Relaxations-spektrometrische Untersuchungen

mit 50 ml Wasser verdünnt. Die Stickoxyde werden nun
verkocht und der Kolbeninhalt quantitativ in ein 600-mlBecherglas übergespült. Die Lösung wird mit Wasser
auf ein Volumen von ca. 400 ml verdünnt. Nun wird
nach Zugabe einiger Tropfen Methylorange mit Ammoniak (d = 0,91) neutralisiert und anschließend mit
1 ml Salzsäure (d = l,10) angesäuert. Die Lösung wird
dann zum Sieden erhitzt und in der Siedehitze mit 15 ml
10-proz. BaCl2-Lösung tropfenweise gefällt. Nach beendeter Fällung wird noch einmal kurz aufgekocht. Das
Bariumsulfat wird nach ca. 2 Stdn. filtriert. Der Niederschlag wird mit heißem Wasser bis zur Cl-Freiheit gewaschen, im Porzellantiegel verascht und 1/« Stde. geglüht.
Verseifung von Buten(2)-diol-1.4-cycl.Sulfit
(I)
33,5 g (0,25 Mol) I werden in einem 250-ml-Rundkolben zusammen mit einer Lösung von 22 g NaOH in
150 ml Wasser am Rückfluß 1 0 - 1 5 Min. gekocht. Anschließend wird das Wasser im Vakuum abgezogen. Der
halbfeste Rückstand wird zweimal mit 50 ml und einmal
mit 25 ml Äthanol extrahiert, die vereinigten alkoholischen Auszüge im Vakuum abgedampft, der Rückstand
einmal mit 50 ml und zweimal mit 25 ml Essigester ausgezogen. Die Essigesterauszüge werden vereinigt, der
Essigester abdestilliert und das cis-Buten-2-diol-1.4 bei
1 0 1 - 1 0 2 ° und 2 mm destilliert. Ausb.: 18 g (82%)
vom Erstarrungspunkt + 4 — 5°. Das Dibenzoat schmilzt
bei 6 6 - 6 7 ° « .
IR-Spektren
der Sulfitester
Die Präparation der in der Tab. 1 aufgeführten
siebengliedrigen Sulfitester erfolgte durch Einbettung
in KBr (4 mg Substanz + 500 mg KBr). I wurde als
Film zwischen NaCl-Platten unter Benutzung des vollautomatisch registrierenden IR-Spektrographen der
Firma Leitz vermessen. Prisma: NaCl. Die IR-Spektren
sind in Abb. 1 wiedergegeben.
6
Vgl. auch „Über die quantitative Bestimmung von eis- und
£rarcs-Buten(2) -diol-1.4-dibenzoat", Z. analyt. Chem., im
Erscheinen.
Relaxations-spektrometrische Untersuchungen schneller Reaktionen
von ATP in wässeriger Lösung
V o n
H.
DIEBLER,
M .
EIGEN
u n d
G.
G.
HAMMES
*
Aus dem Max-Planck-Institut für physikalische Chemie, Göttingen
( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b, 5 5 4 — 5 6 0 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n am 6. Juli 1 9 6 0 )
Relaxations-Untersuchungen mit Hilfe der kürzlich entwickelten Temperatursprung-Methode erbrachten Aufschluß über die Kinetik der sehr schnell verlaufenden Reaktionen von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) mit Protonen-Donatoren bzw. -Akzeptoren und zweiwertigen Metallionen in wäßriger
Lösung. Die Geschwindigkeitskonstanten für die Protonenübertragung entsprechen den Maximalwerten, wie sie nach der Theorie der diffusionsbestimmten Reaktionen zu erwarten sind. Metallkomplex-Bildung und -Zerfall verlaufen beim Ca um etwa zwei Größenordnungen schneller als
beim Magnesium. Die Stabilitätskonstanten der entsprechenden Komplexe unterscheiden sich dagegen
nur geringfügig. Die Protonenübertragung von A T P auf einen Akzeptor wird durch Calcium-Ionen
spezifisch katalysiert. Die vorliegenden Ergebnisse erlauben die Aufstellung eines Modell-Reaktionsmechanismus, der die spezifische Metallionen-Aktivierung bei der enzymatischen Spaltung des ATP,
insbesondere den Mg — Ca-Antagonismus, zu beschreiben gestattet.
Adenosin-5'-triphosphat (ATP) ist als Substrat
vieler enzymatischer Reaktionen eine physiologisch
höchst wichtige Substanz. Seine enzym-katalysierten
Umwandlungen erfordern im allgemeinen zweiwertige Metallionen als Aktivatoren. Ca2® oder Mg 2 ®
sind im Falle der Phosphatspaltung bzw. -Übertragung besonders wirksam. Die Wirkung ist zumeist
sehr spezifisch für das Metallion; so beschleunigt
das eine Ion in vielen Fällen die Reaktion um Größenordnungen besser als das andere. Auch ist hier-
* Gegenwärtige Anschrift: Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Mass., USA.
bei durchweg ein Antagonismus, d. h. eine hemmende Wirkung des nicht oder weniger beschleunigenden Ions zu beobachten.
