Aus der Medizinischen Klinik 5 Hämatologie und

Aus der Medizinischen Klinik 5
Hämatologie und internistische Onkologie
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. A. Mackensen
Charakterisierung von Immune escape Mechanismen bei akuter myeloischer
Leukämie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Alexandra Kolbeck
aus
Landshut
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. A. Mackensen
Korreferent:
Priv.-Doz. Dr. N. Meidenbauer
Tag der mündlichen Prüfung:
18. April 2012
Inhaltsverzeichnis
I. Zusammenfassung........................................................................................... i
II. Summary ........................................................................................................iii
1 Einleitung ........................................................................................................ 1
1.1 DIE AKUTE MYELOISCHE LEUKÄMIE .......................................................................................... 1
1.1.1 PATHOGENESE, KLASSIFIKATION UND THERAPIEOPTIONEN ...................................................... 1
1.1.2 DIE ALLOGENE STAMMZELLTRANSPLANTATION ........................................................................ 4
1.2 IMMUNE ESCAPE MECHANISMEN ................................................................................................ 6
1.2.1 STÖRUNGEN DER HLA-EXPRESSION .......................................................................................... 7
1.2.2 STÖRUNGEN DER KOSTIMULATION UND KOINHIBITION ............................................................. 8
1.2.3 STÖRUNGEN DER APOPTOSE ....................................................................................................... 9
1.2.3.1 Extrinsische Apoptoseinduktion über das Fas/FasL System und deren Inhibition durch FLIP
10
1.2.3.2 Intrinsische Apoptoseinduktion über das Granzyme B/Perforin System und deren Inhibition
durch PI-9 und Mcl-1
11
1.2.4 SEKRETION IMMUNMODULATORISCHER ZYTOKINE ................................................................. 13
1.3 ZIELSETZUNG.............................................................................................................................. 14
2 Patienten, Material und Methoden............................................................. 16
2.1 PATIENTENKOLLEKTIV .............................................................................................................. 16
2.2 KONTROLLZELLEN:.................................................................................................................... 18
2.2.1 MONOZYTEN ............................................................................................................................. 18
2.2.2 G-CSF STIMULIERTE PERIPHERE BLUTSTAMMZELLEN ............................................................. 18
2.2.3 ZELLLINIEN: .............................................................................................................................. 19
2.2.3.1 Jurkat T-Zellen
19
2.2.3.2 YT-Zelllinie
19
2.2.3.3 K562 Zellen
19
2.2.3.4 U937 Zellen
20
2.2.3.5 Kg1a Zellen
20
2.3 METHODEN: ................................................................................................................................ 20
2.3.1 GRUNDLEGENDE TECHNIKEN ................................................................................................... 20
2.3.1.1 Kultivierung von Zellen
20
2.3.1.2 Zentrifugation von Zellen
20
2.3.1.3 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau-Ausschlussfärbung
20
2.3.2 AUFARBEITUNG DER AML-BLASTEN ....................................................................................... 21
2.3.2.1 Schonendes Auftauen von AML-Blasten
23
2.3.2.2 FACS-Analysen zur Phänotypisierung der AML-Blasten, Monozyten und Zelllinien
23
2.3.2.3 Selektion CD34 positiver Blasten über das magnetische Beads System
24
2.3.2.4 Apoptoseinduktion und Nachweis mittels AnnexinV/PI-Färbung
25
2.3.2.5 Proteinbiochemischer Nachweis im Western Blot
26
2.3.2.6 Nachweis von Zytokinen mittels Cytometric beat array (CBA)
28
3 Ergebnisse ..................................................................................................... 29
3.1
STÖRUNGEN DER ANTIGENPRÄSENTATION AUF AML-BLASTEN............................................ 29
3.1.1 EXPRESSION VON HLA-KLASSE I MOLEKÜLEN AUF AML-BLASTEN ...................................... 29
3.1.1.1 Konstitutive HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten
29
3.1.1.2 Induktion der HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten durch IFNγ
31
3.1.1.2.1 Kinetik der HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation.............. 31
3.1.1.2.2 IFNγ induzierte Expression von HLA-ABC bei AML-Blasten .......................................... 31
3.1.2 EXPRESSION VON HLA-KLASSE II MOLEKÜLEN AUF AML-BLASTEN..................................... 32
3.1.2.1 Konstitutive HLA-Klasse II Expression auf AML-Blasten
32
3.1.2.2 Kinetik der HLA-Klasse II Expression auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
33
3.1.2.3 IFNγ induzierte Expression von HLA-DR bei AML-Blasten
34
3.2 EXPRESSION VON KOSTIMULATORISCHEN UND KOINHIBIORISCHEN MOLEKÜLEN AUF AMLBLASTEN ...................................................................................................................................... 35
3.2.1 KONSTITUTIVE EXPRESSION DER KOSTIMULATORISCHEN MOLEKÜLE CD80 UND CD86 AUF
AML-BLASTEN ......................................................................................................................... 35
3.2.2 IFNΓ INDUZIERTE EXPRESSION VON KOSTIMULATORISCHEN MOLEKÜLEN AUF AML-BLASTEN
................................................................................................................................................... 36
3.2.3 EXPRESSION DES KOINHIBITORISCHEN MOLEKÜLS PD-L1 AUF AML-BLASTEN ..................... 36
3.2.3.1 Konstitutive PD-L1 Expression auf AML-Blasten
36
3.2.3.2 Kinetik der PD-L1 Expression auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
36
3.2.3.3 IFNγ induzierte PD-L1 Expression auf AML-Blasten
38
3.3 APOPTOSE RESISTENZEN BEI AML-BLASTEN.......................................................................... 39
3.3.1 DIE FAS/FASL VERMITTELTE APOPTOSE .................................................................................. 39
3.3.1.1 Konstitutive Expression des Fas Rezeptors (CD95) auf AML Blasten
39
3.3.1.2 Kinetik der Expression des Fas Rezeptors auf AML Blasten nach IFNγ Stimulation
40
3.3.1.3 Expression des Fas-Rezeptors CD95 auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
41
3.3.1.4 Apoptose Induktion durch anti-Fas-Antikörper auf AML-Blasten
41
3.3.1.4.1 Apoptose Induktion............................................................................................................. 41
3.3.1.4.2 Sensitivität von AML-Blasten gegenüber Fas-vermittelter Apoptose ............................... 41
3.3.1.4.3 Korrelation zwischen der Sensitivität gegenüber Fas-vermittelter Apoptose und Fas
Expression auf AML-Blasten.............................................................................................. 43
3.3.2 EXPRESSION ANTIAPOPTOTISCHER MOLEKÜLE BEI AML-BLASTEN ........................................ 44
3.3.2.1 Expression antiapoptotischer Moleküle von AML-Zelllinien, Monozyten und PBSC
44
3.3.2.2 FLIPS/L - ein Apoptose inhibitorisches Molekül
45
3.3.2.3 Die Expression von Mcl-1 auf AML-Blasten, leukämischen Zelllinien und nicht malignen,
myeloischen Zellen
47
3.3.2.4 Die Expression von PI-9 auf AML-Blasten
48
3.3.2.4.1 Funktioneller Nachweis der PI-9 Expression über die Komplexbildung von PI9/GrB ...... 48
3.3.2.4.2 PI-9 Expression auf leukämischen Zelllinien, Monozyten und peripheren Blutstammzellen
(PBSC) ................................................................................................................................ 49
3.3.2.4.3 PI-9 Expression von AML-Blasten..................................................................................... 49
3.3.2.4.3.1 konstitutive PI-9 Expression von AML-Blasten .............................................................. 49
3.3.2.4.3.2 Zeit und dosisabhängige IFNγ Stimulation bei P21......................................................... 50
3.3.2.4.3.3 IFNγ induzierte PI-9 Expression von AML-Blasten........................................................ 51
3.4 ZYTOKIN SEKRETION VON AML-BLASTEN .............................................................................. 51
3.4.1 SEKRETION PRO-INFLAMMATORISCHER ZYTOKINE DURCH AML-BLASTEN ........................... 51
3.4.1.1 Sekretion von Interleukin IL-1ß durch AML Blasten
51
3.4.1.2 Sekretion von Interleukin IL-6 durch AML Blasten
53
3.4.1.3 Sekretion von IL-12p70 durch AML Blasten
53
3.4.1.4 Sekretion von TNF-α durch AML Blasten
54
3.4.1.5 Sekretion von Interleukin IL-8 durch AML Blasten
54
3.4.2 DAS ANTI-INFLAMMATORISCHE ZYTOKIN IL-10 ...................................................................... 55
4 Diskussion...................................................................................................... 56
4.1
ANTIGENPRÄSENTATION, KOSTIMULATION UND KOINHIBITION ALS IMMUNE ESCAPE
MECHANISMEN BEI DER AML ................................................................................................... 56
4.1.1 HLA-KLASSE I UND II MOLEKÜLE ........................................................................................... 56
4.1.2 EXPRESSION KOSTIMULATORISCHER MOLEKÜLE ..................................................................... 59
4.1.3 DIE BEDEUTUNG DES KOINHIBITORS PD-L1 FÜR DIE AML ..................................................... 62
4.2 APOPTOSEVERHALTEN VON AML-BLASTEN ........................................................................... 63
4.3 BEDEUTUNG DER EXPRESSION ANTIAPOPTOTISCHER MOLEKÜLE BEI AML-BLASTEN ....... 65
4.3.1 MCL-1....................................................................................................................................... 65
4.3.2 FLIPL ......................................................................................................................................... 68
4.3.3 PI-9............................................................................................................................................ 69
4.4 ZYTOKIN SEKRETION DURCH AML-BLASTEN ......................................................................... 72
4.4.1 SEKRETION PRO-INFLAMMATORISCHER MOLEKÜLE DURCH AML-BLASTEN .......................... 72
4.4.1.1 IL-1beta
72
4.4.1.2 IL-6
72
4.4.1.3 IL-12p70
73
4.4.1.4 TNF-α
74
4.4.1.5 IL-8
74
4.4.2 SEKRETION DES ANTI-INFLAMMATORISCHEN MOLEKÜLS IL-10 DURCH AML-BLASTEN........ 75
4.4.3 BEDEUTUNG DER SEKRETION VON ZYTOKINEN DURCH AML-BLASTEN ................................. 76
5 Literaturverzeichnis..................................................................................... 79
6 Danksagung………………………………………………………………...93
7 Abkürzungsverzeichnis................................................................................ 95
i
I.
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Obwohl in den letzten Jahren in der Therapie der AML große Fortschritte erzielt wurden, sind
die Ursachen für die hohen Rezidivraten nach allogener SZT weiterhin nicht vollständig
geklärt. Als Ursache werden Immune Escape Mechanismen diskutiert, mit deren Hilfe sich
Tumorzellen vor der Elimination durch das Immunsystem schützen. Nach einer allogenen
Stammzelltransplantation spielen Zytokine bei der Entwicklung einer GvHD, bzw. des GvLEffektes eine zentrale Rolle. Besonders IFNγ ist ein Schlüsselmolekül des initialen
Zytokinsturms und bei der Entwicklung einer GvHD. Ziel der vorliegenden Arbeit war
deshalb, mögliche Immune Escape Mechanismen bei der AML in ihren Grundzügen zu
charakterisieren. In einem stark vereinfachten Model des Zytokinsturms wurden AMLBlasten mit IFNγ stimuliert, um dessen Einfluss auf die Entwicklung von Immune escape
Mechanismen zu analysieren.
Methoden
Kryokonservierte AML-Blasten von insgesamt 21 Patienten wurden mittels CD34 Selektion
aufgearbeitet, und jeweils zu drei Zeitpunkten, unmittelbar nach dem Auftauen (t0), sowie
nach 24h mit und ohne IFNγ (24h +/-IFNγ) Stimulation analysiert. Zu den genannten
Zeitpunkten wurde die Oberflächenexpression der HLA-Klasse I und II Moleküle HLA-ABC
und HLA-DR, sowie der Koinhibitorischen Moleküle CD80 und CD86, des Koinhibitorischen
Moleküls
PD-L1,
sowie
des
apoptotischen
Fas
Rezeptors
CD95
mittels
Immunphänotypisierung bestimmt. Ebenso wurde die intrazelluläre Expression von
antiapoptotischen Molekülen wie PI-9, Mc-1 und FLIPL bei AML-Blasten, sowohl
konstitutiv, als auch nach IFNγ Stimulation, mit Hilfe der Western Blot Technik spezifisch
identifiziert und quantifiziert. Die Fas/FasL vermittelte Apoptoseinduktion bei AML-Blasten
wurde in einem funktionellen Apoptoseansatz mit einem agonistischen anti-Fas-Antikörper
überprüft und anschließend nach 24h die Apoptoserate durch Annexin-V/PI Färbung im
Durchflusszytometer detektiert. Die Sekretion von stimulatorischen Interleukinen wie IL-1ß,
IL-6, IL-8, TNFα und IL-12p70, sowie des inhibitorischen Interleukin IL-10 wurde im
Überstand von 24h mit und ohne INFγ inkubierten AML-Blasten mittels Cytometric beat
array (CBA) im Durchflusszytometer bestimmt.
Ergebnisse und Beobachtungen
HLA Klasse I (HLA-ABC) konnte auf allen untersuchten Blasten nachgewiesen werden.
Dabei war unmittelbar nach der Aufarbeitung (t0) jeweils die komplette Blastenpopulation
positiv, und die Expression konnte durch Stimulation mit IFNγ gesteigert werden. Eine
ii
konstitutive HLA-DR Expression konnte bei 19 von 20 AML-Blasten nachgewiesen wer. Die
Dichte der HLA-DR Expression wies jedoch eine hohe Schwankung auf und war durch INFγ
Stimulation beeinflussbar. Mit Ausnahme von 3 Patienten, bei denen eine konstitutive
Expression von CD86 gezeigt wurde, gelang kein Nachweis einer Expression der
Koinhibitoren CD80 und CD86, welche auch nicht durch IFNγ Stimulation induziert werden
konnten. Der Nachweis einer konstitutiven Expression von PD-L1 auf primären AML-Blasten
gelang bei 3/20 Patienten, wobei bei 4/20 AML-Blasten nach IFNγ Stimulation eine
vermehrte Expression von PD-L1 nachgewiesen werden konnte.
Die Expression des Fas Rezeptors CD95 konnte bei 90% der AML-Blasten in geringer Dichte
nachgewiesen, und dessen Induktion durch IFNγ gezeigt werden. Die Apoptoseinduktion über
den agonistischen anti-Fas Antikörper konnte gezeigt werden, allerdings konnte keine
Korrelation zwischen der Apoptoserate der Blasten und der Fas Rezeptor Expression
nachgewiesen werden. Die Expression von antiapoptotischen Molekülen und deren Induktion
durch IFNγ (mit Ausnahme von Mcl-1) konnte nachgewiesen werden, wobei erstmals die
Expression und Induktion durch IFNγ von PI-9 auf AML-Blasten gezeigt werden konnte.
Praktische Schlussfolgerungen
Erstmals konnte bei AML Blasten sowohl die konstitutive Expression des antiapoptotischen
Moleküls PI-9 und des Koinhibitors PD-L1, als auch dessen Induktion durch IFNγ
nachgewiesen werden. AML-Blasten scheinen also anti-apoptotische Moleküle zu
exprimieren, die während des Zytokinsturms nach allo SCT aktiviert werden, um Immune
escape Mechanismen zu entwickeln und sich dem GvL Effekt zu entziehen. Können diese
Ergebnisse in größeren Fallzahlen bestätigt werden, könnte eine spezifische Blockade dieser
Moleküle zukünftig eine therapeutische Option darstellen.
iii
II.
Summary
Acute myeloid leukemia (AML) is still a life-threatening disease. Although therapy of AML
improved over the last years and many patients can be treated successfully at the time of
diagnosis, a lot of them relapse and in response are treated with allogenic stem cell
transplantation. The curative potential of allo-SCT is based on immuno-competent donor Tcells inducing immune reaction against resting blasts. This mechanism is called graft-versusleukemia effect (GvL). It is still unclear why AML patients after allo-SCT relapse more
frequently than patients with CML. Leukemic blasts develop mechanisms to bypass the
immune system. Today, little is known about the so called immune escape mechanisms
developed by AML blasts. Therefore we wanted to detect immune escape mechanisms by
AML blasts. We used stimulation with IFNγ as a simplified model of the cytokine storm after
allo-SCT where IFNγ is a key cytokine.
In this study we investigated different immune escape mechanisms in blasts from 20 patients
with AML. We examined the surface expression of HLA-class I and II molecules, coinhibitory molecules like CD80, CD86 and as a relatively new molecule, PD-L1 and the Fas
receptor CD95 by immunophenotyping. The expression of anti-apoptotic molecules like Mcl1, FLIP and PI-9 was detected by Western blot analysis. Resistance of AML blasts against
Fas/Fas Ligand induced apoptosis was determined in a functional assay with an agonistic antiFas Antibody. Furthermore we examined the cytokine secretion of AML blasts. All of the
mentioned tests were done at the time t0 and with 24h unstimulated and IFNγ stimulated
AML blasts.
We were able to show for the first time the expression of PI-9 by AML blasts. PI-9
overexpression by tumor cells can be used to escape immune surveillance. It has been shown
that IFNγ up-regulates PI-9 expression of hepatocytes. We found PI-9 constitutively
expressed in 16/20 (80%) blasts of AML patients. Stimulation of AML blasts with IFNγ upregulated PI-9 expression in a dose-dependent manner. Up-regulation could be shown in 4/19
blasts of AML patiens after 4-5 hour of IFNγ incubation. 3/19 patients showed a spontaneous
up-regulation.
The co-inhibitory molecule programmed death receptor Ligand 1 (PD-L1), a recently
described B7 family member, is known to inhibit T cell functions like proliferation upon TCR
ligation and cytokine production. We proved that PD-L1 is constitutively expressed on 3/20
and can be up-regulated by IFNγ in 4/20 patients with AML. We also showed that AML
blasts express anti-apoptotic molecules like Mcl-1 and FLIP and their expression can be
induced by INFγ.
iv
Above all this study confirmed results that AML blasts express HLA class I and II molecules
on the surface and expression could be induced by IFNγ. The expression of co-inhibitory
molecules like CD 80 and CD86 could not be up-regulated by IFNγ in this study, whereas
only CD86 was found to be constitutively expressed in a variable amount on the surface of
few AML blasts.
Hence we conclude that AML blasts show different mechanisms of immune escape and
cytokines such as IFNγ, which are secreted during the cytokine storm of acute GvHD by
donor CTL, can contribute to the development of immune escape mechanisms in AML blasts.
1
1
Einleitung
1.1 Die akute myeloische Leukämie
1.1.1 Pathogenese, Klassifikation und Therapieoptionen
Hämatopoetische Zellen der myeloischen und der lymphatischen Zellreihe werden ausgehend
von einer pluripotenten Stammzelle über spezifische Differenzierungsprozesse gebildet. Die
Differenzierung zu funktionsfähigen Blutzellen erfolgt im Knochenmark unter dem Einfluß
von Wachstumsfaktoren. Während der Differenzierung von der Blutstammzelle zur reifen
Blutzelle verändert sich das Expressionsmuster verschiedener Oberflächenantigene, der sog.
CD-Marker (CD= Cluster of differentiation) kontinuierlich, wodurch entartete Zellen anhand
ihrer Antigenexpression einem Differenzierungsstadium zugeordnet werden können.
Die AML tritt gehäuft im Alter auf, zunehmend sind jedoch auch jüngere Menschen
betroffen. Der Median liegt bei 60 Jahren, mit einer Inzidenz der Krankheit von zwei bis drei
pro 100.000 Einwohner und Jahr. Hinzu kommen ca 4/100.000 Menschen, die an einem
myelodysplastischen Syndrom (MDS) erkranken und ein erhöhtes Risiko haben, im Laufe
ihrer Erkrankung eine AML zu entwickeln (ca 8%). Die AML stellt ca. 20% der akuten
Leukämien im Kindesalter und bis zu 80% der akuten Leukämien des Erwachsenen dar,
wovon nur 1/3 der Patienten dauerhaft geheilt werden können (Stone et al., 2004). Nur in den
wenigsten Fällen sind auslösende Faktoren bekannt, häufig finden sich jedoch sekundäre,
therapieassoziierte Leukämien nach vorausgegangener zytotoxischer Behandlung einer
malignen Erkrankung. Auch wenn die ursächlichen Gründe für die Entstehung der AML nicht
abschließend geklärt werden können, helfen Fortschritte in der Diagnostik, genetische
Abnormalitäten zu erfassen und zielgerichtete Therapien zu entwickeln. Als weitere
Risikofaktoren gelten ionisierende Strahlung, längere Exposition gegenüber Chemikalien wie
Benzenverbindungen, sowie genetische Dispositionen. So wurde bei Kindern mit DownSyndrom eine 10-fach erhöhte Inzidenz an akuten myeloischen Leukämien nachgewiesen.
Klinisch manifestiert sich die AML entweder akut innerhalb weniger Tage, oder schleichend
über mehrere Wochen bis Monate. Symptome ergeben sich durch die Verdrängung der
normalen Blutbildung und der daraus meist folgenden Anämie, Thrombo- und
Leukozytopenie. Somit klagen die Patienten zunächst über unspezifische Beschwerden, wie
Leistungsminderung, Fieber, Nachtschweiss, Gewichtsverlust, Müdigkeit, Gliederschmerzen,
Appetitlosigkeit und Hautblutungen.
Die
Therapie
der
Promyelozytenleukämie
einzelnen
AML-M3,
AML-Subgruppen
einem
folgt,
ähnlichen
mit
Ausnahme
der
Schema.
Durch
eine
2
Doppelinduktionschemotherapie wird zunächst eine komplette Remission angestrebt,
obligatorisch folgen drei Konsolidierungszyklen. Abhängig vom AML-Subtyp, der
Konstitution des Patienten und der Prognose schließen sich eine Erhaltungstherapie oder eine
allogene Stammzelltransplantation (SZT) an. Bedingt durch die Komplexität der Erkrankung
werden die Patienten fast ausschließlich in speziellen Zentren nach randomisierten
Studienprotokollen behandelt. Einfluss auf das Therapieschema haben vor allem zwei
Faktoren: Das Alter des Patienten, sowie der Chromosomenstatus (Heilmeier et al., 2007).
Einen immer größeren Stellenwert in der Therapie und vor allem der Prognose der AML
nimmt die Chromosomenanalyse ein. Malignen systemischen Erkrankungen wie der AML
liegen häufig erworbene Chromosomenaberrationen zugrunde, welche zu veränderter
Genexpression führen können und somit zu verändertem oder ungebremstem Zellwachstum
oder einer gestörten Zelldifferenzierung beitragen. Mit Hilfe zytogenetischer Untersuchungen
lassen sich heute vor Therapiebeginn Gendefekte nachweisen, wodurch es möglich wird, die
Therapie der Leukämie spezifischer zu gestalten. Als eindrucksvolles Beispiel sei hier die
Therapie der Promyelozytenleukämie (AML-M3) genannt. Durch Kenntnis der zugrunde
liegenden
Chromosomentranslokation
t(15;17)
kann
die
dadurch
bedingte
Differenzierungsstörung der Granulozyten durch Behandlung mit dem Vitamin-A-SäureDerivat All-Trans-Retinolsäure (ATRA) aufgehoben werden, wodurch die früher meist
tödlich verlaufende Krankheit heute in mehr als 80% der Fälle geheilt werden kann. Mit Hilfe
der Zytogenetik lassen sich die Leukämieformen früh in so genannte Risikogruppen mit
einem niedrigen, mittleren und hohem Rezidivrisiko einteilen, was heute für die
Therapieplanung
und
die
Entscheidung
für
oder
gegen
eine
allogene
Stammzelltransplantation entscheidend ist.
Bei ca. 80% der AML-Patienten lässt sich zunächst durch die Induktionstherapie eine
komplette Remission erzielen, häufig folgen jedoch bereits innerhalb der ersten fünf Jahre
Rezidive, so dass von einem durchschnittlichen 5-Jahres Überleben von 20-40 %
ausgegangen werden muss. Die Konsolidierungstherapien folgen obligatorisch, um im Körper
verbliebene maligne Zellen zu eliminieren, die oftmals selbst mit den momentan zur
Verfügung stehenden Methoden nicht nachgewiesen werden können.
Es existieren zwei verschiedene Einteilungen der AML. Zum einen gilt die FABKlassifikation
(French-American-British),
welche
die
AML-Subtypen
anhand
zytomorphologischer und zytochemischer Aspekte (siehe Tabelle 1) unterscheidet. Die WHOKlassifikation umfasst die wesentlichen Bestandteile der bisherigen FAB-Klassifikation,
3
zusätzlich werden hier genetische und klinische Befunde miteinbezogen. Vor allem die
genetische Charakterisierung der AML erlaubt nicht nur eine an der Prognose orientierte
Einteilung, sondern die Definition einzelner Untergruppen mit rekurrenten balancierten
Translokationen (Kern et al., 2003).
Die WHO favorisiert folgende Einteilung:
AML mit rekurrenten zytogenetischen Aberrationen
AML mit Myelodysplasie-assoziierten Eigenschaften
Therapieassoziierte AML und MDS
AML ohne weitere Spezifizierung
Als zusätzliche Neuerung wurde der Übergang von einem MDS in eine AML von
ursprünglich 30% auf 20% Blasten im Knochenmark herabgesetzt.
FAB
Name
Häufigkeit
Assoziierte Translokation
M0
Akute myeloische Leukämie
3%
Inv (3q26), t(3;3)
1%
M1
Akute Myeloblastenleukämie
M2
Akute Myeloblastenleukämie
25-30%
t(8;21),
40%
t(6;9)
1%
t(15;17)
98%
t(3;17)
1%
t(11;17)
1%
11q23
20%
t(6;9)
1%
Inv(3q26), t(3;3)
3%
5-10%
Inv (16), t(16,16)
80%
2-9%
11q23
20%
t(6;16)
2%
(t1;22)
5%
mit Ausreifung
M3
M4
Akute Promyelozytenleukämie
Akute myelomonozytäre
5-10%
20%
Leukämie
M4eo
Akute myelomonozytäre
Leukämie
M5
Akute Monozytenleukämie
M6
Erythrozytenleukämie
3-5%
M7
Akute
3-12-%
Megakaryozytenleukämie
Tabelle 1: AML-Klassifikation nach FAB
4
1.1.2 Die allogene Stammzelltransplantation
Von einer Stammzelltransplantation profitieren in der Regel vor allem jüngere Patienten, die
aufgrund ihrer Risikofaktoren, sowie zytogenetischer oder molekularer Veränderungen mit
einer hohen Wahrscheinlichkeit an einem Rezidiv erkranken. Auch Patienten, bei denen mit
der Induktionstherapie keine komplette Remission erreicht werden konnte, oder bei denen
nach Abschluss der initialen Therapie ein Rückfall der AML stattgefunden hat, werden bei
kurativem Ansatz Stammzelltransplantiert.
Die allogene SZT stellt für viele Patienten eine effektive und oftmals einzig mögliche
kurative Strategie in der Behandlung der AML dar, dennoch treten unter der stark
immunsuppressiven Therapie häufig lebensbedrohliche Komplikationen auf.
Bei der allogenen SZT werden dem Patienten hämatopoetische Stammzellen (HSC) eines
gesunden Spenders transplantiert. Bei HLA-inkompatiblen oder nicht vorhandenen
Geschwistern werden Stammzellen eines HLA-identen Fremdspenders transplantiert. Die
HSC eines Familien- oder Fremdspenders werden in einem nebenwirkungsarmen Verfahren,
durch die Verabreichung des Zytokins G-CSF, aus dem Knochenmark mobilisiert und aus
dem peripheren Blut mittels Leukapherese gewonnen. Das zentrale therapeutische Prinzip der
SZT ist die Graft-versus-Leukämie (GvL) Reaktion, die von der unerwünschten Spendergegen-Wirt-Reaktion (Graft-versus-Host disease, GvHD), unterschieden werden muss. Beide
Reaktionen
nehmen
entscheidenden
Einfluß
auf
den
Erfolg
der
allogenen
Stammzelltransplantation. Mit der Transfusion von Stammzellen aus dem Knochenmark oder
dem peripherem Blut werden zugleich auch Immunzellen des Spenders übertragen, welche
die Zellen und Gewebe des Empfängers als fremd erkennen und deshalb in einer Spendergegen-Wirt-Reaktion im Rahmen eines massiven Entzündungsvorganges angreifen und
zerstören. Die Lymphozyten des Spenders greifen also folglich nicht nur gesundes Gewebe
an, sondern erkennen im Idealfall auch im Körper verbliebene maligne Zellklone als fremd
und zerstören diese. Diese Immunreaktion wird überwiegend durch zytotoxische T-Zellen
(CTL) und Natürlichen Killer (NK)-Zellen des Spenders vermittelt, und zwar über
apoptoseauslösende Mechanismen wie Granzyme B/Perforin oder das Fas/FasL System. Eine
Unterdrückung dieser Immunantwort bei überschießender Immunreaktion durch eine
Immunsuppression ist möglich, führt allerdings zu einem erhöhten Rezidivrisiko, da damit der
erwünschte Graft-versus-Leukämie-Effekt unterbunden wird. Somit muss die medikamentöse
Immunsuppression fein gesteuert werden, um eine schwere GvHD und Transplantatabstoßung
zu unterdrücken und gleichzeitig den GvL Effekt zu ermöglichen, bzw. zu erhalten.
