Antivirale Therapie gegen Adenoviren mittels
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„Antivirale Therapie gegen Adenoviren mittels löslicher Coxsackievirus- und Adenovirus-RezeptorVarianten“ vorgelegt von Diplom-Biochemiker Carsten Röger geb. in Leipzig von der Fakultät III - Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Neubauer Gutachter: Prof. Dr. Jens Kurreck Gutachter: Prof. Dr. Claus-Thomas Bock Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 07.07.2015 Berlin 2015 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ............................................................................... I Abkürzungsverzeichnis ..................................................................... V 1. Einleitung ......................................................................................... 1 1.1. Adenoviren ................................................................................................. 1 1.1.1. Infektion und Replikation ................................................................................... 2 1.1.2. Klinische Bedeutung und Therapie von Adenovirusinfektionen ....................... 3 1.2. Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) ............................... 5 1.3. Lösliche Rezeptormoleküle als antivirale Therapie................................... 6 1.4. Antivirale Therapie mittels RNA-Interferenz ............................................ 8 1.5. Virale Vektoren ........................................................................................ 11 1.6. Zielstellung ............................................................................................... 14 2. Materialien .................................................................................... 16 2.1. Geräte ....................................................................................................... 16 2.2. Chemikalien ............................................................................................. 17 2.3. Molekularbiologische Kits und Testsysteme ........................................... 17 2.4. Enzyme ..................................................................................................... 18 2.5. Plasmide ................................................................................................... 18 2.6. Virale Vektoren ........................................................................................ 19 2.7. Oligonukleotide ........................................................................................ 20 2.8. Bakterienstämme ...................................................................................... 21 2.9. Medien für Bakterienkulturen .................................................................. 21 2.10. Pufferlösungen Molekularbiologie ........................................................ 22 2.11. Größenmarker......................................................................................... 22 2.12. Real-time PCR-Assays ........................................................................... 22 2.13. Lösungen für die AAV-Vektorproduktion............................................. 22 2.14. Lösungen für Virusreinigung ................................................................. 23 2.15. Westernblotpuffer und -lösungen........................................................... 23 2.16. Westernblot Antikörper .......................................................................... 24 2.17. Medium für Plaque-Assay...................................................................... 24 Inhaltsverzeichnis II 2.18. Zelllinien ................................................................................................ 24 2.19. Zellkulturmedien .................................................................................... 25 3. Methoden ....................................................................................... 26 3.1. Arbeiten mit Bakterien ............................................................................. 26 3.1.1. Herstellung chemokompetenter Bakterienzellen .............................................. 26 3.1.2. Transformation chemokompetenter Bakterienzellen........................................ 26 3.2. Klonierungen ............................................................................................ 26 3.3. Molekularbiologische Methoden.............................................................. 27 3.3.1. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ............................................... 27 3.3.2. Isolierung von Plasmid-DNA ........................................................................... 28 3.3.3. Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben ................................................. 28 3.3.4. Isolierung von RNA aus Geweben ................................................................... 28 3.3.5. cDNA-Synthese über reverse Transkription..................................................... 29 3.3.6. Real-time PCR zur Quantifizierung der mRNA-Expression ............................ 29 3.3.7. Real-time PCR zur Quantifizierung von Adenovirus-Genomen ...................... 29 3.3.8. Real-time PCR zur Quantifizierung der 18 S rRNA ........................................ 30 3.4. Proteinchemische Methoden .................................................................... 30 3.4.1. Westernblot ....................................................................................................... 30 3.4.2. Luciferase-Assay .............................................................................................. 31 3.4.3. Nachweis von sCAR-Fc mittels ELISA ........................................................... 31 3.4.4. Nachweis von Leberenzymen ........................................................................... 31 3.5. Zellbiologische Methoden ........................................................................ 32 3.5.1. Zellkultur .......................................................................................................... 32 3.5.2. Zellviabilität mittels Kristallviolettfärbung (Cell-Killing-Assay) .................... 32 3.5.3. Transfektion ...................................................................................................... 33 3.5.4. Transduktion ..................................................................................................... 33 3.6. Virologische Methoden ............................................................................ 33 3.6.1. Anzucht von Adenovirus 2 und 5 für in vitro Versuche................................... 33 3.6.2. Anzucht und Reinigung von Ad5 für in vivo Versuche.................................... 34 3.6.3. Bestimmung des Adenovirus-Titers durch Plaque-Assay ................................ 35 3.7. Produktion Adeno-assoziierter Virusvektoren (AAV-Vektoren) ............ 35 3.7.1. Produktion von AAV-Vektoren........................................................................ 35 3.7.2. Reinigung von AAV-Vektoren über Iodixanolgradienten ............................... 37 3.7.3. Konzentrierung der AAV-Vektoren ................................................................. 37 3.7.4. Quantifizierung der AAV-Vektoren ................................................................. 38 3.8. In vivo Mausexperimente ......................................................................... 38 Inhaltsverzeichnis III 3.8.1. Applikation von Vektoren und Viren ............................................................... 38 3.8.2. Einleitung einer Immunsuppression ................................................................. 39 3.8.3. Gewinnung von Blutproben.............................................................................. 39 3.8.4. Organentnahme und -begutachtung .................................................................. 39 3.9. Statistik ..................................................................................................... 40 4. Ergebnisse ...................................................................................... 41 4.1. Antivirales Potential von solublen CAR-Varianten (in vitro) ................. 41 4.1.1. Herstellung und Validierung des antiviralen Potentials verschiedener solubler CAR-Varianten ............................................................................................................. 41 4.1.2. Einfluss der Struktur von solublen CAR-Varianten auf ihre antiviraleWirkung 44 4.1.3. Konzentrationsabhängigkeit der antiviralen Wirkung von sCAR-Fc............... 48 4.1.4. Mechanismus der adenoviralen Inhibierung durch sCAR-Fc .......................... 50 4.2. Anti-adenovirale Wirkung von sCAR-Fc gegen Wildtyp-Adenoviren (in vitro)........................................................................................................... 51 4.2.1. Herstellung von sCAR-Fc für die Virusversuche ............................................. 51 4.2.2. Protektive Wirkung von sCAR-Fc bei Adenovirusinfektionen ........................ 53 4.2.3. Dosiseskalationsstudie ...................................................................................... 55 4.2.4. Antivirale Wirkung von sCAR-Fc in der Leberzelllinie .................................. 56 4.2.5. Therapeutischer Einsatz von sCAR-Fc gegen Adenoviren .............................. 56 4.3. Inhibierung der Ad-Infektion mittels sCAR-Fc im Tiermodell ............... 58 4.3.1. Herstellung optimierter scAAV2/9-Vektoren für den Einsatz im Mausmodell .................................................................................................................. 58 4.3.2. Langzeitexpression von sCAR-Fc via scAAV2/9-Vektor................................ 63 4.3.3. Anti-adenovirale Wirkung von sCAR-Fc im immunsupprimierten Mausmodell .................................................................................................................. 66 4.4. Kombination von sCAR-Fc mit Cidofovir und siRNAs zur Inhibierung von Ad-Infektionen (in vitro) .......................................................................... 74 4.4.1. Kombination sCAR-Fc und Cidofovir (CDV) ................................................. 74 4.4.2. Kombination sCAR-Fc und siRNAs ................................................................ 77 4.4.3. Dreifachkombination sCAR-Fc, Cidofovir und siRNAs .................................. 78 5. Diskussion ...................................................................................... 80 5.1. Anti-adenovirales Potential von sCAR-Fc in vitro und in vivo ............... 80 5.2. Kombination von sCAR-Fc mit Cidofovir und siRNAs als Therapie gegen Ad-Infektionen ...................................................................................... 87 5.3. Ausblick.................................................................................................... 90 6. Zusammenfassung ........................................................................ 91 Inhaltsverzeichnis IV 7. Summary........................................................................................ 93 8. Literaturverzeichnis ..................................................................... 95 9. Anhang ......................................................................................... 119 Anhang A: Vektorkarten und Vektorkonstruktionen.............................. 119 Anhang B: Publikationsliste.................................................................... 129 Anhang C: Danksagung .......................................................................... 130 Anhang D: Eidesstattliche Erklärung...................................................... 131 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A Adenin AAV Adeno-assoziiertes Virus Ad Adenovirus/Adenoviren Abb. Abbildung AdV Adenovektor amiRNA artifizielle microRNA Amp Ampicillin bp Basenpaare BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. cirka CAR Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptor CD cluster of differentiation cDNA complementary (komplementäre) DNA CMV Cytomegalievirus CPE cytopathic effect Ct treashhold cycle CVB3 Coxsackievirus B3 DAF decay accelerating factor, CD55 dATP Desoxyadenosin-5’-triphosphat dCTP Desoxycytidin-5’-triphosphat ddH2O doppelt destilliertes Wasser dest. destilliert DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dGTP Desoxyguanosin-5’-triphosphat dNTP Desoxynukleosidtriphosphat Dox Doxyzyklin DTT Dithiothreitol dTTP Desoxythymidin-5’-triphosphat V Abkürzungsverzeichnis dUTP Desoxyuridin-5’-triphosphat E260 Extinktion bei 260 nm E280 Extinktion bei 280 nm ECL enhanced chemiluminescence, verstärkte Chemilumineszenz E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay et al. et altera Fc fragment of crystallization FKS fötales Kälberserum g Erdbeschleunigung bzw. Gramm ggf. gegebenenfalls GFP green fluorescent protein, grün-fluoreszierendes Protein h Stunde HEK human epithelial kidney HIV human immunodeficiency virus, humanes Immundefizienz-Virus HRP horseradish peroxydase, Meerrettichperoxidase Ig Immunglobulin IgG Immunglobulin der Gruppe G IL Interleukin i.p. intraperitoneal ITR inverted terminal repeat i.v. intravenös kb Kilobasenpaare kDa Kilo-Dalton l Liter LB-Medium Luria-Bertani-Medium luc Luciferase M Molarität/molar (mol/l) mA Milliampere mg Milligramm min Minute ml Milliliter mm Millimeter VI Abkürzungsverzeichnis mM millimolar (mmol/l) mRNA messenger RNA miRNA microRNA MOI multiplicity of infection µg Mikrogramm µl Mikroliter NaAcetat Natriumacetat nm Nanometer n.s. nicht sifnifikant nt Nukleotid OD optische Dichte PBS phosphored buffer saline PBS-MK PBS mit MgCl2 und KCl PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) Pfu plaque forming units pH Negativ dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration p.i. post infection, nach der Infektion qPCR quantitative PCR RISC RNA induced silencing complex RLU relative light units RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA-Interferenz rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur RT-PCR reverse Transkriptions-PCR sc self-complementary, selbstkomplementär sCAR soluble CAR, lösliches CAR sec Sekunde s.g. so genannt shRNA short hairpin RNA siRNA small interfering RNA ss single stranded, einzelsträngig T Thymin Tab. Tabelle VII Abkürzungsverzeichnis TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBS TRIS buffered Saline TBST TRIS buffered Saline with Tween 20 TE Tris-EDTA-Puffer Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan Tween 20 Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat V Volt Vol. Volumen U Unit UV Ultraviolett VG Vektor- oder Virusgenome Wt Wildtyp z.B. zum Beispiel VIII 1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1. Adenoviren Humane Adenoviren (Ad) gehören dem Genus Mastadenovirus aus der Familie der Adenoviridae an und beinhaltet zurzeit 57 humanpathogene Spezies, welche in 7 Untergruppen (A bis G) unterteilt sind (ICTV, Stand 2014). Der Name „Adenovirus“ leitet sich von dem Umstand ab, dass die Viren 1953 von Wallace P. Rowe aus Tonsillen und anderen adenioden Geweben isoliert wurden (1). Das unbehüllte Virion mit einem Durchmesser von 65 – 80 nm besteht aus zwei Struktureinheiten (2). Zum einen aus dem ikosaedrischen Nukleokapsid und zum anderen dem Nukleoproteinkomplex (Abb. 1.1). Der Nukleoproteinkomplex beinhaltet das lineare doppelsträngige DNA-Genom, welches mit einer Größe von ungefähr 36 kb. für mehr als 40 Struktur- und Nichtstrukturproteine kodiert. Das Kapsid besteht aus 252 Kapsomeren, wobei 240 von dem Hexonprotein und 12 durch das Pentonprotein gebildet werden. Das Pentonprotein bildet die Basis für die Fiber, welche abhängig vom Serotyp unterschiedliche Längen aufweist (3, 4). Am äußersten Ende der Fiber befindet sich die Knob-Domäne, welche für die Interaktion mit Rezeptoren der Zielzellen essentiell ist (5–7). Abb. 1.1: Schema der Struktur eines Adenovirus-Partikel Die Strukturproteine Hexon und Penton bilden die typische ikosaedrische Form des äußeren Nukleokapsids. Das Penton-Protein bildet dabei die Basis für die Fiber welche über die Knob-Domäne mit zellulären Rezeptoren interagiert. Im Inneren des Nukleoproteinkomplexes befindet sich das lineare doppelsträngige DNA-Genom. (Abbildung modifiziert nach Glasgow et al., 2006 (8)) 1. Einleitung 2 Der Gewebetropismus der Ad ist stark vom Serotyp abhängig. Am häufigsten treten Infektionen des respiratorischen (Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7) und des gastrointestinalen Systems (Ad40, Ad41) auf (3, 9, 10). Aber auch Infektionen des Auges (11–13), des Herzens (14), der Nieren und des Gehirns können mit Ad in Verbindung gebracht werden (15). 1.1.1. Infektion und Replikation Die Infektion der Zielzelle durch Ad beginnt mit der Bindung der Knob-Domäne des Ad (Serotypen A und C-F) an die D1-Domäne des membranständigen Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) (16–18). Ad des Serotypes B nutzen CD46 als Rezeptor (19–21). Anschließend interagieren αvβ3- und αvβ5-Integrine mit den Pentonproteinen des Ad, was zu einer rezeptorvermittelten Endozytose über Clathrin-bedeckte Vesikel führt und das Virus wird in die Zelle internalisiert (22–25). Das Virus wird aus dem Endosomen in das Zytoplasma entlassen, wo es disassembliert wird bevor das virale Genom in den Nukleus geschleust wird (26–28). Das adenovirale Genom besteht aus einer ungefähr 36 kb großen linearen doppelsträngigen DNA, welche durch flankierende inverted terminal repeats (ITR) an den 5´- und 3´- Enden begrenzt wird (4, 29). Die virale Replikation beginnt ungefähr 6 bis 8 Stunden nach der Infektion. Die mehr als 40 Struktur- und Funktionsproteine sind auf beiden Strängen des Genoms in mehreren sich überlappenden Transkriptionseinheiten organisiert (Abb. 1.2) (3, 30). Abb. 1.2: Schema der Struktur des adenoviralen Genoms Das 36 kb große Genom ist unterteilt in 4 frühe (early) Transkriptionseinheiten (E1 – E4) und 5 späte (late) alternative Spleißprodukte (L1 – L5) welche durch den major late promotor (MLP) exprimiert werden. Flankiert wird das Genom durch inverted terminal repeats (ITR). Der mit (Ψ) bezeichnete Bereich des Genoms stellt das Verpackungssignal dar, welches an der Verpackung des Genoms in das Kapsid beteiligt ist. (Abbildung nach Amanda Rosewell, Francesco Vetrini, and Philip Ng, 2011 (30)) 1. Einleitung 3 Dabei werden die exprimierten Proteine entsprechend ihrem Auftreten in verschiedene Phasen eingeteilt. So gibt es frühe (early; E1, E2, E3 und E4), verzögerte (IVa, IX, VAI, VAII) und späte (late; L1 – L5) Proteine (31). Eine Vielzahl dieser Gene ist für die adenovirale Replikation essentiell. Auf drei dieser Proteine soll besonders eingegangen werden, da sie in im Rahmen dieser Promotionsarbeit durchgeführten Untersuchungen zur Wirksamkeit einer RNA Interferenz (RNAi) basierten anti-adenoviralen Therapie herangezogen wurden. So sind die ersten Proteine, welche nach der Translokation des adenoviralen Genoms in den Nukleus exprimiert werden, die E1A-Proteine. Diese haben eine duale Funktion. Einerseits dysregulieren sie den zellulären Metabolismus insbesondere durch Interaktion mit dem Tumorsuppressorgen pRB (4, 32–34), welches regulatorische Eigenschaften im Zellzyklus besitzt. Zusätzlich werden weitere adenovirale und zelluläre Promotorentransaktiviert. Aufgrund der Funktion als Initiator der viralen Replikation führt das Fehlen des E1A-Gens zu replikationsdefizienten Ad, die als Vektoren in der Gentherapie einen weiten Einsatz erfahren haben (35). Ein weiteres essentielles adenovirales Protein ist IVa2. Dieses steuert durch seine Bindung an den major late promotor (MLP), die Expression der späten adenoviralen Proteine (36) und wirkt außerdem an der Bildung des Kapsids sowie der Verpackung des Ad-Genoms in das Kapsid mit. Ad denen das IVa2-Gen fehlt sind nicht in der Lage Kapside zu bilden (37, 38). Auch das Gen für die adenovirale Polymerase (Pol) ist essentiell für die Virusvermehrung, da diese die gesamte adenovirale Replikation vermittelt. Ist der komplette Replikationszyklus abgeschlossen, wird die Zelle lysiert, die neugebildeten viralen Partikel werden frei und können weitere Zellen infizieren. Ein gesamter Replikationszyklus dauert ungefähr 24 bis 36 Stunden und bringt ca. 104 neue Viren je infizierter Zelle hervor (30). 1.1.2. Klinische Bedeutung und Therapie von Adenovirusinfektionen Infektionen mit Adenoviren zeigen beim Menschen meist einen akuten aber dennoch milden Krankheitsverlauf. Der Gewebetropismus hängt dabei stark vom Serotyp ab. So verursachen die Ad Serotypen Ad1, Ad2 und Ad5 (Subgenus C), Ad3 und Ad7 (Subgenus B) und Ad4 (Subgenus E) Erkrankungen des respiratorischen Systems, die Serotypen Ad40 und Ad41 (Subgenus F) gastrointestinale Erkrankungen und die Serotypen Ad8 und Ad37 (Subgenus D) Keratokonjunktividen (12, 13). Daneben werden auch Myokarditiden, Enzephalitiden und Nephritiden beobachtet (14, 15). Die Ad werden in der Regel durch neutralisierende Antikörper vom Immunsystem bekämpft und eliminiert. Es besteht allerdings die 1. Einleitung 4 Möglichkeit, dass Ad latent über Jahre in lymphoidem und renalem Gewebe persistieren können (39). Patienten mit intaktem Immunsystem haben meist keine Schwierigkeiten eine Ad-Infektion ohne Komplikationen zu überstehen. Allerdings kann eine Ad-Infektion bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem zu schwerwiegenden und mitunter auch tödlichen Krankheitsverläufen führen. Am häufigsten tritt dies bei Rezipienten von Organtransplantaten bei gleichzeitiger Immunsuppression auf (40). Die größte Gruppe stellen dabei Kinder nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSCT) dar (41, 42), aber auch Patienten mit akuter Leukämie und HIV (human immunodeficiency virus) -Infizierte gehören zur Risikogruppe (43). Der Übertragungsweg der Ad-Infektion ist zum einen die direkte Übertragung vom Organspender über das Transplantat auf den Empfänger, zum anderen die Reaktivierung einer latenten Ad-Infektion durch die Suppression des Immunsystems des Empfängers (44–49). Das Risiko einer Ad-Infektion bei einer Organtransplantation liegt bei ungefähr 12% – 30%, während die Mortalitätsrate zwischen 7% und 70% liegt (50, 51). Die Krankheitsbilder die in Folge einer schweren Ad-Infektion bei immunsupprimierten Patienten auftreten sind sehr unterschiedlich und reichen von hämorrhagischer Zystitis, Pneumonie, Pankreatitis und Nephritis bis zur Hepatitis, wobei letztere die am häufigsten auftretende Komplikation darstellt. Obwohl schwere Krankheitsverläufe für alle Ad-Serotypen bekannt sind, zeigen doch vor allem die Spezies des Serotyp C (Ad1, Ad2 und Ad5) tödliche Verläufe (13, 41, 52), die häufig durch akutes Leberversagen verursacht werden (46, 48, 51–55). Zurzeit gibt es keine für die klinische Anwendung zugelassene anti-adenovirale Therapie. Die Therapie beschränkt sich daher zum einen auf die symptomatische und unspezifische Behandlung, wie die intravenöse Gabe von Immunglobulinen und die Reduktion der Immunsuppression, wobei dabei die Gefahr einer Abstoßung des erhaltenen Organs jedoch ansteigt (56–58). Zum anderen besteht die Möglichkeit der Verabreichung des antiviralen Medikaments Cidofovir (CDV). CDV ist ein azyklisches Nukleotidphosphat CytosinAnalogon, welches durch vorzeitige Termination die korrekte adenovirale DNA-Replikation stört (59, 60). Allerdings wirkt CDV auch nephrotoxisch und kann daher nur begrenzt eingesetzt werden. Eine Weiterentwicklung stellt dabei CMX001 dar. Dieses CDV-Derivat zeigt eine bessere Bioverfügbarkeit, niedrigere Nephrotoxizität und eine höhere Wirksamkeit gegen Ad des Subgenus A, B, C und D in vitro (40, 61). In verschiedenen Studien konnte zuletzt gezeigt werden, dass CMX001 im immunsupprimierten Patienten effektiver wirkt als CDV. Allerdings wurde dabei nicht die Überlebensrate sondern nur die Überlebensdauer erhöht, was zeigt, dass auch CMX001 noch keine wirkliche Therapie von Ad-Infektionen 1. Einleitung 5 darstellt (40, 62, 63). Zusätzlich zu diesen Standardtherapien werden Ad-spezifische T-Zellen zur Behandlung von immunsupprimierten Patienten verabreicht. Diese Therapieform befindet sich allerdings noch in der Erprobung (64). 1.2. Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) Ad nutzen verschiedene Rezeptormoleküle auf der Oberfläche von Zellen, um diese zu infizieren. Eines davon ist der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR), ein Transmembranprotein der IgG-Superfamilie, welcher von Ad zum Anheften an die Zelle genutzt wird, um anschließend durch Integrine in die Zelle internalisiert zu werden (17, 65). Im Gegensatz dazu, nutzen Coxsackieviren (CV) CAR direkt als Internalisierungsrezeptor (17, 66). Das humane CAR-Gen ist auf Chromosom 21 (21q11.2) lokalisiert und kodiert mit 7 Exons für das aus 346 Aminosäuren bestehende CAR-Protein (67). Die Molekülmasse der Aminosäurekette von CAR beträgt dabei 38 kDa, wobei sich durch Glykosylierungen eine Molekülmasse von 46 kDa ergibt (68). CAR besteht neben einem phosphorylierbaren intrazellulären Bereich (69, 70) und der Transmembrandomäne, welche das Protein in der Zellmembran verankert, aus einem extrazellulären Bereich, welcher durch zwei Ig-like Domänen gebildet wird (Abb. 1.2) (66). Während die D1-Domäne nachweislich für die Bindung von Ad und CV essentiell ist (71), konnte der D2-Domäne noch keine konkrete Funktion zugeordnet werden (72, 73). Abb. 1.2: Schematische Darstellung von CAR Der extrazelluläre Bereich von CAR wird von den beiden Ig-like Domänen D1 und D2 gebildet. Die Transmembrandomäne (TM) verankert das Rezeptormolekül in der Zellmembran. Die intrazelluläre Domäne (ICD) kann phosphoryliert werden und ist daher möglicherweise in die intrazelluläre Signaltransduktion eingebunden. (Abbildung modifiziert nach Coyne and Bergelson, 2005 (71)) Die D1-Domäne hat neben der Virusbindung auch die Eigenschaft mit anderen D1-Domänen von CAR-Proteinen in Kontakt zu treten und Dimere zu bilden (74). Diese Eigenschaft und auch das Vorkommen von CAR in Zell-Zell-Kontaktstellen, wie den tight junctions von Epithelzellen, lassen vermuten, dass CAR maßgeblich an der Ausprägung von Zell-Zell- 1. Einleitung 6 Kontakten und komplexer zellulärer Strukturen beteiligt ist (71). Besonders deutlich wird dies bei der embryonalen Entwicklung des Herzens und des Hirns. CAR ist in dieser Entwicklungsperiode besonders stark in diesen Organen exprimiert. Das Fehlen von CAR, zum Beispiel in CAR knock out Mäusen, führt zu einer embryonalen Letalität, da schwerwiegende Fehlentwicklungen im kardialen System auftreten (75, 76). Selbst die Induktion eines CAR knock out in einem adulten Tier führt zu verschiedenen Fehlfunktionen des kardialen und anderer Organsysteme (77, 78). Dadurch wird deutlich, dass im Zuge einer anti-adenoviralen Therapie eine Inhibierung von CAR möglicherweise zum Auftreten von schwerwiegenden Nebenwirkungen führt. 