Zusammenfassung Genetik

Zusammenfassung Genetik
1 DNA als Träger der genetischen Information
• Welche Beobachtungen und Experimente haben gezeigt, dass DNA der Träger der
Erbinformation ist?
1. Experiment von F. Griffith (1928): Aus toten, virulenten Erregern von
Lungenenzündung werden Eigenschaften auf lebende, nicht virulente Bakterien,
übertragen, so dass dieser Stamm ebenfalls Lungenentzündung verursacht.
2. Experiment von O. Avery (1944): Zerlegung der toten Erreger in Lipide, Proteine,
Kohlenhydrate, RNA und DNA. Nachweis dass nur die Übertragung der DNA den
Stamm virulent macht.
3. Arthur Hershey & Martha Chase (1952): Avery wird nicht geglaubt, da die DNA nur
4 und die Aminosäuren 20 unterschiedliche Bausteine haben. Hersey/Chase zeigen
einerseits mit radiokativen Aminosäuren (S 35 , Schwefel kommt in der DNA nicht
vor) und anderseits mit radioktiven DNA (P 32 , Phospor kommt in den Aminosäuren
nicht vor) an Phagen, dass die Radioaktivität in Form von Phosphor den
Wirtsbakterien bleibt, also in der DNA liegt.
• Worauf beruht die Tatsache, dass der A+T resp. G+C Gehalt der DNA verschiedener
Organismen variert, während der Gehalt an Purin- und Pyrimidin-Basen immer 50%
beträgt?
Auf Grund der konstanten Distanz zwischen den DNA-Rückgraten bindet immer ein
2-ringiges Purin(A,G) mit einem 1-ringigen Pyrimidin(G,C). Welches der beiden
Basenpaare verwendet wird, differiert hingegen je nach Organismus.
• Was versteht man unter Komplementarität zweier DNA Stränge? Was unter
antiparallelen DNA Strängen?
1. Komplementarität bedeutet, dass jeder Strang wieder als Matrize für ein Gegenstück
dienen kann und damit kann sich jeder Teilstrang selbständig zu einer identischen
Kopie der ursprünglichen DNA ergänzen.
2. Damit nicht ein Stang nach der Replikation spiegelverkehrt ist, muss immer ein 5’
auf ein 3’-Ende des anderen Strangs zuliegen kommen.
• Unterschiede zwischen DNA und RNA.
1. RNA enthält Uracil, DNA Thymin, d.h. am C-5 Atom eine Methylgruppe statt ein
H-Atom.
2. RNA enthält als Zucker eine Ribose, DNA eine Desoxiribose, d.h. am C-2’ Atom nur
ein H-Atom statt einer Hydroxygruppe.
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• Was haben Watson und Crick aus ihrem Doppelhelix-Modell im Bezug auf die
DNA-Verdoppelung (Replikation) vorausgesagt?
1. Die DNA-Doppelhelix muss für die Replikation aufgetrennt werden.
2. Die Base Adenin paart sich mit Thymin und Guanin mit Cytosin, anders passen die
Wasserstoffbrücken gar nicht zusammen oder zuminst kann der gleichmässige
Abstand von 20nm kann nicht eingehalten werden.
3. Mutationen durch Einbau von tautomeren Basen und daraus folgender
Falschpaarung.
• Grössenordnung von Bakteriophagen- und Bakteriengenom in Basenpaaren/Genen?
ca. 0.15 cm mit ∼4 Mio Basenpaaren und 1000-5000 Genen.
• Beschreiben Sie die Tertiärstruktur eines bakteriellen Chromosoms.
Kondensierte Schleifenstruktur mit superhelicaler Aufwindung.
• Beschreiben Sie Experimente, die gezeigt haben, dass bakterielle Chromosomen in der
Regel zirkulär sind und bidirektionell repliziert werden.
J. Cairns (1963): „Θ-Figur“
– Markierung der DNA mit H 3 -Thymin
– Isolierung der DNA
– Abbild auf einem strahlenempfindlichen Film (Audiogramm)
– schwach markierte Chromosomen werden während der Replikation in stark markierte
Nährlösung gelegt. Damit wird die Bewegung der Replikationsgabel sichtbar.
• Was versteht man unter semikonservativer Replikation und wie wurde diese nachgewiesen?
– Jeder Strang der ursprünglichen DNA liegt nach der Replikation in einer der beiden
Tochterzellen.
– M. Meselson & F. Stahl (1958): E. Coli werden in schwerem Stickstoff (N 15 )
gezüchtet und anschliessend in normalem N 14 -Stickstoff vermehrt. Anschliessend
wird bei jeder Generation die DNA isoliert und das Verhältnis von N 14 zu N 15
verglichen. Dabei zeigt sich, dass der Anteil hybrider DNA mit einer Zweierpotenz
pro Generation abnimmt. (1 → 12 → 41 → 18 )
• Auf welcher molekularen Tatsache beruht die Beobachtung, dass die DNA-Neusynthese
immer in 5 ->3 Richtung erfolgt?
