Evaluation der Sensitivität von Nachweisverfahren disseminierter
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Ruhr-Universität Bochum Privatdozent Dr. med. Frank Schmitz Dienstort: Klinikum Hildesheim GmbH, Medizinische Klinik II ____________________________________________________________ Evaluation der Sensitivität von Nachweisverfahren disseminierter Tumorzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Young-Ran Markota aus Wuppertal 2007 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr 1. Referent: Privatdozent Dr. med. F. Schmitz 2. Referent: Prof. Dr. med. Stephan Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2008 Für meine Eltern, meine Geschwister und meinen lieben Ehemann I INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung ................................................................................................ 1 1.1 Definition und Dignität von Tumoren................................................... 1 1.2 TNM-Klassifikation .............................................................................. 3 1.3 Das kolorektale Karzinom ................................................................... 6 1.4 Zytokeratin 20 ..................................................................................... 7 1.4.1 Struktur und Variation .................................................................. 7 1.4.2 Zytokeratin 20 .............................................................................. 8 1.5 Disseminierte Tumorzellen ................................................................. 9 1.6 Fragestellung und Zielsetzung.......................................................... 11 2. Material und Methoden......................................................................... 13 2.1 Zellkulturen: HT29, Caco2, Colo320 ................................................. 13 2.2 Präparation von Knochenmark und peripherem Blut ........................ 14 2.3 Präparation von Zell-Verdünnungsreihen ......................................... 16 2.4 Immunozytochemischer Nachweis epithelialer Tumorzellen............. 17 2.5 Isolation von RNA ............................................................................. 18 2.6 Polymerase-Kettenreaktion............................................................... 19 2.6.1 Prinzip der PCR ......................................................................... 19 2.6.2 Hot-Start-PCR ............................................................................ 21 2.7 Nachweis von RNA durch semiquantitative real-time-RT-PCR......... 22 2.8 Polymerase-Kettenreaktion mittels Lightcycler-echnologie............... 23 2.8.1 Prinzip und Technik des Lightcyclers ......................................... 23 2.8.2 Nachweis der DNA mit Hybridisierungssonden.......................... 24 2.8.3 Interne und externe Kontrollen ................................................... 25 2.8.4 Relative Quantifizierung ............................................................. 26 2.8.5 Lightcycler-PCR ......................................................................... 26 2.9 Gelelektrophorese............................................................................. 30 3. Ergebnisse ............................................................................................ 34 3.1 Ergebnisse der Verdünnungsreihen in aqua destillata...................... 34 3.2 Nachweis von Tumorzelldissemination in monokleären Zellen des peripheren Blutes ....................................................................... 36 3.2.1 Ergebnisse für die Zellinien Colo320, Caco2, HT29................... 36 II 3.2.2 Immunzytochemische Detektion epithelialer Markergene (Colo320, Caco2, HT29) ............................................................ 38 3.3 Nachweis von Tumorzelldisseminaten der Zellinie HT29 in CK20-negativem Knochenmark ........................................................ 39 3.3.1 Ergebnisse für HT29 .................................................................. 39 3.3.2 Immunzytochemische Detektion epithelialer Markergene (HT29).................................................................... 41 3.4 Diagnostische Detektion disseminierter Tumorzellen im Knochenmark ............................................................................... 42 4. Diskussion ............................................................................................ 46 5. Zusammenfassung............................................................................... 53 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................... VI DANKSAGUNG............................................................................................XX Lebenslauf..................................................................................................XXI III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS bp engl. base pairs, Basenpaare °C Grad Celsius CK engl. cytokeratin, Zytokeratin cDNA engl. complementary DNA cp engl. crossing point DNA engl. deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH FKS fötales Kälberserum FL Fluoreszein FRET engl. fluorescence resonance energy transfer 5-FU 5- Fluoruracil IF Intermediärfilamente kDA kilo Dalton KM Knochenmark M molar (mol/L) MPE Myeloproliferative Erkrankungen NHL Non-Hodgkin-Lymphom OD optische Dichte PBGD Porphobilinogendeaminase PBMC engl. peripheral blood mononuclear cells, mononukleären Zellen des peripheren Blutes PBS engl. Phosphate buffered saline PCR engl. polymerase-chain-reaction, Polymerase-Kettenreaktion (m)RNA engl. (messenger) ribonucleic acid, Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RT engl. reverse transcriptase, Reverse Transkriptase RPMI Roswell Park Memorial Institute TBE Trisboratpuffer + EDTA V.a. Verdacht auf UICC Union Internationale Contre le Cancer UPM Umdrehung pro Minute IV TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Allgemeine Klassifikation der Dickdarmkarzinome nach Dukes ... 3 Tabelle 2: TNM-Klassifikation maligner Tumoren ......................................... 4 Tabelle 3: Vergleich zwischen UICC-Erkrankungsstadien, Dukes- und TNM-Klassifikation bzw. 5-Jahresüberlebensrate ........................ 5 Tabelle 4: Tumordifferenzierungsgrade, G = Histopathologisches Grading.. 5 Tabelle 5: Normalized ratio für CK20-spezifische RT-PCR verschiedener Kolonkarzinomzellen in Aqua dest. ............................................ 35 Tabelle 6: CK20-mRNA-Expression (normalized ratio) seriell verdünnter Kolonkarzinomzellen in PBMC ................................................... 37 Tabelle 7: CK20-mRNA-Expression (normalized ratio) seriell verdünnter Kolonkarzinomzellen in einer Knochemarkzellsuspension......... 40 Tabelle 8: Auflistung der KM-Spender mit jeweiliger Diagnose und TNM-Klassifikation ..................................................................... 42 Tabelle 9: Vergleich der CK20-mRNA-Expression und immunzytochemisch erfaßten CK20-Proteinexpression in CK20-positiven Knochenmarkproben......................................... 45 Tabelle 10: Prognostische Relevanz disseminierter Tumorzellen im Knochenmark von Patienten mit Kolonkarzinom........................ 51 V ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Modell zur Pathogenese des Kolonkarzinoms, AdenomKarzinom-Sequenz ................................................................. 2 Abbildung 2: Immunzytochemische Doppelfärbung von Zytokeratin-positiven Tumorzellen ........................................ 18 Abbildung 3: CK20 RT-PCR für CK20 anhand CK20-positiver Zellen ....... 28 Abbildung 4: CK20 RT-PCR für CK20 anhand CK20-negativer Zellen...... 29 Abbildung 5: Elektrophoretische Darstellung der Amplifikationsprodukte .. 32 Abbildung 6: Elektrophoretische Darstellung von CK20-positiven und negativen Proben.................................................................. 33 Abbildung 7: Expression der mRNA des CK20-Gens ................................ 34 Abbildung 8: Messung der CK20-mRNA-Expression in Serienverdünnung kolorektaler Karzinomzellen in PBMC................................... 36 Abbildung 9: Sensitivität der immunzytochemischen Detektion von unterschiedlichen CK20-positiven humanen Kolonkarzinomzellen............................................................. 38 Abbildung 10: Sensitivität der semiquantitativen CK20-RT-PCR in CK20-negativen KM-Zellen mit HT29-Zellen ........................ 39 Abbildung 11: Sensitivität der immunzytochemischen Detektion von CK20-positiven HT29-Zellen in CK20-negativen Knochenmarkzellen .............................................................. 41 1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Definition und Dignität von Tumoren Ein Tumor ist eine umschriebene Gewebevermehrung und kann mit Entzündungen und Ödemen einhergehen. Auf Grund autonomer Zellteilung ist ein Tumor von den Regulations- und Regenerationsmechanismen des Körpers abgekoppelt. Die Dignität eines Tumors kann entsprechend seiner Auswirkungen auf den Organismus als benigne oder maligne bezeichnet werden. Das Hauptmerkmal ist dabei die Metastasierungsfähigkeit, aber auch Kriterien wie Veränderungen des Wachstums und Differenzierungsgrad der Zellen werden bei der Beurteilung der Dignität berücksichtigt. Erst mit der Weiterentwicklung der Molekularbiologie und nach der Entschlüsselung des genetischen Codes durch Watson und Crick im Jahr 1953 wurde deutlich, daß die Kanzerogenese von genetischen Veränderungen der Zelle abhängig war (Lengauer et al., 1998, Kinzler et al., 1998). Diese Veränderungen können vererbungsbedingt oder durch Mutagene, wie z.B. ionisierende oder ultraviolette Strahlung (UV) oder Chemikalien ausgelöst werden. Dabei unterscheidet man unter anderem zwischen sogenannten Proto-Onkogenen und den Tumor-Supressor-Genen. Die Überexpression von Proto-Onkogenen und die eingeschränkte oder komplett unterbundene Funktion von Tumor-Supressor-Genen führen in ihrer Gesamtheit zu einer unkontrollierten Zellproliferation, einem Entrinnen vor apoptischen Signalen in der Zelle und schließlich zu einer Expansion der transformierten Zellpopulation (Hunter et al., 1991). Auf Grund der großen Anzahl bekannter Onkogene und Tumor-SupressorGene muß von einer multifaktoriellen Genese maligner Tumoren ausgegangen werden. Ein gut untersuchtes System stellt die Genese des metastasierten kolorektalen Karzinoms dar (Fearon et al., 1990). 1. Einleitung 2 Abbildung 1: Modell zur Pathogenese Karzinom-Sequenz des Kolonkarzinoms, Adenom- Die Karzinogenese des kolorektalen Karzinoms läßt sich durch die Einwirkung chemoprotektiver Faktoren beeinflussen. (Jänne und Mayer, 2000) Bis zur Entstehung eines invasiven Kolonkarzinoms durchläuft eine normale Kolonschleimhaut eine Reihe von pathologischen Veränderungen. Verschiedene chemoprotektive Agentien können die Pathogenese in verschiedenen Stufen hemmen (s. Abb. 1). Dabei können im wesentlichen APC- und COX-2-Gene von NSAR, Folsäure und Calcium gehemmt werden. 1. Einleitung 3 1.2 TNM-Klassifikation Der genauen Charakterisierung des Progressions- bzw. Metastasierungsrisikos von Kolonkarzinomen dient die TNM-Klassifikation als Grundlage. In dieser Klassifikation werden die drei wichtigsten Aspekte, der Primärtumor (T), der Status der Lymphknoten (N) und Fernmetastasen (M) untersucht und zur Einteilung des Tumorstadiums des Erkrankten herangezogen. Es ist ein System zur klinischen bzw. histopathologischen Bestimmung der Tumorausbreitung. Die Stadieneinteilung des Kolonkarzinoms nach Dukes (s. Tab. 1) hat bis heute noch Gültigkeit und ist in ihren Grundelementen eine Vorlage der TNM-Klassifikation (Dukes, 1932). Tabelle 1: Allgemeine Klassifikation der Dickdarmkarzinome nach Dukes Die Dukes Klassifikation dient der Prognoseabschätzung auf der Grundlage der Tiefeninfiltration des Tumors in der Darmwand, des Befalls regionärer Lymphknoten und des Nachweises von Fernmetastasen. Dukes A Auf Mukosa, Submukosa und Muscularis propria beschränkt Dukes B Infiltration aller Wandschichten, Überschreitung der Darmwand Dukes C Befall der regionären Lymphknoten Dukes D Fernmetastasen Die TNM-Klassifikation wurde zwischen 1943 und 1952 von Pierre Denoix aus Frankreich entwickelt. Dabei basieren die heutigen Einteilungssysteme im wesentlichen auf einer Übereinkunft mit der UICC (Union Internationale Contre le Cancer) (Sobin, 2001). Sowohl in der klinischen Praxis wie auch in der klinischen Forschung ist die Einschätzung der Prognose für den Tumorpatienten von wichtiger Bedeutung. Tumorbezogene Prognoseparameter dienen zusätzlich der Vergleichbarkeit von Patientengruppen, insbesondere bei Anwendung unterschiedlicher Therapiemodalitäten. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, potentielle Prognoseparameter zu klassifizieren. Einem Vorschlag der UICC folgend unterteilt man in patienten-, therapie- und tumorbezogene Prognosefaktoren (Gospodarowitz et al., 1995). Die erste zusammenfassende TNM-Klassifikation der UICC wurde 1968 veröffentlicht. Daraufhin wurde sie ca. alle fünf Jahre aktualisiert, zuletzt in 1. Einleitung 4 den Jahren 1997 (Wittekind et al., 1997) und 2002. Sie liegt aktuell in der 6. Auflage vor (Wittekind et al., 2002). Für Kolonkarzinome ist die postoperative histopathologische Klassifikation in Tab. 2 folgendermaßen zusammengestellt: Tabelle 2: TNM-Klassifikation maligner Tumoren Die TNM-Klassifikation dient der Prognoseabschätzung auf der Grundlage der Tiefeninfiltration des Tumors in der Darmwand sowie der benachbarten Gewebe, des Befalls regionärer und entfernter Lymphknoten und des Nachweises von Fernmetastasen. (modifiziert nach Wittekind et al., 1997) pT = Primärtumor pTX Primärtumor kann histologisch nicht beurteilt werden pT0 Kein histologischer Anhalt für Primärtumor pTis Carcinoma in situ pT1 Tumor dringt in die Submukosa ein pT2 Tumor dringt in die Muscularis propria ein pT3 Tumor bricht durch die Muscularis propria in die Subserosa oder in die perikolischen oder perirektalen Gewebe ein pT4 Tumor perforiert das viscerale Peritoneum und dringt direkt in andere Organe oder Strukturen ein pN = Regionäre Lymphknoten pNX Regionäre Lymphknoten können histologisch nicht beurteilt werden pN0 Histologisch keine Lymphknotenmetastasen pN1 Metastasen in 1-3 perikolischen oder perirektalen Lymphknoten pN2 Metastasen in 4 oder mehr perikolischen oder perirektalen Lymphknoten pN3 Metastasen in irgendeinem Lymphknoten entlang eines vaskulären Strangs pM = Fernmetastasen pMX Fernmetastasen können mikroskopisch nicht beurteilt werden pM0 Mikroskopisch keine Fernmetastasen pM1 Mikroskopisch Fernmetastasen Nach der TNM-Klassifikation der UICC werden maligne Tumoren nach folgenden unterschiedlichen Kategorien eingeteilt: man unterscheidet, ob sie prätherapeutisch anhand klinischer Befunde erhoben worden sind (cTNM) oder ob sie postoperativ aufgrund entsprechender histopathologischer Kriterien am Operationspräparat (pTNM) vorgenommen wurden (Wittekind et al., 1997). 1. Einleitung Tabelle 3: 5 Vergleich zwischen UICC-Erkrankungsstadien, Dukes- und TNMKlassifikation bzw. 5-Jahresüberlebensrate Die Prognose eines Patienten hängt entscheidend vom Erkrankungsstadium ab. Abgebildet ist die Überlebenswahrscheinlichkeit eines Erkrankten im UICC-Stadium I-IV und der Beziehung zum TNM-Klassifikationssystem und zur Stadieneinteilung nach Dukes. UICC Dukes TNM Befall 5-JÜ I A T1N0M0 Mukosa/Submukosa > 90 % II B1 T2N0M0 Infiltration Muscularis Ca. 85 % B2 T3N0M0 Infiltration Subserosa ca. 70-80 % III C T4N1M0 Befall regionärer LK 35-65 % IV D TxNxM1 Fernmetastasen Ca. 5 % Je undifferenzierter das Gewebe eines Tumors ist, desto größer ist seine Wachstumsgeschwindigkeit, damit die Bösartigkeit und zusätzlich die Strahlenempfindlichkeit (s. Tab. 4). Entdifferenzierte Karzinome zeigen eine schlechtere Prognose, dies konnte auch für das Kolonkarzinom gezeigt werden (Hermanek und Sobin, 1995, Newland et al., 1994). Tabelle 4: Tumordifferenzierungsgrade, G = Histopathologisches Grading Die Aggressivität eines Tumors hängt unter anderem auch von seinem Differenzierungsgrad ab. Hier hat sich zur Klassifikation das „Grading“ durchgesetzt. GX Differenzierungsgrad kann nicht beurteilt werden G1 Gut differenziert G2 Mäßig differenziert G3 Schlecht differenziert G4 Undifferenziert 1. Einleitung 6 1.3 Das kolorektale Karzinom Maligne Erkrankungen zählen heute zu den häufigsten Todesursachen. Dabei stellt das Kolonkarzinom die zweithäufigste Tumorerkrankung bzw. karzinombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern bei Männern und Frauen dar, geschätzte Neuerkrankungsrate etwa 300.000/Jahr (in Deutschland > 30.000/Jahr) (Midgley und Kerr, 1999). 90 % der Karzinome finden sich nach dem 50. Lebensjahr (Bresalier et al., 1989). Diagnostische Maßnahmen zur Detektion eines Kolonkarzinoms sind die klinische Symptomatik, Ergebnisse von Screeningverfahren (z.B. Test auf fäkales okkultes Blut) und die Familienanamnese. Als diagnostischer Goldstandard gilt derzeit die vollständige Koloskopie, wenngleich die Doppelkontrastuntersuchung des Dickdarms eine vergleichbar hohe Sensitivität zur Detektion von Polypen haben soll wie die Endoskopie. Für den späteren Metastasennachweis sind weitere bildgebende Verfahren (Ultraschall, Computertomographie, Kernspintomographie) unentbehrlich (Burlefinger und Ottenjann, 1991). Die Standardtherapie stellt bei Kolonkarzinomen ohne Lymphgefäßinvasion (UICC I und II) die radikale Resektion des tumortragenden Gewebes oder endoskopische Polypektomie dar (Deutsche Krebsgesellschaft, 1999). Bei wandüberschreitendem Wachstum (UICC III) wird eine adjuvante Chemotherapie zur Verhinderung von Rezidiven oder Metastasen nach Durchführung einer potentiell kurativen lokalen Tumortherapie (z.B. Resektion) und bei klinischer Tumorfreiheit durchgeführt. Bei Verdacht auf Infiltration von Nachbarorganen wird eine neoadjuvante Therapie (Bestrahlung- bzw. Chemotherapie) empfohlen, um ein präoperatives Downstaging zu erreichen und damit die Heilungschance zu erhöhen (Deutsche Krebsgesellschaft, 1999). Auf Grund der Fortschritte in der Chirurgie dieser Tumoren wird die Rezidivrate zunehmend durch die frühzeitige und zum Zeitpunkt der Primärdiagnose meist okkulten Metastasierung bestimmt (Pantel et al., 1996, von Knebel Doeberitz et al., 1996). Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit einem lokal auf das Kolon begrenzten Tumor (UICC I oder II) beträgt etwa 70-80 %. Folglich entwickeln mindestens 20-30 % der 1. Einleitung 7 Patienten dieser Stadien innerhalb von 5 Jahren trotz stattgehabter vollständiger Resektion (R0) ein Tumorrezidiv (Lehnert und Herfarth, 1996). Der Nachweis eines weiteren prognostischen Markers hat daher in dieser Patientengruppe einen besonders hohen Stellenwert, weil man somit Patienten mit erhöhtem Rezidivrisiko frühzeitig erkennen könnte, um diese Patientengruppe möglicherweise mit Durchführung einer adjuvanten Therapie vor einem Rezidiv zu schützen. 1.4 Zytokeratin 20 1.4.1 Struktur und Variation Das Zytoskelett von nahezu allen eukaryontischen Zellen ist aus Mikrotubuli, Mikrofilamenten und den Intermediärfilamenten (IF) aufgebaut. Zytoplasmatische IF sind Polypeptidfilamente mit einem Durchmesser von 10 nm, die ein dichtes Netzwerk bilden, welches vom Zellkern ausstrahlt und zur Plasmamembran zieht. Auf Grund ihrer Zusammensetzung aus spezifischen Polypeptiduntereinheiten werden IF in fünf Klassen bestehend aus neun Gruppen unterteilt. Die Klassen I und II enthalten Zytokeratine (CK), Klasse III Desmin, Gliafaserprotein, Vimentin und Peripherin, Klasse IV Neurofilament-Proteine, α-Internexin und Nestin, Klasse V die Lamine. Die IF der Klassen I-IV sind zytoplasmatisch, die Lamine (Klasse V) nukleär lokalisiert. Die CK-Familie ist eine hochkomplexe, multigene Proteinfamilie, deren Molekulargewicht zwischen 40 und 68 kDA liegt. Bislang sind 20 verschiedene CK bekannt (Moll et al., 1993). Zwölf der CK (CK9-CK20) gehören zur sauren Typ-A-Subfamilie (Klasse I) und acht (CK1-CK8) zur neutral-basischen Typ B-Subfamilie. In den Filamenten sind die CK-Polypeptide immer paarweise vorhanden, so daß ein bestimmtes Typ A-CK und ein bestimmtes Typ B-CK einen Komplex und somit ein Heterodimer bilden. Das Typ B-CK ist im allgemeinen 7-9 kDA größer als das korrespondierende CK vom Typ A. Zwischen 2 und 10 verschiedene CK sind in einer einzelnen Zelle nachweisbar. CK-Filamente können auch mit anderen IF koexprimiert werden. 1. Einleitung 8 CK sind wichtige Marker epithelialer Differenzierung. Die Zusammensetzung der CK in einer Zelle reflektiert sowohl den Zelltyp als auch den Differenzierungsstatus. Die meisten CK-Typen wurden in mehreren Epithelarten nachgewiesen. Andere wiederum sind spezifischer, wie z.B. das CK-Paar CK3 und CK12, das nur in der Kornea nachweisbar ist. Bestimmte CK werden außerdem in geringer Expressionsstärke in nicht-epithelialen Zelltypen gefunden. In den meisten CK-exprimierenden Zellen sind die Filamente in einem Netzwerk aus losen Bündeln angeordnet. In mehrschichtigen Plattenepithelien liegen die CK-Filamente jedoch in dichten Bündeln als Tonofibrillen vor, die an Desmosomen inserieren. 1.4.2 Zytokeratin 20 CK20 ist ein Bestandteil der Intermediärfilament-Protein-Familie und hat eine wichtige Funktion im Zusammenhalt von Zellverbänden und Differenzierungen (Moll et al., 1992, Moll et al., 1993). Die CK20-Expression beschränkt sich primär auf gastrointestinale Gewebe (kolorektale Adenokarzinome), Übergangszell-(Urothel) Karzinome und auf Merkel-Zell-Tumoren (Miettinen, 1995), während in anderen Adenokarzinomen wie z. B. dem der Mammae, des Endometriums und der Lunge keine Expression von CK20 festzustellen ist. Die weitgehend auf das kolorektale Karzinomgewebe beschränkte CK20-Expression stellt daher die Grundlage für zahlreiche Studien dar, nach einer heterotopen CK20Expression in Blut, Lymphknoten, Knochenmark und Urin als Zeichen einer frühen Tumordissemination zu suchen (Soong et al., 2001). 1. Einleitung 9 1.5 Disseminierte Tumorzellen Zur weiteren Einschätzung eines Rezidivrisikos bei malignen Tumoren hat man in den letzten Jahren versucht neben den genannten Prognosefaktoren weitere zu finden. Man unterteilt Absiedlungen von Karzinomzellen in verschiedene Kategorien (Hermanek, 1999, Hermanek et al., 1999). Bis zu einer Größe von 2 mm gelten diese als Mikrometastasen, optional werden sie innerhalb der TNM-Klassifikation mit dem Zusatz (mi) klassifiziert. Bei Nachweis von einzelnen Tumorzellen oder Tumorzellcluster ohne Stromareaktion bezeichnet werden (Zusatz: i). sie als Erst (isolierte) bei einer disseminierte komplett Tumorzellen abgeschlossenen Metastasierungskaskade wird der Begriff Metastasierung verwendet, hierzu zählt der histopathologische Nachweis einer Stromareaktion auf die Tumorzellinfiltration (Hermanek et al., 1999). Allerdings wird der überwiegende Anteil zirkulierender Tumorzellen häufig zerstört. Daher ist der Nachweis von disseminierten isolierten Tumorzellen nicht direkt mit der Entstehung von Metastasen gleichzusetzen (Fidler, 1991, Weiss, 1990). Um frühzeitig Risikogruppen zu identifizieren, benötigt man eine präzisere Tumorcharakterisierung und Bestimmung des Metastasierungsrisikos. Neben der Analyse des Primärtumors auf prognostisch relevante Faktoren ist auch der direkte Nachweis disseminierter Tumorzellen in verschiedenen Organsystemen zur prognostischen Einschätzung ein sinnvoller Ansatz (Weitz et al., 1998, Weitz et al., 2000). Ein Nachweis von disseminierten Tumorzellen zur Identifikation von Risikogruppen wäre zum Beispiel für kurativ operierte Patienten ohne Lymphknotenbefall (UICC II) von Bedeutung. Im Rahmen der aktuellen Diskussion um eine Erweiterung der Indikationsstellung für eine adjuvante Chemotherapie bei begrenzten Tumorstadien könnte der Nachweis oder aber der Ausschluß disseminierter Tumorzellen eine wertvolle Hilfestellung zur Entscheidungsfindung bezüglich einer möglichen weiteren Therapie sein. Bislang galt als adjuvante Standardtherapie das sogenannte Majo-ClinicSchema oder WOLMARK-Schema mittels 5-FU (5- Fluoruracil) bzw. Folinsäure, welche erst im Stadium III zum Einsatz kamen (Francini et al., 1994, Sargent et al., 2001). Nach den neuesten Studien zeigte sich aber eine 1. Einleitung 10 signifikante Überlegenheit mit FOLFOX4, einer Kombination aus Oxaliplatin, Folinsäure und 5-FU (Andre et al., 2004). Entsprechend dem aktuellen Konsensus 2004 wurde die Indikation zur adjuvanten Therapie weniger ausgedehnter Tumorstadien weiter gefaßt, so daß im Einzellfall auch im Stadium II bei ausgewählten Risikosituationen (T4, Tumorperforation /-einriß oder Operation unter Notfallbedingungen) eine adjuvante Chemotherapie erwogen werden kann (Petersen et al., 2002, Merkel et al., 2001). Mamounas et al. (1999) sind der Meinung, daß Patienten mit einem Kolonkarzinom im Stadium Duke B von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren würden, unabhängig von anderen klinischen Faktoren. Auch die Arbeitsgruppe um Gray et al. (2004) ist der Ansicht, daß es einen kleinen aber definitiven Überlebensvorteil durch eine adjuvante Chemotherapie bei Patienten im Stadium II (3-4 %) gibt. Verschiedene Arbeitsgruppen disseminierten Tumorzellen haben bereits epithelspezifische zum Nachweis Detektionsmarker von im Knochenmark (KM) verwendet, weil dieser als ein Indikator für hämatogene Streuung des Primärtumors gilt. Häufig wurden dabei CK (Cytokeratin) als Marker verwendet, wie z.B. CK18 von den Arbeitsgruppen um Schlimok et al. (1990) und Lindemann et al. (1992), oder auch CK7 (Masuda et al., 2005), aber auch CK20 kam häufig zur Anwendung (Litle et al., 1997, Soeth et al., 1997). CK gilt als wichtiger Marker epithelialer Differenzierung. Das Knochenmark ist ein geeignetes Medium auf Grund seiner leichten Zugänglichkeit und des im Normalfall fehlenden Nachweises epithelialer Zellen für die Untersuchung auf eine Tumorzelldissemination. Daher wurde das Knochenmark als Sekundärorgan verwendet, da herkömmliche Methoden zum Nachweis einer Metastasierung in frühen Krankheitsstadien nicht ausreichen. Durch den Nachweis disseminierter Tumorzellen können zahlreiche Informationen gewonnen werden (Prognose, biologische Charakterisierung disseminierter Tumorzellen, intraoperative Tumorzellaussaat), welche zu einem erweiterten Tumorstaging beitragen können und als klinisch relevanter Prognosefaktor einen wesentlichen Fortschritt in der Behandlung von Karzinompatienten versprechen (Osborne und Rosen, 1994, Oruzio et al., 1997). 