I. Projektskizze 1. Projektbezeichnung Identifikation von
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I. Projektskizze 1. Projektbezeichnung Identifikation von tumorspezifischen Antigenen durch Analyse der Spezifität tumorinfiltrierender BZellen in malignen Gliomen mit Hilfe von SEREX 2. Kurztitel Antigenspezifität von tumorinfiltrierenden B-Zellen in Gliomen 3. Zusammenfassung Das zunehmende Verständnis von tumorimmunologischen Vorgängen und die Verfügbarkeit von immunmodulierenden Substanzen wie spezifische monoklonale Antikörper und Cytokine haben in den letzten Jahren zu einer Erweiterung multimodaler Ansätze in der Therapie maligner Tumoren geführt. Die Identifikation einer Reihe von tumorspezifischen Antigenen eröffnet weitere Perspektiven in Sinne von Vakzinierungsstrategien. SEREX ist eine hochpotente Methode, mit Hilfe derer tumorspezifische Antigene durch Detektion von spezifischen Antikörpern im Patientenserum identifiziert werden können. Um spezifischer die tumorinduzierte B-Zell Antwort zu untersuchen, sollen in dem hier geplanten Projekt die Spezifitäten von tumorinfiltrierende B-Zellen mit Hilfe von SEREX analysiert werden. Die Antigen-erkennenden Determinanten der spezifischen Immunglobuline wird rekombinant als sog. FabFragmente hergestellt. Diese Fab-Fragmente werden in die weiteren SEREX Untersuchungen eingesetzt. Positive Klone werden im Nachfolgenden für ihre Seroreaktivität in größeren Kollektiven von Patienten mit Gliomen und gesunden Kontrollen untersucht. Ferner wird das Expressionsmuster in Tumorgeweben sowie Normalgeweben analysiert. In Abhängigkeit der Ergebnisse sind Untersuchungen zur tumorbiologischen Funktion vorgesehen. Das langfristige Ziel dieses Projektes ist es, die Bedeutung der B-Zell-Immunität in Gliomen zu betrachten und die Ergebnisse daraus in multimodale Therapiekonzepte durch Kombination von Radaiochemotherapie und Immuntherapie vor allem in Hinblick auf die minimale Resterkrankung mit einfließen zu lassen. 4. Stand der Forschung und eigene Vorarbeiten 4.1 Stand der Forschung Das zunehmende Verständnis von tumorimmunologischen Vorgängen und die Verfügbarkeit von immunmodulierenden Substanzen wie spezifische monoklonale Antikörper und Cytokine haben in den letzten Jahren zu einer Erweiterung multimodaler Ansätze in der Therapie maligner Tumoren geführt. 1 In dem Konzept der nicht-myeloablativen Knochenmarktransplantation wurde diese Auffassung beispielsweise erfolgreich klinisch umgesetzt [1]. Maligne Erkrankungen werden häufig von Infiltraten aus Entzündungszellen umgeben. Dieses wird als Ausdruck einer Immunantwort auf die Tumorzellen aufgefaßt. Diese Immunreaktion ist v.a. T-Zell-gesteuert und muß daher Antigenvermittelt sein. Die Identifikation einer Reihe von tumorspezifischen Antigenen eröffnet weitere Perspektiven in Sinne von Vakzinierungsstrategien. In den letzten Jahren ist es gelungen, tumorspezifische Antigene für einige Entitäten zu charakterisieren. Nachdem im Mausmodell durch zytotoxische T-Lymphozyten (engl.: cytotoxic T-Lymphocytes, CTL) vermittelte Tumorabstoßungen nachgewiesen werden konnten, verstärkten sich die Bemühungen Tumorantigene mit Hilfe von CTLs zu identifizieren [2-5]. Die CTL basierte Methode zur Identifikation von tumorspezifischen Antigenen hängt von der Verfügbarkeit von stabilen Tumorzellinien sowie charakterisierten tumorspezifischen TZellklonen ab. Hierbei handelt es sich um eine erheblich zeit- und kostenintensive Methode. Das von der Gruppe um Professor Michael Pfreundschuh (Homburg, Saar) entwickelte SEREX-Verfahren (engl.: serological identification of antigens by recombinant expression cloning) hat hier zu entscheidenden