Der Einfluss von Histamin auf die Zytokin
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Der Einfluss von Histamin auf die Zytokin- und Chemokinproduktion bei humanen Bronchialepithelzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2007 von Anja Jäschke, geb. Dembinski geboren in der Lutherstadt Eisleben 2 Dekan: Prof. Dr. Ch. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. S. Sorichter 2. Gutachter: PD Dr. med. Yared Herouy Jahr der Promotion: 2007 3 Meinem Ehemann und meinen Eltern 4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis......................................................................................................... 4 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ 6 1 Einleitung ............................................................................................................. 7 1.1 Das Bronchialepithel .................................................................................... 7 1.1.1 Die immunologischen Funktionen von Bronchialepithelzellen ........... 8 1.2 Die BEAS- 2B ZELLLINIE ........................................................................ 9 1.3 Zytokine ....................................................................................................... 9 1.3.1 Das Zytokin Interleukin 6 (IL-6)........................................................ 10 1.4 Chemokine ................................................................................................. 11 1.4.1 Das Chemokin IL-8 ............................................................................ 12 1.4.2 Die Chemokine Chemokin Monokine induced by gammaInterferon (MIG) Interferon-inducible Protein 10 (IP-10) und Interferon gamma-inducible T-cell alpha Chemoattractant (I-TAC) . 13 1.5 Histamin ..................................................................................................... 15 1.6 Histaminrezeptoren .................................................................................... 16 1.6.1 H1-Rezeptor ....................................................................................... 16 1.6.2 H 2-Rezeptor ...................................................................................... 17 1.6.3 H 3-Rezeptor ...................................................................................... 18 1.6.4 H 4-Rezeptoren .................................................................................. 19 1.6.5 Histamin und Immunmodulation ....................................................... 19 2 Zielsetzung ......................................................................................................... 21 3 Die Material und Methoden ............................................................................... 22 3.1 Material ...................................................................................................... 22 3.1.1 Geräte ................................................................................................. 22 3.1.2 Verbrauchsmaterialien ....................................................................... 22 3.1.3 Chemikalien ....................................................................................... 23 3.1.4 Biochemikalien und Antikörper ......................................................... 23 3.1.5 Medien ............................................................................................... 24 3.1.6 Puffer für ELISA ................................................................................ 24 3.1.7 Puffer und Lösungen für intrazelluläre Kalziummessung ................. 26 3.2 Methoden ................................................................................................... 26 3.2.1 BEAS-2B-Zellkultur .......................................................................... 26 3.2.2 Stimulation der BEAS-2B-Zellen ...................................................... 27 3.2.3 Messung von Zytokinen und Chemokinen per ELISA ...................... 27 3.2.4 Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration .......................... 29 3.2.5 Statistik............................................................................................... 29 4 Ergebnisse .......................................................................................................... 30 4.1 Einfluss von Histamin auf die IL-6-Ausschüttung .................................... 30 4.2 Einfluss von Histamin auf die IL-8-Ausschüttung .................................... 32 4.3 Einfluss von Histamin auf die MIG-Ausschüttung .................................... 34 4.4 Einfluss von Histamin auf die IP-10-Ausschüttung ................................... 35 4.5 Einfluss von Histamin auf die I-TAC-Ausschüttung ................................. 37 4.6 Einfluss von Histamin auf die RANTES-Ausschüttung ............................ 37 5 4.7 Einfluss von Histamin auf die Kalzium-Homöostase von BEAS-2B Zellen ........................................................................................ 38 5 Diskussion .......................................................................................................... 43 5.1 Histamin erhöht die Interleukin-6-ausschüttung aus BEAS-2B Zellen ..... 45 5.2 Histamin erhöht die Interleukin-8-ausschüttung aus BEAS-2B Zellen ..... 46 5.3 Histamin verringert die IP-10, I-TAC, MIG-Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen ........................................................................................ 47 5.4 Histamin verringert die RANTES-Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen .... 49 5.5 Histamin führt zu einem Anstieg des Kalziumeinstroms in die BEAS-2B Zellen ........................................................................................ 50 5.6 Einbau der Ergebnisse in den pathophysiologischer Kontext .................... 50 6 Zusammenfassung .............................................................................................. 52 7 Literaturverzeichnis............................................................................................ 53 8 Abbildungs- und Grafikverzeichnis ................................................................... 65 9 Tabellenverzeichnis............................................................................................ 66 10 Danksagung ........................................................................................................ 67 11 Lebenslauf .......................................................................................................... 68 6 Abkürzungsverzeichnis BAL Bronchoalveoläre Lavage BrdU 5-bromo-2’-deoxyuridin BSA Rinderserumalbumin Ca2+ Kalzium CD Cluster of Differentiation (Nomenklatur zellulärer Oberflächenantigene) EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay FCS Fetales Kälberserum IFN Interferon IL Interleukin IP3 Inositol-1,4,5-Phosphat IP-10 Interferon-inducible Protein 10 I-TAC Interferon gamma-inducible T-cell alpha Chemoattractant IU internationale Einheiten MCP Monocyte Chemotactic Protein MIG Monokine Induced by Gamma Interferon NF-kappaB Transkriptionsfaktor NO Stickstoffmonoxid PALP Pyridoxalphosphat PAR Protease-aktivierter Rezeptor PBS Phosphate buffered Saline p38 MAPK MAPK wachstumsvermitteltes intrazelluläres Signalprotein RANTES Regulated on Activation, normal T-cell expressed and secreted RNA Ribonukleinsäure TMB Tetramethylbenzidin TNF Tumor Nekrose Faktor U/min Umdrehungen pro Minute VCAM vaskuläres Zelladhäsionsmolekül 7 1 Einleitung Die Lunge dient dem lebenswichtigen Gasaustausch und steht über die Atemwege im ständigen Kontakt mit der Umwelt. Alle Strukturen der Atemorgane sind somit permanenten Attacken unterschiedlicher Noxen ausgesetzt. Verschiedene angeborene Abwehrmechanismen, einschließlich Hustenreflex, mukoziliare Clearance und antimikrobieller Wirkung der mukosalen Oberfläche tragen zum Schutz vor Krankheitserregern bei. (85) Die Gewebsoberfläche der Atemwege wird von Epithelzellen gebildet. Erfolgt nun eine Schädigung, schließt sich eine Entzündungsreaktion an, wobei verschiedene Zellen des Immunsystems beteiligt sind. Die verschiedenen Zellen der Immunabwehr werden in ihrem Zusammenspiel durch sogenannte Mediatoren koordiniert, zu denen auch Zytokine und Chemokine gehören. Zu ihren Aufgaben zählen unter anderem die Rekrutierung, Differenzierung und Aktivierung von Leukozyten. (25, 103, 27) Einige Untersuchungen der letzten Jahre zeigten, dass Bronchialepithelzellen in der Lunge zur Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen befähigt sind und somit in die Modulation der Entzündungsreaktion eingreifen. (3, 53, 20) 1.1 Das Bronchialepithel Die Atmungsorgane des menschlichen Organismus bestehen, nach funktioneller Einteilung, aus luftleitenden und gasaustauschenden Abschnitten. Das Bronchialepithel gehört dem luftleitenden Teil der Atemwege an. Es ist ein hochprismatisches Flimmerepithel mit schleimproduzierenden Becherzellen. (2, 28, 29) Das Bronchialepithel stellt dabei eine Grenzfläche zwischen äußerer und innerer Umgebung der Atemwege dar. Die Funktion des respiratorischen Epithels besteht darin, eingeatmete Partikel wie Staub, Allergene, Viren und Bakterien abzufangen. Dabei überzieht der von den Becherzellen und submukösen Drüsen gebildete Schleim die Atemwege. Auf diesem Schleimfilm lagern sich die Partikel ab und werden durch den rhythmischen Zilienschlag zur Epiglottis transportiert und 8 anschließend verschluckt. Dabei stellt das Bronchialepithel nicht nur eine strukturelle Barriere dar, sondern auch eine Quelle proinflammatorischer Mediatoren und Zytokine, die an der Modulation von Entzündungen und an der Regulation des Muskeltonus des Bronchialgewebes beteiligt sind. (2, 69, 4, 100) 1.1.1 Die immunologischen Funktionen von Bronchialepithelzellen Die Bronchialepithelzellen stehen meist in erstem Kontakt mit Krankheitserregern, die über die Atemwege aufgenommen werden. Somit ist eine immunologische Antwort in diesem Anfangsbereich der Erregerattacke am effektivsten. Bronchialepithelzellen exprimieren Oberflächenadhäsionproteine, wie CD 29,CD 54, VCAM-1 und andere Rezeptoren, deren Expression durch Zytokine beeinflusst wird. Die Rezeptoren, die der Zell-Zellinteraktion und der ligandenspezifischen Signalübermittlung dienen, sind ebenso an der Immunmodulation beteiligt, wie die durch aktivierte Bronchialepithelzellen sezernierten Mediatoren: Prostaglandine, NO, Zytokine und Chemokine. Vor allem die Chemokine spielen bei der Rekrutierung von Leukozyten während einer Entzündungsreaktion eine wichtige Rolle. Die von den Bronchialepithelzellen nach Stimulation freigesetzten Chemokine IP-10, MIG und I-TAC wirken T-zellspezifisch wobei RANTES chemotaktisch auf eosinophile Granulozyten wirkt. Einige, der auf den Bronchialepithelzellen befindlichen Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR), setzen nach ihrer Aktivierung Zytokine (IL-6, IL-8) und Mediatoren frei, die die Vasodilatation, Plättchenaggregation, Zellproliferation sowie die Kontraktion oder Relaxation der glatten Muskelzellen beeinflussen. (3, 69, 77, 4, 92, 70, 57) Bei Atemwegserkrankungen, wie Asthma bronchiale kommt es im Lauf der Erkrankung zu einem pathologischen Umbau der anatomischen Strukturen dem sogenannten „airway remodeling“. Die normale Epithelschichtung geht verloren und gleichzeitig führen die überlebenden Epithelzellen zur Umstrukturierung der betroffenen Areale. Dies wiederum hat eine Atemwegseinengung zur Folge. (75, 12, 78) Nicht nur bei Umbauprozessen sind die Bronchialepithelzellen beteiligt, sondern sie werden auch während eines Asthma bronchiale durch das Einwirken von Eosinophile Granulozyten und T-Lymphozyt durch Apoptose zerstört. (92) 9 1.2 Die BEAS- 2B ZELLLINIE Durch Transformation normaler Bronchialepithelzellen durch einen Adenovirus 12-SV40 Hybridvirus, entstanden die BEAS-2B Zellen. Die neue Zelllinie vereinigte einige typische Charakteristika normaler Bronchialepithelzellen. Bei der Herstellung der Zelllinie wurden morphologisch geeignete Kolonien isoliert und kultiviert. Nur die Zellen, die keine viralen Produkte synthetisieren, wurden weiter gezüchtet. Die so entstanden Zellkulturen hatten eine höhere Lebenserwartung als normale Zellen und schienen ein unbegrenztes Proliferationspotential zu besitzen. BEAS-2B Zellen werden häufig verwendet, um das Verhalten von Bronchialepithelzellen zu studieren. Alle Kulturen dieser Zelllinie sind anuploid mit karyotypischen Mutationen, die bei SV40- transformierten Zellen üblich sind. (70) BEAS-2B-Zellen produzieren, ähnlich den Bronchialepithelzellen, eine Reihe von Zytokinen, Chemokine und andere Entzündungsmediatoren. Zytokine und Chemokine werden nach entsprechender Aktivierung freigesetzt. Experimente mit humanen BEAS-2B Zellen haben gezeigt, dass diese IL-6, IL-8 oder TNFα freisetzen. (94) Weitere Experimente ergaben, dass durch Stimulation mit TNFα, IFNγ, IL-4 und IL-13 in Kombination oder allein, die Freisetzung von Eotaxin, RANTES und IL-8 reguliert werden kann. (21) Histamin führt des Weiteren zur Freisetzung von Interleukin-6, Fibronectin und zur Produktion von Eikosanoiden. (61) 1.3 Zytokine An einer Entzündungsreaktion sind viele verschiedene Zellen beteiligt. Deren Koordination setzt ein Kommunikationssystem voraus. Dieses System besteht aus verschiedenen Mediatoren wie Lipiden, Polypeptiden (zu denen die Zytokine zählen), NO, Serotonin und Histamin. (25) 10 Zytokine sind niedermolekulare Proteine, die eine wichtige Rolle bei der Entzündungsreaktion spielen. Sie werden auch als Entzündungsmediatoren bezeichnet. Diese Proteine werden vorwiegend von Zellen des Immunsystems, aber auch von anderen Zellen gebildet und durch Aktivierung dieser freigesetzt. Die Zytokine steuern unter anderem die Differenzierung und Aktivierung der immunologischen Zellen, aber auch die Rekrutierung der Zellen des entzündlichen Gewebes, die an der Entzündung teilnehmen. (25, 27) Während des inflammatorischen Prozesses werden pro- und antiinflammatorische Zytokine gebildet. Der Verlauf der Entzündungsreaktion wird im Wesentlichen durch die Balance dieser Zytokine bestimmt. In der Lunge sind Makrophagen ein wichtiger Produzent von Zytokinen. Inflammatorische Zytokine nehmen bei der Entstehung entzündlicher Lungenerkrankungen eine zentrale Rolle ein. Bei verschiedenen Erkrankungen wie akute Bronchitis, Pneumonie, ARDS wird eine Anhäufung von neutrophilen Granulozyten beobachtet. (25) Im Folgenden soll nur auf die Zytokine dieser Studie eingegangen werden. 1.3.1 Das Zytokin Interleukin 6 (IL-6) IL-6 ist ein Protein bestehend aus 185 Aminosäuren und wurde 1986 erstmals geklont. Es ist ein typisches Zytokin und bildet erst mit 2 Komponenten ein funktionelles Hexamer, das Signale vermittelt. IL-6 ist involviert in die Immunantwort, Entzündung und Hämatopoese. (33, 93) Die IL-6 Produktion erfolgt nach Stimulation in vielen verschiedenen Zellen wie Lymphozyten, Eosinophile, Chondrozyen, Keratinozyten (106) und Bronchialepithelzellen (86). Die Hauptproduzenten sind allerdings stimulierte Monozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. IL-1, TNF, PDGF und bakterielles Endotoxin sind physiologische Stimulatoren für die Synthese von IL-6. Abhängig vom Zelltyp kann durch IL-6 selbst, die eigene Synthese stimuliert oder gehemmt werden. Eine hemmende Wirkung auf die Produktion üben Glucokordikoide aus. (106) Eine physiologische Produktion des IL-6 geht mit der Entwicklung einer normalen Immunantwort einher, während eine Überproduktion zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen und lymphatischen Malignitäten führt. (82) 11 IL-6 ist an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt, wie dem Auftreten des multiplen Myeloms, der postmenopausalen Osteoporose, verschiedener Autoimunerkrankungen, dem Prostatakrebs (93), der rheumatoiden Arthritis, des Lennert Syndroms (ein histozytischen Lymphom), des Morbus Castelman (malignes Lymphom) und der Leberzirrhose (81), um nur einige zu nennen. Auch asthmatische Erkrankungen wie allergisches Asthma (5) und symptomatisches nichtallergisches Asthma (55) korrelieren mit erhöhten IL-6 Werten. 1.4 Chemokine Chemokine sind chemotaktische Zytokine. Zu den Funktionen, die die Chemokine ausüben, gehören die Migration, Aktivierung und Differenzierung von Leukozyten. Die Chemokine spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, Homöostase und Funktion des Immunsystems. Auch außerhalb des Immunsystems können die chemotaktierenden Proteine in endothelialen Zellen entweder zu einer Angiogenese oder eine Angiostase führen. (103, 52) Bis auf zwei (Lymphotactin und Fractalkine) sind alle Chemokine entweder der CCFamilie oder der CXC-Familie angehörig. Die Einteilung basiert auf der Position der ersten beiden Cystein Reste. (103, 13) Wenn die ersten beiden Cystein Reste durch eine Aminosäure getrennt werden, bezeichnet man diese Gruppe als CXC-Chemokine. Die CC-Chemokine sind gekennzeichnet durch das nebeneinander Liegen der Cysteine. (103) Basierend auf dem Vorhandensein einer NH2-Terminalen ELR Sequenz (Glu-LeuArg) werden nun die CXC-Chemokine weiter unterteilt. Die ELR enthaltenden wirken chemotaktisch auf Neutrophile, während die nicht ELR enthaltenden Chemokine Chemotaxis auf Lymphozyten ausüben. (77) 28 humane CC-Liganden (CCL) und 16 humane CXC-Liganden (CXCL) werden derzeit unterschieden. (103) Die CC-Chemokine aktivieren hauptsächlich neutrophile Granulozyten und die CXC-Chemokine wirken auf Lymphozyten, Monozyten, eosinophile und basophile Granulozyten. (25) Diese vermitteln Signale mittels 7-transmembranösen Domän Rezeptoren, die G-Protein gekoppelt sind. (52) 12 Derzeit sind 10 CC-Rezeptoren (CCR) und 5 CXC-Rezeptoren (CXCR) bekannt. Die weitere Signalverarbeitung findet über verschiedenste Wege statt. (103) Hierbei können sich einzelne Chemokine an verschiedene Rezeptoren binden, aber auch einzelne Rezeptoren mit unterschiedlichen Chemokine interagieren. 5 Chemokine werden in dieser Arbeit behandelt. Eine Übersicht der Chemokine mit Namen, Chromosomenlokalisation sowie Rezeptoren, werden in den folgenden Tabellen aufgezeigt. (Tab.1 und 2). CXC-Chemokin-Rezeptor-Familie Systematischer Humaner Ligand Voller Name Chromosom CXCL8 IL-8 Interleukin 8 4q12-q13 CXCR1, CXCR2 CXCL9 MIG monokine induced by 4q21.21 CXCR3 4q21.21 CXCR3 4q21.21 CXCR3 Name Chemokin Rezeptor(en) IFN g CXCL10 IP- 10 IFN-induced protein of 10kDa CXCL11 I- TAC IFN-inducible T-cell a-chemoattractant Tabelle 1: in Anlehnung an: Zlonik A, Yosamu O (2000) Chemokines: A new Classification System and their Role in Immunity und Lukas NW (2001) Role of Chemokines in the Pathogenesis of Asthma CC-Chemokin-Rezeptor-Familie Systematischer Humaner Ligand Voller Name Chromosom Chemokin RANTES Regulated on 17q11.2 CCR1, CCR3, CCR5 Name CCL5 Rezeptor(en) activation, normal Tcell expressed and secreted Tabelle 2: in Anlehnung an: Zlonik A, Yosamu O (2000) Chemokines: A new Classification System and their Role in Immunity und Lukas NW (2001) Role of Chemokines in the Pathogenesis of Asthma 1.4.1 Das Chemokin IL-8 Interleukin-8, auch CXCL 8 genannt, ist ein Protein bestehend aus 72 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 8 kDa. Es ist ein Hauptvertreter der CXCChemokinfamilie und führt zur Chemotaxis, Adhäsion, Migration und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten bei Entzündungsreaktionen. Die chemotaktische Wirkung von IL-8 erstreckt sich auf alle bekannten migrativen Immunzellen [zum 13 Beispiel Eosinophile von Atopikern (58)]. Angiogenetische Aktivität wird dem Zytokin auch zugeschrieben. Zur IL-8 Produktion sind verschiedene Zellen befähigt wie Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten, Chondrozyten, Keratinozyten, und einige Tumorzelllinien. (25, 58, 15, 104) Die Synthese von IL-8 wird unter anderem durch die „early response cytokine“ (IL-1ß, TNFα), Hypoxie, Hyperoxie und Bakterien angeregt. Aber auch die auf die Lunge einwirkenden Schadstoffe der Umwelt, zu denen Dieselstaub und Zigarettenrauch zählen, wirken auf humane Bronchialepithelzellen IL-8 freisetzend. (25, 58, 31) IL-8 bindet an die G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren CXCR 1 und CXCR 2. Die vermittelten Effekte können sowohl stimulierend als auch hemmend sein. Interleukin-8 hemmt verschiedene Vorgänge, beispielsweise die durch IL-4 induzierte IgE Produktion in B-Lymphozyten und die HRF (Histamine Release Factor), CTAP-3 (connective tissue activating protein-3) und IL-3 induzierte Histaminfreisetzung in basophilen Granulozyten. Das Gleiche gilt für die Freisetzung von Leukotrienen, die zur Schmerzauslösung beitragen. Somit ist IL-8 auch an der Vermittlung von Schmerzen beteiligt. (59, 104) Die wichtige Rolle des Interleukin-8 wird durch das Mitwirken in verschiedenen akuten und chronischen