abb. 7.33). Hierzu wurden CD115+-Zellen aufgereinigt und
transferiert.
+
Gate: CD11b Monozyten
+/+
Fcγ
-Donoren
3
p.i.
8
p.i.
Organentnahme
+ Bestimmung der
Virusbeladung
Monozyten-Transfer i.v.
5
Serumpool inf.-Gabe
+ in vivo Imaging
CD115+ Zellen
via MACS-Beads
10 PFU
MCMV i.p.
106
-/-
Fcγ -Rezipient
0
11
p.i.
Tage
Abb. 7.33: Experimentelles Protokoll zur Analyse der protektiven Wirkung von adoptiv transferierten
Monozyten
-/-
5
Die Fcγ -Rezipienten wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc intraperitoneal (i.p.) infiziert und drei Tage später
mit 100µl Serumpool inf. i.p. behandelt. Die Infektion wurde mittels in vivo-Imaging kontrolliert (Daten nicht
gezeigt). 8 Tage nach Infektion fand der adoptive Transfer der aufgereinigten Monozyten statt. 3 Tage nach
Transfer wurde der Versuch beendet und die Versuchstiere wurden auf ihre Virusbeladung in verschiedenen
-/-/+/+
Organen untersucht. Als Kontrolle wurden Fcγ - und Rag1 (Fcγ )- Mäuse herangezogen, die mit Serum
therapiert, jedoch keinem Zelltransfer unterzogen worden waren.
Für den Transfer wurden Milzen und das Blut der Donoren aufbereitet und die Monozyten mittels MACSTechnologie (biotinylierter anti-CD115-Antikörper + Streptavidin-MACS-Beads, Miltenyi) aufgereinigt. Die
Aufreinigung wurde in der FACS-Analyse überprüft (siehe DotPlot-Abbildung). Die Monozytenpopulation lässt
+/+
+
-/+
sich in residente (Gr-1 , FcRIV ) und inflammatorische (Gr-1 , FcRIV ) Monozyten sowie Makrophagen (Gr-1 ,
+
FcRIV , nur in Milz) unterteilen. Die Färbung der Monozyten erfolgte wie in Abb. 7.28 beschrieben. Die
aufgereinigten Zellen aus Milz und Blut wurden gepoolt und intravenös (i.v.) verabreicht.
Ergebnisse
Als Donoren dienten Rag1-/- (Fcγ+/+)- Mäuse, die alle aktivierenden Fcγ-Rezeptoren auf der
Zelloberfläche von Monozyten tragen. Als Rezipienten wurden MCMV-infizierte Fcγ-/--Mäuse
eingesetzt. Pro Tier wurden 4x106 CD115+-Zellen transferiert. Da gereifte Monozyten in vivo
nur sehr kurzlebig sind (Geissmann et al., 2003), wurde der beschriebene Versuch bereits
drei Tage nach Zelltransfer beendet. Die Versuchstiere wurden getötet und die Organe zur
Bestimmung der Virusbeladung entnommen. Die Quantifizierung der viralen Organtiter
erfolgte mittels Luziferase-Test (Abb. 7.34).
Die Fcγ-/--Mäuse konnten die virale Infektion nach der Serumpool inf.-Therapie nicht
kontrollieren und wiesen signifikant höhere Luziferasewerte auf als die Fcγ+/+-Tiere. Die Fcγ-/-Mäuse, denen zusätzlich Monozyten verabreicht wurden, zeigten niedrigere Viruslasten auf
als die Fcγ-/--Kontrollrezipienten. Werden alle vier Tiere der Monozyten-transferierten Gruppe
in die Statistik eingesetzt, ist der Unterschied zur Fcγ-/--Gruppe nicht signifikant. Wird die
Maus mit hohem Virustiter (markiert * in Abb. unten) in der Statistik ignoriert, ergibt sich eine
signifikante Differenz. Eine Verringerung der Virusbeladung auf das Niveau der Viruslast von
Fcγ+/+-Mäusen konnte der Transfer der Monozyten jedoch nicht erreichen. Eine Signifikanz
konnte wegen der kleinen Mausanzahl in diesen Gruppen (Fcγ+/+ und Fcγ-/- + Monozyten)
nicht erreicht werden.
-/-
-/-
● Fcγ + Monozyten ○ Fcγ
+/+
■ Fcγ
Abb. 7.34: Monozyten sind am Antikörper-vermittelten Schutz vor MCMV beteiligt
Die Versuchstiere wurden nach dem experimentellen Protokoll (Abb. 7.33) infiziert und mit Serumpool inf.
+
+/+
therapiert. An Tag 8 nach Infektion wurden CD115 -Zellen aus Milz und Blut der Fcγ -Donoren aufgereinigt und
6
+
-/-
-/-
4x10 CD115 -Zellen pro Fcγ -Rezipientenmaus (n=4) transferiert. Als Kontrolle dienten nicht transferierte Fcγ +/+
Tiere (n=5) und Fcγ -Mäuse (n=3). 10 Tage nach Infektion wurden die oben genannten Organe entnommen und
die daraus hergestellten Homogenate auf ihre Virusbeladung hin untersucht, wie in Abb. 7.11 B beschrieben;
-/Statistik: Mann-Whitney-Test; * p < 0.05, n.s.: nicht signifikant; * Maus der Gruppe Fcγ + Monozyten mit
erhöhtem Virustiter. Gezeigt ist das repräsentative Ergebnis von zwei durchgeführten Versuchen.
107
108
Ergebnisse
7.10.2 Rolle der NK-Zellen
NK-Zellen der Maus sind über den FcγRIII fähig, Antikörper-vermittelt Zellen zu lysieren
(ADCC) (Nimmerjahn & Ravetch, 2006). Unsere Daten bezüglich FcγRIII deuteten bisher
darauf hin, dass NK-Zellen beim Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion
keine wesentliche Rolle spielen (Abb. 7.22). Zur weiteren Untersuchung der Bedeutung von
NK-Zellen für den Schutzeffekt durch polyklonale Serumantikörper wurden die NK-Zellen in
Rag1-/--Versuchstieren depletiert. Zur Entfernung der NK-Zellen wurde ein depletierender
anti-NK1.1. (Klon: PK136)- Antikörper verwendet. Die Gabe von 500µg anti-NK1.1. führte zur
kompletten Depletion der NK-Zellen. Im Durchschnitt wurden > 97% der NK-Zellen entfernt.
Im Experiment wurden die Empfänger-Mäuse einen Tag vor Infektion und nach 7 Tagen
erneut mit anti-NK1.1. behandelt und die Depletion durch FACS-Analysen von PBMCs im
Blut der Tiere nachgewiesen (Abb. 7.35). Der Versuchsverlauf entsprach dem bereits
beschriebenen experimentellen Protokoll (Abb. 7.15).
Abb. 7.35: FACS-Analyse der NK-Zelldepletion im Blut 6 Tage nach NK1.1.-Gabe
Gezeigt ist die DotPlot-Auftragung von PBMCs der Versuchstiere. Die PBMCs wurden mit einem FITCgekoppelten Antikörper gegen NKp46 markiert und gegen den Side-Scatter (SSC) in der Analyse aufgetragen.
Die Kontrolle entspricht einer unbehandelten, nicht-depletierten Maus. Das dargestellte Ergebnis der anti-NK1.1.Behandlung ist repräsentativ für die mit dem Antikörper behandelten Mäuse. Die DotPlot-Analyse zeigt die
erfolgreiche Depletion der NK-Zellen nach anti-NK1.1.-Gabe.
Die Ergebnisse der Virustiter zeigten deutlich (Abb. 7.36 A), dass trotz NK-Zelldeple-tion die
Viruslast nach Serumpool inf.-Therapie in allen Organen signifikant gesenkt wurde,
verglichen mit den Mäusen nach Gabe von naivem Serum. Auffällig ist jedoch, dass die mit
dem anti-NK1.1. und naivem Serumpool behandelten Mäuse höhere Viruslasten in allen
Organen aufwiesen als die nicht-depletierten Tiere (Ausnahme Milz nach Therapie mit
naivem Serum). Dies deutet darauf hin, dass die NK-Zelldepletierten Mäuse für MCMV
suszeptibler sind als die nicht-depletierten Kontrollmäuse. Aus diesem Grund wurde das
Ausmaß der Reduktion des viralen Titers nach Immunserum-Therapie für beide
Rezipientengruppen (+ anti-NK1.1. und keine Depletion) ermittelt (Abb. 7.36 B). In der Lunge
Ergebnisse
und Milz führt die Immunserum-Therapie nach NK-Zelldepletion zu einer tendenziell
geringeren Reduktion der Virusbeladung als in den NK-Zelltragenden Tieren. Der Verlust der
NK-Zellen erhöht dagegen in den Speicheldrüsen die Reduktion des Virustiters nach Gabe
MCMV-spezifischer Serumantikörper signifikant. Im Bezug auf Leber und Niere ist kein
Virustiterunterschied zwischen beiden Mausgruppen zu erkennen. Die Ergebnisse dieses
Versuchs deuten darauf hin, dass die NK-Zellen in unserem Infektionsmodell organspezifisch
agieren. Beim Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion scheinen diese
Zellen keine tragende Rolle zu spielen.
(A)
● anti NK1.1. + Serumpool inf.
▲ anti NK1.1. + Serum naiv
○ Serumpool inf.
∆ Serum naiv
(B)
Abb. 7.36: Rolle der NK-Zellen beim Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion
-/-
5
Rag1 -Tiere (n=5/ Gruppe) wurden mit 1x10 PFU MCMV∆m157luc infiziert und drei Tage nach Infektion (p.i.) mit
polyklonalem Serumpool inf. bzw. naivem Serum (100µl/Maus) behandelt. Die NK-Zelldepletion erfolgte durch die
intraperitoneale Injektion von 500µg anti-NK1.1. einen Tag vor und anschließend 6 Tage nach Infektion mit
MCMV. 14 Tage nach Therapie wurden die oben genannten Organe entnommen und die daraus hergestellten
Homogenate auf ihre Luziferaseaktivität hin untersucht (wie in Abb. 7.11 B beschrieben).
