Epirubicin-, CD95-vermittelte Apoptoseinduktion bei der
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Abteilung Innere Medizin III Universität Ulm Ärztlicher Direktor: Professor Dr. med. Hartmut Döhner Epirubicin/CD95-vermittelte Apoptoseinduktion bei der chronischen lymphatischen Leukämie der B-Zell-Reihe Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Vorgelegt von Manuela Wölfle Wertingen 2005 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. H. Döhner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Th. Gress Tag der Promotion: 08. Juli 2005 Inhaltverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung V 1 1.1 Chronische lymphatische Leukämie 1 1.2 Apoptose 4 1.3 Bcl-2 und Bax 6 1.4 CD95-Rezeptor/Ligandsystem 7 1.5 Chemotherapie und verschiedene Zytostatika 9 1.6 Zielsetzung der Doktorarbeit 11 2 Material und Methoden 12 2.1 Material 12 2.2 Patienten 15 2.3 Zellbiologische Methoden 17 2.4 FACS-Analysen 19 2.5 Molekularbiologische Methoden 23 2.6 Statistik 27 3 Ergebnisse 3.1 Zytotoxizität von Epirubicin gegenüber B-CLL-Zellen 28 28 3.2 Bcl-2- und Bax-Expression bei B-CLL-Lymphozyten unter Epirubicin-Inkubation 34 3.3 CD95-Präsenz auf der Zelloberfläche von B-CLL-Zellen 36 3.4 Apoptoseinduktion 39 3.5 CD95-Signaltransduktionskaskade auf mRNA-Ebene 45 3.6 Apoptose-inhibierende Proteine 45 4 Diskussion 47 4.1 Epirubicin bei der B-CLL 48 4.2 CD95-Rezeptor- und Ligandensystem bei der B-CLL 52 5 Zusammenfassung 57 6 Literaturverzeichnis 59 Danksagung 75 V Abkürzungsverzeichnis A Ampere 7-AAD 7-Actinoaminomycin D A1 „Bcl-2 related protein A1“ Abb. Abbildung ADP Adenosin-5’-Diphosphat AIF Apoptose induzierender Faktor AK Antikörper Apaf-1 „apoptotic protease activating factor 1“ APO1 „surface antigen apoptosis 1” APS Ammoniumpersulfat ATM „Ataxia telangietasia mutated“ ATP Adenosin-5’-Triphosphat b Basen Bad „Bcl-2 antagonist of cell death” Bak „Bcl-2 antagonist killer 1“ Bax Bcl-2 assoziiertes X-Protein Bcl-2 B-Zell CLL/Lymphoma Protein 2 B-CLL Chronische lymphatische Leukämie der B-Zellreihe Bcl-xl „Bcl-2 related protein, long isoform” Bcl-xs „Bcl-2 related protein, short isoform” BID „BH3-interacting domain death agonist” BIRC „Baculovirus IAP repeat-containing protein” bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin °C Grad Celsius ca. Circa CD „Cluster of Differentiation” cDNA „complementary“ DNA CED-3/ICE „Caenorhabditid elegans gene-3/Interleukin-1-betaconverting enzyme” VI CEM humane Zelllinie einer T-Zellleukämie CHOP Kombinationschemotherapie aus Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin, Prednison CLL Chronische lymphatische Leukämie CO2 Kohlendioxid COP Kombinationschemotherapie aus Cyclophosphamid, Vincristin, Prednison dDNA double strang DNA DEPC Diethyl Pyrocarbonat d. h. das heißt DIABLO „direct IAP-binding protein with low pI” DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP 2’-Desoxynukleotid-5’-Triphosphat DTT Dithriolthreitol ECL Enhanced Chemoluminescence EDTA Ethylendiamin-Tetraesigsäure et al. und andere FACS „Fluorescence activating cell sorter” FADD „Fas-associated protein via death domain “ FAS „Fibroblast associated” FC-Antikörper Fragment „cristalline“ eines Antikörper FCS „Fetal calf serum“ FISH „Two-colour fluorescence in situ hybridization“ FITC Fluoresceinisothiocyanat FL1-3 Fluoreszenzspektren 1-3 FSC „forward scatter“ g Gramm ×g ×Erdbeschleunigung GAPD(H) Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase h Stunden VII HCL Hydrochlorid HL60 humane Zelllinie einer akuten myeloischen Leukämie H2O Wasser HRP „Horse-radish-Peroxidase“ IAP „Inhibitor of apoptosis“ Ig Immunglobulin IgG Immunglobulin-Klase G IgM Immunglobulin-Klasse M IL-2 Interleukin 2 iNOS induzierbare NO-Synthetase Jurkat humane Zelllinie einer akuten lymphatischen T-Zellleukämie K562 humane Zelllinie einer chronisch myeloischen Leukämie in Blastenkrise kb Kilobasen kD Kilodalton L Ligand l Liter L32 Ribosomales Protein L32 LD50 letale Dosis, bei der 50% der untersuchten Zellen sterben L-NAME Nω-Nitro-L-Arginine-Methyl-Esther-Hydrochlorid µ mikro (10-6) M Mol m milli (10-3) Mcl-1 „myeloid cell leukemia-1“ MFI mittlere Fluoreszenzintensität MgCl2 Magnesiumchlorid min Minuten MLV murines Leukemia Virus mRNA „messenger“ RNA n nano NaCl Natriumchlorid NHL Non-Hodgkin-Lymphom VIII nm Nano(10-9)-Meter NO „nitric oxide“ NOXA „Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1“ NP40 Nonidet 40 n.s. nicht signifikant OD Optische Dichte Oligo-dT Oligo-desoxy-Thymidin p piko (10-12) p kurzer Arm eines Chromosoms 32 P 32 Phosphor p53 Tumorprotein 53 PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese PARP Poly-ADP-Ribose-Polymerase Pat. Patient PBS phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerasekettenreaktion PDVF Polyvinylidin-Difluorid PE Phycoerythrin pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Konzentration PLA Phospholipase A PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PUMA „p53-upregulated modulator of apoptosis“ p-Wert „probability”-Wert q langer Arm eines Chromosoms RNA Ribonucleinsäure RPA RNase Protection Assay rpm Umdrehungen pro Minute RPMI-Medium Roswell Park Memorial Institute-Medium RT-PCR „reverse transcription“ PCR SAC Staphylococcus aureus Cowan I sDNA single strang DNA IX SDS Sodiumdodecylsulfat sIg surface Immunglobulin SMAC „second mitochondria-derived activator of caspase“ SSC „side scatter” Std. Stunden Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA T-CLL Chronische lymphatische Leukämie der T-Zellreihe TEMED Tetramethylethylendiamin TNF Tumor Nekrose Faktor TNFR I/II Tumor Nekrose Faktor Rezeptor I/II TP53 Tumorprotein 53 TRADD „TNFR associated death domain protein“ TRAF „TNFR-associated factor” Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U „unit” U937 humane Zelllinie eines histiozytischen Lymphoms u. a. unter anderem UI „unit international“ UV Ultraviolett V Volt v. a. vor allem VH variable Region der schweren Kette ZAP-70 zeta assoziiertes Protein mit 70 kD z. B. zum Beispiel < kleiner > größer 1 log 1 logarithmische Stufe α Alpha β Beta γ Gamma 1 Einleitung 1.1 Chronische lymphatische Leukämie 1.1.1 Epidemiologie Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie des Erwachsenen in der westlichen Welt (Harris et al. 1994). Sie hat in Europa und den USA einen Anteil von 25–30% an allen Leukämien, in Asien dagegen einen Anteil von 5% (Rozman u. Monserrat 1995). Es handelt sich dabei um ein niedrig-malignes, leukämisch verlaufendes Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) mit steigender Inzidenz in zunehmendem Lebensalter. In Deutschland liegt die Inzidenz bei 2-3/100000 Einwohner pro Jahr. Geschätzt treten in den USA z.B. etwa 8100 neue Fälle jährlich auf mit einer Prävalenz von etwa 50 000 bis 60 000 Patienten (Greenlee et al. 2000). Die CLL betrifft zumeist ältere Menschen, häufiger Männer als Frauen (2:1), mit einem Altersgipfel zwischen dem 60. und 65. Lebensjahr. Nur etwa 10% der Patienten sind jünger als 50 Jahre. 95% der Patienten erkranken an einer chronischen lymphatischen Leukämie der B-Zellreihe (BCLL), die chronische lymphatische Leukämie der T-Zellreihe (T-CLL) dagegen ist mit 2– 5% selten (Rozman u. Monserrat 1995). 1.1.2 Klinik Die Initialsymptomatik einer CLL verläuft uncharakteristisch und schleichend. Neben meist zervikalen Lymphknotenschwellungen bei 70-80% der Patienten (Hansen 1973) und einer Leukozytose sind unspezifische Allgemeinsymptome wie körperliche Schwäche, Müdigkeit und Leistungsminderung am häufigsten zu finden (Rai 2000). Durch die direkten Folgen der B-Zell-Akkumulation kann es zu Organkomplikationen wie HepatoSplenomegalie und Lymphadenopathie kommen (Cheson et al. 1988), deren Infiltrationsstärke in der Regel mit der Lymphozytose im peripheren Blut korreliert. Aus einer zunehmenden Knochenmarkinfiltration resultiert im Verlauf der Erkrankung eine Knochenmarkinsuffizienz mit sekundärer Thrombozytopenie, Anämie und Neutropenie, wodurch es in Kombination mit der systemischen Hypogammaglobulinämie zu zunehmender Infektanfälligkeit gegenüber viralen und bakteriellen Infekten kommt 1 Einleitung 2 (Molica 1994, Morrison 1998). Infektionen, insbesondere Pneumonie und Sepsis (Diehl et al. 1999), sowie Kachexie und Blutungen gelten als Haupttodesursachen (Hansen 1973). Nach den Empfehlungen der „National Cancer Institute-Sponsered Working Group“ wird zur Diagnosesicherung einer B-CLL eine anhaltende Blutlymphozytose >5x109/l, der durchflusszytometrische Nachweis eines B-CLL-spezifischen Immunphänotyps und eine Leichtkettenrestriktion der Oberflächenimmunglobuline Typ κ oder λ gefordert (Cheson et al. 1996). Immunphänotypisch zeigen charakteristische B-CLL-Zellen eine typische Koexpression von CD19/CD23 und CD19/CD5 und eine niedrige Expression von CD20 und Oberflächenimmunglobulinen (v.a. sIgM und/oder sIgD) (DiGuiseppe u. Borowitz 1998). 1.1.3 Prognosefaktoren Zu den prognostischen Faktoren bei der B-CLL gehören neben der Stadieneinteilung nach Rai oder Binet (Rai et al. 1975, Binet et al. 1981) die Lymphozytenverdopplungszeit (Galton 1966), der Infiltrationsgrad des Knochenmarks (Montserrat et al. 1996), der IgVHMutationsstatus (Stilgenbauer et al. 2002) und bestimmte zytogenetische Veränderungen (Döhner et al. 2000). Chromosomale Aberrationen lassen sich mit Hilfe der Fluoreszenzin-situ-Hybridisierung (FISH) bei bis zu 80% der Patienten finden (Döhner et al. 2000). Davon besonders hervorzuheben sind die Deletion 17p13, bei der das Tumorsuppressorgen TP53 betroffen zu sein scheint, und die Deletion 11q22-q23, als deren Kandidatengen das Tumorsuppressorgen ATM (ataxia telangiectasia mutated) vermutet wird (Stilgenbauer et al. 2000). In multivariaten Analysen konnte gezeigt werden, dass die Deletionen 11q und 17p wichtige unabhängige Prognosefaktoren für den Krankheitsprogress und das Überleben bei der CLL darstellen (Döhner et al. 2000). Häufig sind diese genetischen Hoch-Risiko-Mutationen mit unmutiertem IgVH vergesellschaftet (Oscier et al. 2002, Kröber et al. 2002). Klinisch konnten 11q-Deletionen mit generalisierter Lymphadenopathie, einschließlich mediastinalen und abdominellen Lymphknotenpaketen, und schnellerer Krankheitsprogression mit einem kürzeren behandlungsfreien Intervall und vermindertem Gesamtüberleben korreliert werden (Döhner et al. 1997). Für 17p-Deletionen konnte neben signifikant kürzeren Überlebenszeiten (Döhner et al. 1995, Döhner et al. 2000) ein fehlendes Ansprechen auf Purin-Analoga (Stilgenbauer et al. 1 Einleitung 3 2002) und für p53-Mutationen ein fehlendes Ansprechen auf Alkylantien (El Rouby et al. 1993) gezeigt werden. Eine weitere genetische Veränderung bei der CLL mit schlechter Progrose ist die Trisomie 12, bei der jedoch das Wissen über Kanditatengene, die eine Rolle in der Pathogenese der CLL spielen, stark begrenzt ist (Stilgenbauer et al. 2000). Eine isolierte Deletion 13q14, für die bisher noch keine Kandidatengene identifiziert werden konnten, ist mit einer günstigen Prognose verknüpft (Döhner et al. 2000). Häufig ist diese prognostisch positive Deletion mit dem prognostisch ebenfalls vorteilhaften mutierten IgVH assoziiert (Stilgenbauer et al. 2002). 1.1.4 Biologie der B-CLL Die CLL ist charakterisiert durch eine zunehmende Akkumulation von CD5 positiven BLymphozyten mit niedrigem Proliferationsindex und verlängertem Zellüberleben (O’Brien et al. 2002). Ein Großteil der leukämischen Zellen befindet sich in der G0-Phase des Zellzyklus (Gale et al. 1994, Wolowiec et al. 1995, Delmer et al. 1995, Vrhovac et al. 1998, Bosanquet et al. 2002, Rozman u. Monserrat 1995), doch finden sich in Proliferationszentren von Lymphknoten und im Knochenmark auch proliferierende leukämische Zellen (Lampert et al. 1999). Diesem Proliferationspool wird eine wichtige Rolle beim Progress der Erkrankung zugeschrieben (Granziero et al. 2001). Daneben scheint auch eine Störung der Apoptose zum Krankheitsprogress beizutragen (Reed 2000). B-Zell-Neoplasien können in 3 Kategorien unterteilt werden: 1. Tumoren mit unmutierten VH-Genen, deren Ursprungszellen noch nicht in das Keimzentrum eingetreten sind, 2. Tumoren mit sich ändernden VH-Gen-Mutationen, wie z.B. Follikuläre Lymphome, deren maligne Zellen unter dem Einfluß der Keimzentrumsreaktion bleiben, 3. B-Zell-Tumoren mit stabil mutierten VH-Genen, wie beim Multiplen Myelom, die unwiderbringlich das Keimzentrum durchlaufen haben (Stevenson et al. 1998). Bei der CLL kann die VH-GenSequenz in Keimlinien-Konfiguration oder auch in Form eines somatisch mutierten VHGens vorliegen (Damle et al. 1999, Hamblin et al. 1999, Fais et al. 1998, Oscier et al. 1997). Der VH-Gen-Mutationsstatus scheint hier im Gegensatz zu anderen Erkrankungen stabil zu sein und keine intraklonale Heterogenität zu zeigen (Stevenson et al. 1998, Damle et al. 1999, Hamblin et al. 1999, Fais et al. 1998, Oscier et al. 1997). Bei etwa der Hälfte aller CLL-Fälle konnte das Vorhandensein von signifikanten somatischen Mutationen des VH-Gens gezeigt werden: Diese neoplastischen Zellen 1 Einleitung 4 entsprechen Memory-B-Zellen, die bereits die Entwicklung im Keimzentrum durchlaufen haben (Schroeder u. Dighiero 1994, Fais et al. 1998). Ein unmutiertes VH-Gen deutet auf einen Ursprung der malignen Lymphozyten aus Zentrums-B-Zellen oder naiven B-Zellen hin, bei denen keine Keimzentrumsentwicklung stattgefunden hat (Damle et al. 1999, Hamblin et al. 1999). Ein unmutiertes IgVH-Gen ist als unabhängiger prognostisch ungünstiger Faktor bei der CLL anzusehen und mit schlechteren Therapieansprechraten und schlechterem Überleben assoziiert (Damle et al. 1999, Hamblin et al. 1999, Kröber et al. 2002, Stilgenbauer et al. 2002). Als Ersatz-Marker (surrogate marker) für den VH-Mutationsstatus werden der CD38Expression der Zelloberfläche (Damle et al. 1999, Hamblin et al. 2000) und dem intrazytoplasmatischen ZAP-70 (zeta-assoziiertes Protein mit 70 kd, eine Tyrosinkinase) (Chen et al. 2002, Crespo et al. 2003) prognostische Bedeutung zugeschrieben. Für diese beiden Marker besteht eine inverse Korrelation zum IgVH-Status, klinischen Verlauf und Überleben. Bei etwa einem Drittel der Patienten kann jedoch mit Hilfe der CD38Expression keine ausreichende Aussage über den VH-Mutationsstatus getroffen werden (Kröber et al. 2002, Hamblin et al. 2002). 