Mechanismen der Immunevasion in EBV

Mechanismen der Immunevasion in
EBV-assoziierten malignen Neoplasien
Der naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Christiane Silke Tudor
aus Schäßburg/Rumänien
Seite 1
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung:
07.05.2014
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Johannes Barth
Gutachter/in:
Prof. Dr. Thomas Winkler
OÄ PD Dr. Maike Büttner-Herold
Seite 2
Widmung
In Liebe und Dankbarkeit meiner Familie gewidmet
Seite 3
Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Betreuerin und Zweitgutachterin meiner Dissertation
OÄ PD Dr. Maike Büttner-Herold für die Bereitstellung des interessanten Forschungsthemas,
ihre großartige wissenschaftliche und moralische Unterstützung, Motivation und Geduld,
dafür, dass sie jederzeit bereit war, sich mit den Herausforderungen und Problematiken der
Arbeit auseinanderzusetzen, für die Förderung meiner Teilnahme an ihrer offenen und
engagierten Zusammenarbeit mit vielen regionalen, nationalen und internationalen Instituten,
für das sehr angenehme Arbeitsklima, ihr Vertrauen und ihre Wertschätzung. Du bist einfach
klasse, Maike!
Bei Prof. Dr. Arndt Hartmann möchte ich mich für die Möglichkeit an seinem Institut die
Doktorarbeit anzufertigen, seine Ratschläge und finanzielle Unterstützung bedanken.
Bei Prof. Dr. Thomas Winkler möchte ich mich für die Übernahme der Betreuung seitens der
naturwissenschaftlichen Fakultät und des Erstgutachtens bedanken.
Prof. Dr. Kerstin Amann und ihrer Forschungsgruppe möchte ich ganz herzlich für die
großartige Unterstützung und Ratschläge danken, besonders Christoph, Miri, Stefan, Tina,
Yvonne, Katrin, Andi, Romy, Nadine und Moni. Was hätte ich nur ohne euch gemacht? Ihr
hattet jederzeit ein offenes Ohr für mich und wart sehr hilfsbereit. Das werde ich euch nie
vergessen!
Ein ganz herzliches Dankeschön an alle Mitarbeiter der Pathologie, vor allem den über vierzig
Blutspendern zur Isolation von Monozyten.
Bei dem Graduiertenkolleg 1071 “Viren des Immunsystems” und seinem Sprecher Prof. Dr.
Bernhard Fleckenstein möchte ich mich für die wissenschaftliche und finanzielle
Unterstützung im Rahmen eines 3jährigen DFG-Stipendiums bedanken. Herzlichen Dank an
meine Kollegen des GRK1071. Ich hab die Zusammenarbeit mit euch genossen und bedanke
mich von Herzen für die schöne und sehr wertvolle Zeit mit euch!
Meinen herzlichen Dank auch an meine Mentoren im Rahmen des Graduiertenkollegs 1071
PD Dr. Brigitte Biesinger-Zwosta und Prof. Dr. Alexander Steinkasserer für die vielen
Mentorengespräche und die konstruktive Kritik, die mir dabei geholfen hat, meine
wissenschaftliche Denk- und Arbeitsweise zu optimieren.
Seite 4
Für die finanzielle Unterstützung in den letzten Monaten meiner Doktorarbeit im Rahmen des
Programms zur “Förderung der Chancengleichheit für Frauen in Forschung und Lehre”
möchte ich mich bei der Graduiertenschule der FAU Erlangen bedanken.
Dr. Christopher Dawson und seiner ehemaligen Gruppe aus Birmingham, UK, besonders John
O'Neil möchte ich für meinen informativen Gastaufenthalt in Birmingham, die gute
Zusammenarbeit und wissenschaftliche Unterstützung danken.
Bei PD Dr. Luitpold Distel und seiner Arbeitsgruppe der Strahlenklinik Erlangen möchte ich
mich herzlich für die sehr gute Zusammenarbeit, besonders für die Unterstützung bei den
statistischen Auswertungen bedanken.
Mein besonderer Dank gilt der AG Prof. Dr. Armin Gerbitz der Medizinischen Klinik 5,
Erlangen, vor allem Dr. Heiko Bruns für die vielen wissenschaftlichen Anregungen und auch
praktischen Unterweisungen sowie den regen Erfahrungsaustausch.
Einen ganz besonderen Dank an meine Kollegen der Pathologie Birgit, Christa, Madeleine,
Agnes, Angela, Anja, Tilman, Robert und Christine. Danke für die vielen Gespräche! Ihr habt
mich oft aufgebaut und motiviert und standet mir mit euren unzähligen Ratschlägen zur Seite.
Ihr werdet mir alle fehlen!
Bei allen meinen Freunden möchte ich mich ganz herzlich bedanken, vor allem bei Lidia,
Judith, Ortensia, Hilde und Bobby mit Miri und Becky, Florin, Tash und Valeska! Mit euch
hatte ich schöne und inspirierende Momente, wir haben Höhen und Tiefen erlebt und uns
verbinden einzigartige Erlebnisse. Ihr habt mir oft zugehört, mich getragen, wart auch mal
kritisch und habt mich gleichzeitig unterstützt. Von Herzen danke ich euch dafür!
Meiner Familie gehört meine größte Wertschätzung. Liebe Eltern, danke, dass ihr vor 23
Jahren für mich und meinen Bruder Rumänien verlassen habt, um uns bessere
Ausbildungschancen und ein besseres Leben zu ermöglichen. Diese Arbeit widme ich vor
allem euch, aber auch meiner Oma, die sich immer liebevoll um mich gekümmert und bemüht
hat sowie meinem lieben Bruder Daniel und lieben Schwägerin Martina. Ihr seid die Besten!
Danke auch an die drei besten Neffen der Welt: Christian, Maximilian und Benjamin.
Mein größter Dank und allerhöchste Wertschätzung gehört meinem Gott! Nihil sine deo!
Zusammenfassung
Seite 5
Zusammenfassung
Zusammenfassung 1
Über 90% der Weltbevölkerung sind Epstein-Barr-Virus (EBV)-Träger. Obwohl EBV im
Kindesalter größtenteils zu einer asymptomatischen Infektion führt, gibt es hinreichende
Beweise für seine Karzinogenität. EBV ist nicht nur an der Entstehung von Lymphomen,
sondern auch von epithelialen Tumoren wie dem Nasopharynxkarzinom (NPC) beteiligt.
Obwohl in dem Tumor virale Antigene, einschließlich des latenten Membranproteins (LMP)1,
exprimiert sind, werden diese von dem Immunsystem nicht erkannt, was vermuten lässt, dass
hier Immunevasionsmechanismen aktiv sind. Ein Mechanismus, der häufig von Tumoren
eingesetzt wird, ist die Herunterregulation von Komponenten der human leukocyte antigen
(HLA) Klasse I Antigenpräsentationsmaschinerie (APM). Im Hinblick auf die Immunevasion
erscheint es jedoch kontraintuitiv, dass LMP1 in epithelialen Zelllinien mehrere
Komponenten der HLA Klasse I APM induziert. In NPC Geweben wurde hingegen kein
Unterschied in der Expression der HLA Klasse I APM zwischen LMP1-negativen und LMP1positiven
NPC
Fällen
festgestellt.
LMP1
induziert
gleichzeitig
onkogene
Transkriptionsfaktoren wie signal transducers and activators of transcription (STAT)3 und cMyc, die ebenfalls in die Regulation der HLA Klasse I APM eingreifen können.
Epitheliale Zelllinien dienten in dieser Arbeit als Modell, um das Zusammenspiel von LMP1
mit STAT3 und seinem Zielgen c-Myc bei der Regulation der HLA Klasse I APM zu
analysieren, um damit einen möglichen Mechanismus der Immunregulation und -evasion im
NPC aufzudecken.
LMP1 induzierte nicht nur Komponenten der HLA Klasse I APM, sondern verstärkte
gleichzeitig über die Sekretion von IL6 und die Aktivierung von JAK3 und STAT3 die
Expression des Onkogens c-Myc, welches wiederum einen hemmenden Effekt auf die HLA
Klasse I APM ausübte. Über diesen Mechanismus wäre es denkbar, dass der Tumor das
onkogene Potential von LMP1 ausnutzt und der immunogenen Wirkung des Proteins zugleich
entgegenwirkt. Der hier beschriebene Regulationsmechanismus kann zumindest teilweise den
ausbleibenden Unterschied in der Expression der Komponenten der HLA Klasse I APM
zwischen LMP1-positiven und LMP1-negativen NPC Fällen erklären.
Zusammenfassung
Seite 6
Zusammenfassung 2
Das
klassische
Hodgkin
Lymphom
(cHL)
ist
durch
ein
prominentes
reaktives
inflammatorisches Infiltrat gekennzeichnet, welches jedoch nicht zur effektiven Abtötung der
Tumorzellen führt. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Makrophagen (MΦ) und
Dendritischen Zellen (DC) in der intratumoralen Immunität untersucht.
Zunächst wurde die Verteilung von reifen und unreifen myeloiden (m)DC, MΦ und Typ2artigen MΦ (MΦ-2) in cHL Geweben analysiert und deren Einfluss auf das Überleben der
Patienten untersucht. Zusätzlich wurde in ausgewählten Fällen die Expression von Zytokinen
bestimmt. Ein Zellkulturmodell wurde verwendet, um den Einfluss von cHL-Zelllinien auf die
Reifung von Blutmonozyten abstammenden (mo)DC und die Polarisation von MΦ wie auch
den Effekt von moDC und MΦ auf die Proliferation von cHL-Zelllinien zu ermitteln.
Reife mDC wurden im cHL häufiger vorgefunden als unreife Formen und waren mit
verbessertem tumor-spezifischen Überleben der cHL Patienten assoziiert. In unserem
Zellkultursystem fanden wir einen TNFα-abhängigen, reifeinduzierenden Einfluss von cHLZellüberständen auf moDC, passend zu der in vivo beobachteten Dominanz von reifen mDC.
MФ und MФ-2 waren unter den untersuchten Entzündungszellen am häufigsten vertreten,
wobei CD163-positive MФ-2 mit einer schlechteren Prognose assoziiert waren. Zudem schien
in der Zellkultur der Polarisationszustand von MФ-2 aktiv von den Tumorzellen
aufrechterhalten zu werden. MФ-2 tolerierten das Wachstum einer cHL-Zelllinie, wohingegen
MФ-1 und moDC es inhibierten. Ein typisches immunsuppressives Zytokinprofil konnte im
cHL Tumorgewebe nicht nachgewiesen werden, sondern eher ein Überschuss an anti- und
proinflammatorischen Zytokinen in einer Untergruppe von cHL Patienten mit vielen MФ-2
oder wenigen reifen mDC und somit eher schlechter Prognose. Da in cHL Fällen mit wenigen
MФ-2 und mutmaßlich besserer Prognose eine schwache Zytokinexpression ähnlich der
benignen Kontrollgruppe vorgefunden wurde, könnte man schlussfolgern, dass die hohe
Produktion von Zytokinen die Aggressivität des Tumors fördert.
Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass MΦ, die im cHL Aspekte der
MΦ-2 Polarisation aufweisen, im cHL die Immunevasion fördern, während reife mDC, die
zumindest teilweise durch TNFα induziert werden, an der antitumoralen Immunität beteiligt
zu sein scheinen.
Zusammenfassung
Seite 7
Summary
Summary 1
Epstein-Barr virus (EBV) is a γ-herpes virus persistently infecting 90% of the world
population. Although EBV infection in childhood is mostly asymptomatic, sufficient evidence
exists for its carcinogenicity. Not only lymphomas, but also epithelial malignancies like
undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (NPC) are associated with EBV. Therefore,
besides tumor antigens NPC also express viral antigens, including the EBV latent membrane
protein (LMP)1, that are potential targets for an antitumor immune reaction. However, the
tumor is not eliminated by the immune system, indicating that mechanisms of immune
evasion must be active. One frequently applied method of malignant tumors to evade host
immunity is the downregulation of components of the human leucocyte antigen (HLA) class I
antigen presentation machinery (APM). LMP1, however, induces several components of the
HLA class I APM in epithelial cell lines. This appears counterintuitive with immune evasion.
In NPC tissues, on the contrary, no difference in the expression of the HLA class I APM
between LMP1-negative and LMP1-positive cases was observed. LMP1 simultaneously
induces a multitude of intracellular signaling pathways, including signal transducers and
activators of transcription (STAT)3 pathway and c-Myc, which are also involved in the
regulation of HLA class I APM.
In this study we used an epithelial cell culture model to investigate the complex interplay of
LMP1, STAT3 and its downstream target c-Myc in the regulation of the HLA class I APM to
better understand mechanisms of immune modulation and evasion operational in NPC.
LMP1 not only induced components of the HLA class I APM, but simultaneously reinforced
the expression of the oncogene c-Myc via the secretion of IL6 and the activation of JAK3 and
STAT3. c-Myc furthermore exerted an inhibitory effect on the HLA class I APM. It is
therefore conceivable that the tumor can exploit the oncogenic potential of LMP1 and
counteract its own immunogenicity. Hence, this mechanism may explain at least in part the
lack of a difference in HLA class I APM expression between LMP1-positive and LMP1negative NPC cases.
Zusammenfassung
Seite 8
Summary 2
Classical Hodgkin Lymphoma (cHL) is characterized by a prominent reactive inflammatory
infiltrate that, however, does not lead to an effective eradication of tumor cells. In this study
we focused on the role of macrophages (MΦ) and dendritic cells (DC) in intratumoral
immunity.
First the distribution of mature and immature myeloid (m)DC, MΦ and type2-like MΦ (MΦ2) was analyzed in cHL biopsies and their influence on survival of cHL patients was assessed.
Additionally, the expression of cytokines was determined in selected cases. A cell culture
model was used to study the effect of cHL cell lines on the maturation of monocyte derived
(mo)DC and the polarization of MΦ, as well as the effect of moDC and MΦ on the
proliferation of cHL cell lines.
Mature mDC were more numerous in cHL specimens than immature mDC and were
associated with better tumor-specific survival of the patients. We found an induction of
maturation of moDC by cHL cell supernatants, which was TNFα-dependent in cell culture,
going in line with the predominance of mature mDC in vivo. MФ and MФ-2 were the most
frequent investigated inflammatory cells, with CD163-positive MФ-2 being associated with
poor prognosis. Additionally, in cell culture their polarization state seemed to be maintained
by the tumor cells. MФ-2 tolerated cHL cell proliferation, whereas MФ-1 and moDC
inhibited cHL cell growth. A typical immunosuppressive cytokine profile was not detected in
the cHL biopsies, but rather an excess of both anti- and proinflammatory cytokines in a
subgroup of cHL patients, exhibiting numerous MФ-2 or few mature mDC, thus showing a
presumably adverse constellation. Since cHL cases with few MФ-2 and a putative better
prognosis showed only a weak cytokine expression comparable to a benign control group, we
proposed that a high cytokine production might promote the aggressiveness of the tumor.
In conclusion, we believe that MΦ in cHL promote immune evasion and show some aspects
of MΦ-2 polarization. Mature DC, which may at least partially be induced by TNFα, in
contrast, might participate in antitumor immunity.
Inhaltsverzeichnis
Seite 9
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ............................................................................................................
5
Zusammenfassung 1 ...........................................................................................................
5
Zusammenfassung 2 ...........................................................................................................
6
Summary ...........................................................................................................................
7
Summary 1 .........................................................................................................................
7
Summary 2 .........................................................................................................................
8
Inhaltsverzeichnis .............................................................................................................
9
Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 14
Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... 16
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................... 17
1
Einleitung .......................................................................................................... 22
1.1
Humane Herpesviren .......................................................................................... 22
1.2
Epstein-Barr Virus (EBV) ................................................................................... 24
1.2.1
Infektion mit EBV .............................................................................................. 24
1.2.2
EBV Genom und Latenzen ................................................................................ 25
1.2.3
EBV Replikation ................................................................................................ 28
1.2.4
Latente EBV Genprodukte ................................................................................. 29
1.2.4.1
EBV-encoded RNA (EBER)1 und EBER2 ......................................................... 29
1.2.4.2
EBV nuclear antigen (EBNA)1, EBNA2, EBNA3 und EBNA-LP ................... 29
1.2.4.3
Latent membrane protein (LMP)1 und LMP2 ................................................... 31
1.2.4.3.1 Die Rolle von LMP1 in der Zelltransformation ................................................. 32
1.2.4.3.2 LMP1 Struktur und Signaltransduktion ............................................................. 32
1.2.4.3.3 Immunmodulatorische Funktionen von LMP1 .................................................. 36
Inhaltsverzeichnis
Seite 10
1.2.4.3.4 LMP2 .................................................................................................................. 36
1.2.4.4
Weitere latente Genprodukte .............................................................................. 37
1.3
EBV-assoziierte Erkrankungen .......................................................................... 38
1.3.1
Das Nasopharynxkarzinom (NPC) ..................................................................... 39
1.3.1.1
Klassifikation, Epidemiologie und Ätiologie des NPC ...................................... 39
1.3.1.2
Die Rolle von EBV bei der Karzinogenese des NPC.......................................... 42
1.3.2
Das klassische Hodgkin Lymphom (cHL) ......................................................... 43
1.3.2.1
Epidemiologie und Ätiologie des (c)HL ............................................................ 45
1.3.2.2
Die Zusammensetzung und Rolle des inflammatorischen Begleitinfiltrats
im cHL ................................................................................................................ 47
1.4.
Immunevasionsmechanismen ............................................................................. 49
1.4.1
Immunevasionsmechanismen im NPC ............................................................... 49
1.4.1.1
Die Rolle des EBV in der Immunevasion des NPC ........................................... 49
1.4.1.2
Die HLA Klasse I Antigenpräsentationsmaschinerie (APM) in der
Immunevasion .................................................................................................... 50
1.4.2
Immunevasionsmechanismen im cHL ............................................................... 52
1.4.2.1
Dendritische Zellen (DC) und ihre Rolle in der Immunevasion ........................ 52
1.4.2.2
Makrophagen (MΦ) und ihre Rolle in der Immunevasion ................................. 54
1.5
Zielsetzung ......................................................................................................... 58
1.5.1
c-Myc und EBV-kodiertes LMP1 als potentiell gegensätzlich wirkende
Regulatoren der HLA Klasse I APM in epithelialen Zellen .............................. 58
1.5.2
MΦ und reife DC als Akteure in der Immunreaktion des cHL .......................... 58
2
Material und Methoden ................................................................................... 59
2.1
Hodgkin-Lymphom-Gewebe und Zellkultur ..................................................... 59
2.1.1
Hodgkin-Lymphom-Gewebe ............................................................................. 59
2.1.2
Kultivierung von Zellen ..................................................................................... 59
2.1.3
Generieren von Überständen .............................................................................. 63
2.1.4
Zytospins und Immunzytochemie ...................................................................... 63
2.1.5
Fotodokumentation von Zellkultur und Immunhistologien ............................... 63
2.2
Analysen auf RNS/DNS-Ebene ......................................................................... 64
2.2.1
Transiente reverse Transfektion von RHEK1 Zellen ......................................... 64
Inhaltsverzeichnis
Seite 11
2.2.2
SYBR-Green basierte qRT-PCR ........................................................................ 65
2.2.3
qRT-PCR mit Taqman Sonden .......................................................................... 70
2.2.4
c-myc-Knockdown ............................................................................................. 72
2.3
Analysen auf Proteinebene ................................................................................. 73
2.3.1
ELISA ................................................................................................................. 73
2.3.2
Generieren von Proteinlysaten für Western Blot Analysen ............................... 77
2.3.3
Intrazelluläre Fraktionierung .............................................................................. 78
2.3.4
Determinierung des Proteingehaltes mittels BCA Assay ................................... 78
2.3.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................................. 79
2.3.6
Western Blot ....................................................................................................... 80
2.3.7
Durchflusszytometrische Analysen .................................................................... 82
2.4
Neutralisierung von TNFα ................................................................................. 83
2.5
CCR7 Färbung und Chemotaxis Assay .............................................................. 84
2.5.1
CCR7 Färbung .................................................................................................... 84
2.5.2
Chemotaxis Assay .............................................................................................. 84
2.6
Analysen zum Proliferationsverhalten einer cHL-Zelllinie ............................... 85
2.6.1
CFSE Assay ........................................................................................................ 85
2.6.2
BrdU Assay ........................................................................................................ 86
2.6.3
Analyse der BAFF und APRIL Sekretion in der Kokultur von MΦ und
L1236 ................................................................................................................. 87
2.7
Statistische Auswertung ..................................................................................... 88
2.7.1
Vergleich der Mittelwerte/mittleren Ränge ........................................................ 88
2.7.2
Kaplan-Meier-Analysen ..................................................................................... 88
3
Ergebnisse ......................................................................................................... 90
3.1
EBV-kodiertes LMP1 und die HLA Klasse I APM in Epithelien ..................... 90
3.1.1
Effekt von EBV-kodiertem LMP1 auf die Expression von Komponenten
der HLA Klasse I APM ...................................................................................... 90
3.1.2
Effekt von EBV-kodiertem LMP1 auf die Expression von c-Myc .................... 91
3.1.3
Einfluss von c-Myc auf die Expression der HLA Klasse I APM ....................... 92
Inhaltsverzeichnis
Seite 12
3.1.4
Einfluss von c-Myc auf die von EBV-kodiertem LMP1 induzierte
Hochregulation der HLA Klasse I APM ............................................................ 94
3.1.5
Die Rolle von IL6 und STAT3 bei der Regulation von c-Myc durch
EBV-kodiertes LMP1 ......................................................................................... 96
3.2
Die Rolle von DC und MΦ bei der Immunevasion und antitumoralen
Immunität des cHL ............................................................................................. 98
3.2.1
Charakterisierung der Verteilung von DC und MΦ in cHL Gewebe ................. 98
3.2.2
Prognostischer Einfluss von DC und MΦ auf den klinischen Verlauf von
cHL Patienten ..................................................................................................... 101
3.2.3
Analyse des Zytokinprofils mittels qRT-PCR in cHL Gewebe ......................... 102
3.2.4
Etablierung des Zellkulturmodelles zur Generierung von (mo)DC aus
peripheren Blutmonozyten und MΦ ................................................................... 104
3.2.5
Einfluss von Zytokinen und Überständen von cHL-Zelllinien auf die
Reifung von moDC ............................................................................................ 107
3.2.6
Hemmung der Reifung von moDC durch Inhibition von TNFα ....................... 110
3.2.7
Analyse der chemotaktischen Wirkung von Überständen einer cHL
Zelllinie auf die Migration von moDC ............................................................... 111
3.2.8
Einfluss von Überständen von cHL-Zelllinien und Chemokinen auf die
Polarisation von MΦ .......................................................................................... 112
3.2.9
Regulation der Proliferationsaktivität einer cHL-Zelllinie durch moDC
und MΦ .............................................................................................................. 115
3.2.10
Analyse der BAFF und APRIL Sekretion in Kokultur von MΦ und einer
cHL-Zelllinie ...................................................................................................... 117
4
Diskussion ......................................................................................................... 118
4.1
Regulation der HLA Klasse I APM durch EBV-kodiertes LMP1 ..................... 118
4.1.1
c-Myc und EBV-kodiertes LMP1: gegensätzlich wirkende Regulatoren
der HLA Klasse I APM in epithelialen Zellen ................................................... 118
4.1.2
Expression der HLA Klasse I APM und von c-Myc im EBV-assoziierten
NPC .................................................................................................................... 120
4.1.3
Fazit .................................................................................................................... 122
4.2
MΦ und DC im inflammatorischen Begleitinfiltrat des HL .............................. 124
4.2.1
Charakterisierung des DC und MФ Infiltrates in HL ......................................... 124
4.2.1.1
Verteilung und Reifungszustand von DC im inflammatorischen Infiltrat
des cHL .............................................................................................................. 124
Inhaltsverzeichnis
Seite 13
4.2.1.2
Polarisation von MΦ im Infiltrat des cHL ......................................................... 126
4.2.1.3
Prognostische Relevanz von DC und MΦ im cHL ............................................ 126
4.2.1.4
Verteilung von MФ und DC im cHL in Abhängigkeit von dem EBVStatus und Vergleich mit dem nlpHL ................................................................. 128
4.2.1.5
Analyse des Zytokinprofils von cHL Gewebe ................................................... 129
4.2.2
Zellkulturanalyse zur Interaktion von cHL-Zelllinien mit DC und MФ ............ 130
4.2.2.1
Zellkulturmodell ................................................................................................. 130
4.2.2.2
Reifungsverhalten von moDC nach Stimulation mit cHL Überständen ............ 130
4.2.2.3
Polarisationsverhalten von MΦ nach Stimulation mit cHL Überständen .......... 131
4.2.2.4
Einfluss von moDC, MΦ-1 und MΦ-2 auf das Proliferationsverhalten einer
cHL-Zelllinie ...................................................................................................... 132
4.2.3
Fazit .................................................................................................................... 133
5
Literatur ............................................................................................................ 134
6
Anhang .............................................................................................................. 161
Abbildungsverzeichnis
Seite 14
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1
Das Epstein Barr Virus .................................................................................... 26
Abb. 1.2
Struktureller Aufbau von LMP1 ...................................................................... 33
Abb. 1.3
Signaltransduktion durch LMP1 ..................................................................... 34
Abb. 1.4
Das undifferenzierte Nasopharynxkarzinom ................................................... 40
Abb. 1.5
Modell der sequentiellen Karzinogenese des NPC ......................................... 43
Abb. 1.6
Das klassische Hodgkin Lymphom ................................................................. 44
Abb. 1.7
Das entzündliche Infiltrat im cHL ................................................................... 48
Abb. 1.8
Die HLA Klasse I Antigenpräsentationsmaschinerie ...................................... 51
Abb. 1.9
Modell der Polarisation von MΦ ..................................................................... 56
Abb. 1.10 Wirkmechansimen tumor-assoziierter Makrophagen ...................................... 57
Abb. 2.1
Ficoll Dichtegradienten-Zentrifugation ........................................................... 61
Abb. 2.2
Spezifische Schmelzkurven aller verwendeten Primer bei einer
Konzentration von 250 nM .............................................................................. 68
Abb. 2.3
Durchflusszytometrische Messung zum Chemotaxis Assay ........................... 85
Abb. 2.4
Prinzip der Messung des Proliferationsverhaltens mittels CFSE Assay ......... 86
Abb. 3.1
Hochregulation der HLA Klasse I APM Komponenten in stabil mit
EBV-kodiertem LMP1 transfizierten epithelialen Zelllinien .......................... 90
Abb. 3.2
Hochregulation von c-Myc in stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten
epithelialen Zelllinien ...................................................................................... 92
Abb. 3.3
c-Myc inhibiert die Expression von Komponenten der HLA Klasse I APM
in epithelialen Zellen ....................................................................................... 93
Abb. 3.4
c-myc inhibiert die EBV-kodiertes LMP1-abhängige Induktion der HLA
Klasse I APM Komponenten ........................................................................... 95
Abb. 3.5
EBV-kodiertes LMP1 induziert die STAT3 und IL6 Signaltransduktion ....... 96
Abb. 3.6
Immunohistochemische Färbungen von cHL Biopsien .................................. 99
Abb. 3.7
Verteilung von unreifen und reifen mDC, pDC, MΦ und MΦ-2 in (EBVnegativen/-positiven) cHL und nlpHL ............................................................. 100
Abb. 3.8
Einfluss von CD83- und CD163-positiven Zellen auf die Prognose des cHL 101
Abb. 3.9
Zytokinexpression in cHL Biopsien ................................................................ 103
Abb. 3.10 Generierung von moDC, proinflammatorischen MΦ-1 und
antiinflammatorischen MΦ-2 .......................................................................... 105
Abb. 3.11 Expression von Zytokinen und Chemokinen in moDC, MΦ-1, MΦ-2 und
den cHL-Zelllinien L1236 und HDLM2 ......................................................... 106
Abbildungsverzeichnis
Seite 15
Abb. 3.12 Charakterisierung der Reifung von moDC nach Stimulation mit Zytokinen,
L1236 und HDLM2 Überständen und Chemokinen ....................................... 108
Abb. 3.13 Analyse der Reifung von moDC nach Stimulation mit cHL Überständen
und Neutralisierung von TNFα ........................................................................ 110
Abb. 3.14 Chemotaktisches Verhalten von moDC nach Stimulation mit L1236
Überständen ..................................................................................................... 111
Abb. 3.15 Charakterisierung der Expression von Polarisationsmarkern auf MΦ nach
Stimulation mit L1236 und HDLM2 Überständen und Chemokinen ............. 113
Abb. 3.16 Analyse des Effekts von moDC, MΦ-1 und MΦ-2 auf die Proliferation
von L1236 Zellen ............................................................................................ 116
Abb. 3.17 Analyse der Sekretion von BAFF und APRIL in der Kokultur von MΦ
und L1236 ........................................................................................................ 117
Tabellenverzeichnis
Seite 16
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1
Auflistung humanpathogener Herpesviren ...................................................... 23
Tab. 1.2
EBV Latenzprogramme in EBV-assoziierten Erkrankungen .......................... 27
Tab. 2.1
Primer für SYBR-Green basierte qRT-PCR ................................................... 66
Tab. 2.2
Taqman Sonden ............................................................................................... 71
Tab. 2.3
Zellzahlen für den c-myc-Knockdown ............................................................ 73
Tab. 2.4
Antikörper für Western Blot Analysen ........................................................... 81
Tab. 2.5
Antikörper für durchflusszytometrische Analysen .......................................... 83
Tab. 3.1
Übersicht über die klinischen Daten der Patienten mit HL ............................. 98
Abkürzungsverzeichnis
Seite 17
Abkürzungsverzeichnis
A
Ampere
Abb.
Abbildung
AP
activator protein
APM
Antigenpräsentationsmaschinerie
APRIL
a proliferation inducing ligand
APS
Ammoniumpersulfat
BCA
Bicinchoninsäure
BL
Burkitt-Lymphom
BAFF
B cell activating factor of the TNF family
BARF
BamHI A fragment rightward open reading frame
BART
BamHI A rightward transcript
Bcl
B-cell lymphoma
BCR
B-Zell Rezeptor
BCRF
BamHI C fragment rightward open reading frame
BHRF
BamHI fragment H rightward open reading frame
β2-m
β2-Mikroglobulin
bp
Basenpaare
BrdU
Bromdesoxyuridin
BSA
bovines Serumalbumin
BZLF
BamHI Z fragment leftward open reading frame
cHL
klassisches Hodgkin-Lymphom
°C
Grad Celsius
CD
cluster of differentiation
cDNS
komplementäre DNS
CFSE
carboxyfluorescein succinimidyl ester
COX
Cyclooxygenase
c
zenti-
CTAR
C-terminal acitvating region
CTL
cytotoxic T lymphocytes
Da
Dalton
DC
dendritische Zellen
DNS/DNA
Desoxyribonukleinsäure
Abkürzungsverzeichnis
Seite 18
dNTP
2`-Desoxynukleosid-5`-Triphosphat
EBER
EBV-encoded RNA
EBV
Epstein-Barr Virus
EBNA
EBV nuclear antigen
EBNA-LP
EBV nuclear antigen leader protein
ECL
enhanced chemiluminscence
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGF(R)
epidermal growth factor receptor
ELC
Epstein-Barr virus-induced molecule 1 ligand chemokine
ELISA
enzyme linked immunosorbent assays
ER
endoplasmatisches Retikulum
ERK
extracellular-signal regulated kinase
et al
et alii (und andere)
FACS
fluorescence activated cell sorting
FBS
foetal bovine serum
FFPE
Formalin fixierte und in Paraffin eigebettet
FGF
fibroblast growth factor
FI
Fluoreszenzintensität
g
Gramm
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GM-CSF
granulocyte macrophage colony-stimulating factor
h
Stunde
HCMV
humanes Zytomegalovirus
HEPES
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HHV
humanes Herpesvirus
HIF
Hypoxie-induzierter Faktor
HL
Hodgkin-Lymphom
HLA
human leukocyte antigen
HRP
horse-radish peroxidase
HRS
Hodgkin und Reed-Sternberg
HSV
Herpes-simplex Virus
IARC
International Agency for Research on Cancer
ICAM
intercellular adhesion molecule
ICTV
International Committee on Taxonomy of Viruses
Abkürzungsverzeichnis
Seite 19
IE
internationale Einheiten
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IM
infektiöse Mononukleose
JAK
Janus Kinase
JNK
c-Jun N-terminale Kinase
k
Kilo
KSHV
Kaposi-Sarkoma-assoziiertes Herpesvirus
l
Liter
LCL
lymphoblastoid cell line
ldHL
lymphozytenarmes HL
LFA
leukocyte function-associated antigen
LMP (EBV)
latent membrane protein
LMP (Proteasom)
low molecular weight protein
LPS
Lipopolysaccharid
LP-Zellen
lymphozyten-prädominante Zellen
lrHL
lymphozytenreiches HL
m
milli
m
Meter
M
molar
µ
mikro
MΦ
Makrophagen
MAPK
mitogen-activated protein kinase
mcHL
gemischtzelliges HL
M-CSF
Monozytenkolonien-stimulierender Faktor
MDC
macrophage derived chemokine
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
MHC
major histocompatibility complex
MHC-HC
MHC schwere Kette
Milli-Q H2O
ultrareines Millipore-Wasser
min
Minute
MIP
macrophage inflammatory protein
MMP
Matrix Metalloproteinase
Abkürzungsverzeichnis
Seite 20
moDC
monocyte-derived DC
mRNS
messenger RNS
n
nano
nm
Nanometer
NFκB
nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
nlpHL
nodulär Lymphozyten-prädominantes HL
Notch
Notch homolog, translocation-associated (Drosophila)
NPC
Nasopharynxkarzinom
nsHL
nodulär-sklerosierendes HL
OHL
orale Haarleukoplakie
Ori
origin of replication
p
piko
PBMC
peripheral blood mononuclear cell
PBS
phosphate buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
pDC
plasmazytoide DC
PDI
protein disulfide isomerase
PFA
Paraformaldehyd
PGE2
Prostaglandin-E2
PI3K
Phosphatidylinositol-3-Kinase
PKB/C
Proteinkinase B/C
PLC
Peptid-Beladungskomplex
PMSF
Phenylmethansulfonylfluorid
PTLD
post-transplant lymphoproliferative disorder
PTx
Pertussis Toxin
qRT-PCR
real-time PCR
RANTES
regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
RBP
recombining binding protein suppressor of hairless
RIP
receptor interacting protein kinase
RNS/RNA
Ribonukleinsäure
rpm
revolutions per minute
RPMI
Rosewell-Park-Memorial-Institute
RT-PCR
reverse Transkriptase PCR
SD
Standardabweichung
Abkürzungsverzeichnis
Seite 21
SDS
sodium dodecyl sulfate
sec
Sekunde
SEM
standard error of the mean
siRNA
small interfering RNA
SLC
secondary lymphoid-tissue chemokine
STAT
signal transducers and activators of transcription
Tab.
Tabelle
TAM
Tumor-assoziierte MΦ
TAP
transporter associated with antigen processing
TARC
thymus and activation induced chemokine
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TGFβ
transforming growth factor β
TH
T-Helferzelle
TNF(R)
tumor necrosis factor (receptor)
TR
terminal repeat
TRADD
TNFR-associated death domain
TRAF
TNFR-associated factor
Treg Zellen
regulatorische T-Zellen
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
tRNS
transfer RNS
Tween 20
Poly(oxyethylen)n-Sorbitan-Monolaurat
U
units (Einheit)
ÜS
Überstand
V
Volt
VEGF
vascular endothelial growth factor
WHO
World Health Organization
VZV
Varicella-Zoster Virus
z.B.
zum Beispiel
1 Einleitung
Seite 22
1 Einleitung
1.1 Humane Herpesviren
Das International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) hat im Jahr 2009 die
Taxonomie für Herpesviren aktualisiert. Seitdem gilt die neue Ordnung der Herpesvirales, die
drei
Familien
einschließt,
Herpesviridae
(Säugetier-,
Vogel-
und
Reptil-Viren),
Alloherpesviridae (Fisch- und Frosch-Viren) und Malacoherpesviridae (Muschel-Viren)
(Davison et al, 2009). Aufgrund ihres Genoms und ihrer Morphologie zählen Herpesviren zu
den größten und komplexesten ihrer Art. Morphologisch zeichnen sich Herpesviren durch ihre
lineare, doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (DNS) mit bis zu 290 kbp aus, die von einer
ikosaedrischen Proteinhülle, dem Kapsid, einer proteinhaltigen Matrix, dem Tegument und
einer Lipidmembran, der Virushülle (Envelope), in die sogenannte Glykoprotein-Spikes
eingelagert sind, umgeben ist.
Herpesviren weisen im Wesentlichen vier gemeinsame biologische Merkmale auf (Kieff &
Rickinson, 2001): (1) Alle Herpesviren stellen ein breites Repertoire an Enzymen bereit, die
nicht nur dem eigenen Metabolismus und der Synthese von Virusbausteinen dienen, sondern
auch als Angriffspunkt für moderne antivirale Therapien genutzt werden können. (2) Die
Synthese und der Zusammenbau der viralen DNS sowie des Kapsids erfolgen im Nukleus der
befallenen Zelle. Die Umhüllung mit der Zellkernmembran zur Bildung der Virushülle
entsteht bei dem Austritt aus dem Zellkern. (3) Die Neubildung und Freisetzung der Viren
geht immer mit der unmittelbaren Zerstörung der Wirtszelle einher. (4) Schlussendlich
besitzen Herpesviren die Fähigkeit eine lebenslange latente Persistenz im Wirt zu etablieren,
aus der sie wieder in den lytischen Zyklus zur Virusreplikation übergehen können.
Obwohl über 100 verschiedene Herpesviren bekannt sind, wurden nur 9 humanpathogene
Viren isoliert (Tabelle 1.1): Herpes-simplex Virus 1/humanes Herpesvirus 1 (HSV1/HHV1)
und
2
(HSV2/HHV2),
Varicella-Zoster
Virus
(VZV/HHV3),
Epstein-Barr
Virus
(EBV/HHV4), humanes Zytomegalovirus (HCMV/HHV5), humane Herpesviren 6A, -6B und
-7 (HHV6A, -6B, -7) und Kaposi-Sarkoma-assoziiertes Herpesvirus (KSHV/HHV8).
Die Familie der Herpesviridae wurde von der ICTV aufgrund ihrer spezifischen
Eigenschaften in drei Subfamilien eingeteilt. Alphaherpesvirinae haben einen sehr kurzen
Replikationszyklus. Sie zerstören die Wirtszelle und replizieren in vielen verschiedenen
1 Einleitung
Humanpathogene
Seite 23
Subfamilie
Ort der Latenz
Assoziierte Viruserkrankung
Neurone
Herpes labialis, Herpes genitalis,
Herpesviren
(Herpesviridae)
HHV1 (HSV1)
α
Stomatitis aphtosa
HHV2 (HSV2)
α
Neurone
Herpes genitalis
HHV3 (VZV)
α
Neurone
Windpocken, Gürtelrose
HHV4 (EBV)
γ
B-Zellen
Infektiöse Mononukleose, Hodgkin
Lymphom,
Burkitt-Lymphom, PTLD,
Nasopharynxkarzinom etc.
HHV5 (HCMV)
β
Monozyten
CMV-Pneumonie, CMV-Sialoadenitis,
Lymphozyten
CMV-Retinitis u.a.
HHV6A
β
T-Zellen und ?
?
HHV6B
β
T-Zellen und ?
Drei-Tage-Fieber
HHV7
β
T-Zellen und ?
Drei-Tag-Fieber, Pityriasis rosea
HHV8 (KSHV)
γ
B-Zellen
Kaposi-Sarkom, Lymphome
PTLD: Post-transplant lymphoproliferative disorder
Tab. 1.1 Auflistung humanpathogener Herpesviren
Wirtsgeweben, neigen aber vor allem zur Replikation in sensorischen Neuronen, in denen
auch die latente Infektion etabliert wird. Zu den Alphaherpesviren gehören HSV1, HSV2 und
VZV. Betaherpesvirinae infizieren nur eine begrenzte Anzahl an Wirten und weisen einen
lang dauernden Reproduktionszyklus auf. Die Infektion geht oft mit der Entstehung großer,
mehrkerniger Zellen einher. Eine latente Infektion findet zumeist in Monozyten und
Lymphozyten, vor allem T-Zellen, statt. Auch weitere Zelltypen können befallen sein, jedoch
ist das Spektrum dieser weiteren Latenzorte nicht abschließend geklärt. Zu den
Betaherpesviren zählen HCMV, HHV6 und HHV7. Gammaherpesvirinae infizieren eine sehr
limitierte Auswahl von Wirten und sind lymphotrop, wobei z.B. das Gammaherpesvirus EBV
einen dualen Gewebetropismus aufweist. Einerseits findet die primäre Infektion und
Replikation im respiratorischen und oropharyngealen Epithel statt, andererseits wird die
latente Infektion nach dem Eindringen in den Wirt in B-Zellen etabliert. Gammaherpesviren
werden weiterhin in 2 Genera eingestuft. EBV gehört zu den Lymphokryptoviren (γ-1-
1 Einleitung
Seite 24
Herpesviren), wohingegen das Gammaherpesvirus KSHV als Rhadinovirus (γ-2-Herpesvirus)
eingestuft wird. Sowohl EBV als auch das KSHV weisen onkogenes Potential auf und tragen
zur Pathogenese einiger Lymphome und Karzinome bei (Tab. 1.1). Aufgrund dieser
Eigenschaft wurde EBV 1997 von der International Agency for Research on Cancer (IARC),
einer Behörde der World Health Organization (WHO), als Karzinogen der Gruppe 1
eingestuft.
In dieser Doktorarbeit wird der Schwerpunkt auf immunologische Evasionsmechanismen von
EBV-assoziierten Tumoren gelegt.
1.2 Epstein-Barr Virus (EBV)
Das Epstein-Barr Virus wurde 1964 als erstes humanes Tumorvirus von seinen
Namensgebern Anthony Epstein und Yvonne Barr entdeckt und ein Jahr später aus einer
Burkitt-Lymphom (BL) Zelllinie isoliert (Epstein et al, 1964; Epstein et al, 1965). Dies
geschah im Rahmen der Erforschung des BL, erstmals beschrieben von Denis Burkitt im
Jahre 1958 (Burkitt, 1962). Der Forschergruppe um Anthony Epstein gelang es schließlich die
BL-Zellen
zu
kultivieren
und
Herpesviruspartikel
mittels
Elektronenmikroskopie
nachzuweisen (Epstein & Barr, 1964). Vier Jahre nach seiner Entdeckung wurde das EBV als
Auslöser der infektiösen Mononukleose identifiziert (IM) (Henle et al, 1968). Später wurde
gezeigt, dass über 90% der Bevölkerung eine persistente Infektion mit dem Virus aufweisen
(Liao, 2006). Obwohl das EBV in den meisten Fällen eine asymptomatische Infektion
verursacht, wurde sein transformierendes Potential durch seine Fähigkeit B-Zellen zu
immortalisieren klar und es wurde zum ersten humanen Tumorvirus erklärt (Henle et al,
1967; Pope et al, 1968).
1.2.1 Infektion mit EBV
Die primäre Infektion mit EBV findet zumeist in der frühen Kindheit statt und verläuft in der
Regel asymptomatisch. In den Industrienationen kommt es häufig zu einer späten primären
Infektion im frühen Erwachsenenalter, wobei sich diese dann als IM, auch sogenanntes
Pfeiffersches Drüsenfieber, manifestieren kann (Henle et al, 1968). Hierbei handelt es sich
um ein akutes Krankheitsbild, bei dem es zu einer massiven Expansion von infizierten B-
1 Einleitung
Seite 25
Zellen kommt. Die Übertragung der Viren findet über infizierten Speichel statt, weshalb auch
der Name kissing-disease geprägt wurde. Das lymphoepitheliale Gewebe der Mundhöhle
dient dem Virus als Eintrittspforte. Dieses wandert mutmaßlich über das Oberflächenepithel
zu den reichlich vorhandenen B-Zellen. Die Infektion von B-Zellen erfolgt über das virale
Glykoprotein gp350, das den CD21 B-Zell-Rezeptor und über gp42, das human leukocyte
antigen (HLA) Klasse II Moleküle bindet (Borza & Hutt-Fletcher, 2002; Nemerow et al,
1987). Das Virion wird darauf über Endozytose in die B-Zelle aufgenommen. Infizierte BZellen wandern dann in die Follikel des lymphatischen Gewebes und vermehren sich in der
Keimzentrumsreaktion. Es folgt zur Umgehung der virusspezifischen Immunität eine
Herunterregulation immunogener EBV Proteine und es kommt daraufhin zur Etablierung
einer lebenslangen und asymptomatischen Viruspersistenz im Zellkern von Gedächtnis-BZellen. In gesunden Trägern sind etwa 1-50 von 106 B-Zellen latent infiziert (Miyashita et al,
1995). Eine Infektion anderer Zellarten, besonders von Epithelzellen, kommt zwar vor, ist
aber viel weniger effizient als in B-Zellen. In periodischen Abständen erfolgt eine lytische
Reaktivierung von EBV, vor allem in den Schleimhäuten der Mundhöhle, was die erneute
Freisetzung des Virus ermöglicht. Die lebenslängliche Viruspersistenz findet im Allgemeinen
in einer harmonischen Wirt-Virus Koexistenz in immunkompetenten Individuen statt.
Allerdings konnte auch eine Assoziation des EBV mit einigen malignen Neoplasien
beobachtet werden. Hierzu gehören das BL, das klassische Hodgkin-Lymphom (cHL), das
Nasopharynxkarzinom (NPC) etc. (Tab. 1.1) (Kutok & Wang, 2006; Young & Rickinson,
2004).
1.2.2 EBV Genom und Latenzen
Das EBV besitzt wie alle anderen Herpesviren eine doppelsträngige lineare DNS mit einer
Größe von ca. 172 kbp, die von einem Kapsid, dem Tegument und der Virushülle umgeben ist
(Abb. 1.1 A). Das Virusgenom des häufig als Prototyp fungierenden EBV-Stammes B95-8
wurde aus Patienten mit IM isoliert, in Marmosette Lymphozyten passagiert und als erstes
Herpesvirusgenom vollständig kloniert und sequenziert (Baer et al, 1984). Der Sequenzierung
lag eine Bibliothek bestehend aus Fragmenten, die durch den Verdau der Virus-DNS mit dem
Restriktionsenzym BamHI generiert wurden, zugrunde. Nach diesen Fragmenten wurden die
mehr als 100 offenen Leseraster (Open reading frames, ORF) und Gene benannt und nach
absteigender Fragmentgröße und Ableserichtung alphabetisch benannt, z.B. kann der Name
1 Einleitung
Seite 26
des Genproduktes BZLF1 so hergeleitet werden, dass es sich um ein BamHI Fragment des Z
Abschnittes des linksgerichteten ORF1 handelt (BamHI Z fragment leftward open reading
frame 1). Die lineare EBV DNS zirkularisiert nach der Infektion und liegt im Zellkern der
Wirtszelle als Episom, d.h. als Ringchromosom, neben der Wirts-DNS vor. Allerdings wurde
in NPC Biopsien auch eine Integration des EBV Genoms in das Wirtszellgenom beobachtet,
was jedoch selten vorkommt (Kripalani-Joshi & Law, 1994). Das zirkuläre EBV Episom mit
den darauf kodierten latenten Virusgenen ist in Abb 1.1 B dargestellt (Young & Rickinson,
2004). Zu den latenten EBV-Genen gehören die sechs nukleären Antigene (EBV nuclear
antigen; EBNA1, EBNA2, EBNA3A, 3B, 3C und EBNA leader protein (-LP)), die drei
latenten Membranproteine (latent membrane protein; LMP1, LMP2A und LMP2B) und die
kleinen EBV-kodierten RNS (EBV-encoded RNA; EBER1 und EBER2). Die Fusion des