methodischen Fortschritten geführt [6]. Es handelt sich um die Möglichkeit, spezifische Antigene aus Tumorgeweben durch Erstellung von cDNA-Expressionsbibliotheken serologisch mit Hilfe von autologen oder allogenen Patienten-Seren zu identifizieren. Mittlerweile konnten mehr als 100 Tumorantigene auf diesem Wege nachgewiesen werden [7]. Neben einigen schon zuvor bekannten Antigenen gelang es weitere, wie Hom-Mel-40 oder NY-ESO1 in verschiedenen Neoplasien als tumorspezifisch zu charakterisieren [8, 9]. Diese Antigene gehören zu den sogenannten Cancer-Testis-Antigenen (CT-Antigene), welche ausschließlich in Testis und in malignen Tumoren expremiert werden und damit in Hinblick auf den immuntherapeutischen Einsatz sehr attraktiv sind. Erste klinische Studien zur Vakzinierung mit NY-ESO1 bei Bronchialkarzinomen und Ovarialkarzinomen konnten bereits durchgeführt werden. Neben der immuntherapeutischen Behandlung von manifesten malignen Tumoren, sollten derartige Ansätze jedoch auch in Bezug auf die minimale Resterkrankung in Betracht gezogen werden. Dabei könnte das Immunsystem eine deutliche Unterstützung in der Beseitigung einzelner, nach einer Therapie verbleibender Tumorzellen erfahren und die definitive und damit kurative Eradikation ermöglicht werden. Die Expression und spezifische Seroreaktivität vieler bereits identifizierten Tumorantigene wurde nicht nur in der ursprünglichen Entität sondern auch in weiteren malignen Tumoren gezeigt. Damit kann die Identifikation von spezifischen Tumorantigenen durch Untersuchung einer bösartigen Erkrankung die Erkenntnis über das gesamte Tumorimmunom erweitern. Neben dem experimentell-klinischen Ansatzpunkt solcher Untersuchungen, ergeben sich weitere interessante Aspekte. Tumorspezifische Proteine können nicht nur eine Immunantwort hervorrufen und somit antigen sein, sondern erfüllen vielfach auch eine tumorspezifische Funktion. Die Identifikation von seroreaktiven tumorspezifischen Proteinen kann damit auch weiterführende Einblicke in tumorbiologische Zusammenhänge erlauben. 2 Sahin et al. konnten die differentielle Expression von unterschiedlichen CT-Antigenen in malignen Hirntumoren nachweisen [10]. Dahingegen ergaben SEREX-Analysen mit Serum von Astrozytom Patienten, daß obwohl in dieser Entität ein breites Spektrum von Antigenen expremiert wird, eine Antikörper-Antwort nur gering ausgelöst wird [11]. Die Autoren mutmaßen, daß dieses auf intrinsische Immunsuppression im Tumor zurückzuführen sei. Demgegeneüber gelang es Struss et al. mit Hilfe von SEREX PHF3 als antigen zu identifizieren. Eine Seroreaktivität konnte von den Autoren ausschließlich in Hirntumorpatienten nicht aber in gesunden Kontrollen nachgewiesen werden [12]. Die Identifikation von unbekannten Tumorantigenen in Hirntumoren ist also möglich. Dennoch scheint es Hinweise zugeben, daß der Nachweis der Seroreaktivität peripher erschwert sein könnte. Ziel unseres Projektes ist es daher durch Untersuchung der Antigenspezifität von tumorinfiltrierenden B-Zellen tumorspezifische Antigene zu isolieren. Literatur 1. Slavin S, Nagler A, Naparstek E, Kapelushnik Y, Aker M, Cividalli G, Varadi G, Kirschbaum M, Ackerstein A, Samuel S, Amar A, Brautbar C, Ben-Tal O, Eldor A, Or R: Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood 1998; 91(3): 756-63 2. De Plaen E, Lurquin C, Lethe B et al.: Identification of genes coding for tumor antigens recognized my cytolytic T lymphocytes. Methods 1997; 12:125-142 3. Falk K, Rotschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG: Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 1991; 351:290-6 4. Coulie PG, Brichard V, Van Pel A et al.: A new gene coding for differentiation