1.2 Apoptose Die Homöostase in gesundem Gewebe wird durch das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose aufrechterhalten. Als Apoptose oder programmierter Zelltod wird ein physiologisches Selbstmord-Programm der Zelle bezeichnet, das sich im Laufe der Evolution in allen Lebewesen erhalten hat (Vaux et al. 1994, Steller 1995). Apoptose dient neben einer Zellzahlkontrolle in verschiedenen Geweben auch der Elimination von funktionsgeschädigten oder funktionsschädigenden Zellen (Ashenazi u. Dixit 1998). Nach ausgeprägten DNA-Schäden kann eine gestörte Apoptosefähigkeit sich teilender Zellen zur Entstehung von Tumoren beitragen (Thompson 1995). Unter normalen Homöostase-Bedingungen halten Signale aus der Zellumgebung und zellinterne Sensoren jeder Zelle den Apoptosemechanismus unter Kontrolle (Evan u. Littlewood 1998). Säugetiere haben durch Oberflächenrezeptoren einen weiteren Mechanismus zur Aktivierung eines Zellselbstmordes entwickelt, der insbesondere für das Immunsystem große Bedeutung hat: Durch Todesrezeptoren (death receptor, Oberflächenrezeptoren) werden nach Bindung eines Todesliganden (death ligand) 1 Einleitung 5 Apoptosesignale an das Zellinnere weitergegeben, innerhalb kürzester Zeit Caspasen (s. 1.4) aktiviert und der Zelltod initiiert (Boise u. Thompson 1996). Dieser Apoptoseweg wird als „extrinsic pathway“ bezeichnet. Im Rahmen des Apoptoseprozesses kommt es zur Änderung der Zellmorphologie (zunächst Anschwellen der Zellen, danach Abnahme der Zellgröße), zur Chromatinkondensation, zum Verlust der Plasmamembran-Stabilität durch Verlagerung von Phosphatidylserin von der zytoplasmatischen Membranseite an die Außenmembran und schließlich zur DNA-Fragmentierung (Thompson 1995, Cohen 1997). In den Mitochondrien bewirkt der Apoptoseprozess eine Störung des Elektronentransportes, der oxidativen Phosphorylierung und der Adenosin-Triphophat-(ATP)-Produktion. Daneben werden mitochondriale Proteine in das Cytosol abgegeben, wie Cytochrom C, das zusammen mit dem Protein Apaf-1 („apoptotic protease activating factor 1“) und Procaspase 9 den Apoptose-Aktivierungs-Prozess („apoptosome“) bildet. Dies führt zur Veränderung des zellulären Reduktions-Oxidationspotentials und folgend zur Aktivierung der Apoptosekaskade (Green u. Reed 1998), bei der Caspasen, Aspartat-spezifische Zysteinproteasen, eine zentrale Effektorfunktion haben (Muzio et al. 1996). Nach Aktivierung von Caspasen kommt es zur proteolytischen Spaltung von verschiedenen intrazellulären Schlüsselenzymen, wie dem PARP-Enzym, einem DNA-Reparaturenzym (Tewari et al. 1995, Kitada et al. 1998, Krajewski et al. 1997, Kaufmann et al. 1993). Eine Spaltung des PARP-Enzyms gilt nach Aktivierung der CDE-3/ICE-ähnlichen Proteasen als Zeichen für die Apoptose der betroffenen Zellen (Casciola-Rosen et al. 1996, Solary et al. 2000, O’Gorman u. Cotter 2001, Bellosillo et al. 1997, Kaufmann et al. 1993, Lazebnik et al. 1994, Nicholson et al. 1995). 1 Einleitung 6 Regulationsmechanismen des Apoptosepathways Extrinsic Pathway Intrinsic Pathway TNFR Zellmembran DNA Schaden p53 BID PUMA, NOXA Caspase 8 BAX, BAK Caspase 9 Caspase 3 BCL2, BCL-XL Mitochondria Cytochrom C SMAC/ DIABLO APAF 1 PARP IAP Apoptose Abbildung 1.1: Verschiedene Regulationsmechanismen des Apoptosepathways. 1.3 Bcl-2 und Bax Neben der „extrinsischen“ Regulation kann auch durch die Wirkung unterschiedlichster Regulationsgene des „intrinsic pathway“ eine Regulation der Apoptose erreicht werden: Eine dieser Genfamilien ist die Bcl-2 Familie (Reed 1995). Zu dieser Gen- und ProteinFamilie gehören Apoptose hemmende Mitglieder wie Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 und A1 und Apoptose fördernde Gegenspieler wie Bax, Bcl-xS, Bad und Bak (Reed 1997). Das Bcl-2-Protein (B-Cell CLL/Lymphoma 2) mit einer Größe von 25 kD, dessen Gen auf Chromosom 18q21.3 liegt, hemmt die Apoptose in gesunden Zellen unter physiologischen Bedingungen (Korsmeyer 1992, Reed 1994). Bcl-2 schützt die Zellen gegen verschiedene zytotoxische Stimuli wie γ-Strahlung oder Ultraviolett-Strahlung, Zytokin-Wirkung, Dexamethason und weitere zytotoxische Substanzen. Das Bcl-2-Protein ist ein integraler Bestandteil der inneren Mitochondrienmembran, kontrolliert deren Ionentransport und 1 Einleitung 7 schützt vor Membranbrüchen (Hockenbery et al. 1990). Ein Gegenspieler des antiapoptotischen Bcl-2 ist z.B. Bax (Bcl2-associated X Protein) mit einer Proteinlänge von 21 kD. Das Bax-Protein, dessen Gen auf Chromosom 19q13.3-13.4 liegt, ist im Cytosol lokalisiert, bildet nach Erhalt eines Apoptosesignals mit Bcl-2 Heterodimere und bindet an die transmembranen Poren der äußeren Mitochondrienmembran, wo es zum Verlust der selektiven Ionenpermeabilität führt (Hanada et al. 1993, Pepper et al. 1996, Adams u. Cory 1998). Als Folge der Membranveränderungen kommt es zur Freisetzung von Substanzen aus dem Zwischenmembranenraum, z.B. Cytochrom C oder Apoptose-induzierender Faktor (AIF), das im Zellkern zur Chromatinkondensation und Kernfragmentierung führt. Durch Cytochrom C wird zusätzlich Apaf-1 aktiviert, wodurch Procaspase 9 proteolytisch gespalten wird (Israels u. Israels 1999). Im Vergleich zu B-Lymphozyten Gesunder enthalten B-Lymphozyten von Patienten mit B-CLL höhere Bcl-2-Proteinspiegel (Panayiotidis et al. 1995, Pezzella et al. 1990, Schena et al. 1992, Robertson et al. 1996) und niedrigere Bax-Proteinspiegel (Kitada et al. 1998, Pepper et al. 1996). Aufgrund der anti-apoptotischen Wirkung von Bcl-2 scheint dessen Hochregulation mit zur Akkumulation von B-CLL-Zellen in vivo beizutragen (Panayiotidis et al. 1993, Hanada et al. 1993). Durch Bestimmung der Bcl-2-mRNAExpression lässt sich keine Aussage über zu erwartende Therapieerfolge treffen, doch zeigt sich eine Korrelation zwischen einer erhöhten Bcl-2/Bax-mRNA-Ratio, hohen Lymphozytenzahlen und einem zügigen Krankheitsprogress (Kitada et al. 1998). Hohe Bcl-2-Proteinspiegel scheinen mit kürzerem Überleben assoziiert zu sein (Robertson et al. 1996). Die verminderte Expression von Bax konnte bei der B-CLL mit einer schlechten Prognose (Kitada et al. 1998, Klein et al. 2000) und unabhängig vom Bcl-2-Spiegel mit einer spezifischen Resistenz gegen Doxorubicin, Cycophosphamid und Vincristin, nicht aber gegen Fludarabin, Cladribin und Glukokortikoide korreliert werden (Bosanquet et al. 2002). 1.4 CD95-Rezeptor und Ligandensystem Der CD95(FAS/APO1)-Rezeptor, dessen Gen auf Chromosom 10q24.1 lokalisiert ist, und der CD95-Ligand mit dem entsprechenden Gen auf Chromosom 1q23 gehören zur TumorNekrose-Faktor-/Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptorfamilie, die durch cysteinreiche 1 Einleitung 8 extrazelluläre Domänen charakterisiert ist (Nagata u. Golstein 1995, Itoh et al. 1991). Der CD95-Rezeptor ist auf unterschiedlichsten hämatopoetischen Zellen, einschließlich B- und T-Lymphozyten, variabel exprimiert und kann nach Bindung des CD95-Liganden oder anderer geeigneter Liganden über die Aktivierung von Caspasen Apoptose induzieren (Trauth et al. 1989, Yonehara et al. 1989, Mapara et al. 1993, Nagata 1997). Caspasen finden sich als inaktive Vorläufer/Procaspasen im Cytosol und werden von Zelloberflächenrezeptoren wie CD95 oder TNF-RI sukzessiv durch Spaltung kaskadenartig aktiviert (Muzio et al. 1996). Nach Bindung eines Liganden an den CD95-Rezeptor kommt es über eine Aktivierung von FADD (Fas-associated via death domain) zur Spaltung von Procaspase 8 (Moller et al. 1993, Mapara et al. 1993, Nagata et al. 1997). Durch Caspase 8 werden Procaspasen 1 und 3 aktiviert. Caspase 3 bewirkt Apoptose über eine Spaltung von verschiedenen zellulären Substraten unter anderem von poly (ADP ribose) Polymerase (PARP, 116 kDa) in ein 31 kDa und ein 85 kDa Fragment (Ashkenazi u. Dixit 1998, Kaufmann et al. 1993). Alternativ können Caspasen nach Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien aktiviert werden (Liu et al. 1996). Die Familie der IAP (inhibitor of apoptosis) stellt spezifische Inhibitoren der Caspasen dar. Hierzu gehören BIRC2 (cIAP 1), BIRC3 (cIAP 2) und BIRC4 (XIAP), die durch Bindung die Funktion von Caspase 3 und 7 hemmen, ohne selbst inaktiviert zu werden (Deveraux et al. 1997, Roy et al. 1997). Für die Mitglieder der IAP-Familie wurde in malignen Zellen eine Überexpression mit Hemmung des Apoptose-Prozesses gezeigt (Israels u. Israels 1999). Eine Steigerung der schwachen CD95-Antigenexpression auf B-Lymphozyten bei der CLL (Robertson et al. 1995, Israels u. Israels 1999, Wang et al. 1997) kann durch Zugabe von Staphylococcus aureus Cowan I (SAC), CD40 oder Interleukin 2 (IL-2) in vitro erreicht werden (Ayroldi et al. 1998, Trauth et al. 1989). Nach Stimulation der CD95Antigenexpression mit IL-2 kann bei B-CLL-Zellen durch einen gegen das CD95Oberflächenantigen gerichteten monoklonalen IgM-Antikörper Apoptose induziert werden (Trauth et al. 1989, Yonehara et al. 1989, Nagafuji et al. 1993). Durch Kombination mit Chemotherapeutika konnte in verschiedenen humanen Leukämie-Zelllinien, wie Jurkat, HL-60, K562, U937, CEM, ein synergistischer zytotoxischer Effekt erreicht werden (McGahon et al. 1998). 1 Einleitung 9 1.5 Chemotherapie und verschiedene Zytostatika Im Gegensatz zu gesunden Zellen kann es in Tumorzellen durch Aktivierung von Protoonkogenen und Verlust von Tumorsuppressorgenen zu einer Fehlregulation des Zellzyklus mit rascher Zellverdopplung und Störung des Apoptoseweges kommen (Sobel 1990). Bei vielen Tumoren wird eine zytostatische Therapie eingesetzt, die ihre Wirkung insbesondere durch Schädigung der DNA-Synthese und DNA-Replikation entfaltet. Vor allem Zellen in einer aktiven Replikationsphase von G1- bis M-Phase (G1→Protein- und Nukleotidsynthese, S→Verdopplung der DNA-Helix, G2→Synthese der Zellstrukturen, M→Ausbildung der Mitosespindel für die Zellteilung) sind sensibel auf Chemotherapeutika (Hartwell u. Kastan 1994). Neben erhöhter Empfindlichkeit des Tumorgewebes gegenüber zellschädigenden Einflüssen soll eine relative Selektivität der Zytostatikatherapie für das Tumorgewebe durch Kombination verschiedener Substanzen mit Fokussierung des Effektes gegenseitiger Potenzierung und Streuung der Nebenwirkungen erreicht werden (De Vita u. Schein 1973). Da Chemotherapeutika in ihrer Wirkung nicht spezifisch sind, können an schnell proliferierendem Gewebe wie Knochenmark, Mukosa, Gonaden und Haaren toxische Nebenwirkungen auftreten (Jenns 1994, Sonis 1993, Byrne et al. 1987). Als Spätfolgen zytostatischer Therapien können nach Jahren sekundäre Leukämien, Myelodysplasien oder Zweitkarzinome entstehen (Levine u. Bloomfield 1992, Travis et al. 1991). Die Behandlung der CLL war in den letzten Jahrzehnten einem starken Wandel unterworfen: Nach einer rein symptomatischen Therapie bei indolenter CLL und einer Therapie mit Chlorambucil mit oder ohne Kortikosteroide (Knospe-Schema) oder mit Prednimustin bei Patienten in fortgeschrittenen Stadien wurde Fludarabin als erste nichtalkylierende Substanz in der Behandlung der CLL zunehmend häufig eingesetzt. Bei Fludarabin handelt es sich um ein Chemotherapeutikum aus der Gruppe der Purinanaloga. Purinanaloga sind Antimetabolite, die anstelle des normalen Purins als falsches Substrat in die DNA und RNA inkorporiert werden und dadurch die normale DNA- und RNAFunktion hemmen (Abbildung 1.2 A). Es kommt zu einer Hemmung der DNA-Polymerase α, der Ribonukleotidreduktase, der DNA-Primase und Ligase I (Kamiya et al. 1996, Plunkett u. Ghandi 1993). Fludarabin führt durch DNA-Fragmentierung in sich nicht teilenden Lymphozyten zur Apoptoseinduktion, wodurch seine Effektivität in niedrig- 1 Einleitung 10 malignen Non-Hodgkin-Lymphomen erklärt werden kann (Huang et al. 1995, Dighiero 1996). In neueren, kontrollierten Studienkonzepten wird Fludarabin mit weiteren Substanzen z.B. Cyclophosphamid oder Antrazyklinen kombiniert, um den Stellenwert dieser Kombinationen zu klären. Anthrazykline, z.B. Epirubicin (Abbildung 1.2 B), sind antineoplastisch wirksame Glykosid-Antibiotika, die durch Interkalation in die Doppelhelix der DNA zellzyklusspezifisch in der S- und G2-Phase wirken. Es kommt zur Induktion von DNAEinzel- und Doppelstrangbrüchen, Bildung von freien Sauerstoffradikalen und Hemmung der Topoisomerase II (Smith u. Sones 1994). Neben diesen Wirkungen konnte bei Inkubation von Leukämie-Zelllinien mit Anthrazyklinen über eine Induktion des CD95Liganden Apoptose erreicht werden (Friesen et al. 1996). A Fludarabin B Epirubicin Abbildung 1.2: Chemische Formeln von Fludarabin und Epirubicin. 1 Einleitung 11 1.6 Zielsetzung der Doktorarbeit Um einen näheren Einblick in den Epirubicin-vermittelten, sowie den CD95-vermittelten Apoptoseweg bei der CLL zu gewinnen, werden Blutproben von 46 Patienten mit B-CLL untersucht. Die apoptoseinduzierende Wirkung von Anthrazyklinen bei der CLL wird unter Verwendung von Epirubicin überprüft. Neben dem genaueren Wirkmechanismus, über den diese Substanz Apoptose induziert, wird durch Kombination von Epirubicin mit Fludarabin eine mögliche synergistische Wirkung beider Chemotherapeutika untersucht. Im Weiteren wird die Induktion der CD95-Expression auf der Zelloberfläche bei B-CLLLymphozyten und die konsekutive Initiierung des CD95-vermittelten Apoptoseprozesses überprüft. Auf mRNA-Ebene wird die Expression der Mitglieder der CD95Apoptosekaskade und möglicher Apoptoseinhibitoren analysiert. 