Es ist bekannt, daß A T P mit Ca2® und Mg 2 ®
relativ starke Komplexe bildet, eine Tatsache, die
sicherlich für die aktivierende Wirkung von wesentlicher Bedeutung ist. Die Stabilitätskonstanten dieser Komplexe haben bei 2 0 ° C und der Ionenstärke
/* = 0,1 (0,1-m. KCl) nach M A R T E L L und S C H W A R Z E N B A C H 1 die folgenden Werte (vgl. audi
ALBERTY
1
A. E. M A R T E L L U. G.
653 [1956].
SCHWARZENBACH,
Helv. chim. Acta
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39,
und
SMITH
sowie
NANNINGA
ATP 4 ®
2
)
ATPH 3 ®
10 4 0
102-°
[Mol"1]
IO3-6
IO1-8
[Mol"1]
[Die Abkürzung Mol steht jeweils für g-Mol/Liter.]
Mg 2 ®
Ca2®
Die geringfügigen Unterschiede der Konstanten
für Ca2® und Mg 2 ® können offensichtlich deren um
Größenordnungen verschiedenes Verhalten als Enzym-Aktivatoren nicht verständlich machen. In Anbetracht dieser Tatsache ist es von Interesse, die
Kinetik der Reaktionen zwischen A T P und Mg 2 ®
bzw. Ca2® zu untersuchen, die möglicherweise eher
einen Schlüssel zum Verständnis der genannten Erscheinungen liefert.
Derartige Reaktionen verlaufen allerdings so
schnell, daß sie mit herkömmlichen Untersuchungsmethoden nicht zu erfassen sind. Die innerhalb der
letzten Jahre entwickelten Relaxationsverfahren sind
dagegen geeignet, diese Vorgänge — sowie auch die
entsprechenden schnellen Teilschritte in enzymatischen Reaktionen — einer direkten Beobachtung zugänglich zu machen.
Experimente
Die im folgenden diskutierten Messungen wurden
mit Hilfe der Temperatursprung-Methode 3 ausgeführt.
Hierbei wird ein auf 105 V aufgeladener Kondensator
über die zu untersuchende (in einer Meßzelle befindliche) Lösung sehr schnell entladen. Die Temperatur
der Lösung steigt dabei in ca. 1 //sec um 10° sprunghaft
(homogen) an und bewirkt eine Verschiebung der
Gleichgewichtslage des chemischen Systems. Hierdurch
hervorgerufene Änderungen der Absorption (im sichtbaren und UV-Bereich) werden in Abhängigkeit von der
Zeit direkt gemessen, und zwar mit Hilfe einer spektralphotometrischen Anordnung (Differenzmethode) mit oszillographischer Registrierung. (Der Lichtstrahl durchsezt die Lösung in hinreichender Entfernung von den
Elektroden, so daß keine Störungen durch Entladungsprodukte auftreten können.)
gewichts-Konzentrationen der Reaktionspartner. Eine
Analyse des Relaxationsspektrums ermöglicht die Aufklärung des gesamten Reaktionsmechanismus. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten sei auf eine frühere Veröffentlichung4 verwiesen. Eine ausführlichere Beschreibung der
bei den vorliegenden Messungen verwandten Apparatur
(geeignet zur Bestimmung von Relaxationszeiten zwischen 1 sec und 3 //sec) erfolgt an anderer Stelle 5 .
Die Messungen am ATP-System wurden in der Umgebung des Neutralbereichs (PH 5,5 — 7,5) ausgeführt.
In diesem Bereich erfolgt die Abspaltung des letzten
Protons (PK' = 6,50 bei // = 0,1 und 20 °C), das nach
M A R T E L L und S C H W A R Z E N B A C H 1 in der endständigen Phosphatgruppe gebunden ist. Die pK-Werte der restlichen
protolytischen Gleichgewichte liegen sämtlich unterhalb
4,1. Als Indikator zur PH-Anzeige fanden Phenolrot
(PK' = 7,7) und Chlorphenolrot (PK' = 6,1; in beiden
Fällen bei // = 0,1 (KNO s ) und 20 °C) Verwendung.
In Abwesenheit von Metallionen war im ATP-Phenolrot-System jeweils eine Relaxationszeit (r x ) im Bereich
von 10 — 60 //sec meßbar, deren Reziprokwert sich praktisch als lineare Funktion der ATPH 3 ®-Konzentration
(bei konstantem PH) erwies. Mit steigender H®-Konzentration verschiebt sich diese Relaxationszeit zu kleineren Werten. In Gegenwart von Mg 2 ®-Ionen wird eine
zweite Relaxationszeit (T2) im Bereich zwischen 100 und
400 /usee sichtbar. Sie ist wiederum eine Funktion der
H® und der A T P 4 9 - bzw. ATPH 3 ®-Konzentration. Im
Gegensatz zur kürzeren Relaxationszeit ( r ^ hängt sie
jedoch auch von der Mg2®-Konzentration ab. Für das
System Calcium —ATP liegt diese zweite Relaxationszeit (r 2 ) unterhalb 3 //sec. Die Relaxationszeit
ist
hier wiederum unabhängig von Ca2® bei kleinen Konzentrationen des Metallions (Cca
10 _ 4 -m.). Bei höheren Konzentrationen (!> 10- 4 -m.) deutet sich jedoch
— im Gegensatz zu den Werten für das Mg2®-System —
eine geringfügige Verkürzung von r t (um ca. 15%) an.