1. Einleitung 11 1.6 Fragestellung und Zielsetzung Die Prognose für das Überleben eines Patienten mit Kolonkarzinom hängt vom Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnosesicherung ab. Im Stadium UICC I/ II kann durch eine R0-Resektion eine vollständige Tumorfreiheit erreicht werden, dabei beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate etwa 70-80 %. Die Rezidivrate beim Kolonkarzinom liegt somit innerhalb von 5 Jahren bei etwa 20-30 % (Lehnert et al., 1996). Beim metastasierten Kolonkarzinom finden sich Lebermetastasen zu 69-80 %, Peritonealmetastasen zu 17-32 % und Lungenmetastasen in 12-37 % der Fälle. Es gibt zwingende Hinweise für eine prognostisch ungünstige Bedeutung einer frühzeitigen Dissemination von Tumorzellen ins Knochenmark. Dieser Auffassung folgen zahlreiche Arbeiten (Guo et al., 2005, Lassmann et al., 2002, Leinung et al., 2000, Lindemann et al., 1992, Rosenberg et al., 2002, Schlimok et al., 1990, Soeth et al., 1997, Vogel et al., 2000, Weitz et al., 2000), welche im Nachweis von disseminierten Tumorzellen bei Patienten mit Kolonkarzinom eine prognostische Relevanz sehen. Aber auch bei anderen Karzinomerkrankungen scheint der Nachweis disseminierter Tumorzellen von prognostischer Bedeutung zu sein, wie z.B. beim Blasenkarzinom (Retz et al., 2001), nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom (Passlik et al., 2000), Mammakarzinom (Benoy et al., 2006, Braun et al., 2000, Janni et al., 2001, Leinung et al., 2000, Masuda et al., 2005), Pankreaskarzinom (Roder et al., 1999, Vogel und Kalthoff, 2001) und medullären Schilddrüsenkarzinom (Weber et al., 2002). Gegenwärtig ist die Erfassung einer Tumorzelldissemination ins Knochenmark jedoch methodisch nur unzureichend standardisiert. Bislang war die Immunzytochemie der Goldstandard beim Nachweis von disseminierten Tumorzellen (Pantel et al., 1999). Aber in den letzten Jahrzehnten hat sich nicht nur die Immunzytochemie weiterentwickelt, sondern auch die molekularbiologischen Nachweismethoden haben immer mehr an Sensitivität gewonnen (Pantel und von Knebel Doeberitz, 2000, Pantel und Otte, 2000, Woelfle et al., 2005). Doch bislang konnte keine einheitliche Aussage über die Sensitivität der Methodik zum Nachweis von disseminierten Tumorzellen gemacht werden, 1. Einleitung 12 da sie durch die Abhängigkeit der Ergebnisse vom Untersucher erschwert werden. Dennoch bleibt ein frühzeitiger Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen von besonderer Bedeutung, da diese, noch bevor es zu einer Metastasierung kommen kann, durch eine adäquate Therapie behandelt werden können und somit ein weiteres Fortschreiten der Tumorerkrankung verhindern. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die medulläre Tumorzelldissemination mit einer äußerst sensitiven und standardisierten Nachweismethode, nämlich mit der hochsensitiven RT-PCR für das epitheliale Markergen CK20, im Vergleich zur immunzytochemischen Messung zu vergleichen. Die Etablierung sensitiver und standardisierter Nachweistechniken für Tumorzelldisseminate stellt eine unabdingbare Vorraussetzung für die Etablierung weiterer Prognosefaktoren für Progressions- und Metastasierungswahrscheinlichkeit maligner Tumoren dar. 2. Material und Methoden 13 2. Material und Methoden 2.1 Zellkulturen: HT29, Caco2, Colo320 Die Grundlage der Experimente bildeten drei verschiedene Zellkultur-Reihen (HT29, Caco2, Colo320), welche von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) erhältlich sind. Die HT29Zellen stammen aus dem Jahre 1964 von einem Adenokarzinom des Kolons einer 44-jährigen Kaukasierin. Dieser wird als „heterotransplantable“ und als ein gut differenzierter Tumor I. Grades beschrieben (Fogh, 1975). Bei den Caco2-Zellen handelt es sich ebenfalls um Zellen aus einem Adenokarzinom des Kolons eines 72-jährigen Kaukasiers aus dem Jahre 1997 (Fogh et al., 1977, Rousset, 1986, Bacher et al., 1992). Die Colo320-Zellen konnten 1977 aus den Tumormassen einer 55-jährigen Kaukasierin mit einem undifferenzierten Adenokarzinom des Sigmas isoliert werden (Quinn et al., 1979). Um eine Kontamination der Kulturen mit Pilzen, Bakterien, Viren und Mykoplasmen zu vermeiden, wurden alle Arbeiten unter sterilen Bedingungen ausgeführt; Geräte, Medien und Puffer, die mit den Zellen in direkte Berührung kamen, wurden bei 180°C hitzester ilisiert, autoklaviert oder steril filtriert. Die Handhabung der Zellen (Ausplattieren, Ernährung, Passagieren) erfolgte ausschließlich an sterilen Werkbänken, deren Keimfreiheit durch regelmäßige Reinigung mit 70 % Ethanol gewährleistet war. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Medium bestehend aus einer Mischung aus Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium und 10 % fötalem Kälberserum (FKS), 1% Glutamin, sowie 1% Penicillin/Streptomycin (Penicillin und Streptomycin im Verhältnis 1:1). In einem Wärmeschrank (Heraeus/Deutschland) wuchsen die Zellen bei 37 °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5 % (v /v) CO2 in einer Zellkulturflasche bis zu einer 90 % Konfluenz. Anschließend wurde das Nährmedium der Zellen abgesaugt und 5 ml 0,5 % Trypsin hinzugefügt und für 10 min bei 37 °C im Wärmebrutschrank inkubiert. Nach dem Ablösen der Zellen vom Boden der Zellkulturflasche wurde das Trypsin durch Zugabe von 2. Material und Methoden 14 RPMI-Medium durch Substratüberschuß inaktiviert. Anschließend wurden die Zellen in 20 ml vorgewärmtem PBS-Puffer aufgenommen und 5 min mit 500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Sediment in 10 ml PBS-Puffer erneut aufgenommen. Mit Hilfe des CoulterCounters wurde anschließend die Zellzahl bestimmt. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen zusätzlich in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zählkammer besteht aus 4 Quadraten, welche in jeweils 16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Es wurden 2 große Quadrate unter dem Mikroskop ausgezählt und der Mittelwert bestimmt. Die Zahl der Zellen wurden nach folgender Formel bestimmt: Zellzahl / ml = n x 2 x 104, wobei n die Anzahl der Zellen in einem großen Quadrat bildet und 2 den Verdünnungsfaktor darstellt. 2.2 Präparation von Knochenmark und peripherem Blut Für die experimentelle Arbeit wurde ausschließlich Probenmaterial verwandt, welches nach Beantwortung der medizinischen Indikationsstellung übrig geblieben war. Der Patient gab hierzu seine schriftliche Einverständniserklärung zur Wahrung des Rechts auf informationelle Selbstbestimmung. Ein Votum der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum liegt vor. Für den Nachweis von disseminierten Tumorzellen eignet sich besonders das Knochenmark, weil unter normalen Umständen keine epithelialen Zellen im Knochenmark nachweisbar sind. Das Knochenmark, ein häufiger Metastasierungsort, bietet zusätzlich den Vorteil einer leichten und weitgehend ungefährlichen Zugänglichkeit. Das Knochenmark wurde von dorsal aus dem Bereich um die Spina iliaca posterior superior in Lokalanästhesie entnommen. Um auch hier eine Kontamination der Punktionsnadel mit CK20 aus der Epidermis zu vermeiden, wurde die Haut nach sorgfältiger Desinfektion mit einer Stichinzision mittels Skalpell geöffnet und die Punktionsnadel vorsichtig bis zur Kortikalis des Beckenkammes vorgeschoben. Durch Druck und Drehen der Punktionsnadel wurde vorsichtig ein Loch in das Beckenkamm gebohrt. 10-15 ml des gewonnenen Knochenmarkbluts wurden in einem 2. Material und Methoden 15 Lithium-Heparinat-Röhrchen aufgefangen und zur weiteren Aufarbeitung ins Labor gegeben. Es wurden Knochenmarkaspirate von Patienten mit bereits bekannter Kolonkarzinomerkrankung gewonnen und selektive Knochenmarkaspirate von Patienten ohne onkologische Erkrankung verwendet. Diese hatten bekannte Erkrankungen wie Anämien oder Non-Hodgkin-Lymphome, welche in der üblichen immunzytologischen Diagnostik keinen Nachweis von Karzinomzellen zeigten. Für die Präparation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurde etwa 10-15 ml venöses Blut aus der Armbeuge gewonnen, dabei wurden die ersten 5 ml verworfen, damit keine Kontamination mit CK20 aus den epidermalen Zellen erfolgte. Für diese Entnahme wurden gesunde Probanden (Studenten) ausgewählt, bei denen weder Vorerkrankungen zum Zeitpunkt der Blutentnahme noch akute Erkrankungen vorlagen. Das periphere Blut diente als Grundlage für die Verdünnungsreihen mit den verschiedenen Zellkulturen. Das Knochenmarkaspirat aus dem 15 ml Lithium-Heparinat-Röhrchen und das gewonnene periphere Blut wurden jeweils in 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und mit vorgewärmtem PBS ohne Calcium und Magnesium bis zu einem Volumen von 35 ml aufgenommen. Das verdünnte Aspirat wurde schließlich auf 15 ml Ficoll Paque Plus (4°C) gesch ichtet und bei 400 g für 40 min zentrifugiert. Mit einer 10 ml Pipette wurde vorsichtig der Ring mit mononukleären Zellen abgenommen und in ein neues Greiner-Röhrchen überführt und mit PBS bis auf 30 ml aufgefüllt, welches erneut bei 270 g für 30 min zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde vom Überstand befreit und in 2 ml PBS aufgenommen. Anschließend erfolgte wie bereits bei der Zählung der kultivierten Zellen eine Zählung am Coulter-Counter und in der NeubauerKammer. 2. Material und Methoden 16 2.3 Präparation von Zell-Verdünnungsreihen Der erste Abschnitt der Arbeit beschäftigt sich mit der Sensitivität der Methode zum Nachweis von disseminierten Tumorzellen anhand unterschiedlicher Zellverdünnungsreihen und der zweite Teil mit der Anwendung der Methode an 30 Knochenmarkproben. Aus den humanen Kolonkarzinomzellen Colo320, Caco2 und HT29 wurde zunächst RNA extrahiert und in definierten Mengen (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng) aliqoutiert, um anschließend über die semiquantitative RT-PCR die Sensitivität der Methode zu bestimmen. Als Negativ-Kontrolle fungierten mononukleäre Zellen des peripheren Blutes von CK20-negativen Spendern. Als nächstes wurden nach Ermittlung der absoluten Zellzahl von Zytokeratinpositiven Zellen der humanen Karzinomzellen Colo320, Caco2 und HT29 folgende Zellzahlen in Suspension per Verdünnung hergestellt: 1, 10, 1000, 10.000, 100.000. Zytokeratin-negative mononukleäre Zellen des peripheren Blutes und des Knochenmarks wurden in vorgewärmter PBS-Lösung verdünnt und über einen Ficoll Paque Plus-Gradienten zentrifugiert (400 x g/40 min). Der Ring mit mononukleären Zellen wurde vorsichtig abgenommen, die Zellen in PBS gewaschen (230 x g /30 min) und schließlich auf eine absolute Zellzahl von 1 x 106 Zellen eingestellt. Anschließend wurden die aufgearbeiteten humanen Karzinomzellen beigemischt. Dadurch ergaben sich folgende Verdünnungsstufen: 1:105, 1:10 4, 1:103, 1:102, 1:101. Die Zellsuspension wurde mit einer Zytozentrifuge auf einen Objektträger zentrifugiert. Schließlich erfolgte die immunzytochemische Färbung und mikroskopische Detektion der Zytokeratin-positiven Zellen. Der quantitative CK20-Nachweis aus den Zellen der humanen Kolonkarzinomzellen Colo320, Caco2 und HT29 in den jeweiligen Verdünnungsreihen erfolgte ebenso durch eine molekularbiologische Detektion mit dem Lightcycler (LC) und die Darstellung der Ergebnisse im Verhältnis zu einem unreguliertem Gen als normalized ratio. 2. Material und Methoden 17 Nach allen quantitativen Detektionen am Lightcycler wurde aus der gewonnenen cDNA eine Semiquantifizierung mittels Gelelektrophorese durchgeführt. 