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Standard-Chemikalien 7-Actinoaminomycin D, 5mg, 97% Sigma-Aldrich, Steinheim Agarose NEEO Roth, Karlsruhe Albumin aus Rinderserum BSA Serva, Heidelberg Ampicillin Sodium Crystalline Sigma-Aldrich, Steinheim APS Sigma, Deisenhofen Aprotinin, Protease-Inhibitor Boehringer, Mannheim Aqua ad iniectabilia Braun, Melsungen Borsäure AppliChem, Darmstadt Bromphenol Blau Serva, Heidelberg Butanol Roth, Karlsruhe Chemilumineszenz (ECL) Amersham, Freiburg Chloroform-Isoamylalkohol, 24:1 Sigma, Deisenhofen DNA-Ladepuffer Gibco, Eggenstein dNTP, 100mM Amersham, NJ, USA DTT, 100mM Promega, Heidelberg EDTA, pH 8,0 Roth, Karlsruhe Essigsäure Roth, Karlsruhe Ethanol Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Steinheim Ficoll Separating Solution Biochrom, Berlin First Strand Buffer 5× GIBCO, Eggenstein Fix and Perm Kit Grub, Kaumberg, Österreich GEL 30 Acrylamid Roth, Karlsruhe Glycerin Roth, Karlsruhe Immobilon-Polyvinylidin-Difluorid-Membran Millipore, Bedford, MA, USA 2 Material und Methoden 13 (PDVF) Isopropanol Roth, Karlsruhe Isotone Natriumchloridlösung 0,9% Braun, Melsungen Magermilchpulver Fluka, Buchs, Schweiz Methanol Roth, Karlsruhe Magnesiumchlorid Sigma, Deisenhofen MgCl2-Solution Perkin Elmer, Überlingen Naphtol Blau Schwarz Merck, Darmstadt Nω-Nitro-L-Arginine-Methyl-Ester- Sigma-Aldrich, Steinheim Hydrochlorid, 1g (=NO-Synthetase-Inhibitor = L-NAME) (C7H15N504) Nonidet P40 (NP40) Fluka, Buchs, Schweiz Oligo (dT)12-18 Primer GIBCO, Eggenstein PBS,10x, steril GIBCO, Eggenstein PCR-Puffer II 10× Perkin Elmer, Überlingen Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen, Hilden PMSF, Protease-Inhibitor Boehringer, Mannheim Protein-Assay 5×Stammlösung Bio-Rad, München QIA prep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen, Hilden Skim-Milk Difco, Detroit, USA SuRE/Cut Buffer B for Restriction Enzyms Boehringer, Mannheim SDS Sigma, Deisenhofen Skim-Milk Difco, Detroit, USA TEMED, RNase/DNase frei Sigma, Deisenhofen Tris Hydrochlorid Roth, Karlsruhe Tris Ultrapure usb, Cleveland, USA Trizol Gibco/BRL, New York, USA Trypan Blau Seromed, Berlin Tween 20 Sigma, Deisenhofen Urea Ultra Pure Invitrogen, Karlsruhe 2 Material und Methoden 14 2.1.2 Enzyme Ampli Taq DNA Polymerase Perkin Elmer, Überlingen DNase I, RNase frei Boehringer, Mannheim Reverse Transkriptase Invitrogen, Karlsruhe RNase, DNase frei Boehringer, Mannheim RNase-Inhibitor Roche, Mannheim 2.1.3 Antikörper Anti-Maus-IgG, peroxidase-gebunden Amersham, Freiburg CD95-IgM-Ligand, 10 mg Immunotech, Marseille, Frankreich CD95(UB2)-FITC, 0,2mg Immunotech, Marseille, Frankreich Hasen-Anti-Maus-IgG-PE, 500 µg/ml DAKO, Carpinteria, USA Hamster-anti-Mensch-Bcl-2, monoklonal, Pharmingen, San Diego, USA 100 µg/ml Human IL-2, 10 µg R- u. D-Systems, Wiesbaden Maus IgG2a-FITC, 0,2 mg Becton Dickinson, Heidelberg Maus-Anti-Mensch-Bax, monoklonal, 1 µg/µl Immunotech, Marseille, Frankreich Ziege-anti-armenischer-Hamster-IgG-FITC, Dianova, Hamburg 1 mg/ml 2.1.4 Zytostatika Farmorubicin-Lösung, 50mg/25ml Pharmacia Upjohn, Erlangen (=Epirubicinhydrochlorid) Fludarabin Sigma-Aldrich, Steinheim 2.1.5 Kulturmedien und Zusatzstoffe RPMI 1640 Medium Biochrom, Berlin MycoplexTM Foetal Calf Serum PAA, Linz, Österreich Penicillin/Streptomycin 10000 U, 100000 µg/ml Biochrom, Berlin L-Glutamin Biowhittaker, Walkersville, USA 2 Material und Methoden 15 2.1.6 Größenstandards 100 Base Pair Marker,1µg/µl Amersham, New Jersey, USA Lambda DNA-Hind III-EcoRi Digest, 1µg/µl Gibco, Eggenstein 2.1.7 PCR-Primer PCR-Primer, je 100 µmol/µl MWG-Biotech, Ebersberg BIRC2 (cIAP 1, Hiap2) 3`: 5`CAG CAT TTT CTT CTC CAG TGG 3` BIRC2 (cIAP 1, Hiap2) 5`: 5`CTG AGC ATG CAG ACA CAT GCA 3` BIRC3 (cIAP 2, Hiap1) 3`: 5`TGA GGG TAA CTG GCT TGA AC 3` BIRC3 (cIAP 2, Hiap1) 5`: 5`CAG CTT CAA GAC ACT TCA AG 3` BIRC4 (XIAP) 3`: 5`CGA ATA TTA AGA TTC CGG CCC A 3` BIRC4 (XIAP) 5`: 5`GAA AAC TAT CTG GGA AGC AGA G 3` CD95 (TNFRSF6) 3`: 5`TTG GTA TTC TGG GTC CG 3` CD95 (TNFRSF6) 5`: 5`CGG AGG ATT GCT CAA CAA C 3` GAPD 3`: 5`TGG GAA GCT TGT CAT CAA CGG 3` GAPD 5`: 5`GGC AGT GAT GGC ATG GAC TG 3` 2.1.8 Standardgeräte Biofuge pico-Zentrifuge Heraus, Fellbach DK 640 Spectrophotometer Beckmann, Krefeld Facs Calibour Becton Dickinson, Heidelberg Gene Amp PCR System 2400 Perkin Elmer, Überlingen GS-6R Centrifuge Beckmann, Krefeld Lamin Air HLB 2472 GS Heraus, Fellbach Reax 2000 (Mixer) Heidolph, Schwabach Water-Jacketed Inkubator Forma Scientific, Ohio, USA 2.2 Patienten Für die Untersuchungen wird peripheres Blut von 46 Patienten (22 unbehandelt, 24 vorbehandelt), die an einer B-CLL erkrankt sind, nach Aufklärung und Einwilligung verwendet. Die Diagnose ist nach klinischen, morphologischen und immunologischen Kriterien gestellt worden. 15 Patienten sind zum Zeitpunkt der Messreihen im Stadium Binet A, 10 Patienten im Stadium Binet B und 21 Patienten im Stadium Binet C. 2 Material und Methoden 16 Einschlusskriterien waren eine Leukozytenzahl von mehr als 10000/µl und bei vorbehandelten Patienten ein therapiefreies Intervall von mindestens 1 Monat. Tabelle 2.1: Patientencharakteristika Patienten-Nr. Pat. 1 Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 Pat. 5 Pat. 6 Pat. 7 Pat. 8 Pat. 9 Pat. 10 Pat. 11 Pat. 12 Pat. 13 Pat. 14 Pat. 15 Pat. 16 Pat. 17 Pat. 18 Pat. 19 Pat. 20 Pat. 21 Pat. 22 Pat. 23 Pat. 24 Pat. 25 Pat. 27 Pat. 28 Pat. 29 Pat. 30 Pat. 31 Pat. 32 Pat. 33 Pat. 34 Pat. 35 Pat. 36 Pat. 37 Pat. 38 Pat. 39 Pat. 40 Pat. 41 Geschlecht Alter Binet-Stadium Leukozytenzahl (103/µl) M M W W M M M W W M M M M M M W M M M M W W. M M M W M M M M W M M M M M M M W W 61 Jahre 71 Jahre 67 Jahre 68 Jahre 82 Jahre 67 Jahre 81 Jahre 67 Jahre 67 Jahre 68 Jahre 67 Jahre 65 Jahre 63 Jahre 58 Jahre 45 Jahre 84 Jahre 77 Jahre 51 Jahre 71 Jahre 65 Jahre 52 Jahre 64 Jahre 60 Jahre 45 Jahre 63 Jahre 57 Jahre 64 Jahre 54 Jahre 58 Jahre 72 Jahre 89 Jahre 59 Jahre 64 Jahre 68 Jahre 72 Jahre 54 Jahre 67 Jahre 59 Jahre 66 Jahre 65 Jahre C B B A A C A A C A C C C A A A C A C A B C C A C A B A B C B A C A C B C C C A/B 47 60 16 29 19 300 30 45 200 150 300 30 40 12 40 21 72 12 95 60 79 93 14 40 31 22 22 40 53 180 100 51 41 150 180 27 300 110 340 10 2 Material und Methoden Pat. 42 Pat. 43 Pat. 44 Pat. 45 Pat. 46 Pat. 47 Pat. 48 Pat. 49 Pat. 50 Pat. 51 Pat. 52 17 W M M W M M M M M M W 49 Jahre 80 Jahre 60 Jahre 65 Jahre 55 Jahre 67 Jahre 64 Jahre 54 Jahre 58 Jahre 63 Jahre 62 Jahre A/B A B A C C C C C C C 20 20 19 52 150 237 177 450 41 123 35 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Lymphozyten-Separierung Die Lymphozytenseparierung erfolgt aus EDTA-Blut. Nach Mischung des EDTA-Blutes mit sterilem 1×PBS im Verhältnis 1:1 wird Ficoll-Hypaque mit der Blut-Suspension ohne Phasenvermischung überschichtet. Nach Zentrifugation bei 400×g für 20 Minuten wird die die mononukleären Zellen beinhaltende Interphase entnommen und nach erneutem Waschen in 1×PBS in sterilem Kulturmedium (RPMI 1640 mit 10% FCS, 1% PenicillinStreptomycin und 1% L-Glutamin) aufgenommen. 2.3.2 Bestimmung der Zellzahl Die Zellsuspension wird im Verhältnis 1:1 mit Trypan Blau versetzt, um abgestorbene Zellen und Zelltrümmer durch den Farbstoff zu markieren. In einer Neubauer-Zählkammer werden die lebenden Zellen gezählt und deren Konzentration wie folgt errechnet: Zellen ml = 10 4 × Anzahl der Zellen × Verdünnungsfaktor Anzahl der ausgezählten 16er - Felder der Zählkammer 2.3.3 Kultivierung von Zelllinien und primären Tumorzellen Spezifische Zelllinien (Jurkat) und primäre B-CLL-Zellen werden bei 37°C, 5% CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95% in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 10% fetalem Kälberserum (=FCS) kultiviert. Ein Wechsel des Kulturmediums erfolgt nach jeweils 3 Tagen und Waschen der Zellen in 1×PBS unter Konstanthaltung der Zellkonzentration. 2 Material und Methoden 18 2.3.4 CD95-Stimulation der Lymphozyten Eine B-CLL-Zellsuspension mit 1×106 Zellen/ml wird zur Stimulation der CD95Rezeptorantigenpräsentation auf der Zelloberfläche mit 10 000 UI/ml Interleukin 2 (IL-2) versetzt und 72 Stunden im Brutschrank kultiviert. Nach einem Waschschritt mit 1×PBS zur Entfernung des IL-2 wird das Zellpellet in frischem Kulturmedium aufgenommen und weitere 48 Stunden inkubiert. Als Kontrollpopulation wird eine Zellsuspension ohne Zusatz von IL-2 mitgeführt. Die CD95-Antigenpräsentation wird zu den Zeitpunkten Tag 0, Tag 3 und Tag 6 wie in Kapitel 2.4.3 beschrieben durchflusszytometrisch bestimmt. 2.3.5 Apoptoseinduktion durch Zusatz verschiedener Zytostatika 48 Stunden nach Beendigung des stimulierenden Effekts von IL-2 wird die Zellsuspension mit 1×106 Zellen/ml aus Kapitel 1.3.4 in 6 Teile aufgeteilt. Der Hälfte der Proben wird 0,3 µg/ml NO-Synthetase-Inhibitor L-NAME zugefügt. Die Proben werden zusätzlich mit a) dem Anthrazyklin Epirubicin in einer Konzentration von 0,15 µg/ml, b) mit 100 ng/ml IgM-Antikörper (= CD95-Ligand) und c) als Kontrolle ohne weitere Zusätze kultiviert. Analog wird mit den weiteren 3 Proben verfahren, denen kein L-NAME zugesetzt wird (Abbildung 2.1 A). In einem weiteren Ansatz werden 1×106 B-CLL-Zellen/ml ohne vorherigen Zusatz von IL2 in 6 Teile aufgeteilt und mit steigenden Konzentrationen von Epirubicin (0,07 µg/ml, 0,15 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,35 µg/ml, 0,7 µg/ml) inkubiert. Als Negativkontrolle dienen Zellen, die in Kontroll-Medium kultiviert werden (Abbildung 2.1 B). Eine weitere Zellsuspension mit 1×106 Zellen/ml wird mit einer Kombination aus Fludarabin und Epirubicin versetzt. Dafür wird die Zellsuspension in 4 Teile aufgeteilt und a) mit 0,15 µg/ml Epirubicin, b) 0,7 µg/ml Fludarabin, c) einer Kombination aus 0,15 µg/ml Epirubicin und 0,7 µg/ml Fludarabin und d) für die Negativkontrolle ohne Zusätze 72 Stunden inkubiert (Abbildung 2.1 C). Die Apoptoseraten werden 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zusatz der Zytostatika durchflusszytometrisch gemessen, siehe Kapitel 2.4.2. 2 Material und Methoden A: 19 1 x 10 6 Zellen/ml mit/ohne IL-2 Epirubicin Epirubicin -L-Name +L-Name IgM -L-Name +L-Name Kontrolle Kontrolle -L-Name +L-Name 1 x 10 6 Zellen/ml B: Epirubicin 0,07µg/ml IgM Epirubicin 0,15µg/ml C: Epirubicin 0,25µg/ml Epirubicin 0,35µg/ml Epirubicin 0,7µg/ml Kontrolle 1 x 10 6 Zellen/ml Epirubicin 0,15µg/ml Fludarabin 0,7µg/ml Epirubicin/Fludarabin 0,15µg/ml/0,7µg/ml Kontrolle Abbildung 2.1: Verschiedene Ansätze zur Apoptoseinduktion. A: 1×10 6 B- CLL-Zellen/ml werden nach Vorinkubation mit IL-2 wie folgt aufgeteilt: Je 2 Proben werden mit 0,15 µg/ml Epirubicin, 100 ng/ml IgM-Antikörper und für die Negativkontrolle ohne Zusatz kultiviert. Zusätzlich wird eine der Doppelproben mit 0,3 µg/ml des NO-Synthethaseinhibitors L-NAME versetzt. B: 1×106 B-CLLZellen/ml werden nach Separation aus peripherem Blut mit aufsteigenden Konzentrationen des Zytostatikums Epirubicin (0,07 µg/ml, 0,15 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,35 µg/ml, 0,7 µg/ml) inkubiert. Die Kontrollprobe bleibt ohne Zusätze. C: 1×106 Zellen/ml werden 72 Stunden lang mit a) 0,15 µg/ml Epirubicin, b) 0,7 µg/ml Fludarabin, c) einer Kombination aus 0,15 µg/ml Epirubicin und 0,7 µg/ml Fludarabin und d) für die Negativkontrolle ohne Zusätze inkubiert. 2.4 FACS-Analysen 2.4.1 Methodik Zur Untersuchung definierter Eigenschaften von Einzelzellen in Zellsuspensionen z.B. Größe, Granularität oder Expression spezifischer Antigene kann die Durchflusszytometrie verwendet werden. Durch Kombination mehrerer Messverfahren (z.B. Messung der Lichtstreuung und der Fluoreszenz definierter Wellenlänge) können mit durchflusszytometrischen Geräten (FACS-Gerät = fluorescence activating cell sorter) Zellen hinsichtlich morphologischer Kriterien (z.B. Größe, Membranstruktur, intrazellulärer Strukturen) und hinsichtlich ihrer Beladung mit fluorochrommarkierten Antikörpern analysiert werden. Beim Messvorgang werden in dieser Versuchsreihe jeweils 10000 Zellen einer Suspension durch eine Mikrokapillare einzeln in einen Laserstrahl 2 Material und Methoden 20 geleitet. Die Lichtstreuung wird als Vorwärtsstreuung („forward scatter“ = FSC) mit Beeinflussung durch die Zellgröße und im rechten Winkel dazu als Seitwärtsstreuung („side scatter“ = SSC) in Abhängigkeit von der intrazellulären Granularität und der Membranbeschaffenheit durch die Detektoren des Geräts erfasst. Dadurch können verschiedene Zellsubpopulationen (z.B. Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) unterschieden werden. Verunreinigungen durch Zelltrümmer oder Erythrozyten können durch das Setzen eines Schwellenwerts („threshold“) im FSC in Abhängigkeit von ihrer Größe von der Messung ausgeschlossen werden. Die Messdaten werden in einem Computer abgespeichert und bearbeitet. Durch das Setzen von Zielbereichen können Populationen mit bestimmten Eigenschaften von den übrigen Zellen getrennt und quantifiziert werden. Durch eine elektronische Kompensation ist bei Mehrfachmessungen eine parallele Erfassung und Diskriminierung der sich teilweise überlagernden Fluoreszenzspektren (FL1-3) möglich. Für die unten beschriebenen durchflusszytometrischen Analysen werden für jede Messung aus einer Zellsuspension 1×106 Zellen entnommen, mehrmals gewaschen und in Abhängigkeit von der Messreihe mit dem entsprechenden Antikörper inkubiert. Die Messungen werden an einem FACSCalibur-Durchflusszytometer unter Verwendung der Lysis-II Software durchgeführt. Die Ergebnisse werden mit der Paint-a-Gate Pro Software (Becton Dickinson, Heidelberg) ausgewertet. 2.4.2 Quantifizierung apoptotischer Zellen nach Zugabe von Zytostatika Zur Quantifizierung apoptotischer Zellen wird 7-Actinoaminomycin D (7-AAD) verwendet. Bei 7-AAD handelt es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der durch die im Rahmen des Apoptoseprozesses veränderten Membranen diffundiert und sich zwischen Guanin und Cytosin der gebrochenen DNA-Doppelstränge interkaliert (Philpott NJ et al. 1996). Die Extinktion von 7-AAD wird bei 630 nm (Rotfluoreszenz) gemessen. Die Bestimmung der Zytostatika induzierten Apoptoseraten wird 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe der Zytostatika und der agonistischen Antikörper am Durchflusszytometer durchgeführt. 1×106 Zellen der Zellsuspension werden nach zweimaligem Waschen mit 1×PBS in 100 µl 1×PBS und 20 µl 7-AAD (5 mg/ml) gelöst und 20 Minuten bei 4°C lichtgeschützt inkubiert. Anschließend folgt die Quantifizierung der apoptotischen Zellen am Durchflusszytometer (Abbildung 2.2). 