Die exotherme Hydrolyse des Nucleotid-Triphosphates kann an die endotherme Synthese
der kovalenten Bindung zwischen dem 3’- Ende und dem am 5’-C-Atom hängenden
Phospat des herangeführeten Nucleotids gekoppelt werden. Wird das Nucleotid an das
5’-Ende herangeführt, kann zwar das Diphosphat durch Hydrolyse abgespalten werden,
aber die gewonnene Energie verpufft ungenutzt, da die Bindung in diesem Fall am
3’-C-Atom erfolgen müsste.
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• Welche Folgen hat dies für den DNA-Replikationsmechanismus?
– nur der Leadingstrand kann kontinuierlich durch Polymerase III Enzyme
synthetisiert werden.
– Der Laggingstrand wird in kurzen Stücken (Okazaki-Fragmenten), initialisiert durch
RNA-Primer aufgebaut.
– Die Okazakifragmente werden durch Polymerase I synthetisiert und durch Ligasen
verbunden.
• Welche Proteine sind notwendig für die Initiation und Elongation der Replikation und
welches ist ihre jeweilige Funktion?
1. Initiation
– dnaA markiert den OriC
– Helicase spaltet die beiden DNA-Strange auf
2. Elongation
– SSB Singlestranded binding protein stabilisiert die offenliegenden Einzelstränge
– Primase synthetisiert auf dem Laggingstrand die RNA-Primer, da die
Polymerase nur ansetzen aber nicht initialisieren kann.
– Polymerase III synthetisiert den Leadingstrand
– Die Gyrase entspannt die DNA vor der Replikationsgabel durch Entfernen der
Überspannung.
– Polymerase I synthetisiert auf dem Laggingstrand die Okazakifragmente
– Ligase verbindet die Okazakifragmente
– Exonuklease korrigiert Fehler
• Welche Eigenschaften der DNA-Polymerase III tragen bei zu der tiefen Fehlerrate des
Replikationsprozesses?
Die integrierte Exonuklease entfernt falsch eingefügte Basenpaare. Die SSB markieren
dabei den Matrizenstrang, damit die Exonuklease weiss, welches Nucleotid das falsche ist.
• Erklären Sie das Prinzip der Polymerase-Ketten-Reaktion und jenes der
DNA-Sequenzanalyse nach Sanger.
1. Polymerase-Ketten-Reaktion: Wird eingesetzt zur Vervielfachung einer
DNA-Sequenz deren Primer bekannt und verfügbar sind.
Die DNA wird durch Hitze (94◦ ) in die beiden Einzelstränge gespalten. Anschliessend
wird auf 50◦ abgekühlt, damit sich die bekannten Primer anlagern. Zuletzt wird je
nach GC-Gehalt auf die für die Polymerase (∼ 72◦ ) ideale Temperatur erhöht und
die Sequenz repliziert. Die Polymerase wird aus bitzeresistenden Bakterien
gewonnen. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis sich genügend DNA angesammelt hat.
2. DNA-Sequenzanalyse nach Sanger:
Durch Beifügen von radioaktiv markierten Dideoxynukleotiden werden Abbrüche bei
der Polymerase provoziert, da die Hydroxygruppe am *’-C-Atom fehlt. Diese
Abbrüche erfolgen zufällig je nach Mischverhältnis von Deoxy- und
Dideoxynukleotiden. Dies wird in getrennten Versuchen für alle vier Nucleotide
durchgeführt und mittels Gelelektrophorese sichtbar gemacht.
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2 Fluss der genetischen Information
• Wie unterscheidet sich die RNA-Polymerase von der DNA-Polymerase und welche
Eigenschaften teilen sich diese beiden Enzyme?
– Die RNA-Polymerase kann eine neue Polynucleotidkette mit einem 5’-Ende starten.
– RNA Polymerase baut Uracil anstatt Thymin ein
– Die DNA-Polymerase repliziert DNA und die RNA-Polymerase transkribiert RNA.
Dabei arbeitet die DNA-Polymerase wesentlich genauer, da sich ein Fehler in der
Replikation auf die kommenden Generationen vererbt.
– Die DNA-Polymerase arbeitet an einem einzelnen DNA-Strang, während die
RNA-Polymerase einen Doppelstrang über ca. 17 Basenpaare auftrennt und ein ca.
12 Basenpaare langes RNA/DNA-Hybridmolekül bildet.
– Beide Polymerasen können Nucleotide zu Ketten synthetisieren, wobei der Zucker
bei DNA eine Desoxyribose ist um Gegensatz zur Ribbose in der RNA am
2’-C-Atom statt einer Hydroxylgruppe nur ein H-Atom hat.
• Welche „Signale“ in der DNA sind notwendig für eine exakte Initiation und Termination
der Transkription?
– Die Transkription beginnt bei einem Promotor. Die RNA-Polymerase erkennt diesen
am Sigma-Faktor. Der Promotorbereich liegt -10 bis -35 Basenpaare vor dem Start
der Gensequenz.