1.3. Lösliche Rezeptormoleküle als antivirale Therapie Das Prinzip der antiviralen Therapie mittels solublen (löslichen) Rezeptormolekülen beruht darauf, die zellulären Proteine, welche von den Viren genutzt werden um in die Zielzellen zu gelangen, als lösliche Moleküle einzusetzen und so die Rezeptorbindungsstellen zu blockieren. Dabei kommt es zu einem Konkurrenzzustand zwischen der Bindung des Virus an den entsprechenden Rezeptor und der Bindung an das lösliche Rezeptormolekül. Ziel dieses Ansatzes ist das Verhindern oder das Erschweren der Internalisierung des Virus in die Zielzelle. Je nach Art des Virus wirken die solublen Rezeptormoleküle auf unterschiedliche Weise. Zum einen kann durch die Bindung eines solublen Rezeptormoleküls eine Konformationsänderung des Virus hervorgerufen werden, wodurch meist das Genom frei wird und das Virus an sich nicht mehr infektiös ist. Theoretisch könnte demnach die Bindung eines einzigen solublen Rezeptormoleküls ausreichen, um ein Viruspartikel zu neutralisieren. Als Beispiel ist hierbei die Bildung von altered particles (A-Partikel) des Coxsackievirus B3 (CVB3) zu nennen, welches CAR als Internalisierungsrezeptor benutzt (79–81). In diesem Zusammenhang konnte bereits die Wirksamkeit von löslichem CAR (sCAR-Fc) in einem klinisch relevanten Mausmodell bei der Coxsackievirus B3 (CVB3) Infektion des Herzens verdeutlicht werden. Im Ergebnis dieser Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass sCARFc die CVB3-Infektion des Herzens in vivo effektiv inhibieren kann und sich dadurch die Kontraktilität des Herzens signifikant verbessern lässt (82). Anderseits können auch lösliche Rezeptormoleküle genutzt werden, deren zelluläre Gegenstücke für ihre entsprechenden Viren nur als attachment-Rezeptoren dienen. So bindet CVB3 den decay accelerating factor (DAF) um in eine räumliche Nähe zum Internalisierungsrezeptor CAR zu gelangen (83). Beim Einsatz solcher solubler Rezeptorproteine wird eine Bindung an die zellulären Rezeptoren 1. Einleitung 7 durch das Abdecken der Rezeptorbindungsstellen des Virus mit löslichen Rezeptormolekülen und einer damit einhergehenden sterische Behinderung erschwert oder ganz verhindert. Dieser Vorgang folgt im Großen und Ganzen dem Mechanismus der kompetitiven Hemmung und ist demnach Abhängig von der Konzentration des löslichen Rezeptormoleküls und der Dosis des entsprechenden Virus. Somit muss für eine effektive Inhibierung jede Rezeptorbindungsstelle des Virus blockiert sein, da sonst über eine freie Kontaktstelle die Anheftung an die Zielzelle erfolgen kann. Daher ist es für diesen Mechanismus wichtig, dass die löslichen Rezeptormoleküle in einem Überschussverhältnis zu ihrem Virus vorliegen. Lösliche Rezeptormoleküle treten teilweise natürlich als alternative Splice-Varianten ihrer entsprechenden zellulären Rezeptoren auf oder können durch gentechnische Methoden generiert werden. Es konnte bereits gezeigt werden, dass solche gentechnisch generierten löslichen Rezeptor-Moleküle das Potential besitzen Virusinfektionen zu inhibieren (69, 84). Neben dem bereits gegen CVB3 eingesetzten sCAR-Fc wurde auch eine lösliche Variante des Poliovirusrezeptors erfolgreich zur Inhibierung des Poliovirus, welcher wie CVB3 zur Familie der Picornaviren gehört, eingesetzt (85). Ein weiteres Beispiel ist der Einsatz von löslichem CD46 gegen Masernviren (86, 87). Aber auch gegen HIV wurden lösliche CD4Rezeptormoleküle getestet (88–91). Dabei können diese rekombinant hergestellten solublen Rezeptorproteine in ihrer Struktur verändert werden, um verschiedene Eigenschaften zu verbessern. So fusionierte die Gruppe um Lim den extrazellulären Bereich des CAR mit dem Fc-Teil des humanen IgG1. Dabei entstand ein dimerisches Molekül in der Form eines Antikörpers, welches verbesserte Solubilisierung und Haltbarkeit aufwies (92). Die Fusion des extrazellulären Bereichs von CD46 mit der oktamerbildenden Domäne des C4 bindenden Proteins (C4bp) aus dem Komplementsystem führte zu einem oktameren solublen Rezeptormolekül, welches erfolgreich in vitro und in vivo gegen Masernviren eingesetzt wurde. Dabei war dieses Molekül effektiver als die monomerische soluble CD46 Variante, welche nur aus dem extrazellulären Bereich bestand. Soluble Rezeptorproteine lassen sich als rekombinante Proteine in Bakterien- und Säugerzellen und Hefen herstellen und nach Aufreinigung für Applikationen einsetzen. Dabei muss ermittelt werden, inwieweit die korrekte Struktur und Funktionalität des Proteins durch diese Herstellungs- und Aufreinigungsmethoden gewahrt bleibt oder ob es durch die Applikation zu Nebenwirkungen kommt (84, 93). 1. Einleitung 1.4. 8 Antivirale Therapie mittels RNA-Interferenz Der Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi) ist ein natürlicher, zellulärer Prozess der posttranskriptionalen Genregulation, welcher zuerst bei Caenorhabditis elegans (94) und seither bei verschiedenen weiteren Organismen nachgewiesen wurde (95, 96). Es konnte auch am Beispiel des Noramura-Virus gezeigt werden, dass RNAi als antivirale Strategie in Säugerzellen fungiert (97). Hervorgerufen wird dieser Mechanismus durch das Auftreten doppelsträngiger RNA (dsRNA)-Moleküle. Diese können sowohl exogenen (synthetische RNAs oder Intermediate der Replikation von RNA-Viren) als auch endogenen Ursprungs (microRNAs) sein (98). Im Zytoplasma werden dsRNA-Moleküle von Dicer, einer Ribonuklease vom Typ III, gebunden und durch dessen RNase-Aktivität in charakteristische 21 nt lange small interfering RNAs (siRNAs) prozessiert. Dabei bilden 19 Nukleotide einen doppelsträngigen Bereich, während an den 3´-Enden 2 ungepaarte Nukleotide überhängen (99, 100). Zusammen mit weiteren RNA-bindenden Proteinen, bilden Dicer und die siRNA den RISC-loading complex (101), welcher die siRNA anschließend zum RNA induced silencing complex (RISC) transportiert. Dort wird durch das Argonaut 2 Protein der passenger strandabgebaut. Dies geschieht auf Basis der Sequenz und der thermodynamischen Eigenschaften der beiden RNA-Stränge (102, 103). Nach der Degradierung des passenger strand verbleibt der guide strand im RISC, welcher dadurch aktiviert wird. Der aktivierte RISC kann nun im Zytoplasma an, zu dem guide strand der siRNA komplementären, einzelsträngigen RNA-Molekülen binden. Der zum guide strand komplementäre RNA-Strang wird anschließend durch die Endonuklease-Aktivität des im RISC befindlichen Ago-Proteins gespalten und in der Folge vollständig abgebaut (104). Ziele dieser siRNAs können exogene RNA-Transkripte von Viren oder Bakterien, ganze virale RNA-Genome oder endogene mRNAs sein. Durch den vollständigen Abbau der RNA-Transkripte wird die Expression der entsprechenden Proteine verringert, was letztendlich zu einem silencing der entsprechenden Gene führt. Um siRNAs effektiv in vivo nutzen zu können werden diese entweder als small hairpin RNAs (shRNAs), welche den sense und antisense Strang der siRNA als Haarnadelstruktur enthalten, eingesetzt (105, 106). Oder aber man nutzt artifizielle microRNAs (amiRNAs), bei denen sense und antisense Strang der siRNA in die Umgebung einer natürlich vorkommenden microRNA (miRNA) eingebettet sind (107). Sowohl shRNAs als auch amiRNAs können für den in vivo Einsatz effektiv von viralen Vektoren exprimiert werden. Die RNAi bietet die Möglichkeit zur Aufklärung von Gen-Funktionen ohne dass dafür extra Gene ausgeknockt werden müssten. Allerdings stellt die RNAi auch eine effektive Methode zur Bekämpfung von viralen Infektionen dar. 1. Einleitung 9 Es konnte für verschiedene Organismen (Pflanzen, Insekten, Säuger) gezeigt werden, dass die RNAi natürlicherweise zur Bekämpfung viraler Infektionen eingesetzt wird (97, 108–110). Daher wurde in verschiedenen Studien die Wirksamkeit von RNAi bei der Inhibierung von Virusinfektion untersucht und sowohl in vitro als auch in vivo für verschiedene Viren bestätigt. Hierzu zählen unter anderen HBV, HCV, HIV (111–113), Influenza Viren (114, 115) und Enterovirusinfektionen (116–118). Mögliche Ansatzpunktesind dabei die Inhibierung viraler Rezeptoren sowie das silencing zellulärer Gene, welche direkt oder indirekt an der viralen Replikation beteiligt sind. So konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation verschiedener Rezeptoren für das Hepatitis-C-Virus zu einer verringerten viralen Replikation in vitro führte (119). Ebenso konnte eine Inhibierung der CVB3-Infektion von bis zu 97%und eine Verbesserung der kardialen Funktion in vivo mit dem silencing von CAR durch small hairpin RNAs (shRNAs) erreicht werden (120, 121). Allerdings könnte das silencing zellulärer Gene zum Zwecke der Virusabwehr auch Nebenwirkungen haben, wenn die entsprechenden zellulären Komponenten weitere wichtige Funktionen erfüllen. So führte der knock out des CAR im Tiermodell in unterschiedlichen Entwicklungsstadien zu schweren Fehlfunktionen des kardialen und anderer Organsysteme (78). Daher stellt die direkte Inhibierung viraler Gene die bevorzugte Vorgehensweise dar, da hierdurch potentielle Nebenwirkungen seltener zu erwarten sind. Bei RNA-Viren kann der Mechanismus der RNAi direkt gegen das virale RNA-Genom eingesetzt werden. So konnten bereits in verschiedenen Studien die RNA-Viren HCV, HIV (122, 123) und CVB3 (124, 125) in vitro und in vivo mittels RNAi inhibiert werden. Beim Einsatz der RNAi gegen DNA-Viren, wie den Adenoviren, ist ein direkter Einsatz gegen das virale Genom nicht möglich. Allerdings können die Transkripte für die Virusreplikation essentieller Gene ein mögliches Ziel sein. So konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz von siRNAs gegen die essentiellen Gene E1A, IVa2 und Hexon eine effektive Inhibierung der Ad5 Replikation in vitro erreicht werden konnte (126). Diese Studie zeigte außerdem, dass für eine erfolgreiche Inhibierung der viralen Replikation mehrere virale Gene gleichzeitig adressiert werden sollten, um die unterschiedlich hohen funktionellen Wirksamkeiten bei unterschiedlichen Expressionsleveln zu berücksichtigen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Kombination von verschiedenen siRNAs gegen unterschiedliche adenovirale Gene zusätzlich positive Effekte aufweist. So wirken siRNAs gegen Gene des Replikationsmechanismus, z.B. der viralen DNA-Polymerase, besonders effektiv gegen die Ad-Replikation. Der zusätzliche Einsatz von siRNAs gegen E1A, welches in den Zellzyklus der Wirtszelle eingreift, verringerte deutlich 1. Einleitung 10 den durch die Ad-Infektion ausgelösten zytopathischen Effekt. Obwohl die siRNA gegen E1A einzeln eingesetzt kaum einen Effekt auf die Ad-Inhibierung hatte (126, 127). Ein weiteres Argument, verschiedene siRNAs gegen virale Gene einzusetzen, ist dass Viren eine hohe Mutationsrate aufweisen, welche dazu führen kann, dass sie sich dem Angriff durch RNAi entziehen. Das Angreifen mehrerer essentieller Gene hilft die mögliche Bildung von EscapeMutanten zu unterdrücken (125, 128). Die antivirale Therapie mittels RNAi stellt demnach einen vielversprechenden Ansatz bei der Behandlung verschiedener Viren dar. In Abb. 1.3 sind noch einmal die verschiedenen antiviralen Ansätze dargestellt. Abb. 1.3: Schematische Darstellung Antiviraler Strategien. Soluble Rezeptormoleküle blockieren das Eindringen der Viren in die Zelle durch kompetitive Hemmung. siRNAs können gegen verschiedene targets eingesetzt werden. So können damit zelluläre Bestandteile, welche eine wichtige Rolle für den Lebenszyklus des Virus spielen, herunterreguliert werden (z.B. Rezeptoren). Des Weiteren können siRNAs direkt auf das Virusgenom wirken (z.B. bei RNA-Viren) oder aber gegen die virale mRNA. Virustatika (z.B. Cidofovir) können durch Blockierung der korrekten DNA-Replikation ebenfalls entscheidend in den viralen Lebenszyklus eingreifen. 1. Einleitung 1.5. 11 Virale Vektoren Virale Vektoren ermöglichen einen effizienten Gentransfer in Zellen sowohl in vitro als auch in vivo. Dafür stehen verschiedene Vektorsysteme zur Verfügung, wovon lentivirale, adenovirale und Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren die am häufigsten genutzten darstellen. Das Grundprinzip dieser unterschiedlichen Vektorsysteme beruht auf der Veränderung des Genoms der zugrundeliegenden Viren, sodass diese zwar noch die genetischen Informationen für die Verpackung des Vektors, nicht aber für Replikation und Zelllyse enthalten (129–131). Demnach haben Vektoren die gleiche oder ähnliche Fähigkeiten ihre Zielzellen zu transduzieren und ihr Genom einzuschleusen wie ihre zugrundeliegenden Viren, allerdings fehlt ihnen die Fähigkeit zur Reproduktion. Virale Vektoren haben gegenüber anderen Methoden des Gentransfers den Vorteil, dass sie effektiv und spezifisch verschiedene Zelltypen und Gewebe transduzieren können und sich auch durch eine hohe, anhaltende und stabile Transgenexpression von Monaten bis Jahren auszeichnen (132, 133). Dies macht sie zu effektiven Werkzeugen der Gentherapie, was sich auch in der Nutzung viraler Vektoren in einer Vielzahl klinischer Studien widerspiegelt (134–137). Die Behandlung der seltenen Lipoproteinlipasedefizienz (LPLD) wird mit Hilfe von AAVVektoren durchgeführt und stellt die erste in der westlichen Welt zugelassene Gentherapie zur Behandlung am Menschen dar (138). Für unterschiedliche Anwendungen in der Gentherapie werden auch entsprechend unterschiedliche Vektorsysteme genutzt. Jedes dieser Systeme hat spezifische Vor- und Nachteile, welche für deren Einsatz bedacht werden müssen. So erreichen lentivirale Vektoren eine hohe zeitliche Stabilität der Transgen-Expression, da die entsprechende genetische Information ins Wirtsgenom integriert wird (139). Allerdings besteht dabei die Gefahr, dass im Genom des Wirts schwere Mutationen auftreten oder die Zellen entarten und Krebs entsteht. Im Gegensatz dazu liegt die genetische Information, welche von adenoviralen und AAV-Vektoren in die Zellen transduziert wird als extrachromosomales Konstrukt vor. Adenovirale Vektoren werden kurze Zeit nach der Transduktion durch das Immunsystem eliminiert, wodurch sie nur für kurzfristige Transgenexpressionen genutzt werden können (140). AAV-Vektoren zeigen dagegen so gut wie keine immunogene Wirkung, wodurch das transduzierte Transgen über Monate oder Jahre in den Zielzellen verbleiben kann (141, 142). Dies könnte unter Umständen negativ sein, falls das eingebrachte Transgen Nebenwirkungen hervorrufen würde. 1. Einleitung 12 AAV-Vektoren gehören zur Familie der Parvoviridae, welche ein nicht umhülltes, ikosaedrisches Kapsid und ein lineares, einzelsträngiges DNA-Genom besitzen. Das relativ kleine Genom von ungefähr 4800 bp enthält nur die Gene rep und cap und ist von 2 inverted terminal repeats (ITRs) begrenzt (143). Für AAV-Vektoren sind verschiedene Serotypen bekannt, welche mit unterschiedlichen Gewebetropismen einhergehen. Allein im menschlichen Gewebe konnten 55 verschiedene Serotypen nachgewiesen werden (144) in Tabelle 1.1 sind die Gewebetropismen der am häufigsten genutzten AAV-Serotypen dargestellt. Tab. 1.1: Gewebetropismus ausgewählter AAV-Serotypen. Tabelle nach Zincarelli et al., 2008 (145); Geisler et al., 2011 (146); Nonnenmacher und Weber, 2012 (147) AAV Gewebetropismus AAV1 Skelettmuskulatur (SM), Zentrales Nervensystem (ZNS), Retina, Pankreas AAV2 Glatte Muskulatur, SM, ZNS, Leber, Niere AAV3 Leberkarzinome, SM AAV4 ZNS, Retina AAV5 SM, ZNS, Lunge, Retina AAV6 SM, Herz, Lunge AAV7 SM, Retina, ZNS AAV8 Leber, SM, ZNS, Retina, Pankreas, Herz AAV9 Leber, Herz, Gehirn, SM, Lunge, Pankreas, Niere Bis vor kurzem wurden für den Gentransfer ausschließlich AAV-Vektoren des Serotyp 2 genutzt. Da diese allerdings eine geringe Transduktionseffizienz in vivo aufwiesen, wurden neue pseudotypisierte AAV-Vektoren entwickelt (148). Diese bestehen aus einem AAV-2 basierten Vektorgenom und dem Kapsid eines weiteren Serotypen. Dadurch wurde eine Vielzahl an neuen AAV-Vektoren geschaffen, die unterschiedliche Gewebetropismen und daher auch unterschiedliche Anwendungsmöglichkeiten aufweisen. Desweiteren muss im Bereich der AAV-Vektoren noch zwischen konventionellen einzelsträngigen (ss) und selbstkomplementierenden (sc) AAVs unterschieden werden. Bei den ssAAVs liegt nur ein einzelsträngiges Genom vor, von welchem nach der Transduktion noch ein komplementärer Zweitstrang synthetisiert werden muss bevor das Transgen exprimiert werden kann. Diese Zweitstrangsynthese ist sehr ineffektiv, sodass eine deutliche Transgenexpression in vivo erst nach Wochen nachweisbar ist. Bei den scAAVs liegt aufgrund einer Veränderung innerhalb 1. Einleitung 13 der ITRs nach der Transduktion eine doppelsträngige Struktur vor, sodass eine Transgenexpression viel früher starten kann und bereits nach Tagen nachweisbar ist. Allerdings ist durch die Doppelstrang ähnliche Struktur die Verpackungskapazität im Vergleich zu den ssAAV-Vektoren verringert. Die Verpackungsgrenze für scAAV-Vektoren liegt bei ungefähr 2,2 – 2,4 kb, während ssAAV-Vektoren ein 4,6 kb großes Genom verpacken können (149, 150). Die Unterschiede in den Transduktionsmechanismen von ssund scAAV-Vektoren ist in Abb. 1.4 dargestellt. Abb. 1.4: ssAAV- und scAAV-Vektoren im Vergleich. Nach Transduktion muss bei ssAAV-Vektoren erst der Zweitstrang synthetisiert werden, bevor eine Transgen-Expression starten kann. Nach Transduktion mit scAAVVektoren liegt das Genom bereits in einer doppelsträngigen Form vor und das Transgen kann sofort exprimiert werden. Schema modifiziert nach Daya und Berns, 2008 (151) 1. Einleitung 1.6. 14 Zielstellung Bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr können Ad-Infektionen zu schweren und mitunter tödlich verlaufenden Erkrankungen führen. Zu den Risikogruppen gehören vor allem immunsupprimierte Patienten, wie Empfänger von Organtransplantaten, Kinder nach hämatopoetischer Stammzelltherapie aber auch Patienten mit akuter Leukämie. Gegenwärtig gibt es keine zugelassene und routinemäßig in der Klinik eingesetzte kausale Therapie bei Ad-Infektionen. Die Behandlung basiert zurzeit vornehmlich auf symptomatischen und unspezifischen Ansätzen, wie z.B. der intravenösen Gabe von Immunglobulinen und der Gabe von Nukleotidanaloga (z.B. Cidofovir). Aussagen bezüglich der Wirksamkeit sind jedoch begrenzt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung des antiviralen Potentials von solublen Varianten des CAR bei Ad-Infektionen in vitro und in vivo. Hierbei soll geklärt werden, ob und in welchem Maße sCAR-Varianten, welche aus dem extrazellulären Bereich des CAR bestehen, Ad-Infektionen inhibieren können. Dafür sollen verschiedene Varianten sCAR exprimierender Plasmide hergestellt und in der Zellkultur exprimiert werden. Die so produzierten löslichen Rezeptormoleküle sollen anschließend auf ihr antivirales Potenzial hin untersucht werden. Weiterhin soll untersucht werden, inwieweit bestimmte neue, gentechnisch generierte sCARMutanten verbesserte antivirale Eigenschaften aufweisen. Dafür sollen sCAR-Varianten hergestellt werden, welche eine verkürzte D2-Domäne aufweisen. In diesem Zusammenhang soll geklärt werden ob diese kleineren Moleküle eine höhere Expression aufweisen und gleichzeitig weiterhin antiviral wirken können. Zusätzlich soll dadurch untersucht werden, ob für die D2-Domäne des CAR, für die bisher keine Virus bindende Funktion nachgewiesen wurde, ein möglicher Einfluss auf die antivirale Wirkung der sCAR-Varianten zu beobachten ist. Der mögliche antivirale Effekt von sCAR-Varianten soll anschließend im in vivo Modell untersucht werden. Dabei wird auf eine gentherapeutische Einbringung des Transgens in das Versuchstier über AAV-Vektoren zurückgegriffen. In diesem Zusammenhang soll geklärt werden, wie sich die Expression des Transgens über einen längeren Zeitraum entwickelt. 1. Einleitung 15 Anschließend soll untersucht werden, inwieweit die so eingebrachte sCAR-Variante in der Lage ist Ad in vivo zu inhibieren. Abschließend soll die Wirksamkeit verschiedener antiviraler Agenzien in Kombination mit sCAR Proteinen beurteilt werden. Dabei sollen Cidofovir und verschiedene, gegen adenovirale Gene gerichtete, siRNAs zum Einsatz kommen. 2. Material 16 2. Materialien 2.1. Geräte Gerät Hersteller Autoklav Laboklav MV80 SHP Steriltechnik AG, Detzel Schloss,D Bakterienschüttler Innova 42 Incubator New Bruinswick Scientific, St. Albans, GB Beatmungsgerät für Nager Typ 7025 UgoBasile, Comerio, VA, IT Blotapparatur Mini Protean® Tetra Cell BioRad, München, D CO2-Inkubator HERAcell® 240i Thermo Scientific, Karlsruhe, D CO2-Inkubator MCO-20AIc Sanyo, München, D Elektrophoreseeinheit PerfectBlue Mini M Elektrophoreseeinheit X-Cell SureLock TM Peqlab, Erlangen, D Life Technologies, Darmstadt, D Fluoreszenzmikroskop Observer Z1 Axio Zeiss, Berlin, D Geldokumentation UV Solo TS Biometra-Analytik Jena, Jena, D Luminometer Lumat LB9507 Berthold Technologies, Bad Wildbad, D Mikroplattenreader Sunrise Basic Tecan, Männedorf, CH Mikroskop Primo Vert Zeiss, Berlin, D Narkosegerät Univentor 400 Univentor, Zejtun, MLT Operationslicht Schott KL 1500 Schott AG, Mainz, D Operationsmikroskop LEICA MZ 125 Leica, Solms, D PCR Thermocycler T Personal Biometra, Göttingen, D Realtime PCR Thermal Cycler CFX96TM C1000 BioRad, München, D Rollerflaschensystem HERAcell® 240i Thermo Scientific, Karlsruhe, D Sterilbank MSC Advantage 1.8 Thermo Scientific, Karlsruhe, D Sterilbank MSC 2020 1.2 Thermo Scientific, Karlsruhe, D Spektrophotometer Nanodrop 2000 Thermo Scientific, Karlsruhe, D Spektrophotometer V-650 Jasco, Tokyo, J Thermomixer Comfort 1,5 ml Eppendorf, Hamburg, D Tischzentrifuge 5415R Eppendorf, Hamburg, D Ultrazentrifuge Optima L-90K Beckman Coulter, Krefeld, D Ultrazentrifugenrotor Typ 70Ti und TLA-120 Beckman Coulter, Krefeld, D Western Blot & Gel Imaging System, ChemiDoc MP BioRad, München, D Zentrifuge Sigma 3-18K Sigma, Osterode am Harz, D Zentrifuge Sigma 3-16PK Sigma, Osterode am Harz, D 2. Material 2.2. 17 Chemikalien Standardchemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden, soweit nicht anders angegeben, von folgenden Firmen bezogen: Sigma-Aldrich (München, Deutschland), Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Greiner Bio-One (Essen, Deutschland), Life Technologies (Darmstadt, Deutschland), Nunc (Wiesbaden, Deutschland) oder Roche (Mannheim, Deutschland). Die Medien und Zusätze für die Zellkultur wurden von der Firma PAA Laboratories (Coelbe, Deutschland) oder von Gibco BRL (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. 2.3. Molekularbiologische Kits und Testsysteme Methoden Bezeichnung und Hersteller DNA-Isolation peqGOLD Tissue DNA Mini Kit (peqlab, Erlangen, D) Gelextraktion QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, D) IgG-Nachweis Hum. IgG ELISA (Bethyl Lab Inc., Montgomery, AL, USA) Klonierung CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) Leberenzymnachweis InfinityTM AST (GOT) InfinityTM ALT (GPT) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) Luciferase Assay Bright-GloTM Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) Plasmidisolation peqGOLD Plasmid Miniprep Kit (peqlab, Erlangen, D) EndoFree® Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, D) EndoFree® Plasmid Mega Kit (Qiagen, Hilden, D) qPCR Mastermix TaqMan Gene Expression Master Mix (2x) (Life Technologies, Darmstadt, D) SsoFastTMEvaGreen® Supermix (Bio Rad, München, D) Reverse Transkription High Capacity® cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) RNA-Isolation TRIzol® Reagent (Life Technologies, Darmstadt, D) Transfektionsreagenzien Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, Darmstadt, D) Polyethylenimin (Polysciences, Eppelheim, D) Western Blot Substrat Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 2. Material 2.4. 18 Enzyme Alle Enzyme wurden entsprechend den Herstellerangaben in den mitgelieferten Puffern und den empfohlenen Mengen eingesetzt Bezeichnung Hersteller Alkaline Phospatase, calf intestinal (CIP) Roche, Mannheim, D Benzonase Merck, Darmstadt, D DNase I, peqGOLD Peqlab, Erlangen, D Proteinase K Peqlab, Erlangen, D Pfu-Polymerase Stratagene Restriktionsenzyme New England Biolabs (NEB), Frankfurt a.M.,D T4 DNA-Ligase New England Biolabs (NEB), Frankfurt a.M.,D 2.5. Plasmide AAV-Shuttleplasmide / Expressionsplasmide Bezeichnung Größe Insert zw. ITRs Expression und Bemerkungen pdAAV-sCAR-Fc 2668 bp sCAR-Fc pdAAV-sCAR-Fctrunk 2668 bp trunkierter sCAR-Fc (keine Expression) pdAAV-sCAR 1868 bp sCAR pdAAV-sFc 1897 bp sFc pdAAV-sCAR-C4bp 2076 bp sCAR-C4bp pscAAV-GFP(124) 2329 bp GFP (Kontrollplasmid) pdAAV-sCAR-3-Fc 2288 bp sCAR-3-Fc pdAAV-sCAR-31/2-Fc 2360 bp sCAR-31/2-Fc pdAAV-sCAR-32/3a-Fc 2396 bp sCAR-32/3a-Fc pdAAV-sCAR-32/3b-Fc 2405 bp sCAR-32/3b-Fc pdAAV-sCAR-4-Fc 2441 bp sCAR-4-Fc pdAAV-sCAR-41/2-Fc 2492 bp sCAR-41/2-Fc pdAAV-sCAR-D2-Fc 2967 bp sCAR-D2-Fc pdAAV-sCAR-Hinge 1973 bp sCAR-Hinge pdAAV-sCAR-Fc opt. 2371 bp sCAR-Fc, Codon optimiert für Maus pdAAV-sCAR-Fctrunk opt. 2371 bp trunkierter sCAR-Fc (keine Expression) Die Vektorkarten und die Beschreibung der Plasmidkonstruktion befinden sich im Anhang. 2. Material 19 AAV-Verpackungsplasmide Bezeichnung Ursprung Verwendung pDG Sipo et al., 2007 (152) AAV2-Produktion P5E18-VD2/9 Dr. Wilson, Pennsylvania, USA AAV9-Produktion pHelper Stratagene, La Jolla, USA AAV9-Produktion 2.6. Virale Vektoren In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl AAV-Vektoren (Serotyp 2 und 9) und adenovirale Vektoren (AdV) eingesetzt. Bezeichnung Expressionskassette Vektortyp scAAV2-CMV-sCAR-Fc sCAR-Fc AAV2 scAAV2-CMV-sCAR-Fc opt. sCAR-Fc opt. AAV2 scAAV9-CMV-sCAR-Fc sCAR-Fc AAV9 scAAV9-CMV-GFP GFP AAV9 scAAV9-CMV-sCAR-3-Fc sCAR-3-Fc AAV9 scAAV9-CMV-sCAR-Fc opt. sCAR-Fc opt. AAV9 sCAR-Fctrunk opt. AAV9 AdG12 Dox-regulierbare Expression von sCAR-Fc AdV Ad5CMVluc Luciferase AdV Ad5TRELuc Luciferase AdV Ad5TetO7[HRE]AFP-luc Luciferase AdV (in vivo auf sCAR-Fc verkürzt) scAAV9-CMV-sCAR-Fctrunk opt. (in vivo auf sCAR-Fctrunk verkürzt) 2. Material 2.7. 20 Oligonukleotide Primer und Sonden wurden von der Firma Tib Molbiol (Berlin, D) bzw. Metabion (Steinkirchen, D) bezogen. Die siRNAs wurden von der Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, D) bezogen. Eine Übersicht der verwendeten Oligonukleotide befindet sich in der nachflogenden Tabelle. Bezeichnung 5‘ – 3‘ Sequenz Verwendung C4bp-BamHI s TCA GGG ATC CCG AGA CCC CCG AAG GCT sCAR-C4bp GTG Klonierung C4bp-MluI as TCA GAC GCG TTT ATA GTT CTT TAT CCA AAG TGG SP-Fc-s GAT TTC GCC AGA AGT GAT CCC AAA TCT sFc-Klonierung TGT GAC SP-Fc-a GTC ACA AGA TTT GGG ATC ACT TCT GGC GAA ATC Fc-SalI-a CTG CTG GTC GAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG AAVsCAR EcoRIs GCG AAT TCC AGC ATG GCG CTC CTG CTG sCAR-Klonierung TGC AAVsCAR EcoRIas ATC GAA GAA TTC ACG CGT TTA CGC TTT ATT TGA AGG AGG CAR-D2s GCA GAT CTA CCT TCA GGT GC sCAR-D2-Fc Klonierung CAR-D2as ATG GGA TCC GCG GCC GC sCAR Hinge Fc a CTG CTG GTC GAC TCA TCC CCC CAC GAG sCAR-Hinge TTC Klonierung GCG AAT TCC ATG GCG CTC CTG Klonierung verkürzte div sCAR-Fcs sCAR-Fc Varianten sCAR323a-Fc as CGG ATC CCA CTC ATA CTG TAA TG sCAR323b-Fc as CGG ATC CAA TTT TTG CCA CTC ATA C sCAR412-Fc as CGG ATC CGA GTA CTC AGA AGA GGC sCAR4-Fc as CGG ATC CGC TAA CCA TGA AGT GGG sCAR312-Fc as CGG ATC CTC ACA TTT TAT CTT AAA G sCAR3-Fc CGG ATC CAC AAG AAC TAC CAG ATG 2. Material sCAR-mut fw sCAR-mut rev AAV CMV Enhancer - 329 fw 21 AGA TCG AAT TCG ATG GCC CTG CTG CTG TGA TTC GTG CTGGTC GTC TAC GCG TTC ACT TGC CAG GGC TCA G TGC CCA GTA CAT GAC CTT ATG G AAV CMV Enhancer - 462 rev GAA ATC CCC GTG AGT CAA ACC CMV enhancer-383T 6'FAM-AGT CAT CGC TAT TAC CAT GG-MGB Generierung trunk. sCAR-Fc Variante AAV-Quantifizierung AAV-Quantifizierung Sonde Hexon-19112-s AAC CGT GTG CTG GAC ATG GC Hexon-19500-as GCT GCA TGA TTA ATT TCA GTT TCG 18SrRNA s GGTGGAGCGATTTGTCTGGT Ad-Quantifizierung 18SrRNAQuantifizierung 18SrRNA as TGGGAATTCCTCGTTCATGG siE1A CGG AGG UGU UAU UAC CGA AdTdT siRNA gegen E1A UUC GGU AAU AAC ACC UCC GdTdG siIVa2 GUU AGU GAU CCC AGA AAU AdTdT siRNA gegen IVa2 UAU UUC UGG GAU CAC UAA CdGdT siPol siScr CAA CGU CUU CCA GCG UCC AAC CAU A siRNA gegen CAA GAC CCG CUU ACC UUC UAC UGC A Polymerase UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT Scrambled siRNA ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT 2.8. Bakterienstämme Für die vorliegende Arbeit wurden ausschließlich E.coli XL10-Gold Ultracompetend Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA) genutzt. 2.9. Medien für Bakterienkulturen LB-Medium Zum Ansätzen von LB-Medium wurde die entsprechende Menge LB-Medium (Lennox)Pulver (Carl Roth, Karlsruhe, D) in Wasser gelöst und für 20 min bei 121°C autoklaviert. 2. Material 22 LB-Agar Zum Ansätzen von LB-Agar wurde die entsprechende Menge LB-Agar (Lennox)-Pulver (Carl Roth, Karlsruhe, D) in Wasser gelöst und für 20 min bei 121°C autoklaviert. Anschließend wurde der Agar auf ungefähr 60°C abgekühlt und ggf. mit 100 µg/ml Ampizillin versetzt, bevor die entsprechenden Agar-Platten gegossen wurden. 