2 Material und Methoden 21 Es werden jeweils 10000 Zellen sowohl in der Kontrollpopulation, als auch in den Populationen mit unterschiedlichen Zusätzen untersucht. Zur Bestimmung der Spontanapoptoseraten werden die jeweiligen Kontrollpopulationen verwendet. Der Prozentsatz der „drug-spezifischen“ Apoptose, der die Spontanapoptose von CLLZellen berücksichtigt, wird nach Friesen et al. 1996 berechnet: Drugspezifische Apoptose = (Zytostatikainduzierte Apoptose - Spontanapoptose) × 100 100 - Spontanapoptose Mit IL-2 24 h 48 h 72 h Abbildung 2.2: Apoptosemessung am FACS unter Verwendung von 7-AAD. Dargestellt sind die Apoptosemessungen 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe des Zytostatikums. Dabei können zwei Zellpopulationen voneinander abgegrenzt werden: links oben kommen die apoptotischen Zellen zur Darstellung, die durch ihre kleinere Zellgröße und stärkere Anreicherung von 7-AAD von den viablen Zellen rechts unten zu unterscheiden sind. Die Datenanalyse von viablen und apoptotischen Zellen erfolgte durch das Einzeichnen einer Messfläche mit Hilfe der FACS-Lysis II und Paint-a-Gate Pro Software von Becton Dickinson. 2.4.3 Quantifizierung spezifischer Zelloberflächenantigene Die Quantifizierung spezifischer Zelloberflächenantigene (z.B. CD95) erfolgt durch die Verwendung von Fluorochrom markierten Antikörpern. Dabei regt monochromatisches Licht aus einem Argonlaser mit z.B. 488 nm Fluorochrome wie FITC (Fluoresceinisothiocyanat) oder PE (Phycoerythrin) zur Emission von Fluorezenzspektren (FITC = gelbgrün, ca. 530 nm; PE = rot-orange, ca. 575 nm) an, die von den Photomultiplyern des Geräts gemessen werden. Zur Darstellung unspezifischer Bindungen ist eine Isotypenkontrolle Gesamtantigenmenge mit nötig. einem Hierdurch kann unspezifischen nach Bestimmung Antikörper diese der Kurve (Isotypenkontrolle) mit der spezifischen Messkurve verglichen werden, um eine Aussage über das untersuchte Antigen zu treffen. 2 Material und Methoden 22 Zur durchflusszytometrischen Messung der CD95-Antigenpräsentation der Zelloberfläche werden 1×106 B-CLL Zellen auf zwei Proben verteilt und mit 1×PBS zur Entfernung des Kulturmediums gewaschen. Für die Isotypenkontrolle wird das Zellpellet mit 100 µl 1×PBS/1% Bovines Serum-Albumin (BSA) und mit 10 µl IgG-Antikörper (10 µg/ml) inkubiert. Für die Analyse des CD95-Antigens werden 100 µl 1×PBS/1% BSA und 5µl CD95-Antikörper (10 µg/ml) zugegeben. Bei Raumtemperatur folgt eine Inkubation für 30 Minuten unter Lichtabschluss. Anschließend werden die Proben zweimal mit 1×PBS gewaschen und das Zellpellet in 200 µl 1×PBS/1% BSA gelöst. Der verwendete Antikörper und die Isotypenkontrolle sind FITC-markiert, so dass die Messung im Durchflusszytometer bei 530 nm (Grünfluoreszenz) erfolgt. 2.4.4 Bestimmung der Proteinexpression von Bcl-2 und Bax unter Inkubation mit Epirubicin Unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenz können nach Zellpermeabilisierung intrazelluläre Strukturen (z.B. Bcl-2, Bax) der Targetzellen bestimmt werden. Nach Inkubation mit einem unmarkierten spezifischen Antikörper kann durch die Verwendung eines sekundären fluorochrommarkierter Anti-Antikörper das untersuchte Agens nachgewiesen werden. Die Messung der Bcl-2 und Bax Proteinexpression in Proben von CLL-Patienten wird wie von Pepper et al. 1999 beschrieben durchgeführt und wie folgt modifiziert: 1×106 B-CLL-Zellen/ml werden mit 0,15 µg/ml Epirubicin über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Für die Negativkontrolle werden B-CLL-Zellen in RPMI-Medium kultiviert. Die Proteinexpression von Bcl-2 und Bax wird 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe von Epirubicin durchflusszytometrisch bestimmt. Hierfür werden 1×106 Zellen mit 1×PBS/1% BSA gewaschen und mit 100 µl Reagenz A (Fix and Perm Kit) 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss fixiert. Nach Waschen mit 1×PBS/1% BSA werden die Zellen mit 100 µl Reagenz B (Fix and Perm Kit) permeabilisiert. Für die indirekte Doppelmessung von Bcl-2 und Bax erfolgt eine 15minütige Inkubation mit 5 µl des monoklonalen Anti-Bcl-2-Antikörpers (Konzentration 100 µg/ml, Hamster-anti-Mensch-Bcl-2, Pharmingen, San Diego, CA, USA) und 2 µl des monoklonalen anti-Bax-Antikörpers (Konzentration 1 µg/µl, Maus-Anti-Mensch-Bax, Immunotech, Marseille, Frankreich) bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss. 2 Material und Methoden 23 Die Kontrollprobe für die Isotypenkontrolle wird mit 1 µl Hamster-IgG-Antikörper (Konzentration 500 µg/ml) und 20 µl Maus-IgG-Antikörper (Konzentration 50 µg/ml, beides Pharmingen) versetzt und ebenfalls für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit 1×PBS/1% BSA werden alle Proben mit 100 µl Reagenz B, sowie mit 2 µl eines FITC-markierten Ziege-anti-Hamster-IgG (Konzentration 1 mg/ml, Dianova, Hamburg) und 10 µl eines PE-markierten Hasen-Anti-Maus-IgG (Konzentration 500 µg/ml, DAKO, Carpinteria, CA, USA) als Zweitantikörper 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Nach Waschen mit 1×PBS und Zugabe von 200 µl 1×PBS erfolgt die Quantifizierung der Bcl-2 und Bax Proteinexpression am Durchflusszytometer. Durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz der zugehörigen IgG-Isotypenkontrolle wird die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Bcl-2 und Bax Proteinexpression über einen Zeitraum von 72 Stunden bestimmt. 2.5 Molekularbiologische Methoden 2.5.1 Trizol-Isolation von Gesamt-RNA und photometrische Konzentrationsbestimmung Die Gesamt-RNA wird aus einer Zellsuspension mit 1×107 Zellen/ml zu den Zeitpunkten 0 Stunden, 4 Stunden, 8 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden unter Verwendung der Trizol-RNA-Extraktions-Methode, wie in den Herstellerhinweisen beschrieben, isoliert. Die Proben werden bis zur photometrischen Bestimmung der RNAKonzentration bei –80°C gelagert. Die Konzentration der Gesamt-RNA wird nach Messung der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) anhand folgender Formel errechnet: KonzentrationRNA [µg/µl] = OD260 × 40µg* × VF/ 1000 µl VF = Verdünnungsfaktor *Bei Bestimmung der Extinktion von RNA und sDNA: 40µg *Bei Bestimmung der Extinktion von dDNA: 50µg 2 Material und Methoden 24 2.5.2 Reverse Transkription mRNA wird mit Hilfe der Reversen Transkription (RT) in cDNA umgeschrieben. Dazu werden 4 µg RNA und 0,5 µl Oligo-dT mit DEPC-H2O zu einem Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Nach Inkubation bei 70°C für 5 Minuten, um ein Annealing der Oligo-dTPrimer an die mRNA zu ermöglichen, wird den Proben auf Eis je 10 µl Mastermix (6 µl First-Strand-Puffer, 2 µl dNTP (10mM), 0,9 µl DTT, 0,5 µl RNase-Inhibitor und 0,6 µl Reverse Transkriptase (MLV-RT)) zugefügt und bei 42°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Inaktivierung der Reversen Transkriptase erfolgt durch 5minütige Hitzedenaturierung bei 95°C. Auf Eis wird das Volumen mit DEPC-H2O auf 50 µl aufgefüllt. Mit einer GAPDHPCR wird der Erfolg der reversen Transkription kontrolliert (siehe Kapitel 1.5.3). 2.5.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 3 µl der zu untersuchenden cDNA werden mit 47 µl Master-Mix (34,7 µl H2O, 4 µl MgCl2 (25 mM), 5 µl PCR-Puffer II (10x), 1 µl dNTP (10 mM), 1 µl Primer 5` (20 pmol/µl), 1 µl Primer 3` (20 pmol/µl), 0,3 µl Taq-Polymerase (5U/µl)) vermischt und mittels Gene Amp PCR-Zyklen (Perkin Elmer) amplifiziert. Bei jeder Analyse wird eine Positiv- und Negativkontrolle (H2O) mitgeführt. Es werden folgende Programme verwendet: BIRC2: 35 Zyklen 95°C 95°C 63°C 72°C 72°C 4°C 1:45 0:30 0:45 0:45 7:00 ∞ BIRC3: 35 Zyklen 95°C 95°C 59°C 72°C 72°C 4°C 1:45 0:30 0:45 0:45 7:00 ∞ BIRC4: 35 Zyklen 95°C 95°C 64°C 72°C 72°C 4°C 1:45 0:30 0:45 0:45 7:00 ∞ GAPDH: 25 Zyklen 95°C 95°C 55°C 72°C 72°C 4°C 1:45 0:30 0:45 0:45 7:00 ∞ 2.5.4 Gelelektrophorese zur DNA-Fragmentanalyse Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe werden nichtdenaturierende Agarose-Gele mit variabler Dichte von 0,5–3% Agarose in Abhängigkeit von der Fragmentlänge der untersuchten DNA eingesetzt. Nach Lösen der Agarose in 2 Material und Methoden 25 1×TBE (2,25 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA; pH 8,0) bei 100°C und Zugabe von Ethidiumbromid werden die Gele horizontal in IBI-Gelkammern gegossen. Die zu analysierende DNA-Probe wird vor dem Auftragen auf das Gel mit DNA-Ladepuffer im Verhältnis 4:1 gemischt. Die Elektrophorese wird in 1×TBE als Laufpuffer abhängig von der Gelkonzentration mit einer Stromstärke von 100 mA bis 150 mA durchgeführt. Als standardisierter Längenvergleich wird ein 100 Basenpaar-Marker mit auf das Gel aufgetragen. Eine Visualisierung des Ergebnisses erfolgt unter UV-Licht. 2.5.5 RNase Protection Assay (RPA) 10 µg der zu untersuchenden mRNA werden mit einem 32P-markierten Anti-Sense-RNAPool hybridisiert, der durch in-vitro-Transkription aus einem DNA-Template-Set nach den Anweisungen des Herstellers (Pharmingen, San Diego, USA) synthetisiert wird. Zur Degradation ungebundener Einzelstrang-RNA und des ungebundenen 32 P-markierten RNA-Pools wird die mRNA mit einzelstrangspezifischer RNase inkubiert. Die größenspezifische Auftrennung des Hybridisierungsprodukts erfolgt in einer denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE, 7.5% Polyacrylamid, 7 M Urea) in 0,5×TBE bei 70 Watt 2,5 Stunden lang. Das Ergebnis wird durch Autoradiographie auf Kodak-Film dokumentiert. Zur semiquantitativen Analyse der Gele wird die β-Radioaktivität jeder Probe am Phosphorimager bestimmt. 2.5.6 Western-blot-Analysen zur Untersuchung von Proteinen Zur Proteingewinnung wird ein Zellpellet von 1×107 Zellen nach einem zweimaligen Waschschritt mit 1×PBS auf Eis in 500µl–1000µl Lysepuffer I (10 mM Tris-Puffer, pH 7,3, 0,15 M NaCl, 0,01 M MgCl2, 0,05% NP40, 1 mM PMSF, 0,1 mM PLA) resuspendiert. Die Zelllyse erfolgt unter ständiger Rotation für 30 Minuten bei 4°C. Nach 5minütiger Zentrifugation mit 10000×g bei 4°C und Entfernung des Überstands wird das Zelllysat bei –80°C gelagert. Zur Proteinbestimmung nach Bradford wird 1 ml der ProteinAssay 5×Stammlösung nach Verdünnung mit H20 (Verhältnis 1:4) mit je 5 µl Proteinlösung vermischt. Die photometrische Bestimmung erfolgt mit einem Doppelansatz bei 595 nm. Mit Hilfe einer Eichkurve kann die Proteinmenge in µg/µl errechnet werden. Zur Auftrennung der Proteine wird eine SDS-Polyacrylamid Gel-Elekrophorese (SDSPAGE) verwendet, bestehend aus Trenngel (8-15% PAA, 0,375 M Tris Base pH 8,0, 0,1% 2 Material und Methoden 26 SDS, 0,1% APS, 0,02-0,1% Temed) und Sammelgel (5,1% PAA, 12 mM Tris Base pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% APS, 0,1% Temed). Das Sammelgel erlaubt eine Konzentrierung der Proteine, damit sie in einer Lauffront in das Trenngel einlaufen. Je nach Proteingröße wird die Polyacrylamid-Konzentration des Trenngels zwischen 8% und 15% Polyacrylamid (PAA) gewählt. Das Trenngel wird nach dem Gießen mit 400µl Butanol überschichtet. Nach ca. 20 –30 Minuten ist das Gel polymerisiert, das Butanol wird verworfen und das Trenngel wird mit dem Sammelgel überschichtet. Die Protein-Proben werden mit Laemmlie-Puffer (500 mM Tris HCL, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenol Blau, 10% Glycerol, pH 6,8) 1:1 gemischt und 5 Minuten bei 95°C denaturiert. Als Laufpuffer dient 1×Tris-Glycin-Elektrophorese-Puffer (125 mM Tris Base, pH 8,3, 1,25 M Glycin, 0,5% SDS). Die Gelelektrophrese wird mit 80V gestartet. Nach Einlaufen der Proben ins Trenngel wird die Spannung auf 120-140V erhöht. Zur Darstellung elektrophoretisch aufgetrennter Proteine werden diese auf ImmobilonPolyvinylidin-Difluorid (PDVF)-Membranen übertragen. Dieser Vorgang erfolgt bei einer Proteingröße über 80 kDa durch Tank Blotting, wofür Chromatographie-Papiere in Blotting-Puffer getränkt werden. In einer mit Blotting-Puffer gefüllten Wanne werden auf zwei Chromatographie-Papiere die in Methanol getränkte Membran, darüber das Trenngel und zwei weitere Chromatographie-Papiere geschichtet. Geblottet wird 2 Stunden lang bei einer Stromstärke von 1000 mA. Danach kann die Transfermembran 15 Minuten mit Amidoschwarz (0,2% Naphtol Blau Schwarz, 25% Isopropanol, 10% Essigsäure) angefärbt und anschließend mit Amidoschwarz-Entfärbelösung (25% Isopropanol, 10% Essigsäure) entfärbt werden, um dadurch eine gleichmäßige Beladung der Membran zu dokumentieren. Vor der Detektion einzelner Proteine wird die Transfermembran mit Milchproteinen (1×PBS, 0,05% Tween, 5% Magermilchpulver) 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, um eine unspezifische Hintergrund-Markierung zu reduzieren. Zur Detektion spezifischer Proteine wird die Transfermembran mit einer entsprechenden Antikörperlösung inkubiert. Die verwendeten Antikörper werden in Verdünnungen zwischen 1:100 und 1:10000 in 1×PBS/0,05% Tween eingesetzt. Die Inkubation erfolgt 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständiger Bewegung, um eine gleichmäßige Benetzung der Transfermembran während der Inkubationszeit zu gewährleisten. Nach erneutem Waschen (dreimal 15 Minuten mit 1×PBS/0,05%-0,2% Tween) erfolgt die Detektion mit einem Peroxidase-gekoppelten FC-Antikörper und nachfolgender Chemilumineszenz-Reaktion. 2 Material und Methoden 27 2.6 Statistik Die Ergebnisse einer Untersuchungsreihe werden durch die Einzelwerte, die dazugehörigen Mediane und die jeweiligen oberen und unteren Quartile dargestellt. Zur statistischen Analyse von Unterschieden der medianen Apoptoseraten zwischen vorbehandelten und nicht-vorbehandelten Patientenproben, deren Zellen mit 0,15 µg/ml Epirubicin oder Kontrollmedium inkubiert werden, wird der Mann-Whitney-Test (=UTest) verwendet. Beim Vergleich der Apoptoseraten einer Kombinationstherapie aus Fludarabin und Epirubicin mit der errechneten Summe der Apoptosraten der Einzelsubstanzen wird unter Verwendung des Wilcoxon-Tests die statische Signifikanz untersucht. Dieser Test wird auch zur Überprüfung eines statisch signifikanten Unterschieds der Apoptoseraten ohne IL-2-Inkubation und mit IL-2-Inkubation verwendet. Um die unterschiedlichen Apoptoseraten von Proben vorbehandelter und nichtvorbehandelter Patienten zu vergleichen, wird der Mann-Whitney-Test (=U-Test) verwendet. Mit Hilfe des Wilcoxon-Tests werden Änderungen der Apoptoseraten nach IL2-Vorinkubation und Apoptoseinduktion mit Epirubicin oder einem agonistischen IgMAntikörper, teilweise auch mit dem NO-Synthetaseinhibitor L-NAME untersucht, im Vergleich zu B-CLL-Zellen, die nicht mit IL-2 vorbehandelt werden. In allen Tests ergibt sich eine statistische Signifikanz bei einem p-Wert von ≤ 0,05. 