linearen DNS-Doppelstrangs zum Ringchromosom erfolgt durch die terminal repeat
Regionen (TR), die jeweils an den Enden der DNS lokalisiert sind. In der Nähe des TR ist der
origin of viral replication (Ori) P gelegen (grün), von dem aus die Replikation des Episoms
beginnt. Wenn sich das Virus in dem latenten Replikationszyklus befindet, können
verschiedene Latenzprogramme angeschaltet werden.
A
B
Abb. 1.1 Das Epstein-Barr Virus. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme des EBV Virions. (B) Das
Diagramm zeigt die Lokalisation und Transkriptionsrichtung der EBV latenten Gene auf dem doppelsträngigen
viralen DNS Episom. Die dicken schwarz-blauen Pfeile zeigen die Exons, die für die latenten Gene kodieren und
die Richtung der Gentranskription. Der lange äußere blaue Pfeil repräsentiert die EBV Transkription während
der Latenz III, in der alle EBNAs ausgehend von dem Cp oder Wp Promotor transkribiert werden, während der
innere rote Pfeil die EBV Transkription während der Latenz I und II ausgehend von dem Promotor Qp
repräsentiert. Übernommen aus Young & Rickinson, 2004. (Anmerkung: Für alle in dieser Arbeit zitierten
Abbildungen wurden Lizenzen erworben.)
1 Einleitung
Seite 27
Basierend auf Beobachtungen verschiedener EBV-positiver Zelllinien und einiger EBVassoziierter maligner Neoplasien wurden vier Latenzprogramme definiert, in denen
unterschiedliche Genkonstellationen exprimiert sind. Das Genexpressionsmuster hängt von
der jeweiligen Aktivität der in Abb. 1.1 dargestellten Promotoren ab, die durch
wirtszellspezifische Einflüsse moduliert werden kann. Außerdem scheint die Kombination
latenter EBV Gene Voraussetzung für eine Immortalisierung der befallenen Zellen zu sein.
LMP1 ist das einzige latente Gen, für das in Rattenfibroblasten eine eigenständige
immortalisierende Wirkung gezeigt werden konnte (Wang et al, 1985). Keines der anderen
latenten Gene ist alleine in der Lage Wirtszellen zu immortalisieren. In Tab. 1.2 sind die
verschiedenen
Latenzprogramme
zusammengefasst.
Die
Latenz
0
(oder
auch
asymptomatische Persistenz) wird in zirkulierenden Gedächtnis-B-Zellen von gesunden
Trägern beobachtet. Hierbei wird die Expression der EBERs und gelegentlich von LMP2A
beobachtet. Kommt es zu einer gelegentlichen Teilung dieser Wirtszellen, wird die Latenz I
mit der Expression von EBNA1 initiiert, wie sie im BL vorkommt. Die EBV-assoziierten
Malignome cHL und NPC, die Thema der Doktorarbeit sind, weisen eine Latenz II auf. Hier
werden alle latenten Genprodukte mit Ausnahme von EBNA2, EBNA3 und EBNA-LP
exprimiert. Lediglich in der Latenz III wird das komplette Spektrum der latenten Gene
abgeschrieben. Die durch die in vitro Infektion von B-Zellen mit EBV induzierbaren
immortalisierten lymphoblastoiden Zelllinien (lymphoblastoid cell line; LCL), wie auch die in
vivo infizierten B-Zellen der IM und der post-transplant lymphoproliferative disorders
(PTLD) werden durch die in der Latenz III exprimierten viralen Genprodukte zur
Proliferation angeregt. Die Wirtszellen, in denen eine andere Latenzform vorliegt, erfahren
dahingegen keine zusätzlichen EBV-abhängigen Proliferationssignale (Middeldorp et al,
2003; Niedobitek et al, 2001). Bei der Einteilung der viralen Genexpressionsmuster in
verschiedene Latenzformen sollte jedoch berücksichtigt werden, dass es sich hier um ein
Latenz EBERs
0
I
II
III
+
+
+
+
EBNA-1
+/+
+
+
EBNA2
EBNA3
EBNA-LP
+
LMP1 LMP2A LMP2B EBV-assoziierte
Erkrankung
+
+
+
+
+
+
+
Gesunde Träger
BL
cHL, NPC
IM, PTLD, LCL
LCL: lymphoblastoid cell line
Tab. 1.2 EBV Latenzprogramme in EBV-assoziierten Erkrankungen
1 Einleitung
Seite 28
vereinfachtes Modell handelt und dass die EBV-Genexpression im Wirt ein dynamischer
Prozess ist, bei dem sich das Virus an die wirtsspezifischen Gegebenheiten anpasst. So
wurden z.B. atypische Genexpressionsvarianten im BL entdeckt, was die Vorstellung einer
dynamischen Expression der latenten EBV Gene unterstützt (Kelly et al, 2002).
1.2.3 EBV Replikation
Das EBV weist in vivo und in vitro eine stabile latente Infektion auf, die jedoch in den
replikativen, lytischen Zyklus übergehen kann. Eine lytische Reaktivierung wird während der
Latenz durch die Expression von latenten Genen wie LMP1 und LMP2 inhibiert (Adler et al,
2002; Miller et al, 1994). Der Wechsel vom latenten zum lytischen Zyklus wird unter
anderem durch die Induktion der immediate early (unmittelbar frühen) EBV Genprodukte
initiiert. Eine Schlüsselrolle kommt hierbei dem unmittelbar frühen Genprodukt BamHI Z
fragment leftward open reading frame 1 (BZLF1) zu, welches notwendig und ausreichend für
die Induktion des lytischen Zyklus ist (Rooney et al, 1989). Die frühen (early) und späten
(late) lytischen Genprodukte werden dann zur Vervollständigung der Replikation des Virus
benötigt. Einige lytische Gene greifen in humane Signalwege der Wirtszelle ein, so z.B. das
BamHI A fragment rightward open reading frame 1 (BARF1)-Gen, das nach Transfektion in
der Lage ist Epithelzellen von Primaten zu immortalisieren und die Wachstumsrate der
transfizierten Zellen zu erhöhen (Wei et al, 1997). Das BamHI C fragment rightward open
reading frame 1 (BCRF1)-Gen besitzt eine 90%ige lineare Aminosäuresequenz-Identität zum
humanen IL10 (Moore et al, 1990) und stellt daher mit hoher Wahrscheinlichkeit durch seine
immunsuppressive Wirkung das Überleben von Viruspartikel-produzierenden Zellen in einer
feindlichen inflammatorischen Umgebung sicher. Ein weiteres Gen wäre das BamHI H
fragment rightward open reading frame 1 (BHRF1), das strukturelle und funktionelle
Ähnlichkeit zum humanen antiapoptotischen B-cell lymphoma 2 (bcl-2)-Gen aufweist und
wahrscheinlich auch zu einer Verlängerung des Überlebens von Viruspartikel-produzierenden
Zellen vor der Lyse führt (Henderson et al, 1993).
1 Einleitung
Seite 29
1.2.4 Latente EBV Genprodukte
1.2.4.1 EBV-encoded RNA (EBER)1 und EBER2
Unabhängig vom Phänotyp der Wirtszelle werden bei einer latenten EBV Infektion hohe
Mengen an EBV-encoded RNA (EBER)1 und 2 exprimiert (105-107 Kopien/Zelle). Es handelt
sich hierbei um kleine nicht-kodierende und nicht-polyadenylierte RNS, die eine stabile
Sekundärstruktur vorweisen mit extensiver intramolekularer Basenpaar- und damit auch
hairpin- Bildung, ähnlich den tRNS (Arrand & Rymo, 1982; Glickman et al, 1988; Howe &
Steitz, 1986). EBERs werden in allen Latenzformen exprimiert und dienen aus diesem Grund
als sensitivster Marker für die Detektion einer EBV Infektion. Obwohl EBERs nicht für die
EBV-Reaktivierung, Replikation, Freisetzung, Infektiosität, Genexpression oder die
Transformation von B-Zellen in vitro verantwortlich sind, wurde dennoch gezeigt, dass
EBER2 die Effektivität der Transformation durch die effiziente Induktion von Interleukin
(IL)6 ca. 100fach erhöhen kann (Wu et al, 2007). Werden EBERs in BL Zelllinien exprimiert,
induzieren diese Zellproliferation, Apoptoseresistenz und die Expression von Typ I
Interferonen (IFN) und IL10 (Kitagawa et al, 2000; Ruf et al, 2000; Samanta et al, 2006;
Samanta et al, 2008). EBERs können zudem in Epithelzellen des NPC zur Induktion des
autokrin wirkenden Wachstumsfaktors insulin-like growth factor (IGF-) 1 führen, was auf
einen transformierenden Effekt in diesen Zellen schließen lässt (Iwakiri et al, 2005). Zudem
wurde eine Resistenz gegenüber apoptotischem Stress in NPC Zelllinien gezeigt, in denen
EBERs exprimiert waren (Wong et al, 2005).
1.2.4.2 EBV nuclear antigen (EBNA)1, EBNA2, EBNA3 und EBNA-LP
Die Expression von EBNA1 wird in allen EBV infizierten Zellen, allen Latenzformen und
EBV-assoziierten Erkrankungen beobachtet. Sie kann von vier verschiedenen Promotoren
(Wp, Cp, Qp, Fp) initiiert werden und ist für die Aufrechterhaltung und Replikation des EBV
Episoms durch die Bindung und Aktivierung des OriP, von dem aus die Replikation des EBV
Genoms gestartet wird, zuständig (Kieff & Rickinson, 2001). Weiterhin ist EBNA1 ein
wichtiger viraler transkriptioneller Transaktivator, der an virale Promotoren binden und sie
aktivieren kann, wie z.B. den Cp- und LMP1-Promotor (Gahn & Sugden, 1995; Sugden &
Warren, 1989). EBNA1 ist ein nukleäres Protein bestehend aus einem basischen
Aminoterminus, einem Gly-Ala repeat-Segment, einem nuclear localization signal und einem
1 Einleitung
langen
hydrophoben
Seite 30
C-Terminus
mit
DNS-Bindungs-
und
Dimerisierungsaktivität
(Middeldorp et al, 2003). Das Gly-Ala repeat-Segment ist für die Funktion von EBNA1
entbehrlich, spielt aber eine wichtige Rolle in der Evasion vor der Immunreaktion des Wirts,
da es die Degradierung von EBNA1 im Proteasom inhibiert und dadurch die Prozessierung
und
anschließende
Präsentation
des
Proteins
durch
die
humanen
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex; MHC) Klasse I
Moleküle an zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T lymphocytes; CTL) verhindert (Levitskaya et
al, 1997). Aus diesem Grund können B-Zellen, welche ausschließlich EBNA1 exprimieren
schwer durch CTL erkannt und eliminiert werden. Hingegen kann EBNA1 eine CD4-positive
T- Helferzell (TH)-Immunantwort hervorrufen, deren Relevanz in vivo jedoch unklar ist
(Munz et al, 2000). Neben seinen Funktionen bei Aufrechterhaltung und Replikation des EBV
Genoms, wurde für EBNA1 außerdem onkogenes Potential nachgewiesen, welches allerdings
für die Transformation durch EBV nicht obligatorisch ist. Eine der ersten Studien, die EBNA1
mit der Transformation von Maus B-Zellen in Verbindung brachte, ist immer noch
Gegenstand kontroverser Diskussionen (Wilson et al, 1996). Während EBNA1 die
Rekombinations-aktivierenden Gene (RAG) 1 und 2 (Tsimbouri et al, 2002) sowie reaktive
Sauerstoffspezies induziert (Gruhne et al, 2009) und damit zu genomischer Instabilität oder
spezifischen Translokationen beitragen könnte, scheint es auf der anderen Seite keinen
Zusammenhang zwischen EBNA1 und der Entwicklung von Lymphomen in EBNA1
transgenen Mäusen zu geben (Kang et al, 2005). EBNA1 fördert das Wachstum und das
Überleben von cHL-Zelllinien (Flavell et al, 2008) und scheint in NPC Zelllinien ein potenter
transkriptioneller Regulator zu sein. So wurde gezeigt, dass EBNA1 nicht nur die
Signalkaskade des Wachstumsfaktors transforming growth factor β (TGFβ), sondern auch des
activator protein (AP)1 beeinflusst, was zur Karzinogenese des NPC beitragen könnte (O'Neil
et al, 2008; Wood et al, 2007).
EBNA2 ist ein Phosphoprotein, das zu den ersten postinfektiös detektierbaren latenten
Proteinen gehört und für die Transformation von B-Zellen unerlässlich ist (Cohen et al, 1989;
Hammerschmidt & Sugden, 1989). Die Rolle, die EBNA2 bei der Transformation spielt, ist
vor allem auf seine Fähigkeit der Transaktivierung von viralen und zellulären Genen
zurückzuführen. EBNA2 aktiviert nicht nur den viralen Promotor Cp und die Promotoren der
latenten Proteine LMP1 und LMP2, sondern auch zelluläre Gene wie CD21, signal
transducers and activators of transcription (STAT)3 und c-myc, die die Aktivierung und das
Wachstum von B-Zellen beeinflussen (Kieff & Rickinson, 2001). Ungewöhnlich ist, dass
1 Einleitung
Seite 31
EBNA2 nicht direkt an die zelluläre DNS bindet, sondern unter anderem mit dem
Transkriptionsfaktor recombining binding protein suppressor of hairless (RBP-Јκ) interagiert,
um die Promotoren der oben genannten Gene zu aktivieren (Grossman et al, 1994). Da RBPЈκ ein downstream Zielgen von Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila)
(Notch1) ist, wird EBNA2 partiell als ein konstitutiv aktives Homolog von Notch1 angesehen
(Hofelmayr et al, 2001). Notch1 kann jedoch LMP1 und c-myc nicht in dem Maße aktivieren,
wie EBNA2 (Kohlhof et al, 2009).
EBNA3 umfaßt die drei nukleären Phosphoproteine EBNA3A (EBNA3), EBNA3B (EBNA4)
und EBNA3C (EBNA5). Die Transkription dieser Gene folgt nach der Transkription von
EBNA2 und EBNA-LP. EBNA3A und EBNA3C haben im Gegensatz zu EBNA3B eine
wichtige Funktion in der Transformation von B-Zellen (Tomkinson et al, 1993). Alle drei
Proteine scheinen in einem komplexen Zusammenspiel mit EBNA2 als teils aktivierende und
teils inihibierende transkriptionelle Regulatoren der Expression von EBV Zielgenen zu
fungieren (Niedobitek et al, 2001). So aktiviert EBNA2 z.B. die Cp und LMP1 Promotoren,
EBNA3C hingegen greift regulierend ein und induziert zwar den LMP1 Promotor (Wang et
al, 1990), inhibiert aber den Cp Promotor (Radkov et al, 1997). Darüber hinaus induziert
EBNA2 die Expression des Onkoproteins c-Myc, welches durch EBNA3C stabilisiert wird
(Bajaj et al, 2008).
EBNA-LP (auch als EBNA6 bekannt) ist ein nukleäres Phosphoprotein und wird wie EBNA2
als frühes latentes Protein nach der EBV Infektion exprimiert. EBNA-LP fungiert zusammen
mit EBNA2 als transkriptioneller Coaktivator der Cp und LMP1 Promotoren (McCann et al,
2001). Weitere Funktionen, die EBNA-LP zugeschrieben werden, sind eine mögliche Rolle
bei der Evasion der IFN vermittelten Immunantwort (Echendu & Ling, 2008), die in vitro
Inhibition der p53-Rb Achse, die in vivo jedoch nicht nachgewiesen werden konnte (Young &
Murray, 2003) und, zusammen mit EBNA2, die Induktion der G1-Zellzyklusphase in
ruhenden B-Zellen (Sinclair et al, 1994) als wichtiger früher Schritt der EBV vermittelten
Transformation.
1.2.4.3 Latent membrane protein (LMP)1 und LMP2
EBV exprimiert drei latente Membranproteine: LMP1, das am besten untersuchte latente EBV
Protein, LMP2A und LMP2B. Im Weiteren wird besonders auf das primäre EBV Onkogen
1 Einleitung
Seite 32
LMP1 und seine Wirkung in epithelialen Zellen und NPC eingegangen. Es sollen hier vor
allem die Hauptmerkmale und die für diese Arbeit relevanten Effekte von LMP1 näher
erläutert werden.
1.2.4.3.1 Die Rolle von LMP1 in der Zelltransformation
LMP1 ist als eines der wichtigsten EBV Proteine für die Immortalisierung von B-Zellen
essentiell. Die erste Studie, die zur Aufklärung dieses Sachverhaltes beitrug, zeigte, dass die
Expression von LMP1 zur Transformation von Rattenfibroblasten führte und damit als
klassisches Onkogen fungiert (Wang et al, 1985). Dies wurde später für B-Zellen bestätigt
(Kaye et al, 1993). Die Tatsache, dass LMP1 in vielen EBV-assoziierten Neoplasien, wie cHL
und NPC, exprimiert wird, führte bald zu der Schlussfolgerung, dass LMP1 zur EBVvermittelten Tumorigenese beiträgt. Viele Studien zeigten, dass LMP1 zur Antigenvermittelten Aktivierung von B-Zellen, Hochregulation von antiapoptotischen Proteinen, wie
Bcl-2 und A20, sowie zur Induktion von diversen zellulären Oberflächenmarkern führt, die
sowohl in vitro als auch in vivo den Transformationsprozess fördern (Eliopoulos & Young,
2001). In nicht-tumorigenen Keratinozyten führt LMP1 zur Inhibierung der EpithelzellDifferenzierung, was den undifferenzierten Phänotyp der Epithelzellen im NPC erklären
könnte (Dawson et al, 1990). Darüber hinaus induziert LMP1 in nicht-transformierten
Epithelzellen einen Phänotyp, der an psoriatische Keratinozyten erinnert (Morris et al, 2008).
LMP1 kann außerdem einige etablierte Epithelzelllinien transformieren (Fahraeus et al, 1990;
Hu et al, 1993) und eine Hyperkeratose in einem transgenen Mausmodell induzieren (Wilson
et al, 1990). Wenn LMP1 in tumorigenen Epithelzellen exprimiert wird, verursacht es ein
Verankerungs-unabhängiges Wachstum sowie eine gesteigerte Zellmotilität und Invasion
(Dawson et al, 2012).
1.2.4.3.2 LMP1 Struktur und Signaltransduktion
LMP1 ist ein 66 kDa großes Membranprotein mit einem kurzen N-Terminus (Aminosäure 123), 6 Transmembrandomänen (Aminosäure 24-186) und einem langen C-Terminus
(Aminosäuren 187-386; Abb. 1.2). Der N-Terminus ist für korrekte Lokalisation und die
1 Einleitung
Seite 33
Abb. 1.2 Struktureller Aufbau von LMP1.
LMP1
ist
ein
Protein
mit
6
Transmembrandomänen, einem kurzen N- und
23
23
187
N
N
einem
langen
funktionellen
C-Terminus.
Domänen
des
Die
drei
C-Terminus
(CTAR1-3) vermitteln die Signaltransduktion
der LMP1 Oligomere ins Zellinnere durch die
Bindung und Aktivierung von zellulären
Adaptermolekülen (TRAFs, JAK3, TRADD,
C
386
C
RIP).
Ausrichtung des Proteins in der Membran zuständig (Coffin et al, 2001). Auch wird über
diesen der Abbau des in hoher Konzentration zytotoxisch wirkenden LMP1 reguliert (Aviel et
al, 2000; Hammerschmidt et al, 1989). Die Transmembrandomänen vermitteln die
Aggregation und Oligomerisierung des Proteins in den sogenannten lipid rafts der Membran,
welche für die Induktion der Signaltransduktion durch LMP1 unabdingbar sind (Clausse et al,
1997). LMP1 ist ein konstitutiv aktives, ligandenunabhängiges Signalprotein. Der CTerminus von LMP1 ist für die Transformation von B-Zellen notwendig (Kaye et al, 1995).
Er beinhaltet 3 C-terminal activating regions (CTAR)1-3. Diese funktionellen Domänen sind
für die Signalvermittlung von LMP1 in das Zellinnere zuständig. Dazu binden sie zelluläre
Adaptermoleküle einschließlich der tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated
factors (TRAFs), TNFR-associated death domains (TRADD), der receptor interacting
protein kinase (RIP) und der Janus Kinase (JAK) 3. Diese Adaptermoleküle wiederum
aktivieren nachfolgende zelluläre Signalwege wie den nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B-cells (NFκB), den c-Jun N-terminale Kinase (JNK)/p38, den
Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), den extracellular-signal regulated kinases (ERK) und
den JAK/STAT-Signalweg (Abb. 1.3). LMP1 induziert somit vergleichbare Signalwege wie
CD40, ein Mitglied der TNFR Familie und wird aufgrund dessen als CD40-Homolog
angesehen (Graham et al, 2010; Uchida et al, 1999). CD40 wird im Gegensatz zu LMP1
Liganden spezifisch aktiviert und in seiner Aktivität reguliert, was CD40 vom konstitutiv
aktiven, onkogenen viralen LMP1 unterscheidet (Homig-Holzel et al, 2008; Rastelli et al,
2008).
NFκB ist ein Transkriptionsfaktor, der u.a. Proliferation, Differenzierung, Apoptose und
Inflammation beeinflusst. NFκB hat hiermit nicht nur eine Schlüsselfunktion in der
1 Einleitung
Seite 34
Immunantwort, sondern auch in der Onkogenese maligner Tumore. CTAR1 und CTAR2
aktivieren den NFκB Signalweg durch die TRAF und TRADD Adaptermoleküle des TNF
Signalweges, wobei CTAR2 eine höhere Aktivität in Epitehlzellen zeigt (Dawson et al, 2012).
Das onkogene Potential von LMP1 durch die Aktivierung des NFκB Signalweges wurde
durch die Apoptose von LCL gezeigt, in denen die LMP1-abhängige Aktivierung des NFκB
Signalweges inhibiert wurde (Cahir-McFarland et al, 2000). Zudem beeinträchtigt die
Hemmung der NFκB-Aktivierung die Fähigkeit von LMP1 die zelluläre Transformation und
Kanzerogenität von Rattenfibroblasten zu induzieren (He et al, 2000). Die transformierende
Wirkung von NFκB kann durch die Induktion von antiapoptotischen Signalen wie A20, von
Zytokinen wie IL6 und IL8, von zellulären Oberflächenproteinen wie CD40 und CD54, von
Angiogenese Faktoren wie Cyclooxygenase (COX) 2 und vascular endothelial growth factor
(VEGF) und Zellzyklus regulierenden Proteinen erklärt werden (Eliopoulos & Young, 2001;
Tsao et al, 2002). Da die Aktivierung von NFκB diverse Signaltransduktionskaskaden
miteinbezieht, werden viele der phänotypischen LMP1-assoziierten Veränderungen in der
Wirtszelle der Aktivierung von NFκB zugeschrieben.
Abb.1.3 Signaltransduktion durch LMP1. Übernommen aus Zheng et al., 2007.
1 Einleitung
Seite 35
Die mitogen-activated protein kinases (MAPK) Familie schließt die ERK, p38 und JNK
Kinasen ein. Diese spielen eine wichtige Rolle in der Regulation und Koordinierung von
Wachstums- und Stresssignalen. JNK und p38 werden sowohl von CTAR1 als auch CTAR2
aktiviert (Dawson et al, 2012). JNK aktiviert sein onkogenes Zielgen AP1, das in die
Regulation von Transformation, Proliferation, Differenzierung und Apoptose involviert ist.
p38 übt seine Funktionen über STAT1 und weitere Kinasen aus. So induziert es in
Zusammenarbeit mit NFκB Zytokine wie IL6 und IL8 oder greift durch die Modifizierung der
p53-Phosphorylierung in die Apoptose ein (Eliopoulos et al, 1999; Li et al, 2007b). ERK wird
nur von CTAR1 aktiviert und ist an Prozessen wie Proliferation, Differenzierung, Umbau des
Zytoskeletts und Zellmotilität beteiligt (Dawson et al, 2008). Vor allem durch die
Veränderung der Motilität der Zellen, aber auch durch die Induktion von Matrix
Metalloproteinase (MMP)1 werden die invasiven Eigenschaften von Epithelien verstärkt, was
die Onkogenität von LMP1 erhöht (Dawson et al, 2012).
PI3K wird von CTAR1 aktiviert und ist an Zellproliferation, Motilität und vor allem dem
Überleben der Zellen beteiligt (Mainou et al, 2005). Downstream Faktoren von PI3K sind
unter anderen die Proteinkinase (PK)B und die PKC. PKB schützt die Zelle vor Apoptose,
indem sie apoptotische Signale unterdrückt und ist an der Regulation des Zytoskeletts und der
Zellmotilität beteiligt (Tsao et al, 2002). PKC reguliert Wachstum, Differenzierung und
Apoptose.
JAK3 wird vor allem von CTAR3 in Zusammenarbeit mit CTAR1 und/oder CTAR2 aktiviert
und führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von STAT Proteinen (Gires et al, 1999;
Zheng et al, 2007). Es gibt sieben STAT Proteine, die ähnliche Struktur und Funktion
aufweisen: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6 (Heinrich et al,
1998). Der STAT/JAK Signalweg kann durch zahlreiche Zytokine, Wachstumsfaktoren und
CD40 aktiviert werden (Gires et al, 1999). Vor allem STAT3 aber auch STAT5 spielen eine
wichtige Rolle in der Tumorprogression, indem sie die Proliferation, das Überleben und die
Invasion von Tumorzellen fördern (Yu et al, 2009). STAT3 begünstigt die Entstehung eines
tumorfördernden inflammatorischen Milieus einerseits durch die Aktivierung von NFκB und
die Induktion des IL6 Signalweges durch JAK3 und andererseits durch die Inhibierung der
STAT1- und NFκB-abhängigen Aktivierung der antitumoralen TH1 Immunantwort (Yu et al,
2009). STAT3 wird aufgrund seiner vielseitigen pro-onkogenen Eigenschaften nicht nur im
NPC als Angriffsziel möglicher Krebstherapien betrachtet (Ho et al, 2013).
1 Einleitung
Seite 36
1.2.4.3.3 Immunmodulatorische Funktionen von LMP1
LMP1 selbst weist nur geringe Immunogenität auf. So werden im Wirt nur wenige LMP1spezifische CD8-positive oder CD4-positive T-Zellen gefunden, was beispielsweise im
Gegensatz zu den EBNA3 Proteinen des Latenzprogramms III steht (Hislop et al, 2007).
Hingegen ruft LMP1 eine Vielzahl immunmodulatorischer Effekte hervor, die zu einem
immunogenen Phänotyp führen können. Demzufolge hat LMP1 nicht nur eine Funktion als
Wachstumsstimulus, sondern auch als Regulator von Immunfunktionen. Zu den
immunologischen Effekten von LMP1 gehört die Induktion von Adhäsionsmolekülen
(leukocyte function-associated antigen (LFA), intercellular adhesion molecule (ICAM),
CD18), Chemokinen (CCL17, CCL22), Zytokinen (IL6, IL8, IL10) und kostimulatorischen
Molekülen (CD86, CD80) (Middeldorp & Pegtel, 2008). Außerdem induziert LMP1 ein
inflammatorisches Genexpressionsprogramm in kultivierten Keratinozyten mit Induktion von
IL1β und IL1α (Morris et al, 2008). In diesen Mechanismus sind außerdem TNFα, TGFβ,
CXCL1-3 und granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) involviert
(Dawson et al, 2012), die sowohl an der Rekrutierung von Leukozyten als auch an der
Migration und Proliferation von Epithelzellen beteiligt sind. Besonders ist auch die Induktion
von Genen, die an der Prozessierung und Präsentation von Antigenen im Rahmen der
spezifischen Immunreaktion beteiligt sind, hervorzuheben. Die Induktion von MHC Klasse I
und den transporter associated with antigen processing (TAP)1 und 2 Proteinen durch LMP1
wurde 1995 erstmals in BL Zelllinien beschrieben (Rowe et al, 1995), was durch den
stimulatorischen Einfluss von LMP1 auf die NFκB Untereinheit RelB vermittelt wurde (Pai et
al, 2002). Aber auch in Epithelzelllinien wurde gezeigt, dass MHC Klasse I durch LMP1
induziert wird (Murray et al, 1998).
1.2.4.3.4 LMP2
Das LMP2 Gen codiert 2 verschiedene Proteine LMP2A und LMP2B. Beide Proteine
bestehen aus 12 Transmembrandomänen, einem C-Terminus und nur LMP2A besitzt
zusätzlich einen N-Terminus (Longnecker & Kieff, 1990). Keines der beiden Proteine ist für
die EBV-vermittelte Transformation von B-Zellen in vitro essentiell (Longnecker, 2000).
LMP2A imitiert die Signaltransduktion des B-Zell-Rezeptors, mit dem es strukturelle und
funktionelle Eigenschaften teilt. Wenn LMP2A in B-Zellen von transgenen Mäusen
1 Einleitung
Seite 37
exprimiert wird, entstehen Immunglobulin-negative B-Zellen, welche die peripheren
Lymphorgane kolonisieren (Caldwell et al, 1998). Demzufolge kann LMP2A den B-ZellRezeptor zumindest teilweise ersetzen. Zudem kann LMP2A die Expression von Genen
fördern, die den Zellzyklus induzieren, Apoptose inhibieren und die zellvermittelte Immunität
unterdrücken (Young & Rickinson, 2004). In Epithelzellen übt LMP2A unterschiedliche
Funktionen aus. LMP2A kann Epithelzellen transformieren und deren Adhäsion und Motilität
erhöhen, was durch den PI3K-PKB Signaltransduktionsweg vermittelt werden könnte
(Scholle et al, 2000). Es wurde außerdem gezeigt, dass LMP2A die NFκB und STATSignaltransduktion unterdrückt und die LMP1 Expression moduliert (Stewart et al, 2004).
LMP2B scheint eher regulatorische Eigenschaften zu haben und die Aktivität von LMP2A zu
modulieren (Longnecker, 2000).
1.2.4.4 Weitere latente Genprodukte
Weitere Genprodukte, die während der latenten Phase der EBV-Infektion exprimiert werden,
sind EBV-kodierte BamHI A rightward transcripts (BARTs) und EBV-kodierte microRNA.
BARTs sind stark gesplicte Transkripte, die in allen EBV-assoziierten Erkrankungen, vor
allem dem NPC, und im Blut von gesunden Individuen nachgewiesen wurden (Young &
Rickinson, 2004). Sie sind nicht essentiell für die Transformation von B-Zellen und scheinen
die Entwicklung und das Wachstum von epithelialen Tumoren zu unterstützen (Marquitz &
Raab-Traub, 2012).
microRNA sind kleine nicht-kodiernede RNS mit einer Länge von 20-24 Nukleotiden, die die
Expression von mRNS herunterregulieren können. EBV exprimiert mindestens 22
microRNA, die vor allem in B-Zellen mit einer EBV Latenz III, aber nicht in NPC
nachgewiesen wurden (Xing & Kieff, 2007). Ihr Angriffsziel sind verschiedene zelluläre
Gene wie z.B. des p53 Tumorsuppressor-Signalweges oder auch Chemokine, was ihre
potentielle Rolle in der EBV-vermittelten Tumorigenese unterstützt (Choy et al, 2008; Xia et
al, 2008).
1 Einleitung
Seite 38
1.3 EBV-assoziierte Erkrankungen
Die Primärinfektion mit EBV im frühen Erwachsenenalter führt zu einer selbstlimitierenden
Lymphoproliferation mit akutem Krankheitsbild, der IM. Dieses manifestiert sich mit Fieber,
Lymphknotenschwellungen, Nachtschweiß und einer Tonsillitis. In den betroffenen
Lymphknoten kommt es zu einer Expansion des Paracortex durch EBV infizierte polyklonale
B-Blasten (Brown et al, 1986) und aktivierte T-Zellen (Svedmyr & Jondal, 1975). Einige der
infizierten B-Zellen zeigen eine plasmazytoide Differenzierung und es wird vermutet, dass
EBV in diesen Zellen replizieren kann (Niedobitek et al, 1997; Thorley-Lawson et al, 2008).
In der IM liegt eine Latenz des Typs III mit Expression aller EBV-latenten Gene vor,
wenngleich die Expression der verschiedenen EBV-latenten Gene auf Einzelzellniveau sehr
heterogen ist (Tierney et al, 1994).
Zusätzlich ist das EBV mit einer Reihe von benignen und malignen Neoplasien assoziiert.
Eine gefürchtete Komplikation, die bei immunsupprimierten Patienten z.B. nach einer
Organtransplantation auftreten kann, ist die PTLD, die zumeist vom B-Zell-Phänotyp und
EBV-assoziiert ist. PTLDs treten vor allem bei Organempfängern auf, die EBV-negativ waren
und das Virus im Rahmen der Transplantation vom Organspender erhalten haben und somit
keine schnelle, sekundäre Immunantwort gegen EBV auslösen können (Hopwood &
Crawford, 2000). PTLDs schließen benigne polyklonale Lymphoproliferationen bis hin zu
genuinen Lymphomen ein (Oudejans et al, 1995). Die polyklonale Expansion von EBVinfizierten B-Zellen kann sich nach einer Reduktion der immunsuppressiven Therapie spontan
zurückbilden
(Knowles,
1999).
Weitere
mit
EBV
assoziierte
Erkrankungen
in
immunsupprimierten Patienten sind die acquired immune deficiency syndrome (AIDS)related lymphomas. Diese Erkrankungen sind ebenfalls meist B-zellulär und treten in Folge
der Immunsuppression bei HIV-Infektionen auf.
Auch in immunkompetenten Individuen kann EBV die Entstehung verschiedener maligner
Lymphome begünstigen, wie die des BL und cHL (vgl. Kapitel 1.3.2.). Das BL tritt
endemisch und nicht-endemisch auf. Das endemische BL im äquatorialen Afrika ist zu 95%
EBV-assoziiert, während das nicht-endemische BL in Europa und USA nur in 10-20% eine
EBV Assoziation aufweist (Middeldorp et al, 2003). Es liegt zumeist eine Latenzform Typ I
vor, in der hauptsächlich EBNA1 exprimiert wird. Für BL typisch ist eine Translokation, bei
der das c-myc Gen unter die Kontrolle des Promotors des Immunglogulin schwere Ketten
Lokus kommt, was zu einer Überexpression des Onkogens c-myc führt (Zech et al, 1976).
1 Einleitung
Seite 39
EBNA1 scheint diesen Prozess der Translokation zu begünstigen (Kuhn-Hallek et al, 1995).
EBV-assoziierte T- und Natürliche Killer (NK)-Zell-Lymphome kommen sehr selten vor, da
EBV eher B-lymphotrop ist (Jones et al, 1988). Wenn EBV jedoch T- oder NK-Zellen
infiziert und es zur Entwicklung eines Lymphoms kommt, so sind diese hoch-maligne mit
schlechter Prognose (Kanavaros et al, 1993; Young & Rickinson, 2004).
Weiterhin wird EBV mit epithelialen Erkrankungen oder Neoplasien in Verbindung gebracht.
Dazu gehört die benigne orale Haarleukoplakie (OHL), eine weiße epitheliale Läsion des
Zungenrands, die bei immunsupprimierten Individuen wie AIDS Patienten zu finden ist. Im
Jahre 1985 wurde erstmals ein Zusammenhang zwischen der OHL und EBV beschrieben
(Greenspan et al, 1985). Die OHL verursacht keine weiteren Symptome und wird meistens
nicht behandelt, wenngleich eine antiherpesvirale Therapie Abhilfe schaffen kann. Weitere
epitheliale EBV-assoziierte Erkrankungen sind das NPC (vgl. Kapitel 1.3.1) und in seltenen
Fällen das Magenkarzinom. Weltweit sind etwa 10% der Adenokarzinome des Magens mit
EBV assoziiert (Middeldorp et al, 2003). Das EBV-positive Magenkarzinom hat eine relativ
gute Prognose im Vergleich zu EBV-negativen Fällen (Fukayama et al, 2008).
Auch weitere Malignome wurden mit EBV in Verbindung gebracht. Dazu gehören
Lymphoepitheliome des Mittelohrs, der Speicheldrüsen, der Lunge und des Thymus.
Außerdem wurden Tumore der glatten Muskelzellen mit EBV in Zusammenhang gebracht
(Middeldorp et al, 2003).
1.3.1 Das Nasopharynxkarzinom (NPC)
1.3.1.1 Klassifikation, Epidemiologie und Ätiologie des NPC
Klinisch manifestiert sich das NPC häufig mit Symptomen wie nasaler Obstruktion und
Mittelohrerguss bis hin zum Verlust des Gehörs. Der Tumor ist zwar sehr Radio- und
Chemotherapie sensitiv, häufig auftretende Rezidive und Metastasen in dreißig bis sechzig
Prozent der Fälle erhöhen jedoch die Sterblichkeit (Spano et al, 2003). Das NPC kann laut
WHO histopathologisch in drei Subtypen unterteilt werden: Das verhornende differenzierte
Plattenepithelkarzinom (Typ I), das nicht-verhornende differenzierte Plattenepithelkarzinom
(Typ II) und das nicht-verhornende undifferenzierte Karzinom (Typ III; Abb. 1.4 A), das auch
1 Einleitung
Seite 40
B
A
Abb.
1.4
Das
undifferenzierte
Nasopharynxkarzinom.
(A)
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
eines
undifferenzierten NPC Falles mit atypischen epithelialen Zellverbänden vor dem Hintergrund eines reaktiven
entzündlichen Infiltrats. (B) Die EBER in situ Hybridisierung eines undifferenzierten NPC zeigt die EBVAssoziation.
aufgrund seines prominenten inflammatorischen Infiltrats als lymphoepitheliales Karzinom
bekannt ist. Das Vorkommen der verschiedenen Subtypen des NPC ist regional
unterschiedlich. In endemischen Regionen, wie Süd-China, dominiert das undifferenzierte
Karzinom (Typ III) mit bis zu 97% aller NPC, in westlichen Ländern dominieren hingegen
verhornende Plattenepithelkarzinome (Typ I) mit bis zu 75% der Tumoren (Marks et al,
1998). Nahezu alle undifferenzierten Typ III Karzinome der endemischen Regionen sind EBV
positiv (Abb. 1.4 B), während die verhornenden differenzierten Typ I Karzinome EBVnegativ sind (Raab-Traub, 2002). Der Nachweis der Monoklonalität des EBV Genoms
innerhalb eines NPC impliziert, dass die Infektion mit EBV vor der klonalen Expansion der
malignen Zellen in der frühen Karzinogenese stattfindet (Raab-Traub, 2002). In nichtendemischen Regionen liegt die Inzidenz des NPC unter 1 pro 100000 Personen im Jahr. In
endemischen Regionen hingegen, wie Süd-China und besonders Kanton, liegt die Inzidenz
viel höher bei 25-30 pro 100000 Personen im Jahr (Lo et al, 2004). Unabhängig von der
Ethnizität erkranken Männer zwei- bis dreimal häufiger an NPC als Frauen. Die Tatsache,
dass die Inzidenz des NPC stark von der geographischen Region abhängt, lässt auf eine
Assoziation des Tumors mit Umwelteinflüssen und genetischen Faktoren schließen.
Zu den Umweltfaktoren in endemischen Regionen wird der hohe Anteil nitrosaminhaltiger,
traditioneller Lebensmittel (z.B. gesalzener Fisch) gerechnet. Vor allem der Verzehr von
nitrosaminhaltigem Fisch in der Kindheit ist mit einem erhöhten NPC-Risiko assoziiert (Yu &
Yuan, 2002). Ratten, die mit nach kantonesischer Art gesalzenem Fisch gefüttert wurden,
1 Einleitung
Seite 41
entwickelten nasale und nasopharyngeale Tumoren (Huang et al, 1978). Andere
Umweltfaktoren wie Staub, Rauch und chemische Dämpfe wie auch Kräuter der chinesischen
Medizin spielen ebenfalls eine potentielle Rolle in der Entstehung des NPC (Yu & Yuan,
2002). Eine Assoziation mit Zigarettenrauch oder Formaldehyd-Exposition erscheint
hingegen nur schwach und wurde lange kontrovers diskutiert (Raab-Traub, 2002). Aktuellere
Studien konnten jedoch zeigen, dass Zigarettenrauch, vor allem bei Langzeitrauchern und in
Kombination mit Alkohol ein erhebliches Risiko für die Entstehung eines NPC darstellt
(Fachiroh et al, 2012; Feng et al, 2009; Friborg et al, 2007; Ji et al, 2011; Polesel et al, 2011).
Sowohl genetische als auch epigenetische Veränderungen von Genen, die zelluläre Prozesse
wie Proliferation, Differenzierung, Genomstabilität und Apoptose beeinflussen, sind in der
Entstehung des NPC involviert, was die Ergebnisse von Migranten- und Fall-Kontroll-Studien
belegen (Lo & Huang, 2002). So wurde gezeigt, das Polymorphismen in CYP2E, einer Form
des Cytochrom P450 Enzyms, den Metabolismus von Nitrosaminen beeinträchtigen und es
dadurch zu einer Anreicherung dieses Karzinogens kommt (Hildesheim et al, 1995).
Außerdem wurden bei NPC Patienten Polymorphismen in der Glutathion-S-Transferase M1,
die eine wichtige Rolle in der Detoxifikation von Tabakrauch spielt, beobachtet (NazarStewart et al, 1999). Auch die Assoziation von HLA Klasse I Subtypen mit dem NPC wurde
extensiv analysiert. Chinesen mit einem HLA-A2 Haplotypen haben beispielsweise ein
erhöhtes Risiko an NPC zu erkranken (Hildesheim et al, 2002). In einer Metaanalyse wurden
außerdem HLA-B14 und -B46 als potentielle NPC Risikofaktoren identifiziert (Goldsmith et
al,
2002).
Zusätzlich
wurden
chromosomale
Abnormitäten
in
verschiedenen
Tumorsuppressorgenen (p14, p16, RASSF1A, p53, TSLC1 etc.) und Onkogenen (Erhöhung
der Kopienzahl von c-myc, PI3K, p63 etc.) beschrieben (Lo & Huang, 2002). Hervorzuheben
ist, dass c-myc in einer immunohistochemischen Studie zwar weder mit dem Alter,
Geschlecht, Rauchverhalten, Tumorstadium, EBV-Antikörpertiter oder dem familiären
Hintergrund assoziiert war, jedoch mit einem schlechten NPC Überleben korrelierte (Porter et
al, 1994). Auch die Transduktion von apoptotischen Signalen und Wachstumssignalen wie
NFκB, Bcl3, EGFR, MMPs, Hypoxie-induzierter Faktor (HIF)-1α kann häufig beeinträchtigt
sein (Lo et al, 2004).
1 Einleitung
Seite 42
1.3.1.2 Die Rolle von EBV bei der Karzinogenese des NPC
Die Tatsache, dass das EBV über 90% der Weltbevölkerung infiziert, aber nur ein kleiner
Prozentsatz EBV-assoziierte Tumoren entwickelt, zeigt, dass EBV zur Induktion der
Tumorigenese alleine nicht hinreichend ist. Es ist vielmehr das Zusammenspiel zahlreicher
onkogener Einflüsse, das die Entstehung EBV-assoziierter Tumore induziert. EBV ist vor
allem B-lymphotrop und persistiert nach der Primärinfektion in B-Gedächtniszellen aber nicht
im nasopharyngealen Epithel von gesunden EBV-Trägern (Lo et al, 2004). Im Gegensatz zu
B-Zellen kann das EBV Epithelzellen nur in viel geringerem Ausmaß infizieren, wobei der
genaue Mechanismus unklar ist. Man vermutet, dass der Eintritt der Viren nicht durch
Endozytose, sondern eher durch direkte Fusion der viralen Hülle und Zellmembran stattfindet
(Borza & Hutt-Fletcher, 2002; Borza et al, 2004; Miller & Hutt-Fletcher, 1992). Eine aktuelle
Studie zeigt, dass EBV orale Epithelzellen sowohl von apikal nach basolateral und umgekehrt
durchwandern kann, was ein Durchdringen des Virus in das lymphatische Gewebe der
Tonsille bei der Primärinfektion, aber auch die EBV Sekretion in den Speichel von bereits
infizierten Individuen und damit Überträgern erklären kann (Tugizov et al, 2013). Das EBV
liegt in NPC Zellen als Episom vor und ist nur selten in das Wirtsgenom integriert (KripalaniJoshi & Law, 1994; Lo et al, 2004). In den Tumorzellen des NPC liegt eine Latenzform des
Typs II vor, in der EBERs, EBNA1, LMP2, LMP1 und BARTs exprimiert sind (Niedobitek et
al, 1992; Young et al, 1988). Außerdem wurde das frühe lytische EBV Gen BARF1 in NPC
detektiert (Decaussin et al, 2000). Vor allem die viralen Onkogene LMP1 und BARF1
scheinen im NPC für die EBV-vermittelte Tumorigenese relevant zu sein. In vitro Versuche
haben gezeigt, dass EBV infizierte nasopharyngeale Epithelzellen ihr Wachstumsverhalten
nicht ändern, jedoch ein erhöhtes Invasions- und Migrationspotential aufweisen (Lo et al,
2004). Es wird deshalb vermutet, dass EBV die Invasivität der NPC Zellen erhöht. In Mäusen
wurde gezeigt, dass EBV-positive nasopharyngeale Epithelien nicht in der Lage sind, Tumore
zu bilden (Lo et al, 2004). Aufgrund der unzureichenden Karzinogenität des EBV wurde ein
Stufen-Modell zur Karzinogenese von NPC postuliert, das sowohl die EBV-Infektion,
Umweltfaktoren wie auch genetische und epigenetische Veränderungen als NPC Auslöser
berücksichtigt (Abb. 1.5). Häufig werden in NPC, aber auch in histologisch normalem
nasopharyngealem Epithel von gesunden Individuen aus den geographischen Risikoregionen
in Süd-China Deletionen im Chromosom 3p und 9p vorgefunden, die auch in low-grade EBVnegativen dysplastischen Läsionen vorkommen (Chan et al, 2002; Chan et al, 2000). Diese
1 Einleitung
Seite 43
Abb. 1.5 Modell der sequentiellen Karzinogenese des NPC. Übernommen aus Lo et al., 2004.
genetischen Veränderungen sowie die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (p14, p16,
RASSF1A) scheinen noch vor der EBV-Infektion der nasopharyngealen Epithelien
aufzutreten und die Epithelzellen für eine EBV Infektion und Aufrechterhaltung des latenten
Zyklus zu prädisponieren. Die nachfolgende Expression der latenten EBV Genprodukte trägt
dann zum Fortschreiten der Tumorentwicklung bei.
1.3.2 Das klassische Hodgkin Lymphom (cHL)
Vor mehr als 150 Jahren beschrieb Thomas Hodgkin ein Krankheitsbild in verschiedenen
Altersgruppen, das mit Lymphknotenschwellungen, Milztumoren und der Entwicklung einer
Kachexie einherging und später Hodgkin-Erkrankung genannt wurde (Hodgkin, 1832). Seit
diese Erkrankung als Lymphom identifiziert wurde, wird die Bezeichnung Hodgkin
Lymphom (HL) verwendet. Das HL ist gemäß der IARC durch vier charakteristische
Merkmale gekennzeichnet: 1. Es entsteht zumeist in Lymphknoten der Halsregion. 2. Häufig
sind junge Erwachsene betroffen. 3. Es besteht aus nur wenigen (< 2%) großen mono- und
multinukleären Tumorzellen (HRS-Zellen), die in ein dichtes heterogenes inflammatorisches
Infiltrat eingebettet sind (Abb. 1.6 A). 4. Die Tumorzellen sind oft von T-Lymphozyten
umringt.
1 Einleitung
Seite 44
Dreißig Prozent aller diagnostizierten Lymphome sind HL. Diese setzen sich zu 95% aus
dem klassischen HL (cHL) und zu 5% aus dem nodulär Lymphozyten-prädominanten HL
(nlpHL), auch sog. noduläres Paragranulom, zusammen. cHL und nlpHL sind zwei
unterschiedliche Tumorentitäten, die sich in ihrem klinischen Verlauf, der Zusammensetzung
des
zellulären
Hintergrunds,
der
Morphologie,
der
EBV-Assoziation
und
dem
Immunphänotyp der Tumorzelle unterscheiden. Das nlpHL ist ein sehr langsam wachsender
Tumor und hat in frühen Stadien eine bessere Prognose als das cHL. Bei beiden Entitäten
handelt es sich in der ganz überwiegenden Zahl der Fälle um B-Zell-Neoplasien. Die
neoplastischen Zellen des nlpHL heißen Lymphozyten-prädominante (LP) Zellen oder auch
Popcorn-Zellen und befinden sich in einem Entwicklungsstadium zwischen Keimzentrumsund Gedächtnis-B-Zellen. Die Tumorzellen des cHL, die sog. Hodgkin und Reed- (HRS)
Zellen hingegen leiten sich von prä-apoptotischen Keimzentrums-B-Zellen ab, welche nicht
durch apoptotische Signale eliminiert werden können (Brune et al, 2008; Kanzler et al, 1996).
Diese Zellen weisen keine funktionellen Immunglobulin (Ig) Gene auf (Braeuninger et al,
1997).
Das cHL wird abhängig von der Komposition des inflammatorischen Infiltrats und des
Ausmaßes der Fibrose in vier Subtypen eingeteilt: Nodulär-sklerosierender Typ (ns),
Mischtyp (mc, mixed cellularity), lymphozytenarmer Typ (ld, lymphocyte depleted) und
lymphozytenreicher Typ (lr). In westlichen Ländern sind mehr als 60% des cHL vom nsHL
Typ und ca. 30% vom mcHL Typ.
A
B
Abb. 1.6 Das klassische Hodgkin Lymphom. (A) Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines cHL Falles mit typischen
großen mono- und multinukleären HRS-Zellen in einem entzündlichen Infiltrat. (B) LMP1 Immunhistochemie
eines cHL Falles mit positiven HRS-Zellen.
1 Einleitung
Seite 45
1.3.2.1 Epidemiologie und Ätiologie des (c)HL
Das HL ist mit einer Inzidenz von 3 pro 100000 Personen im Jahr eines der häufigsten
Lymphome in westlichen Ländern (Kuppers, 2009b). Vier Tumorstadien sind definiert, die
u.a. bei der Wahl der Behandlung, Chemo- und/oder Radiotherapie, eine Rolle spielen.
Heutzutage wird eine Heilungsrate von 80% - 90% erreicht (Diehl et al, 2004). Erwachsene
Männer sind häufiger von HL betroffen als Frauen (Correa & O'Conor, 1971). Im Kindesalter
ist die Geschlechterverteilung umgekehrt. Hier sind Mädchen häufiger betroffen als Jungen.
Typisch für das HL ist eine bimodale Altersverteilung in den westlichen Ländern mit einer
hohen Inzidenz bei 10-35 Jährigen und bei über 55 Jährigen (Harris et al, 1999). Zudem
wurden familiäre und geographische Häufungen beschrieben. Klinisch kommt es beim HL
zumeist zu einer schmerzfreien Lymphknotenschwellung, was mit B-Symptomen wie
Nachtschweiß, Fieber, undefinierbarem Juckreiz und ungewolltem Gewichtsverlust
einhergehen kann.
Die Ätiologie des HL ist nur inkomplett verstanden. Familiäre Faktoren, Immunsuppression
und virale Infekte scheinen eine Rolle zu spielen. So haben gleichgeschlechtliche Geschwister
von HL Erkrankten ein 10fach erhöhtes Risiko ein HL zu entwickeln (Grufferman et al,
1977), was auf genetische Risiken hindeutet, aber auch die Möglichkeit einer abnormen
Immunantwort miteinschließt (Ansell, 2012). Eine Assoziation von cHL mit EBV-Infektion
wurde in zahlreichen epidemiologischen und serologischen Studien belegt und damit eine
mögliche Rolle des Virus bei der Tumorentstehung impliziert. In Entwicklungsländern findet
sich in manchen Regionen eine nahezu 100%ige Assoziation des cHL mit dem EBV Virus. In
westlichen Ländern hingegen liegt die Rate bei 20% - 50% (Herbst et al, 1993). Für das
nlpHL findet sich keine Assoziation mit dem EBV (Glaser et al, 1997). Dieser Tumor ist EBV
negativ. Der Mischtyp des HL ist am häufigsten (in ca. 75% der Fälle) mit dem EBV
assoziiert und auch am häufigsten in Entwicklungsländern vertreten (Hummel et al, 1992).
Das nsHL, welches vor allem in westlichen Ländern auftritt, ist nur in 10% - 40% der Fälle
EBV assoziiert. Die Klonlität des EBV Genoms in den Tumorzellen des cHL spricht für eine
pathogenetische Rolle des Virus bei der Lymphomentwicklung. Die Ergebnisse von Studien,
die das Überleben von cHL Patienten in Abhängigkeit von dem EBV Status des Tumors
untersuchten sind eher widersprüchlich. Neuere Daten lassen hier auf eine altersabhängige
Verteilung schließen. Patienten mit EBV-assoziiertem cHL unter 34 Jahren zeigten ein
besseres Überleben und über 50 Jahre ein schlechteres Überleben im Vergleich zu Patienten
1 Einleitung
Seite 46
mit EBV-negativem cHL, was durch einen beeinträchtigten Immunstatus in älteren cHL
Patienten verursacht sein könnte (Herling et al, 2006; Jarrett et al, 2005; Keegan et al, 2005).
Das EBV wurde erstmals im Jahre 1987 in einem cHL nachgewiesen (Weiss et al, 1987), und
es wurde gezeigt, dass die späte Exposition mit EBV mit dem Krankheitsbild der IM ein
erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines EBV-positiven cHL im späteren Leben darstellt
(Hjalgrim et al, 2003). Eine zufällige Lokalisation von EBV in HRS-Zellen erscheint
unwahrscheinlich, da HRS-Zellen eines Tumors ein klonales EBV Genom aufweisen, in allen
HRS-Zellen eines Virus-assoziierten Tumors EBV nachgewiesen werden kann und nur eine
sehr geringe Anzahl an EBV-positiven B-Zellen in gesunden Trägern zu finden ist. Zudem
wird das EBV-kodierte Protein LMP1 sehr stark in den HRS-Zellen exprimiert (Abb. 1.6 B),
was auf eine Rolle von LMP1 in der Pathogenese des cHL hindeuten kann (Deacon et al,
1993). Im cHL liegt eine Latenz II mit Expression der latenten EBV-Gene EBNA1, LMP1
und LMP2 vor (Deacon et al, 1993; Niedobitek et al, 2000). Das Zusammenspiel dieser Gene
in der Pathogenese des cHL ist noch weitgehend ungeklärt, u.a. da keine Zelllinien mit einer
Latenz II als in vitro Modell existieren. Es ist jedoch bekannt, dass alle in der Latenz II
exprimierten Gene die B-Zell Proliferation und Differenzierung beeinflussen können (vgl.
Kapitel 1.2.3). Wie EBV-positive HRS-Zellen dem Immunsystem entkommen können,
obwohl immunogene Proteine wie LMP2 exprimiert werden, ist ebenfalls nicht vollständig
geklärt. Ein systemisches Versagen der Immunreaktion bei der EBV Bekämpfung konnte
nicht nachgewiesen werden, so dass eher ein lokaler Defekt in der Immunantwort vermutet
wird (Dolcetti et al, 1995). Bekannt ist, dass die Deregulation des NFκB Signalweges in der
Pathogenese des EBV-positiven als auch des EBV-negativen HL eine wichtige Rolle spielt.
HRS-Zellen zeigen eine starke konstitutive Aktivierung von NFκB, das in B-Zellen
normalerweise nur transient aktiv ist (Bargou et al, 1997). Im EBV-assoziierten cHL scheint
LMP1 als Imitator des CD40 Rezeptors zu einer starken Aktivierung von NFκB zu führen
(Graham et al, 2010), was im EBV-negativen cHL durch die Inaktivierung der NFκB
Inhibitoren IκBα und A20 oder die Amplifizierung des NFκB Gens REL erreicht werden kann
(Kuppers, 2009b). Dadurch können B-Zell Rezeptor (BCR)-negative, “verkrüppelte” B-Zellen
überleben, die sonst aufgrund der Antigen-abhängigen Selektion bei fehlendem spezifischen
BCR apoptotisch würden (Chaganti et al, 2005). Außerdem kann LMP2A die Funktion des
fehlenden BCR Rezeptors nachahmen und damit ein Überlebenssignal in BCR-negativen
Zellen vermitteln (Caldwell et al, 2000). Da jedoch auch EBV-negative cHL Fälle auftreten,
1 Einleitung
Seite 47
ist EBV für die Pathogenese des cHL offenbar nicht notwendig. Es scheint aber hierfür nötige
und wichtige genetische Veränderungen induzieren zu können.
1.3.2.2 Die Zusammensetzung und Rolle des inflammatorischen Begleitinfiltrats im cHL
Ein gemeinsames Kennzeichen aller HL Subtypen ist das Vorliegen sehr weniger
neoplastischer Zellen, die von einer großen Anzahl nicht-neoplastischer entzündlicher Zellen
umgeben sind, die u.a. T- und B-Lymphozyten, Makrophagen (MΦ), Granulozyten,
Plasmazellen, Fibroblasten, aber auch dendritische Zellen (DC) einschließen (Steidl et al,
2011). Die Zusammensetzung des Infiltrats wird durch die Zytokin-vermittelten Interaktionen
(crosstalk) zwischen reaktiven Zellen und HRS-Zellen bestimmt (Abb. 1.7). Es wird
angenommen, dass HRS- und LP-Zellen durch u.a. deregulierte NFκB und STAT
