Abteilung Genvektoren Institut für Klinische Molekular

Department of
Gene Vectors
Institute of
Clinical Molecular
Biology and
Tumour Genetics
DIE
INSTITUTE
Abteilung
Genvektoren
Institut für
Klinische Molekularbiologie und
Tumorgenetik
Munich
(Head: apl. Prof. Dr. Wolfgang
Hammerschmidt)
München
(Leiter: apl. Prof. Dr.
Wolfgang Hammerschmidt)
ie Abteilung Genvektoren befasst
sich mit der molekularbiologischen
Untersuchung eines Herpesvirus
des Menschen und dessen Interaktion mit
menschlichen Zielzellen. Das Herpesvirus,
Epstein-Barr-Virus (EBV) genannt, ist ein
Krankheitserreger, der als Modell für verschiedene Aspekte der herpesviralen Infektion des menschlichen Wirts betrachtet
wird. Epstein-Barr-Virus war das erste
menschliche Tumorvirus, das entdeckt
wurde; es gilt heute als karzinogenes
Agens nach der internationalen Klassifikation der WHO. Das Virus ist assoziiert mit
einer Reihe von Tumoren wie dem Nasopharyngealen Karzinom, dem Burkitt- und
Hodgkinlymphom und anderen Lymphomen des Menschen, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten auftreten.
Eine besondere Eigenschaft des EpsteinBarr-Virus macht die Forschung mit diesem
viralen System besonders attraktiv: Das
Virus infiziert sehr effizient ruhende, also
nicht proliferierende, menschliche B-Zellen.
Die Infektion ist latent, Nachkommenviren
werden nicht gebildet, die genetische Information des Virus bleibt aber in der infizierten Zelle erhalten. Diese latent infizierten
D
esearch in the Department of Gene
Vectors is concerned with the molecular analysis of a human herpes
virus, called Epstein-Barr virus, and the
interaction of the virus with its host cell.
Epstein-Barr virus is a model pathogen in
that it infects man and establishes a latent
infection for a lifetime. Epstein-Barr virus
was the first human tumour virus to be
discovered and is now classified as a group
1 carcinogen by the WHO. This virus is
strongly associated with a number of
human tumours such as nasopharyngeal
carcinoma, Burkitt’s lymphoma, immunosuppression-related lymphomas, Hodgkin’s
disease, and others. One characteristic of
the virus makes the viral system particularly attractive for research: EBV infects
resting (non-proliferating) human B-lymphocytes and converts them into B-cell
lines that can proliferate indefinitely in cell
culture. This biological property provides a
cell culture model for EBV related diseases
and is reminiscent of some (but not all)
aspects of tumour etiology in man.
This cell culture model is used as a basis
in our molecular research, which focuses
on various aspects of the control of cell
proliferation, DNA replication, and signalling
of cellular and viral receptor molecules.
The main emphasis from a technical and
methodological point of view is on the
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Zellen erwerben die Eigenschaft, unbegrenzt zu proliferieren und spiegeln damit
einige (aber nicht alle) Aspekte der Tumorentstehung beim Menschen wider.
Die Immortalisation von B-Zellen stellt
also ein Modellsystem dar, das wir als Arbeitsplattform benutzen. Im Rahmen unserer molekularbiologischen Forschung verfolgen wir verschiedene Aspekte, die sich
mit der Kontrolle der Zellproliferation, der
viralen und zellulären DNA-Replikation und
der Signalübertragung von Virus-kodierten
und zellulären Rezeptoren befassen. Als
methodischen Ausgangspunkt haben wir
uns Techniken erarbeitet, die es erlauben,
das virale Genom in jeder Hinsicht genetisch zu verändern. Diese molekulargenetischen Werkzeuge erlauben nicht nur die
gezielte Manipulation der pathogenen
Eigenschaften des Virus, sondern ermöglichen es auch, sichere Genvektoren herzustellen, die therapeutisch interessante Gene in normale oder transformierte menschliche B-Zellen einbringen können.