3 Ergebnisse 3.1 Zytotoxizität von Epirubicin gegenüber B-CLL-Zellen 3.1.1 Dosis- und zeitabhängige Kinetik der Apoptoseinduktion durch Epirubicin Um die Dosis-Empfindlichkeit sowie das zeitabhängige Apoptose-Verhalten von B-CLLZellen gegenüber Epirubicin zu untersuchen, werden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des Zytostatikums Epirubicin (0,07 µg/ml, n=27; 0,15 µg/ml, n=28; 0,25 µg/ml, n=19; 0,35 µg/ml, n=24; 0,7 µg/ml, n=9) inkubiert. Als Negativkontrolle dienen BCLL-Zellen, die in RPMI-Medium ohne Zusatz von Epirubicin kultiviert werden. Die Apoptoseraten werden nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden durchflusszytometrisch unter Verwendung von 7-AAD gemessen. Aus diesen Rohdaten werden die drug-spezifischen Apoptoseraten für die jeweiligen Epirubicin- Konzentrationen und die verschiedenen Zeitpunkte berechnet (s. Material und Methoden). Für Epirubicin lässt sich in B-CLL-Zellen eine dosis- und zeitabhängige Apoptosesteigerung zeigen. Die medianen Apoptoseraten der B-CLL-Zellen für die verschiedenen Epirubicin-Konzentrationen reichen von 5,0% bei einer Konzentration von 0,07µg/ml bis 82,6% bei 0,7µg/ml nach 24 Stunden und von 30,0% bei 0,07µg/ml bis 100% bei 0,7µg/ml nach 72 Stunden (Abbildung 3.1). Der Median der Spontan-Apoptose der Kontrollpopulation beträgt 12,5% (unteres Quartil: 8,3% -oberes Quartil: 17,4%) nach 24 Stunden, 17,3% (10,7%-21,9%) nach 48 Stunden und 12,9% (7,7%-17,1%) nach 72 Stunden (Daten nicht gezeigt). Mediane der drug-spezifischen Apoptoserate [%] 3 Ergebnisse 29 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0h 24 h 0,07 µg/ml 0,15 µg/ml 48 h 0,25 µg/ml 0,35 µg/ml 0,7 µg/ml 72 h Zeit Abbildung 3.1: Mediane drug-spezifischer Apoptoseraten für verschiedene Epirubicin-Konzentrationen. BCLL-Zellen werden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Epirubicin (0,07µg/ml, n=27; 0,15µg/ml, n=28, 0,25µg/ml, n=19; 0,35µg/ml, n=24;0,7µg/ml, n=9) inkubiert. Die Apoptoseraten werden nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden gemessen. Es zeigen sich Apoptoseraten zwischen 5,0% (0,07µg/ml) und 82,6% (0,7µg/ml) nach 24 Stunden und zwischen 30,0% (0,07µg/ml) und 100% (0,7µg/ml) nach 72 Stunden. 3.1.2 Untersuchung der Epirubicin-Sensitivität von B-CLL-Zellen bei vortherapierten und nicht-vorbehandelten Patienten Um den möglichen Einfluß einer Vortherapie auf die Zytotoxizität von Epirubicin bei BCLL-Zellen zu untersuchen, werden die erhobenen Apoptoseraten in Relation zum Vorbehandlungsstatus der Patienten gesetzt. Hierzu werden B-CLL-Zellen von vorbehandelten (n=16) und nicht behandelten (n=13) Patienten mit 0,15 µg/ml Epirubicin inkubiert. 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe des Zytostatikums wird die Apoptoserate durchflusszytometrisch mit 7-AAD bestimmt. Wie in Abbildung 3.2 zu sehen ist, zeigt die spontane Apoptoserate bei Inkubation ohne Epirubicin keinen Unterschied zwischen vortherapierten und nicht-vorbehandelten Patienten über einen Zeitraum von 72 Stunden. Bei den mit Epirubicin behandelten Zellen zeigt sich nach 24 Stunden eine 1,7-fache, nach 48 Stunden eine 1,6-fache und nach 72 Stunden eine 1,3fache Abnahme der Apoptoserate bei vortherapierten Patienten. Diese war im MannWhitney-Test nicht signifikant. 3 Ergebnisse 30 A 100 90 % apoptotische Zellen 80 n. s. n. s. (-1,7) 70 60 50 40 30 20 10 0 24 h Kontrolle 24 h Kontrolle 24 h Epirubicin 24 h Epirubicin (vortherapiert) (vortherapiert) B 100 90 n. s. n. s. (-1,6) % apoptotische Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 C 100 48 h Kontrolle 48 h Kontrolle 48 h Epirubicin 48 h Epirubicin (vortherapiert) (vortherapiert) n. s. n. s. (-1,3) 90 % apoptotische Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 72 h Kontrolle 72 h Kontrolle 72 h Epirubicin 72 h Epirubicin (vortherapiert) (vortherapiert) Abbildung 3.2: Epirubicin-Sensitivität von B-CLL-Zellen bei vorbehandelten und nicht-vorbehandelten Patienten. B-CLL-Zellen von 16 unbehandelten (■) und 13 vorbehandelten (□) Patienten unterscheiden sich nicht in ihrer Spontanapoptoserate über einen Zeitraum von 72 Stunden. Bei Inkubation mit 0,15µg/ml Epirubicin zeigt sich nach 24 Stunden eine 1,7-fache (A), nach 48 Stunden eine 1,6-fache (B) und nach 72 Stunden eine 1,3-fache (C) Abnahme der Apoptoserate bei vortherapierten Patienten. 3 Ergebnisse 31 Zusätzlich wird bei diesem Patientenkollektiv die LD50-Konzentration ermittelt. Hierzu werden die in 1.1.1 gemessenen Apoptoseraten der unterschiedlichen EpirubicinKonzentrationen (0,07 µg/ml, 0,15 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,35 µg/ml, 0,7 µg/ml) nach 48 Stunden verwendet. Die LD50-Konzentration für B-CLL-Zellen von vorbehandelten Patienten ist mit 0,20 µg/ml nur geringfügig höher als die LD50-Konzentration für B-CLLZellen von nicht-vorbehandelten Patienten (0,18 µg/ml) (Abbildung 3.3). Die LD50Konzentrationen zu den Zeitpunkten 24 Stunden und 72 Stunden zeigen keinen wesentlichen Unterschied im Verhalten der vorbehandelten und nicht-vortherapierten BCLL-Zellen (Daten nicht gezeigt). LD50 bei vorbehandelten und nicht-vortherapierten Patienten 100 % apoptotische Zellen 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,07 µg/ml 0,15 µg/ml 0,25 µg/ml LD 50 nicht-vorbehandelt vorbehandelt 0,35 µg/ml 0,7 µg/ml Epirubicin-Konzentration Abbildung 3.3: Im Vergleich der LD50-Konzentrationen bei B-CLL-Zellen von nicht vortherapierten Patienten (■) und von bereits vortherapierten Patienten (□) zeigt sich eine nur geringfügig höhere Epirubicin-Konzentration (0,18 µg/ml vs. 0,20 µg/ml) in der Gruppe der vortherapierten Patienten, die zum Erreichen der LD50 nötig ist. 3.1.3 Analyse der zytostatischen Wirkung des Anthrazyklins Epirubicin Um bei der zytostatischen Wirkung von Epirubicin zwischen Apoptose und Nekrose differenzieren zu können und um die Apoptose-Ergebnisse, die mittels FACS-Analyse erhoben werden, zu bestätigen, wird ein Poly-ADP-Ribose-Polymerase(PARP)-Western Blot durchgeführt. 1×107 Zellen/ml werden in RPMI-Medium oder unter Zusatz von 0,15 µg/ml Epirubicin für 36 Stunden kultiviert. Als Positivkontrolle dienen Zellen, die mit 0,7 µg/ml Fludarabin inkubiert werden. Nach Proteinextraktion aus 1×107 Zellen wird die Proteinfraktion durch eine SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) 3 Ergebnisse 32 aufgetrennt und durch Tankblotting auf eine Immobilon-Polyvinylidin-Difluorid(PDVF)Membran übertragen. apoptosespezifische 89 Das native PARP-Proteinmolekül kDa-Fragment werden durch (113 kDa) und das Antikörpermarkierung und Chemilumineszenzreaktion detektiert. Sowohl nach Fludarabin-Inkubation als auch nach Epirubicin-Inkubation kann eine Spaltung des 113 kDa PARP-Proteins in ein 89 kDa Proteinfragment nachgewiesen Epirubicin Fludarabin Medium werden (Abbildung 3.4). 113 kDa PARP 89 kDa PARP Abbildung 3.4: PARP-Westernblot zur Differenzierung zwischen Nekrose und Apoptose. B-CLL-Zellen werden mit Fludarabin oder Epirubicin inkubiert. Als Negativkontrolle werden die B-CLL-Zellen in RPMIMedium ohne Zusätze kultiviert. Sowohl in der Positivkontrolle (Fludarabin) als auch bei mit Epirubicin inkubierten B-CLL-Zellen zeigt sich die charakteristische Spaltung des nativen PARP (113 kDa) in das 89 kDa PARP-Fragment. 3.1.4 Kombinationseffekte von Epirubicin und Fludarabin bei B-CLL-Zellen Da in neueren klinischen Therapiekonzepten die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie von Epirubicin und Fludarabin bei Patienten mit B-CLL hinsichtlich ihrer synergistischen Effekte untersucht wird, wird diese Kombination in vitro getestet. Hierzu werden 1×106 BCLL-Zellen/ml von 30 Patienten in RPMI-Medium, mit 0,15 µg/ml Epirubicin, 0,7 µg/ml Fludarabin oder einer Kombination aus beiden Zytostatika mit oben genannten Konzentrationen inkubiert. Nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden wird die erreichte Apoptose durchflusszytometrisch bestimmt. Nach Summation der Einzelapoptoseraten beider Zytostatika werden diese mit der tatsächlich gemessenen Apoptose der Kombinationstherapie verglichen: Nach 24 Stunden zeigen 27/30 Proben einen synergistischen Effekt in der Kombinationstherapie aus Fludarabin und Epirubicin (Synergismus ist definiert als ein Anstieg der Apoptoserate um mindestens 5% gegenüber der errechneten Summe der Einzelapoptoseraten aus 0,15 µg/ml Epirubicin und 0,7 µg/ml Fludarabin). Der mediane Apoptose-Anstieg der Kombinationstherapie beträgt 72% nach 24 Stunden. Dieses Ergebnis ist im Wilcoxon- 3 Ergebnisse 33 Test (p<0,001; Abbildung 3.5) statistisch signifikant bei einer errechneten medianen Apoptose von 11,62% und einer gemessenen medianen Apoptoserate der Kombinationstherapie von 19,96%. Nach 48 Stunden kann bei 15/30 Proben ein synergistischer Effekt der Kombinationstherapie erzielt werden. Dabei ergab sich in den Proben der Kombinationstherapie eine mediane Apoptoserate von 72%. Die mediane Einzel-Apoptoserate von Fludarabin beträgt 25,8% und von Epirubicin 37,2%. Der mediane Apoptose-Anstieg gegenüber der errechneten Summe (58,8%) von 22% ist im Wilcoxon-Test (p=0,69; Abbildung 3.5) statistisch nicht signifikant. In 8/15 Proben ohne synergistische Wirkung nach 48 Stunden ist dies durch eine hohe Einzel-Apoptoserate (≥40%) zu erklären. Hierdurch ist die Detektion eines Synergismus nicht mehr möglich. In den Proben (n=6), die mit niedrigeren Konzentrationen von Fludarabin (0,35 µg/ml) und Epirubicin (0,07µg/ml) inkubiert werden, zeigt sich über einen Zeitraum von 72 Stunden ebenfalls ein Wirkungssynergismus der Kombinationstherapie im Vergleich zur errechneten Summe der Einzelsubstanzen. Statistische Signifikanz mit Hilfe des WilcoxonTests kann nach 48 Stunden gezeigt werden (p<0,05), nicht jedoch nach 72 Stunden (p=0,11) (Daten nicht dargestellt). 100 n.s. Mediane apoptotischer Zellen 90 80 + 22% 70 60 50 p<0,001 40 30 + 72% 20 10 0 Fludarabin 24 h Epirubicin 48 h Summe Fludarbin + Epirubicin Zeit Fludarabin + Epiuribicin Abbildung 3.5: Apoptoseraten der Kombinationstherapie Fludarabin/Epirubicin. 1×106Zellen/ml werden mit 0,15 µg/ml Epirubicin, 0,7 µg/ml Fludarabin oder mit einer Kombination beider Chemotherapeutika inkubiert (n=30). Nach 24 Stunden kann in der Kombination aus Fludarabin und Epirubicin ein medianer Anstieg der Apoptoserate von 72% gegenüber der Summe der Einzelsubstanzen erreicht werden (p<0,001). Nach 48 Stunden steigt die mediane Apoptoserate der Kombinationstherapie um 22% (p=0,69). 3 Ergebnisse 34 3.2 Bcl-2- und Bax-Expression bei B-CLL-Lymphozyten unter Epirubicin-Inkubation 3.2.1 Bcl-2- und Bax-Proteinexpression unter 0,15 µg/ml Epirubicin Nach Inkubation mit Epirubicin wird die Proteinexpression von Bcl-2 und dessen Gegenspieler Bax in B-CLL-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. 1×106 B-CLL-Zellen/ml von 15 Patienten werden mit 0,15 µg/ml Epirubicin inkubiert und die Proteinexpression von Bcl-2 und Bax über einen Zeitraum von 48 Stunden untersucht. Als Negativkontrolle werden B-CLL-Zellen in RPMI-Medium inkubiert. Die MFI (mean fluorescent intensity) der Bcl-2- und Bax-Expression liegt in den Kontrollen zwischen 6 und 76 für Bcl-2 und bei 7-97 für Bax. In B-CLL-Zellen, die mit Epirubicin inkubiert werden, liegen die MFI-Werte bei 1-113 für Bcl-2 und zwischen 0 und 55 für Bax. Die mediane Bcl-2- und Bax-Proteinexpression der mit Epirubicin inkubierten Proben zeigt dabei keinen signifikanten Unterschied (>1log der mean fluorescent intensity) im Vergleich mit der medianen Bcl-2- und Bax-Proteinexpression der Kontrollpopulation (Abbildung 3.6). A Bcl-2-Expression Fluoreszenzintensität 100 10 1 0h 24 h Kontrolle 48 h Epirubicin Zeit 3 Ergebnisse 35 B Bax-Expression Fluoreszenzintensität 100 10 1 0h 24 h Kontrolle 48 h Zeit Epirubicin Abbildung 3.6: Bcl-2- und Bax-Proteinexpression bei B-CLL Zellen unter Inkubation mit Epirubicin. Über einen Zeitraum von 48 Stunden zeigen sich keine signifikanten Unterschiede (>1log der mean fluorescent intensity) in der Bcl-2(A)- und Bax(B)-Proteinexpression im Vergleich zur Kontrollpopulation. 3.2.2 Bcl-2- und Bax-mRNA-Expression unter 0,15 µg/ml Epirubicin Um die Ergebnisse der Bcl-2- und Bax-Proteinexpression auf mRNA-Ebene zu überprüfen, werden RNase-Protection-Assays (n=3) durchgeführt. Dazu werden 1×107 Zellen/ml mit 0,15 µg/ml Epirubicin inkubiert und zu Beginn der Untersuchungsreihe (0 Stunden), nach 2 Stunden, 4 Stunden, 8 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden die GesamtRNA nach der im Arbeitsprotokoll beschriebenen Extraktionsmethode isoliert. 10 µg der Proben-RNA werden mit 32 P-markierter anti-sense RNA für Bcl-2, Bax und L32 hybridisiert und in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Unter Inkubation mit Epirubicin zeigt sich kein signifikanter Unterschied in der Bcl-2- und Bax-mRNA Expression über einen Zeitraum von 48 Stunden (Abbildung 3.7). Zur Quantifizierung der Ergebnisse wird die Expression für Bcl-2 und Bax in Relation zur Expression des House-Keeping-Gens L32 gesetzt. Auch hierbei zeigt sich keine signifikante Zu- oder Abnahme der Expression von Bcl-2 und Bax (Abbildung 3.8). 3 Ergebnisse 36 Patient 40 0 2 4 8 24 48 Zeit [h] bax bcl-2 L32 Abbildung 3.7: RNase-Protection-Assay für Bcl-2, Bax und L32. Autoradiographie eines Patienten: 1×107 Zellen/ml werden mit 0,15 µg/ml Epirubicin für 48 Stunden inkubiert. Nach 0 Stunden, 2 Stunden, 4 Stunden, 8 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden wird die Gesamt-RNA von 1x107 Zellen isoliert und mit 32P-markierter anti-sense RNA hybridisiert. Aufgrund der hohen Apoptoserate kann nach 48 Stunden bei dem dargestellten Patienten keine ausreichende Menge an RNA extrahiert werden. L32 wird als House-Keeping-Gen zur Kontrolle des RPA eingesetzt. bcl-2/bax-mRNA-Expression unter Epirubicin relative Expression 30 20 10 0 2 Std. 4 Std. 8 Std. 24 Std. 48 Std. bcl-2/L32-Ratio 23,17 14,7 18,55 14,57 13,57 bax/L32-Ratio 20,05 15,17 20,02 21,02 19,6 Abbildung 3.8: Bei der Quantifizierung der relativen Expression von Bcl-2 und Bax können über einen Zeitraum von 48 Stunden in den RNA-Expressionsmustern von Bcl-2 und Bax in Relation zum House-Keeping-Gen L32 keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden. 3.3 CD95-Präsenz auf der Zelloberfläche von B-CLL-Zellen 3.3.1 Änderung der CD95-Expression durch Interleukin 2 Inkubation An 29 Proben von B-CLL Patienten wird der CD95-Rezeptorstatus unter Inkubation mit Interleukin 2 (IL-2) analysiert. Nach der Zellseparation werden 1×106Zellen/ml für 72 3 Ergebnisse 37 Stunden mit 10000 UI/ml IL-2 inkubiert. Die CD95-Expression wird zum Zeitpunkt 0 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe von IL-2 durchflusszytometrisch bestimmt. Beispiele sind in Abbildung 3.9 gezeigt. A Pat.36 FAS 0h FAS FAS 72 h ohne IL2 72 h mit IL2 FAS FAS FAS 0h 72 h ohne IL2 72 h mit IL2 B Pat.20 C Pat.21 FAS FAS FAS 0h 72 h ohne IL2 72 h mit IL2 Abbildung 3.9: CD95-Expression unter IL-2 Inkubation, exemplarisch bei 3 Patienten. Das grüne Histogramm stellt die Isotypenkontrolle dar, während das blaue Histogramm das Expressionsniveau der zu messenden Population anzeigt. A: Bei Patienten mit anfänglich negativem Rezeptorstatus kann nach einer 72stündigen Inkubation mit 10000 IU/ml IL-2 der CD95-Rezeptor nachgewiesen werden. B: Bei dieser B-CLL Probe bleibt auch nach Inkubation mit IL-2 über 72 Stunden der CD95-Rezeptor negativ. C: Bereits inital zeigt diese Patientenprobe einen positiven CD95-Rezeptorstatus, der auch nach 72stündiger Inkubation positiv bleibt. 