Reaktionsmechanismus
Das unter den vorliegenden Versuchsbedingungen
gültige vollständige Reaktionsschema lautet:
^12
- MeATPH© + In2© II
MeATP2© + Hin©
r
k,21
\
k-t
kO
13A II "-31
^24 ^42
III
4
ku
]
IV
Me2© + ATP 4 ©+Hin®„
— Me2© - f ATPH3© + In2©
Die zeitliche Änderung der Zusammensetzung eines
t
*43
f
vielstufigen Reaktionssystems ist durch ein Spektrum
von Relaxationszeiten charakterisiert; diese stehen in
Me2© + ATP*© + H© + In2©
definiertem Zusammenhang mit den GeschwindigkeitsV
konstanten der einzelnen Teilschritte sowie den GleichA. A L B E R T Y U . R . M. S M I T H , J . Amer. chem. Soc. 78, 2376
[1956]. Vgl. auch L . B. N A N N I N G A , J . Phys. Chem., 6 1 ,
1144 [1957]. (Angaben über die Temperaturabhängigkeit der Gleichgewichte.)
* Als Stabilitätskonstante ist das Konzentrationsprodukt unter den angegebenen Ionenstärke-Bedingungen definiert:
2
R.
I
3
4
5
G. C Z E R L I N S K I u. M. E I G E N , Z. Elektrochem., Ber. Bunsenges.
physik. Chem. 63, 652 [1959].
M . E I G E N , Z. Elektrochem., Ber. Bunsenges. physik. Chem.
64, 115 [I960].
H . D I E B L E R U . M . E I G E N , Veröffentlichung in Vorbereitung
vgl. auch 1. c. 8 .
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11
Me 2 ® steht für Ca2® oder Mg 2 ®, während I n 2 0 und
Hin® die Indikatorkomponenten bezeichnen. Im vorliegenden Falle ist CH® immer klein gegenüber den
Konzentrationen aller übrigen Reaktionspartner. Der
Zustand V kann daher als stationärer Zwischenzustand
angesehen werden; er tritt explizit nicht in Erscheinung.
In Abwesenheit von Me2® ist somit nur eine Relaxationszeit (TJ) ZU erwarten, die die Umwandlungen zwischen den Zuständen III und IV beschreibt. Die Gleichgewichtseinstellung kann dabei durch eine direkte Protonenübertragung (III ^ IV) oder über die freien Protonen (III ^ V ^ IV) erfolgen. [Umwandlungen des
Typs: 0H® + H A ^ H 2 0 + A® verlaufen wegen der
gleichsinnigen Ladung von OH® und HA = ATPH 3 ®
bzw. IH® wesentlich langsamer als die entsprechenden
Reaktionen V ^ IV bzw. V ^ III und brauchen unter
den vorliegenden Bedingungen (PH < 7,2) nicht berücksichtigt zu werden.] Für die reziproke Relaxationszeit läßt sich dann folgender Ausdruck errechnen:
—
=
ki3
•(CATPH +
CIN) +
kZi
• (CATP +
j
CHIII)
(!)
^53' Cln
• CATP
—- ist (bei const,
T
PH)
eine lineare Funktion von
CATPH,
I
wenn C A T P > C H I H > C A T P H > C I und k5i C A T P ^ ^ 5 3 C I N
ist. Eine Variation der Konzentrationen in den Experimenten ermöglichte die Bestimmung aller in rt auftretenden Geschwindigkeitskonstanten mit Ausnahme
von ki5 und k5i .
N
In Gegenwart von Me2® ist die Relaxationszeit
nur
dann durch Gl. (1) gegeben, wenn die Einstellung der
Metallkomplex-Gleichgewichte ( I ^ e l l l , 1 1 ^ IV) langsam gegenüber der Einstellung der protolytischen Gleichgewichte erfolgt. (Hierbei ist — in Ubereinstimmung
mit den vorliegenden experimentellen Bedingungen:
Cjie < 2 • 1 0 - 4 - m . — vorausgesetzt, daß MeATPH im
Vergleich zu den anderen Reaktionspartnern in so klei-
1 + CH Kja
+
d ln
1 ö
l n
CH
C A T P H
3
2
1
0
1 2
3
V 5 6
7 8 9 10 11 12
CATPH-105[M]—+
Abb. 1. Reziproke Relaxationszeit l / r t in Abhängigkeit von
der ATPH-Konzentration [vgl. Gl. ( 1 ) ] bei konst. pH-Wert.
O •
' Meßpunkte für Lösungen in Abwesenheit von zweiwertigen Metallionen sowie bei kleinen Ca- und Mg-Konzentrationen. X : Meßpunkt für C c a = 2 - 1 0 _ 4 - m . Das Abweichen der
Ca-Meßpunkte von der Geraden bei CCa ^ 10 —4 -m. wurde
unter anderen Bedingungen ebenfalls eindeutig beobachtet;
die Mg-Meßpunkte zeigten unter gleichen Bedingungen keine
derartigen Abweichungen.
ner Konzentration vorliegt, daß die Einstellung des
Gleichgewichts I ^ II auf den gesamten Protonenumsatz
nur von untergeordnetem Einfluß bleibt.) Diese Bedingung ist für Mg 2 ® im gesamten Konzentrationsbereich
erfüllt. Die gemessenen Relaxationszeiten r t erfahren
keinerlei Änderung gegenüber den in Abwesenheit von
Mg 2 ® bestimmten Werten (vgl. Abb. 1).