5
In der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) führt der GvL-Effekt bei
Rezidiven nach SZT durch alleinigen adoptiven Transfer von Donorlymphozyteninfusionen
(DLI) bei mehr als 70% der Patienten zur Heilung. Das Ansprechen nach DLI bei der AML
liegt dagegen unter 30% (Kolb et al., 1995).
Aus diesen Gründen ist es wichtig, die Pathophysiologie der GvHD bzw. der GvL-Reaktion
nach allogener Stammzelltransplantation genau zu studieren, um den GvL Effekt wirksamer
zur Elimination von Tumorzellen einsetzen zu können.
Abbildung 1: Pathophysiologie der GvHD
Pathophysiologie und Zytokinsturm der GvHD. Phase 1: Schädigung des körpereigenen, gesunden Gewebes durch Radio-/Chemotherapie
führt zur Freisetzung inflammatorischer Zytokine. Phase 2: T-Zell Aktivierung bewirkt verstärkte Freisetzung von IFNγ und IL-2. Phase 3:
Effektorphase: Immunantwort auf zellulärer und sekretorischer Ebene führt über Apoptoseinduktion zur Zerstörung körpereigenen Gewebes,
Freisetzung weiterer inflammatorischer Zytokine und einem massiven Entzündungsgeschehen (Hill and Ferrara, 2000).
Die Pathophysiologie der GvHD kann in drei Phasen eingeteilt werden. In der
Konditionierungsphase
Konditionierungstherapie
(Phase1)
in
Form
wird
einer
körpereigenes
myeloablativen
Gewebe
durch
die
Chemotherapie
bzw.
Ganzkörperbestrahlung geschädigt. Betroffen ist vor allem die Darmmukosa, was zur
Aufnahme von Darmbakterien und nachfolgender Freisetzung von Lipopolysaccharid (LPS)
und Sekretion inflammatorischer Zytokine wie Tumornekrosefaktor (TNF) -α und Interleukin
(IL)-1 führt. Diese beiden inflammatorischen Moleküle führen zu einer verstärkten
Expression von HLA Klasse I und Adhäsions- Molekülen auf Antigenpräsentierenden Zellen.
Die zweite Phase der GvHD ist geprägt von einer Aktivierung von T-Zellen. Über IL-12 wird
6
eine Proliferation von Th1 T-Zellen induziert, diese führt zur vermehrten Sekretion von IL-2
und IFNγ, was wiederum die T-Zell Expansion und die Aktivität der CTL und NK-Zellen
verstärkt. Zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen schädigen das Gewebe über das
GranzymeB/Perforin-System, Fas/FasL Interaktion, bzw. über TNFα. Während der
Effektorphase (Phase3) werden die aktivierten Immunzellen mittels Freisetzung weiterer
immunstimulatorischer
Moleküle
unterstützt.
Durch
die
massive
Freisetzung
inflammatorischer Moleküle wird ein regelrechter Zytokinsturm ausgelöst, der zum
charakteristischen klinischen Bild der GvHD führt.
Bei dem Zytokinsturm nach allogener SZT sind Interferone wichtige Mediatoren und
Schlüsselmoleküle.
Während
Interferone
zum
einen
für
die
Schädigung
des
Empfängergewebes mitverantwortlich sind, übernehmen sie zum anderen eine wichtige
Aufgabe bei der Elimination maligner Zellen.
IFNγ ist in diesem Zusammenhang von besonderem Interesse, weil es in hohem Maße von TZellen sezerniert wird. IFNγ ist ein Typ II Interferon welches physiolgischerweise von TNK-Zellen synthetisiert und freigesetzt wird. Die wichtigsten Effektormechanismen von IFNγ
sind eine Hochregulation von HLA-Klasse I Molekülen, eine Induktion der humoralen
Immunantwort, sowie Induktion weiterer Zytokine wie IL-12 und TNFα. Ersvaer et al fanden
bei AML-Patienten eine hohe Expression des IFNγ-Rezeptors und zeigten, dass T-Zellen in
Gegenwart von AML Blasten aktiviert werden und IFNγ freisetzen können. Dadurch kann die
Proliferation und Apoptoseregulation der Blasten beeinflusst werden (Ersvaer et al., 2007).
Patienten, die nach einer SZT eine GvHD entwickeln, zeigen eine vermehrte Aktivierung von
Th-1 Zellen und deutlich erhöhte IFNγ Level (Körholz et al., 1997). In verschiedenen
tierexperimentellen Versuchen konnte auch gezeigt werden, dass der GvL- Effekt durch IFNγ
vermittelt wird (Hill et al., 1999).
1.2 Immune Escape Mechanismen
Als „Immune Escape“-Mechanismen werden im Allgemeinen Abwehr-Strategien von
malignen Zellen verstanden, mit deren Hilfe sie sich der Erkennung oder Eliminierung durch
das Immunsystem entziehen. Die Charakterisierung dieser Mechanismen ist für das
Verständnis der Tumorimmunologie und die Entwicklung neuer, spezifischer Tumortherapien
von entscheidender Bedeutung. Zu den bisher definierten Mechanismen zählen eine
verminderte Antigenexpression der Tumorzelle, Veränderungen der Expression von HLA
Klasse I und II Molekülen, fehlende Kostimulation bzw. vermehrte Koinhibition, eine
7
Expression antiapoptotischer Moleküle, sowie die Sekretion immunmodulatorischer
Botenstoffe.
Abbildung 2: Bekannte Immune Escape Mechanismen
Schematische Darstellung verschiedener intra- und extrazellulärer Immune Escape Mechanismen. Dazu zählen eine Inhibition der
Apoptoseinduktion über den intrinsischen Weg durch fehlende Freisetzung von Perforin/Granzyme B durch CTL´s oder die intrazelluläre
Blockade durch Expression antiapoptotischer Moleküle wie PI-9, die Sekretion immunsuppressiver Zytokine, die Modulation des
Tumormicroenvironment durch Sekretion immunmodulatorischer Botenstoffe, eine veränderte Expression von HLA Klasse I und II
Molekülen, fehlende Kostimulation bzw. vermehrte Koinhibition.
1.2.1 Störungen der HLA-Expression
Für
die
Aktivierung
von
zytotoxischen,
CD8+
T-Lymphozyten
werden
stabile,
funktionstüchtige HLA-Klasse-I-Peptid-Komplexe benötigt, während für die Aktivierung von
CD4+ T-Lymphozyten HLA-Klasse-II-Moleküle notwendig sind. Unterbleibt diese Antigen
Präsentation, kann keine Immunantwort gegen maligne Zellen induziert werden.
HLA-defiziente Tumorzellklone können sich so der T-Zell Antwort entziehen, sind jedoch,
zumindest theoretisch, für eine NK vermittelte Lyse empfänglich. Eine gestörte
Antigenpräsentation
kann
auch
durch
intrazelluläre
Fehlsteuerungen
in
der
Antigenprozessierungsmaschinerie (APM) ausgelöst werden. Selbst bei intakter HLAExpression auf Tumorzellen werden diese bei verminderter oder fehlerhafter Peptidbeladung
der HLA-Komplexe nicht durch T-Zellen erkannt (Chang et al., 2004).
Bis zu 75% aller Tumorzelllinien weisen eine verminderte HLA Klasse I Expression im
Vergleich zu korrespondierenden nicht-malignen Zellen auf. Ein kompletter Verlust der HLA
8
Klasse I Expression konnte in bis zu 52% der Tumore nachgewiesen werden. Bereits in
prämalignen Stadien konnten Alterationen in der HLA-Expression detektiert werden, welche
häufig mit verminderter Tumor-Differenzierung, Progression und schlechter klinischer
Prognose einhergingen (Seliger and Huber, 1999).
1.2.2 Störungen der Kostimulation und Koinhibition
Um eine effektive Immunantwort zu induzieren muss neben dem Signal 1 (HLA Peptid) auch
das Signal 2 (Kostimulation) auf antigenpräsentierenden Zellen vorhanden sein. Nur durch
das Zusammenspiel dieser beiden Signale kann eine T-Zell Aktivierung und damit eine
erfolgreiche Immunantwort ausgelöst werden. Für die Kostimulation werden Moleküle wie
B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) auf den APC und deren Rezeptor, CD28, auf den Lymphozyten
benötigt. Fehlen diese oder weitere kostimulatorische Moleküle wie beispielsweise ICAM-1,
CD40 oder LFA-3 führt dies langfristig zur Anergie von T-Zellen (Seliger and Huber, 1999).
CD80 und CD86 binden an die Rezeptoren CD28 und CTLA-4. Während die Interaktion B7CD28 stimulatorische Effekte ausübt, führt die Interaktion B7-CTLA-4 zur Inhibition bzw.
Limitation der Immunantwort. B7-Moleküle werden auf allen antigenpräsentierenden Zellen,
dendritischen Zellen (DC), Makrophagen und B-Zellen exprimiert. Auf nicht-aktivierten BZellen, DC und Makrophagen wird CD86 schwach exprimiert, während eine Zellaktivierung
zu verstärkter Expression und de novo Expression von CD80 führt (Collins et al., 2005). Aus
diesem Grund können Tumorzellen auch durch fehlende Expression kostimulatorischer
Signale oder Expression von koinhibitorischen Molekülen vom Immunsystem nicht als
maligne erkannt werden. Verschiedene Studien belegten bisher eine verminderte bis fehlende
Expression von kostimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 auf AML-Blasten
(Dermime et al., 1997) (Régis T. Costello, 1998) (Vollmer et al., 2003) (Brouwer et al.,
2000b).
In den letzten Jahren wurden auch koinhibitorische Moleküle der B7-Familie identifiziert
(Greenwald et al., 2005). Das bekannteste Molekül dieser Familie ist der Koinhibitor PD-L1
(Programmed Death Receptor Ligand-1). PD-L1 führt durch Bindung an seinen Rezeptor PD1, welcher auf aktivierten T- und B-Lymphozyten exprimiert wird, zu verminderter
Proliferation und Zytokinsekretion von Effektorzellen und fehlender Aktivierung von naiven
T-Zellen (Freeman et al., 2000) (Brown et al., 2003). Dieser inhibitorische Effekt wurde
sowohl für CD4+ als auch für CD8+ T-Zellen gezeigt (Carreno and Collins, 2002). Die
Blockade von PD-L1 auf Tumoren führt im Tiermodell zu einer effektiven Tumorabstoßung
(Strome et al., 2003), (He et al., 2005), (Iwai et al., 2005), so dass die Expression von PD-L1
9
auf Tumorzellen als ein weiterer Immune Escape Mechanismus diskutiert wird. Obwohl viele
Studien einen hemmenden Einfluss von PD-L1 auf die T-Zell Aktivität zeigen, gibt es
Hinweise, dass PD-L1 auch stimulatorisch auf T-Zellen wirken könnte (Keir et al., 2007).
Möglicherweise wird über PD-L1 auf T-Zell Subpopulationen die Freisetzung des
inhibitorischen Zytokins IL-10 induziert, was zu einer T-Zell Anergie führt (Dong and Chen,
2003).
PD-L1 wurde auf T- und B- Zellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, Endothel-, Epithelund Gliazellen, sowie auf Herzmuskelzellen, Keratinozyten und der Feto-maternalen Barriere
nachgewiesen (Blank et al., 2005). PD-L1 wird interessanterweise auf einer Reihe von
Tumoren, darunter Larynx-, Lungen-, Magen-, Kolon-, Brust-, Zervix-, Ovarial-, Blasen-,
Leber- und Nierenzellkarzinomen, Gliomen und Melanomen exprimiert. In vitro Experimente
haben gezeigt, dass PD-L1 auf Tumorzelllinien, Monozyten, Keratinozyten und dendritische
Zellen (DC) durch IFNγ induziert wird (Dong and Chen, 2003, Dong et al., 2002). Die
häufige Expression von PD-L1 steht im Kontrast zu den kostimulatorischen Molekülen, CD80
und CD86, welche auf Tumoren selten nachgewiesen wurden. Eine weitere wichtige Funktion
der PD-L1/PD-1 Interaktion ist die Regulation der peripheren Toleranz. Gestützt wird diese
These durch die Tatsache, dass in PD-1 defizienten Mäusen gehäuft Autoimmunkrankheiten
zu beobachten sind (Blank and Mackensen, 2007).
Die Expression von PD-L1 auf AML-Blasten könnte eine Erklärung für die geringe
Effektivität von leukämiespezifischen CTL bei AML-Patienten sein. Bisher konnte jedoch bei
AML Blasten keine konstitutive PD-L1 Expression nachgewiesen werden (Tamura et al.,
2005).
1.2.3 Störungen der Apoptose
Apoptose ist als programmierter, physiologischer Zelltod definiert. Apoptose kann
grundsätzlich über zwei wichtige Mechanismen induziert werden. Der extrinsische Signalweg
wird über die Aktivierung von auf der Zelloberfläche exprimierten Todesrezeptoren und
nachfolgender intrazellulärer Caspaseaktivierung ausgelöst. Caspasen sind wichtige
intrazelluläre Effektormoleküle, die in inaktiver Form gespeichert werden und nach
Aktivierung eine Caspasekaskade auslösen. Wird durch Freisetzung von Perforin und
Granzyme B aus CTL die Zellmembran „löchrig“, kann der intrinsische Signalweg durch
Freisetzung
von
Cytochrom
C
aus
dem
Mitochondrium
aktiviert
werden.
Die
Apoptoseinduktion stellt einen energieabhängigen, aktiven und irreversiblen Mechanismus
dar.
10
Abbildung 3: Apoptose induzierende Mechanismen
Schematische Darstellung der extrinsischen (Fas/FasL) und intrinsischen (GranzymeB/Perforin) Apoptoseinduktion. Rote Pfeile
symbolisieren die Caspasen-Kaskade, schwarze Pfeile stellen die durch inhibitorische Moleküle wie Mcl-1, c-FLIP und PI-9 induzierte
Hemmung der Apoptose dar. Dabei hemmt Mcl-1 die Cytochrom C Freisetzung aus dem Mitochondrium, PI-9 die Aktivierung der proapoptotischen Moleküle Pro-Casp3 und bid und c-FLIP die Aktivierung der Caspasenkaskade indem es, strukturell der Caspase 8 ähnlich
aber mit fehlender enzymatischer Aktivität in den DISC Komplex eingebaut wird.
Apoptose dient nicht nur dem eigentlichen Zelluntergang, sondern wirkt im Immunsystem als
wichtiger Regulationsmechanismus. Störungen dieser fein regulierten Balance können zu
Erkrankungen führen, wobei bei malignen Erkrankungen häufig eine verminderte
Apoptoserate, jedoch z.B. bei neurodegenerativen Erkrankungen vermehrte Apoptoseraten
beschrieben wurden.
Oberflächenmoleküle wie der Fas Ligand (FasL), Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), Tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) und das in lysosomalen Granula
enthaltene Granzyme B und Perforin sind Rezeptoren, bzw. intrazelluläre Moleküle, mit
denen Immuneffektorzellen, wie CTL und NK-Zellen, entartete Zellen eliminieren (Classen et
al., 2003).
1.2.3.1 Extrinsische Apoptoseinduktion über das Fas/FasL System und
deren Inhibition durch FLIP
Der Fas Rezeptor (CD95, bzw. Apo-1) ist ein Typ-I-Transmembranprotein, 45kD groß und
Mitglied der TNF-Superfamilie. Lokalisiert auf der Zellmembran löst er mit der Bindung an
seinen Liganden FasL Apoptose aus. FasL ist ein TypII Protein, welches ebenfalls zur TNFSuperfamilie gehört. Eine FasL Expression wurde bisher nicht nur in hämatopoetischen
11
Zellen, sondern auch in immunprivilegierten Zellen und vielen Malignomen nachgewiesen
(Seliger and Huber, 1999).
Die Interaktion von Fas/FasL ist ein fein regulierter, immunologisch bedeutender Prozess.
Physiologischerweise ist das Fas/FasL System wichtig für die Entwicklung und Reifung der
zellulären Immunität, der Homöostase peripherer T- und B-Zellen und die Regulation der
Immunantwort. Pathologisch ist dieser Mechanismus auch an der Entstehung von
Autoimmunkrankheiten oder einer GvHD nach allogener Stammzelltransplantation beteiligt.
Eine Expression von CD95 konnte auf Thymozyten, Monozyten, aktivierten NK-Zellen, Bund T-Lymphozyten, sowie Hepatozyten, Pankreas-, Herz- und Nierenzellen nachgewiesen
werden (Seliger and Huber, 1999). In vitro können anti-Fas-Antikörper die Wirkung von FasL
imitieren und bei Bindung an den Fas Rezeptor Apoptose auslösen. Durch die Bindung von
FasL an Fas auf der Zelloberfläche wird eine Reihe von Apoptose induzierenden Schritten
ausgelöst. Zunächst erfolgt eine Trimerisierung des Fas Rezeptors, was intrazellulär zur
Annäherung der aktiven Zentren, und dadurch zur Anlagerung des Adaptermoleküls FADD
(Fas-associated death-domain) führt. FADD bildet durch Interaktion mit dem Fas Rezeptor
auf der einen und der Pro-Caspase-8 auf der anderen Seite über so genannte
Todeseffektordomänen den DISC (Death-inducing signaling complex). Durch die
unmittelbare Zusammenlagerung der Pro-Caspase-8 Moleküle reicht deren intrinsische
Aktivität aus, um sich autokatalytisch zu aktivieren (Hengartner, 2000). Durch Aktivierung
von Caspase-8 wird die Caspasenkaskade in Gang gesetzt und damit die endgültigen
apoptotischen Schritte eingeleitet. Die Fas induzierte Apoptose kann durch verschiedene
antiapoptotische Proteine, wie z.B. c-FLIP (FLICE (Fas-associated death-domain-like IL1beta-converting enzyme)-inhibitory protein) oder Proteine der bcl-2 Familie inhibiert
werden. C-FLIP kann, strukturell der Caspase-8 ähnlich, in den DISC-Komplex eingebaut
werden und führt aufgrund der fehlenden enzymatischen Aktivität zum Abbruch des
Apoptose induzierdenden Signalweges (Scaffidi et al., 1999). c-FLIP wurde in verschiedenen
Tumorentitäten, wie Melanomen (Medema et al., 1999), Kolon- (Longley et al., 2006) und
Zervix-Karzinomen, sowie in CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (Kim et al., 2002) und
Hodgkin-Lymphomen (Mathas et al., 2004) nachgewiesen.
1.2.3.2 Intrinsische Apoptoseinduktion über das Granzyme B/Perforin
System und deren Inhibition durch PI-9 und Mcl-1
Die über Granzyme B/Perforin induzierte Apoptose ist der Hauptmechanismus für die
Elimination von virus-infizierten Zellen, intrazellulären Pathogenen und Tumorzellen durch
12
CTL und NK-Zellen. Granzyme B ist eine Serin-Protease, welche die Caspasen-3 und -8, BID
(ein anti-apoptotisches Regulatormolekül der bcl-2 Familie) und den DNAse-Komplex
aktivieren kann. Diese Schritte münden in der Cytochrom C-Freisetzung aus dem
Mitochondrium.
Auch bei der Entwicklung der GvHD ist das Fas/FasL und GrB/Perforin System maßgeblich
beteiligt. Um sich vor der Elimination durch das Immunsystem zu schützen können
Tumorzellen sich der GrB/Perforin vermittelten Apoptose entziehen, indem sie Moleküle
exprimieren, die GrB oder Perforin inhibieren. Der einzige bisher identifizierte Inhibitor für
GrB ist PI-9, ein 42kd schweres Protein, welches mit GrB einen irreversiblen Komplex bildet
und damit die Wirkungen von GrB inhibiert. PI-9 exprimierende Zellen sind zwar gegen
GrB/Perforin, also gegen die intrinsische Apoptose geschützt, nicht aber gegen den über
Todesrezeptoren vermittelten Zelltod. Classen et al. zeigten, dass eine Überexpression von
SPI6, dem Maushomolog von PI-9, in Lymphomzellen zur Resistenz gegenüber einer CTL
vermittelten Zelllyse führt (Classen et al., 2004).
PI-9 wurde bisher in vielen Geweben nachgewiesen, so auch im Zytosol und im Zellkern von
CTL, wo PI-9 die Zellen vor einer Autolyse durch freigesetztes GrB schützt, weiterhin in NKund APC-Zellen (Bladergroen et al., 2001). Die Expression von PI-9 kann durch verschiedene
Transmitter induziert werden. PI-9 wird unter anderem durch Östrogene, aber auch
Glukokortikoide und proinflammatorische Moleküle wie IL-1ß und TNFα sowie LPS
induziert (Kanamori et al., 2000) (Kannan-Thulasiraman and Shapiro, 2002). Barrie et al.
zeigten erstmals, dass auch antivirale Zytokine wie IFNγ und IFNα die Expression von PI-9 in
humanen Hepatozyten induzieren können. Kein Nachweis einer PI-9 Expression gelang
bisher in Melanozyten, Mamma-, bzw. Zervix-Epithel und im Kolon (Medema et al., 2001).
Die Expression von PI-9 in menschlichen Tumoren wird seit einiger Zeit als möglicher
Immune Escape Mechanismus diskutiert, nachdem eine PI-9 Expression in humanen
Mamma- und Kolon-Karzinomen, sowie in Lymphomen (NHL+HL) (Bladergroen et al.,
2002) und ALL nachgewiesen werden konnte (Classen et al., 2004).
Ein weiterer Inhibitor auf mitochondrialer Ebene ist das antiapoptotische Molekül Mcl-1.
Mcl-1 kann zusammen mit Bak, einem pro-apototischen Mitglied der Bcl-2 Familie,
Heterodimere bilden, wodurch eine Aktivierung von Bak und damit die Bildung von Poren in
der äußeren Mitochondrien-Membran, sowie die folgende Cytochrom C Freisetzung
unterbunden wird (Minet et al., 2006).
Die Expression von Mcl-1 wird über Survival– und Differenzierungssignale wie Zytokine und
Wachstumsfaktoren reguliert. Die Steuerung der Expression von Mcl-1 erfolgt auf
13
verschiedenen Wegen, so konnte eine Beteiligung der Interleukine IL-3, IL-5, IL-6 und IL-7
nachgewiesen werden, ebenso von GM-CSF, VEGF, EGF und IFNα. Die genaue Regulation
dieser Signalwege ist noch unbekannt (Yang-Yen, 2006). Mcl-1 konnte in vielen
Tumorzelllinien und Tumorentitäten nachgewiesen werden, so z.B. in B-Zell Non-HodgkinLymphomen (B-NHL) (Zuo et al., 2006), dem hepatozellulären Karzinom, ALL, CLL und
AML (Fleischer et al., 2006). Dies legt den Verdacht nahe, dass auch die Überexpression von
Mcl-1 von Tumorzellen als Immune Escape Mechanismus genutzt wird, um den intrinsischen
Apoptoseweg zu inhibieren.
1.2.4 Sekretion immunmodulatorischer Zytokine
Die Umgebung eines Tumors, das Tumor Microenvironment, ist essentiell für die
Proliferation, Angiogenese, Invasion und Metastasierungsfähigkeit eines malignen Zellklons.
In der direkten Nachbarschaft schaffen sich Tumore durch die Sekretion von
Überlebenssignalen,
Wachstumsfaktoren,
pro-angiogenetischen
Faktoren
und
Adähsionsmolekülen optimale Lebensbedingungen (Kusmartsev and Gabrilovich, 2006).
Der Einfluss von Zytokinen auf das Tumor Microenvironment und die Entwicklung von
Tumorzellen wurde intensiv untersucht. Bekannt ist mittlerweile, dass sich Tumorzellen die
Eigenschaften körpereigener, den Immunprozess regulierender Zytokine und Botenstoffe
zunutze machen können. Über eine Sekretion von immunsuppressiven Molekülen wie IL-10,
VEGF (vascular endothelium growth factor) und TGF-ß (transforming growth facotr-ß)
supprimieren Tumorzellen die Immunantwort. IL-10 induziert eine T-Zell Anergie und
verhindert so eine effektive Antigenpräsentation an CTL (Steinbrink et al., 1999) ebenso wie
die Sekretion von IL-2 (Taga & Tosato, 1992). Auch die Apoptoseregulation wird von
Zytokinen wie Interferon beeinflusst (Chawla-Sarkar et al., 2003).
IL-1ß ist eine Isoform des Zytokin Interkeukin-1 (IL-1) und ist and der Regulierung
inflammatorischer Prozesse und der Apoptose beteiligt. Wenig bekannt ist bisher über die
endogene Expression von IL-1ß in Leukämieblasten. IL-6 gehört zur Gruppe der so
genannten „Akut-Phase-Proteine“, welche als unmittelbare Reaktion des Körpers auf
entzündliche, traumatische oder auch maligne Vorgänge freigesetzt werden. IL-6 spielt bei
der interzellulären Kommunikation eine wichtige Rolle und ist am Wachstum und der
Differenzierung von Zellen beteiligt. Als Stimulus für die IL-6 Produktion wirken vor allem
IL-1 und TNF-ß. IL-6 wirkt als Differenzierungs- und Wachstumsfaktor, vor allem auf
hämatopoetische Vorläuferzellen, B- und T-Zellen, sowie auf weitere gewebeständige Zellen
des Körpers.
14
IL-8 wird von Endothelzellen, Monozyten und Fibroblasten produziert, vor allem durch
Stimulation mit IL-1 oder TNF-α. Es wirkt vor allem auf Granulozyten und induziert dort
Chemotaxis sowie eine Stimulation der Expression von Adhäsionsmolekülen. Durch
angiogenetische Eigenschaften scheint IL-8 auch eine wichtige Rolle bei der Ausdehnung und
Metastasierung von Tumoren und der AML zu spielen. (Xie, 2001) (de Bont et al., 2001).
TNF-α ist an nahezu allen entzündlichen Vorgängen im Körper beteiligt und stimuliert vor
allem die Bildung weiterer Akut-Phase Proteine. TNF-α hat viele Effektorfunktionen, unter
anderem die Apoptoseinduktion, die Stimulation der Zellproliferation und Zelldifferenzierung
und wirkt of synergistisch mit IL-1 und IL-6. TNF-α wird überwiegend durch Makrophagen
freigesetzt, aber auch durch Lymphozyten, Mastzellen, Endothelzellen und Fibroblasten.
Interleukin 10 blockiert die Zytokinsekretion von TH1- sowie NK-Zellen, die Induktion von
T-Zellanergie, die Suppression der von Monozyten abhängigen T-Zellproliferation sowie die
Inhibition von HLA Klasse I- und II Oberflächenexpression durch spezifische Blockierung
von Komponenten der Antigen- Prozessierung (Seliger and Huber, 1999). Hauptaufgabe ist
die Terminierung immunologischer Prozesse, indem die Freisetzung inflammatorischer
Mediatoren wie IL-2 und IFNγ unterdrückt wird. Zielzellen für IL-10 sind hauptsächlich die
Effektorzellen des Immunsystems, Lymphozyten und Antigenpräsentierende Zellen. IL-10
wird hauptsächlich von Makrophagen freigesetzt, stimuliert durch Endotoxin, TNF-α und
Katecholaminen.
1.3 Zielsetzung
Obwohl in den letzten Jahren in der Therapie der AML große Fortschritte erzielt wurden, sind
die Ursachen für die hohen Rezidivraten nach allogener SZT im Vergleich zur CML
weiterhin nicht vollständig aufgeklärt. Als Ursache werden Immune Escape Mechanismen
von Leukämiezellen diskutiert, mit deren Hilfe sie sich vor der Elimination durch das
Immunsystem schützen. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, mögliche Immune Escape
Mechanismen bei der AML in ihren Grundzügen zu charakterisieren.