25/29 Proben (86%) zeigen einen initial negativen CD95-Rezeptorstatus. Durch Zugabe von IL-2 kann bei 19/25 (76%) Proben nach 72 Stunden eine Expression des CD95Rezeptors auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. 6/25 Patienten (24%) zeigen nach 72stündiger Inkubation weiter einen negativen Rezeptorstatus. Bei vier B-CLL Proben bleibt ein initial positiver Rezeptorstatus unter IL-2 Inkubation positiv (Tabelle 3.1). 3 Ergebnisse 38 Tabelle 3.1: CD95-Expression bei 29 Patientenproben vor und nach Inkubation mit IL-2 CD95-Expression vor IL-2 Inkubation CD95-Expression nach IL-2 Inkubation 6 negativ (24%) 25 negativ (86%) 19 positiv (76%) 0 negativ (0%) 4 positiv (14%) 4 positiv (100%) 3.3.2 Dauer der CD95-Expression auf der Zelloberfläche An vier Patienten wird die Dauer der CD95-Rezeptor-Antigenpräsentation nach Entfernen des IL-2 aus dem Kulturmedium untersucht. Hierzu werden 1×106Zellen/ml für 72 Stunden mit 10000 UI/ml IL-2 versetzt, anschließend gewaschen und erneut in RPMI-Medium kultiviert. Die CD95Antigenpräsenz kann über einen Zeitraum von bis zu 16 Tagen durchflusszytometrisch nachgewiesen werden (Abbildung 3.10). Danach zeigt sich ein Grossteil der Zellen apoptotisch. Pat. 40 Mit IL-2 Tag 3 Tag 0 vor IL-2-Inkubation Mit IL-2 Tag 8 Tag 12 Tag 16 Abbildung 3.10: Dauer der CD95-Antigenpräsentation. Dargestellt ist exemplarisch bei 1/4 untersuchten Patienten die Dauer der CD95-Expression nach Stimulation mit IL-2. Diese kann über einen Zeitraum von bis zu 16 Tagen durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. 3 Ergebnisse 39 3.4 Apoptoseinduktion 3.4.1 Apoptoseinitiierung durch alleinige CD95-Präsenz Bei 25/29 der oben genannten Patienten wird nach 72stündiger Inkubation mit IL-2 die Apoptoserate unter Verwendung von 7-AAD bestimmt, um eine mögliche ApoptoseStimulation durch alleinige Präsenz des CD95-Rezeptors auf der Zelloberfläche zu untersuchen. Die Kontrollpopulation wird analog ohne Zugabe von IL-2 behandelt. Es zeigt sich in den mit IL-2 inkubierten Populationen ohne Veränderung des CD95Rezeptorantigens (4 Proben CD95-negativ, 3 Proben CD95-positiv) bei geringer Fallzahl eine im Median um 10% verminderte Apoptoserate im Vergleich zu den Kontrollpopulationen, die im Wilcoxon-Test statistisch nicht signifikant ist (Abbildung 3.11 A). Bei Veränderung des CD95-Rezeptorantigens (n=18) sinkt die mediane Apoptoserate um 4% in den mit IL-2 inkubierten Proben mit statistischer Signifikanz im Wilcoxon-Test (p<0,05, Abbildung 3.11 A). Zusätzlich wird die Auswirkung der IL-2 Inkubation auf die Apoptoserate in Relation zum Vorbehandlungsstatus der Patienten gesetzt. Hierbei zeigt sich keine Veränderung der Apoptoserate zwischen vortherapierten (n=13) und nicht-vorbehandelten (n=12) Patientenproben unter IL-2 Inkubation (Mann-Whitney-Test, p=0,83; Abbildung 3.11 B). Eine um 14% höhere mediane Spontanapoptoserate in den Proben vortherapierter Patienten ist im Vergleich mit der medianen Spontanapoptoserate von Proben nicht-vorbehandelter Patienten statistisch nicht signifikant (Mann-Whitney-Test, p=0,27). 3 Ergebnisse 40 A Apoptoserate nach IL-2 Stimulation in Abhängigkeit vom CD95-Antigenstatus 100 I negativ => positiv II negativ => negativ positiv => positiv III 90 p<0,05 80 n. s. n. s. Apoptoserate 70 60 50 40 30 20 10 0 ohne IL-2 mit IL-2 ohne IL-2 mit IL-2 ohne IL-2 mit IL-2 Einfluss von IL-2 auf die Apoptoseraten von vorbehandelten und nichtvorbehandelten Patienten B 100 90 80 I II n.s. n.s. Apoptoserate 70 60 50 40 30 20 10 0 Ohne IL-2 Mit IL-2 ohne Vortherapie mit Vortherapie ohne Vortherapie mit Vortherapie Abbildung 3.11: Apoptoserate unter IL-2 Inkubation. A: Auswirkung der IL-2 Stimulation auf die Apoptoserate in Abhängigkeit vom CD95-Rezeptorstatus. In den mit IL-2 inkubierten Patientenproben zeigt sich ohne Veränderung des CD95-Rezeptorantigens (II: 4 Proben CD95negativ, III: 3 Proben CD95-positiv) bei geringer Fallzahl eine im Median um 10% verminderte Apoptoserate im Vergleich zu den Kontrollpopulationen, die im Wilcoxon-Test statistisch nicht signifikant ist. Bei Veränderung des CD95-Rezeptorantigens (n=18, I) sinkt die mediane Apoptoserate um 4% in den mit IL-2 inkubierten Proben mit statistischer Signifikanz im WilcoxonTest (p<0,05). I: Patientenproben mit initial negativem CD95-Rezeptorstatus, die unter Inkubation mit IL-2 CD95 exprimieren, II: unter Inkubation mit IL-2 anhaltend negativer CD95Rezeptorstatus, III: bereits initial positiver Rezeptorstatus. B: Auswirkung der IL-2 Inkubation auf die Apoptoserate in Relation zum Vorbehandlungsstatus der Patienten. Unter IL-2 Inkubation (II) zeigt sich keine signifikante Veränderung der Apoptoserate in Abhängigkeit vom 3 Ergebnisse 41 Vorbehandlungsstatus der Patienten (Mann-Whitney-Test). In den Proben ohne IL-2 Inkubation (I) zeigt sich eine statistisch nicht signifikante höhere Spontanapoptoserate in der Gruppe der vortherapierten Patienten (Mann-Whitney-Test). Dargestellt sind die Einzelapoptoseraten ■, sowie der Median ─. 3.4.2 Apoptoseinduktion durch agonistischen apoptoseinduzierender Ligand des CD95-Rezeptors IgM-Antikörper als Bei 21 Patienten wird nach Inkubation mit IL-2 zur Induktion der CD95-AntigenExpression die apoptotische Wirkung eines agonistischen IgM-Antikörpers, der eine CD95-Rezeptor-Liganden-Interaktion simuliert, durchflusszytometrisch untersucht. Nach Vorinkubation von 1×106Zellen/ml mit 10000 IU/ml IL-2 für 72 Stunden wird 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe von 100 ng/ml des agonistischen IgMAntikörpers die induzierte Apoptose durchflusszytometrisch gemessen. In der Kontrollpopulation findet keine Vorinkubation mit IL-2 statt. Sowohl in den Patientenproben, die eine Expression des CD95-Rezeptors auf der Zelloberfläche zeigen (17/21) als auch in den Patientenproben ohne CD95-Expression (4/21) kann eine proapoptotische Wirkung des IgM-Antikörpers nach IL-2 Vorinkubation bestimmt werden. Diese Wirkung ist im Wilcoxon-Test in der Gruppe der CD95-positiven Patienten statistisch signifikant (p<0,05, Abbildung 3.12 A), in der Gruppe der CD95negativen Patienten bei sehr niedriger Fallzahl (n=4) nicht signifikant (p=0,144, Abbildung 3.12 B). Nach 72 Stunden zeigt sich in der CD95-Rezeptor-positiven Gruppe eine im Median um 39% gesteigerte Apoptoserate im Vergleich zur Kontrollpopulation (Abbildung 3.12 A). 3 Ergebnisse 42 IgM-Apoptose bei CD95-positiven Patienten (n=17) A 100 24 h 48 h 72 h 90 % apoptotische Zellen 80 70 p<0,0005 p<0,05 p<0,001 60 50 40 30 20 10 0 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 IgM-Apoptose bei CD95-negativen Patienten (n=4) B 100 24 h n. s. 48 h n. s. 72 h n. s. 90 % apoptotische Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 Abbildung 3.12: IgM induzierte Apoptose. A: Bei 17/21 Patienten, bei denen nach 72stündiger Vorinkubation mit IL-2 der CD95-Rezeptor auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden kann, zeigt sich unter IgM-Inkubation eine statistisch signifikante Zunahme der Apoptoserate um 39% nach 72 Stunden (p<0,001). B: Bei 4/21 Patienten mit negativen CD95-Rezeptorstatus kann durch Zugabe des IgM-Antikörpers nach 72 Stunden eine Steigerung der medianen Apoptoserate um 15% erreicht werden ohne statistische Signifikanz (p=0,144). Einzelapoptoseraten ■, Median ─. 3 Ergebnisse 43 3.4.3 Steigerung der Apoptoserate durch Induktion des CD95-Rezeptorliganden mit Epirubicin B-CLL-Proben (n=21) werden nach Stimulation des CD95-Rezeptors durch IL-2 mit Epirubicin inkubiert. Hierdurch soll eine Steigerung der Apoptoserate durch eine Epirubicin-vermittelte Expression des CD95-Liganden und konsekutive autokrine Aktivierung des CD95-Rezeptors erreicht werden. 1×106Zellen/ml werden nach Vorinkubation mit 10000 IU/ml IL-2 72 Stunden lang mit 0,15 µg/ml Epirubicin inkubiert. 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Zugabe des Zytostatikums werden die Apoptoseraten durchflusszytometrisch bestimmt. Eine Kontrollpopulation wird analog, jedoch ohne Zusatz von IL-2, behandelt. Über einen Zeitraum von 72 Stunden kann im Wilcoxon-Test keine signifikante Steigerung der Apoptoseraten (>10%) im Vergleich zur Kontrollpopulation erzielt werden (Abbildung 3.13). n. s. 100 24 h n. s. 48 h n. s. 72 h 90 % apoptotische Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 Abbildung 3.13: Epirubicin-CD95 vermittelte Apoptose. Über einen Zeitraum von 72 Stunden kann über die autokrine Stimulation des CD95-Rezeptors unter Inkubation mit Epirubicin keine signifikante Steigerung der Apoptoserate im Vergleich zur Kontrollpopulation induziert werden. Einzelapoptoseraten ■, Median ─. 3.4.4 Hemmung der NO-Synthetase in B-CLL Zellen In Zellkulturmodellen ist eine protektive Wirkung der NO-Synthetase und ihres Produkts NO gegenüber der CD95-induzierten und Caspasen-vermittelten Apoptose gezeigt worden. Auch bei der B-CLL ist eine Expression der NO-Syntetase und des NO-Moleküls mit 3 Ergebnisse 44 verminderter Apoptoserate beschrieben worden. Zur Steigerung der Apoptoserate durch Hemmung der endogenen NO-Synthetase wird der NO-Synthetase-Inhibitor Nω-Nitro-LArginine-Methyl-Ester-Hydrochloride (L-NAME) eingesetzt. 1×106Zellen/ml (n=15) werden nach Vorinkubation mit IL-2 mit 0,3 mg/µl L-NAME in Kombination mit 0,15 µg/ml Epirubicin oder 100 ng/ml IgM-Antikörper über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. Die Kontrollpopulation wird analog ohne L-NAME kultiviert. Die Apoptoseraten werden durchflusszytometrisch unter Verwendung von 7AAD bestimmt. Zu keinem Zeitpunkt kann in der Kombination L-NAME/IgM-Antikörper noch in der Kombination L-NAME/Epirubicin eine statistisch signifikante Steigerung der medianen Apoptose im Vergleich zur Kontrollpopulation nachgewiesen werden. Eine statistisch signifikante Steigerung der Apoptoserate nach IL-2 Vorinkubation und Zugabe des agonistischen IgM-Antikörpers, wie in Kapitel 1.4.2 dargestellt, kann bestätigt werden. Beispielhaft werden die Apoptoseraten nach 48 Stunden dargestellt (Abbildung 3.14). n. s. 100 n. s. p<0,005 A 90 p<0,005 % apoptotische Zellen 80 70 B n. s. n. s. n. s. n. s. 60 50 40 30 20 10 0 Ohne IL-2 Mit IL-2 Ohne IL-2 Mit IL-2 -L-NAME +L-NAME -L-NAME +L-NAME -L-NAME +L-NAME -L-NAME +L-NAME Abbildung 3.14: Apoptoseinduktion unter Inkubation mit dem NO-Synthetaseinhibitor L-NAME. Nach 48 Stunden kann durchflusszytometrisch keine Zunahme der IgM(A)- oder Epirubicin(B)-induzierten Apoptose nach Hemmung der NO-Synthetase durch L-NAME gezeigt werden. 3 Ergebnisse 45 3.5 CD95-Signaltransduktionskaskade auf mRNA-Ebene Mittels RNase Protection Assays (RPA) wird die Expression der Mitglieder der CD95vermittelten Signaltransduktionskaskade (CD95-Rezeptor, CD95-Ligand, FADD, Caspase 8, Caspase 3) untersucht. Bei 6 B-CLL Patientenproben wird aus 1×107 Zellen nach Vorinkubation mit IL-2 Gesamt-RNA extrahiert und mittels RNase-Protection-Assay analysiert. Sowohl der CD95-Rezeptor als auch die weiteren Mitglieder des Signaltransduktionsweges lassen sich auf mRNA-Ebene nachweisen (Abbildung 3.15). Als Jurkat House-Keeping-Gen wird L32 verwendet. Patient 14 15 17 19 21 22 CD95-Rezeptor CD95-Ligand FADD Caspase 8 Caspase 3 L 32 Abbildung 3.15: RNase Protection Assay zum Nachweis der CD95-Signaltransduktionskaskade auf RNAEbene. Es lässt sich mRNA für den CD95-Rezeptor, CD95-Ligand, FADD, Caspase 3 und 8 nachweisen. Zusätzlich dargestellt ist als House-Keeping-Gen L32. 3.6 Apoptose-inhibierende Proteine Für die Proteine BIRC4 (XIAP, 362bp), BIRC3 (cIAP2, 307bp) und BIRC2 (cIAP1, 324bp) ist eine Apoptose-inhibierende Funktion durch Hemmung der proteolytischen Spaltung von Procaspasen 3, 6 und 7 gezeigt worden. Die mRNA-Expression dieser Moleküle in B-CLL Zellen wird mittels RT-PCR überprüft. Nach Etablierung der RT-PCR mit der T-ALL-Zelllinie Jurkat kann bei sämtlichen B-CLL Tumorproben (12/12) das jeweilige Transkript und das House-Keeping-Gen GAPDH (302bp) nachgewiesen werden (Abbildung 3.16). A Jurkat H 2O 46 Marker 3 Ergebnisse Patient 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 21 Patient H 2O Marker B Jurkat BIRC4 (Xiap) 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 Jurkat H2O C Marker BIRC3 (cIAP2) Patient 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 21 Marker D Jurkat H2O BIRC2 (cIAP1) Patient 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 21 GAPDH Abbildung 3.16: RT-PCR zum Nachweis von A) BIRC4 (XIAP), B) BIRC3 (cIAP2) und C) BIRC2 (cIAP1). Bei allen Patienten lassen sich die Gen-spezifischen Transkripte nach Darstellung mittels GelElektrophorese nachweisen. Als Positivkontrolle für die RT-PCR-Reaktion wird das HouseKeeping-Gen GAPDH benutzt (D). Als interne Positivkontrolle für die jeweiligen Transkripte wird die T-ALL-Zelllinie Jurkat sowie als Negativkontrolle H2O verwendet. 