Die Expression des Endozytose- rezeptors DEC - biomed

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wissenschaft & praxis
Die Expression des Endozytoserezeptors DEC-205 / CD205 in
humaner Haut und Tonsillen
Zusammenfassung der Diplomarbeit von Zita Ehammer, die 2002
an der MTA-Akademie Innsbruck diplomierte. Die Diplomarbeit
wurde bei der diesjährigen Tagung „Histologie – Zytologie“
prämiert.
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Nachdem einige von uns im Dezember 2002
gebeten wurden, passende Diplomarbeiten
zum Thema Histologie/Zytologie einzusenwissenschaft
den, wurde unter anderem auch meine Di& praxis
plomarbeit zur Prämierung und Präsentation
ausgewählt. So konnte ich erfreulicherweise meine Diplomarbeit im Rahmen der Tagung „Histologie – Zytologie“ am
24. April im AKH Wien präsentieren und den MTA-Preis
2003 mit Freude entgegennehmen.
Einleitung
Dendritische Zellen (DC)
DC sind hochspezialisierte, professionelle antigenpräsentierende Zellen, die eine zentrale und entscheidende Rolle in der Entstehung der Immunität spielen.
DC kommen in zwei Reifungszuständen vor. Unreife DC
besitzen wenig MHC-Klasse-II-Moleküle an der Zelloberfläche, jedoch viel im Zellinneren. Die Morphologie unreifer
DC in Geweben wie der Haut ist klassisch dendritisch, d. h.
sie besitzen multiple, z. T. verzweigte Fortsätze. Bei der Wanderung von DC über die afferente Lymphe in Richtung
Lymphknoten lässt sich eine Umgestaltung von unreifen in reife DC beobachten. Die Hauptmerkmale von reifen DC sind
eine außergewöhnlich hohe Zelloberflächen-Expression von
MHC-Molekülen (Klasse I und II) sowie die verstärkte Expression von Adhäsionsmolekülen und von Molekülen mit
kostimulatorischer Funktion für T-Lymphozyten.
„Adjuvansfunktion“
Darunter versteht man die
Sensibilisierung von T-Helferzellen. Dabei werden die antigen-spezifischen T-Zellen dazu gebracht, sich zu vermehren und Zytokine auszuschütten. Diese Funktion ist eine Eigenschaft der reifen DC.
Das CD205/DEC-205 Molekül
Der DEC-205-Rezeptor
gehört zu der C-Typ-Lektinrezeptorfamilie. Er ist spezialisiert für die Antigenaufnahme,
vor allem von Mannose-hältigen Zuckermolekülen, wie sie typischerweise auf Bakterien
vorkommen und wird durch Rezeptor-vermittelte Endozytose
internalisiert. Anschließend kommt es in ungewöhnlich effizienter Weise zur Bildung von MHC-Klasse-II-Peptidkomplexen, die an der Zelloberfläche präsentiert und vom
T-Zellrezeptor erkannt werden. Die T-Zellen können nun eine effiziente antigenspezifische Immunantwort durchführen.
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Molekülen mit
ähnlichen Eigenschaften gefunden und charakterisiert (z. B.:
CD207/Langerin, CD209/DC-SIGN, BDCA-2). So wird Langerin von den epidermalen Langerhanszellen exprimiert, aber
nicht von den dermalen DC. Umgekehrt wird DC-SIGN ausschließlich von dermalen DC exprimiert. BDCA-2 ist charakteristisch für die erst kürzlich beschriebene Variante von
DC, die plasmazytoiden DC. Die genauen Liganden für diese Rezeptoren und somit eine mögliche Aufgabenverteilung
ist noch unvollständig bekannt.
Fragestellung und Methodik
Zielsetzung meiner Diplomarbeit war es, die Expression
des CD205/DEC-205-Rezeptors in humaner Haut und Tonsillen zu untersuchen. Zusätzlich wurde untersucht, ob sich
die Expression von DEC-205 während der Wanderung und
Reifung von DC verändert. Dazu fertigte ich Kryostatschnitte
an, färbte diese mittels Immunfluoreszenz mit anti-human-
Aufgaben von DC
Die Eigenschaften von DC können in drei zeitlich und
räumlich voneinander verschiedenen Funktionsbereichen betrachtet werden.
„Wächterfunktion“
Darunter versteht man die Antigenaufnahme und deren
Verarbeitung. Dieser Vorgang ist die Voraussetzung für die
Antigenerkennung durch T-Lymphozyten und wird von den
unreifen DC erfüllt. Zur Antigenaufnahme besitzen diese
Zellen effiziente Mechanismen, wie die „Makropinozytose“
oder – besonders wirkungsvoll – die „Rezeptor-vermittelte Endozytose“ (z. B.: DEC-205).
„Migratorische Funktion“
Da die Orte der Antigenaufnahme und der Induktion einer Immunantwort meist verschieden sind, erfolgt die Wanderung zwischen diesen beiden Orten über die afferenten
lymphatischen Gefäße.