2.4 Immunozytochemischer Nachweis epithelialer Tumorzellen Eine Zellsuspension mit etwa 250.000 Zellen pro Loch auf der Mikrotiterplatte wurden auf die Objektträger mit einer Zytozentrifuge für 5 min und bei 2000 Umdrehung pro Minute (UPM) aufgebracht. Die Detektion von zytokeratinhaltigen Zellen erfolgte mit einem monoklonalen Maus-Antikörper A45B/B3 gegen Panzytokeratin unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein epitheliales, intermediäres Filamentprotein, CK20. Bei dieser immunzytochemischen Färbung wurden die Zellen, nachdem sie fixiert und permeabilisiert wurden, mit Konjugaten aus spezifischen Fab-Fragmenten von Antikörpern und alkalischer Phosphatase inkubiert. Durch enzymatische Umsetzung des Farbreagenzes erfolgte die Bildung einer roten Präzipitation an den spezifisch gebundenen Konjugaten am epithelialen Zytoskelett. Die Färbung der Zytokeratinpositiven Zellen erfolgte nach Anleitung von Epimet®, Baxter. Anschließend erfolgte die mikroskopische zytokeratinhaltigen Zellen (s. Abb. 2). Detektion und Auszählung der 2. Material und Methoden 18 Abbildung 2: Immunzytochemische Doppelfärbung von Zytokeratin-positiven Tumorzellen Tumorzellen lassen sich immunzytochemisch durch die Expression des epithelialen Marker-Gens Zytokeratin nachweisen. Die Expression von Zytokeratin zeigt sich durch die dunkle Färbung der Zellen im Bild. 2.5 Isolation von RNA Für den sensitiven Nachweis von Transkripten in der RT-PCR ist die Qualität der RNA sowie ein konsequentes Ribonuklease (RNase) freies Arbeiten elementar. RNasen sind sehr stabile und aktive Enzyme. Sie sind schwierig zu inaktivieren, und bereits kleinste Mengen sind ausreichend, um RNA zu zerstören. Beim Umgang mit RNA mußten daher Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden: Tragen von RNase-freien Handschuhen, Reinigung aller freien Arbeitsflächen mit Natriumhypochlorit, Bestrahlung der Pipetten unter UV-Licht für 10 min, Verwendung von sterilen Einmal-Kunststoff-Artikel (Pipetten, Reaktionsgefäße, etc.) und Ansetzen von Lösungen mit RNase-freiem Wasser. Aus den über dem Dichtegradienten gewonnenen mononukleären Zellen wurde mit Hilfe des „RNeasy Mini Kits“ von Qiagen® m-RNA isoliert. Die Aufarbeitung erfolgte nach der Anleitung des Herstellers. Die Präparation der mRNA beruht auf der Bindung und späteren Elution der Ribonukleinsäuren unter spezifischen Pufferbedingungen auf einer speziell 2. Material und Methoden 19 entwickelten Membran. Die extrahierte mRNA wurde in 50 µl RNase freies Wasser aufgenommen. Da RNA bei Raumtemperatur nicht stabil ist, wurde sie bei -80 °C eingefroren. Die aufgereinigte RNA wurde am Eppendorf Photometer bei 260 nm gemessen. Da Proteine in RNA-Lösungen als Verunreinigungen vorkommen können und ebenfalls bei 260 nm absorbieren, können sie das Ergebnis verfälschen. Um die Reinheit der RNA zu bestimmen, wurde zusätzlich die Absorption bei 280 nm gemessen, um die optische Dichte (OD) zu ermitteln. Der Quotient aus OD 260/280 ist ein Wert für die Reinheit. Reine RNA hat eine OD ≥ 1,8. Quotienten kleiner als 1,6 lassen auf Verunreinigungen mit Proteinen schließen. Die exakte Formel lautet: Extinktion (260 nm) x Faktor (40) = OD. 1 OD ≅ 40 µg / ml gelöste RNA. Für die RNA-Verdünnungsreihe wurde die gemessene RNA-Konzentration mit RNase-freiem Wasser in folgenden Konzentrationen in Lösung gebracht: 100 ng, 10 ng, 1 ng und 0,1 ng. 2.6 Polymerase-Kettenreaktion 2.6.1 Prinzip der PCR Die Methode der PCR wurde in den 1980er Jahren von dem amerikanischen Biochemiker Kary B. Mullis entwickelt (Mullis et al., 1992, Saiki et al., 1988) und hat sich seitdem zum unersetzlichen Hilfsmittel für verschiedene Bereiche wie z.B. der Forschung, Gentechnik, medizinische Diagnostik, Paläontologie und Kriminalistik entwickelt. Mit Hilfe der PCR lassen sich in vitro durch enzymatische Synthese spezifische Nukleotidsequenzen millionenfach vervielfältigen (Amplifikation). Unter optimalen Bedingungen könnte man so ein einziges vorhandenes DNA-Molekül exponentiell vervielfältigen und anschließend nachweisen. Durch Erhitzen wird ein Doppelstrang-DNA-Molekül denaturiert. Daraus ergeben sich 2 Einzelstrangmoleküle (Template), an die spezifische Startermoleküle (Primer) bei bestimmter Temperatur (annealing temperature) 2. Material und Methoden 20 angebunden (hybridisiert) werden und den somit zu amplifizierenden DNABereich definieren. Primer sind sogenannte synthetisierte kurze 17-24merOligonukleotid-Einzelstränge. Sobald ein Primer am Template gebunden hat, verlängert eine hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus) diesen Primer, indem sie jeweils die komplementären im Überschuß vorliegenden freien Desoxynukleotid-Triphosphate (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) entsprechend der Matrize an das unmodifizierte 3`-Ende des Oligonukleotids bindet und somit ein Doppelstrang-Molekül synthetisiert. Das Resultat zeigt sich in Form einer identischen Verdopplung der Ausgangsmenge der DNA. Nach zyklischer Wiederholung (etwa 15-40 mal), in der Regel einer aus drei Schritten bestehenden Temperaturprofils, folgt eine exponentielle Zunahme von DNA-Fragmenten. Bei 35 Zyklen ergeben sich daraus 235 Moleküle. In der Regel besteht ein PCR-Zyklus aus drei Reaktionsschritten: 1. Denaturierung: Durch Erhitzen der DNA auf ca. 95 °C und Halten der Temperatur für kurze Zeit (etwa 5-30 sec) wird die Matrizen-DNA aufgeschmolzen. Es entstehen einzelsträngige DNA-Moleküle. 2. Anlagerung (Annealing): Die Primer, sogenannte synthetische Oligonukleotide, hybridisieren an die komplementären Sequenzen der Einzelstränge durch kurze Haltezeiten (etwa 30 sec) bei einer für den Primer bzw. für das Primerpaar optimalen Temperatur (etwa 55-65 °C) und leiten somit die Amp lifikation des dazwischen gelegenen Sequenzabschnittes ein. 3. Verlängerung (Elongation): Durch Polymeraseaktivität bei 72 °C (etwa 30 sec) w ird ausgehend vom 3´Ende des Primers der Gegenstrang der gewünschten DNA-Sequenz synthetisiert. In der Regel entspricht die gewählte Temperatur dem Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase. 2. Material und Methoden 21 Mittels längerer Haltezeit bei 95 °C (z.B. 5-10 min ) vor Beginn des ersten Zyklus ist es möglich, evtl. eine stark verknäuelte DNA-Doppelhelix komplett zu denaturieren. Nach Beendigung des letzten Zyklus wird eine einmalige Haltezeit von ca. 4 min. bei 72 °C angefügt, um unv ollständig synthetisierte DNA-Stränge vervollständigen zu lassen. In der Regel werden die PCRExperimente in Thermocyclern durchgeführt. 2.6.2 Hot-Start-PCR Mit Hilfe einer sogenannten Hot-Start-PCR können unspezifische Amplifikationen vermieden werden. Auch bei geringeren Temperaturen (z.B. Raumtemperatur) kann eine Polymeraseaktivität auftreten, obwohl die optimale Reaktionstemperatur der Taq-Polymerase bei 72 °C liegt; es tritt also weniger bis gar keine Aktivität auf, je geringer die Temperatur (z.B. 0 bis -20 °C) ist. Es ist daher notwendig, das Zusammentr effen aller Reaktionskomponenten bei Temperaturen oberhalb von 0 °C und unterhalb der Schmelztemperatur der Primer möglichst zu vermeiden, da sich bei niedrigeren als der Annealing-Temperatur Primer vermehrt unspezifisch an die DNA anlagern bzw. Oligomere bilden, die dann von der Polymerase zu unerwünschten Nebenprodukten polymerisiert werden können. Eine HotStart-PCR kann in verschiedenen Versionen durchgeführt werden, eine davon ist die Verwendung eines Antikörpers. Diese Methode beruht auf eine Komplexbildung mit einem spezifischen Antikörper, welche zur Inaktivierung der Polymerase führt. Dieser wird mit der zu verwendenden Polymerase inkubiert und anschließend zum gesamten Reaktionsgemisch dazugegeben (z.B. Taq-Polymerase aus Lightcycler-DNA Master CK20-Kit, Roche Diagnostics, mit Taq Start Antibody, BD Clontech). Der Antikörper denaturiert erst durch Einwirkung von Hitze (erste Denaturierungsphase im Thermocycler) und die Polymerase erhält somit ihre ursprüngliche Aktivität zurück. Der kritische Temperaturbereich vor der PCR kann auch generell durch konsequentes Arbeiten auf Eis oder in sogenannten Coolracks bei der PCRProbenvorbereitung und durch zusätzliches Vorheizen des Thermocyclers auf 95 °C vermieden werden. 2. Material und Methoden 2.7 22 Nachweis von RNA durch semiquantitative real-time-RTPCR Mit Hilfe der reversen Transkriptase wird ein mRNA-Molekül in eine komplementäre cDNA umgeschrieben. Dieses Enzym wird aus den RNAViren Rous Sarcoma und Avian Myeloblastosis isoliert. Durch Verfolgung der PCR-Produktbildung in Echtzeit (real-time) werden Fluoreszenzsignale während und nach jedem einzelnen Zyklus gemessen. In der reversen Verdünnungsreihen Transkription der wurde humanen extrahierte RNA Kolonkarzinomzellen aus den und den Patientenmaterialien eingesetzt, um cDNA zu erhalten, die nach der Vervielfältigung mittels Polymerase-Kettenreaktion am Lightcycler spezifisch quantifiziert wurden, daher der Begriff semiquantitative real-time-PCR. Die Reaktionen wurden zunächst in 0,2 ml PCR-Tubes (Firma Eppendorf) angesetzt. Nach den Angaben des Herstellers wurden für ein 20 µl Ansatz folgende Komponenten in einem RNase-freien Reaktionsgefäß zusammengegeben: RNase freies Wasser (je 2 µl), CK20-Reverse Transkriptase Reaction Mix (je 4µl), CK20-Random Hexamers p(dN)6 (je 1 µl), CK20-Desoxynucleotide Triphosphate (dNTP)-Mix (je 2 µl), CK20Reverse Transkriptase (je 1 µl). Zum Reaktionsgemisch von 10 µl wurden 10 µl RNA, 10 µl des Calibrators als positive RT-Kontrolle oder H2O als negative RT-Kontrolle hinzugefügt, so daß das Gesamtvolumen schließlich 20 µl betrug. Die Primerhybridisierung dauerte zunächst 10 min bei 25 °C, anschließend bet rug die Transkription 30 min bei 42 °C. Die Reaktion wurde durch Erhitzen au f 94 °C nach 5 min beendet, dabei wurden RNA-cDNA Hybride denaturiert. Die Proben wurden anschließend bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. 2. Material und Methoden 2.8 23 Polymerase-Kettenreaktion mittels LightcyclerTechnologie 2.8.1 Prinzip und Technik des Lightcyclers Die Technik des Lightcyclers wurde erstmalig von Wittwer 1997 dargestellt (Wittwer et al., 1997). Im Gegensatz zu den üblichen Blockcyclern handelt es sich dabei um ein Gerät, in dem 32 Reaktionsansätze in dünnen Glaskapillaren in einem Probenkarussell Platz finden. Die Temperaturregulierung erfolgt über eine Widerstandstandsheizung, die Luft als Medium verwendet, und durch Aufheiz- und Abkühlraten von bis zu 20 °C/sec den I nnenraum des Blockcyclers auf die entsprechenden Temperaturen bringt. Über einen Ventilator wird die Luft homogen in der thermischen Kammer verteilt und dadurch wird sichergestellt, daß an jeder Position des Rotors die gleiche Temperatur herrscht. Die Anregung der Farbstoffe in den Reaktionsansätzen erfolgt über eine Lichtquelle (Light emitting diode = LED) mit blauem Licht mit einer Wellenlänge von 470 nm im Lightcycler, welches daraufhin fluoreszierendes Licht abstrahlt. Während jedem PCR-Zyklus, in drei unterschiedlichen Kanälen mit jeweils drei verschiedene Wellenlängen, wird diese Fluoreszenz im Bereich der Kapillarenspitze statt über einem Photomultipliers über eine optische Einheit gemessen und ermöglicht somit eine Online-Detektion der PCR, da die Fluoreszenzdaten sofort auf dem Bildschirm abgebildet werden (Roche Diagnostics). Da der gesamte Prozeß in einem geschlossenen Gefäß durchgeführt wird, werden zusätzlich Kontaminationen zwischen den einzelnen Prozeßschritten vermieden. Das Lightcycler System ermöglicht es, einen PCR-Lauf innerhalb kürzester Zeit durchzuführen, der inklusive Sondenhybridisierung nur ca. 1 h dauert, und auf dem Monitor das Ergebnis des Laufs in Form von FluoreszenzKurven zu verfolgen und somit sehr schnell und direkt interpretieren zu können. Die Schnelligkeit der PCR wird vor allem durch den schnellen Ausgleich der Temperaturunterschiede begünstigt. Zum einem liegt es an der Verwendung von Luft als Temperaturmedium, die aufgrund ihrer geringen Dichte im Gegensatz zu Metall im Blockcycler sehr schnell erhitzbar und abkühlbar ist, 2. Material und Methoden 24 und zum anderen an der Verwendung von dünnen, feinen Glaskapillaren, die im Verhältnis zum Volumen ein sehr günstiges Oberflächenverhältnis aufweisen. Die erforderlichen Zeiten für die Denaturierung und das Annealing können damit sehr gering gehalten werden, was die Qualität der Amplifikationsreaktion nicht beeinflußt, sondern theoretisch sogar die Spezifität verbessern sollte (Wittwer et al., 1990). Es gibt dafür drei verschiedene Kanäle, in denen jeweils Licht unterschiedlicher Wellenlänge mit dem LC gemessen werden kann. • Kanal F1 (530 nm) für SYBR-Green I • Kanal F2 (640 nm) für LC Red 640 • Kanal F3 (710 nm) für LC Red 705 (Bellin et al., 2001). Zur Detektion von CK20 in den verschieden Zellsuspensionen wurde das Hybridisierungssonden-Format verwendet. 