Erkrankungen deutlich: Psoriasis, rheumatische Arthritis (104), bakterielle und virale Infektionen, Tumoren (38, 101), vor allem bei Lungenerkrankungen wie Asthma, ARDS, chronisch obstruktive Lungenerkrankung und idiopathische Lungenfibrose. (58, 71) 1.4.2 Die Chemokine Chemokin Monokine induced by gamma-Interferon (MIG) Interferon-inducible Protein 10 (IP-10) und Interferon gammainducible T-cell alpha Chemoattractant (I-TAC) IP-10, MIG und I-TAC sind Chemokine, die einige Gemeinsamkeiten aufweisen und deshalb in dieser Arbeit zusammen behandelt werden. Nach Aktivierung erfolgt die Synthese und Freisetzung aus vielen verschiedenen Zellen. MIG wird beispielsweise aus Monozyten, neutrophilen Granulozyten (45), Astrozyten (76) und 14 Atemwegsepithelzellen (42) ausgeschüttet. Bronchialepithelzellen können nach Aktivierung jeweils IP-10, MIG und I-TAC (77) sezernieren. Bei der Betrachtung der Lokalisation der genetischen Information für die Chemokine IP-10, MIG und I-TAC wird deutlich, dass diese in einem Minicluster abseits des Hauptclusters der CXC-Chemokine lokalisiert sind. Diese genannten Chemokine weisen eine hohe Spezifität des Interagierens in Bezug auf T-Lymphozyten auf. So wirkt IP-10, MIG und I-TAC chemotaktisch auf aktivierte T-Lymphozyten. (103) Diese 3 Chemokine binden an den CXCR3 Rezeptor, der auf Th1-, B-Zellen, natürlichen Killerzellen (77) und eosinophilen Granulozyten (40) exprimiert wird und führt nach Chemokinbindung zur Migration der besetzten Zellen. (77) Ein weiterer resultierender Effekt ist die Angiostase. (47, 74, 73, 66) Die Chemokine IP-10 und MIG agieren überwiegend mit Lymphozyten. MIG teilt sich mit den Chemokin IP-10 den CXCR3 Rezeptor. Dieser wird in großen Mengen auf Th1 Zellen exprimiert. In Folge dessen lässt sich eine Involvierung des Chemokins MIG an der Th1 Antwort aufzeigen. Vor allem entzündliche Vorgänge in der Lunge, die durch Th1 Zellen eingeleitet werden, sind durch das Vorhandensein von IFN-γ induzierten Chemokinen gekennzeichnet. (16, 105) Bei verschiedenen Erkrankungen wie beispielsweise Sjögrensyndrom (63, 64) und Arteriosklerose (53) konnte eine Beteiligung der Chemokine nachgewiesen werden. IP-10 könnte ebenso eine Rolle in der Pathogenese von Rhinovirus induzierten Erkältungen und Rhinovirus induzierter Verschlechterung von Asthma spielen, da der humane Rhinovirus bei humanen Bronchialepithelzellen zu einer Ausschüttung von IP-10 führt. (83) Vor allem Th1-Typ Erkrankungen werden mit erhöhten IP-10-, MIG- und I-TACChemokinwerten in Verdingung gebracht. (77) Aber nicht nur bei Erkrankungen, die durch eine Th1 Antwort dominiert sind, scheinen die Chemokine IP-10 und MIG beteiligt zu sein. So beispielsweise konnten erhöhte IP-10 Werte nach einer allergischen Reaktion im BAL von Asthmatikern sowie im Serum von Patienten mit atopischer Dermatitis gemessen werden. (95,7) Neue Untersuchungen zeigen die Dominanz von Th2 Zellen, wobei ein reger Verkehr von IP-10 und MIG beobachtet wurde. (6) 15 Die CXCR 3 Liganden IP-10, MIG und I-TAC wirken nicht nur agonistisch auf den CXCR3 Rezeptor, sondern auch antagonistisch auf den CCR3 Chemokinrezeptor. Dessen Liganden (wie RANTES) wirken vor allem chemotaktisch auf Th2Lymphozyten. Wenn IP-10, MIG und I-TAC als Antagonisten fungieren wird die Th2-Immunantwort gehemmt und auf diese Weise die Th1-Immunantwort verstärkt. (49) So ist es nicht verwunderlich, dass zur Entwicklung von antiallergischen Medikamenten CXCR3 Agonisten genutzt werden könnten. (23) I-TAC besitzt die stärkste Affinität zum CXCR3 Rezeptor, den er sich mit MIG und IP-10 teilt und agonistisch bindet. Eine anagonistische Bindung vollzieht sich nicht nur am CCR3 (49), sondern auch am CCR5 Rezeptor (67). 1.5 Histamin 1910 isolierten Barger und Dale sowie Kutscher Histamin aus einem Mutterkorn und identifizierten die chemische Struktur. Des Weiteren beschrieben Bager und Dale erstmals den Zusammenhang des Histaminaufbaus und der physiologischen Wirkung auf glatte Muskelzellen und den Blutdruck. Im gleichen Jahr entdeckte Ackerman die Synthese des Histamins durch bakterielle Decarboxylierung der Aminosäure Histidin. Im Verlauf der Geschichte erschloss man das Vorkommen des Histamins in verschiedensten Geweben wie der Intestinalmukosa und Hypophyse im Leber-, Lungen- und Muskelgewebe. (41) Die Bildung des Gewebshormons Histamin, dessen chemische Verbindung 4-(2 Aminoäthl)-Imidazol Pyridoxalphosphat) lautet, erfolgt Decarboxylierung durch der PALP-abhängige Aminosäure (Coenzym: Histidin. Die verantwortlichen Enzyme sind die L-Aminosäuredecarboxylase (in fetalem Gewebe, Nieren, Leber) oder die Histidindecarboxylase (in fetalem Gewebe, Placenta, Magenmucosa und Knochenmark). Der Abbau erfolgt im Körper entweder durch Histaminase (Diaminoxidase, Aldehyddehydrogenase) zu Imidazolacetat oder durch eine N-Methylierung mit anschließender Oxidation zu N-Methylimidazolacetat. (68) Histamin ist ein biogenes Amin und gehört den Mediatorsubstanzen an. Histamin ist vor allem in Gewebsmastzellen, Thrombozyten und basophilen Leukozyten enthalten. (27) 16 Im Zentralennervensystem wirkt Histamin als Transmitter und ist vorhaltig in spezifischen histaminergen Neuronen zu finden, deren Zellkörper im Hypothalamus liegen. (27) In verschiedenen physiologischen Prozessen ist Histamin beteiligt: bei den Funktionen des Gastrointestinaltraktes, der Funktion des Zentralen- nervensystems und der Immunzellfunktion. (47) Histamin spielt eine entscheidende Rolle bei der allergischen Reaktion und trägt zur Entstehung der typischen Symptome der Typ I Reaktion wie Urtikaria, Asthma, Rhinitis bei. Die Freisetzung des Histamins bei der Allergie des Typ I verläuft wie folgt: Die membranständigen Antikörper IgE der sensibilisierten basophilen Granulozyten und Mastzellen werden nach Antigenkontakt brückenartig verbunden. Danach findet die allergische Histaminliberation statt. Nicht nur Histamin auch andere Mediatoren werden bei der Typ I Reaktion ausgeschüttet. Einige dieser Mediatoren führen dazu, dass chemotaktisch weitere Zellen des Immunsystems angelockt und aktiviert werden, die dann wiederum zu lokalen Entzündungsreaktionen führen. (27) 1.6 Histaminrezeptoren Die einzelnen physiologischen Effekte werden durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelt. Zum heutigen Zeitpunkt unterscheidet man 4 Histaminrezeptoren H1, H2, H3, H4, die jeweils unterschiedliche funktionelle und transduktionelle Wege beschreiten. (24) Einige wichtige physiologische Wirkungen im menschlichen Organismus, die über Histamin und dessen Rezeptoren vermittelt werden, sollen die folgenden Ausführungen zeigen. 1.6.1 H1-Rezeptor Der Histaminrezeptor H1 wird durch eine Aminosäuresequenz gebildet, die aus 491 Aminosäuren besteht und somit ein Molekulargewicht von 56 kDa bildet. Das Protein ist aus 7 transmembranären Domänen zusammengesetzt und G-Protein 17 gekoppelt. (32) Die dazugehörigen genetischen Informationen befinden sich auf dem Chromosom 3p25 (62) und wurde 1991 erstmals kloniert (60). Der H1-Rezeptor wird von den verschiedenen Zellen wie glatten Muskelzellen, Nierenmark, Herz, Endothelzellen (24), Keratinozyten (26) dentritischen Zellen (37), Lungengewebe und verschiedenen Zellpopulationen der Lunge (24, 87) exprimiert. Die Stimulation des Rezeptors leitet nun via G-Protein zur Aktivierung der Phospholipase C hin, die wiederum zur Bildung von Inositol-1,4,5-Phosphat (IP3) führt. Die anschließende Aktivierung von Proteinkinasen und Phospholipase A2 kann direkt oder indirekt durch Anstieg des intrazellulären Kalziums erfolgen. Die Histaminrezeptoraktivität vermittelt über verschiedene Signalwege unterschiedliche physiologische Effekte. (27) In den glatten Muskelzellen wird durch Kalziummobilisation die Kontraktion der Bronchial- und Darmmuskulatur sowie eine Vasokonstriktion größerer Gefäße eingeleitet. Eine Endothelkontraktion führt zu einer Erhöhung der Venolenpermeabilität (Quaddelbildung). Durch den intrazellulären Kalziumanstieg reagieren die Endothelzellen mit der Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO), das zu einer Vasodilatation von vorwiegend kleineren Gefäßen führt. Ferner kommt es durch die Erregung von Histamin H1-Rezeptoren zu einer Freisetzung von Arachidonsäure und zur Synthese ihrer Metaboliten. (27) 1.6.2 H 2-Rezeptor Das Protein, das den Rezeptor bildet, setzt sich aus 359 Aminosäuren zusammen und wurde erstmals 1991 geklont. Die Besetzung dieses Rezeptors mit Histamin führt zu einer Aktivierung der Adenylatzyklase. Infolgedessen kommt es zu einer Steigerung des intrazellulären cAMP. (32, 60) Eine positiv chronotrope und positiv inotrope Wirkung des Histamins am Herzmuskel sowie die Steigerung der Drüsensekretion in der Magenschleimhaut werden über den H2-Rezeptor vermittelt. Sowohl die Aktivität des H1-Rezeptors als auch die des H2-Rezeptors, führt zu einer Vasodilatation der kleineren Gefäße wie, Arteriolen und Koronargefäßen. Die Erregung von H2-Rezeptoren führt ferner zu einer Dilatation der Pulmonalgefäße. (27) 18 Weiterhin ist Histamin via H2-Rezeptor an verschieden regulatorische Aufgaben beteiligt zum Beispiel Produktion, Differenzierung und Reifung einer Vielzahl von Zellen des Herzgewebes, der glatten Muskulatur und Zellen des Immunsystems. (24) H2-Rezeptor-Antagonisten bzw. H2-Antihistaminika hemmen die H2-Rezeptoren an der Magenschleimhaut und somit die histaminvermittelte Säuresekretion. H2Antihistaminika werden bei Patienten mit peptischen Ulzera verwendet. (27) 1.6.3 H 3-Rezeptor Das Protein, das den H3-Rezeptor bildet, hat ein Molekulargewicht von 70 kDa und wurde 1999 erstmals geklont. Nach der Stimulation des Rezeptors erfolgt eine Hemmung der Adenylatzyklase. (32, 51) Phylogenetische und homologische Analysen zeigen, dass Unterschiede zu den vorher beschriebenen H1- und H2Rezeptoren bestehen, wobei H1- und H2- dem H3-Rezeptor zu 20 % identisch sind und eine 25%ige Übereinstimmung zu anderen Aminrezeptoren (Serotonin-, Adrenalin-, Dopamin-, Muskarinrezeptor) besteht. (60, 36) Histamin ist ein Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und der H3-Rezeptor ein präsynaptischer Autorezeptor an histaminergen Neuronen. Ebenso wird der Einfluss auf das Acetylcholin-, Serotonin-, Dopamin-, Gamma-aminobutylsäure- und Noradrenalinniveau genommen und wirkt somit auch als Heterorezeptor. Verschiedene Studien zeigen, dass dieser präsynaptische H3-Rezeptor im autonomen Nervensystem an