– Die Transkription endet mit einem Terminator. Dieser wird oft aus einer Schleife in
der DNA, gebildet durch zwei komplementäre Sequenzen gefolgt von einigen A oder
T. Diese sind schwächer bindend, da sie nur 2 H-Brücken aufweisen.
• Welches sind die drei Gruppen von RNA Molekülen in der Zelle, wodurch unterscheiden
sie sich voneinander und welches sind ihre spezifischen Funktionen während der
Expression genetischer Information?
1. ribosonale RNA (rRNA)
Bildet die Ribosomen und macht ca. 80% der RNA in der Zelle aus.
2. Transfer-RNA (tRNA)
kleine RNA-Moleküle, welche bei der Proteinsynthese als Adapter zwischen den
Aminosäuren und der mRNA verwendet werden. Machen ca. 15% der RNA in der
Zelle aus. Sie hat Kleeblattform mit einem Arm als Anticodon zum Aufsetzen auf
der mRNA und einem Arm um die Aminosäure hinzuführen.
3. Messenger-RNA (mRNA)
Eigentliche codierende RNA, welche in der Proteinsynthese abgelesen wird. Sie
macht etwa 5% aller RNA aus.
• Die Aminoacyl-tRNA Synthetasen sind die Schlüsselenzyme beim Umschreiben des
genetischen Codes in Aminosäuren. Weshalb?
Die Aminoacyl-tRNA Synthetasen koppeln die Aminosäuren an die tRNA. Es gibt
deshalb 20 verschiedene dieser Enzyme. Ohne die Koppelung wäre eine Paarung mit
mRNA nicht möglich, sie sichern die Genauigkeit der Translation.
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• Weshalb gibt es in einer bakteriellen Zelle in der Regel weniger als 61 verschiedene
tRNAs?
Wegen dem degenerierten Code muss die dritte Base des Anticodon-Arm nicht so strikt
mit der Messenger-RNA paaren, da die dritte Base oft keine Rolle mehr spielt und für
dieselbe Aminosäure codiert.
• Wie erkennt ein Ribosom den Anfang eines Gens?
Am Startcodon AUG, seltener GUG. Damit AUG als Startcodon von der Aminosäure
Methionin (MET), welche auch mit AUG codiert unterschieden werden kann, existieren
zwei verschiedene tRNA’s.
• Wie wirken Antibiotika und wie können sich Mikroorganismen gegen die Wirkung von
Antibiotika schützen?
1. Wirkung auf:
– Transkription (z.B. RNA-Polymerase)
– Translation(z.B. Aminoacyl-tRNA Synthetasen)
– Zellwandbiosynthese
Unterscheiden sich alle bei Prokaryoten und Eukaryoten.
2. Schutz:
– Pumpen, welche das Antibiotika wieder hinauspumpen
– Modifikation des Antibiotikums, dass es nicht mehr in die Translation oder
Transkription eingreifen kann
– Modifikation der Zielstruktur, dass das Antibiotikum diese nicht mehr findet.
– Zerstörung und Abbau des Antibiotikums
• Welches sind die Voraussetzungen für das Auftreten und die Verbreitung von
Antibiotikaresistenten Bakterien?
Die Lebensbedingungen müssen so sein, dass die Überlebenschancen für die Mutanten um
ein vielfaches grösser sind als für den ursprünglichen Wildtyp.
3 Escherichia Coli
• Welche molekularen Mechanismen führen zu Veränderungen in der DNA?
– Tautomere Umlagerung (Verschiebung einer Doppelbindung)
Cytosin C* in der seltenen Iminoform paart mit Adenin und Thymin T* in der
seltenen Enolform paart mit Guanin. Analoges gilt für die Iminoform von Adenin A*
↔ Cytosin und die Enolform von Guanin G* ↔ Thymin.
– Basendesaminierung (Ersatz der Aminogruppe durch ein O-Atom)
Sind pH und Temperatur abhängig. Am häufigsten bei Cytosin, welches dadurch zu
Uracil wird und in der RNA-Welt nicht mehr von einer korrekten Base unterschieden
werden konnte. Deshalb wurde in der DNA-Welt Uracil durch Thymin ersetzt.
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• Wie prägen sich Basenveränderungen zu stabilen Mutationen aus?
Wenn sich während dem die Stänge getrennt sind, die Imino- resp. Enolform der Base in
die Normalform zurückwandelt, wird sie bei der Replikation mit der falschen Base
gepaart. Diesen Fehler kann der Reparaturmechanismus nicht feststellen und die
Mutation wird weitervererbt.
• Beschreiben Sie die Konsequenzen von Punktmutationen in einem bestimmten Gen auf
die Funktion des betreffenden Genprodukts.
– Stumme Mutation
Mutation codiert für die gleiche Aminosäure
– Neutrale Mutation
Verändertes Triplett codiert für eine chemisch ähnliche Aminosäure
– Missense Mutation
Verändertes Triplett codiert für eine chemisch nicht verwandte Aminosäure
– Nonsense Mutation
Verändertes Triplett ist ein STOP Codon
• Was ist der Unterschied zwischen Reversion und Suppression einer Mutation?