Signaltransduktionswege und genetische Läsionen eine abnormale Immunantwort induzieren
(Kuppers, 2009a), die durch unkontrollierte Zytokin- und Chemokinsekretion der malignen
Zellen vermittelt wird (Skinnider & Mak, 2002; Teruya-Feldstein et al, 2000). Dadurch wird
eine inflammatorische Reaktion induziert und aufrechterhalten, die das Überleben und
Wachstum der malignen Zellen ermöglicht (Khan, 2006). Der Proliferationsstimulus auf
HRS-Zellen wird dabei autokrin und parakrin von umgebenden Entzündungszellen vermittelt.
So konnten Atayar et al. zeigen, dass HRS-Zellen T-Zell-spezifische Transkriptionsfaktoren
wie T-bet und GATA3 exprimieren, die die Sekretion von Chemokinen und Zytokinen
fördern, welche autokrin das Tumorzellwachstum und -überleben unterstützen (Atayar et al,
2005). Das genaue Zusammenspiel des Tumors mit dem inflammatorischen Infiltrat ist nicht
vollständig geklärt. Das Infiltrat könnte nicht nur eine Quelle für Wachstumsfaktoren der
Tumorzellen sein, sondern auch Ausdruck einer gegen den Tumor gerichteten, jedoch
ineffizienten Immunreaktion. Mechanismen der Immunevasion werden in Kapitel 1.4 genauer
erläutert.
Im
HL
liegt
ein
komplexes
System
aus
Entzündungszellen
und
Entzündungsmediatoren im Tumor vor (Abb. 1.7).
Dominiert wird das Infiltrat durch CD4-positive T-Helfer (TH)-Zellen (Poppema et al, 1982),
insbesondere TH2-Zellen und regulatorische T (Treg)-Zellen (Ma et al, 2008; Poppema et al,
1996), die gehäuft in der unmittelbaren Umgebung von HRS-Zellen vorkommen. HRS-Zellen
sezernieren zahlreiche Chemokine, die spezifisch diese T-Zell Subtypen anlocken. Dazu
1 Einleitung
Seite 48
Abb. 1.7 Das entzündliche Infiltrat im cHL. Es findet eine rege Zytokin-vermittelte Interaktion zwischen
HRS-Zellen und den infiltrierenden Zellen statt. BAFF, B-cell activating factor; APRIL, a proliferation-inducing
ligand; BLC, B lymphocyte chemoattractant; FASL, Fas ligand; MEC, mucosae-associated epithelial
chemokine; Gal-1, Galectin-1; PDL, programmed cell death 1 ligand. Übernommen aus Steidl et al., 2011.
gehören regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES/CCL5),
thymus and activation induced chemokine (TARC/CCL17) und macrophage derived
chemokine (MDC/CCL22) (Fischer et al, 2003; Poppema & van den Berg, 2000). Auch MΦ
sind zahlreich im inflammatorischen Infiltrat des HL vertreten. Diese werden von Mediatoren
angelockt und aktiviert, die zum einen von HRS-Zellen produziert werden wie z.B.
Monozytenkolonien-stimulierender Faktor (M-CSF) und CX3CL1 und zum anderen von TH1
Zellen wie z.B. IFNγ, welches MΦ aktivieren kann (Steidl et al, 2011). MΦ selbst
produzieren IL8, das chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten wirkt (Foss et al, 1996). Im
nsHL finden sich zahlreiche Fibroblasten. Diese werden durch IL13, TNFα und fibroblast
growth factor (FGF) stimuliert, welche von HRS-Zellen produziert werden (Steidl et al,
1 Einleitung
Seite 49
2011). Die Anwesenheit von DC ist in cHL bereits beschrieben worden (Barros et al, 2012).
Ihre Funktion ist allerdings bisher noch nicht untersucht.
1.4 Immunevasionsmechanismen
Aufgabe des Immunsystems ist es Eindringlinge (Viren, Bakterien etc.), aber auch endogene
Antigene (z.B. Tumoren) abzuwehren, um das Überleben des Organismus zu gewährleisten.
Gleichwie der Organismus Abwehrmechanismen entwickelt hat, haben auch Pathogene
Mechanismen entwickelt, um dem Immunsystem zu entkommen. Bei Tumoren ist zum einen
die
körpereigene
Immunantwort,
z.B.
aufgrund
mangelhafter
Präsentation
von
Tumorantigenen oder fehlender kostimulatorischer Moleküle, ineffektiv, was zur Ausbildung
von Toleranz bzw. Anergie gegenüber den Tumorantigenen führt. Zum anderen wird die
Effektivität der antitumoralen Immunreaktion durch Immunevasionsmechanismen der
Tumore gehemmt.
1.4.1 Immunevasionsmechanismen im NPC
1.4.1.1 Die Rolle des EBV in der Immunevasion des NPC
Wie bereits oben erwähnt sind nahezu alle undifferenzierten NPC EBV positiv und das Virus
spielt bei der Immunevasion des NPC eine wichtige Rolle. Ein Mechanismus, der für die
lebenslange Persistenz von EBV im Wirt essentiell ist, ist eine sehr limitierte virale
Antigenexpression, die den Virus nahezu vollkommen unsichtbar für das Wirtsimmunsystem
macht. Unter normalen Bedingungen zwingt das Immunsystem das EBV dazu, sich zu
verbergen. Kommt es aber lokal zu einem immunsupprimierten Milieu, kann EBV ein
gewisses Repertoire an viralen Proteinen exprimieren, die zur Entwicklung des NPC beitragen
(Li et al, 2007a). Obwohl funktionelle Effektor-T-Zellen gegen die Virusproteine LMP1 und
LMP2 im entzündlichen Begleitinfiltrat des NPC vorkommen, ist die lokale T-Zell
Zytotoxizität und die Zytokinsekretion beeinträchtigt, was auf die Anwesenheit von
immunsuppressiven Treg Zellen zurückgeführt wurde (Li et al, 2007a). Treg Zellen werden in
vitro
überdies
durch
LMP1-Peptide
angeregt,
IL10
zu
produzieren,
was
die
immunsuppressive Tumorumgebung noch verstärkt (Marshall et al, 2003). LMP1 kann zudem
die Expression des antiapoptotischen Proteins bcl-2 in B-Zellen induzieren, was Wirtszellen
1 Einleitung
Seite 50
dazu befähigt apoptotische Signale von CTL zu ignorieren; in Epithelzellen scheint LMP1
jedoch durch die Aktivierung von NFκB/AP-1 und deren downstream Zielgenen
Apoptoseresistenz zu vermitteln (Dawson et al, 2012). Außerdem kann LMP1 die IFNαvermittelte antivirale Signaltransduktion hemmen und die Produktion und Sekretion
immunmodulierender Exosomen induzieren (Middeldorp & Pegtel, 2008). Weitere LMP1
induzierte immunmodulatorische Moleküle helfen in dem Tumor eine “immunsuppressive
Wolke” zu etablieren (Middeldorp & Pegtel, 2008). Auch die Herunterregulation der HLA
Klasse I Maschinerie wurde als Immunevasionsmechanismus im NPC diskutiert (Ogino et al,
2007; Sengupta et al, 2006). Außerdem können einige EBV-kodierte Proteine nur
eingeschränkt über HLA Klasse I Moleküle präsentiert werden. So besitzt EBNA1 eine GlyAla repeat-Sequenz, die die eigene Prozessierung durch das Proteasom und folglich die
Antigenpräsentation verhindert (Levitskaya et al, 1997). Zudem kann EBNA3C die eigene
Proteinexpression auf eine so geringe Kopienzahl beschränken, dass es nur zu einer
ineffizienten Antigenpräsentation kommt (Crotzer et al, 2000).
1.4.1.2 Die HLA Klasse I Antigenpräsentationsmaschinerie (APM) in der Immunevasion
CD8-positive T-Zellen können mit Pathogenen befallene Zellen nur erkennen und
eliminieren, wenn sie vorher durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) geprimt werden.
Dies geschieht durch die Antigenpräsentation mit Hilfe von MHC Klasse I Molekülen (Abb.
1.8). MHC Klasse I Proteine werden von jeder kernhaltigen Körperzelle exprimiert und sind
darauf spezialisiert endogene zytosolische Antigene an CD8-positive T-Zellen zu
präsentieren, um diese zu mobilisieren und zu aktivieren. Exogene Antigene werden durch
MHC Klasse II Moleküle an CD4-positive T-Zellen präsentiert. Um präsentierbare Peptide
aus endogenen Antigenen zu generieren, werden Proteine im Zytosol durch die Peptidasen des
Immunproteasoms mit den Untereinheiten low molecular weight protein (LMP) 2, 7 und 10 in
Peptide gespalten. Da die MHC Klasse I Antigenbindestelle kontrolliert Peptide präsentieren
soll, befindet sich diese im endoplasmatischen Retikulum (ER). Zu präsentierende Peptide
müssen deshalb durch ein Transportersystem mit den Untereinheiten TAP1 und TAP2 in das
Lumen des ER eingeschleust werden, um an MHC I zu binden. Zuerst bindet β2Mikroglobulin (β2-m) an die durch das Chaperon-Protein Calnexin inaktivierte MHC Klasse I
schwere Kette (MHC-HC) und führt dadurch zur Ablösung von Calnexin und zur Integration
in den Peptid-Beladungskomplex (PLC) mit den Chaperonen Tapasin, Calretikulin, ERp57
1 Einleitung
Seite 51
und protein disulfide isomerase (PDI) wie auch den Transporterproteinen TAP1 und TAP2.
Die mittels TAP in das ER transportierten Peptide binden nun an die MHC-HC, der PLC
Komplex dissoziiert und der Komplex aus der MHC Klasse I HC, dem Antigen und β2-m
transloziert mit Hilfe des trans-Golgi Netzwerks an die Oberfläche der Zelle, um das Antigen
an CD8-positive T-Zellen zu präsentieren. (Murphy et al, 2008).
In zahlreichen Tumorerkrankungen wurde eine Herunterregulation oder sogar ein kompletter
Verlust von HLA Klasse I Molekülen beschrieben. Vor allem der Verlust von β2-m, TAP1
und HLA Klasse I schwere Kette Genen wie auch Defekte in der Gentranskription durch
irreversible Mutationen sind hierbei relevant (Seliger, 2008b). Diese veränderte Expression
scheint die Immunevasion in vielen Tumoren, u.a. auch dem NPC, durch die fehlende
Präsentation von Tumor-assoziierten Antigenen zu begünstigen (Ogino et al, 2007; Sengupta
et al, 2006). Aber auch die Expression von immunsuppressiven HLA Klasse I Komponenten
© Dr. Christine Stöhr
Abb. 1.8 Die HLA Klasse I Antigenpräsentationsmaschinerie. Erklärung siehe Text. Freundlicherweise von
Dr. Christine Stöhr, Abteilung für Uropathologie, Pathologisches Institut Erlangen, zur Verfügung gestellt.
1 Einleitung
Seite 52
wie HLA-G und HLA-E in Tumorzellen führt zu einer Unterdrückung des Immunsystems
(Carosella et al, 1999). Die Expression der HLA Klasse I Maschinerie kann aber auch durch
das Mikromilieu reversibel beeinflusst werden. So führen IFN und TNFα zu einer Induktion,
IL4 zur Stabilisierung und IL10 zur Herunterregulation der HLA Klasse I Komponenten
(Seliger, 2008a).
1.4.2 Immunevasionsmechanismen im cHL
Das cHL hat verschiedene Strategien zur Immunevasion entwickelt. Die neoplastischen HRSZellen können Immunevasionsmechanismen vermitteln wie z.B. durch die Expression von
HLA-G, einem nicht klassischen MHC Klasse I Gen, das die tumortoxische Wirkung von
NK-Zellen und CTL unterdrückt (Diepstra et al, 2008), die Deregulation der MasterTranskriptionssysteme NFκB und JAK-STAT (Steidl et al, 2011) oder auch durch die
Expression von EBV-spezifischen Genen wie dem Onkogen LMP1 (Khan, 2006). Außerdem
weist das Mikromilieu des Tumors eine Zusammensetzung von Chemokinen, Zytokinen und
Immunzellen auf, die der Immunevasion dient. So wird das prominent entzündliche Infiltrat
des cHL von TH2- und Treg-Zellen und den entsprechenden Mediatoren geprägt. Treg und
auch HRS-Zellen produzieren IL10 und TGFβ (Skinnider & Mak, 2002), welche
immunsuppressiv wirken und Effektor T-Zellen, vor allem CTL, inhibieren. Auch andere
immunmodulatorische Zytokine sind vorhanden wie IL13, das die Proliferation von B-Zellen
stimuliert oder M-CSF, das zur Rekrutierung/Differenzierung von immunsuppressiven MΦ
führt (Skinnider & Mak, 2002). Proinflammatorische Zytokine, wie TNFα, Lymphotoxin
(LT)α und andere Mitglieder der TNFR-Ligandenfamilie spielen jedoch auch eine wichtige
Rolle in der Pathogenese des cHL, da sie die NFκB Signaltransduktion beeinträchtigen. Im
Weiteren soll besonders auf die Funktion der DC und MΦ und ihre Rolle in der
Immunevasion eingegangen werden.
1.4.2.1 Dendritische Zellen (DC) und ihre Rolle in der Immunevasion
Monozyten (CD14-positiv) und DC Subtypen (CD1c-positiv oder CD141-positiv) entstehen
im Knochenmark aus gemeinsamen myeloiden Vorläuferzellen und werden ins Blut
abgegeben (Collin et al, 2013). Alle DC Subtypen kommen im homöostatischen
1 Einleitung
Seite 53
Gleichgewicht in allen Geweben vor. Plasmazytoide DC (pDC; CD123 positiv) stammen von
lymphoiden Vorläuferzellen ab und produzieren im peripheren Blut nach Stimulation durch
Fremdantigene reichlich IFN vom Typ I. Monozyten können aus dem Blut in entzündetes
oder infiziertes Gewebe rekrutiert werden und in DC oder auch MΦ ausdifferenzieren. Im
unreifen Zustand sind DC vor allem phagozytierende Zellen, die eine geringe zytotoxische
Wirkung haben und eine wichtige Rolle bei der Prozessierung von Antigenen spielen. Unreife
DC
zeigen
eine
geringe
Expression
von
kostimulatorischen
Molekülen
und
Adhäsionsmolekülen (CD40, CD54, CD58, CD80, CD86 etc.) und eine hohe Konzentration
von intrazellulären MHC Klasse I und II Molekülen (Banchereau & Steinman, 1998).
Fremdantigene, Zytokine oder auch Erregermoleküle wie bakterielles Lipopolysaccharid
(LPS) vermitteln Gefahrensignale, die zur Aktivierung von NFκB und damit zur
Mobilisierung von DC führen. DC migrieren in die T-Zell Zone lymphatischer Organe
(homing) und reifen dort. Das homing wird durch die Induktion des Chemokinrezeptors CCR7
auf DC und die Produktion der CCR7 Liganden CCL19/Epstein-Barr virus-induced molecule
1 ligand chemokine (ELC) und CCL21/secondary lymphoid-tissue chemokine (SLC) in den
lymphatischen Organen vermittelt. Die Fähigkeit zur Aufnahme und Prozessierung von
Antigenen ist bei reifen DC im Vergleich zu unreifen Formen deutlich reduziert, während die
Fähigkeit zur Antigenpräsentation an naive T-Zellen im Lymphknoten dominiert und
optimiert ist. Folglich ist die Oberflächenexpression von MHC Klasse I und II, aber auch die
Expression von kostimulatorischen und Adhäsionsmolekülen stärker als in unreifen Formen
(Banchereau & Steinman, 1998). Ebenso wird der Reifungsmarker myeloider DC CD83
verstärkt exprimiert (Banchereau & Steinman, 1998), während monozytäre Marker wie CD14
und CD68 herunterreguliert werden. Bei fehlerhafter Antigenpräsentation oder fehlenden/
unkoordinierten kostimulatorischen Signalen, lösen DC keine Aktivierung der T-Zellen,
sondern einen Zustand der Toleranz gegenüber dem präsentierten Antigen aus. Damit bilden
DC eine Schnittstelle zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem und
entscheiden über dessen Aktivierung oder Toleranzausbildung (Murphy et al, 2008) .
Um humane DC Kolonien in vitro zu erzeugen, wurden zunächst CD34-positive
Vorläuferzellen aus Knochenmark oder Nabelschnurblut isoliert und in halbfestem Medium
mit GM-CSF und TNFα stimuliert (Young et al, 1995). Durch Zugabe weiterer Zytokine oder
Verwendung anderer Zytokinkombinationen können verschiedene DC Subtypen generiert
werden wie z.B. Langerhanszell-ähnliche DC durch die Zugabe von TGFβ (Strobl et al,
1996). Die jedoch am häufigsten verwendeten Vorläuferzellen zur Generierung von
1 Einleitung
Seite 54
myeloiden DC sind Blutmonozyten, die bis zu sechs Tagen mit GM-CSF und IL4 stimuliert
werden (Romani et al, 1996; Sallusto & Lanzavecchia, 1994). Zur Induktion der Reifung
wurde zunächst TNFα verwendet, das später noch durch die Zugabe von IL1β, IL6 und PGE2
ergänzt wurde, um eine potente DC Reifung zu erzielen (Jonuleit et al, 1997).
Obwohl in vielen Tumoren DC detektiert werden, wird, trotz ihrer hohen Kapazität Antigene
zu präsentieren, keine effektive Immunantwort initiiert. Die genaue Ursache hierfür ist noch
nicht geklärt, es scheint aber eher ein komplexes Zusammenspiel vieler deregulierter
Mechanismen zu sein. Mögliche Mechanismen wären eine sehr geringe Anzahl an
infiltrierenden DC, eine beeinträchtigte Signaltransduktion und Zytokinproduktion, eine
ineffektive Antigenpräsentation, das Fehlen von kostimulatorischen Signalen, sowie eine
gestörte Reifung der DC (Gabrilovich, 2004; Hillenbrand et al, 1999).
1.4.2.2 Makrophagen (MΦ) und ihre Rolle in der Immunevasion
MΦ sind in vielen lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben ortständig und sorgen durch
den Abbau von apoptotischen Zellen und Zellschrott sowie durch die Produktion von
Wachstumsfaktoren für die Gewebshomöostase (Geissmann et al, 2010). Sie haben je nach
Gewebe unterschiedliche Funktionen und Phänotypen und dementsprechend auch
unterschiedliche Bezeichnungen wie z.B. Kupffer-Zellen der Leber, Alveolar-MΦ der Lunge
und Mikrogliazellen des zentralen Nervensystems. Zudem gehören MΦ zusammen mit
Granulozyten und DC zu den phagozytierenden Zellen des Immunsystems und bilden neben
den neutrophilen Granulozyten die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems.
Im Falle einer Entzündung können Monozyten in höherem Maße als im Normalzustand in das
jeweilige Gewebe rekrutiert werden und in Abhängigkeit von dem inflammatorischen Milieu
zu MΦ ausdifferenzieren. Durch ihre Ausstattung mit diversen Oberflächenrezeptoren sind
MΦ in der Lage eine effektive Immunantwort gegen zahlreiche Pathogene zu bewirken.
Besonders die Mannose (CD206)-, scavenger (CD163)-, β-Glukan-, Komplement- und FcRezeptoren detektieren spezifische Motive von Pathogenen oder opsonierte Antigene und
initiieren deren Phagozytose. MΦ sind als APC auch an der spezifischen Immunabwehr
beteiligt und bilden wie die DC eine Schnittstelle zwischen dem angeborenen und erworbenen
Immunsystem. Jedoch wandern MΦ nicht zu lymphatischen Geweben aus, sondern
präsentieren die Antigene lokal an bereits aktivierte T-Lymphozyten und sind damit eher an
1 Einleitung
Seite 55
der Aufrechterhaltung der spezifischen Immunreaktion oder der Abwehr bei einer Reinfektion
beteiligt. Zudem findet die anschließende Wundheilung unter Einbeziehung spezifisch
ausdifferenzierter MΦ statt. Damit weisen MΦ ein breites Funktionsspektrum und eine hohe
Plastizität auf, die durch das umgebende Milieu moduliert werden. Trotz ihrer phänotypischen
Vielfalt ist allen MΦ-Subtypen die Expression der typischen Marker CD68 (Bestandteil
intrazellulärer lysosomaler Membranproteine) und CD11b (involviert in Adhäsion, Migration,
Chemotaxis und Phagozytose) gemeinsam. Auch wenn MΦ ein Kontinuum an funktionellen
Stadien aufweisen, werden sie modellhaft analog zu der Typ I und II Entzündungsreaktion in
zwei extreme Polarisationszustände, namentlich die M1 (klassisch) und M2 (alternativ)
Polarisation, eingeteilt (Abb. 1.9; (Sica et al, 2006)). Die Polarisation in M1 MΦ wird durch
INFγ, das bakterielle LPS sowie andere bakterielle Produkte initiiert und ist durch eine hohe
Produktion von IL12, IL23 und anderen proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen
gekennzeichnet, wodurch eine Aktivierung der Typ I Abwehrreaktion vermittelt wird (Sica et
al, 2006). M1 MΦ exprimieren zudem Rezeptoren zur Antigenpräsentation (HLA-DR) und
Opsonierung (CD16). Auch GM-CSF führt zur Entstehung von MΦ mit M1 Funktionen.
Diese wurden als MΦ-1 bezeichnet und bilden eine Vorstufe von aktivierten MΦ mit
verminderter Fähigkeit zur Phagozytose (Verreck et al, 2006). Durch die hohe Produktion
toxischer Substanzen wie reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffintermediate (RNI, ROI)
besitzen M1 MΦ großes Potential zur Eliminierung von Mikroorganismen und Tumorzellen.
Die Polarisation in M2 MΦ wird u.a. durch die Zytokine IL4, IL13, IL10 und durch Vitamin
D3 vermittelt (Sica et al, 2006). Die unterschiedlichen Stimuli führen zu mindesten 3
Subtypen von M2 MΦ, die anhand ihrer spezifischen Funktionen subklassifiziert werden. M2
MΦ aktivieren je nach Stimulus eine Typ II Entzündung, wirken immunregulierend (IL10
Produktion) oder sind durch ihr hohes phagozytotisches Potential (CD163, CD206) am
Umbau von Geweben beteiligt, was die Angiogenese und damit auch den Tumorprogress
fördern kann (Mantovani et al, 2002). M2 MΦ sind zwar phagozytotisch aktiv, sind jedoch
nicht in die Antigenpräsentation involviert. Auch M-CSF induziert MΦ mit M2 Eigenschaften
(MΦ-2) wie der Expression von CD206 und CD163, die eine Vorstufe von aktivierten M2
MΦ repräsentieren (Verreck et al, 2006).
MΦ haben homöostatische und reparative aber auch proinflammatorische Funktionen. Ist ihr
funktionelles Potential nicht adäquat reguliert, kommt es zur Entstehung diverser
Erkrankungen. So sind MΦ mit unkontrollierter proinflammatorischer Aktivität mit
1 Einleitung
Seite 56
Abb. 1.9 Modell der Polarisation von MΦ. Erklärung siehe Text. Übernommen aus Sica et al, 2006.
Autoimmunerkrankungen und chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Atherosklerose,
Asthma, entzündlichen Darmerkrankungen, rheumatoider Arthritis und Fibrose assoziiert
(Wynn et al, 2013). Auf der anderen Seite spielen immunsuppressive MΦ eine Rolle in vielen
malignen Tumoren. MΦ sind unter den Leukozyten des inflammatorischen Infiltrats im
Tumor die am häufigsten vorkommende Komponente (Mantovani et al, 2002). Sie werden
hauptsächlich durch die im Tumor produzierten Chemokine M-CSF und CCL2/monocyte
chemotactic protein (MCP-1), aber auch durch GM-CSF, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8 und
VEGF rekrutiert (Murdoch et al, 2004). Tumor-assoziierte MΦ (TAM) werden dann vom
Tumor “erzogen” Mediatoren zu produzieren, die dem Tumor nützlich sind (Abb. 1.10; (Sica
et al, 2006)). Durch die Produktion von IL10, TGFβ und diversen Chemokinen wird die
adaptive Immunantwort unterdrückt, während Wachstumsfaktoren, TNF, Chemokine und
TGFβ sowie die Aktivierung von MMPs die Invasionsfähigkeit und Angiogenese des Tumors
erhöhen und sowohl das Wachstum als auch das Überleben des Tumors fördern (Biswas &
Mantovani, 2010; Mantovani & Locati, 2013; Pollard, 2004; Sica et al, 2006). Darüber hinaus
weisen TAM eine nur geringe tumortoxische Kapazität und geringes antigenpräsentierendes
Potential und somit einen M2 MΦ-ähnlichen Phänotyp auf (Mantovani et al, 2004; Verreck et
al, 2006). In Abhängigkeit vom Tumormilieu, unter normoxischen Bedingungen und bei guter
Vaskularisierung können TAM jedoch auch antitumorale Wirkung aufweisen und eher M1
1 Einleitung
Seite 57
Abb. 1.10 Wirkmechansimen tumor-assoziierter Makrophagen. Erklärung siehe Text. Übernommen aus Sica
et al, 2006.
MΦ-ähnliche Funktionen ausüben (Biswas et al, 2008; Mantovani & Locati, 2013; Movahedi
et al, 2010). Ausschlaggebend für den TAM Phänotyp sind auch Tumorart und Tumorstadium
(Coffelt et al, 2009). TAM können daher nicht strikt in M1 oder M2 MΦ kategorisiert
werden, sondern scheinen einen plastischen, gemischten Phänotyp aufzuweisen. Ist aber die
Ausdifferenzierung abgeschlossen, können M2 MΦ auch durch erneute Stimulation keine
proinflammatorischen Signale mehr vermitteln (Verreck et al, 2006). Die potentiell
protumorigene Rolle von TAM wurde in verschiedenen Malignomen festgestellt (Bingle et al,
2002; Lewis & Pollard, 2006) und im cHL zum ersten Mal vor einigen Jahrzehnten
beschrieben und aktuell mittels Genexpressionsanalyse und immunhistochemischen Studien
bestätigt (Coppleson et al, 1973; Kamper et al, 2011; Ree & Kadin, 1985; Steidl et al, 2010;
Tan et al, 2012; Yoon et al, 2012; Zaki et al, 2011)
1 Einleitung
Seite 58
1.5 Zielsetzung
EBV wurde aufgrund seiner Assoziation mit verschiedenen Malignomen, u.a. dem NPC und
dem cHL, von der IARC als Klasse 1 Karzinogen eingestuft. In dieser Arbeit sollen
Immunevasionsmechanismen EBV-assoziierter Tumore untersucht werden.
1.5.1 c-Myc und EBV-kodiertes LMP1 als potentiell gegensätzlich wirkende Regulatoren
der HLA Klasse I APM in epithelialen Zellen
EBV-kodiertes LMP1 induziert Komponenten der HLA Klasse I APM, was zunächst im
Hinblick auf die Immunevasion im NPC kontraintuitiv erscheint. Im NPC wurde jedoch kein
Unterschied in der Expression von verschiedenen HLA Klasse I APM Untereinheiten
zwischen LMP1-negativen und LMP1-positiven NPC Fällen festgestellt (Ogino et al, 2007).
In einem epithelialen Zellkultursystem soll geklärt werden, ob LMP1 über die Regulation von
STAT3 und c-Myc die Expression der HLA Klasse I APM moduliert und damit
möglicherweise einen wichtigen Mechanismus der Immunevasion beeinflusst.
1.5.2 MΦ und reife DC als Akteure in der Immunreaktion des cHL
Das cHL ist durch ein prominentes reaktives inflammatorisches Infiltrat gekennzeichnet,
welches jedoch nicht zur effektiven Abtötung der Tumorzellen führt. Es soll hier die
Interaktion von malignen cHL Zellen mit mDC und MΦ untersucht werden. Hierzu wird die
Verteilung von reifen und unreifen mDC und MΦ in Geweben von cHL analysiert und deren
Einfluss auf das Überleben der Patienten untersucht. Zusätzlich wird in ausgewählten Fällen
die Expression von einigen Zytokinen, die eine Rolle bei der DC Reifung und/oder MΦPolarisation spielen, bestimmt. Ein Zellkultursystem dient als Modell, um den Einfluss von
cHL-Zelllinien auf die Reifung von aus peripheren Blutmonozyten generierten (mo)DC und
die Polarisation von MΦ wie auch den Effekt von moDC und MΦ auf die Proliferation von
cHL-Zelllinien zu ermitteln. Es soll geklärt werden, ob der Einfluss von cHL Zellen auf die
Reifung von DC und die Polarisation von MΦ zur Immunevasion beitragen könnte.
2 Material und Methoden
Seite 59
2 Material und Methoden
2.1 Hodgkin-Lymphom-Gewebe und Zellkultur
2.1.1 Hodgkin-Lymphom-Gewebe
Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe von 106 klassischem
Hodgkin Lymphom (cHL) Patienten, 8 nodulär Lymphozyten-prädominantem HL (nlpHL)
Patienten und 10 Patienten mit reaktiver Lymphadenopathie wurde aus dem Archiv des
pathologischen Institutes des Universitätskrankenhauses Erlangen, Deutschland, gesammelt.
Klinische Daten zu allen Patienten wurden mit Hilfe des Tumorzentrums Erlangen
zusammengetragen und in eine SPSS Tabelle eingetragen und im Rahmen der Doktorarbeit
aktualisiert. Material von 106 Fällen stammte von der Biopsie bei Erstdiagnose und von 8
Fällen von der Biopsie eines Rezidivs. In 110 Fällen wurde das HL im Lymphknoten
diagnostiziert, in zwei Fällen in Nasopharynxgewebe, in einem Fall in Thymusgewebe und in
einem Fall in einer Speicheldrüse.
Immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen CD1a, CD83, CD68, CD123 und
CD163 wurden zur Charakterisierung des Entzündungsinfiltrates im HL im pathologischen
Institut durchgeführt und von einem erfahrenen Pathologen ausgewertet.
2.1.2 Kultivierung von Zellen
RHEK1 und HeLa Zelllinien
Die RHEK1 Zelllinie ist eine humane immortalisierte Keratinozytenzelllinie der Vorhaut. Die
LMP1 exprimierenden RHEK1/LMP1 Zellen wurden durch stabile Transfektion mit einem
pcDNA3-LMP1 Plasmid, in dem LMP1 des EBV Stammes B95-8 unter der Kontrolle des
CMV immediate early Promotors exprimiert wird, generiert (Siegler et al, 2004). Die Zellen
wurden mit 400 µg/ml G418 (Roth, Karlsruhe, Deutschland) selektioniert. Die parentale
RHEK1 Zelllinie diente als Kontrolle.
Die Zervixkarzinom-Zelllinie HeLa wurde stabil mit dem pSV2.gpt.MTLM Plasmid, das die
Expression von LMP1 durch einen mit ZnSO4 induzierbaren Metallothionein-Promotor
reguliert, transfiziert (Eliopoulos et al., 1997). Stabile Klone wurden mit 25 µg/ml
Mykophenolsäure, 10 µg/ml Hypoxanthin und mit 160 µg/ml Xanthin (Sigma-Aldrich,
Deisenhof, Deutschland) selektioniert. Die Expression von LMP1 wurde kontinuierlich mit 10
2 Material und Methoden
Seite 60
µM ZnSO4 (Sigma-Aldrich) oder in Experimenten mit 20 µM ZnSO4 stimuliert. Die parentale
Zelllinie diente als Kontrolle.
Alle Zelllinien wurden in RPMI-1640 + GlutaMAX + NaHCO3 Medium (Sigma-Aldrich) mit
10% fötalem Kälberserum (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland), 50 U/ml Penicillin und 50
µg/ml Streptomycin (Invitrogen) bei 5% CO2-Pratialdruck und 37°C kultiviert. Die Zellen
wurden freundlicherweise von LS Young, Birmingham, UK, zur Verfügung gestellt.
L1236 und HDLM2 Zelllinien
Die L1236 Zelllinie stammt aus dem peripheren Blut eines Patienten mit cHL vom Mischtyp
(Stadium IV, Therapie-refraktär, terminal, drittes Rezidiv) und die HDLM2 Zelllinie aus dem
Pleuraerguss eines Patienten mit cHL vom nodulär-sklerosierenden Typ (Stadium IV). Die
beiden Suspensionszelllinien wurden in RPMI-1640 + L-Glutamin + NaHCO3 Medium mit
10% fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin bei 5% CO2Pratialdurck und 37°C kultiviert. Beide Zelllinien wurden bei der DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Braunschweig, Deutschland)
erworben.
Generierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus PBMC
Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) wurden aus 40 ml heparinisiertem
humanem Blut von 40 gesunden Spendern (Durchschnittsalter: 35 Jahre) mittels Ficoll-Paque
(GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Dazu
wurden pro Proband je 15 ml Ficoll in zwei 50 ml Falcon Tubes vorgelegt. Bei der
Blutentnahme wurden 40 ml peripheres Blut in zwei 20 ml Spritzen mit Heparin (Ratiopharm,
Ulm, Deutschland) aufgezogen. Das Heparin, zur Unterdrückung der Blutgerinnung, wurde
mit 0,9% NaCl zu einer Konzentration von 100 IE/ml vorverdünnt und dem Blut zu einer
Endkonzentration von 10 IE/ml Heparin (Ratiopharm) zugesetzt. Je 20 ml Blut wurden dann
mit 10 ml PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4 x 2H2O, 3 mM NaH2PO4 x H2O, pH 7,4 (mit
NaOH eingestellt), ad Milli-Q H2O; autoklaviert; Roth) verdünnt und anschließend vorsichtig
in extremer Schieflage auf das vorgelegte Ficoll aufgetragen. Der erste Zentrifugationsschritt
bei 1600 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 20 min bei minimal eingeschalteter Bremse
(Stufe 1) führte zur Auftrennung der zellulären Blutbestandteile in Plasma (mit
Thromobozyten), Interphasering mit PBMC und Erythrozyten (Abb. 2.1). Die beiden Plasmen
2 Material und Methoden
Seite 61
verdünntes,
heparinisiertes
Blut
1600 rpm
20 min
Plasma,
Thrombozyten
PBMC
Ficoll
Ficoll
Erythrozyten,
Granulozyten,
Thrombozyten
Abb. 2.1 Ficoll Dichtegradienten-Zentrifugation
und Interphaseringe eines Spenders wurden in ein neues 50 ml Falcon Tube überführt und bei
1800 rpm für 10 min mit eingeschalteter Bremse (Stufe 8) zentrifugiert. Das Pellet wurde in
500 µl PBS aufgenommen und mit weiteren 5 ml PBS und 5 ml Medium (RPMI-1640 + LGlutamin + NaHCO3 Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin und 50
µg/ml Streptomycin) bei 1300 rpm für 10 min zentrifugiert. Die selektive Entfernung der
Thrombozyten erfolgte über drei Waschschritte mit 5 ml PBS und 5 ml Medium bei niedriger
Umdrehungszahl (1000 rpm) für 8 min. Das Pellet (zumeist 80 – 100 x 106 PBMC) wurde in
5 ml Medium aufgenommen, in eine T25 Zellkulturflasche überführt und für 2 h bei 37°C und
5% CO2 inkubiert. Monozyten wurden in dieser Zeit adhärent. Nicht adhärente Zellen wurden
nach dieser Zeit durch viermaliges Spülen mit 5 ml 37°C warmem PBS und Medium (1:1)
entfernt. Dabei wurde die Zellkulturflasche mehrfach auf die Unterlage geklopft, um auch
nur schwach adhärente Zellen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen wurden in 5 ml
Medium aufgenommen. Um DC zu generieren, wurden die Monozyten für 6 Tage mit 25
ng/ml rekombinantem humanem GM-CSF (CellGenix, Freiburg, Deutschland) und 10 ng/ml
rekombinantem humanem IL4 (CellGenix) behandelt. An Tag 2 und 5 wurden die Zytokine
in 1 ml Medium erneuert. Die so generierten DC entwickelten in den 6 Tagen einen typischen
Phänotyp mit verzweigten, dendritischen Zytoplasma-Ausläufern (Abb. 3.10 A).
Zur Generierung von MΦ-1 wurden die nach dem Waschen verbleibenden Monozyten für 5
Tage mit 5 ml Medium und 50 ng/ml rekombinantem humanem GM-CSF und für die
Generierung von MΦ-2 mit 50 ng/ml rekombinantem humanem M-CSF (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA) inkubiert. Die MΦ-1 entwickelten in der Zeit einen typischen
Spiegelei-artigen, sogenannten fried egg Phänotyp und die MΦ-2 eine typische
spindelförmige Morphologie (Abb. 3.10 A). Die so generierten Zellen wurden in RPMI-1640
+ GlutaMAX + NaHCO3 Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin und 50
µg/ml Streptomycin bei 5% CO2-Pratialdurck und 37°C kultiviert.
2 Material und Methoden
Seite 62
Generierung von B-Zellen aus PBMC
Zur Isolierung von B-Zellen mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) mithilfe von MSSäulen und dem OctoMACS Separator (MACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Germany) wurden 108 PBMC (in PBS, 2 mM EDTA) bei 1000 rpm für 10 min zentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 600 µl Puffer (0,5% bovines Serumalbumin (BSA)-PBS, 2 mM
EDTA) unter der Zugabe von 200 µl FcR blocking reagent und 200 µl CD19 MicroBeads
(MACS Miltenyi Biotec) resuspendiert und 15 min bei 4°C inkubiert. Danach wurden die
Zellen in 10-20 ml Puffer gewaschen, in 500 µl Puffer aufgenommen und durch ein Zellsieb
mit 30 µm Poren vereinzelt. Darauf wurden die MS-Säulen in den OctoMACS Magneten
eingebracht, mit 50 µl Puffer gespült und dann die zu sortierende Zellsuspension auf die
Säulen aufgetragen. Die durch magnetische Beads markierten CD19-positiven Zellen
verblieben somit aufgrund der magnetischen Anhaftung in der Säule und CD19-negative
Zellen wurden durch dreimaliges Waschen entfernt. Schließlich wurden die mit CD19positiven Zellen beladenen Säule aus dem Magnetfeld entfernt und die CD19-positiven Zellen
mit 1 ml Puffer herausgespült, bei 1200 rpm für 4 min zentrifugiert, und gezählt. Auf diese
Weise gewonnene B-Zellen wurden daraufhin in einer Konzentration von 106 B-Zellen/ml für
48 h in RPMI Medium inkubiert, um Überständen zu generieren.
Quantifizierung und Überprüfung der Vitalität der Zellen
Die Anzahl der Zellen wurde mittels Trypanblau-Färbung bestimmt. 10 µl der Zellsuspension
wurde mit 10 µl Trypanblau (Sigma-Aldrich) gemischt. Davon wurden 10 µl in eine
Neubauer-Zählkammer (Neubauer Improved Bright-Line, Laboroptik, Lancing, UK)
pipettiert. Tote Zellen zeigten aufgrund der erhöhten Permeabilität der Zellmembran eine
dunklere Färbung und konnten dadurch von den lebendigen mikroskopisch gut unterschieden
werden. Die lebenden Zellen in den vier Eckquadraten wurden bestimmt. Die
durchschnittliche Anzahl wurde mit dem Verdünnungsfaktor 2 und dem Kammerfaktor 104
multipliziert, um die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen.
Sämtliche Zelllinien des pathologischen Instituts, einschließlich der hier verwendeten, wurden
routinemäßig mittels polymerase chain reaction (PCR) zum Ausschluss einer Kontamination
mit Mycoplasmen untersucht und gegebenenfalls behandelt.
Alle Materialien für die Durchführung der Zellkulturarbeiten wurden bei Greiner Bio One
(Frickenhausen, Deutschland), Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland) und Corning Incorporated
Costar (Amsterdam, Niederlande) bestellt.
2 Material und Methoden
Seite 63
2.1.3 Generieren von Überständen
Zur Generierung von Überständen der Zelllinien L1236 und HDLM2 zur Behandlung von
monocyte-derived (mo)DC, MΦ-1 und MΦ-2 wurden 1 x 106 Zellen/ml für 48 h bei 37°C und
5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden am Ende der Inkubationszeit abzentrifugiert, die
Überstände filtriert und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Da die cHLZelllinien sehr stoffwechselaktiv waren, wurden in den folgenden Versuchen nur 50% der
Überstände eingesetzt und durch 50% frisches Medium ergänzt. Um Überstände von moDC,
MΦ-1 und MΦ-2 herzustellen, wurden 5 x 105 Zellen/ml für 48 h bei 37°C und 5% CO2
inkubiert. Die Überstände wurden abzentrifugiert und bei -80°C aufbewahrt. Da diese
Primärzellen deutlich weniger stoffwechselaktiv waren, wurden in allen folgenden Versuchen
90% der Überstände eingesetzt und durch 10% frisches Medium ergänzt.
2.1.4 Zytospins und Immunzytochemie
MΦ-1 oder MΦ-2 wurden mit L1236 im Verhältnis von 6:1 in einer Gesamtkonzentration von
3,5 x 105 Zellen/ml in 24-Well Platten für 48 h mit 50% MΦ-konditioniertem Medium
(Medium der ersten 5 Tagen der MΦ Generierung) inkubiert. Zur Herstellung der
Zytozentrifugationspräparate wurden die Zellen mit PBS gewaschen und gezählt. Max. 1 x
105 Zellen wurden in 200 µl PBS aufgenommen und in einen speziellen trichterförmigen
Aufsatz, der auf einem mit Filterpapier ausgestatteten Objektträger aufgesetzt wurde,
pipettiert. Die Flüssigkeit der Zellsuspension wurde durch das Filterpapier aufgenommen und
durch eine zentrale runde Aussparung im Filterpapier konnten die Zellen mittels ZytospinZentrifuge auf den Objektträger bei 1000 U/min für 10 min unter Ausnutzung der
Zentrifugalkraft aufgebracht werden. Die Zellen wurden an der Luft getrocknet und
anschließend mit eiskaltem Aceton (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) für 10 min bei
-20°C fixiert. Die Ki67/CD68 Doppelfärbung wurde im Forschungslabor des pathologischen
Instituts Erlangen durchgeführt und von einem erfahrenen Pathologen ausgewertet.
2.1.5 Fotodokumentation von Zellkultur und Immunhistologien
Phasenkontrast-Aufnahmen
von
Monozyten,
moDC,
MΦ-1
und
MΦ-2
und
Fluoreszenzaufnahmen der BrdU Assays von MΦ und L1236 Kokulturexperimenten wurden
2 Material und Methoden
Seite 64
mit einem 10x/0.30 Ph1 Objektiv an einem Olympus IX81 Mikroskop mit Hilfe der cellSens
dimension Software (Olympus, Hamburg, Deutschland) aufgenommen. Bilder von
immunhistochemischen Färbungen wurden mit einem 10x/25 Okular und einem 40x/0.75
Objektiv an einem Zeiss Imager.A1 mit Hilfe der AxioVision SE64 Rel.4.8 Software (Zeiss,
Göttingen, Deutschland) aufgenommen.
2.2 Analysen auf RNS/DNS-Ebene
2.2.1 Transiente reverse Transfektion von RHEK1 Zellen
RHEK1 Zellen wurden mithilfe von Lipofectamin LTX PLUS (Invitrogen) transient revers
mit LMP1, c-myc oder beiden Plasmiden (ko-)transfiziert. Das pLNSX-LMP1 Plasmid und
der dazugehörige Leervektor pLNSX wurden freundlicherweise von LS Young, Birmingham,
UK, zur Verfügung gestellt. Das pcDNA3-c-myc Plasmid wurde von der Firma addgene
(Cambridge, MA, USA) bezogen (Ricci et al, 2004). Als korrespondierender Kontrollvektor
diente das pcDNA3 Plasmid. Eine konstante Menge von 2 µg DNS wurde pro Probe
eingesetzt, davon jeweils 1 µg pLNSX/pLNSX-LMP1 und 1 µg pcDNA3/pcDNA3-c-myc
Plasmid.
Die Plasmid-DNS wurde mit 100 µl Optimem (Invitrogen) und anschließend 2 µl PLUS
Reagenz versetzt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Plus-Reagenz diente zur
Entspiralisierung der DNS zur Erleichterung des Einbringens von Fremd-DNS. Zu diesem
Mix wurden 3 µl Lipofectamin pipettiert und weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Der gesamte Transfektionsmix wurde in eine 12-Well Platte vorgelegt und mit 900 µl
RHEK1-Zellsuspension überschichtet. Für Genexpressionsanalysen mittels qRT-PCR wurden
die Zellen in einer Konzentration von 2,0 x 105/ml ausgesät und für 48 h mit dem
Transfektionsmix
bei
37°C
und
5%
CO2
inkubiert.
Für
Western
Blots
oder
durchflusszytometrische Analysen wurden die Zellen in einer Konzentration von 0,8 x 105/ml
ausgesät und für 96 h mit dem Transfektionsmix bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Das
Medium wurde nach 48 h gewechselt.
2 Material und Methoden
Seite 65
2.2.2 SYBR-Green basierte qRT-PCR
Isolierung der Gesamt-RNS von humanen Zelllinien
Die Gesamt-RNS von unbehandelten, c-myc-Knockdown oder LMP1 und/oder c-myc
transfizierten RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 Zellen wurde unter
Verwendung eines kommerziell erwerblichen Kits (RNeasy Kit, Qiagen, Hilden,
Deutschland) isoliert. Die adhärenten Zellen (max. 5 x 106) wurden zweimal mit PBS
gewaschen und mit 350 µl RLT Lysepuffer versetzt. Die adhärenten Reste der lysierten Zellen
wurden mit einem Zellschaber vom Boden des Zellkulturgefäßes gelöst. Die Suspension
wurde darauf in ein 1,5 ml Eppendorf Tube überführt und bis zur vollständigen Lyse
gevortext. Die lysierten Zellen wurden dann mittels QIAshredder (Qiagen) homogenisiert.
Alle weiteren Schritte wurden nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die isolierte
RNS wurde in PCR-Grade Nuklease-freiem Wasser (Qiagen) aufgenommen, mittels
Nanodrop-Spektrophotometrie (Spektrophotometer ND-1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland)
gemessen und bei -80°C aufbewahrt.
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Die Reverse Transkription wurde unter Verwendung der RevertAid Reversen Transkriptase
von Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland) durchgeführt. Folgende Reagenzien (Fermentas)
wurden eingesetzt:
500 ng
RNS
2 µl
dNTPs
1 µl
Random Hexamers
ad 14,5 µl
PCR-Grade nukleasefreies Wasser
Zur Denaturierung der RNS (vor allem bei hohem GC-Gehalt) und damit Anlagerung der
random Hexamere wurden die Proben für 5 min bei 65°C inkubiert und danach sofort wieder
auf Eis gestellt. Anschließend wurden 4µl 5x RT-Puffer, 0,5 µl RiboLock RNAse Inhibitor
(40 U/µl) und 1 µl RevertAid Reverse Transkriptase (200 U/µl) zugegeben (Fermentas), so
dass jeweils ein Endvolumen von 20 µl erreicht wurde. Die Reverse Transkription wurde in
einem Thermo Hybaid HBPXE02 Thermal Cycler (Ashford, UK) durchgeführt und fand unter
folgenden Bedingungen statt: 10 min 25°C, 60 min 42°C, 10 min 70°C. Das entstandene
Produkt wurde 1:5 mit PCR-Grade Nuklease-freiem Wasser für qRT-PCR Analysen verdünnt
und bei -20°C aufbewahrt.
2 Material und Methoden
Seite 66
Primersequenzen, Primeroptimierung und Primereffizienzberechung für qRT-PCR
Die Sequenzen der Primer für SYBR-Green basierte qRT-PCR sind einschließlich der
jeweiligen Amplikongröße in Tab. 2.1 aufgeführt. Der c-myc Primer wurde für die Detektion
von zellulären c-myc Transkripten und c-myc (pcDNA3) für die Detektion von pcDNA3-cmyc-Plasmid Transkripten verwendet. Der GAPDH (RHEK1) Primer wurde als
housekeeping-Gen für RHEK1 und GAPDH (HeLa) als housekeeping-Gen für HeLa
verwendet. Die Primer wurden so ausgewählt, dass folgende Kriterien erfüllt wurden:
 Schmelztemperatur ca. 60°C
 Amplikongröße unter 300 bp
 Primerlänge ca. 20 bp
 Spezifische Schmelzkurve ohne Bildung von Primerdimeren (Abb. 2.2)
 Spezifität der Primer für die Zielsequenz (BLAST Test)
Gen
Primersequenz 5‘  3‘
Amplikongröße Referenz
For: ctc gcg cta ctc tct ctt
β2-m
Rev: aag acc agt cct tgc tga
217 bp
For: cag ctg ctt aga cgc tgg att
c-myc
Rev: gta gaa ata cgg ctg cac cga
Diosdado et al,
131 bp
For: atc tgc gac ccg gac gac ga
c-myc (pcDNA3)
Rev: gtt cgg gct gcc gct gtc tt
Respa et al, 2011
2009
Primer Designing
144 bp
Tool, NCBI
151 bp
Dahl et al, 2007
For: tgg tca cca ggg ctg ctt
GAPDH (HeLa)
Rev: agc ttc ccg ttc tca gcc tt
For: gaa ggt gaa ggt cgg agt
GAPDH (RHEK1)
Rev: gaa gat ggt gat ggg att tc
T Rau, Erlangen,
226 bp
For: gca gct cag atc acc aag
HLA-A
Rev: ctg cca ggt cag tgt gat ct
Primer Designing
240 bp
For: agg cgg cgg tca tag tca t
LMP1 (pLNSX)
Rev: ccg tgg ggg tcg tca tca
Deutschland
Tool, NCBI
LS Young,
108 bp
Birmingham, UK
297 bp
Respa et al, 2011
297 bp
Respa et al, 2011
For: tgc tgc atc caca ta acc at
LMP2
Rev: tgt gca ctc tct ggt tca gc
For: gga atc tct ggc aaa gtc ca
TAP1
Rev: tgg gtg aac tgc atc tgg ta
Tab. 2.1 Primer für SYBR-Green basierte qRT-PCR
2 Material und Methoden
Seite 67
Die optimale Konzentration der Primer lag bei 250 nM. Um die Effizienz der Primer zu
bestimmen, wurde die Ct slope method verwendet. Dazu wurden Standardkurven aus acht
1:10-Verdünnungen eines erfolgreich amplifizierten qRT-PCR-Produktes erstellt, aus deren
Steigung die Primereffizienz bestimmt wurde. Für Primer, die für die Transkriptionsanalysen
in RHEK1 eingesetzt wurden, wurden folgende Effizienzen ermittelt:
 β2-m:
93,9%
 c-myc:
93,8%
 c-myc (pcDNA3):
84,3%
 GAPDH (RHEK1):
94,7%
 HLA-A:
91,7%
 LMP1 (pLNSX):
94,8%
 LMP2:
86,9%
 TAP1:
87,9%
Für Primer, die für die Transkriptionsanalysen in HeLa eingesetzt wurden, wurden folgende
Effizienzen ermittelt:
 β2-m:
95,3%
 c-myc:
92,4%
 GAPDH (HeLa):
88,6%
 HLA-A:
95,3%
 LMP2:
90,4%
 TAP1:
90,7%
Weiterhin wurden alle Primer mittels PCR auf ihre Spezifität hin überprüft. Es konnte gezeigt
werden, dass pro Primerpaar ein Amplikon mit spezifischer Länge nachweisbar war.
Derivative Reporter (-Rn)
2 Material und Methoden
Seite 68
β2-m
c-myc
c-myc (pcDNA3)
GAPDH
(HeLa)
GAPDH
(RHEK1)
HLA-A
LMP1
(pLNSX)
LMP2
TAP1
Temperatur ( C)
Abb. 2.2 Spezifische Schmelzkurven aller verwendeten Primer bei einer Konzentration von 250 nM
2 Material und Methoden
Seite 69
SYBR-Green basierte qRT-PCR
Es wurde ein two-step protocol durchgeführt, was die Umschreibung der isolierten RNS in
cDNS (siehe oben) vor der relativen Quantifizierung der Genexpression mittels qRT-PCR
beinhaltete. Die Nukleinsäure-interkalierende Eigenschaft des Fluoreszenzmarkers SYBRGreen diente zur Messung der Genreplikation. Alle Messungen wurden in speziellen 96-Well
Platten (MicroAmp, Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode 0.1 ml) von Applied
Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) in Triplikaten und mit No-Template Kontrollen ohne
cDNA Probe zum Ausschluss einer Kontamination durchgeführt. Die Amplifikation der PCRProdukte wurde mittels “Abi Prism 7500 fast Sequence Detection System” unter Verwendung
der SDS 7500 Software v2.0.6 detektiert (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland). Zur
Durchführung der qRT-PCR wurde die ΔΔCT Methode mit Effizienzkorrektur angewendet.
Der cycle threshold (CT) wurde als die Anzahl der Zyklen definiert, die benötigt wurden, um
ein konstant definiertes Fluoreszenzniveau zu erhalten und wurde für jedes Primerpaar in den
verschiedenen PCR-Läufen konstant beibehalten. GAPDH wurde als housekeeping-Gen und
zur Normalisierung der Proben verwendet (CT-Zielgen – CT-GAPDH = ΔCT). Dazu wurde auf jeder
Platte das GAPDH Gen mitgeführt. Die normalisierten Werte der Kontrollgruppe (z.B.
RHEK1 par C RNAi; Abb. 3.3 A) wurden von den normalisierten Werten der behandelten
Gruppe (z.B. RHEK1 par c-myc RNAi; Abb. 3.3. A) abgezogen (ΔCT-Behandlung – ΔCT-Kontrolle =
ΔΔCT). Die x-fache Änderung (fold change) wurde als 2-ΔΔCT berechnet, da die Menge des
DNS Produktes im Idealfall pro Zyklus verdoppelt wurde. In der Praxis kann diese optimale
PCR-Effizienz nicht erreicht werden, weswegen die Effizienz der Primer berechnet und eine
Korrektur durchgeführt wurde.
Für die praktische Durchführung der qRT-PCR wurde ein Master Mix hergestellt, der
folgende Komponenten pro Well beinhaltete:
 250 nM Primermix (Forward und Reverse Primer)
 6,25 µl 2x Power SYBR-Green PCR Master Mix (SYBR-Green Farbstoff, AmpliTaq
Gold DNA Polymerase, dNTPs, ROX dye als interner passiver Referenzfarbstoff;
Applied Biosystems)
 ad 10 µl PCR-Grade Nuklease-freies Wasser
10 µl des qRT-PCR Master Mixes und 2,5 µl der verdünnten cDNS (siehe oben) wurden in
jedes Well einer 96-Well Platte pipettiert. Die Wells der Platte wurden mit einer transparenten
2 Material und Methoden
Seite 70
Klebefolie (Optical Adhesive Covers, Applied Biosystems) verschlossen und die Platte wurde
bei 1000 rpm für 1 min zentrifugiert.
Folgendes PCR-Programm wurde angewendet:
 holding stage (1): 50°C, 20 sec
 holding stage (2): 95°C, 10 min
 cycle stage:
Step1 95°C, 15 sec
40 Zyklen
Step 2 60°C, 1 min
Die holding stages wurden als Aktivierungsschritt der DNS-Polymerase und als DNS
Denaturierungsschritt
vorgeschaltet.
In
40
Zyklen
folgte
dann
abwechselnd
ein
Denaturierungsschritt (15 sec, 95°C) und ein Elongationsschritt (1 min, 60°C). Jedem Lauf
wurde eine Schmelzkurvenanalyse nachgeschaltet, um unspezifische Primerdimer-Bildung
auszuschließen.
2.2.3 qRT-PCR mit Taqman Sonden
RNS Isolierung aus FFPE Gewebematerial
Für die Isolierung von Gesamt-RNS aus FFPE Material (10 µm dicke Schnitte; cHL und
reaktive
Lymphadenopathie
Biopsien)
wurde
eine
standardisierte
vollautomatische
Isolierungsmethode, die auf Germanium-beschichteten magnetischen Beads (XTRAKT RNA
Kits, STRATIFYER Molecular Pathology GmbH, Köln, Deutschland) in Kombination mit
dem “Liquid Handling Robot XTRACT SL” (STRATIFYER Molecular Pathology GmbH,
Köln, Deutschland) beruhte, verwendet (Bohmann et al, 2009). Die Methode beinhaltete
sowohl eine Extraktions-integrierte Deparaffinierung als auch einen DNase I Verdau. DNSfreie Gesamt-RNS wurde mit 100 µl Eluierungspuffer eluiert und bei -80°C aufbewahrt. Die
Qualität der RNS wurde mittels Expression des housekeepers CALM2 als ein Surrogat für
amplifizierbare mRNS mittels Taqman qRT-PCR überprüft.
Taqman qRT-PCR
Zur Analyse der CALM2 (housekeeping-Gen), IL12B, TNF, IL10 und TGFβ1 Expression
mittels Taqman-Sonden basierter qRT-PCR wurden “QuantiFast Probe” Assays für one-step
qRT-PCR, in der die Umschreibung und Amplifikation der cDNA im selben Schritt stattfand,
mit Singleplex Detektion nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (Qiagen). In Tab.
2 Material und Methoden
Seite 71
2.2 sind die verwendeten spezifischen Sonden aufgelistet. Dieser Assay wurde speziell für
stark degradierte RNS, wie sie in FFPE Material vorkommt, entwickelt und für hoch
spezifische Ergebnisse wurde die integrierte genomische DNS entfernt. Zur Entfernung der
DNS wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:
 2,5 µl 2x QuantiFast Master Mix 1 (inklusive eines “genomic DNA Whipeout
Buffers”)
 1 µl template RNS
 1,5 µl PCR-Grade Nuklease-freies Wasser
Dieser Reaktionsmix wurde in die Wells einer 96-Well Platte pipettiert und 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Für die one-step Singleplex qRT-PCR wurde folgender
Reaktionsansatz verwendet:

2,5 µl 2x QuantiFast Master Mix 2
 0,5 µl 20x QuantiFast Probe Assay (mit dem Dye Label FAM und dem Quencher
IBFQ)
 0,2 µl ROX Dye Lösung (interner passiver Referenzfarbstoff)
 0,1 µl QuantiFast RT Mix
 1,7 µl PCR-Grade Nuklease-freies Wasser
Je 5 µl des qRT-PCR Reaktions- Master Mixes wurden pro Well der 96-Well Platte eingesetzt
und für 1 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Folgendes PCR-Programm wurde angewendet:
 Reverse Transkription: 20 min 50°C
 PCR initialer Aktivierungschritt: 5 min 95°C
 Zyklen:
Schritt1 95°C, 15 sec
Schritt 2 60°C, 30 sec
Assay Name/Sonde
40 Zyklen
QuantiFast Primer/
Sonden-Referenznummer
Hs_CALM2_1_FAM
QF00518987
Hs_IL12B_1_FAM
QF00023499
Hs_TNF_1_FAM
QF00062811
Hs_IL10_1_FAM
QF000446460
Hs_TGFβ1_2_FAM
QF00531146
Tab. 2.2 Taqman Sonden
2 Material und Methoden
Seite 72
Zur Messung und Berechnung der Genexpression wurden Reagenzien und Geräte, wie unter
“SYBR-Green basierte qRT-PCR” beschrieben, verwendet. Die ΔΔCT Methode wurde
angewendet. Als Positivkontrolle und Kontrollgruppe wurde die RNS der cHL-Zelllinie
L1236 verwendet. Die L1236 RNS wurde mittels RNeasy Kit (Qiagen) isoliert wie unter 2.2.2
beschrieben.
2.2.4 c-myc-Knockdown
Für den Knockdown von c-myc wurden Zellen revers mit ON-TARGET plus SMART pool
siRNA transfiziert (Thermo Scientific, Dharmacon, Bonn, Deutschland). Folgende vier c-myc
spezifischen
siRNA
wurden
UUACGCACAAGAGUUCCGU
3’,
von
5’
Dharmacon
synthetisiert:
UCCAAGACGUUGUGUGUUC
5’
3’,
5’
UGUUGGUGAAGCUAACGUU 3’ und 5’ UUCCACAGAAACAACAUCG 3’. Der ONTARGET plus non-targeting Pool (Dharmacon) von mindestens 4 mismatches zu jedem
menschlichen Gen diente als Negativkontrolle. Die siRNA wurden mit dem TransfektionsReagenz DharmaFECT1 (Dharmacon) revers transfiziert. Für die Quantifizierung der c-myc
Genexpression mittels SYBR-Green basierter qRT-PCR (siehe Kapitel 2.2.2) wurden die
Zellen 48 h mit dem siRNA spezifischen Master Mix inkubiert und anschließend wurde die
Gesamt-RNS mittels RNeasy Kit (Qiagen) isoliert. Für Studien an dem Proteom der Zellen
wurden die Zellen für 48 h mit dem siRNA Mix inkubiert, danach wurde das Medium
gewechselt und die Zellen für weitere 48 h inkubiert. Die Zellen wurden dann für Western
Blot Analysen lysiert (siehe Kapitel 2.3.2 und folgende).
Für die Transfektion mit c-myc siRNA wurden die in Tabelle 2.3 aufgelisteten Zellzahlen
verwendet.
Pro Well einer 12-Well Platte wurde folgender siRNA Mix (Dharmacon) erstellt:
 45 µl siRNA Puffer
 5 µl
siRNA
 50 µl Serum-freies Medium
Zusätzlich wurde pro Well einer 12-Well Platte folgender Transfektions-Mix (Dharmacon)
hergestellt:
 98 µl Serum-freies Medium
 2 µl
DharmaFECT1
2 Material und Methoden
Zelllinie
Seite 73
Zellzahl für qRT-PCR
Zellzahl für Western Blot
Analysen (48 h Inkubation)
Analysen (96 h Inkubation)
RHEK1 par
2,3 x 105/ml
1,5 x 105/ml
RHEK1 LMP1
3,2 x 105/ml
2,5 x 105/ml
HeLa par
1,2 x 105/ml
1,5 x 105/ml
HeLa LMP1
1,0 x 105/ml
0,8 x 105/ml
Tab. 2.3 Zellzahlen für den c-myc-Knockdown
Beide Ansätze wurden durch Resuspendieren mit der Pipette vermengt und für 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Der siRNA Mix wurde zu dem Transfektions-Mix hinzugegeben
und durch Resuspendieren vermengt. Der gesamte Master Mix wurde dann für weiter 20 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Jeweils 200 µl des Master Mixes wurden daraufhin in ein Well
einer 12-Well Platte gegeben. Eine Zellsuspension von 800 µl pro Well mit den in Tab. 2.3
aufgelisteten Zellzahlen wurden zu dem jeweiligen Master Mix pipettiert und die Platte wurde
zur Durchmischung vorsichtig hin und her geschwenkt. Die Zellsuspensionen und
verschiedenen Ansätze wurden mit Antibiotika-freiem Medium hergestellt.
2.3 Analysen auf Proteinebene
2.3.1 ELISA
IL6 ELISA
Zur Bestimmung der IL6 Sekretion von RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1
mittels enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) wurden 96-Well Platten (F96 Polysorp
Immuno Plate, Nunc, Roskilde, Dänemark) mit einem IL6 Antikörper (2 µg/ml in PBS, 50
µl/Well; MAB206, R&D Systems) bei Raumtemperatur über Nacht beschichtet. Nach drei
Waschschritten mit 0,05% Tween 20-PBS und nach Blockieren der freien Bindungsstellen
mit 1% BSA-PBS für 1 h bei Raumtemperatur und drei weiteren Waschschritten wurden
jeweils 50 µl der Verdünnungsreihe des rekombinanten humanen IL6 Standards (R&D
Systems) in Verdünnungspuffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween 20,
in sterilem Milli-Q H2O; pH 7,3) mit Konzentrationen von 4000 pg/ml bis 31,3 pg/ml oder 50
µl Überstände der Zelllinien in die einzelnen Wells pipettiert und für 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Leerkontrollen (blanks; Inkubation nur mit Verdünnungspuffer) wurden mitgeführt
2 Material und Methoden
Seite 74
und von allen Standard- und Proben-Messungen subtrahiert. Für die Generierung von
Überständen als Proben wurden die Zellen in einer Konzentration von 4 x 105/ml in eine 6Well Platte für 24 h ausgesät. Die Überstände wurden bis zur Analyse bei -20 °C aufbewahrt.
Nach drei weiteren Waschschritten wurden die Platten mit 50 µl eines biotinylierten IL6
Detektionsantikörpers (BAF206, R&D Systems) mit einer Konzentration von 200 ng/ml in
Verdünnungspuffer pro Well für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Auf drei weitere
Waschschritte folgte die Inkubation mit 50 µl des Streptavidin-HRP Komplexes (R&D
Systems) in einer 1:200 Verdünnung mit Verdünnungspuffer für 20 min bei Raumtemperatur.
Danach wurden 50 µl der 1:1 vermengten Substrat-Reagenzien A und B (R&D Systems) dazu
pipettiert und nach ca. 10 min wurde die Reaktion mit der Stoplösung (0,18 M H2SO4 in
sterilem Milli-Q H2O) beendet. Die Absorption wurde bei 450 nm und 590 nm als Referenz
an einem Absorptionsleser (Synergy 2, BioTek, Bad Friedrichshall, Deutschland) gemessen.
IL10 und IL12 ELISA
Um die Sekretion von IL10 und IL12/IL23 (Untereinheit p40) durch moDC, MΦ, L1236 und
HDLM2 zu bestimmen, wurde jeweils ein DuoSet ELISA Kit (IL10: DY217B, IL12/23:
DY1240, R&D Systems) verwendet. Alle Schritte wurden nach den Angaben des Herstellers
durchgeführt. 96-Well Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit dem CaptureAntikörper (IL10: 2 µg/ml, IL12: 4µg/ml) inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit einem
Waschpuffer gewaschen (0,05% Tween 20 in PBS, pH 7.4). Nach einer einstündigen
Inkubation mit Reagenzverdünner (Reagent Diluent; 1% BSA in PBS, pH 7,4) zum
Blockieren der freien Bindungsstelle und nach erneutem Waschen wurden die Platten mit den
Standards (2000 - 4000 pg/ml bis 7,8- 15,6 pg/ml rekombinantes humanes IL10 oder
IL12/IL23 p40), die mit Reagent Diluent verdünnt wurden oder den Proben beladen und für 2
h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden wie folgt generiert: moDC und MΦ
wurden in einer Konzentration von 1 x 106/ml +/- 100 ng/ml LPS ausgesät und für 24 h
inkubiert. L1236 und HDLM2 wurden in einer Konzentration von 1 x 106/ml ausgesät und für
48 h inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und die Überstände bei mindestens -20°C
aufbewahrt. Die mit LPS behandelten Proben wurden in einer 20fachen Verdünnung
eingesetzt. Leerwerte (blanks; Inkubation nur mit Reagent Diluent) wurden mitgeführt und
von allen Standard- und Proben-Messungen subtrahiert. Die Platten wurden erneut gewaschen
und mit einem biotinylierten Detektionsantikörper (IL10: 150 ng/ml, IL12: 100 ng/ml) für 2 h
inkubiert. Dann wurde in die Platten für 20 min der Streptavidin-HRP Komplex und
darauffolgend das HRP-Substrat aus den Reagenzien A & B gegeben, bis eine gut erkennbare
2 Material und Methoden
Seite 75
Farbreaktion auftrat. Zwischen den verschiedenen Schritten wurden die Platten gewaschen.
Die Reaktion wurde durch Zugabe einer Stoplösung (2 N H2SO4 in sterilem Milli-Q H2O)
beendet. Die Absorption wurde bei 450 nm und 540 nm als Referenz an einem
Absorptionsleser (Synergy 2, BioTek) gemessen.
MDC/CCL22 ELISA
Der MDC ELISA wurde so durchgeführt, wie bereits für den IL6 ELISA beschrieben. Das
Coaten einer 96-Well Platte erfolgte mit einem MDC-spezifischen Antikörper (2 µg/ml in
PBS, 50 µl/Well; MAB336, R&D Systems) über Nacht. Als Standard wurde rekombinantes
humanes MDC (R&D Systems) in einer Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen von
2000 pg/ml bis 31,3 pg/ml verwendet. 100 µl der Proben wurden pro Well eingesetzt. Die als
Proben verwendeten Überstände wurden aus L1236 und HDLM2 in einer Konzentration von
1 x 106/ml in eine 6-Well Platte nach Inkubation von 48 h generiert. Die Überstände wurden
bei -20 °C aufbewahrt. Der biotinylierte MDC Detektionsantikörper (BAF336, R&D
Systems) wurde in einer Konzentration von 10 ng/ml eingesetzt. Im Weiteren wurde so
verfahren, wie bereits für den IL6 ELISA beschrieben.
TARC/CCL17 ELISA
Der TARC ELISA wurde so durchgeführt, wie bereits für den IL6 ELISA beschrieben. Das
Coaten einer 96-Well Platte erfolgte mit einem TARC-spezifischen Antikörper (2 µg/ml in
PBS, 50 µl/Well; MAB364, R&D Systems) über Nacht. Als Standard wurde rekombinantes
humanes TARC (R&D Systems) in einer Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen von
4000 pg/ml bis 31,3 pg/ml verwendet. 100 µl der Proben wurden pro Well pipettiert. Die als
Proben verwendeten Überstände wurden aus L1236 und HDLM2 in einer Konzentration von
1 x 106/ml in eine 6-Well Platte nach Inkubation von 48 h generiert und in einer Verdünnung
von 1:100 eingesetzt. Die Überstände wurden bis zur Messung bei -20 °C aufbewahrt. Der
biotinylierte TARC Detektionsantikörper (BAF364, R&D Systems) wurde in einer
Konzentration von 10 ng/ml eingesetzt. Im Weiteren wurde so verfahren, wie bereits für den
IL6 ELISA beschrieben.
2 Material und Methoden
Seite 76
TGFβ ELISA
Für die Messung der TGFβ1 Produktion der L1236 und HDLM2 Zelllinien, wurde ein DuoSet
ELISA Kit (DY240, R&D Systems) verwendet. Eine 96-Well Platte wurde mit dem CaptureAntikörper (2 µg/ml) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Nach dreimaligem
Waschen mit Waschpuffer (0,05% Tween-20 in PBS) wurde die Platte für 1,5 h mit dem
Blockierungspuffer (5% Tween-20, 0,05% NaN3 in PBS) bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Platte wurde erneut gewaschen und mit dem Standard (2000 pg/ml bis 15,6 pg/ml
rekombinantes humanes TGFβ1) oder den aktivierten Überständen für 2 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Um die Überstände zu generieren, wurden 1 x 106 L1236 oder
HDLM2 pro ml in serumfreiem Medium für 48 h kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugiert
und die Überstände bei -20 C aufbewahrt. Da TGFβ in den Überständen in inaktiver Form
vorlag, mussten es zuerst zu der immunreaktiven Form aktiviert werden. Dazu wurden 250 µl
der Überstände mit 50 µl 1 N HCl versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Aktivierung wurde durch die Zugabe von 50 µl 1,2 N NaOH/0,5 M HEPES abgestoppt. Nach
der Inkubation mit den Überständen/Standards wurde die Platte gewaschen und der
biotinylierte Detektionsantikörper (300 ng/ml) für 2 h bei Raumtemperatur aufgetragen. Im
Weiteren wurde so verfahren, wie bereits für den IL6 ELISA beschrieben.
TNFα ELISA
Der TNFα ELISA wurde so durchgeführt, wie bereits für den IL6 ELISA beschrieben. Das
Coaten einer 96-Well Platte erfolgte mit einem TNFα-spezifischen Antikörper (2 µg/ml in
PBS, 50 µl/Well; MAB610, R&D Systems) über Nacht. Als Standard wurde rekombinantes
humanes TNFα (R&D Systems) in einer Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen von
1000 pg/ml bis 31,3 pg/ml verwendet. 100 µl der Proben wurden pro Well eingesetzt. Die hier
verwendeten Überstände wurden aus L1236 und HDLM2 in einer Konzentration von 1 x
106/ml in eine 6-Well Platte nach Inkubation für 48 h generiert. Die Überstände wurden bei
-20 C aufbewahrt. Der biotinylierte TNFα Detektionsantikörper (BAF210, R&D Systems)
wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml eingesetzt. Im Weiteren wurde so verfahren, wie
bereits für den IL6 ELISA beschrieben.
2 Material und Methoden
Seite 77
2.3.2 Generieren von Proteinlysaten für Western Blot Analysen
Alle nachfolgenden Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Zur Lyse wurden die Zellen
dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit dem Zelllysepuffer für 15 min inkubiert. Der
Lysepuffer für die Extraktion zytoplasmatischer Proteine war wie folgt zusammengesetzt:
 50 mM Tris-Cl pH 8,0
 10 mM EDTA
 1% NP40 (Roche, Mannheim, Germany)
 pro 10 ml eine Protease Inhibitor Cocktail Tablette (Roche)
 ad steriles Milli-Q H2O
Für die Extraktion von zytoplasmatischen und nukleären Proteinen wurde der RIPA
Lysepuffer verwendet:
 50 mM Tris pH 7,4
 150 mM NaCl
 1mM EDTA
 1% NP40
 0,5% Na-Deoxycholate (Merck Millipore)
 0,1% SDS (Roth)
 pro 10 ml eine Protease Inhibitor Cocktail Tablette
 ad steriles Milli-Q H2O
Eine gut bewachsene 10 cm Zellkulturschale wurde mit 1 ml Lysepuffer, eine gut bewachsene
6 cm Schale mit 400 µl, ein gut bewachsenes Well einer 6-Well Platte mit 200 µl, einer 12Well Platte mit 100 µl und einer 24-Well Platte mit 50 µl lysiert. Nach einer Inkubation von
15 min wurden die Zellreste mit einem Schaber von dem Boden des Gefäßes gelöst, in ein
Eppendorf Tube überführt und für 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Zur Auflösung der
Zellkernmembran für die zusätzliche Extraktion von nukleären Proteinen wurden die Lysate
zunächst sonifiziert, wofür sie bei 30%iger Leistung (power) 10 mal 1sec-Pulsen ausgesetzt
wurden, (HTU SONI 130, Heinemann, Ultraschall- und Labortechnik, Schwäbisch Gmünd,
Deutschland) und bei 13000 rpm für 10 min zentrifugiert. Die im Überstand befindlichen
Proteinextrakte wurden bei mindestens -20°C aufbewahrt.
2 Material und Methoden
Seite 78
2.3.3 Intrazelluläre Fraktionierung
Um den Status der STAT3-Phosphorylierung sowohl auf zytoplasmatischer als auch nukleärer
Ebene zu untersuchen, wurden die Zellen zunächst dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen.
Alle weiteren Schritte erfolgten auf Eis. Die Zellen wurden vorsichtig mit einem Zellschaber
von dem Boden der Zellkulturschale gelöst, in ein Eppendorf Tube überführt und bei 2000
rpm für 4 min zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 300 µl Zytoplasma-Extraktionspuffer
(10 mM Tris pH 7,5, 40 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10% Glycerol, 0,125% NP40, 1 mM PMSF,
pro 10 ml eine Protease Inhibitor Cocktail Tablette (Roche), ad steriles Milli-Q H2O)
resuspendiert, für 5 min unter regelmäßigem leichtem Vortexen auf Eis inkubiert und für 10
min bei 13000 rpm zentrifugiert. Die flüssige Phase mit den Proteinen der zytoplasmatischen
Zellfraktion wurde in ein neues Tube überführt und bei -20°C aufbewahrt. Das verbleibende
Zellpellet mit den Zellkernen wurde in 1 ml Saccharose-Lösung (0,25 M Saccharose, 10 mM
MgCl2, 10 mM HEPES, ad steriles Milli-Q H2O) aufgenommen. Mit dieser Zellpellet-ZuckerLösung wurde eine dichtere Zuckerlösung (1 ml; 0,35 M Saccharose, 0,5 MgCl2, 10 mM
HEPES, ad steriles Milli-Q H2O), die in ein 50 ml Falcon Tube vorgelegt wurde,
überschichtet. Es folgte eine 5 min Zentrifugation bei 2500 rpm zur spezifischen Extraktion
der Zellkerne. Das entstandene Pellet mit den Zellkernen wurde in 50 µl Zellkern-Lysepuffer
(10 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% Glycerol, 1 mM PMSF, pro
10 ml eine Protease Inhibitor Cocktail Tablette (Roche), ad steriles Milli-Q H2O)
resuspendiert, bei 30% power 10 mal 1 sec-Pulsen ausgesetzt und bei 13000 rpm für 10 min
zentrifugiert. Der Überstand mit den Proteinen der nukleären Zellfraktion wurde bei
mindestens -20°C aufbewahrt.
2.3.4 Determinierung des Proteingehaltes mittels BCA Assay
Um den Proteingehalt von Zelllysaten zu bestimmen, wurde die Bicinchoninsäure (BCA)Methode (Thermo Scientific) verwendet. Zur Berechnung des Proteingehaltes wurde ein BSA
Standard von 2 µg/ml bis 0 µg/ml mitgeführt. In eine 96-Well Platte wurden jeweils in
Duplikaten 5 µl Standard oder Probe mit jeweils 45 µl sterilem Milli-Q H2O zur Verdünnung
pipettiert. Der BCA Mix (im Verhältnis BCA:Kupfer(II)-sulfat von 50:1) wurde in einem
Volumen von 200 µl zu den Proben dazu pipettiert. Die Platte wurde kurz geschüttelt, bei
37°C für 30 min inkubiert und für 10 min bei Raumtemperatur abgekühlt. Die Messung
erfolgte bei 650–750 nm an einem Micro-Plate Reader (Multi-label Reader VICTORTM X3-
2 Material und Methoden
Seite 79
PerkinElmer, Rodgau, Deutschland). Die Standardkurve wurde zur Ermittlung der
Proteinkonzentration der Proben verwendet. Zur gleichmäßigen Beladung der Gele wurden
pro Probe 20 µg Protein geladen.
2.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von Proteinen nach Molekulargewicht erfolgte durch diskontinuierliche
Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Dazu wurden Polyacrylamidgele nach folgendem Protokoll
hergestellt:
Sammelgel: 4% Gel
 4% Rotiphoresegel 30 37,5:1 (Roth)
 0,125 M Tris pH 6,8
 0,1% SDS
 ad steriles Milli-Q H2O
 0,1% APS (Sigma-Aldrich)
 0,1% TEMED (Roth)
Trenngel: 9, 10, 11, 12, 15% Gel
 9, 10, 11, 12, 15% Rotiphoresegel 30 37,5:1
 0,375 M Tris pH8,8
 0,1% SDS
 ad steriles Milli-Q H2O
 0,1% APS
 0,1% TEMED
APS und TEMED wurden erst bei der Herstellung der Gele zur Polymerisierung des
Acrylamids zugegeben. Die Trenngellösung wurde in eine Glasapparatur von BioRad
(München, Deutschland) pipettiert, mit 70% Isopropanol überschichtet und 10 min
ausgehärtet, danach wurde das feste Trenngel mit der Sammelgellösung überschichtet, mit
dem Kamm zur Geltaschenbildung versehen und für 30 min auspolymerisiert. Proben wurden
zur weiteren Denaturierung und Reduktion zu 50% mit Laemmli-Puffer (40 mM Tris-Cl pH
6,8, 4% SDS, 20% Glycerol, 4% β-Mercaptoethanol, 0,2% Bromophenolblau, ad steriles
2 Material und Methoden
Seite 80
Milli-Q H2O) gemischt. Proben und biotinylierter Marker (zur Detektion bei der Entwicklung;
Cell Signaling, New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) wurden für 5 min bzw. 2 min
zur Denaturierung auf 95°C erhitzt und in die Geltaschen pipettiert. Der vorgefärbte ProteinMarker (PageRuler Plus, Fermentas) wurde ohne vorheriges Erhitzen aufgetragen. Die
Gelelektrophorese erfolgte in einer Mini-PROTEAN II Cell Elektrophoreseapparatur
(BioRad) in 1 x Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 1% SDS, ad Milli Q H2O) und
wurde für ca. 10 min zur Konzentrierung der Proben bei 70 V und dann bei 120 V für ca. 1 h,
bis die Lauffront das Ende des Gels erreichte, durchgeführt.
2.3.6 Western Blot
Nach der Auftrennung mittels Elektrophorese wurde das Gel in Transferpuffer (20 mM Tris,
150 mM Glycin, 20% Methanol, ad Milli Q H2O) gewaschen und die im Gel
eingeschlossenen Proteine auf eine in Transferpuffer vorbefeuchtete Nitrozellulosemembran
für 1-2 h transferiert (Amersham Hybond-ECL, GE Healthcare). Das auf die Membran
aufgetragene Gel wurde hierfür zwischen jeweils 3 Filterpapiere gelegt und in ein Hoefer
SemiPhor Semi-dry Transfer System (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland)
eingelegt. Die nicht vom Gel bedeckte, freiliegende Anode wurde mit Parafilm abgedeckt und
eine Stromstärke von 1 mA pro 1cm2 Membran/Stapel angelegt (ca. 50 mA). Ein Gewicht von
ca. 1 kg wurde auf das Transfer System aufgelegt. Nachdem der Transfer erfolgt war, wurde
die Membran in Milli Q H2O gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur in 5% BSA-0,1%
Tween 20-PBS (PBS-T) zum Blockieren der freien Bindungsstellen inkubiert. Für die
Detektion von STAT3 und STAT3-P wurde die Membran mit 5% Milchpulver in PBS-T
geblockt. Nach drei 5-minütigen Waschschritten in PBS-T wurde die Membran in den
meisten Fällen mit dem jeweiligen Primärantikörper (siehe Tab. 2.4) für 2 h inkubiert.
Ausschließlich zur Detektion von STAT3-P wurde die Membran über Nacht und zur
Detektion von β-Aktin und GAPDH für 1 h mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach
erneutem Waschen (3 x 5 min) mit PBS-T, erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem
jeweiligen HRP-konjugierten Sekundärantikörper (1:1000 anti-Mouse oder anti-Rabbit
(DakoCytomation, Glostrup, Dänemark) in 1% BSA-PBS-T; zusätzlich wurde anti-Biotin
1:2000 zur Detektion des biotinylierten Markers zugegeben). Die Membran wurde wieder
dreimal 5 min in PBS-T gewaschen. Zur Detektion der Proteinbanden wurde die Membran
mittels der enhanced chemiluminescence (ECL)-Methode (Merck Millipore) entwickelt.
2 Material und Methoden
Seite 81
Proteinbanden wurden mit einem Genegnome Imaging System und der Genesnap Software
v7.0.4 (Syngene, Cambridge, UK) oder mittels Fusion FX7 Imaging Systems und der Bio1D
Software v15.02 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) visualisiert. Als Ladekontrolle
dienten β-Aktin, GAPDH oder Lamin B1. Die Membranen wurden nacheinander mit
unterschiedlichen Antikörperlösungen inkubiert, insofern sich die Größen der zu
detektierenden Proteine nicht überschnitten. Die Membranen wurden hierbei nicht gestrippt.
Protein
Antikörper/Herkunft
Antikörperlösung
Verdünnung
β-Aktin
β-Aktin
1% BSA-PBS-T
1:10000
3% BSA-PBS-T
1:500
3% BSA-PBS-T
1:1000
3% BSA-PBS-T
1:30000
3% BSA-PBS-T
1:1000
3% BSA-PBS-T
1:1000
1% BSA-PBS-T
1:200
3% BSA-PBS-T
1:1000
3% BSA-PBS-T
1:500
3% BSA-PBS-T
1:1000
5% BSA-TBS-T
1:1000
Sigma Aldrich (A5441)
β2-m
Beta-2-Microglobulin
DakoCytomation (A0072)
c-Myc
c-Myc [Y69]
Abcam (ab32072)
GAPDH
GAPDH (HRP; 6C5)
Abnova (MAB5476)
HLA-B
HLA-B [EP2624]
Abcam (ab110645)
Lamin B1
Lamin B1
Invitrogen (33-2000)
LMP1
EBV-LMP1 (CS.1-4)
Dako (IR753)
LMP2
Proteasom 20S LMP2
Abcam (ab42987)
TAP1
TAP1
Stressgen (CSA-620)
STAT3
Stat3
BD (610189)
STAT3-P
Phospho-Stat3 (Tyr705)
Cell Signaling Technology (9131)
Tab. 2.4 Antikörper für Western Blot Analysen
2 Material und Methoden
Seite 82
2.3.7 Durchflusszytometrische Analysen
HC-10 Färbungen
Für die Analyse der Expression der HLA Klasse I schweren Ketten mittels eines
monoklonalen Antikörpers (HC-10; spezifisch für β2-m freie HLA-A3, A10, A28, A29, A30,
A31, A32, A33, HLA-B (außer -B5702, -B5804, und -B73) und C schwere Ketten) wurden
RHEK1 und RHEK1/LMP1 Zellen kurz trypsiniert, zweimal mit PBS gewaschen und für 30
min bei Raumtemperatur mit dem HC-10 Antikörper (1:100) (Perosa et al, 2003; Stam et al,
1986) in 1% BSA-PBS inkubiert. Zur Kontrolle wurden Zellen mitgeführt, die nur mit der
1%igen BSA-PBS Lösung ohne HC-10 Antikörper inkubiert wurden. Nach zweimaligem
Waschen mit PBS, Inkubation mit einem Alexa Fluor 488 Antikörper (1:100, Invitrogen) für
30 min bei Raumtemperatur und einem erneuten Waschschritt mit 2 x PBS wurden die Zellen
in 300 µl PBS aufgenommen und am FACSCanto II Durchflusszytometer mithilfe der
FACSDiva Software v6.1.3 (BD, Heidelberg, Deutschland) untersucht. Da die Expression der
HLA Klasse I schweren Ketten nur auf der Oberfläche der Zellen untersucht werden sollte,
wurden die Zellen nicht permeabilisiert. Eine Fixierung der Zellen war nicht nötig, da die
Messung sofort nach der Färbung erfolgte.
Dreifach- und Vierfachfärbung von DC und MΦ
Zur Kompensation wurden je 5 µl CD45 Antiköper verwendet, die mit PE (Invitrogen), FITC
oder APC konjugiert waren oder 10 µl HLA-DR-PerCP (BD).
Nach 24-stündiger Behandlung der DC wurden die Zellen mit PBS gewaschen und es erfolgte
eine Dreifachfärbung von Oberflächenmarkern mit 10 µl CD14-PE (BD), 10 µl CD40-FITC
(Abcam) und 10 µl CD83-APC (BD; siehe Tab. 2.5). Die Zellen wurden außerdem mit der
geeigneten Isotypkontrolle gefärbt (siehe Tab. 2.5). Die Färbung fand für 15 min bei 4°C statt.
Es erfolgte erneut ein Waschschritt mit PBS und die Zellen wurden dann in 200 µl eiskaltem
1% PFA-PBS aufgenommen. Die Färbung mit CD3-FITC, CD11c-APC und CD20-PE (BD)
zur Messung der DC Reinheit erfolgte unter den gleichen Bedingungen.
Nach 24-stündiger Behandlung der MΦ wurden die Zellen zum Ablösen vom
Zellkulturgefäßboden mit 2 mM EDTA-PBS für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und in
ein FACS Tube überführt. Die verbleibenden adhärenten Zellen wurden in PBS mit einem
Zellschaber gelöst und zu den übrigen hinzugefügt. Nach dem Abzentrifugieren für 5 min bei
1200 rpm wurden die Zellen zur Fixierung in 100µl Cytofix/Cytoperm (BD) für 20 min bei
2 Material und Methoden
Seite 83
Protein
Antikörper
Isotypkontrolle Herkunft
CD3
CD3-FITC (IgG1)
-
BD (345764)
CD3
-
FITC-IgG1
Antibodies Online
(ABIN118618)
CD11b
CD11b-APC (IgG2a)
APC-IgG2a
BD (333143; 551414)
CD11c
CD11c-APC (IgG2b)
-
BD (333144)
CD11c
-
APC-IgG2b
Invitrogen (MG2b05)
CD14
CD14-PE (IgG2b)
PE-IgG2b
BD (345785; 555743)
CD20
CD20-PE (IgG1)
PE-IgG1
BD (345793; 555749)
CD40
CD40-FITC (IgG1)
-
Abcam (ab27281)
CD40
-
FITC-IgG1
Antibodies Online
(ABIN118618)
CD68
CD68-FITC (IgG2b)
FITC-IgG2b
BD (562117; 555057)
CD83
CD83-APC (IgG1)
APC-IgG1
BD (551073; 555751)
CD163
CD163-PE (IgG1)
PE-IgG1
BD (556018; 555749)
CD206
CD206-APC (IgG1)
APC-IgG1
BD (550889; 555751)
HLA-DR
HLA-DR-PerCP (IgG2a)
PerCP-IgG2a
BD (347402; 349054)
Alle Antikörper waren aus der Maus und gegen Mensch gerichtet.
Tab. 2.5 Antikörper für durchflusszytometrische Analysen
4°C inkubiert. Die Zellen wurden 2 x mit Perm/Wash (BD) gewaschen und mit jeweils 10 µl
HLA-DR-PerCP, 10 µl CD163-PE, 5 µl CD68-FITC und 5µl CD206-APC oder mit 5 µl der
jeweiligen Isotypkontrollen für 30 min bei 4°C inkubiert (BD; siehe Tab. 2.5). Es folgten 2
Waschschritte mit Perm/Wash. Darauf wurden die Zellen in 200 µl Perm/Wash zur Messung
der Fluoreszenz aufgenommen. Die Färbung mit CD3-FITC, CD11b-APC und CD20-PE
(BD) zur Messung der MΦ Reinheit erfolgte unter den gleichen Bedingungen.
2.4 Neutralisierung von TNFα
moDC wurden für 24 h mit 50% L1236 Überständen alleine oder zusätzlich mit 10 µg/ml
einer IgG1 Isotypkontrolle (HCA049A, AbD Serotec, Bio-Rad, Düsseldorf, Deutschland), mit
10 µg/ml eines neutralisierenden antiTNFα Antikörpers (MAB610, R&D Systems) oder mit
2 Material und Methoden
Seite 84
10 µg/ml Infliximab, einem therapeutischen antiTNFα Antikörper (Remicade, MSD Sharp &
Dohme GmbH, Haar, Deutschland), inkubiert. Die Zellen wurden dann mittels
Durchflusszytometrie analysiert.
2.5 CCR7 Färbung und Chemotaxis Assay
2.5.1 CCR7 Färbung
Die CCR7 (CD197) Färbung der DC wurde mit dem Cytofix/Cytoperm (BD) Kit
durchgeführt, wie oben beschrieben. Pro Färbung wurden 20 µl des CCR7 Antikörpers
(CCR7-PE (IgG2a); BD) oder 5 µl der Isotypkontrolle (PE-IgG2a; BD) verwendet.
2.5.2 Chemotaxis Assay
Migrations-Assays wurden in einem 96-Well Chemo Tx Chemotaxis System mit
Polycarbonat track-etch (PCTE) Membranen mit einer Porengröße von 3 µm und einer
Porendichte von 2 x 104 Poren/mm2 (Neuro Probe, Gaithersburg, USA) durchgeführt. In die
Wells wurden je 30 µl eines Chemotaxis-Mediums (RPMI 1640, 2% FBS, 0.9% CaCl2, 0,5
mM MgCl2) mit 1 µg/ml secondary lymphoid tissue chemokines (SLC) vorgelegt. Die
Membran wurde so auf die 96-Well Platte aufgebracht, dass ein Vakuum entstand. Auf die
Membran wurde eine Zellsuspension von 5-6 x 104 DC/Well in 80 µl des ChemotaxisMediums pipettiert. Die DC wurden vorher für 24 h bei 37°C und 5% CO2 mit normalem
Medium als Kontrolle (Abb. 2.3. A), mit 50% L1236-Überstand (Abb. 2.3. B) oder mit einer
Positivkontrolle (5 ng/ml IL1β, 10 ng/ml IL6, 10 ng/ml TNFα, 1 µg/ml PGE2), die zur
Induktion der Reifung diente, behandelt. Hierzu wurden je 2 x 105 DC in 350 µl Medium pro
Well einer 24-Well Platte ausgesät. Als Negativkontrolle wurden, wie beschrieben,
behandelte DC durch 4-stündige Koinkubation mit Pertussis Toxin (PTx, 100 ng/ml) am Ende
der 24-stündigen Inkubation der Zellen immobilisiert. Nach 24-stündiger Behandlung der DC
wurden die Zellen zum Ablösen vom Zellkulturgefäßboden mit 2 mM EDTA-PBS für 15 min
bei Raumtemperatur inkubiert, mit PBS und anschließend mit Chemotaxis-Medium
gewaschen. Nach dem Auftragen der Zellen auf der Membran der Chemotaxis-Platte wurde
die Platte bei 37°C und 5% CO2 für 1 h inkubiert. Der Inhalt der unteren Wells mit den
2 Material und Methoden
A
Seite 85
B
Abb. 2.3 Durchflusszytometrische Messung zum Chemotaxis Assay. (A) Die Messung der Mediumkontrolle
ist abgebildet. (B) Gezeigt ist die Messung zur Behandlung mit L1236-Überstand. In dem Gate der migrierten
Zellen (P1) finden sich deutlich mehr Ereignisse als bei der Mediumkontrolle. P1: Gate mit penetrierten Zellen;
P2: Gate mit PE-konjugierten Beads.
migrierten Zellen wurde dann in FACS Tubes überführt, in die jeweils dieselbe Anzahl an PEkonjugierten Beads (CaliBRITE PE Beads; BD) in 200 µl PBS vorgelegt war. Die Wells
wurden einmal kräftig mit 25 µl Chemotaxis-Medium durch Resuspendieren ausgewaschen
und die Suspension mit den restlichen Zellen wurde zu den FACS Tubes hinzugefügt. Bei der
durchflusszytometrischen Analyse wurde auf die Beads gegated und pro Probe dieselbe
Anzahl Beads gezählt (je 10.000 Beads wurden aufgenommen; P2 der Abb. 2.3), so dass die
dazugehörige Anzahl an migrierten Zellen (P1 in Abb. 2.3) mittels eines FACSCanto II
Durchflusszytometers und der FACSDiva Software v6.1.3 (BD) quantifiziert werden konnte
und somit die Proben untereinander vergleichbar waren.
2.6 Analysen zum Proliferationsverhalten einer cHL-Zelllinie
2.6.1 CFSE Assay
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ist ein fluorescence cell tracking dye, der
sowohl Oberflächenproteine als auch intrazelluläre Proteine irreversibel bindet (vor allem
Lysin-Seitenketten, aber auch andere zugängliche Amingruppen). Da bei jeder Zellteilung nur
die Hälfte des Fluoreszenzfarbstoffes an die Tochterzellen weitergegeben wird, kann durch
2 Material und Methoden
Seite 86
CFSE-Intensität: 100%
1.Zellteilung
CFSE-Intensität: 50%
2.Zellteilung
CFSE-Intensität: 25%
Abb. 2.4 Prinzip der Messung des Proliferationsverhaltens mittels CFSE Assay
die Intensität der Fluoreszenz, die mittels Durchflusszytometrie bestimmt wird, auf das
relative Proliferationsverhalten geschlossen werden. Je geringer das Signal ist, desto mehr
proliferieren die Zellen. Das Prinzip ist in Abb. 2.4 dargestellt.
Für die CFSE Färbung wurden 4-8 x 106 L1236 Zellen mit PBS gewaschen und in 200 µl
PBS
aufgenommen.
Je
500
µl
der
PBS-CFSE
Färbelösung
wurden
in
einer
Gesamtkonzentration von 3,5 µM CFSE zugegeben und schnell vermengt, so dass eine
gleichmäßige Färbung aller Zellen stattfinden konnte. Die Zellen wurden 4 min bei
Raumtemperatur mit dem Farbstoff inkubiert und immer wieder leicht gevortext. Danach
folgte eine zweimalige Waschung mit FBS-haltigem Medium. Pro Well einer 96-Well Platte
wurden 6 x 104 oder 3 x 104 L1236 mit 90% moDC oder MΦ Überständen (siehe Kapitel
2.1.3) für 48 h oder 96 h in einem Gesamtvolumen von 200 µl bei 37°C und 5% CO2 im
Dunkeln inkubiert. Als Kontrolle wurden mit nicht-konditioniertem, frischem Medium
inkubierte Zellen mitgeführt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem FACSCanto II
Durchflusszytometer und der FACSDiva Software v6.1.3 (BD) analysiert und ließ auf das
relative Proliferationsverhalten der Zellen schließen.
2.6.2 BrdU Assay
Um das Proliferationsverhalten auf DNS-Ebene zu untersuchen, wurden L1236 Zellen mit
einem Überschuss an Bromdesoxyuridin (BrdU) inkubiert. BrdU wird während der S-Phase
des Zellzykluses anstelle des Nukleotides Thymidin in die DNS der Zelle eingebaut. BrdU
kann durch die Färbung mit einem spezifischen Antikörper sichtbar gemacht werden. Je
stärker das Signal ist, desto stärker proliferieren die Zellen.
Um den Einfluss von den durch MΦ sezernierten löslichen Faktoren auf das
2 Material und Methoden
Seite 87
Proliferationsverhalten von L1236 Zellen zu untersuchen, wurden 3 x 104 L1236 Zellen mit
90% MΦ-1 oder MΦ-2 Überständen (siehe Kapitel 2.1.3) in 96-Well Platten und einem
Gesamtvolumen von 100 µl für 48 h unter Anwesenheit von 100 µM BrdU bei 37°C und 5%
CO2 inkubiert. Um zusätzlich die Rolle des direkten Zell-Zell-Kontaktes zu untersuchen,
wurde MΦ-1 oder MΦ-2 mit L1236 im Verhältnis von 6:1 (30000 MΦ:5000 L1236) in 96Well Platten und einem Gesamtvolumen von 100 µl für 48 h mit 50% MΦ-konditioniertem
Medium (Medium der ersten 5 Tagen der MΦ Generierung) und 100 µM BrdU ko-kultiviert.
Die Platten wurden nach der Kokulturphase bei 1200 rpm für 5 min zentrifugiert und die
Überstände mit einer Pumpe abgesaugt. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen
und für mindestens 1 h durch den Luftstrom der Zellkulturbank getrocknet. Es folgte die
Fixierung der Zellen mittels -20°C-kaltem Methanol für 20 min bei -20°C. Die Zellen wurden
dann dreimal 5 min mit einer Blockierungslösung (1% BSA, 10% FBS, 0,02% NaN3, PBS)
auf einem Schüttler gewaschen und für 1 h mit der Blockierungslösung inkubiert. Nach
dreimaligem Waschen mit PBS auf einem Schüttler folgte die Inkubation mit einem BrdUspezifischen Antikörper (1:12 in 1% BSA-PBS; Millipore, Billerica, MA, USA) über Nacht
bei 4°C. Nach erneutem dreimaligen Waschen mit PBS auf einem Schüttler wurden die Zellen
mit einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:100 in 1% BSA-PBS; Invitrogen) für 1 h
bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgten abschließend drei Waschschritte mit PBS auf einem
Schüttler. Schließlich wurde in jedes Well 100 µl PBS pipettiert. Die mikroskopischen
Aufnahmen
wurden
wie
in
2.1.5
beschrieben
durchgeführt.
Die
Messung
der
Fluoreszenzintensität erfolgte bei einer Exzitation von 485/20 und einer Emission von 528/20
mit einem Fluoreszenz-Reader (Synergy 2, BioTek).
2.6.3 Analyse der BAFF und APRIL Sekretion in der Kokultur von MΦ und L1236
BAFF und APRIL ELISA
Für die Untersuchung der Sekretion von B cell activating factor of the TNF family (BAFF)
und a proliferation inducing ligand (APRIL) wurden Überstände nach 48-stündiger
Inkubation von MΦ-1, MΦ-2 (106/ml) und der Kokultur mit L1236 Zellen (6:1; 106 MΦ:1,7 x
105 L1236) in 50% MΦ-konditioniertem Medium (Medium der ersten 5 Tagen der MΦ
Generierung) generiert. Die Überstände wurden mittels eines BAFF Quantikine oder eines
APRIL DuoSet ELISA (R&D Systems) untersucht. Der APRIL ELISA wurde wie bereits
2 Material und Methoden
Seite 88
unter 2.3.1 für andere DuoSet ELISAs und gemäß der Angaben des Herstellers durchgeführt.
Der BAFF ELISA wurde ebenfalls nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
BAFF Neutralisierung
Zur Neutralisierung von BAFF wurden MΦ-1 und MΦ-2 für 48 h mit BrdU und BAFF
neutralisierenden Antikörpern mit L1236 Zellen (6:1; 30000 MΦ:5000 L1236) in einer 96Well Platte ko-kultiviert. Folgende BAFF Antikörper wurden in folgenden Konzentrationen
eingesetzt: Antikörper gegen lösliches BAFF (1 oder 2 µg/ml; AF124, R&D Systems),
Antikörper gegen den BAFF-Rezeptor (10 oder 20 µg/ml; αBAFF-R, AF1162, R&D
Systems) und das Therapeutikum Benlysta, ein humaner monoklonaler Antikörper, der gegen
BAFF gerichtet ist (10, 20 oder 50 µg/ml; GlaxoSmithKline, Human Genome Sciences,
Rockville, Maryland, USA). Die Proliferationsrate der L1236 Zellen wurde dann mittels
BrdU Assay, wie unter 2.6.2 beschrieben untersucht.
2.7 Statistische Auswertung
2.7.1 Vergleich der Mittelwerte/mittleren Ränge
Nach mehrmaliger Wiederholung von unabhängigen Versuchen unter gleichen Bedingungen
wurde der Mittelwert und die Standardabweichung (SD) oder der Standardfehler (SEM)
angegeben. Die Signifikanz der Ergebnisse wurde durch folgende Tests berechnet: Bei
Normalverteilung wurde der t-Test für un-/gepaarte Stichproben verwendet. Bei nichtNormalverteilung wurde bei ungepaarten Stichproben der Mann-Whitney-U-Test und bei
gepaarten Stichproben der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test verwendet. Es wurden folgende
Signifikanz-Niveaus festgelegt: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Die Berechnung der
statistischen Werte und die Erstellung der Graphen erfolgte mit der Software GraphPad Prism
5 (Version 5.02, GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA).
2.7.2 Kaplan-Meier-Analysen
Das tumorspezifische Überleben von cHL Patienten wurde definiert als Zeitpunkt des
Einganges der Biopsie bis zum letzten dokumentierten Kontakt mit dem Patienten (follow-up)
oder cHL-bedingten Tumortod. Die tumorspezifischen Überlebensraten der cHL Patienten
2 Material und Methoden
Seite 89
wurden mittels Kaplan-Meier Analysen berechnet. Der Log-Rank-Test wurde verwendet, um
die Überlebensraten zwischen den cHL Fällen mit guter und schlechter Prognose zu
vergleichen. p < 0,05 wurde in allen Tests als statistisch signifikant akzeptiert. Statistische
Analysen erfolgten mit dem statistischen Software Programm SPSS (Version 19.0 SPSS,
IBM, München, Deutschland).
3 Ergebnisse
Seite 90
3 Ergebnisse
3.1 EBV-kodiertes LMP1 und die HLA Klasse I APM in Epithelien
3.1.1 Effekt von EBV-kodiertem LMP1 auf die Expression von Komponenten der HLA
Klasse I APM
In
Voruntersuchungen
zur
Regulation
der
humanen
Klasse
I
Leukozyten-
Antigenpräsentationsmaschinerie (HLA Klasse I APM) durch EBV-kodiertes LMP1, wurde
die Expression von Proteasomuntereinheiten, von Komponenten des Transportsystems, von
A
B
par
LMP1
HeLa
par
LMP1
LMP1
60
β-Actin
40
Relative fold change
kDa
RHEK1
par LMP1
HLA Klasse I APM Expression in RHEK1
15
10
5
0
HLA-A
C
RHEK1
D
kDa
2-m
RHEK1
par
LMP1
TAP1
par
LMP2
HeLa
LMP1
β2-m
9
TAP1
60
20
LMP2
β-Actin
40
HC-10
Abb. 3.1 Hochregulation der HLA Klasse I APM Komponenten in stabil mit EBV-kodiertem LMP1
transfizierten epithelialen Zelllinien. (A) Western Blots von RHEK1 und HeLa Zellen zeigten eine kräftige
Produktion von EBV-kodiertem LMP1 in den stabil transfizierten Zelllinien RHEK1/LMP1 und HeLa/LMP1.
Ein repräsentatives Experiment von 3. (B) Mittels qRT-PCR wurde die Hochregulation der Genexpression von
HLA-A, β2-m, TAP1 und LMP2 in RHEK1/LMP1 nachgewiesen. Die Daten von 3 unabhängigen Experimenten
sind als Mittelwert ± SD angegeben. (C) Durchflusszytometrische Analysen von RHEK1 und RHEK1/LMP1
Zellen zeigten eine Induktion der HLA Klasse I schweren Kette (HC-10-Antiköper) in Zellen mit Expression
von EBV-kodiertem LMP1. Gestrichelte Linien zeigen die Kontrollfärbung ohne HC-10 Antiköper und
durchgehende Linien die HC-10 Positivität in RHEK1 (grau) oder RHEK1/LMP1 (schwarz) Zellen. Ein
repräsentatives Experiment von 3. (D) Western Blot Analysen der Regulation der HLA Klasse I APM
Komponenten in RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 zeigten eine deutliche Hochregulation von β2m, TAP1 und LMP2 in stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten Zelllinien. Ein repräsentatives
Experiment von 3.
3 Ergebnisse
Seite 91
Chaperonen, von HLA Klasse I schweren Ketten (HC; HLA-A und HC-10) und von β2Mikroglobulin (β2-m) mittels Immunzytochemie in RHEK1 und RHEK1/LMP1 Zellen
verglichen. HLA-A, β2-m, die Proteasomuntereinheit low molecular mass protein 2 (LMP2)
und die Untereinheit des Transporterkomplexes transporter associated with antigen
processing 1 (TAP1) des endoplasmatischen Retikulums (ER) wurden in den stabil mit EBVkodiertem LMP1 transfizierten RHEK1/LMP1 Zellen hochreguliert im Vergleich zu der