(A) Viruslastbestimmung in den Rezipiententieren nach Depletion von NK-Zellen. (B) Reduktion der
Virusbeladung nach Transfer von Serumpool inf.. Der Mittelwert der Luziferasewerte in den Mausorganen Gruppe
-/-/Serumpool naiv (Rag1 + anti-NK1.1. bzw. Rag1 keine Depletion) wurde jeweils ins Verhältnis gesetzt zu den
gemessenen Werten der entsprechenden Mausgruppe nach Therapie mit polyklonalem Serumpool inf.. Der
Quotient ergibt die n-fache Reduktion des Organtiters nach Behandlung mit MCMV-spezifischen
Serumantikörpern. Statistik (A+B): Mann-Whitney-Test; * p< 0.05, ** p< 0.005, n.s.: nicht signifikant; gezeigt
werden die repräsentativen Ergebnisse eines von drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
109
110
Diskussion
8 Diskussion
Die Gabe von Immunglobulinen bzw. CMV-spezifischen Hyperimmunseren (HIS) stellt bei
einer HCMV-Infektion von immunsupprimierten Patienten sowie Schwangeren einen
wichtigen und vielversprechenden Therapieansatz dar. In klinischen Transplantationsstudien
konnte bereits gezeigt werden, dass die Gabe von HIS bzw. intravenös verabreichten
Immunglobulinen (IVIG) den progressiven Krankheitsverlauf einer CMV-Infektion und sogar
den Tod verhindern kann (Snydman et al., 1987; Kocher et al., 2003). Es wurde ebenfalls
berichtet, dass die HIS-Behandlung von schwangeren Frauen, die eine HCMVPrimärinfektion durchliefen, das Risiko vor einer kongenitalen Infektion des ungeborenen
Kindes mindern kann (Nigro et al., 2005). Allerdings hat sich der prophylaktische und
therapeutische Einsatz von antiviralen Hyperimmunseren insgesamt als nur begrenzt
wirksam erwiesen. In vielen Fällen wurde lediglich das Risiko einer Neuinfektion bzw.
Reaktivierung gesenkt oder die Krankheitssymptome einer bestehenden CMV-Erkrankung
wurden gemildert (Wittes et al., 1996; Raanani et al., 2008; Adler, 2012). Es ist daher
notwendig, die Antikörperbehandlung zu optimieren und die Ursachen für den limitierten
Erfolg einer Antikörpertherapie zu klären. Das bessere Verständnis des Antikörpervermittelten Wirkmechanismus bei einer viralen Infektion sollte dazu beitragen, den
Therapieansatz mit antiviralen Immunglobulinen zu optimieren.
Frühere Arbeiten mit MCMV im Mausmodell haben bereits gezeigt, dass der adoptive
Transfer von Serum infizierter oder immunisierter Tiere den MCMV-Titer infolge einer
Neuinfektion oder bei einer reaktivierten Infektion senken kann (Araullo-Cruz et al., 1978;
Shanley et al., 1981; Lawson et al., 1988; Cekinović et al., 2008). Die Experimente von
Klenovsek et al. (2007) stellten heraus, dass der adoptive Transfer von MCMV-spezifischen
Gedächtnis-B-Zellen (GBZ) in immundefizienten Rag1-/--Mäusen eine MCMV-spezifische
Antikörperantwort induziert, die für die Kontrolle und Inhibition der viralen Dissemination
verantwortlich sind. Auf diesen Ergebnissen basierend wurden in der vorliegenden Arbeit die
möglichen Effektormechanismen dieser Antikörper untersucht und die beteiligten, für den
Schutz verantwortlichen Antigenspezifitäten analysiert.
Diskussion
8.1 Rolle der Antigenspezifitäten
Eine Virusinfektion induziert Antikörper sowohl gegen virale Strukturproteine als auch gegen
nicht-strukturelle virale Antigene, die auf der Oberfläche infizierter Zellen exprimiert werden.
Im Gegensatz zu den Antikörpern gegen Strukturproteine sind die Antikörper gegen nichtstrukturelle Antigene in den in vitro-Analysen ausschließlich nicht-neutralisierend. Die
Identifizierung immundominanter MCMV-Antigene, die eine protektive Antikörperantwort
induzieren können, sollte zur Klärung des Schutzmechanismus von Antikörpern beitragen.
Hierzu wurden alle potentiellen MCMV-Glykoproteine in einen eukaryoten Vektor kloniert und
auf ihre Oberflächenexpression untersucht. Nicht alle rekombinanten MCMV-Glykoproteine
wurden auf der Oberfläche transfizierter Zellen mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz
nachgewiesen. Es ist durchaus möglich, dass diese rekombinant hergestellten Proteine
falsch gefaltet waren und von der Zelle abgebaut wurden oder für die Zellen toxisch waren.
Insgesamt wurden 34 Glykoproteine auf der zellulären Oberfläche nachweisbar exprimiert
und erlaubten die Charakterisierung von Antikörperspezifitäten aus Seren von MCMVimmunen Mäusen, die mit MCMV infiziert (Serum inf.) bzw. immunisiert (Serum imm.)
wurden. Es muss jedoch dabei bedacht werden, dass die Erkennung der Antigene durch die
Serumantikörper in der indirekten Immunfluoreszenz eingeschränkt sein kann. Eine geringe
Transfektionsrate des Plasmids oder die schwache Expression der Proteine auf der
Zelloberfläche können Faktoren sein, die die Bindung der Serumantikörper minimieren und
den Nachweis durch die Antikörper erschweren. Außerdem ist es nicht auszuschließen, dass
die Antikörper konformationsabhängige Epitope erkennen, die durch die Faltung des
Glykoproteins nach einer Infektion bzw. Immunisierung entstehen. Dadurch könnte die
Bindung dieser Antikörper an das rekombinant-exprimierte Protein eingeschränkt sein.
Unsere Analysen zeigten, dass nach einer Infektion 16 von 34 und nach einer Immunisierung
8 von 34 der rekombinanten Proteine durch Serumantikörper erkannt wurden. Neben den
Strukturproteinen gB und gM/gN scheinen die Proteine m07, m08 oder m14 immundominant
zu sein, da sie von > 50% der getesteten Seren infizierter Donoren erkannt wurden. Über
diese Proteine existiert noch keine Literatur und laut Vorhersagen von Kattenhorn et al.
(2004) werden sie nicht in das Viruspartikel eingebaut. Es ist daher möglich, dass es sich
dabei um nicht-strukturelle Proteine handelt. Diese viralen Proteine wären gute Kandidaten
für die Herstellung monoklonaler Antikörper (mAb). Therapieversuche mit diesen mAbs
würden einen Hinweis darauf geben, ob nicht-neutralisierende Antikörper Schutz nach einer
MCMV-Infektion vermitteln können.
Einen ersten Anhaltspunkt zur Klärung dieser Fragestellung lieferten die Experimente mit
den mAbs gegen m04 und m153, die von Prof. Dr. S. Jonjić (Universität Rijeka, Kroatien)
hergestellt und in unseren Experimenten therapeutisch in die infizierten Rag1-/--Mäuse
eingesetzt wurden (Kap. 7.3.2). Beide Antikörper zeigten im in vitro- Neutralisationstest keine
111
112
Diskussion
Aktivität (Daten nicht gezeigt). Die Gabe beider mAbs in Kombination verminderte die
Viruslast in den Organen gegenüber der für MCMV irrelevanten IgG-Kontrolle. Die Daten
deuteten darauf hin, dass nicht-neutralisierende Antikörper, die gegen nicht-strukturelle
Virusantigene gerichtet sind, am Antikörper-vermittelten Schutz beteiligt sind. Der
schützende Effekt beider Antikörper war jedoch wesentlich geringer als der des
verabreichten Serumpool inf., der die Virusbeladung in den Organen auf ein sehr niedriges
Level reduzierte. Dies kann mehrere Gründe haben. Das Protein m04 gilt als
Immunevasionsprotein, das MHC-I-Moleküle im Endoplasmatischen Reticulum bindet und
einen Komplex bildet, der auf die Zelloberfläche transportiert wird (Kleijnen et al., 1997). Auf
diese
Weise
wird
die
NK-Zellantwort
und
eine
MHC-I-restringierte
CTL-Antwort
herunterreguliert (Kavanagh et al., 2001). Sollte das Epitop, das der mAb auf m04 bindet,
konformationsabhängig sein, ist die Erkennung des Antikörpers, bedingt durch die
Komplexbildung mit MHC-I, während der Infektion nicht mehr möglich. Zum anderen ist nicht
auszuschließen, dass die Oberflächenexpression von m04 so gering ist, dass der Antikörper
sein Zielantigen während der laufenden Infektion nicht detektiert. Die Bindung an m153
könnte sich ähnlich verhalten, falls m153 im Verlauf einer natürlichen Infektion nur in
geringen Konzentrationen auf der Zelloberfläche exprimiert wird.
Möglicherweise ist die Kombination vieler unterschiedlicher nicht-neutralisierender und/oder
neutralisierender Antikörperspezifitäten für die Schutzfunktion ausschlaggebend. Der in
unseren Versuchen verwendete protektive Serumpool inf. enthält unterschiedliche
Spezifitäten gegen verschiedene Struktur- und Nicht-Strukturproteine (Tab. 7.2), die
neutralisierend und nicht-neutralisierend wirken können. Burton et al. (2001) argumentieren
zudem, dass für die effektive Neutralisation von Viren lediglich die Besetzung möglichst
vieler viraler Epitope durch viele unterschiedliche Antikörperspezifitäten notwendig ist.
Hinweise hierfür lieferten bereits Studien zu HIV (Scheid et al., 2009; Klein et al., 2012). Die
Kombination mehrerer Antikörperspezifitäten, gerichtet gegen unterschiedliche Epitope von
HIV, riefen in diesen Arbeiten die bestmögliche antivirale Aktivität hervor.
Zum besseren Verständnis des Effektormechanismus der protektiven Serumantikörper des
Serumpools ist es notwendig, eine Sammlung an verschiedenen mAbs unterschiedlicher
Antigenspezifitäten zur Verfügung zu haben. In vivo-Therapieexperimente mit diesen mAbs
könnten sowohl den Einfluss verschiedener Antikörperspezifitäten auf die virale Protektion
herausstellen als auch zur Klärung des Antikörper-vermittelten Effektormechanismus
beitragen. Bisher waren unsere Versuche, mAbs gegen m07 und m08 herzustellen, leider
nicht erfolgreich.
8.2 Antikörper-vermittelte Effektormechanismen
Die Kontrolle einer Virusinfektion durch Antikörper kann verschiedenen Mechanismen
unterliegen (Burton, 2002). Dazu zählen die Neutralisation und Komplement-abhängige
Diskussion
Eliminierung freier Viruspartikel sowie die Eliminierung virusinfizierter Zellen durch FcRezeptor-exprimierende Effektorzellen (ADCC/ Phagozytose) oder durch das Komplement
(CDC). Die genauen Effektormechanismen der humoralen Immunantwort gegen CMV sind
bisher noch nicht geklärt. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass neben
der Neutralisation freier Viruspartikel auch andere Mechanismen eine wichtige Rolle beim
Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion spielen. Der Versuch von MCMV
mittels der Expression viraler Fc-Rezeptoren (vFcR) die humorale Abwehr zu umgehen, wie
der vFcR des m138-Genproduktes, war für den Antikörper-vermittelten Schutz nicht von
großer Bedeutung. Crnković-Mertens und Kollegen (1998) zeigten auch in einer früheren
Arbeit, dass die Virusreplikation nicht von der vFcR-Expression und dem damit verbundenen
Abfangen von Immunglobulinen beeinflusst wird. Bei FACS- oder in vitro-Analysen von
MCMV-infizierten Zellen wurden die viralen Fc-Rezeptoren mit unspezifischem Serum aus
der Maus oder der Ziege geblockt, um mögliche Interaktionen von Nachweis-Antikörpern mit
den vFcR auszuschließen.