Abb. 1: Doppelfärbung von Hautschnitten. Die Langerin(CD207)positiven Zellen in der Epidermis exprimieren nur schwach DEC-205
(CD205) und heben sich aus der Hintergrundfärbung der Keratinozyten kaum ab. In der Dermis sind deutlich mehr DEC-205-positive
Zellen (Dreieck), die z. T. Langerin ko-exprimieren (d. h. es handelt
sich hier meist um unreife DC). Die linke Bildreihe stellt die Überlagerung beider Fluoreszenzfarben dar.
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DEC-205-monoklonalen Antikörpern und beurteilte sie in einem Auflichtfluoreszenzmikroskop. Als Vergleich dienten
bereits bekannte dendritische Zellmarker, wie z. B.: Langerin
und DC-LAMP.
Abb. 2: Die wenigen DC-LAMP(CD208)-positiven Zellen in der Dermis exprimieren stark DEC-205 (CD205), sind also reife DC. Der
Großteil der DEC-205-positiven Zellen ist jedoch Langerin- sowie
DC-LAMP-negativ. Die linke Bildreihe stellt die Überlagerung beider Fluoreszenzfarben dar.
Ergebnisse
Die DEC-205-Expression in der Haut
Die epidermalen Langerhanszellen der Haut exprimieren nur schwach DEC-205. In der Dermis sind deutlich mehr
DEC-205-positive Zellen, die MHC Klasse II ko-exprimieren.
Die wenigen ausgewanderten Langerin-positiven Zellen in der
Dermis exprimieren schwach DEC-205. DC-LAMP-positive
Zellen – vermutlich migratorische DC – weisen eine starke
DEC-205-Expression auf.
Organkultur
Von denselben Präparaten wurden von Mag. S. Holzmann epidermale Häutchenpräparate angefertigt und drei
bis vier Tage kultiviert. Dabei zeigte sich, dass die aktivierten
Langerhanszellen den DEC-205-Rezeptor hinaufregulierten.
Die DEC-205-Expression in der Tonsille
Die DEC-205-Expression im Plattenepithel der Tonsille ist
ähnlich der Normalhaut. Im Kryptenepithel befinden sich
schwach DEC-205-exprimierende Langerhanszellen und stärker exprimierende DC-LAMP-positive reife DC.
Abb. 3: DEC-205-positive Zellen in der B-Zellzone der Tonsille. Zwei
B-Zellfollikel sind mit Sternchen markiert. In der höheren Vergrößerung (untere Bilder) erkennt man die dendritische Form der
reaktiven Zellen.
Der Großteil der DEC-205-positiven Zellen befindet sich
jedoch im T-Zellareal der Tonsille. Nur wenige dieser Zellen
sind Langerin-positiv. Auch nur einzelne DEC-205-positive
Zellen ko-exprimieren DC-LAMP, sind also reif.
Überraschenderweise wurden auch in der intrafollikulären
B-Zellzone der Tonsille DEC-205-exprimierende Zellen gefunden. In Doppelimmunfluoreszenzfärbungen mit Langerin
und DC-LAMP wurden, wie erwartet, keine positiven Zellen
gefunden. Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen CD4
und CD2, als Marker für DC der Keimzentren, waren aufgrund der Schwäche der Färbung nicht aussagekräftig. Aufgrund der begrenzten Zeitdauer war es mir im Rahmen meiner Diplomarbeit nicht möglich, diese Zellpopulation genauer zu charakterisieren.
Zur Beantwortung der Frage, ob es sich bei den DEC205-positiven Zellen in der B-Zellzone der Tonsille um die
„Germinal Center Dendritic Cells“, die „Tingible Body Makrophages“ oder sogar um die follikulär-dendritischen Zellen handelt, gäbe es die Möglichkeit diese Zellen zu isolieren
und mit verschiedenen Antikörpern zu färben.
Schlussfolgerungen
■ DEC-205 in der Haut vorwiegend in der Dermis
■ DEC-205 wird mit der Reifung hoch-reguliert
■ DEC-205 überraschend auf Zellen im B-Zellfollikel der
Tonsille
Diese Daten bilden eine Grundlage für weiterführende
funktionelle Studien an isolierten Zellpopulationen.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer für die Ermöglichung dieser Diplomarbeit. Er stand mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite und erleichterte mir die z. T.
sehr schwierige Auswertung der Immunfluoreszenzfärbungen,
sowie bei Frau Hella Stössel, die mir bei der Durchführung der
Immunfluoreszenzfärbungen mit ihrer langjährigen Erfahrung sehr behilflich war.
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Zita Ehammer, Dipl. MTA
E-Mail: [email protected]
Abb. 4: Betreuer Univ. Doz. Nikolaus Romani, Dr. rer. nat. und Dipl.
MTA Zita Ehammer, Diplomarbeit, MTA-Akademie Innsbruck
(2002), durchgeführt an der Univ.-Klinik für Dermatologie und Venerologie in Innsbruck.
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