antigen is recognized by autologous cytolytic T-lymophocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med 1994; 180:36-42 5. De Smet C, De Backer O, Faraoni I, Lurquin C, Brasseur F, Boon T: The activation of human gene MAGE1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylation. Proc Natl Acand Sci USA 1996; 93:7149-53 6. Sahin U, Türeci Ö, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, Stenner F, Luo G, Schobert I, Pfreundschuh M: Human neoplasms elicit multipl specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 11810-3 7. Scanlan M, Gure AO, Jungbluth AA, Old LJ, Chen YT: Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer immunotherapy. Immunol Rev 2002; 188:22-32 8. Sahin U, Türeci Ö, Pfreundschuh M: Serological identification of human tumor antigens. Curr Opin Immunol 1997; 9:709-16 9. Chen YT, Scanlan MJ, Sahin U et al.: A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:1914-18 10. Sahin U, Koslowski M, Türeci Ö, Eberle T, Zwick C, Romeike B, Moringlane JR, Schwechheimer K, Feiden W, Pfreundschuh M: Expression of cancer testis genes in human brain tumors. Clin Cancer Res 2000; 6: 3916-22 3 11. Schmits R, Cochlovius B, Treitz G, Regitz E, Ketter R, Pruess KD, Romeike BFM, Pfreundschuh M: Analysis of the antibody repertoire of astrocytoma patients against antigens expressed by gliomas. Int J Cancer 2002; 98:73-7 12. Struss AK, Romeike BFM, Munnia A, Nastainczyk W, Steudel WI, König J, Ohgaki H, Feiden W, Fischer U, Meese E: PHF3-specific antibody responses in over 60% of patientswith glioblastoma multiforme. Oncogene 2001; 20:4107-14 4.2 Eigene Vorarbeiten 4.2.1 SEREX Analysen in Non Hodgkin Lymphomen Wie zuvor ausgeführt, erlangte die SEREX Technologie bereits breite Anwendung bei der Identifikation neuer Tumorantigene in soliden Tumoren. Aufbauend auf Arbeiten zum frühen extranodalen Marginalzonen Lymphom vom MALT-Typ des Magens konnte diese Methode auch auf hämatologische Neoplasien übertragen werden [1]. Am Ludwig Institute for Cancer Research, New York, USA unter der Leitung von Dr. Lloyd Old und Dr. Yao-Tseng Chen wurden cDNA Expressionsbibliotheken untersucht, welche von unterschiedlichen Non-Hodgkin Lymphomen erstellt wurden. Diese wurden sowohl mit dem jeweils autologen Serum, als auch mit mehreren allogenen Seren in Hinblick auf, für Tumorantigene spezifische Serum-Antikörper untersucht. Hierbei wurden eine Vielzahl reaktiver Antigene detektiert. Bei der Mehrzahl handelte es sich um ubiquitär expremierte Autoantigene. Einige scheinen aber, wie weiterführende Untersuchungen ergaben, differentiell in Tumoren exprimiert zu sein. [1] 4.2.2 SEREX Analysen in Autoimmunerkrankungen Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemische rheumatische Erkrankung, welche klinisch durch Gelenkentzündung und –destruktion gekennzeichnet ist. Autoantikörper können im Serum von RA Patienten nachgewiesen werden und scheinen pathogenetisch für die Erkrankung bedeutsam zu sein. Für einige Autoantikörper wie den sogenannten Rheumafaktor ist die Spezifität bekannt. Es können aber auch eine Vielzahl von Autoantikörpern unbekannter Spezifität im Serum von RA Patienten nachgewiesen werden. In einem am Deutschen Rheumaforschungszentrum Berlin unter der Leitung von PD Dr. Claudia Berek durchgeführten Projekt wurde daher SEREX genutzt, um unbekannte Autoantigene durch Detektion von Autoantikörper im Serum sowie in Synovialflüssigkeit von RA Patienten zu charakterisieren. Es wurde eine Testis Expressionbibliothek mit einem Pool von RA Seren analysiert. Hierbei konnten 21 unterschiedliche Antigene isoliert werden, von welchen 8 unbekannter Funktion waren. Die anderen Klone korrespondierten zu Genfamilien wie Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktionsfaktoren, Faktoren, welche an der Cytoskelett Formation beteiligt sind, sowie Spilcing Faktoren. Die Untersuchung von Einzelseren von RA Patienten sowie gesunden Kontrollen zeigte eine höhere Frequenz von Autoantikörpern in RA Patienten gegenüber den Kontrollen. Ferner konnten individuelle Klone ermittelt werden, welche prädominant mit RA Seren aber nicht oder nur gering mit gesunden Kontrollseren reagierten. 