Die in Gegenwart von Mg 2 ® gefundene zweite, längere Relaxationszeit (r 2 ) ist offensichtlich — insbesondere auf Grund ihrer Cng-Abhängigkeit — den langsamer verlaufenden Metallkomplex-Reaktionen zuzuordnen. Die Komplexgleichgewichte I ^ III und II ^ IV
sind in ihrer zeitlichen Einstellung über die schnell eingestellten protolytischen Gleichgewichte (I ^ II und
III ^ IV bzw. III ^ V ^ IV) miteinander gekoppelt
(ti
T2) . Unter dieser Bedingung gilt:
1 + CH Kjß
a/CEK0
I
k42(Cug+ß
CATP +
CATPH)
(2)
l+ß/CEKi5
+
^45/^-02
J
1+ ,
Kll_Cl°_
1+Kin cH
und
V
, FE3I ( C M G + C A T P + C A T P H / / # )
l+
«5 In CH
<5 In Cjtfg AT PH .
mit
10
) (1 + ^45 CH) CH/C M gATPH+l/^24C M g + ^45/^02
^02/^45
= 1+
(l+
In gepufferter Lösung (c5Ch ~ 0) werden a und ß = l.
(In Abb. 2 sind die mit dem Faktor l/ß korrigierten
Größen mit einem Stern bezeichnet: K* = K\jß ;
C* — Ci/ß.) K24 ist die oben angegebene Stabilitätskonstante des Magnesiumkomplexes von ATPH 3 ®, Ki n
die Assoziationskonstante des Indikatorgleichgewichts,
d+^02
CH) CH/CATPH
+ K
2 I
C U G + K J K ,
das bei endlichen Indikatorkonzentrationen mit zu berücksichtigen ist.
Die
£
4
5
Gleichgewichtskonstanten
=
C
A
T
P
H
Kn2 =
betragen nach
ATpH
Csig ATP ' CH
MARTELL
und
CATP•CH
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u n
j
SCHWAR-
10 '
und 106'5 *. Die durch Gl. (2) beschriebene Konzentrations- und pH-Abhängigkeit wird durch
die Meßwerte eindeutig wiedergegeben. Unter den genannten Bedingungen spielen allerdings die durch k2i
und k 42 charakterisierten Reaktionen nur eine verhältnismäßig geringe Rolle, so daß l / r 2 im wesentlichen
durch die Terme mit kl3 und k3l bestimmt ist. Immerhin war es möglich, aus den bei höheren H®-Konzentrationen gefundenen Abweichungen von dem in Abb. 2
ZENBACH
4
5
r
S
3
T
6
ö
^^ 5
1
3
2
1
0
1
2
3
'
1
5
6
"15 "H
Abb. 2. Reziproke Relaxationszeit l / r 2 für Mg 2 ®-ATP-Lösungen in Abhängigkeit des durch Gl. (2) vorgegebenen Konzentrations-Parameters. © : Meßwerte bei konstantem PH [lineare Abhängigkeit, vgl. Gl. (2) ] . X : Meßwerte bei verschiedenen pH-Werten [diese sollten nach Gl. (2) nicht auf der
eingezeichneten Geraden liegen].