Nach einer allogenen SZT spielen Zytokine bei der Entwicklung einer GvHD, bzw. des GvLEffektes eine zentrale Rolle. Besonders IFNγ ist ein Schlüsselmolekül des initialen
Zytokinsturms und bei der Entwicklung einer GvHD. AML Blasten wurden nach Isolation
mit IFNγ stimuliert und die Hochregulierung von koinhibitorischen Molekülen wie PD-L1,
eine verminderte Expression von kostimulatorischen Molekülen, veränderte intrazelluläre
Expression antiapoptotischer Moleküle oder eine veränderte Zytokin-Sekretion untersucht.
15
Eine
Immunphänotypisierung
der
AML-Blasten
sollte
Aufschluss
über
die
Oberflächenexpression von HLA Klasse I und II Molekülen, dem Fas-Rezeptor CD95, den
kostimulatorischen Molekülen CD80 und CD86, sowie dem koinhibitorischen Molekül PDL1 geben.
Die Entwicklung von Apoptoseresistenz spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung
und Progression. Deshalb sollte die Resistenz der AML-Blasten gegenüber Fas/Fas Ligand
vermittelter Apoptose sowie gegenüber einer GrB/Perforin vermittelten Apoptoseinduktion
untersucht werden. Die Fas/FasL vermittelte Apoptose wurde in einem funktionellen Ansatz
mit einem agonistischen anti-Fas-Antikörper überprüft. Als möglicher Resistenzmechanismus
gegenüber der GrB/Perforin induzierten Apoptose sollte die intrazelluläre Expression von PI9, dem einzigen natürlichen Inhibitor für Granzyme B, bei AML-Blasten mittels Western Blot
nachgewiesen werden. Die Expression von PI-9 wurde bisher bei leukämischen Zellen nicht
beschrieben. Zusätzlich sollte die Expression weiterer antiapoptotischer Moleküle wie
FLIPS/L, einem Inhibitor der Fas/FasL vermittelten Apoptose und Mcl-1, einem
antiapoptotischen Molekül der bcl-2 Familie, untersucht werden.
16
2 Patienten, Material und Methoden
2.1 Patientenkollektiv
Die untersuchten Leukämieblasten stammen aus dem Knochenmark bzw. dem peripheren
Blut von AML Patienten. Die Proben wurden nach Erteilung eines positiven Ethikvotum (Nr.
05/097 „Leukämiezellbank“) entweder bei Erstdiagnose, einem Rezidiv nach Chemotherapie,
bzw. einem Rezidiv nach allogener Stammzelltransplantation gewonnen. Die Klassifikation
der Blasten erfolgte nach der FAB-Einteilung. Untersucht und ausgewertet wurden Proben
von 21 Patienten im Alter zwischen 18 und 74 Jahren (Durchschnitt 51,5 Jahre), davon waren
11 Patienten männlich, 10 Patienten weiblich. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff
gelagert und unmittelbar vor der Aufarbeitung aufgetaut. Bei 2 Patienten konnte
Probematerial zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden: P8 konnte im 1. Rezidiv und
im Rezidiv nach allo-SZT untersucht werden, P4 zum Zeitpunkt des ersten, zweiten und
dritten Rezidivs.
Die im folgenden Teil evaluierten Parameter konnten nicht durchgehend bei allen 21
eingeschlossen Patienten bestimmt werden. Die Gründe hierfür lagen meist in der zu geringen
Anzahl vitaler Zellen im aufgearbeiteten Präparat. Prozentuale Angaben beziehen sich daher
stets auf die tatsächlich untersuchte Patientenanzahl.
MDS
M4
M2
M4
M0
M1
M2
M4
M2
M5a
n.d.
M4
M4eo
M2
M2
M5
M1
M2
M4
n.d.
M5
1
2
3
4a-c
5
6
7
8a,b
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
05/01
10/04
04/01
01/01
01/01
11/00
10/00
09/00
08/00
08/00
n.d.
07/00
03/00
05/99
01/00
12/99
03/98
07/98
01/99
01/99
01/98
ED
ED
R
ED
ED
ED
ED
ED
ED
ED
ED
n.d.
ED
ED
R
ED
ED
R
R
R
R
R
Status
m
m
De
novo
De
novo
m
De
novo
m
m
w
w
De
novo
De
novo
Sek
Sek
w
De
novo
m
m
m
w
m
m
de
novo
sek
De
novo
De
novo
De
novo
w
w
sek
n.d.
w
w
w
w
De
novo
sek
De
novo
De
novo
m
sek
Sex
74 J.
n.d.
18 J.
61 J.
70 J.
59 J
61 J.
52 J.
20 J.
74 J.
56 J.
54 J.
58 J.
20 J.
66 J.
42 J.
31 J.
36 J.
49 J.
59 J.
53 J.
Alter
Tabelle 2: Patientencharakteristik
AML
(FAB)
Patient
(Px)
30-40%
n.d.
90%
60%
95%
n.d.
35%
n.d.
90%
40%
n.d.
80%
90%
69%
90%
93 %
90%
84%
40%
80%
84%
%Blasten
410
n.d.
n.d.
Norm
569
245
n.d.
1216
329
1254
n.d.
523
891
936
600
417
477
4,81
1236
439
271
LDH
U/l
intital
7,1
n.d.
n.d.
2,16
255
37
n.d.
158,4
6,54
129,4
n.d.
n.d.
21
63
51,3
35,4
85,7
262
123
72,5
5,3
Leukos/nl
initial
46,XY
Komplexe Aberrationen
Komplexe Aberrationen
46,XY, t(12;16)
46,XX
46 XX, t (4;17)
46,XY
46,XY
Inv 16, CBFß-MYH11-Fusionstranskript,
Trisomie 22
46,XX
n.d.
46XY, t(10;11), t(11;11), MLLRearrangement
komplexer Karyotyp, v. a MDS
t (11;17)
46, XX
Trisomie 11
46,XX,t(1;2),t(1;9)
46XY, Inv 16(p13;q22),t(1;1)(q24;q44),
CBFß-MyH11-Fusionstranskript
46,XY
Actos/AraC
Litalir
TAD/HAM
TAD/HAM+G-CSF
S-HAI+Fludarabin
HAM/HAM
TAD/HAM
Actos/Vioxx/AraC,
HAM/HAM+G-CSF
TAD/HAM
S-HAI
AraC/MTX
n.d.
TAD/HAM
Cytarabin+Actos+Vioxx
HAM/HAM+G-CSF
S-HAI
n.d.
Tumorlysesyndrom
nein
nein
09/01
Nein
CR:03/01
1.R: 12/03
CR: 03/04
n.d.
Nein
nein
nein
12/02
12/02
Nein
n.d.
10/01
06/00
07/01
03/00
nein
04/00
n.d.
11/99
08/00
12/99
n.d.
05/98
04/99
08/99
Allo
SZT
CR: 03/01
1. R: 09/01
CR:01/01
CR:02/00
1.R: 02/01
CR: 06/99
1.R: 01/00
2.R: 05/00
CR: 10/00
1.R: 06/01
2.R: 04/02
CR:09/00
1.R: 07/01
2.R: 03/02
n.d.
CR:09/00
1.R: 11/00
CR: 09/00
1:R: 10/02
CR: 10/00
CR: 11/00
nein
HAM/HAM+G-CSF
HAM/AraC
HAM/HAM
HAI
AMSA/AraC
HAM/HAM
AraC
CR: 01/00
CR: 08/98
1.R: 06/99
2.R: 07/00
3.R: n.d.
1. Rezidiv 10/99
CR: 03/99
1.R: 06/99
1.R: 11/98
2.R. 02/99
3.R: 07/99
CR
1.R: 08/99
Ansprechen
TAD/HAM
TAD/HAM
Topotecan/AraC
AMSA/AraC
ICE/ICE
AMSA/AraC
HAI
Vakzinierung
HAI
TAD/HAM/TAD
TAD/HAM
46,XY, del(2) (p), -5,+6, -7, +8, +8,
der(9), t(5;9), der(10), -12, -14, 16q+,
17p+, +17p+ [24]/46,XY(1)
46,XX
Therapie
Zytogenetik
17
03/04: Einleitung
Erhaltungstherapie
08/05: 2 R. palliative
Chemo
Planung der Allo-KMT für
09/01
Exitus letalis: 06/01
Exitus letalis: 10/04
Exitus letalis: 10/01
Lungeninfiltration
07/05 CR
01/01 Einleitung
Erhaltungstherapie
Exitus letalis 11/00
02/01 - 11/04:CR
03/01-03/04: AMLErhaltungstherapie
(Abschluss 3/04 bei CR)
Exitus letalis: 02/01
n.d.
Exitus letalis 04/02
Exitus letalis: 07/02
Exitus letalis 06/00
Exitus letalis: 03/01
CR. 03/03
Exitus letalis 11/99
Exitus letalis
Exitus letalis 03/00
Exitus letalis 09/99
Exitus letalis: 09/99
Verlauf
18
Legende Patientencharakteristik: Nr: fortlaufende Nummerierung der eingeschlossenen Patientenproben, AML
(FAB): Einteilung der Leukämie nach FAB-Klassifikation. ED: Zeitpunkt der Erstdiagnose (ED). Status: Material
bei Erstdiagnose (ED) oder im Rezidiv (R) der Erkrankung. De novo: primäre Leukämie, sek: sekundäre
Leukämie als Folge z.B: eines MDS. Sex: Geschlecht, m=männlich, w=weiblich. Alter: Alter bei
Diagnosestellung. % Blasten: Anteil Leukämieblasten in der aufgearbeiteten Patientenprobe. LDH U/l initial:
Höhe der LDH bei Erstdiagnose. Leukos/nl initial: Höhe der Leukozyten bei Erstdiagnose, bzw im Rezidiv.
Zytogenetik: Nachweis zytogenetischer Veränderungen von Blasten der AML-Patienten. Therapie:
Chemotherapieschema. Ansprechen: Ansprechen auf Chemotherapie, R= Rezidiv, CR=komplette Remission.
Allo-SZT: allogene Stammzelltransplantation, Zeitpunkt. Verlauf: klinischer Verlauf des Patienten. N.d.:not done,
bzw. keine Werte vorliegend.
2.2 Kontrollzellen:
2.2.1 Monozyten
Die als Kontrollzellen eingesetzten Monozyten (MNC) wurden von gesunden Spendern durch
Leukapherese gewonnen. Bei der Anreicherung der Zellen aus dem Spenderblut wurde das
Prinzip der Gegenstrom-Zentrifugation eingesetzt. Dabei wurde das Blut zunächst in eine
erythrozytenreiche Fraktion, die dem Spender zurückgegeben wurde, sowie eine
erythrozytenarme Fraktion aufgetrennt, aus welcher anschließend die MNC gewonnen
wurden.
Bei der Gegenstrom-Zentrifugation werden die MNC in eine Spezialkammer geleitet und dort
gemäß ihrer Größe und Dichte aufgetrennt und gesammelt. Die eigentliche Trennung der
verschiedenen Populationen erfolgte durch Erhöhung der Durchflussrate in der Kammer bei
gleich bleibender Umdrehungszahl der Zentrifuge von 2500 UPM. Die Monozytenfraktion
konnte bei 111ml/Minute gewonnen werden. Die Reinheit der Monozytenpopulation wurde
anhand der Expression von CD14 durchflusszytometrisch bestimmt.
2.2.2 G-CSF stimulierte periphere Blutstammzellen
Das Ausgangsmaterial für die Isolation der peripheren Blutstammzellen (PBSC) waren
Blutprodukte, welche bei der Verarbeitung von zitrathaltigen Vollblutspenden zu
Plasmakonzentraten anfallen und stammten von gesunden Spendern, die über 4-6 Tage mit GCSF (Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) behandelt wurden.
Der Einsatz von rekombinantem G-CSF ist ein gängiges und nebenwirkungsarmes Verfahren,
um Stammzellen aus dem Knochenmark in die Peripherie auszuschwemmen, um so die für
eine Stammzelltransplantation nötigen gesunden Stammzellen aus dem Blut zu gewinnen.
Das Spenderblut wurde in einem 50ml Röhrchen (Corning) 1:2 mit PBS (Gibco) verdünnt,
resuspendiert und davon max. 30ml vorsichtig in die mit 20ml Ficoll-Lösung (Ficoll
separating solution, Biochrom) bestückten Röhrchen geschichtet. Die Auftrennung der Zellen
19
erfolgte während der Zentrifugation (Megafuge 3.0.R, Heraeus) für 30Minuten, bei 1900rpm,
18°C ohne Abbremsen der Zentrifuge. Dadurch bildet sich über der Ficoll Schicht die so
genannte Interphase, in der sich Zellen geringerer Dichte sammeln, während die Erythrozyten
und Granulozyten ein Zellpellet am Röhrchenboden bilden. Die in der Interphase enthaltenen
PBSC konnten so leicht mit einer dünnen Pipette abgesammelt werden, wurden in ein 50ml
Röhrchen überführt, und anschließend drei mal in PBS bei 1800rpm, 10Minuten, 4°C
gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblaufärbung gezählt und je nach weiterer
Verwendung sofort verarbeitet oder bei -80°C tiefgefroren.
2.2.3 Zelllinien:
2.2.3.1 Jurkat T-Zellen
Die Jurkat-Zelllinie wurde aus einem humanen T-Zelllymphom generiert und von der
Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) erworben.
Die Zelllinie wurde Medium kultiviert, und alle drei bis vier Tage im Verhältnis 1:5 geteilt
und mit neuem Medium versetzt.
2.2.3.2 YT-Zelllinie
Die NK-Zelllinie stammt aus einer humanen akuten lymphatischen Leukämie (ALL) und
wurde uns freundlicherweise, ebenso wie die unten aufgeführte K562-Linie, von der
Arbeitsgruppe Prof. Multhoff, Universität Regensburg, überlassen.
Nachgewiesenermaßen produziert die YT-Zelllinie große Mengen des zytolytischen Moleküls
Granzyme B, ist jedoch nicht in der Lage dieses auszuschleusen. Um sich selbst vor
Granzyme B vermittelter Zelllyse zu schützen exprimieren YT-Zellen den physiologischen
GrB-Inhibitor, Proteinase-Inhibitor9 (PI-9) (Bladergroen et al., 2001). Eingesetzt wurde die
Zelllinie als Positivkontrolle für den Nachweis von intrazellulärem PI-9 im Western BlotVerfahren.
2.2.3.3 K562 Zellen
Die aus einer humanen Chronisch Myeloischen Leukämie (CML) in Blastenkrise stammende
Zelllinie K562 wurde ebenfalls in RPMI B Medium kultiviert und als Kontrolle im Western
Blot eingesetzt. Zellen wurden als Kontrollzellen im funktionellen Apoptoseansatz und in
Form spezieller Lysate im Western Blot Verfahren eingesetzt.
20
2.2.3.4 U937 Zellen
Die Zelllinie U937 wurde aus einem humanen histiozytischen Lymphom generiert und hat
Monozyten ähnliche Eigenschaften. Die Zellen wurden in RPMI B Medium etwa alle zwei bis
drei Tage im Verhältnis von 1:2 bis 1:5 je nach Bedarf geteilt. U937 Zellen wurden als
Kontrollzellen im funktionellen Apoptoseansatz und in Form spezieller Lysate im Western
Blot Verfahren eingesetzt.
2.2.3.5 Kg1a Zellen
Die Zelllinie Kg1a wurde aus Zellen der akuten myeloischen Leukämie gewonnen. Die Zellen
wurden in RPMI B Medium etwa alle zwei bis drei Tage im Verhältnis von 1:2 bis 1:5 je nach
Bedarf geteilt. U937 Zellen wurden als Kontrollzellen im funktionellen Apoptoseansatz und
in Form spezieller Lysate im Western Blot Verfahren eingesetzt.
2.3 Methoden:
2.3.1 Grundlegende Techniken
Alle Arbeiten mit Leukämieblasten und Zelllinien wurden unter sterilen Bedingungen an der
Zellbank (CleanAir, Biohazard) durchgeführt.
2.3.1.1 Kultivierung von Zellen
Alle Zelllinien und primäres Patientenmaterial wurden in einem Zellkulturschrank (BBD
6220, Heraeus) bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%, einem CO2 Gehalt von 5% und
einer Temperatur von 37°C kultiviert. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen (Costar 75cm2,
bzw. 162cm2, Corning) und RPMI-A/B Medium inkubiert.
2.3.1.2 Zentrifugation von Zellen
Die Zentrifugation der primären Blasten und der Zelllinien erfolgte bei 1000 rpm (rounds per
minute), bzw 1400 rpm, 4°C für 7 Minuten. (Megafuge 3.OR, bzw. Tischzentrifuge Biofuge
fresco, Heraeus). Abweichungen davon werden in den jeweiligen Methoden angegeben.
2.3.1.3 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau-Ausschlussfärbung
Die Trypanblaufärbung wurde zur Ermittlung der Zellzahl, sowie als Vitalitätsnachweis der
aufgetauten Blasten eingesetzt.
21
Von der aufgetauten Zellsuspension wurden 50 µl entnommen, 1:1 mit Trypanblau vermischt,
davon eine Verdünnungsreihe erstellt und die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer mit Hilfe
eines Mikroskops (Axiolab, ZEISS) ausgezählt. Ausgezählt wurden zwei, bzw. vier
Kammern, wobei nur die vitalen Zellen erfasst wurden. Die Unterscheidung zwischen
lebenden und toten Zellen wird durch die unterschiedliche Trypanblau-Anreicherung in der
Zellmembran ermöglicht. Nur die geschädigte Membran abgestorbener Zellen lagert
Trypanblau ein und erscheint dadurch im Mikroskop bläulich gefärbt.
Berechnet wurde die Zellzahl nach folgender Formel:
Zellzahl
Zahl der ausgezählten Quadrate
×Verdünnungsfaktor×0,01=Zellzahl/ml
Mit Hilfe dieser Methode konnte nach dem Auftauen durchgehend die Vitalität der Zellen
gewährleistet werden.
2.3.2 Aufarbeitung der AML-Blasten
Die Aufarbeitung der Proben folgte stets einem gleichen Schema, wobei die einzelnen
Methoden im Folgenden erläutert werden:
Die Proben wurden über 10 Minuten durch Zugabe von Blastenmedium nach einem
schonenden Protokoll aufgetaut und zum Zeitpunkt t0 phänotypisch charakterisiert. Als erstes
wurden die Proben durchflusszytometrisch auf die Expression der frühen myeloischen Marker
CD33 und CD34, sowie CD45 hin untersucht. Daraus wurde die Blastenkonzentration der
Probe bestimmt.
CD34+ Blasten wurden mit Hilfe des MACS-Systems (magnetic cell sorting) aufgereinigt,
CD33+/CD34- Blasten wurden aufgrund der eigenen, unbefriedigenden Ergebnisse der CD33+
Selektion nicht aufgereinigt. CD33+/CD34- Blasten wurden mit einer Reinheit zwischen 4890% in den Versuchen eingesetzt. Während in den durchflusszytometrischen Auswertungen
die Blasten klar von eventuell verunreinigenden Populationen wie Lymphozyten oder
Monozyten abgegrenzt werden konnten (Béné, 2005), wurde im Apoptoseansatz, sowie im
Western Blot eine mögliche Verunreinigung bei der Auswertung der Ergebnisse
berücksichtigt.
22
Abbildung 4: Aufarbeitung der AML Blasten
Die primären AML-Blasten wurden nach einem schonenden Verfahren über 10 Minuten aufgetaut und in Medium überführt. Sofort nach
dem Auftauen wurde eine phänotypische Analyse (Zeitpunkt t0) hinsichtlich der Oberflächenmoleküle HLA-ABC, HLA-DR, PD-L1, CD95,
CD80 und CD86 durchgeführt. Ebenso wurde über die Expression der frühen myeloischen Marker CD33/CD34 und CD45 der Blastengehalt
der aufgetauten Probe bestimmt. CD34 positive Zellen wurden anschließend mit Hilfe des MACS-System selektioniert. Die Kontrolle der
Aufreinigung erfolgte über eine erneute phänotypische Analyse mit den Markern CD34/CD45, sowie dem Isotyp. Anschließend wurden die
aufgereinigten Blasten in einem 24 Stunden Ansatz mit -/+ IFNγ (200 U/ml), bzw. einem über den Fas-Rezeptor Apoptose induzierenden,
agonistischen Antikörper (2ug/ul) inkubiert (-/+ CH11), als Kontrollen wurden jeweils Blasten in normalem Medium inkubiert. Nach der
Aufreinigung wurden die Western Blot Lysate (t0) gewonnen. Nach 24 stündiger Inkubation im Brutschrank wurden die Blasten wurden
zunächst die Überstände des IFNγ-Ansatzes, für spätere Zytonkinbestimmungen, geernet und bei -80°C bis zur Verarbeitung gelagert. Dann
wurden die Zellen gewaschen, ein Teil der Zellen für die FACS-Analyse nach dem Panel von t0, der andere Teil für die Western Blot Lysate
verwendet. Blasten aus dem Apoptoseansatz wurden sofort eisgekühlt, um die apoptotischen Prozesse gleichzeitig zu stoppen. Anschließend
wurden die Zellen mit Annexin V-FITC und PI gefärbt und die Apoptoserate im FACScalibur bestimmt.
Standardmäßig wurden die Blasten bereits vor der Aufreinigung (t0) auf die Expression der
HLA-Moleküle HLA-ABC und HLA-DR, sowie die Kostimulatoren CD80 und CD86, den
Koinhibitor PD-L1 und den Apoptose-Rezeptor CD95 hin untersucht. Im Anschluß an die
Aufreinigung wurden vom Zeitpunkt t0 Lysate für den Western Blot gewonnen.
Zur Bestimmung der Apoptoserate wurde ein Teil der Blasten nach der Aufreinigung für 24 h
jeweils mit und ohne dem agonistischen Fas Antikörper CH11 (Biomol) in RPMI Medium
inkubiert und anschließend die Apoptoserate durchflusszytometrisch durch eine AnnexinV/PI
Färbung bestimmt.
23
In einem zweiten Ansatz wurden die Blasten 24 h jeweils mit und ohne IFNγ inkubiert. Nach
24 h wurden die Blasten mit und ohne IFNγ erneut auf die Expression oben genannter Marker
untersucht, außerdem wurden Lysate für den Western Blot gewonnen.
Die zellfreien Überstände der 24h inkubierten Proben wurden tiefgefroren und zu einem
späteren
Zeitpunkt
durchflusszytometrisch
(Cytometric-Bead-Array
(CBA),
Becton
Dickinson) der Gehalt der Zytokine IL-8, IL-1ß, IL-6, IL-10, TNF-α und IL-12p70 bestimmt.
2.3.2.1 Schonendes Auftauen von AML-Blasten
Um die empfindlichen Blasten möglichst schonend aufzutauen, wurden die in 90%
Dimethylsulfoxid (DMSO) und 10% fetalem Kälberserum (FCS) tiefgefrorenen Zellen aus
dem Stickstoff genommen und unverzüglich zwei Minuten im 37°C warmen Wasserbad unter
leichtem Schütteln erwärmt. Anschließend wurden die Zellen in ein 50 ml Röhrchen überführt
und im 1 Minuten Takt eine definierte Menge Medium (insgesamt 14, 4 ml) zugegeben. Um
das für die Zellen schädliche DMSO zu entfernen, wurden die Zellen nach der Auftauphase
sofort zentrifugiert. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Zellen in Medium
aufgenommen und auf Eis gestellt.
2.3.2.2 FACS-Analysen zur Phänotypisierung der AML-Blasten,
Monozyten und Zelllinien
Unmittelbar nach dem Auftauen wurden die AML-Blasten phänotypisch charakterisiert. Dazu
wurden die Blasten in zwei Schritten mit FACS-Waschpuffer zentrifugiert. Nach der zweiten
Zentrifugation wurden die Überstände dekantiert, die Zellen im Rücklauf suspendiert, in PBS
aufgenommen und in die vorbereiteten Röhrchen (4ml Polystyrene, FALCON) verteilt.
Nach Zugabe der entsprechenden Antikörper, bzw. Isotypkontrollen wurden die Zellen für 20
Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Um überschüssige Antikörper zu
entfernen, folgten zwei weitere Zentrifugationsschritte in PBS und anschließender Fixierung
der Färbung in 200 µl FACS-Fixativ. Die Aquirierung der gefärbten Zellen erfolgte im
Durchflusszytometer FACS-Calibur (BectonDickinson) Durch die Färbung mit den 4
Fluoreszenzfarbstoffen
FITC
(Fluoreszeinisothiocyanat),
PE
(Phycoerythrin),
APC
(Allophycocyanin), PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) unterschiedlicher Wellenlänge
konnte die Expression vier verschiedener Antigene gleichzeitig erfasst werden.
Zur Auswertung der Ergebnisse wurde die CellQuest-Software benutzt und die
Blastenpopulation über die Expression von CD34/CD33 und CD45 von anderen Zellgruppen
deutlich abgegrenzt (Béné, 2005).
24
Antigen
Konjugat
Klon
Isotyp
Hersteller
CD14
FITC
MΦP9
IgG2b
BD Biosciences
CD33
APC
CD33-4D3
IgG2b
Caltag
CD34
APC
581 (KlasseIII)
IgG1
Caltag
CD45
FITC
2D1
Maus IgG1
BectonDickinson
CD45
PE
HI30
Maus IgG1
Caltag
CD45
APC
HI30
Maus IgG1
Caltag
CD45
PerCP
2D1 (lambda)
Maus IgG1
BectonDickinson
CD80
FITC
BB1
Maus IgM
BectonDickinson
CD86
PE
2331
Maus IgG1
BD Biosciences
CD95
PE
DX2
Maus IgG1
Pharmingen
PD-L1
PE
MIH1
IgG1
eBioscience
HLA-ABC
FITC
G46-2.6
Maus IgG1
Pharmingen
HLA-DR
FITC
L243
Maus IgG2a
Pharmingen
HLA-A2
FITC
BB7-2
IgG2b
Pharmingen
Isotypkontrolle
FITC/PE/PerCP
X40
Maus IgG1
Pharmingen
Isotypkontrolle
FITC
G155-178
Maus IgG2a
Pharmingen
Isotypkontrolle
FITC
UHB
IgM
Coulter
Isotypkontrolle
APC
679.1MC7
Maus IgG1
Coulter
Isotypkontrolle
APC
MOPC-195
Maus IgG2b
Caltag
Tabelle 3: Herstellernachweis monoklonaler Antikörper und Isotypkontrollen
2.3.2.3 Selektion CD34 positiver Blasten über das magnetische Beads
System
Mit Hilfe des MACS-Systems (magnetic cell sorting) wurden aus dem Knochenmarkspunktat,
bzw. aus dem peripheren Blut der Patienten die CD34+ Blasten selektioniert. Der zur
Sortierung verwendete Antikörper wird auch zur Aufreinigung von CD34+ hämatopoetischen
Stammzellen (HSC) im klinischen Einsatz verwendet und wirkt nicht aktivierend auf die
Blasten (Ringhoffer et al., 2004). Die Selektion erfolgte mit kleinen Abweichungen nach der
empfohlenen Vorgehensweise des Herstellers.
Zunächst wurden die Zellen zwei mal in eiskaltem, entgastem MACS-Puffer gewaschen,
anschließend bis zu 108 Zellen in 300 µl MACS-Puffer resuspendiert und 100µl Fc-
25
Blockierungs-Lösung (Miltenyi Biotec) zugegeben. Nach etwa 20 Sekunden Schütteln
werden unspezifische Bindungen der Anti-CD34-Beads blockiert. Nachdem 100µl AntiCD34-MicroBeads (paramagnetische Antikörper, Direct CD34+ Progenitor Cell Isolation Kit,
Miltenyi Biotec) zugegeben wurden, folgte eine 30 minütige Inkubation im Kühlschrank. Zur
Entfernung der überschüssigen Beads folgte eine Zentrifugation mit MACS-Puffer.