der Ausschüttung von Neurotransmittern im Herzen, in der Lunge und im Gastrointestinaltrakt beteiligt ist. Eine Beteiligung zeigt Histamin an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Nahrungsaufnahme, der Körpertemperatur, des Gedächtnisses und an anderen homöostatischen Prozessen. (91, 51) Die Aktivität der parasympathischen Nerven wird durch die Stimulation der H3Rezeptoren, in Bronchien und Trachea gehemmt. Beschrieben wurde des Weiteren ein hemmender Effekt auf die Freisetzung von Neuropeptiden (Tachykinin oder Calcitonin-gene-related-Peptid) aus sensorischen C-Fasern in Atemwegen, Hirnhäuten und Herz. Auch in anderen Zellen des Körpers sind H3-Rezeptoren vorhanden, die Einfluss auf verschiedene Prozesse nehmen. (27) 19 1.6.4 H 4-Rezeptoren Zwischen den Jahren 2000 und 2002 wurde der H4-Histaminrezeptor erstmals von verschiedenen Gruppen beschrieben und kloniert. (87) Dieser G-Protein-gekoppelte Rezeptor wird aus 390 Aminosäuren gebildet und ist in etwa zu 37 bis 43 % mit dem H3-Rezeptor identisch. Die Homologie beträgt dabei in der transmembranären Region 58 %. (36) Am stärksten ist die Ausschüttung des Rezeptors im Knochenmark und den Leukozyten, geringer hingegen in der Lunge, im Herz, in der Milz, im Thymus und im Dünn- und Dickdarm. (24) H4-Rezeptoren scheinen eine wichtige Rolle bei Immun- und/oder Entzündungsreaktion zu spielen, da sie auf einer Vielzahl verschiedenster Leukozyten zu finden sind. (102, 48) Der H4-Rezeptor wird durch kleine Dosen Histamin aktiviert, aber nicht durch R-αMethylhistamin. Eine Blockierung erfolgt durch eine hohe Dosis Thioperamide (ein Imidozolantagonist), aber nicht durch Nichtimidazolantagonisten. (81, 102) 1.6.5 Histamin und Immunmodulation Histamin ist als ein Entzündungsmediator bekannt, der verschiedene immunregulatorische Effekte einschließt. Der H1-Rezeptor vermittelt nach Stimulation stimulierende, entzündungsfördernde Effekte. Signale, die über den H2Rezeptor übertragen werden besitzen hemmende, entzündungshemmende Effekte. Es werden des Weiteren Suppressorzellinduktion, Induktion der IL-10 Produktion, Hemmung der Lymphozytenproliferation, IL-12 Sekretion aus Monozyten, Polymorphnuklear- und Neutrophilenchemotaxis, auf das Immunsystem beschrieben. Weitere immunregulatorische Effekte, die durch den H2 Rezeptor vermittelt werden, sind die IgE Produktion in B-Zellen, die IL-5-Produktion in Th2-Zellen, die IL-16 Ausschüttung aus CD8+ und die Reifung, Polarisation sowie der Einfluss auf die Chemokinproduktion von dentritischen Zellen. (80, 24, 37, 102) Eine wichtige Rolle spielt der Histamin H1-Rezeptor beim Modulieren entzündlicher und allergischer Reaktionen. (24) H1-Rezeptor-Antagonisten bzw. H1- Antihistaminika sind therapeutisch indiziert bei allergischen Erkrankungen wie 20 Urtikaria, allergische Rhinitis, Conjunctivitis, Pruritus, Arzneimittelallergien und Insektenstichen. Weiterhin werden die Antihistaminika als Antiemetika genutzt. Einige Substanzen der 1. Generation mit stärker sedierender Wirkung eignen sich als Hypnotikum, da sie die Bluthirnschranke durchdringen können. Die H1-Rezeptoren befinden sich im Gegensatz zu den H3-Rezeptoren nicht präsynaptisch, sondern postsynaptisch. H1-Antihistaminika der 2. Generation wirken nur minimal oder haben keinen sedierenden Effekt, weil sie nicht ins ZNS gelangen. (27, 91) Der H3-Rezeptor veranlasst den intrazellulären Kalziumanstieg und reguliert die Zytokinausschüttung in Aveolarmakrophagen und Mastzellen. Das Zytokinnetzwerk wird durch Histamin beeinflusst. Histamin kann die Ausschüttung von IL-1, IL-2, IFN-gamma, TNF hemmen und von IL-5, IL-6, IL-8 fördern. (8, 37) In Abb. 1 ist der Einfluss des Histamins auf das Zytokinnetzwerk der Lunge schematisch dargestellt. Abb 1: Quelle Sirois J, Ménard G, Moses AS, Bissonnette EY(2000) Importance of Histamine in the Cytokine Network in the Lung Through H2 and H3 Receptors: Stimulation of IL-10 Production Da Histamine H4-Rezeptoren vor allem auf peripheren mononuklearen Blutzellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Mastzellen, CD8+ und CD4+ T-Zellen zu finden sind, deutet dies darauf hin, dass H4 an der Immun- und/oder Entzündungsmodulation beteiligt ist. (102, 48) Folgende Entzündungsvorgänge werden durch den H4Rezeptor vermittelt: histamininduzierte Chemotaxis auf Eosinophile und Mastzellen, IL-16 Freisetzung aus CD8+ Lymphozyten, Zymosan-induzierte Rekrutierung von Neutrophilen und Kalziummobilisation in Mastzellen. (87, 34) Verschiedene Ergebnisse der Forschung in Bezug auf das Vorhandensein (87, 102), bzw. nicht Vorhandensein (47, 62) des Histamin H4-Rezeptors in der Lunge wurden vorgelegt. Neue Erkenntnisse bestätigen eine hohe Expression von H4-Rezeptoren in der Lunge 21 und machen somit den H4-Rezeptor zu einem Ziel für entzündliche Lungenbeschwerden, wie beispielsweise allergisches Asthma. (87) 2 Zielsetzung Das Bronchialepithel ist ein respiratorisches Epithel und überzieht die Oberfläche des luftleitenden Respirationstraktes. Dabei spielen die Zellen des Epithels eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr, nicht nur als zelluläres Hindernis, sondern auch bei der Modulation der Entzündung durch inflammatorische Mediatoren. Histamin stellt eine wichtige Mediatorsubstanz in unserem Körper dar, die über 4 verschiedene Rezeptoren unterschiedliche Signale vermittelt. Unter anderem wirkt es als Vermittler der allergischen Sofortreaktion und trägt zur Entstehung der typischen Symptome der Typ I Reaktion, wie Asthma bei. In früheren Untersuchungen hat sich gezeigt, dass Atemwegsepithelzellen in der Pathophysiologie pulmonaler Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen und auch viele immunregulatorische Funktionen ausüben. Immunzellen, die man bei Krankheiten des Respirationstraktes findet, zum Beispiel Lymphozyten, Neutrophilen, Mastzellen oder dendritische Zellen lassen sich durch Histamin beeinflussen. Die funktionelle Expression von Histaminrezeptoren konnte auf Lungengewebe und verschiedenen Zellpopulationen der Lunge nachgewiesen werden. Daraus ergibt sich die Frage: Ist extrazelluläres Histamin in der Lage die immunologischen Funktionen von Epithelzellen zu beeinflussen? In dieser Arbeit wird dies am Modell der BEAS-2B Zelllinie näher betrachtet. Es soll des Weiteren untersucht werden: • Welchen Einfluss übt der Histamin-Rezeptoragonist H1(betahistine)-, H2(dimaprit)- und H3(R-α-methyl-histamine auf das intrazelluläre Kalzium von BEAS-2B-Zellen aus? • Lässt sich die Sekretion des Zytokins IL-6 durch Histamin beeinflussen? • Wie wirkt sich die Stimulation mit Histamin auf die Freisetzung der CXCChemokine IL-8, IP-10, MIG und I-TAC aus? 22 3 Die Material und Methoden 3.1 3.1.1 Material Geräte Spannungsquelle Consort E835 PeqLab, Erlangen, D Analysewaage Handy H 51-D Sartorius, Göttingen, D Begasungsbrutschrank Heraeus Stuttgart, D Biophotometer Eppendorf, Hamburg, D Digitales Fluoreszenzmikroskop Attofluor, Zeiss, Oberkochern, D Dispense Finnpipette, Thermo Labsystems, USA ELISA-Reader Bio-Tek Instruments, Inc., Gödenstorf, D Biofuge fresco Heraeus, Stuttgart, D Mikrobiologische Heraeus, Stuttgart, D Sicherheitswerkbank Mikroskop CK2 Olympus, Hamburg, D Neubauer-Zählkammer Brand. Wertheim/Main, D pH-Meter pH535 MultiCal WTW, Weilheim, D Pipetus akku Hirschmann, Eberstadt, D Pipetten (20, 200, 1000 µl) Finnpipette,Thermo Labsystems, USA Präzisionswaage Scaltec SBC52 Scalted, Heiligenstadt, D Umlufttrockenschrank Heraeus, Stuttgart, D Tischzentrifuge 5415C Eppendorf, Hamburg, D Transferpipette (100, 200 µl) Brand, Wertheim/Main, D Zentrifuge Rotanta Hettich, Bäch, CH 3.1.2 Verbrauchsmaterialien Dispenser-Tips Finnpipette, Thermo Labsystems, USA ELISA-Platten 96 Well Nunc, Dänemark Kulturplatten 24 Well Culture Cluster Costar, Corning Inc., Bodenheim, D 23 Kulturplatten 96 Well Microtest 96 Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NY, USA Pipettenspitzen Brand, Wertheim/Main, D Reagenzröhrchen Falcon 2052 (15, 50 ml) Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NY, USA Reaktionsgefäße (0,75 und 1,5 und 2 ml) Eppendorf, Hamburg, D Zellkulturflaschen (175 cm²) BD Falcon, Bedford, USA 3.1.3 Chemikalien Aceton Merck, Darmstadt, D BSA Sigma, Deisenhofen, D Collagen R Serva, Heidelberg, D Duo-Set für ELISA (IL-6) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (IL-8) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (IP-10) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (I-TAC) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (MIG) R & D , Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (RANTES) R & D , Minneapolis, USA FCS gold PAA Laboratories, Pasching, A IFN γ Immuntools, Friesoythe, D Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, D Sulfinpyrazon Dr. Ferrari, Ferrara, Italien TNF α Strathmann Biotec, Hannover, D Trizol-Reagent Gibco, Paisley, UK Trypsin/EDTA-Lösung Biochrom, Berlin, D 3.1.4 Biochemikalien und Antikörper Aceton Merck, Darmstadt, D BSA Sigma, Deisenhofen, D Collagen R Serva, Heidelberg, D 24 Duo-Set für ELISA (IL-6) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (IL-8) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (IP-10) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (I-TAC) R & D, Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (MIG) R & D , Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (RANTES) R & D , Minneapolis, USA FCS gold PAA Laboratories, Pasching, A IFN γ Immuntools, Friesoythe, D Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, D Sulfinpyrazon Dr. Ferrari, Ferrara, Italien TNF α Strathmann Biotec, Hannover, D Trizol-Reagent Gibco, Paisley, UK Trypsin/EDTA-Lösung Biochrom, Berlin, D 3.1.5 Medien Kulturmedium für BEAS2B –Zellkultur Mem-Medium mit 5% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin 3.1.6 Puffer für ELISA Waschpuffer für ELISA (IL6, IL8, MIG, ITAC, RANTES, IP-10, BrdU-ELISA) PBS mit 0,05% pH = 7,2 -7,4 Tween 20 25 Blockpuffer für ELISA (IL6, IL8, MIG, ITAC, RANTES, IP-10) PBS mit 5% Sucrose 1% BSA 0,05% NaN3 pH = 7,2 -7,4 Verdünnungspuffer für ELISA (IL6, MIG, ITAC, RANTES, IP-10) PBS mit 1% BSA pH = 7,2 -7,4 Verdünnungspuffer für ELISA (IL8) 20 mM Trizma base, 150 mM NaCl, 0,1% BSA und 0,05% Tween20 pH = 7,2 -7,4 Substratpuffer für ELISA 3,15 g Zitronensäure-Monohydrat in 500 ml Aqua bidest. pH = 4,1 TMB-Lösung für ELISA 480 mg TMB, 10 ml Aceton, 90 ml Ethanol und 200 µl H2O2 26 3.1.7 Puffer und Lösungen