dargestellten (den k13- und /c31-Termen entsprechenden)
Verlauf audi die Konstanten k2i und ki2 zu bestimmen
(eingetragene, nicht auf der Geraden befindliche Meßpunkte bei ph < 7 ) . Für Ca2® is,t offensichtlich die
oben genannte Bedingung — nämlich, daß die protolytischen Gleichgewichte sich schneller einstellen als die
Metallkomplex-Gleichgewichte — nicht erfüllt. Im genannten Zeitbereich Q> 3 //s) war nur eine Relaxationszeit (r x ) meßbar, die für Cca < 10~ 4 -m. von der Ca2®Konzentration unabhängig [und damit durch Gl. (1)
darstellbar] ist. Dieses Verhalten war zu erwarten, da
bei früheren Messungen 4 ' 6 bereits gefunden worden
war, daß sich Ca 2 ®-Komplexe mit einer um Größenordnungen höheren Geschwindigkeit bilden als Mg 2 ®Komplexe. Unter den vorliegenden Bedingungen ist r 2
wesentlich kürzer als r t und mit der genannten Methode
nicht mehr erfaßbar. Das bedeutet aber auch, daß bei
höheren Ca2®-Konzentrationen die Einstellung der protolytischen Gleichgewichte ( r ^ durch das Metallion
katalysiert werden kann. Eine entsprechende Verkür* Das Gleichgewicht MeATP 2 ® + H ©
MeATPH® sowie
auch das mit III ^L V identische Gleichgewicht
In2® + H® ^ I l n H ®
hätten in der Schreibweise des oben wiedergegebenen
Reaktionsschemas über den Stufen I ^ II aufgeführt werden müssen. Da jedoch MeATPH hinreichend klein ist,
kann man es aus den gleichen Gründen wie das Gleichgewicht I Z^. II in r t vernachlässigen. Bei der Berechnung
zung von r t konnte tatsächlich bei Ca2®-Konzentrationen
von ca. 2 • 10 - 4 -m. beobachtet werden. Der Effekt ist
folgendermaßen zu verstehen: Die durch Komplexbildung erfolgende Ladungsneutralisation ermöglicht einen
schnelleren Protonenaustausch zwischen den beiden negativ geladenen Reaktionspartnern, so daß k12 und k2l
größer als k Si und Ä;43 sein sollten Bei sehr hohen
Metallionenkonzentrationen liegt das Gleichgewicht vollständig auf Seiten der Stufen I und II. Hier erfolgt der
Protonenaustausch in Anwesenheit von Ca2® wie auch
von Mg2® (CMe ^ 10~ 3 -m.) um einen gewissen Faktor
schneller als in Abwesenheit oder bei niedrigeren Konzentrationen der Metallionen, was auch experimentell
für beide Ionen nachgewiesen werden konnte. Die oben
mitgeteilten Experimente beziehen sich jedoch durchweg auf Metallionen-Konzentrationen, bei denen die
Verbindung MeATPH nur in vernachlässigbar kleiner
Konzentration vorliegt. Hier könnte eine Verkürzung
von xx nur dann auftreten, wenn die Einstellung des
Gleichgewichts III ^ IV auf dem Wege III ^ I ^ II ^ IV
schneller als auf dem direkten Wege erfolgen kann.
Bei Mg2® (im Falle nicht zu hoher Konzentrationen)
ist dies wegen r 2
r x nicht möglich, wohl aber — unter
vergleichbaren Konzentrationsbedingungen — bei Ca2®
(vgl. den besonders gekennzeichneten Meßpunkt in
Abb. 2). Es handelt sich im Falle des Ca2® (bei nicht
zu hohen Konzentrationen) um eine echte katalytische
Wirkung. Sie könnte unter geeigneten Bedingungen die
Wirkung des Mg 2 ®-ions um Größenordnungen — entsprechend den Unterschieden in den k13-, k3l- bzw. k2i-,
ki2-Werten — übertreffen * und stellt den Modellfall
einer Reaktionsaktivierung durch Metallionen (s. u.)
dar. Für die Geschwindigkeitskonstanten der Ca-Komplexbildung lassen sich auf Grund der gefundenen
Katalyse sowie auf Grund der Tatsache, daß r 2 <C 3 //sec
ist, untere Grenzwerte angeben. Andererseits ist durch
die Theorie diffusionsbestimmter Reaktionen ein oberer
Grenzwert vorgegeben, der sich um weniger als eine
Größenordnung von diesem Wert unterscheidet.
Ergebnisse und Diskussion
Die numerischen Werte für die einzelnen Geschwindigkeitskonstanten sind im folgenden zusammengestellt. Aus apparativen Gründen 5 konnten die
kürzeren Relaxationszeiten vorerst nur bei niedrigeren Temperaturen ( < 1 5 ° C )
bestimmt werden.
(Die Messungen für r < 5 • 1 0 ~ 5 sec mußten in der
Nähe des Dichtemaximums des Wassers ausgeführt
werden, da sonst eine Druckoszillation mit Kavitavon r 2 wurden diese Stufen als eingestellte Gleichgewichte
mitberücksichtigt.
6 G. C Z E R L I N S K I , H. D I E B L E R U . M . E I G E N , Z . phys. Chem. N . F .
19, 246 [1959].
* Das ist dann der Fall, wenn die dem Schritt I ^ II entsprechende Reaktion sehr viel schneller als die dem Schritt
III
IV entsprechende verläuft. Im vorliegenden Falle
erfolgt die Protonenübertragung auch ohne Ladungsneutralisierung noch hinreichend schnell.
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tions-Erscheinungen auftritt 5 .) Die aus den r 2 -Werten
Konstanten
bestimmten
beziehen
(Ä; 43 , k2i) sind kleiner als die der Protonen-Rekom-
sich dagegen auf 25 ° C . Die Unterschiede in den
bination auf Grund der geringeren Beweglichkeiten
k-Werten für die beiden angegebenen Temperaturen
der Reaktionspartner und der zwischen ihnen wirk-
sollten im Falle derartig schneller Reaktionen rela-
samen elektrostatischen Abstoßung
tiv gering sein.
der Ionenstärke 0,1 bereits weitgehend kompensiert
Geschwindigkeitskonstanten
a) Protolytische Reaktionen (13 ° C ; ^ = 0,1)
/c12~108
Mol-1
sec-1;
k2l ~ 109 M o l - 1 s e c - 1 * ;
k3i =
/C43 —
k35 =
k53 =
(4,8 ± 1,2) • 107 M o l " 1 s e c " 1 ;
(7,1 ± 1 , 4 ) - IO8 M o l - 1 s e c - 1 ;
(6 ± 4 ) • 102 s e c - 1 ;
(3 ± 2) • 1010 M o l " 1 s e c - 1 .
b) Metall-Komplex-Reaktionen
Mg2® :
Ca 2 ®:
Mg 2 ®:
k3l =
kti =
kn>
A:13>
Ä24 =
ki2 =
(25 ° C , ^ = 0,1)
(1,2 ± 0,3) • 107 M o l " 1 s e c - 1 ;
1,2 ± 0 , 3 - I O 3 s e c " 1 ;
109 M o l " 1 s e c " 1 ;
105 s e c - 1 ;
(3±2)-104sec"1;
(3 ± 2) • 106 M o l - 1 s e c - 1 .