Die eigentliche Selektion erfolgt mit Hilfe eines Magneten. Die Aufreinigungssäule befindet
sich in einem starken Magnetfeld, wodurch die mit den magnetischen anti-CD34-Beads
beladenen Zellen in der Säule zurückgehalten werden, während die unmarkierte Population
als Eluat die Säule verlässt. Um die reinen CD34+ Blasten zu erhalten, wurde die Säule aus
dem Magnetfeld entfernt und die markierten Blasten mit Macs-Puffer aus der Säule
ausgeschwemmt. Diese Sortierung wurde ein zweites Mal durchgeführt, um eine möglichst
reine Blastenpopulation zu erzielen.
Im Anschluss an die Selektion wurde die Anzahl der Blasten mit Hilfe der NeubauerZählkammer bestimmt und die Reinheit der Blastenpopulation mittels FACS-Analyse
detektiert (Färbung mit CD34 und CD45-Antikörper), wobei durchgehend Reinheiten von
mehr als 90 % erzielt wurden.
Abbildung 5: Aufreinigung von AML Blasten
A) AML-Blasten vor der Sortierung mit einem Blastenanteil von 82% CD34+CD45low. B) AML-Blasten nach positiver Selektion mittels
CD34-Expressison (Reinheit 94%). C) Die AnnexinV/PI-Färbung zeigt, dass AML-Blasten nach der Selektion überwiegend vital sind
(AnnexinV-/PI- 89%).
2.3.2.4 Apoptoseinduktion und Nachweis mittels AnnexinV/PI-Färbung
Das Prinzip der Apoptosemessung mittels AnnexinV und Propidiumjodid beruht auf der
unterschiedlichen Einlagerung der beiden Substanzen in die Zellmembran, bzw. DNA.
Während sich in der frühen Phase der Apoptose Annexin-V an das bereits nach außen
gekehrte Phosphatidylserin
anlagert,
bindet
Propidiumjodid (PI),
als
ein
„später
Apoptosemarker“ an die apoptotisch freigesetzte DNA. Diese Doppelfärbung ist nötig, da
26
Annexin-V auch an nekrotische Zellen binden kann (Vermes et al., 1995). Zur Bestimmung
der Apoptoserate wurden die Blasten 24 Stunden in einer Konzentration von 0,5 × 106 /ml
Medium in einer 24 well Kulturplatte (Costar) inkubiert, ein Teil ohne weiteren Zusatz, der
andere Teil unter Zugabe von 2µl des agonistischen anti-Fas-Antikörper (Klon CH11,
Biomol). CH11 ist ein Apotptose aktivierender Antikörper, der die Trimerisierung von Fas an
Fas-Rezeptor positiven Zellen induziert (Yonehara et al., 1989).
Nach 24 Stunden wurde in beiden Ansätzen der Anteil apoptotischer Zellen durch AnnexinV-FITC/PI (Caltag), bzw. durch Annexin V-FITC/CD34 APC Färbung und anschließender
Aquirierung detektiert. Die Zellen wurden während der Färbeschritte durchgehend auf Eis
gehalten, um weitere apoptotische Prozesse zu unterbinden. Nachdem die Zellen zwei Mal in
eiskaltem PBS gewaschen wurden, wurden sie in 200 ul Färbelösung, bestehend aus 195µl
Annexin-V-Bindungspuffer, 5µl Annexin-V-FITC und 5µl PI aufgenommen und für 20
Minuten abgedunkelt auf Eis inkubiert.
Die Aquirierung im Durchflusszytometer erfolgte innerhalb von 60 Minuten ohne Fixierung.
Zur Auswertung der Apoptoserate der Blasten wurde zum einen die Differenz der Annexin
positiven unbehandelten und CH-11 inkubierten Zellen verwendet, zum anderen wurde die
Apoptoserate der CH-11 stimulierten Blasten in Prozent bezogen auf die unbehandelten
Blasten verwendet.
2.3.2.5 Proteinbiochemischer Nachweis im Western Blot
Mit Hilfe der Western Blot Technik können Proteine spezifisch identifiziert und quantifiziert
werden. In dem verarbeiteten Material von an AML erkrankten Patienten wurde unmittelbar
nach der Aufarbeitung (t0), sowie nach 24h Inkubation mit und ohne IFNγ die Expression von
PI-9, FLIPS/L und Mcl-1 untersucht. Als Kontrolle wurden alle Membranen nach erfolgreicher
Antikörper-Inkubation in einem zweiten, bzw. dritten Schritt mit ß-actin inkubiert, um falsch
negative Ergebnisse auszuschließen. Als Positivkontrolle für die nachzuweisenden Antikörper
wurden Zelllinien, bzw. Monocyten oder PBSC eingesetzt.
Nach der Proteinpräparation aus dem Zytoplasma, wurden die Proteine mittels SDS-Page
elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran (Immobilon™Transfer
Membran PVDF, Milipore) geblottet und dort mittels eines spezifischen Antikörpers markiert.
Nach der HRP-basierten-Entwicklung (ECL Western Blotting detection reagents, Amersham)
erfolgte die Visualisierung (Curix60) in der Dunkelkammer. Um Proteine im Western Blot
nachzuweisen, müssen diese zunächst aus dem Zytoplasma freigesetzt werden. Dazu wird
eine definierte Zellzahl zwei Mal in eiskaltem PBS gewaschen, der Überstand mit einer
27
Pipette sorgfältig entfernt und das Pellet durch leichtes Aufrütteln gelöst. Durch Zugabe von
zweifachem SDS-Lyse-Puffer und 10 minütiger Erhitzung bei 95°C im Thermomix wurden
die Zellen lysiert und die Proteine denaturiert. Sofort im Anschluß wurden die Cups für circa
30 Sekunden kräftig geschüttelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C gelagert. Alle
Lysate wurden in der Konzentration 5 × 106 Zellen pro 100µl SDS-Lyse-Puffer hergestellt.
Die SDS-Gelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung der Proteine aufgrund ihres
Molekulargewichts.
Durch
das
Detergens
SDS
(Natriumdodecylsulfat)
wird
die
Sekundärstruktur der Proteine aufgehoben, zugleich werden sie negativ geladen, wodurch sie
allein aufgrund ihres Molekulargewichtes voneinander getrennt werden können. Die
einzelnen Gele wurden für jede Elektrophorese neu hergestellt.
Über das Trenngel wurde nach der Aushärtung (20 Minuten) ein 5 % Sammelgel nach
gleichem Verfahren gegossen. Nach Zusammensetzung der Apparatur und Befüllung mit
Lämmli-Puffer wurden die Geltaschen mit den Lysaten bestückt, wobei bei jedem Gel eine
Tasche mit einem Biorad-Kaleidoscope-Marker gefüllt wurde. Der Marker besteht aus einem
Proteingemisch definierter Größe, an welches Farbstoffe gekoppelt sind, die der späteren
Identifizierung des nachzuweisenden Proteins mittels Molekülgröße dienen. Nach Anlegen
einer Spannung von 60 Volt bei wechselnden Ampere (Blue power plus) für circa 30 Minuten
durchwandern die Proteine zunächst das Sammelgel. Die Separation im Trenngel erfolgte bei
120V-150V über ca. 90 Minuten. Um die aufgetrennten Proteine sichtbar machen zu können,
müssen die Banden zunächst vom Gel mittels der Blotapparatur (Fastblot B43, Biometra) auf
eine Membran übertragen werden. Die Filterpapiere werden in den entsprechenden
Blotpuffern (A-C) getränkt, die Membran kurz in Methanol geschwenkt und auf jeweils drei
Lagen Filterpapier, Blotpuffer A und B, geschichtet. Das Gel wird aus der Apparatur gelöst,
auf die Membran gelegt und mit drei Lagen Filterpapier (Blotpuffer C) bedeckt, woraufhin für
45 Minuten ein Strom von 0,8 mA/cm2 angelegt wird.
Nach erfolgreicher Übertragung wird die Membran zur Blockierung unspezifischer
Antikörperbindungen für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler in 5%
Magermilchlösung inkubiert. Die Inkubation mit dem spezifischen Antikörper erfolgte in
einer Konzentration von 1:1000. Die Inkubation mit dem Sekundär-Antikörper erfolgt nach
30 Minuten Waschen in TBST für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler. Für die
Entwicklung der Membran wurde diese ca. 30 Minuten in TBST, anschließend eine Minute in
der Entwicklungslösung geschwenkt und in der Dunkelkammer entwickelt. Die Membran
kann nach einstündigem Waschen in TBST für weitere Färbeschritte verwendet werden.
28
Sollen nacheinander Proteine ähnlichen Molekulargewichts nachgewiesen werden, muss der
spezifische Antikörper aus der Proteinbindung gelöst werden (Re-blot plus Strong Antibody
Stripping Solution, Chemicon). Dazu wurde der Blot nach der Entwicklung 20 Minuten in der
Reblot-Lösung geschwenkt, 10 Minuten in Magermilch geblockt und nochmals entwickelt,
um eventuell verbliebene Antikörper zu detektieren. Konnten keine Antikörper mehr
nachgewiesen werden, wurde die Membran erneut mit einem spezifischen Antikörper
inkubiert.
Antikörper
FLIPS/L
Mcl-1
PI-9
ß-actin
Anti-mouse
Anti-rabbit
Klon
G11, sc-5276
S-19
7D8
A-2066
polyklonal
polyklonal
Isotyp
Maus IgG1
Hase IgG
Maus IgG1
Hase IgG
Hersteller
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
ALEXIS biochemicals
Sigma
Dako
Dako
Tabelle 4: Herstellernachweis und Eigenschaften verwendeter Antikörper
2.3.2.6 Nachweis von Zytokinen mittels Cytometric beat array (CBA)
Als ein weiterer Immune Escape Mechanismus wird die Produktion von inhibitorischen oder
stimulatorischen Zytokinen diskutiert.
Mit
Hilfe
des
Cytometric-Bead-Array
(CBA,
Becton
Dickinson),
wurde
die
Zytokinproduktion der aufgearbeiteten Blasten im Durchflusszytometer untersucht. Der CBA
ist eine elegante Methode zur gleichzeitigen Analyse verschiedener Zytokine. Der Test enthält
einen für jedes Zytokin spezifischen Antikörper (capture bead) der während der drei
stündigen Inkubation mit einem PE gekoppelten Farbstoff markiert wird. Durch die
verschiedenen Fluoreszenzintensitäten können die einzelnen Zytokine innerhalb einer
Fluoreszenz im Durchflusszytometer als deutlich getrennte Populationen voneinander
abgegrenzt werden. Überprüft wurde die Freisetzung von IL-8, IL-1ß, IL-6, IL-10, TNF-α und
IL-12p70.
Die Zytokine wurden im Überstand der 24 h inkubierten Blasten gemessen, zum einen der
Überstand unstimulierter Blasten, zum anderen der Überstand mit IFNγ stimulierten Blasten.
Nach der Inkubation wurde die Suspension abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und
bis zur durchflusszytometrischen Analyse bei -20°C gelagert. Der CBA wurde nach der
Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der Zytokine im Plasma
erfolgte anhand einer Standardreihe und Messung der Fluoreszenzintensität der einzelnen
Proben im FL3 Kanal des Durchflusszytometers.
29
3 Ergebnisse
3.1 Störungen der Antigenpräsentation auf AML-Blasten
3.1.1 Expression von HLA-Klasse I Molekülen auf AML-Blasten
3.1.1.1 Konstitutive HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten
In der vorliegenden Arbeit wurden die Blasten unmittelbar nach der Aufarbeitung mit antiHLA-ABC-FITC, CD45 PerCP und CD34, bzw. CD33 APC Antikörpern gefärbt und im
FACS-Calibur analysiert. Abbildung 6 zeigt die Gating Strategie von AML-Blasten und deren
HLA-ABC Expression. Ebenso wurden die Oberflächenmoleküle HLA-DR, der Fas-Rezeptor
CD95, der Koinhibitor PD-L1 und die Kostimulatoren CD80 und CD86 analysiert und
ausgewertet.
Abbildung 6: Gating von primären AML Blasten und konstitutive HLA-ABC Expression
Um die Blastenpopulation von anderen myeloischen, bzw. lymphoiden Zellpopulationen abzugrenzen, wurden bei der Auswertung der
Ergebnisse die für Blasten charakteristischen Oberflächemarker CD33/CD34 und CD45 verwendet. (A) zeigt die Auftragung im FSC
und SSC. (B) zeigt die Auftrennung in CD33 und CD45, wobei 3 Populationen abgegrenzt werden können. Zum einen die CD33/CD45
doppelt negative Population, eine CD33 neg/CD45 stark positive Population (R2) und die mit R1 gekennzeichnete CD33+/CD45+
intermediäre Population. Diese Zellpopulation wurde für die weiteren Auswertungen verwendet. (C) zeigt die HLA-ABC Expression der
in R1 eingegrenzten Zellpopulation. grau=Isotyp, rot hinterlegt=t0, blau=24h unbehandelt, grün=24h IFNγ Stimulation.
Die AML-Blasten exprimieren zum Zeitpunkt t0, d.h. unmittelbar nach der Aufreinigung, in
hohem Maße HLA-ABC. Es sind keine Subpopulationen abgrenzbar, die jeweils komplette
Blastenpopulation ist zu 100% (> 97%) HLA-ABC positiv. Auffällig ist jedoch die große
Streuungsbreite der HLA-Klasse I Expression im Vergleich der verschiedenen AMLPatienten. Bei 3 Patienten (Patient P1, P4b, P16) fällt konstitutiv eine besonders hohe Dichte
an HLA-ABC Molekülen auf (siehe Abbildung 7).
30
Abbildung 7: HLA-ABC Expression auf primären AML-Blasten und nicht malignen myeloischen Zellen
A)Expression von HLA-ABC Molekülen auf AML-Blasten bei Erstdiagnose und im Rezidiv. Die Blasten wurden unmittelbar nach der
Aufarbeitung unselektiert über die myeloischen Marker CD33/CD34 identifiziert und die HLA-ABC Expression jeweils unmittelbar nach der
Aufarbeitung (t0), sowie nach 24 stündiger Kultur in An- (24h –IFNγ) und Abwesenheit (24h +IFNγ) von IFNγ analysiert. Von anderen
nicht-malignen Zellen wurden die Blasten über die Expression von CD34/CD45 abgegrenzt. Für die Auftragung verwendet wurde die
mediane Dichte (Median) der HLA-ABC Expression auf AML-Blasten, wobei der Median der Isotypen mit einberechnet wurde. B)
Dargestellt wird vergleichend die Expression von HLA-ABC Molekülen der Patienten zwischen der CD45 hoch positiven (nicht maligne
myeloische Zellen) und der CD45 intermediär positiven (AML-Blasten) Zell-Population. Aufgetragen wurde die mediane Fluoreszenzdichte
der HLA-ABC Expression. Analysiert wurden die Zellpräparate unmittelbar nach der Aufarbeitung.
Vergleicht man die HLA-ABC Expression auf verschiedenen Zellpopulationen eines
Patienten, nämlich zwischen den CD34+/CD45++ high, entsprechend den nicht-malignen
myeloischen
Zellen
und
CD34+/CD45+
intermediär,
entsprechend
der
malignen
Blastenpopulation, wie in Abbildung 7 dargestellt, so zeigt sich, dass bei 19 von 20 Patienten
die CD34+/CD45+ intermediäre Zellpopulation eine vermehrte HLA-ABC Expression im
Vergleich zu den nicht-malignen, myeloischen CD34+/CD45++high Zellen aufweist. Dies
bestätigt die Ergebnisse von Wetzler (Wetzler et al., 2001). Lediglich bei einem Patienten
(P12) zeigen die nicht-malignen Zellen im Vergleich zur Blastenpopulation eine 41% höhere
Dichte an HLA-ABC Molekülen.
31
3.1.1.2 Induktion der HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten durch
IFNγ
3.1.1.2.1
Kinetik der HLA-Klasse I Expression auf AML-Blasten nach
IFNγ Stimulation
Wie bereits bekannt kann die Expression von HLA-Klasse I Molekülen auf der Zelloberfläche
durch Stimulation mit IFNγ gesteigert werden. Zunächst wurde die Kinetik der HLA-Klasse I
Expression exemplarisch auf AML-Blasten eines Patienten überprüft. Die Blasten von Patient
P21 wurden zum Zeitpunkt t0 auf ihre HLA-ABC Expression analysiert, anschließend wurde
ein Teil der Blasten als Kontrolle in Medium, der andere Teil mit 200 IU/ml IFNγ inkubiert
und die ersten sechs Stunden stündlich, dann nach 12 h, 24 h und 48 h Inkubation der Verlauf
der Oberflächenexpression von HLA-ABC detektiert.
Abbildung 8: Kinetik der Expression von HLA-ABC auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
Blasten von Patient P21 wurden in einem Zeitverlaufsexperiment über 28 h mit IFNγ inkubiert. Nach definierten Zeitabständen wurde die
Oberflächenexpression der HLA-Klasse I Moleküle HLA-ABC analysiert.
Die aufgereinigten Blasten von Patient P21 exprimierten zum Zeitpunkt t0 konstitutiv HLAABC. Nachdem bis zu 4 Stunden nach IFNγ Stimulation zunächst eine leicht verminderte
HLA-ABC Expression zu beobachten war, war anschließend eine kontinuierliche Zunahme
der HLA-ABC Expression nachweisbar. Nach 24 stündiger Stimulation war die maximale
Expression erreicht.
3.1.1.2.2
IFNγ induzierte Expression von HLA-ABC bei AML-Blasten
Nachdem bereits alle untersuchten, primären AML-Blasten zum Zeitpunkt t0 HLA-ABC
exprimierten, und nachdem bei Patient 21 eine Hochregulation der HLA-Klasse I Moleküle
nachgewiesen wurde, wurden die Blasten aller AML-Patienten mit IFNγ stimuliert. Wie
exemplarisch für Patient 21 gezeigt, reagierten auch die anderen AML-Blasten auf die IFNγStimulation mit einer deutlich erhöhten Expression der HLA-Klasse I Moleküle. Wie in
32
Abbildung 7 gezeigt, kam es bei allen untersuchten AML-Blasten nach Stimulation mit IFNγ
zu einer vermehrten Expression der HLA-Moleküle. Auffällig ist, dass Blasten von Patient P1
nach IFNγ-Stimulation nur mit einer geringen Hochregulation von HLA-ABC reagierten,
obwohl sie zum Zeitpunkt t0 die stärkste HLA-ABC Expression aufwiesen. Umgekehrt
zeigten die Blasten von Patient P5 zum Zeitpunkt t0 eine geringe konstitutive HLA-ABCExpression, konnten aber nach IFNγ Stimulation mit einer >70%-igen Zunahme der HLAABC im Vergleich zu unstimulierten Blasten reagieren.
% Zunahme der HLA-ABC Expression
Anzahl
Patienten-Nummer
nach 24h IFNγ Stimulation bezogen auf
(Prozent)
24h Medium
20-40%
2 (10%)
1, 16
40-60%
12 (60%)
2, 3, 4a, 4c, 6, 8a, 8b,9, 11, 12, 15, 19
60-80%
6 (30%)
4b, 5, 7, 10, 14, 21
Tabelle 5: Steigerung der HLA-ABC Expression auf AML-Blasten nach 24h IFNγ Stimulation
Im Vergleich zum Zeitpunkt t0 zeigten 7 Patienten (P2, P8a, P11, P15, P19) nach 24stündiger Inkubation in Medium auch ohne IFNγ Stimulation eine vermehrte HLA-ABC
Expression. 12 Patienten (60%) (P 3, 4a-c, 5, 6, 7, 8b, 9, 10, 12, 14) reagierten nicht auf die
Inkubation im Medium und zeigten eine unveränderte HLA-ABC Expression. Lediglich
Patient P16 zeigte eine verminderte HLA-Expression.
3.1.2 Expression von HLA-Klasse II Molekülen auf AML-Blasten
3.1.2.1 Konstitutive HLA-Klasse II Expression auf AML-Blasten
Eine konstitutive HLA-DR Expression konnte bei 19 von 20 AML-Blasten Präparaten
nachgewiesen werden (Abbildung 10). Die Dichte der HLA-DR Expression wies jedoch eine
hohe Schwankung auf.
Konstitutive HLA-DR
Anzahl der
Patienten-Nummer
Expression (in %)
Patienten
>90%
11
3, 4a, 4b, 4c, 5, 8a, 8b, 9, 10, 16, 19
70-90%
4
1, 11, 14, 21
40-70%
4
2, 6, 12, 15
<10%
1
7
Tabelle 6: Anteil HLA-DR positiver Zellen der AML-Blastenpopulation
33
Patient P7 exprimierte zum Zeitpunkt t0 kein HLA-DR, dies ließ sich auch im Verlauf durch
IFNγ Stimulation nicht induzieren. 11 Patienten exprimierten zum Zeitpunkt t0 zu mehr als
95% HLA-DR, somit ist die gesamte Population positiv. 6 Patienten exprimierten konstitutiv
HLA-DR, anteilig an der Gesamtpopulation zwischen 40-90%, wobei bei 3 von 6 Patienten
nur eine Teilpopulation der AML-Blasten HLA-DR positiv war (P6, P12, P15). Auffällig stark
war die Expression von HLA-DR bei Patient P10, wo 97% der Zellen HLA-DR mit hoher
Dichte auf der Zelloberfläche exprimierten.
3.1.2.2 Kinetik der HLA-Klasse II Expression auf AML-Blasten nach IFNγ
Stimulation
Abbildung 9: Expression von HLA-DR auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
Blasten von Patient P21 wurden über 28 h mit 200 IU/ml IFNγ inkubiert. Nach definierten Zeitabständen wurde die Oberflächenexpression
der HLA-Klasse II Moleküle HLA-DR mit einem FITC konjugierten Antikörper analysiert.
Parallel zur Analyse der Expression von HLA-Klasse I Molekülen wurde nach IFNγ
Stimulation bei Patient P21 auch die Kinetik der Expression des HLA-Klasse II Moleküls
HLA-DR beobachtet. Patient P21 zeigte konstitutiv eine schwache Oberflächenexpression
von HLA-DR. Innerhalb der ersten 6 Stunden der IFNγ Stimulation ließ sich keine vermehrte
Expression von HLA-DR nachweisen. Wie in Abbildung 11 gezeigt, kam es nach 12stündiger Inkubation mit IFNγ zu einem Anstieg des Median (MFI) auf das Dreifache des
Ausgangswertes. Die höchste Dichte an HLA-DR Molekülen konnte nach 24 Stunden
nachgewiesen werden.
34
3.1.2.3 IFNγ induzierte Expression von HLA-DR bei AML-Blasten
Eine Hochregulation von HLA-DR nach IFNγ Stimulation wurde bei einer mehr als 20%
gesteigerten Expression im Vergleich zu unstimulierten Blasten definiert. Blasten von drei
Patienten zeigten eine weniger als 20% gesteigerte Expression von HLA-DR nach
Stimulation mit IFNγ. Blasten von weiteren drei Patienten zeigten Auffälligkeiten in der
HLA-DR Expression. Blasten von Patient P10 waren komplett refraktär auf eine Stimulation
mit IFNγ, wobei diese konstitutiv eine sehr starke Expression des HLA-DR Moleküls zeigten.
Blasten von Patient P5 zeigten einen kompletten Verlust der HLA-DR Expression nach 24 h
Medium und IFNγ Stimulation, wobei konstitutiv 100% der Blasten HLA-DR exprimierten.
Bei Patient P15 waren konstitutiv zwei Blasten-Populationen abgrenzbar, die HLA-DR
positiv bzw. negativ waren. Nach IFNγ Stimulation exprimierten alle Blasten dieses Patienten
HLA-DR auf der Oberfläche.
35
Abbildung 10: HLA-DR Expression auf AML-Blasten
Die Blasten wurden unmittelbar nach der Aufarbeitung unselektiert mit den myeloischen Markern CD33/CD34 und HLA-DR gefärbt
und im FACS analysiert. Von lymphozytären Zellen wurden die myeloischen Zellen über die Expression von CD34/CD45 abgegrenzt.
Dargestellt sind die Histogramme zu den drei Messzeitpunkten t0, 24 h Medium, 24 h IFNγ Inkubation, sowie die Isotyp Kontrolle. A)
Expression von HLA-DR bei AML Blasten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose. B) Expression von HLA-DR bei AML Blasten zum
Zeitpunkt des Rezidivs.
3.2 Expression von kostimulatorischen und koinhibiorischen
Molekülen auf AML-Blasten
3.2.1 Konstitutive Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80
und CD86 auf AML-Blasten
Auf den hier untersuchten AML-Blasten konnte keine konstitutive Expression von CD80
nachgewiesen werden, was die Ergebnisse von (Brouwer et al., 2000b) bestätigt.
Brouwer et al konnten eine Expression von CD86 auf AML Blasten nachweisen, allerdings
schwankte der Anteil CD86 positiver Blasten zwischen 0 bis 90%. Bei AML-FAB M0, M3
und M6 konnte nur eine schwache oder fehlende Expression nachgewiesen werden (Brouwer
et al., 2000b). Auch in dieser Arbeit bestätigte sich die hohe Variabilität in der Expression
von CD86 auf AML Blasten (Abbildung 11). Bei 9 von 18 AML-Patienten (50%) waren 020% der Blasten, bei 6 Patienten (33%) 20-50% und bei 3 Patienten (17%) bis zu 80% der
Blasten CD86 positiv.
36
Abbildung 11: Konstitutive Expression von CD86 auf AML-Blasten
Die AML-Blasten wurden unmittelbar nach der Aufarbeitung auf deren Expression von CD86 untersucht. Gezeigt sind die Histogramme der
CD86 Expression (rot hinterlegt) und dem dazugehörigen Isotyp (schwarze Linie) von 4 AML-Patienten zum Zeitpunkt t0 mit
unterschiedlicher Expressionsdichte.
3.2.2 IFNγ induzierte Expression von kostimulatorischen Molekülen auf
AML-Blasten
Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Brouwer et al, die nach 24-stündiger Stimulation eine
schwache, aber signifikant vermehrte Expression von CD80 auf AML Blasten nachweisen
konnte, wurde in dieser Studie keine Induktion von CD80 nach IFNγ Stimulation
nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Auch die Expression von CD86 konnte durch IFNγ nicht
moduliert werden.
3.2.3 Expression des koinhibitorischen Moleküls PD-L1 auf AML-Blasten
3.2.3.1 Konstitutive PD-L1 Expression auf AML-Blasten
Der Nachweis einer konstitutiven Expression von PD-L1 auf primären AML-Blasten gelang
bei 3 von 20 Patienten. Die stärkste Expression zeigten Blasten von Patient P10, bei dem 94%
der Blasten PD-L1 positiv waren. Auffallend war bei diesem Patienten auch die sehr starke
Expression von HLA-DR Molekülen. Auf den Blasten von Patient P5 waren 90%, bei Patient
P21 76% der Blasten positiv für PD-L1, allerdings mit einem relativ schwachen Median.
3.2.3.2 Kinetik der PD-L1 Expression auf AML-Blasten nach IFNγ
Stimulation
Es ist bekannt, dass die Oberflächenexpression von PD-L1 durch IFNγ induziert wird (Blank
et al, 2004). Daher wurden AML-Blasten von Patient P21 mit unterschiedlichen
Konzentrationen von IFNγ vorbehandelt und die Expression von PD-L1 zu unterschiedlichen
Zeitpunkten evaluiert (Abbildung 12).
37
Die Expression von PD-L1 konnte bei Blasten von Patient P21 dosisabhängig nach
Stimulation mit IFNγ gesteigert werden. In Zeitverlaufsexperimenten wurde bereits 3-4
Stunden nach Beginn der Stimulation mit 200U/ml IFNγ eine Hochregulation von PD-L1 im
Vergleich zu unstimulierten Zellen detektiert.
Abbildung 12: PD-L1 Expression auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation bei Patient P21
A) Kinetik der PD-L1 Expression auf AML-Blasten von Patient P21 nach IFNγ Stimulation. Blasten von Patient P21 wurden über 48 h mit
IFNγ inkubiert. Nach definierten Zeitpunkten wurde die Oberflächenexpression des koinhibitorischen Moleküls PD-L1 analysiert.
Aufgetragen wurde der Median der Fluoreszenzintensität. B) Dosisabhängige Expression von PD-L1. Die Blasten von Patient P21 wurden
24h ohne (Φ) und mit verschiedenen Konzentrationen (2U, 20U, 200U, 2000U) von IFNγ inkubiert. C) IFNγ induzierte PD-L1 Expression
bei Patient P21 zum Zeitpunkt t0, nach 24h Inkubation in Medium, und nach jeweils 24h Inkubation mit 200, bzw. 2000 U/ml IFNγ.