– Aus eine Suppression resultiert der gleiche Phänotyp aber ein unterschiedlicher
Genotyp.
– Aus einer Reversion resultiert wieder der ursprüngliche Genotyp.
• Was sind konditionale Mutationen und weshalb sind diese für den Genetiker besonders
interessant?
Mutationen, welche nur bei bestimmten äusseren Bedingungen auftreten wie z.B.
Temperatur oder pH-Wert. Damit kann mit den Umgebungsbedingungen gesteuert
werden, wann sich der Mutant als unterschiedlicher Phänotyp zeigt.
• Welche Mutationsarten erhält man, wenn man eine Bakterienkultur mit folgenden
Mutagenen behandelt:
Erklären Sie weshalb.
– Basenanaloge (z.B. 5-Bromouracil):
Wird statt Thymin eingebaut, paart aber mit Guanin statt Adenin, da es wegen der
höheren Elektroneagativität zu Ionenbildung neigt und dehalb die Lage der beiden
restlichen Wasserstoffbrücken besser zu Guanin passen. Daraus resultiert eine
Punktmutation A-T → G-C.
– alkylierende Substanzen (z.B. Ethylmethansulfonat):
Durch Anhängen eine Methylgruppe an das doppeltgebundene O-Atom beim Guanin
entfällt eine Wasserstoffbrücke und das O 6 -Methylguanin paart mit Thymin. Daraus
resultiert eine Punktmutation G-C → A-T.
– UV:
Hochenergetisches UV-Licht von ∼ 300 nm verbindet die C-Atome des Purin- resp.
Pyrimidinringe benachbarter Nukleotide kovalent zu einem Cyclobutylring. Dies tritt
vor allem bei Thymin in Form sogenannter Thymindimere auf und unterbricht die
DNA-Replikation.
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• Beschreiben Sie alle Möglichkeiten, die eine Zelle hat, um spontane und induzierte
chromosomale Mutationen zu korrigieren.
– Die Alkyltransferasen erkennen und entfernen spezifisch Alkylgruppen. Sie können
damit falsche Methylgruppen entfernen.
– Die DNA-Glykosylase entfernt unnatürliche Basen inkl. Uracil aus der DNA.
Anschliessend werden durch die Endonuclease Die Zucker und Purin/Pyrimidinreste
entfernt. Eine Polymerase setzt ein neues Nucleosit ein und die Ligase verbindet die
Bruchstellen.
– Grössere fehlerhafte Abschnitte werden durch die Nuklease herausgeschnitten und
von der Polymerase neu synthetisiert. Am Schluss werden die Bruchstellen von der
Ligase neu verbunden.
– Nach der Replikation wird der alte Strang an Methylresten erkannt, damit nicht aus
Versehen die Matrize verändert wird. Die Methylierung von Adenin in der Sequenz
GATC ist natürlich und stört die Basenpaarung nicht. Nach der Replikation ist der
neue Strang noch nicht methyliert wodurch die falsche Base einer Fehlpaarung
identifiziert wird.
– Die Photolyase kann einen Thymindimer spalten und so direkt reparieren. Das
Enzym ist lichabhängig und wirkt deshalb im Dunkeln nicht.
– Die SOS-Antwort hilft der Replikationsgabel über eine DNA-Läsion (z.B.
Thymindimer) hinwegzulesen. Dabei leidet jedoch die Genauigkeit der
Polymerisierungsreaktion und es treten vermehrt Replikationsfehler auf. Das
SOS-System besteht aus mehreren Proteinen, die nur dann von der Zelle hergestellt
werden, wenn diese große DNA-Schäden enthält.
4 Homologe Rekombination
• Erklären Sie wie es zu Inversionen, Deletionen, Insertionen oder Duplikationen im
Bakteriengenom kommen kann.
Wenn DNA durch horizontalen oder vertikalen Gentransfer aufgenommen wird, kann es
bei der homologen Kombination zu Fehlern kommen. Diese äussern sich als:
– Inversion, wenn bei der Auflösung einer Überkreuzung ein Stück DNA in den
falschen Strang eingebaut wird.
– Deletion, wenn ein DNA-Abschnitt verloren geht und abgebaut wird oder selten als
Plasmid übrig bleibt.
– Insertion, wenn ein Stück DNA z.B. aus einem Plasmid eingefügt wird.
– Duplikation, wenn ein Stück DNA verdoppelt wird.
Beim Falten der DNA kann es zu ortspezifischen Mutationen kommen. Diese äussern sich
als:
– Inversion hervorgerufen durch Invertasen z.B. Variation des Flagellin in Salmonella
typhimurium.
– Insertion oder Deletion durch Integrase resp. Resolvase (einfügen resp. herauslösen
eines Genes)
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• Was ist horizontaler Gentransfer und inwiefern spielen homologe Rekombination und
Transposition bei diesem eine Rolle?
Übertragung von DNA zwischen Individuen der gleichen oder unterschiedlicher Spezies.