2.8.2 Nachweis der DNA mit Hybridisierungssonden Zusätzlich zu den Primern wurden zur sequenzspezifische Detektion des PCR-Produktes sogenannte Hybridisierungssonden (hybridisation probes) verwendet. Es handelt sich dabei um zwei modifizierte Oligonukleotide (etwa 23-30 bp lang), eine Anker- und eine Detektionssonde, die mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, die jeweils Licht unterschiedlicher Wellenlänge emittieren. Die erste Sonde trägt an ihrem 3´Ende den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein (FL), die zweite Sonde ist an ihrem 5´-Ende mit dem Fluorophor LC red 640 markiert. Nur nach sequenzspezifischer Hybridisierung gelangen beide Farbstoffe in räumliche Nähe, so daß sie sich gegenseitig anregen können. Der Donor-Farbstoff FL wird zunächst durch die blaue Lichtquelle des Lightcyclers (LED) angeregt und strahlt ein grünes Licht mit etwas geringerer Wellenlänge ab. Durch diese Lichtenergie wird der Akzeptorfarbstoff angeregt, wenn er sich nahe genug an der anderen Sonde befindet, und strahlt dann Licht einer anderen Wellenlänge ab. Dieser Energie-Transfer wird als „fluorescence resonance energy transfer“ (FRET) bezeichnet und wird dann als ein effizientes Fluoreszenzsignal gemessen, wenn die Sonden so konstruiert sind, daß sie 2. Material und Methoden 25 mit einem Basenpaar Abstand voneinander an die Template-DNA binden. Die vom Akzeptor-Fluorophor emittierte Fluoreszenz wird schließlich vom Lightcycler detektiert und das Ergebnis des Laufs wird simultan in Form von Fluoreszenz-Kurven auf einem Monitor (`online` oder in `real-time`) sichtbar gemacht und kann somit sehr schnell und direkt interpretiert werden. Während der Denaturierung findet noch keine Hybridisierung statt, daher gibt es auch kein Fluoreszenzsignal. Am Ende jedes Annealing-Schrittes wird die emittierte Fluoreszenz gemessen. Die Fluoreszenzintensität ist dabei direkt proportional zu der Menge der bis dahin spezifisch amplifizierten Templates. Nachdem sich die gemessene Fluoreszenzintensität zum ersten Mal von der Hintergrundstrahlung abhebt, wird die fraktionelle Zykluszahl automatisch von Lightcycler Software berechnet. Diesen Punkt, an dem die PCR Reaktion in den gemessenen Proben die logarithmische Phase erreicht, nennt man crossing-point (cp). Je weniger Template-Moleküle zu Beginn der Reaktion in einer Probe enthalten sind, desto mehr Amplifikationszyklen sind notwendig, bevor ein Fluoreszenzsignal meßbar ist und der cp erreicht wird. Nach dem Annealing-Schritt wird die Temperatur erhöht, und während der Elongationsphase werden die Hybridisierungssonden durch das spezifische Amplifikat ersetzt. Danach sind die PCR-Produkte doppelsträngig und die Sonden zu weit entfernt, um ein FRET-Signal zu ermöglichen. Die Fluoreszenz fällt mit dem Abdissoziieren der Sonden von der Template-DNA wieder ab. Die Sequenzspezifität der Sonden stellt sicher, daß nur dann ein Fluoreszenzsignal entsteht, wenn ein spezifisches Template in der Reaktion vorhanden ist. 2.8.3 Interne und externe Kontrollen Für die Detektion von CK20 (target) wurden zusätzlich zu den Primern Oligonukleotide aus der Region des „menschlichen Genoms“ gewählt, die für das Enzym Porphobilinogendeaminase (PBGD) kodiert. Das PBGD-Gen ist ein sogenanntes „Housekeeping Gene“ und liefert bei Vorhandensein von menschlicher cDNA ein PCR-Amplifikat von 151 bp (Roche Molecular Biochemicals 2000). 2. Material und Methoden Die Detektion des 26 PBGD-Amplifikats, sogenannte interne Kontrolle (reference), beweist retrospektiv die erfolgreiche RNA-Extraktion und Reverse Transkription aus dem Probenmaterialien und die technisch gut abgelaufene PCR. Jede Probe wurde praktisch im Doppeltansatz untersucht, als target (CK20) und als reference (PBGD). In die Auswertung wurden nur solche Experimente miteinbezogen, bei denen ein klares PBGD-Signal und die entsprechende Negativ-Kontrollen, sogenannte externe Kontrollen, in Form von Wasserproben negativ waren. Bei den Negativ-Kontrollen handelte es sich um die RT-negativ-Kontrolle und die PCR-Negativ-Kontrolle. 2.8.4 Relative Quantifizierung Durch einen Kalibrator wird eine Normalisierung der relativen Ratio durch Unterschiede in der Detektion und Sensitivität von PCR-Lauf zu PCR-Lauf ausgeglichen. Zusätzlich gleicht ein Rechenlogarithmus der Software Unterschiede in der PCR Effizienz von target und reference Gen aus. Das ist die normalized ratio. Auf diese Weise wird aus den PCR-Rohdaten die normalized ratio der untersuchten Genexpression berechnet. Das Schlußergebnis wurde mit 106 multipliziert, der Wert den der Kalibrator nach jedem PCR-Lauf zugeteilt bekam. Daher hat eine Probe mit einem Wert von 105 einen 10fach geringeren Wert als der Kalibrator. 2.8.5 Lightcycler-PCR Die Polymerase Kettenreaktion wurde eingesetzt zur Quantifizierung von spezifischen Sequenzen bestehend aus CK20 und PBGD aus der in der Reversen Transkription produzierten cDNA aus Kolonkarzinomzellinien und Knochenmark von Patienten. Das Gesamtvolumen von jeder Probe für die PCR betrug 20 µl und setzte sich zusammen aus 2 µl Template (cDNA von humanen PBMC, PBMC von humanen Knochenmärkern und cDNA aus diversen Zellinien) und 10 µl Mastermix, aus dem fertigen Kit der Firma Roche (Lightcycler-CK20 Quantification Kit), bestehend aus Sonden (je 2 µl des gelösten Lyophylisats mit der Konzentration von 2pmol/µl, Detection Mix, und Reference Detection 2. Material und Methoden 27 Mix), 2 µl Enzym-Mastermix von Roche (enthält Puffer, Taq-Polymerase, dNTP´s und MgCl2 in einer Konzentration von 1,0 mmolar), PCR-H2O von Roche 14 µl. Jeweils 18 µl des fertigen Mastermix wurden in die in einem Kühlblock vorgelegten Boro-Silikat-Kapillaren unter der Flow pipettiert. Der Kühlblock wurde dann im „unsterilen“ Bereich mit den vorbereiteten Template-DNA, bzw. PCR-H2O als Negativ-Kontrolle, beschickt und die Kapillaren mit den dazugehörigen Deckeln versiegelt. Die Kapillaren wurden anschließend einer Heraeus-Zentrifuge etwa 10 sec bei 2000 UPM zentrifugiert, damit die Probe sich im unteren Bereich der Kapillare sammelt, wo die Fluoreszenz gemessen wird. Schließlich wurde der Kapillarenhalter mit den Kapillaren beladen und in den Lightcycler eingesetzt, der Deckel verschlossen und der Lauf gestartet. Die Fluoreszenz, welche im Kanal F2/F1 detektiert wurde, wurde nach Beendigung der PCR mit einer Lightcycler Analysis Software ausgewertet. Die Kapillaren wurden nach Beendigung des Laufs umgekehrt in ein Eppendorf-Behälter gestellt und kurz in einer Heraeus-Zentrifuge anzentrifugiert, so daß die sich nun im Eppendorf-Behälter befindlichen PCRProdukte, für weitere Versuche mit der Polyacrylamid-Gel verwendet werden konnten. Die Auswertung der Lightcycler-PCR erfolgte über die „Relative Quantifizierungs-Software“ der Firma Roche, in Verbindung mit den Ergebnissen der Polyacrylgel-Elektrophorese und den immunzytologischen Ergebnissen. Beim Auftragen der PCR-Produkte auf die Polyacrylamidgele wurde eine sichtbare Bande an der entsprechenden Stelle (erwartete Größe des Produkts in Basenpaaren) als ein positives Ergebnis gewertet. Folgende Abbildungen (Abb. 3 und Abb. 4) zeigen typische Ergebnisse von Zytokeratin-positiven und -negativer Zellen nachgewiesenen am Lightcycler. 2. Material und Methoden 28 CK20-positive Probe No Colour Name Crossing-Point 1 dunkelblau calibrator target 24.52 2 hellgrün calibrator reference 26.72 3 rot RT aqua target ------ 4 schwarz RT aqua reference ------ 5 hellblau HT29 target 17.44 6 grau HT29 reference 22.88 Abbildung 3: CK20 RT-PCR für CK20 anhand CK20-positiver Zellen Die RT-PCR für CK20 zeigt fluoreszenzspektroskopisch Amplifikationsprodukte für die Kalibrator-Proben (dunkelblau, hellgrün), für die CK20-positive Probe (hellblau) und für interne Kontrolle der CK20-positiven Probe (grau). Die Amplifikation wird online fluoreszenzspektroskopisch in Abhängigkeit der eingesetzten bzw. amplifizierten cDNA-Menge gemessen. Kritisch bei der quantitativen Bestimmung ist der sogenannte crossing-point, d.h. derjenige mRNA-Gehalt der sich fluoreszenzspektroskopisch vom Grundrauschen unterscheidet. Zur Veranschaulichung wurden in der graphischen Darstellung die Positiv-Kontrollen und Negativ-Kontrollen und eine CK20-positive Probe in der Abbildung 3 dargestellt. 2. Material und Methoden 29 CK20-negative Probe No Colour Name Crossing-Point 1 dunkelblau calibrator target 24.52 2 hellgrün calibrator reference 26.72 3 rot RT aqua target ------ 4 schwarz RT aqua reference ------ 5 violett CK20 negativ target ------ 6 dunkelgrün CK20 negativ reference 27.43 Abbildung 4: CK20 RT-PCR für CK20 anhand CK20-negativer Zellen Die RT-PCR für CK20 zeigt fluoreszenzspektroskopisch nur Amplifikationsprodukte für die Kalibrator-Proben (dunkelblau, hellgrün) und die Referenzkontrolle für die CK20- negative Probe (dunkelgrün). In dieser Abbildung wird eine CK20-negative Probe mit positiven und negativen Kontrollen dargestellt. Hier erkennt man, daß trotz fehlender CK20-Expression das housekeeping gene darstellbar war. Das bedeutet, daß auch diese negative Probe korrekt aufgearbeitet wurde. 2. Material und Methoden 2.9 30 Gelelektrophorese Der Begriff Elektrophorese beschreibt die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen (wie z.B. die Nukleinsäuren) wandern dabei auf die Anode zu, die positiv geladenen auf die Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit des geladenen Moleküls ergibt sich aus dem Quotienten aus Geschwindigkeit und Feldstärke. Sie ist aber auch abhängig vom Verhältnis seiner Masse zur Ladung. Dieses Masse/Ladungs-Verhältnis ist für Nukleinsäuren annähernd konstant, unabhängig von der Größe bzw. der Länge des Moleküls. Bei der Elektrophorese in einem Trägergel kommt der für die Trennung wichtige Molekularsiebeffekt hinzu. Zur Größenauftrennung von Nukleinsäuren ist daher eine Matrix mit bestimmter Porengröße notwendig wobei die Beweglichkeit von der Länge des Moleküls, der Porengröße innerhalb der Matrix und unter anderem vom pH-Wert und von der Ionenstärke des Mediums beeinflußt wird. Vom pH-Wert ist der Dissoziierungsgrad der als Elektrolyt gewählten schwachen Säure oder der Base abhängig und bestimmt in erster Linie die Ionen-Nettoladung und damit die Nettobeweglichkeit der Teilchen. Das elektrische Feld wirkt als treibende und ausrichtende Kraft, die die Teilchen durch das Molekularsieb zieht. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist direkt proportional der angelegten Spannung und der Ladung und umgekehrt proportional dem Radius der Teilchen (Rick, 1990, Gross, 1965). Als Matrix wird zumeist Agarose oder Polyacrylamid (klassische Gelelektrophorese) bzw. Dextran, Zellulose, Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Polyethylenglykol (Kapillargelelektrophorese) verwendet (Heller, 1998, Lottspeich und Zorbas, 1998). Das PCR-Produkt (cDNA) kann mit Hilfe verschiedener Zusatzmethoden detektiert und weiter aufgeschlüsselt werden. Die gängigsten Verfahren sind die Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Gelelektrophorese mit southern blotting, die dot-blot-Analyse und die Reverse-dot-blot-Analyse. Es gibt zahlreiche Variationen in der Konsistenz der Gele und den Bedingungen des Reaktionsablaufes. Die unterschiedlichen Formen hängen von den PCRProdukten ab und sollten jeweils dem individuellen Experiment angepaßt 2. Material und Methoden 31 werden. Die Darstellung der im Gel aufgetrennten DNA-Fragmente erfolgt zumeist durch eine Silber- oder Ethidiumbromid-Färbung (Lyons, 1992, Herrington und O´D McGee, 1992). Das Polyacrylamid-Gel ist ein synthetisches Polymerisations- und Vernetzungsprodukt von Acrylsäureamid (CH2=CH-CO-NH2) und dem Vernetzer N,N´Methylenbisacrylsäureamid (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2). Durch Ko- oder Mischpolymerisation entstehen PAA-Ketten in Lösung. Das dreidimensionale Maschenwerk des PAA-Gels entsteht durch Vernetzung der Polymerketten an den Stellen, wo das Bisacrylamid eingebaut ist (Maurer, 1971). Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften erscheinen sie als Trägersubstanz für die Elektrophorese besonders geeignet: Sie sind chemisch stabil und indifferent, optisch hoch transparent, und ihre Struktur ist zur Erzeugung verschiedener Porenweiten veränderbar. Die Auftrennung ist dabei so effizient, daß sich die zu auftrennende Substanz, die sich nur um wenige Basenpaare unterscheiden, als diskrete Banden gut unterscheiden lassen. Hinzu kommt, daß adsorptive und elektro-osmotische Effekte vernachlässigbar gering sind. Die Gele sind stabil gegen pH- und Temperaturveränderungen sowie in ihren Eigenschaften gut reproduzierbar. Der Polymerisationsgrad des Acrylamids und auch der Vernetzungsgrad des Vernetzers sind Substanzen die zu den Eigenschaften des Gels wie Porengröße, Viskosität und Festigkeit beitragen. Diese können aber durch die Menge des verwendeten Vernetzers variiert werden. Die Porengröße kann somit durch die Polymerisationstechnik in gewissen Grenzen beeinflußt und gesteuert werden (Maurer, 1968). Die aus der Polymerase-Kettenreaktion gewonnenen cDNA wurden über ein Polyacrylamid-Gel mittels Elektrophorese getrennt. Die Elektrophorese erfolgte in vertikalen Gelkammern mit einer konstanten Leistung von 100 V ca. 25 min. Als Elektrophoresepuffer wurde TBE-Puffer verwendet. Der TBEPuffer pH 8,3 besteht aus folgenden Substanzen: 90 mM Tris-Base, 2 mM EDTA, 90 mM Borsäure. Vor der Herstellung der Gele wurden die Glasplatten gesäubert. Durch Zugabe von 0,2 % Temed® (20 µl), 0,04 % Ammoniumperoxodisulfat (200 µl) in TBE-Puffer (3 ml) in 6 % 2. Material und Methoden 32 Acrylamid/Bisacrylamid (2 ml) wurde die Polymerisation gestartet und das Gel direkt gegossen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die aufgetrennten cDNAMoleküle mit Hilfe von Ethidiumbromid visualisiert, bevor sie unter UVIllumination am UV-Tisch der Firma Biometra ausgewertet wurden. Folgende Abbildungen (Abb. 5 und 6) zeigen typische elektrophoretische Nachweise von positiven und negativen RT-PCR-Amplifikationsprodukten von internen Kontrollen und CK20-Proben mittels Polyacryl- Gelelektrophorese. Kontrolle DNA-Leiter Zielgen DNA-Leiter Abbildung 5: Elektrophoretische Darstellung der Amplifikationsprodukte Die Amplifikationsprodukte (Zielgen) und die Kontrolle (unreguliertes Gen) wurden im Anschluß an die RT-PCR elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht visualisiert. Durch die elektrophoretische Aufarbeitung der gewonnenen cDNA aus der RT-PCR wurde zusätzlich eine semiquantitative und zugleich optische Darstellung der Ergebnisse erreicht. Alle Proben wurden an einer standardisierten DNA-Leiter abgelesen. Hierbei wurden zusätzlich zu allen Proben die Kontroll-Proben (reference und target) erneut elektrophoretisch aufgetrennt. In der Abbildung 5 läßt sich die unterschiedliche Länge (bp) von 2. Material und Methoden 33 target und reference erkennen. Die reference-Kontrolle hat 151 bp und die target-Kontrolle besitzt 124 bp. Positive Kontrolle CK 20negativ DNA-Leiter Positive Kontrolle CK 20positiv DNA-Leiter Abbildung 6: Elektrophoretische Darstellung von CK20-positiven und negativen Proben. Die mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR und konsekutiver Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte bestimmt. Dargestellt sind eine CK20-negative Probe (links) und eine CK20-positive Probe (rechts) bei vergleichbarer Expression der Kontrolle (housekeeping gene). In dieser Abbildung werden eine CK20-positive und eine CK20-negative Probe gegenüber gestellt. Hierbei ist zu erkennen, daß bei der negativen Probe nur die interne Kontrolle, nämlich das sogenannte housekeeping gene nachzuweisen war, während bei der positiven Kontrolle sowohl das target (CK20) als auch das housekeeping gene nachweisbar waren. 3. Ergebnisse 34 3. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse der Verdünnungsreihen in aqua destillata Aus den Kolonkarzinomzellinien Colo320, Caco2 und HT29 wurde RNA extrahiert, in RNase-freiem Wasser gelöst und in einer Serienverdünnung aliquotiert (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng) portioniert. Die Sensitivität der Methode der quantitativen RT-PCR zur Messung der mRNA-Expression des epithelialen Markergens CK20 wurde als normalized ratio, also als Verhältnis zwischen zu messender Probe und Referenzstandard, dargestellt. Hierbei handelt es sich um einen Quotienten aus regulierter Ziel-mRNA und dem sogenannten housekeeping gene (s. 2.8.3), welches konsekutiv in Zellen exprimiert wird. Die relative mRNA-Expression des CK20-Gens ist in Abbildung 7 als normalized ratio für die zuvor genannten kolorektalen Karzinomzellen dargestellt: Detektion mittels CK20 RT-PCR Norm aliz ed Ratio humane Kolonkarzinomzellen in Aqua dest 10000000 1000000 100000 10000 0,1 1 10 100 RNA in ng/ml Colo23 Caco2 HT29 Abbildung 7: Expression der mRNA des CK20-Gens Die Expression des CK-20-Gens wurde im Verhältnis zum PBDG-Gen (housekeeping gene) mittels RT-PCR ermittelt. Für die RT-PCR wurde eine Serienverdünnung der isolierten Gesamt-RNA von 0,1 bis 100 ng pro Reaktion eingesetzt. In 4 von 15 PCR-Läufen konnte die interne Kontrolle (housekeeping gene) jedoch nicht nachgewiesen werden, so daß diese 4 Proben für die weiteren 3. Ergebnisse 35 Untersuchungen ausgeschlossen wurden. Als externe Kontrolle konnte das sogenannte Kalibrator-Target in jedem PCR-Lauf detektiert werden. Eine CK20-Expression konnte für HT29 bereits schon bei einer eingesetzten RNA-Konzentration von 0,1 ng/ml gemessen werden mit einer normalized ratio von 1724756,00 für 10-10g RNA (n=4), während bei den anderen Kolonkarzinomzellinien Colo320 und CaCo2 eine CK20-Expression erst ab 1 ng/ml detektiert werden konnte. Für Colo320 lag die normalized ratio bei 71881,00 für 10-9g RNA (n=3) und für Caco2 bei 59403,25 für 10-9g RNA (n=4). Aus Abb. 7 geht außerdem noch hervor, daß die CK20-Expression bei den verschiedenen humanen Kolonkarzinomzellen variiert. HT29 hat insgesamt eine fast zweifach höhere CK20-Expression als Colo320- oder Caco2-Zellen (s. Tab. 5). Tabelle 5: Normalized ratio für CK20-spezifische RT-PCR verschiedener Kolonkarzinomzellen in Aqua dest. Die Expression der mRNA für das epitheliale Marker-Gen CK20 wurde semiquantitativ mittels RT-PCR im Verhältnis zu einem unregulierten Gen (normalized ratio) bestimmt. Die RNA aus den Tumorzellinien Colo320, Caco2 und HT29 wurden vorab in destilliertem RNase-freiem Wasser verdünnt. RNA-Konzentra- Colo320 Caco2 HT29 tion (ng/ml) (n=3) (n=4) (n=4) 0,1 0,00 0,00 1724756,00 1 71881,00 59403,00 2106404,00 10 69578,00 68736,00 2522992,00 100 97237,00 143450,00 4055503,00 3. Ergebnisse 36 3.2 Nachweis von Tumorzelldissemination in monokleären Zellen des peripheren Blutes 3.2.1 Ergebnisse für die Zellinien Colo320, Caco2, HT29 In diesem Abschnitt der Arbeit wurden humane CK20-positive kolorektale Karzinomzellen mononukleären CK20-negative Zellen beigemischt. Anschließend erfolgte eine Messung der Sensitivität der quantitativen RTPCR. Die Ergebnisse werden in folgender Graphik verdeutlicht (s. Abb. 8): Detektion mittels CK20 RT-PCR humane Kolonkarzinomzellen in PBMC Normalized Ratio 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 10 100 1.000 10.000 100.000 Zellzahl in 1Mio. PBMCs Colo23 Caco2 HT29 Abbildung 8: Messung der CK20-mRNA-Expression in Serienverdünnung kolorektaler Karzinomzellen in PBMC Die Expressionshöhe des CK20-Gens wurde als normalized ratio exponentiell ausgedrückt. Eine CK20-Expression konnte für alle 3 Kolonkarzinomzellinien bereits schon bei einer Verdünnung von 1:104 detektiert werden. Die normalized ratio für Colo320 betrug 102,00 für 1:104 PBMC (n=3), für Caco2: 110,67 für 1:104 PBMC (n=3). Für HT29 allerdings wurde eine knapp 25-fach höhere Konzentration gemessen: 2595,25 für 1:104 PBMC (n=4). Auch hier wird in Abb. 8 wieder deutlich, daß die CK20-Expression bei HT29Zellen deutlich höher liegt als bei Colo320 oder Caco2. 3. Ergebnisse Tabelle 6: 37 CK20-mRNA-Expression (normalized ratio) seriell verdünnter Kolonkarzinomzellen in PBMC Die Expression der mRNA für das epitheliale Marker-Gen CK20 wurde semiquantitativ mittels RT-PCR im Verhältnis zu einem unregulierten Gen (normalized ratio) bestimmt. Die RNA aus den Tumorzellinien Colo320, Caco2 und HT29 wurden vorab in PBMC verdünnt. Zellzahl/1Mio. Colo320 Caco2 HT29 (n=3) (n=3) (n=4) 1 0.00 0.00 0.00 10 0.00 0.00 0.00 100 102.00 110.67 2595.25 1.000 3853.00 6606.00 39116.5 10.000 7933.00 23027.00 367890.25 100.000 12866.67 46217.67 1471660.00 CK20-neg. PBMC-Medium 3. Ergebnisse 38 3.2.2 Immunzytochemische Detektion epithelialer Markergene (Colo320, CaCo2, HT29) Die unterschiedlichen Zellverdünnungsreihen aus humanen Kolonkarzinomzellen in 1 Million PBMC wurden auf Objekträger zentrifugiert, immunzytochemisch gefärbt und anschließend mikroskopisch ausgezählt. Immunzytochemisch detektierte Anzahl von Kolonkarzinomzellen / 1 Mio. PBMC Die folgende Graphik zeigt die Ergebnisse (s. Abb.9): 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 10 100 1.000 10.000 100.000 Verdünnung: Kolonkarzinomzellen / 1 Mio. PBMC Colo320 Caco2 HT29 Abbildung 9: Sensitivität der immunzytochemischen Detektion von unterschiedlichen CK20-positiven humanen Kolonkarzinomzellen Tumorzellen lassen sich immunzytochemisch durch die Expression des epithelialen Marker-Gens Zytokeratin nach serieller Verdünnung in humanen Kolonkarzinomzellen detektieren. Bei der immunzytochemischen Aufarbeitung der verschiedenen Kolonkarzinomzellen in PBMC konnten bereits bei einer Verdünnung von 1:103 Caco2- und HT29-Zellen positiv detektiert werden. Allerdings war eine fast dreifach höhere Menge an HT29-Zellen festzustellen. Bei der nächsten Verdünnungsstufe von 1:102 konnte auch eine geringe Anzahl an Colo320Zellen nachgewiesen werden. Die Zahl Kolonkarzinomzellinien verhielt sich exponentiell. der detektierbaren 3. Ergebnisse 39 3.3 Nachweis von Tumorzelldisseminaten der Zellinie HT29 in CK20-negativem Knochenmark 3.3.1 Ergebnisse für HT29 Die HT29-Zellen zeigten in den beiden vorangegangenen Versuchen eine sehr hohe CK20-Expression. Daher wurden diese CK20-positiven kolorektalen Karzinomzellen ausgewählt und eine Verdünnung in 1 Million CK20-negativen Knochenmarkzellen durchgeführt, um anschließend die Sensitivität der semiquantitativen RT-PCR im nativen KM-Material zu erfassen. Folgende Graphik verdeutlicht die Ergebnisse (s. Abb. 10): HT29 in 1Mio. CK20-negativen KM-Zellen 10000000 Normalized Ratio 1000000 100000 10000 1000 100 1 10 100 1.000 10.000 1.000.000 Beigemischte Anzahl an HT29 Zellen HT29 Abbildung 10: Sensitivität der semiquantitativen CK20-RT-PCR in CK20negativen KM-Zellen mit HT29-Zellen Die Sensitivität der RT-PCR für das epitheliale Marker-Gen CK20 wurde mittels Serienverdünnung von HT29-Zellen (CK20-positiv) in Knochenmark ermittelt. Eine Verdünnung von 1:105 HT29-Zellen gestattete den Nachweis von Tumorzellen in einer Knochenmarkzellsuspension mit einer normalized ratio von 1155,96 (n=4). Die graphische Darstellung zeigt ferner, daß die nachweisbare Expression mit der Zahl der beigemischten Tumorzellen positiv korreliert. 3. Ergebnisse 40 Tabelle 7: CK20-mRNA-Expression (normalized ratio) seriell verdünnter Kolonkarzinomzellen in einer Knochemarkzellsuspension Die Expression der mRNA für das epitheliale Marker-Gen CK20 wurde semiquantitativ mittels RT-PCR im Verhältnis zu einem unregulierten Gen (normalized ratio) bestimmt. Die RNA aus der Tumorzellinie HT29 wurde vorab in einer Knochenmarkzellsuspension verdünnt. Zellzahl/1 Mio. CK20-neg. HT29 KM-Zellen (n=4) 1 0,00 10 1155,96 100 14023,29 1.000 90384,81 10.000 801455,85 1.000.000 9747723,80 3. Ergebnisse 41 3.3.2 Immunzytochemische Detektion epithelialer Markergene (HT29) Die Karzinomzellverdünnungsreihen mit HT29-Zellen, welche in 1 x 106 CK20-negativen KM-Zellen untergemischt worden waren, wurden auf Objekträger zentrifugiert, immunzytochemisch gefärbt und anschließend mikroskopisch ausgezählt. Die folgende Graphik zeigt die Ergebnisse (Abb. Immunzytochemisch detektierte Anzahl von Kolonkarzinomzellen / 1 Mio. PBMC 11): 10000 1000 100 10 1 1 10 100 1.000 10.000 1.000.000 Beigemischte Anzahl an HT29-Zellen HT29 Abbildung 11: Sensitivität der immunzytochemischen Detektion von CK20 positiven HT29-Zellen in CK20-negativen Knochenmarkzellen HT29-Zellen wurden immunzytochemisch durch die Expression des epithelialen Marker-Gens Zytokeratin nach serieller Verdünnung in einer Knochenmarkzellsuspension detektiert. Bei der immunzytochemischen Darstellung der HT29-Zellen in KM-Zellen können die HT29-Zellen bei einer Verdünnung von 1:104 mikroskopisch nachgewiesen werden. Auch hier zeigte der immunzytochemisch Nachweis einen exponentiellen Anstieg. 