Darstellung der Histogramme. Die schwarze Linie beschreibt die Isotyp-Kontrolle, die rot unterlegte Fläche die PD-L1 Expression.
Als Kontrollzellen wurden periphere Blutstammzellen (PBSC) und Monozyten verwendet.
Sie wurden ebenfalls für 24h mit und ohne IFNγ stimuliert und die Oberflächenexpression
von PD-L1 zum Zeitpunkt t0, nach 24 Kultur in Medium und nach 24 h IFNγ Stimulation
bestimmt. Wie Abbildung 13 zeigt, exprimierten PBSC konstitutiv nur in geringem Maße PDL1 auf der Oberfläche. Nach 24 Stunden zytokinfreier Kultur blieb die Expression gleich,
nach Zusatz von 200 IU/ml IFNγ wurde sie deutlich gesteigert. Die Monozyten waren
konstitutiv negativ für PD-L1, reagierten jedoch bereits durch 24-stündige Inkubation in
38
zytokinfreiem Medium mit einer verstärkten Expression, welche sich durch Zugabe von 200
IU/ml IFNγ noch einmal deutlich steigern ließ.
Abbildung 13: PD-L1 Expression auf humanen Monozyten und peripheren Stammzellen (PBSC)
Dargestellt sind die Histogramme der PD-L1 Expression humaner peripherer Blutstammzellen (CD34+ PBSC) und aufgereinigter
Monozyten (Mono 1-3) von verschiedenen gesunden Spendern. Die oberste Reihe (t0) zeigt die Expression von PD-L1 unmittelbar nach der
Aufreinigung, die mittlere Reihe die Expression nach 24 h Inkubation ohne (24h -IFNγ) und die untere Reihe nach 24 h Inkubation mit 200
IU/ml IFNγ (24h + IFNγ).
3.2.3.3 IFNγ induzierte PD-L1 Expression auf AML-Blasten
Nachdem in vorherigen Versuchen gezeigt werden konnte, dass die AML-Blasten für IFNγ
sensitiv waren und mit einer Steigerung der HLA-ABC Expression reagiert hatten, wurde
auch die IFNγ vermittelte Induktion von PD-L1 auf AML Blasten untersucht. Erstmals konnte
gezeigt werden, dass AML Blasten auf Stimulation mit IFNγ mit einer erhöhten Expression
des koinhibitorischen Moleküls PD-L1 reagierten. Vier von 20 AML-Blasten Präparaten
zeigten nach IFNγ Stimulation eine vermehrte Expression von PD-L1 (Abbildung 14: PD-L1
Expression auf AML-Blasten).
AML-Blasten von Patient P19 exprimierten zum Zeitpunkt t0 kein PD-L1, reagierten aber
bereits nach 24-stündiger Stimulation mit IFNγ mit einer Hochregulation von PD-L1. Nach
24h IFNγ Stimulation waren schließlich 84% der AML-Blasten PD-L1 positiv, was einer
Steigerung von 88% bezogen auf die unbehandelte Probe entspricht. Deutlich konnten 2
Subpopulationen abgegrenzt werden. Blasten von Patient P15 exprimierten konstitutiv kein
PD-L1, nach Stimulation waren 78% der Blasten positiv, allerdings mit geringer Dichte.
Blasten von Patient P2 waren konstitutiv negativ für PD-L1, nach IFNγ Stimulation waren
55% der Blasten schwach positiv. Wie in Abbildung 12: PD-L1 Expression auf AML-Blasten
39
nach IFNγ Stimulation bei Patient P21gezeigt, war die PD-L1 Expression auf den Blasten von
Patient P21 nach IFNγ Stimulation deutlich hochreguliert, insgesamt waren 96% der Blasten
PD-L1 positiv.
Wie in vorherigen Experimenten gezeigt, reagierten alle hier untersuchten AML-Blasten
sensibel auf eine Stimulation mit IFNγ. Insgesamt zeigten nur vier von 19 AML-Patienten
(P2, P15, P19, P21) eine vermehrte Expression von PD-L1 nach IFNγ Stimulation.
Abbildung 14: PD-L1 Expression auf AML-Blasten
Dargestellt ist die Expression von PD-L1 zum Zeitpunkt t0, nach 24h Inkubation in Medium und 24h Stimulation mit IFNγ. Rot hinterlegt ist
die PD-L1 Expression, schwarz der zugehörige Isotyp. A) Konstitutive Expression von PD-L1 auf AML-Blasten. 2 Patienten (P5, P10)
exprimierten zum Zeitpunkt t0 den Koinhibitor PD-L1. B) Expression von PD-L1 nach 24h Inkubation mit und ohne IFNγ Stimulation. 4
Patienten (P2, P15, P19) (P21 in Abb. 13 gezeigt) reagierten auf Stimulation mit IFNγ mit einer vermehrten Expression von PD-L1.
3.3 Apoptose Resistenzen bei AML-Blasten
3.3.1 Die Fas/FasL vermittelte Apoptose
3.3.1.1 Konstitutive Expression des Fas Rezeptors (CD95) auf AML Blasten
Der Fas Rezeptor (CD95, bzw. Apo-1) und sein Ligand (FasL) sind Mitglieder der TNF
Superfamilie und lösen bei Aktivierung eine Reihe von apoptoseinduzierender Mechanismen
aus.
40
Abbildung 15: Expression des Fas Rezeptor CD95 auf AML-Blasten
Die AML-Blasten wurden unmittelbar nach der Aufarbeitung unselektiert mit den myeloischen Markern CD33/CD34 und CD95 gefärbt und
im FACS analysiert. Abgegrenzt wurden die Blasten über die Expression von CD34/CD45. Die Ergebnisse sind als Median der
Fluoreszenzintensität der CD95 Expression dargestellt, wobei der Median der Isotypen miteinberechnet wurde.
90% der AML-Blasten exprimierten unmittelbar nach der Aufarbeitung (t0) CD95. Blasten
von Patient P8a und P7 waren konstitutiv negativ für CD95. Bei 12 von 20 untersuchten
AML-Blastenpräparaten waren mehr als 90% der Zellen positiv für den Fas Rezeptor,
allerdings mit starker Schwankung des Median, wie Abbildung 15 zeigt. Lediglich bei den
Patienten P1 und P4c waren weniger als 50% der Blasten CD95 positiv. Die Dichte der
Expression des Fas Rezeptors ist bei allen Patienten gering.
3.3.1.2 Kinetik der Expression des Fas Rezeptors auf AML Blasten nach
IFNγ Stimulation
Abbildung 16: Expression des Fas Rezeptor (CD95) auf AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
41
Kinetik der Expression des Fas-Rezeptors (CD95) auf AML-Blasten von Patient P21 nach IFNγ Stimulation. Die Blasten von Patient P21
wurden über 28 h mit IFNγ stimuliert. Nach definierten Zeitpunkten wurde die Oberflächenexpression von CD95 analysiert.
Auch die Expression des Fas-Rezeptors auf AML-Blasten wird über IFNγ reguliert. Bei
zunächst schwacher CD95 Expression zum Zeitpunkt t0, begannen die Blasten nach etwa 4
Stunden auf die IFNγ Stimulation mit einer vermehrten CD95 Expression zu reagieren. Nach
24 Stunden wurde die maximale Expression erreicht.
3.3.1.3 Expression des Fas-Rezeptors CD95 auf AML-Blasten nach IFNγ
Stimulation
Wie die Experimente zur Kinetik der CD95 Expression auf AML-Blasten nach IFNγ
Stimulation zeigen, wird die Expression des Fas Rezeptors auf AML-Blasten durch IFNγ
moduliert. Kein Patient reagierte auf die Stimulation mit IFNγ mit einer verminderten
Expression von CD95. Die AML-Blasten von 13 von 20 Patienten reagierten mit einer mehr
als 20% vermehrten Steigerung der CD95 Expression, während 7 Patienten auch nach IFNγ
Stimulation eine unveränderte CD95 Expression zeigten.
3.3.1.4 Apoptose Induktion durch anti-Fas-Antikörper auf AML-Blasten
3.3.1.4.1
Apoptose Induktion
Experimentell können Anti-Fas-Antikörper die Wirkung von FasL imitieren und bei Bindung
an den Fas Rezeptor Apoptose auslösen. Zur Apoptoseinduktion wurde ein aktivierender antiFas-Antikörper (Klon CH11) eingesetzt. Es handelt sich dabei um einen Antikörper der
Klasse IgM, der die zur Apoptoseinduktion notwendige Trimerisierung von Fas induziert
(Yonehara et al., 1999).
3.3.1.4.2
Sensitivität von AML-Blasten gegenüber Fas-vermittelter
Apoptose
Als Kontrolle wurde die Apoptoseinduktion mit dem CH11-Antkörper auch an den
myeloischen Zelllinien K562, Kg1a und U937 überprüft. Die Zellen wurden in einer
Konzentration von 0,5×106/ml in die Versuche eingesetzt und für 24h mit und ohne Zugabe
des CH11-Antikörpers inkubiert.
Wie Abbildung 17 zeigt, sind die Leukämie-Zelllinien K562 und Kg1a nicht sensibel
gegenüber einer Fas-vermittelten Apoptose. Der Anteil der apoptotischen Zellen lag bei 11
bzw. 13% bei der K562 Zelllinie und bei 3 bzw. 4% bei der Kg1a Linie, jeweils nach 24h
Inkubation ohne, bzw. mit dem CH-11-Antikörper. Bei U937 Zellen kam es nach anti-Fas
42
Exposition zu einer Steigerung der Apoptoserate um 91%, somit sind die Leukämiezellen
sensitiv für eine Apoptoseinduktion über das Fas/FasL System.
Abbildung 17: Fas-vermittelte Apoptose in leukämischen Zell-Linien
Die Zellen wurden jeweils 24h in einer Konzentration von 0,5×106/ml +/- 2ug/ml CH11-Antikörper inkubiert. Nach 24h Inkubation
wurden die Zellen mit AnnexinV/FITC und Propidiumjodid (PI) gefärbt und die Apoptoserate im Durchflusszytometer gemessen.
Dargestellt sind jeweils die Dotplots der Zelllinien nach 24h Inkubation mit (24h/+CH11) und ohne (24h/unb) Zugabe des CH11Antikörpers.
Da es sich bei den untersuchten AML-Blasten um kryokonservierte Zellen handelte, betrug
die spontane Apoptoserate nach 24 Stunden Kultur ca. 20%.
Die AML-Blasten der untersuchten Patienten ließen sich aufgrund ihrer Sensitivität
gegenüber einer Fas-vermittelten Apoptose in 3 Gruppen einteilen, wie in Tabelle 7:
Apoptoseraten von AML-Blasten dargestellt. Der überwiegende Anteil der AML-Blasten
(67%) zeigte nach Stimulation mit dem apoptoseinduzierenden Antikörper 0-20% höhere
Apoptoseraten als die Blasten des unbehandelten Ansatzes. Fünf Patienten zeigen um bis zu
20-40% erhöhte und ein Patient (P9) mehr als 40% erhöhte Apoptoseraten.
% Apoptose nach Anti-Fas
Anzahl Patienten
Patienten-Nummer
Exposition
(Prozent)
>40%
1 (5%)
9
20-40%
5 (28%)
2, 4c, 7, 8b, 15
<20%
12 (67%)
1, 3, 4a, 5, 6, 8a, 10, 12, 14, 16, 17, 19
Tabelle 7: Apoptoseraten von AML-Blasten nach anti-Fas-Antikörper Exposition
43
3.3.1.4.3
Korrelation zwischen der Sensitivität gegenüber Fasvermittelter Apoptose und Fas Expression auf AML-Blasten
Nachdem die AML-Blasten den Fas Rezeptor exprimierten und für die Apoptoseinduktion
über den anti-Fas-Antikörper sensitiv waren, sollte überprüft werden, ob zwischen der Fas
Rezeptor Expression und der Apoptosesensitivität eine Korrelation bestand.
In der Literatur korrelierte die Expression des Fas Rezeptors CD95 auf AML-Blasten bisher
nicht mit dem FAB Subtyp, allerdings zeigen AML Blasten mit fortschreitendem
Krankheitsverlauf eine verminderte oder fehlende Fas Oberflächenexpression. Bisher konnte
sowohl bei MDS Patienten (Bouscary et al., 1997), als auch bei AML Patienten (Iijima et al.,
1997) keine Korrelation zwischen der Fas Expression und Apoptose Rate nachgewiesen
werden.
Abbildung 18: Apoptoseinduktion bei AML-Blasten
Die AML-Blasten wurden nach der Aufarbeitung jeweils 24h in einer Konzentration von 0,5×106/ml +/- 2ug/ml CH11-Antikörper inkubiert.
Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit Annexin V/FITC und Propidiumjodid gefärbt und die Apoptose im
Durchflusszytometer gemessen. Dargestellt ist die Apoptoserate der Blasten in Prozent (%) im Vergleich zur Expression des Fas Rezeptors
(Median CD95, 24h unb). Berechnet wurde die Apoptoserate aus der Gesamtzahl der apoptotischen Zellen des unbehandelten Ansatzes,
bezogen auf die Gesamtzahl der apoptotischen Zellen des mit CH11 inkubierten Ansatzes.
Die Ergebnisse früherer Studien lassen sich auch auf die hier untersuchten AML-Blasten
übertragen. Es konnte keine Korrelation zwischen der Apoptoserate der Blasten und der Fas
Rezeptor Expression nachgewiesen werden.
44
3.3.2 Expression antiapoptotischer Moleküle bei AML-Blasten
3.3.2.1 Expression antiapoptotischer Moleküle von AML-Zelllinien,
Monozyten und PBSC
Als Kontrollzellen wurden neben den Zelllinien K562, KG1a, U937 und YT auch von
gesunden Spendern gewonnene periphere Blutstammzellen (PBSC) und Monozyten
verwendet. Von den Zelllinien wurde nur die konstitutive Expression der antiapoptotischen
Moleküle bestimmt, während bei den PBSC und Monozyten jeweils die konstitutive
Expression zum Zeitpunkt t0, sowie die Expression nach 24-stündiger Inkubation -/+ IFNγ
bestimmt wurde.
FLIPL konnte bei den Zelllinien nur in KG1a und sehr schwach in K562 Zellen nachgewiesen
werden (Abbildung 19). FLIPs konnte in keiner der Zelllinien nachgewiesen werden, was im
Gegensatz zu bereits veröffentlichten Daten von Benesch steht, denen der Nachweis in KG1a
Zellen gelang (Benesch et al., 2003). Alle Zelllinien exprimierten PI-9, wobei YT und K562
Zellen eine deutlich stärkere PI-9 Expression als KG1a und U937 Zellen zeigten. Ein
positiver Nachweis für Mcl-1 gelang in den Zelllinien K562, KG1a und U937. Die als
Kontrollzellen eingesetzten gesunden Stammzellen, sowie humane Monozyten exprimierten
zu allen drei Zeitpunkten FLIPL, Mcl-1 und PI-9. Eine IFNγ Stimulation induzierte in den
Monozyten keine Veränderung der Expressionsstärke von FLIPL und Mcl-1, während die
PBSC mit einer leicht vermehrten Expression der beiden Moleküle reagierten. FLIP L wird von
PBSC und Monozyten schwach exprimiert, während Mcl-1 von PBSC stark und von
Monozyten sehr stark exprimiert wurde.
PI-9 wurde von PBSC und Monozyten sowohl konstitutiv, als auch nach 24-stündiger
Inkubation mit IFNγ exprimiert. Monozyten zeigten jedoch nach 24 Stunden eine deutlich
stärkere Bande als zum Zeitpunkt t0, die Expressionsdichte der unstimulierten und der
stimulierten Monozyten war aber unverändert.
45
Abbildung 19: Expression antiapoptotischer Moleküle auf Leukämiezell-Linien und myeloischen Zellen
Nachweis antiapoptotischer Moleküle FLIPL, Mcl-1 und PI-9 im Western-Blot. Die Western-Blot Lysate wurden jeweils zum Zeitpunkt
der Aufarbeitung (t0), sowie nach 24 stündiger Inkubation in An- oder Abwesenheit von IFNγ gewonnen. Nach Entfernen des
Erstantikörpers wurden die Membranen zur Kontrolle des Gesamtproteingehaltes jeweils mit ß-actin gefärbt A) konstitutive Expression
von FLIPL, Mcl-1 und PI-9 bei Zelllinien (K562, KG1a, U937, YT). B) Expression von FLIPL, Mcl-1 und PI-9 bei SpenderStammzellen (PBSC) und Monozyten (Mono1, Mono2). FLIP und Mcl-1 wurden in einem Blot durch den Einsatz der Reblot Stripping
solution nacheinander bestimmt, während für den Nachweis von PI-9 ein separater Western-Blot geführt wurde.
Bezüglich der FLIP Expression und dem Apoptoseverhalten der Zelllinien fiel auf, dass K562
und
Kg1a
Zellen
bei
positiver
FLIP
Expression
durch
Inkubation
mit
dem
apoptosestimulierenden Antikörper CH11 keine erhöhte Apoptoserate zeigten, während U937
Zellen bei fehlender FLIP Expression durch CH11 Inkubation eine deutlich erhöhte
Apoptoserate aufwiesen (Abbildung 17).
3.3.2.2 FLIPS/L - ein Apoptose inhibitorisches Molekül
Während auf mRNA Ebene mehrere Splice-Varianten nachgewiesen werden konnten
(Scaffidi et al., 1999), sind bisher auf Proteinebene zwei Varianten des Moleküls bekannt:
FLIP LONG (FLIPL), ein 55kD und 440AS großes Molekül und FLIP SHORT (FLIPS),
27/28kD und 202AS groß. FLIPL ist strukturell der Caspase8 ähnlicher. Beide Isoformen
können jedoch an den DISC binden (de Melo Campos et al., 2007). Es wurde bisher bei
keinem AML-Patienten die kurze Form, FLIPs, nachgewiesen.
Wie bereits in MDS-Zellen gezeigt, exprimieren auch Blasten von AML Patienten FLIP L. In
Übereinstimmung mit der von Benesch beschriebenen relativ schwachen Expression von
FLIPL an MDS Patienten zeigen die hier durchgeführten Western Blot Analysen generell eine
schwache Expression von FLIPL. 13 AML-Patienten exprimierten bereits konstitutiv FLIPL
(72%). Die stärkste Expression wurde bei den Patienten P15 und P21 gefunden, während bei
allen anderen Proben die Expression von FLIPL relativ schwach war. 2 Patienten (11%) (P05,
P04b) waren zu jedem gemessenen Zeitpunkt negativ für FLIP L. 9 Patienten (50%)
46
exprimierten zu den drei Messzeitpunkten FLIPL in gleicher Dichte. Die Stimulation mit IFNγ
bewirkte keine Änderung der FLIPL Expression. Eine verstärkte Expression nach IFNγ
Stimulation konnte lediglich bei zwei AML-Patienten gezeigt werden. Patient P21
exprimierte bereits konstitutiv FLIPL und reagierte auf die Stimulation mit einer stärkeren
Expression, während Patient P8b konstitutiv negativ war und auf die Stimulation mit einer
Induktion der FLIPL Expression reagierte. Blasten von 5 AML-Patienten (28%) waren
konstitutiv schwach positiv oder negativ und regulierten nach 24stündiger Inkubation in
Medium die FLIPL Expression hoch, unabhängig von IFNγ. Blasten von Patient P2 zeigten
konstitutiv und nach IFNγ Stimulation eine gleich starke FLIPL Bande, während nach
24stündiger Inkubation in Medium keine Bande nachweisbar war.
Abbildung 20: FLIPL Expression bei AML-Blasten
Die Expression des antiapoptotischen Moleküls FLIPL wurde bei AML-Blasten zu drei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt: Unmittelbar
nach der Aufreinigung der Blasten (t0 konstitutiv), nach 24-stündiger Inkubation in Medium (24h Medium) bzw. mit Stimulation mit IFNγ
(24h IFNγ). Die AML-Blasten wurden hinsichtlich ihrer FLIPL Expression in vier Gruppen eingeteilt: 2/19 Patienten exprimierten die
Blasten zu keinem Zeitpunkt FLIPL (- - -). Der überwiegende Anteil (9/18) der untersuchten Blastenpopulationen exprimierte zu allen drei
Messzeitpunkten FLIPL in gleicher Stärke (+ + +). 5/18 Patienten zeigten gegenüber dem t0 Wert nach 24h Inkubation und Stimulation
verstärkte Banden (-/+ ++ ++). Zwei Patienten zeigen nach IFNγ Stimulation eine verstärkte FLIPL Bande (-/+ -/+ +++).
In keiner der aufgearbeiteten AML-Proben gelang der Nachweis von FLIPs, weder
unmittelbar nach der Aufarbeitung noch nach 24-stündiger Kultur in An- oder Abwesenheit
von IFNγ. In der Literatur ist bisher keine Expression von FLIPs auf AML Blasten
beschrieben.
47
3.3.2.3 Die Expression von Mcl-1 auf AML-Blasten, leukämischen
Zelllinien und nicht malignen, myeloischen Zellen
Das 36 kD schwere Polypeptid Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1) ist ein antiapoptotisches
Molekül der bcl-2 Familie. Der hohe Turnover erklärt sich mitunter durch den Abbau im
Proteasom und dient einer schnellen Reaktion und Anpassung auf eine sich ändernde
Umgebung. Über die Regulation von Mcl-1 durch IFNγ auf AML-Blasten wurde bisher nicht
berichtet.
Wie bereits beschrieben, exprimieren die Zelllinien K562, Kg1a und U937 Mcl-1 (Kaufmann
et al., 1998), wobei Kg1a Zellen eine schwächere Expression als die beiden anderen Zelllinien
aufweisen. Wie in Abbildung 19 gezeigt, exprimierten zum Zeitpunkt t0 sowohl die
Monozyten als auch die PBSC Mcl-1, was im Western-Blot als deutliche Bande sichtbar war.
Die Blasten von 17 AML Patienten (94%) zeigten bereits konstitutiv eine Expression des
antiapoptotischen Moleküls Mcl-1, wobei besonders drei Patienten (P21, P15, P11) eine sehr
starke Expression zeigten. Lediglich bei Blasten eines AML Patienten (P14) war sowohl
konstitutiv als auch nach 24 stündiger Inkubation in An- oder Abwesenheit von IFNγ
Stimulation keine Mcl-1 Expression nachweisbar.
Wie in Abbildung 21 gezeigt, exprimierten AML-Blasten von 11 Patienten (61%) Mcl-1 zu
allen drei Zeitpunkten in äquivalentem Maße. 78 % der Blasten der untersuchten Patienten
zeigten nach IFNγ Stimulation keine vermehrte Expression von Mcl-1. AML-Blasten von 4
Patienten (P21, P9, P8b, P16) zeigten nach 24-stündiger Inkubation in Medium eine
schwächere Expression von Mcl-1 als konstitutiv, welche durch IFNγ Stimulation aber wieder
gesteigert werden konnte. Jedoch zeigten sich Unterschiede der Expressionsstärke im
Vergleich zwischen der 24h Inkubation in Medium mit der konstitutiven Expression t0. Drei
Patienten (P01, P10 und P02) zeigten konstitutiv eine schwache Bande, nach 24 Stunden
Inkubation, zeigte sich eine deutlich stärkere Bande, welche aber durch IFNγ Stimulation
nicht mehr gesteigert werden konnte.
48
Abbildung 21: Mcl-1 Expression von primären AML-Blasten
Die Expression des antiapoptotischen Moleküls Mcl-1 wurde bei AML-Blasten zu drei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt: Unmittelbar
nach der Aufreinigung der Blasten (t0 konstitutiv), nach 24-stündiger Inkubation in Medium (24h Medium) und nach 24-stündiger
Stimulation mit IFNγ (24h IFNγ). Die AML-Blasten wurden hinsichtlich ihrer Mcl-1 Expression in fünf Gruppen eingeteilt: Blasten, die zu
keinem Zeitpunkt Mcl-1 (- - -) exprimieren. Ein Anteil, der konstitutiv eine Mcl-1 Expression zeigt, diese nach 24h vermindert und nach
IFNγ auf den Ursprungswert hochreguliert (++ -/+ ++) Blasten, die zu allen drei Zeitpunkten äquivalente Mengen von Mcl-1 exprimierten
(+ + +). Ein Teil, der konstitutiv Mcl-1 exprimiert, nach 24h Inkubation die Expression verstärkt, welche sich aber durch IFNγ nicht mehr
steigern lässt (-/+ ++ ++).
3.3.2.4 Die Expression von PI-9 auf AML-Blasten
PI-9, dem einzig physiologischen Inhibitor für GrB, einem wichtigen Effektormolekül der
CTL vermittelten Zelllyse, wurde in AML-Blasten untersucht, da bisher die Expression von
PI-9 in AML-Blasten nicht beschrieben war. Mittels Western Blot Analyse wurde die
Expression von PI-9 in AML-Blasten und bei der NK-Zelllinie YT als Positivkontrolle
untersucht.
3.3.2.4.1
Funktioneller Nachweis der PI-9 Expression über die
Komplexbildung von PI9/GrB
Funktionell wurde die Expression von PI-9 anhand der Komplexbildung von PI-9 mit seinem
Substrat Granzyme B (PI-9/GrB-Komplex) untersucht (Sun et al., 1996) (Classen et al.,
2004). Aus der PI-9+ Zelllinie K562 wurden Zelllysate gewonnen, denen unterschiedliche
Konzentrationen von rekombinantem Granzyme B zugesetzt wurden. Diese Ansätze wurden
dann im Western-Blot aufgetragen und mit Antikörpern gegen PI-9 bzw. Granzyme B
inkubiert. Je mehr Granzyme B zu den K562-Lysaten gegeben wurde, desto mehr PI-9/GrB-
49
Komplex bzw. desto weniger freier PI-9 kann nachgewiesen werden. In Lysaten der PI-9Linie U937 konnte keine Komplexbildung beobachtet werden.
Abbildung 22: Komplexbildung von PI-9 mit Granzyme B
Zelllysate der PI-9+ Linie K562 und der PI-9- Linie U937 wurden mit steigenden Konzentrationen von rekombinantem Granzyme B (GrB,
29kD) inkubiert und im Western-Blot analysiert. Die Entwicklung des Blots mit einem PI-9 Antikörper zeigt die Abnahme des freien PI-9
(42kD) bei steigender Granzyme B Konzentration und vermehrtem Auftreten des PI-9/GrB-Komplexes (ca. 63kD). Der Komplex lässt sich
besser mit dem Antiköper für Granzyme B (Klon 2C5) nachweisen.
3.3.2.4.2
PI-9 Expression auf leukämischen Zelllinien, Monozyten und
peripheren Blutstammzellen (PBSC)
Als Kontrollzelllinie wurden YT Zellen verwendet, in denen PI-9 durch einen Defekt nicht
ausgeschleust werden kann, und deshalb innerhalb der Zellen in großem Maße gespeichert
wird (Horie et al., 2005). Als Kontrollzellen wurden Monozyten und PBSC verwendet, von
denen direkt nach Aufreinigung (t0) und nach 24h +/-IFNγ Proteine für Western-Blot
Analysen gewonnen wurden. Sowohl Monozyten als auch PBSC zeigten eine starke
konstitutive Expression von PI-9 zum Zeitpunkt t0. Monozyten wiesen nach 24h Kultur eine
verstärkte Expression auf, die durch Gabe von IFNγ nicht weiter gesteigert werden konnte.
Die Expression von PI-9 bei PBSC konnte durch IFNγ jedoch gesteigert werden (Abbildung
19: Expression antiapoptotischer Moleküle ).
3.3.2.4.3
PI-9 Expression von AML-Blasten
3.3.2.4.3.1 konstitutive PI-9 Expression von AML-Blasten
Erstmals konnte bei leukämischen Blasten der Granzyme B Inhibitor PI-9 nachgewiesen
werden. 15 der untersuchten Proben (83%) exprimierten zum Zeitpunkt t0 PI-9. Lediglich 3
Patienten exprimieren unmittelbar nach der Aufarbeitung kein PI-9.