8.2.1 Neutralisation von MCMV
Neutralisation von Viren durch Antikörper kann in verschiedenen Stadien der Infektion
stattfinden und unterliegt damit unterschiedlichen Effektormechanismen (Reading &
Dimmock, 2007). Die neutralisierende Aktivität ist u.a. abhängig vom zu infizierenden Zelltyp,
wie schon für HCMV (Gerna et al., 2008) und für MCMV in dieser Arbeit bestätigt wurde
(Abb. 7.7). Im Allgemeinen stellt die Antikörper-abhängige Neutralisation während einer
viralen Infektion einen sehr wichtigen Schutzmechanismus für viele verschiedene
Virussysteme dar. Studien am Makaken-Modell mit dem Affen-Immundefizienz-Virus (SIV;
engl.: simian immunodeficiency virus) (Shibata et al., 1999; Bogers et al., 2008; Roederer et
al., 2014) oder am Mausmodell mit Influenzaviren (Laursen & Wilson, 2013) stellten die
Neutralisation als eine essentielle Schutzfunktion heraus. Für HCMV beruht die Entwicklung
eines Vakzins v.a. auf der Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen Epitope von
Strukturproteinen (Britt & Mach, 1996, Pass et al., 2009; Freed et al., 2013). Damit wird dem
Mechanismus
der
HCMV-Neutralisation
ebenfalls
ein
hohes
Protektionsvermögen
beigemessen. In einem MCMV-Infektionsmodell mit neugeborenen Mäusen hatten
neutralisierende mAbs das Potential, die Viruslast im Gehirn der infizierten Tiere zu
reduzieren, erreichten jedoch nicht den Schutzlevel eines MCMV-spezifischen Serums
(Cekinović et al., 2008). In unserer Arbeitsgruppe wurden ähnliche Ergebnisse mit der
Therapie neutralisierender mAbs erzielt, die gegen das virale Hüllprotein gN oder gB
gerichtet
waren
(Dissertation
Astrid
Karbach,
http://www.opus4.kobv.de/opus4-
fau/files/3528/DissertationAstridKarbach.pdf. Wie bereits diskutiert, kann hier die fehlende
Mischung unterschiedlicher Antikörperspezifitäten für den Teilschutz bei der MCMV-Infektion
113
114
Diskussion
verantwortlich
sein.
Es
ist
aber
auch
denkbar,
dass
die
Neutralisation
als
Effektormechanismus nicht ausreichend ist für die effektive Inhibition von MCMV.
In der vorliegenden Arbeit wurde dazu ein experimenteller Ansatz gewählt, der den
Schutzeffekt eines Serumpools MCMV-immunisierter Tiere mit dem eines Serumpools
infizierter Tiere verglich. Beide Serumpools setzten sich jeweils aus unterschiedlichen
Antikörperspezifitäten zusammen (Daten nicht gezeigt) und hatten ähnliche IgG-Titer gegen
MCMV (Abb. 7.5.). Die Neutralisationskapazität der Pools wurde außerdem in vitro normiert
(Kap. 7.3.1). Es muss jedoch bedacht werden, dass die gemessene in vitroNeutralisationskapazität und der Neutralisationsmechanismus sich durchaus von der in vivoSituation unterscheiden können (Farrel & Shellam, 1990; Farrel & Shellam, 1991). Auch ein
in vitro gut neutralisierender Antikörper kann im lebenden Organismus durchaus keine
Wirkung haben. Im in vivo-Transferexperiment mit MCMV-infizierten Mäusen riefen die
Serumantikörper des Pools imm. eine geringere Protektion hervor als die Antikörper des
Serumpools inf.. Diese Beobachtung stimmt mit den Ergebnissen von Klenovsek et al.
(2007) überein, bei denen die Gedächtnis-B-Zellen aus immunisierten Donoren einen
geringeren MCMV-Schutz vermittelten. Beide Serumpools unterscheiden sich in der
Zusammensetzung der antigenspezifischen Antikörper. Die MCMV-Infektion induziert
zusätzlich zu der humoralen Immunantwort gegen Strukturproteine auch die Herstellung von
Antikörpern gegen Nicht-Strukturproteine, die nicht-neutralisierend sind. Somit deuten die
Daten
darauf
hin,
dass
neben
der
Neutralisation
andere
Antikörper-vermittelte
Effektorfunktionen zusätzlich an der Protektion einer MCMV-Infektion beteiligt sind.
Es ist schwierig, der Neutralisation in unseren Schutzexperimenten eine eindeutige Funktion
zuzuschreiben, denn die Ergebnisse unserer Experimente deuten zumindest auf einen
Teilschutz der MCMV-Infektion durch neutralisierende Antikörper hin. Die Herstellung von
Fab- oder Fab(2)-Fragmenten der polyklonalen IgGs der Serumpools (durch enzymatische
Abtrennung des Fc-Teils) wäre dazu eine Möglichkeit, zwischen Neutralisation und IgG-Fcabhängigen Prozessen wie ADCC, Phagozytose oder CDC zu differenzieren. Die Arbeit von
Mozdzanowska und Kollegen (2003) am Influenza-Mausmodell demonstrierte, dass die
Behandlung von infizierten SCID-Mäusen mit Fab-Fragmenten eines mAbs die Infektion
kontrollierte. Der Effekt konnte damit auf die Neutralisation des Virus zurückgeführt werden.
Schlesinger und Chapman (1995) zeigten dagegen, dass nach Entfernung der Fc-Domäne
eines stark neutralisierenden mAbs gegen das Gelbfiebervirus das verbleibende F(ab)2Fragment weiterhin in vitro dieselbe Neutralisationskapazität besaß, aber in vivo keinen
effektiven Schutz lieferte. Das bestätigt die Beobachtung von Hangartner et al. (2006), der
zeigen konnte, dass neutralisierende Antikörper ebenfalls über neutralisationsunabhängige
Mechanismen protektiv wirken, wie z.B. über Fc-Rezeptoren. Dass die Situation insgesamt
sehr komplex ist, demonstrieren die neuesten Daten zu Schutzversuchen mit mAbs am
Influenza-Mausmodell (Dilillo et al., 2014). Dilillo und Kollegen (2014) zeigten, dass
Diskussion
Antikörper, die gegen das Hämagglutinin (HA) allein gerichtet sind, sowohl über FcγRezeptor-abhängige als auch gleichzeitig -unabhängige Mechanismen in vivo-Schutz
vermitteln können.
8.2.2 Die Bedeutung der MCMV-Dissemination für den Antikörper-vermittelten Schutz
Zur Klärung des schützenden Effektormechanismus von Antikörpern ist es notwendig zu
wissen, wie CMV disseminiert. Die virale Ausbreitung über freie Viruspartikel ist ein guter
Angriffspunkt für neutralisierende Antikörper. Bei einer zellassoziierten Dissemination kann
das Virus der viralen Kontrolle durch neutralisierende Antikörper entkommen. Hier würde
vielmehr
die
Antikörper-vermittelte
Schutzmechanismus darstellen.
Zytolyse
oder
Phagozytose
einen
wichtigen
HCMV wird in seropositiven Donoren vorwiegend
zellgebunden in Leukozyten detektiert (Winston et al., 1980; Lipson et al., 2001; Roback et
al., 2006), wohingegen die Viruskonzentration von extrazellulärem Virus nur sehr gering ist
(Hamprecht et al., 1998). Die zellassoziierte Transmission von HCMV könnte auch ein Grund
dafür
sein,
weshalb
die
klinische
Anwendung
von
neutralisierend
wirkenden
Immunglobulinen in Transplantationspatienten keinen eindeutigen Schutzeffekt bei einer
HCMV-Reaktivierung zeigen (Boeckh, 1999). In weiteren Arbeiten wurde auch beschrieben,
dass neutralisierende Antikörper nicht die Fähigkeit besitzen, die virale Dissemination über
Zell-Zell-Transmission zu verhindern (Sinzger et al., 2007; Jacob et al., 2013). Der genaue
Mechanismus der Transmission von infektiösem Virus von einer infizierten Zelle zu einer
uninfizierten Zelle ist bisher nicht genau geklärt, könnte aber auf der Zell-Zell-Fusion beruhen
(Digel et al., 2006).
Nach Wirtseintritt disseminiert MCMV nach einer initialen Replikation in Endothelzellen oder
Stromazellen hämatogen über Monozyten (Stoddart et al., 1994). Hsu et al. (2009)
demonstrierten dagegen die virale Ausbreitung über freie Viruspartikel. Dies würde die Daten
von Spector et al. (1992) bestätigen, die infektiöse HCMV-Partikel im Plasma von AIDSPatienten nachweisen konnten. Während einer Virämie ist die produktive Virusreplikation
ebenfalls mit der Freisetzung von neuen Viruspartikeln aus der Zelle verbunden. Diese
haben anschließend die Möglichkeit, andere bzw. benachbarte Zellen über Penetration neu
zu infizieren. Damit würden die extrazellulären Viren auch wieder zum Angriffspunkt von
neutralisierenden Antikörpern. Obwohl in der Literatur allgemein die Meinung vertreten wird,
dass MCMV präferenziell zellassoziiert disseminiert, kann in unserem Infektionsmodell die
Neutralisation als am Schutz beteiligter Effektormechanismus nicht ausgeschlossen werden.
8.2.3 Antikörper-vermittelte Kontrolle von MCMV durch Komplement
Das Komplementsystem besitzt die Fähigkeit, sowohl freie Viruspartikel als auch
virusinfizierte Zellen über die Bindung des Fc-Teils eines Virus-gebundenen IgGs zu
eliminieren (Hirsch, 1982). Phagozytierende Zellen, die Komplement-Rezeptoren auf ihrer
115
116
Diskussion
Oberfläche tragen, haben so die Möglichkeit, Virus-Antikörper-Komplexe oder infizierte
Zellen zu beseitigen. In älteren Arbeiten wird die direkte Antikörper-vermittelte Virolyse
postuliert (Berry & Almeida, 1968; Welsh et al., 1976). Die Antikörper-vermittelte
Neutralisation von Viren kann durch die Erkennung und Bindung von Komplementproteinen
verstärkt werden, indem das Komplement die zelluläre Bindung und Penetration des Virus
zusätzlich zu den gebundenen Antikörpern blockiert. Dieser Mechanismus ist für
verschiedene Viren wie Paramyxoviren (Johnson et al., 2008) und Influenza (Jayasekera et
al., 2007), aber auch für HCMV mehrfach beschrieben (Spiller et al., 1997; Ohta et al., 2009).
Unsere in vitro-Neutralisationsdaten (Abb. 7.8) bestätigen diese Beobachtungen für MCMV.