parentalen Zelllinie RHEK1. Für alle anderen HLA Klasse I APM Komponenten wurde mit
dieser Methode kein Unterschied in der Expression festgestellt. Daher wurden für die
weiteren Zellkultruntersuchungen HLA Klasse I schwere Ketten, β2-m, TAP1 und LMP2 als
durch EBV-kodiertes LMP1 regulierte Proteine der HLA Klasse I APM ausgewählt.
Wie in Abb. 3.1 A dargestellt, wurde die Expression von EBV-kodiertem LMP1 in den
verwendeten stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten Zelllinien RHEK1/LMP1 und
HeLa/LMP1 mittels Western Blot bestätigt. Es konnte sowohl auf RNS-Ebene mittels qRTPCR als auch auf Proteinebene mittels Durchflusszytometrie und Western Blot gezeigt
werden, dass HLA Klasse I schwere Ketten, β2-m, TAP1 und LMP2 durch EBV-kodiertes
LMP1 in RHEK1/LMP1 Zellen im Vergleich zu parentalen RHEK1 Zellen hochreguliert
waren (Abb. 3.1 B-D). In HeLa/LMP1 Zellen konnte derselbe Effekt von EBV-kodiertem
LMP1 auf die HLA Klasse I APM gezeigt werden (Abb. 3.1 D).
3.1.2 Effekt von EBV-kodiertem LMP1 auf die Expression von c-Myc
Da die Expression von c-Myc stark von der Dichte der Zellen abhing, wurden RHEK1,
RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 Zellen mit unterschiedlicher Konfluenz ausgesät und
die Expression von c-Myc mittels Western Blot verglichen (Abb. 3.2 A). Die für unsere
weiteren Untersuchungen optimale Konfluenz der Zellen lag bei etwa 50%, da ein dichterer
Zellrasen zur Hemmung der c-Myc Expression führte. Für alle weiteren Experimente wurde
daher darauf geachtet, dass die Zellen bei der Ernte eine Konfluenz von etwa 50% aufwiesen.
Abb. 3.2 A zeigt, dass EBV-kodiertes LMP1 die c-Myc Proteinexpression in RHEK/LMP1
Zellen stark und in HeLa/LMP1 schwächer hochregulierte. Auf der Ebene der Genexpression
wurde eine signifikante Hochregulation von c-Myc nur in RHEK1/LMP1 beobachtet (Abb.
3.2 B).
3 Ergebnisse
RHEK1
kDa
50%
70%
100%
30%
50%
70%
B
100% Konfluenz
LMP1
60
c-Myc
60
β-Actin
40
HeLa
kDa
30%
50%
80%
100%
30%
50%
80%
c-myc Expression
Relative fold change
(vs RHEK1 par or HeLa par)
A
Seite 92
100% Konfluenz
LMP1
par
LMP1
3
2
1
0
RHEK1
HeLa
60
60
c-Myc
β-Actin
40
Abb. 3.2 Hochregulation von c-Myc in stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten epithelialen
Zelllinien. (A) Die Western Blot Analyse zeigt eine deutliche Abhängigkeit der c-Myc Expression von der
Konfluenz der Zellen und der davon abhängigen Zelldichte. Die c-Myc Proteinmenge nahm mit steigender
Konfluenz ab. Vergleicht man die parentalen Zellen RHEK1 und HeLa mit RHEK1/LMP1 und HeLa/LMP1 bei
einer Konfluenz von 50%, so sieht man eine Zunahme der c-Myc Expression in Abhängigkeit von EBVkodiertem LMP1. Ein repräsentatives Experiment von 3. (B) Die qRT-PCR Analyse der c-Myc Expression auf
RNS-Ebene in RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 zeigte eine deutliche Zunahme von c-Myc in
Abhängigkeit von EBV-kodiertem LMP1 in RHEK1/LMP1, aber nicht in HeLa/LMP1 Zellen. Daten von 3
unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SD angegeben.
3.1.3 Einfluss von c-Myc auf die Expression der HLA Klasse I APM
Wie schon in anderen Studien und Zellarten gezeigt (Blom et al, 1997; Staege et al, 2002;
Versteeg et al, 1988; Vertuani et al, 2009), inhibiert c-Myc die Expression der HLA Klasse I
APM. Um festzustellen, ob dieser Mechanismus auch in unserem Zellsystem nachweisbar ist,
wurde c-myc mittels RNAi Technologie unter der Verwendung c-myc spezifischer siRNA in
RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 Zellen ausgeschaltet (Knockdown). Nach 48
h Inkubation mit den c-myc spezifischen siRNA, wurden alle Zelllinien mittels qRT-PCR
(ΔΔCT Methode mit Effizienzkorrektur) analysiert (Abb. 3.3 A). Auf RNS-Ebene konnte eine
signifikante Herunterregulation von c-myc beobachtet werden, die gleichzeitig mit einer
Induktion der Komponenten HLA-A, β2-m, TAP1 und LMP2 der HLA Klasse I APM
einherging. Die Expression von EBV-kodiertem LMP1 schien vor allem in RHEK1/LMP1
den Effekt des c-myc-Knockdown auf die HLA Klasse I APM Komponenten zu verstärken.
Nach 96 h c-myc-Knockdown wurden in allen Zelllinien die Komponenten der HLA Klasse I
APM auf Proteinebene mittels Western Blot analysiert (Abb. 3.3 B). Auch hier war der
induzierende Effekt des c-myc-Knockdowns auf die Komponenten der HLA Klasse I APM
3 Ergebnisse
Seite 93
A
B
RNAi
RHEK1
par
LMP1
C
c-myc
C
c-myc
kDa
LMP1
20
RHEK1 - c-myc RNAi
Relative fold change
(vs RHEK1 par C RNAi)
60
15
RHEK1
RHEK1
RHEK1
RHEK1
par C RNAi
par c-myc RNAi
LMP1 C RNAi
LMP1 c-myc RNAi
c-Myc
60
HLA-B
40
β2-m
10
9
TAP1
60
5
LMP2
20
β-Actin
0
c-myc
Relative fold change
(vs HeLa par C RNAi)
40
20
2-m
HLA-A
TAP1
LMP2
RNAi
HeLa - c-myc RNAi
HeLa
HeLa
HeLa
HeLa
40
HeLa
par
LMP1
C
c-myc
C
c-myc
kDa
par C RNAi
par c-myc RNAi
LMP1 C RNAi
LMP1 c-myc RNAi
LMP1
60
60
c-Myc
β2m
10
9
TAP1
60
5
20
LMP2
β-Actin
40
0
c-myc
HLA-A
2-m
TAP1
LMP2
RHEK1 par
RHEK1/LMP1
HC-10
HC-10
C
Abb. 3.3 c-Myc inhibiert die Expression von Komponenten der HLA Klasse I APM in epithelialen Zellen.
(A) Die qRT-PCR Analyse (ΔΔCT Methode mit Effizienzkorrektur) von RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und
HeLa/LMP1 Zellen nach c-myc-Knockdown für 48 h zeigte eine Stimulation der Genexpression der HLA Klasse
I APM Komponenten HLA-A, β2-m, TAP1 und LMP2. Die Expression von EBV-kodiertem LMP1 schien vor
allem in RHEK1/LMP1 den Effekt des c-myc-Knockdowns zu verstärken. Daten von 3 unabhängigen
Experimenten sind als Mittelwert ± SD angegeben. (B) Die Western Blot Analyse von RHEK1, RHEK1/LMP1,
HeLa und HeLa/LMP1 nach 96 h c-myc-Knockdown zeigt eine Herunterregulation von c-Myc in RHEK1 und
RHEK1/LMP1 bzw. HeLa und HeLa/LMP1. Der c-myc-Knockdown bewirkte eine Hochregulation aller
angegebenen HLA Klasse I APM Komponenten in beiden Zelllinien. Ein repräsentatives Experiment von
mindestens 2. (C) Die durchflusszytometrischen Analysen in RHEK1 und RHEK1/LMP1 nach 96 h c-mycKnockdown zeigen eine Hochregulation der HLA Klasse I schweren Kette (HC-10). Der Effekt von EBVkodiertem LMP1 auf die Expression der HLA Klasse I schweren Kette wurde durch den c-myc-Knockdown
weiter verstärkt. Gestrichelte Linien zeigen die Kontrollfärbung ohne HC-10 Antiköper und durchgehende
Linien die HC-10 Positivität nach c-myc-Knockdown (schwarz) oder ohne c-myc-Knockdown (grau). Ein
repräsentatives Experiment von 3.
3 Ergebnisse
Seite 94
deutlich sichtbar und war vor allem in der stark c-Myc exprimierenden Zelllinie
RHEK1/LMP1 am deutlichsten erkennbar. An RHEK1 und RHEK1/LMP1 Zellen wurden
weiterhin
96
h
nach
c-myc-Knockdown
durchflusszytometrische
Untersuchungen
durchgeführt, um den Effekt auf die HLA Klasse I schwere Kette (HC-10) zu messen. Die
Zellen wurden nicht permeabilisiert, um ausschließlich die Oberflächenexpression der HLA
Klasse I schweren Ketten mit dem HC-10 Antikörper zu bestimmen. In Abb. 3.3 C wird
deutlich, dass der c-myc-Knockdown zu einer Induktion der Oberflächenexpression der HLA
Klasse I schweren Kette führt. Der induktive Effekt auf die HLA Klasse I APM wurde durch
die Expression von EBV-kodiertem LMP1 in den RHEK1/LMP1 Zellen deutlich verstärkt im
Vergleich zu dem beobachteten Effekt in parentalen RHEK1 Zellen.
3.1.4 Einfluss von c-Myc auf die von EBV-kodiertem LMP1 induzierte Hochregulation
der HLA Klasse I APM
Da der Knockdown von c-myc die Hochregulation der HLA Klasse I APM Komponenten
bewirkte, stellten wir die Hypothese auf, dass eine c-myc Transfektion das Gegenteil zur
Folge haben sollte oder zumindest den Effekt von EBV-kodiertem LMP1 auf die Regulation
der HLA Klasse I APM Komponenten abschwächen sollte. Da die stabil mit EBV-kodiertem
LMP1 transfizierten Zelllinien nur unzureichend mit c-myc transient transfiziert werden
konnten, wurde die parentale Zelllinie RHEK1 mit den Expressionsvektoren von EBVkodiertem LMP1, c-myc oder mit beiden Plasmiden für 96 h transient revers (ko-)transfiziert.
Wie erwartet und schon in der stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten Zelllinien
gezeigt, wurde die Expression von β2-m, TAP1 und LMP2 nach der Transfektion mit EBVkodiertem LMP1 deutlich induziert (Abb. 3.4 A). Wurde jedoch eine Kotransfektion von
EBV-kodiertem LMP1 mit c-myc durchgeführt, so war die stimulierende Wirkung von EBVkodiertem LMP1 auf die Komponenten der HLA Klasse I APM gut erkennbar reduziert. Wie
in Abb. 3.4 A außerdem gezeigt, konnte eine konsistente c-Myc Expression nach Transfektion
gut mittels Western Blot dargestellt und überwacht werden, was für die Expression des
Plasmides des EBV-kodierten LMP1, mutmaßlich aufgrund der deutlich geringeren
Proteinexpression im Vergleich zu den stabil transfizierten Zellen, nicht umsetzbar war.
Deswegen wurde eine gleichmäßige Expression von EBV-kodiertem LMP1 mittels qRT-PCR
auf RNS-Ebene sichergestellt. Abb. 3.4 B zeigt ein konsistentes Expressionsniveau von EBVkodiertem LMP1, wenn man die alleinige Transfektion mit EBV-kodiertem LMP1 mit der
3 Ergebnisse
Seite 95
Kotransfektion von EBV-kodiertem LMP1 und c-myc vergleicht. Um den Effekt der
Kotransfektion auf die HLA Klasse I schwere Kette zu untersuchen, wurden RHEK1 Zellen
nach 96 h Kotransfektion mit dem HC-10 Antikörper gefärbt und am Durchflusszytometer
analysiert. Wie in Abb. 3.4 C dargestellt, führte die Kotransfektion von EBV-kodiertem
LMP1 und c-myc zu einer schwach signifikanten Abnahme der HLA Klasse I schweren
Ketten Expression im Vergleich zur Expression nach alleiniger Transfektion mit EBVkodiertem LMP1. Durchschnittlich befanden sich in dem analysierten Gate (G2) 3,0 % (±
0,7%) der ungefärbten Kontrollzellen, 67,3 % (± 15,4%) der mit EBV-kodiertem LMP1
transfizierten Zellen und 56,0 % (± 20,3%) der mit EBV-kodiertem LMP1 und c-myc kotransfizierten Zellen (n = 5; p = 0,049).
abhängige Induktion der HLA Klasse I APM
RHEK1 par
A
kDa
1
1
0.25
0.75
1
0.5
0.5
1
1
1
-
Abb. 3.4 c-myc inhibiert die EBV-kodiertes LMP1-
0.25
0.75
1
-
0.5
0.5
1
-
60
pLNSX-LMP1/µg
pLNSX/µg
pcDNA3-c-myc/µg
pcDNA3/µg
Komponenten. (A) RHEK1 Zellen wurden transient
c-Myc
beiden Plasmiden für 96 h (ko-)transfiziert. Mittels
β2-m
Western Blot wurde die Expression von β2-m, TAP1
TAP1
und LMP2 analysiert. EBV-kodiertes LMP1 alleine
9
60
revers mit EBV-kodiertem LMP1, c-myc oder mit
führte zu einer Induktion der Expression von β2-m,
LMP2
20
TAP1 und LMP2. Der induktive Effekt war erkennbar
β-Actin
40
reduziert, wenn c-myc ko-transfiziert wurde. Ein
repräsentatives Experiment von 3. (B) qRT-PCR
B
Relative fold change
(vs LMP1 0.25 µg)
4
Analysen
zeigen
eine
konsistent
erhöhte
und
vergleichbare Expression von EBV-kodiertem LMP1
3
nach 48 h alleiniger Transfektion im Vergleich zur
2
Kotransfektion mit c-myc in RHEK1 Zellen. Daten von
1
3 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SD
angegeben. (C) Mittels Durchflusszytometrie wurden in
LM
P
m 10
yc
.5
µ
1
µg g
c-
c-
LM
P
m 10
yc
.2
5
1
µg µg
LM
P1
µg
5
0.
0.
LM
P
25 1
µg
0
RHEK1 Zellen die transiente Transfektion mit EBVkodiertem LMP1 (0,5 µg) und die Kotransfektion von
EBV-kodiertem LMP1 (0,5 µg) und c-myc (1 µg)
miteinander verglichen. Ein schwach signifikanter (p =
C
0.049; n = 5) inhibitorischer Effekt von c-myc auf die
LMP1: 82,5%
LMP1+c-myc: 73,3%
induktive Wirkung von EBV-kodiertem LMP1 auf die
HLA Klasse I schwere Kette (HC-10) konnte gezeigt
werden. Gestrichelte Linie: Kontrollfärbung ohne HC10 Antikörper. Die Prozentzahl von positiven Zellen in
Gate G2 ist für mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierte
Zellen (LMP1) und EBV-kodiertem LMP1 und c-myc
ko-transfizierte
Zellen
(LMP1+c-myc)
repräsentative Experiment von 5 angegeben.
HC-10
für
dieses
3 Ergebnisse
Seite 96
3.1.5 Die Rolle von IL6 und STAT3 bei der Regulation von c-Myc durch EBV-kodiertes
LMP1
Wie bereits gezeigt, induzierte EBV-kodiertes LMP1 nicht nur die HLA Klasse I APM
Komponenten sondern auch c-Myc, das der Hochregulation der HLA Klasse I APM
Komponenten entgegenwirkt. Ein möglicher Kandidaten-Signalweg für die Induktion von
A
B
kDa
C
RHEK1
N
LMP1
C
N
HeLa
par
C
N
par
LMP1
20000
LMP1
C
N
STAT3-pY705
80
Lamin B1
IL-6 pg/ml
par
25000
60
15000
3000
2000
STAT3
80
1000
GAPDH
30
0
RHEK1
C
D
RHEK1 par
kDa
-
5
10
10
50
100
CP690550/µM
STAT3-pY705
STAT3-pY705
60
5
kDa
80
80
RHEK1LMP1
-
IL-6/ng/ml
HeLa
80
STAT3
STAT3
80
c-Myc
60
β-Actin
40
c-Myc
β-Actin
40
Abb. 3.5 EBV-kodiertes LMP1 induziert die STAT3 und IL6 Signaltransduktion. (A) Western Blot
Analysen des Phosphorylierungsstatus von STAT3-pY705 und der Expression von STAT3-Gesamtprotein
wurde in den zytoplasmatischen (C) und nukleären (N) Fraktionen von RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und
HeLa/LMP1 durchgeführt. Lamin B1 diente als Ladekontrolle für die nukleären und GAPDH für die
zytoplasmatischen Fraktionen. Die stabile Transfektion mit EBV-kodiertem LMP1 führte zu einer milden
Induktion von überwiegend zytoplasmatischem STAT3 und zu einer wesentlich stärkeren Induktion der
nukleären STAT3-pY705-Phosphorylierung. Jeweils ein repräsentatives Experiment von 3. (B) Die ELISA
Analyse der IL-6 Sekretion in RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 zeigte eine starke Induktion des
Zytokins in Abhängigkeit von EBV-kodiertem LMP1. Daten von 3 unabhängigen Experimenten sind als
Mittelwert ± SD angegeben. (C) Mittels Western Blot wurde der Effekt von rekombinantem humanem IL-6 auf
STAT3, STAT3-pY705 und c-myc in RHEK1 Zellen untersucht. IL-6 führte zu einer milden Hochregulation
von STAT3 und c-Myc und zu einer starken Induktion der STAT3-pY705-Phosphorylierung. Ein repräsentatives
Experiment von 3. (D) Die Western Blot Analyse zeigt den Effekt des JAK3 Inhibitors CP690550 (Tofacitinib)
auf die STAT3-Gesamtprotein Expression, die STAT3-pY705-Phosphorylierung und die c-Myc Expression. Die
Inkubation von RHEK1/LMP1 mit CP690550 für 48 h führte zu einer starken Abnahme der STAT3-pY705Phosphorylierung und Dosis-abhängig zu einer Reduktion der STAT3 und c-Myc Expression. Ein
repräsentatives Experiment von 3.
3 Ergebnisse
Seite 97
c-myc durch LMP-1 war der in malignen Tumoren sehr häufig aktive STAT3
Signaltransduktionsweg (Bowman et al, 2001; Kiuchi et al, 1999). Um dieser Hypothese
nachzugehen, wurden RHEK1, RHEK1/LMP1, HeLa und HeLa/LMP1 in zytoplasmatische
und nukleäre Fraktionen geteilt. Die STAT3 Expression und auch der STAT3-pY705Phosphorylierungsstatus wurden untersucht (Abb. 3.5 A). Die STAT3 Expression wurde
durch die stabile Transfektion mit EBV-kodiertem LMP1 nur sehr diskret induziert, während
es zu einer starken Induktion der STAT3-pY705-Phosphorylierung in Anwesenheit von EBVkodiertem LMP1 in Zytoplasma und Nukleus kam. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass
EBV-kodiertes LMP1 insgesamt zu einer Steigerung der Phosphorylierung von STAT3 führte
und es sich hier nicht lediglich um einen Effekt eines erhöhten Transportes von STAT3pY705 vom Zytoplasma in den Zellkern handelte. Der Anstieg der STAT3-pY705Phosphorylierung in stabil mit EBV-kodiertem LMP1 transfizierten Zellen wurde von einer
stark vermehrten IL-6 Sekretion durch RHEK1 und HeLa Zellen begleitet (Abb. 3.5 B). IL-6
wiederum war selbst in der Lage die STAT3-pY705-Phosphorylierung und darüber hinaus
auch die c-Myc Expression zu induzieren (Abb. 3.5 C). Weiterhin konnte durch die Inhibition
der
Tyrosinkinase
JAK3
in
RHEK1/LMP1
mit
einem
spezifischen
Inhibitor
(CP69055/Tofacitinib) gezeigt werden, dass JAK3 maßgeblich in die Aktivierung des
STAT3-Signaltransduktionsweges involviert war, da die STAT3-pY705-Phosphorylierung
nach JAK3-Hemmung nahezu gänzlich aufgehoben war (Abb. 3.5 D). Die Reduktion der
STAT3-pY705-Phosphorylierung war hier von einer Dosis-abhängigen Abnahme der c-Myc
Expression begleitet.
Insgesamt induzierte das EBV-kodierte LMP1 nicht nur die Expression der Komponenten der
HLA
Klasse
I
APM,
sondern
stimulierte
gleichzeitig
den
JAK3/STAT3
Signaltransduktionsweg, was zu einer begleitenden Induktion der c-Myc Expression führte,
wodurch wiederum der stimulatorische Effekt auf die HLA Klasse I APM relativiert wurde.
3 Ergebnisse
Seite 98
3.2 Die Rolle von DC und MΦ bei der Immunevasion und antitumoralen Immunität des
cHL
3.2.1 Charakterisierung der Verteilung von DC unc MΦ in cHL Gewebe
Eine Übersicht über die Patienten und klinischen Daten der HL-Fälle ist in Tabelle 1 gegeben.
106 cHL und 8 nlpHL Fälle wurden untersucht. Die cHL Untergruppe beinhaltete nahezu
ausschließlich nodulär sklerosierende (ns) oder Mischtsyp (mc) HL Subtypen (97,2%). Eine
EBV Infektion der HRS-Zellen wurde in 34% der cHL Fälle detektiert. Die meisten nlpHL
Fälle (87,5%) wurden in einem Ann Arbor Stadium I oder II diagnostiziert und die meisten
cHL Fälle (64.2%) in Stadium II oder III (Tabelle 3.1). Die mittlere Nachverfolgungszeit
betrug 7,8 Jahre für cHL und 10,4 Jahre für nlpHL Patienten. In der nlpHL Gruppe traten
keine Rezidive oder Tumortode auf, in der cHL Gruppe erlitten 17% ein Rezidiv und 10.4%
starben an dem cHL.
Charakteristiken
n (%)
n (%)
HL Fälle
cHL
106 (100)
nsHL
65 (61.32)
mcHL
38 (35.85)
andere
3 (2.83)
nlpHL
8 (100)
Geschlecht
Männlich
66 (62.26)
4 (50)
Weiblich
40 (37.74)
4 (50)
EBV Status
EBV negativ
68 (64.15)
EBV positiv
36 (33.96)
Nicht bekannt
2 (1.89)
Ann-Arbor
Stadium I
16 (15.09)
5 (62.50)
Stadium II
43 (40.57)
2 (25.00)
Stadium III
25 (23.59)
0 (0)
Stadium IV
13 (12.26)
1 (12.50)
Stadium nicht bekannt
9 (8.49)
0 (0)
Alter bei Diagnose (Jahre) 38.92 ± 20.02
36.06 ± 20.05
Nachverfolgung (Jahre)
10.39 ± 3.68
7.78 ± 4.91
Rezidiv
18 (16.98)
0 (0)
Tumortod
11 (10.38)
0 (0)
Tab. 3.1 Übersicht über die klinischen Daten der Patienten mit HL
3 Ergebnisse
Seite 99
Als Marker für myeloide (m)DC wurden CD1a (unreife mDC) und CD83 (reife mDC)
verwendet, wie schon in der Literatur beschrieben (Gottfried et al, 2008) (Abb. 3.6 A und B).
Intratumorale mDC zeigten einen prädominant reifen Phänotyp mit wenigen CD1a-positiven
und deutlich mehr CD83-positiven mDC (Abb. 3.7 A). CD123-positive plasmazytoide (p)DC
waren im cHL unter den DC am stärksten vertreten (Abb. 3.6 C und Abb. 3.7 A). Für die
Quantifizierung von MΦ wurde CD68, ein lysosomaler Marker, der alle MΦ anfärbt und
CD163, ein Marker für MΦ-2, verwendet (Abb. 3.6 D und E). CD68-positive MΦ stellten den
zahlenmäßig am stärksten vertretenen Typ von Antigen-präsentierenden Zellen dar (Abb. 3.7
B). CD163-positive MΦ-2 kamen ähnlich häufig vor wie CD68-positive MΦ, was darauf
hindeutete, dass die Mehrzahl der MΦ im cHL einen MΦ-2-artigen Phänotyp aufwiesen.
A
B
CD1a (unreife mDC)
C
CD83 (reife mDC)
D
CD123 (pDC)
E
CD68 (MΦ)
CD163 (MΦ-2)
Abb. 3.6 Immunohistochemische Färbungen von cHL Biopsien. (A) Gezeigt ist die Färbung von unreifen
CD1a-positiven mDC in einem cHL Fall mit zahlreichen tumorinfiltrierenden Zellen neben wenigen CD1anegativen cHL Zellen. (B) CD83-positive reife mDC neben CD83-positiven HRS-Zellen (Pfeil). (C) Die CD123
Färbung zeigt pDC mit plasmazytoider Morphologie neben CD123-negativen HRS-Zellen. (D) Dargestellt sind
zytoplasmatisch CD68-positive MΦ und (E) CD163 gefärbte MΦ mit membranöser und zytoplasmatischer
Positivität neben CD68- und CD163-negativen HRS-Zellen. Repräsentative Beispiele von cHL Biopsien sind
gezeigt. Bilder wurden mit einem 40x/0,75 Objektiv an einem Zeiss Imager.A1 unter Anwendung der
AxioVision SE64 Rel.4.8 Software aufgenommen. (Die hier gezeigten Daten wurden im Rahmen dieses
Projektes am pathologischen Institut generiert und von einer erfahrenen Pathologin ausgewertet.)
3 Ergebnisse
Seite 100
Im Weiteren wurde die Verteilung von APC Subtypen zwischen EBV-positiven und EBVnegativen cHL bzw. zwischen cHL und nlpHL Fällen verglichen. In EBV-positivem cHL
fanden sich im Vergleich zu EBV-negativem cHL eine erhöhte Anzahl von CD68-positiven
MΦ und CD163-positiven MΦ-2 und eine geringere Anzahl von reifen mDC (Abb. 3.7 C),
was aber nicht mit einem schlechteren tumorspezifischen Überleben einherging (Daten nicht
gezeigt). Das prognostisch günstigere nlpHL war mit signifikant geringerem Vorkommen von
MΦ und speziell MΦ-2 assoziiert (Abb. 3.7 D).
A
B
***
n.s.
***
***
D
C
*
2
***
2000
1500
1000
*
2500
positive cells/mm
*
500
**
2000
1500
1000
500
CD163
CD123
CD68
cH
L
nl
pH
L
CD83
cH
L
nl
pH
L
CD1a
cH
L
nl
pH
L
-
+
EB
V
+
CD68
EB
V
-
EB
V
+
-
CD123
EB
V
EB
V
+
CD83
EB
V
+
-
-
EB
V
EB
V
EB
V
EB
V
CD1a
cH
L
nl
pH
L
0
0
cH
L
nl
pH
L
positive cells/mm
2
2500
CD163
Abb. 3.7 Verteilung von unreifen und reifen mDC, pDC, MΦ und MΦ-2 in (EBV-negativen/-positiven)
cHL und nlpHL. (A) Die Box Plots zeigen die Verteilung der verschiedenen DC Subtypen in allen cHL Fällen.
(B) MΦ und MΦ-2 waren die dominante Gruppe infiltrierender APC. (C) Die Verteilung von verschiedenen
APC Subtypen in EBV-negativen und EBV-positiven cHL und (D) cHL und nlpHL wurde verglichen. Die
Anzahl der CD83-positiven mDC war geringer und die Anzahl der MΦ und MΦ-2 war höher in EBV-positiven
im Vergleich zu EBV-negativen Fällen. In nlpHL war die Anzahl von MΦ und MΦ-2 im Vergleich zu cHL
signifikant reduziert. Der t-Test für ungepaarte Strichproben wurde bei Normalverteilung und der MannWhitney-U-Test wurde bei nicht-Normalverteilung verwendet mit *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001.
Anzahl gefärbter Fälle: CD1a-cHL: 101, CD1a-nlpHL:8, CD83-cHL: 97, CD83-nlpHL: 6, CD123-cHL: 97,
CD123-nlpHL: 6, CD68-cHL: 96, CD68-nlpHL: 5, CD163-cHL: 94, CD163-nlpHL: 6.
3 Ergebnisse
Seite 101
3.2.2 Prognostischer Einfluss von DC und MΦ auf den klinischen Verlauf von cHL
Patienten
Um die Rolle der verschiedenen APC Subtypen auf das tumorspezifische Überleben zu
untersuchen, wurden Kaplan-Meier Analysen durchgeführt. CD1a-, CD68- und CD123-
A
B
Cut-off: mean
Cut-off: 50th percentile
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
0
C
5
10
15
20
0
D
Cut-off: 75th percentile
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
5
10
15
20
10
15
20
Cut-off: 50th percentile
1.0
0
5
0
5
10
15
20
Abb. 3.8 Einfluss von CD83- und CD163-positiven Zellen auf die Prognose des cHL. (A) Kaplan-Meier
Analysen zum tumorspezifischen Überleben von cHL Patienten in Bezug auf die Anzahl von infiltrierenden
CD83-positiven reifen mDC, von (B und C) CD163-positiven MΦ-2 und (D) bzgl. des Verhältnisses von
CD163-positiven MΦ-2 zu CD83-positiven reifen mDC (CD163:CD83) wurden durchgeführt. Als cut-off (zur
Einteilung der Vergleichsgruppen) wurde der Mittelwert (A), der Median/50. Perzentile (B und D) bzw. die 75.
Perzentile (C) verwendet, um die Gruppen mit hoher und niedriger Anzahl von CD83-positiven Zellen/mm2,
CD163-positiven Zellen/mm2 und mit hohem und niedrigem Quotienten von CD163-positiven zu CD83positiven Zellen/mm2 zu definieren. Eine hohe Anzahl von CD83-positiven mDC wie auch eine niedrige Anzahl
von CD163-positiven MΦ-2 waren mit besserem tumorspezifischem Überleben assoziiert.
3 Ergebnisse
Seite 102
positive Zellen hatten keinen Einfluss auf das tumorspezifische Überleben (Daten nicht
gezeigt). Das tumorspezifische Überleben von Patienten mit einer hohen Anzahl von CD83positiven reifen mDC war signifikant besser im Vergleich zu der Gruppe mit wenigen CD83positiven mDC (p=0,048; Abb. 3.8 A). Im Gegensatz dazu war eine hohe Anzahl von CD163positiven Zellen stark mit dem Tumortod assoziiert und die Signifikanz dieses Befundes stieg
mit steigender Perzentile als cut-off zur Einteilung der Vergleichsgruppen an (50. Perzentile:
p=0,004; 75. Perzentile: p=0,00019; Abb. 3.8 B und C). Zusätzlich wurde das Verhältnis von
CD163- zu CD83-positiven Zellen berechnet und hohe Werte dieses Quotienten waren mit
schlechtem tumorspezifischem Überleben assoziiert, somit waren Patienten mit niedriger
CD163- und hoher CD83-positiver Zellzahl bzgl. ihres Überlebens begünstigt (p=0,006; Abb.
3.8 D).
3.2.3 Analyse des Zytokinprofils mittels qRT-PCR in cHL Gewebe
RNS aus FFPE Material von cHL Biopsien wurde isoliert und qRT-PCR Analysen
durchgeführt, um das Zytokin Profil zu bestimmen. Im FFPE Material sind die Nukleinsäuren
stark degradiert, weswegen spezifische Taqman Sonden verwendet wurden, die sehr
spezifisch und effizient Sequenzen mit weniger als 100 bp detektieren können. Die
Expression von IL12B, TNF, IL10 und TGFβ1 wurde untersucht, da sie im cHL Gewebe
exprimiert werden und die Entwicklung und Reifung der DC und/oder die MΦ Polarisation
beeinflussen (Banchereau & Steinman, 1998; Biswas & Mantovani, 2010; Gottfried et al,
2008; Steidl et al, 2011). cHL Fälle wurden ausgewählt, die eine besonders hohe (>75.
Perzentile) oder niedrige (<25. Perzentile) Anzahl CD83- oder CD163-positiver Zellen
aufwiesen, um auch bei niedriger Anzahl untersuchter Fälle mögliche Unterschiede aufdecken
zu können. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der RNS der L1236 Zelllinie normalisiert und
mit 10 Fällen von reaktiver Lymphadenopathie verglichen. Die Gruppen mit niedriger Anzahl
von CD83- bzw. hoher Anzahl von CD163-positiven Zellen, von denen ein schlechtes
tumorspezifisches Überleben zu erwarten wäre, zeigten die stärkste Expression aller
getesteten Zytokine in einigen Fällen (Abb. 3.9 A-D). Ein typisches MΦ-1 oder MΦ-2
Zytokinprofil konnte nicht festgestellt werden. Vielmehr waren sowohl pro- als auch
antiinflammatorische Zytokine teilweise deutlich hochreguliert. Interessanterweise wies die
Gruppe mit niedriger Anzahl an CD163-positiven Zellen eine sehr geringe Zytokinexpression
auf, welche mit den Befunden aus reaktiven Lymphadenopathien vergleichbar war.
3 Ergebnisse
Seite 103
4000
IL12B (Relative fold change)
A
2000
200
100
1
0
TNF (Relative fold change)
B
L1236
CD83 high
CD83 low
CD163 high
CD163 low
rLA
L1236
CD83 high
CD83 low
CD163 high
CD163 low
rLA
L1236
CD83 high
CD83 low
CD163 high
CD163 low
rLA
L1236
CD83 high
CD83 low
CD163 high
CD163 low
rLA
10
5
2
1
0
IL10 (Relative fold change)
C
200000
100000
30000
20000
10000
1
0
TGF1 (Relative fold change)
D
500
400
200
100
1
0
3 Ergebnisse
Seite 104
Abb. 3.9 Zytokinexpression in cHL Biopsien. Die Expression von (A) IL12B, (B) TNF, (C) IL10 und (D)
TGFβ1 wurde mittels qRT-PCR an aus FFPE isolierter RNS untersucht. Die cHL Fälle wurden unter
Zuhilfenahme der 25. und 75. Perzentile als cut-off in Gruppen mit hoher (high; >75. Perzentile) oder geringer
Anzahl (low; <25. Perzentile) von CD83- oder CD163-positiven infiltrierenden Zellen unterteilt. Gruppen mit
geringer Anzahl von CD83- und hoher Anzahl von CD163-positiven Zellen zeigten zumindest in einigen Fällen
eine besonders starke Expression der getesteten Zytokine. Die Gruppe mit niedriger Anzahl von CD163positiven Zellen zeigte dahingegen eine geringe Zytokinexpression, welche vergleichbar mit den Fällen der
reaktiven Lymphadenopathie (rLA) war. Daten (Triplikate) der einzelnen untersuchten Fälle sind jeweils als
Mittelwert ± SD angegeben.
3.2.4 Etablierung des Zellkulturmodelles zur Generierung von (mo)DC aus peripheren
Blutmonozyten und MΦ
Monozyten aus humanem peripherem Blut wurden für 6 Tage in Anwesenheit von IL4 und
GM-CSF zur Generierung von unreifen monocyte-derived (mo)DC ausdifferenziert. Sie
zeigten die erwartete Morphologie mit typischen verzweigten Zytoplasma-Fortsätzen (Abb.
3.10 A). Für die Vordifferenzierung von MΦ wurden Monozyten für 5 Tage entweder mit
GM-CSF für die Generierung von MΦ-1 mit sogenannter “Spiegelei” Morphologie oder mit
M-CSF für die Generierung von MΦ-2 mit spindelförmiger Morphologie inkubiert (Abb. 3.10
A). Um die Reinheit der moDC und MΦ zu überprüfen, wurden die Zellen nach der
Ausdifferenzierung auf die Expression von zelllinientypischen Markern hin untersucht (Abb.
3.10 B). moDC zeigten einen geringen Prozentsatz an CD14 exprimierenden Zellen, einem
Marker für Monozyten, und waren zu 98% positiv für CD11c, einem Marker für DC. MΦ-1
und MΦ-2 waren jeweils stark CD68- und CD11b-positiv (MΦ Marker). Alle Zelllinien
waren nur geringfügig mit B- und/oder T-Zellen kontaminiert (<1%). Somit konnten wir
davon ausgehen, dass die Zelllinien einen angemessenen Reinheitsgrad aufwiesen. MΦ-1
zeigten außerdem eine hohe HLA-DR Expression und waren nahezu vollständig CD163negativ (Abb. 3.10 C). MΦ-2 hingegen exprimierten den für MΦ-2 spezifischen scavenger
Rezeptor CD163 und im Vergleich zu MΦ-1 sehr gering HLA-DR. Demzufolge gingen wir
von einer effizienten Ausdifferenzierung der Monozyten in die verschiedenen modellhaften
moDC und MΦ-Untertypen aus.
3 Ergebnisse
Seite 105
Abb.
A
3.10
Generierung
proinflammatorischen
von
moDC,
MΦ-1
und
antiinflammatorischen MΦ-2. (A) Monozyten
moDC
aus humanem peripherem Blut wurden in moDC,
MΦ-1 oder MΦ-2 in Anwesenheit von 10 ng/ml
GM-CSF
IL4 und 25 ng/ml GM-CSF (6 Tage), 50 ng/ml
5 Tage
Monozyten
MΦ-1
GM-CSF (5 Tage) oder 50 ng/ml M-CSF (5
Tage)
ausdifferenziert.
Dargestellt
sind
Monozyten einen Tag nach Isolation, moDC mit
den typisch verzweigten Fortsätzen, MΦ-1 mit
MΦ-2
der typischen “Spiegelei” Morphologie und MΦ2 mit typischer spindelförmiger Morphologie.
Bilder wurden mit einem 10x/0,30 Ph1 Objektiv
moDC
B
MΦ-1
100
cellSens dimension Software aufgenommen. (B)
80
Die Reinheit von moDC wurde durch die
60
Messung der Marker CD14 (Monozyten), CD3
40
(T-Zellen), CD20 (B-Zellen) und CD11c (moDC)
20
mittels
% positive cells (M-1)
% positive cells (moDC)
100
80
60
40
20
0
0
CD14 CD3 CD20 CD11c
CD68 CD3 CD20 CD11b
MΦ-2
% positive cells (M-2)
an einem Olympus IX81 Mikroskop mit Hilfe der
Durchflusszytometrie
bestimmt.
Die
Expressionsrate lag jeweils bei 12%, 0%, <1%
beziehungsweise 98%. Die Expression von CD14
100
in moDC wurde in 25 und für CD3, CD20 und
80
CD11c in 4 Experimenten analysiert. Die
60
Reinheit
40
durchflusszytometrischer Analyse der Marker
20
CD68 (MΦ), CD3 (T-Zellen), CD20 (B-Zellen)
und
0
CD68 CD3 CD20 CD11b
der
CD11b
MΦ
(MΦ)
wurde
bestimmt.
mittels
Die
Expressionsraten der MΦ-1 lagen bei 95%, <1%,
<1% beziehungsweise 92% und der MΦ-2 bei
C
98%, <1%, <1% beziehungsweise 86%. Für die
10000
M-1
M-2
8000
Untersuchung von CD68, CD3, CD20 und
CD11b
in
MΦ
wurden
4
Experimente
durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte ±
4000
SEM. (C) MΦ-1 und MΦ-2 wurden auf ihre
2000
Expression von CD163 und HLA-DR hin
0
untersucht. Durchflusszytometrische Analysen
-D
LA
H
D
16
R
3
-2000
C
MFI
6000
ließen eine typische Expression von CD163 in
MΦ-2 und starke Expression von HLA-DR in
MΦ-1 erkennen. Daten von 10 unabhängigen
Experimenten sind als Mittelwert ± SEM
angegeben.
3 Ergebnisse
Seite 106
Zusätzlich wurde die Expression von IL10 und IL12 durch moDC, MΦ-1 und MΦ-2
analysiert (Abb. 3.11 A). Nach Stimulation mit LPS, zeigten moDC und MΦ-1 eine hohe
Sekretion von IL12 und vergleichsweise eine geringe Sekretion von IL10. MΦ-2 hingegen
sezernierten reichlich IL10 und fast kein IL12. Hiermit wurde ebenfalls die erfolgreiche
Differenzierung von Monozyten in die verschiedenen MΦ-Typen mit entsprechendem
Zytokinprofil bestätigt. Die Zelllinien L1236 und HDLM2, die von klassischen Hodgkin
Lymphomen (cHL) abstammen, dienten als Modell für die Tumorzellen des cHL. Die in
diesem Projekt häufig verwendeten Überstände dieser Zelllinien wurden auf die Produktion
von Chemokinen und Zytokinen hin untersucht (Abb. 3.11 B). TARC und MDC wurden am
150000
IL12 (pg/ml)
100000
moDC
moDC
20000
M-1
50000
1000
10000
1000
500
500
0
LPS
0
LPS
-
+
B
C
-
+
Calm2
TNF
TGFβ1
IL12B
IL10
TARC
MDC
TNF
TGF
IL12
IL10
350000
300000
250000
6000
pg/ml
M-1
M-2
M-2
IL10 (pg/ml)
A
4000
1000
500
L1236
0
L1236
HDLM-2
Abb. 3.11 Expression von Zytokinen und Chemokinen in moDC, MΦ-1, MΦ-2 und den cHL-Zelllinien
L1236 und HDLM2. (A) ELISA Analysen zeigten eine starke Produktion von IL12 in moDC und MΦ-1, vor
allem nach Stimulation mit LPS (100 ng/ml). In MΦ-2 hingegen konnte nur eine sehr geringe IL12 Sekretion
nachgewiesen werden auch nach Stimulation mit LPS. IL10 wurde dagegen am stärksten von MΦ-2 sezerniert.
Der Unterschied zwischen moDC/MΦ-1 und MΦ-2 war vor allem nach LPS Zugabe evident. Daten von
mindestens 3 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. (B) Mittels ELISA wurde die
Expression von TARC, MDC, TNFα, TGFβ, IL12 und IL10 in L1236 und HDLM2 analysiert. Die TARC und
MDC Produktion war relativ hoch, vor allem in HDLM2. Allerdings zeigten L1236 eine höhere Sekretion von
TNFα und IL12. Daten von mindestens 3 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.
(C) Das Zytokinexpressionsprofil in L1236 wurde auf RNS-Ebene durch qRT-PCR bestätigt, wie im
Amplifikationsplot angezeigt. Ein repräsentatives Experiment von 13.
3 Ergebnisse
Seite 107
stärksten exprimiert, vor allem in HDLM2. TNFα und IL12 hingegen wurden kräftiger von
L1236 als von HDLM2 produziert. Das Zytokinprofil für L1236 konnte auf RNS-Ebene
mittels qRT-PCR bestätigt werden (Abb. 3.11 C).
3.2.5 Einfluss von Zytokinen und Überständen von cHL-Zelllinien auf die Reifung von
moDC
Um das Reifungsverhalten von moDC zu untersuchen, wurden Zytokine eingesetzt, die für
ihren Einfluss auf die DC Reifung bekannt sind und bekanntermaßen im cHL exprimiert
werden (Banchereau & Steinman, 1998; Gottfried et al, 2008). TNFα induzierte die
Expression des Aktivierungsmarkers CD40 und des Reifungsmarkers CD83, wie erwartet
(Abb. 3.12 A). IL10 blockierte die Entwicklung von moDC, was durch die Hochregulation
des Monozyten Markers CD14 angezeigt wurde (Abb. 3.12 A). TGFβ führte zu einer
Herunterregulation von CD83 und inhibierte damit, wie erwartet, die Ausreifung der moDC
(Abb. 3.12 A). Da in den verwendeten cHL-Zelllinien die Chemokine TARC und MDC stark
sezerniert wurden, wollten wir testen, ob auch diese Chemokine einen Einfluss auf die
Aktivierung und die Reifung der moDC ausüben. Wie in Abb. 3.12 A gezeigt, konnte kein
Einfluss auf die Expression der Marker CD40, CD14 und CD83 festgestellt werden.
HRS-Zellen
sezernieren
zusammen
mit
den
inflammatorischen
Zellen
des
Entzündungsinfiltrats im cHL eine komplexe Mischung von Immunmediatoren. Um dem
Rechnung zu tragen, wurden moDC mit einem Zytokincocktail bestehend aus den oben
verwendeten Zyotkinen TNFα, IL10 und TGFβ oder mit Zellkultur Überständen der cHLZelllinien L1236 und HDLM2 behandelt. Alle Behandlungen führten zur Aktivierung der
moDC und/oder induzierten ihre Reifung (Abb. 3.12 B), vergleichbar mit TNFα, was mit dem
überwiegenden Vorkommen reifer mDC in cHL Biopsien gut in Einklang zu bringen ist (Abb.
3.7 A). Dieser Effekt war deutlicher nach Behandlung mit L1236 Überständen, die eine
höhere TNFα Sekretion aufwiesen als HDLM2 Zellen (Abb. 3.11 B). Bei der Inkubation mit
dem Zytokincocktail dominierte der reifungsfördernde Effekt von TNFα über die Wirkung
von IL10 und TGFβ. Die als Kontrolle verwendete Behandlung der moDC mit B-Zell
Überständen gesunder Spender, führte im Vergleich zu den Überständen der malignen BZelllinien L1236 und HDLM2 zu keiner signifikanten Veränderung der Aktivierungs- und
Reifungsmarker der DC (Abb. 12 B).
3 Ergebnisse
Seite 108
A
moDC
CD40
CD14
800
400
on
tro
l
TN
F
200
tro
l
0
CD14
IL10
n.s.
600
400
200
800
400
200
200
0
l
on
tro
l
TG
F
0
CD14
n.s.
n.s.
800
1000
800
400
200
0
on
tro
l
CD14
C
l
on
tro
C
n.s.
n.s.
800
1000
800
CD83 (MFI)
400
200
Isotype
C
Control
MDC
D
M
CD14
l
C
0
l
C
M
D
l
on
tro
CD40
400
200
0
on
tro
0
600
on
tro
CD14 (MFI)
500
C
CD40 (MFI)
600
1000
C
1500
MDC
CD83
TARC
n.s.
C
Control
TA
R
C
l
on
tro
TA
R
C
CD40
400
200
0
C
0
600
C
500
CD83 (MFI)
CD14 (MFI)
CD40 (MFI)
600
1000
TA
R
1500
Isotype
CD83
TGFβ
n.s.
M
D
Control
C
C
C
on
tro
l
TG
F
CD40
400
on
tro
0
600
TG
F
600
**
1000
CD83 (MFI)
800
CD14 (MFI)
800
Isotype
CD83
C
C
C
on
IL
10
CD40
400
IL
10
0
600
l
0
l
500
n.s.
CD40 (MFI)
C
1000
200
on
tro
800
IL
10
400
1000
on
tro
1500
n.s.
**
CD83 (MFI)
600
CD14 (MFI)
2000
Control
CD83
TNFα
800
Isotype
F
on
tro
l
C
Control
n.s.
TARC
500
0
CD14
TN
F
CD40
TN
C
on
tro
l
0
Isotype
TGFβ
1000
200
0
CD40 (MFI)
CD83 (MFI)
400
200
IL10
**
1500
600
CD14 (MFI)
CD40 (MFI)
600
TNFα
CD83
n.s.
***
800
CD83
3 Ergebnisse
Seite 109
B
moDC
CD40
CD14
600
1500
400
0
Isotype
il
l
tro
kt
a
C
on
l
tro
kt
ai
C
n.s.
*
1000
800
800
200
200
0
l
tro
S
CD14
on
Ü
l
L1
2
C
C
on
tro
L1
23
6
C
on
tro
Ü
S
l
0
CD40
Isotype
Control
400
Ü
S
0
600
CD83
6
200
400
L1
23
400
CD83 (MFI)
600
CD14 (MFI)
CD40 (MFI)
CD83
Cocktail
600
L1236 ÜS
CD14
oc
on
Control
*
800
0
C
C
C
oc
on
kt
a
tr o
l
il
CD40
l
0
1000
500
200
200
*
C
oc
400
2000
36
(TNFα, TGFβ, IL10)
CD14 (MFI)
Cocktail
CD40 (MFI)
600
800
CD83 (MFI)
***
800
CD83
n.s.
L1236 ÜS
n.s.
n.s.
800
800
600
600
*
1000
400
200
Ü
LM
H
D
H
HDLM2 ÜS
n.s.
800
800
CD83 (MFI)
200
200
el
lÜ
l
tro
S
l
tro
el
lÜ
on
Ü
C
Bc
S
l
tro
ll
on
ce
C
B-
Control
CD14
S
0
0
CD40
400
on
0
600
CD83
Bc
200
400
C
CD14 (MFI)
400
n.s.
1000
600
Isotype
CD83
LM
2
2
C
on
tro
l
S
l
tro
CD14
D
C
LM
D
H
Control
n.s.
600
CD40 (MFI)
0
on
Ü
tro
S
l
CD40
2
on
C
Isotype
800
B-Zell ÜS
200
0
0
400
S
200
600
Ü
400
CD83 (MFI)
CD14 (MFI)
HDLM2 ÜS
CD40 (MFI)
800
B-Zell ÜS
Abb. 3.12 Charakterisierung der Reifung von moDC nach Stimulation mit Zytokinen, L1236 und HDLM2
Überständen und Chemokinen. (A) moDC wurden für 24 h mit 10 ng/ml TNFα, IL10, TGFβ, TARC oder
MDC behandelt oder (B) mit einem Zytokincocktail (jeweils 10ng/ml TNFα, IL10 und TGFβ), mit 50% L1236
Überständen (ÜS), 50% HDLM2 Überständen (ÜS) oder 50% Überständen (ÜS) von B-Zellen gesunder Spender
behandelt. Die Expression von CD40, CD14 und CD83 wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Der
deutlichste induktive Effekt auf die moDC Aktivierung und Reifung wurde nach Behandlung mit TNFα oder
dem TNFα-haltigen Cocktail festgestellt. Die Überstände der cHL-Zelllinien hatten einen milden, TNFαähnlichen Effekt auf die moDC Reifung. Neben Punktdiagrammen ist jeweils ein repräsentatives Histogramm
eines Spenders dargestellt. Die Linien in den Punktdiagrammen verbinden die zusammengehörigen Messwerte
der einzelnen Spender. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist jeweils angezeigt. Der t-Test für gepaarte
Strichproben wurde bei Normalverteilung und der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wurde bei nichtNormalverteilung verwendet mit *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Daten von 5-14 unabhängigen
Experimenten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt.
3 Ergebnisse
Seite 110
3.2.6 Hemmung der Reifung von moDC durch Inhibition von TNFα
Da TNFα einen starken Effekt auf die Reifung der moDC zeigte (Abb. 3.12 A) und auch in
vivo im cHL Infiltrat, das von reifen mDC geprägt ist (Abb. 3.7 A), exprimiert wurde (Abb.
3.9 B), sollte getestet werden, ob eine TNFα Neutralisierung den beobachteten Effekt
aufheben kann. Dazu wurden bei der Inkubation von moDC mit L1236 Überständen zwei
verschiedene neutralisierende antiTNFα Antikörpern, darunter das Therapeutikum Infliximab,
zu dem Versuchsansatz hinzugefügt. Wie in Abb. 3.13 dargestellt, führte die Neutralisierung
von TNFα zu einer signifikanten Reduktion der CD40 und CD83 Expression der moDC.
Demzufolge scheint die Reifung der moDC, die bei Inkubation mit cHL Überständen
n.s.
n.s.
**
300
200
100
100
0
NF