für intrazelluläre Kalziummessung Hanks Balanced Salts Solution (HBSS) 1M HEPES 1x Hanks´ Balanced Salts in 1.000 ml Aqua bidest. pH = 7,4 natriumfreie Salzlösung 300 mM Sucrose 1 mM MgSO4 1 mM K2HPO4 5,5 mM Glucose 1 mM CaCl2 20 mM Hepes pH = 7,4 3.2 3.2.1 Methoden BEAS-2B-Zellkultur Mit diesen Zellkulturen arbeitete man unter sterilen Bedingungen mit Hilfe der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank. In 175 cm² großen Zellkulturflaschen, die ca. 30 ml des Kulturmediums beinhalteten, wurden die BEAS-2B-Zellen bei 37° C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit im Brutschrank gehalten. Diese Flaschen wurden mit 0,01 mg/ml Fibronectin, 0,03 mg/ml Kollagen und 0,001 mg/ml Rinderserumalbumin in Kulturmedium gelöst und über einen Zeitraum von 2 bis 72 Stunden vorbehandelt. Das so genannte Beschichten ermöglichte den Zellen ein besseres Anhaften an der Oberfläche der Kulturflaschen. Die Zellen wurden kultiviert, bis sie den Boden der Kulturflasche fast vollständig bedeckten und wurden alle 2-3 Tage geteilt. Hierfür wurde das Kulturmedium entfernt und die Flaschen einmal mit PBS gewaschen. Um ein Ablösen der adhärenten Zellen auf dem Flaschenboden zu ermöglichen, wurden diese mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (verdünnt im Verhältnis 1:1 mit PBS) mittels eines einminütigen hin- und 27 herschwenkens behandelt. Nach dem Absaugen der Trypsin/EDTA-Lösung konnten die Flaschen mit den BEAS-2B Zellen für 15 min im Brutschrank inkubiert werden. Mit PBS wurden nun die Zellen vom Flaschenboden abgewaschen. Um die Zellen aus der Lösung zu extrahieren, wurde die Zellsuspension in 50 ml-Reagenzröhrchen für 10 min bei 1.500 Umdrehungen/min zentrifugiert. Der Überstand konnte abgesaugt werden und das im Reagenzgefäß verbleibende Pellet enthielt die Zellen. Diese wurden im Röhrchen mit Kulturmedium angereichert und mit Hilfe des Zellzählers deren Anzahl bestimmt. 2x106 Zellen wurden in jeweils eine neue Kulturflasche pipettiert und weiter kultiviert. Für die Experimente konnten die gezüchteten restlichen Zellen verwendet werden. Die Zellen der 5. bis zur 15. Generation hielt man für die Versuche in der Kultur. Jeweils 1.500 bis 3.000 Zellen/ cm² wurden nach der Einstellung in die Flaschen eingesät. . 3.2.2 Stimulation der BEAS-2B-Zellen Die Zellsuspension wurde so bearbeitet, dass sich eine Zellzahl von 105 Zellen/ml einstellte. In den nun verwendeten sterilen 24-Well-Zellkulturplatten trug man jeweils 1 ml, also 105 Zellen in jedes Well, auf. Das Histamin und Zytokine wurden in der jeweiligen Konzentration hinzugefügt. Daran schloss sich eine erneute Inkubationsperiode von 24 Stunden an. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 1.500 U/min von 5 Minuten wurden die Zellkulturüberstände abgenommen und in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Anschließend fror man die stimulierten BEAS-2B bei -70° C ein. Die weiterhin am Boden der Platte haftenden Zellen wurden mit Trizol-Reagenz lysiert, in sterile 0,5 ml-Reaktionsgefäße pipettiert und ebenfalls bei -70° C eingefroren. Anschließend lagerte man die Zellen über Nacht im Brutschrank. Am nächsten Tag wurde das über den Zellen stehende Medium abgesaugt und durch neues Zellkulturmedium ersetzt. 3.2.3 Messung von Zytokinen und Chemokinen per ELISA Mit Hilfe des Sandwich-ELISAs bestimmte man die unbekannten Konzentrationen, der zu betrachtenden Substanzen. Diese wurden durch zwei substanzspezifische 28 Antikörper, die sich gegen verschiedene Substanzepitope richteten, ermittelt. An der festen Phase band man den ersten Antikörper. Ein Enzym, welches den zweiten Antikörper markiert, katalysiert eine Farbreaktion. Zwischen die beiden Antikörper wurde nun die zu Konzentrationsbestimmung bestimmende erfolgte Substanz photometrisch gebunden mit und Standartkurve die als Vergleichsparameter. Der folgende Abschnitt beschreibt die Handhabung von ELISA-Sets der Firma R&D-Systems: Die ELISA-Platte wurde mit 100 μl/Well des jeweiligen Capture-Antikörpers in PBS ca. 12 Stunden inkubiert. Danach klopfte man die Platte auf Zellulosepapier aus und in jedes Well der Platte pipettierte man 200 μl Waschpuffer. Direkt im Anschluss wurde die Platte nochmals ausgeklopft. Insgesamt wusch man die Platten auf diese Weise 3-mal. Um unspezifische Bindevorgänge zu vermeiden, wurden nach diesem ersten Waschschritt 200 μl Block-Puffer in jedes Well gegeben. Die Inkubation der Platte mit Blockpuffer dauerte 1 Stunde. Nun folgte ein erneuter Waschschritt. Im Anschluss trug man die Proben und die Standards, die zuvor mit dem passenden Verdünnungspuffer (Herstellerangabe) verdünnt worden waren, auf die ELISA-Platte auf. Die Platte mit den Proben und Standarts inkubierten 2 Stunden, bevor der nächste Waschschritt folgte. 100 μl des biotinylierten Zweitantikörpers wurden in jedes Well pipettiert. Eine weitere Inkubationszeit von 2 Stunden schloss sich an. 100 μl Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat pro Well wurden, nach vorherigem waschen, eingebracht. Da Streptavidin hochaffin an Biotin bindet, vermittelt es den Zusammenhalt zwischen dem Zweitantikörper und der Meerrettichperoxidase. Die anschließende 20-minütige Inkubation erfolgte ohne Licht. Ein letztes Mal wurde die Platte gewaschen. 100 μl TMB-Substratlösung (10 ml Substratpuffer mit 0,5 ml TMB-Lösung) wurde in jedes Well gegeben. Die Inkubationszeit betrug ebenfalls 20 Minuten unter Lichtausschluss. Danach stoppte man mit Hilfe von 50 µl 4N Schwefelsäure pro Well die Reaktion und hat im ELISA-Reader (Wellenlänge 450 nm) gemessen. Eine spezielle Software diente der abschließenden Auswertung der gemessenen Daten. 29 3.2.4 Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration Die Konzentration wurde auf 103 BEAS-2B-Zellen in 1 ml in HBSS+BSA eingestellt. Danach erfolgte eine Beladung mit 4 µM Fura-2AM (dem Fluoreszenzfarbstoff) und eine anschließende Inkubation von 30 Minuten bei 37°C. Das überschüssige Fura-2AM ist durch zweimaliges Waschen mit natriumfreier Salzlösung entfernt worden. Anschließend nahm man diese Zellen in ca. 5 ml dieser natriumfreien Salzlösung auf. 250 µmol/ml Sulfinpyrazon wurden zur Festigung des Fluoreszenzfarbstoffs in den Zellen hinzugegeben. In eine 24-Well-Platte verteilte man pro Well jeweils 270 µl der Zellsuspension und danach stellte man diese auf den zuvor auf 37° C vorgeheizten Mikroskopiepult. Die Messung erfolgte mit einem digitalen Fluoreszenzmikroskop. Die Fluoreszenz wurde nach Stimulation fluorospektrometrisch gemessen und mit Hilfe der Absorption zwischen den Wellenlängen 340 nm und 380 nm die Ratio bestimmt. Dabei entsprach die Ratio dem Verhältnis der Grundfluoreszenz zur Fluoreszenz, die nach Zugabe von 30 µl Stimulus gemessen wurde. 3.2.5 Statistik Die statistische Auswertung erfolgte mit dem ANOVA (analysis of variance) –Test. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) dargestellt. Um die globale Differenz zwischen den einzelnen Gruppen zu ermitteln, wurde der ANOVA-Test durchgeführt. War dieser signifikant (p<0,05), schloss sich als PostTest, der Turkey´s Multiple Comparison Test an. P< 0,05 wurde als signifikant angesehen. 30 4 Ergebnisse Die BEAS-2B Zellen wurden einerseits mit Histamin alleine stimuliert, andererseits durch Zugabe von verschiedenen Zytokinen wie IFNχ, TNFα und IL1-β, welche das entzündliche Mikromilieu charakterisieren. Zum besseren Verständnis der einzelnen Histaminrezeptoren wurden die Zellen des Weiteren mit selektiven HistaminAgonisten stimuliert. 4.1 Einfluss von Histamin auf die IL-6-Ausschüttung Die mit Histamin stimulierten BEAS-2B Zellen wurden mittels ELISA auf die IL-6Sekretion untersucht. Dazu wurden Zellüberstände von jeweils 100.000 Zellen im ELISA verwendet, die während des ELISAs nochmals verdünnt wurden. Die Grafik 1 entstand anhand des Mittelwertes aller gemessenen Proben mit Hilfe von GraphPad. In der Graphik abgebildet ist das Sekretionsverhalten der BEAS-2B Zellen. Zu sehen ist eine deutliche Steigerung der IL-6-Sekretion, die konzentrationsabhängig ist und ihr Maximum bei 10-4 M für Histamin hat und danach wieder abnimmt. Der Spitzenwert der IL-6-Sekretion bei Histamin-Stimulation beträgt ca. 810 pg IL-6/ml/200.000 Zellen. Der Mediumwert ist bei ca. 420 pg IL-6/ml/100.000 Zellen. 31 Grafik 1: Einfluss von Histamin auf die IL-6 Sekretion aus BEAS-2B Zellen Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit Histamin inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IL-6-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. Für die Untersuchung, welche Histaminrezeptoren die IL-6-Ausschüttung aus BEAS2B Zellen stimulierten, wurden die Zellen verschiedenen Histaminagonisten (H1(betahistine)-, H2(dimaprit)- und H3(R-α-methyl-histamine)-spezifische Histaminrezeptorenagonisten) ausgesetzt (Graphik 2). Der größte Effekt konnte mit dem Histamin-H1-Agonisten Betahistine erzielt werden. Die Messungen ergaben einen konzentrationsabhängigen Anstieg bis zu einer Konzentration von 10-3, gefolgt vom Abfall der IL-6 Konzentration bei einer Betahistaminekonzentration von 10-2. 32 Graphik 2: Einfluss von Histaminrezeptoragonisten auf die IL-6 Ausschüttung Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit den angegebenen Histaminagonisten inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IL-6-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. 4.2 Einfluss von Histamin auf die IL-8-Ausschüttung Die Grafik 3 zeigt die Ergebnisse der IL-8 aus BEAS-2B Zellen nach der Stimulation mit Histamin. Der Mediumwert liegt im Mittel bei ca. 190 pg IL-8/ml/100.000 Zellen. Ähnlich des Kurvenverlaufs der IL-6 Auswertung ist während der Histaminkonzentrationserhöhung bis zu einem Wert von 10-4 M ein Anstieg und anschließend wieder ein Abfall zu beobachten. Dabei beträgt die höchste IL-8Ausschüttung bei Histamin-Stimulation ca. 550 pg IL-8/ml/100.000 Zellen. 33 Graphik 3: Einfluss von Histamin auf die IL-8 Sekretion aus BEAS-2B Zellen Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit Histamin inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IL-8-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. Grafik 4: Einfluss von Histaminrezeptoragonisten auf die IL-8 Ausschüttung Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit den angegebenen Histaminagonisten inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IL-8-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. 