50
Abbildung 23: PI-9 Expression von AML-Blasten
Die Expression des antiapoptotischen Moleküls PI-9 wurde bei AML-Blasten zu drei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt: Unmittelbar nach
der Aufreinigung der Blasten (t0 konstitutiv), nach 24 Stunden Inkubation in Medium (24h Medium) und nach 24 Stunden Stimulation mit
IFNγ (24h IFNγ). Die AML-Blasten wurden hinsichtlich ihrer PI-9 Expression in vier Gruppen eingeteilt: 3 Patienten exprimierten zu
keinem Zeitpunkt PI-9 (- - -). Der überwiegende Anteil (10/18) der untersuchten Patienten exprimierten zu allen drei Messzeitpunkten PI-9
in gleicher Stärke (+ + +). 2/18 Patienten zeigten gegenüber dem t0 Wert nach 24h Inkubation und Stimulation verstärkte Banden (-/+ ++
++). Drei Patienten (P08b) zeigen nach IFNγ Stimulation eine verstärkte Expression von PI-9 (-/+ -/+ +++).
3.3.2.4.3.2 Zeit und dosisabhängige IFNγ Stimulation bei P21
Da P21 in vorherigen Versuchen sehr sensibel auf IFNγ Stimulation reagierte, wurde zunächst
die
Expression
von
PI-9
an
diesem
Patienten
in
einem
Konzentrations-
und
Zeitverlaufsversuch untersucht.
Abbildung 24: Dosis- und Zeitabhängige Induktion von PI-9 durch IFNγ
AML-Blasten des Patienten P21 exprimieren nach Inkubation mit steigenden Konzentrationen von IFNγ dosisabhängig PI-9. Durch
Inkubation mit IL-2 erfolgt keine PI-9 Induktion. (A). In Zeitverlaufsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Expression von PI-9 3-4
Stunden nach Stimulation mit IFNγ (200U/ml) nachweisbar ist. Als Referenz wurde die Expression von β-Actin untersucht (B).
51
Initial (t0) exprimieren die Blasten von Patient P21 kein PI-9. In zwei Zeit-, bzw.
Dosisabhängigen Ansätzen mit IFNγ konnte jedoch eine eindeutige Induktion und Expression
des GrB Inhibitors nachgewiesen werden (Abbildung 24).
Nach Kultur der Blasten über 24 Stunden zeigte sich eine spontane, aber niedrige Expression
von PI-9, die durch Zugabe von IFNγ dosisabhängig gesteigert werden konnte. Durch IL-2
kam es zu keiner Induktion von PI-9, was im Widerspruch zu den von (Horie et al., 2005)
publizierten Daten steht, die IL-2 als Induktor von PI-9 in immunkompetenten Zellen
beschrieben haben. In Zeitverlaufsexperimenten konnte nach Stimulation mit IFNγ die
Expression von PI-9 nach 3-4 Stunden auf Proteinebene detektiert werden
3.3.2.4.3.3 IFNγ induzierte PI-9 Expression von AML-Blasten
Wie bereits in dem Zeit und dosisabhängigen Verlauf bei Patient P21 gezeigt werden konnte,
kann eine Stimulation mit IFNγ zu einer Induktion und Expression von PI-9 bei AML-Blasten
führen. Daraufhin wurden 17 weitere Proben von AML-Patienten untersucht.
Western-Blot Analysen der AML-Blasten zeigten bei insgesamt 3 Patienten (17%) eine
vermehrte Expression von PI-9 nach IFNγ Stimulation (Abbildung 23). Ebenfalls 3 Patienten
waren zu allen Messzeiten negativ für PI-9 (P06, P09, P14). 10 Patienten (56%) exprimierten
sowohl zum Zeitpunkt t0, als auch nach 24h -/+ IFNγ die gleiche Menge PI-9. P02 und P11
zeigten konstitutiv eine schwächere Bande als nach 24h Inkubation -/+ IFNγ. Die Stimulation
mit IFNγ bewirkte bei diesen beiden Patienten keine zusätzliche Steigerung der Expression
(Abbildung 23: PI-9 Expression von AML-Blasten).
3.4
Zytokin Sekretion von AML-Blasten
3.4.1 Sekretion pro-Inflammatorischer Zytokine durch AML-Blasten
3.4.1.1 Sekretion von Interleukin IL-1ß durch AML Blasten
Im Überstand konnte mit dem CBA in 100% der untersuchten Proben IL-1ß nachgewiesen
werden (Nachweisgrenze: 7,2 pg/ml). Als vermehrte Sekretion von IL-1ß nach Stimulation
mit IFNγ wurden diejenigen Proben gewertet, die nach Stimulation bezogen auf den Wert der
unstimulierten Probe, einen um 20% höheren IL-1ß Wert aufwiesen. Der Gehalt an IL-1ß
schwankte zwischen 156-5000 pg/ml. Auffällig war, dass bei 4 von 18 Patienten nach 24h
52
Inkubation in Medium keine IL-1ß Sekretion nachgewiesen wurde, während nach Stimulation
mit IFNγ bei diesen Patienten eine IL-1ß Sekretion gemessen werden konnte.
Umgekehrt wurde bei 3 Patienten (16%) (P8b, P10, P14) in der unbehandelten Probe IL-1ß
nachgewiesen, wohingegen nach IFNγ Stimulation der IL-1ß Nachweis negativ war.
7 Patienten (37%) reagierten auf die IFNγ Stimulation mit einer mehr als 20% höheren IL-1ß
Sekretion. 5 Patienten (28%) antworteten mit einer um mehr als 20% verminderten Sekretion.
IL-1ß Sekretion [pg/ml]
X von 18 Patienten
Patient
Nach IFNγ Stimulation >20% erhöht
7 (39%)
2, 3, 4b, 4c, 5, 6, 11
Nach IFNγ Stimulation >20% erniedrigt
5 (28%)
4a, 8b, 10, 14 19
Unverändert
6 (33%)
7, 8a, 9, 15, 17, 21
Tabelle 8: IL-1ß Sekretion von AML Blasten nach IFNγ Stimulation
Patient P12 wurde hier nicht berücksichtigt, da der Vergleichswert nach IFNγ Stimulation fehlt.
Abbildung 25: IL-1ß Sekretion von AML-Blasten nach 24h Inkubation.
Aufgereinigte AML-Blasten wurden 24h mit (+IFNγ) und ohne (unb) Zusatz von 200 IU/ml IFNγ inkubiert. Die Überstände wurden bei 20°C bis zur weiteren Analyse gelagert und zusammen mit Hilfe eines CBA analysiert. Dargestellt ist die Sekretion von IL-1ß [pg/ml],
aufgeteilt in die Sekretion von Blasten bei Erstdiagnose (A) und im Rezidiv (B). Die Nachweisgrenze für IL-1ß liegt bei 7,2 pg/ml.
53
3.4.1.2 Sekretion von Interleukin IL-6 durch AML Blasten
Insgesamt konnte bei 8 von 19 Patienten (42%) die Sekretion von IL-6 nachgewiesen werden
(Abbildung 14). Dabei wiesen vor allem die Patienten P11 und P12 auffallend hohe Werte auf
(Nachweisgrenze 2,5 pg/ml). Während die Patienten P11 und P21 nach Stimulation mit IFNγ
eine um 57%, bzw. 36% vermehrte IL-6 Sekretion zeigten, wies Patient P19 eine um 60 %
verminderte Ausschüttung des Zytokins auf. Vier der untersuchten Patientenproben (21%)
zeigten eine relativ niedrige IL-6 Freisetzung und reagierten nicht auf Stimulation mit IFNγ. 1
Patient reagierte auf IFNγ Stimulation mit einer um mehr als 20% verminderten Sekretion
von IL-6.
IL-6 Sekretion [pg/ml]
X von 18 Patienten
Patienten-Nummer
Nach IFNγ Stimulation >20% erhöht
2 (11%)
11, 21
Nach IFNγ Stimulation >20% erniedrigt
1 (6%)
19
Unverändert
4 (22%)
8a, 9, 15, 17
Tabelle 9: IL-6 Sekretion von AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
Patient P12 wurde hier nicht berücksichtigt, da der Vergleichswert nach IFNγ Stimulation fehlt.
Abbildung 26: IL-6 Sekretion von AML-Blasten nach 24h Inkubation
Aufgereinigte AML-Blasten wurden 24h mit (+IFNγ) und ohne (unb) Zusatz von 200 IU/ml IFNγ inkubiert. Die Überstände wurden bei 20°C bis zur weiteren Analyse gelagert und mit Hilfe eines CBA analysiert. Dargestellt ist die Sekretion von IL-6 [pg/ml] aller AML FABSubgruppen. Die Nachweisgrenze für Il-6 des CBA liegt bei 2,5 pg/ml.
3.4.1.3 Sekretion von IL-12p70 durch AML Blasten
Die Sekretion von IL-12p70 konnte bei keinem der untersuchten Überstände nachgewiesen
werden (0/19), weder nach 24h Inkubation in Medium, noch nach 24h Stimulation mit IFNγ
(Daten nicht gezeigt). Alle Werte lagen unterhalb der Nachweisgrenze von 1,9pg/ml.
54
3.4.1.4 Sekretion von TNF-α durch AML Blasten
Eine TNF-α Sekretion konnte insgesamt bei drei Patienten (16%) beobachtet werden. Alle
anderen Patienten wiesen TNF-α Werte unterhalb der Nachweisgrenze (3,7 pg/ml) auf. Bei
zwei Patienten, P19 und P11 wurde eine geringe TNF-α Sekretion (<100pg/ml) nach 24
Stunden Inkubation bestimmt, die durch die Gabe von IFNγ um das 6-10 fache gesteigert
werden konnte. Patient P12 wies eine besonders hohe Sekretion von TNF-α in der
unbehandelten Probe auf (2663 pg/ml), leider lagen diesbezüglich keine Vergleichswerte nach
Simulation mit IFNγ vor (Daten nicht gezeigt).
3.4.1.5 Sekretion von Interleukin IL-8 durch AML Blasten
Mehrfach wurde die spontane Sekretion von IL-8 durch AML-Blasten gezeigt, der Einfluss
von IFNγ auf die Sekretion von IL-8 durch AML-Blasten wurde bisher noch nicht
beschrieben.
IL-8 Sekretion [pg/ml]
Anzahl
Patienten-Nummer
Nach IFNγ Stimulation >20% erhöht
0
Nach IFNγ Stimulation >20% erniedrigt
9 (50%)
2, 3, 4a, 4c, 8a, 8b, 9, 15, 17
Unverändert
9 (50%)
4b, 5, 6, 7, 10, 11,14, 16, 21
Tabelle 10: IL-8 Sekretion von AML-Blasten nach IFNγ Stimulation
Die Tabelle zeigt die Änderungen der IL-8 Sekretion von AML-Blasten nach IFNγ Stimulation. Aus den Werte der beiden Ansätze -/+ IFNγ
wurde der prozentuale Unterschied berechnet. Patient P19 wurde hier nicht berücksichtigt, da die beiden Werte außerhalb des Messbereiches
lagen.
Insgesamt wurde bei allen untersuchten Patientenproben eine IL-8 Sekretion nachgewiesen.
Die Schwankung bei positiv gemessenen Proben lag zwischen 47 bis 5000 pg/ml. Bei drei der
gemessenen Proben (P11, P12, P19), lagen die IL-8 Konzentrationen mit >5000pg/ml
außerhalb des Meßbereiches des CBA. Die Nachweisgrenze für IL-8 lag bei 3,6 pg/ml. 17
von 18 untersuchten Patienten zeigten nach 24h Kultur der primären AML-Blasten eine IL-8
Sekretion, bei einem Patienten (P08b) konnte keine IL-8 Sekretion nachgewiesen werden.
IFNγ bewirkt keine verstärkte Sekretion von IL-8 bei AML-Blasten, da im Vergleich zur
spontanen Sekretion in keiner Probe ein erhöhter IL-8 Gehalt nachgewiesen werden konnte.
Bei 9 gemessenen Proben (50%) blieb der Gehalt an IL-8 nach 24 h Inkubation im
unstimulierten und mit IFNγ stimulierten Anteil gleich. Dagegen konnte bei 9 Proben (50%)
eine um mehr als 20% verminderte IL-8 Konzentration im Überstand gemessen werden.
55
Abbildung 27: IL-8 Sekretion von AML-Blasten nach 24h Inkubation
Aufgereinigte AML-Blasten wurden 24h mit (+IFNγ) und ohne (unb) Zusatz von 200 U/ml IFNγ inkubiert. Die Überstände wurden bei 20°C gelagert und mit einem CBA analysiert. Dargestellt ist die Sekretion von IL-8 [pg/ml] von AML-Blasten bei Erstdiagnose (A) und im
Rezidiv (B). Die Nachweisgrenze des CBA für IL-8 liegt bei 3,6 pg/ml.
3.4.2 Das anti-inflammatorische Zytokin IL-10
Lediglich bei einem der untersuchten Patienten (P12) konnte die Sekretion von IL-10 nach
24h Inkubation in Medium (83,7 pg/ml) nachgewiesen werden. Bei allen weiteren 17
Patienten lagen die IL-10 Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze von 3,3 pg/ml
(Daten nicht gezeigt).
56
4 Diskussion
In dieser Arbeit wurden mögliche Immune Escape Mechanismen bei primären AML-Blasten
in ihren Grundzügen charakterisiert. Von besonderem Interesse sind Reaktionen von
Leukämiezellen, die es Tumorzellen ermöglichen, nach einer myeloablativen Chemotherapie
mit allogener Stammzelltransplantation zu überleben und zu rezidivieren. Durch die
Inkubation mit IFNγ, einem Schlüsselmolekül des nach einer Transplantation auftretenden
Zytokinsturms, wurden vereinfacht die Bedingungen nach einer Stammzelltransplantation
simuliert. Dieser Ansatz soll dazu beitragen, die Ursachen der hohen Rezidivraten der AML
genauer zu erforschen. Dazu wurden die Oberflächenexpression von HLA-Molekülen, des
Fas-Rezeptors sowie von kostimulatorischen und koinhibitorischen Molekülen analysiert.
Außerdem wurde die endogene Expression antiapoptotischer Moleküle, die Produktion von
Zytokinen ebenso wie das Apoptoseverhalten von primären AML-Blasten zu drei Zeitpunkten
untersucht.
4.1 Antigenpräsentation, Kostimulation und Koinhibition als
Immune Escape Mechanismen bei der AML
4.1.1 HLA-Klasse I und II Moleküle
Störungen der Antigenpräsentation können bereits in einer sehr frühen Phase zu fehlender
oder mangelhafter Aktivierung des Immunsystems führen. Tumore können sich diese
Strategie zu nutze machen, um sich vor einem Angriff durch immunkompetente Zellen zu
schützen. Für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren sind Alterationen der
HLA-Antigenexpression sehr bedeutend. Wie eingangs bereits beschrieben und in Abbildung
2 schematisch dargestellt, können Störungen auf jeder Stufe der Antigenpräsentation
auftreten. Auch über exogene Einflüsse wie Chemo- oder Immuntherapien kann die
Antigenpräsentation beeinflusst werden. Beobachtungen weisen beispielsweise auf eine in
vivo Immunselektion nach Peptidvakkzinierung hin, welche den therapeutischen Effekt von
T-Zell basierten Therapien neutralisieren könnte (Bocchia et al., 2000).
Sowohl HLA-Klasse I wie auch HLA-Klasse II Moleküle können Peptide für T-Zellen/TZellrezeptoren präsentieren. Über diesen Mechanismus sind sie auch an der Abwehr von
Tumorzellen, der GvHD und dem GvL Effekt beteiligt. Der Mechanismus von Tumoren sich
durch einen Verlust der HLA-Moleküle der Elimination durch das Immunsystem zu
entziehen, konnte bei vielen Tumorentitäten nachgewiesen werden und ist heute als Immune
Escape Mechanismus anerkannt. Besonders bei metastasierten Tumoren kann häufig ein
57
Verlust von HLA-Molekülen zwischen 40 bis 90% beobachtet werden (Garrido et al., 1997).
Im Gegensatz dazu steht die in diesen Experimenten gezeigte und in der Literatur
beschriebene Tatsache, dass AML-Blasten eine starke Expression der HLA-Klasse I
Moleküle zeigen. Dies bestätigt Ergebnisse von Brouwer (Brouwer et al., 2000b) (Brouwer et
al., 2000a), die sowohl konstitutiv als auch nach 24h Kultur auf AML-Blasten über eine
starke HLA-ABC Expression, mit Ausnahme der AML-M6, berichteten. Maligne
leukämische Zellen scheinen also, zumindest theoretisch, die Fähigkeit zu besitzen, Tumor
assoziierte Antigene auf der Zelloberfläche an zytotoxische T-Lymphozyten zu präsentieren,
was eine sehr wichtige Vorraussetzung für die Entwicklung adoptiver Immuntherapien ist.
Dennoch gelingt eine erfolgreiche Immunabwehr der malignen leukämischen Zellen nur in
seltenen Fällen. AML-Blasten müssen also weitere Mechanismen entwickelt haben, um sich
vor einem Angriff des Immunsystems zu schützen. Eine Möglichkeit könnte ein Defekt der
Antigenprozessierungsmaschinerie sein, welcher selbst bei intakter Expression der HLAMoleküle zu einer fehlerhaften Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche führen kann
(Hoves, 2009).
In vielen soliden Tumoren existieren in der Regel sowohl HLA positive wie auch HLA
negative Tumorzellen (Algarra et al., 2000). Bei den hier untersuchten Blasten der akuten
myeloischen Leukämie ist stets die komplette Blastenpopulation HLA-ABC positiv. Ein
Erklärungsansatz wäre die klonale Entwicklung der AML. Da Blasten und normal
differenzierte Leukozyten bei AML Patienten von einer pluripotenten Stammzelle
abstammen, können Blasten auch HLA Moleküle exprimieren. Unterschiede zeigten sich in
der Dichte der Expression. Insbesondere drei Patienten fallen durch die extrem dichte
Expression von HLA-ABC auf. Zwei Patienten davon (P4, P16) gehören zu den FABSubgruppen M4, bzw. M5. Möglicherweise exprimieren Leukämien der myelomonozytären
Reihe
aufgrund
der
weiter
fortgeschrittenen
Differenzierung
in
Richtung
Antigenpräsentierende Zelle mehr HLA-Moleküle als Blasten anderer Subgruppen.
Verminderte Expression von HLA-Molekülen kann durch Stimulation mit IFNγ ausgeglichen
werden. Bei den hier untersuchten AML-Blasten hat die Stimulation mit IFNγ eine deutliche
Steigerung der Expression der HLA-ABC Moleküle zur Folge, sowohl bei der Erstdiagnose
als auch im Rezidiv der AML. Besonders bei soliden Tumoren wird in der Literatur über
einen Verlust der HLA-Klasse-I Expression berichtet. Als Ursache der bestehenden HLAExpression auf AML-Blasten wurde die schnelle, klonale Entwicklung der AML diskutiert,
die es im Vergleich zum langsameren Wachstum von soliden Tumoren wie Mamma- oder
Prostata-CA nicht ermöglicht, mit einer verminderten Expression von HLA-Molekülen zu
58
reagieren (Wetzler et al., 2001). Da jedoch bei hier untersuchten AML-Blasten auch im
Rezidiv die HLA-Expression unverändert hoch ist, scheint diese These unwahrscheinlich.
Vergleicht man die Populationen der CD34+/CD45 stark positiv (lymphozytäre Zellen) und
CD34+/CD45 intermediär (maligne Zellen) exprimierenden Zellen miteinander, so zeigt sich,
dass die Population der CD34+/CD45 intermediären Zellen, eine höhere Dichte der HLAABC Expression aufweist als die CD45 stark positive Population. Dies lässt vermuten, dass
maligne myelozytäre Zellen mehr HLA-ABC exprimieren, als lymphozytäre Zellen. Die im
Vergleich zu Leukozyten vermehrte Expression von HLA-Klasse I Molekülen auf AMLBlasten wurde bereits beschrieben (Wetzler et al., 2001). Ein Vergleich zwischen der
Erstdiagnose der AML und einem Rezidiv zeigte keine signifikanten Veränderungen der
HLA-Klasse I Expression, was auch bestätigt, dass bei der AML eine verminderte Expression
der HLA Moleküle in der Regel nicht als Immune escape Mechanismus genutzt wird.
Die Expression von HLA-DR Molekülen auf AML-Blasten wurde bereits mehrfach
beobachtet. Welche Bedeutung die Expression von HLA-DR für den Verlauf maligner
Krankheiten hat, ist jedoch noch unklar. In B-Zell Lymphomen konnte ein Verlust von HLADR Molekülen mit einem aggressivem Verlauf der Krankheit in Verbindung gebracht werden
(Pilkington et al., 1993). Wetzler et al konnten zeigen, dass ca. 20% der untersuchten AMLPatienten HLA-DR negativ waren (Wetzler et al., 2003). Die HLA-DR negativen Fälle
gehören zur einen Hälfte zur Subgruppe der AML-M3, die andere Hälfte verteilt sich auf
andere AML-Subtypen. Unterschiede im Verlauf der Krankheit zwischen den HLA-DR
negativen und positiven AML-Fällen konnten nicht festgestellt werden. Eine Erklärung
könnte sein, dass HLA-Klasse II Antigene eine weniger wichtige Rolle bei der Induktion
einer Immunantwort gegen Leukämie assoziierte Antigene spielen als HLA-Klasse I
Moleküle. Möglicherweise kann ein Fehlen der HLA-Klasse II Moleküle auch durch KreuzPräsentation kompensiert werden, indem APCs anstelle der Blasten Leukämie-assoziierte
Antigene an CD4+ T-Zellen präsentieren.
Weitere Studien assoziieren eine fehlende HLA-DR Expression hauptsächlich mit der AMLM2 (Lazarchick and Hopkins, 1998), (Fenu et al., 1995). Eine veränderte Expression von
Oberflächenmolekülen kann häufig bei Rezidiven von malignen Krankheiten beobachtet
werden. Änderungen der HLA-DR Expression zum Zeitpunkt eines Rezidivs bei der AML
sind aber selten. In den vorliegenden Untersuchungen konnte mit Ausnahme eines Falles bei
allen Patienten eine HLA-DR Expression nachgewiesen werden. Die Dichte der Expression
zeigt jedoch eine hohe Schwankung. Bei 55% der Patienten tragen mehr als 95% der Blasten
konstitutiv HLA-DR auf der Oberfläche. Bei drei Patienten (P6, P12, P15) ist nur eine
59
Teilpopulation positiv für HLA-DR. Auffallend ist ein Patient (P10), bei dem alle Blasten
eine sehr hohe Dichte an HLA-DR auf der Oberfläche tragen, die aber auf Stimulation mit
IFNγ nicht mit einer zusätzlichen Steigerung reagierten. Die Induktion von HLA-DR durch
IFNγ auf AML-Blasten wurde bereits in der Literatur beschrieben (Munker and Andreeff,
1996). Auffallend ist außerdem Patient P5, welcher einen kompletten Verlust der HLA-DR
Expression nach 24h Medium und IFNγ Stimulation zeigt, wobei konstitutiv 100% der
Blasten HLA-DR exprimierten.
Eine weitere Studie zeigte eine leicht, aber nicht signifikant verminderte Expression von
HLA-Klasse II Molekülen auf AML Blasten. Bei diesen AML Blasten war die Expression
von HLA-Klasse I und II Molekülen auf CD33/CD34+ Blasten im Vergleich zu CD33/CD34Leukozyten signifikant erhöht. Diese Vergleiche zeigen, dass die AML keine Krankheit ist,
die zu einem generellen Verlust der HLA-Moleküle führt (Vollmer et al., 2003), (Brouwer et
al., 2000b). AML-Blasten exprimieren also sowohl HLA-Klasse I als auch HLA-Klasse II
Moleküle. Der Verlust dieser Moleküle wird nicht als genereller Immune Escape
Mechanismus eingesetzt. Die Blasten besitzen also zumindest theoretisch die Fähigkeit,
tumorspezifische Antigene an T-Lymphozyten zu präsentieren. Warum es trotz dieser
Fähigkeit nur in seltenen Fällen zu einer Immunantwort gegen die malignen Zellen der AML
kommt,
bleibt
zu
klären.
In
diesem
Zusammenhang
sind
Störungen
der
Antigenprozessierungsmaschinerie bei der AML von großem Interesse und müssen gründlich
erforscht werden.
4.1.2 Expression kostimulatorischer Moleküle
Eine Expression des Kostimulators CD80 konnte in diesen Versuchen nicht nachgewiesen
werden. Eine fehlende Expression von CD80 auf AML-Blasten zeigten auch weitere Studien
(Vollmer et al., 2003), (Tamura et al., 2005). Allerdings konnten Buggins et al zeigen, dass
die Expression von CD80 auf leukämischen Zellen die Erkennung von malignen Zellen durch
T-Zellen verbessert. Die Expression des Kostimulators CD80 auf malignen Zellen führt zu
einem längeren Überleben aktivierter T-Zellen. Die Sekretion von Th1 Zytokinen konnte
nicht beobachtet werden, was vermuten lässt, dass trotz eines kostimulatorischen Signals
Einflüsse des Microenvironments des Tumors eine effektive Immunantwort unterdrücken
können. Gentransfer Experimente, in denen CD80 in humane und murine Tumorzellen
eingeschleust wurde, konnten zeigen, dass die T-Zell Aktivierung durch die CD80 Expression
erhöht und die Generation von tumor-spezifischen CTLs ermöglicht wird (Buggins et al.,
1999), (Buggins et al., 2001). Die Kostimulatoren CD80 und CD86 werden auf APCs, DCs,
60
aktivierten Makrophagen und B Zellen und auf Langerhanszellen konstitutiv exprimiert,
haben jedoch eine unterschiedliche Kinetik. CD86 wird konstitutiv schwach exprimiert und
nach Aktivierung schnell hochreguliert, während CD80 erst später während der
Proliferationsphase hochreguliert wird (Wang and Chen, 2004). Obwohl CD80 und CD86
ähnliche Funktionen haben, scheint CD86 für die Induktion der Immunantwort aufgrund der
zeitlich unterschiedlichen Expression eine wichtigere Rolle zu spielen (Sharpe and Freeman,
2002).
Wie bereits von Brouwer et al. beschrieben, exprimieren AML-Blasten CD86 auf ihrer
Oberfläche, jedoch ist die Expression oft schwach und die Intensität stark schwankend. Die
hier erzielten Ergebnisse bestätigen die die hohe Varianz der Expression von CD86 auf AML
Blasten. Bei nur drei Patienten konnte die Expression von CD86 nachgewiesen werden, bei
allen jedoch mit geringer Intensität. Eine Regulation durch IFNγ konnte nicht beobachtet
werden. Whiteway et al zeigten, dass der Anteil CD86 exprimierender Blasten bei den
Subgruppen AML-M4 und M5 höher ist als bei anderen Subtypen. Die gleichzeitige
Expression von CD80 und CD86 auf Blasten, korreliert mit einer signifikant längeren
Remissionsphase (Whiteway et al., 2003). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die
Expression der Kostimulatoren auf leukämischen Zellen zu einer verbesserten Immunabwehr
beitragen kann.
Der Mechanismus der Kostimulation von T-Zellen und APC ist bereits gut untersucht. Über
den Einfluss der Expression von kostimulatorischen Molekülen auf malignen Zellen auf die
Induktion einer gegen den Tumor gerichteten Immunantwort gibt es noch keine eindeutigen
Studien. Die fehlende Expression von kostimulatorischen Molekülen auf malignen Zellen
kann als weiterer Immune escape Mechanismus angesehen werden. Bei fehlenden
kostimulatorischen Signalen können selbst antigenspezifische T-Zellen oft nicht aktiviert
werden. Im Falle einer sehr starken Antigenpräsentation an die antigenspezifischen T-Zellen
reicht jedoch oft auch die Interaktion zwischen APC und dem T-Zell Rezeptor aus, um eine
T-Zell Aktivierung zu induzieren. Bei fehlenden Proliferationsfaktoren führt eine Aktivierung
jedoch zum so genannten Aktivierungs-induzierten Zelltod.