Bei gleichen Spezies sind die daraus folgenden Variationen erwünscht, bei
unterschiedlicher Spezies handelt es sich in der Regel um ein symbiotisches oder
parasitäres Verhältnis. Unterschieden werde folgende Verfahren:
– Konjugation
Übertragung von Plasmiden (Bakterieller Sex)
– Transformation
Aufnahme von freier DNA
– Transduktion Übertragung von DNA durch Viren/Phagen
• Welches sind die Unterschiede zwischen homologer Rekombination , ortsspezifischer
Rekombination und Transposition?
– Bei der homologen Rekombination werden lange Stücke auf weitern Teilen identischer
DNA rekombiniert. In der Regel handelt es sich um DNA derselben Spezies.
– Bei der ortsspezifischen Rekombination werden kurze 10-15 überinstimmende
Basenpaare rekombiniert und die Stücke über das Kreuz geschnitten.
– Bei der Transposition springt ein Gen mit oder ohne Replikation an eine andere
Stelle.
• Beschreiben Sie wie sich die Proteine RecA und RecBCD am Rekombinationsprozess
beteiligen?
1. RecA
–
–
–
–
kann einen Einzelstrang und eine Doppelhelix zusammenhalten
bindet an das Rückgrat der DNA, also nicht sequenzspezifisch
bindet an die singlestanded DNA
bindet auf der Länge von 5-6 Nucleotiden
2. RecBCD
– Ist eigentlich eine Helicase für die Lockerung blockierter Replikationsgabeln.
Ermöglicht zusammen mit RecA den Start der Polymerase an beiden Enden.
• Beschreiben Sie die Abläufe während dem Austausch zweier DNA Stränge bei der
homologen Rekombination (zeichnen!).
Die Stränge laufen übers Kreuz. (Schenkelwanderung, Hollyday-Junction). Je nachdem
wie beim zweiten mal geschnitten wird, gibt es einen Patch oder einen Splice.
• Wie gross ist die erkannte Zielstruktur bei der Transposition und wie kommt es zu deren
Verdoppelung?
Die Zielstruktur enthält 3-15 Basenpaare. Auf beiden Seiten wird ein Strang geschnitten
und mit je einem Strang des Transposons verbunden. Die entstehenden Lücken werden
anschliessend mit Polymerase repliziert.
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• Welches sind die Unterschiede zwischen replikativer und konservativer Transposition?
Bei der konservativen Transposition verschiebt sich das Transposon(Tn) oder die
Insertionssequenz(IS) an eine neue Stelle. Bei der replikativen Transposition wird an die
neue Stelle kopiert.
• Erläutern Sie welche Auswirkungen IS-Elemente und Transposons auf eine Bakterienzelle
haben können.
– Liegt das Ziel in einem Gen, ist dieses nicht mehr funktionell
– Liegt das Ziel unmittelbar vor einem Gen, ändert sich dessen Genexpression
– Liegt das Ziel in einer nichtcodierenden Region, hat es keine Auswirkungen
5 Plasmide
• Was sind Hfr Stämme und wie wurde mit deren Hilfe die Zirkularität des
Bakterienchromosoms nachgewiesen?
Hfr-Stämme haben das fertilitets Plasmid F + ins Chromosom integriert und konjugieren
deshalb häufiger als normale Stämme. Durch Abbruch der Konjugation und
Untersuchung des Phänotyps der Rezipientenzellen, kann die Reihenfolge der Gene und
deren Distanz vom OriT festgestellt werden. Bestehen verschiedene OriT, wird die
Zirkularität aus der Reihenfolge sichtbar.
• Was versteht man unter einem breiten Wirtsspektrum eines Plasmids und wie würden Sie
ein solches nachweisen?
Je mehr Enzyme ein Plasmid selbst codiert, desto unabhängiger wird es von einem
bestimmten Wirt.
• Welche Funktionen braucht es für einen konjugativen DNA-Transfer zwischen zwei Zellen?
Es braucht eine F + Donor und einen F − Rezipient. Der Donor bildet Pili und erkennt
damit die F − Nachbarzelle Die Pili binden an die Zelloberfläche und werden eingezogen.
Dort bildet sich eine Pore, damit ist der Zell-Zell-Kontakt hergestellt. Am OriT des
F-Plasmids entsteht ein Einzelstrangbruch und das 5’-Ende wandert durch die Pore in
den Rezipienten. In beiden Zellen findet Replikation statt, im Rezipient diskontinuierlich.
• Erfolgt die Replikation der übertragenen DNA in der Donor Zelle bei der Konjugation
kontinuierlich oder diskontinuierlich? Weshalb?
Kontinuierlich, weil der Leadingstrand im Donor bleibt.
• Welche molekulare Mechanismen haben mit grosser Wahrscheinlichkeit zur Entstehung
und Verbreitung von R-Plasmiden geführt?
– R-Plasmide codieren alle Proteine, welche für einen Transfer nötig sind.
– Sie enthalten ein oder meherer Antibiotika-Resistenz-Gene
– Antibiotikaresistenzen werden mittels Integrons eingefangen und weiterverbreitet.