4 Diskussion Die chronische lymphatische Leukämie vom B-Zell-Typ, die häufigste Leukämie bei Erwachsenen der westlichen Welt (Harris et al. 1994), ist ein indolentes, leukämisch verlaufendes Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) mit zunehmender Inzidenz in hohem Lebensalter. Ursächlich für die Akkumulation der wenig proliferierenden B-CLL-Zellen scheint eine gestörte Fähigkeit zur Apoptose zu sein, wodurch es konsekutiv zu hämatopoetischer und immunologischer Insuffizienz kommt. Apoptose, ein sich im Laufe der Evolution in allen Lebewesen erhaltendes physiologisches Selbsttod-Programm der Zelle (Vaux et al. 1994, Steller 1995), kann durch Einsatz von zytotoxischen Substanzen bei Leukämien und soliden Tumoren aktiviert werden (Barry et al. 1990, Friesen et al. 1996). Die B-CLL zeigt einen heterogenen Verlauf mit Überlebenszeiten von wenigen Monaten bis mehr als 20 Jahren. Bei der Therapie der Erkrankung stehen palliative Strategien im Vordergrund, da eine vollständige Beseitigung des malignen Zellklons lange Zeit nicht möglich war. Durch neuere Chemotherapeutika werden in der Monotherapie der B-CLL im Vergleich zu Alkylanzien wie Chlorambucil häufigere und länger anhaltende komplette Remissionen und ein längeres krankheitsfreies Überleben erzielt (Rai et al. 2000). Durch Purinanaloga wie Fludarabin lassen sich bei vorbehandelten Patienten Ansprechraten von 13-67% mit kompletten Remissionsraten bis 37%, sowie bei nicht-vorbehandelten Patienten von 70-80% mit kompletten Remissionen von 23-37% erreichen (Cheson 1998, Fenchel et al. 1995, Bergmann et al. 1993). Durch komplette Remissionen werden kurative Ansätze wie Hochdosischemotherapien mit anschließender autologer oder allogener peripherer Blutstammzelltransplantation ermöglicht. Durch Kombination mit anderen Zytostatika, z.B. Anthrazyklinen, soll die therapeutische Effizienz von Fludarabin weiter verbessert werden. Da sich in klinischen Studien bei der CLL eine höhere Effektivität einer anthrazyklinhaltigen Kombinationschemotherapie wie CHOP (Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin, Prednison) gegenüber einer anthrazyklinfreien Kombination z.B. COP (Cyclophosphamid, Vincristin, Prednison) zeigte (French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia 1986, French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia 1989), wird nun in kontrollierten 4 Diskussion 48 klinischen Studien die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie von Fludarabin und Anthrazyklinen geprüft. In ersten klinischen Studien, z.B. einer Phase-II-Studie mit 38 teilweise vorbehandelten Patienten, konnte bei einem Gesamtansprechen von 82% mit 32% kompletten Remissionen in der Kombinationstherapie Fludarabin-Epirubicin die Effektivität dieser Kombination gezeigt werden (Schmitt et al. 2002, Rummel et al. 1999). Eine Phase III-Multicenter-Studie ergab beim Vergleich einer Fludarabin-Monotherapie mit einer Kombinationstherapie Fludarabin-Epirubicin Gesamtansprechraten von 73% in der Fludarabin-Gruppe und von 87% in der Fludarabin-Epirubicin-Gruppe mit höheren Raten an kompletten Remissionen und einer Verlängerung des medianen progressionsfreien Überlebens (Rummel et al. 2003). 4.1 Epirubicin bei der B-CLL Da es bisher nur wenige in-vitro-Daten zur Wirkungsweise von Epirubicin bei der CLL gibt, wurde in dieser Arbeit die in-vitro-Effektivität von Epirubicin zur ApoptoseInduktion bei primären B-CLL-Zellen untersucht. Für Epirubicin konnte eine dosis- und zeitabhängige Wirkungskinetik gegenüber B-CLL-Zellen in vitro gezeigt werden. Dabei wurden durch höhere Epirubicin-Dosen höhere Apoptoseraten erreicht als durch eine längere Inkubationszeit. Die Apoptoseraten lagen über einen Zeitraum von 24 bis 72 Stunden zwischen 5% und 30% bei 0,07 µg/ml Epirubicin und zwischen 83% und 100% mit 0,7 µg/ml Epirubicin. Die Spontanapoptoseraten in diesem Zeitraum von 12% bis 17% sind mit den in-vitro-Spontanapoptoseraten vergleichbar, die in anderen Studien bestimmt wurden (Bromidge et al. 1998, Bellosillo et al. 1997, Castejon et al. 1997, Consoli et al. 1998, Bellosillo et al. 1999). Zwischen vortherapierten und nicht-vorbehandelten Patientenproben konnte kein signifikanter Unterschied in den Spontanapoptoseraten erhoben werden. Ein Vergleich der medianen in-vitro-Apoptoseraten von vorbehandelten und nicht-vortherapierten Patienten unter Epirubicin-Inkubation zeigte eine nur geringfügig geringere mediane Apoptoserate in den Proben der bereits vorbehandelten Patienten. Auch bei Bestimmung der LD50-Raten lagen die Epirubicin-Konzentrationen mit 0,18 µg/ml und 0,20 µg/ml in beiden Gruppen in etwa gleich, so dass eine Wirksamkeit der Substanz sowohl bei nicht-vorbehandelten Patienten als auch in der Zweit- oder Drittlinien-Therapie vermutet werden kann. Unterstützt werden diese Ergebnisse von Klein et al., der in vitro eine fehlende Resistenzentwicklung von 4 Diskussion 49 Fludarabin-resistenten B-CLL-Zellen gegenüber dem Anthrazyklin Adriamycin zeigen konnte (Klein et al. 2000). Noch unklar scheint in diesem Zusammenhang, in welcher Reihenfolge der zytostatischen Therapieabfolge es zur Entwicklung von Resistenzen kommt, da beispielsweise bei sequentieller Anwendung nach Anthrazyklinen eine ex-vivoResistenzentwicklung gegenüber alkylierenden Substanzen sowie platinhaltigen Zytostatika und Purinanaloga beschrieben wurde (Bosanquet u. Bell 1996). Da es sich bei der Therapie der B-CLL überwiegend um ein palliatives Vorgehen handelt, bei dem viele Patienten im Verlauf ihrer Krankheitsgeschichte mehrerer Therapien bedürfen, sollten hier neuere Daten abgewartet werden, die eine bestimmte Reihenfolge der zytoreduktiven Therapie zur Vermeidung einer Resistenzentwicklung nahe legen. Nach klinisch-pharmakologischen Angaben liegen die maximalen Plasmakonzentrationen von Epirubicin bei therapeutischen Standarddosierungen von 60 mg/m2 bis 150 mg/m2 bei 5,7 µg/ml bis 9,3 µg/ml. Die in dieser Arbeit bestimmte LD50-Rate für B-CLL-Zellen vorbehandelter und nicht-vorbehandelter Patienten in vitro ist mit 0,2 µg/ml deutlich niedriger, so dass diese Daten die klinischen Ergebnisse stützen, die eine hohe Wirksamkeit von Epirubicin auch bei vorbehandelten Patienten mit B-CLL zeigten. Die Kombinationstherapie von Epirubicin mit Fludarabin, die wie erwähnt, bereits in klinischen Studien untersucht wird, wurde in vitro hinsichtlich ihrer Effizienz bei B-CLLZellen untersucht. Hierbei zeigte sich in vitro ein synergistischer Effekt der Kombination aus Epirubicin und Fludarabin. Nach 24 Stunden stieg die mediane Apoptoserate bei kombinierter Inkubation um 72% im Vergleich zur errechneten Summe der Einzelapoptoseraten von Fludarabin und Epirubicin. Nach 48 Stunden fiel der synergistische Effekt mit 22% geringer aus, da durch die Einzelsubstanzen bei etwa der Hälfte der Proben bereits hohe Apoptoseraten (>40%) erreicht wurden, was die Detektion eines Synergismus nicht mehr möglich machte. Auch in anderen in vitro- und in vivoStudien konnte die Wirksamkeit von unterschiedlichen Kombinationstherapien mit hohen Ansprechraten bei der B-CLL gezeigt werden (Bellosillo et al. 1999, Hallek et al. 2001). Diese Ergebnisse spiegeln sich mittlerweile im klinischen Alltag wieder, wo zunehmend Kombinationstherapien aus z.B. Anthrazyklinen und Purin-Analoga eingesetzt werden. Um zu unterscheiden, ob es sich bei den oben dargestellten Daten, durch die Epirubicin zum Zelltod führt, um Veränderungen im Rahmen von Nekrose oder Apoptose handelt, wurden die Messungen am Durchflusszytometer mit 7-AAD (7-Actinoaminomycin D) 4 Diskussion 50 durchgeführt. Dieser fluoreszierende Farbstoff diffundiert durch die im Rahmen des Apoptoseprozesses veränderten Membranen und wird während des späteren Apoptoseprozesses zwischen Guanin und Cytosin der gebrochenen DNA-Doppelstränge interkaliert (Philpott et al. 1996). Zur Bestätigung der am Durchflusszytometer erhobenen Daten wurde ein PARP-Western-Blot durchgeführt. Nach Initiierung der Apoptose kommt es über eine Aktivierung von Caspasen zur Spaltung von verschiedenen wichtigen intrazellulären Schlüsselenzymen wie dem PARP-Enzym, einem DNA-Reparaturenzym (Tewari et al. 1995, Kitada et al. 1998, Krajewski et al. 1997). Eine Spaltung des PARPEnzyms gilt nach Aktivierung der CDE-3/ICE-ähnlichen Proteasen als Zeichen für die Apoptose der betroffenen Zellen (Casciola-Rosen et al. 1996, Solary et al. 2000, O’Gorman et al. 2001, Bellosillo et al. 1997, Kaufmann et al. 1993, Lazebnik et al. 1994, Nicholson et al. 1995). Nach Inkubation mit Epirubicin konnte in B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene eine Spaltung des PARP-Enzyms gezeigt werden. Als Positivkontrolle wurde Fludarabin verwendet, für das neben Bendamustin, Flavoperidol, Chlorambucil und Prednisolon die Spaltung von PARP im Rahmen des Apoptoseprozesses beschrieben ist (Chow et al. 2001, Byrd et al. 1998, Chandra et al. 1997, King et al. 1998). Der Mechanismus, über den zytoreduktive Substanzen in B-CLL-Zellen Apoptose induzieren, ist nicht genau bekannt. Fludarabin wirkt z.B. durch Hemmung der DNA- und RNA-Synthese und der DNA-Reparaturmechanismen zytoreduktiv. Zusätzlich induziert Fludarabin Apoptose durch DNA-Fragmentierung auch in ruhenden B-Lymphozyten, wodurch die Effektivität in niedrig-malignen Non-Hodgkin-Lymphomen erklärt werden kann (Huang et al. 1995, Dighiero 1996). Für Epirubicin konnte gezeigt werden, dass es durch Komplexbildung mit der DNA die Nukleinsäure- und Proteinsynthese der Zellen als Voraussetzung für eine ungestörte Zellfunktion auch in nicht-proliferierenden Zellen hemmt (Dolbey 2002, Adkins et al. 1997, Brock 1989). Neben diesen Mechanismen kann Apoptose unter anderem durch die Wirkung unterschiedlichster Regulationsgene, wie der Bcl-2-Familie, beeinflusst werden. Das Bcl-2 Protein ist in B-CLL-Zellen überexprimiert und ein erhöhtes Bcl-2/Bax-Verhältnis scheint mit einem schlechteren klinischen Verlauf vergesellschaftet zu sein (Pezzella et al. 1990, Zutter et al. 1991, Schena et al. 1992, Korsmeyer et al. 1992, Pepper et al. 1996, Thomas et al. 1996). Bax, ein starker ApoptosePromotor, bildet mit Bcl-2 Heterodimere und hemmt den anti-apoptotischen Effekt von Bcl-2 (Oltvai et al. 1993). Ob initiale Bcl-2- oder Bax-Spiegel oder das Bcl-2/Bax- 4 Diskussion 51 Verhältnis mit dem Ansprechen auf zytoreduktive Therapien korreliert werden können, konnte in mehreren in-vitro-Studien nicht abschließend geklärt werden (Pepper et al. 1996, Thomas et al. 1996, Begleiter et al. 1996, Stoetzer et al. 1999). Da die intrazellulären Mechanismen zur Initiierung des Epirubicin-vermittelten Apoptoseprozesses in B-CLLZellen nicht bekannt sind, wurde die Protein- und mRNA-Expression von Bcl-2 und Bax unter Inkubation mit Epirubicin analysiert. Hierbei konnten für Bcl-2 und Bax sowohl auf mRNA-Ebene, als auch auf Proteinebene keine signifikanten Änderungen des Expressionsniveaus zwischen den mit Epirubicin-inkubierten B-CLL-Zellen und den Kontrollpopulationen gezeigt werden. Unwahrscheinlich ist eine maskierte Veränderung der mRNA- oder Proteinspiegel von Bcl-2 und Bax durch nicht-leukämische Zellen, da nur B-CLL-Zellen von hochleukämischen Patienten für diese Untersuchungen benutzt wurden. Ob höhere Dosen von Epirubicin zu signifikanten Veränderungen der mRNA- oder Proteinspiegel von Bcl-2 oder Bax führen, ist nicht geklärt. Da sich aber bei der hier verwendeten Dosierung bereits eine effektive Induktion der Apoptose (40% nach 48 Stunden) zeigte, scheint eine Änderung der Bcl-2- und Bax-mRNA- und Proteinexpression unter höheren Dosierungen von Epirubicin unwahrscheinlich. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen sind auch nach Apoptoseinduktion mit Flavoperidol (Byrd et al. 1998), Fludarabin und Cyclophosphamid (Bellosillo et al. 1999, Kitada et al. 1998) und Bendamustin (Schwänen et al. 2002) keine signifikanten Änderungen der Bcl-2- und BaxProteinexpression gezeigt worden. Im Widerspruch dazu stehen Ergebnisse von Gottardi et al., der bei 5/12 Patienten mit B-CLL eine Supprimierung der Bcl-2-mRNA- und Proteinexpression nach Inkubation mit Fludarabin in vitro beschreibt (Gottardi D et al. 1997). Eine Abnahme der Bcl-2-mRNA- und Proteinexpression einhergehend mit einer signifikanten Apoptosezunahme konnte auch nach Inkubation mit Anti-sense Bcl-2 Oligonukleotiden in einer neueren in-vitro-Studie mit B-CLL-Zellen gezeigt werden (Pepper et al. 1999). Neben den hier dargestellten Veränderungen der Bcl-2- und BaxProtein- und RNA-Spiegel können auch andere Regulationsmechanismen zur Chemotherapie-induzierten Apoptose beitragen: Durch eine Spaltung und Inaktivierung von Bcl-2 durch Caspasen oder Inaktivierung von Bcl-2 durch Phosphorylierung und anschließende Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien kann Apoptose induziert werden (Solary et al. 2000, Fadeel et al. 2000). Eine weitere Möglichkeiten zur Apoptoseinduktion unter Inkubation mit Purin-Analoga oder Alkylantien ist eine 4 Diskussion 52 Aktivierung und Stabilisierung von p53 (Stankovic et al. 1999), z.B. über eine Phosphorylierung durch ATM (ataxia teleangiectasia Mutation) (Prives 1998). Für Deletionen und Inaktivierungen von p53 und ATM konnte bei der B-CLL eine Assoziation mit kürzerem Überleben und Therapieversagen gezeigt werden (Stankovic et al. 1999, Döhner et al. 2000, Döhner et al. 1995). Diese Erkenntnisse haben mittlerweile auch Einzug in den klinischen Alltag gehalten, wo eine Risikostratefizierung stattfindet. 4.2 CD95-Rezeptor- und Ligandensystem bei der B-CLL Das CD95-System, ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Familie (Itoh et al. 1991), ist ein essentieller Bestandteil in der physiologischen Regulation des Immunsystems (Nagata 1997) und gilt als ein wichtiger Mechanismus in der durch Chemotherapeutika induzierten Apoptose (Trauth et al. 1989, Debatin et al. 1990, Friesen et al. 1996, Walczak u. Krammer 2000). Neben einer Expression des Rezeptors auf Zellen des lymphatischen Systems findet sich auch eine Expression auf Hepatozyten, alveolären Zellen, Myokardzellen und unterschiedlichen Tumorzellen. Die Expression des CD95-Liganden ist selektiver als die des CD95-Rezeptors und findet sich insbesondere auf zytotoxischen T-Lymphozyten und natürlichen Killerzellen. Durch Bindung des Liganden an seinen Rezeptor wird die intrazelluläre Signalkaskade aktiviert. Für B-Lymphozyten von Patienten mit CLL ist eine niedrige bzw. fehlende Expression des CD95-Rezeptors beschrieben (Mapara et al. 1993, Moller et al. 1993, Wang et al. 1997). Eine Hochregulation dieses Rezeptors ist durch Staphylococcus aureus Cowan 1, CD40, Interleukin 2 (IL-2) oder Interferon γ möglich (Mapara et al. 1993, Garrone et al. 1995, Wang et al. 1997, Nagafuji et al. 1993). Durch Zugabe eines monoklonalen anti-CD95 IgM-Antikörpers kann die Wirkung des endogenen Liganden mit konsekutiver Apopotseinduktion im molekularen Modell kopiert werden (Fadeel et al. 1998). Durch Inkubation von lymphatischen Zelllinien mit dem Anthrazyklin Doxorubicin konnte eine mRNA- und Protein-Expression des CD95-Liganden induziert werden, die zu einer autokrinen Aktivierung des CD95-Rezeptors mit konsekutiver Apoptoseinduktion führte (Friesen et al. 1996). Bei 29 Proben von hochleukämischen Patienten mit B-CLL wurde der CD95Rezeptorstatus vor und nach einer 72stündigen Inkubation mit IL-2 untersucht. 