Die getesteten Serumpools neutralisieren das Virus mit intrinsischem Komplement um ein
Vielfaches besser als ohne Komplement. Die Rolle des Komplements beim Antikörpervermittelten Schutz in vivo ist damit jedoch nicht geklärt. Aus diesem Grund wurde ein
Versuchsansatz etabliert, der es erlaubte, die Schutzwirkung von Antikörpern in der
Abwesenheit des Komplements am Mausmodell zu untersuchen. Die Depletion des
Komplements erfolgte durch die Verabreichung des Cobra Venom Faktors. Unsere Daten
zeigten deutlich, dass das Komplement bzw. der CDC-Effektormechanismus keine
herausragende Rolle beim Antikörper-vermittelten Schutz in unserem Infektionsmodell spielt.
Die Tiere kontrollierten die MCMV-Infektion nach Immunserumgabe in allen Organen trotz
Komplement-Depletion. Lediglich in der Lunge und Leber war ein tendenziell höherer
Virustiter zu sehen, verglichen mit der Mausgruppe, die über ein funktionierendes
Komplementsystem verfügte. Das deutet darauf hin, dass das Komplement die virale
Replikation mit Hilfe von Antikörpern organspezifisch beeinflussen kann, jedoch nicht
vollständig inhibiert. Möglicherweise wurde der Ausfall des Komplementsystems durch
andere Antikörper-vermittelte, protektive Mechanismen kompensiert. Es ist auch denkbar,
dass das Komplementsystem während der MCMV-Infektion keine Funktion hat, da das Virus
ein effizientes System entwickelt hat, der Komplementkaskade zu entkommen. Für HCMV ist
bekannt, dass es u.a. die Expression der zellulären Komplementregulationsproteine, CD46
und CD55, auf der Oberfläche infizierter Zellen hochreguliert, wodurch die Akkumulation von
C3-Konvertasen gesenkt wird. Dadurch werden die infizierten Zellen vor der Lyse durch den
Membranangriffskomplex geschützt (Spiller et al., 1996). MCMV induziert ebenfalls die
Expression von CD46 auf infizierten Mausfibroblasten, die mit einer verminderten Zytolyse
durch das Komplement einhergeht (Nomura et al., 2002). Die viralen Proteine, die in diese
Antikörper-vermittelte Komplementaktivität eingreifen, sind noch nicht identifiziert.
8.2.4 FcγR-abhängige Kontrolle von MCMV durch spezifische Antikörper
Unsere bisherigen Daten deuten darauf hin, dass Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelte Mechanismen am Schutz bei einer MCMV-Infektion beteiligt sind. Hierbei wäre ADCC oder die
Phagozytose von infizierten Zellen bzw. von Virus-Antikörper-Komplexen denkbar. Diese
Diskussion
Hypothese wurde mittlerweile in Arbeiten mit anderen Virussystemen wie dem West-Nil-Virus
(Chung et al., 2007), SIV am Makaken-Modell (Sun et al., 2011) oder dem Influenzavirus
(Jegaskanda et al., 2013a) bestätigt. Für Herpesviren gibt es ebenfalls Hinweise für die
Beteiligung von FcγR beim Antikörper-vermittelten Schutz (Kohl et al., 1990; Chu et al.,
2008). Die genaue Bedeutung von FcγR beim Antikörper-vermittelten Schutz von
Cytomegalovirus-Infektionen ist dennoch nicht klar.
Einfluss der Fcγ-Kette auf den Antikörper-vermittelten Schutz
Zur Klärung der Rolle der FcγR in unserem Infektionsmodell wurden FcγR-defiziente Mäuse,
die eine genetische Deletion der γ-Kette aufwiesen, zunächst auf Rag1-/- (Fcγ+/+) -Hintergrund
gekreuzt und gezüchtet. Die γ-Kette ist ein wesentlicher Bestandteil des für IgE hoch-affinen
FcεR (Ra et al., 1989) sowie des FcγR-Proteinkomplexes aller aktivierender FcγR (FcγRI,
FcγRIII und FcγRIV). Die γ-Kette ist notwendig für die Oberflächenexpression der FcRezeptoren
auf
verschiedenen
Zellen.
Deren
Deletion
bedingt
gleichzeitig
den
Funktionsverlust der FcγR (Takai et al., 1994) sowie anderer γ-Kette-abhängiger Proteine
wie des NK-Zellrezeptors NKp46 (Moretta et al., 2001), des PIR-A (paired Ig-like receptor;
Takai & Ono, 2001) und des eines C-Typ-Lectins Mincle, das v.a. auf Makrophagen
exprimiert wird (Yamasaki et al., 2008). Die Ergebnisse der Serumtransferversuche mit
FcγR-defizienten Rag1-/--Mäusen (Fcγ-/-) (Kap. 7.5) zeigten deutlich, dass die aktivierenden
FcγR für den Antikörper-vermittelten Schutz während einer MCMV-Infektion entscheidend
sind. Die Fcγ-/--Mäuse hatten signifikant höhere Virustiter in allen Organen und ein signifikant
verkürztes Überleben gegenüber den Tieren, die über ein funktionierendes FcγRezeptorsystem verfügten. Dennoch war in dem Kurzzeitversuch eine Minderung der
Viruslast durch den immunen Serumpool in den Fcγ-/--Mäusen zu beobachten (Abb. 7.17 A).
Nach der prophylaktischen Gabe des Immunserums überlebten die Fcγ-/--Mäuse die MCMVInfektion länger als die Fcγ-/--Mäuse, die naives Serum erhalten hatten (Abb. 7.18 B). Das
bedeutet, dass trotz fehlender FcγR-Expression die polyklonalen Antikörper einen Teilschutz
gegen MCMV bewirken können. Da das Komplement offenbar keinen Einfluss auf den
Antikörper-vermittelten Schutz hat, könnte die Reduzierung des Virustiters bzw. das längere
Überleben der Fcγ-/--Mäuse auf der Neutralisation von MCMV beruhen. Allerdings wirft dies
die Frage auf, wie der Virus-Antikörper-Komplex beseitigt wird. Das erfordert demnach
weitere experimentelle Analysen.
In diesen Experimenten war gleichzeitig eine konstant erhöhte MCMV-Suszeptibilität der
Fcγ-/--Mäuse auffallend. Die gesteigerte virale Infektiösität wurde auch schon bei Influenzainfizierten, FcγR-defizienten Mäusen festgestellt (Huber et al., 2001). Wie oben beschrieben,
ist die γ-Kette mit anderen Komponenten des Immunsystems verknüpft, die Antikörperunabhängig an der Immunabwehr beteiligt sind. Der Verlust γ-Kette könnte somit zur
117
118
Diskussion
Beeinträchtigung dieser Immunreaktionen geführt haben und die erhöhte MCMV-Infektiösität
in den transgenen Fcγ-/--Mäusen in unseren Experimenten erklären.
Auswirkungen der Defizienz eines individuellen FcγR auf den Antikörper-vermittelten
Schutz
Zur genaueren Klärung dieses Effektormechanismus wurden Mäuse mit Deletion eines
individuellen FcγR (FcγRI, FcγRIII bzw. FcγIV) auf Rag1-/--Hintergrund gezüchtet und in
weiteren Serumtransferexperimenten daraufhin untersucht.
Der Funktionsverlust eines einzelnen FcγR hatte keinen Einfluss auf den Schutzeffekt des
immunen Serumpools (Kap. 7.7). Die einzelnen FcγR binden mit unterschiedlicher Affinität
an die verschiedenen IgG-Subtypen (Abb. 3.5). Dabei bindet monomeres IgG hoch-affin an
FcγRI, und Antigen-Antikörper-Immunkomplexe binden mit hoher Avidität vorwiegend an
niedrig- bis mittel-affine, aber auch an hoch-affine Fc-Rezeptoren. Der Serumpool inf., der für
die Therapie der MCMV-Infektion in den transgenen FcγR-Mäusen eingesetzt wurde, enthält
alle IgG-Subtypen. Der Ausfall eines aktivierenden FcγR kann in unserem Modell folglich von
den zwei verbleibenden aktivierenden FcγR kompensiert werden, die über die Bindung des
jeweiligen IgG-Subtyps ihre Effektorfunktion weiterhin ausüben können. Dies spricht für
einen redundanten Effekt des FcγR-Systems. Um die Aufgabe eines einzelnen FcγR in
unserem Infektionsmodell genauer zu untersuchen, müssten bei der Therapie der FcγRdefizienten Rag1-/--Mäuse protektive mAbs mit unterschiedlichem IgG-Subtyp eingesetzt
werden. Interessant war dennoch der Befund, dass die polyklonalen Serumantikörper in den
FcγRIII-defizienten Rag1-/--Mäusen keine Minderung des Schutzeffektes hervorriefen. Für
FcγRIII-defiziente Mäuse ist bekannt, dass ADCC über NK-Zellen nicht vermittelt werden
kann und die Phagozytose von IgG-gebundenen Partikeln nicht mehr möglich ist (Hazenbos
et al., 1996). Dieses Ergebnis erlaubt es, Rückschlüsse auf die Funktion von NK-Zellen
mittels ADCC zu ziehen, da NK-Zellen auf ihrer Oberfläche ausschließlich FcγRIII als
aktivierenden FcγR exprimieren. So scheinen NK-Zellen keine wesentliche Rolle beim
Antikörper-vermittelten Schutz via FcγRIII zu spielen.
Auswirkungen des Funktionsverlustes zweier aktivierender FcγR auf den Antikörpervermittelten Schutz
Zur Klärung der möglichen Redundanz des Fc-Rezeptorsystems wurden Rag1-/--Mäuse in
den Experimenten eingesetzt, die einen Funktionsverlust zweier aktivierender FcγR
aufwiesen. Für die kombinierte Deletion von FcγRI und FcγRIV standen transgene Mäuse
zur Verfügung, die auf Rag1-/--Hintergrund gekreuzt und gezüchtet wurden (FcγRI+IV-/-). Der
Funktionsverlust des FcγRI und FcγRIV hatte keinen Einfluss auf die Schutzwirkung der
polyklonalen Antikörper. Die FcγRI+IV-/--Mäuse hatten vergleichbar genauso niedrige
Virustiter in allen Organen wie die Fcγ+/+-Kontrolltiere. Der Antikörper-vermittelte Schutz
Diskussion
müsste folglich über den FcγRIII stattgefunden haben, der von Monozyten, DCs, NK-Zellen
und Neutrophilen exprimiert wird. Die Ergebnisse der Serumtransferversuche mit den
FcγRIII-/--Mäusen deuteten bereits darauf hin, dass NK-Zellen für den Schutz nicht essentiell
sind. So könnte es sich in den FcγRI+IV-/--Tieren um die Antikörper-abhängige Phagozytose
von infizierten Zellen oder Phagozytose von Virus-Antikörper-Komplexen durch Monozyten
und/oder Neutrophile über den FcγRIII handeln. Die Protektion der polyklonalen Antikörper
könnte ebenfalls durch eine erhöhte Oberflächenexpression des FcγRIII auf den
Effektorzellen begünstigt werden. Unsere FACS-Analysen zeigten in FcγRIV-/-- und
FcγRI+IV-/--Tieren auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten einen leicht gesteigerten
CD16/32-Oberflächennachweis (Abb. 7.29), der jedoch sowohl den FcγRIII als auch den
FcγRIIB betrifft und daher nicht eindeutig dem FcγRIII zuzuordnen ist.