2.10. Pufferlösungen Molekularbiologie • 50-fach TAE-Puffer: 2 M Tris, 1 M Acetat, 0,05 M EDTA • Agarosegelelektrophorese-Laufpuffer: 1-fach TAE • DNA-Ladepuffer: 6-fach Gel Loading Dye Blue (NEB, Frankfurt/ Main, D) 2.11. Größenmarker • SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) • 1 kb DNA Ladder (NEB, Frankfurt/Main, D) 2.12. Real-time PCR-Assays • Mouse IL-6: Mm00446190_m1 (Life Technologies, Darmstadt, D) • Mouse IL-12: Mm00434165_m1 (Life Technologies, Darmstadt, D) 2.13. Lösungen für die AAV-Vektorproduktion • 60 % Iodixanol-Lsg. OptiPrepTM Density Gradient Medium (Sigma-Aldrich, München, D) • PBS-MK: 1-fach PBS, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2 • 0,5 % Phenolrot-Lösung (Sigma-Aldrich, München, D) 2. Material • 23 Zusammensetzung der Iodixanol-Lösungen: Iodixanol 15% 25% 40% 54% 60% Iodixanol 12,5 ml 20 ml 33 ml 45 ml PBS-MK 37,5 ml 28 ml 16,5 ml 5 ml Phenolrot-Lsg. --- 100 µl --- 80 µl Gesamtvolumen 50 ml 48 ml 49,5 ml 50 ml 2.14. Lösungen für Virusreinigung • TBS: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 (pH 7,5; einstellen mit HCl) • PEG/NaCl-Lösung: 2,5 M NaCl, 20% PEG 8000 2.15. Westernblotpuffer und -lösungen • NuPAGE® MES SDS Running Buffer (20X) (Life Technologies, Darmstadt, D) • NuPAGE® Transfer Buffer (20X) (Life Technologies, Darmstadt, D) • NuPAGE® LDS Sample Buffer (4X) (Life Technologies, Darmstadt, D) • NuPAGE® Bis-Tris Pre-Cast Gels (Life Technologies, Darmstadt, D) Die kommerziellen Puffer wurden laut Herstellerangaben angesetzt und verwendet. • Ponceau S Solution (Sigma-Aldrich, München, D) • TBST: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 • Block-Puffer: 5 % Magermilchpulver in TBST 2. Material 24 2.16. Westernblot Antikörper Primärantikörper: • CAR: H-300 (sc15405, rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, USA) Verdünnung: 1:250 • IgG-Fc: HRP-gekoppelter sheep-anti-human IgG Antikörper NA933 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) Verdünnung: 1:500 Sekundärantikörper: • HRP-gekoppelter goat-anti-rabbit Antikörper (DAKO GmbH, Hamburg, D) Verdünnung: 1:10.000 2.17. Medium für Plaque-Assay Für die 5 %ige Low-Melting-Agarose (LMA)-Lösung wurden 5g LMA-Pulver (SigmaAldrich, München, D) in 100 ml PBS gelöst und für 20 min bei 121°C autoklaviert. Anschließend wurde die LMA-Lösung in 6 ml Aliquots bei 4°C gelagert. 2.18. Zelllinien • HEK293: Human embryonal kidney, ACC 305 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, D) • HeLa: Human cervix carcinoma, ACC57 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, D) • Huh7: Human Liver Carcinoma (Hepatoma), (Institut für angewandte Zellkultur Dr.Toni Lindl GmbH, München, D) • EA.hy926: Fusionszelllinie aus Nabelvenenzellen und A549-Zellen, CRL-2922 (ATCC, Manassas, USA) 2. Material 25 2.19. Zellkulturmedien • HEK293: DMEM (4,5 g/l Glucose) (PAA, Cölbe, D) 10% FKS (c.c.pro GmbH, Oberdorla, D) L-Glutamin (2 mM) Penicillin (100 U/ml) Streptomycin (100 µg/ml) • HeLa: DMEM (1 g/l Glucose) (PAA, Cölbe, D) 10% FKS L-Glutamin (2 mM) Penicillin (100 U/ml) Streptomycin (100 µg/ml) • Huh7: DMEM (4,5 g/l Glucose) (PAA, Cölbe, D) 10% FKS (c.c.pro GmbH, Oberdorla, D) L-Glutamin (2 mM) Penicillin (100 U/ml) Streptomycin (100 µg/ml) • EA.hy926: DMEM (4,5 g/l Glucose) (PAA, Cölbe, D) 10% FKS (c.c.pro GmbH, Oberdorla, D) L-Glutamin (2 mM) Penicillin (100 U/ml) Streptomycin (100 µg/ml) HAT (100 mM Hypoxanthin, 0,4 mM Aminopterin, 16 mM Thymidin) 3. Methoden 26 3. Methoden 3.1. Arbeiten mit Bakterien 3.1.1. Herstellung chemokompetenter Bakterienzellen Für die Herstellung chemokompetenter Bakterienzellen wurden 5 ml LB-Medium mit 5 µl eines E.coli Stocks angeimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Mit 2 ml dieser Übernachtkultur wurden 250 ml frisches LB-Medium angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert bis eine OD595 nm von 0,4 bis 0,6 erreicht wurde. Die Kultur wurde in vorgekühlte Zentrifugenbecher überführt und 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Kultur bei 4°C für 5 min bei 3000 g zentrifugiert und das entstandene Zellpellet wurde in 50 ml eiskalter 0,1 M MgCl2-Lösung vorsichtig resuspendiert. Es folgte eine 5 minütige Zentrifugation bei 0°C und 3000 g. Das Zellpellet wurde in 50 ml eiskalter 0,1 M CaCl2Lösung vorsichtig resuspendiert und 20 min auf Eis gestellt. Die Zellsuspension wurde wie zuvor zentrifugiert und das entstandene Zellpellet wurde in 5 ml 0,1 M CaCl2/14 % GlycerinLösung vorsichtig aufgenommen. Die Zellsuspension wurde in vorgekühlte EppendorfReaktionsgefäße zu je 50 µl aliquotiert und umgehend bei -80°C gelagert. 3.1.2. Transformation chemokompetenter Bakterienzellen Für die Transformation wurde ein 50 µl Aliquot der zuvor hergestellten chemokompetenten Bakterienzellen für 15 min auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden 10 bis 20 µl des Ligationsansatzes zu den Zellen gegeben, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Der Transformationsansatz wurde bei 42°C für 30 Sekunden einem Hitzeschock unterzogen um die Transformation einzuleiten. Die Zellen wurden im Anschluss für 1 min auf Eis abgekühlt und anschließend mit 900 µl LB-Medium (37°C vorgewärmt) versetzt. Es folgte eine Inkubation unter Schütteln (500 rpm) bei 37°C für 1 h. Anschließend wurde die Zellsuspension auf Agar-Platten mit Selektionsmedium (Ampicillin, 100 µg/ml) ausplattiert und bei 37°C für 16 h im Brutschrank inkubiert. 3.2. Klonierungen Um DNA-Fragmente zur Klonierung zu erhalten, wurden mittels Restriktionsendonukleasen vom Typ II (NEB, Frankfurt am Main, D) Restriktionsverdaue von Plasmid-DNA entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Eine Restriktionsdauer von 1 h wurde 3. Methoden 27 dabei nicht überschritten. Wenn nötig, wurden die Enzyme anschließend entsprechend der Herstellerangaben hitzeinaktiviert. Um ein mögliches Religieren eines bereits geschnittenen Plasmids zu vermeiden, wurden die entsprechenden Plasmidfragmente mittels Alkaliner Phosphatase bei 37°C für 15 min. dephosphoryliert. Die so behandelten DNA-Fragmente konnten anschließend mittels Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt werden. Die für die Ligation benötigten DNA-Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels Gelextraktionskit (Quiagen) isoliert. Die so gewonnenen DNA-Fragmente wurden im Anschluss mittels T4 DNA-Ligase für 2 h bei Raumtemperatur ligiert. Das Verhältnis von geschnittenem Vektor zu Insert betrug dabei 1:5, d.h. das Insert wurde in starkem Überschuss eingesetzt. Der Ligationsansatz wurde anschließend in chemokompetente Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA der daraus resultierenden Klone wurde mittels Minipräparation isoliert und anschließend per Restriktionsverdau überprüft. Positive Klone wurden im Anschluss durch die Firma LGC Genomics (Berlin, D) sequenziert. Wurden DNAFragmente mittels PCR hergestellt, wurden diese zunächst im CloneJET Klonierungsvektor (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) zwischenkloniert und anschließend über Transformation chemokompetenter Zellen amplifiziert. Wurde für die Herstellung von DNAFragmenten eine Gensynthese benötigt, so wurde diese von der Firma Geneart (Life Technologies, Darmstadt, D) durchgeführt. Sämtliche für die Klonierung relevanten Arbeitsschritte erfolgten entsprechend den in den Kits angegebenen Herstellerangaben. 3.3. Molekularbiologische Methoden 3.3.1. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration von Nukleinsäuren (DNA und RNA) wurde spektralphotometrisch mittels Nanodrop 2000 bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dabei wird zugrunde gelegt, dass ein Absorptionsunterschied von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml bzw. einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml entspricht. Um genaue Messwerte zu erhalten, sollte die Extinktion zwischen 0,1 und 1,0 liegen. Der Quotient aus E260/E280 kann als Maß für die Reinheit der DNA bzw. RNA herangezogen werden. Der Quotient sollte für DNA im Bereich 2,0 ± 0,2 und für RNA über 2,0 liegen. Um die Reinheit besser einschätzen zu können, empfiehlt es sich ein Spektrum von 230 bis 310 nm aufzunehmen, da im Bereich von 260 nm ebenfalls noch Salze (230 nm) und Proteine (280 nm) eine Absorption aufweisen können. 3. Methoden 28 3.3.2. Isolierung von Plasmid-DNA Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen erfolgte in verschiedenen Maßstäben von 5 ml (Mini) bis 1000 ml (Mega) Kulturvolumen, abhängig von der benötigten DNAMenge. Im kleinsten Maßstab wurde Plasmid-DNA aus 5 ml einer Übernachtkultur eines entsprechenden Klons mittels peqGOLD Plasmid Mini Kit (Peqlab) isoliert. Für höhere DNAAusbeuten wurde das Kulturvolumen der Übernachtkultur auf 250 ml (Maxi) bzw. 1000 ml (Mega) erhöht. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte hierbei endotoxinfrei mit dem EndoFree® Plasmid Maxi- bzw. Mega Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland). Die gefällte Plasmid-DNA wurde anschließend in 200 µl (Maxi) bzw. 1000 µl (Mega) des beiliegenden TE-Puffers aufgenommen und nach Bedarf verdünnt. 3.3.3. Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben Die Isolierung von Gesamt-DNA aus Zellen erfolgte durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen in PBS bei -80°C bzw. 37°C. Dabei entstandene Zelltrümmer wurden 5 min bei 10.000 g abzentrifugiert und der DNA-haltige Überstand wurde für weitere Untersuchungen wie z.B. qPCR genutzt. Für die Isolierung von Gesamt-DNA aus Geweben wurde das PeqGOLD Tissue DNA Mini Kit (Peqlab) genutzt. Dabei wurde nach Herstellerangaben vorgegangen und bis zu 40 mg schwere Gewebestücke im entsprechenden Puffer mittels eines sterilen Pistills zerkleinert. Nach der Isolierung wurde die DNA in 400 µl Elutionspuffer eluiert und anschließend mittels Nanodrop quantifiziert. Sollte für gewisse Anwendungen eine höhere DNA-Konzentration nötig gewesen sein, wurde die DNA mit 1/10 Vol. NaAcetat und 2,5 Vol. 100 % EtOH gefällt und in einem geringeren Volumen aufgenommen. 3.3.4. Isolierung von RNA aus Geweben Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben erfolgte mittels TRIzol® Reagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Dafür wurden 50 – 100 mg schwere Gewebestücke mit 1ml TRIzol® Reagenz versehen und mit einem sterilen Pistill zerkleinert. Anschließend wurde durch Zugabe von Chloroform eine Extraktion der RNA vorgenommen. Im Folgenden wurde die RNA mit Isopropanol gefällt und anschließend durch Zentrifugation pelletiert. Die Aufnahme der pelletierten RNA erfolgte in nukleasefreiem Wasser und wurde anschließend mittels Nanodrop quantifiziert. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -80°C. 3. Methoden 29 3.3.5. cDNA-Synthese über reverse Transkription Ausgehend von einer RNA-Matrize wurde mittels reverser Transkription (RT) und randomisierten Hexamer-Primern des High Capacity® cDNA Reverse Transcription Kits ein komplementärer DNA-Strang synthetisiert. Durch den Einsatz randomisierter HexamerPrimer kann sowohl mRNA als auch rRNA als Template für die RT-Reaktion dienen. Je Ansatz wurde 1 μg der isolierten RNA als Template benutzt. Die RNA wurde mit dem für die RT benötigten Zutaten nach Protokollangaben gemischt und anschließend die RT-Reaktion durchgeführt. Die Reaktion beginnt mit einem Inkubationsschritt bei 25 °C für 10 min, gefolgt von 37 °C für 2 h und abschließend bei 85 °C für 5 min. Die cDNA wurde bei -80 °C gelagert oder gleich mittels qPCR analysiert. 3.3.6. Real-time PCR zur Quantifizierung der mRNA-Expression Die real-time PCR wurde angewendet, um die Expression inflammatorischer Zytokine (IL-6, IL-12) in der Leber von Mäusen zu ermitteln. Dafür wurden spezifische Genexpressionsassays und der TaqMan Gene Expression Master Mix von Life Technologies (Darmstadt, D) eingesetzt. Der Mastermix beinhaltet die für die Amplifikation nötigen dNTPs, die Polymerase sowie den Reaktionspuffer, während die Expressionsassays ein für das jeweilige Target spezifisches Primer-Sonden-Set beinhalten. Der Gesamtansatz setzte sich zusammen aus 5 μl TaqMan Gene Expression Master Mix, 0,5 μl des jeweiligen Expressionsassays, 2 μl der zuvor generierten cDNA und 2,5 μl nukleasefreiem Wasser. Die Amplifikation erfolgte entsprechend den Herstellerangaben bei einem initialen 2-min-Schritt bei 50 °C, gefolgt von 10 min bei 95 °C und 40 Zyklen von 15 sec bei 95 °C und 1 min bei 60 °C. Eine Normalisierung der erhaltenen mRNA-Expression erfolgte auf die Expression der 18 S rRNA. 3.3.7. Real-time PCR zur Quantifizierung von Adenovirus-Genomen Zur Quantifizierung von Ad-Genomen aus der Gesamt-DNA von Zellen bzw. Gewebe wurde ein EvaGreen® basierter real-time PCR-Assay verwendet. Dabei wurden spezifische Primer für das adenovirale Gen Hexon eingesetzt. Der PCR-Ansatz enthielt 10 μl des SsoFastTM EvaGreen® Supermixes, je 0,5 μl der Primer Hexon s (10 μM) bzw. Hexon as (10 μM), 7 μl nukleasefreies Wasser und 2 μl DNA. Das Temperaturprofil der Amplifikation bestand aus einem initialen Denaturierungsschritt von 30 sec bei 95 °C und 40 Zyklen bestehend aus 5 sec 3. Methoden 30 bei 95 °C und 5 sec bei 55 °C. Eine Normalisierung der Quantifizierung erfolgte auf die Expression der 18 S rRNA. 3.3.8. Real-time PCR zur Quantifizierung der 18 S rRNA Um DNA-Konzentrationsunterschiede zwischen verschiedenen Proben auszugleichen, wurde die Expressionsstärke der 18 S rRNA herangezogen. Dadurch ließen sich die Daten aus der Real-time PCR normieren. Hierfür wurde ein EvaGreen® basierter real-time PCR-Assay verwendet. Der PCR-Ansatz enthielt 10 μl des SsoFastTM EvaGreen® Supermixes, je 0,5 μl der Primer 18 S rRNA fw (10 μM) bzw. 18 S rRNA rev (10 μM), 7 μl nukleasefreies Wasser und 2 μl cDNA bzw. DNA. Das Temperaturprofil der Amplifikation bestand aus einem initialen Denaturierungsschritt von 30 sec bei 95 °C und 40 Zyklen bestehend aus 5 sec bei 95 °C und 5 sec bei 55 °C. Um die Unterschiede in der Quantifizierung verschiedener Proben zu berechnen wurde die ΔΔc(t)-Methode angewandt. 3.4. Proteinchemische Methoden 3.4.1. Westernblot Die Expression von Proteinen kann mittels Westernblot nachgewiesen, analysiert und quantifiziert werden. Zum Nachweis der löslichen CAR-Konstrukte, wurden die entsprechenden Zellkulturüberstände gesammelt und 15 µl davon zusammen mit 5 µl des NuPAGE-LDS-Sample-Buffer (4x) (life technologies) bei 95 °C für 5 min aufgekocht. Die Proteine wurden über NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gele (Invitrogen) bei 140 V für 1 – 1,5 h aufgetrennt und anschließend bei 200 mA für 1,5 – 2 h auf eine PVDF-Membran (Bio-Rad) übertragen. Der Erfolg des Blottens konnte durch das Anfärben der Proteine auf der Membran mit Ponceaurot (5 min) beurteilt werden. Anschließend wurde die Membran mehrmals mit Wasser gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit 5 %igem Block-Puffer inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TBST erfolgte eine Inkubation mit dem Primärantikörper für mind. 1 h in TBST mit 5 % Trockenmilch. Zur Detektion der extrazellulären Domäne von CAR wurde der Antikörper H-300 sc-15403 (Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1:250 genutzt. Nach mehrmaligem Waschen mit TBST wurde die Membran für mind. 1 h mit einem HRP-gekoppelten goat-anti-rabbit sekundären Antikörper (DAKO GmbH) inkubiert, wobei eine Verdünnung von 1:10.000 in TBST mit 5 % Trockenmilch genutzt wurde. Für die Detektion des IgG1-Fc-Teils von sCAR-Fc oder sFc wurde die Membran mit dem HRP-gekoppelten sheep-anti-human IgG Antikörper NA933 (GE Healthcare) wie oben 3. Methoden 31 beschrieben in einer Verdünnung von 1:500 inkubiert. Mittels ECL-System (Amersham Biosciences GmbH) wurde eine Chemolumineszenz-Reaktion ausgelöst, welche anschließend mit Hilfe des ChemiDoc-MP (Bio-Rad) digital detektiert und dokumentiert wurde. 3.4.2. Luciferase-Assay Das Enzym Fireflyluciferase setzt bei der Reaktion mit seinem Substrat abhängig von der Enzymmenge Licht frei. Diese Lichtmenge kann direkt mit einem Luminometer bestimmt werden und ermöglicht so den Rückschluss auf die Enzymmenge. In der vorliegenden Arbeit wurde das Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega) genutzt. Zu analysierende Zellkulturproben wurden einmal mit PBS gewaschen und dann mit 150 μl (für 24-WellPlatten) pro Well lysiert. Die Platten wurden 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend wurde das Lysat in Eppendorfgefäße überführt und bei 14.000 g für 5 min zentrifugiert. Die Überstände konnten dann direkt im Luminometer analysiert werden. Dabei wurden jeweils 50 μl Probe unter Zugabe von jeweils 10 μl Substrat analysiert, wobei die Messzeit 10 sec betrug. Sämtliche Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung. 3.4.3. Nachweis von sCAR-Fc mittels ELISA Zum Nachweis von sCAR-Fc wurde ein ELISA-Kit zur Detektion des Fc-Teils von humanem IgG (Bethyl Laboratories Inc.) entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Für die absolute Quantifizierung des in einer Probe enthaltenen sCAR-Fc wurde der im Kit mitgelieferte IgG-Standard genutzt. Mittels des ELISA-Kits wurden sowohl Zellkulturüberstände als auch das Serum von Mäusen analysiert. Wie durch den Hersteller empfohlen, wurden für jede Probe verschiedene Verdünnungen angelegt. Als Vergleich diente bei der Analyse von Zellkulturüberständen Zellkulturmedium GFP-transduzierter Zellen, während bei der Analyse von Serumproben aus Mäusen, Serum untransduzierter Mäuse genutzt wurde. Die Auswertung des ELISAs erfolgte mit Hilfe der Graph Pad Prism Software für nichtlineare Standardkurven durch nichtlineare Regression. 3.4.4. Nachweis von Leberenzymen Durch den Nachweis der Leberenzyme Alanin-Aminotransferase (ALT) und AspartatAminotransferase (AST) im Serum, lässt sich bei einer viralen Infektion der Grad der Leberschädigung bewerten. Im Vergleich zu nicht infizierten Individuen, ist die Serumkonzentration der Leberenzyme bei Infizierten erhöht. Zum Nachweis der 3. Methoden 32 Leberenzyme wurden das spezifische Testkit InfinityTM AST (GOT) Liquid Stable Reagent bzw. ALT (GPT) Reagent (Thermo Scientific) genutzt. Die Konzentration von ALT und AST im Serum wurde mittels UV-Spektrometer bei 340 nm und 37 °C nach den Herstellerangaben bestimmt. Als Kontrolle diente Serum von nicht infizierten Mäusen. 3.5. Zellbiologische Methoden 3.5.1. Zellkultur Die Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2. Zum Passagieren und Vereinzeln von Zellen wurde zunächst das verbrauchte Zellkulturmedium entfernt, anschließend wurden die Zellen mit PBS vorsichtig gewaschen. Zum Ablösen der Zellen vom Boden der Zellkulturflasche wurden diese mit Trypsin/EDTA bei 37 °C inkubiert. Durch Zugabe von frischem serumhaltigem Medium wurde das Trypsin/EDTA-Gemisch inaktiviert und die Zellen anschließend durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min pelletiert. Das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und die gewünschte Menge an Zellen erneut in einer frischen Zellkulturflasche ausgesät. Das Passagieren der Zellen wurde abhängig vom Zustand der Zellen 2 – 3 mal wöchentlich durchgeführt. 3.5.2. Zellviabilität mittels Kristallviolettfärbung (Cell-Killing-Assay) Die Färbung von Zellen mit Kristallviolett ermöglicht eine optische Bewertung der Zellviabilität und –gesundheit. Der Farbstoff Kristallviolett wird nur von intakten, adhärenten Zellen aufgenommen, woraufhin sich diese violett verfärben. Lysierte Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf und erscheinen dadurch farblos. Die am Boden des Zellkulturgefäßes wachsenden Zellen wurden zunächst durch Zugabe von 10-prozentiger Trichloressigsäure (TCA) fixiert. Nach 10 min wurde die TCA abgenommen und die Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die Kristallviolett-Lösung für 5 min auf die fixierten Zellen gegeben. Nach dem Entfernen der Färbelösung wurden die Zellen mehrmals mit PBS gewaschen bis alle Reste der Färbelösung entfernt wurden. Anschließend wurden die Zellen an der Luft getrocknet. Der Konfluenzgrad des gefärbten Zellrasens wurde dann optisch bewertet. Diese Methode wurde für die Bewertung der Zellgesundheit nach Infektion mit Virus als auch nach Applikation von zytotoxischen Substanzen herangezogen. 3. Methoden 33 3.5.3. Transfektion Als Transfektion wird das Einbringen von fremden Erbinformationen in eukaryotische Zellen bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Plasmide als auch siRNAs in Zellen transfiziert. Für die Transfektion von Plasmiden wurde das lineare Polymer Polyethylenimin (PEI) als Transfektionsreagenz genutzt. Dabei wurde je µg der zu transfizierenden PlasmidDNA 1 µl PEI-Lösung (2,58 mg PEI/ml) eingesetzt. Sowohl PEI-Lösung als auch PlasmidDNA wurden separat in 150 mM NaCl-Lösung verdünnt. Anschließend wurde die PEILösung tropfenweise zur Plasmid-DNA-Lösung gegeben und bei Raumtemperatur für mind. 20 min inkubiert. Das Volumen des Transfektionsansatzes war abhängig vom Volumen des zu transfizierenden Mediums und lag bei 10 %. Nach der Inkubationszeit wurde der Transfektionsansatz tropfenweise in das Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen gegeben. Nach 4 h erfolgte ein Mediumwechsel. Die Menge DNA für ein Well einer 6-wellPlatte betrug 2 µg. Für größere bzw. kleinere Zellkulturgefäße wurde die Menge angepasst. Für die Transfektion von siRNAs wurde das kationische Liposomen-bildende Reagenz Lipofectamine® 2000 nach Herstellerangaben eingesetzt. 3.5.4. Transduktion Das Einbringen von fremden Erbinformationen in eukaryotische Zellen mit Hilfe von viralen Vektoren wird als Transduktion bezeichnet. Dafür wurden Zellen in entsprechende Zellkulturgefäße ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 70 – 90 % kultiviert. Die gewünschte Menge an viralen Vektoren wurde in PBS (Transduktionsvolumen 1 – 10 % des Kulturvolumens) verdünnt und anschließend in das Kulturmedium der zu transduzierenden Zellen gegeben. Anschließend wurden die Zellen unter Standardbedingungen weiter kultiviert. 3.6. Virologische Methoden 3.6.1. Anzucht von Adenovirus 2 und 5 für in vitro Versuche Die in der vorliegenden Arbeit genutzten Adenoviren 2 und 5 wurden freundlicherweise von Stefan Weger (Institut für Virologie, Campus Benjamin Franklin, Charité - Universitätsmedizin Berlin) zur Verfügung gestellt. Um eine ausreichende Menge dieser Viren für die in vitro Versuche zur Verfügung zu haben, wurden neue Viren angezogen. Dafür wurden je Virus zwei 175 cm² Zellkulturflaschen mit HeLa-Zellen so ausgesät, dass sie 24 h später eine Konfluenz von 90 % erreicht hatten. Die jeweiligen Virusaliquots wurden mit 20 ml serumfreien Medium auf die Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 2 h bei 37 °C 3. Methoden 34 und 5 % CO2 im Brutschrank wurde das Medium gegen 20 ml frisches serumhaltiges Medium ausgetauscht. Die Zellen wurden anschließend für mind. 30 h weiter inkubiert. Der Fortschritt der virusbedingten Zelllyse wurde daraufhin mehrfach am Mikroskop begutachtet. Zum Zeitpunkt der vollständigen Zelllyse wurden die Zellkulturflaschen bei -80 °C über Nacht eingefroren. Anschließend wurden die virushaltigen Zellen wieder aufgetaut und der FrierTau-Zyklus wurde zweimal wiederholt. Das virushaltige Lysat wurde dann bei 3000 g und 4 °C für 30 min zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Die virushaltigen Überstände wurden anschließend aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Die Bestimmung des Virus-Titers erfolgte mittels Plaque-Assay. 3.6.2. Anzucht und Reinigung von Ad5 für in vivo Versuche Für die Produktion von Ad5 für die Applikation im Tierversuch wurden HEK293-Zellen in einer 6cm Zellkulturschale ausgesät und bei einem Konfluenzgrad von 90% mit Ad5 (3.6.1) infiziert. Die Zellen wurden anschließend bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 4 – 5 Tagen waren die Zellen komplett lysiert und 1,5 ml des Lysats wurden auf 3 mit HEK293-Zellen konfluent bewachsene 6cm Zellkulturplatten gegeben. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen kultiviert bis die Zellen komplett lysiert waren. Anschließend wurden 15 ml des Lysats auf 10 mit HEK293-Zellen konfluent bewachsene 15cm Zellkulturschalen gegeben und die Zellen für weitere 4 – 5 Tage unter Standardbedingungen kultiviert. Nach der Zelllyse wurde dem gesammelten Lysat Nonident P40 (NP-40, Fluka) mit einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben und für 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde das Lysat 10 min bei 20.000 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände mit 0,5 Vol. einer sterilen eisgekühlten 2,5M NaCl/20% PEG-Lösung vermengt und über Nacht bei 4°C gefällt. Anschließend wurde der Ansatz bei 20.000 g und 4°C für 15 min zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 4 ml TBS aufgenommen und bei 3.000 g und RT für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 2g CsCl versetzt und auf eine Dichte von 1,34 g/ml eingestellt, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C für eine Stunde und einer Zentrifugation bei 3.000 g und 4°C für 10 min. Der Überstand wurde in ein 2 ml Beckman Ultrazentrifugenröhrchen überführt und dieses verschweißt. Das Röhrchen wurde anschließend für 3 h bei 90.000 rpm und 20°C in einer Ultrazentrifuge (Beckman Rotor TLA120) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation konnte der Virusring, welcher sich gebildet hatte, vorsichtig mit einer Insulinkanüle abgezogen werden (max. 1 ml). Für die Reinigung der Viren wurde eine Sephadex-G-25 Säule 3 mal mit 6 ml TBS gewaschen. Anschließend wurde die Viruslösung auf die Säule gegeben und die gereinigte Viruslösung in 12 x 500 µl 3. Methoden 35 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden jeweils 1:10 in TBS verdünnt und bei der OD von 260 nm gemessen. Fraktionen mit einer OD von 0,5 oder höher wurden gepoolt und die OD nochmals bestimmt. Anschließend wurde Konzentration der Viruslösung wie folgt Partikel/µl = OD x Verdünnungsfaktor x 109 bestimmt: Zur Stabilisierung der Viren wurde 1 µg BSA pro µl Viruslösung zugegeben. Die Viruslösung wurde aliquotiert und bei -80°C gelagert. 3.6.3. Bestimmung des Adenovirus-Titers durch Plaque-Assay Zur Bestimmung des Ad-Titers wurde ein Plaque Assay auf HEK293-Zellen durchgeführt. HEK293-Zellen wurden so in 6-Well-Zellkulturplatten ausgesät, dass 24 h später ein konfluenter Zellrasen vorhanden war. Die Viruslösung wurde mit serumfreiem Medium dekadisch von 1:10 bis 1:109 verdünnt. Diese Verdünnungen wurden anschließend vorsichtig auf die konfluenten Zellen gegeben, wobei darauf geachtet wurde den Zellrasen nicht zu beschädigen. Es folgte ein Inkubationsschritt für 2 h bei 37 °C und 5 % CO2. Eine 5prozentige Low-Melting-Agarose wurde mittels Mikrowelle zum Schmelzen gebracht und auf 42 °C im Wasserbad temperiert. Die flüssige Agarose wurde mit frischem Medium 1:4 vermischt, die Viruslösung vorsichtig abgesaugt und die Zellen wurden mit dem agarosehaltigen Medium überschichtet. Zur Verfestigung der Agarosewurden die Zellkulturplatten für 10 min bei Raumtemperatur belassen und anschließend bei Standardbedingungen im Brutschrank kultiviert. Nach 7bis 10 Tagen waren mittels Mikroskop deutliche Plaques im Zellrasen auszumachen und wurden ausgezählt. Die Bestimmung der infektiösen Viruspartikel in PFU/ml erfolgte nach der Formel (ausgezählte Plaques x Verdünnungsstufe)/Volumen der Virusverdünnung in ml. Die Bestimmung erfolgte sowohl für Ad2 als auch für Ad5 in Doppelbestimmung mit zwei vollständig unabhängigen Verdünnungsreihen. 