In Studien an AML-Blasten zeigten Brouwer et al im Gegensatz zu den hier erzielten
Ergebnissen eine schwache Expression von CD80 und bestätigen eine stark variable
Expression von CD86 auf AML-Blasten. Im Gegensatz dazu steht auch die schwache, aber
signifikante Hochregulation von CD80 und CD86 nach 24h Kultur, was mit einer
verbesserten Erkennung der Blasten durch CTLs verbunden war. Die Ergebnisse lassen
vermuten, dass AML-Zellen generell keinen intrinsischen Defekt haben, sondern die
61
Fähigkeit besitzen, kostimulatorische Moleküle zu exprimieren. Möglicherweise kann durch
die Anwendung von Zytokinen wie GM-CSF oder IFNα die Hochregulation der
Kostimulatoren bewirkt werden, was die AML-Blasten für eine Lyse durch T-Zellen
anfälliger machen würde. Somit wären auch die Grundlagen für adoptive Immuntherapien
mittels antigenspezifischer CTLs verbessert. Das Scheitern von DLI bei einem AML-Rezidiv
nach Stammzelltransplantation kann auch durch die fehlende Kostimulation mitverursacht
sein, da die fehlende T-Zell Aktivierung als Immune escape genutzt werden kann (Brouwer et
al., 2000b). Boyer et al bewiesen die Fähigkeit von AML-Blasten, unter dem Einfluss eines
Zytokincocktails zu antigenpräsentierenden Zellen zu differenzieren. Unter dem Einfluss von
GM-CSF und TNF-α konnte bei den Blasten nach einer Kurzkultur eine vermehrte CD80
Expression und Antigenpräsentation beobachtet werden (Boyer et al., 2000). Ähnliches
berichteten Hicks et al (Hicks et al., 2001), die AML-Blasten in vitro mit IL-3, IL-6 und GMCSF stimulierten. Unter diesen Kulturbedingungen zeigten im Vergleich zu unstimulierten
Blasten eine höhere CD80 Expression und Differenzierung. Im zytotoxischen Ansatz konnten
dadurch CTLs CD80+ AML-Blasten eliminieren.
Die Studie von Vollmer et al. beschreibt im Gegensatz zu den hier erzielten Ergebnissen eine
signifikant vermehrte Expression von CD86 auf AML-Blasten im Vergleich zu CD33-/CD34Monozyten (Vollmer et al., 2003). Die Expression des Kostimulators CD86 auf der Mehrheit
der AML Blasten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose und sogar in Rezidiven ist eine gute
Vorraussetzung für die Etablierung adoptiver Immuntherapien. Die fehlende Reaktion des
Immunsystems auf maligne Erkrankungen wie die Leukämie könnte auch durch das Fehlen
oder die verminderte Anzahl von APC, bzw. dendritischen Zellen mitverursacht werden.
Besonders für den erfolgreichen Einsatz von DLI sind die Erkenntnisse wichtig, dass HLAABC und kostimulatorische Moleküle nicht nur bei der Erstdiagnose, sondern auch im
Rezidiv nachweisbar sind. Für die Entwicklung und Verbesserung von Immuntherapien, wäre
es ein großer Erfolg, die Expression von HLA-ABC, CD40, CD80 and CD86 auf malignen
Zellen zu erhöhen, um die Effektivität von adoptiven Therapien zu verbessern.
Um ein kostimulatorisches Signal auszulösen, muss die Dichte der Expression der
Kostimulatoren auf der Zelloberfläche und die Anzahl positiver Zellen in der Population nicht
sehr stark sein. Bei der B-ALL ist eine schwache CD86 Expression ausreichend, um ein
kostimulatorisches Signal auszulösen und eine Anergie zu verhindern (Cardoso et al., 1996).
In vitro Versuche mit AML-Blasten zeigen, dass nur 5% CD86 positive Zellen benötigt
werden, um eine allogene T-Zell Aktivierung auszulösen. AML Blasten, die zu weniger als
10% CD86 positiv sind, sind in der Lage, kostimulatorische Signale zu senden und die
62
Proliferation von T-Zellen und die IL-2 Produktion auf ähnliche Weise zu stimulieren, als
Populationen in denen über 60% der Zellen CD86 positiv sind (Whiteway et al., 2003). Diese
Daten zeigen, dass bereits eine schwache Expression der Kostimulatoren bzw. eine positive
Teilpopulation dazu beitragen kann, einen antileukämischen Effekt deutlich zu verbessern,
was für die Entwicklung von Tumorvakkzinen bedeutend ist.
4.1.3 Die Bedeutung des Koinhibitors PD-L1 für die AML
Die AML hat trotz aller Bemühungen im Vergleich zu anderen leukämischen Erkrankungen
hohe Rezidivraten. Bisherige Versuche, spezifische Immuntherapien gegen die AML mittels
Vakkzinierung oder adoptiver Zelltherapien zu entwickeln, ließen mit der Erzeugung
tumorspezifischer T-Zellen Hoffnungen keimen, selten konnten diese T-Zellen aber in vitro
das Tumorwachstum kontrollieren. Ein Grund für das Scheitern tumorspezifischer T-Zellen
könnte das Tumormicroenvironment, bzw. inhibitorische Moleküle sein, welche Tumore vor
dem Immunsystem schützen. Daten von Ösophagus-, Lungen-, und Brustkarzinomen zeigen
eine Korrelation zwischen der PD-L1 Expression und dem Überleben von Tumorpatienten
(Ghebeh et al., 2006), (Konishi et al., 2004), (Ohigashi et al., 2005). PD-L1, ein relativ neues
Mitglied der B7-Familie, konnte in diesen Versuchen auf AML-Blasten nachgewiesen
werden. PD-L1 inhibiert die Proliferation von T-Zellen durch die Interaktion mit seinem
Gegenspieler PD-1. PD-L1 interagiert allerdings auch mit einem weiteren, bisher
unbekannten Rezeptor, der vermutlich ein T-Zell stimulatorisches Signal auslöst (Tamura et
al., 2005).
Bei der Mehrheit der hier untersuchten AML-Blasten kann initial keine PD-L1 Expression
nachgewiesen werden. Lediglich 3 von 20 Patienten sind zum Zeitpunkt t0 positiv. Der
Median der Expression ist generell relativ niedrig, allerdings sind bei Patient P10 94% der
Blasten PD-L1 positiv. Auffallend war bei diesem Patienten bereits auch die extrem starke
Expression von HLA-DR Molekülen. Wie bereits nachgewiesen, konnte PD-L1 in vitro durch
IFNγ induziert werden. Auf die Stimulation mit IFNγ reagierten 4 von 20 Patienten mit einer
PD-L1 Expression, ein Patient mit einer vermehrten Expression im Vergleich zum Zeitpunkt
t0, drei Patienten mit einer erstmaligen Expression nach IFNγ Stimulation. Kann in weiteren
Versuchen bei AML Patienten eine verstärkte PD-L1 Expression nach IFNγ Stimulation
gezeigt werden, so kann man vermuten, dass Blasten die Expression von PD-L1 als Immune
escape Mechanismus nutzen. Interessant wäre ein Vergleich der PD-L1 Expression bei
Patienten bei Erstdiagnose der AML, nach einer Stammzelltransplantation beziehungsweise
im Rezidiv. Da der Erfolg von Donor Lymphozyten Infusionen bei Rezidiven der AML
63
hauptsächlich T-Zell vermittelt ist, könnte die Expression des Koinhibitors durch eine
Suppression der T-Zell-Aktivität zu dem schlechten Ansprechen der AML gegenüber DLI
beitragen. In vitro Experimente konnten deutlich zeigen, dass PD-L1 auf Tumorzellen die
Aktivität von CD8+ T Zellen supprimiert, ebenso die Proliferation und Zytokinproduktion
(Blank and Mackensen, 2007).
Studien haben andererseits auch gezeigt, dass PD-L1 und PD-L2 auch als Kostimulatoren für
T-Zellen wirken können. Wann die PD-1 Liganden inhibitorisch oder stimulatorisch wirken,
ist noch unklar. Unterschiedliche Ergebnisse in den Studien könnten daher rühren, dass in den
meisten Studien, die eine kostimulatorische Funktion beschreiben, ruhende T-Zellen
verwendet wurden, während die inhibitorischen Eigenschaften überwiegend in Studien mit
aktivierten T-Zellen beschrieben wurden. Eine Erklärung für die stimulatorischen
Eigenschaften könnte ein zweiter Rezeptor sein, der ähnlich dem B7-CD28/CTLA-4
Zusammenspiel stimulatorische Signale gibt, wie CD28. PD-L1 und PD-L2 mRNA konnte
sowohl in lymphoiden, wie auch nicht-lymphoiden Organen nachgewiesen werden, im
Gegensatz zur mRNA von CD80 und CD86, welche nur in hämatopoetischen Zellen
gefunden wurde. PD-L1 und PD-L2 werden entweder durch Aktivierung hochreguliert oder
durch IFNγ Stimulation auf Monozyten und dendritischen Zellen. Sowohl PD-L1 als auch
PD-L2 sind starke Inhibitoren der T-Zell Proliferation und Zytokinproduktion. Auch in
Gegenwart eines starken B7-CD28 kostimulatorischen Signals reicht die Expression weniger
Moleküle aus. Im Gegensatz dazu scheint PD-L1 in hohen Antigenkonzentrationen die T-Zell
Proliferation nicht zu inhibieren, sondern lediglich die Zytokinproduktion zu verringern
(Sharpe and Freeman, 2002).
PD-L1 ist ein relativ spät entdecktes Molekül. Um die genauen Signal- und
Regulationsmechanismen zu erforschen sind weitere Studien nötig. Auch um zu klären, ob
PD-L1 wie bisher angenommen, rein inhibitorisch wirkt, oder doch auch aktivierende
Eigenschaften aufweist. Für aussagekräftige Daten muss die Expression von PD-L1 in
größeren Fallzahlen auf AML-Blasten untersucht werden.
4.2 Apoptoseverhalten von AML-Blasten
Eine Leukämie kann sich unter anderem durch die Imbalance zwischen Apoptose und
Proliferation entwickeln. Um den apoptotischen Zelltod auszulösen, nützen Abwehrzellen
zwei verschiedene Mechanismen. Zum einen die Induktion über den Fas-Rezeptor oder
Todesrezeptor, zum anderen die über CTL vermittelte Lyse durch Granzyme B/Perforin. Die
64
Apoptoseinduktion über das Fas/FasL System gehört zu den best erforschten Apoptose
auslösenden Mechanismen (Krammer, 2000). Zellen, die den Fas Rezeptor CD95
exprimieren, sind sensibel für die Apoptoseinduktion über das Fas/FasL System. In diesen
Versuchen wurde zunächst die Oberflächen Expression von CD95 auf AML Blasten
untersucht. Die Dichte der Fas Moleküle ist generell niedrig, allerdings exprimieren die
untersuchten Blasten mit Ausnahme von zwei Patienten (P8a, P7) konstitutiv den Fas
Rezeptor. Bei 60% der Patienten sind mehr als 90% der Blasten CD95 positiv.
In einem funktionellen Ansatz mit einem agonistischen Anti-Fas Antikörper wurde die
Apoptosesensitivität der AML-Blasten überprüft. Bei 67% der untersuchten Patienten konnte
durch den anti-Fas-Antikörper keine Apoptose ausgelöst werden. Lediglich 33% der Patienten
zeigten im Vergleich zum unbehandelten Kontrollansatz erhöhte Apoptoseraten (P2, P4c, P7,
P8b, P15, P9). Auffällig ist Patient P9 (AML-M2), bei dem im Vergleich mehr als 53% der
Blasten in Apoptose gehen.
Übereinstimmend mit der Literatur (Whiteside and Rabinowich, 1998) korreliert die
Expression des Fas Rezeptors auf der Oberfläche der AML-Blasten nicht mit der Sensitivität
für Fas/FasL vermittelte Apoptose. Sowohl Fas als auch FasL wird von vielen Tumoren und
normalen Geweben exprimiert. Die Expression von Fas (Min et al., 1996), (Li et al., 2000)
und Fas L (Gupta et al., 1999) bei hämatologischen Erkrankungen wie der AML und dem
MDS (Bouscary et al., 1997) wurde bereits mehrfach beschrieben. Bei der CML wurde eine
Beeinflussung der Fas Rezeptor Expression auf CML Blasten durch IFNα nachgewiesen.
Unabhängig von der Stärke der Fas Expression sind CML Blasten in der Blastenkrise gegen
Fas vermittelte Apoptose resistenter als Blasten in der chronischen Phase (Selleri and
Maciejewski, 2000).
Die Oberflächenexpression des Fas Rezeptors allerdings ist variabel, bedingt durch die
Aktivität von assoziierten Proteasen und schneller Internalisierung des Rezeptor-Liganden
Komplexes. Mögliche Gründe für die Resistenz gegenüber Fas/FasL vermittelter Apoptose
können die verminderte oder fehlende Expression des Fas-Rezeptors auf der Zelloberfläche,
die Expression anti-apoptotischer Moleküle der bcl-2 Familie oder FLIP oder Mitglieder der
IAP Familie sein.
Untersuchungen zeigten, dass CD34+ AML Blasten Apoptose resistenter sind als CD34Fraktionen. Je höher der Anteil der CD34+ Blasten der untersuchten AML-Proben waren,
desto geringer war der Anteil apoptotischer Zellen (van Stijn et al., 2003), was die These
stützt, dass die Expression von CD34 auf AML-Blasten ein schlechter prognostischer Faktor
ist. Undifferenzierte AML-Subgruppen (M0, M1) exprimieren im Vergleich weniger CD95
65
und sind gegen Fas vermittelte Apoptose resistenter als die FAB-Subgruppen M2-M5
(Wuchter et al., 1999). Das therapeutische Ziel ist also die Expression des Fas Rezeptors zu
steigern und die Apoptosesensitivität maligner Zellen zu verbessern. Durch IFNγ scheint die
Sensitivität von Tumorzellen für FasL zu steigen (Keane et al., 1996). CD34+
hämatopoetische Vorläuferzellen exprimieren konstitutiv nicht den Fas Rezeptor, dieser kann
durch
IFNγ
und
TNF-α
jedoch
induziert
werden,
was
zu
einer
vermehrten
Apoptosesensitivität führt (Nagafuji et al., 1995), (Maciejewski et al., 1995). In diesen
Versuchen führte die Stimulation mit IFNγ bei 65% der Patienten zu einer verstärkten
Expression des Fas Rezeptors. Der regulierende Einfluss von IFNγ und TNF auf die
Expression von CD95 auf AML Blasten wurde bereits beschrieben (Munker and Andreeff,
1996), (Mohr et al., 2005b).
4.3 Bedeutung der Expression antiapoptotischer Moleküle bei AMLBlasten
Eine besondere Bedeutung bei der Entstehung von Apoptoseresistenzen gegenüber CTL
vermittelter Lyse kommt der Hochregulation antiapoptotischer Moleküle zu. CTL lysieren
Zielzellen v.a. durch die gerichtete Freisetzung von Perforin/Granzyme B (Lowin et al.,
1994), zudem spielt die rezeptorvermittelte Induktion von Apoptose durch Fas, TRAIL und
TNF eine Rolle (Barry and Bleackley, 2002).
In den hier durchgeführten Experimenten wurde die Expression antiapoptotischer Moleküle
zu drei verschiedenen Zeitpunkten (t0, 24 h -/+ IFNγ) in Western Blot Analysen untersucht.
Antiapoptotische Moleküle sind unter anderem für die Resistenz von AML-Blasten gegenüber
Therapieregimes und dem Immunsystem verantwortlich. Zu den am besten erforschten
Molekülen gehört die Bcl-2 Familie. In dieser Arbeit wurde die Expression von
antiapoptotischen Molekülen an Blasten von 20 AML Patienten analysiert. Die Expression
von Mcl-1 und FLIP wurde bereits beschrieben, die Expression des GranzymeB Inhibitors PI9 war bei AML-Blasten bisher nicht bekannt.
4.3.1 MCL-1
Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1) ist ein antiapoptotisches Molekül der Bcl-2 Familie, das
während der Differenzierung von Monozyten früh exprimiert wird. Seine Halbwertszeit
beträgt lediglich wenige Stunden.
66
Auch bei AML-Blasten wurde über die Expression von Mcl-1 berichtet. Exprimieren AMLBlasten Mcl-1 bereits zum Zeitpunkt der Erstdiagnose scheint dies keinen Einfluss auf das
Ansprechen der Initialtherapie zu haben, allerdings zeigen 53% der von Kaufmann et al
untersuchten Patienten im Rezidiv eine mehrfach erhöhte Mcl-1 Expression im Vergleich zur
Erstdiagnose (Kaufmann et al., 1998). Andrerseits konnte in vitro bei ALL und CLL Patienten
gezeigt werden, dass eine Überexpression von Mcl-1 die Wirkung des CD20-Antikörpers
Rituximab deutlich vermindern kann (Hussain et al., 2007). Die Expression von Mcl-1 kann
durch Wachstumsfaktoren wie Il-5, IL-6, GM-CSF, und IFNα beeinflusst werden (Huang et
al., 2000, Chao et al., 1998, Jourdan et al., 2000).
Erhöhte Level des antiapoptotischen Moleküls Mcl-1 wurden bisher in verschiedenen soliden
Tumoren, wie Lebertumoren (HCC) (Fleischer et al., 2006), Prostata-CA (Krajewska et al.,
1996), Melanomen (Tang et al., 1998), Mamma-CA (Zapata et al., 1998) und
hämatologischen Krankheiten wie B-CLL, B-NHL (Zuo et al., 2006), AML und ALL
(Shangar and Johnson, 2003), (Andersen et al., 2005) nachgewiesen. Häufig ist dabei eine
verminderte Mcl-1 Expression mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika
assoziiert. Umgekehrt führt eine experimentell vermehrte Mcl-1 Expression bei humanen
HCC-Zellen zu einer erhöhten Apoptose-Resistenz gegenüber Chemotherapeutika (Fleischer
et al., 2006).
Auch für die Differenzierung und das Überleben aller T-Lymphozyten Subpopulationen ist
Mcl-1 wichtig. Eine konstitutive Expression und Hochregulation nach Aktivierung konnte
gezeigt werden. Mcl-1 ist auch an der Differenzierung von Neutrophilen und
hämatopoetischen Stammzellen beteiligt (Dzhagalov et al., 2008).
Wie eingangs erwähnt, wird die Expression von Mcl-1 stark über Survival– und
Differenzierungssignale wie Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Eine konstitutive
Expression und Hochregulation von Mcl-1 konnte bei Zelllinien des Multiplen Myeloms
durch die Stimulation mit IL-6 und IFNα (Puthier et al., 2001) nachgewiesen werden.
Bei den in dieser Arbeit untersuchten AML-Patienten zeigten 17 Patienten (94%) bereits
konstitutiv eine Expression des antiapoptotischen Moleküls Mcl-1, wobei besonders drei
Patienten (P21, P15, P11) eine sehr starke Expression zeigten. Lediglich ein Patient
exprimierte konstitutiv und auch nach 24 Stunden Inkubation und IFNγ Stimulation kein Mcl1 (P14). 61% der untersuchten Proben exprimierten Mcl-1 zu allen drei Zeitpunkten in
äquivalentem Maße. 78% der untersuchten Patienten reagierten nicht auf die IFNγ
Stimulation. Lediglich vier Patienten zeigten nach Stimulation mit IFNγ erhöhte Mcl-1 Level.
67
Im Vergleich zur 24h inkubierten, unbehandelten Probe zeigten sie eine vermehrte Mcl-1
Expression, die aber der Stärke der Bande der konstitutiven Expression entsprach.
Die konstitutive Expression von Mcl-1 bei AML-Blasten scheint weit verbreitet zu sein. Die
von Kaufmann beschriebene These, dass AML-Blasten zum Zeitpunkt eines Rezidivs Mcl-1
zum Teil um ein Vielfaches stärker exprimierten als zum Zeitpunkt der Erstdiagnose konnte
in diesen Versuchen nicht bestätigt werden. Allerdings fehlen in den hier durchgeführten
Analysen Vergleiche bei Patienten zwischen Erstdiagnose und Rezidiv. Hier konnte nur
Material bei Erstdiagnose und im Rezidiv von verschiedenen Patienten verglichen werden.
Bisher konnte kein Zusammenhang zwischen der Expression von Mcl-1 und dem Ansprechen
der AML auf die Erstbehandlung und damit auch der Prognose festgestellt werden, ebenso
wenig wurde ein Zusammenhang zwischen der FAB-Klassifikation und der Höhe der
Expression des antiapoptotischen Moleküls Mcl-1 gefunden (Kaufmann et al., 1998).
Bei der ALL und CLL wurde eine vermehrte Mcl-1 Expression bereits mit einer Resistenz
gegenüber Rituximab in Verbindung gebracht. Bei ALL und CLL Zellen reicht bereits eine
verminderte Mcl-1 Expression aus, um eine Destabilisation der Mitochondrienmembran zu
erreichen und die Zellen somit für Apoptose zu sensibilisieren (Hussain et al., 2007), (Pepper
et al., 2008). Bei NHL-Patienten in kompletter Remission konnten deutlich geringere Mcl-1
Level als bei Patienten in fortgeschrittenem Krankheitsstadium nachgewiesen werden,
während hohe Level mit einem schlechten klinischem Verlauf, Rezidiven, Resistenzen gegen
Chemotherapeutika und aggressiven Verläufen korreliert waren (Kuramoto et al., 2002).
Der Erfolg von DLI bei der CML und die Erkenntnis, dass T Zellen chemoresistente CMLBlasten und Zelllinien des Multiplen Myeloms eliminieren können, haben die Bemühungen
verstärkt, immuntherapeutische Ansätze gegen hämatologische Krankheiten zu entwickeln.
Um dem Phänomen des Immune escape entgegenzuwirken, müssen Strategien entwickelt
werden, die speziell die Strukturen von malignen Zellen angreifen, die das Überleben und das
Wachstum von Tumorzellen steuern. Die meisten Tumoren haben solche Strukturen,
beispielsweise antiapoptotische Moleküle, die die Apoptose auslösende Caspasen-Kaskade
inhibieren. Andersen et al zeigten, dass tumorspezifische CTLs in der Lage sind, Mcl-1
Peptide zu erkennen und eine Immunreaktion auszulösen (Andersen et al., 2005). Diese
Reaktion konnte auch für andere Mitglieder der Bcl-2 Familie bewiesen werden, was zeigt,
dass eine Immunantwort gegen antiapoptotische Moleküle induzierbar ist und diese
interessante Ziele für adoptive Immuntherapien sein können. Mitglieder der Bcl-2 Familie
sind auch für Resistenzen gegenüber Chemotherapeutika verantwortlich, so dass künftig eine
68
Kombination von zytotoxischen Medikamenten und Immunotherapien, die die Bcl-2 Familie
beeinflussen, die Effektivität der Therapie von malignen Erkrankungen verbessern könnte.
In klinischen Studien wurden bereits Mcl-1 spezifische Vakkzine bei AML Patienten getestet.
So konnte nachgewiesen werden, dass Tumorpatienten spontane T-Zell Antworten gegen
Mcl-1 Peptide entwickeln können. Eine starke Reaktion Mcl-1 spezifischer CTL konnte
mittels des spezifischen IFNγ Elispot assay bei CLL, Melanom, Pankreas-CA und MammaCA Patienten nachgewiesen werden (Sorensen et al., 2006). In Versuchen mit Mcl-1
spezifischen CTL und angereicherten AML-Blasten wurden AML-Blasten in vitro effektiv
lysiert (Andersen et al., 2008). Da Mcl-1 in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert wird,
scheint es ein effektiver Mechanismus von malignen Zellen zu sein, um einer Elimination
durch das Immunsystem zu entgehen. Gleichzeitig lassen die Ergebnisse der Studien
Hoffnungen keimen, wirksame Therapien zu entwickeln.
4.3.2 FLIPL
CTL können ihre Zielzellen über zwei verschiedene Mechanismen angreifen. Zum einen über
Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche, zum anderen über die Freisetzung zytolytischer
Granula. In Vivo konnte die Apoptoseinduktion über Todesrezeptoren durch das
rezeptornahe, antiapoptotische Protein c-FLIP inhibiert werden. c-FLIP kann allerdings nur
die über Todesrezeptoren vermittelte Apoptose inhibieren, auf die Apoptoseinduktion über
GrB/Perforin hat es keinen Einfluss (Medema et al., 1999). c-FLIP wird in verschiedenen
Melanomen, Kolon- und Zervix-Karzinomen überexprimiert (Medema et al., 2001). Aber
nicht nur c-FLIP kann Tumore vor der Lyse durch Todesrezeptoren schützen. Auch die
verminderte Expression oder Mutation von Todesrezeptoren, sowie die Mutation der
Caspase8 kann Zellen vor einer Lyse schützen. Als weiterer antiapoptotischer Mechanismus
wurde von Mohr die Expression der Caspase8L diskutiert, einer antiapoptotischen SpliceVariante der Caspase8, welche in humanen CD34+ Stammzellen und AML-(FAB-M0), sowie
ALL-Blasten nachgewiesen werden konnte (Mohr et al., 2005a). In humanen CD34+
Stammzellen konnte FLIP stark exprimiert auf Proteinebene nachgewiesen werden (Heeje et
al., 2002).
Auf proteinbiochemischer Ebene konnten bisher zwei Splicevarianten nachgewiesen werden.
Die kurze Form, FLIPs, konnte in diesen Versuchen bei keinem der AML-Patienten detektiert
werden. Nachgewiesen wurde FLIPs bei Patienten mit MDS, bei welchen eine Korrelation
zwischen des Level der FLIPs Expression in CD34+ Knochenmarkszellen und der
Apoptoserate hergestellt werden konnte (Benesch et al., 2003).
69
In eigenen Ergebnissen konnte FLIPL bei AML Patienten nachgewiesen werden, jedoch
zeigten sich generell schwache Expressionslevel. Konstitutiv zeigten 72% der Patienten eine
schwache FLIPL Expression. Die Stimulation mit IFNγ zeigte bei 2 Patienten verstärkte FLIPL
Level. Ein Zusammenhang zwischen der FLIPL Expression und der Apoptoserate der AMLBlasten konnte nicht nachgewiesen werden.
Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von Kirchoff, die vermuten, dass eine DISC
assoziierte Caspase8 Aktivität invers mit dem FLIPs Level korreliert. Dies würde bedeuten,
dass hohe FLIPs Level zu erniedrigten Apoptoseraten führen können. Ein Vergleich zwischen
den FLIPL Level von MDS Patienten und AML Patienten zeigte keine Unterschiede.
Kontrovers diskutiert wird seit Jahren auch eine Caspase8 aktivierende Funktion von FLIP L.
Vermutet wird, dass FLIPL sowohl anti- als auch proapoptotische Wirkungen haben kann,
abhängig von der Expressionsstärke (Chang et al., 2002, Benesch et al., 2003).
Auch in Zelllinien, die quantitativ untersucht wurden, wurde c-FLIP nur in geringer Menge
nachgewiesen. Stimulierung ruhender peripherer T-Zellen führt zur vermehrten Expression
von IL-2 und CD95, trotzdem sind die T-Zellen in diesem Stadium gegen CD95 vermittelte
Apoptose resistent. Nach IL-2 Kultur entwickeln T-Zellen am Tag 6 einen Apoptose
sensitiven Phänotyp. Bei unveränderter CD95 Expression, muss die Apoptose-Resistenz am
Tag 1 durch Blockierung des CD95 Signalweges erfolgen. Als Inhibitor wurde c-FLIP
diskutiert, wobei die Menge an FLIP an Tag1 und Tag6 unverändert blieb (Scaffidi et al.,
1999).
4.3.3 PI-9
Erstmals konnte gezeigt werden, dass auch AML-Blasten den GranzymeB Inhibitor PI-9
exprimieren. Da GranzymeB das wichtigste Effektormolekül der CTL-vermittelten Zelllyse
ist, kann die Expression des physiologischen Inhibitors Zellen vor einer Elimination durch das
Immunsystem schützen. Bei der AML ist dies von besonderem
Interesse, da
Hochrisikopatienten häufig mit einer Stammzelltransplantation behandelt werden, und die im
Körper verbliebenen Blasten dabei Ziel von zytolytischen Zellen sein sollen. Nach einer
allogenen Stammzelltransplantation sind die Effektivität von CTL und NK Zellen enorm
wichtig für die Kontrolle der Krankheit. Der durch diese Zellen vermittelte GvL Effekt ist
abhängig von der Sensitivität der Zielzellen für Granzyme B und Perforin und dem Verhältnis
zwischen CTL/Zielzellen.
PI-9 dient zum einem dem Selbstschutz (NK und CTL), zum anderen als Schutz vor Lyse bei
Antigenpräsentation (DC) und vor Lyse durch ungerichtet freigesetztes Granzyme B
70
((Bladergroen et al., 2001), (Buzza et al., 2001), (Hirst et al., 2001)). Die Überexpression von
PI-9 in Tiermodellen hat eine verminderte Tumorabstoßung zur Folge (Medema et al., 2001).