Zum Zeitpunkt des Versuchs existierten für die kombinierte Defizienz des FcγRI und FcγRIII
keine genetisch veränderten Mäuse. Eine genetische Deletion der FcγRIII- und FcγRIVKombination ist dagegen nicht möglich, da das FcγRIII- bzw. FcγRIIB-Gen mit dem des
FcγRIV verlinkt ist (Mechenita et al., 2002; Nimmerjahn et al., 2005). Folglich wurde für das
Ausschalten des FcγRIII in den FcγRI-/-- und FcγRIV-/--Mäusen ein blockierender Antikörper,
der anti-CD16/32 (Klon: 2.4G2) verwendet, der sowohl den FcγRIII als auch den
inhibitorischen FcγRIIB bindet. Interessanterweise war in diesem experimentellen Ansatz die
Viruslast nach Behandlung mit dem Serumpool inf. in den FcγRI+ FcγRIII- bzw. FcγRIV+
FcγRIII-defizienten Mäusen signifikant höher als in den Mäusen, die einen Funktionsverlust
nur eines aktivierenden FcγR (FcγRI-/- bzw. FcγRIV-/-) aufwiesen. Dies bestätigt die
Hypothese einer möglichen Redundanz der FcγR, hier der Rezeptoren FcγRI und FcγRIII
sowie der Rezeptoren FcγRIV und FcγRIII. Das Phänomen der Redundanz ist nicht
ungewöhnlich und wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen in Tumormodellen für das
Melanom gezeigt (Otten et al., 2008; Albanesi et al., 2012).
Allerdings
müssen
unsere
Ergebnisse
auch
kritisch
betrachtet
werden.
Denn
+/+
überraschenderweise führte die Behandlung von Fcγ -Mäusen mit dem anti-CD16/32Antikörper trotz der Therapie mit dem MCMV-spezifischen Serum zu einer hohen
Virusbeladung in allen Organen, die sogar keinen signifikanten Unterschied zu der mit
naivem Serum behandelten Gruppe aufwies (Abb. 7.26 A). Dieses Ergebnis stimmt somit
nicht mit dem genetischen FcγRIII-/--Mausmodell überein, in dem die MCMV-Infektion mit
Hilfe der polyklonalen Serumantikörper kontrolliert werden konnte. Die Verwendung des
CD16/32-Antikörpers blockiert neben dem FcγRIII auch den inhibitorischen FcγRIIB und
könnte
so
ein
Hinweis
auf
eine
mögliche
Funktion
des
FcγRIIB
in
unseren
Schutzexperimenten sein.
Andere Arbeitsgruppen haben zudem gezeigt, dass 2.4G2, neben der FcγRIIB/FcγRIIIBindung, auch mit dem FcγRI und dem FcγRIV interagieren kann (Unkeless, 1979; Hirano et
al., 2007). So wäre es möglich, dass in unseren Versuchen der 2.4G2 über seinen Fc-Teil
119
120
Diskussion
den FcγRI und den FcγRIV unspezifisch blockiert. Dies würde die erhöhte Viruslast in den
Fcγ+/+-Mäusen
nach
2.4G2-Behandlung
und
Immunserum-Therapie
erklären.
Die
kontinuierliche und häufige Verabreichung des 2.4G2-Antikörpers macht die unspezifische
Bindung wahrscheinlich, jedoch ist dieser Effekt in den Versuchen nicht überprüft worden.
Zum Ausschluss dieser unspezifischen Fc-Teil-Bindung könnten in unserem Infektionsmodell
z.B. 2.4G2-Fab(2)-Fragmente eingesetzt werden.
Die Arbeit von de Andrés et al. (1997) konnte in der Knochenmarkszellkultur eine durch die
Behandlung mit 2.4G2 induzierte Apoptose von Granulozyten beobachten. So könnten auch
in unserem in vivo-Modell mit der 2.4G2-Behandlung mögliche Effektorzellen eliminiert
worden sein. Folglich kann es nicht ausgeschlossen werden, dass der anti-CD16/32Antikörper neben der Blockade des FcγRIIB und des FcγRIII auch andere Reaktionen
auslöst,
die
sich
negativ
auf
unsere
Schutzversuche
auswirken
könnten.
Überraschenderweise bewirkt das immune Serum in den anti-CD16/32-behandelten FcγRI-/-bzw. FcγRIV-/--Mäusen im Gegensatz zu den Fcγ+/+-Tieren noch einen Teilschutz vor MCMV
(Abb. 7.26 B). Dieser Effekt lässt sich nur schwer erklären, verdeutlicht aber die enorme
Komplexität des FcγR-Systems und unseres Infektionsmodells.
Rolle des inhibierenden FcγRIIB in unseren Schutzversuchen
Der FcγRIIB ist der einzige inhibitorische Fc-Rezeptor. Er besteht ausschließlich aus der αKette, die auf der zytoplasmatischen Domäne das ITIM-Motiv trägt. FcγRIIB wird von einer
Vielzahl von Zellen (myeloide Zellen und B-Zellen), außer den NK-Zellen und T-Zellen,
exprimiert. In der Regel wird dieser Rezeptor mit den aktivierenden FcγR auf der zellulären
Oberfläche koexprimiert und ist wichtig für die Regulation der Zellaktivierung sowie für die
humorale Toleranz. In der vorliegenden Arbeit wurde das Augenmerk hauptsächlich auf die
aktivierenden FcγR gelegt. Da in unserem Rag1-/--Mausmodell eine B-Zelldefizienz vorliegt,
spielt der FcγRIIB keine Rolle bei der Kontrolle der humoralen B-Zellantwort. Der
inhibierende Rezeptor wird, wie schon erwähnt, ebenfalls von anderen Zelltypen exprimiert.
So wurde von uns anfangs die Theorie aufgestellt, dass eine FcγRIIB-Defizienz zu einem
gesteigerten Schutzeffekt von polyklonalen Antikörpern in einer MCMV-infizierten Maus
führen könnte. Die Überlebenskinetik von MCMV-infizierten FcγRIIB-defizienten Rag1-/-Mäusen zeigte keinen verbesserten Schutzeffekt der polyklonalen Serumantikörper. Die
FcγRIIB-/--Mäuse erlagen der MCMV-Infektion zu einem ähnlichen Zeitpunkt wie die Fcγ+/+Kontrollmäuse (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurde dem inhibitorischen Rezeptor
in unserem Infektionsmodell zunächst keine wesentliche Funktion zugesprochen.
Interessant war die Beobachtung, dass NK-Zellen nach einer MCMV-Infektion die
Expression des FcγRIIB induzieren konnten (Abb. 7.30). Die Expression des FcγRIIB auf
NK-Zellen wurde bereits für das humane System beschrieben (Dutertre et al., 2008). Hierbei
handelte es sich um eine NK-Zellsubpopulation, die nur etwa 1% aller NK-Zellen ausmacht.
Diskussion
Dutertre und Kollegen (2008) zeigen, dass der FcγRIIB die FcγRIII-vermittelten
Antikörpermechanismen reguliert, indem der Rezeptor die Degranulation der NK-Zellen
inhibiert. Welche Rolle der FcγRIIB auf NK-Zellen in unseren experimentellen Ansätzen
hatte, ist nicht klar und erfordert weitere Analysen.
Die Daten aus den in vivo-Experimenten der mit anti-CD16/32 behandelten Tiere gaben
ebenfalls einen ersten Hinweis auf eine mögliche Funktion des inhibitorischen Fc-Rezeptors
in unserem Infektionssystem. Mousavi und Kollegen (2007) demonstrierten im Ratten-Modell
die FcγRIIB-vermittelte Endozytose von Immunkomplexen in Leberendothelien. Deren
Analysen stellten ebenfalls heraus, dass der an den FcγRIIB-gebundene Immunkomplex mit
dem Rezeptor über einen Clathrin-abhängigen Weg endozytiert wird, ins endosomale
Kompartiment geleitet wird und der unbeladene FcγRIIB wieder auf die Zelloberfläche
transportiert wird. Diese Erkenntnisse geben dem FcγRIIB in unserem experimentellen
Ansatz möglicherweise eine neue Bedeutung.
8.3 Rolle von Effektorzellen beim Antikörper-vermittelten Schutz vor MCMV
Am Antikörper-vermittelten Schutz können unterschiedliche Zelltypen beteiligt sein (Abb.
8.1). In unserem Rag1-/--Mausmodell wurden, bedingt durch die B- und T-Zelldefizienz der
Mäuse, einige Zelltypen als Effektoren ausgeschlossen. Neben den B- und T-Lymphozyten
sind auch Dendritische Zellen (DC) in unseren Serumtransferversuchen als Effektoren am
Antikörper-vermittelten Schutz nicht berücksichtigt worden. DCs haben die Möglichkeit,
Antigen-Antikörper-Komplexe zu endozytieren und zu prozessieren. Sie haben jedoch noch
eine weitere Funktion, nämlich die Antigene über MHC-I- und MHC-II-Moleküle den T- und
B-Lymphozyten zu präsentieren und diese damit zur Immunabwehr zu stimulieren. Basophile
Granulozyten und Mastzellen sind wiederum bei allergischen Reaktionen von Bedeutung.
In unseren Infektionsexperimenten sind v.a. die NK-Zellen, Monozyten und neutrophile
Granulozyten mögliche Kandidaten für Effektorzellen. In dieser Arbeit wurde vorwiegend die
Rolle von NK-Zellen und Monozyten/Makrophagen genauer untersucht. Die Rolle von
neutrophilen Granulozyten beim Antikörper-abhängigen Schutz vor einer viralen Infektion ist
noch nicht klar. In einem Tumor-Mausmodell wurde jedoch gezeigt, dass neutrophile
Granulozyten das Potential besitzen, mit Hilfe von Antikörpern Tumorzellen zu eliminieren
(Albanesi et al., 2013). Eine mögliche Beteiligung von Neutrophilen sollte demnach in
weiteren Experimenten berücksichtigt und näher untersucht werden.
121
122
Diskussion
Abb. 8.1: Zelluläre Effektormechanismen, ausgelöst durch Antigen-gebundene Antikörper
Immunkomplexe (IC) binden an aktivierende und inhibierende Fc-Rezeptoren, die auf unterschiedlichen Zelltypen
exprimiert werden. Sie induzieren damit unterschiedliche Effektormechanismen. Die Bindung der ICs an die FcRezeptoren von DCs hat die Phagozytose und Präsentation der prozessierten Antigen-Peptide über MHC-I- und
+
MHC-II-Komplexe zur Folge. Die spezifische Erkennung der Peptide durch zytotoxische CD8 , CD4
+
und
regulatorische T-Zellen (Treg) resultieren in der Aktivierung dieser Zellen, die zur Eliminierung virusinfizierter
Zellen, zur Rekrutierung von T-Helfer-Zellen für die weitere Stimulierung von B-Zellen oder zur Modulation
anderer Immunabwehrmechanismen führen. B-Zellen exprimieren ausschließlich den inhibitorischen FcγR, der
die Signalweiterleitung über den B-Zellrezeptor reguliert. Auf Plasmazellen werden alleinig die inhibitorischen
Signalwege aktiviert. Basophile und Mastzellen spielen v.a. bei allergischen Reaktionen eine wichtige Rolle. Grau
unterlegt sind die Zellen, die in der vorliegenden Arbeit als Effektoren nicht berücksichtigt wurden (modifiziert
nach Nimmerjahn & Ravetch, 2008).