25/29 Proben (86%) zeigten durchflusszytometrisch einen initial negativen CD95-Rezeptorstatus. 4 Diskussion 53 Durch Zugabe von IL-2 konnte bei 19/25 Proben (76%) nach 72 Stunden eine Expression des CD95-Rezeptors auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Bei 6/25 Proben (24%) blieb der CD95-Rezeptor unter 72stündiger Inkubation negativ. Die induzierte CD95Antigenpräsenz konnte über einen Zeitraum von 16 Tagen durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Durch eine alleinige Hochregulation des CD95-Rezeptors mit IL-2 konnte in den untersuchten Patientenproben eine um bis zu 10% verminderte mediane Apoptoserate im Vergleich zu den Kontrollpopulationen erreicht werden. Dabei zeigte sich kein Unterschied zwischen vortherapierten und nicht-vorbehandelten Patientenproben. Die verminderte Apoptoserate scheint u.a. durch einen stimulierenden Effekt des IL-2 verursacht zu sein. Aus diesem Grund wurde bei den weiteren Experimenten nach 72 Stunden ein Mediumwechsel durchgeführt, um den stimulierenden Effekt des IL-2 zu minimieren. Zur Simulation der physiologischen Aktivierung des CD95-Systems erfolgte nach Hochregulation des CD95-Rezeptors durch IL-2 eine Inkubation mit einem agonistischen anti-CD95 IgM-Antikörper. Nach 72 Stunden konnte in der CD95-Rezeptor-positiven Gruppe die mediane Apoptoserate um 39% im Vergleich zur Kontrollpopulation gesteigert werden. Übereinstimmende Apoptoseraten wurden bei Inkubation einer lymphatischen Zelllinie (CEM-Zelllinie) mit einem agonistischen Anti-CD95 IgM-Antikörper beschrieben (McGahon et al. 1998). In humanen B-Lymphozyten aus Tonsillengewebe konnte durch einen monoklonalen anti-CD95 Antikörper nach Hochregulation des CD95Rezeptors mit einem CD40-Ligand oder einem monoklonalen anti-CD40 Antikörper das durch CD40 ausgelöste Zellwachstum gehemmt und 48 Stunden nach Zugabe des Antikörpers Apoptoseraten bis zu 75% induziert werden (Garrone et al. 1995). Bei Kombination eines anti-CD95 IgM-Antikörpers mit verschiedenen Chemotherapeutika konnte ein synergistischer Effekt auf die Apoptoseraten in Zelllinien humaner Leukämien und solider Tumoren gezeigt werden (Morimoto et al. 1993, Mitzutani et al. 1997, Nakamura et al. 1997). Im Gegensatz zu den hier gezeigten Apoptoseraten wird bei CLLZellen von einer Resistenz gegen anti-CD95-induzierte Apoptose berichtet. Nach CD95Stimulation mit Interferon γ und Inkubation mit einem monoklonalen anti-CD95 Antikörper konnte bei CLL-Zellen in vitro keine Steigerung der Apoptoseraten erreicht 4 Diskussion 54 werden (Panayiotidis et al. 1995). Eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Apoptoseraten in der Literatur können die verwendeten anti-CD95 Antikörper sein. Für das Anthrazyklin Doxorubicin konnte, wie erwähnt, eine Stimulation der m-RNA und Protein-Expression des CD95-Liganden mit konsekutiver Stimulation und Aktivierung des CD95-vermittelten Apoptoseweges in lymphatischen Zelllinien erreicht werden (Friesen et al. 1996). In den hier gezeigten Untersuchungen konnte über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden durch den konsekutiven Zusatz von IL-2 und Epirubicin durchflusszytometrisch keine signifikante Steigerung der Apoptoseraten (>10%) im Vergleich zur Kontrollpopulation nach alleiniger Epirubicin-Inkubation erzielt werden. Bei B-CLLZellen scheint es somit nicht zu einer Epirubicin-vermittelten Expression des CD95Liganden mit autokriner Stimulation des CD95-Rezeptors zu kommen. Diese Daten werden unterstützt durch Ergebnisse von McGahon et al., der durchflusszytometrisch keine signifikante Hochregulation der Proteinspiegel des CD95-Rezeptors oder CD95-Liganden nach Inkubation von humanen Leukämie-Zelllinien mit dem Anthrazyklin Doxorubicin oder anderen Chemotherapeutika z.B. Etoposid, Methotrexat oder Camptothecin zeigen konnte (McGahon et al. 1998). Da zum Zeitpunkt der Untersuchung noch keine Daten vorlagen, ob die Mitglieder der CD95-Rezeptor-Kaskade in B-CLL-Zellen exprimiert sind, wurden diese mittels RNase Protection Assays auf mRNA-Ebene untersucht. Hierbei konnten bei 6 Patientenproben der CD95-Rezeptor, der CD95-Ligand, das „Fas-assoziierte death domain“-Protein FADD, Caspase 3 und Caspase 8 nachgewiesen werden. Somit scheint zumindest auf mRNAEbene die Voraussetzung zur CD95-vermittelten Apoptose zu bestehen. Offen muss an dieser Stelle bleiben, ob auch eine Expression auf Proteinebene erfolgt oder ob es z.B. durch Mutationen einen Funktionsverlust einzelner Mitglieder bei der B-CLL gibt. In der physiologischen Apoptosekontrolle des CD95-Systems wird Nitric oxide (NO) eine wichtige Rolle zugeschrieben. NO ist ein molekularer Botenstoff des Gefäß- und Immunsystems (Moncada et al. 1991, Nathan 1992), der aus L-Arginin und mehreren Cosubstraten durch verschiedene Isoformen der NO-Synthetase produziert wird (Nathan u. Xie 1994). Durch die Aktivität der NO-Synthetase wird durch Hochregulation von NO in humanen Leukozyten der CD95-induzierte Apoptoseweg gehemmt, was durch eine fehlende Spaltung von PARP gezeigt werden konnte (Mannick et al. 1997). In BLymphozyten bei Burkitt-Lymphomen scheint bereits durch niedrige Spiegel der 4 Diskussion 55 induzierbaren NO-Synthetase (iNOS) und das dadurch produzierte NO die Apoptose gehemmt zu sein (Mannick et al. 1994). In B-Lymphozyten von Patienten mit B-CLL ist auf mRNA- und Protein-Ebene eine induzierbare NO-Synthetase (iNOS) nachgewiesen worden, die schon bei relativ niedrigen NO-Spiegeln anti-apoptotisch wirkt (Zhao et al. 1998). Durch Verwendung des NO-Synthetase-Inhibitors L-NAME konnte ein Anstieg der Apoptoserate von B-CLL-Zellen erreicht werden (Zhao et al. 1998). Unter Verwendung des NO-Sythetase-Inhibitors Nω-Nitro-L-Arginine-Methyl-Ester-Hydrochloride (L- NAME) wurde in dieser Arbeit nach IL-2 Inkubation und Hochregulation des CD95Rezeptors die Apoptoserate in vitro in Kombination mit Epirubicin oder dem agonistischen anti-CD95 IgM-Antikörper untersucht. Dabei konnte über einen Zeitraum von 72 Stunden keine Steigerung der Apoptoserate in der Kombination mit dem anti-CD95 IgMAntikörper oder mit Epirubicin im Vergleich zur Kontrollpopulation ohne Zusatz des NOSynthetase-Inhibitors gezeigt werden. Weitere Faktoren, die unter anderem die Apoptoserate von B-CLL-Zellen in vitro beeinflussen können, sind Apoptoseinhibitoren (inhibitors of apoptosis: IAP). Diese stellen eine Proteinfamilie dar, die im Laufe der Evolution konserviert wurde und in allen Spezies von Insekten bis zum Menschen als Gegenspieler von Caspasen vor Zelltod schützt (Clem u. Miller 1994, Roy et al. 1997, Duckett et al. 1996). Die Apoptoseinhibitoren BIRC2 (cIAP1), BIRC3 (cIAP2) und BIRC4 (XIAP) hemmen Caspase 3 und 7 (Deveraux et al. 1997, Roy et al. 1997) sowie die proteolytische Aktivierung von Procaspasen 3, 6 und 7 durch die Cytochrom C aktivierte Caspase 9. Die Proteolyse von Caspase 8 und die daraus folgende Aktivierung von Procaspase 3 kann dagegen nicht durch die Mitglieder der IAPFamilie unterdrückt werden (Deveraux et al. 1998). Da Mitglieder der IAP-Familie Apoptose hemmen (Ducket et al. 1996, Liston et al. 1996) und in verschiedenen menschlichen Tumoren und Lymphomen überexprimiert scheinen (Ambrosini et al. 1997), wurden in dieser Arbeit auf RNA-Ebene Mitglieder der IAP-Familie bei der B-CLL untersucht. Mittels Polymerase-Ketten-Reaktion konnte BIRC2, BIRC3 und BIRC4 in den Proben von 12 hochleukämischen Patienten mit B-CLL nachgewiesen werden. Unwahrscheinlich ist jedoch, dass durch Apoptose-Inhibitoren wie BIRC2, BIRC3 und BIRC4 alleine die verminderte Apoptose der B-Lymphozyten bei der CLL erklärt werden kann. 4 Diskussion 56 Die hier dargestellten Ergebnisse zu Epirubicin als Monosubstanz und in Kombination mit Fludarabin unterstützen klinischen Studien, die Epirubicin in Kombination mit anderen Substanzen unter anderem mit Fludarabin als effektives Zytostatikum zur Therapie der BCLL einsetzen. Die durch Epirubicin-vermittelte Apoptose scheint dabei nicht durch Veränderungen der Bcl-2- und Bax-Protein- und mRNA-Expression bewirkt zu werden. Nach Aktivierung des CD95-Systems mit IL-2 kann in B-CLL-Zellen über einen antiCD95 IgM-Antikörper Apoptose induziert werden. Durch Epirubicin scheint es nicht zu einer gesteigerten Expression des Liganden mit autokriner Stimulation des CD95Rezeptors und Steigerung der Apoptose zu kommen, da keine signifikante Veränderung der Apoptoserate im Vergleich zur Kontrollpopulation gezeigt werden konnte. NO scheint für die verminderte Apoptoserate von B-CLL-Zellen nur eine untergeordnete Rolle zu spielen, wogegen die Rolle der Apoptoseinhibitoren noch nicht geklärt ist. 5 Zusammenfassung Bei der chronischen lymphatischen Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) handelt es sich um ein niedrig-malignes, leukämisch verlaufendes Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), das sich klinisch durch eine chronische klonale Akkumulation von CD5 („Cluster of Differentiation“ 5) positiven B-Zellen auszeichnet. Diese Zellakkumulation scheint durch eine gestörte Fähigkeit zur Apoptoseinitiierung verursacht zu sein. Als Schlüsselproteine, die in der Apoptose bei NHL eine Rolle spielen, sind Bcl-2 (B-Zell CLL/Lymphoma Protein 2), Bax (Bcl-2 assoziiertes X-Protein) und das CD95-System zu nennen. Die Vermutung, dass zytoreduktive Substanzen bei der B-CLL über eine Initiierung der Apoptose wirken, konnte für das Anthrazyklin Epirubicin bestätigt werden. Daneben wurden die Mechanismen, über die dieses Chemotherapeutikum Apoptose induziert, untersucht. Zur Überprüfung der apoptose-induzierenden Wirkung von Anthrazyklinen bei der B-CLL wurde die durch Epirubicin-Inkubation induzierte Apoptoserate quantifiziert. Dabei konnte eine dosis- und zeitabhängige Wirkungskinetik gezeigt werden. Ein Einfluss von Vortherapien auf die durch Epirubicin erzielte Apoptoserate scheint vernachlässigbar zu sein. Der zytoreduktive Effekt von Epirubicin wird dabei durch eine Aktivierung der Apoptose verursacht, was durch Quantifizierung der Apoptoserate durch 7-AAD (7Actinoaminomycin D) und Spaltung des PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase)-Moleküls auf Proteinebene gezeigt werden konnte. Durch Kombination von Epirubicin mit Fludarabin konnte eine synergistische Zytotoxizität mit Steigerung der Apoptoserate um bis zu 72% erreicht werden. Unter Epirubicin-Inkubation konnten mittels RNaseProtection-Assays und FACS („Fluorescence activating cell sorter”)-Analysen keine signifikanten Expressionsunterschiede auf mRNA („messenger“-Ribonucleinsäure)- und Protein-Ebene für Bcl-2 und Bax gezeigt werden, obwohl die verwendeten Dosen effektiv Apoptose bei in vitro kultivierten B-CLL-Zellen induzieren konnten. Als weiterer Schlüsselmechanismus in der durch Chemotherapeutika verursachten Apoptose bei Lymphozyten gilt das CD95-Rezeptor- und Ligandensystem. Durch Interleukin 2 (IL-2) konnte bei initial CD95-Rezeptor negativen Patientenproben eine Expression des CD95-Rezeptors nachgewiesen werden. Durch alleinige IL-2 Inkubation 5 Zusammenfassung 58 konnte jedoch keine Apoptose induziert werden. Nach Zugabe eines monoklonalen antiCD95 IgM-Antikörpers (Immunglobulin Klasse M) konnte im Vergleich zur Kontrollpopulation eine Apoptosesteigerung um maximal 39% erreicht werden. Dagegen konnte durch Epirubicin, für das eine autokrine Aktivierung des CD95-Rezeptors durch Expression des Liganden vermutet wird, keine signifikante Zunahme der Apoptose gezeigt werden. Mit RNase Protection Assays konnten auf mRNA-Ebene die Mitglieder der CD95-Apoptosekaskade nachgewiesen werden. Durch eine Überexpression von NO („nitric oxide“) wird in humanen Lymphozyten der CD95-induzierte Apoptoseweg gehemmt und eine Spaltung von PARP bleibt aus. Die Expression von NO scheint für die verminderte Apoptoserate bei der B-CLL eine nur untergeordnete Rolle zu spielen, da durch Inhibition der NO-Synthetase kein signifikanter Anstieg der Epirubicin-vermittelten Apoptoserate und der CD95-vermittelten Apoptoserate erreicht werden konnte. Es konnten weitere Apoptose-Inhibitoren, die eine Hemmung der Aktivierung von Caspase 3, 6 und 7 bewirken, auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, in wie weit Caspasen und Apoptose-Inhibitoren tatsächlich zur geringen Apoptoseneigung von B-CLL-Zellen beitragen und ob diese neue Angriffspunkte für eine spezifische Therapie bieten. Die hier dargestellten Ergebnisse zu Epirubicin als Monosubstanz und in Kombination mit Fludarabin unterstützen klinischen Studien, die Epirubicin in Kombination mit anderen Substanzen u.a. mit Fludarabin als effektives Zytostatikum zur Therapie der B-CLL einsetzen. Die durch Epirubicin-vermittelte Apoptose scheint dabei nicht durch Veränderungen der Bcl-2- und Bax-Protein- und mRNA-Expression bewirkt zu werden. Nach Aktivierung des CD95-Systems mit IL-2 kann in B-CLL-Zellen über einen antiCD95 IgM-Antikörper Apoptose induziert werden. Durch Epirubicin dagegen scheint es nicht zu einer Expression des CD95-Liganden zu kommen, über den die weitere Apoptose aktiviert wird. 6 1. 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Außerdem möchte ich mich bei meinen Eltern Marianne und Günther Wölfle für das Verständnis, die Geduld und die Unterstützung bedanken, die sie mir während meines Studiums und vor allem während der Bearbeitung meiner Dissertation entgegenbrachten.