Weiterhin läßt sich die Geschwindigkeitskonstante
für die Rekombination des Protons mit ATP 4 ® zu
ca. 10 1 1 M o l - 1 s e c - 1 (k5i) und die der zugehörigen
Rückreaktion zu ca. 3 • 10 4 s e c - 1 (& 45 ) abschätzen.
Die relativ weiten Fehlergrenzen für die angegebenen Werte rühren z. T. daher, daß sich der pEWert in schwach gepufferten Lösungen nicht sehr
konstant halten läßt, und daß in einzelnen Fällen
die Meßtemperatur nicht mit der Temperatur übereinstimmt, auf die sich die Gleichgewichtskonstanten
(Literaturwerte) beziehen. Diese Einflüsse sind
durchweg von untergeordneter Bedeutung. Der wesentlichere Fehler ist durch die Unsicherheit der
Auswertung bedingt, da der betrachtete Reaktionsschritt oftmals nur geringfügig zum numerischen
Wert der Relaxationszeit beiträgt. Die experimentell
bestimmbaren Größen, die Relaxationszeiten, konnten durchweg mit einer Genauigkeit von ± 10% erhalten werden.
Eine Analyse der in Tab. 1 a wiedergegebenen
Werte für die Geschwindigkeitskonstanten zeigt, daß
die protolytischen Reaktionen {k53, &54 , &43, k21)
diffusionsbestimmt sind 4 . Der Wert der Konstanten
k53 für die Rekombination des Protons mit dem Indikatoranion entspricht durchaus den bereits früher
für Reaktionen ähnlichen Typs erhaltenen Ergebnissen (z. B. 4,5 • 10 1 0 M o l - 1 s e c - 1 für Essigsäure 4
(,u = 0 ) , 4 , 8 - 1 0 1 0 M o l " 1 s e c " 1 für ytf-Naphthol im
angeregten Zustand 7 ( ^ = 0 ) ; der in Tab. 1 a angegebene Wert ist erwartungsgemäß etwas kleiner,
da er sich auf die Ionenstärke ^ = 0,1 bezieht). Die
der
Protonenübertragungs-Reaktionen
(die aber
bei
w i r d ) . Die Protonenübertragung erfolgt durchweg
bei jeder sterisch günstigen Begegnung der Partner
innerhalb eines Wirkungsabstandes von ca. 5 Ä . Die
Werte für die zugehörigen Rückreaktionen sind auf
Grund der Gleichgewichtsbedingungen entsprechend
kleiner.
Die Metallkomplex-Reaktionen zeigen wiederum
ein Verhalten, wie es bereits bei den oben zitierten 4 ' 6
Untersuchungen mit anderen Liganden gefunden
wurde: Die Bildung der Ca-Komplexe erfolgt um
ca. 2 Größenordnungen schneller als die der entsprechenden Mg-Komplexe. Die numerischen Werte der
Rekombinationsgeschwindigkeitskonstanten
(Ä; 31 ,
ki2) hängen etwas von der Wahl der Gleichgewichtskonstanten (vgl. Ref. 1 bzw. 2) ab.
Dieser Befund mag für die Erklärung der aktivierenden Wirkung der genannten Metallionen bei
der enzymatischen Spaltung des A T P von Bedeutung
sein. Wie in der Einleitung bereits ausgeführt wurde,
läßt sich die Spezifität in der Wirksamkeit der beiden
Ionen nicht auf das Gleichgewichtsverhalten der einfachen Komplexe zurückführen. Insbesondere ist eine
höhere Wirksamkeit des Ca2® als Aktivator zunächst
kaum zu verstehen.
Das nunmehr an einer Reihe von Beispielen u. a.
auch bei der Bildung von Doppelkomplexen, d. h.
Komplexen eines Metallions mit zwei Substraten *,
allgemein nachgewiesene reaktionskinetische Verhalten der beiden Ionen ermöglicht eher ein Verständnis der Unterschiede in der aktivierenden Wirkung
bei Enzymreaktionen. Hierzu sei folgender einfache
Mechanismus betrachtet:
III'
EMeP' v
12
EMe + S —
EMeS
I
II
21
23
33 t
> EMeP
\3'4
\
34
> P 4 EMe
III
IV
* für Me2® =Ca 2 ®
A. W E L L E R , Z . Elektrochem., Ber. Bunsenges. physik. Chem.
7
64,
55
[I960].
* Die Liganden des zweiten Substrats waren Amino-diessigsäuren; über die Untersuchungen wird an anderer Stelle
ausführlicher berichtet werden 8 .