34 Analog zu den IL-6 Messungen wurden die Zellen der IL-8 Reihe ebenfalls den verschiedenen Histaminagonisten (H1(betahistine)-, H2(dimaprit)- und H3(R-α- methyl-histamine)-spezifische Histaminrezeptorenagonisten) ausgesetzt. Die IL-8 Ausschüttung ist bei einer R-α-methyl-histamine-Konzentration von 10-4 am Höchsten (ca. 875 pg IL-8/ml/100.000 Zellen). Es erfolgt ein konzentrationsabhängiger Anstieg der IL-8 Ausschüttung bis zu einer R-α-methylhistamine-Konzentration von 10-4 und ein anschließender Abfall der Ausschüttung bei einer Konzentration von 10-3. Der Kurvenverlauf für die Histaminagonisten Betahistine und Dimaprit entspricht dem von R-α-methyl-histamine, wobei die Maxima eine geringere IL-8 Auschüttung von nur ca. 750 pg IL-8/ml/100.000 Zellen zeigen. Das Maximum für Betahistine liegt bei einer Konzentration von 10-4 und für Dimaprit bei 10-5. 4.3 Einfluss von Histamin auf die MIG-Ausschüttung Die BEAS-2B Zellen wurden mit einer Kombination aus proinflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ (c = 100 IU/ml) vorinkubiert, um eine nachweisbare Chemokinausschüttung zu erzielen. Dies gilt für die Untersuchung der Chemokine MIG, IP-10 und RANTES. Die Ergebnisse der MIG-Ausschüttung nach Histaminstimulation aus BEAS-2B Zellen ist in Grapfik 5 dargestellt. In der Abbildung wird eine Verringerung der MIG Ausschüttung deutlich und somit wird durch Histamin eine Runterregulation des Chemokins verursacht. Der Mediumwert beträgt ca. 3.050 pg MIG/ml/100.000 Zellen Histamin erreichte bei einer Konzentration von 10-3 M den größten Effekt. Die gemessene Chemokinausschüttung lag hier bei ca. 1.800 pg MIG/ml/100.000 Zellen und ist vergleichbar mit dem bei 10-4 M ermittelten Wert. 35 Grafik 5: Einfluss von Histamin auf die MIG Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit Histamin und der Zytokinkombination IFNγ / TNFα (jeweils 100 IU/ml) inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der MIG-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. 4.4 Einfluss von Histamin auf die IP-10-Ausschüttung Grafik 6 zeigt den Einfluss von Histamin auf die IP-10 Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen. Die Mediumwerte schwanken im Mittel zwischen ca.15.100 pg IP10/ml/100.000 Zellen und ca. 13.900 pg IP-10/ml/100.000 Zellen. Eine Verringerung der IP-10-Ausschüttung ist zu beobachten. Der tiefste Wert bei Histamin-abhängiger Stimulation konnte bei ca. 6.500 pg IP-10/ml/100.000 Zellen mit einer HistaminKonzentration von 10-3 M ausgemacht werden. Der maximale Effekt wurde bei einer Konzentration von 10-7 M sichtbar. Der Wert lag bei ca.13.900 pg IP-10/ml/100.000 Zellen. Histamin zeigt eine Runterregulation bei dem IP-10 Zytokin. 36 Grafik 6: Einfluss von Histamin auf die IP-10 Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit Histamin und der Zytokinkombination IFNγ / TNFα (jeweils 100 IU/ml) inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IP-10-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. Grafik 7: Einfluss von Histaminrezeptoragonisten auf die IP-10 Ausschüttung Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit den angegebenen Histaminagonisten und der Zytokinkombination IFNγ / TNFα (jeweils 100 IU/ml) inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der IP-10-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. 37 Zur weiteren Untersuchung welcher Histaminrezeptor hauptsächlich für die Runterregulation der IP-10-Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen verantwortlich ist, wurden die Zellen auch mit den spezifischen Histaminrezeptorenagonisten Betahistine (H1), Dimaprit (H2) und R-α-methyl-histamine (H3) stimuliert. Betahistine (H1) und R-α-methyl-histamine (H3) führen kaum zu einer Änderung der Konzentration von IP-10. Dimaprit (H2) hingegen regelt die IP-10 Ausschüttung runter. 4.5 Einfluss von Histamin auf die I-TAC-Ausschüttung Die Ausschüttung des Zytokins I-TAC nach der Stimulation mit Histamin ergab keine signifikanten Ergebnisse und wird daher nicht weiter betrachtet. 4.6 Einfluss von Histamin auf die RANTES-Ausschüttung In Grafik 8 sind die Untersuchungsergebnisse für das Chemokin RANTES dargestellt. Für Histamin konnte eine Runterregulation von RANTES ausgemacht werden. Der gemessene Mediumwert lag bei ca. 19.700 pg RANTES/ml/100.000 Zellen. Unter Histamin-Einfluß wurde ein Abfall bis auf ca. 7.800 pg RANTES/ ml/100.000 Zellen sichtbar, die bei einer Histamin-Konzentration von 10-4 M gemessen wurde. Bei einer Histamin-Konzentration von 10-3 M konnte wiederum ein leichter Anstieg auf 8.500 pg RANTES/ ml/100.000 Zellen beobachtet werden. 38 Grafik 8: Einfluss von Histamin auf die RANTES Ausschüttung Jeweils 1x105 Zellen wurden für 24 Stunden mit Histamin und der Zytokinkombination IFNγ / TNFα (jeweils 100 IU/ml) inkubiert. Danach wurden die Überstände abgenommen und der RANTES-Gehalt per ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von insgesamt 3 unabhängigen Versuchen. 4.7 Einfluss von Histamin auf die Kalzium-Homöostase von BEAS-2B Zellen In der Grafik 9 ist der Einfluss von Histamin auf die Kalzium-Homoöstase der untersuchten Zelllinie dargestellt. Die Ca2+ Ströme wurden gemessen, um die funktionelle Expression der Histaminrezeptroren zu klären. 39 Grafik 9: Einfluss von Histamin auf die Kalzium-Homoöstase Die Zellen wurden mit Fura-2/AM beladen und mit verschiedenen Histamin-Konzentrationen stimuliert. Das zytosolische Ca2+ wurde fluoreszenzmikroskopisch gemessen und als Quotient der Absorption von 340 nm zu 380 nm angegeben. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives von insgesamt 3 Experimenten. Die Stimulation der BEAS-2B Zellen mit Histamin führte zu einem raschen konzentrationsabhängigen Ca2+ Einstrom mit anschließendem langsamen Abfall, wobei die stärkste Antwort nicht bei der zu erwartenden höchsten Konzentration von 10-4 M Histamin zu beobachten ist, sondern bei einer Konzentration von 10-5 M. Um des Weiteren die Beteiligung der Rezeptoren an der Kalzium-Homöostase zu untersuchen, wurde die Messung mit den Histaminagonisten Betahistine (H1), Dimaprit (H2) und R-α-methyl-histamine (H3) vorgenommen. Die Grafiken 10 und 12 zeigen einen konzentrationsabhängigen schnellen Ca2+ Anstieg für die Histaminagonisten Betahistine (H1) und R-α-methyl-histamine (H3) mit anschließendem langsamen Abfall zum Ausgangswert. Der H2-Agonist Dimaprit hingegen stellt keine Änderung des Ca2+Spiegels in den BEAS-2B Zellen dar. 40 Grafik 10: Einfluss von Histaminagonist Betahistine auf die Kalzium-Homoöstase Die Zellen wurden mit Fura-2/AM beladen und mit verschiedenen Betahistine-Konzentrationen stimuliert. Das zytosolische Ca2+ wurde fluoreszenzmikroskopisch gemessen und als Quotient der Absorption von 340 nm zu 380 nm angegeben. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives von insgesamt 3 Experimenten. Grafik 11: Einfluss von Histaminagonist Dimaprit auf die Kalzium-Homoöstase Die Zellen wurden mit Fura-2/AM beladen und mit verschiedenen Dimaprit-Konzentrationen stimuliert. Das zytosolische Ca2+ wurde fluoreszenzmikroskopisch gemessen und als Quotient der Absorption von 340 nm zu 380 nm angegeben. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives von insgesamt 3 Experimenten. 41 Grafik 12: Einfluss von Histaminagonist R-α-methyl-histamine auf die Kalzium-Homoöstase Die Zellen wurden mit Fura-2/AM beladen und mit verschiedenen R-α-methyl-histamine– Konzentrationen stimuliert. Das zytosolische Ca2+ wurde fluoreszenzmikroskopisch gemessen und als Quotient der Absorption von 340 nm zu 380 nm angegeben. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives von insgesamt 3 Experimenten. Die Graphik 13 zeigt eine Untersuchung des Einflusses der Histaminantagonisten (H1-Antagonist Diphenhydramine, H2-Antagonisten Cimetidine und der H3Antagonist Thioperamide) auf den durch Histamin hervorgerufenen intrazellulären Kalziumanstieges. Der H1-Antagonist Diphenhydramine und der H3-Antagonist Thioperamide verringerten den intrazellulären Kalziumanstieg, wobei diese beim Einsatz des H2-Antagonisten Cimetidine konstant bleibt. 42 Grafik 13: Einfluss der Histaminantagonisten auf den durch Histamin hervorgerufenen intrazellulären Kalziumanstieges Die Zellen wurden mit H1, H2, H3-Antagonisten vorinkubiert, mit Fura-2/AM beladen und dann mit 10-4M Histamin stimuliert. Das zytosolische Ca2+ wurde fluoreszenzmikroskopisch gemessen und als Quotient der Stimulation angegeben. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives von insgesamt 3 Experimenten. * Signifikanter Unterschied zwischen Histamin-stimulierten-Zellen und mit Medium inkubierten Zellen p < 0,05. 43 5 Diskussion Während der vergangenen 2 Jahrzehnte hat sich die Entzündung als ein wichtiges pathophysiologisches Charakteristikum der Allergie herausgestellt. Die Mastzellen spielen eine wichtige Rolle während der allergischen Reaktion. Sie sind die Quelle verschiedenster potenter Mediatoren wie Histamin. (98) Histamin, dessen Freisetzung aus Mastzellen und Basophilen auch als Degranulation bezeichnet wird, führt zu einer Erhöhung des Histaminlevels. Ein Anstieg des Histamins ist bei verschiedenen Erkrankungen, zu denen auch Asthma zählt, zu beobachten. Während einer allergischen Erkrankung, wird die Mastzelldegranulation durch IgE vermittelt und kann mit antiallergischen Medikamenten gehemmt werden. (30) Die Bronchialepithelzellen spielen bei der Pathogenese des Asthmas ebenfalls eine zentrale Rolle, da zahlreiche Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren und NO sezerniert werden. (19) Nach der Degranulation herrscht eine erhöhte Histaminkonzentration, die die Bronchialepithelzellen beeinflussen und zu einer veränderten Chemokinausschüttung führen könnte. Die allergische Reaktion umfasst 2 Phasen: eine frühe und eine späte Phase. Die frühe Phase Reaktion wird hauptsächlich durch die Histaminausschüttung aus Mastzellen eingeleitet. Durch das Binden des Histamins an spezifische Rezeptoren werden die klinischen allergischen Symptome ausgelöst. Dieser Mediator aktiviert außerdem Neutrophile sowie Eosinophile und wirkt chemotaktisch auf diese Zellen. Histamin erhöht den IL-8 Spiegel und ruft das Leukozyten-Rolling auf Endothelzellen hervor. Somit ist Histamin an der frühen als auch an der späten Phase der allergischen Reaktion beteiligt. (98) Es ist in der BAL von Asthmatikern während einer allergischen Reaktion zu finden. Dabei stimmt der Grad der Histaminkonzentration