8.3.1 NK-Zellen
In der Literatur wird den NK-Zellen eine essentielle Rolle bei der FcγRIII-abhängigen
Eliminierung von Tumorzellen zugesprochen (Sondel & Hank, 2001; Alderson & Sondel,
2011). Für Virusinfektionen wurde schon in älteren Publikationen auf die Bedeutung von
ADCC mittels NK-Zellen verwiesen (Santoli et al., 1978; Kohl et al., 1979) und wird aktuell
bei HIV (Chung et al., 2008) oder Influenzaviren (Jegaskanda et al., 2013b) als wichtiger
therapeutischer Ansatz diskutiert. In unserem experimentellen Ansatz hat ADCC als NKZellbedingter Schutzmechanismus scheinbar keine wesentliche Funktion, da die FcγRIII-
Diskussion
defizienten Mäuse die MCMV-Infektion nach Antikörpergabe kontrollieren konnten (Abb.
7.22). Zur weiteren Bestätigung dieser Beobachtung wurden die NK-Zellen mit Hilfe eines
depletierenden Antikörpers aus dem Mausorganismus eliminiert. Die Depletion der NKZellen hatte sehr deutlich einen Einfluss auf die MCMV-Suszeptibilität, jedoch keinen Effekt
auf den Antikörper-vermittelten Schutz in Leber, Niere und Speicheldrüsen der MCMVinfizierten Tiere. In der Lunge und Milz dagegen schien die Eliminierung der NK-Zellen die
protektive Wirkung des Serums tendenziell zu verringern (Abb. 7.36 B). Es wäre möglich,
dass NK-Zellen zusätzlich zu den Antikörper-abhängigen Prozessen andere Mechanismen
zur Kontrolle der Virusreplikation in diesen beiden Organen nutzen. Es kann nicht
ausgeschlossen werden, dass der erhöhte virale Titer auf den durch die NK-Zelldepletion
hervorgerufenen Funktionsverlust eines anderen aktivierenden NK-Zellrezeptors, des
NKG2D, zurückzuführen ist. Die Arbeit von Zafirova et al. (2009) zeigte schließlich in
NKG2D-defizienten Mäusen eine erhöhte NK-Zellresistenz gegenüber einer MCMV-Infektion.
Ein Einfluss des Ly49H-NK-Zellrezeptors wurde in unseren Versuchen über die direkte
Erkennung des m157-Proteins ausgeschlossen, da die Infektion der Mäuse mit der m157deletierten MCMV-Mutante (MCMV∆m157luc) stattfand. In der Literatur sind keine weiteren
MCMV-Antigene beschrieben, die zur Ly49H-vermittelten Zytotoxizität führen. Das
Vorhandensein eines anderen MCMV-Antigens, das vom Ly49H-NK-Zellrezeptor erkannt
wird, kann an dieser Stelle jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Es wäre auch denkbar, dass eine noch nicht charakterisierte murine NK-Zellsubpopulation
unabhängig von FcγRIII zu ADCC fähig ist, wie kürzlich im humanen System bei der HCMVKontrolle durch NKG2C+-Zellen gezeigt wurde (Aicheler et al., 2013). Der klassische ADCCSchutzmechanismus über den FcγRIII kann in unseren Schutzversuchen mit polyklonalen
Antikörpern den NK-Zellen allerdings nicht zugeordnet werden.
Die offensichtlich erhöhte Suszeptibilität für MCMV nach NK-Depletion wurde schon von
anderen Arbeitsgruppen beobachtet (Bukowski et al., 1984; Shanley, 1990). Ein möglicher
Grund dafür ist der Verlust der MCMV-Inhibition durch die NK-Zell-vermittelte Ausschüttung
von IFN-γ. Außerdem könnte es sich ebenfalls um einen kompetierenden Effekt handeln
zwischen der Beseitigung der anti-NK1.1.-markierten NK-Zellen und der Phagozytose von
MCMV-infizierten Zellen. Bekanntermaßen ist der in diesen Experimenten verwendete
Depletionsantikörper anti-NK1.1. vom Isotyp IgG2a und kann somit von allen FcγRexprimierenden und phagozytierenden Zellen gebunden werden.
8.3.2 Monozyten
CD115+-Monozyten wurden in unseren Expressionsanalysen als die Zellpopulation
identifiziert, die alle aktivierenden FcγR exprimieren. Die Expression wurde nach einer
MCMV-Infektion von Rag1-/--Tieren sogar verstärkt (Tab. 7.7). Damit wären Monozyten gute
Effektorzellen, die am Antikörper-vermittelten Schutz bei einer MCMV-Infektion beteiligt sein
123
124
Diskussion
könnten. Monozyten haben eine besondere Stellung während einer CMV-Infektion, da sie als
Zielzelle für die Infektion und weitere virale Dissemination fungieren. Eine vollständige
Replikation von CMV ist jedoch erst im Stadium eines differenzierten Makrophagen möglich
(Stoddart et al., 1994). Somit wird Monozyten und Makrophagen eine duale Funktion
zugesprochen: sie sind Ort der viralen Replikation und sind auch an der Immunabwehr vor
CMV beteiligt (Hanson et al., 1999).
Monozyten
lassen
sich
in
mindestens
zwei
Subpopulationen
unterteilen,
die
inflammatorischen und die residenten Monozyten. Diese weisen nicht nur unterschiedliche
Oberflächenmarker auf, sondern sind auch funktionell verschieden (Geissmann et al., 2003).
Ein besonderes Merkmal von residenten Monozyten ist die Expression des FcγRIV, der auf
der Oberfläche inflammatorischer Monozyten nicht nachweisbar ist (Biburger et al., 2011).
Zur Untersuchung der Funktion der Monozyten beim Antikörper-vermittelten Schutz wurden
die Monozyten und Makrophagen zunächst mit Hilfe von Clodronaten depletiert. Monozyten
sind mit einer Überlebensdauer von 2-4 Tagen sehr kurzlebige Zellen, die durch neue, aus
dem Knochenmark stammende Monozyten abgelöst werden (Geissmann et al., 2010).
Außerdem sind inflammatorische Monozyten nur kurzweilig (ca. 18-24 Stunden; eigene
Beobachtungen, Daten nicht gezeigt) im Blutstrom vertreten, bevor sie zum Ort der
Entzündung rekrutiert werden (Geissmann et al., 2003). Somit ist im Blut ein ständiger
Durchlauf immer wieder neuer inflammatorischer Monozyten nachweisbar und hätte folglich
eine tägliche Applikation von Clodronaten erfordert, um diese Monozyten-Subpopulation aus
dem Blutstrom zu eliminieren. Residente Monozyten zirkulieren länger im Blutkreislauf, bevor
sie ins periphere Gewebe wandern. Residenten Monozyten wurde von Biburger und
Kollegen (2011) bereits eine FcγR-abhängige Effektorfunktion im Mausmodell zugeordnet.
Aus diesem Grund konzentrierte sich die Verabreichung der Clodronate in unserem
experimentellen Ansatz auf die Depletion der residenten Monozyten. Die Behandlung der
Rag1-/--Mäuse mit Clodronaten hatte jedoch eine stark erhöhte Suszeptibilität für MCMV zur
Folge, die mit einem progressiven Krankheitsverlauf und sehr frühem Tod der infizierten
Mäuse einherging (Abb. 7.32 C). Trotz des verstärkten Infektionsverlaufs Clodronatbehandelter Tiere schien das Immunserum tendenziell einen Schutz zu vermitteln (Abb. 7.32
C und D). Allerdings belief sich der Beobachtungszeitraum wegen des schwerwiegenden
Krankheitsverlaufs nur über wenige Tage (Abb. 7.32 C) oder aber der Versuch konnte wegen
der geringen Mausanzahl (Mäuse vorzeitig euthanasiert) statistisch nicht ausgewertet
werden (Abb. 7.32 D).
Für die erhöhte Suszeptibilität können mehrere Gründe diskutiert werden. Die Gabe von
Clodronaten, die von phagozytierenden Zellen aufgenommen werden, führt zu intensiven
Entzündungsreaktionen
und
Apoptose-Vorgängen
im
Mausorganismus,
die
eine
ungehemmte Virusdissemination begünstigen. Dies würde auch die von uns im Blut-FACS
beobachtete enorme Zunahme der Granulozytenanzahl nach einer Clodronatapplikation
Diskussion
erklären (Daten nicht gezeigt). In der Literatur wurde zudem beschrieben, dass die
Clodronatgabe auch die Depletion von pDCs (plasmazytoide Dendritische Zellen) bewirken
kann (Atibalentja et al., 2011). Unsere Analysen zeigten einen Tag nach Clodronatgabe
ebenfalls eine deutlich verminderte pDC-Population im murinen Blut (bis zu 80% Depletion),
die sich jedoch nach 24 Stunden wieder an eine normale Zellzahl angeglichen hatte (Daten
nicht gezeigt). pDCs sind u.a. Produzenten von IFN-α/β, das bei der frühen Immunabwehr
von MCMV unerlässlich ist und die Virusinfektion eindämmt (Delale et al., 2005). Ein weiterer
Grund für die erhöhte MCMV-Suszeptibilität könnte der Verlust der Disseminationsbarriere
durch die Elimination der Monozyten bzw. Makrophagen sein, die permissive Zelltypen vor
einer Infektion bewahren und gleichzeitig antivirale Zytokine induzieren (Hanson et al.,
1999). Mit dem Verlust der Monozytenpopulation könnte somit ebenfalls die TypI-IFNAntwort beeinflusst sein. Barbalat et al. (2009) postulierten nämlich, dass durch MCMV über
die Bindung des auf inflammatorischen Monozyten präsentierten TLR2 die Produktion von
IFN-α/β
initiiert
wird.