3.7. Produktion Adeno-assoziierter Virusvektoren (AAV-Vektoren) 3.7.1. Produktion von AAV-Vektoren Zur Produktion von AAV-Vektoren wurden HEK293T-Zellen verwendet. Die Produktion der Vektoren erfolgte für Zellkulturexperimente in 15cm Zellkulturschalen und für in vivo Anwendungen in 800 cm2 Rollerflaschen. Die Rollerflaschen wurden 30 min mit Kollagen beschichtet und anschließend mit PBS gewaschen. In Zellkulturschalen wurden 1 x 107und in Rollerflaschen wurden 5 x 107 HEK-293T-Zellen ausgesät. Wenn die Zellen eine Konfluenz 3. Methoden von 80 – 36 90 % erreicht hatten wurden sie mit AAV-Shuttle- und AAV- Verpackungsplasmiden mittels PEI co-transfiziert. Die Verhältnisse der DNA-Mengen der verschiedenen Plasmide können der folgenden Tabelle für das jeweilige Format entnommen werden. Format 15 cm Zellkulturplatte (AAV2) 15 cm Zellkulturplatte (AAV9) 800 cm² Rollerflasche (AAV9) AAV-Shuttle pDG p5E18-VP 2/9 pHelper 6 µg 18 µg --- --- 10 µg --- 10 µg 18 µg 50 µg --- 90 µg 90 µg Für die Transfektion wurde die Plasmid-DNA in 150 mM NaCl-Lösung verdünnt und mit 1 µl PEI (2,58 mg/ml) pro µg zu transfizierender DNA vermengt. Das Volumen des Transfektionsgemisches entspricht 10% des Kulturvolumens der zu transfizierenden Zellkultur. Der Transfektionsansatz wurde bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert und anschließend tropfenweise den zu transfizierenden Zellen zugegeben. Anschließend wurden die Zellen bei 37°C und 5% CO2 für 72 h inkubiert. Die Drehrate für die Produktion in Rollerflaschen betrug 0,2 rpm. 72 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet. Für die Zellkulturschalen wurde ein steriler Zellschaber benutzt, während die Zellen in den Rollerflaschen durch starkes Rotieren der Flasche abgelöst wurden. Die Zellen wurden anschließend im Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 1.000 g durch Zentrifugation pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets wurden 2 mal mit PBS gewaschen und ggf. mit weiteren Zellpellets derselben Vektorproduktion vereinigt. Die Zellen wurden durch 3 maliges Einfrieren bei -80°C und Auftauen bei 37°C im Wasserbad aufgeschlossen. Anschließend wurde pro ml Zelllysat 250U Benzonase zugegeben. Es folgte eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde im Wasserbad. Eine gute Durchmischung wurde durch regelmäßiges Invertieren erreicht. Die Entfernung der Zelltrümmer erfolgte durch Zentrifugation bei 4000 g für 30 min. Der vektorhaltige Überstand wurde überführt und die letzten Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 g für 30 min entfernt. Der vektorhaltige Überstand konnte anschließend direkt über einen Iodixanolgradienten gereinigt oder aber bei 80°C gelagert werden. 3. Methoden 37 3.7.2. Reinigung von AAV-Vektoren über Iodixanolgradienten Die Reinigung der produzierten AAV-Vektoren wurde durch eine Dichtegradientenzentrifugation mittels Iodixanol durchgeführt. Die unterschiedlichen Iodixanol-Lösungen (15%, 25%, 40% und 54%) wurden in einem OptiSeal®-Röhrchen (Beckman) mit steigender Konzentration unterschichtet (Abb. 3.1). Zur besseren Unterscheidung wurden die IodixanolLösungen mit 25% und 54% Iodixanol mittels Phenolrot unterschiedlich angefärbt. Die vektorhaltige Lösung wurde anschließend vorsichtig auf die oberste Iodixanolschicht aufgelagert. Der so hergestellte Gradient wurde in einer Ultrazentrifuge bei 18°C und 54.000 rpm (Rotor Beckman 70Ti) für 2 h bei ausgeschalteter Bremse zentrifugiert. Die AAV-Vektoren wurden dabei in der farblosen Bande zwischen der 25 %igen und der 54 %igen Iodixanolschicht angereichert. Mit Hilfe einer 18G-Kanüle wurde diese Schicht seitlich aus dem Röhrchen abgezogen. Abb. 3.1: Schichtung des Iodixanolgradientens. Durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen Phenolrot zu den 25% und 54% Schichten ergeben sich unterschiedliche Farben. 3.7.3. Konzentrierung der AAV-Vektoren Um eine möglichst hohe Konzentration an AAV-Vektoren zu erhalten, wurden die gereinigten AAV-Vektoren konzentriert. Dafür wurde die aus dem Gradienten abgezogene AAV-Lösung 10-fach mit PBS-MK verdünnt und anschließend in 15 ml Amicon Ultra Tubes (Millipore, Schwalbach, D) konzentriert. Die hohe Verdünnung der AAV-Lösung sollte ein Verstopfen der Filtereinheit vermeiden. Die AAV-Lösung wurde mittels der Amicon Tubes solange bei 2.000 g zentrifugiert bis das gewünschte Restvolumen erreicht wurde. Bei einer 3. Methoden 38 Produktion von AAV-Vektoren in 8 Rollerflaschen, wurde bis auf ein Restvolumen von 1 – 1,5 ml konzentriert. Anschließend wurde die AAV-Lösung aliquotiert und bei -80°C gelagert. 3.7.4. Quantifizierung der AAV-Vektoren Für die Quantifizierung der AAV-Vektoren wurde die Vektor-DNA isoliert. Um eine Kontamination mit möglicher verbliebener Plasmid-DNA zu vermeiden, wurde die AAVLösung 2 h mit DNaseI bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Vektorhüllen durch eine Inkubation mit Proteinase K für eine Stunde bei 37°C verdaut. Die dabei freigewordene Vektor-DNA wurde mittel Phenol-Chlorform-Extraktion isoliert und mit Ethanol gefällt. Die gereinigte DNA wurde in einer quantitativen real-time PCR bestimmt und gegen einen Standard aus einer dekadischen Verdünnung des AAV-Shuttleplasmids verglichen. Zur Detektion des CMV-Promotors, welcher sich in allen in dieser Arbeit untersuchten Vektoren befindet, wurden der CMV fw und CMV rev Primer sowie die 6‘-FAM-CMV-enhancer Sonde eingesetzt. Die PCR beinhaltete einen initialen Schritt von 50°C für 2 min, gefolgt von 10 min bei 95°C. Anschließend folgten 40 Zyklen von 15 sec bei 95°C und 1 min bei 60°C. 3.8. In vivo Mausexperimente Alle Tiere, die für diese Arbeit genutzt wurden, wurden in Einklang mit den Richtlinien der deutschen Tierschutzverordnung und Tierschutzgesetze gehalten und gepflegt. Alle tierexperimentellen Versuche wurden durch das Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo) Berlin genehmigt. Für die Arbeiten wurden ausschließlich Balb/C-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, D) eingesetzt. 3.8.1. Applikation von Vektoren und Viren Die 5 Wochen alten Balb/C-Mäuse wurden mittel Isofluran narkotisiert und über den Zeitraum der Applikation mit Hilfe eines Narkosegeräts unter Narkose gehalten und beatmet. Die Vektoren bzw. Viren wurden mit sterilem PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Das Applikationsvolumen lag bei 75 µl. Für den Eingriff wurde die vena jugularis freipräpariert und die Vektoren bzw. Viren mittels Hamiltonspritze und Katheter langsam in die Vene appliziert. Nach einem Zeitraum von einer Minute wurde der Katheter entfernt und die Blutung mit einem Wattestäbchen gestillt. Anschließend wurde die Wunde mit 3. Methoden 39 chirurgischem Nahtmaterial verschlossen. War es für einen Versuch erforderlich sowohl Vektoren als auch Viren bzw. zwei verschiedene Vektoren zu applizieren, wurde die erste Applikation über die linksseitige und die zweite Applikation über die rechtsseitige vena jugularis vollzogen. 3.8.2. Einleitung einer Immunsuppression Für die Immunsuppression der Versuchstiere wurde eine von Toth et al. angewandte Methode verwendet (153). Die 5 Wochen alten Balb/C-Mäuse wurden mit einer initialen Menge von 140 mg Cyclophosphamid (CP) pro kg Mausgewicht i.p. injiziert. Bis zum Ende des Versuchszeitraums wurde die Gabe von CP mit einer Menge von 100 mg pro kg Mausgewicht 2 mal wöchentlich wiederholt. Der Erfolg der Immunsuppression wurde mit Hilfe von Blutausstrichen überprüft. Die Begutachtung erfolgte durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Robert Klopfleisch (Institut für Tierpathologie der Freien Universität Berlin). 3.8.3. Gewinnung von Blutproben Um den Versuchstieren in regelmäßigen Abständen Blut abnehmen zu können, wurde mit Hilfe einer Lanzette (Goldenrod Animal Lancet (5 mm) MEDIpoint International Inc., USA) die vena facialis punktiert. Einige Tropfen Blut wurden aufgefangen bevor die Wunde mit einem Wattestäbchen gestillt wurde. Die Entnahme erfolgte wechselseitig an der linken und rechten vena facialis. Die Blutproben wurden für 20 min bei RT agglutiniert und anschließend bei 2.000 g für 15 min zentrifugiert. Das Serum wurde abgenommen und bei -20°C gelagert. 3.8.4. Organentnahme und -begutachtung Am Ende des Versuchszeitraums wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation euthanisiert und die Organe Leber, Lunge, Herz, Milz und Pankreas entnommen. Die Organe wurden für spätere Analysen zu gleichen Teilen sowohl in 4 %iger Paraformaldehyd-Lösung fixiert als auch in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die gefrorenen Organstücke wurden anschließend bei -80°C gelagert. Die Organstücke in 4%iger Paraformaldehyd-Lösung wurden durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Robert Klopfleisch (Institut für Tierpathologie der Freien Universität Berlin) weiter behandelt und analysiert. Die Organstücke wurden 24 h nach der Entnahme in Paraffin eingebettet und mittels Mikrotom wurden 2 µm starke Gewebeschnitte angefertigt. Die Gewebeschnitte wurden anschließend mit Eosin und Haematoxylin angefärbt (HE-Färbung) und begutachtet. 3. Methoden 3.9. 40 Statistik Die Ergebnisse sind als Durchschnittswerte angegeben mit dem Standardfehler (SEM) als Fehlerindikator. Für die Ergebnisse der in vitro Versuche wurde ein ungepaarter Student-tTest angewendet, während für die Ergebnisse der in vivo Untersuchungen der zweiseitige Mann-Whitney U-Test verwendet. Wenn die so errechneten P-Werte zwischen zwei Meßwertgruppen einen Wert kleiner 0,05 erreichten, wurde der Unterschied zwischen den Meßwertgruppen als signifikant bezeichnet. Dabei wurde für Werte zwischen 0,05 und 0,01 die Signifikanzstufe eines Sternchen (*) vergeben. Für Werte kleiner 0,01 wurden zwei Sternchen (**) und für Werte kleiner 0,001 wurden drei Sternchen (***) vergeben. 4. Ergebnisse 41 4. Ergebnisse 4.1. Antivirales Potential von solublen CAR-Varianten (in vitro) Schon seit geraumer Zeit werden soluble, also lösliche, Virusrezeptormoleküle benutzt, um virale Infektionen zu inhibieren. Das Prinzip beruht auf einer Bindung der Rezeptormoleküle an die entsprechenden Bindungsstellen des Virus, welche entweder eine Konformationsänderung des Virus hervorruft und es somit inaktiviert wird. Oder es findet eine reine Blockade der Virusbindungsstellen statt, wodurch das Virus seine spezifischen Zielzellen nicht infizieren kann. Es konnte bereits am Beispiel des Coxsackievirus B3 gezeigt werden, dass mit einer solublen (s) Form des Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptors (CAR) eine signifikante Inhibierung der viralen Infektion möglich ist (82). Da Adenoviren denselben Rezeptor benutzen wie das Coxsackievirus, lag die Vermutung nahe, dass sCARProteine ebenfalls Adenoviren inhibieren könnten. 4.1.1. Herstellung und Validierung des antiviralen Potentials verschiedener solubler CAR-Varianten Der Aufbau des CAR ist bereits in der Einleitung beschrieben (Abschnitt 1.2). Um eine soluble Rezeptorvariante zu erhalten, muss durch molekulargenetische Methoden die Transmembrandomäne (TM) des Rezeptors, welche den Rezeptor in der Zellmembran verankert, entfernt werden. Der extrazelluläre Bereich des Rezeptors, bestehend aus der virusbindenden D1-Domäne und der D2-Domäne, kann mit Domänen anderer Moleküle fusioniert werden, um zusätzliche spezifische Eigenschaften zu erhalten oder bestehende zu verstärken. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst 3 verschiedene Rezeptorvarianten untersucht und teilweise auch selbst hergestellt (Abb. 4.1). 4. Ergebnisse 42 Abb. 4.1: soluble Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptor-(sCAR)-Varianten. (links) Die verschiedenen Strukturelemente der sCAR-Varianten sind schematisch dargestellt sowie die molekulare Größe der Monomere. Alle sCAR-Varianten mit Ausnahme des sFc bestehen aus den extrazellulären Domänen (D1 und D2) des CAR und sind C-terminal mit anderen Strukturdomänen wie dem C4-bindenden Protein (C4bp) oder dem Fc-Teil des humanen Immunglobulin G1 (IgG-Fc) verknüpft (sCAR-C4bp/sCAR-Fc) oder stehen allein. In den CARDomänen existieren Glykosylierungsstellen (N106/N201), deren Position dargestellt ist. Das Molekül sFc besteht ausschließlich aus dem solubilisierten IgG-Fc und dient als Kontrolle. (rechts) Die exemplarische Darstellung einer möglichen 3D-Struktur des sCAR-Fc mit D1-Domäne (blau), D2-Domäne (grün) und IgG-Fc (gelb/rot). Die Struktur wurde anhand der Aminosäuren vorhergesagt. Das Modell wurde über „I-TASSER Server“ errechnet (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) Der für die Inhibierung der Coxsackievirus B3 Infektion bereits eingesetzte sCAR-Fc ist ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen des CAR und dem Fc-Teil des humanen Immunglobulin 1 (IgG1). Durch den Fc-Teil und seine beiden Disulfidbrücken am NTerminus bildet sCAR-Fc ein dimeres Protein mit annähernd 130 kDa. Außerdem werden durch den Fc-Teil die Stabilität und die Löslichkeit des Fusionsproteins erhöht (92). Die Rezeptorvariante sCAR besteht lediglich aus den beiden extrazellulären Domänen des CAR und liegt als Monomer vor. Bei dem Fusionsprotein sCAR-C4bp wurde der extrazelluläre Bereich des CAR mit der α-Kette des C4 bindenden Proteins fusioniert. Dies konnte bereits die Wirksamkeit von sCD46 erheblich steigern (87). sCAR-C4bp liegt durch den C4bp-Teil als Oktamer vor. Als Kontrolle dient unter anderem die soluble Form des Fc-Teil von IgG1 (sFc), welche keinerlei Anteile des CAR aufweist. Alle Konstrukte lagen in Expressionsplasmiden vor. Um Zellkulturüberstände mit sezernierten sCAR-Varianten zu erhalten, wurden HEK293Zellen mit den verschiedenen Expressionsplasmiden äquimolar (gleiche Molekülmengen) transfiziert und die Überstände 72h nach Transfektion abgenommen. Um die Größe und das Sekretionslevel der verschiedenen Rezeptorvarianten zu vergleichen, wurden die CARhaltigen Überstände in einem denaturierenden Westernblot aufgetrennt (Abb. 4.2). 4. Ergebnisse 43 Abb. 4.2: Proteinexpression der verschiedenen sCAR-Varianten. HEK293-Zellen wurden mit äquimolaren Mengen der entsprechenden Expressionsplasmide mittels PEI transfiziert. Die Zellkulturüberstände mit den solublen Proteinen wurden 72h später abgenommen, über eine denaturierende PAGE aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert. Die sCAR-Varianten wurden mittels anti-CARAntikörper (H300) und sFc wurde mittels anti-IgG-FcAntikörper nachgewiesen. Als Marker wurde der SeeBlue®Plus2-Marker (Invitrogen) verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass alle solublen Proteine sezerniert werden und auch in ihrer Größe den Erwartungen entsprechen. Allerdings zeigte der Westernblot unterschiedliche Expressionslevel der verschiedenen Konstrukte. Es scheint dass je kleiner das Protein ist, um so mehr kann innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens sezerniert werden. Die Proteine sCAR und sFc sind mit ca. 30 kDa die kleinsten der Rezeptorkonstrukte und liegen in einem hohen Expressionslevel vor. Außerdem scheint auch die Oligomerisierung des nativen Proteins eine entscheidende Rolle bei der Sekretion zu spielen. So ist das sCAR-C4bp-Konstrukt nur um einige kDa größer als sCAR, allerdings liegt das native Protein von sCAR-C4bp als Oktamer vor, während sCAR als Monomer vorliegt. Um zu zeigen, dass sCAR-Varianten grundsätzlich in der Lage sind Ad zu inhibieren und um das antivirale Potential der verschiedenen Rezeptorvarianten einschätzen zu können, wurde zunächst untersucht, inwieweit diese die Aufnahme von replikationsdefizienten Adenovektoren (AdV) in Zellen inhibieren können. Hierfür wurde Ad5TRELuc genutzt, welcher Firefly-luciferase exprimiert. Dadurch lässt sich mittels Messung der Luciferase- 150 100 50 FP G sF c 4b p sC A R -C R sC A R -F c 0 sC A relative Luciferase Aktivität [%] Aktivität direkt die AdV-Aufnahme in die Zellen messen (Abb. 4.3). Abb. 4.3: Inhibierung der AdV-Aufnahme durch sCAR-Varianten. HEK293-Zellen wurden mit äquimolaren Mengen der entsprechenden Expressionsplasmide mittels PEI transfiziert. Die Zellkulturüberstände wurden 72h später abgenommen. Replikationsdefiziente Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) wurde in 500 µl der entsprechenden sCAR-haltigen Zellkulturüberstände für 30 min vorinkubiert und anschließend für 2 h auf HeLa-Zellen gegeben. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Luziferaseaktivität bestimmt. 4. Ergebnisse 44 Als Kontrolle dienen sowohl GFP- als auch sFc-Medium. Das Zellkulturmedium von GFPtransfizierten Zellen, in welchem sich keine rekombinanten solublen Proteine befanden, diente dabei als Referenz zu den Medien mit solublen Rezeptorvarianten. Das sFc-Medium enthielt ein solubles Protein, welches keine Bestandteile des ursprünglichen CAR aufweist und dient demnach als Kontrolle, inwieweit der Fc-Teil des humanen IgG1 in der Lage ist AdV zu binden bzw. deren Aufnahme in die Zelle zu inhibieren. Es konnte gezeigt werden, dass die solublen CAR-Varianten generell in der Lage sind, die Aufnahme von AdV in die Zellen zu inhibieren, wobei die Effizienz der verschiedenen Varianten variierte. sCAR-Fc und sCAR-C4bp hatten beide mit 76,5% eine höhere inhibierende Effizienz auf die AdVAufnahme, als sCAR mit 54,4%. Das Protein sFc, zeigt keine Inhibierung gegenüber AdV, was nahe legt, dass die Inhibierung der AdV-Aufnahme ausschließlich über den extrazellulären Teil des CAR erfolgt. Die beiden sCAR-Fusionsproteine sCAR-Fc und sCARC4bp waren ähnlich effektiv die Aufnahme von AdV in Zellen zu inhibieren. Allerdings unterschieden sich beide sehr stark in ihrem Expressionslevel im Zellkulturüberstand (Abb. 4.2), was auf ein unterschiedliches Sekretionsverhalten hindeutet. Da die solublen Rezeptorvarianten beim Einsatz im Mausmodell über virale Vektoren in den körpereigenen Zellen exprimiert werden sollen, spielt ein hohes Expressionslevel und eine gute Solubilisierung eine entscheidende Rolle für die Anreicherung der Fusionsproteine in der Blutbahn. Aufgrund der komplexen Struktur, Größe und damit einhergehenden schlechten Solubilisierung von sCAR-C4bp war zu vermuten, dass eine in vivo Expression zu einem niedrigen Expressionslevel in der Blutbahn führen würde. Daher wurde für weitere Untersuchungen dem sCAR-Fc der Vorzug gegeben. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass sCAR-Fc und sCAR-C4bp die Aufnahme von AdV in die Zielzellen inhibieren können. 4.1.2. Einfluss der Struktur von solublen CAR-Varianten auf ihre antivirale Wirkung Da in den vorangegangenen Experimenten beobachtet werden konnte, dass kleinere Proteine potentiell besser sezerniert und demnach viel stärker im Medium angereichert werden, wurde in den nachfolgenden Experimenten untersucht, ob durch Reduktion der Größe von sCAR-Fc eine verstärkte Sezernierung auftritt. Um dabei die Effizienz der Virusinhibierung zu erhalten, wurde die D2-Domäne, in der sich keine Virusbindungsstellen befinden (72), am Cterminalen Ende schrittweise deletiert. Dabei entstanden durch genetic engineering 6 4. Ergebnisse 45 verschieden lange Proteine (Abb. 4.4), wobei bei einer Variante (sCAR-3-Fc) die D2-Domäne vollkommen deletiert wurde. Abb. 4.4: sCAR-Fc-Varianten mit unterschiedlichen D2-Domänen. Die Strukturelemente sind wie in Abbildung 3.1 dargestellt. Die Größe der D2-Domäne ist durch die Aminosäurereste angegeben. Ausgehend von sCAR-Fc wurde die D2-Domäne schrittweise verkürzt, bzw. komplett deletiert. Im Fall von sCAR-D2-Fc wurde eine zusätzliche D2-Domäne eingefügt. Bei dem Protein sCAR-Hinge wurde ausgehend von sCAR-Fc die FcDomäne bis auf die Hinge-Region mit den Disulfidbrücken verkürzt. Bei der Verkürzung wurde darauf geachtet, dass bestehende Motive der Sekundärstruktur nicht zerstört werden (154) (Uniprot Datenbank P78310-CXADR_HUMAN). Weiterhin wurde eine Variante mit zusätzlicher D2-Domäne (sCAR-D2-Fc) konstruiert, da aus anderen Veröffentlichungen hervorging, dass eine zusätzliche Domäne zu einer höheren Effizienz führen könnte (92). Andererseits wurde bei einer Variante der Fc-Teil bis auf die dimerisierende Hinge-Region gekürzt (sCAR-Hinge), wobei eine Stabilisierung des Dimers nur noch über die beiden Schwefelbrücken möglich ist, aber letztendlich eine sehr kleine sCAR-Variante entsteht. Die so erhaltenen sCAR-Fc-Varianten wurden, wie die anderen sCAR-Konstrukte, hinsichtlich ihrer Expression und ihrer Effizienz bei der Inhibierung von Ad-Infektionen mit dem humanen sCAR-Fc verglichen. HEK293-Zellen wurden äquimolar mit den verschiedenen sCAR-Fc-Mutanten exprimierenden Plasmiden transfiziert und die Überstände mit den sCAR-Varianten 72 h später abgenommen. In denaturierender und reduzierender SDS-PAGE waren deutlich die Größenunterschiede und Expressionslevel der einzelnen Varianten zu erkennen (Abb. 4.5). 4. Ergebnisse 46 Abb. 4.5: Proteinexpression der verschiedenen sCAR-Varianten. HEK293-Zellen wurden mit äquimolaren Mengen der entsprechenden Expressionsplasmide mittels PEI transfiziert. Die Zellkulturüberstände mit den solublen Proteinen wurden 72h später abgenommen und über eine denaturierende PAGE aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert. Die in ihrer Größe veränderten sCAR-Varianten wurden mittels anti-CAR-Antikörper (H300) und die speziesspezifischen sCAR-Varianten wurden mittels anti-IgG-Fc-Antikörper nachgewiesen. Als Marker wurde der SeeBlue®Plus2-Marker (Invitrogen) verwendet. Die sCAR-Varianten mit der verkürzten bzw. deletierten D2-Domäne hatten ein ähnliches Expressionslevel wie sCAR-Fc, wobei die kürzeren Proteine tendenziell in größeren Mengen sezerniert werden. Die Variante mit der zusätzlich eingeführten D2-Domäne und damit dem größten Fusionsprotein in diesem Versuch, zeigte dagegen ein geringeres Expressionslevel. Das vergleichsweise kurze sCAR-Hinge wies im Vergleich zu den anderen Varianten die höchste Anreicherung im Zellkulturüberstand auf. Obwohl die SDS-PAGE unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungendurchgeführt wurde, was zur Auflösung der Oligomere führen sollte, ließen sich vor allem bei den sCAR-Varianten mit den verkürzten D2-Domänen weitere Proteinbanden erkennen. Dies lässt darauf schließen, dass die Dimere, welche durch den Fc-Teil des Fusionsproteins gebildet wurden, nicht vollständig in ihre monomerische Form überführt wurden, was für eine hohe Stabilität des Fusionsproteins spricht. Um das Inhibierungspotential der verschiedenen sCAR-Varianten auf die AdInfektion unabhängig von ihrem Expressionslevel bewerten zu können, wurden die Proteinmengen in den Überständen auf einen einheitlichen Wert eingestellt. Dafür wurde per kommerziell erhältlichem IgG-ELISA-Kit die Proteinmenge in den Zellkulturüberständen 4. Ergebnisse 47 bestimmt und auf den Wert von 2,5 µg/ml eingestellt. Ausgenommen von dieser Vorgehensweise war die Variante sCAR-Hinge, da durch die stark verkürzte Fc-Domäne keine Detektion mit Hilfe des ELISA-Kits möglich war. Die Variante sCAR-D2-Fc zeigte ein sehr geringes Expressionslevel und erreichte innerhalb dieser Versuche nicht die Konzentration von 2,5 µg/ml, sondern nur 300 ng/ml. Die Varianten sCAR-Hinge und sCARD2-Fc wurden daher unverdünnt in den Inhibierungsversuchen gegen AdV eingesetzt. Als Kontrolle diente konditioniertes Medium, welches von nicht transfizierten Zellen abgenommen wurde. Ad5TRELuc wurde wie oben beschrieben mit den entsprechenden Überständen inkubiert und auf HeLa-Zellen gegeben. Nach 24 h wurde die LuciferaseAktivität bestimmt (Abb. 4.6). Abb. 4.6: Inhibierung der AdV-Aufnahme durch verschieden große sCAR-Varianten. HEK293-Zellen wurden mit äquimolaren Mengen der entsprechenden Expressionsplasmide mittels PEI transfiziert. Die Zellkulturüberstände mit den solublen Proteinen wurden 72h später abgenommen, die Proteinmenge in den Überständen mittels IgG-ELISA-Kit ermittelt und auf einen Wert von 2,5 µg/ml eingestellt. Bei sCARVarianten welche das Kit nicht detektieren kann (sCAR-Hinge) oder nur sehr gering sezerniert wurden (sCARD2-Fc) wurde keine Einstellung der Proteinkonzentration vorgenommen. Replikationsdefiziente Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) wurde in 500 µl der entsprechenden sCAR-haltigen Zellkulturüberstände für 30 min vorinkubiert und anschließend für 2 h auf HeLa-Zellen gegeben. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Luziferaseaktivität bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei sCAR-Varianten welche eine verkürzte oder deletierte D2Domäne aufweisen die Inhibierungsfähigkeit im Vergleich zu sCAR-Fc mit zunehmender Verkürzung der Domäne stark abnimmt. Die Variante sCAR-3-Fc, bei welcher nur noch die virusbindende D1-Domäne mit dem IgG-Fc-Teil fusioniert ist, zeigt nahezu keinen inhibierenden Effekt. Inwieweit dieser Effekt durch eine rein strukturelle Funktion der D2Domäne oder aber durch eine direkte Beteiligung an der Virusbindung entsteht, muss noch 4. Ergebnisse 48 geklärt werden. Die Inhibierung der Aufnahme von AdV in die Zellen war bei der über den Fc-Teil verkürzten Variante sCAR-Hinge ähnlich stark ausgeprägt wie bei sCAR-Fc. Allerdings ist dessen Expressionslevel im Vergleich zu sCAR-Fc beträchtlich höher (Abb. 4.5), sodass sich auch aus diesem Konstrukt keine höhere Effizienz bei der AdV-Inhibierung ableiten lässt. Interessanterweise verhält es sich bei dem Fusionsprotein mit der doppelten D2-Domäne - sCAR-D2-Fc – gegenteilig zum sCAR-Hinge. Obwohl das Expressionslevel deutlich niedriger ist (Abb. 4.5), erreicht sCAR-D2-Fc in seiner Inhibierungsfähigkeit ähnliche Werte wie sCAR-Fc. Dabei tritt die gleiche Problematik wie bei dem vorher beschriebenen sCAR-C4bp auf: Wenn keine gute Solubilisierung des Fusionsproteins gegeben ist, dann bietet sich dieses nicht für einen Einsatz im Mausmodell an. Nach der Untersuchung verschiedener strukturell modifizierter sCAR-Varianten hinsichtlich ihrer Inhibierungsfähigkeit gegen AdV aber auch ihrer Solubilisierung, stellte sich das Fusionsprotein sCAR-Fc, welches aus den vollständigen extrazellulären Domänen des CAR und aus dem IgG-Fc-Teil besteht, als die effizienteste und im Hinblick auf die geplanten in vivo Untersuchungen am besten geeignete sCAR-Variante dar. Dieses Protein lässt sich gut solubilisieren und wurde bereits erfolgreich in einem in vivo Versuch gegen Coxsackieviren eingesetzt. In den weiterführenden Experimenten zur Inhibierung von Ad-Infektionen wurde daher ausschließlich mit sCAR-Fc gearbeitet. 4.1.3. Konzentrationsabhängigkeit der antiviralen Wirkung von sCAR-Fc Es ist bekannt, dass Coxsackieviren der Gruppe B CAR als Internalisierungsrezeptor nutzen. Eine Bindung von Coxsackievirus an CAR führt zu einer Konformationsänderung des Virus, wodurch sogenannte A-Partikel (altered particles) entstehen, durch die anschließende das Virusgenom in die Zielzelle eingebracht wird. Der Vorgang der A-Partikel-Bildung wurde auch beobachtet, wenn Coxsackieviren die lösliche Rezeptorvariante sCAR-Fc binden (82). Dabei verliert das Virus seine Infektiosität, da das Virusgenom nicht in eine Zielzelle transportiert werden kann. Demnach scheint es theoretisch möglich, dass ein einziges sCARFc Oligomer die Bildung eines A-Partikel hervorrufen kann. CAR dient im Gegensatz zu Coxsackieviren bei Ad aber nur der Anheftung (attachment) des Virus an die Zelle. Die Internalisierung in die Zelle erfolgt dann über Integrine. Um Ad effektiv durch sCAR-Fc inhibieren zu können, muss theoretisch jede Rezeptorbindungsstelle des Virus besetzt sein, da sonst eine Bindung des zellulären Rezeptors über eine unbesetzte Bindungsstelle möglich sein könnte. Demnach konkurrieren zellulärer CAR und sCAR-Fc um die Bindungsstellen am 4. Ergebnisse 49 Virus kompetitiv. Die Inhibierung von Ad durch sCAR-Fc würde daher stark von der Menge des eingesetzten Fusionsproteins abhängen. Im Folgenden wurde eine mögliche Konzentrationsabhängigkeit dieses Mechanismus überprüft. Zellkulturüberstände mit sCARFc wurden wie unter Punkt 4.1.1. beschrieben hergestellt und mittels AmiconFiltersystemkonzentriert. Anschließend wurde die Proteinmenge durch einen IgG-Fc-ELISA bestimmt und ergab eine Konzentration von 50 µg/ml. Als Kontrolle dienten Kulturüberstände von Zellen, welche mit der trunkierten Variante von sCAR-Fc transfiziert wurden. Diese Variante bildet durch Translationsabbruch nach der 10. Aminosäure kein Protein und dient demnach als Negativkontrolle. Replikationsdefiziente Ad5TRELuc wurden mit definierten Mengen sCAR-Fc vorinkubiert und anschließend auf HeLa-Zellen gegeben. Die Aufnahme der AdV in die Zellen wurde 24h später durch Luciferase-Assay verifiziert relative Luciferase Aktivität [%] (Abb. 4.7). 