Um diesen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden, arbeiten wir an drei teilweise überlappenden Themen, die die EBVGenetik und viralen Vektorentwicklung zum
Inhalt haben oder Aspekte der DNA-Replikation beziehungsweise der Signaltransduktion bearbeiten.
Am Jahresende waren in der Abteilung
8 Wissenschaftler, 8 Doktoranden, 2 Diplomanden und 3 technische Mitarbeiterinnen
beschäftigt; insgesamt werden ca. 61 % der
Personalstellen über Drittmittel finanziert.
Immuntherapie mit EBV-Vektoren
Zur Zeit werden weltweit etwa 100.000
Transplantationen großer Organe und
Knochenmark durchgeführt. Um eine Abstoßung des transplantierten Organs zu
vermeiden, ist es nötig, das Immunsystems des Empfängers zu unterdrücken. Als
Folge dieser Unterdrückung können ansonsten ungefährliche Virusinfekte bei Transplantationspatienten verheerende Folgen
haben. Insbesondere die Herpesviren
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GSF
tools that we have developed to dissect the
virus’s genome genetically. These tools
enable us both to manipulate the pathogenic characteristics of the virus, and to use
the virus as a harmless gene vector that
can deliver genes of therapeutic interest
into normal or transformed human B-cells.
In order to carry out research into these
different but overlapping topics, the
department is divided into three groups
working on EBV genetics and vector
development, DNA replication, and
signalling.
At the end of the year there were 8 scientists, 8 postgraduate students, 2 undergraduate students, and three technicians in
the department, nearly two-thirds
supported by grant funds.
(Cytomegalovirus, CMV, und Epstein-BarrVirus, EBV), aber auch Adenovirusinfektionen sind für einen hohen Anteil an lebensgefährlichen Komplikationen und Todesfällen verantwortlich. Konventionelle antivirale
Therapeutika sind nur bedingt wirksam
und besitzen teilweise gravierende Nebenwirkungen, so dass oft nur die Möglichkeit
bleibt, das Ausmaß der Immunsuppression
zu reduzieren mit dem Risiko, eine Organabstoßung zu provozieren. Aus dieser
schwierigen Lage heraus setzt man heute
Hoffnungen auf den Einsatz Virus-spezifischer T-Zellen, nicht nur die Viruserkrankung akut und effizient unter Kontrolle zu
halten, sondern gleichzeitig auch ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen.
Diese Methode wird als „adoptiver T-Zelltransfer“ bezeichnet.
Die immunologische Kontrolle über virale Infektionserreger erfolgt fast ausschließ-
EBV peptide
pp65 peptide
DIE
INSTITUTE
pp65-specific T cell
class I molecule
T cell receptor
mini-LCL
Abb. 1: Für die Aktivierung spezifischer T-Zellen ist es nötig, dass Proteinbestandteile (Peptide)
von professionellen Antigen präsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen und LCLs, im Kontext mit HLA Klasse I- und II-Molekülen dargeboten werden. Spezifische T-Zellen erkennen diesen
HLA-Peptidkomplex mit Hilfe eines Rezeptors und beginnen sich zu teilen und Zytokine zu produzieren. In der Folge werden alle Zellen, die identische HLA-Peptidkomplexe tragen (wie etwa
CMV-infizierte Zellen) von diesen T-Zellen erkannt und zerstört.
lich über zytotoxische T-Zellen; diese T-Zellen erkennen und lysieren Virus-infizierte
Zellen im infizierten Organismus. Da gewöhnlich eine stark ausgeprägte antivirale
zytotoxische T-Zellantwort gegen EBV
und CMV existiert, war es mit relativ einfachen Mitteln möglich, spezifisch gegen
EBV oder CMV gerichtete zytotoxische
T-Zellen in vitro zu vermehren und diese
T-Zellen im Rahmen der Prophylaxe oder
Therapie von Virus-bedingten Problemen
in immunsupprimierten Patienten klinisch
auf ihre Wirksamkeit zu testen. Wie erwähnt, werden beide Viren, obwohl sie im
Gesunden normalerweise apathogen sind,
zum gravierenden Problem nach der therapeutisch herbeigeführten fundamentalen
Immunsuppression im Kontext der allogenen Knochenmarkstransplantation, aber
auch nach Transplantation solider Organe.