Daraus
folgend
führen
sehr
wahrscheinlich
verschiedene
Nebenwirkungen der Clodronatbehandlung zu einer ungehemmten Virusinfektion und
erschweren somit die Interpretation unserer erzielten Ergebnisse. Deshalb wurde versucht,
die Rolle der Monozyten beim Antikörper-vermittelten Schutz mit Hilfe eines adoptiven
Zelltransfers zu untersuchen. Hierzu wurden Monozyten aus naiven Fcγ+/+-Mäusen
aufgereinigt, die alle aktivierenden FcγR auf ihrer Oberfläche tragen. Diese wurden
anschließend in infizierte und mit immunem Serum behandelte Fcγ-/--Mäuse transferiert. Mit
diesem experimentellen Ansatz konnte demonstriert werden, dass Monozyten am
Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion beteiligt sind. Die Viruslast der
Tiere, die Monozyten erhielten, konnte sichtbar gesenkt werden im Gegensatz zu den Fcγ-/-Kontrollmäusen, denen keine Zellen appliziert wurden. Bei dem beobachteten Schutzeffekt
kann es sich um die Antikörper-vermittelte und FcγR-abhängige Phagozytose/ Endozytose
von Immunkomplexen oder infizierten Zellen handeln, und es kann die damit verbundene
Freisetzung von Sauerstoffradikalen („oxidativer Burst“) und/oder die Ausschüttung von proinflammatorischen Mediatoren hervorrufen (Nimmerjahn & Ravetch, 2008; Abb. 8.1).
Die übertragenen Monozyten waren mit Hilfe der polyklonalen Serumantikörper jedoch nicht
in der Lage, die Virusinfektion gleichermaßen wie die Fcγ+/+-Tiere zu kontrollieren. Das kann
durchaus durch die Kurzlebigkeit der Monozytenpopulation bedingt sein, die gleichzeitig nicht
die Fähigkeit besitzt, im Mausorganismus zu expandieren. Zuletzt wäre es noch interessant
zu klären, über welchen Mechanismus Monozyten Immunkomplexe und infizierte Zellen
eliminieren. Die Phagozytose der infizierten Zelle oder die durch Infektion bedingte
apoptotische Zelle wäre als Mechanismus am naheliegendsten.
125
126
Diskussion
8.4 Hypothesen zum Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion
Die Ergebnisse zeigten deutlich die wesentliche Rolle von aktivierenden FcγR beim
Antikörper-vermittelten Schutz vor einer MCMV-Infektion. Die Deletion der γ-Kette bewirkte
ein deutlich reduziertes Schutzpotential der MCMV-spezifischen Antikörper in unserem
Mausmodell. Dennoch zeigte das polyklonale Immunserum in den Fcγ-/--Mäusen einen
protektiven Teileffekt. Die Tiere hatten im therapeutischen Serumtransferexperiment eine
niedrigere Viruslast in den Organen und ein verlängertes Überleben nach prophylaktischer
Antikörperbehandlung, verglichen mit den Fcγ-/--Mäusen, die naives Serum erhielten. Die
Neutralisation als beteiligter Schutzmechanismus könnte eine mögliche Erklärung sein.
Allerdings ist damit die Frage verbunden, wie die Antikörper-Virus-Komplexe bzw. die vom
Antikörper opsonisierten, infizierten Zellen in den FcγR-defizienten Mäusen abgeräumt
werden (Abb. 8.2). Eine Option wäre die Clathrin-vermittelte Endozytose oder FcγRunabhängige Phagozytose. In der Literatur werden solche Mechanismen für Virusinfektionen
kaum beschrieben bzw. meist mit dem Viruseintritt in die Wirtszelle in Verbindung gebracht
(Barrow et al., 2013). Für den inhibierenden FcγRIIB, der von der γ-Kette unabhängig ist,
wird die Endozytose von Immunkomplexen beschrieben (Mousavi et al., 2007). Somit wäre
es denkbar, dass dieser Mechanismus in den Fcγ-/--Mäusen eine Rolle spielt.
Ein weiterer Rezeptor, dem Beachtung geschenkt werden sollte, ist der neonatale FcRezeptor (FcRn). Er ist ein membranständiges Glykoprotein, das in unterschiedlichen
Geweben in verschiedenen Zelltypen gefunden wird (Roopenian & Akilesh, 2007). Der FcRn
gehört zur MHC-Superfamilie und bindet IgG mit schwacher Affinität. Dieser Rezeptor kann
ebenfalls Immunkomplexe binden, diese ins Lysosom dirigieren, und nach Abladung seiner
Fracht das freie IgG wiederverwertet. Da diesem Rezeptor vorwiegend die Aufgabe der
Transzytose zugeschrieben wird, wäre es theoretisch möglich, dass dieser Rezeptor an der
viralen Dissemination von Zelle-zu-Zelle beteiligt ist.
In der Literatur ist ein weiterer Effektormechanismus beschrieben, der Antikörper-vermittelt
zur Eliminierung von Viren führt. Bei diesem Mechanismus handelt es sich um die
intrazelluläre, Antikörper-vermittelte Degradation (IAMD; engl. intracellular antibodymediated degradation), die bisher nur für nicht-behüllte Viren, speziell Adenoviren,
beschrieben wurde (Mallery et al., 2010). Hierbei bindet der Virus-Antikörper-Komplex an
das intrazellulär lokalisierte Effektorprotein TRIM21, das die Antikörper-gebundenen Virionen
über die Ubiquitinylierung in das Proteasom dirigiert. Im Falle von MCMV sind die
Internalisierung bzw. Endozytose des Antikörper-Virus-Komplexes und dessen freie
Zugänglichkeit für TRIM21 die Voraussetzung für diesen Prozess.
Ungeklärt bleibt in dieser Arbeit die Beobachtung der nach Infektion induzierten Expression
des inhibitorischen FcγRIIB auf NK-Zellen. NK-Zellen sind zytotoxische Lymphozyten. Daher
ist die FcγRIIB-abhängige Endozytose von Immunkomplexen eher unwahrscheinlich. Ob
Diskussion
dieser Rezeptor die Phosphorylierung und damit Aktivierung des FcγRIII der NK-Zellen
beeinflusst, ist in unserem Modell nicht von Bedeutung, da gezeigt werden konnte, dass NKZellen über den aktivierenden FcγRIII vermutlich keine Schutzfunktion ausüben.
Abb. 8.2: Hypothetische Effektormechanismen von Antikörpern in unserem Infektionsmodell
Dargestellt sind die möglichen Antikörper-vermittelten Effektormechanismen unter Ausschluss von Komplementabhängigen Mechanismen wie CDC und Virolyse (graue Darstellung), sowie unter Ausschluss der Effektorwege,
die über die aktivierenden FcγR vermittelt werden (roter Blitzpfeil). Die Rolle der nach einer MCMV-Infektion
induzierten Expression des FcγRIIB auf NK-Zellen ist ungewiss. Der Fcγ-unabhängige Abbau von AntigenAntikörper-Komplexen bzw. IgG-opsonisierten infizierten Zellen stellt ebenfalls einen ungeklärten Mechanismus
dar.
127
128
Diskussion
Die vorliegende Arbeit zeigt deutlich die Abhängigkeit des Antikörper-vermittelten Schutzes
von aktivierenden Fcγ-Rezeptoren während einer MCMV-Infektion. Der Schutz durch ein
polyklonales Serum konnte keinem einzelnen Rezeptor zugeordnet werden. Das spricht für
eine redundante Funktion des Fcγ-Rezeptorsystems in unserem experimentellen Modell. Zur
genauen Untersuchung der Funktion eines individuellen Rezeptors müssten monoklonale
Antikörper unterschiedlichen IgG-Subtyps eingesetzt werden, da sie unterschiedliche
Affinitäten zu den einzelnen Fcγ-Rezeptoren aufweisen.
Die Ergebnisse unserer
Schutzexperimente widersprechen der allgemeinen Meinung, dass NK-Zellen durch ADCC
Viren bzw. virusinfizierte Zellen eliminieren. Stattdessen wurde eine Beteiligung von
Monozyten am Antikörper-vermittelten Schutz ersichtlich. Diese Erkenntnis wird bestärkt
durch die nachgewiesene der Expression aller Fcγ-Rezeptoren auf Monozyten, die nach
einer MCMV-Infektion der Versuchstiere sogar steigt. Diese Arbeit verdeutlicht auch die
Beteiligung anderer Antikörper-abhängigen Prozesse an der Protektion MCMV-infizierter
Mäuse. Dabei könnte die Neutralisation einer der wichtigen Mechanismen sein.
Diese
Dissertation
liefert
damit
Anhaltspunkte
zur
Verbesserung
der
aktuellen
Therapieansätze mit Immunglobulinen sowie der Vakzine-Entwicklung gegen HCMV. Im
Wesentlichen sollte zur Bekämpfung einer HCMV-Infektion neben der Neutralisation auch
Fcγ-Rezeptor-vermittelte Schutzmechanismen durch Antikörper gesetzt werden. Deshalb
sollten sich künftige Impfstoffe aus Struktur- und Nicht-Strukturproteinen von HCMV
bestehen. Wie schon von Chu et al. (2008) am HSV-2-Modell beschrieben, ist die
Kombination von mehreren Effektormechanismen vermutlich die beste Strategie um einen
optimalen Schutz zu erhalten. In diesem Zusammenhang scheinen HCMV-Dense Bodies
(DB), bei denen es sich um nicht-infektiöse komplexe Viruspartikel handelt, geeignete
Kandidaten für die Vakzine-Entwicklung zu sein. In einer neuen Arbeit wurde nämlich
beschrieben, dass DB eine effektive humorale Immunantwort hervorrufen und gleichzeitig
eine starke zelluläre Immunabwehr gegen virale Proteine wie gB und pp65 induzieren
können (Cayatte et al., 2013).
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147
148
Abkürzungsverzeichnis
10 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen
Abb.
ADCC
AIDS
AF700
AK
APC
ATCC
ATP
bio
bp
BTE
bzw.
ca.
CD
CDC
CDR
CH
CL
CMV
Cos-7
CSR
C-Terminus
CTL
CVF
DAPI
DC
ddH2O
DMEM
DMSO
DNA
dNTP
ds
DTT
E
E. coli
EDTA
EGTA
ELISA
ERB A/B
et al.
FACS
FcγR
FITC
FKS
gB (H, L, M, N, O)
GBZ
gC
ggf.
gp(s)
HA
HCMV HIS
Abbildung
Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
Acquired Immunodeficiency Syndrome
Alexa Fluor 700
Antikörper
Allophycocyanin
American Type Culture Collection
Adenosintriphosphat
biotinyliert
Basenpaar
Biologisch Technisches Entwicklungsgebäude
beziehungsweise
circa
Cluster of differentiation
Complement Dependent Cytotoxicity
Complementarity Determining Region
konstante Region schwere Kette
konstante Region leichte Kette
Cytomegalovirus
Nierengewebszellen von Grünen Meerkatzen
class switch recombination
Carboxy-Terminus
cytotoxische T-Zelle
Cobra venom Faktor
4,6-Diamidin-2-phenylindol´
Dendritische Zelle
doppelt-destiliertes Wasser
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleosidtriphosphat
Doppelstrang
Dithiothreitol
Early
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N,N-tetraessigsäure
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Endotoxin Removal Buffer
et alii/alia
fluorescence-activated cell sorting (Durchflusszytometrie)
Fcγ-Rezeptoren
Fluoresceinisothiocyanat
Fetales Kälberserum
Glykoprotein B (H, L, M, N, O)
Gedächtnis-B-Zelle
Glykoproteinkomplex
gegebenfalls
Glykoprotein€
Hämagglutinin
HCMV-Hyperimmunserum
Abkürzungsverzeichnis
HCMV
HHV
HIV
HRP
HSV
IFN
i.p.