150 100 50 0 0 1 5 10 sCAR-Fc [µg/ml] 20 50 Abb. 4.7: Konzentrationsabhängigkeit der Inhibierung von AdV durch sCAR-Fc. HEK293-Zellen wurden mit sCAR-Fc-Expressionsplasmid mittels PEI transfiziert. Die Zellkulturüberstände mit den solublen Proteinen wurden 72h später abgenommen. Die Überstande wurden mittels Amicon-Filtersystem konzentriert und die sCAR-Fc-Konzentration mittels IgG-Fc-ELISA-Kit bestimmt. Der replikationsdefiziente Adenovektor Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) wurde mit verschiedenen Mengen sCAR-Fc für 30 min in 500 µl Medium vorinkubiert und anschließend für 2 h auf HeLa-Zellen gegeben. Als Kontrolle wurden Zellkulturüberstände mit einer trunkierten sCAR-Fc Variante eingesetzt (0 µg). Die Konzentrationsstufen wurden mit diesem Kontrollmedium auf die entsprechenden Mengen verdünnt. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Luziferaseaktivität bestimmt. Dabei ließ sich beobachten, dass mit steigender sCAR-Fc Menge, bei gleicher Vektorenzahl, die AdV-Aufnahme signifikant reduziert wurde. Bei der in diesem Experiment höchsten eingesetzten sCAR-Fc Menge konnte eine maximale Inhibierung von mehr als 95% im Vergleich zur Kontrolle erreicht werden. Dies zeigt, dass die Inhibierung der AdV durch 4. Ergebnisse 50 sCAR-Fc dem Mechanismus der kompetitiven Hemmung ähnlich ist und von der Menge an Inhibitor, also sCAR-Fc, abhängt. 4.1.4. Mechanismus der adenoviralen Inhibierung durch sCAR-Fc Der Mechanismus der AdV-Inhibierung über sCAR-Fc zeigt, dass durch Blockierung der Rezeptorbindungsstellen am AdV die Internalisierung in die Zielzelle verhindert oder zumindest stark erschwert wird. Daraus ergibt sich allerdings auch die Problematik, dass sCAR-Fc nur extrazellulär wirken und AdV inhibieren kann. Wurde eine Zelle bereits von AdV transduziert, kann das Fusionsprotein die intrazellulären Infektions- und Replikationsschritte nicht mehr beeinflussen. Um dies zu bestätigen, wurde im AdVAufnahme-Assay sCAR-Fc zu unterschiedlichen Zeitpunkten zum AdV zugegeben. Im prophylaktischen Ansatz wurden die AdV mit sCAR-Fc haltigen Medium (wie unter Punkt 4.1.1. beschrieben hergestellt) vorinkubiert und anschließend auf HeLa-Zellen gegeben bzw. wurden AdV gleichzeitig mit sCAR-Fc haltigen Medium auf HeLa-Zellen gegeben. Im therapeutischen Ansatz wurden HeLa-Zellen zunächst mit AdV transduziert und sCAR-Fc wurde anschließend auf die Zellen gegeben. Als Kontrolle diente konditioniertes Medium. Die Auswertung erfolgte über die Bestimmung der Luciferase-Aktivität (Abb. 4.8). Abb. 4.8: Inhibierung der AdV-Aufnahme zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Replikationsdefiziente Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) wurde für die Vorinkubation in 500 µl sCAR-Fc-haltigen Zellkulturüberstand (10 µg/ml) für 30 min inkubiert und anschließend für 2 h auf HeLa-Zellen gegeben. Für die gleichzeitige Applikation wurden HeLa-Zellen mit sCAR-Fc-haltigem Zellkulturüberstand inkubiert und anschließend für 2 h mit Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) transduziert. Zusätzlich wurden HeLa-Zellen mit Ad5TRELuc (200 Partikel/Zelle) 2 h transduziert und anschließend mit sCAR-Fc-haltigen Zellkulturüberstand versorgt. Als Kontrolle diente konditioniertes Medium. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Luciferaseaktivität bestimmt. 4. Ergebnisse 51 Die Ergebnisse zeigen, dass nur der prophylaktische Einsatz von sCAR-Fc zu einer signifikanten Reduktion der AdV-Aufnahme in die Zellen führt. Der therapeutische Einsatz von sCAR-Fc zeigte keinen Einfluss auf die intrazelluläre Expression des Reportergens Luciferase, folglich hat sCAR-Fc keinen Einfluss auf die AdV, wenn diese bereits in die Zelle aufgenommen wurden. Letztendlich konnte gezeigt werden, dass sCAR-Fc grundsätzlich in der Lage ist AdV signifikant zu inhibieren und damit auch potentiell Ad-Infektionen. Die Ergebnisse der Inhibierungsversuche mit replikationsdefizienten AdV stellen allerdings nur ein artifizielles Modell dar, da dabei allein die AdV-Aufnahme in die Zellen bestimmt werden kann, jedoch andere Aspekte adenoviraler Infektionen wie DNA-Replikation, Zelllyse und Neuinfektion nicht untersucht werden können. Um einen Einsatz von sCAR-Fc als antiadenovirale Therapie bewerten zu können, wurden in den nachfolgenden Experimenten Wildtyp-Ad eingesetzt. 4.2. Anti-adenovirale Wirkung von sCAR-Fc gegen Wildtyp-Adenoviren (in vitro) Da bereits gezeigt werden konnte, dass das Fusionsprotein sCAR-Fc die Aufnahme von replikationsdefizienten AdV in Zellen inhibieren kann, sollte im Folgenden untersucht werden, inwieweit sCAR-Fc auch replikationskompetente Wildtyp-Ad inhibieren kann. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei auf die Zellviabilität, die Replikation viraler DNA und die Generierung neuer infektiöser Viruspartikel gelegt. Für die Untersuchungen standen uns humane Ad2 und Ad5 zur Verfügung, welche uns freundlicherweise von Dr. Stefan Weger (Institut für Virologie, CBF, Charité Universitätsmedizin Berlin) bereitgestellt wurden. Diese Viren wurden anschließend in unserer Arbeitsgruppe amplifiziert, konzentriert, aufgereinigt und quantifiziert hinsichtlich ihrer physischen und biologisch aktiven Partikel. 4.2.1. Herstellung von sCAR-Fc für die Virusversuche Für die Inhibierungsversuche mit den Wildtyp Ad wurden sCAR-Fc in hoher Konzentration benötigt. Dies ist mit sCAR-Fc haltigen Überständen, welche durch Plasmidtransfektion sCAR-Fc exprimierender Plasmide generiert wurden, nicht oder nur unter Konzentrierung mittels Amicon-Filter zu erreichen. Daher wurden HeLa-Zellen mit AdG12, einem replikationsdefizienten AdV welcher sCAR-Fc unter einem Doxyzyklin (Dox)-abhängigen Promoter exprimiert (82), transduziert. Der adenovirale Vektor und die Zugabe von Dox 4. Ergebnisse 52 ermöglichen eine hohe Expression des Transgens und folglich eine hohe Anreicherung von sCAR-Fc im Kulturmedium. 72h nach Transduktion wurde das Medium abgenommen und die sCAR-Fc Konzentration mittels IgG-Fc-ELISA bestimmt. Als Kontrollmedium wurden Zellen mit Ad5TetO7[HRE]AFP-luc (155) transfiziert, welcher kein solubles Protein exprimiert. Da in diesen Experimenten sCAR-Fc von einem adenoviralen Vektor, und nicht wie in den vorhergehenden Versuchen über ein Expressionsplasmid, exprimiert wurde, musste anfangs geprüft werden, inwieweit das aktuelle Fusionsprotein ähnlich gut die Aufnahme von AdV inhibiert. Somit sollte sichergestellt werden, dass die sCAR-Fc aus unterschiedlichen Quellen sich in ihrer Funktion und ihrem antiviralen Potential nicht unterscheiden. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Dosen Ad5CMVluc (156) mit sCARFc haltigen Medium bzw. Kontrollmedium inkubiert und anschließend auf EA.hy926-Zellen gegeben. Die Aufnahme der AdV wurde 24h später über die Expression des Reportergens Luciferase verifiziert (Abb. 4.9). Abb. 4.9: Inhibierung der AdV-Aufnahme durch adenoviral hergestelltes sCAR-Fc. HeLa-Zellen wurden mit je 1000 Viruspartikeln (VG)/Zelle AdG12 (sCAR-Fc-Medium) bzw. Ad5TetO7[HRE]AFP-luc (Kontrollmedium) transfiziert und jeweils mit 1µg/ml Dox versetzt. Zellkulturüberstände wurden 72 h später abgenommen und die sCAR-Fc Konzentration mittels IgG-Fc-ELISA-Kit bestimmt. Verschiedene Konzentrationen replikationsdefiziente Ad5CMVLuc wurden in 500 µl sCAR-Fc-haltigen Zellkulturüberstand (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium für 30 min inkubiert und anschließend für 2 h auf EA.hy926-Zellen gegeben. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Luziferaseaktivität bestimmt. Die Inhibierung der AdV-Aufnahme in die Zelle lag im Bereich zwischen 68% und 77%, wobei die Inhibierung mit sinkender Vektordosis zunahm. Demnach lag die Inhibierungsrate genau in dem Bereich, welcher basierend auf den Experimenten mit sCAR-Fc exprimierenden Plasmiden für die eingesetzte sCAR-Fc Menge erwartet wurde. Daher wurden für die Inhibierungsversuche mit Wildtypviren das sCAR-Fc-haltige Kontrollmedium eingesetzt, welche über die AdV exprimiert wurden. Medium und das 4. Ergebnisse 53 4.2.2. Protektive Wirkung von sCAR-Fc bei Adenovirusinfektionen Da sCAR-Fc seine inhibierende Wirkung nur extrazellulär entfalten und demnach auch nur den initialen Schritt der Bindung des Virus an CAR stören kann, wurde bisher nur die eigentlich Aufnahme der Ad/AdV in die Zellen untersucht. Allerdings muss bei einer Ad Infektion in Betracht gezogen werden, dass diese durch voll replikationskompetente Viren verursacht wird und eine Vielzahl von Replikationszyklen durchlaufen kann. Nach jedem Zyklus werden neue Ad frei und können weitere Zellen infizieren. Dabei besteht die Möglichkeit, dass sCAR-Fc die Aufnahme der neuen Viren ebenso inhibieren kann wie bei der Initialaufnahme. Demnach stellte sich die Frage, inwieweit sCAR-Fc, trotz des ausschließlich extrazellulären Wirkens, die Replikation der viralen DNA, die Generierung neuer infektiöser Viren und die Viabilität der infizierten Zellen beeinflussen kann. Die Zellviabilität stellt einen guten Indikator für die Schwere einer laufenden Infektion mit Ad dar. Der durch die virale Infektion ausgelöste Stress wird dabei durch einen zytopathischen Effekt (CPE) sichtbar und erlaubt dadurch eine Bewertung des allgemeinen Zustands der Zellkultur. Um den Einfluss von sCAR-Fc auf die Zellviabilität zu zeigen, wurden EA.hy926-Zellen mit sCAR-Fc haltige Medium bzw. Kontrollmedium (wie unter Punkt 4.2.1. beschrieben) versorgt und anschließend mit unterschiedlichen Virusdosen Ad2 infiziert. Da nicht klar war, ob sCAR-Fc durch die Virusbindung verbraucht wird oder über längere Zeit in der Zellkultur wirksam bleibt, wurde ein Teil der Zellkultur täglich mit neuem sCAR-Fc haltigen Medium bzw. Kontrollmedium versorgt, während der andere Teil nur mit frischem Medium aufgefüllt wurde. Nach 5 bzw. 6 Tagen wurden die Zellen fixiert und die lebenden Zellen mit Kristallviolett angefärbt (Abb. 4.10). Abb. 4.10: Inhibierung der Ad-induzierten Zytotoxizität durch sCAR-Fc. EA.hy926-Zellen wurden mit 500 µl sCAR-Fc-haltigen Medium (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium versorgt und anschließend mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. Zum einen wurde das sCAR-Fc-Medium bzw. das Kontrollmedium täglich gewechselt und zum anderen wurde es über den gesamten Versuchsablauf auf den Zellen belassen. Nach 5 bzw. 6 Tagen nach der Infektion erfolgte eine Beurteilung der Zellviabilität über eine Kristallviolettfärbung der noch lebenden Zellen. 4. Ergebnisse 54 Anschließend wurde der Grad des CPE begutachtet. Dabei zeigte sich, dass bei den mit Ad infizierten Zellen, welche mit sCAR-Fc behandelt wurden, kein CPE festzustellen war. Die unbehandelten Ad-infizierten Zellen zeigten einen umso höheren CPE je mehr Virusdosis eingesetzt wurde. Die infizierten Zellen, deren Medium täglich erneuert wurde, zeigten die gleiche Ausprägung des CPE wie die Zellen deren Medium nicht erneuert wurde. Dies lässt darauf schließen, dass sCAR-Fc auch über einen längeren Zeitraum in der Zellkultur wirksam bleibt. Da die Beurteilung der Schwere einer Ad Infektion allein über den CPE eine eher ungenaue, weil subjektive, Beobachtung darstellt, muss diese durch quantitative Analysen untermauert werden. Dafür kann sowohl die Replikation der viralen DNA als auch die Generierung neuer infektiöser Viren bestimmt werden. Für dieses Experiment wurden EA.hy926-Zellen mit verschiedenen Mengen Ad2 in An- bzw. Abwesenheit von sCAR-Fc infiziert und nach 48h durch Frier-Tau lysiert. Zum einen wurde mit Hilfe einer quantitativen PCR die Menge an viraler DNA bestimmt und zwischen sCAR-Fc behandelten und unbehandelten Zellen (Kontrollmedium wie unter Punkt 4.2.1. beschrieben) verglichen. Zum anderen wurden die durch Frier-Tau freigesetzten Ad in einem Plaque-Assay eingesetzt, um die Zahl an neu generierten infektiösen Viren zu bestimmen (Abb. 4.11). Abb. 4.11: Inhibierung der adenoviralen Replikation durch sCAR-Fc. EA.hy926-Zellen wurden mit 500 µl sCAR-Fc-haltigen Medium (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium überschichtet und anschließend mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. 48 h nach der Infektion wurden die Zellen durch 3x Frier-Tau lysiert und die Menge viraler DNA mittels quantitativer Realtime-PCR mit Hexon spezifischen Primern bestimmt (links). Zusätzlich wurde die Menge an neugebildeten infektiösen Viren mittels Virus-Plaque-Assay quantifiziert (rechts). Beide Methoden zeigten eine dosisabhängige Inhibierung der Ad-Replikation durch sCARFc, da sowohl weniger virale DNA replizierte und auch weniger neue infektiöse Viren generiert wurden. Die Inhibierung lag für die Replikation der viralen DNA zwischen 97,5% und 85,5%, während sie bei der Bildung neuer Viren zwischen 99,1% und 79,3% lag. Auch hier zeigt sich wieder die Konzentrationsabhängigkeit dieses Mechanismus. Je weniger Virus bei gleichbleibender Menge sCAR-Fc für die Infektion genutzt wird, umso höher ist der 4. Ergebnisse 55 inhibierende Effekt. Damit konnte bestätigt werden, dass die Inhibierung des CPE durch die sCAR-Fc vermittelte Inhibierung der Virusreplikation erfolgt. 4.2.3. Dosiseskalationsstudie Da sich sCAR-Fc bisher als sehr potenter Inhibitor bei Ad Infektionen erwiesen hat, sollte im Folgenden durch eine Dosiseskalation ermittelt werden, bis zu welcher Ad-Dosis prophylaktisch verabreichtes sCAR-Fc einen protektiven Effekt auf die infizierten Zellen ausübt. Dafür wurden EA.hy926-Zellen in An- bzw. Abwesenheit von sCAR-Fc mit Dosen von 2,5 bis 50 MOI Ad5 infiziert. An Tag 4 bzw. Tag 6 p.i. wurde der CPE mittels einer Kristallviolett-Färbung bewertet (Abb. 4.12). Abb. 4.12: Dosiseskalationstudie von Ad5 in An- bzw. Abwesenheit von sCAR-Fc. EA.hy926-Zellen wurden mit 500 µl sCAR-Fc-haltigen Medium (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium überschichtet und anschließend mit verschiedenen Dosen Ad5 infiziert. 4 bzw. 6 Tage nach der Infektion erfolgte eine Ermittlung der Zellviabilität über eine Kristallviolettfärbung der noch lebenden Zellen. Es zeigte sich deutlich, dass die Zellen, welche nicht mit sCAR-Fc behandelt wurden fast komplett lysiert waren, während die Zellen, welche sCAR-Fc prophylaktisch erhalten hatten einen sehr viel geringeren CPE aufwiesen. An Tag 6 war der CPE von sCAR-Fc behandelten Zellen (50 MOI) und mit Kontrollmedium behandelten Zellen (2,5 MOI) ähnlich ausgeprägt. Dies zeigt, dass eine prophylaktische Gabe von sCAR-Fc in einer 20-fachen Reduzierung des CPE infizierter Zellen resultiert. Das anti-adenovirale Potential von sCAR-Fc konnte damit bestätigt werden. 4. Ergebnisse 56 4.2.4. Antivirale Wirkung von sCAR-Fc in der Leberzelllinie Da sCAR-Fc im späteren Verlauf auch im Tiermodell eingesetzt werden soll, musste überprüft werden inwieweit die Inhibierung der Ad-Infektion auch in anderen Zelllinien zu beobachten ist, da im Falle von Ad-Infektionen die Leber eines der am häufigsten betroffenen Organe ist. Um sich dem eigentlichen Modell zu nähern, wurde das anti-adenovirale Potential von sCAR-Fc bei der Infektion von Huh7-Zellen, einer Leberkarzinom-Zelllinie, getestet. Diese wurden wie vorher beschrieben mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert und anschließend erfolgte eine Einschätzung der Inhibierung der Ad-Infektion über die Zellviabilität und die quantitative Analyse neu generierter Viruspartikel (Abb. 4.13). Abb. 4.13: Inhibierung der Adenovirusinfektion in Leberzellen. Huh7-Zellen wurden mit 500 µl sCAR-Fchaltigen Medium (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium versorgt und anschließend mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. 5 Tage nach der Infektion erfolgte eine Beurteilung der Zellviabilität über eine Kristallviolettfärbung der noch lebenden Zellen (links). Huh7-Zellen wurden wie zuvor beschrieben in An- und Abwesenheit von sCAR-Fc mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und die Bildung neuer infektiöser Viruspartikel über ein Virus-Plaque-Assay ermittelt (rechts). Der inhibierende Effekt von sCAR-Fc, welcher bereits für EA.hy926-Zellen gezeigt werden konnte, wurde bei den Leberkarzinomzellen nochmals bestätigt. Der Einsatz von sCAR-Fc resultierte sowohl in einer Verbesserung der Zellviabilität als auch in einer Reduzierung neuer infektiöser Viren, wobei bei der höchsten eingesetzten Virusdosis eine Reduktion von 93,7 % und bei der niedrigsten Dosis eine Reduktion von 98,3 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen erreicht werden konnte. 4.2.5. Therapeutischer Einsatz von sCAR-Fc gegen Adenoviren Alle bisherigen Untersuchungen zur Inhibierung von Ad-Infektion durch sCAR-Fc beschränkten sich auf einen prophylaktischen Ansatz, wobei sCAR-Fc entweder vor oder 4. Ergebnisse 57 gleichzeitig mit der Infektion verabreicht wurde. Im klinischen Alltag spielt dieser Fall allerdings eine eher untergeordnete Rolle. Entscheidender ist die Frage welches antivirale Potential sCAR-Fc besitzt, wenn eine fortschreitende Infektion bereits vorliegt und es demnach therapeutisch verabreicht wird. Auch hier gilt es wieder zu bedenken, dass sCAR-Fc nur Viren außerhalb der Zellen an einer Infektion weiterer Zellen hindern kann und demnach keinerlei Einfluss auf bereits infizierte Zellen hat. Für dieses Experiment wurden EA.hy926Zellen 2h mit 0,1 Moi Ad2 infiziert. Anschließend wurde sCAR-Fc bzw. Kontrollmedium zu verschiedenen Zeitpunkten (24h, 30h, 48h, 72h) zugegeben. Als Referenz wurden sowohl Zellen verwendet die nicht infiziert wurden, als auch Zellen die gleichzeitig mit der Infektion mit sCAR-Fc bzw. Kontrollmedium erhielten. Nach 6 Tagen wurde die Zellviabilität über eine Kristallviolett-Färbung bewertet (Abb. 4.14). Abb. 4.14: Inhibierung einer laufenden Ad-Infektion. EA.hy926-Zellen wurden mit 0,1 moi Ad2 infiziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit sCAR-Fc behandelt. 500µl sCAR-Fc-haltiges Medium (12 µg/ml) bzw. Kontrollmedium wurde gleichzeitig (0 h) und 24 h, 30 h, 48 h und 72 h nach der Infektion zugegeben. Unbehandelte Zellen wurden zu den gleichen Zeitpunkten mit Kontrollmedium behandelt. Die mock-Zellen blieben als Kontrolle uninfiziert. 6 Tage nach der Infektion erfolgte eine Beurteilung der Zellviabilität über eine Kristallviolettfärbung der noch lebenden Zellen (links). 6 Tage nach der Infektion wurden die Zellen lysiert und die virale DNA mittels qPCR über Hexon-spezifische Primer quantifiziert (rechts). Es zeigte sich, dass eine frühzeitige Gabe von sCAR-Fc in einer starken Inhibierung des durch Ad induzierten CPE resultiert. Dieser protektive Effekt nahm weiter ab, je später sCAR-Fc zu den infizierten Zellen gegeben wurde. Allerdings zeigte sich, dass selbst 72h nach Ad-Infektion die Gabe von sCAR-Fc noch zu einer Reduktion der viralen Infektion und des dadurch hervorgerufenen CPE führte. Eine Analyse der Replikation der viralen DNA mittels qPCR zeigte ein ähnliches Bild. Dabei konnte noch 30 h nach Infektion eine signifikante Reduktion der viralen Replikation von 26 % nachgewiesen werden. Die Gabe von sCAR-Fc nach 48 h bzw. 72 h führte lediglich zu einer tendenziellen Inhibierung der AdInfektion um 30 % bzw. 18 %. Die stärkste Inhibierung wurde dennoch durch eine frühzeitige Gabe von sCAR-Fc erreicht. So konnte die virale DNA-Replikation durch die gleichzeitige 4. Ergebnisse 58 Applikation von sCAR-Fc und Ad um 94 % reduziert werden. 24 h nach der Infektion führte die Gabe von sCAR-Fc nur noch zu einer Reduktion der viralen DNA-Replikation um 45 %. Demnach ist sCAR-Fc sehr wohl in der Lage auch im therapeutischen Ansatz als antivirales Agens zu wirken und die virale Infektion zumindest zu verlangsamen, wobei die Effektivität stark vom Zeitpunkt der sCAR-Fc-Gabe abhängt. 4.3. Inhibierung der Ad-Infektion mittels sCAR-Fc im Tiermodell Alles in allem konnte durch die verschiedenen in vitro Experimente gezeigt werden, dass sCAR-Fc ein sehr potentes anti-adenovirales Biomolekül darstellt, welches nicht nur prophylaktisch sondern auch therapeutisch eingesetzt werden kann. In den nachfolgenden Untersuchungen sollte nun geklärt werden, inwieweit sCAR-Fc auch in vivo eine AdInfektion inhibieren kann. Voraussetzung ist dabei, dass sCAR-Fc in großen Mengen in der Blutbahn vorliegt und dadurch eindringende Viren neutralisiert werden, bevor sie ihre Zielzellen erreichen können. 4.3.1. Herstellung optimierter scAAV2/9-Vektoren für den Einsatz im Mausmodell Für das in vivo Modell wurde letztlich die Methode der Applikation über Vektoren gewählt, da mittels AAV-Vektoren hohe Expressionsraten vom Transgen in vivo erzielt werden können (157). Um eine stabile und langanhaltende Expression des Transgens zu gewährleisten, sollten daher self complementary (sc) Adeno-assoziierte Virus Vektoren (AAV-Vektoren) des Serotyp 2/9 genutzt werden. Dieser Serotyp hat sich als besonders effektiv für in vivo Anwendungen erwiesen, wobei bevorzugt Leber und Herz transduziert werden (158). Diese Organe zeichnen sich durch einen hohen Blutdurchsatz aus. Dadurch kann der in den transduzierten Zellen exprimierte sCAR-Fc schnell in die Blutbahn übergehen. Die sCAR-FccDNA lag bereits integriert als AAV-Expressionsplasmid vor. Das Plasmid enthält ein scAAV-Genom, welches nach Verpackung zu einer schnellen Transgenexpression beiträgt (150).Durch Co-Transfektion mit zwei Verpackungsplasmiden auf denen wichtige, zur Generierung von AAV-Vektoren benötigte Gene liegen, wurden in HEK293-Zellen AAVVektoren verpackt. Dabei spielt die Verpackungskapazität eine entscheidende Rolle. Die Verpackungsgrenze für einen scAAV-Vektor liegt bei ungefähr 2400 bp. Die vorhandene Expressionskassette aus CMV-Promotor, sCAR-Fc und SV40polyA hatte allerdings eine Größe von 2668 bp und lag damit leicht über der Verpackungsgrenze. Eine Veröffentlichung zum diesem Thema (159) zeigte, dass bei überschrittener Verpackungsgrenze ein Gemisch 4. Ergebnisse 59 aus dimerischen und monomerischen AAV-Vektoren produziert wird. Das Verhältnis wird dabei von der Größe des zu verpackenden Inserts bestimmt. Je größer dieses ausfällt umso größer ist auch der Anteil an monomerischen AAV-Vektoren. Da in der vorliegenden Arbeit die Überschreitung der Verpackungsgrenze lediglich 268 bp und damit knapp 10 % der Genomgröße betrug, wurde die Produktion der AAV-Vektoren mit der vorliegenden Expressionskassette begonnen. Nach diesem Schema wurden sCAR-Fc-cDNA enthaltende scAAV9-CMV-sCAR-Fc und GFP-cDNA enthaltende scAAV9-CMV-GFP produziert, wobei das GFP sowohl als Transfektionskontrolle für die AAV-Produktion als auch als Kontrolle der Funktionalität der entsprechenden AAV-Vektoren diente. Die vorhandene Expressionskassette für scAAV9CMV-GFP lag mit 2329 bp in der Verpackungsgrenze. Zur Überprüfung, der Funktionalität der so produzierten scAAV9-CMV-sCAR-Fc Vektoren, wurde die konzentrierte AAVLösung nach Quantifizierung auf frische HEK293-Zellen gegeben und die Konzentration von sCAR-Fc im Überstand mittels ELISA bestimmt. Dafür wurden die Zellen mit 4 x 103, 4 x 104 und 4 x 105Vektorgenomen (VG)/Zelle transduziert und 72h später die Überstände für die Konzentrationsbestimmung von sCAR-Fc abgenommen. Mit den scAAV9-CMV-GFP wurde ebenso verfahren, wobei die Expression des GFP nach 72h optisch bewertet wurde. Bei der Konzentrationsbestimmung von sCAR-Fc zeigte sich, dass selbst bei der höchsten Dosis von 4 x 105 VG/Zelle nur eine sCAR-Fc Konzentration von maximal 30 ng/ml im Überstand erreicht wurde. Diese Menge fällt im Vergleich zur Transfektion mit Plasmid-DNA, bei der sCAR-Fc Mengen von bis zu 5 µg/ml erreicht werden konnten, sehr gering aus. Bei der optischen Begutachtung der scAAV9-CMV-GFP transduzierten Zellen, zeigte sich allerdings eine deutliche Expression des fluoreszierenden Proteins GFP (Abb. 4.15). Abb. 4.15: Funktionstest der scAAV9-CMV-GFP. HEK293-Zellen wurden mit 4 x 103, 4 x 104, 4 x 105 VG/Zelle AAV9-CMV-GFP transduziert (von links nach rechts). Die Expression des GFP wurde 72 h nach der Transduktion mittels Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Vergrößerung: 40x Die Signalstärke bzw. die Anzahl der GFP exprimierenden Zellen war umso größer je mehr Vektorgenome transduziert wurden. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass die AAV9-CMV-GFP funktional sind. Demnach konnte das Fehlen von sCAR-Fc nicht damit 4. Ergebnisse 60 erklärt werden, dass die Produktion der AAV-Vektoren generell gescheitert war bzw. die Vektoren nicht funktional waren. Um zu überprüfen, inwieweit im konkreten Fall des sCARFc-Vektors die Überschreitung der Verpackungsgrenze möglicherweise zu einer Einschränkung der biologischen Funktionalität führte, wurde ein kleineres Insert von ähnlicher Struktur verpackt. Statt der cDNA für sCAR-Fc wurde die cDNA von sCAR-3-Fc (sCAR-Fc Variante ohne D2-Domäne) verpackt. Dadurch verringerte sich die Größe der Expressionskassette auf 2288 bp und lag damit innerhalb der beschriebenen Verpackungsgrenze für dimerische AAV-Vektoren. Um dies zu überprüfen wurden mit sCAR-Fc und sCAR-3-Fc AAV-shuttle scAAV2/9-Vektoren produziert. Die Vektoren wurden durch Frier-Tau gewonnen und in 1 ml PBS aufgenommen. Ein Volumen von 800 µl wurde auf frische HEK293-Zellen gegeben. Nach 4 h Transduktionszeit wurde das Medium gewechselt und eine initiale Probe als Referenz für die sCAR-Fc-Bestimmung abgenommen. Weitere Proben des Überstandes wurden nach 24 h und 72 h genommen. Die sCAR-FcMenge in den Proben wurde anschließend mittels ELISA bestimmt (Abb. 4.16). Abb. 4.16: Funktionstest der scAAV2/9-Vektoren in Abhängigkeit ihrer Größe. HEK293-Zellen wurden mit mit 800 µl scAAV9-CMV-sCAR-Fc- bzw. scAAV9-CMV-sCAR-3-Fc-Lysat transduziert. 4 h nach der Transduktion wurde das Medium gewechselt und eine initiale Probe (0 h) für die ELISA-Messung abgenommen. Weitere Proben wurden 24 h und 72 h nach der Transduktion abgenommen. Die Expression der jeweiligen solublen Proteine wurde mittels IgG-ELISA-Kit bestimmt. Es zeigte sich, dass die Expression von sCAR-Fc sowohl in der Menge, als auch im Expressionsverlauf sehr gering ausfiel. Im Vergleich dazu wird sCAR-3-Fc sehr viel besser exprimiert. 72 h nach Transduktion mit den AAV-Vektoren ließ sich eine sCAR-3-Fc-Menge messen, welche rund 4,5x höher lag als die von sCAR-Fc. Die nachgewiesenen Mengen bei 0 h lassen sich damit erklären, dass durch die fehlende Reinigung noch Produkte der Plasmidtransfektion im Lysat vorhanden waren. Von den bisherigen Daten ausgehend, konnte 4. Ergebnisse 61 angenommen werden, dass das Shuttleplasmid von sCAR-Fc aufgrund der überschrittenen Verpackungskapazität nicht korrekt in AAV-Vektoren verpackt wird. Um innerhalb der Verpackungskapazität zu liegen, wurde deshalb die Expressionskassette in ihrer Größe angepasst. Im Einzelnen wurde dafür der CMV-Promotor verkürzt, ein kürzeres, synthetisches polyA eingesetzt und alle Sequenzen entfernt, die vorher als Platzhalter dienten. Das eigentliche Transgen sCAR-Fc blieb unverändert. Die Gesamtlänge der Expressionskassette lag anschließend bei 2371 bp und damit innerhalb der postulierten Verpackungskapazität für scAAV-Vektoren. Das gesamte Konstrukt wurde durch die Firma Geneart synthetisiert und dabei im Hinblick auf den Einsatz im Maus-Modell auf den Organismus Maus Codon optimiert, um die Expression in vivo weiter zu steigern. Die so synthetisierte Expressionskassette wurde anschließend in ein AAV-Shuttleplasmid kloniert. Um zu überprüfen, ob die Optimierung des Shuttleplasmids zu einer besseren Verpackung in AAV-Vektoren und damit zu einer gesteigerten Expression des Transgens führt, wurden wie im vorangegangenen Versuch AAV-Vektoren von der optimierten und der nicht optimierten Variante produziert. Für diesen Versuch wurden statt AAV2/9-Vektoren die für die Zellkultur besser geeigneten AAV2/2-Vektoren produziert. Diese unterscheiden sich nur im Aufbau ihrer Kapsidproteine, der Mechanismus der Verpackung ist bei beiden allerdings derselbe. Ein Volumen von 800 µl des AAV-haltigen Lysats der so produzierten scAAV2-CMV-sCAR-Fc und scAAV2-CMV-sCAR-Fc opt. wurde auf HEK293-Zellen gegeben und die Expression von sCAR-Fc wurde mittels ELISA verfolgt (Abb. 4.17). Abb. 4.17: Funktionstest der AAV2/2-Vektoren in Abhängigkeit der optimierten und nicht optimierten Variante. HEK293-Zellen wurden mit 800 µl scAAV2-CMV-sCAR-Fc- bzw. scAAV2-CMV-sCAR-Fc opt.Lysat transduziert. 