Mehrere klinische Zentren praktizieren
bereits diese Art der Therapie, so Gruppen
in Memphis (USA), Edinburgh (UK), Stockholm und Brisbane (Australien), meist
erfolgreich und ohne gravierende Nebenwirkungen.
Zur Generierung von EBV-spezifischen
T-Zellen bietet es sich an, B-Lymphozyten
mit EBV zu infizieren und dadurch ständig
proliferierende Zelllinien (sogenannte LCLs)
zu generieren. Da diese LCLs verschiedene
virale Proteine (Antigene) produzieren,
sind sie sehr effektive Stimulatoren für
EBV-spezifische T-Zellen. Das klassische
Kultivierungssystem für CMV dagegen,
CMV-infizierte und Virus-produzierende Fibroblasten, eignet sich zwar prinzipiell zur
Generierung Virus-spezifischer T-Zellen in
vitro, weist aber im Vergleich zu EBV-infizierten LCLs als antigenpräsentierenden
Zellen klare Nachteile auf. Bei Fibroblasten
handelt es sich nicht um professionelle an-
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pp65 mini-EBVs
periphere T-Zellen
B-Zellen
Restimulation
pp65 mini-LCLs
expandierte und aktivierte pp65und EBV-spezifische T-Zellen
Abb. 2: Zur Herstellung von pp65 exprimierenden mini-LCLs werden rekombinante EBV-Partikel
in einer zu diesem Zweck entwickelten Verpackungszelllinie hergestellt und primäre B-Zellen damit infiziert. Diese mini-LCLs dienen als Stimulatoren für periphere T-Zellen. So gelingt die
Herstellung einer großen Zahl pp65- und EBV-spezifischer T-Zellen, die zur adjuvanten Therapie
verwendet werden können.
tigenpräsentierende Zellen, die nur sehr
eingeschränkt HLA Klasse I-Moleküle exprimieren. HLA Klasse-II-Moleküle und Zelladhäsionsmoleküle werden gar nur nach
Interferon-Behandlung in gewissem Maß
exprimiert. HLA-Moleküle sichern zum
einen die individuelle genetische Identität,
zum anderen die Gewebsverträglichkeit.
HLA-Moleküle erlauben die Erkennung von
eigenen und fremden Zellen (auch Krebszellen) und sind die Basis für zelluläre Immunität und Antigenerkennung, die im
Kontext der HLA-Moleküle erfolgt (Abb. 1).
Im Resultat entstehen mit Hilfe von Virusinfizierten Fibroblasten als Antigen-präsentierende Zellen T-Zellpopulationen, bei
denen nur ein geringer Anteil Virus-spezifisch ist. Für den klinischen Einsatz ist daher eine langwierige Klonierung der T-Zellen und anschließende Expansion nötig.
Mit dieser Methode wurden die Pionierarbeiten auf dem Gebiet des adoptiven Transfers mit virusspezifischen T-Zellen geleistet, bei denen 14 Stammzelltransplantations-Patienten prophylaktisch CMV-spezifische T-Zellen erhielten und frei von CMVassoziierten Krankheitsbildern blieben.
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Wohl wegen des besonders hohen Aufwandes dieser Methode ist sie für den klinischen Einsatz von anderen nicht aufgegriffen worden.
Um die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zellen zu erleichtern, haben wir ein
in vitro-Modell entwickelt, in dem gentechnisch veränderte LCLs als Stimulatoren für
Virus-spezifische T-Zellen verwendet werden. Um solche rekombinanten LCLs von
fast jedem Spender generieren zu können,
verwenden wir mini-EBV-Plasmide. Bei diesen Plasmiden handelt es sich quasi um
„abgespeckte“ Viren, die nur noch knapp
die Hälfte der Erbsubstanz des WildtypEBVs umfassen. Dennoch haben sie die
biologische Eigenschaft nicht verloren,
B-Zellen zu immortalisieren. Gleichzeitig
bieten sie aber die Möglichkeit, Fremdgene
(wie virale Antigene anderer Viren wie
pp65 von CMV; Abb. 2) unterzubringen.