ITAM
ITIM
i. v.
IVC
IVIG
IE
IF
IgG/ IgA /IgE / IgM / IgD
IL
int
L
LAP
LB
log
LS
luc
mAb
M2
MCMV
MCS
MEF
mIEND
MФ
n
n.d.
neg.
NK-Zelle
nnt
n.s.
nt
N-Terminus
OD
ORF
P
p.a.
PBMC
PBSo
PCR
pDC
PE
PE-Cy7
pH
p.IgG
p.i.
pos.
rpm
RPMI
RT
S.
Humanes Cytomegalovirus
Humanes Herpesvirus
Humanes Immundefizienz Virus
Meerrettichperoxidase
Herpes Simplex Virus
Interferon
Intraperitoneale Applikation
immunoreceptor tyrosine-based activation Motiv
immunoreceptor tyrosine-based inhibition Motiv
Intravenöse Applikation
Isolated ventilated cages
intravenös applizierbare Immunglobuline
Immediate Early
Indirekte Immunfluoreszenz
Immunglobulin der Klasse G, A, E, M, D
Interleukin
intermediär
Late
Luciferase Assay Puffer
Luria-Bertani
logarithmisch
Luciferin Solution
luciferase
monoklonaler Antikörper
murine Fibroblastenzelllinie
Murines Cytomegalovirus
Multiple Cloning Site
Embryonale Mausfibrobalsten
murine Endothelzellen
Makrophagen
Anzahl
nicht definiert
negativ
Natürliche Killer Zelle
nicht-neutralisierend
nicht signifikant
neutralisierend
Amino-Terminus
Optische Dichte
Open Reading Frame
Signifikanzwert
post applicationem
mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
Phospate buffered saline
Polymerasekettenreaktion
plasmazytoide Dendritische Zellen
R-Phycoeryrthrin
R-Phycoeryrthrin kombiniert mit Cyanin 7 (Tandemfarbstoff)
potentia Hydrogenii
post IgG-Gabe
post infectionem
positiv
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
Roswell Park Memorial Institute
Raumtemperatur
Seite
149
150
Abkürzungsverzeichnis
s.
SAP
SCID
SCT
SD
Serumpool inf. /imm.
SIV
SOC
sog.
SPF
ST-2
Tab.
TBE
TEMED
TM
TMB
TNF
Tris
Tween® 20
u.a.
USA
ü.N.
v.a.
vgl.
VH
VL
VSP
v/v
WT
w/v
z. B.
ZNS
siehe
Shrimps Alkaline Phosphotase
Severe Combined Immunodeficiency
Stammzell-Transplantation
Standardabweichung
Serumpool infiziert / immunisiert
Simianes Immundefizienz-Virus
Super Optimal Broth
sogenannte
specific pathogen free
Murine Stromazellen
Tabelle
Tri-Borat-EDTA
N,N,N,N-Tetramethylethan-1,2-diamin ′′
Transmembrandomäne
3,3,5,5-Tetramethylbenzidin ′′
Tumornekrosefaktor
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol
Polyoxyethylen-20-sorbitanmonolaurat
unter anderem
Vereinigte Staaten von Amerika
über Nacht
vor allem
vergleiche
variable Region schwere Kette
variable Region leichte Kette
Virusstandardpuffer
Volumenprozent
Wildtyp
Gewichtsprozent
zum Beispiel
Zentrales Nervensystem
Einheiten
C°
Å
Da
F
g
h
l
M
min
mol
PFU
RLU
sek
U
V
Ω
Vorsatzzeichen
Grad Celsius
Ångström
Dalton
Farad
Gramm
Stunde
Liter
Molar
Minute
Mol
Plaque forming unit
Relative Light Unit
Sekunde
Unit
Volt
Ohm
k
m
µ
v
kilo (103 )
milli (10-3 )
mikro (10-6 )
nano (10-9)
griechische Buchstaben
α
alpha
β
beta
γ
gamma
λ
lambda
µ
my
Ω
omega
Φ, φ phi
ζ
zeta
∆
Delta
Curriculum Vitae
Lebenslauf
Curriculum Vitae
Persönliche Daten
Anna Bootz, geb. Wnekowicz
Geboren am 10. März 1979 in Malapane (Polen)
Promotionsarbeit
Seit 04/2007
Klinische und Molekulare Virologie, Universitätsklinikum Erlangen
bei Prof. Dr. Michael Mach
Thema:“Die Rolle von Fcγ-Rezeptoren bei der humoralen Immunantwort
gegen das Cytomegalovirus”
seit 2008
Mitglied der Graduiertenschule/SFB643 „Zelluläre
Immunintervention“
Werdegang
02/2006 - 03/2007 Diplomarbeit an der Virologie des Universitätsklinikums in
Freiburg/Breisgau
Thema: “Charakterisierung vom rekombinanten Pneumonievirus der
Maus mit deletiertem oder mutiertem Glykoprotein G“
09/2001- 03/2007
Studium der Molekularen Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg/Breisgau
Abschluss Diplom Molekular Medizinerin
09/1998 - 09/2001 Ausbildung zur examinierten Krankenschwester
09/1989 - 07/1998 Adam-Kraft-Gymnasium in Schwabach
09/1985 - 07/1989 Christian-Maar-Grundschule in Schwabach
151
152
Publikationen und Präsentationen
Publikationen und Präsentationen
Publikationen
Bootz A., Nimmerjahn F., Schneider A., Winkler T.H. and Mach, M. (2014). Fcgamma
receptors are crucial for antibody-mediated protection from infection with murine
cytomegalovirus (manuscript in preparation)
Marschall M, Niemann I, Kosulin K, Bootz A, Wagner S, Dobner T, Herz T, Kramer B,
Leban J, Vitt D, Stamminger T, Hutterer C, Strobl S. (2013). Assessment of drug
candidates for broad-spectrum antiviral therapy targeting cellular pyrimidine biosynthesis.
Antiviral Res 100, 640-648.
Krempl CD, Wnekowicz A, Lamirande EW, Nayebagha G, Collins PL, Buchholz UJ
(2007). Identification of a novel virulence factor in recombinant pneumonia virus of mice.
J Virol 81, 9490-9501.
Präsentationen
international
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2013): Monocytes rather than NK-cells contribute
to antibody mediated protection from MCMV infection. 15th International Congress of
Immunology, Mailand, Italien, 2013. (Vortrag)
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2012): Fc gamma receptors protect from
Cytomegalovirus infection. 37th Annual International Herpesvirus Workshop in Calgary,
Alberta, Canada, 2012. (Vortrag, Poster)
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2011): Fc gamma receptors are important for
protection from Cytomegalovirus infection. 98th Annual meeting of the American
Association of Immunologists in San Francisco, California, USA, 2011. (Poster)
Bootz, A., Winkler, TH., Weisel, F. and Mach, M. (2009): Protection from Cytomegalovirus
infection after transfer of memory B cells or immune serum. 12th International CMV
Workshop in Boston, Massachusetts, USA, 2009. (Vortrag, Poster)
Wnekowicz, A., Sprater, F., Kropff, B., Winkler, TH., and Mach, M. (2008): Identification of
immunogenic Murine Cytomegalovirus glycoproteins. 33rd Annual International
Herpesvirus Workshop in Estoril, Portugal, 2008. (Poster)
national
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2013): Fc gamma receptors and not complement
are crucial for protection from MCMV infection. 23rd Annual meeting of Society for Virology
in Kiel, 2013. (Poster)
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2011): Fc gamma receptors are important for
protection from Cytomegalovirus. 21st Annual meeting of Society for Virology in Freiburg,
2011. (Poster)
Bootz, A., Winkler, TH., and Mach, M. (2009): Protection from Cytomegalovirus infection
after transfer of memory B cells is independent of Fc receptor mediated mechanisms. 19th
Annual meeting of Society for Virology in Leipzig, 2009. (Poster)
Danksagung
Danksagung
Ich möchte mich bei allen von ganzen Herzen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben und mich unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt….
…. Prof. Dr. Michael Mach für die Ermöglichung meines Promotionsvorhabens und
kompetente Betreuung meiner Arbeit. Vielen lieben Dank für die ständige
Diskussionsbereitschaft, die vielen Ratschläge und die Möglichkeit bei nationalen und
internationalen Kongressen teilzunehmen.
….Prof. Dr. Thomas Winkler für die Erstellung meines Erstgutachtens und Mitbetreuung
meiner Arbeit. Ich danke ihm für seine ständige Gesprächsbereitschaft, die guten
Ratschläge und seine motivierende Art.
…Prof. Dr. Thomas Stamminger für die Erstellung meines Zweitgutachtens.
….Prof. Dr. Falk Nimmerjahn für die Betreuung im Graduiertenkolleg und für seine
Hilfestellung und Anregungen bei Fragen zum Fc-Rezeptorsystem.
….meinen Kollegen meiner Arbeitsgruppe für die nette Atmosphäre, Zusammenarbeit und
Diskussionsbereitschaft. Ganz lieben Dank an Barbara Kropff, Nadja Spindler und AnnaKatharina Wiegers für ihre ständige Hilfsbereitschaft in allen Bereichen des Laboralltags
und guten Ratschläge in experimentellen Angelegenheiten. Johannes Spindler danke ich
für seine Hilfe als Hiwi. Florian Weisel für die tolle Einarbeitung und Zusammenarbeit.
Andrea Schneider für die Hilfestellung bei den Genotypisierungen der Mäuse und bei den
FACS-Analysen. Außerdem bedanke ich mich bei den ehemaligen Mitgliedern der
Arbeitsgruppe Karolina Barthelmess und Christiane Burkhardt sowie aus der NachbarArbeitsgruppe Nina Reuter und Marco Thomas für ganz tolle Mittags- und Kaffeepausen
und die vielen lustigen Momente. Ich freue mich sehr darüber sagen zu können, dass der
ein oder andere mehr ein Freund als ein Kollege für mich ist.
….meiner Familie. Meiner Schwiegermutter für das unermüdliche Korrekturlesen. Meiner
Schwester für ihre große Hilfe, Motivation und ihre Freundschaft. Meiner Mama und
Günter, ohne die ein Studium und damit die Promotion nicht möglich wären. Ich danke
Euch für Euren Glauben an mich und die Unterstützung in allen Lebenslagen. Günter, wo
auch immer Du jetzt bist, ich weiß Du wärst stolz auf mich!
…. meinem Ehemann für all seine Liebe, Geduld und großartige Unterstützung. Danke,
dass Du immer für mich da bist.
… zuletzt meinem kleinen Emil für seine Liebe und seine Umarmungen, auch wenn er hin
und wieder auf seine Mama verzichten musste.
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