Tumorzellen die PI-9 exprimieren und zusätzlich gegen CD95 vermittelte Apoptose resistent
sind, sind gegen einen Angriff von CTLs geschützt. Die alleinige Expression von PI-9 reicht
aber nicht aus, um maligne Zellen auch vor der Apoptoseinduktion über Todesrezeptoren zu
schützen. PI-9 wurde bei soliden Tumoren (van Houdt et al., 2005) und lymphatischen
Malignomen detektiert ((Bladergroen et al., 2002), (ten Berge et al., 2002), (Classen et al.,
2004)). Die Expression von PI-9 in gesundem, somatischem Gewebe kann hauptsächlich in
Lymphgewebe, immunprivilegierten Organen und T-Lymphozyten beobachtet werden, was
vermuten lässt, dass die Expression in diesen Geweben Zellen vor endogenem oder
missgerichtetem GrB schützt.
Die Expression von PI-9 wird am stärksten durch Östrogene induziert, aber auch
Glucokortikoide und proinflammatorische Moleküle wie IL-1ß und TNFα sowie LPS
verstärken die Expression des Inhibitors ((Kanamori et al., 2000), (Kannan-Thulasiraman and
Shapiro, 2002)). Barrie et al (2004) zeigten erstmals, dass antivirale Zytokine wie IFNγ und
IFNα die Expression von PI-9 bei humanen Hepatozyten induzieren können. Weiterhin ist
IFNγ, wie auch andere proinflammatorische Moleküle wie Il-1ß und TNFα, ein zentrales
Molekül des initialen Zytokinsturms bei der Entwicklung einer GvHD nach allogener KMT.
Da AML-Patienten häufig mit einer Stammzelltransplantation behandelt werden und eine
GvHD entwickeln, war der Einfluss von inflammatorischen Zytokinen wie IFNγ auf die
AML-Blasten von besonderem Interesse. In den hier durchgeführten Western Blot Analysen
waren konstitutiv 78% der untersuchten AML-Patienten positiv für PI-9. Sowohl Patienten
mit einer neu diagnostizierten, als auch Patienten mit einem AML Rezidiv exprimieren
konstitutiv den GranzymeB Inhibitor. Nachdem die Regulation von PI-9 bereits durch
verschiedene Zytokine und Moleküle gezeigt wurde, scheint prinzipiell die Expression von
PI-9 auch bei AML-Blasten durch IFNγ regulierbar zu sein. Drei Patienten, die zum Zeitpunkt
t0 entweder negativ oder positiv waren, reagierten auf die Stimulation mit IFNγ mit einer
deutlich verstärkten oder de novo Expression von PI-9. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass
lediglich drei von 18 Patienten zu allen untersuchten Zeitpunkten kein PI-9 exprimierten und
diese Patienten eine neu diagnostizierte AML aufweisen (M1/M2). Neben denjenigen
Patienten, die auf die IFNγ Stimulation nicht mit einer vermehrten Expression reagierten,
waren zwei Patienten, die PI-9 nach 24h Kultur spontan hochregulierten.
Die Anzahl der in diesen Versuchen eingesetzten AML-Patienten ist zu gering, um daraus
Folgerungen zu ziehen. Die Tatsache, dass AML-Blasten PI-9 konstitutiv exprimieren ist
71
jedoch eindeutig. In größeren Fallstudien muss nun untersucht werden, ob es einen
Zusammenhang zwischen der Expression von PI-9 und der FAB-Subgruppe der AML,
zwischen der PI-9 Expression bei Erstdiagnose und im Rezidiv oder auch zwischen dem
Therapieregime und der PI-9 Expression gibt. In weiteren Versuchen soll geklärt werden, wie
sich die Expression von PI-9 bei Patienten im Laufe der Krankheit verändert. Denkbar wäre
eine Hochregulation von PI-9 als Reaktion der Blasten auf eine Chemotherapie oder
Stammzelltransplantation. Auch der Einfluss weiterer inflammatorischer Zytokine auf die PI9 Expression bei AML-Blasten ist von Interesse. Kokulturen von leukämiespezifischen CTLs
und PI-9+ AML-Blasten könnten Aufschluss darüber geben, ob PI-9+ Blasten im Vergleich
zu PI-9- tatsächlich gegenüber einer Lyse durch CTLs resistenter sind. Denkbar wäre auch
eine Inaktivierung von PI-9 durch bisher unbekannte Moleküle oder Granzyme M (Mahrus et
al., 2004). PI-9+ Lymphomzelllinien und primäre Lymphomzellen sind trotz der Expression
von PI-9 sensitiv für die Lyse durch CTL und NK-Zellen, was durch einen veränderten Inhalt
zytotoxischer Granula und eine mögliche Inaktivierung durch Granzyme M verursacht sein
könnte (Godal et al., 2006).
Horie et al untersuchten die Expression von PI-9 und Granzyme B auf mRNA Ebene bei
Patienten nach einer Stammzelltransplantation. Überraschend zeigte sich, dass Patienten mit
einer GvHD nach der Transplantation erhöhte Granzyme B, aber verminderte PI-9 Level
hatten. Verminderter PI-9 Gehalt führt zu höherer Sensitivität gegenüber GrB und Perforin,
wodurch möglicherweise schwerere GvhD Reaktionen auftreten können (Horie et al., 2005).
Die Expression von PI-9 in menschlichen Tumoren wird seit einiger Zeit als möglicher
Immune escape Mechanismus diskutiert. Wie bereits erwähnt, kann PI-9 durch eine Vielzahl
von Zytokinen reguliert werden. Für die AML ist IFNγ von besonderer Bedeutung, da es bei
der nach einer Stammzelltransplantation auftretenden GvhD in großem Maße freigesetzt wird
und für den sogenannten Zytokinsturm mitverantwortlich ist. Wie in diesen Versuchen
gezeigt werden konnte, ist PI-9 prinzipiell sensibel für eine Regulation durch IFNγ. Eine
Hochregulation von PI-9 während des Zytokinsturms nach einer Stammzelltransplantation
kann den im Körper verbliebenen Blasten helfen, sich vor dem Immunsystem zu schützen.
Durch die fehlende Elimination durch CTL können sich die PI-9 positiven Blasten erneut
vermehren und zu einem resistenten AML-Rezidiv führen. Dieser Mechanismus kann
demzufolge als Immune escape Mechanismus genutzt werden.
72
4.4 Zytokin Sekretion durch AML-Blasten
4.4.1 Sekretion pro-inflammatorischer Moleküle durch AML-Blasten
4.4.1.1 IL-1beta
IL-1beta ist ein wichtiges Molekül für die Proliferation von AML-Blasten. In Versuchen mit
AML-Blasten, bzw. myeloischen Zelllinien konnte gezeigt werden, dass durch eine Inhibiton
des IL-1beta converting enzyme (ICE), welches normalerweise IL-1 aktiviert, die IL-1beta
Produktion dosisabhängig verringert wurde, was möglicherweise eine verminderte
Blastenproliferation zur Folge haben könnte (Estrov et al., 1995). In einer Studie an CML
Zellen zeigte die Inkubation mit IL-1ß keinen antiapoptotischen Effekt (Gisslinger et al.,
1997), allerdings konnte bei Blasten von CML Patienten hohe intrazelluläre IL-1ß Level
nachgewiesen werden. Bei gleichzeitig gering ausgeprägter IL-1ß Rezeptor Expression
konnte die Störung der endogenen Balance zwischen endogenen Zytokin Agonisten und
Antagonisten bei fortgeschrittenem Krankheitstadium nachgewiesen und mit einem
schlechten Langzeitüberleben assoziiert (Kurzrock, 2001). Tao et al zeigten, dass AML Zellen
höhere IL-1beta Proteinlevel als normale Zellen enthalten und vermuten, dass die Imbalance
der Zytokinexpression zu dem abnormen Verhalten der Leukämiezellen beiträgt (Tao et al.,
2000).
In eigenen Versuchen konnte die Sekretion von IL-1ß durch Blasten von AML Patienten in 14
von 18 untersuchten Proben nachgewiesen werden. Lediglich vier Patienten (P4b, P4c, P2,
P5) zeigten keine spontane IL-1ß Produktion. Interessanterweise konnte aber bei diesen
Patienten nach IFNγ Stimulation eine IL-1ß Freisetzung beobachtet werden. Die mit IFNγ
inkubierten Ansätze zeigten mit Ausnahme von drei Patienten (16%) (P8b, P10, P14) eine IL1ß Freisetzung. Insgesamt reagierten sieben Patienten (37%) auf die IFNγ Stimulation mit
einer mehr als 20% höheren IL-1ß Sekretion, während fünf Patienten (28%) mit einer um
mehr als 20% verminderten Sekretion antworteten.
4.4.1.2 IL-6
Neben den bekannten physiologischen Funktionen wie zum Beispiel der Induktion der
Immunglobulinproduktion von aktivierten B Zellen, ist IL-6 auch an der Differenzierung von
Leukämie-Zellen beteiligt (Duits et al., 1992). Tumorzellen von Patienten mit Multiplem
Myelom sind in der Lage IL-6 zu sezernieren. Zusätzlich wurde gezeigt, dass anti-IL-6Antikörper das Wachstum dieser Zellen inhibieren (Zhou et al., 2005). Bei Hodgkin und NonHodgkin Lymphomen wurde beobachtet, dass die IL-6 Level bei Erstdiagnose und Rezidiv
73
erhöht waren und dass diese vermehrte IL-6 Sekretion mit etablierten prognostischen
Faktoren korrelierte (Kurzrock, 2001). Bei der CLL konnten erhöhte IL-6 Level mit
fortschreitendem Krankheitverlauf beobachtet werden und wurden sogar als prognostischer
Marker diskutiert. Auch von soliden Tumoren wie dem Nierenzellkarzinom wurde berichtet,
dass die malignen Zellen IL-6 freisetzen, welches die Differenzierung von myeloischen
Vorläuferzellen in DCs inhibiert (Kusmartsev and Gabrilovich, 2006). Menetrier-Caux et al
konnten zeigen, dass Tumorzelllienen hohe Konzentrationen von IL-6 produzieren und dieses
die Differenzierung von CD34+ Progenitorzellen hemmt. Aufgehoben werden kann dieser
Effekt durch den Einsatz von anti-IL-6 Antikörpern (Menetrier-Caux et al., 1998). IL-6
fördert auch die durch G-CSF mobilisierte Freisetzung von Stammzellen aus dem
Knochenmark. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Stromazellen von MDS Patienten große
Mengen an IL-6 und TNF-L freisetzen (Manakova et al., 2001). Eine spontane Sekretion von
IL-6 nach 24h Kultur konnte bei acht von 19 Patienten nachgewiesen werden. Dabei zeigten
vor allem zwei Patienten (P11, P12) auffallend hohe Werte. Zwei Patienten (P11, P21)
reagierten auf die Stimulation mit IFNγ mit einer vermehrten IL-6 Sekretion, ein Patient (P19)
mit einer verminderten und vier Patienten zeigten unveränderte IL-6 Level.
4.4.1.3 IL-12p70
IL-12p70 ist ein proinflammatorisches Zytokin, welches die Produktion und Freisetzung von
IFNγ bewirkt, wichtig ist für die Differenzierung von CD4+ T Zellen in T1-Helfer-Zellen,
welche wiederum IFNγ produzieren und die Zell-vermittelte Immunität beeinflussen und
somit das angeborene mit dem erworbenen Immunsystem verbinden. Eine Sekretion von IL12p70 konnte bei keinem der untersuchten Patienten nachgewiesen werden. Aus der Literatur
ist bekannt, dass IL-12 signifikant die Zytotoxizität von Mononukleären Zellen erhöht und die
Anzahl leukämischer Zellen bei MDS Patienten vermindert. Ebenso konnte dies bei Patienten
mit CML und AML in kompletter Remission beobachtet werten (Pan et al., 2000). Falls diese
Ergebnisse in weiteren Untersuchungen bestätigt werden könnten und IL-12p70 das
Wachstum von Tumorzellen verlangsamen oder gar verhindern könnte, wäre dies ein Ansatz,
um beispielsweise nach einer erfolgreichen Tumortherapie im Körper verbliebenen maligne
Zellklone zu reduzieren.
74
4.4.1.4 TNF-α
Überschiessende
TNF
Freisetzung
bewirkt
im
Körper
massive
immunologische
Veränderungen, welche zu einer starken Zytokinfreisetzung und zum SIRS führen können.
Bei malignen hämatologischen Erkrankungen konnte eine vermehrte Expression von TNF-α
in Knochenmarkbiopsien von MDS-Patienten (Stifter et al., 2005) und im Serum von B-CLL
und an Haarzellleukämie erkrankten Patienten nachgewiesen werden (Foa et al., 1990).
Ebenso wurde bei MDS Patienten eine TNF-α Produktion durch Stromazellen nachgewiesen
(Moqattash and Lutton, 2004). Der Einsatz von TNF-α Blockern zur Behandlung
rheumatologischer Krankheiten oder chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist bereits
möglich.
Die Sekretion von TNF-α konnte bei drei Patienten nach 24h Kultur beobachtet werden.
Dabei wies ein Patient (P12) eine starke Sekretion auf, während zwei Patienten (P19, P11)
deutlich niedrigere Werte zeigten. Bei diesen Patienten bewirkte die Stimulation mit IFNγ im
Vergleich zur 24h Kultur eine um mehr als 20% vermehrte TNF-α Freisetzung. Die Sekretion
von TNF-α durch AML-Blasten konnte auf niedrigem Level bereits von Schulz et al
nachgewiesen werden (Schulz et al., 2001).
4.4.1.5 IL-8
Il-8 wirkt regulierend auf die Angiogenese von Tumorzellen und das Zellwachstum, die
Leukozyteninfiltration und modifiziert dadurch auch die Immunantwort gegen maligne
Zellen. Die Interaktion zwischen Tumor- und Stromazellen kann zu einer IL-8 Sekretion
führen, was wiederum durch die angiogenetische und chemotaktische Wirkung zur
Progression von humanen Tumoren beitragen kann.
In der Literatur wurde über die Sekretion von IL-8 durch AML Blasten und die Expression
auf mRNA Ebene bereits 1993 berichtet (Tobler et al., 1993). Auch bei der pädiatrischen
AML wurde eine IL-8 Expression auf Proteinebene nachgewiesen. Vor allem monozytäre
AML Subgruppen (M4, M5) sezernieren große Mengen IL-8 (de Bont et al., 2001).
Interessanterweise metastasieren Blasten der AML-M4 und M5 häufig in nichthämatologischen Geweben, was mit Apoptoseresistenz und der Fähigkeit Endothelgrenzen zu
durchbrechen verbunden ist (Vinante et al., 1996, Vinante et al., 1993). In Kokulturen von
AML Blasten und Stromazellen, bzw. Fibroblastenzelllinien zeigte sich eine vermehrte IL-8
Freisetzung und Proliferation, sowie eine verminderte Apoptoserate der Leukämiezellen. Die
IL-8 Sekretion durch AML Blasten konnten aber auch durch die Zugabe von IL-3, SCF, und
GM-CSF erhöht werden (Ryningen et al., 2005).
75
Über den Einfluss von IFNγ auf die Sekretion von IL-8 durch AML Blasten ist bisher nichts
bekannt. Ersvaer et al zeigten, dass IFNγ in Gegenwart von AML Blasten sezerniert werden
kann und die Zellproliferation, die Apoptoseregulation und die Balance zwischen pro- und
antiangiogenetischer Chemokin Freisetzung beeinflusst (Ersvaer et al., 2007).
In dieser Untersuchung konnte die Sekretion von IL-8 durch AML-Blasten bei 17 von 18
Patienten bestätigt werden. Die Stimulation mit IFNγ bewirkte keine vermehrte Sekretion von
IL-8. Bei 50% der Patienten konnten nach IFNγ Stimulation unveränderte IL-8 Level
nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten ebenfalls 50% der Patienten nach IFNγ
Stimulation eine um mehr als 20% verringerte IL-8 Sekretion.
4.4.2 Sekretion des anti-inflammatorischen Moleküls IL-10 durch AMLBlasten
IL-10 reguliert Wachstum und Differenzierung von B-Zellen, NK-Zellen, T-Zellen,
Mastzellen, und Granulozyten (Asadullah et al., 2003). Auf Melanomzellen konnte eine 50%
verminderte HLA-Klasse I Expression nach IL-10 Behandlung nachgewiesen werden
(Asadullah et al., 2003).
Hohe systemische IL-10 Konzentrationen konnten sowohl in verschiedenen Tumorentitäten
als auch in tumorinfiltrierenden Lymphozyten nachgewiesen werden (Zhou et al., 2005). Bei
malignen hämatologischen Erkrankungen wurde der Einfluss von IL-10 bisher hauptsächlich
in B-CLL und T-Zell Leukämien überprüft. Bei der B-CLL scheint IL-10 die Proliferation
und Differenzierung der Blasten, sowie die Apoptose zu inhibieren (Jurlander et al., 1997),
(Mori et al., 1996). Eine Behandlung mit IL-10 in vitro konnte verschiedene Tumorzellen wie
Melanom- und Lymphomzellen in einen CTL resistenten Phänotyp verwandeln. Die
Inhibition der IL-10 Produktion durch T-Zellen oder maligne Zellen führte in Tumormodellen
zu einer verbesserten tumorspezifischen Immunabwehr (Mocellin et al., 2005).
Ein potentieller Immune escape Mechanismus könnte deshalb die Produktion von IL-10 durch
die leukämischen Blasten sein. Als einziges immunsuppressives Zytokin wurde IL-10 in den
Überständen der AML-Zellen untersucht. Lediglich bei einem Patienten (P12) konnte IL-10
nach 24h Kultur im Überstand nachgewiesen werden. Auch nach Stimulation mit IFNγ
konnte bei keinem Patienten eine IL-10 Sekretion nachgewiesen werden, wobei bei Patient
P12 der Vergleichswert nach IFNγ Stimulation fehlt. Der negative Nachweis von IL-10 im
Überstand stimmt mit den Ergebnissen von Buggins überein, die eine immunsuppressive
Wirkung des Überstandes von AML-Blasten auf T-Zellen zeigen konnten, obwohl die
inhibitorischen Faktoren IL-10, VEGF und TGF-ß im Überstand nicht nachgewiesen werden
76
konnte (Buggins et al., 2001). Auch diese Ergebnisse lassen vermuten, dass bei der AML die
Sekretion von IL-10 nicht direkt genutzt wird, um eine Tumorabwehr zu verhindern, sondern
dass möglicherweise weitere immunsuppressive Faktoren von den Blasten sezerniert werden.
Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Studien, die eine IL-10 Sekretion und Expression
auf mRNA Ebene nachweisen konnten. So konnte Schulz bei einem Patienten mit hohem
zirkulierendem IL-10 Level beobachten, dass DLI Gaben keinen antileukämischen Effekt
zeigten (Schulz et al., 2001).
Weitere Untersuchungen werden nötig sein, um genauere Informationen über die
Interaktionen zwischen Tumorzellen und dem umgebenden Microenvironment, vor allem
über deren molekulare Signaltransduktion, zu bekommen. Durch ein besseres Verständnis
dieser Zusammenhänge wird es vielleicht möglich sein, neue spezifische Therapien zu
entwickeln
und
bestehende
chemotherapeutische
Möglichkeiten
mit
spezifischen
Immuntherapien zu kombinieren.
4.4.3 Bedeutung der Sekretion von Zytokinen durch AML-Blasten
Durch intensive Forschungsarbeiten konnten in den letzten Jahren tiefere Einblicke
hinsichtlich der Wirkung und Wechselwirkung von Zytokinen, ihren Rezeptoren und deren
Einfluss auf fein regulierte Mechanismen des Immunsystems gewonnen werden. Auch die
komplexen Interaktionen zwischen der Regulation von Differenzierungsvorgängen wie der
Hämatopoese einerseits und der Entwicklung hämatologischer Krankheiten andererseits
werden zunehmend aufgeklärt. So sind heute bereits Zytokin-Inhibitoren bei der Behandlung
von Autoimmun- oder chronisch entzündlichen Erkrankungen eine wichtige Therapieoption.
Über die Sekretion von Zytokinen durch AML-Blasten ist bisher wenig bekannt. Sicher ist
jedoch, dass das Zytokinnetzwerk einen großen Einfluss auf die Differenzierung von
Tumorzellen und das Tumormilieu nimmt. Viele Immundefekte und auch das schlechte
Ansprechen von adoptiven Immuntherapien können möglicherweise durch das von den
malignen Zellen generierte immunsuppressive Microenvironment erklärt werden, welches
sich deutlich von dem physiologischen, durch APCs geschaffene unterscheidet. In Studien
konnte der immunsuppressive Einfluss des Überstandes von malignen Zellen auf die Reifung
und Differenzierung von DCs nachgewiesen werden (Menetrier-Caux et al., 1998). Um sich
dem Immunsystem zu entziehen, produzieren Tumore TGF-ß, IL-10, Prostaglandin E2 und
Membran gebundene Moleküle wie TRAIL, FAS, CTLA-4 (Blank and Mackensen, 2007).
In vitro konnte gezeigt werden, dass Überstände von AML-Kulturen das T Zell Wachstum
supprimieren und somit eine Art Immunsuppression bewirken. Zwei wesentliche Effekte
77
konnten beobachtet werden. Zum einen wird die Produktion von TH1 Zytokinen inhibiert,
zum anderen scheint auch der Eintritt in den Zellzyklus inhibiert zu werden. Überstände der
Zelllinie U937 (Buggins et al., 1999) und primärer AML-Blasten (Buggins et al., 2001)
inhibieren die Antigen Präsentation und die Freisetzung von IFNγ und IL-2 durch T Zellen in
Kokulturen.
Um Zytokine erfolgreich in vivo in der Behandlung von Leukämien einzusetzen, müssen
einige Schwierigkeiten ausgeräumt werden. Ziel jeglicher Therapie ist es, möglichst selektiv
auf maligne Zellen einzuwirken. Erschwert wird dieses Ziel zum einen durch die pleiotrophe
Wirkung von Zytokinen, zum anderen durch die Vielzahl von Zellen, die in der Lage sind
Zytokine zu sezernieren und auf deren Stimulus hin zu reagieren. Hinzu kommt, dass maligne
Zellen physiologische Zytokine nutzen, um das Immunsystem zu beeinflussen. Eine Blockade
dieser Zytokine könnte also auch die Differenzierung und Regulierung physiologischer
Vorgänge wie die Blutbildung beeinflussen. Kürzlich wurde gezeigt, dass Stromazellen und
Makrophagen von MDS Patienten im Vergleich zu Zellen von gesunden Spendern, signifikant
höhere Mengen an TNF-α und IL-6 produzieren (Manakova et al., 2001).
Ein möglicher antileukämischer Mechanismus wäre die Freisetzung von antiproliferierenden,
proapoptotischen oder antiangionetischen Zytokinen. Normale T Zellen können in Gegenwart
von AML Zellen aktiviert werden, IFNγ freisetzen und dadurch die AML Proliferation, die
Apoptoseregulation und die Balance zwischen pro- und antiangionetischen Chemokinen
beeinflussen. Zusätzlich erhöhte IFNγ die Stress-induzierte, spontane in vitro Apoptose
(Ersvaer et al., 2007).
In der Therapie von Tumorerkrankungen ruhen Hoffnungen auf der immunmodulatorischen
Wirkung von Zytokinen. Ziel eines Einsatzes von Zytokinen können die Stimulation der
körpereigenen Abwehr maligner Zellen sein oder die Inhibition der Proliferation bzw.
Förderung der Apoptosesensitivität der malignen Zellen. Ziel von Vakkzinationsversuchen
oder der in vitro Stimulation von spezifischen CTLs mit anschließendem Transfer ist, über die
T-Zellaktivierung eine wirksame Abwehrreaktion gegen maligne Zellen auszulösen.
Vermutlich ändern sich die Expressionsmuster von Zytokinen auch im Verlauf einer
Tumorerkrankung. Denkbar wäre bei rezidivierenden Krankheiten eine verminderte
Sensibilität und Unabhängigkeit gegenüber Wachstumsfaktoren.
Zytokine spielen eine wichtige Rolle in der Entstehung der GvHD nach einer
Stammzelltransplantation. Der ungewöhnliche Befall von GvHD Organen wie Haut, Darm
und Leber wird nur unzureichend durch die systemische Freisetzung von Zytokinen erklärt.
Bei einer rein durch sytemische Zytokin Wirkung verursachten GvHD müssten auch viszerale
78
Organe wie beispielsweise die Nieren betroffen sein. Als Beispiel seien Beobachtungen
genannt, in denen die systemische Gabe von TNF-α und IL-1 keine lymphomononukleäre
Zellinfiltration, wie bei der GvHD beobachtet, auslöst (Hill and Ferrara, 2000).
Der Einsatz von Zytokinen in der Behandlung der AML bleibt kontrovers. Abzuwägen bleibt
der Nutzen gegenüber den zu erwartenden negativen Einflüssen. Dennoch können Zytokine
möglicherweise adjuvant eingesetzt werden, um maligne Zellen für folgende Chemotherapien
zu sensibilisieren.
79
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6 Danksagung
An dieser Stelle gilt mein ganz besonderer Dank Herrn Professor Andreas Mackensen für die
Überlassung des Themas, das Vertrauen und die geduldige, tatkräftige Unterstützung während
meiner Arbeit im Labor und an dieser Arbeit.
Für die Einarbeitung in die Thematik und die grundlegenden Analysemethoden danke ich
Frau Sabine Hoves. Dem gesamten Team des Labores der Hämatolgie/Onkologie danke ich
für die aufmunternden Worte, zahlreichen Kaffeepausen, kritischen Anmerkungen und
Hilfestellungen bei alltäglichen Problemen.
Vielen Dank auch an meine Eltern, Martin, meine Freunde Paula, Tina und Christian, sowie
meinen Bruder Jürgen für eure Unterstützung, aufbauenden Worte und zahlreichen
Telefonate.
95
7 Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AG
Antigen
Allo
Allogen
AML
Akute myeloische Leukämie
APC
Antigen presenting cell
ATRA
All-Trans-Retinolsäure
Auto
Autolog
Bak
Bcl-2 homologous antagonist killer
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
CD
Cluster of differentiation
CML
Chronisch myeloische Leukämie
CTL
zytotoxische T-Zelle
CTLA-4
CTL-associated protein-4
DC
Dendritische Zelle
DED
Death effector domain
DISC
Death-inducing signaling complex
DLI
Donorlymphozyteninfusion
DMSO
Dimethylsulfoxid
ED
Erstdiagnose
EDTA
Ethylendiamin-tetraacetat
FAB
French-American-British-Klassifikation
FACS
Fluorescent-activated cell sorter
FADD
Fas-associated death domain
FasL
Fas Ligand
FC
Forward scatter
FCS
Fetal calf serum
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
FLIP
FLICE (Fas-associated
death-domain-like IL-1beta-converting
enzyme)-inhibitory protein
G-CSF
Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor
GvHD
Graft-versus-Host disease
GvL
Graft-versus-Leukämie
96
HCC
Hepatozelluläres Karzinom
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
HSA
Humanes Serum Albumin
HSC
Hämatopoetische Stammzelle
IFNγ
Interferon gamma
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IL-10
Interleukin-10
IL-12p70
Interleukin-12p70
IL-6
Interleukin-6
IL-8
Interleukin-8
kD
Kilo-Dalton
LDH
Laktatdehydrogenase
LPS
Lipopolysaccharid
MACS
Magnetic cell sorting
MDS
Myelodysplastisches Syndrom
m-RNA
Messenger-Ribonukleinsäure
NK-Zelle
Natürliche Killerzelle
PBL
Periphere Blutlymphozyten
PBS
Phosphat gepufferte Saline
PBSC
Periphere Blutstammzellen
PD-L1
Programmed Death Receptor Ligand-1
PD-L2
Programmed Death Receptor Ligand-2
PE
Phycoerythrin
PI
Propidiumjodid
PI-9
Proteinase Inhibitor 9
R
Rezidiv
sFasL
Löslicher Fas Ligand
SSC
Sideward scatter
SZT
Stammzelltransplantation
TCR
T cell receptor
TGF-ß
Transforming growth factor-ß
TH1
T-Helferzelle 1
TNF-α
Tumor Nekrose Faktor-α
97
TRAIL
TNF-related apoptosis inducing ligand
U
Unit (Einheit)
ug/ul
Mikrogramm/Mikroliter
UPM
Umdrehungen pro Minute
VEGF
Vascular endothelial growth factor