8 H. D I E B L E R , Dissertation, Göttingen 1 9 6 0 .
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Ein Enzym-Metall-Komplex EMe reagiert mit dem
Substrat S und verwandelt dieses in das Produkt P.
Für den Fall, daß die Bildung des Komplexes EMeS
oder der Zerfall des Komplexes EMeP der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist, kann Ca2® unter
optimalen Bedingungen die (in gerader Richtung
I—»-IV verlaufende) Reaktion ca. 100-mal stärker
beschleunigen als Mg 2 ®. Dieser Unterschied kann sich
verringern, wenn die Umwandlung II —^ III nicht
schnell genug erfolgt und so für die Gesamtgeschwindigkeit bestimmend wird (z. B. wenn bei stationärem
Ablauf k2s ^ k2x w i r d ) . Die Bedingungen für eine
solche Ca-Aktivierung sollten bei der enzymatischen
Hydrolyse des A T P erfüllt sein, von der bekannt ist 9 ,
daß sie durch Ca2® wesentlich besser aktiviert wird
als durch Mg 2 ®, und deren Maximalgeschwindigkeit
hinreichend groß ist.
In zahlreichen anderen Fällen findet man jedoch,
daß Mg 2 ® der bessere Aktivator ist. Auch das läßt
sich mit Hilfe des oben wiedergegebenen Mechanismus verständlich machen, z. B. wenn eine Gabelung
des Reaktionsweges vorliegt. Die Reaktion III —> III'
steht dann in Konkurrenz zum Zerfall des EnzymMetall-Substrat-Komplexes. Dieser hat für Mg 2 ®
eine ca. 100-mal größere Lebensdauer als für Ca 2 ®;
mithin ist die Umwandlung zu P' im Falle des Mg 2 ®
wesentlich begünstigt.
Ein aktivierender Einfluß durch Mg 2 ® ist bei der
Muskelkontraktion bekannt 1 0 . Obwohl die gleichzeitig mit der Kontraktion zu beobachtende ATPSpaltung allein besser durch Ca2® katalysiert wird 9 ,
ist für die Kontraktion selbst das Mg 2 ® unentbehrlich. Der oben angegebene Mechanismus vermag ein
solches Verhalten, d. h. verschiedene spezifische Wirkungen von Ca und Mg innerhalb eines Reaktionsmechanismus, (sogar quantitativ) zu beschreiben:
Die Kontraktion — deren Mechanismus hier nicht
weiter zur Diskussion stehen soll — kann durch
eine zur Dissoziation des Protein-Metall-SubstratKomplexes in Konkurrenz stehende Umwandlung
(Strukturänderung bzw. Faltung des Proteins) aufgefaßt werden (Schritt 3 3 ' ) . Der Zustand III' repräsentiert dann die kontrahierte Form. Im Fall des
Ca2® erfolgt zwar die Spaltung schnell genug, jedoch
dissoziiert der Komplex (Schritt 3 4 ) , bevor die Um-
9
10
K. J. L A I D L E R U . M . F. M O R A L E S , Arch. Biochim.
biophysica Acta [Amsterdam] 3 9 , 3 7 [ 1 9 5 2 ] .
H . H . WEBER,
Z . Elektrochem.,
Ber. Bunsenges. physik.
Chem. 55, 5 1 1 [ 1 9 5 1 ] . S. auch: H . H . W E B E R , Arzneimittel-
wandlung (Schritt 33 ) stattfinden kann. Im Falle
des Mg2® ist dagegen die Lebensdauer des Zustandes III lang genug, um eine Umwandlung nach III'
hin zu erlauben. Dieser Konkurrenzvorgang würde
auch den Antagonismus beider Ionen erklären.
Der aus dem oben angegebenen Reaktionsschema
folgende Unterschied der Aktivierungskinetik von
Ca und Mg ist im Prinzip unabhängig von den zur
Zeit diskutierten Modellen der Muskelkontraktion 11
und würde für die verschiedenen Mechanismen in
gleicher Weise zutreffen.
Auf den Fall der im allgemeinen durch Mg 2 ®Ionen bevorzugt aktivierten reversiblen Phosphatübertragungen (z. B. durch Hexokinase, Pyruvatkinase etc.) sind diese Überlegungen wegen der
Reversibilität aller Reaktionsschritte nicht ohne weiteres anwendbar. In den oben genannten Mechanismen ist eine für Ca2® und Mg 2 ® um Größenordnungen verschiedene Aktivierung allein auf Grund
der Unterschiede in der Komplexkinetik möglich.