• Welche verschiedenen Antibiotika-Resistenzmechanismen kennen Sie?
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• Was bedeutet ’Hfr’ und weshalb werden diese Stämme so bezeichnet?
high-frequency-of-replication-Stämme konjugieren mit einer Frequenz 10 −1 gegenüber
10−4 − 10−5 Stämmen ohne integrierters Fertilitätsplasmid.
• Was versteht man unter Transformation und was ist deren Bedeutung für
Mikroorganismen?
– Aufnahme freier DNA aus der Umgebung
– Dadurch dass tote Zellen ihre DNA in die Umgebung entlassen, haben lebendige
Zellen die Möglichkeit diese aufzunehmen und damit mittels homologer
Rekombination eigene defekte DNA-Stücke zu reparieren. (z.B. TT-Dimere)
• Was sind Integrons und welche Rolle spielen sie bei der horizontalen Verbreitung von
genetischem Material?
Transposons, welche spezialisiert sind Antibiotika-Resistenz-Gene aufzunehmen.
6 Bakteriophagen
• Wie kann man Bakteriophagen nachweisen?
Eine Mischung von Indikatorbakterien und Phagen wird auf eine Nährlösung gegeben.
Wenn das Mischverhältnis klein genug ist, bilden sich Plaqueflecken, dort wo die
Bakterien von den Viren lysiert worden sind. (Indikatorrasen)
• Wie beteiligen sich Bakteriophagen am horizontalen Gentransfer?
Sie übertragen zusammen eingebaut in die eigen DNA auch Bakteriengene. Diers Vorgang
heisst Transduktion.
• Welches sind die Unterschiede zwischen genereller und spezieller Transduktion? Wie
würde eine rec Mutation (z.B. recA-) die Frequenz der beiden Transduktionswege
beeinflussen?
– Generelle Transduktion entsteht durch Verpackungfehler beim Verpacken der
Phagen-DNA in die Proteinhülle. Dabei werden irrtümlich Bruchstück der
Wirts-DNA mitgegeben, welche in der nächsten Wirtszelle homolog rekombinieren.
– Spezielle Transduktion entsteht durch fehlerhafte Excision (illegitime
Rekombination) der Viren-DNA aus dem Wirtschromosom. Diese Phagenpartikel
haben eine defekte Integrationsstelle und können nur mit homologer Rekombination
oder einen Helferphagen in die Wirts-DNA integrieren.
– recA− bedeutet dass das Protein RecA nicht mehr synthetisiert wird. RecA wirkt
als spezifische Protease von CI. somit ist genügend CI vorhanden und dieses wirkt
als λ-Repressor. Der Wirt bleibt deshlb länger im lysogenen Stadium.
• Welches sind die Unterschiede zwischen Komplementation und Rekombination bei
Phagenkreuzungen? Wie kann man die beiden unterscheiden?
– Rekombination benötigt zwei homologe (zusammenpassende) Stücke DNA. Damit
das durch Transduktion übertragene Stück in die Wirts-DAN eingebaut werden
kann, müssen zwei Überkreuzungen entstehen.
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– Kombination kann auch mit jedem Stück DNA vorkommen und dient in erster Line
der Reparatur defekter Gene, solange ein intakter Satz vorhanden ist.
• Was ist gemeint wenn man ein Bakteriophagen-Genom terminal redundant nennt? Wie
entsteht terminale Redundanz?
Das Phagen-Genom wird σ-repliziert und in lineare Stücke geteilt, welche am Anfang und
Ende wieder zu cirkulärer DNA kombinieren können.
• Weshalb ist ein λ-lysogener E. coli Stamm immun gegen eine Superinfektion durch λ
Phagen?
Weil auf Grund des Promotors PRM (RM = Repressor Maintenance) genügend CI als
λ-Repressor vorhanden ist, werden die Promotoren PL und PR eines infizierenden Phagen
sofort unterdrückt.
• Worauf beruht die Regulation der Genexpression am λ-switch?
Der Switch ist eine Stelle mit drei Operatoren. Die Repressoren Cro (Lyse) und CI
(Lysogenie) binden gegenseitig an diese Operatoren und erniedrigen die Bindungsaffinität
für den andern. Derjenige der das instabile Gleichgewicht auf seine Seite ziehen kann,
gewinnt.
• Was ist lysogene Konversion?
Wenn Bakteriophagen ode Plasmide Virulenzgene für den Wirt übertragen.
• Weshalb eignen sich lysogene Bakteriophagen ideal als Vehikel für horizontalen
Gentransfer?
Bakteriophagen können große DNA Fragmente übertragen und in rauhen
Umweltbedingungen überleben.
7 Genexpression
• Eine Zelle kann ihre Stoffwechsel-Enzyme auf zwei Arten regulieren: über deren Synthese
oder über deren Aktivität. Können Sie je ein Beispiel für diese beiden Mechanismen
angeben? Was sind die Vorteile bzw. Nachteile dieser beiden Strategien?