4 Es konnte hier gezeigt werden, daß SEREX auch zum Nachweis von Autoantigenen in Autoimmunerkrankungen anwendbar ist. Klone mit prädominanter Reaktion in RA Seren könnten diagnostische Anwendung finden. Welche funktionelle Relevanz in Bezug auf die Pathogenese der rheumatioden Arthritis sich ergibt, muß Ziel weiterer Untersuchungen sein. Veröffentlichungen hierzu befinden sich in Vorbereitung. 4.2.3 Molekularbiologische und bioinformatische Erweiterung von CT-Antigen Familien CT-Antigene sind auf Grund ihrer auf maligne Tumoren und normales Hodengewebe begrenzte Expression vielversprechende Ziele in immuntherapeutischen Ansätzen. Sie liegen meist in Multigenfamilien vor. Ihre funktionelle Bedeutung ist aber mit Ausnahme der in der Spermiogenese involviereten SCP-1 und OY-TES-1 unbekannt. Zum weiteren Verständnis der Bedeutung von CTAntigenen wurden Genbankanalysen sowie molekularbiologische Untersuchungen zur Multigenfamilie NY-ESO sowie den Maushomologen von SSX Genen durchgeführt. 4.2.3.1 NY-ESO3 Neben dem zuvor schon bekannten LAGE-1 Antigen konnte ein weiteres Mitglied der NY-ESO Familie identifiziert werden. NY-ESO3 zeigt zwar weniger als 50% Homologie zu NY-ESO1 und LAGE-1, ist aber genomisch zwischen 2 exakten Kopien von NY-ESO1 und einer Kopie von LAGE-1 lokalisiert. Ferner konnte gezeigt werden, daß es sich bei NY-ESO3, obwohl es eindeutig zur Familie des CT-Antigen NY-ESO1 gehört, ubiquitär expremiert ist. Genbankanalysen ergaben, das es sowohl in Maus als auch in Ratte Homologe zur NY-ESO3 nicht aber zu NY-ESO1 oder LAGE-1 gibt. [2] 4.2.3.2 mSSX Das CT- Antigen SSX wurde zuerst auf Grund seiner Involvierung in die Translokation t(x;18) in synovialen Sarkomen beschrieben. Es handelt sich im Menschen um eine Multigenfamilie mit 9 kompletten Genen. Durch Klonierung von Maus Testitis und Maus Tumoren konnten zwei Subfamilien, mSSXA und mSSXB, identifiziert werden. mSSXA ist singulär, während es 12 homologe mSSXB Gene gibt. Für mSSXA und mSSXB konnte eine restriktive Expression in Tumoren und normalem Testis gezeigt werden. Vergleichbar zu dem Expressionsmuster von humanem SSX Genen konnten mSSX Gene in einigen aber nicht allen Maustumoren nachgewiesen werden. [3] Literatur 1. Alpen B, Güre A, Scanlan M, Williamson B, Neubauer A, Old LJ, Chen YT: SEREX analysis in low grade gastric marginalzone B-cell lymphoma of MALT-type. Ann Oncol 2002; 13, Supp 2:273 (Abstract) 2. Alpen B, Güre AO, Scanlan MJ, Old LJ, Chen YT.: A new member of the NY-ESO-1 gene family is universally expressed in somatic tissues and evolutionarily conserved. Gene 297:141-9, 2002 5 3. Chen YT, Alpen B, Ono T, Güre AO, Scanlan MJ, Biggs III WH, Arden K, Nakayama E, Old LJ: Identification and characterization of mouse SSX genes: a multigene family on X chromosome with restricted cancer/testis expression. Genomics 82(6):628-36, 2003 5.1 Bisher beantragte Förderung der Projektes oder themenverwandter Teilprojekte Entfällt 5.2 Drittmittelperspektive Aufgrund des Projektumfang gehen wir derzeit davon aus, einen Folgeantrag auf Anschubfinanzierung für das Jahr 2005 zu stellen. Dabei erwartet wir, daß anhand der Ergebnisse des ersten Jahres Anfang 2005 in der Lage zu sein, einen umfangreichen Drittmittelantrag zu stellen. 