lix
im
ab
1)
In
f
an
In
f
an
tiT
G
L1236 ÜS +
tiT
NF

lix
im
ab
1)
-
G
(Ig
pe
ty
lix
im
ab
NF

In
f
tiT
an
0
L1236 ÜS +
Is
o
Is
o
ty
pe
(Ig
G
-
1)
0
L1236 ÜS +
*
200
-
100
*
*
300
(Ig
200
**
pe
*
400
ty
300
n.s.
n.s.
400
Is
o
***
**
CD83 (MFI)
400
CD14 (MFI)
CD40 (MFI)
beobachtet wurde, zumindest teilweise TNFα-abhängig zu sein.
Abb. 3.13 Analyse der Reifung von moDC nach Stimulation mit cHL Überständen und Neutralisierung
von TNFα. moDC wurden für 24 h mit L1236 Überständen (ÜS) alleine oder zusätzlich mit je 10 µg/ml einer
IgG1-Isotypkontrolle, eines antiTNFα Antikörpers oder von Infliximab behandelt. Die Expression des DC
Aktivierungsmarkers CD40, des Monozytenmarkers CD14 und des DC Reifungsmarkers CD83 wurde mittels
Durchflusszytometrie bestimmt. Nach TNFα Neutralisierung kam es zu einer deutlichen Reduktion der
Expression des Aktivierungs- und Reifungsmarkers. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist jeweils
angezeigt. Aufgrund normalverteilter Werte wurde der t-Test für gepaarte Strichproben verwendet mit *p < 0,05,
**p < 0,01 und ***p < 0,001. Daten von 6-7 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt.
3 Ergebnisse
Seite 111
3.2.7 Analyse der chemotaktischen Wirkung von Überständen einer cHL-Zelllinie auf
die Migration von moDC
Durch die Behandlung mit L1236 Überständen wurde die Reifung von moDC induziert. Da
aktivierte DC ein verstärktes homing- und damit auch Migrationsverhalten aufweisen sollten,
wollten wir testen, ob die mit L1236 Überständen behandelten moDC in einem ChemotaxisAssay verstärkt migrieren. Dazu wurden behandelte Zellen zunächst auf die Expression des
Chemokin-Rezeptors CCR7 hin untersucht. Weder 6 Tage mit IL4 und GM-CSF
ausdifferenzierte moDC noch mit L1236 Überstand behandelte Zellen zeigten eine CCR7
Expression. Nach Behandlung mit einem Zytokincocktail bestehend aus TNFα, IL10 und
TGFβ konnte jedoch eine CCR7 Expression induziert werden (Abb. 3.14 A). Zur Analyse des
Migrationsverhaltens wurde das Chemokin SLC im Chemotaxis-Assay verwendet.
Interessanterweise kam es trotz des Fehlens des CCR7 Chemokinrezeptors zu einer
DC
A
B
SLC Chemotaxis
**
Penetrierte Zellen
12000
**
8000
1000
500
CCR7
Isotype
Control
L1236 ÜS
Cocktail (TNFα, TGFβ, IL10)
M
ed
iu
m
ko
nt
ro
lle
L1
23
P
6
M
os
Ü
ed
iti
S
vk
iu
m
on
ko
tro
nt
l
le
ro
lle
L1
+
23
PT
Po
6
x
Ü
si
S
tiv
+
ko
PT
nt
ro
x
lle
+
PT
x
0
Abb. 3.14 Chemotaktisches Verhalten von moDC nach Stimulation mit L1236 Überständen. (A) moDC
wurden für 24 h mit Medium als Kontrolle, 50% L1236 Überständen oder einem Zytokincocktail (jeweils 10
ng/ml TNFα, IL10 und TGFβ) behandelt und die Expression des SLC Rezeptors CCR7 wurde untersucht. moDC
wiesen auch nach Behandlung mit L1236 Überständen (ÜS) keine CCR7 Expression auf, jedoch konnte durch
Stimulation mit dem Cocktail die CCR7 Expression induziert werden. Ein repräsentatives Experiment von 3. (B)
moDC wurden für 24 h mit Medium als Kontrolle, 50% L1236 Überständen oder einem weiteren Zytokinmix
(5ng/ml IL1β, 10ng/ml IL6, 10ng/ml TNFα, 1µg/ml PGE2) als Positivkontrolle behandelt und ChemotaxisAssays mit SLC als Chemokin wurden durchgeführt. Als Kontrolle wurden bei allen Behandlungen die moDC
vorher mit Pertussis Toxin (PTx) vorinkubiert, um die Motilität der moDC zu inhibieren und zu beweisen, dass
die unbehandelten Zellen durch aktive Migration durch die Membran penetrierten. Die penetrierten Zellen
wurden zur Normierung mit PE-konjugierten Beads versetzt und die Anzahl der migrierten Zellen wurde mittels
Durchflusszytometrie bestimmt. Der t-Test für gepaarte Strichproben wurde bei Normalverteilung und der
Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wurde bei nicht-Normalverteilung verwendet mit *p < 0,05, **p < 0,01 und
***p < 0,001. Daten von 5-14 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.
3 Ergebnisse
Seite 112
signifikant gesteigerten Migration der mit L1236 Überstand behandelten moDC im Vergleich
zu unbehandelten moDC, wenn auch geringfügiger im Vergleich zur Positivkontrolle, in der
eine verstärkte Reifung der moDC induziert wurde (Abb. 3.14 B). Da L1236 Überstände die
Expression von CCR7 nicht induzierten, vermuten wir, dass die beobachtete Steigerung der
Migration der mit L1236 Überständen behandelten moDC durch eine anderweitige, durch
unsere Experimente nicht erklärbare Induktion ihrer Motilität verursacht sein müsste.
3.2.8 Einfluss von Überständen von cHL-Zelllinien und Chemokinen auf die Polarisation
von MΦ
Um auf die Frage einzugehen, ob die MΦ Polarisation durch cHL-konditioniertes Medium
moduliert werden kann, wurden MΦ-1 und MΦ-2 mit Überständen der Zelllinien L1236 und
HDLM2 inkubiert. Änderungen in der Expression von CD68, einem MΦ-Marker, den MΦ-2
Markern scavenger Rezeptor CD163 und Mannose-Rezeptor CD206 als auch von HLA-DR,
welches besonders auf MΦ-1 exprimiert wird, wurden mittels Durchflusszytometrie
analysiert. MΦ-1 zeigten eine signifikante Reduktion der HLA-DR Expression nach
Behandlung mit L1236 Überständen. Eine Induktion der MΦ-2 Marker CD163 und CD206
wurde jedoch nicht beobachtet (Abb. 3.15 A). Im Gegensatz dazu wurde die Expression von
CD163 und CD206 in MΦ-2 nach Behandlung mit L1236 und HDLM2 Überständen
konsistent und hoch signifikant induziert (Abb. 3.15 A). Weiterhin zeigte die Behandlung von
MΦ-2 mit den Chemokinen TARC und MDC keinen Einfluss auf die Polarisation der MΦ
(Abb. 3.15 B).
3 Ergebnisse
Seite 113
CD68 (MFI)
1000
l
S
S
Ü
LM
2
C
D
H
CD206 (MFI)
S
l
H
D
C
LM
2
on
Ü
tro
S
Ü
6
1000
500
0
500
S
l
HLA-DR
2
Ü
tro
on
C
Ü
S
6
on
tro
Control
HDLM2 ÜS
1000
LM
C
LM
D
Isotype
L1236 ÜS
1500
0
l
HLA-DR
2
on
Ü
tro
S
l
S
6
Ü
tro
1500
C
0
l
0
***
HLA-DR (MFI)
4000
2000
L1
23
HLA-DR (MFI)
6000
2000
n.s.
2000
CD206
2000
H
HLA-DR (MFI)
4000
on
tro
l
n.s.
10000
8000
6000
Ü
l
tro
H
**
6
0
on
S
Ü
0
D
C
LM
2
on
tro
l
S
6
Ü
tro
on
C
L1
23
10000
CD206
***
20000
10000
C
0
20000
L1
23
0
CD163
30000
L1
23
10000
1000
40000
30000
20000
10000
***
40000
CD206 (MFI)
CD206 (MFI)
20000
S
l
on
tro
C
H
n.s.
30000
on
L1
23
Ü
S
l
on
tro
C
40000
LM
2
*
D
6
Ü
S
l
on
tro
C
L1
23
40000
2000
0
0
CD163
Ü
on
tro
C
D
H
CD163 (MFI)
2000
D
0
CD68
**
3000
H
0
LM
2
S
l
CD163 (MFI)
1000
500
***
3000
1500
500
C
on
tro
S
Ü
2
C
C
1000
l
CD206 (MFI)
1000
0
D
2000
8000
HLA-DR (MFI)
2000
H
2000
CD163 (MFI)
2500
1500
n.s.
3000
2500
10000
HLA-DR
CD68
LM
Ü
on
tro
l
S
l
CD163 (MFI)
6
on
tro
C
L1
23
n.s.
30000
CD206
1000
0
0
3000
CD163
1000
2000
Ü
0
2000
n.s.
3000
6
1000
CD68 (MFI)
CD68 (MFI)
CD68 (MFI)
2000
n.s.
3000
*
3000
L1
23
n.s.
3000
CD68
MΦ-2
MΦ-1
A
Isotype
L1236 ÜS
Control
HDLM2 ÜS
3 Ergebnisse
Seite 114
B
MΦ-2
n.s.
2500
1000
0
0
CD68
C
n.s.
n.s.
2500
CD163 (MFI)
2000
1000
0
0
tro
C
n.s.
6000
CD163
C
C
TA
on
R
tro
on
l
500
l
500
C
1000
1500
D
1500
M
C
on
tro
l
tro
l
TA
R
C
500
2000
CD163 (MFI)
1000
500
2500
CD163
1500
M
1500
D
C
CD68 (MFI)
2000
on
CD68 (MFI)
2000
CD68
n.s.
2500
n.s.
5500
CD206 (MFI)
CD206
CD206 (MFI)
5000
4000
2000
4500
4000
3500
3000
n.s.
1000
C
400
0
on
tro
C
TA
R
on
tro
HLA-DR
C
0
l
200
C
200
D
400
600
M
HLA-DR (MFI)
600
C
n.s.
800
l
HLA-DR
HLA-DR (MFI)
800
M
C
on
TA
1000
CD206
D
tro
C
R
tro
C
on
l
2500
l
0
Isotype
TARC
Control
MDC
Abb. 3.15 Charakterisierung der Expression von Polarisationsmarkern auf MΦ nach Stimulation mit
L1236 und HDLM2 Überständen und Chemokinen. (A) Vordifferenzierte MΦ wurden für 24 h mit 50%
L1236 oder HDLM2 Überständen (ÜS) und (B) mit 10 ng/ml TARC oder MDC behandelt. Die Expression von
CD68, CD163, CD206 und HLA-DR wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Nach Behandlung mit den
Überständen konnte in MΦ-1 eine Reduktion der HLA-DR Expression beobachtet werden und in MΦ-2 wurde
die Polarisation nicht nur aufrechterhalten, sondern durch Induktion von CD163 und CD206 verstärkt. Ein
repräsentatives Histogramm eines Spenders ist jeweils neben Punktdiagrammen, bei denen die Messwerte der
einzelnen Spender aller Probanden verbunden sind, gezeigt. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist jeweils
dargestellt. Der t-Test für gepaarte Strichproben wurde bei Normalverteilung und der Wilcoxon-VorzeichenRang-Test wurde bei nicht-Normalverteilung verwendet mit *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Daten von
5-10 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.
3 Ergebnisse
Seite 115
3.2.9 Regulation der Proliferationsaktivität einer cHL-Zelllinie durch moDC und MΦ
Um den Effekt von moDC und MΦ auf die Tumorzellproliferation zu analysieren, wurden
Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-markierte L1236 Zellen mit Überständen von
moDC, MΦ-1 und MΦ-2 behandelt. CFSE, ein sog. fluorescence cell tracking dye, wird in die
Zelle beim Anfärben eingelagert und bei der Zellteilung nur zu je 50% an beide Tochterzellen
weitergeben, d.h. mittels der Intensität der Fluoreszenz kann auf das relative
Proliferationsverhalten geschlossen werden. Demnach ist das CFSE-Signal ein reziproker
Indikator für die Zellproliferation. Ein erhöhtes CFSE Signal und damit eine signifikante
Inhibition des L1236 Zellwachstums wurde nach Inkubation mit moDC und MΦ-1
Überständen beobachtet (Abb. 3.16 A). MΦ-2 Überstände hingegen beeinflussten die L1236
Proliferation nicht (Abb. 3.16 A). Ähnliche Ergebnisse wurden in einem BrdU-Assay erzielt,
bei dem der BrdU Einbau in die DNS von L1236 Zellen im Rahmen der mitotischen Aktivität
nach Behandlung mit MΦ-1 und MΦ-2 Überständen bestimmt wurde (Abb. 3.16 B). Um zu
bestimmen, ob der direkte Zell-Zell-Kontakt den Effekt auf die Proliferation von L1236
erhöht, wurden MΦ-1 und MΦ-2 mit L1236 ko-kultiviert und BrdU-Assays wurden
durchgeführt. In Kokultur fanden wir wiederholt einen signifikant geringeren BrdU Einbau in
die L1236 DNS nach Inkubation mit MΦ-1 im Vergleich zu MΦ-2, jedoch keinen
signifikanten Unterschied im Vergleich zur Behandlung mit Überständen (Abb. 3.16 B und
C). Da die Kokultur von MΦ und L1236 mit 50% des für die MΦ Polarisation verwendeten
Mediums durchgeführt wurde, wurden zum Ausschluss eines Einflusses von GM- und M-CSF
auf die Proliferation von L1236 BrdU-Assays mit diesen Zytokinen durchgeführt. Es konnte
kein signifikanter Einfluss von GM- und M-CSF auf die Proliferation von L1236 festgestellt
werden (Abb. 3.16 D). Um die Aufnahme und den Einbau von BrdU in die DNS von MΦ als
signifikantem Störfaktor bei den Analysen auszuschließen und damit eventuellen
Fehleinschätzungen der L1236 Proliferation vorzubeugen, wurde die Expression von Ki67 in
MΦ (CD68-positive Zellen) während der Kokultur mit L1236 immunzytochemisch
untersucht. MΦ in Kokultur waren überwiegend Ki67 negativ und es kann geschlussfolgert
werden, dass die Proliferationsrate und somit die DNS Replikation in MΦ sehr gering war
(Abb. 3.16 E). Demnach repräsentierten die Ergebnisse zur Messung der L1236 Proliferation
mittels BrdU Assay mit großer Wahrscheinlichkeit die proliferative Aktivität der L1236
Zellen.
3 Ergebnisse
n.s.
n.s.
*
50
60000
40000
on
C
S
Ü
M
D
L1236 L1236
+M-1 +M-2
(1:6)
(1:6)
Ü
S
0
tro
l
S
S
MΦ-2
48h Behandlung von L1236
E
n.s.
100000
100
% Ki67/CD68 positive cells
n.s.
FI (BrdU)
80000
+L1236
60000
40000
20000
0
50
SF
-C
M
-C
SF
on
M
tro
l
0
G
C
+BrdU
+L1236
***
20000
Ü
Ü

-2

-1
M
C
m
oD
on
Ü
tro
S
l
S
S
Ü
Ü

-2

-1
M
M
l
m
oD
C
tro
Ü
S
48h Kokultur
MΦ-1
100
0
0
on
C
C
50
*

-2
0
100
*
80000
M
50
*
48h Kokultur
n.s.
150

-1
CFSE (MFI) in % of Control
100
*
150
C
CFSE (MFI) in % of Control
**
48h ÜS Behandlung von L1236
FI (BrdU) in % of Control
**
150
B
*
FI (BrdU)
96h ÜS Behandlung von L1236
48h ÜS Behandlung von L1236
M
A
Seite 116
L1236 L1236
+M-1 +M-2
(1:6) (1:6)
Abb. 3.16 Analyse des Effekts von moDC, MΦ-1 und MΦ-2 auf die Proliferation von L1236 Zellen. (A)
L1236 Zellen wurden mit Überständen von moDC, MΦ-1 und MΦ-2 in Anwesenheit von CFSE für 48 h oder 96
h inkubiert. Die angezeigte mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
(B) L1236 Zellen wurden in Anwesenheit von BrdU für 48 h mit Überständen von MΦ-1 und MΦ-2 inkubiert
oder (B und C) mit MΦ-1 und MΦ-2 in einem Verhältnis von 1:6 ko-kultiviert. BrdU wurde mittels eines BrdUspezifischen Primärantikörpers und eines Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpers sichtbar gemacht.
Die Fluoreszenzintensität (FI) wurde mit einem Fluoreszenz Reader bestimmt. moDC Überstände (ÜS) und MΦ1 ÜS hemmten die Expansion von L1236 Zellen, MΦ-2 ÜS hingegen ließen die Zellproliferation unbeeinflusst.
Alle in (C) gezeigten Photographien der Zellkultur wurden mit einem 10x/0,30 Ph1 Objektiv an einem Olympus
IX81 Mikroskop mit Hilfe der cellSens dimension Software aufgenommen. Ein repräsentatives Beispiel ist
gezeigt. (D) L1236 Zellen wurden für 48 h mit 25 ng/ml GM- oder M-CSF in Anwesenheit von BrdU inkubiert.
Die FI wurde bestimmt wie unter (B) angegeben. GM- und M-CSF hatten keinen signifikanten Einfluss auf die
Proliferation von L1236. (E) L1236 wurden mit MΦ-1 oder MΦ-2 für 48 h im Verhältnis von 1:6 ko-inkubiert
und eine immunzytochemische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen Ki67 und CD68 wurde durchgeführt. Es
fand sich kein Unterschied in Ki67 Expression in den MΦ in Abhängigkeit von ihrer Polarisation. Der t-Test für
ungepaarte/gepaarte Strichproben wurde bei Normalverteilung und der Mann-Whitney-U-Test/WilcoxonVorzeichen-Rang-Test wurde bei nicht-Normalverteilung verwendet mit *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p <
0,001. Daten von (A) 6-9, (B) 6-8, (D) 3 und (E) 8 unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM
angegeben.
3 Ergebnisse
Seite 117
3.2.10 Analyse der BAFF und APRIL Sekretion in Kokultur von MΦ und einer cHLZelllinie
Da die Proliferation von L1236 durch die Kokultur mit MΦ beeinflusst wurde, stellte sich die
Frage, welcher Mechanismus hier involviert war. BAFF und APRIL sind Zytokine, die die
Proliferation von B-Zellen induzieren und als Überlebensfaktoren in B-Zell Neoplasien
fungieren. Um zu testen, ob BAFF oder APRIL in unserem System präsent und involviert
waren, wurden Überstände von MΦ-1 oder MΦ-2 bzw. von MΦ-1/L1236 oder MΦ-2/L1236
Kokulturen mittels ELISA analysiert. Die in Abb. 3.17 A gezeigten Konzentrationen der
beiden Zytokine waren gering. Neutralisierung der BAFF Wirkung mit einem Antikörper
gegen das BAFF Protein (αBAFF, Benlysta) oder gegen den BAFF Rezeptor (αBAFF-R)
zeigte im BrdU Assay keinen Einfluss auf die Proliferation von L1236 Zellen in Kokultur mit
MΦ-1 oder MΦ-2 (Abb. 3.17 B). Eine Beteiligung von IL4 bei der Regulation des
Wachstums von L1236 konnte mittels ELISA auch ausgeschlossen werden.
150
A
100
APRIL pg/ml
BAFF pg/ml
80
100
50
60
40
20
L1236 + M-1
+M 23
 6
-1
M

-2
L1
+M 23
 6
-2
L1236 + M-2
150
FI (BrdU) in % of Control
100
50
50
/m
l
/m
l
µg
50
/m
l
µg
20
µg
/m
l
BAFF-R
10
µg
20
µg
/m
l
m
l
BAFF
10
g/
2µ
g/
m
l
l
tr o
on
Benlysta
1µ
/m
l
/m
l
µg
µg
50
/m
l
µg
BAFF-R
20
/m
l
10
µg
/m
l
20
µg
g/
2µ
BAFF
10
m
l
tr o
g/
1µ
on
C
m
l
0
l
0
100
C
FI (BrdU) in % of Control
150
B
L1
L1
M