4 h nach der Transduktion wurde das Medium gewechselt und eine initiale Probe (0 h) für die ELISA-Messung abgenommen. Weitere Proben wurden 24 h und 72 h nach der Transduktion abgenommen. Die Expression von sCAR-Fc wurde mittels IgG-ELISA-Kit bestimmt. 4. Ergebnisse 62 Es zeigte sich, dass die AAV-Vektoren der optimierten Variante eine rund 4,5-fach stärke Expression von sCAR-Fc aufwiesen, als die AAV-Vektoren der nicht optimierten Variante. Eine parallele Transfektion der beiden Plasmide pdAAV-CMV-sCAR-Fc und pdAAV-CMVsCAR-Fc opt. ergab, dass die Expression von sCAR-Fc von beiden Varianten annähernd gleich war. Die Expression von dem nicht optimierten Plasmid ergab eine Konzentration von 6,8 µg/ml während die sCAR-Fc-Menge von dem optimierten Plasmid bei 5,3 µg/ml lag. Die etwas schlechtere Expression von der optimierten Variante lässt sich mit der CodonOptimierung für Maus erklären, da HEK293T-Zellen eine humane Zelllinie ist. Ausgehend von den Ergebnissen mit den nicht gereinigten AAV-Lysaten, sollten im Anschluss noch einmal gereinigte und quantifizierte AAV-Vektoren getestet werden. Dafür wurden auf jeweils 10 großen Zellkulturschalen sCAR-Fc exprimierende AAV2-Vektoren von der optimierten und der nicht optimierten sCAR-Fc-Expressionskassette produziert und anschließend mittels Ultrazentrifugation über einen Iodixanolgradienten gereinigt. Die über eine TaqMan quantifizierten AAV-Vektoren wurden mit einer Dosis von 100 VG/Zelle und 1000 VG/Zelle auf HEK293-Zellen transduziert. Nach 72 h wurde die sCAR-Fc-Menge im Zellkulturüberstand mittels ELISA bestimmt (Abb. 4.18). Abb. 4.18: Funktionstest der gereinigten AAV2-Vektoren in Abhängigkeit der optimierten und nicht optimierten Variante. HEK293-Zellen wurden mit 100 bzw 1000 VG/Zellen AAV2-CMV-sCAR-Fc bzw. AAV2-CMV-sCAR-Fc opt. transduziert. 4 h nach der Transduktion wurde das Medium gewechselt und eine initiale Probe (0 h) für die ELISA-Messung abgenommen. 72 h nach der Transduktion wurde die Expression von sCAR-Fc mittels IgG-ELISA-Kit bestimmt. Es zeigte sich, dass auch in diesem Fall die Transduktion mit AAV-Vektoren der optimierten Variante zu einer um ein Vielfaches höheren Menge an sCAR-Fc führte, als eine Transduktion mit AAV-Vektoren der nicht optimierten Variante. Mit dem 13-fachen fällt der 4. Ergebnisse 63 Unterschied bei den gereinigten AAV-Vektoren sogar deutlich größer aus, als bei den nicht aufgereinigten AAV-Lysaten. Da die Expression von sCAR-Fc mittels transfizierter Plasmide bei beiden Varianten annähernd gleich ist, bei der Transduktion mit AAV-Vektoren aber große Unterschiede aufweist, kann letztendlich davon ausgegangen werden, dass das Shuttleplasmid der optimierten Variante besser in AAV-Vektoren verpackt wird als die nicht optimierte Variante. In diesem Fall spielt demnach die Einhaltung der Verpackungsgrenzen eine entscheidende Rolle für die korrekte Verpackung und Bildung funktionaler AAV-Vektoren. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle AAV9-CMV-sCAR-Fc, welche in den Tierversuchen eingesetzt werden sollten, mit dem optimierten sCAR-Fc-Shuttleplasmid hergestellt. 4.3.2. Langzeitexpression von sCAR-Fc via scAAV2/9-Vektor Für die Untersuchung der Wirkung von sCAR-Fc gegen Ad im Tiermodell wurde ein prophylaktischer Ansatz gewählt. Demnach sah das Modell vor, dass zum Zeitpunkt der Infektion des Versuchstiers bereits eine gewisse Menge an sCAR-Fc in der Blutbahn vorhanden ist, welches dann die Viren am Eindringen in die entsprechenden Zielzellen hindern kann. Da sCAR-Fc über einen scAAV2/9-Vektor im Versuchstier selbst produziert wird, war es notwendig Parameter wie Anfangszeitpunkt der Expression, maximale Serumkonzentration von sCAR-Fc und Dauer der Expression vorher zu ermitteln, um anschließend einen optimalen Zeitpunkt für die Infektion mit Ad festlegen zu können. Die genannten Parameter wurden bereits für einen sCAR-Fc exprimierenden Adenovektor, AdG12, im CVB3-Tiermodell ermittelt (82). Im folgenden Experiment diente AdG12 als Kontrollvektor. Die scAAV2/9-Vektoren wurden wie oben beschrieben hergestellt, aufgereinigt und konzentriert. Nach der Quantifizierung mittels TaqMan-PCR wurden die Vektoren in einer Konzentration von 1 x 106 VG/Zelle auf HEK293-Zellen gegeben. Nach 72 h wurde die Menge an produzierten sCAR-Fc mittels ELISA bestimmt. Die produzierte Menge an sCAR-Fc entsprach mit rund 1 µg/ml den vorhergehenden Ergebnissen und daher funktionieren die Vektoren wie erwartet und konnten im in vivo Versuch eingesetzt werden. Der Versuchsablauf und die Einteilung der Gruppen sind im unten stehenden Schema dargestellt (Abb. 4.19). 4. Ergebnisse 64 Abb. 4.19: Versuchsablauf Langzeitexpression von sCAR-Fc durch scAAV9-CMV-sCAR-Fc. Je 10 männliche Balb/C-Mäuse (5 Wochen) wurden mit 1 x 1010 VG AdG12 bzw. 2 x 1011 VG scAAV9-CMVsCAR-Fc i.v. über die vena jugularis transduziert. Die Hälfte jeder Gruppe wurde an einem geraden die andere Hälfte an einem folgenden ungeraden Tag operiert. Die AdG12 transduzierte Gruppe erhielt täglich frisches Dox (200 µg/ml) über das Trinkwasser mit einem Zusatz von 5 % Saccharose. Die scAAV9-CMV-sCAR-Fc transduzierten Tiere erhielten als Trinkwasser eine 5 %ige Saccharose-Lösung. Blutproben wurden alle 2 Tage von jeweils 5 Tieren gewonnen (wechselnd abhängig vom OP-Tag). 28 Tage nach der Transduktion wurden die Tiere getötet und die Organe Herz, Leber, Lunge und Milz entnommen. Teilproben der Organe wurden für die pathologische Begutachtung in 4 % Formalin-Lösung fixiert. Der Rest der Organe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zeitnah bei -80°C gelagert. Die 5 Wochen alten männlichen Mäuse vom Stamm Balb/c wurden mit 2 x 1011 VG scAAV9-CMV-sCAR-Fc bzw. mit 1 x 1010 Partikeln AdG12 intravenös via vena jugularis transduziert. Durch die Operation der Tiere an zwei aufeinander folgenden Tagen, konnte erreicht werden, dass bei den nachfolgenden Blutentnahmen jeder Tag abgedeckt werden konnte, ohne jedes Tier täglich mit einer Blutentnahme zu belasten. Die AdG12-vermittelte Expression von sCAR-Fc wurde über die Gabe von Dox (200 µg/ml) im Trinkwasser eingeleitet. Da Dox einen bitteren Geschmack hat, wurde dem Trinkwasser 5% Saccharose beigemengt. Dadurch sollte gewährleistet werden, dass die Tiere das Dox-haltige Wasser nicht ablehnen. Tiere die kein Dox benötigten bekamen 5% Saccharose zum Trinkwasser beigemengt. Am Ende des Untersuchungszeitraums von 28 Tagen wurden die Tiere getötet und die Organe Herz, Leber, Lunge und Milz zur pathologischen Begutachtung entnommen. Um den Expressionsverlauf von sCAR-Fc über 28 Tage zu dokumentieren, wurde alle 2 Tage von jeweils 5 Tieren jeder Gruppe, durch Punktion der vena facialis, Blutproben genommen und die Serumkonzentration von sCAR-Fc mittels ELISA bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die AdG12-vermittelte sCAR-Fc Expression bis Tag 5 schnell auf knapp 0,55 µg/ml anstieg. (Abb. 4.20). 4. Ergebnisse 65 Abb. 4.20: Serumkonzentration von sCAR-Fc in der Langzeitexpression durch AdG12 und scAAV9CMV-sCAR-Fc. Blutproben wurden bei RT und 2000 g für 15 min zentrifugiert. Das Serum wurde abgenommen und bei -20°C gelagert. Die Serumkonzentration wurde mittels IgG-ELISA-Kit ermittelt. Zum Tag 6 fiel die Serumkonzentration von sCAR-Fc deutlich ab und zeigte dann für den Rest des Untersuchungszeitraums eine minimale Expression von ungefähr 100 ng/ml. Verglichen dazu zeigte die sCAR-Fc Expression nach scAAV9-CMV-sCAR-Fc Applikation einen anderen Verlauf. Bereits 24 h nach Transduktion erreichte die Serumkonzentration von sCAR-Fc 1000 ng/ml und stieg bis zum Tag 10 moderat an. Ab Tag 10 stieg die Menge an sCAR-Fc im Serum stark an, bis sie ab Tag 20 40 µg/ml erreichte und bis zum Ende des Untersuchungszeitraums relativ konstant blieb. Um auszuschließen, dass durch die Vektoren oder die hohe Expression von sCAR-Fc mögliche Organ- bzw. Gewebeveränderung verursacht werden, wurden am Institut für Tierpathologie der Freien Universität Berlin von den entnommenen Organen Schnitte angefertigt und eine HE-Färbung durchgeführt (Abb. 4.21). Abb. 4.21: HE-Färbung der Organschnitte. 28 Tage nach der Transduktion mit 2 x 1011 VG scAAV-CMV-sCAR-Fc wurden die Tiere getötet und die Organe Herz, Leber, Lunge und Milz entnommen und anschließend in 4 %iger Formalin-Lösung eingebettet. Die Anfertigung der Gewebeschnitte, die HE-Färbung und die pathologische Begutachtung erfolgte durch die Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Robert Klopfleisch vom Institut für Tierpathologie der Freien Universität Berlin. 4. Ergebnisse 66 Bei der Begutachtung konnten keine Auffälligkeiten in den Geweben, die mit den Vektoren in Zusammenhang stehen, festgestellt werden. In dem Tierversuch zeigten sich letztendlich zwei wichtige Eigenschaften von AAV-Vektoren. Zum einen die lange Expressionszeit und zum anderen die Expressionsstärke, welche scheinbar höher ist als bei AdV. Allerdings ist zu beachten, dass die AAV-vermittelte Expression eine längere Anlaufzeit benötigt bis das maximale Expressionslevel erreicht ist. Alle diese Faktoren mussten für das folgende Tiermodell mit einbezogen werden, insbesondere musste ein Zeitpunkt für die Ad-Infektion festgelegt werden. 4.3.3. Anti-adenovirale Wirkung von sCAR-Fc im immunsupprimierten Mausmodell Ad-Infektionen haben im immunkompetenten Patienten einen sehr milden Verlauf. Im Zuge einer Immunsuppression z.B. durch Organtransplantation kann eine Ad-Infektion allerdings einen schweren bis tödlichen Verlauf nehmen. Da der Organismus nicht mehr in der Lage ist die Viren effektiv zu bekämpfen kommt es zu einer generalisierten Infektion, wobei die Leber besonders betroffen ist. Diese immunsupprimierten Patienten sind die eigentliche Zielgruppe, die für eine mögliche Behandlung mit sCAR-Fc in Frage kommt. Daher muss dem Umstand der Immunsuppression auch im Tiermodell Rechnung getragen werden und so sollte im folgenden Tierversuch die antivirale Wirkung von sCAR-Fc bei Ad-Infektionen im immunsupprimierten Modelltier untersucht werden. Um eine Immunsuppression zu erreichen, wurde den Versuchstieren Cyclophosphamid (CP) verabreicht, welches innerhalb von 14 Tagen zu einer Immunsuppression führte (153). Die Expression von sCAR-Fc wurde vor der eigentlichen Ad-Infektion über die Transduktion von AAV-Vektoren vermittelt. Der Vorversuch zeigte bereits, dass sCAR-Fc über AAV2/9 effektiv, langfristig und in großen Mengen exprimiert wird. Daraus ließen sich diverse Zeitfenster für die Gabe von AAVVektoren und Ad-Infektion ableiten. Für den folgenden Versuch zur Inhibierung von AdInfektionen durch sCAR-Fc wurde der Zeitpunkt der Ad-Infektion auf 14 Tage nach der Transduktion mit scAAV9-CMV-sCAR-Fc festgelegt. Zu diesem Zeitpunkt ist bereits eine große Menge von sCAR-Fc im Serum (Abb. 4.20). Zusätzlich sollte zu diesem Zeitpunkt eine signifikante Suppression des Immunsystems der Versuchstiere erreicht worden sein. Die Versuchstiere wurden nicht mit replikationskompetenten Wildtyp-Ad infiziert, sondern mit einem Luciferase exprimierenden AdV. Da nur die Inhibierung der initialen Aufnahme der viralen Partikel durch sCAR-Fc untersucht werden soll, ist hierfür der Einsatz von AdV 4. Ergebnisse 67 ausreichend. Der genaue Versuchsablauf und die Einteilung der Gruppen sind im folgenden Schema dargestellt (Abb. 4.22). Abb. 4.22: Versuchsablauf Inhibierung von Ad5CMVluc durch sCAR-Fc im immunkompetenten und – supprimierten Versuchstier. 32 männliche Balb/C-Mäuse (5 Wochen) wurden in 2 Gruppen zu je 16 Tieren eingeteilt. Bei einer der beiden Gruppen wurde durch die Gabe von 140 mg/kg Cyclophoshamid (CP) i.p. die Immunsuppression eingeleitet. Diese wurde durch die Gabe von 100 mg/kg CP 2x wöchentlich weitergeführt. Die andere Gruppe blieb immunkompetent. Je 6 Tiere der immunsupprimierten und der immunkompetenten Gruppe wurden mit 2 x 1011 VG scAAV9-CMV-sCAR-Fc bzw. scAAV9-CMV-sCAR-Fctrunk i.v. über die vena jugularis transduziert. Je 4 Tiere der Immungruppen wurden sham operiert und eine NaCl-Lösung i.v. verabreicht. 14 Tage nach der Transduktion wurden die Tiere mit 1 x 1010 Partikeln Ad5CMVluc i.v. über die vena jugularis transduziert. 6 Tage danach wurden die Tiere getötet und die Organe Herz, Leber, Lunge und Milz entnommen. Teilproben der Organe wurden für die pathologische Begutachtung in 4 % Formalin-Lösung fixiert. Der Rest der Organe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zeitnah bei -80°C gelagert. Die männlichen Balb/c-Mäuse werden mit 2 x 1011 VG scAAV9-CMV-sCAR-Fc intravenös über die vena jugularis transduziert. Als Kontrolltiere fungieren zum einen Tiere die statt der Vektoren eine NaCl-Lösung erhalten haben und zum anderen Tiere, die mit 2 x 1011 VG scAAV9-CMV-sCAR-Fctrunk transduziert wurden, wobei dieser Vektor eine Mutation in der Sequenz für sCAR-Fc trägt, welche zu einem Abbruch der Proteinsynthese führt und dadurch kein sCAR-Fc exprimiert werden kann. Gleichzeitig mit der Transduktion der AAV-Vektoren wurde eine Immunsuppression mittels CP bei der Hälfte der Tiere in allen 3 Gruppen begonnen, dabei wurden den Versuchstieren initial 140 µg CP/g Körpergewicht i.p. verabreicht. Die weitere CP-Behandlung wurde zweimal wöchentlich mit einer Dosis von 100 µg/g Körpergewicht fortgesetzt. Tiere welche nicht mit CP behandelt wurden, blieben immunkompetent und dienten als Vergleichstiere. Am Tag 14 nach der AAV-Applikation erfolgte die Transduktion mit 2 x 1010 VG Ad5CMVluc. Gleichzeitig wurden Blutproben durch Punktion der vena facialis genommen. Zum einen sollte darin mittels ELISA die Menge 4. Ergebnisse 68 an sCAR-Fc im Serum zum Zeitpunkt der Transduktion bestimmt werden und zum anderen wurde über Blutausstriche und Zählung der Immunzellen der Grad der Immunsuppression ermittelt. 6 Tage nach der Transduktion mit Ad5CMVluc wurden die Versuchstiere getötet und die Organe Leber, Lunge, Herz, Milz und Pankreas entnommen. Zusätzlich wurden Blutproben für die Bestimmung von sCAR-Fc im Serum und für die Anfertigung von Blutausstrichen entnommen. Es zeigte sich, dass durch die Blutausstriche keine genaue Einschätzung der Immunsuppression der Versuchstiere vornehmen ließ. Es zeigte sich zwar, dass es Veränderungen in den Anteilen der einzelnen Immunzellen gab, wobei meist die Monozyten betroffen waren, aber da diese Werte auch immer stark vom Mausstamm abhängen, konnte keine explizite Aussage dazu getroffen werden. Mehr Aufschluss zum Grad der Immunsuppression brachte die pathologische Begutachtung der Milz. Dabei ließ sich eine gering- bis mittelgradige lymphozytäre Depletion bzw. Atrophie mit gleichzeitiger erhöhter extramedullärer Hämatopoese beobachten. Sowohl die lymphozytäre Depletion, als auch die extramedulläre Hämatopoese sprechen für eine erfolgreiche Immunsuppression der Versuchstiere. Um die Inhibierung der Aufnahme der AdV beurteilen zu können, wurde zum Zeitpunkt der Transduktion am Tag 14 und zum Ende des Versuchs am Tag 19 die Menge an sCAR-Fc im Serum ermittelt. Dabei zeigte sich, dass die Immunsuppression ebenfalls einen Einfluss auf die sCAR-Fc Expression hat. In den immunkompetenten Tieren wurde am Tag 14 eine Konzentration von knapp 5 µg/ml erreicht, welche sich bis zum Tag 19 auf ungefähr 8 µg/ml erhöhte. Bei den immunsupprimierten Mäusen lagen die Werte am Tag 14 bei knapp 44 µg/ml und erhöhten sich bis zum Ende des Versuchs auf ungefähr 48 µg/ml. Allerdings ließ sich dadurch dokumentieren, dass zum Zeitpunkt der Transduktion mit AdV eine hohe Menge sCAR-Fc im Serum vorhanden war. Um den Grad der Inhibierung zu ermitteln, wurden Leberstücken der Versuchstiere für eine Luciferase-Messung eingesetzt und das Maß der Luciferase-Expression (RLU) mit dem Gewicht der Leberstücken ins Verhältnis gesetzt (Abb. 4.23). 4. Ergebnisse 69 Abb. 4.23: Inhibierung von Ad5TRELuc durch sCAR-Fc im immunkompetenten und –supprimierten Versuchstier. Leberstücken wurden gewogen und in Luciferase-Lysispuffer mittels sterilen Pistills homogenisiert. Nach einer Inkubationszeit von 30 min wurden die Proben 14.000 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Messung der Luciferaseaktivität genutzt (links). Aus Leberstücken wurde mittels TissueDNA Kit (peqlab) Gesamt-DNA isoliert und die adenovirale DNA in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer quantifiziert. Normierung erfolgte auf die 18S-rRNA (rechts). trunk = scAAV9-CMV-sCAR-Fctrunk sCAR-Fc = scAAV9-CMV-sCAR-Fc Die Untersuchung der Leber auf Transduktion mit Ad5TRELuc durch Messung der Luciferase-Aktivität zeigte, dass der Einsatz von sCAR-Fc zu keiner signifikanten Veränderung der AdV-Aufnahme führte. Auch der Nachweis der Vektor-DNA mittels qPCR aus isolierter DNA von Leber, Pankreas, Lunge und Milz zeigte keine signifikante Inhibierung der AdV-Aufnahme durch sCAR-Fc. Die Unwirksamkeit von sCAR-Fc könnte in der hohen Dosis von 2 x 1010 VG Ad5CMVLuc liegen. In den in vitro Experimenten zur Wirksamkeit von sCAR-Fc und dessen Konzentrationsabhängigkeit wurde eine Dosis von 2 x 107 VG AdV, also 1000-fach weniger, eingesetzt. Mit dieser vergleichsweise geringen AdVDosis konnte durch 50µg/ml sCAR-Fc eine Inhibierung von bis zu 95 % erreicht werden. Die Dosis von 2 x 1010 VG Ad5CMVluc wurde gewählt, da diese in der Literatur als Dosis beschrieben wird, bei welcher Lebertoxizität beobachtet wurde (160). Um die generelle Wirksamkeit von sCAR-Fc in vivo nachzuweisen, müsste eine niedrigere Dosis eingesetzt werden, damit der inhibierende Effekt von sCAR-Fc sichtbar wird. Um eine geeignete Dosis für die Ad-Infektion zu finden, musste zunächst geklärt werden, wie niedrig die eingesetzte Dosis maximal sein darf, um sie noch nachweisen zu können. Dafür wurde ein Vorexperiment durchgeführt, indem 14 Tage nach Immunsuppression verschiedene Dosen des Wildtyp-Virus Ad5 appliziert und zwei Tage später die Ad5-DNA in der Leber nachgewiesen wurde. In diesem Experiment wurde explizit dasWildtyp-Ad5 eingesetzt, da dieses zwei entscheidende replikationskompetent und Vorteile können hat. innerhalb Zum einen sind die der zwei Tage einen Wildtyp-Ad5 kompletten 4. Ergebnisse 70 Replikationszyklus durchlaufen. Zum anderen ist man mit dem Einsatz der Wildtyp-Viren dem eigentlichen Modell sehr viel näher und kann nun auch den Aspekt der Virusreplikation in die Beobachtung mit einbeziehen. Für diesen Versuch wurden 12 männliche Balb/c-Mäuse initial mit 140 µg CP/g Körpergewicht immunsupprimiert. Die Immunsuppression wurde anschließend mit 100 µg CP/g Körpergewicht zweimal wöchentlich fortgesetzt. Am Tag 14 nach dem Einleiten der Immunsuppression wurden jeweils 4 Tiere mit Dosen von 2 x 107, 2 x 108 und 2 x 109 Partikel Ad5 infiziert und 48 h später getötet. Den Tieren wurden die Leber und Blutproben für die weitere Analyse entnommen. Aus der Leber wurde GesamtDNA isoliert und die Virus-DNA mittels qPCR nachgewiesen. In der nachstehenden Tabelle sind die verschiedenen Dosen, DNA-Mengen und Ct-Werte dargestellt (Tab. 4.1). Partikel Ad5 DNA-Menge qPCR Ct-Wert Bereich 2 x 107 400 ng 33 - 39 2 x 10 8 200 ng 31 -32 2 x109 100 ng 24 -29 Tab. 4.1: Nachweis adenoviraler DNA. Aus Leberstücken wurde mittels Tissue-DNA Kit (peqlab) GesamtDNA isoliert und die adenovirale DNA in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer quantifiziert. Dargestellt sind die in der qPCR eingesetzten DNA-Mengen und die korrespondierenen Ct-Wert-Bereiche. Es zeigte sich, dass auch die niedrigste Dosis von 2 x 107 Partikeln Ad5 mit Ct-Werten von 33 bis 39 Zyklen noch nachgewiesen werden konnte. Ausgehend von diesen Ergebnissen sollte im anschließenden Tierversuch die Dosis von 5 x 107 Partikeln Ad5 für die Infektion eingesetzt werden. Da ein Anstieg der Serumkonzentration der Leberenzyme AlaninAminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) ein Indiz für die Lebertoxizität und demnach auch für den Grad einer Virusinfektion ist, sollten die Serumkonzentrationen dieser beiden Enzyme bestimmt werden (Abb. 4.24). Abb. 4.24: Nachweis der Leberenzyme AST und ALT. Blutserumproben wurden gemäß den Anweisungen im Protokoll der ASTbzw. ALT-Kits (Sigma-Aldrich) behandelt und auf die Leberenzyme hin untersucht. Als Negativkontrolle fungierte Blutserum nicht-infizierter Mäuse. 4. Ergebnisse 71 Allerdings zeigte sich, dass in dem gewählten Dosisbereich innerhalb von zwei Tagen keine signifikanten Veränderungen der Serumkonzentration von AST und ALT auftraten. Scheinbar reichen die eingesetzten Dosen Ad5 bzw. die Replikationszeit von 48 h nicht aus um eine Schädigung der Leber zu induzieren. Im folgenden Versuch sollte daher die Expression von Zytokinen als Gradmesser der viralen Infektion ermittelt werden. Da im vorangegangenen Tierversuch eine geeignete Infektionsdosis für Ad5 ermittelt wurde, sollte im folgenden Experiment nun die antivirale Wirksamkeit von sCAR-Fc in vivo gezeigt werden. Der genaue Ablauf des Versuchs mit den Einteilungen der Gruppen ist im nachstehenden Schema dargestellt (Abb. 4.25). Abb. 4.25: Versuchsablauf Inhibierung von Ad5 durch sCAR-Fc im immunsupprimierten Versuchstier. 20 männliche Balb/C-Mäuse (5 Wochen) wurden in 4 Gruppen zu je 5 Tieren eingeteilt. Bei 3 Gruppen wurde durch die Gabe von 140 mg/kg Cyclophoshamid (CP) i.p. die Immunsuppression eingeleitet (IS). Diese wurde durch die Gabe von 100 mg/kg CP 2x wöchentlich weitergeführt. Die andere Gruppe blieb immunkompetent (IK). Je eine IS-Gruppe wurden mit 2 x 1011 VG AAV2/9-CMV-sCAR-Fc bzw. AAV2/9-CMV-sCAR-Fctrunk i.v. über die vena jugularis transduziert. Die verbleibende IS-Gruppe und die IK-Gruppe wurde sham operiert und eine NaCl-Lösung i.v. verabreicht. 14 Tage nach der Transduktion wurden alle Tiere mit 5 x 107 Partikeln Ad5 i.v. über die vena jugularis infiziert. 2 Tage danach wurden die Tiere getötet und die Organe Herz, Leber, Lunge und Milz entnommen. Teilproben der Organe wurden für die pathologische Begutachtung in 4 % Formalin-Lösung fixiert. Der Rest der Organe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zeitnah bei 80°C gelagert. Wie in den oben beschrieben Tierversuchen (Abb. 4.22), wurde die Immunsuppression gleichzeitig mit der Applikation von 2 x 1011 VG scAAV9-CMV-sCAR-Fc und scAAV9CMV-sCAR-Fctrunk begonnen. Am Tag 14 nach Transduktion der AAV-Vektoren wurden die entsprechenden Tiere mit 5 x 107 Partikeln Ad5 infiziert. Nach 48 h wurden die Tiere getötet und die Organe Leber, Herz, Lunge, Milz und Pankreas sowie Blutproben für weitere Untersuchungen entnommen. Angefertigte Blutausstriche wurden zur Bestimmung des Immunstatus herangezogen. Dabei wurde festgestellt, dass sich im Gegensatz zu den immunkompetenten Tieren bei den immunsupprimierten Tieren keine Leukozyten mehr nachweisen ließen. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass die Immunsuppression 4. Ergebnisse 72 erfolgreich war. Die Bestimmung der sCAR-Fc Konzentration im Serum ergab, ähnlich wie in vorhergehenden Experimenten, einen Wert von 49 µg/ml. Aus den verschiedenen Organen wurde Gesamt-DNA isoliert und mittels qPCR die adenovirale DNA nachgewiesen (Abb.4.26). Abb. 4.26: Inhibierung der Ad5-Infektion in diversen Organen. Aus Organstücken wurde mittels TissueDNA Kit (peqlab) Gesamt-DNA isoliert und die relativen Ad5 Genomkopien in einer qPCR mittels Hexonspezifischer Primer nachgewiesen. Die Gruppe IS NaCl wurde auf 100 % gesetzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu den AAV2/9-CMV-sCAR-Fctrunk transduzierten Tieren, die Behandlung mit sCAR-Fc in Leber und Herz zu einer signifikant geringeren Aufnahme von Ad5 führte. Die Inhibierung der Ad5-Aufnahme lag dabei bei 65% in der Leber und 62% im Herzen. In den Organen Lunge, Milz und Pankreas wurde dagegen nur eine tendenzielle Verringerung der Ad5-Aufnahme von ungefähr 45% beobachtet. Es konnte dabei ebenfalls eine Aussage über die generelle Aufnahme von Ad5 in die verschiedenen Organe getroffen werden (Abb. 4.27). 4. Ergebnisse 73 Abb. 4.27: Aufnahme der Ad5 in diverse Organe. Aus Organstücken der IK NaCl und IS NaCl Tiere wurde mittels Tissue-DNA Kit (peqlab) Gesamt-DNA isoliert und die relativen Ad5 Genomkopien wurden in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer nachgewiesen. Dargestellt ist die Aufnahme der Ad5 relativ zur Leber (100 %). Neben der Leber ist vor allem die Milz das Organ, in welchem die meiste adenovirale DNA nachgewiesen werden konnte. In Lunge und Herz ließ sich dagegen sehr viel weniger, im Pankreas fast gar keine Ad-DNA (2,8 %) nachweisen. Bei den Organen Herz, Lunge und Milz ließen sich, abhängig vom Immunstatus, Unterschiede in der Ad5-Aufnahme beobachten, welche allerdings nicht signifikant waren. Da eine Einschätzung der Lebertoxizität über die Bestimmung der ALT- und AST-Serumlevel in dem gewählten Dosisbereich von 5 x 107 Partikeln Ad5 nicht ausreichend hätte geklärt werden können, wurde alternativ die mRNA Expression der Interleukine 6 und 12 (IL-6 und IL-12) in der Leber bestimmt. Die Expression von Interleukinen bietet eine gute Möglichkeit die Schwere einer Infektion zu begutachten, da diese bereits exprimiert werden, bevor es zu einer zellulären Schädigung und damit einem Anstieg der ALT- und AST-Serumlevel kommt. Für diese Untersuchung wurde aus Lebergewebestücken Gesamt-RNA präpariert und die Expression derIL-6- und IL-12-mRNA mittels quantitativer RT-PCR bestimmt (Abb. 4.28). Abb. 4.28: Expression der IL12-mRNA. Aus Leberstücken wurde mittels TRIzol-Reagent (life technologies) Gesamt-RNA isoliert und mittels RT-Reaktion in cDNA umgeschrieben. Die relative Expression von IL-6 (links) und IL12 (rechts) wurde in einer spezifischen TaqMan-PCR für IL-6 und IL-12 nachgewiesen. Dargestellt ist die IL-6/IL12-Expression relativ zur nicht-infizierten Gruppe IK sham (100 %) und normiert auf 18S-rRNA. IK = immunkompetent, IS = immunsupprimiert 4. Ergebnisse 74 Es zeigte sich, dass die Infektion mit Ad5 nach 2 Tagen zu einer signifikanten Erhöhung der Expression von IL-6in den immunsupprimierten Tieren um mehr als das 7-fache führte. Die Transduktion der trunkierten sCAR-Fc-Variante in den immunsupprimierten Tieren hatte scheinbar keinen Einfluss auf die Expression der Interleukine im Vergleich zu den shamoperierten Tieren. Der Einsatz von sCAR-Fc verringerte im Vergleich zur trunkierten Variante die Expression von IL-6 und IL-12 signifikant um mehr als 50% und zeigt damit eine geringere Belastung der Leber durch die Ad-Infektion. Zusammengefasst konnte in den letzten Experimenten gezeigt werden, dass sCAR-Fc in vivo effektiv die Infektion verschiedener Organe mit Ad inhibieren kann und sich die Belastung der viralen Infektion dadurch signifikant verringern ließ. Da die Leber bei einer systemischen Ad-Infektion besonders betroffen ist, ist besonders hervorzuheben, dass sCAR-Fc in der Leber zu einer signifikanten Verringerung der Viruslast führte. Das Fusionsprotein sCAR-Fc ist damit ein vielversprechendes Biomolekül welches die Ad-Infektion von immunsupprimierten Patienten inhibieren kann. 4.4. Kombination von sCAR-Fc mit Cidofovir und siRNAs zur Inhibierung von Ad-Infektionen (in vitro) 1 In den vorangegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass das lösliche Rezeptormolekül sCAR-Fc eine adenovirale Infektion sowohl in vitro als auch in vivo effektiv inhibieren kann. Allerdings ist das inhibierende Potential auf die initiale Infektion der Zielzelle beschränkt, da sCAR-Fc nur außerhalb der Zellen wirken kann. Um das antivirale Potential einer möglichen Therapie gegen Ad zu erhöhen, bietet sich eine Kombination mit anderen antiviralen Substanzen an, welche zusätzlich zur extrazellulären Wirkung von sCARFc auf intrazellulärer Ebene wirken können. Dafür kommt das Nukleotidanalogon Cidofovir und verschiedene anti-adenovirale siRNAs in Frage. 