• Können Sie erklären, weshalb in Bakterien die Expression von Genen für katabolische
Enzyme meist über deren Induktion, jene von Genen für anabolische Enzyme meist über
deren Repression gesteuert wird?
• Erklären Sie den Unterschied zwischen dem Lac-Repressor und dem Trp-Repressor im
Bezug auf deren Wirkungsweise und allosterische Interaktion mit dem Effektor.
• Werden b-Galactosidase und Lac-Permease in Gegenwart oder Abwesenheit eines
Induktors (IPTG) in einer Zelle mit folgendem diploiden Zustand gebildet:
I+P-O+Z+Y+/I-P+O+Z+Y-?
• Aus welchem Grund wird das lac Operon in der Gegenwart von Glucose nicht abgelesen,
auch wenn Lactose ebenfalls im Medium vorhanden ist? Welcher Mechanismus liegt
diesem Phänomen zugrunde?
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• Angenommen man mutiert die beiden Trp Codons (UGG) in der trp Leader Region
(trpL) zu Gly Codons (GGG), wie wirkt sich das auf die Expression des trp Operons aus,
wenn: 1.) Tryptophan im überschuss im Wachstumsmedium vorhanden ist oder 2.) wenn
die Zelle unter Tryptophan- Mangel leidet?
8 Restriktion / Modifikation
• Erklären Sie das Experiment der wirtskontrollierten Modifikation mit dem
Bakteriophagen Lambda, und analysieren Sie es mit Hilfe Ihres Wissens über
Restriktions/Modifikationssysteme.
• Weshalb eigene sich Restriktionsendonukleasen der Klasse II besonders für
molekulargenetische Arbeiten? Weshalb nicht jene der Klassen I und III?
• Wovon hängt die Häufigkeit ab, mit welcher ein Restriktionsenzym ein bestimmtes DNA
Molekül schneidet?
• Welche chemische Reaktion wird von DNA-Ligasen katalysiert?
• Beschreiben Sie je eine positive und eine negative Selektionsstrategie, die bei
Klonierungsexperimenten mit Plasmidvektoren verwendet werden.
• Was versteht man unter reverser Genetik?
9 Glossar
Allel Eine von mehreren Formen eines Gens (Wildtype Allel, Mutanten Allel)
auxotrophe Mutation Auxotrophe Mutanten sind nicht mehr fähig ein bestimmtes
Stoffwechselprodukt (z.B. Aminosäuren) zu synthetisieren und sind deshalb abhängig von
dessen Zusatz im Wachstumsmedium.
Bakteriophagen Viren, die Bakterien infizieren.
Chromosom Doppelsträngiges DNA-Molekül, welches essentielle genetische Information trägt
Deletion Löschung eines Basenpaares, führt zu einer Verschiebung des
Translationsmechsnismus und mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:21 zu einem Abbruch.
DnaA Initiatorprotein für die → Replikation bei E. Coli. Erkennt und bindet an → OriC.
Ermöglicht es den → Helicasen an diese Region zu binden.
DNA Poymerase
Expression Kontrolliertes Abschreiben der genetischen Information und Übersetzen in Proteine.
Gelelektrophorese In einem Gel werden die Proteine durch elektrische Wechselwirkung zur
Ladungsquelle gezogen. Dabei werden die grossen Proteine im Gel stärker zurückgehalten,
so dass eine Sortierung nach Grösse entsteht.
Gen codierende Sequenz für ein Protein samt den Expressionssignalen (→ Start und →
Stop-Codon)
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Genom gesamte genetische Information einer Zelle
Genotyp Zustand des genetischen Materials, Allelzusammensetzung
Helicase öffnet die Doppelhelix
Insertion Einfügung eines Basenpaares, führt zu einer Verschiebung des
Translationsmechsnismus und mit einer
Integron Transposon, das gezielt Antibiotikaresistenzen einfängt. Wahrscheinlichkeit von 1:21
zu einem Abbruch.
Komplementation Aufheben der phänotypische Auswirkung einer Mutation durch Beimischen
einer zweiten Kopie des entsprechenden Gens (merodiploider Zustand). Zugegeben wird
meist das entsprechende → Allel des Wildtyps.
konditionale Mutation Der Phänotyp prägt sich nur unter bestimmten (permessivem oder
restriktiven) Bedingungen aus. Beispiel: temperatursensitive Mutation.
Konjugation „sexueller “Kontakt zwischen Bakterien. Dabei wird DNA getauscht. Kann nur
von Bakterien mit den Ferilitets-Gen initiert werden.
Ligase Verbindet die Okazakifragmente zu einem DNA-Strang
Lyse Zerstörung der Plasmamembran einer Zelle und Freigabe des Cytoplasmas. Führt zum
Zelltod.