6. Ziele Das Ziel diese Projektes ist es, unbekannte, tumorspezifische Antigene in malignen Gliomen zu identifizieren. Dabei soll die Rolle der tumorinfiltrierenden B-Zellen in Gliomen durch Untersuchung ihrer Antigenspezifität mit Hilfe der SEREX-Methode untersucht werden. Im Ausblick kann dieses zum tumorbiologische und tumorimmunologische Verständnis von malignen Hirntumoren beitragen. Ferner können sich hieraus aber auch weiterführenden Aspekte in Hinblick auf multimodale Therapiekonzept insbesondere unter Berücksichtigung der minimalen Resterkranung ergeben. 7. Arbeitsprogramm 7.1 Material Für die hier geplanten Untersuchungen werden im Institut für Neuropathologie der Charité vorhandene Gefriergewebe von Gliomen verwendet werden. Ferner sollen Gliompatienten, welche in der Klinik für Strahlentherapie behandelt werden, nach deren Einwilligung im Rahmen von Routine Blutentnahmen Serumproben (ein 10ml Röhrchen) entnommen werden. Diesem Vorgehen wurde von der Ethikkommission der Charité zugestimmt. 7.2 SEREX Zur Identifikation von neuen, unbekannten tumorspezifischen Antigenen werden bei SEREX cDNA Expressionsbibliotheken mit Hilfe von Serum gescreent. Befinden sich im Patientenserum hochtitrige Antikörper gegen Tumorantigene, so reagieren diese mit den entsprechenden Klonen der Bibliothek. Durch Sequenzierung der Klone und Internet gestützter Genbankanalyse können die zu Grunde liegenden Gene identifiziert werden. Ferner besteht die Möglichkeit Sequenzvergleiche mit der öffentlich zugänglichen SEREX Datenbank am Ludwig Institute for Cancer Research in Zürich 6 durchzuführen. Dadurch kann erhoben werden, welche Antigene schon bei vorherigen SEREX Untersuchungen identifiziert wurden und in welchen Entitäten dieses möglich war. In dem geplanten Projekt soll zur Detektion von neuen unbekannten tumorspezifischen Antigenen Fab-Fragmente eingesetzt werden, welche von tumorinfiltrierenden B-Zellen ausgehend, rekombinant hergestellt werden. Vorteil hiervon ist die gezielte Analyse der tumorspezifischen B-Zell Antwort. Insbesondere bei Hirntumoren ist es denkbar, daß auch bei beinträchtigter Blut-Hirnschranke der Titer von spezifischen Antikörpern nicht in dem Detektionsbereich von SEREX liegt. Ferner werde durch das hier gewählte Herangehen alle solche Antikörper, die zum Hintergrund der natürlichen Autoantikörper gehören, vernachlässigt. Grundlage für unsere Analyse wird eine cDNA Expressionsbibliothek sein, welche anhand von Testis mRNA erstellt wurde. Testis eignet sich auf Grund einer generalisierten Hypomethylierung des genetischen Materials und damit einer annähernd genomweiten Expression des genetischen Repertoires als Surrogatgewebe. 7.3 Herstellung von rekombinanten Fab-Fragmenten Fab-Fragmente stellen den Anteil eines Antikörpermoleküls dar, der durch die antigenerkennende Domänen einer leichten und einer schweren Kette gebildet wird. In dem geplanten Projekt sollen Fab-Fragmente von tumorinfiltrierenden B-Zellen aus Gliomgewebe rekombinant hergestellt werden. Hierzu werden zunächst mittels Mikrodissektion einzelne B-Zellen aus entsprechend aufgearbeitetem Gefriergewebe isoliert. Anschließend erfolgt die PCR Amplifikation von leichter und schwere Immunglobulinkette. Hierfür wird zunächst in einer Reversetranskriptasereaktion die gesamte Immunglobulin mRNA in cDNA umgeschrieben. Durch Drittelung des Ansatzes erfolgt dann eine PCR mit einen Gemisch von familienspezifischen Primern für die schwere Kette sowie je ein Ansatz für Lambda oder Kappa leichte Kette. Proben, für welche sowohl eine schwere als auch eine leichte Kette amplifiziert werden kann, werden weiter bearbeitet. Zunächst erfolgt die Klonierung und Plasmidsequenzierung, um die exakte Sequenz sowie die Familienzugehörigkeit der Ketten festzulegen. Anschließend werden beide Ketten in einen Expressionsvektor kloniert. Durch die speziellen Eigenschaften des Vektors und geeignete Kultur- und Aufreinigungsbedingungen lagern sich die beiden Ketten zu Fab-Fragmenten zusammen. 