3. Ergebnisse 42 3.4 Diagnostische Detektion disseminierter Tumorzellen im Knochenmark Im letzten Abschnitt der Arbeit wurden 30 Knochenmarkproben von Patienten im Alter zwischen 41-84 Jahren mit verschiedenen benignen und malignen Erkrankungen aufgearbeitet. Nach den vorangegangenen Überprüfungen der Sensitivität zum Nachweis der CK20-Expression in humanen Kolonkarzinomzellen sollte nun eine realitätsnahe Untersuchung mit pathologischem KM erfolgen. Es wurden Anteile von Knochenmarkaspiraten von 13 Patienten mit malignen Erkrankungen des unteren Gastrointestinaltraktes (Kolonkarzinom) und von 17 weiteren Patienten mit anderen Erkrankungen untersucht. Tabelle 8: Auflistung der KM-Spender mit jeweiliger Diagnose und TNMKlassifikation Die Indikation zur Knochenmarkasservation bestand in der Abklärung eines Verdachtes auf eine hämatopoetische Grunderkrankung oder eine stattgehabte hämatogene Filialisierung in das Knochenmark bei epithelialem Tumorleiden. Patient (Nr.) Alter Indikation zur KM-Punktion Diagnose 1 67 Unklare Leukozytopenie und Anämie Anämie unklarer Ätiologie 2 53 Immunkomplexvaskulitis, V. a. Anämie Anämie, Ulcus cruris 3 62 Kontrolle bei Z. n. KMKolonkarzinom Nekrose und V. a. MPE 4 62 Leukozytopenie, Neutropenie und Anämie zur weiteren Abklärung Anämie 5 83 Rekurrensparese und Raumforderung im Mediastinum Bronchialkarzinom 6 55 Thrombozytopenie Thrombozytopenie TNMKlassifikation pT0pN0pM0 pT0pN0pM0 3. Ergebnisse 43 7 79 Multiple Lymphome NHL 8 41 Tumorsuche bei unklarer Thrombozytopenie Myeloische Leukose 9 55 Thrombozytopenie bei Thrombozytopenie AntiphospholipidSyndrom 10 79 Tumorsuche bei unklarer Anämie Anämie unklarer Ätiologie 11 84 Unklare Leukozytopenie Leukozytopenie unklarer Ätiologie 12 72 Axilläre LK-Schwellung Okkultes unklarer Genese Mammakarzinom pT2pN0pMo 13 88 V. a. KM-Infiltration Rezidivierendes Rektumkarzinom pT3pN1pM0 14 48 V. a. Lymphom Anämie 15 79 Blutungsanämie Mittelgradig differenziertes Rektumkarzinom pT3pN0pMX 16 63 V. a. ÖsophagusKarzinom mit KMInfiltration Ösophaguskarzinom pT3pN1pM0 17 68 Unklare Leukozytopenie Sigmakarzinom pT2pN0pMX 18 66 Tumorstaging bei gesichertem Kolonkarzinom Mittelgradig differenziertes Adenomkarzinom pT1pN0pMX 19 80 Anämieabklärung Metastasiertes Kolonkarzinom pT3pN1pM1 20 63 Unklare Thrombozytose Magenkarzinom pT0pN0pM0 21 73 Tumorstaging bei gesichertem Adenokarzinom Adenokarzinom der Papilla vateri pT2pN0pMX Anämieabklärung Mittelgradig differenziertes Adenokarzinom des Sigmas pT4pN0pMX 22 60 3. Ergebnisse 44 23 58 V. a. Kolonkarzinom mit schwerer Anämie Adenokarzinom des Rektums pT1pN0pM0 24 73 Abklärungsbedürftige Eisenmangelanämie Adenokarzinom des Zoekums pT2pN0pM0 25 56 Initial Tumorsuche bei Panzytopenie Mittelgradig differenziertes Adenokarzinom des Rektums pT2pN1pM0 GII 26 67 Leukozytopenie bei Chemotherapie Niedrig differenziertes Adenokarzinom des Rektums pT3pN0pM0 GIII 27 75 V. a. KM-Infiltration Adenokarzinom des Sigmas pT2pN0pMX 28 75 Schwere Anämie Adenokarzinom des Magens pT2pN0pMX GII 29 56 V. a. auf KMInfiltration Bronchialkarzinom pT4pN2pM1 30 78 Anämieabklärung Mittelgradig differenziertes Colon ascendens-Karzinom pT3pN1pM0 GII Von insgesamt 30 untersuchten Patienten waren nur 5 Patienten in der RTPCR und in der immunzytochemischen Färbung positiv (s. Tab.9). Von diesen 5 Patienten hatten 2 Patienten ein Rektumkarzinom, die anderen ein Bronchialkarzinom, ein Mammakarzinom oder eine Leukozytopenie unklarer Ätiologie. Ein Zusammenhang zwischen der normalized ratio und histopathologischen Tumorklassifikation konnte nicht gefunden werden. der 3. Ergebnisse Tabelle 9: 45 Vergleich der CK20-mRNA-Expression und immunzytochemisch erfaßten CK20-Proteinexpression in CK20-positiven Knochenmarkproben Die Bestimmung der mRNA-Expression des CK20-Gens mittels RT-PCR gestattet eine qualitative und semiquantitative Aussage zur Kontamination des Knochenmarkes mit epithelialen Zellen im Vergleich zur Immunzytochemie. CK20 RT-PCR (normalized ratio) Patient (Nr.) CK20 Immunozytochemie (Gesamtzellzahl) Diagnose 5 Bronchialkarzinom 151,38 4 11 Leukozytopenie unklarer Ätiologie 674,37 2 12 Okkultes Mammakarzinom 2155,00 4 13 Rezidivierendes Rektumkarzinom 178,55 5 15 Mittelgradig differenziertes Rektumkarzinom 258,36 1 In der anschließenden Elektrophorese konnte die amplifizierte CK20-cDNA visualisiert werden (s. Kapitel 2.9). 4. Diskussion 46 4. Diskussion Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein standardisiertes, reproduzierbares und hochsensitives Verfahren zum Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark bei Patienten mit einem kolorektalen Karzinom mittels eines CK20-Marker-Panels zu entwickeln. Zur Zeit belegen immer mehr Studien, daß eine Erweiterung der Indikation zur adjuvanten Therapie einen klinischen Nutzen für die entsprechenden Patienten bieten kann. Daher erscheint unter anderem eine Erweiterung des TNM-Systems um die disseminierten Tumorzellen sinnvoll. Dies könnte zu einer besseren Diagnostik und Therapie von malignen Tumoren führen. Im Regelfall erfolgt im UICC-Stadium I und II eines Kolonkarzinoms eine R0Resektion des tumortragenden Gewebes. Es ist aber bislang noch nicht geklärt, was mit einem Patientenkollektiv geschieht, bei dem sich im Stadium UICC II disseminierte Tumorzellen nachweisen lassen. Im Einzelfall kann auch in diesem Stadium bei ausgewählten Risikosituationen (T4, Tumorperforation/-einriß oder Operation unter Notfallbedingungen) eine adjuvante Chemotherapie erwogen werden (Merkel et al., 2001, Petersen et al., 2002). Andere Arbeitsgruppen sind auch der Ansicht, daß Patienten im Stadium II von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren würden (Gray et al., 2004, Mamounas et al., 1999). Da konventionelle Methoden zum Nachweis einer Metastasierung in frühen Krankheitsstadien nicht ausreichen, wurde das Knochenmark als Sekundärorgan untersucht. Die Vorteile sind seine leichte Zugänglichkeit, die geringe Invasivität der Gewinnung und der im Normalfall fehlende Nachweis epithelialer Zellen. In einer Kontrollstudie mit über 200 Knochenmarkproben von Nicht-Tumor-Erkrankten war die immunzytochemische Darstellung mit A45-B/B3 negativ (Braun et al., 2000). CK20 wurde bereits häufig als RT-PCR-Marker zur Detektion von Tumorzellen in verschiedenen Arten von Tumoren verwendet (Bostik et al., 1998, Weber et al., 2000), aber meistens in kolorektalen Karzinomen (Funaki et al., 1998, Guo et. al., 2005, Soeth et al., 1997, Wang et. al., 2006, Weitz et al., 2000, Wharton et al., 1999). CK20 ist ein epithelialer Marker, welcher nicht im KM vorkommt, da sich seine Expression in erster Linie auf gastrointestinale Gewebe wie kolorektale Adenokarzinome, Übergangszell- 4. Diskussion 47 (Urothel) Karzinome und auf Merkel-Zell-Tumoren beschränkt (Miettinen, 1995). Die ersten histopathologischen Nachweismethoden zur Detektion von mikrometastatischen Tumorzell-Aggregaten wurden 1980 von Burkhardt et al. beschrieben. Über mehr als ein Jahrzehnt dominierte die zytologische Identifikation von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark (Schlimok et al., 1987). Seit mehr als 15 Jahren beschäftigen sich verschiedene Arbeitsgruppen mit der Detektion von disseminierten Tumorzellen mittels Immunzytochemie (Broll et al., 1996, Funke et al., 1989, Oruzio et al., 1997, Pantel und Riethmüller, 1994, Schlimok et al., 1990), wobei diese Methode zusehends an bedeutender klinischer Relevanz gewann. Aktuell wird die Immunzytochemie von vielen Autoren weiterhin als Goldstandard betrachtet (Kaifi et al., 2005, Oruzio et al., 1997, Pantel et al., 1997, Pantel et al., 1999, Pantel und Riethmüller, 1994, Woelfle et al. 2005). In den vorliegenden Experimenten liegt die immunzytochemische Nachweisgrenze für HT29-, CaCo2- und Colo320-Zellen zwischen 1:103 – 1:104 in PBMC oder in Knochenmarkszellen. Eine sehr hohe Sensitivität bei einer Nachweisquote von etwa einer Tumorzelle in 105-106 mononukleären Zellen konnte die Arbeitsgruppe um Oruzio et al. (1997) zeigen. Pantel et al. (1996) schließt auf eine hohe Wiederfindungsrate von Tumorzellen durch immunzytologische Methoden, bei Modellexperimenten an peripheren Blutoder Knochenmarkproben, die mit Tumorzellen kontaminiert wurden. Es konnten 2-4 Tumorzellen in 107 mononukleären Zellen gefunden werden. Neben dem immunzytochemischen Ansatz ist die RT-PCR das zweite Standardverfahren, um einzelne disseminierte Tumorzellen mit einer ausreichenden Sensitivität nachzuweisen. In der letzten Dekade wurde die Möglichkeit, eine geringe Anzahl disseminierter Tumorzellen verschiedener Tumoren im Blut oder KM durch molekularbiologisch Methoden zu detektieren, in zahlreichen Studien erarbeitet (Benoy et al., 2006, Burchill und Selby, 2000, Ghoessein et al., 1999, von Knebel Doeberitz et al., 1996, Lassmann et al., 2002, Masuda et al., 2005, Pantel et al., 1999, Pantel und Otte, 2000, Rosenberg et al., 2002, Soeth et al., 1997, Zieglschmid et al., 2005, Zippelius et al., 1997). 4. Diskussion Um die 48 Spezifität dieser Methode zu überprüfen, wurden RNA- Verdünnungsreihen aus drei verschiedenen humanen Kolonkarzinomzellen (Colo320, Caco2 und HT29) hergestellt. Dabei gelang bereits der Nachweis der CK20-mRNA-Expression ab einer Menge von 0,1 ng eingesetzter Gesamt-RNA aus CK20-positiven HT29-Zellen mit der quantitativen RTPCR. Die beiden anderen Karzinomzellen, Colo320 und Caco2, konnten erst bei einer eingesetzten Gesamt-RNA-Menge von 1 ng detektiert werden. Retz et al. (2001) überprüften die Sensitivität der CK20-RT-PCR mit Hilfe einer RNA-Verdünnungsreihe (50 ng – 5 ng) aus HT1376-Zellen, eine Zellinie eines humanen Blasenkarzinoms. Die Detektionsgrenze dieser Studie lag bei 10 ng Gesamt-RNA. Dieser Vergleich mit Daten aus der Literatur belegt, daß die eigenen Detektionsgrenzen den aktuell publizierten Sensitivitätskriterien durchaus entsprechen. Retz et al. (2001) erreichten in ihren Versuchen mit HT1376-Zellen ebenfalls eine sehr hohe Sensitivität für den Nachweis von 2 HT1376-Zellen pro 106 mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Diese sehr hohe Sensitivität ist insofern nur schwer mit der hohen Sensitivität der vorliegenden Arbeit vergleichbar, da es sich weder um eine Zellinie kolorektalen Ursprunges noch um identische Kultivierungsbedingungen handelte. Auch Flatmark et al. (2002) erzielten eine hohe Sensitivität für den Nachweis epithelialer Markergene bei der Untersuchung von 12 Zellinien (Co205, HCT15, HCT116, Colo320DM, SW480, SW620, Caco2, HT29, WiDr, KM20L2, HCC2998 und Co115). Die verwandte Methodik unterschied sich jedoch grundsätzlich von derjenigen der vorliegenden Arbeit, da zuvor eine Zellseparation der Tumorzellen mit gekoppelten monoklonalen Antikörpern durchgeführt worden war. Von den immunologisch separierten Zellen reagierten 98 % positiv für das epitheliale Markergen. In den 7 Verdünnungsreihen aus 20, 100, 200 oder 1000 Co205-Zellen pro 10 PBMC konnten im Mittel 77% der Zellen wiedergefunden (engl. recovery) werden. Diese recht hohe Sensitivität wäre durch die immunomagnetische Separation und konsekutive Anreicherung der Tumorzellen zu erklären. Eine hohe Sensitivität der RT-PCR mit einem Lightcycler-basierten System zeigten auch Soong et al. (2001). CK20 konnte in HT29-Zellen ab einer Verdünnung von 1:105 Zellen (HL60-Zellen) detektiert werden. 4. Diskussion 49 Somit konnte auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden, daß die RTPCR in den durchgeführten Versuchen eine vielversprechende und äußerst sensitive Nachweismethode ist und dem jetzigen Goldstandard, der Immunzytochemie, wahrscheinlich gleichzusetzen ist. Durch die Experimente konnte des weiteren gezeigt werden, daß HT29 die höchste CK20-Expression von den drei untersuchten Zellkulturen hat. Diese Zellen wurden einer definierten Menge CK20-negativer Knochenmarkzellen beigemischt. Dabei stellte sich heraus, daß auch die Andersartigkeit des Milieus nicht dazu beitrug die Sensitivität zu senken. Hierbei lag die Nachweisgrenze ebenfalls bei 1:105 Knochenmarkzellen für HT29-Zellen. Obwohl alle humanen Zellkulturen nach dem gleichen Schema aufgearbeitet und ausgewertet Expressionsqualität wurden, der liegt einzelnen die Vermutung Zellinien sich nahe, daß untereinander die sehr unterscheiden kann und daher für die Detektion der unterschiedlichen Zellen von großer Bedeutung ist. Dies könnte ein Ansatz für weitere Studien sein, in denen die Bedeutung der unterschiedlichen Expression der Oberflächenmarker untersucht werden muß. Weitere publizierte Ergebnisse zeigen, daß der Nachweis einer CK20Expression im Blut und KM mittels PCR mit dem fortgeschrittenem Stadium eines kolorektalen Tumors (Weitz et al., 1998) und einer geringeren Überlebenszeit korrelierten (Lambrechts et al., 1998, Soeth et al., 1997). Schließlich wurden 30 Knochenmarksproben auf CK20-Expression getestet. Trotz hoher Sensitivität der molekularbiologischen Methode konnte in nur 15,4% der Fälle (2/13) CK20-Expression bei Patienten mit Kolonkarzinom nachgewiesen werden. In anderen Studien ließen sich 27 - 32% positive Ergebnisse in Kollektiven zwischen 88 - 277 Patienten aufweisen (Lindemann et al., 1992, Pantel et al., 1993, Schlimok et al., 1990). Aufgrund der geringen Fallzahl lassen sich die unterschiedlichen Ergebnisse allerdings nicht vergleichen. Hier wurde auch kein Zusammenhang zwischen CK20positiven Fällen und Tumorstadium gefunden. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich allerdings, daß drei Knochenmarkproben von Patienten ohne Kolonkarzinom positiv auf CK20 reagierten. Bei einigen Arbeitsgruppen wurde ein ebenso unerwartetes Ergebnis beobachtet, nämlich daß Patienten ohne Kolonkarzinom positiv auf 4. Diskussion 50 CK20 reagierten. Sie vermuteten eine Transkription von CK20 in den hämatopoetischen Zellen (Champelovier et al.,1999, Ko et al., 1998, Zippelius et al., 1997). Zweifel bezüglich der Spezifität und der Sensitivität kamen ebenso bei weiteren Arbeitsgruppen auf. Die Spezifität des Nachweisverfahrens wurde auf Grund der CK20-Expression in hämatopoetischen Zellen in Frage gestellt, zumal nur eine geringe Anzahl von Tumorzellen im Patientenmaterial nachweisbar ist (van Houten et al., 2000, Jung et al., 1998, Schittek et al., 1999). Um eine mögliche Transkription von CK20 aus hämatopoetischen Zellen zu vermeiden, wurde bei allen Aufarbeitungen ein Ficoll-Gradient genutzt, um Zellpopulationen aufzureinigen und mögliche Fehler auszuschalten. Eine mögliche Ursache für falsch-positive Ergebnisse in Kontrollgruppen könnte zum einen die große Heterogenität der Tumoren sein (Pantel et al., 1993) und zum anderen die Down-Regulation von Zytokeratinen. Daher ist es nötig, die Spezifität der Nachweisverfahren weiter zu verfeinern, da eine hohe Rate von falsch-positiven Ergebnissen eine Übertherapie der Patienten nach sich ziehen könnte. Lassmann et al. (2002) sehen daher die Rolle der CK20-Expression als Marker von Kolonkarzinomen und anderen Karzinomen bislang nicht ausreichend im Detail erarbeitet. Das Problem der bislang durchgeführten Studien ist, daß es noch keine standardisierten Verfahren zur Detektion der disseminierten Tumorzellen gibt. Diverse Ein- und Ausschlußkriterien von Patienten sowie Fallzahlen und verwendete Marker erschweren den Vergleich der zahlreichen Studien untereinander. Auch die unterschiedlichen Methoden (immunzytochemische und molekularbiologische) und Beobachtungszeiten verhindern es, eine einheitliche Aussage machen zu können. Prognosefaktoren wie Tumorgröße, Nodalstatus und histopathologisches Grading ermöglichen zwar eine grobe Risikoeinschätzung für das Auftreten eines Tumorrezidivs, lassen aber eine individuelle Diskriminierung der Therapiebedürftigkeit nicht zu. Daher kann ein Nachweis von disseminierten Tumorzellen, zusätzlich zur Beurteilung der Prognose, auch wichtige Informationen zum Ausmaß einer intraoperativen, mechanisch induzierten Tumorzellaussaat geben (Weitz et al., 1998, Weitz et al., 2000). Aber auch die Effektivität von adjuvanten Therapien durch 4. Diskussion 51 wiederholte Untersuchungen auf disseminierte Tumorzellen, sogenannte Surrogat-Marker, könnte dadurch bestimmt werden. Hinsichtlich der prognostischen Relevanz zeigt die folgende Tabelle einen Auszug einiger Arbeitsgruppen über Ansichten zur Bedeutung von disseminierten Zellen im Knochenmark und deren mögliche prognostische Relevanz. Tabelle 10: Prognostische Relevanz disseminierter Tumorzellen im Knochenmark von Patienten mit Kolonkarzinom Verschiedene Studien untersuchten die Tumorzelldissemination ins Knochenmark. Autor Flatmark et al. prognostische Patienten -zahl Detektionsrate (%) Marker Material 275 17 MOC31 Zytologie Relevanz Technik ImmunSeparation RT-PCR IZC einer Prognostische Bedeutung + Lassmann 97 63 CK Gewebe + et al. 95 Leinung et 167 24 CK Zytologie IZC + al. Leinung et 145 25 CK Zytologie IZC + al. Lindemann 88 32 CK18 Zytologie IZC + et al. Litle et al 18 45 CK20 Zytologie IZC Rosenberg 52 RT-PCR 85 CK Gewebe + et al. 55 IZC Schlimok et 156 27 CK18 Zytologie IZC + al. Soeth et al. 65 31 CK20 Zytologie RT-PCR + Vlems et 32 25 CK Zytologie RT-PCR al. Vogel et al. 295 31 CK Zytologie RT-PCR + Weitz et al. 30 27 CK Zytologie RT-PCR + CK: Cytokeratin (Zytokeratin); IZC: Immunzytochemische Färbung; MOC31: Monoklonaler Antikörper gekoppelt an Magnetkörnchen (Dynabeads M450). Die meisten Arbeitsgruppen (siehe Tab. 10) vertreten die Meinung, daß unabhängig von der Methode, ein Nachweis von disseminierten Tumorzellen eine prognostische Relevanz hat. Allerdings steht die Arbeitsgruppe um Litle et al. (1997) diesem Standpunkt eher kritisch gegenüber. Trotz einer Detektionsrate von 45 % der CK20-Zellen im KM bei Kolonkarzinompatienten mit der immunzytochemischen Methode, sind sie der Meinung, daß es 4. Diskussion 52 unsicher sei, ob gerade diese Zellen vom Primärtumor abstammen, da auch CK18 häufig bei rektalen Karzinomen nachgewiesen wurde. Vlems et al. (2003) untersuchte die CK20-Expression bei Kolonkarzinompatienten mit der RT-PCR. Dabei waren lediglich 6 von 41 peripheren Blutproben und 8 von 32 Knochenmarkproben CK20 positiv. Die Ergebnisse zeigten keine Korrelation zwischen CK20-positiven Ergebnissen im peripheren Blut, KM und beim späteren Tumorrezidiv. Das relativ kleine Patientenkollektiv trägt sicherlich dazu bei, daß bezüglich der prognostischen Relevanz keine sicheren Aussagen gemacht werden können. Der Nachweis disseminierter Tumorzellen stellt ein viel versprechendes Konzept in der onkologischen Diagnostik dar, wenngleich die noch sehr begrenzten Ergebnisse der klinischen Studien in keine eindeutige Richtung zu weisen scheinen. Das individuelle Rezidivrisiko und die Therapieüberwachung mittels spezieller Marker ist Voraussetzung für eine zuverlässige Einschätzung der individuellen Prognose, welche durch eine große Fallzahl und lange Nachbeobachtungszeit der Patienten realisiert werden könnte (Weitz et al., 2000). Die Durchführung von klinischen Studien, zum Nachweis des Nutzens einer in diesem Sinne geänderten Therapiestrategie, ist daher von besonderer Bedeutung (Weitz und Herfarth, 2001, Ellis, 2000). Zielsetzung weiterer Studien müßte es sein, den Nachweis disseminierter Tumorzellen in die Indikationsstellung zur adjuvanten Therapie mit einzubeziehen. Es macht Sinn, diesen Ansatz konsequent weiter zu verfolgen, da die noch zahlreichen Informationen, die durch den Nachweis disseminierter Tumorzellen zu gewinnen sind (Prognose, biologische Charakterisierung disseminierter Tumorzellen, intraoperative Tumorzellaussaat, Surrogat-Marker), zu einem erweiterten Tumorstaging beitragen können und als klinisch relevanter Prognosefaktor einen wesentlichen Fortschritt in der Therapie von Karzinompatienten darstellen könnte. 5. Zusammenfassung 53 5. Zusammenfassung Es hat sich gezeigt, daß eine frühzeitige Metastasierung von Kolonkarzinomen in das Knochenmark mit einem signifikant verkürzten Überleben oder aber mit einem disease free survival vergesellschaftet ist. Diese tumor-biologische Entität wird gegenwärtig in der geläufigen TNMKlassifikation nicht oder nur unzureichend berücksichtigt. Um jedoch innovative und effektive adjuvante Therapie-Konzepte beim kolorektalen Karzinom zu etablieren, versuchten wir eine Methodik zu etablieren, die einfach, schnell, zuverlässig und reproduzierbar bereits geringste Mengen epithelialer Markergene auf der mRNA-Ebene im Vergleich zur Immunzytochemie nachweisen läßt. Hierzu etablierten wir die hoch sensitive quantitative RT-PCR für das epitheliale Markergen Cytokeratin20. Initial testeten wir die Sensitivität unseres Meßverfahrens an in vitro in Aqua destillata verdünnten RNAProben. Hierbei gelang eine äußerst sensitive Detektionsmethode, so daß CK20-RNA bereits ab einer Verdünnung von 0,1 ng aus einzelnen CK20positiven Zellen mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Daraufhin übertrugen wir unser Testverfahren auf eine der Realität angemessene Umgebung, indem wir eine serielle Verdünnung CK20-positiver Kolonkarzinomzellen in mononukleären Zellen aus peripherem Blut isoliert durchführten. Die Verdünnung unserer zu detektierenden Karzinomzellen gelang mit vergleichbar hoher Sensitivität, wie die zuvor durchgeführte Verdünnung in Wasser. Es läßt sich somit festhalten, daß die PCR für zirkulierende CK20-positive Zellen im peripheren Blut nicht durch eventuell ko-zirkulierender Inhibitoren kompromittiert wurde. Da Knochenmark sich in seiner Zusammensetzung jedoch erheblich vom peripheren Blut auch insbesondere hinsichtlich seines Fettgehaltes unterscheidet, verdünnten wir schließlich die zuvor genau definierten CK20positiven Kolonkarzinomzellen in einem CK20-negativen Knochenmark. Hierbei konnten wir feststellen, daß die Sensitivität der Detektionsmethode aufgrund des andersgearteten Milieus mit einem höheren Fettgehalt an Sensitivität nicht verliert. 5. Zusammenfassung 54 Im Knochenmark verdünnte humane Kolonkarzinomzellen ließen sich nicht mit geringerer Empfindlichkeit nachweisen als im peripheren Blut oder Wasser verdünnte RNA dieser Zellen. Die Sensitivität bemaß sich auf ein Minimum von 10 HT29-Zellen, die in 1 Mio. mononukleären Zellen aus dem Knochenmark isoliert beigefügt werden mußten, um eine sichere Detektion mit der quantitativen RT-PCR zu gewährleisten. Hiermit lag die Sensitivität der Detektion etwa gleich hoch wie der gegenwärtige Goldstandard, der die Verwendung eines PanzytokeratinAntiserums zur immunzytochemischen Färbung epithelialer Karzinomzellen vorsieht. Hierbei konnten wir zeigen, daß eine kritische Determinante für die Bestimmung einer frühzeitigen Tumordissemination in das Knochenmark die Expressionshöhe innerhalb einer Zelle für das CK20-Gen ist. So unterschieden sich unsere drei humanen Kolonkarzinomzellen um den Faktor 10-100 in Bezug auf die mRNA-Expression für das CK20-Gen. Dieser Umstand muß ebenfalls bei der Interpretation der erhaltenen Befunde berücksichtigt werden. In der Zusammenfassung muß daher festgehalten werden, daß die CK20mRNA-Expression diagnostisches ein sicheres, Werkzeug zur zuverlässiges frühzeitigen und reproduzierbares Tumordissemination von Kolonkarzinomzellen in das Knochenmark ist. Hierbei unterliegt die Methode keiner Interobserver-Variabilität definierten Nachweisgrenze immunzytochemische Messung aufgrund der mathematisch (crossing-point), epithelialer während Markergene genau die durchaus diskussionsbedürftige Intermediärergebnisse und eine höhere InterobserverVariabilität nach sich zieht. Literaturverzeichnis VI LITERATURVERZEICHNIS ANDRE, T., BONI, C., MOUNEDJI-BOUDIAF, L., NAVARRO, M., TABERNERO, J., HICKISH, T., TOPHAM, C., ZANINELLI, M., CLINGAN, P., BRIDGEWATER, J., TABAHFISCH, I., DE GRAMONT, A. (2004). Oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer. N Engl J Med 350, 2343-51 BACHER, A., GRIEBL, K., MACKAMUL, S., MITREITER, R., MUCKTER, H., BEN SHAU, Y. (1992). 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Schmidt danke ich für die Möglichkeit der Durchführung der Versuche in seinem molekularbiologischen Labor. Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Priv.-Doz. Dr. med. Frank Schmitz für die freundliche Überlassung des Themas und die ständige Mitbetreuung der Experimente sowie die immense Motivation bei der Durchführung und Auswertung der Ergebnisse. Ein ganz großer Dank gebührt dem leitenden Laborassistenten Rainer Lebert und Herrn Dr. med. Nikolaus Ansorge für die Einführung in laborexperimentelles Arbeiten. Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern im Labor des St. JosefHospitals-Universitätsklinik Bochum bedanken, die am Gelingen der Arbeit unterstützend mitgewirkt haben. Meinen Eltern und Geschwistern gebührt großer Dank für ihre Unterstützung und Geduld. Ich danke besonders meinem Mann, für die zahlreichen fruchtbaren Disskussionen und kritische Durchsicht des Manuskriptes. Lebenslauf XXI LEBENSLAUF Persönliche Daten: Name: Markota, Young-Ran (geb. Suh) Geburtstag: 06.02.1975 Geburtsort: Wuppertal Familienstand: verheiratet Nationalität: deutsch Schulbildung: 1981-1984: Rudolf-Steiner-Schule, Wuppertal 1984-1985: Grundschule Elfenhang, Wuppertal 1985-1994: Gymnasium Vohwinkel, Wuppertal 06/1994: Allgemeine Hochschulreife Berufsausbildung: 1994-1997: Ausbildung zur medizinisch-technischenLaboratoriumsassistentin, MTA-Schule der Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf 09/1997: Examen zur staatlich anerkannten MTLA Studium: 1997-2004: Studium der Humanmedizin Universität Bochum 05/2004: Medizinisches Staatsexamen an der Ruhr- Lebenslauf XXII Praktisches Jahr: 1. Tertial: Innere Medizin Bethesda Krankenhaus Wuppertal Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. B. Sanner 2. Tertial: Dermatologie St. Josef-Hospital Bochum Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. P. Altmeyer 3. Tertial: Chirurgie Bethesda Krankenhaus Wuppertal Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. D. K. Wilker Facharztausbildung: Dermatologische Gemeinschaftspraxis Dres. P. Dorittke und B. Kardorff, Mönchengladbach 01.07.2004 – 31.07.2006 Artemed Fachklinik Prof. Dr. Dr. K. Salfeld GmbH & Co. KG Bad Oeynhausen seit 01.08.2006