mit dem Maß der Überempfindlichkeit der Bronchien überein. Beim Asthma bronchiale beeinflussen Zytokine und Chemokine die Immunantwort, als auch pathologischen Veränderungen (z. B. Atemwegsfibrose, „airway remodelling“). (80, 9, 35) Histamin vermittelt über 4 spezifische Oberflächenrezeptoren verschiedene Effekte auf Zielzellen. Der H4 Histaminrezeptor ist an der Chemotaxis von Leukozyten und 44 Mastzellen im Areal der Entzündung beteiligt. Dies suggeriert eine wichtige Rolle der H4 Rezeptoren in der Regulation der Immunfunktion und eröffnet neues therapeutisches Potential für allergische und entzündliche Erkrankungen. Der H1Rezeptor übermittelt die meisten relevanten Effekte für Asthma. (98, 46) Das Vorhandensein von Histaminrezeptoren konnte in der Lunge in verschiedensten Gewebe- und Zelltypen festgestellt werden. Eine im Jahr 2002 durchgeführte Untersuchung von Gantner et al (24) zeigt, dass Histamin-Rezeptor mRNA im Lungengewebe, in verschiedenen Zellpopulationen der Lunge und Immunzellen ausgeschüttet wird. Verschiedene Lungenzellen, wie Bronchialepithelzellen, Fibroblasten, glatte Muskelzellen der Bronchien und mikrovaskuläre Endothelzellen, wurden dabei untersucht. Die H1 und die H4 Expression erfolgte in allen untersuchten Proben. H2 wurde nur von glatten Muskelzellen der Bronchien, Lungen- und Trachealgewebe ausgeschüttet. Keine oder sehr geringe Ausschüttung beobachtete man hingegen bei der H3-mRNA aus mikrovaskulären Endothelzellen. Auch die Expression der H3, H4 mRNA in Zellen des Immunsystems wurde untersucht, wie Lymphozyten (CD8+,CD4+), Monozyten, tonsillären B-Zellen, Mastzellen, unreife dentritische Zellen, reife dentritische Zellen und Eosinophile. Dabei ist die Expression der H4-mRNA in dentritischen Zellen, Eosinophilen und tonsillären B-Zellen am höchsten. H3 wird aus reifen und unreifen dentritischen Zellen ausgeschüttet. (24, 37) Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass über die H1- und H3Histaminrezeptoren ein intrazellulärer Kalziumstrom vermittelt wird, aber der H2Histaminrezeptor nicht beteiligt ist. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien an unreifen dentritischen Zellen überein. Hier wurden ebenfalls intrazelluläre Kalziumströme gemessen, die über H1- und H3-Rezeptoren vermittelt wurden, aber nicht über den H2-Rezeptor. (37) In dieser Arbeit konnte ein Mitwirken der H1- und H3-Histaminrezeptoren auf die BEAS-2B Zellen nachgewiesen werden, das lässt vermuten, dass sich funktionelle Rezeptoren auf diesen Zellen befinden. Dabei können die Epithelzellen der Luftwege ein Ziel für neue therapeutische Ansätze darstellen. In wieweit diese Rezeptoren Signale bei einer entzündlichen und/oder Abwehrreaktionen vermitteln und weitere relevante Mechanismen auslösen, ist noch zu klären. 45 Bei der Behandlung von Allergien sind die H1-Antihistaminika eine Standarttherapie. Hingegen war die Verabreichung des anti-ulzerativen Medikaments H2 Antagonist bei Asthmatikern anfänglich kontrainduziert, beruhend auf der Hemmung der Bronchorelaxation. Dies bestätigte sich allerdings nicht. Vorteilhaft bei der Asthmabehandlung ist die Beteiligung der H2 Rezeptoren an der Regulation von Immunprozessen. H3-Rezeptoren sind weder in der Lunge, noch in den meisten Leukozyten zu finden. Deshalb sind eine Bronchodilatation und ein entzündungshemmender Effekt mit H3-Präparaten nicht möglich. Dennoch werden H3-Agonisten bei der Behandlung von Asthma in Betracht gezogen, da die H3Rezeptoren in den Atemwegen an der Regulation von cholinergen Nerven und der Freisetzung von Neuropeptiden beteiligt sind. (24) Basierend auf dem Expressionsmuster und der Rolle bei der IL-16 Regulation könnten selektive H4 Antagonisten in Zukunft ein Ansatz zur Entwicklung antiallergischer und antiasthmatischer Medikamente darstellen. (47, 24) Bei der Entwicklung der Immunantwort in der Lunge sind Alveolarmakrophagen beteiligt, die im gesamten Respirationstrakt und im Lumen der Atemwege zu finden sind und sowohl entzündungsfördernde als auch entzündungshemmende Zytokine produzieren. Entscheidend für das Aufrechterhalten der Homoöstase in der Lunge ist eine gute Balance bei der Produktion dieser Zytokine. Freigesetztes Histamin stört die Balance, da es Einfluss auf die Zytokinproduktion nimmt. Dabei wirkt sich das Histamin nicht nur auf die Zytokinauschüttung und –produktion von Alveolarmakrophagen aus (80), sondern eventuell auch von Bronchialepithelzellen. Ob dabei auch die Bronchialepithelzellen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Immunantwort spielen, muss durch weitere Forschungsarbeit noch geklärt werden. 5.1 Histamin erhöht die Interleukin-6-ausschüttung aus BEAS-2B Zellen IL-6 ist ein pleiotrophisches Molekül, das in großen Mengen im biologischen Fluid und Gewebe von Asthmapatienten und von Patienten mit asthmatischen Diathese gefunden wurde. (99) 46 Die Untersuchung zeigte, dass durch Histaminagonisten (Betahistine (H1), Dimaprit (H2) und R-α-methyl-histamine (H3)) die Ausschüttung dosisabhängig gesteigert wurde. Untersuchungen aus der Vergangenheit mit Endothelzellen und dentritischen Zellen führten zu den gleichen Ergebnissen. (37, 61, 14) Das wiederum stärkt die Vermutung, dass Histamin entzündliche Prozesse in der Lunge beeinflusst. IL-6 hat aber auch eine antiinflammatorische und zellschützende Aktivität und ist der Hauptstimulator der Akuten-Phase Reaktion. Dies wiederum führt zu der Annahme, dass IL-6 ein Alarmsignal ist und zum Abschwächen der Gewebeentzündung und Gewebeverletzung dient. (18, 17) Des Weiteren ist IL-6 ein zentraler Faktor für das B-Zellwachstum und dessen Differenzierung. Die physiologische Produktion des IL6 ist für die Entwicklung einer normalen Immunantwort wichtig. Eine Überproduktion hingegen wird für eine pathogene Rolle bei der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen und lymphoiden Malignitäten verantwortlich gemacht. (82) IL-6 wird von humanen Bronchialepithelzellen produziert und spielt eine Rolle bei der IL-4 abhängigen IgE Synthese. Th2 Zytokine wie IL-4 und IL-13 beeinflussen die Freisetzung von IL-6 aus humanen Bronchialepithelzellen. (86) Die pathophysiologische Umstrukturierung histologischer Strukturen der Lunge, werden durch IL-6 beeinflusst. Es spielt eine Schlüsselrolle beim „airway remodelling“, subepitheliale Fibrose und Dyskrinie, da die Muzingenexpression durch IL-6 beeinflusst wird. (43, 10) 5.2 Histamin erhöht die Interleukin-8-ausschüttung aus BEAS-2B Zellen Das Chemokin IL-8 wird von Atemwegsepithelien nach Anregung durch verschiedene Stimuli hin synthetisiert und freigesetzt. Dabei wird durch IL-1β und TNFα die IL-8 Sekretion besonders aktiviert. Auch inhalierte Allergene, Bakterien und bakterielle Produkte, Viren und virale Produkte führen bei Atemwegsepithelien zu einer IL-8 Sekretion. (2, 59) IL-8 ist der Hauptvertreter der CXC-Chemokine, dessen Hauptfunktion die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten darstellt. (25, 15) Neben den Funktionen, die IL-8 auf Neutrophile ausübt, IL-8 verursacht nach einer Allergenprovokation die 47 Neutrophilen in der Lunge, wirken auch diverse andere Effekte auf leukozytäre sowie nicht leukozytäre Zellen. (58, 90) Zum Beispiel ist IL-8 unter anderem auch an der Rekrutierung von Eosinophilen beteiligt und somit ein wichtiger chemotaktischer Faktor für Eosinophile. (44) Die Ergebnisse zeigten eine dosisabhängige Steigerung der Histaminkonzentration nach Stimulation mit Histaminagonisten. Analoge Untersuchungsergebnisse zeigten sich mit Endothelzellen und dentritischen Zellen. (39, 37) Shimizu et al bewiesen mit ihren Untersuchungen an humanen Keratinozyten, dass der H1 Antagonist Cetirizine die IL-8 Produktion hemmt. (79) Eine weitere Studie an humanen Keratinozyten von Matsubara et al zeigte, dass Histamin die Produktion nicht nur von IL-8, sondern auch von IL-6 steigert und diese Reaktion mit Olopatadine, ebenfalls ein H1 Antagonist, vollständig gestoppt wurde. Somit könnten die H1 Antagonisten ebenfalls einen antiinflammatorischen Nutzen durch den Eingriff in die Zytokinproduktion aufweisen. (54) Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass Histamin in die entzündlichen Prozesse der Atemorgane eingreift. 5.3 Histamin verringert die IP-10, I-TAC, MIG-Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen Neben der Fähigkeit Zytokine freizusetzen, können Atemwegsepithelien auch über die Sekretion von verschiedenen Chemokinen Einfluss auf die Zusammensetzung des zellulären Infiltrats und den Krankheitsverlauf nehmen. Die Chemokine IP-10, I-TAC und MIG wirken speziell chemotaktisch auf aktivierte T-Lymphozyten. Das proinflammatorische Th1-Zytokin IFN-gamma induziert in humanen Bronchialepithelzellen die Produktion der Chemokine. (77) Während eines Entzündungs- und/oder Reparationsprozesses der Atemwege werden auf humanen Atemwegsepithelzellen CXCR3 Rezeptoren, der die Chemokinliganden binden, exprimiert. Die unterschiedlichen Liganden des Rezeptors vermitteln mehrere voneinander abgegrenzte Zellantworten, die für das Wachstum und die Migration verschiedener hämatopoetischer und struktureller Zellen wichtig sind. Die Atemwegsepithelzellen setzen die Liganden Mig/CXCL9, IP-10/CXCL10 und ITAC/CXCL11 frei. Die Epithelzellen exprimieren nicht nur den klassischen 48 CXCR3-A Rezeptor sondern auch einen CXCR3-B Rezeptor, der mit Binden von Liganden eine autokrine Reaktion vermitteln könnte. (42) Die Untersuchung zeigte, dass durch Histaminagonisten die Ausschüttung dosisabhängig geschwächt wird. Untersuchungen bei der in allergensensibilisierten Lungen von Mäusen nach einer Allergenprovokation MIG eingebracht wurde, zeigten folgende Reaktionen: eine reduzierte Atemwegshyperreaktivität, eine Eosinophilenakkumulation, eine Verringerung von Th2 Zytokinen (wie IL-4) und ein Anstieg der Th1 Zytokine (wie IL-12). Diese Studien stellen eine Rolle von MIG während einer allergischen Atemwegsentzündung dar. Somit scheint MIG sich wie ein typisches Th1 Chemokin zu verhalten und die Fähigkeit zu besitzen, der allergischen Th2 Entzündungsreaktion entgegen zu wirken.