-1
+M 23
 6
-1
M

-2
L1
+M 23
 6
-2
0
M

-1
0
Benlysta
Abb. 3.17 Analyse der Sekretion von BAFF und APRIL in der Kokultur von MΦ und L1236. (A)
Überstände von MΦ-1, MΦ-2 und von der Kokultur von MΦ mit L1236 Zellen (6:1) wurden nach 48 h
abgenommen. ELISA Analysen zur BAFF und APRIL Sekretion zeigten sehr geringe Konzentrationen der
benannten Zytokine in allen Ansätzen. (B) MΦ-1 und MΦ-2 wurden für 48 h unter Anwesenheit von BrdU und
BAFF-spezifischen Antikörpern mit L1236 Zellen (6:1) ko-kultiviert. BrdU wurde mittels eines BrdUspezifischen Primärantikörpers und eines Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpers sichtbar gemacht.
Die Fluoreszenzintensität (FI) wurde mit einem Fluoreszenz Reader bestimmt. Daten von (A) 2-3 und (B) 3-5
unabhängigen Experimenten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.
4 Diskussion
Seite 118
4 Diskussion
4.1 Regulation der HLA Klasse I APM durch EBV-kodiertes LMP1
4.1.1 c-Myc und EBV-kodiertes LMP1: gegensätzlich wirkende Regulatoren der HLA
Klasse I APM in epithelialen Zellen
Die Herunterregulation der HLA Klasse I APM ist ein Mechanismus der Immunevasion und
wird von vielen Tumoren ausgenutzt (Chang et al, 2003). HLA Klasse I APM Defekte
können zu einer gestörten Prozessierung und Präsentation von Tumor-assoziierten Antigenen
an Effektorzellen des Immunsystems und damit zum Überleben von malignen Zellen führen
(Seliger et al, 2000).
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine stabile Transfektion von Epithelzelllinien
mit LMP1 zu einer starken Hochregulation verschiedener Komponenten der HLA Klasse I
APM führte, was für B-Zellen bereits bekannt ist (Rowe et al, 1995). Die Induktion der HLA
Klasse I APM Komponenten durch LMP1 scheint im Licht der Immunevasion jedoch
schwierig zu verstehen, da die Antigenpräsentation Tumor-eigener Antigene an zytotoxische
T-Zellen über diese Moleküle stattfindet.
Allerdings ist auch bekannt, dass das virale LMP1 das humane Onkogen c-Myc induziert
(Bowman et al, 2001; Kiuchi et al, 1999). c-myc kann wiederum immunsuppressives
Potential durch eine Hemmung der HLA Klasse I APM Expression entfalten (Blom et al,
1997; Vertuani et al, 2009). So wurde schon 1988 gezeigt, dass c-myc einen suppressiven
Effekt auf die HLA Klasse I Expression in humanen Melanomzelllinien hat (Versteeg et al,
1988). Später wurde nachgewiesen, dass c-myc einen nicht-immunogenen Phänotyp in EBV
infizierten B-Zellen durch die Herunterregulation von HLA Klasse I Komponenten bewirkt
(Staege et al, 2002), was auf die Beeinträchtigung der Interferon (IFN)-Signaltransduktion
zurückgeführt werden konnte (Schlee et al, 2007). Darüber hinaus konnte eine
Herunterregulation von HLA Klasse I Komponenten durch c-myc auch in einer urothelialen
Zelllinie und einer renalen Karzinomzelllinie nachgewiesen werden (Belldegrun et al, 1993;
Ottesen et al, 1990).
Aufgrund dieser Beobachtungen kam c-Myc als Kandidatengen in Betracht, welches der
immunogenen Wirkung von LMP1 entgegenwirken könnte. Wie erwartet hatte c-Myc einen
entgegengesetzten, d.h. hemmenden Effekt auf die Expression der untersuchten Komponenten
der HLA Klasse I APM im Vergleich zu LMP1. In dem untersuchten Zellkulturmodell kam es
4 Diskussion
Seite 119
zum einen zu einer Induktion der HLA Klasse I APM nach c-myc-Knockdown, zum anderen
reduzierte c-myc den induktiven Effekt von LMP1 auf dieselbige bei transienter Koexpression
von LMP1 und c-myc.
Es gibt Hinweise, dass LMP1 c-myc über einen STAT3-abhängigen Signalweg in
Epithelzellen induziert (Chen et al, 2003; Lo et al, 2006). Das humane Onkogen STAT3 ist in
vielen Tumoren inklusive dem NPC konstitutiv aktiv, und es wurde postuliert, dass eine
chronische Aktivierung für die EBV-vermittelte Tumorigenese in immunkompetenten
Individuen notwendig ist (Chen et al, 2001; Hsiao et al, 2003). STAT3 begünstigt die
Invasion und Proliferation von Tumorzellen im NPC (Lui et al, 2009) und fördert die
Immunevasion von Tumoren durch die Induktion antiinflammatorischer und die Hemmung
proinflammtorischer Signale, aber auch durch die starke Aktivierung des Onkogens c-myc
(Bowman et al, 2001; Kiuchi et al, 1999). Es ist daher nicht verwunderlich, dass das virale
Onkogen LMP1 STAT3 ausnutzt und sogar über mehrere Angriffspunkte induzieren kann:
durch die CTAR3 Domäne mittels JAK3 (Gires et al, 1999), durch die CTAR1 Domäne
(Kung & Raab-Traub, 2008) indirekt über die NFκB- und p38- abhängige Induktion von IL6
(Hirano et al, 2000) und durch die Induktion der Transkription des epidermal growth factor
(EGF)-Rezeptors (Fujii et al, 2002).
Wir konnten zeigen, dass LMP1 zu einer starken Induktion der STAT3-Phosphorylierung und
damit Aktivierung führte, wodurch STAT3 ein guter Kandidat für die Vermittlung der c-Myc
Induktion durch LMP1 war. In Übereinstimmung mit früheren Berichten konnten wir belegen,
dass LMP1 die IL6 Sekretion induziert (Eliopoulos et al, 1997), und dass IL6 die c-Myc
Expression sowie die STAT3 Aktivierung begünstigt (Hodge et al, 2005). Ferner wurde
postuliert, dass IL6 in einen positiven feedback loop von LMP1 Expression und STAT3
Aktivierung involviert ist (Chen et al, 2003). Zudem wurde als Hinweis auf eine mögliche
Relevanz in vivo das Zytokin IL6 auch in Tumorgewebe einer Untergruppe von EBVassoziierten NPC Fällen in neoplastischen Epithelien und/oder dem entzündlichen Infiltrat
gefunden (Beck et al, 2001; Hirano et al, 2000; Lesina et al, 2011; Okamoto et al, 1997). Es
erscheint deshalb denkbar, dass LMP1 nicht nur lokal in LMP1 exprimierenden Zellen selbst,
sondern auch parakrin auf LMP1-negative Tumorzellen in der Nachbarschaft durch die
gesteigerte Sekretion von Zytokinen wie IL6, aber auch IL10 (Nakagomi et al, 1994) wirkt.
IL6 führt durch die potente Aktivierung von STAT3 über JAK zur Unterdrückung der
Apoptose und fördert die Progression epithelialer Neoplasien (Hodge et al, 2005), was in
EBV-assoziierten, LMP1-exprimierenden Tumoren eine wichtige Rolle bei der Tumorigenese
4 Diskussion
Seite 120
spielen könnte. Auch die Aktivierung von IL10 könnte zum malignen Potential von LMP1
beitragen. Ogino et al konnten zeigen, dass es in LMP1-positiven NPC zur erhöhten
Expression von IL10 kommt und postulierten, dass das Zytokin durch seinen
immunsuppressiven Effekt zur Immunevasion beitragen kann (Ogino et al, 2007). IL10 kann
zudem c-myc hochregulieren und die Expression der HLA Klasse I APM beeinträchtigen
(Kurte et al, 2004; Zeidler et al, 1997). Ferner wurde gezeigt, dass NPC, die eine starke IL10
Expression aufweisen, mit schlechter Prognose assoziiert sind (Fujieda et al, 1999).
Um die Rolle der Janus-Kinasen bei der Aktivierung von STAT3 in unserem Modell zu
untersuchen, kamen spezifische Hemmstoffe für JAK2 und JAK3 zum Einsatz. Während
JAK2 Inhibitoren in unserem Zellkultursystem nur schwach die STAT3-Phosphorylierung
inhibierten (Daten nicht gezeigt), hatte der JAK3 Inhibitor CP690550 einen stark negativen
Effekt auf die STAT3-Phosphorylierung und dosisabhängig auch auf die c-Myc Expression.
Dieser Befund stützte noch die Vermutung, dass STAT3, welches durch JAK3 phosphoryliert
wird, eine wichtige Rolle bei der Regulation von c-myc spielt.
Zusammenfassend wäre es denkbar, dass LMP1 seinem eigenen immunogenen Effekt in
Epithelzellen entgegenwirken könnte, indem es zwar die HLA Klasse I APM induziert,
gleichzeitig aber durch die Induktion von c-Myc über IL6, JAK3 und STAT3 diesen Effekt
minimiert. So könnte der Tumor das mannigfaltige onkogene Potential von LMP1 nutzen und
zugleich eine möglicherweise kontraproduktive Induktion der HLA Klasse I APM
abschwächen.
4.1.2 Expression der HLA Klasse I APM und von c-Myc im EBV-assoziierten NPC
Die Expression von LMP1 ist in EBV-assoziierten epithelialen Tumoren heterogen. LMP1
kann auf RNS-Ebene in den meisten NPC Fällen detektiert werden (Lin et al, 2001). Zudem
wurden LMP1 spezifische Antikörper in den Seren von über 70% NPC Patienten gefunden
(Xu et al, 2000). Die Detektion des LMP1 Proteins mittels Immunhistochemie ist mit 20% 60% hingegen variabler (Fahraeus et al, 1988; Niedobitek et al, 1992). Im Vergleich weisen
LMP1-positive NPC ein aggressiveres Wachstum auf als LMP1-negative Fälle sowie eine
gesteigerte Invasion in Lymphknoten und ein schnelleres Fortschreiten der Erkrankung (Hu et
al, 1995; Liu et al, 2003; Ozyar et al, 2004).
4 Diskussion
Seite 121
Durch vielseitige Immunevasionsmechanismen gelingt es dem NPC sich im Wirtsorganismus
zu etablieren. Die Hochregulation von Komponenten der HLA Klasse I APM hingegen
scheint für den Tumor mit Hinsicht auf die Immunevasion kontraproduktiv, da eine
Überexpression der HLA Klasse I Proteine die Antigenpräsentation induzieren und damit die
antitumorale zytotoxische T-Zellantwort fördern könnte. Histologische Analysen bezüglich
der Expression der HLA Klasse I APM im NPC haben widersprüchliche Ergebnisse gezeigt.
Einige Studien zeigen eine von dem LMP1 Status unabhängige heterogene Expression der
HLA Klasse I Maschinerie in NPC (Oudejans et al, 2002; Yao et al, 2000). Andere
Untersuchungen beschreiben, dass Gene der HLA Klasse I Maschinerie (HLA Klasse I
schwere Kette, Tapasin, LMP2, TAP1 und TAP2) im NPC herunterreguliert sind (Ogino et al,
2007; Sengupta et al, 2006). In einer Genexpressionsstudie wurde eine EBV-abhängige
Hemmung der HLA Klasse I APM Expression beim Vergleich von EBV-positiven und EBVnegativen NPC Fällen berichtet (Sengupta et al, 2006). In einer immunhistochemischen
Studie hingegen war die Expression von HLA Klasse I Molekülen von dem EBV- und LMP1Status unabhängig (Ogino et al, 2007). Immunhistochemische Untersuchungen in unserer
Gruppe bestätigten eine Herunterregulation von einigen Komponenten der HLA Klasse I
APM im Vergleich zu Normalgewebe in einem kleinen Kollektiv von EBV-positiven NPC
Fällen, wobei dieser Effekt nicht von dem LMP1 Status beeinflusst wurde (Tudor et al, 2012).
Diese Beobachtungen im NPC sind im Widerspruch zu Berichten über EBV-positiven LMP1exprimierenden cHL, in denen Proteine der HLA Klasse I APM stärker exprimiert sind als in
EBV- und damit LMP1-negativen Fällen (Murray et al, 1998; Oudejans et al, 1996).
Interessanterweise kam es zu einer selektiven Reduktion der HLA-A schweren Ketten in
NPC, während die Expression der HLA-B schweren Ketten im Vergleich zum Normalgewebe
unverändert blieb (Tudor et al, 2012). Ein ähnliches Phänomen wurde auch in Burkitt
Lymphom (BL) Zelllinien beobachtet (Masucci et al, 1987). Demanet et al berichteten eine
selektive Herunterregulation von HLA-A und HLA-Bw6, aber nicht von HLA-Bw4 in
Leukämie-Zellen und schlussfolgerten, dass dieser Effekt dazu beitragen könnte gleichzeitig
der Zytotoxizität von NK-Zellen als auch von CTL zu entgehen, da HLA-Bw4 die NKZellfunktion inhibieren kann (Demanet et al, 2004). Ein vergleichbarer Effekt, der sich durch
die differentielle Regulation verschiedener HLA Klasse I Allele deren unterschiedliche
Funktionen zu Nutze macht, könnte auch im NPC relevant sein.
Die Rolle des humanen Onkogens c-Myc ist im NPC nicht vollständig verstanden. Einige
Studien konnten eine c-myc Expression im NPC nachweisen und mit schlechtem Überleben
4 Diskussion
Seite 122
in Verbindung bringen (Luo et al, 1997; Porter et al, 1994; Zhou et al, 2013). Eine
immunhistochemische Studie zeigte jedoch in 60% der NPC Fälle eine niedrige c-myc
Expression, was mit einem aggressiveren Tumorverhalten mit höherer Frequenz von
Lymphknotenmetastasen einherging (Hwang et al, 2003).
Übereinstimmend mit unseren in vitro Daten wurde in immunhistochemischen Analysen aus
unserer Forschungsgruppe (s.o.) in einer kleinen NPC-Kohorte in LMP1-positiven im
Vergleich zu LMP1-negativen NPC Fällen eine erhöhte Expression von c-Myc festgestellt
(Tudor et al, 2012). Diese Beobachtung könnte aufgrund des inhibitorischen Effekts von cMyc die fehlende Induktion der Proteine der HLA Klasse I APM in NPC durch LMP1
zumindest teilweise erklären. Immunhistochemisch konnte in einer früheren Studie keine
Assoziation von LMP1-Status und der STAT3-Phosphorylierung im NPC Gewebe
nachgewiesen werden (Buettner et al, 2006). Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass die
STAT3-Phosphorylierung nur transient ist (Buettner et al, 2006), so dass Unterschiede
zwischen LMP1-positiven und LMP1-negativen NPC durch immunhistochemische Analysen
nicht detektiert werden können. Auch dürften in vivo weitere Signalwege bei der Regulation
der STAT3-Phosphorylierung, der HLA Klasse I APM und von c-Myc eine Rolle spielen, die
in dem Zellkulturmodell nicht berücksichtig sind. So ist das virale LMP1 ein Protein, dass die
Funktion des TNF Rezeptors CD40 nachahmt (Graham et al, 2010; Uchida et al, 1999). CD40
wiederum wird regelmäßig auf der Oberfläche von NPC Zellen exprimiert (Young et al,
1998) und es finden sich im Begleitinfiltrat von NPC CD40-Ligand exprimierende
Entzündungszellen (Agathanggelou et al, 1995). Dies könnte erklären, warum sich die in der
Zellkultur beobachteten Effekte nicht oder nur teilweise in den immunhistochemischen
Analysen von Tumorgewebe nachvollziehen lassen. So wäre es denkbar, dass CD40 in
LMP1-negativen NPC einen Teil der LMP1 Funktionen übernimmt.
4.1.3 Fazit
LMP1 induziert in epithelialen Zelllinien mehrere Komponenten der HLA Klasse I APM, was
im Hinblick auf die Immunevasion paradox erscheint, da HLA Klasse I Protein-Antigen
Komplexe die Stimulation von spezifischen CTL vermitteln. Gleichzeitig verstärkt LMP1
jedoch über die Sekretion von IL6 und die Aktivierung von JAK3 und STAT3 die Expression
des
Onkogens
c-Myc,
welches
wiederum
einen
hemmenden
Effekt
auf
die
Antigenpräsentationsmaschinerie ausübt. Über diesen Mechanismus wäre es denkbar, dass der
4 Diskussion
Seite 123
Tumor das onkogene Potential von LMP1 ausnutzt und der immunogenen Wirkung des
Proteins zugleich entgegenwirkt. In dem komplexen Tumorgewebe des NPC spielen außer
LMP1, STAT3, IL6 und c-Myc auch zahlreiche weitere Faktoren bei der Vermittlung
immunologischer Prozesse eine Rolle. Dazu gehört die Oberflächenexpression von CD40 im
NPC (Young et al, 1998) sowie die Expression von IL10 (Fujieda et al, 1999), das
immunsuppressive Wirkung hat. Der hier beschriebene Regulationsmechanismus kann jedoch
zumindest teilweise den in Tumorgewebe fehlenden Unterschied in der Expression der
Komponenten der HLA Klasse I APM zwischen LMP1-positiven und LMP1-negativen NPC
Fällen erklären.
4 Diskussion
Seite 124
4.2 MΦ und DC im inflammatorischen Begleitinfiltrat des cHL
Das inflammatorische Begleitinfiltrat des cHL ist als potentieller Vermittler der
Immunevasion von großem Interesse. CD4-positive T-Zellen, insbesondere TH2-Zellen und
Treg, sind die am häufigsten vorkommenden zellulären Komponenten des cHL Mikromilieus
und wurden jeweils mit verbessertem Überleben in Zusammenhang gebracht (Schreck et al,
2009; Tzankov et al, 2008). Dies erscheint insofern überraschend, als man insbesondere von
Treg postulieren könnte, dass diese aufgrund ihrer regulatorischen Funktion antitumorale
Effektor-T-Zellen hemmen und somit das Tumorwachstum unterstützen. Andererseits ging
das Vorkommen von CTL im cHL mit schlechtem Überleben einher (Alvaro et al, 2005;
Oudejans et al, 1997). Neben den lymphozytären Zellen des entzündlichen Infiltrates kommen
zahlreiche andere Entzündungszelltypen im cHL vor, zu denen auch Makrophagen und DC
gehören (Barros et al, 2012; Steidl et al, 2011). In der vorliegenden Arbeit haben wir uns vor
allem mit dem Effekt des Mikromilieus des cHL auf die Reifung von DC und die Polarisation
von MФ als mögliche Mechanismen der Immunevasion beschäftigt. Zusätzlich wurde
untersucht welche Wirkung DC und MФ auf die Proliferation von cHL Zellen haben.
4.2.1 Charakterisierung des DC und MФ Infiltrates in HL
Bei der Analyse von Tumorgewebe von cHL Patienten, fanden sich neben myeloiden (m)DC
und plasmazytoiden (p)DC als zahlenmäßig dominierende analysierte Zellpopulation MΦ,
die in der überwiegenden Zahl MΦ-2 Charakeristika mit Expression von CD163 aufwiesen.
Das Infiltrat von MФ und DC wurde immunhistochemisch charakterisiert, Computer-assistiert
quantifiziert und mit dem klinischen Verlauf korreliert. In einer kleinen, ausgewählten Gruppe
von cHL Fällen wurde zudem RNS isoliert und mittels RT-PCR das Zytokinprofil
charakterisiert.
4.2.1.1 Verteilung und Reifungszustand von DC im inflammatorischen Infiltrat des cHL
Untersuchungen in verschiedenen Malignomen implizieren, dass häufig ein atypischer
Reifungsphänotyp von DC im Tumorgewebe vorliegt. DC sind im Tumor häufig unreif
(CD1a-positiv), was ihre Einwanderung in lymphatische Gewebe zur Induktion einer
spezifischen Immunantwort verhindert (Gabrilovich, 2004; Gottfried et al, 2008). Eine
4 Diskussion
Seite 125
fehlende Differenzierung von unreifen, phagozytotisch aktiven DC zu reifen DC mit hoher
Kapazität zur Antigenpräsentation hätte zur Folge, dass die Präsentation von Tumorassoziierten Antigenen an Effektor-T-Zellen reduziert ist, wodurch die spezifische
Immunreaktion gegen Tumorzellen unterdrückt würde (Gabrilovich, 2004). In einer Studie an
Mammakarzinomen wurden zwar in 60% der Fälle reife DC (CD83-positiv) detektiert, diese
waren aber auf das peritumorale Gewebe beschränkt und nicht direkt im Karzinom lokalisiert
(Bell et al, 1999; Iwamoto et al, 2003). Es wäre somit denkbar, dass Tumoren im Rahmen der
Immunevasion die DC Reifung z.B. durch die Produktion von Zytokinen wie IL10, IL6,
TGFβ, VEGF, macrophage inflammatory protein (MIP)-3α und M-CSF hemmen und damit
deren homing in die sekundären Lymphorgane und die Aktivierung von Tumor-spezifischen
Effektor-T-Zellen beeinträchtigen (Gottfried et al, 2008). Wir konnten zeigen, dass signifikant
mehr reife CD83-positive mDC im reaktiven Infiltrat des cHL vertreten waren als unreife
CD1a-positive
mDC.
Dies
spricht
dagegen,
dass
im
cHL
eine
vergleichbare
Immunevasionsstrategie mit Hemmung der mDC Reifung, wie für das Mammakarzinom
diskutiert (Gottfried et al, 2008), eine Rolle spielt. Im cHL-Tumormilieu werden verschiedene
Zytokine produziert, die die Reifung von mDC sowohl positiv also auch negativ beeinflussen
könnten. Zu diesen gehören u.a. das Reifungs-induzierende TNFα als auch das Reifungsinhibierende IL10 sowie TGFβ (Steidl et al, 2011). Bereits ausgereifte mDC verlieren den
IL10 Rezeptor, so dass IL10 auf sie keinen Reifungs-hemmenden Effekt mehr ausüben kann
(Banchereau & Steinman, 1998). Es wäre deshalb denkbar, dass im cHL reife mDC
dominieren, da in den Tumor bereits gereifte mDC rekrutiert werden, die gegen die IL10
Wirkung resistent sind oder aber, dass der Effekt von IL10 im Tumor durch andere Reifungsfördernde
Stoffe
unterdrückt
wird.
Passend
zu
unseren
Befunden
wurde
im
Nierenzellkarzinom und dem pädiatrischen cHL das Vorkommen von CD83-positive DC
beschrieben (Barros et al, 2012; Thurnher et al, 1996). In unseren Analysen war die am
zahlreichsten vertretene DC-Subpopulation im Tumor die der pDC. Das Vorhandensein von
pDC im entzündlichen Begleitinfiltrat von Malignomen wurde bereits im Mammakarzinom,
Ovarialkarzinom und Melanom (Sica et al, 2006), sowie im cHL (Chetaille et al, 2009)
beschrieben.
4 Diskussion
Seite 126
4.2.1.2 Polarisation von MΦ im Infiltrat des cHL
Unter allen hier untersuchten infiltrierenden Entzündungszellen waren die MФ bei weitem am
häufigsten vertreten. Da die Anzahl CD163-positiver Zellen annähernd der Anzahl CD68positiver MФ entsprach, schlussfolgerten wir, dass die Mehrheit der TAM Eigenschaften von
MФ-2 aufweisen. Jedoch ist zu berücksichtigen, dass TAM nicht strikt in MФ-1 oder MФ-2
eingeteilt werden können, da TAM in vivo Merkmale von beiden MФ Subtypen aufweisen
können (Mantovani et al, 2004; Verreck et al, 2006; Mantovani & Locati, 2013; Movahedi et
al, 2010; Verreck et al, 2006). Die Einteilung in MФ-1 und MФ-2 soll als ein Modell dienen
das zur Vereinfachung zwei Differenzierungsextreme repräsentiert. Passend zu unseren
Ergebnissen konnte eine Gruppe zeigen, dass CD163/CD68-doppelt positive M2-Zellen im
cHL häufiger vorkamen als HLA-DR/CD68-doppelt positive M1-Zellen (Zaki et al, 2011).
Auch andere Studien zeigten eine erhebliche Infiltration des cHL mit CD163-positiven MФ
(Kamper et al, 2011; Tan et al, 2012; Yoon et al, 2011). Es wurde beschrieben, dass MФ eine
hohe Plastizität aufweisen (Auffray et al, 2007; Stout et al, 2005). Die Prädominanz von
MФ-2 in vivo könnte ein Indiz dafür sein, dass entweder überwiegend MФ-2 und nur wenige
MФ-1 rekrutiert werden oder dass antiinflammatorische Signale, wie z.B. M-CSF, IL10 und
TGFβ eine Umdifferenzierung von MФ-1 zu MФ-2 bewirken. Im Mikromilieu vieler Tumore
herrschen
hypoxische
Bedingungen,
die
als
zusätzlicher
in
vivo
Stimulus
zur
Ausdifferenzierung in die Richtung von MФ-2 agieren könnten (Lewis & Pollard, 2006).
Verreck et al konnten außerdem in vitro zeigen, dass bereits ausdifferenzierte MФ-2 weder
durch LPS noch durch andere Immunogene dazu stimuliert werden können, ein
proinflammatorisches Milieu zu schaffen, was erstens auf eine starke antiinflammatorische
Kapazität der MФ-2 schließen lässt und zweitens auf eine Abnahme der Plastizität im
ausdifferenzierten Stadium (Verreck et al, 2006). Eine starke Akkumulation von MΦ-2 in
vivo wäre demzufolge erklärbar.
4.2.1.3. Prognostische Relevanz von DC und MΦ im cHL
Bei den Analysen der prognostischen Relevanz von DC und MФ im cHL konnten wir keinen
Einfluss von CD123-positiven pDC, CD1a-positiven unreifen DC und CD68-positiven MΦ
auf das tumorspezifische Überleben von cHL Patienten feststellen. Für pDC wurde diskutiert,
dass sie tolerogen wirken und damit an der Immunevasion beteiligt sein könnten (Demoulin et
4 Diskussion
Seite 127
al, 2013). Wir und eine weitere Gruppe (Chetaille et al, 2009) konnten jedoch kein Indiz
dafür finden, dass CD123-positiven pDC die Prognose des cHL beeinflussen.
Die Anzahl von DC war in einer immunhistochemischen Studie an pädiatrischen cHL-Fällen
nicht mit dem klinischen Verlauf assoziiert (Barros et al, 2012). Nach unseren Kenntnissen
existieren bisher keine Berichte über den Einfluss von mDC auf die Prognose von
Erwachsenen mit cHL. Wie bereits für das Mammakarzinom beschrieben, konnten auch wir
keinen Effekt von CD1a-positiven unreifen DC auf das tumorspezifische Überleben
nachweisen (Coventry et al, 2002; Coventry & Morton, 2003). Im Gegensatz dazu waren
CD83-positive reife DC mit besserem tumorspezifischem Überleben im cHL assoziiert, wie
bereits für verschiedene andere Malignome berichtet (Gottfried et al, 2008). Vor allem
immunhistochemische Untersuchungen im Mammakarzinom zeigen, dass CD83-positive reife
DC den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen (Iwamoto et al, 2003). Dies könnte die
Hypothese stützen, dass reife DC mit intakter homing- und Präsentationskapazität die antitumorale Immunantwort durch eine eigene zytotoxische Wirkung oder durch eine spezifische
T-Zell-Aktivierung fördern könnten. CD83 kann außer auf mDC auch auf pDC exprimiert
werden (Zhou & Tedder, 1995). Da pDC jedoch keinen Einfluss auf das tumorspezifische
Überleben im cHL zeigten, halten wir es für wahrscheinlich, dass der positive Effekt von
CD83-positiven DC auf das tumorspezifische Überleben auf die Wirkung von reifen mDC
zurückzuführen ist. Eine in einem kleinen Teil der Zellen mögliche morphologische
Überlappung von kleinen Hodgkin-Zellen, die auch CD83 exprimieren, mit mDC könnte die
Ergebnisse der Analyse ebenfalls beeinflussen, was eine zukünftige Bestätigung der
Ergebnisse z.B. mittels durchflusszytometrischer Analysen in Tumorzellsuspensionen aus
frischem cHL-Material, welches uns leider nicht zur Verfügung stand, erfordert.
Der adverse prognostische Einfluss von MФ im Begleitinfiltrat verschiedener Tumoren
einschließlich des cHL ist seit Jahrzehnten bekannt und in zahlreichen Studien bestätigt
(Coppleson et al, 1973; Kamper et al, 2011; Ree & Kadin, 1985; Steidl et al, 2010; Tan et al,
2012; Yoon et al, 2012; Zaki et al, 2011). In über 80% der Berichte, die die Rolle von TAM
in verschiedenen Malignomen untersucht haben, war deren zahlreiches Vorkommen im
inflammatorischen Infiltrat mit einem schlechten klinischen Verlauf verbunden (Bingle et al,
2002; Lewis & Pollard, 2006). Verschiedene Studien haben sich mit der prognostischen Rolle
von MФ im cHL beschäftigt. In einer Arbeit wurde in therapierefraktären cHL Fällen eine
Hochregulation von TAM-spezifischen Genen festgestellt (Steidl et al, 2010) und darüber
hinaus in immunhistochemischen Analysen gezeigt, dass eine große Anzahl von CD68-
4 Diskussion
Seite 128
positiven MФ mit einem verkürzten progressionsfreien Überleben assoziiert war (Steidl et al,
2010). Vergleichbare Ergebnisse wurden von anderen Gruppen erhoben, die eine signifikante
Korrelation zwischen CD68- und/oder CD163-positiven MФ und schlechter Prognose oder
schlechtem Gesamtüberleben feststellen konnten (Kamper et al, 2011; Tan et al, 2012; Yoon
et al, 2012; Zaki et al, 2011). In anderen Studien konnten diese Befunde jedoch nicht bestätigt
werden, und es wurde keine Assoziation von CD68 oder CD163 mit dem Überleben im cHL
beobachtet (Azambuja et al, 2012; Harris et al, 1999; Sanchez-Espiridion et al, 2012).
Bei unseren Untersuchungen fand sich eine hoch signifikante Assoziation einer hohen Anzahl
von CD163-positiven MФ mit vermindertem tumorspezifischem Überleben, während CD68positive MФ keinen Einfluss auf das Überleben hatten. Dieser Befund könnte auf eine
Untergruppe von CD163-negativen MФ in der Gruppe der CD68-positiven MФ hindeuten,
die den negativen Effekt auf die Prognose von cHL Patienten verschleiert. Weiterhin scheint
das Verhältnis von CD163- zu CD83-positiven Zellen Einfluss auf den Verlauf der
Erkrankung zu nehmen, da eine große Anzahl von mDC und eine gleichzeitig geringe Anzahl
von MФ-2 signifikant positiv auf das Überleben einwirkten. Dies könnte ein Hinweis auf eine
funktionelle Interaktion der beiden Zelltypen sein.
4.2.1.4 Verteilung von MФ und DC im cHL in Abhängigkeit von dem EBV-Status und
Vergleich mit dem nlpHL
Die Anzahl von CD163- und CD68-positiven MФ war im nlpHL, das eine eigene Entität mit
weniger aggressivem klinischem Verlauf darstellt, niedriger als im cHL. Dies könnte die
Rolle der TAM als Marker für die Aggressivität eines Tumors unterstreichen. Zusätzlich
waren CD163- und CD68-positive MФ häufiger in EBV-positiven im Vergleich zu EBVnegativen cHL zu finden, was im Einklang mit früheren Berichten steht (Azambuja et al,
2012; Kamper et al, 2011; Tan et al, 2012). Interessanterweise waren auch weniger CD83positive reife mDC in EBV-positiven cHL Fällen vorhanden. Diese Ergebnisse unterstreichen
die Möglichkeit einer funktionellen Abhängigkeit von reifen mDC und MΦ-2 im cHL. Trotz
der Assoziation von EBV-positiven Fällen mit einer höheren Anzahl von MФ-2 und einer
niedrigeren Anzahl von CD83-positiven DC war eine EBV-Assoziation von cHL Fällen nicht
mit einem schlechteren Überleben der Patienten verbunden (Daten nicht gezeigt).
4 Diskussion
Seite 129
4.2.1.5 Analyse des Zytokinprofils von cHL Gewebe
In der Folge haben wir das Zytokinprofil in einigen ausgewählten cHL Biopsien
charakterisiert. Hierbei wurde die Expression der Zytokine IL12B, TNF, IL10 und TGFβ auf
RNS Ebene analysiert. Von diesen Zytokinen ist bekannt, dass sie im cHL exprimiert werden
und gleichzeitig die Reifung von DC und/oder die Polarisation von MФ beeinflussen können
(Banchereau & Steinman, 1998; Biswas & Mantovani, 2010; Gottfried et al, 2008; Steidl et
al, 2011). Es wurden Fälle mit hohen oder niedrigen Zahlen von CD83- oder CD163positiven Zellen gewählt und aufgrund der Ergebnisse der Überlebensanalyse postuliert, dass
Fälle mit geringer Infiltration durch CD83-positive Zellen (CD83 low) oder hoher Infiltration
durch CD163-positive Zellen (CD163 high) prognostisch ungünstiger sein sollten, als solche
mit hohen CD83-Zahlen oder niedrigen CD163-Zahlen. Die untersuchten cHL Fälle wurden
mit reaktiven Lymphadenopathien verglichen, die ein reaktiv-entzündliches Mikromilieu
repräsentieren und damit als benigne Kontrollen dienten. Dabei wurde festgestellt, dass alle
untersuchten Zytokine, antiinflammatorische (IL10, TGFβ1) sowie proinflammatorische
(IL12B, TNF), in einer Untergruppe von cHL Fällen in beträchtlich höherem Maße vorkamen
als in der Kontrollgruppe. Fälle mit hoher Expression der Zytokine fanden sich vor allem in
Untergruppen (CD83 low und CD163 high), die eine mutmaßlich adverse prognostische
Konstellation aufwiesen. Während die hohe Expression von IL10 und TGFβ1 im Sinne der
Immunevasion plausibel erscheint, da diese eine immunsuppressive Wirkung haben, wirkt es
zunächst paradox, dass auch IL12B und TNF vermehrt produziert wurden. Allerdings wurde
die IL12 Expression im cHL bereits 1995 beschrieben und eine Tumor-unterstützende Rolle
für das Zytokin postuliert (Schwaller et al, 1995). Auch Steidl et al fanden in
therapierefraktären cHL Fällen eine TAM-spezifische Gensignatur mit erhöhter Expression
von Genen, die in die IL12 Signaltransduktion involviert sind (Steidl et al, 2010). Außerdem
ist bekannt, dass CTL, die durch die IL12 Signaltransduktion stimuliert werden, mit
schlechtem Überleben im cHL verbunden sind (Alvaro et al, 2005; Oudejans et al, 1997).
Und obwohl IL12 theoretisch in der Lage ist, den Phänotyp von TAM so zu modulieren, dass
sie antitumorigen wirken (Watkins et al, 2007), wurde gleichzeitig eine persistente
Inflammation als Auslöser der Tumorentstehung diskutiert (Brower, 2005; Dinarello, 2006).
Des Weiteren könnte man auf den ersten Blick auch vermuten, dass TNFα durch die starke
Induktion der Reifung von DC eher antitumorigene Wirkung hat. Auf der anderen Seite ist
bekannt, dass TNFα angiogen wirkt und damit das Tumorwachstum fördert (Balkwill, 2002),
so dass ein Tumor von der gesteigerten TNFα Sekretion profitieren kann. Demnach könnte
4 Diskussion
Seite 130
eine Überproduktion von sowohl antiinflammatorischen als auch proinflammatorischen
Zytokinen im cHL besonders vorteilhaft für den Tumorprogress sein. Auch die Beobachtung,
dass in Fällen mit wenigen CD163-positiven MФ (CD163 low) und somit mutmaßlich einer
besseren
Prognose
eine
schwache
Zytokinexpression
ähnlich
den
reaktiven
Lymphadenopathien vorgefunden wurde, könnte die Annahme unterstützen, dass die hohe
Produktion von Zytokinen die Aggressivität des Tumors fördert.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass im cHL kein typisches immunsuppressives Milieu
vorzufinden
ist,
sondern
eher
ein
komplexes
Zytokingemisch,
das
sowohl
antiinflammatorische als auch proinflammatorische Mediatoren beinhaltet und zu der
einzigartigen Immunreaktion im cHL beiträgt.
4.2.2 Zellkulturanalyse zur Interaktion von cHL-Zelllinien mit DC und MФ
4.2.2.1 Zellkulturmodell
In cHL Tumorgewebe wurde eine überwiegend reife mDC Population und eine Prädominanz
von MФ mit MΦ-2-artigen Charakteristika festgestellt. Um den Einfluss von Tumorzellen des
cHL auf das Reifungsverhalten von DC und die Polarisation von MΦ in vitro
nachzuvollziehen, wurden aus peripheren Blutmonozyten generierte (mo)DC und
vordifferenzierte MΦ mit cHL-Zellüberständen und Zytokinen, die im cHL vorkommen,
behandelt. Des Weiteren wurde der Effekt von moDC sowie MΦ-1 und MΦ-2 auf das
Proliferationsverhalten von cHL Zellen untersucht. Die aus dem Blut generierten
verschiedenen Zelltypen konnten durch ihre spezifische Morphologie, die erwartete IL10 oder
IL12 Expression sowie die Expression spezifischer Marker validiert werden.
4.2.2.2 Reifungsverhalten von moDC nach Stimulation mit cHL Überständen
Zur Charakterisierung des Reifungsverhaltens von moDC wurde die Expression eines
Aktivierungsmarkers (CD40), eines Reifungsmarkers (CD83) und eines Monozyten Markers
(CD14) untersucht. Überstände von cHL-Zelllinien förderten die Reifung und/oder
Aktivierung von moDC in unseren Untersuchungen, während die Überstände von B-Zellen
gesunder Spender keinen Einfluss auf die moDC-Reifung oder Aktivierung nahmen. Dieser
Befund deutet auf einen spezifischen Effekt der cHL-Zellüberstände hin und passt zu der oben
4 Diskussion
Seite 131
beschriebenen Prädominanz reifer mDC in cHL Gewebe. Dieser Reifungs-fördernde Effekt
war nach Stimulation mit Überständen der L1236 Zelllinie stärker ausgeprägt als nach
Stimulation mit HDLM2 Überständen. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre die mehr als
doppelt so hohe Sekretion von Reifungs-induzierendem TNFα durch L1236 Zellen im
Vergleich zu HDLM2 Zellen. Da in den von uns untersuchten cHL Geweben sowohl
reifungsfördernde (TNFα) als auch reifungshemmende (IL10 und TGFβ) Zytokine
gleichzeitig exprimiert wurden, sollte geklärt werden ob einer der beiden Effekte über den
anderen dominieren kann. Dazu wurden moDC zeitgleich mit hohen Dosen von TNFα und
IL10 sowie TGFβ behandelt, um die Komplexität des Zusammenspiels der gegenläufig
wirksamen Faktoren im cHL modellhaft widerzuspiegeln (Banchereau & Steinman, 1998;
Steidl et al, 2011). Hierbei wurde zwar der Effekt von TNFα auf die Reifung und Aktivierung
der moDC im Vergleich zu der alleinigen Wirkung des Zytokins etwas abgeschwächt, er
dominierte jedoch über die Reifungs-hemmende Wirkung der anderen beiden Faktoren.
Insgesamt wiesen die so behandelten moDC somit einen reiferen Phänotyp auf als
unbehandelte Kontrollen. Die Neutralisierung von TNFα in Überständen von L1236 Zellen
mittels verschiedener anti-TNFα-Antikörper führte überdies zu einer Reduktion der Reifung
und Aktivierung der behandelten DC. Auch dieser Befund unterstrich die zentrale Rolle von
TNFα bei der Beeinflussung der moDC-Reifung.
4.2.2.3 Polarisationsverhalten von MΦ nach Stimulation mit cHL Überständen
Zur Charakterisierung von Polarisationsprozessen von MФ, die im cHL eine Rolle spielen
könnten, bedienten wir uns eines Modell-Systems, welches die beiden extremen
Polarisationszustände von proinflammatorischen MФ-1 und immunregulatorischen MФ-2
widerspiegelt, die durch Stimulation mit GM-CSF oder M-CSF generiert werden können
(Verreck et al, 2004). Dieses Modell kann zwar nicht vollständig den intermediären
Differenzierungsphänotyp der TAM in der in vivo Situation reflektieren (Biswas et al, 2008;
Stout et al, 2005), es kann jedoch zum Verständnis des Differenzierungsprozesses von
polarisierten zirkulierenden MФ, die in das Tumor-Milieu rekrutiert werden, beitragen. Die
Behandlung mit cHL Zellkulturüberständen konservierte und verstärkte den MФ-2 Phänotyp
in den vordifferenzierten MФ-2, wie anhand der Hochregulation des antiinflammatorischen
scavenger Rezeptors CD163 (Akila et al, 2012) und des angiogen wirkenden MannoseRezeptors CD206 (Laoui et al, 2011) gesehen. Die Überstände der cHL-Zelllinien waren
4 Diskussion
Seite 132
jedoch nicht in der Lage vordifferenzierte MФ-1 in einen MФ-2 Phänotyp zu konvertieren,
um damit MФ-1 als potentiell tumortoxische Effektorzellen auszuschalten. Allerdings konnte
eine schwache, aber signifikante Reduktion der HLA-DR Expression in MФ-1 detektiert
werden. Diese Reduktion der HLA-DR Expression könnte zu einer verminderten Fähigkeit
Antigene an Effektor T-Zellen zu präsentieren führen und damit die gegen den Tumor
gerichtete Immunreaktion abschwächen. Die in den immunhistochemischen Untersuchungen
beobachtete Prädominanz von CD163-positiven MФ in cHL Biopsien könnte aufgrund der in
vitro Befunde bedeuten, dass in den Tumor vor allem MФ mit Typ 2 Charakteristika
rekrutiert und dort erhalten werden. Eine Umdifferenzierung ausdifferenzierter MФ-1 in einen
MФ-2-artigen Phänotyp wäre anhand der Zellkulturbefunde eher unwahrscheinlich. Jedoch
kann es gut möglich sein, dass die teilweise nur in vivo vorkommenden Stimuli zur
Umdifferenzierung von MФ-1 (z.B. Hypoxie) einen stärkeren Einfluss auf die MФ im
Mikromilieu des cHL Tumors ausüben als in vitro.
4.2.2.4 Einfluss von moDC, MΦ-1 und MΦ-2 auf das Proliferationsverhalten einer cHLZelllinie
In unserem Zellkulturmodell wurden Zellen der cHL-Zelllinie L1236 mit Überständen von
moDC und MФ inkubiert oder mit unterschiedlich differenzierten Makrophagen ko-kultiviert.
Während moDC und MФ-1 einen inhibitorischen Effekt auf die L1236 Expansion ausübten,
hatten MФ-2 keinen Einfluss auf die Proliferation von L1236-Zellen. Da bei Kokultur und
Inkubation mit Überständen vergleichbare Ergebnisse bzgl. des Effekts von MФ-1 und MФ-2
auf die Tumorzellproliferation beobachtet wurden, ergab sich kein Anhalt, dass die
wachstumshemmende Wirkung von MФ-1 von einem direkten Zell-Zell-Kontakt abhing.
Offenbar waren zumindest teilweise lösliche Faktoren ausreichend, um inhibitorische
Eigenschaften auf das Wachstum der L1236-Zellen zu entfalten. In Übereinstimmung mit
unseren Ergebnissen berichtete Dufresne et al, dass MФ-1 die Proliferation von humanen
Blasenkarzinomzellen inhibierten, während in seinem Modell MФ-2 nicht nur das
Tumorzellwachstum tolerierten, sondern sogar induzierten (Dufresne et al, 2011). Darüber
hinaus korrelierte die Dichte der TAM Infiltration in Mammakarzinomen positiv mit der
proliferativen Aktivität des Tumors, was eine Induktion des Tumorwachstums durch die TAM
implizieren könnte (Tsutsui et al, 2005). Kandidatenstoffe, die einen wachstumssteigernden
Effekt von MФ-2 auf cHL Zellen entweder parakrin oder autokrin vermitteln könnten, waren
4 Diskussion
Seite 133
BAFF und APRIL, von denen bekannt ist, dass sie das B-Zell Wachstum stimulieren (Mackay
& Schneider, 2009; Ng et al, 2005). Beide Zytokine konnten jedoch weder in den
Überständen der MФ/L1236 Kokultur vorgefunden werden, noch hatte die Neutralisation von
BAFF in der Kokultur einen Effekt auf das Wachstum von L1236- Zellen. Diese Befunde sind
auch im Einklang mit dem fehlenden Effekt von MФ-2 auf die Proliferation von L1236Zellen. Eine mögliche Erklärung für die proliferative Wirkung von MФ auf epitheliale
Malignome ist die durch M-CSF induzierbare Produktion von EGF durch MФ-2 (Goswami et
al, 2005). Für EGF ist bekannt, dass es die Proliferation, Migration und Invasion von
Karzinomzellen, die den EGF-Rezeptor (EGFR) exprimieren, induzieren kann (Mendelsohn
& Baselga, 2000). In B-Zellen, B-Lymphom-Zelllinien und im cHL dürfte ein solcher Effekt
jedoch nicht relevant sein, da diese keinen EGFR exprimieren (Buettner et al, 2006; Chan et
al, 2009; Moroni et al, 2001). Diese Tatsache könnte erklären, warum MΦ-2 bzw. TAM zwar
einen proliferativen Effekt auf Karzinomzellen ausüben, dieser Mechanismus in unserer
Studie in einer B-Zell-Neoplasie jedoch nicht beobachtet werden konnte.
4.2.3 Fazit
Reife mDC finden sich im cHL häufiger als unreife Formen und sind mit besserem Überleben
der Patienten assoziiert. Dieser antitumorale Effekt könnte durch die Induktion einer
spezifischen T-Zell-Antwort mittels Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung erfolgen
oder auch durch eine direkte Zytotoxizität der mDC. CD163-positive MФ sind hingegen mit
einer schlechteren Prognose assoziiert und ihr Polarisationszustand scheint aktiv von den
Tumorzellen aufrechterhalten zu werden. Ein typisches immunsuppressives Zytokinprofil
findet sich in cHL Tumorgewebe jedoch nicht, sondern eher ein Überschuss an
antiinflammatorischen und proinflammatorischen Zytokinen in einer Untergruppe von cHL
Patienten mit adversem prognostischen Markerprofil.
Demnach scheinen MΦ, die im cHL einige Aspekte der MΦ-2 Polarisation aufweisen, im
cHL die Immunevasion zu fördern, während reife mDC an der antitumoralen Immunität
beteiligt sein könnten.
5 Literatur
Seite 134
5 Literatur
Adler B, Schaadt E, Kempkes B, et al. (2002) Control of Epstein-Barr virus reactivation by
activated CD40 and viral latent membrane protein 1. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 99(1): 437-42
Agathanggelou A, Niedobitek G, Chen R, et al. (1995) Expression of immune regulatory
molecules in Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinomas with prominent
lymphoid stroma. Evidence for a functional interaction between epithelial tumor cells and
infiltrating lymphoid cells. The American journal of pathology 147(4): 1152-60
Akila P, Prashant V, Suma MN, et al. (2012) CD163 and its expanding functional repertoire.
Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry 413(7-8): 669-74
Alvaro T, Lejeune M, Salvado MT, et al. (2005) Outcome in Hodgkin's lymphoma can be
predicted from the presence of accompanying cytotoxic and regulatory T cells. Clinical
cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 11(4):
1467-73
Ansell SM (2012) Hodgkin lymphoma: 2012 update on diagnosis, risk-stratification, and
management. American journal of hematology 87(12): 1096-103
Arrand JR, Rymo L (1982) Characterization of the major Epstein-Barr virus-specific RNA in
Burkitt lymphoma-derived cells. Journal of virology 41(2): 376-89
Atayar C, Poppema S, Blokzijl T, et al. (2005) Expression of the T-cell transcription factors,
GATA-3 and T-bet, in the neoplastic cells of Hodgkin lymphomas. The American journal of
pathology 166(1): 127-34
Auffray C, Fogg D, Garfa M, et al. (2007) Monitoring of blood vessels and tissues by a
population of monocytes with patrolling behavior. Science 317(5838): 666-70
Aviel S, Winberg G, Massucci M, et al. (2000) Degradation of the epstein-barr virus latent
membrane protein 1 (LMP1) by the ubiquitin-proteasome pathway. Targeting via
ubiquitination of the N-terminal residue. The Journal of biological chemistry 275(31): 234919
Azambuja D, Natkunam Y, Biasoli I, et al. (2012) Lack of association of tumor-associated
macrophages with clinical outcome in patients with classical Hodgkin's lymphoma. Annals of
oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 23(3): 73642
5 Literatur
Seite 135
Baer R, Bankier AT, Biggin MD, et al. (1984) DNA sequence and expression of the B95-8
Epstein-Barr virus genome. Nature 310(5974): 207-11
Bajaj BG, Murakami M, Cai Q, et al. (2008) Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C interacts
with and enhances the stability of the c-Myc oncoprotein. Journal of virology 82(8): 4082-90
Balkwill F (2002) Tumor necrosis factor or tumor promoting factor? Cytokine & growth
factor reviews 13(2): 135-41
Banchereau J, Steinman RM (1998) Dendritic cells and the control of immunity. Nature
392(6673): 245-52
Bargou RC, Emmerich F, Krappmann D, et al. (1997) Constitutive nuclear factor-kappaBRelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin's disease tumor cells.
The Journal of clinical investigation 100(12): 2961-9
Barros MH, Hassan R, Niedobitek G (2012) Tumor-associated macrophages in pediatric
classical Hodgkin lymphoma: association with Epstein-Barr virus, lymphocyte subsets, and
prognostic impact. Clinical cancer research : an official journal of the American Association
for Cancer Research 18(14): 3762-71
Beck A, Pazolt D, Grabenbauer GG, et al. (2001) Expression of cytokine and chemokine
genes in Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma: comparison with
Hodgkin's disease. The Journal of pathology 194(2): 145-51
Bell D, Chomarat P, Broyles D, et al. (1999) In breast carcinoma tissue, immature dendritic
cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas.
The Journal of experimental medicine 190(10): 1417-26
Belldegrun A, Tso CL, Sakata T, et al. (1993) Human renal carcinoma line transfected with
interleukin-2 and/or interferon alpha gene(s): implications for live cancer vaccines. Journal of
the National Cancer Institute 85(3): 207-16