Wesentliche Voraussetzung hierfür ist, daß der
eigentliche Umwandlungsschritt II —> III (und auch
III —>• III') auf Grund der Gegenwart der Metallionen relativ schnell erfolgt. Trifft diese Voraussetzung nicht zu, so kann die spezifische Wirkung des
Metallions nur noch auf einem direkten Eingriff in
die Reaktion II — I I I (Polarisation und Lockerung
einer Bindung) oder auf einer — auch im Gleichgewichtsverhalten zum Ausdruck kommenden — bevorzugten Stabilität des Zustandes II beruhen. Unter
diesen Bedingungen sollte das Magnesium-Ion
bevorzugter Aktivator sein. Der stärkere Einfluß des
Mg 2 ® auf die Bindungsverhältnisse in koordinativ
angelagerten Molekeln kommt z. B. direkt in den um
mehr als eine Größenordnung verschiedenen Hydrolyse-Geschwindigkeiten der Ca 2 ®- und Mg 2 ®-Aquokomplexe zum Ausdruck. Auch scheinen auf Grund
neuerer Beobachtungen im Falle von 2 und mehr
Substraten allgemein die Mehrfach-Komplexe des
Mg in der (Gleichgewichts-) Stabilität gegenüber
denen des Ca bevorzugt zu sein. Wir werden auf
diese Effekte noch in einer ausführlicheren Veröffentlichung zurückkommen.
Es muß betont werden, daß der oben angegebene
Mechanismus hypothetischer Natur ist und nur eine
L . OULLET,
11
Forsch. (Drug Res.) 1 0 , 4 0 4
Literaturangaben).
M. F. M O R A L E S , Rev. Mod. Phys.
[1960]
31, 426
(daselbst weitere
[1959].
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(in Gang befindliche) Untersuchungen an Enzymsystemen direkt nachgeprüft werden.
— wir glauben eine besonders einfache — Möglichkeit zur Erklärung beider Aktivierungseffekte bei
der irreversiblen Phosphatspaltung und ihrer Folgereaktionen darstellt. Das wirkliche Geschehen mag
wesentlich komplizierter sein; es muß durch weitere
Der N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n sind
wir für die Gewährung eines Stipendiums, das einem
von uns (G. G. H.) die Mitarbeit ermöglichte, zu besonderem Dank verpflichtet.
Untersuchungen zur Biogenese des Erythromycins
I. Mitt.: Der A u f b a u des Lactonringes*
V o n
HANS
GRISEBACH,
HANS
ACHENBACH
u n d
WERNER
HOFHEINZ
Aus dem Chemischen Laboratorium der Universität Freiburg/Brg.
( Z . Naturforschg. 15 b , 5 6 0 — 5 6 8 [ 1 9 6 0 ] ; eingegangen am 27. Juli 1960)
After addition of propionic acid-[l- 14 C-3-T] to cultures of Streptomyces erythreus the 14 C/T ratio
in the isolated erythromycin was determined and K u h n - R o t h oxidation was carried out to determine the location of the 14C and T activity in the molecule. The results prove that the lactone ring of
erythromycin is derived from propionate units. Possibly propionic acid also plays a part in the biosynthesis of cladinose.
Das Antibioticum Erythromycin (I) 1 , ein Stoffw e c h s e l p r o d u k t v o n Streptomyces
hat als
erythreus,
Grundgerüst einen makrocyclischen Lactonring, der
glykosidisch mit 2 Zuckern, Desosamin und Cladinose, verknüpft ist. Einige weitere Vertreter dieser
neuen Klasse von Naturstoffen, die als Macrolide 2
bezeichnet werden, sind in den letzten Jahren entCH 3
CH 3
I
deckt worden. Auf Grund der regelmäßigen Anordnung der C-Methylgruppen im Erythromycin hat
G E R Z O N 3 die Möglichkeit
diskutiert, daß die Biogenese des Lactonringes aus 7 Propionateinheiten
erfolgen könnte.
Der Gedanke einer Beteiligung von Propionsäure
am Aufbau methylverzweigter Fettsäuren war früher
CH3
I
CH3
I
CH3
I
CH3
I
I
H 3 C - C H 2 - C • • c h 2 - C • • C H 2 - C • • CH2-C • • C H 2 - C • • C H 2 - C • • C H 2 - C
II
o
II
0
II
O
II
O
I
O
8aCH33
0 8aCH
II
I
OH OH
I I
II
O
O
6a CH3
I
II
II
O
4a CH8
I
2a CH3
I
HsCi5-Ci4H1-Ci3H-Ci2-C11H-CioH-C9-C8H-C7H1-C6-C6H-C4H-C3H-
12a
C H
10a
3
C H
OH
3
or2
C
2
H - Ci = 0
O R I
0
H
RI
=
3
C
O C H
H3C
ch3
\ /
N
3
R2
- O H
- C H
* Ein kleiner Teil der Ergebnisse wurde bereits in einer kurzen Mitt. veröffentlicht: H . G R I S E B A C H , H . A C H E N B A C H U .
U . C . G R I S E B A C H , Z. Naturforschg. 47, 2 0 6
[I960].
P.F.WILEY,
O . WEAVER,
K . GERZON,
U . C . QUARCK,
E . H . FLYNN,
1 — O H
0
J - O H
/
Desosamin
Cladinose
1
—
H3C-
3
M . V . SIGAL
R . R . CHAUVETTE U. R .
jr.,
2
3
J. Amer. chem. Soc. 7 9 , 6 0 6 2 [ 1 9 5 7 ] .
R. B . W O O D W A R D , Angew. Chem. 6 9 , 5 0 [ 1 9 5 7 ] ,
K. G E R Z O N , Vortrag auf dem 1 4 . Internationalen Kongreß
f. reine u. angewandte Chemie, Zürich, 23. Juli 1955.
MONAHAN,
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