4.4.1. Kombination sCAR-Fc und Cidofovir (CDV) Um das antivirale Potential der Therapie von sCAR-Fc in Kombination mit CDV einschätzen zu können, sollte im Vorfeld die Wirkung der Einzelkomponente CDV ermittelt werden. Da bereits nachgewiesen wurde, dass CDV konzentrationsabhängig in Zellkultursystemen zytotoxisch wirken kann, musste im Vorfeld die höchste nicht toxische Konzentration an CDV ermittelt werden. Dafür wurden EA.hy926-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen 1 Diese Studie wurde gemeinsam mit Tanja Pozzuto durchgeführt 4. Ergebnisse 75 CDV (5 µM – 5 mM) behandelt und nach 7 Tagen die Zytotoxizität mittels Cell-killing-Assay bestimmt (Abb. 4.29). Abb. 4.29: Cytotoxizität von CDV in EA.hy926-Zellkultur. EA.hy926Zellen wurden mit den dargestellten Konzentrationen CDV ausgesät. CDVhaltiges Medium wurde 24 h später erneuert. Zur Bestimmung der Cytotoxizität wurde 7 Tage später ein Cell-killing-Assay durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Überlebensrate der Zellen mit steigender Konzentration von CDV abnahm, wobei die Zellen bis zu einer Konzentration von 150 µM CDV noch weitestgehend intakt waren. Diese Konzentration wurde bereits für andere Zelllinien als tolerierbar publiziert (161). Für die weiterführenden Experimente wurde daher CDV immer in einer Konzentration von 150 µM eingesetzt. Nachdem die tolerierbare Konzentration für CDV ermittelt wurde, konnte im Anschluss das antivirale Potential bestimmt werden. Für dieses Experiment wurden EA.hy926-Zellen mit CDV Konzentrationen von 0 µM, 50 µM und 150 µM ausgesät und 24 h später mit verschiedenen moi Ad2 (0,1; 0,5; 2,5) infiziert und erneut mit den entsprechenden Mengen CDV behandelt. Am Tag 4 nach der Infektion erfolgte eine Bewertung des CPE mittels Kristallviolettfärbung der Zellen (Abb. 4.30). Abb. 4.30: antivirales Potential von CDV. EA.hy926-Zellen wurden mit den dargestellten Konzentrationen CDV ausgesät. CDV-haltiges Medium wurde 24 h später erneuert und mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. Zur Bestimmung der Cytotoxizität wurde 4 Tage später ein Cell-killing-Assay durchgeführt. 4. Ergebnisse 76 Es konnte beobachtet werden, dass die Behandlung mit CDV den durch die Ad-Infektion ausgelösten CPE konzentrationsabhängig inhibieren kann. Der größte inhibitorische Effekt war dabei bei 150 µM CDV zu beobachten, wobei die nichtinfizierten Zellen zeigten, dass diese CDV Konzentration gut tolerierbar ist. Damit konnte nachgewiesen werden, dass CDV generell in der Lage ist die Infektion mit Ad zu inhibieren. Im Folgenden sollte die antiadenovirale Wirkung der Kombination von CDV mit sCAR-Fc getestet werden. Dafür wurden EA.hy926-Zellen wie oben beschrieben ausgesät und 24 h später mit CDV (150 µM), sCAR-Fc (5 µg) oder beiden Komponenten behandelt und anschließend mit verschiedenen moi Ad2 infiziert. Nach einer Infektionszeit von 2 h wurden die entsprechenden Medien inklusive der Komponenten erneuert. Am Tag 7 nach der Infektion wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt und der durch die Ad verursachte CPE optisch begutachtet (Abb. 4.31). Abb. 4.31: antivirales Potential von CDV in Kombination mit sCAR-Fc. EA.hy926-Zellen wurden mit 150 µM CDV ausgesät. 24 h später wurden die Zellen mit 150 µM CDV, 5 µg sCAR-Fc oder beiden Komponenten behandelt und anschließend mit verschiedenen Dosen Ad2 infiziert. Nach 2 h Infektionszeit wurden die Medien inklusive aller Komponenten erneuert. 7 Tage später wurde ein Cellkilling-Assay durchgeführt. Es konnte nochmals gezeigt werden, dass die Einzelkomponenten CDV und sCAR-Fc im Vergleich zu den unbehandelten Zellen in der Lage sind die Ad-Infektion zu inhibieren. Die Kombination der beiden Substanzen führt ebenfalls zu einer effektiven Inhibierung der AdAufnahme und Replikation, allerdings ließ sich im Vergleich zu den sCAR-Fc behandelten Zellen kein additiver Effekt durch CDV feststellen, da die starke Wirkung von sCAR-Fc einen möglichen Zusatzeffekt von CDV überdeckt. Da das Cell-killing-Assay nur eine recht grobe Einschätzung additiver Effekte der Kombinationstherapie zulässt, sollte in den nachfolgenden Untersuchungen auf die quantitative RT-PCR zurückgegriffen werden. 4. Ergebnisse 77 4.4.2. Kombination sCAR-Fc und siRNAs Ein weiterer Ansatz zur Behandlung von Ad-Infektion ist das Einbringen von siRNAs in die infizierten Zellen, wo diese dann den Abbau der viralen mRNA einleiten. Dabei haben sich in der Vergangenheit verschiedene siRNAs als effektiv in der Zellkultur erwiesen. In der vorliegenden Untersuchung wurden 3 siRNAs gegen die adenoviralen mRNAs von E1a, IVa2 und Pol einzeln und in Kombination eingesetzt. HeLa-Zellen wurden mit Ad5 (moi 2,5) für 2 h infiziert und anschließend mit den verschiedenen siRNAs in einer Konzentration von 10 nM (sowohl einzeln als auch in Kombination) mittels Lipofektion transfiziert. Eine scrambled-siRNA dient dabei als Kontrolle. Nach 48 h wurde die DNA der HeLa-Zellen isoliert und mittels Hexon-spezifischer Primer in der qPCR auf adenovirale DNA untersucht (Abb. 4.32). Abb. 4.32: Antivirale Wirkung verschiedener siRNAs und deren Kombinationen. HeLa Zellen wurden 24 h nach dem Aussäen mit 2,5 moi Ad5 für 2 h infiziert und anschließend mittels Lipofektion mit 10 nM siRNAs transfiziert (bei Kombinationen von siRNAs wurde eine Gesamtmenge von 10 nM eingesetzt). Eine scrambled-siRNA (scr) diente als eine Kontrolle. 48 h später wurde die DNA der HeLa-Zellen durch Zellaufschluss isoliert und die adenovirale DNA in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer quantifiziert. Alle Werte sind auf die unbehandelte Kontrolle normiert. Dabei zeigte sich, dass alle eingesetzten siRNAs im Vergleich zur Kontroll-siRNA deutlich die Ad5-Replikation inhibieren. Von den einzelnen siRNAs stellte siPol mit einer Reduktion der Ad5-Replikation um das 12-fache die effektivste dar. Dabei ist sie nicht nur effektiver gegenüber den anderen einzeln eingesetzten siRNAs, sondern auch gegenüber den verschiedenen Kombinationsansätzen. Ein kombinierter Einsatz der siRNAs mit sCAR-Fc ergab allerdings ein differenzierteres Bild (Abb. 4.33). 4. Ergebnisse 78 Abb. 4.33: Antivirale Wirkung der Kombination von sCAR-Fc und siRNAs. HeLa-Zellen wurden in Anbzw. Abwesenheit von 1 µg sCAR-Fc mit 2,5 moi Ad5 infiziert. Nach 2 h Infektionszeit wurden die Medien inklusive sCAR-Fc erneuert und mit den siRNAs (10 nM) siPol, siE1A und siIVa2 (A) sowie deren Kombinationen (B) mittels Lipofektion transfiziert. 24 h nach Infektion erfolgte eine weitere Erneuerung des Mediums inklusive sCAR-Fc. 48 h nach Infektion wurde die DNA der HeLa-Zellen durch Zellaufschluss isoliert und die adenovirale DNA in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer quantifiziert. Dabei wurden die mit den siRNAs transfizierten HeLa-Zellen vor der Infektion mit Ad5 (moi 2,5) zusätzlich mit 1 µg sCAR-Fc behandelt. Der alleinige Einsatz von sCAR-Fc gegen Adenoviren resultierte in einer Inhibierung von knapp 70%. Es zeigte sich erneut, dass siPol von den einzeln eingesetzten siRNAs bei der Ad5-Replikation die effektivste darstellte. Allerdings wirkten in diesem kombinierten Ansatz mit sCAR-Fc die Kombinationen verschiedener siRNAs besser, als ohne sCAR-Fc. Besonders die Zweier-Kombination aus siIVa2 und siPol sowie die Kombination aller siRNAs zeigten einen besonders starken inhibitorischen Effekt gegenüber den Kontrollen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die zusätzliche Gabe von sCAR-Fc die antivirale Wirkung der siRNAs um ein Vielfaches verstärkt. Für die nachfolgende Untersuchung der additiven Wirkung von sCAR-Fc, CDV und siRNAs konnte nun auf ein effektives siRNA-Gemisch zurückgegriffen werden. 4.4.3. Dreifachkombination sCAR-Fc, Cidofovir und siRNAs Nachdem gezeigt werden konnte, dass CDV und die siRNAs sowohl einzeln als auch in Kombination mit sCAR-Fc anti-adenoviral wirken, sollte nun abschließend die Wirkung aller drei Komponenten in einem Inhibierungsansatz getestet werden. Dafür wurden HeLa-Zellen 4. Ergebnisse 79 mit CDV-haltigem Medium (150 µM) ausgesät und 24 h später mit Ad5 (moi 2,5) für 2 h in An- bzw. Abwesenheit von sCAR-Fc (1 µg) infiziert. Anschließend wurde das Medium erneuert und mit dem siRNA-Gemisch (10 nM) aus siPol, siE1a und siIVa2 transfiziert. Eine weitere Erneuerung des Mediums erfolgte nach 24 h. 48 h nach der Infektion wurde die DNA der HeLa-Zellen isoliert und die virale DNA mittels qPCR nachgewiesen (Abb. 4.34). Abb. 4.34: antivirales Potential der Dreifachkombination aus sCAR-Fc, siRNAs und CDV. HeLa-Zellen wurden mit 150 µM CDV ausgesät. 24 h später wurden die Zellen in An- bzw. Abwesenheit von 1 µg sCAR-Fc mit 2,5 moi Ad5 infiziert. Nach 2 h Infektionszeit wurden die Medien inklusive der Komponenten CDV und sCAR-Fc erneuert und mit dem siRNA-Gemisch (10 nM) aus siPol, siE1A und siIVa2 mittels Lipofektion transfiziert. 24 h nach Infektion erfolgte eine weitere Erneuerung des Mediums inklusive der Komponenten CDV und sCAR-Fc. 48 h nach Infektion wurde die DNA der HeLa-Zellen durch Zellaufschluss isoliert und die adenovirale DNA in einer qPCR mittels Hexon-spezifischer Primer quantifiziert. Es konnte noch einmal bestätigt werden, dass sowohl der Einsatz der Einzelkomponenten CDV, sCAR-Fc und siRNAs als auch die Kombinationen sCAR-Fc/CDV und sCARFc/siRNAs eine signifikante Reduzierung der viralen Replikation bewirken. Die stärkste Inhibierung der Ad-Infektion, mit einer Reduzierung der Ad5-Replikation um mehr als 99%, konnte allerdings beim Einsatz aller 3 Komponenten festgestellt werden. Diese Inhibierung war 22,8-fach stärker als die Kombination siRNA/sCAR-Fc und 95-fach stärker als die siRNAs alleine. Damit konnte eindeutig gezeigt werden, dass der Einsatz von CDV, sCAR-Fc und siRNAs einen additiven Effekt auf die Inhibierung der Ad-Infektion in vitro bewirkt. Damit ist der Weg frei zur Etablierung neuer therapeutischer Ansätze in der Klinik. 5. Diskussion 80 5. Diskussion 5.1. Anti-adenovirales Potential von sCAR-Fc in vitro und in vivo Das Blockieren der Interaktion eines Virus mit seinem korrespondieren zellulären Rezeptor durch soluble Rezeptor Analoga (SRA) stellt einen vielversprechenden Ansatz für eine Behandlung viraler Infektionen dar. Für verschiedene virale Infektionen wurden SRA bereits erfolgreich eingesetzt. Dazu gehören die vesikuläre Schweinekrankheit (162), das Masernvirus (87), das Coxsackievirus (84, 163), das Poliovirus (85) und das Rhinovirus (164). Die Bindung der SRA an die Virusoberfläche führt in erster Linie zu einer kompetitiven Inhibierung des viralen attachments an den zellulären Rezeptor. Als weiterer wichtiger Mechanismus der Virusneutralisation wurde die Bildung von nicht infektiösen altered (A)-particles durch die Bindung an SRA beschrieben. Allerdings scheint dieser Mechanismus auf die Gruppe der Picornaviridae beschränkt zu sein (83, 85, 165). Es ist eine wichtige Voraussetzung für die Virusneutralisierung, dass die SRA die korrekten Virus bindenden Domänen der zellulären Rezeptoren aufweisen, allerdings kann es von Vorteil sein diese Virus bindenden Domänen mit anderen Domänen, z.B. wie in der vorliegenden Arbeit mit der humanen IgG1-Fc Region (sCAR-Fc), zu fusionieren. Durch die Disulfidbrücken der Fc-Region bildet sich ein dimerisches Molekül mit Antikörper ähnlicher Struktur. Diese charakteristische Struktur erhöht die Halbwertzeit des Fusionsproteins deutlich (166) und beschleunigt die Eliminierung der Viren über das Erkennen der IgG-Fc-Domäne gebundener SRA durch Fc-Rezeptoren an der Oberfläche von Makrophagen (167). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sCAR-Fc, ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Region des CAR und dem Fc-Bereich des humanen IgG1, die Aufnahme von Ad in die Zielzellen effizienter inhibiert als monomerer sCAR, welches nur aus dem extrazellulären Bereich des CAR besteht. Bei der Inhibierung von CVB3-Infektionen zeigten sCAR-Fc und sCAR hingegen eine ähnliche Effizienz (83). Dies könnte direkt mit dem unterschiedlichen Inhibierungsmechanismus von sCAR-Fc bei CVB3 und Ad Infektionen zusammenhängen. sCAR-Fc induziert die Bildung von A-particles nach Bindung an CVB3. Hierbei reicht theoretisch schon die Bindung eines sCAR/sCAR-Fc Moleküls an die Virusoberfläche aus, um eine Konformationsänderung im Kapsid auszulösen. Diese führt dann zum Verlust der Infektiosität. Die Neutralisierung von Ad hingegen erfolgt über eine kompetitive Hemmung. Die Effizienz ist damit in hohem Maße von der Absättigung aller Rezeptorbindungsstellen abhängig. Möglicherweise ist sCAR-Fc, welches zwei identische virusbindende 5. Diskussion 81 Rezeptordomänen besitzt dazu besser geeignet, als sCAR, der nur über eine virusbindende Domäne verfügt. Bei CVB3 fällt dieser Unterschied scheinbar weniger ins Gewicht. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass bereits sehr geringe Mengen des SRA ausreichend sind um eine Virusneutralisierung zu erreichen. So war für die effektive Inhibierung von CVB3-Infektionen eine sCAR-Fc Konzentration von 150 – 200 ng/ml ausreichend (82, 92). Für die maximale Inhibierung von Ad von 97 % musste hingegen eine bis zu 250-fach höhere Konzentration sCAR-Fc eingesetzt werden. Bisher ist nur für die D1-Domäne von CAR eine direkte Virusbindung nachgewiesen (16, 168). Untersuchungen von Excoffon et al. zeigten allerdings, dass nach Entfernung der D2Domäne bzw. der Glykosylierungen des membranständigen CAR die Virusbindung an den Rezeptor signifikant abnahm (72, 73). Es wurde daraus geschlussfolgert, dass der D2-Domäne eine entscheidende Bedeutung bei der Ad-CAR-Interaktion zukommt. Als mögliche Ursache wurde dabei vermutet, dass durch Entfernung der D2-Domäne der Abstand zwischen Zelloberfläche und D1 Domäne so stark verkürzt wurde, dass Ad nicht mehr korrekt an die verbliebene virusbindende Domäne D1 binden konnte. Inwieweit diese Verkürzung auch einen Einfluss auf die Interaktion von Ad mit den löslichen CAR Homolog hatte, war nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte dies näher untersucht werden, wobei gleichzeitig die Möglichkeit, durch kürzere Proteine eine höhere Expression der SRA zu erreichen, geklärt werden sollte. Dafür wurden durch sequentielle Verkürzung der D2-Domäne des sCAR-Fc vom C-Terminus aus, 6 soluble Proteine hergestellt wobei darauf geachtet wurde, dass bestehende Strukturmotive nicht unterbrochen wurden. Aus der Verkürzung der D2-Domäne resultierte eine höhere Expression der SRA aber auch eine Verringerung der anti-adenoviralen Wirkung, wobei mit kürzer werdender D2-Domäne die Ad-Inhibierung abnahm. Im Falle des sCAR-Fc ohne D2-Domäne bestand so gut wie keine Inhibierung mehr. Da es sich bei diesen Proteinen hierbei um soluble Varianten des CAR handelt, konnte ein zu geringer Abstand der Virus bindenden D1-Domäne zum Virus als Ursache für die fehlende sCAR-Fc–Ad Interaktion ausgeschlossen werden. Es besteht die Möglichkeit, dass die durch die Verkürzung falsch gefaltete D2-Domäne einen Einfluss auf die Konformation und dadurch auch auf die Virusbindung der D1-Domäne hat. Dies ist allerdings unwahrscheinlich, da im Falle von sCAR-3-Fc (ohne D2) ebenfalls keine Virusbindung erfolgte. Die Faltung der Proteindomänen beginnt bereits während der Translation vom N-Terminus (169). Die Faltung des Proteins beginnt demnach an der D1-Domäne, wodurch diese unabhängig von der Struktur der D2-Domäne gefaltet wird. Dass die Veränderungen in der Struktur der D2- 5. Diskussion 82 Domäne trotzdem einen Einfluss auf die Struktur der D1-Domäne haben könnte, kann an dieser Stelle allerdings nicht ausgeschlossen werden. Eine andere Erklärung für den Funktionsverlust der verkürzten sCAR-Fc-Varianten könnte sich jedoch direkt aus der dimerischen Struktur des sCAR-Fc ableiten. Je kürzer die D2-Domänen werden, umso näher kommt die D1 Domäne der hinge-Region des IgG-Fc. Dies könnte zu einer sterischen Behinderung der Virusbindung führen und somit als Erklärung für die Beobachtungen dienen. Letztendlich zeigen diese Untersuchungen jedoch, dass die D2- Domäne auch im sCAR-Fc eine Bedeutung für die Virusneutralisierung hat. Weiterführende Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um ihre Bedeutung weiter aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit konnte die effektive Wirkung von sCAR-Fc gegen Wt-AdInfektionen anhand verschiedener Gesichtspunkte aufgezeigt werden. So konnte in der Zellkultur sowohl die adenovirale Replikation um bis zu 99%, als auch der dadurch hervorgerufene zytopathische Effekt, effektiv durch den Einsatz von sCAR-Fc inhibiert werden. Diese Inhibierung konnte auch für eine Leberzelllinie demonstriert werden, was darauf schließen lässt, dass sCAR-Fc potentiell auch in vivo die Ad-Aufnahme in die Leber inhibieren könnte. Dies ist besonders wichtig, da die Leber in infizierten und immunsupprimierten Patienten besonders stark von der Ad-Infektion betroffen ist. Die effektive Inhibierung konnte erreicht werden, da sCAR-Fc in den beschriebenen Experimenten prophylaktisch eingesetzt wurde. Nach der Aufnahme von Ad in die Zelle kann sCAR-Fc nicht mehr wirken und die Replikation der Ad findet statt. Erst wenn die Replikation abgeschlossen ist, die Wirtszelle lysiert wird und neue Ad frei werden, kann sCAR-Fc die Infektion neuer Zellen wieder inhibieren. Dieser therapeutische Effekt konnte in der vorliegenden Arbeit ebenfalls gezeigt werden. Noch 30 h nach einer Ad-Infektion konnte die Gabe von sCAR-Fc eine signifikante Inhibierung der Ad-Replikation im Vergleich zur Kontrolle bewirken und selbst 72 h nach einer Ad-Infektion konnte dieser Effekt tendenziell nachgewiesen werden. Aus den Ergebnissen der in vitro Untersuchungen wurde deutlich, dass für eine effektive Inhibierung von Ad in vivo ein sCAR-Fc Serumlevel von mindestens 10 µg/ml erreicht werden müsste, wenn die Ad Konzentration im Blut bei ungefähr 107 bis 108 Viruspartikeln pro ml liegt, einer Konzentration die im oberen Bereich derer liegt, die häufig bei Patienten mit schwerer disseminierter Ad Infektion gefunden wird (170–172). Es konnte bereits gezeigt werden, dass CVB3-Infektionen durch verschiedene Vektor-basierte Ansätze bei denen 5. Diskussion 83 sCAR-Fc exprimiert wurde, erfolgreich behandelt werden konnten. Eine PlasmidTransfektion in den Musculus tibialis anterior von Mäusen mit anschließender Elektroporation führte zu einem sCAR-Fc Serumlevel von weniger als 0,1 µg/ml (92)und durch Expression über den induzierbaren Adenovektor AdG12 wurde eine sCAR-Fc Konzentration von weniger als 1 µg/ml erreicht (82). Beide Ansätze wären damit für die Zwecke dieser Arbeit nicht nützlich gewesen, da sie die angestrebte sCAR-Fc Konzentration von mindestens 10 µg/ml nicht erreicht hätten. Um die hohe sCAR-Fc Konzentration in vivo zu erreichen, wurde deshalb ein sCAR-Fc exprimierender dimerischer AAV-Vektor entwickelt. Der dimerische scAAV9-CMV-sCAR-Fc erreichte am Tag 11 nach der Applikation in die Maus bereits eine sCAR-Fc Konzentration von mehr als 10 µg/ml. Dies korreliert mit der Fähigkeit von dimerischen AAV-Vektoren nach der Transduktion eine sehr schnelle Transgen-Expression einzuleiten (150). Weitere Faktoren die wahrscheinlich einen Einfluss auf die hohe Transgen-Expression hatten, waren die Nutzung einer für die Maus Codon-optimierten sCAR-Fc cDNA und die Verwendung eines AAV-Vektors vom Serotyp 9. Dieser stellt, unter den für in vivo Experimente am häufigsten genutzten AAV-Serotypen, den Typ mit der höchsten in vivo Transgen-Expression dar (173, 174). Für die in vivo Untersuchungen musste eine neue Expressionskassette für sCAR-Fc generiert werden, da die ursprünglich zur Verfügung stehende Kassette aus dem AdG12 mit einer Größe von 2668 bp ca. 10% über der maximalen Verpackungsgrenze dimerischer AAV-Vektoren von 2400 bp lag (149, 150). Zwar konnten Wu et al. zeigen, dass man trotz überschrittener Verpackungsgrenze dimerische AAV-Vektoren produzieren kann, dabei jedoch ein Gemisch aus dimerischen und monomerischen AAV-Vektoren entsteht. Dabei verschiebt sich das Verhältnis mit zunehmender Größe des Transgens mehr und mehr zu Gunsten der monomerischen AAV-Vektoren (159). Allerdings war eine Generierung funktionell aktiver sCAR-Fc exprimierender dimerischer AAV-Vektoren nicht möglich. Dies zeigt, dass offensichtlich nicht nur die Größe der Expressionskassette sondern auch andere Faktoren, die die Verpackung dimerischer AAV-Vektoren beeinflussen, entscheidend für die Generierung funktioneller AAV-Vektoren sind. Andere sCAR-Fc Expressionskassetten, welche kleiner waren als 2400 bp, ließen sich ohne Probleme verpacken und waren funktionell. Dabei handelte es sich auch um kürzere Varianten des eigentlichen sCAR-Fc, sodass ein möglicher Einfluss der Sequenz auf den Verpackungsprozess eher unwahrscheinlich zu sein scheint. Allerdings besteht die Möglichkeit, dass ab einer bestimmten Größe, spezifische Sequenzen nicht mehr korrekt verpackt werden können (175). Um diesem Problem zu entgehen, wurde eine neue sCAR-Fc Expressionskassette generiert. Diese beinhaltet einen verkürzten CMV- 5. Diskussion 84 Promotor, eine für Maus Codon-optimierte sCAR-Fc cDNA und ein verkürztes synthetisches PolyA. Durch diese Veränderungen lag die neue Expressionskassette bei einer Größe von 2371 bp und damit unter der Verpackungsgrenze von 2400 bp. Die Expressionskassette ließ sich anschließend ohne Probleme verpacken und die Vektoren waren funktionell. Der so optimierte scAAV9-CMV-sCAR-Fc wurde in den weiterführenden Experimenten für alle Tierversuche genutzt. Um den Verlauf der Transgen-Expression des scAAV-CMV-sCAR-Fc und mögliche Nebenwirkungen des sCAR-Fc zu untersuchen, wurde in einem Langzeitversuch die Expression von sCAR-Fc über einen Zeitraum von 28 Tagen beobachtet. Dabei diente der AdG12 (82)als Kontrolle und erbrachte in der vorliegenden Arbeit einen sCAR-Fc Serumlevel von maximal 550 ng/ml am Tag 5 nach Transduktion. Anschließend fiel die sCAR-Fc Expression stark ab, während bei der Nutzung des scAAV9-CMV-sCAR-Fc die sCAR-Fc Konzentration bis Tag 20 auf ungefähr 40 µg/ml anstieg und bis zum Ende des Untersuchungszeitraums auf diesem Level verblieb. Dies verdeutlicht die großen Unterschiede bei der Nutzung der verschiedenen Vektorsysteme und den Vorteil von AAVVektoren. Die hohe in vivo Expression von sCAR-Fc führte zu keinen Nebenwirkungen. Parenchymatöse Organe mit scAAV9-CMV-sCAR-Fc behandelter Kontrolltiere waren histologisch ohne Unterschiede zu unbehandelten Tieren. Diese Beobachtungen stehen in Übereinstimmung mit früheren Studien, die ebenfalls keine Nebenwirkung einer sCAR-Fc Behandlung in vivo zeigten (82, 84, 92). Allerdings konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass auch sehr hohe sCAR-Fc Serumspiegel gut toleriert werden. Da Ad-Infektionen im immunsupprimierten Organismus einen schwerwiegenderen Verlauf nehmen als in immunkompetenten Organismen, wurde in den folgenden Untersuchungen die anti-adenovirale Wirksamkeit von sCAR-Fc in immunsupprimierten Mäusen untersucht. Zur Induktion der Immunsuppression, wurden den Tieren Cyclophosphamid (CP) verabreicht, welches 14 Tagen nach Applikation zu einer erfolgreichen Immunsuppression führt (153). 14 Tage nach Transduktion des scAAV9-CMV-sCAR-Fc befinden sich mehr als 10 µg/ml sCAR-Fc im Serum, sodass von einer effizienten Inhibierung der Ad ausgegangen werden konnte. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Tiere mit einer Dosis von 2 x 1010 VG des Indikatorvektors Ad5CMVluc transduziert. Die Dosis von 2x 1010 VG wurde gewählt, da bei dieser Konzentration Lebertoxizität beobachtet werden kann (160). Die Leber ist eines der primären Organe welche bei einer Ad-Infektion immunsupprimierter Patienten geschädigt 5. Diskussion 85 werden (46, 52). Die anschließende Untersuchung der Inhibierung der Ad-Aufnahme ergab allerdings keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den sCAR-Fc behandelten Tieren und den Kontrollen. Vergleicht man die Ansätze der in vitro mit den in vivo Versuchen, stellt man fest, dass in den Zellkulturexperimenten eine maximale Dosis von 2 x 107 VG zu inhibierenden Ad eingesetzt und dabei mit 50 µg/ml sCAR-Fc eine Inhibierung der AdAufnahme um 97% erreicht wurde. Diese Ad-Dosis lag damit um das ca. 1000-fache niedriger als die in den Tierversuchen eingesetzte Dosis. Da bereits festgestellt wurde, dass die inhibierende Wirkung von sCAR-Fc konzentrationsabhängig ist, war ein möglicher inhibierender Effekt in diesem Ansatz durch die hohe Dosis des zu inhibierenden Ad nicht erkennbar. Nachfolgend wurde für die Untersuchung der antiviralen Wirkung von sCAR-Fc im immunsupprimierten Mausmodell eine Dosis von 5 x 107 Partikeln Ad5 eingesetzt. In diesem Dosisbereich ließ sich die Ad5-DNA noch sicher über eine quantitative PCR in der Leber nachweisen. Die Expression des sCAR-Fc über den scAAV9-CMV-sCAR-Fc führte zu einer signifikanten Inhibierung der Ad-Infektion in der Leber und im Herzen der immunsupprimierten Mäuse. In Lunge, Milz und Pankreas ließ sich nur eine tendenzielle Reduktion feststellen. Der Nachweis einer Ad-induzierten Lebertoxizität über die Leberspezifischen Enzyme ALT und AST ließ sich bei der geringen Dosis Ad5 nicht führen, was darauf hindeutete, dass die Ad Dosis zu niedrig oder der Untersuchungszeitraum zu kurz waren um eine adäquate Schädigung der Leberzellen zu induzieren. Allerdings konnte in der Leber der mit sCAR-Fc behandelten Tiere eine Reduktion der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-12 festgestellt werden, was als indirekter Beweis für eine geringere hepatische Ad-Infektion dienen kann. Besonders IL-6 ist ein wichtiger Bestandteil der akuten Phase nach einer Infektion und wird unter anderem in Hepatozyten gebildet (176). Es fiel bei der Ermittlung der Zytokine auf, dass der IL-6-Level in den immunsupprimierten Tieren im Vergleich zu den immunkompetenten Kontrolltieren stark erhöht war. Dies könnte durch die Gabe von CP zu erklären sein, da CP eine Erhöhung des IL6-Levels hervorrufen kann (177, 178). Besonders die hier gezeigte Inhibierung der Leberentzündung ist wichtig für eine erfolgreiche Ad-Behandlung, da gerade Leberversagen den häufigsten Grund für einen tödlichen Ausgang bei immunsupprimierten Patienten darstellt (46, 52). Die Ergebnisse zur Ad-Inhibierung durch sCAR-Fc war teilweise überraschend, da bereits gezeigt wurde, dass Ad die Leber über Interaktionen mit Blutgerinnungsfaktoren wie FX 5. Diskussion 86 (179–181) und FIX sowie dem Komplementsystembestandteil C4-bindendes Protein (182) CAR-unabhängig infiziert.CAR ist stark in der Leber exprimiert (183). Seine Rolle bei der Ad-Aufnahme in die Leber bleibt jedoch umstritten. Neben Studien, die CAR nur eine geringe Bedeutung beimessen (184) zeigten andere Studien eine signifikante Bedeutung von CAR bei der hepatischen Ad-Infektion (185). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützen letztere Aussage, zeigen allerdings auch, dass CAR keine zentrale Rolle als AdRezeptor in der Leber zuzukommen scheint. Dies zeigt sich darin, dass beim Einsatz von 5 x 107 VG Ad5 pro Maus eine Reduktion der Ad-Infektion der Leber um 65% erreicht wurde und bei einer Dosis von 2 x 1010 Ad5 VG pro Maus kein Inhibierungseffekt nachweisbar war. Im Gegensatz dazu konnte durch die Inhibierung des Blutgerinnungsfaktors FX mit dem Medikament Warfarin eine Inhibierung der Ad-Infektion der Leber von ungefähr 2-log-Stufen erreicht werden, wobei die eingesetzte Ad5 Dosis mit 4 x 1011 VG um knapp das 10.000fache höher lag als die in der vorliegenden Arbeit verabreichte Dosis Ad5 (181). Die vergleichsweise geringe Effizienz von sCAR-Fc eröffnet die Frage, inwieweit dies einen möglichen Ansatz zur Ad-Behandlung im Menschen darstellen könnte. Obwohl es keine festgelegten Regeln, ab wann eine antivirale Behandlung bei schweren Ad-Infektionen zu erfolgen hat, existieren, wird der Einsatz einer solchen Behandlung bereits ab dem Nachweis von mehr als 1000 Kopien Ad pro ml Blut von immunsupprimierten Patienten empfohlen (12, 186). In der klinischen Praxis werden Patienten häufig erstmalig behandelt, wenn ihr Ad Titer zwischen 104 und 108 Ad Kopien pro ml Blut liegt (170–172). Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sCAR-Fc in diesem Konzentrationsbereich (5 x 107 VG Ad5) effektiv Ad im immunsupprimierten Organismus inhibieren kann. Die inhibierende Wirkung beschränkte sich jedoch auf Leber und Herz. Die Inhibierung in Lunge, Milz und Pankreas konnte nicht statistisch signifikant nachgewiesen werden. Ein Grund hierfür mag sein, dass AAV9 Vektoren bevorzugt die Leber und das Herz transduzieren (173),wodurch eine höhere lokale sCAR-Fc Konzentration als in den anderen Organen erzielt wird. Diese wiederum ermöglicht die bessere Inhibierung der Ad. 5. Diskussion 5.2. 87 Kombination von sCAR-Fc mit Cidofovir und siRNAs als Therapie gegen Ad-Infektionen Das Risiko an einer schweren Ad-Infektion zu erkranken, z.B. bei immunsupprimierten Patienten nach Organtransplantation, ist auch in heutiger Zeit sehr hoch. Dennoch gibt es zurzeit keinerlei zugelassene kausale Therapie, die spezifisch gegen Ad-Infektionen gerichtet ist. Schwere Ad-Infektionen werden auf verschiedene Weise behandelt. Sehr wirksam scheint dabei eine Reduzierung immunsuppressiv wirkender Medikamente zu sein. Allerdings steigt damit auch das Risiko von Abstoßungsreaktionen. Daneben werden antivirale Medikamente und unspezifische Therapien mit Immunglobulinen und Verfahren der Intensivmedizin angewendet (12). Trotzdem ist die Behandlung nicht in allen Fällen erfolgreich und es kommt häufig zu Todesfällen (46, 187–189). Einen neuen vielversprechenden anti-adenoviralen Ansatz bei der Bekämpfung von viralen Infektionen stellt die RNAi dar undmehrfach konnte bereits gezeigt werden, dass die Inhibierung der adenoviralen Genexpression durch siRNAs möglich ist (127, 190–192). In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht inwieweit die Kombination von sCAR-Fc, CDV und anti-adenoviralen siRNA die Inhibierung von Ad-Infektionen, verstärkt. Zunächst wurden drei siRNAs gegen das adenovirale E1A, IVa2 und DNA-Polymerase (siE1A, siIVa2 und siPol), welche bereits in verschiedenen Studien als hocheffizient erwiesen haben (126, 127),einzeln und in Kombination eingesetzt. Die siPol zeigte dabei die stärkste und die siE1A die schwächste Inhibierungsrate. Da siPol die virale DNA-Polymerase als Ziel hat, ist es nachvollziehbar, dass durch den Eingriff in den kritischen Schritt der DNA-Replikation die Inhibierungsrate so hoch liegt. Die Daten bestätigen andere Untersuchungen, die zeigten, dass das silencing von Genen der Replikationsmaschinerie effektiver als bei anderen adenoviralen Genen ist (127). Für E1A konnte gezeigt werden, dass selbst eine 40-fache Herunterregulation der E1A Expression keinen inhibierenden Effekt auf die Ad-Replikation aufweist (193). Durch Kombinationen der verschiedenen siRNAs konnte der inhibitorische Effekt der einzeln eingesetzten siRNAs, vor allem siPol, nicht weiter verstärkt werden. Ein Grund hierfür könnte die Tatsache sein, dass um die Gesamtkonzentration der eingesetzten siRNAs in den Experimenten konstant zu halten in den Kombinationsansätzen der Anteil der einzelnen siRNAs verringert wurde. Offensichtlich konnte die damit verbundene Reduzierung der siRNA Konzentration nicht durch additive Wirkung infolge co-silencings verschiedener adenoviraler Gene kompensiert werden. In anderen Studien konnten sowohl synergistische wie auch additive Effekte durch siRNA-Kombinationen erreicht werden. Beispiele hierfür 5. Diskussion 88 sind die siRNA-Behandlung von Infektionen mit dem Chikungunya-Virus (194) und dem Hepatitis C Virus (195). Auch beim Hepatitis B Virus in Transgenen Mäusen konnte durch den Einsatz von siRNAs gegen verschiedene Gene eine stärke Inhibierung der viralen Replikation erreicht werden, als durch den Einsatz einzelner siRNAs (196). Um die inhibierende Wirkung der siRNAs zu verstärken, bietet es sich an diese mit anderen antiviralen Agenzien zu kombinieren. Diese antiviralen Agenzien sollten nach Möglichkeit weitere kritische Schritte in der Ad-Replikation blockieren (197–199). Eine der meist angewandten antiviralen Therapien stellt die Gabe des azyklischen Nukleotidanalogon Cidofovir (CDV) dar, welches zur Inhibierung der DNA-Replikation und dadurch zu einer verminderten Replikation der Ad führt (12). Doch die nachgewiesene Nephrotoxizität und auch der mögliche Einfluss auf die DNA-Replikation nichtinfizierter Zellen machen den Einsatz in der Klinik als Standardtherapie schwierig (200). CDV wurde bisher nur zur Behandlung von durch Zytomegalievirus (CMV) verursachte Retinitis bei AIDS-Patienten zugelassen, jedoch wird es auch zur Behandlung von viralen Infektionen, die durch andere DNA-Viren hervorgerufen werden verwendet (59, 60, 201, 202). Das neue Medikament CMX001 (Brincidofovir) ist ein Lipidester-Derivat des Wirkstoffs CDV. Es zeichnet sich durch eine verbesserte Bioverfügbarkeit, eine erhöhte zelluläre Aufnahme und einer verringerten Toxizität aus (153, 203). Es wirkt u.a. gegen CMV, Ad und Herpes Simplex Virus (204). Die Behandlung mit CMX001 konnte in Einzelfallstudien erfolgreich die AdInfektion in immunsupprimierten Stammzellempfängern inhibieren (62). Allerdings bleibt die Todesrate bei den Patienten unverändert hoch und nur die durchschnittliche Überlebensdauer wird erhöht (40, 63). Im Zuge dieser Arbeit konnte die antivirale Wirkung von CDV bei Ad bestätigt werden. Der Einsatz von 150 µM CDV in der Zellkultur zeigte einen deutlich geringeren Ad-induzierten CPE. Höhere CDV Dosierungen führten allerdings zu zytotoxischen Effekten in der nichtinfizierten Zellkultur, sodass 150 µM die maximale Dosis darstellte. Diese Dosis wurde auch von anderen Arbeitsgruppen angewendet (161). Für die Behandlung viraler Infektionen haben sich oftmals Kombinationstherapien, bei denen die einzelnen Therapeutika an verschiedenen kritischen Punkten des viralen Replikationszyklus ansetzen, effizienter als die jeweiligen Monotherapien erwiesen (205–207). Um dies auch für Ad Infektionen zu untersuchen, wurde untersucht inwieweit sCAR-Fc, das die Virusaufnahme blockiert in Kombination mit CDV, das die Replikation der adenoviralen DNA inhibiert, eine additive Wirksamkeit zeigen. Die Untersuchungen zeigten, dass die Kombinationstherapie eine effektivere Inhibierung der Ad-Infektion in vitro ermöglichte als die Monotherapien. 5. Diskussion 89 Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Aufnahme des Virus in seine Zielzelle einen der wichtigsten Schritte im Replikationszyklus eines Virus darstellt und dass die Blockierung dieses Schrittes eine effektive Möglichkeit bietet die virale Infektion zu inhibieren (87, 92, 208–210). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass sCAR-Fc die Ad-Aufnahme in vitro und in vivo effektiv inhibieren kann. Beim Einsatz von sCAR-Fc zusammen mit den einzelnen siRNAs und den siRNA-Kombinationen zeigte sich, dass das anti-adenovirale Potential der siRNAs nochmals verstärkt wurde. Weitere Studien der Arbeitsgruppe zeigten ähnliche Ergebnisse bei einem kombinierten Einsatz von sCAR-Fc und siRNAs gegen die 3D-Polymerase des CVB3, wobei eine verstärkte antivirale Effizienz gegenüber den Einzelkomponenten nachgewiesen wurde (207, 211). Da die verschiedenen hier diskutierten antiviralen Ansätze alle an unterschiedlichen Stellen (Virusaufnahme, DNA-Replikation, Genexpression) in die Ad-Replikation eingreifen, wurde untersucht, inwieweit eine Kombination aus sCAR-Fc, siRNAs und CDV die inhibierenden Effekte der Kombinationen siRNA/sCAR-Fc und CDV/sCAR-Fc weiter verstärkt. Es konnte gezeigt werden, dass die Ad-Replikation durch die Kombination aller 3 anti-adenoviralen Agenzien um mehr als 99% inhibiert werden konnte. Die Inhibierung ist damit stärker als die der Einzelkomponenten und der Kombinationen aus siRNA/sCAR-Fc sowie CDV/sCAR-Fc. Da jede Komponente nacheinander und völlig unabhängig voneinander wirkt, kann man mindestens von einem additiven Effekt ausgehen. So inhibiert sCAR-Fc den initialen Schritt der Virusaufnahme. Das CDV wirkt auf die DNA der nicht von sCAR-Fc geblockten Viren durch die Inhibierung der viralen DNA-Replikation. Die siRNAs inhibieren effektiv die von der DNA transkribierten viralen mRNAs. Ist der Ad-Replikationszyklus abgeschlossen und die Zelle geht in den lytischen Zustand über, kann sCAR-Fc wieder die Ad-Aufnahme in neue Zellen blockieren. Inwieweit diese Art der Therapie im humanen Patienten angewendet werden kann, gilt es noch zu untersuchen. Die Nutzung von siRNAs zur Behandlung viraler Infektionen wurde bereits in verschiedenen in vivo Studien demonstriert (212–215). Durch chemische Veränderungen kann der Verbleib von siRNAs im Körper verlängert werden (214). Durch das Einbetten in Nanopartikel (216) oder durch Expression von hepatotropen viralen Vektoren (217) können siRNAs in vivo effektiv in die Leber transportiert werden. Dieser Punkt ist für die Behandlung von Ad-Infektionen besonders wichtig, da Leberversagen den häufigsten Grund für den Tod infizierter Patienten darstellt (46, 52). Das sCAR-Fc könnte wie in der vorliegenden Arbeit über virale Vektoren in den Körper transferiert werden, wobei über einen 5. Diskussion 90 längeren Zeitraum keine Nebenwirkungen der hohen sCAR-Fc Konzentration beobachtet werden konnten. Eine andere Möglichkeit sCAR-Fc zu applizieren wäre die Nutzung von rekombinant hergestelltem sCAR-Fc (84). Allerdings muss dabei darauf geachtet werden, dass sCAR-Fc seine natürliche Struktur und seine Glykosylierungen aufweist. So gibt es mittlerweile genetisch modifizierte Hefestämme, welche ein annähernd humanes Expressionsmuster aufweisen (218). Dies muss für jedes rekombinante Protein überprüft werden. So konnte sCAR-Fc rekombinant in Pichia pastoris hergestellt werden, um anschließend gegen CVB3 eingesetzt zu werden. Dabei zeigte sich, dass das exprimierte Protein kein Dimer bildete und auch nicht glykosyliert war (219). Die Nutzung von siRNAs und sCAR-Fc zusammen mit der etablierten Therapie von CDV könnte die therapeutische Effizienz verstärken. Alternativ könnte in der Kombination die CDV-Dosis herabgesetzt werden, um die Nebenwirkungen durch CDV und damit die Risiken für immunsupprimierte Patienten zu verringern. 5.3. Ausblick In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das sCAR-Fc in vitro und in vivo AdInfektionen effektiv inhibieren kann. Bei diesen Ansätzen handelte es sich allerdings größtenteils um prophylaktische Ansätze. Eine effektive Inhibierung von Ad-Infektionen durch sCAR-Fc in einem therapeutischen Modell muss daher zukünftig untersucht werden. Desweiteren sollte das Modelltier ausgetauscht werden. Da sich humane Ad in Mäusen nicht verbreiten, sind diese keine optimalen Modellorganismen. Hierfür würde sich der syrische Hamster anbieten, in welchem humane Ad eine permissive Infektion durchlaufen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der anti-adenovirale Effekt von sCAR-Fc durch Kombination mit siRNAs und CDV erheblich verstärkt wird. Diese Kombinationstherapie sollte im Tiermodell unter prophylaktischen und therapeutischen Gesichtspunkten untersucht werden, um anschließend einen möglichen Einsatz in der Klinik abzuklären. Um sCAR-Fc in der Klinik ohne Gentherapie zu verabreichen, wird eine Möglichkeit benötigt sCAR-Fc rekombinant herzustellen. Dabei sollte vor allem darauf geachtet werden, dass die native Struktur und Funktionalität erhalten bleibt. Desweiteren wird ein entsprechendes Reinigungsprotokoll benötigt, um mögliche Nebenwirkungen zu minimieren. 6. Zusammenfassung 91 6. Zusammenfassung Adenovirus (Ad)-Infektionen zeigen beim Menschen in der Regel einen akuten, aber weitestgehend milden Krankheitsverlauf. Bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr können Adenovirusinfektionen zu schweren und mitunter tödlich verlaufenden Erkrankungen führen. Zu den Risikogruppen gehören vor allem immunsupprimierte Patienten, wie Empfänger von Organtransplantaten, Kinder nach hämatopoetischer Stammzelltherapie aber auch Patienten mit akuter Leukämie. Gegenwärtig ist in der Klinik jedoch keine spezifisch auf Adenovirusinfektionen ausgerichtete Therapie im Einsatz. Die Behandlung basiert vor allem auf symptomatischen und unspezifischen Ansätzen. Daher bedarf es der Entwicklung neuer spezifischer anti-adenoviraler Therapieansätze. In der vorliegenden Arbeit wird das antivirale Potential rekombinanter löslicher Varianten des Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptors (CAR) gegen (Ad) beschrieben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf dem Fusionsprotein sCAR-Fc, welches aus dem extrazellulären Bereich des CAR und dem Fc-Teil des humanen IgG1 besteht. 1) Von den verschiedenen untersuchten löslichen Varianten des CAR ist sCAR-Fc die effektivste im Hinblick auf die Inhibierung der Ad-Aufnahme in die Zellen. Dabei wirkt sCAR-Fc ausschließlich extrazellulär und die inhibierende Wirkung ist konzentrationsabhängig. Durch eine Verkürzung der D2-Domäne des sCAR-Fc wurden verschiedene Varianten generiert, welche eine verringerte Ad-Inhibierung aufwiesen. 2) Durch die sCAR-Fc vermittelte Inhibierung der Aufnahme von Ad konnte die adenovirale Replikation und auch der dadurch hervorgerufene zytopathische Effekt in der Zellkultur um bis zu 99 % verringert werden. 3) Die inhibierende Wirkung des sCAR-Fc war umso stärker je eher die Behandlung der AdInfektion begonnen wurde. So war das antivirale Potential im prophylaktischen Ansatz am größten. Allerdings konnte auch eine therapeutische Gabe von sCAR-Fc bei frühzeitigem Behandlungsbeginn eine signifikante Inhibierung der Ad-Infektion erzielen. 4) Durch die systemische Applikation des im Rahmen dieser Arbeit hergestellten scAAV9CMV-sCAR-Fc konnten hohe sCAR-Fc Serumspiegel von bis zu 40 µg/ml über einen langen Zeitraum in vivo im Mausmodell generiert werden. Dabei konnten keine Nebenwirkungen der hohen sCAR-Fc Expression beobachtet werden. 6. Zusammenfassung 92 5) Die antivirale Wirkung des sCAR-Fc, welche in vitro nachgewiesen wurde, konnte ebenfalls in vivo bestätigt werden. So war es möglich durch den Einsatz von sCAR-Fc die adenovirale Infektion der Leber und des Herzens in einem immunsupprimierten Mausmodell signifikant zu inhibieren. Gleichzeitig konnte ein signifikanter Rückgang von proinflammatorischen Zytokinen in der Leber nachgewiesen werden. 6) Die Kombination von sCAR-Fc mit anderen antiviralen Agenzien, wie Cidofovir und verschiedenen gegen adenovirale mRNAs gerichtete siRNAs, konnten den inhibitorischen Effekt von sCAR-Fc um ein Vielfaches verstärken. Diese Kombinationstherapie könnte einen neuen Ansatz in der Behandlung von Ad-Infektionen im immunsupprimierten Patienten darstellen. In der vorliegenden Dissertation konnte die inhibierende Wirkung löslicher CAR-Varianten gegen Ad veranschaulicht werden. Der Einsatz dieser Moleküle, allen voran sCAR-Fc, bietet damit eine zusätzliche Option bei der üblichen Behandlung von Ad-Infektionen im immunsupprimierten Patienten. Durch die Kombination mit weiteren antiviralen Agenzien könnte eine effektivere und vielversprechende Therapie bei Ad-Infektionen in Risikopatienten ermöglicht werden. 7. Summary 93 7. Summary Adenoviruses induce acute but mild infections in human patients. However, in immunocompromised patients adenovirus can cause severe infections sometimes leading to death. Immunosuppressed patients like recipients of organ transplantations, children after hematopoietic stem cell therapy and patients with acute leukemia are part of the high risk group. Currently, there is no specific curative anti-adenoviral therapy available in the clinics. The therapy is mainly based on the unspecific treatment of the symptoms. Therefore, there is a necessity of the development of new specific anti-adenoviral therapeutic approaches. The present study describes the antiviral potential of recombinant soluble variants of the coxsackievirus- and adenovirus-receptor (CAR) against adenoviruses (Ad). A special focus is given to the fusionprotein sCAR-Fc, which consists of the extracellular Region of CAR and the Fc-domain of the human IgG1. 1) From the different soluble CAR variants sCAR-Fc was the most efficient one in terms of cellular Ad-uptake inhibition. sCAR-Fc is effective exclusively extracellular und its inhibitory effect is concentration dependent. Through the reduction of the D2-domain of sCAR-Fc different variants were generated, which showed a reduced Ad-inhibition. 2) Due to the sCAR-Fc mediated inhibition of the Ad-uptake the adenoviral replication and the induced cytopathic effect in cell culture was reduced by 99%. 3) The inhibitory effect of sCAR-Fc was higher the earlier the treatment of the Ad-infection started and the antiviral potential in the prophylactic approach was the strongest. However, also an early therapeutic application of sCAR-Fc was able to significantly inhibit the Adinfection. 4) Through systemic application of scAAV9-CMV-sCAR-Fc high sCAR-Fc concentrations in the serum of up to 40 µg/ml were expressed over a long period in an in vivo mouse model. No side effects could be observed during this time. 5) The antiviral effect of sCAR-Fc, which could be observed in vitro, was also verified in vivo. The treatment with sCAR-Fc was able to significantly inhibit the adenoviral infection of the liver and the heart in an immunocompromised mouse model. At the same time a significant reduction of proinflammatory cytokines in the liver could be observed. 7. Summary 94 6) The combination of sCAR-Fc treatment with other antiviral agents like Cidofovir or siRNAs against adenoviral mRNAs was able to strongly increase the inhibitory effect of sCAR-Fc. This combined therapy represents a possible new approach for the treatment of Adinfections in immunocompromised patients. In this present study the inhibitory effect of soluble CAR-variants against Ad was demonstrated. The application of these molecules, first of all sCAR-Fc offer new options for the usual treatment of Ad-infections in immunocompromised patients. Through the combination with other antiviral agents, a more effective and promising Ad-therapy in high risk patients could be established. 8. Literaturverzeichnis 95 8. Literaturverzeichnis 1. ROWE,W.P., HUEBNER,R.J., GILMORE,L.K., PARROTT,R.H. and WARD,T.G. (1953) Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570–3. 2. Walls,T., Shankar,A.G. and Shingadia,D. (2003) Adenovirus: an increasingly important pathogen in paediatric bone marrow transplant patients. Lancet. Infect. Dis., 3, 79–86. 3. 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Anhang Anhang A: Vektorkarten und Vektorkonstruktionen Das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fc war bereits in der Arbeitsgruppe von Dr. Fechner vorhanden. Die Protein codierende Sequenz wurde von dem Plasmid pAdG12 (82) amplifiziert und in das pCR4Blunt-TOPO-Plasmid (Invitrogen, Mannheim, D) kloniert (pCRTOPO-sCAR-Fc). Die sCAR-Fc cDNA wurde über das Restriktionsenzym EcoRI ausgeschnitten und in das Plasmid pscAAV-CMV kloniert. Das Plasmid pscAAV-CMV wurde hergestellt, indem eine einzelne EcoRI-Schnittstelle und ein SV40 poly A downstream des CMV Promotors in dem Plasmid pscAAV-MCS (124) eingefügt wurde. 9. Anhang 120 Das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fctrunk lag bereits bei der Arbeitsgruppe Dr. Fechner vor. Durch eine Deletion im Sense Primer kam es während der Amplifikation zu einer Verschiebung des Leserahmens, woraufhin an Position 13 der sCAR-Fc Sequenz ein StoppCodon entstand. Das Genprodukt ist dadurch nur 12 AS lang. 9. Anhang 121 Das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR wurde hergestellt, indem mit den Primern AAVsCAR EcoRIs und AAVsCAR EcoRIas die Protein codierende Sequenz amplifiziert wurde und anschließend mit EcoRI in das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fc, unter Entfernung des sCARFc, einkloniert wurde. 9. Anhang 122 Das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-C4bp war bereits in der Arbeitsgruppe von Dr. Fechner vorhanden. Die cDNA des C4bp wurde mittel RT-PCR mit den Primern C4bp-BamHI s und C4bp-MluI as aus mRNA von Huh7-Zellen generiert. Die cDNA wurde mittels BamHI/MluIVerdau hinter das sCAR im pCRTOPO-sCAR-Fc, unter Entfernung des Fc-Teils, einkloniert. Über einen EcoRI-Verdau wurde sCAR-C4bp anschließend in das pdAAV-sCAR-Fc, unter Entfernung von sCAR-Fc, einkloniert. 9. Anhang 123 Die cDNA für das IgG-Fc wurde mit den Primern SP-Fc-s und Fc-SalI-a von dem Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fc amplifiziert. Um das Peptid soluble zu machen, musste eine Signalsequenz zum Ausschleusen kloniert werden. Diese Signalsequenz wurde mit den Primern AAVsCAR EcoRIs und SP-Fc-a von dem Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fc amplifiziert. Anschließend erfolgte eine Overlap-PCR mit den beiden generierten DNAFragmenten und den Primern AAVsCAR EcoRIs und Fc-SalI-a. Das so generierte sFc-DNAFragment wurde über EcoRI und SalI in das Plasmid pdAAV-CMV-sCAR-Fc, unter Entfernung von sCAR-Fc einkloniert. 9. Anhang 124 Die sCAR-Fc-Varianten mit den verkürzten D2-Domänen (sCAR-3-Fc bis sCAR-41/2-Fc) wurden alle auf die gleiche Art und Weise generiert. Für diese Plasmide ist die Konstruktion exemplarisch an pdAAV-CMV-sCAR-3-Fc beschrieben. Mit den Primern div sCAR-Fcs und sCAR3-Fc wurde ein entsprechendes DNA-Fragment von pdAAV-CMV-sCAR-Fc amplifiziert. Mit den Primern AAVsCAR EcoRIs und Fc-SalI-a wurde ein sCAR-FcFragment generiert, welches von einer EcoRI- und einer SalI-Schnittstelle flankiert wurde. Nach EcoRI/SalI-Verdau des pdAAV-CMV-sCAR-Fc wurde dieses Fragment einkloniert. Anschließend konnten die generierten verkürzten sCAR-Varianten über einen EcoRI/BamHIVerdau einkloniert werden. 9. Anhang 125 Das DNA-Fragment sCAR-Hinge wurde mittels der Primer AAVsCAR EcoRIs und sCAR Hinge Fc a amplifiziert und anschließend mit EcoRI und SalI, unter Entfernung des sFc, in pdAAV-CMV-sFc einkloniert. 9. Anhang 126 Das DNA-Fragment für die D2-Domäne wurde mit Hilfe der Primer CAR-D2s und CARD2as von pdAAV-CMV-sCAR-Fc amplifiziert. Das DNA-Fragment wird durch eine BglII und eine BamHI-Schnittstelle flankiert. Durch Linearisierung des pdAAV-CMV-sCAR-Fc mit BamHI kann das DNA-Fragment einkloniert werden, da BglII und BamHI die gleichen Überhänge produzieren. Der Übergang zwischen den beiden D2-Domänen wird allerdings danach nicht mehr von BglII und BamHI erkannt. 9. Anhang 127 Die Expressionskassette für pdAAV-CMV-sCAR-Fc opt. wurde für Maus Codon optimiert und von der Firma Life Technologies (Darmstadt, D) synthetisiert. Die Expressionskassette enthält neben dem sCAR-Fc, einen verkürzten CMV-Promotor (Genbank accesion number U55763.1) und ein synthetisches polyA (Genbank accesion number KJ175229.1) und wurde in dem Plasmid pAM (Life Technologies, Darmstadt, D) geliefert. Mittels NotI/XbaI-Verdau wurde die Expressionskassette, unter Entfernung der alten Expressionskassette, in pdAAVCMV-sCAR-Fc einkloniert. 9. Anhang 128 Um ein Plasmid mit einer trunkierten Version des sCAR-Fc zu generieren, wurde eine Mutations-PCR mit den Primern sCAR-mut fw und sCAR-mut rev (AG Kurreck) durchgeführt. Als DNA-Matrize diente pdAAV-CMV-sCAR-Fc opt. Durch den Primer sCAR-mut fw wurde das Codon für die 6. AS gegen ein Stopp-Codon ausgetauscht. Dadurch kommt es zur keiner sCAR-Fc Expression. Anschließend konnte das mutierte DNA-Fragment über den Verdau mit EcoRI und MluI in pdAAV-CMV-sCAR-Fc opt. einkloniert werden. 9. Anhang 129 Anhang B: Publikationsliste Veröffentlichte Primärartikel 1. Pozzuto T, Röger C, Kurreck J, Fechner H, Enhanced Suppression of Adenovirus Production by Triple Combination of Anti-Adenoviral siRNAs, Soluble Adenovirus Receptor Trap sCAR-Fc and Cidofovir. Antiviral Res. 2015, Aug;120:72-8 2. Röger C, Pozzuto T, Klopfleisch R, Kurreck J, Pinkert S, Fechner H, 2015. Expression of an engineered soluble coxsackievirus and adenovirus receptor by a dimeric AAV9 vector inhibits adenovirus infection in mice. Gene Ther. 2015, Jun;22(6):458-66 3. Gröβl T, Hammer E, Bien-Möller S, Geisler A, Pinkert S, Röger C, Poller W, Kurreck J, Völker U, Vetter R, Fechner H, 2014. A novel artificial microRNA expressing AAV vector for phospholamban silencing in cardiomyocytes improves Ca2+ uptake into the sarcoplasmic reticulum. PloS One 2014, 9, e92188 Kongressbeiträge 1. C.Röger, S. Pinkert, S. Weger, R. Klopfleisch, J. Kurreck, H. Fechner. 2013. “Soluble coxsackievirus and adenovirus receptor (sCAR-Fc) has prophylactic and therapeutic potential in adenovirus infections”. Posterpräsentation beim 21st European Society of Gene and Cell Therapy Congress in Madrid. 2. C.Röger, S. Pinkert, S. Weger, H. Fechner. 2013. “Soluble coxsackievirus and adenovirus receptor (sCAR-Fc) has prophylactic and therapeutic potential in adenovirus infections (in vitro)”. Posterpräsentation beim 23rd Annual Meeting of the Society for Virology in Kiel. 3. C. Röger, S. Pinkert, H. Fechner. 2011. “Soluble coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) variants and their therapeutic potential in coxsackievirus and adenovirus infection”.Posterpräsentation beim 21st Annual Meeting of the Society for Virology in Freiburg. 9. Anhang 130 Anhang C: Danksagung Herrn Prof. Dr. Jens Kurreck danke ich, dass er mir ermöglichte meine Dissertation im Fachgebiet für Angewandte Biochemie anfertigen zu können. Prof. Dr. Claus-Thomas Bock und Prof. Dr. Roland Lauster danke ich für die Begutachtung meiner Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Dr. Henry Fechner, der mich in den vielen Jahren hervorragend betreut, motiviert und angespornt hat. Ein offenes Ohr zu jeder Zeit, gute Gespräche und konstruktive Diskussionen auf Augenhöhe haben eine angenehme Arbeitsatmosphäre geschaffen. Desweiteren danke ich meinen Kollegen, die mir in dieser Zeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Besonders hervorheben möchte ich dabei Dr. Sandra Pinkert, Dr. Tanja Pozzuto und Dr. Anja Geisler. Auch möchte ich die Gelegenheit nutzen meinen Mit-Doktoranden Katrin Schaar und Elisabeth Stein für die angenehme Zeit und den regen Austausch zu danken. Auch geht ein großes Dankeschön an Petra Seifert, Viola Röhrs und Bernd Krostitz, die sowohl innerhalb als auch außerhalb des Wissenschaftsbetriebes vieles möglich gemacht haben. Ganz besonders möchte ich mich bei Prof. Dr. Robert Klopfleisch und seinen Kollegen für die schnelle und gewissenhafte Begutachtung von Gewebeschnitten und Blutausstrichen bedanken. Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei den Mitgliedern der Sonnenfeld-Stiftung bedanken, die es mir mit einem 2-jährigen Stipendium ermöglichten meine experimentelle Arbeit fortzusetzen. Zu guter Letzt möchte ich natürlich meiner gesamten Familie und vor allem meinen Eltern für die unendliche Geduld und Unterstützung danken, welche sie mir zukommenließen. Meinen Freunden danke ich, dass sie mich durch ihre beständige Motivation und teils ins Sadistische abdriftende Nachbohren über das Vorankommen in der Dissertation, dazu bewegt haben dieses Projekt erfolgreich zu beenden. 9. Anhang 131 Anhang D: Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre an Eides Statt, dass die vorliegende Dissertation in allen Teilen von mir selbständig angefertigt wurde und die benutzten Hilfsmittel vollständig angegeben worden sind. Berlin, 15.07.2015 _________________________________________ (Carsten Röger)