Lysogenie Zustand eines Bakterium, das die DNA eines Virus inaktiv in sein Genom eingebaut
hat. Das Virsu kann sich zugegebenem Zeitpunkt aktivieren und löst anschiessend die
Zelle auf (→ Lyse)
Mutante Zelle (Organismus), die eine Mutation im Genom trägt
Mutation Prozess, der zu vererbbarem (stabilem) veränderten Genom führt. Veränderte Stelle
des Genoms, die aus diesem Prozess entstanden ist. Unterschieden wird bezüglich der
Veränderung der DNA in → Punktmutation, → Deletion und → Insertion. Bezüglich der
Auswirkung wird die → konditionale, die → auxotrophe und die → Resistenzmutation
unterschieden.
mRNA Eigentliche codierende RNA, welche in der Proteinsynthese abgelesen wird. Sie macht
etwa 5% aller RNA aus.
OriC chromosomal origin of replication, Replikationsursprung
OriT transferial origin of replication, Replikationsursprung bei horizontaler Replikation mittels
→ Konjunktion. (σ-Replikation)
OriV vegetative origin of replication, Replikationsursprung bei Plasmiden bei vertikaler
Replikation innerhalb des Wirtes. (Θ-Replikation)
Phagen → Bakteriophagen
Phänotyp äusseres Erscheinungsbild einer Zelle oder eines Individuums. Manifestation des
Genotyps
Plasmid Kleines ringförmiges DNA-Molekül, das sich unabhängig vom Genom vermehrt.
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Polymerasen Enzyme, welche die Nucleotide zu einem DNA-Strang oder RNA-Strang
zusammenfügen.
Primase Legt auf einer DNA-Matrize einen kurzen RNA-Strang an.
Primosom Komplex aus → Primase und → Helicase auf dem Laggingstand zur
Effizienzsteigerung der Replikation.
Promotor Nucleotidsequenz in der DNA an die die RNA-Polymerase bindet. Die
RNA-Polymerase erkennt diesen am Sigma-Faktor. Der Promotorbereich liegt -10 bis -35
Basenpaare vor dem Start der Gensequenz.
Punktmutation Austausch eines Base Basenpaares. Führt zu stummer, neutraler, missens oder
nonsens Mutation.
Replikation Exaktes Übertragen der genetischen Information auf Tochterzellen.
Resistenzmutation verleihen Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz (z.B. Antibiotika).
rRNA Bildet die Ribosomen und macht ca. 80% der RNA in der Zelle aus.
Reversion Rückmutation
Transduktion Übertragung von Bakteriengenen eingebaut in virale DNA.
Transfromation Aufnahme von freier DNA. Diese stammt z.B. aus abgestorbenen Zellen und
kann homolog rekombiniert erden.
Sigma-Faktor Protein, welches die RNA-Polymerase benötigt um an einem → Promotor
anzudocken und die → Transkription in Gang zu setzen. Sobald ca. 10 Basenbaare
synthetisiert sind, wird der Sigmafaktor freigegeben und die Polymerase kommt erst
richtig in Gang. Verschiedene Sigma-Faktoren erkennen verschiedene Promotorsequenzen
und können so verschiedene Genfamilien ablesen.
SSB Single stranded DNA binding protein. Bindet und stabilisiert einzelsträngige DNA.
Start-Codon Sequenz AUG, selten GUG
Stop-Codon Sequenzen UAA, UAG, UGA
Suppression unabhängige 2. Mutation, die phänotypische Auswirkung einer ersten Mutation
ganz oder teilweise aufhebt
temperente Phagen Phagen mit einem lysogenen Entwicklungszyklus. (Phagen DNA in
Wirts-DNa eingebettet)
Terminator Signal auf Bakterien-DNA, das die → Transkription zum Halten bringt. Wird oft
aus einer Schleife in der DNA, gebildet durch zwei komplementäre Sequenzen gefolgt von
einigen A oder T. Diese sind schwächer bindend, da sie nur 2 H-Brücken aufweisen.
Topoisomerasen Enzyme, die DNA Überspiralisierung einführen oder entfernen
Topoisomerasen I Einzelstrangbrüche, entspannt superhelikale Aufwindungen
Topoisomerasen II Doppelstrangbrüche, Energie-abhängig (ATP) führt superhelikale
Aufwindungen ein z.B. Gyrase: Einführen von negativer Überspiralisierung
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Transkription Ablesen eines einzelnen DNA-Strangs aus einer Doppelhelix und Sythese einer
komplementären RNA-Strangs durch → Polymerase. Abgelesen wird dabei der dem
codierende Strang gegenüberligende Matrizenstrang.
Transposons „Springende Gene“, sind ins Chromosom eingebaut und werden vertikal repliziert.
tRNA kleine RNA-Moleküle, welche bei der Proteinsynthese als Adapter zwischen den
Aminosäuren und der mRNA verwendet werden. Machen ca. 15% der RNA in der Zelle
aus. Sie hat Kleeblattform mit einem Arm als Anticodon zum Aufsetzen auf der →
mRNA und einem Arm um die Aminosäure hinzuführen. Die Paarung der dritten Base
des Anticodon mit der mRNA ist weniger strikt, so dass weniger als 61 aber mehr als 20
tRNA in der Zelle existieren.
Wildtyp unmutierte, ursprüngliche Allelform
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