(22, 88) Die Stimulation von BEAS-2B Zellen mit Histamin führte zu einer konzentrationsabhängigen Runterregulation der MIG Sekretion. Daraus lässt sich schließen, dass die Anwesenheit von Th1 Lymphozyten sinkt und somit die Th2 Dominanz bei der Entzündung verstärkt wird. Das könnte den Zusammenhang zwischen der Histaminkonzentration und dem Ausmaß bronchialer Überempfindlichkeit während eines Asthma bronchiale erklären. IP-10 wirkt chemotaktisch auf Th1 Lymphozyten und findet sich in den Atemwegen von Asthmatikern in erhöhten Konzentrationen wieder. Eine Studie mit Mäusen ergab, dass das IP-10 Level nach einer Allergenprovokation anstieg, über dies hinaus führte IP-10 zu einer Erhöhung der Atemwegshyperreaktivität, Eosinophilenakkumulation und IL-4 Konzentration. (56) Konzentrationsabhängig wird die IP-10 Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen durch Histamin gehemmt. Die Hemmung der IP-10 Ausschüttung könnte die asthmatische Entzündung abschwächen sowie eine Th2 angetriebene Immunantwort fördern. Da hauptsächlich der H2-Rezeptor an der histamininduzierten Hemmung der IP-10 Ausschüttung beteiligt ist und dieser vor allem entzündungshemmende und immunsupressive Effekte vermittelt, kann man daraus schließen, dass es eine Beteiligung an entzündungshemmende und immunsupressive Prozessen gibt. (8, 37) 49 5.4 Histamin verringert die RANTES-Ausschüttung aus BEAS-2B Zellen Das Chemokin RANTES ist ein chemotaktisches Agens für Eosinophile, Lymphozyten und Monozyten und ist befindlich in Zellen der Atemwegsmucosa sowie in BEAS-2B. Die Tatsache, dass RANTES in hohen Mengen vom Atemwegsepithel bei Asthma produziert wird, lässt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Asthma und anderen Atemwegserkrankungen vermuten. Durch den Einsatz von Glucocorticoiden konnte eine Runterregulation der RANTES Produktion von Epithelzellen beobachtet werden. (84, 52) Die Genexpression der Chemokine RANTES, IL-8, MIG und IP-10 in BEAS-2B Zellen wird sowohl durch NF-kappaB (Transkriptionsfaktor) und p38 MAPK (wachstumsvermitteltes intrazelluläres Signalprotein), als auch durch die interzellulären Kontakte mit Eosinophilen reguliert. (97) Somit könnten Eosinophile, die durch RANTES rekrutiert wurden, wiederum Einfluss auf die Genexpression von Chemokinen aus Bronchialepithelzellen nehmen. Eine weitere Beteiligung des Chemokins RANTES wird bei der Histaminfreisetzung beobachtet. Auf der einen Seite aktiviert RANTES basophile Granulozyten und bewirkt die Freisetzung von Histamin. Auf der anderen Seite wird diese gehemmt, wenn die Freisetzung durch verschiedene Zytokine induziert wurde. (26) Die Untersuchungen zeigten eine Verringerung der RANTES Ausschüttung nach der Stimulation mit Histamin und nicht eine zu erwartende Hochregulation. Im Gegensatz dazu führte eine Untersuchung mit Keratinozyten nach Stimulation des H1 Rezeptor zu einer Freisetzung von RANTES. (26) Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass Histamin die Produktion von RANTES hemmt, diese Tatsache könnte die Th2 Dominanz verstärken und somit zu einer gesteigerten allergischen Entzündungsreaktion führen. Im Vergleich dazu spielt RANTES bei der Chemotaxis von Eosinophilen also bei der allergischen Entzündungsreaktion der Lunge eine wichtige Rolle. (72) Folglich führt eine Hemmung von RANTES zu einer Abschwächung der allergischen Entzündungsreaktion durch eine verringerte Eosinophileneinwanderung. Die Effekte, die durch RANTES ausgeübt werden sind sehr vielseitig und manchmal widersprüchlich. (1) Welche Rolle dabei Histamin auf die Produktion und 50 Ausschüttung von RANTES einnimmt, muss in seinen Einzelheiten noch geklärt werden. 5.5 Histamin führt zu einem Anstieg des Kalziumeinstroms in die BEAS-2B Zellen Eine frühere Untersuchung von Noah TL et al mit den BEAS-2B Zellen zeigte, dass Histamin einen flüchtigen Kalziumanstieg (Ca2+ aus intrazellulären Speichern) induziert. Dieser Effekt wird durch den H1-Antagonisten Diphenhydramin gehemmt. Ein Zusammenhang zwischen der Änderung des intrazellulären Kalziumspiegels und der IL-6 Sekretion bei BEAS-2B Zellen wurde nachgewiesen. (61) Die Ergebnisse dieser Arbeit können einen Kalziumanstieg nach Stimulation mit Histamin sowie den Effekt von H1-Antagonisten ebenfalls bestätigen. Allerdings konnte bei dieser Untersuchung auch ein hemmender Effekt von H2-Antagonisten auf die chemotaktische Aktivität festgestellt werden. Der H3-Antagonist hatte hingegen keine Auswirkung auf die chemotaktische Aktivität. Die schon von Noah TL et al aufgestellte Vermutung, dass die BEAS-2B Zellen funktionelle Histaminrezeptoren besitzen, wird hiermit gefestigt. 5.6 Einbau der Ergebnisse in den pathophysiologischer Kontext Verschiedenen Auswirkungen von extrazellulär befindlichem Histamin auf die Bronchialepithelzellen in vitro konnten in dieser Arbeit gezeigt werden. Somit ergeben sich mögliche Konsequenzen für Entzündungsprozesse in der Lunge. Durch die Stimulation der Bronchialepithelzellen mit Histamin wird IL-6 vermehrt freigesetzt, vor allem bei der Aktivierung des H1-Rezeptors mit Hilfe des H1Histaminrezeptoragonisten Betahistidine. Das Zytokin IL-6 ist mit Asthma bronchiale assoziiert. Es regt unter anderem die Atemwegsepithelien zu vermehrter Mucinbildung an und wirkt beim „airway remodeling“ mit. (18, 11, 99) Somit ist hier von einer Beteiligung des Zytokins IL-6 auszugehen, man kann aber nur vom 51 Eingreifen des Histamins in die allergischer Atemwegsentzündungsreaktion sprechen, da auch ein entzündungshemmender Effekt von IL-6 aufzuweisen ist. (96) Das Chemokin IL-8 wird nach Stimulation der verschiedenen Histaminrezeptoren ausgeschüttet, dabei ist der Effekt, der über den H3-Rezeptor vermittelt wird am größten. Die chemotaktische Wirkung des IL-8 bezieht sich vor allem auf neutrophile Granulozyten, aber es lockt auch die eosinophilen Granulozyten von Atopikern an. (25, 58) Histamin ist somit an der Rekrutierung von Entzündungszellen in die Lunge beteiligt. Histamin verursacht eine Hemmung der Ausschüttung des Chemokins MIG aus Bronchialepithelzellen. Durch MIG wird unter anderem die Migration eosinophiler Granulozyten inhibiert und Chemotaxis auf Th1-Lymphozyten ausgeübt sowie eine Ausübung von protektive Eigenschaften bei der Pathogenese der bronchialen Hyperreagibilität. (50, 65, 89) Demzufolge verursacht Histamin eine Verschiebung des Th1-/Th2-Gleichgewichts zu Gunsten einer Th2-Antwort und zu einer verstärkten Infiltration durch Eosinophile. Noch sind nicht alle Wechselwirkungseffekte, von Histaminen auf Bronchialepithelzellen, eindeutig einem bestimmten pathophysiologischen Szenario zuzuschreiben. Dennoch legt diese Arbeit die Beteiligung von H1- und H3Histaminrezeptoren an der Immunmodulation bei Atemwegserkrankungen nahe. Betrachtet man die vorliegenden Ergebnisse im Kontext mit den Effekten, die extrazelluläres Histamin auf andere Immunzellen, wie Lymphzyten oder dendritische Zellen haben (24, 37), können Antagonisten an Histaminrezeptoren in Zukunft weiterhin als therapeutische Option zum Beispiel beim Asthma bronchiale darstellen, wobei als Ansatz nicht nur der H1- und H3-Histaminrezeptor in Betracht gezogen werden sollte, sondern auch der H4-Histaminrezeptor (87). 52 6 Das Zusammenfassung Immunsystem kann von IL-6 aktiviert werden und verschiedene Immunreaktionen hervorrufen sowie Einfluss auf die Entzündungsreaktion nehmen. Daraus resultieren neue Therapieansatzmöglichkeiten. Humane Bronchialepithelzellen spielen durch ihre Lokalisation in den Atemwegen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr. Diese Zellen stehen in erstem Kontakt mit Allergenen, Schmutzpartikeln und Krankheitserregern wie Bakterien oder Viren und dienen der Initiation und Aufrechterhaltung von Immunreaktionen. Histamin ist als ein Entzündungsmediator bekannt, der verschiedene immunregulatorische Effekte einschließt. Er wird vor allem bei allergischen Reaktion freigesetzt und trägt zur Entstehung der typischen Symptome der Typ I Reaktion wie Urtikaria, Asthma und Rhinitis bei. Die Beteiligung des Histamins an Entzündungsreaktionen in der Lunge, im Speziellen der Einfluss auf BEAS-2B Zellen, eine Zelllinie, die Eigenschaften von Bronchialepithelzellen vereinigt, wurde untersucht. Mit den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass BEAS-2B Zellen hinsichtlich der Zytokine IL-6, IL-8, IP-10, MIG und RANTES unter Einfluss von Histamin ein verändertes Sekretionsmuster zeigten. Bei BEAS-2B Zellen wurde das IL-6 und IL-8 konzentrationsabhängig vermehrt ausgeschüttet, während Werte für die Chemokine MIG, IP-10 und RANTES konzentrationsabhängig abnahmen. Bei der Betrachtung des Einflusses von Histamin auf die Kalzium-Homoöstase der BEAS-2B Zellen konnte festgestellt werden, dass nur die H1 und H3 Rezeptoren an einen Ca2+ Einstrom und einer chemotaktischen Aktivität beteiligt sind. Die Effekte, die Histamin ausübt, werden über verschiedene Rezeptoren vermittelt. Histamin nimmt eine sehr komplexe Rolle bei den pathophysiologischen Abläufen während einer allergischen Atemwegserkrankung ein. 53 7 1 Literaturverzeichnis Appay V, Rowland-Jones SL (2001) RANTES: a versatile and controversial chemokine. 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Für die Bereitschaft das Zweitgutachten zu übernehmen, bedanke ich mich bei PD Dr. med. Yared Herouy. Meinem Betreuer Herrn Dr. Marco Idzko danke ich für das aufmerksame Durchsehen des Textes dieser Arbeit und für seine Ansprechbarkeit. Herrn PD Dr. Zissel danke ich für die Bereitstellung seines Labors und seiner ständigen Hilfsbereitschaft. Ebenfalls möchte ich mich bei allen anderen Mitarbeitern des pneumologischen Labors für die Unterstützung danken. Den anderen Doktoranden und Diplomanden des pneumologischen Labors gilt ebenfalls mein Dank, durch sie wurde die Arbeit im Labor noch interessanter. Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, Großeltern und Schwiegereltern, ohne deren finanzielle und moralische Unterstützung das Zahnmedizinstudium und auch diese Arbeit nicht möglich gewesen wären. Am Schluss möchte ich meinem Mann Christian danken, der mit mir während des gesamten Studiums alle Höhen und Tiefen meisterte sowie mich immer wieder motivierte nicht aufzugeben. 68 11 Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Anja Jäschke, geb. Dembinski Geburtstag/-ort: 24.08.1979, Lutherstadt Eisleben Familienstand: verheiratet Schulausbildung: 09/86 – 07/91 Grundschule in Ahlsdorf 09/91 – 06/98 Gottfried August Bürger Gymnasium Benndorf, Abitur Studium: 04/99 – 12/04 Studium der Zahnmedizin an der Albert Ludwigs Universität Freiburg 04/00 Zahnärztliches Vorphysikum 04/02 Zahnärztliches Physikum 07/05 – 12/05 Staatsexamen Beruf: 07/05 -06/07 Assistenzzahnärztin in freier Praxis