LCLs, die mit Hilfe dieser mini-EBVs generiert wurden („mini-LCLs“) exprimieren
daher nicht nur EBV-Proteine, sondern
auch sehr effizient CMV-Antigene. Mit diesem Zellsystem gelingt es uns, sehr effizient CMV-spezifische T-Zellen von jedem
virale Antigene in Frage, wie sie in Karzinomen der Cervix, der Haut und bei Karzinomen im Hals-Nasen-Ohren-Bereich auftreten. Diese Karzinome sind in der Regel mit
dem humanen Papillomvirus infiziert, dem
auch eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung zukommt. Andere Antigene zellulären Ursprungs, die in Krebszellen genetisch mutiert sind, eignen sich ebenfalls als
Zielantigene für zytotoxische T-Zellen. Als
Beispiel können hier verschiedene zelluläre
Antigene beim Melanom herangezogen
werden. Es besteht die berechtigte Hoffnung, dass es mit Hilfe des adoptiven
T-Zelltransfers gelingt, in Zukunft auch
bei bestimmten Tumoren therapeutische
Erfolge zu erzielen.
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beliebigen Spender in großer Zahl herzustellen. Von solchen T-Zellen wissen wir,
dass sie alle erhofften zellbiologischen und
zytotoxischen Eigenschaften aufweisen,
die für einen wirkungsvollen Einsatz am
Patienten nötig sind. Wir hoffen deshalb, in
naher Zukunft diese T-Zellen auch klinisch
bei Transplantationspatienten einsetzen zu
können.
Prinzipiell eignet sich dieses System der
In-vitro-Expansion von zytotoxischen T-Zellen
auch für die zelluläre Therapie bei Tumorpatienten. Voraussetzung ist die Kenntnis
eines Tumor-spezifischen Antigens, das als
Zielantigen der T-Zellen erkannt werden
kann. Als Beispiel für ein solches Tumorassoziiertes Antigen kommen ebenfalls
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Zusammenarbeit
Ausgewählte Veröffentlichungen
Es bestehen vielfältige Kooperationen im Münchner
Raum mit Instituten der Ludwig-Maximilians-Universität (LMU) und Klinischen Kooperationsgruppen der
LMU und der GSF. Auf nationaler Ebene bestehen Zusammenarbeiten mit der Abteilung Nephrologie und
Zelltherapie der Medizinischen Universität Hannover,
dem Heinrich-Pette-Institut in Hamburg und der III. Medizinischen Klinik der Universität Mainz. Internationale
Zusammenarbeiten betreffen Kollegen aus dem CRC Institute for Cancer Studies, University of Birmingham,
Birmingham, UK; McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin,
USA; Baylor College of Medicine, Department of Molecular Virology and Microbiology, Houston, Texas, USA;
National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA
und dem Laboratoire de Virologie Humaine, INSERM
ENS, Lyon Cédex, France.
Gruffat, H., Batisse, J., Pich, D., Neuhierl, B., Manet, E.,
Hammerschmidt, W., Sergeant, A.: Epstein-Barr virus
mRNA export factor EB2 is essential for production of
infectious virus. J Virol, 76, 9635–9644 (2002).
Moosmann, A., Khan, N., Cobbold, M., Zentz, C.,
Delecluse, H.J., Hollweck, G., Hislop, A.D., Blake, N.W.,
Croom-Carter, D., Wollenberg, B., Moss, P.A., Zeidler, R.,
Rickinson, A.B., Hammerschmidt, W.: B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus encoding a foreign
antigen efficiently reactivate specific cytotoxic
T cells. Blood, 100, 1755–1764 (2002).
Neuhierl, B., Feederle, R., Hammerschmidt, W.,
Delecluse, H.J.: Glycoprotein gp110 of Epstein-Barr
virus determines viral tropism and efficiency of
infection. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15 036–15 041
(2002).