7.4 Seroreaktivität in anderen Tumoren und gesunden Kontrollen Für positive Klone wird die Untersuchung der Seroreaktivität auf weitere Kollektive ausgedehnt werden. Hierbei sollen zunächst Seren von Patienten mit Glioblastomen auf ihre Reaktivität mit den identifizierten Antigenen hin getestet werden. Desweiteren werden Seren von Patienten mit anderen Tumoren sowie gesunde Kontrollen mit einbezogen. In Abhängigkeit von den Ergebnissen wird dieses durch SEREX oder aber auch bei gut rekombinant expremierbaren Genen durch ELISA Testung 7 erfolgen. Letzteres bietet dann auch die Möglichkeit einer Titerbestimmung der jeweiligen Antikörper gegen das tumorspezifische Antigen. 7.5 Expressionsanalysen Die Expression tumorspezifischer Antigene wird zunächst auf mRNA Ebene mit Hilfe von RT-PCR sowohl im Tumormaterial als auch in gesunden Geweben unterschiedlicher Organe untersucht werden. Bei differenzieller Expression kann zur Quantifizierung eine Echtzeit-PCR erfolgen. Die Expression auf Proteinebene zu erfassen, erfordert bei unterschiedlichen Verfahren den Zugang zu zumindest polyklonalen Antikörpern. Läßt sich das identifizierte Gen gut rekombinant expremieren, können mit Hilfe dieser Proteine Antikörper in Tieren erzeugt werden. Dieses Verfahren wird von einem kommerziellen Anbieter in Anspruch genommen werden. Die Antikörper werden im ELISA zur quantitativen Bestimmung der Expression des betreffenden Antigenes verwendet. Des weiteren können sie aber auch in der Immunhistochemie eingesetzt werden, um am histologischen Präparat die Expression nachzuweisen. Hier ergibt sich zusätzlich der Vorteil, daß eine subzellulare Lokalisation des Antigens möglich wird. 7.6 Tumorbiologische Funktion Untersuchungen zur tumorbiologischen Relevanz identifizierter tumorspezifischer Gene hängen nicht nur von unseren Ergebnissen sondern auch davon ab, welche Informationen schon über diese Gene erhältlich sind. Entsprechende Ansätze können also nicht im Vornherein festgelegt werden. 8. Voraussetzungen für die Durchführung des Projektes 8.1 Kooperationspartner Die Isolation von Einzel-B-Zellen mit Hilfe von Mikrodissektion aus Gefrierschnitten wird in Kooperation mit Prof. Dr. Andreas von Deimling und Dr. Ali-Fuat Okuducu, Institut für Neuropathologie der Charité erfolgen. Der Vektor für die rekombinante Expression von Fab-Fragemten wurde von Prof. Dr. Arne Skerra, Institut für Biologische Chemie der TU-München, Freising-Weihenstephan zur Verfügung gestellt. 8.2 Apparative Ausstattung Die apparative Ausstattung des Bereiches Strahlenbiologie der Klinik für Strahlentherapie, Charité Campus Mitte erlaubt die Durchführung aller hier beschriebenen Arbeiten. 8 9. Förderdauer 1 Jahr, mit absehbarer Verlängerung um ein weiteres Jahr. 10. Beantragte Mittel 10.1 Konsumtive Mittel RT-PCR Kit, Qiagen 1 200,- Euro Oligonukleotid Primer 500,- Euro Bakterienmedien 1 200,- Euro TA Klonierungskit Invitrogen 900,- Euro Nitrozellulose Membranen 3 600,- Euro Antibiotika 500,- Euro BCIP/NBT 1 000,- Euro sekundär Antikörper 1 000,- Euro IPTG 100,- Euro Plastikwaren 2 000,- Euro Summe 10.2 Die 12 000,- Euro Begründung hier beantragten Mittel dienen der Durchführung des Verbrauchsmittelbedarf für ein Jahr wird hierdurch gedeckt werden. Anlagen Ethikvotum Gentechnische Sicherheit 9 geplanten Projektes. Der