Bingle L, Brown NJ, Lewis CE (2002) The role of tumour-associated macrophages in tumour
progression: implications for new anticancer therapies. The Journal of pathology 196(3): 25465
Biswas SK, Mantovani A (2010) Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte
subsets: cancer as a paradigm. Nature immunology 11(10): 889-96
Biswas SK, Sica A, Lewis CE (2008) Plasticity of macrophage function during tumor
progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J Immunol 180(4): 2011-7
5 Literatur
Seite 136
Blom DJ, Mooy CM, Luyten GP, et al. (1997) Inverse correlation between expression of
HLA-B and c-myc in uveal melanoma. The Journal of pathology 181(1): 75-9
Bohmann K, Hennig G, Rogel U, et al. (2009) RNA extraction from archival formalin-fixed
paraffin-embedded tissue: a comparison of manual, semiautomated, and fully automated
purification methods. Clinical chemistry 55(9): 1719-27
Borza CM, Hutt-Fletcher LM (2002) Alternate replication in B cells and epithelial cells
switches tropism of Epstein-Barr virus. Nature medicine 8(6): 594-9
Borza CM, Morgan AJ, Turk SM, et al. (2004) Use of gHgL for attachment of Epstein-Barr
virus to epithelial cells compromises infection. Journal of virology 78(10): 5007-14
Bowman T, Broome MA, Sinibaldi D, et al. (2001) Stat3-mediated Myc expression is
required for Src transformation and PDGF-induced mitogenesis. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 98(13): 7319-24
Braeuninger A, Kuppers R, Strickler JG, et al. (1997) Hodgkin and Reed-Sternberg cells in
lymphocyte predominant Hodgkin disease represent clonal populations of germinal centerderived tumor B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America 94(17): 9337-42
Brower V (2005) Researchers attempting to define role of cytokines in cancer risk. Journal of
the National Cancer Institute 97(16): 1175-7
Brown NA, Liu C, Garcia CR, et al. (1986) Clonal origins of lymphoproliferative disease
induced by Epstein-Barr virus. Journal of virology 58(3): 975-8
Brune V, Tiacci E, Pfeil I, et al. (2008) Origin and pathogenesis of nodular lymphocytepredominant Hodgkin lymphoma as revealed by global gene expression analysis. The Journal
of experimental medicine 205(10): 2251-68
Buettner M, Heussinger N, Niedobitek G (2006) Expression of Epstein-Barr virus (EBV)encoded latent membrane proteins and STAT3 activation in nasopharyngeal carcinoma.
Virchows Archiv : an international journal of pathology 449(5): 513-9
Burkitt D (1962) A children's cancer dependent on climatic factors. Nature 194: 232-4
Cahir-McFarland ED, Davidson DM, Schauer SL, et al. (2000) NF-kappa B inhibition causes
spontaneous apoptosis in Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cells. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(11): 6055-60
5 Literatur
Seite 137
Caldwell RG, Brown RC, Longnecker R (2000) Epstein-Barr virus LMP2A-induced B-cell
survival in two unique classes of EmuLMP2A transgenic mice. Journal of virology 74(3):
1101-13
Caldwell RG, Wilson JB, Anderson SJ, et al. (1998) Epstein-Barr virus LMP2A drives B cell
development and survival in the absence of normal B cell receptor signals. Immunity 9(3):
405-11
Carosella ED, Rouas-Freiss N, Paul P, et al. (1999) HLA-G: a tolerance molecule from the
major histocompatibility complex. Immunology today 20(2): 60-2
Chaganti S, Bell AI, Pastor NB, et al. (2005) Epstein-Barr virus infection in vitro can rescue
germinal center B cells with inactivated immunoglobulin genes. Blood 106(13): 4249-52
Chan AS, To KF, Lo KW, et al. (2002) Frequent chromosome 9p losses in histologically
normal nasopharyngeal epithelia from southern Chinese. International journal of cancer
Journal international du cancer 102(3): 300-3
Chan AS, To KF, Lo KW, et al. (2000) High frequency of chromosome 3p deletion in
histologically normal nasopharyngeal epithelia from southern Chinese. Cancer research
60(19): 5365-70
Chan G, Nogalski MT, Yurochko AD (2009) Activation of EGFR on monocytes is required
for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 106(52): 22369-74
Chang CC, Campoli M, Ferrone S (2003) HLA class I defects in malignant lesions: what have
we learned? The Keio journal of medicine 52(4): 220-9
Chen H, Hutt-Fletcher L, Cao L, et al. (2003) A positive autoregulatory loop of LMP1
expression and STAT activation in epithelial cells latently infected with Epstein-Barr virus.
Journal of virology 77(7): 4139-48
Chen H, Lee JM, Zong Y, et al. (2001) Linkage between STAT regulation and Epstein-Barr
virus gene expression in tumors. Journal of virology 75(6): 2929-37
Chetaille B, Bertucci F, Finetti P, et al. (2009) Molecular profiling of classical Hodgkin
lymphoma tissues uncovers variations in the tumor microenvironment and correlations with
EBV infection and outcome. Blood 113(12): 2765-3775
Choy EY, Siu KL, Kok KH, et al. (2008) An Epstein-Barr virus-encoded microRNA targets
PUMA to promote host cell survival. The Journal of experimental medicine 205(11): 2551-60
5 Literatur
Seite 138
Clausse B, Fizazi K, Walczak V, et al. (1997) High concentration of the EBV latent
membrane protein 1 in glycosphingolipid-rich complexes from both epithelial and lymphoid
cells. Virology 228(2): 285-93
Coffelt SB, Hughes R, Lewis CE (2009) Tumor-associated macrophages: effectors of
angiogenesis and tumor progression. Biochimica et biophysica acta 1796(1): 11-8
Coffin WF, 3rd, Erickson KD, Hoedt-Miller M, et al. (2001) The cytoplasmic amino-terminus
of the Latent Membrane Protein-1 of Epstein-Barr Virus: relationship between
transmembrane orientation and effector functions of the carboxy-terminus and transmembrane
domain. Oncogene 20(38): 5313-30
Cohen JI, Wang F, Mannick J, et al. (1989) Epstein-Barr virus nuclear protein 2 is a key
determinant of lymphocyte transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 86(23): 9558-62
Collin M, McGovern N, Haniffa M (2013) Human dendritic cell subsets. Immunology 140(1):
22-30
Coppleson LW, Rappaport H, Strum SB, et al. (1973) Analysis of the Rye classification of
Hodgkin's disease. The prognostic significance of cellular composition. Journal of the
National Cancer Institute 51(2): 379-90
Correa P, O'Conor GT (1971) Epidemiologic patterns of Hodgkin's disease. International
journal of cancer Journal international du cancer 8(2): 192-201
Coventry BJ, Lee PL, Gibbs D, et al. (2002) Dendritic cell density and activation status in
human breast cancer -- CD1a, CMRF-44, CMRF-56 and CD-83 expression. British journal of
cancer 86(4): 546-51
Coventry BJ, Morton J (2003) CD1a-positive infiltrating-dendritic cell density and 5-year
survival from human breast cancer. British journal of cancer 89(3): 533-8
Crotzer VL, Christian RE, Brooks JM, et al. (2000) Immunodominance among EBV-derived
epitopes restricted by HLA-B27 does not correlate with epitope abundance in EBVtransformed B-lymphoblastoid cell lines. J Immunol 164(12): 6120-9
Davison AJ, Eberle R, Ehlers B, et al. (2009) The order Herpesvirales. Archives of virology
154(1): 171-7
5 Literatur
Seite 139
Dawson CW, Laverick L, Morris MA, et al. (2008) Epstein-Barr virus-encoded LMP1
regulates epithelial cell motility and invasion via the ERK-MAPK pathway. Journal of
virology 82(7): 3654-64
Dawson CW, Port RJ, Young LS (2012) The role of the EBV-encoded latent membrane
proteins LMP1 and LMP2 in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Seminars
in cancer biology 22(2): 144-53
Dawson CW, Rickinson AB, Young LS (1990) Epstein-Barr virus latent membrane protein
inhibits human epithelial cell differentiation. Nature 344(6268): 777-80
Deacon EM, Pallesen G, Niedobitek G, et al. (1993) Epstein-Barr virus and Hodgkin's
disease: transcriptional analysis of virus latency in the malignant cells. The Journal of
experimental medicine 177(2): 339-49
Decaussin G, Sbih-Lammali F, de Turenne-Tessier M, et al. (2000) Expression of BARF1
gene encoded by Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma biopsies. Cancer research
60(19): 5584-8
Demanet C, Mulder A, Deneys V, et al. (2004) Down-regulation of HLA-A and HLA-Bw6,
but not HLA-Bw4, allospecificities in leukemic cells: an escape mechanism from CTL and
NK attack? Blood 103(8): 3122-30
Demoulin S, Herfs M, Delvenne P, et al. (2013) Tumor microenvironment converts
plasmacytoid dendritic cells into immunosuppressive/tolerogenic cells: insight into the
molecular mechanisms. Journal of leukocyte biology 93(3): 343-52
Diehl V, Thomas RK, Re D (2004) Part II: Hodgkin's lymphoma--diagnosis and treatment.
The lancet oncology 5(1): 19-26
Diepstra A, Poppema S, Boot M, et al. (2008) HLA-G protein expression as a potential
immune escape mechanism in classical Hodgkin's lymphoma. Tissue antigens 71(3): 219-26
Dinarello CA (2006) The paradox of pro-inflammatory cytokines in cancer. Cancer
metastasis reviews 25(3): 307-13
Dolcetti R, Frisan T, Sjoberg J, et al. (1995) Identification and characterization of an EpsteinBarr virus-specific T-cell response in the pathologic tissue of a patient with Hodgkin's
disease. Cancer research 55(16): 3675-81
Dufresne M, Dumas G, Asselin E, et al. (2011) Pro-inflammatory type-1 and antiinflammatory type-2 macrophages differentially modulate cell survival and invasion of human
bladder carcinoma T24 cells. Molecular immunology 48(12-13): 1556-67
5 Literatur
Seite 140
Echendu CW, Ling PD (2008) Regulation of Sp100A subnuclear localization and
transcriptional function by EBNA-LP and interferon. Journal of interferon & cytokine
research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine
Research 28(11): 667-78
Eliopoulos AG, Gallagher NJ, Blake SM, et al. (1999) Activation of the p38 mitogenactivated protein kinase pathway by Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1
coregulates interleukin-6 and interleukin-8 production. The Journal of biological chemistry
274(23): 16085-96
Eliopoulos AG, Stack M, Dawson CW, et al. (1997) Epstein-Barr virus-encoded LMP1 and
CD40 mediate IL-6 production in epithelial cells via an NF-kappaB pathway involving TNF
receptor-associated factors. Oncogene 14(24): 2899-916
Eliopoulos AG, Young LS (2001) LMP1 structure and signal transduction. Seminars in
cancer biology 11(6): 435-44
Epstein MA, Achong BG, Barr YM (1964) Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from
Burkitt's Lymphoma. Lancet 1(7335): 702-3
Epstein MA, Barr YM (1964) Cultivation in Vitro of Human Lymphoblasts from Burkitt's
Malignant Lymphoma. Lancet 1(7327): 252-3
Epstein MA, Henle G, Achong BG, et al. (1965) Morphological and Biological Studies on a
Virus in Cultured Lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma. The Journal of experimental
medicine 121: 761-70
Fachiroh J, Sangrajrang S, Johansson M, et al. (2012) Tobacco consumption and genetic
susceptibility to nasopharyngeal carcinoma (NPC) in Thailand. Cancer causes & control :
CCC 23(12): 1995-2002
Fahraeus R, Fu HL, Ernberg I, et al. (1988) Expression of Epstein-Barr virus-encoded
proteins in nasopharyngeal carcinoma. International journal of cancer Journal international
du cancer 42(3): 329-38
Fahraeus R, Rymo L, Rhim JS, et al. (1990) Morphological transformation of human
keratinocytes expressing the LMP gene of Epstein-Barr virus. Nature 345(6274): 447-9
Feng BJ, Khyatti M, Ben-Ayoub W, et al. (2009) Cannabis, tobacco and domestic fumes
intake are associated with nasopharyngeal carcinoma in North Africa. British journal of
cancer 101(7): 1207-12
5 Literatur
Seite 141
Fischer M, Juremalm M, Olsson N, et al. (2003) Expression of CCL5/RANTES by Hodgkin
and Reed-Sternberg cells and its possible role in the recruitment of mast cells into
lymphomatous tissue. International journal of cancer Journal international du cancer 107(2):
197-201
Flavell JR, Baumforth KR, Wood VH, et al. (2008) Down-regulation of the TGF-beta target
gene, PTPRK, by the Epstein-Barr virus encoded EBNA1 contributes to the growth and
survival of Hodgkin lymphoma cells. Blood 111(1): 292-301
Foss HD, Herbst H, Gottstein S, et al. (1996) Interleukin-8 in Hodgkin's disease. Preferential
expression by reactive cells and association with neutrophil density. The American journal of
pathology 148(4): 1229-36
Friborg JT, Yuan JM, Wang R, et al. (2007) A prospective study of tobacco and alcohol use
as risk factors for pharyngeal carcinomas in Singapore Chinese. Cancer 109(6): 1183-91
Fujieda S, Lee K, Sunaga H, et al. (1999) Staining of interleukin-10 predicts clinical outcome
in patients with nasopharyngeal carcinoma. Cancer 85(7): 1439-45
Fujii M, Yamashita T, Ishiguro R, et al. (2002) Significance of epidermal growth factor
receptor and tumor associated tissue eosinophilia in the prognosis of patients with
nasopharyngeal carcinoma. Auris, nasus, larynx 29(2): 175-81
Fukayama M, Hino R, Uozaki H (2008) Epstein-Barr virus and gastric carcinoma: virus-host
interactions leading to carcinoma. Cancer science 99(9): 1726-33
Gabrilovich D (2004) Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendriticcell defects. Nature reviews Immunology 4(12): 941-52
Gahn TA, Sugden B (1995) An EBNA-1-dependent enhancer acts from a distance of 10
kilobase pairs to increase expression of the Epstein-Barr virus LMP gene. Journal of virology
69(4): 2633-6
Geissmann F, Manz MG, Jung S, et al. (2010) Development of monocytes, macrophages, and
dendritic cells. Science 327(5966): 656-61
Gires O, Kohlhuber F, Kilger E, et al. (1999) Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus
interacts with JAK3 and activates STAT proteins. The EMBO journal 18(11): 3064-73
Glaser SL, Lin RJ, Stewart SL, et al. (1997) Epstein-Barr virus-associated Hodgkin's disease:
epidemiologic characteristics in international data. International journal of cancer Journal
international du cancer 70(4): 375-82
5 Literatur
Seite 142
Glickman JN, Howe JG, Steitz JA (1988) Structural analyses of EBER1 and EBER2
ribonucleoprotein particles present in Epstein-Barr virus-infected cells. Journal of virology
62(3): 902-11
Goldsmith DB, West TM, Morton R (2002) HLA associations with nasopharyngeal
carcinoma in Southern Chinese: a meta-analysis. Clinical otolaryngology and allied sciences
27(1): 61-7
Goswami S, Sahai E, Wyckoff JB, et al. (2005) Macrophages promote the invasion of breast
carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.
Cancer research 65(12): 5278-83
Gottfried E, Kreutz M, Mackensen A (2008) Tumor-induced modulation of dendritic cell
function. Cytokine & growth factor reviews 19(1): 65-77
Graham JP, Arcipowski KM, Bishop GA (2010) Differential B-lymphocyte regulation by
CD40 and its viral mimic, latent membrane protein 1. Immunological reviews 237(1): 226-48
Greenspan JS, Greenspan D, Lennette ET, et al. (1985) Replication of Epstein-Barr virus
within the epithelial cells of oral "hairy" leukoplakia, an AIDS-associated lesion. The New
England journal of medicine 313(25): 1564-71
Grossman SR, Johannsen E, Tong X, et al. (1994) The Epstein-Barr virus nuclear antigen 2
transactivator is directed to response elements by the J kappa recombination signal binding
protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
91(16): 7568-72
Grufferman S, Cole P, Smith PG, et al. (1977) Hodgkin's disease in siblings. The New
England journal of medicine 296(5): 248-50
Gruhne B, Sompallae R, Marescotti D, et al. (2009) The Epstein-Barr virus nuclear antigen-1
promotes genomic instability via induction of reactive oxygen species. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 106(7): 2313-8
Hammerschmidt W, Sugden B (1989) Genetic analysis of immortalizing functions of EpsteinBarr virus in human B lymphocytes. Nature 340(6232): 393-7
Hammerschmidt W, Sugden B, Baichwal VR (1989) The transforming domain alone of the
latent membrane protein of Epstein-Barr virus is toxic to cells when expressed at high levels.
Journal of virology 63(6): 2469-75
5 Literatur
Seite 143
Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, et al. (1999) World Health Organization classification of
neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory
Committee meeting-Airlie House, Virginia, November 1997. Journal of clinical oncology :
official journal of the American Society of Clinical Oncology 17(12): 3835-49
He Z, Xin B, Yang X, et al. (2000) Nuclear factor-kappaB activation is involved in LMP1mediated transformation and tumorigenesis of rat-1 fibroblasts. Cancer research 60(7): 18458
Heinrich PC, Behrmann I, Muller-Newen G, et al. (1998) Interleukin-6-type cytokine
signalling through the gp130/Jak/STAT pathway. The Biochemical journal 334 ( Pt 2): 297314
Henderson S, Huen D, Rowe M, et al. (1993) Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a
viral homologue of Bcl-2, protects human B cells from programmed cell death. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(18): 8479-83
Henle G, Henle W, Diehl V (1968) Relation of Burkitt's tumor-associated herpes-ytpe virus to
infectious mononucleosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 59(1): 94-101
Henle W, Diehl V, Kohn G, et al. (1967) Herpes-type virus and chromosome marker in
normal leukocytes after growth with irradiated Burkitt cells. Science 157(3792): 1064-5
Herbst H, Stein H, Niedobitek G (1993) Epstein-Barr virus and CD30+ malignant
lymphomas. Critical reviews in oncogenesis 4(2): 191-239
Herling M, Rassidakis GZ, Vassilakopoulos TP, et al. (2006) Impact of LMP-1 expression on
clinical outcome in age-defined subgroups of patients with classical Hodgkin lymphoma.
Blood 107(3): 1240; author reply 1241
Hildesheim A, Apple RJ, Chen CJ, et al. (2002) Association of HLA class I and II alleles and
extended haplotypes with nasopharyngeal carcinoma in Taiwan. Journal of the National
Cancer Institute 94(23): 1780-9
Hildesheim A, Chen CJ, Caporaso NE, et al. (1995) Cytochrome P4502E1 genetic
polymorphisms and risk of nasopharyngeal carcinoma: results from a case-control study
conducted in Taiwan. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the
American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of
Preventive Oncology 4(6): 607-10
5 Literatur
Seite 144
Hillenbrand EE, Neville AM, Coventry BJ (1999) Immunohistochemical localization of
CD1a-positive putative dendritic cells in human breast tumours. British journal of cancer
79(5-6): 940-4
Hirano T, Ishihara K, Hibi M (2000) Roles of STAT3 in mediating the cell growth,
differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors.
Oncogene 19(21): 2548-56
Hislop AD, Taylor GS, Sauce D, et al. (2007) Cellular responses to viral infection in humans:
lessons from Epstein-Barr virus. Annual review of immunology 25: 587-617
Hjalgrim H, Askling J, Rostgaard K, et al. (2003) Characteristics of Hodgkin's lymphoma
after infectious mononucleosis. The New England journal of medicine 349(14): 1324-32
Ho Y, Tsao SW, Zeng M, et al. (2013) STAT3 as a therapeutic target for Epstein-Barr virus
(EBV): associated nasopharyngeal carcinoma. Cancer letters 330(2): 141-9
Hodge DR, Hurt EM, Farrar WL (2005) The role of IL-6 and STAT3 in inflammation and
cancer. Eur J Cancer 41(16): 2502-12
Hodgkin (1832) On some Morbid Appearances of the Absorbent Glands and Spleen. Medicochirurgical transactions 17: 68-114
Hofelmayr H, Strobl LJ, Marschall G, et al. (2001) Activated Notch1 can transiently
substitute for EBNA2 in the maintenance of proliferation of LMP1-expressing immortalized
B cells. Journal of virology 75(5): 2033-40
Homig-Holzel C, Hojer C, Rastelli J, et al. (2008) Constitutive CD40 signaling in B cells
selectively activates the noncanonical NF-kappaB pathway and promotes lymphomagenesis.
The Journal of experimental medicine 205(6): 1317-29
Hopwood P, Crawford DH (2000) The role of EBV in post-transplant malignancies: a review.
Journal of clinical pathology 53(4): 248-54
Howe JG, Steitz JA (1986) Localization of Epstein-Barr virus-encoded small RNAs by in situ
hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 83(23): 9006-10
Hsiao JR, Jin YT, Tsai ST, et al. (2003) Constitutive activation of STAT3 and STAT5 is
present in the majority of nasopharyngeal carcinoma and correlates with better prognosis.
British journal of cancer 89(2): 344-9
5 Literatur
Seite 145
Hu LF, Chen F, Zhen QF, et al. (1995) Differences in the growth pattern and clinical course
of EBV-LMP1 expressing and non-expressing nasopharyngeal carcinomas. Eur J Cancer
31A(5): 658-60
Hu LF, Chen F, Zheng X, et al. (1993) Clonability and tumorigenicity of human epithelial
cells expressing the EBV encoded membrane protein LMP1. Oncogene 8(6): 1575-83
Huang DP, Ho JH, Saw D, et al. (1978) Carcinoma of the nasal and paranasal regions in rats
fed Cantonese salted marine fish. IARC scientific publications(20): 315-28
Hummel M, Anagnostopoulos I, Dallenbach F, et al. (1992) EBV infection patterns in
Hodgkin's disease and normal lymphoid tissue: expression and cellular localization of EBV
gene products. British journal of haematology 82(4): 689-94
Hwang CF, Su CY, Huang SC, et al. (2003) Low expression levels of p27 correlate with locoregional recurrence in nasopharyngeal carcinoma. Cancer letters 189(2): 231-6
Iwakiri D, Sheen TS, Chen JY, et al. (2005) Epstein-Barr virus-encoded small RNA induces
insulin-like growth factor 1 and supports growth of nasopharyngeal carcinoma-derived cell
lines. Oncogene 24(10): 1767-73
Iwamoto M, Shinohara H, Miyamoto A, et al. (2003) Prognostic value of tumor-infiltrating
dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas. International journal of cancer
Journal international du cancer 104(1): 92-7
Jarrett RF, Stark GL, White J, et al. (2005) Impact of tumor Epstein-Barr virus status on
presenting features and outcome in age-defined subgroups of patients with classic Hodgkin
lymphoma: a population-based study. Blood 106(7): 2444-51
Ji X, Zhang W, Xie C, et al. (2011) Nasopharyngeal carcinoma risk by histologic type in
central China: impact of smoking, alcohol and family history. International journal of cancer
Journal international du cancer 129(3): 724-32
Jones JF, Shurin S, Abramowsky C, et al. (1988) T-cell lymphomas containing Epstein-Barr
viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. The New England journal of
medicine 318(12): 733-41
Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, et al. (1997) Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins
induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free
conditions. European journal of immunology 27(12): 3135-42
5 Literatur
Seite 146
Kamper P, Bendix K, Hamilton-Dutoit S, et al. (2011) Tumor-infiltrating macrophages
correlate with adverse prognosis and Epstein-Barr virus status in classical Hodgkin's
lymphoma. Haematologica 96(2): 269-76
Kanavaros P, Lescs MC, Briere J, et al. (1993) Nasal T-cell lymphoma: a clinicopathologic
entity associated with peculiar phenotype and with Epstein-Barr virus. Blood 81(10): 2688-95
Kang MS, Lu H, Yasui T, et al. (2005) Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 does not induce
lymphoma in transgenic FVB mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 102(3): 820-5
Kanzler H, Kuppers R, Hansmann ML, et al. (1996) Hodgkin and Reed-Sternberg cells in
Hodgkin's disease represent the outgrowth of a dominant tumor clone derived from (crippled)
germinal center B cells. The Journal of experimental medicine 184(4): 1495-505
Kaye KM, Izumi KM, Kieff E (1993) Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is
essential for B-lymphocyte growth transformation. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 90(19): 9150-4
Kaye KM, Izumi KM, Mosialos G, et al. (1995) The Epstein-Barr virus LMP1 cytoplasmic
carboxy terminus is essential for B-lymphocyte transformation; fibroblast cocultivation
complements a critical function within the terminal 155 residues. Journal of virology 69(2):
675-83
Keegan TH, Glaser SL, Clarke CA, et al. (2005) Epstein-Barr virus as a marker of survival
after Hodgkin's lymphoma: a population-based study. Journal of clinical oncology : official
journal of the American Society of Clinical Oncology 23(30): 7604-13
Kelly G, Bell A, Rickinson A (2002) Epstein-Barr virus-associated Burkitt lymphomagenesis
selects for downregulation of the nuclear antigen EBNA2. Nature medicine 8(10): 1098-104
Khan G (2006) Epstein-Barr virus, cytokines, and inflammation: a cocktail for the
pathogenesis of Hodgkin's lymphoma? Experimental hematology 34(4): 399-406
Kieff E, Rickinson A (2001) Epstein-Barr Virus. Fields Virology, Lippincott Williams &
Wilkins, Philadelphia 4th Edition: 2511-2574
Kitagawa N, Goto M, Kurozumi K, et al. (2000) Epstein-Barr virus-encoded poly(A)(-) RNA
supports Burkitt's lymphoma growth through interleukin-10 induction. The EMBO journal
19(24): 6742-50
5 Literatur
Seite 147
Kiuchi N, Nakajima K, Ichiba M, et al. (1999) STAT3 is required for the gp130-mediated full
activation of the c-myc gene. The Journal of experimental medicine 189(1): 63-73
Knowles DM (1999) Immunodeficiency-associated lymphoproliferative disorders. Modern
pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc
12(2): 200-17
Kohlhof H, Hampel F, Hoffmann R, et al. (2009) Notch1, Notch2, and Epstein-Barr virusencoded nuclear antigen 2 signaling differentially affects proliferation and survival of
Epstein-Barr virus-infected B cells. Blood 113(22): 5506-15
Kripalani-Joshi S, Law HY (1994) Identification of integrated Epstein-Barr virus in
nasopharyngeal carcinoma using pulse field gel electrophoresis. International journal of
cancer Journal international du cancer 56(2): 187-92
Kuhn-Hallek I, Sage DR, Stein L, et al. (1995) Expression of recombination activating genes
(RAG-1 and RAG-2) in Epstein-Barr virus-bearing B cells. Blood 85(5): 1289-99
Kung CP, Raab-Traub N (2008) Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces
expression of the epidermal growth factor receptor through effects on Bcl-3 and STAT3.
Journal of virology 82(11): 5486-93
Kuppers R (2009a) The biology of Hodgkin's lymphoma. Nature reviews Cancer 9(1): 15-27
Kuppers R (2009b) Molecular biology of Hodgkin lymphoma. Hematology / the Education
Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education
Program: 491-6
Kurte M, Lopez M, Aguirre A, et al. (2004) A synthetic peptide homologous to functional
domain of human IL-10 down-regulates expression of MHC class I and Transporter
associated with Antigen Processing 1/2 in human melanoma cells. J Immunol 173(3): 1731-7
Kutok JL, Wang F (2006) Spectrum of Epstein-Barr virus-associated diseases. Annual review
of pathology 1: 375-404
Laoui D, Movahedi K, Van Overmeire E, et al. (2011) Tumor-associated macrophages in
breast cancer: distinct subsets, distinct functions. The International journal of developmental
biology 55(7-9): 861-7
Lesina M, Kurkowski MU, Ludes K, et al. (2011) Stat3/Socs3 activation by IL-6
transsignaling promotes progression of pancreatic intraepithelial neoplasia and development
of pancreatic cancer. Cancer cell 19(4): 456-69
5 Literatur
Seite 148
Levitskaya J, Sharipo A, Leonchiks A, et al. (1997) Inhibition of ubiquitin/proteasomedependent protein degradation by the Gly-Ala repeat domain of the Epstein-Barr virus nuclear
antigen 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
94(23): 12616-21
Lewis CE, Pollard JW (2006) Distinct role of macrophages in different tumor
microenvironments. Cancer research 66(2): 605-12
Li J, Zeng XH, Mo HY, et al. (2007a) Functional inactivation of EBV-specific T-lymphocytes
in nasopharyngeal carcinoma: implications for tumor immunotherapy. PloS one 2(11): e1122
Li L, Guo L, Tao Y, et al. (2007b) Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus regulates
p53 phosphorylation through MAP kinases. Cancer letters 255(2): 219-31
Liao JB (2006) Viruses and human cancer. The Yale journal of biology and medicine 79(3-4):
115-22
Lin SY, Tsang NM, Kao SC, et al. (2001) Presence of Epstein-Barr virus latent membrane
protein 1 gene in the nasopharyngeal swabs from patients with nasopharyngeal carcinoma.
Head & neck 23(3): 194-200
Liu LT, Peng JP, Chang HC, et al. (2003) RECK is a target of Epstein-Barr virus latent
membrane protein 1. Oncogene 22(51): 8263-70
Lo AK, Lo KW, Tsao SW, et al. (2006) Epstein-Barr virus infection alters cellular signal
cascades in human nasopharyngeal epithelial cells. Neoplasia 8(3): 173-80
Lo KW, Huang DP (2002) Genetic and epigenetic changes in nasopharyngeal carcinoma.
Seminars in cancer biology 12(6): 451-62
Lo KW, To KF, Huang DP (2004) Focus on nasopharyngeal carcinoma. Cancer cell 5(5):
423-8
Longnecker R (2000) Epstein-Barr virus latency: LMP2, a regulator or means for EpsteinBarr virus persistence? Advances in cancer research 79: 175-200
Longnecker R, Kieff E (1990) A second Epstein-Barr virus membrane protein (LMP2) is
expressed in latent infection and colocalizes with LMP1. Journal of virology 64(5): 2319-26
5 Literatur
Seite 149
Lui VW, Wong EY, Ho Y, et al. (2009) STAT3 activation contributes directly to Epstein-Barr
virus-mediated invasiveness of nasopharyngeal cancer cells in vitro. International journal of
cancer Journal international du cancer 125(8): 1884-93
Luo J, Xiao J, Tao Z, et al. (1997) Detection of c-myc gene expression in nasopharyngeal
carcinoma by nonradioactive in situ hybridization and immunohistochemistry. Chinese
medical journal 110(3): 229-32
Ma Y, Visser L, Blokzijl T, et al. (2008) The CD4+CD26- T-cell population in classical
Hodgkin's lymphoma displays a distinctive regulatory T-cell profile. Laboratory
investigation; a journal of technical methods and pathology 88(5): 482-90
Mackay F, Schneider P (2009) Cracking the BAFF code. Nature reviews Immunology 9(7):
491-502
Mainou BA, Everly DN, Jr., Raab-Traub N (2005) Epstein-Barr virus latent membrane
protein 1 CTAR1 mediates rodent and human fibroblast transformation through activation of
PI3K. Oncogene 24(46): 6917-24
Mantovani A, Locati M (2013) Tumor-associated macrophages as a paradigm of macrophage
plasticity, diversity, and polarization: lessons and open questions. Arteriosclerosis,
thrombosis, and vascular biology 33(7): 1478-83
Mantovani A, Sica A, Sozzani S, et al. (2004) The chemokine system in diverse forms of
macrophage activation and polarization. Trends in immunology 25(12): 677-86
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, et al. (2002) Macrophage polarization: tumor-associated
macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in
immunology 23(11): 549-55
Marks JE, Phillips JL, Menck HR (1998) The National Cancer Data Base report on the
relationship of race and national origin to the histology of nasopharyngeal carcinoma. Cancer
83(3): 582-8
Marquitz AR, Raab-Traub N (2012) The role of miRNAs and EBV BARTs in NPC. Seminars
in cancer biology 22(2): 166-72
Marshall NA, Vickers MA, Barker RN (2003) Regulatory T cells secreting IL-10 dominate
the immune response to EBV latent membrane protein 1. J Immunol 170(12): 6183-9
5 Literatur
Seite 150
Masucci MG, Torsteindottir S, Colombani J, et al. (1987) Down-regulation of class I HLA
antigens and of the Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein in Burkitt lymphoma
lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
84(13): 4567-71
McCann EM, Kelly GL, Rickinson AB, et al. (2001) Genetic analysis of the Epstein-Barr
virus-coded leader protein EBNA-LP as a co-activator of EBNA2 function. The Journal of
general virology 82(Pt 12): 3067-79
Mendelsohn J, Baselga J (2000) The EGF receptor family as targets for cancer therapy.
Oncogene 19(56): 6550-65
Middeldorp JM, Brink AA, van den Brule AJ, et al. (2003) Pathogenic roles for Epstein-Barr
virus (EBV) gene products in EBV-associated proliferative disorders. Critical reviews in
oncology/hematology 45(1): 1-36
Middeldorp JM, Pegtel DM (2008) Multiple roles of LMP1 in Epstein-Barr virus induced
immune escape. Seminars in cancer biology 18(6): 388-96
Miller CL, Lee JH, Kieff E, et al. (1994) An integral membrane protein (LMP2) blocks
reactivation of Epstein-Barr virus from latency following surface immunoglobulin
crosslinking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 91(2): 772-6
Miller N, Hutt-Fletcher LM (1992) Epstein-Barr virus enters B cells and epithelial cells by
different routes. Journal of virology 66(6): 3409-14
Miyashita EM, Yang B, Lam KM, et al. (1995) A novel form of Epstein-Barr virus latency in
normal B cells in vivo. Cell 80(4): 593-601
Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF, et al. (1990) Homology of cytokine synthesis inhibitory
factor (IL-10) to the Epstein-Barr virus gene BCRFI. Science 248(4960): 1230-4
Moroni M, Veronese S, Schiavo R, et al. (2001) Epidermal growth factor receptor expression
and activation in nonseminomatous germ cell tumors. Clinical cancer research : an official
journal of the American Association for Cancer Research 7(9): 2770-5
Morris MA, Dawson CW, Wei W, et al. (2008) Epstein-Barr virus-encoded LMP1 induces a
hyperproliferative and inflammatory gene expression programme in cultured keratinocytes.
The Journal of general virology 89(Pt 11): 2806-20
5 Literatur
Seite 151
Movahedi K, Laoui D, Gysemans C, et al. (2010) Different tumor microenvironments contain
functionally distinct subsets of macrophages derived from Ly6C(high) monocytes. Cancer
research 70(14): 5728-39
Munz C, Bickham KL, Subklewe M, et al. (2000) Human CD4(+) T lymphocytes consistently
respond to the latent Epstein-Barr virus nuclear antigen EBNA1. The Journal of experimental
medicine 191(10): 1649-60
Murdoch C, Giannoudis A, Lewis CE (2004) Mechanisms regulating the recruitment of
macrophages into hypoxic areas of tumors and other ischemic tissues. Blood 104(8): 2224-34
Murphy K, Travers P, Walport M (2008) Janeway's Immunobiology. Garland Science, Taylor
& Francis Group LLC, New York and London 7th Edition
Murray PG, Constandinou CM, Crocker J, et al. (1998) Analysis of major histocompatibility
complex class I, TAP expression, and LMP2 epitope sequence in Epstein-Barr virus-positive
Hodgkin's disease. Blood 92(7): 2477-83
Nakagomi H, Dolcetti R, Bejarano MT, et al. (1994) The Epstein-Barr virus latent membrane
protein-1 (LMP1) induces interleukin-10 production in Burkitt lymphoma lines. International
journal of cancer Journal international du cancer 57(2): 240-4
Nazar-Stewart V, Vaughan TL, Burt RD, et al. (1999) Glutathione S-transferase M1 and
susceptibility to nasopharyngeal carcinoma. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention :
a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American
Society of Preventive Oncology 8(6): 547-51
Nemerow GR, Mold C, Schwend VK, et al. (1987) Identification of gp350 as the viral
glycoprotein mediating attachment of Epstein-Barr virus (EBV) to the EBV/C3d receptor of B
cells: sequence homology of gp350 and C3 complement fragment C3d. Journal of virology
61(5): 1416-20
Ng LG, Mackay CR, Mackay F (2005) The BAFF/APRIL system: life beyond B
lymphocytes. Molecular immunology 42(7): 763-72
Niedobitek G, Agathanggelou A, Herbst H, et al. (1997) Epstein-Barr virus (EBV) infection
in infectious mononucleosis: virus latency, replication and phenotype of EBV-infected cells.
The Journal of pathology 182(2): 151-9
Niedobitek G, Baumann I, Brabletz T, et al. (2000) Hodgkin's disease and peripheral T-cell
lymphoma: composite lymphoma with evidence of Epstein-Barr virus infection. The Journal
of pathology 191(4): 394-9
5 Literatur
Seite 152
Niedobitek G, Meru N, Delecluse HJ (2001) Epstein-Barr virus infection and human
malignancies. International journal of experimental pathology 82(3): 149-70
Niedobitek G, Young LS, Sam CK, et al. (1992) Expression of Epstein-Barr virus genes and
of lymphocyte activation molecules in undifferentiated nasopharyngeal carcinomas. The
American journal of pathology 140(4): 879-87
O'Neil JD, Owen TJ, Wood VH, et al. (2008) Epstein-Barr virus-encoded EBNA1 modulates
the AP-1 transcription factor pathway in nasopharyngeal carcinoma cells and enhances
angiogenesis in vitro. The Journal of general virology 89(Pt 11): 2833-42
Ogino T, Moriai S, Ishida Y, et al. (2007) Association of immunoescape mechanisms with
Epstein-Barr virus infection in nasopharyngeal carcinoma. International journal of cancer
Journal international du cancer 120(11): 2401-10
Okamoto M, Lee C, Oyasu R (1997) Interleukin-6 as a paracrine and autocrine growth factor
in human prostatic carcinoma cells in vitro. Cancer research 57(1): 141-6
Ottesen SS, Skouv J, Kieler J (1990) Reduced HLA-A,B,C expression in tumourigenic v-raf
transfected human urothelial cells. Eur J Cancer 26(3): 305-10
Oudejans JJ, Harijadi H, Kummer JA, et al. (2002) High numbers of granzyme B/CD8positive tumour-infiltrating lymphocytes in nasopharyngeal carcinoma biopsies predict rapid
fatal outcome in patients treated with curative intent. The Journal of pathology 198(4): 46875
Oudejans JJ, Jiwa M, van den Brule AJ, et al. (1995) Detection of heterogeneous Epstein-Barr
virus gene expression patterns within individual post-transplantation lymphoproliferative
disorders. The American journal of pathology 147(4): 923-33
Oudejans JJ, Jiwa NM, Kummer JA, et al. (1996) Analysis of major histocompatibility
complex class I expression on Reed-Sternberg cells in relation to the cytotoxic T-cell response
in Epstein-Barr virus-positive and -negative Hodgkin's disease. Blood 87(9): 3844-51
Oudejans JJ, Jiwa NM, Kummer JA, et al. (1997) Activated cytotoxic T cells as prognostic
marker in Hodgkin's disease. Blood 89(4): 1376-82
Ozyar E, Ayhan A, Korcum AF, et al. (2004) Prognostic role of Ebstein-Barr virus latent
membrane protein-1 and interleukin-10 expression in patients with nasopharyngeal
carcinoma. Cancer investigation 22(4): 483-91
5 Literatur
Seite 153
Pai S, O'Sullivan BJ, Cooper L, et al. (2002) RelB nuclear translocation mediated by Cterminal activator regions of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 and its
effect on antigen-presenting function in B cells. Journal of virology 76(4): 1914-21
Perosa F, Luccarelli G, Prete M, et al. (2003) Beta 2-microglobulin-free HLA class I heavy
chain epitope mimicry by monoclonal antibody HC-10-specific peptide. J Immunol 171(4):
1918-26
Polesel J, Franceschi S, Talamini R, et al. (2011) Tobacco smoking, alcohol drinking, and the
risk of different histological types of nasopharyngeal cancer in a low-risk population. Oral
oncology 47(6): 541-5
Pollard JW (2004) Tumour-educated macrophages promote tumour progression and
metastasis. Nature reviews Cancer 4(1): 71-8
Pope JH, Horne MK, Scott W (1968) Transformation of foetal human keukocytes in vitro by
filtrates of a human leukaemic cell line containing herpes-like virus. International journal of
cancer Journal international du cancer 3(6): 857-66
Poppema S, Bhan AK, Reinherz EL, et al. (1982) In situ immunologic characterization of
cellular constituents in lymph nodes and spleens involved by Hodgkin's disease. Blood 59(2):
226-32
Poppema S, Lai R, Visser L, et al. (1996) CD45 (leucocyte common antigen) expression in T
and B lymphocyte subsets. Leukemia & lymphoma 20(3-4): 217-22
Poppema S, van den Berg A (2000) Interaction between host T cells and Reed-Sternberg cells
in Hodgkin lymphomas. Seminars in cancer biology 10(5): 345-50
Porter MJ, Field JK, Leung SF, et al. (1994) The detection of the c-myc and ras oncogenes in
nasopharyngeal carcinoma by immunohistochemistry. Acta oto-laryngologica 114(1): 105-9
Raab-Traub N (2002) Epstein-Barr virus in the pathogenesis of NPC. Seminars in cancer
biology 12(6): 431-41
Radkov SA, Bain M, Farrell PJ, et al. (1997) Epstein-Barr virus EBNA3C represses Cp, the
major promoter for EBNA expression, but has no effect on the promoter of the cell gene
CD21. Journal of virology 71(11): 8552-62
Rastelli J, Homig-Holzel C, Seagal J, et al. (2008) LMP1 signaling can replace CD40
signaling in B cells in vivo and has unique features of inducing class-switch recombination to
IgG1. Blood 111(3): 1448-55
5 Literatur
Seite 154
Ree HJ, Kadin ME (1985) Macrophage-histiocytes in Hodgkin's disease. The relation of
peanut-agglutinin-binding macrophage-histiocytes to clinicopathologic presentation and
course of disease. Cancer 56(2): 333-8
Ricci MS, Jin Z, Dews M, et al. (2004) Direct repression of FLIP expression by c-myc is a
major determinant of TRAIL sensitivity. Molecular and cellular biology 24(19): 8541-55
Romani N, Reider D, Heuer M, et al. (1996) Generation of mature dendritic cells from human
blood. An improved method with special regard to clinical applicability. Journal of
immunological methods 196(2): 137-51
Rooney CM, Rowe DT, Ragot T, et al. (1989) The spliced BZLF1 gene of Epstein-Barr virus
(EBV) transactivates an early EBV promoter and induces the virus productive cycle. Journal
of virology 63(7): 3109-16
Rowe M, Khanna R, Jacob CA, et al. (1995) Restoration of endogenous antigen processing in
Burkitt's lymphoma cells by Epstein-Barr virus latent membrane protein-1: coordinate upregulation of peptide transporters and HLA-class I antigen expression. European journal of
immunology 25(5): 1374-84
Ruf IK, Rhyne PW, Yang C, et al. (2000) Epstein-Barr virus small RNAs potentiate
tumorigenicity of Burkitt lymphoma cells independently of an effect on apoptosis. Journal of
virology 74(21): 10223-8
Sallusto F, Lanzavecchia A (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured
human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. The Journal of
experimental medicine 179(4): 1109-18
Samanta M, Iwakiri D, Kanda T, et al. (2006) EB virus-encoded RNAs are recognized by
RIG-I and activate signaling to induce type I IFN. The EMBO journal 25(18): 4207-14
Samanta M, Iwakiri D, Takada K (2008) Epstein-Barr virus-encoded small RNA induces IL10 through RIG-I-mediated IRF-3 signaling. Oncogene 27(30): 4150-60
Sanchez-Espiridion B, Martin-Moreno AM, Montalban C, et al. (2012) Immunohistochemical
markers for tumor associated macrophages and survival in advanced classical Hodgkin's
lymphoma. Haematologica 97(7): 1080-4
Schlee M, Holzel M, Bernard S, et al. (2007) C-myc activation impairs the NF-kappaB and
the interferon response: implications for the pathogenesis of Burkitt's lymphoma.
International journal of cancer Journal international du cancer 120(7): 1387-95
5 Literatur
Seite 155
Scholle F, Bendt KM, Raab-Traub N (2000) Epstein-Barr virus LMP2A transforms epithelial
cells, inhibits cell differentiation, and activates Akt. Journal of virology 74(22): 10681-9
Schreck S, Friebel D, Buettner M, et al. (2009) Prognostic impact of tumour-infiltrating Th2
and regulatory T cells in classical Hodgkin lymphoma. Hematological oncology 27(1): 31-9
Schwaller J, Tobler A, Niklaus G, et al. (1995) Interleukin-12 expression in human
lymphomas and nonneoplastic lymphoid disorders. Blood 85(8): 2182-8
Seliger B (2008a) Different regulation of MHC class I antigen processing components in
human tumors. Journal of immunotoxicology 5(4): 361-7
Seliger B (2008b) Molecular mechanisms of MHC class I abnormalities and APM
components in human tumors. Cancer immunology, immunotherapy : CII 57(11): 1719-26
Seliger B, Maeurer MJ, Ferrone S (2000) Antigen-processing machinery breakdown and
tumor growth. Immunology today 21(9): 455-64
Sengupta S, den Boon JA, Chen IH, et al. (2006) Genome-wide expression profiling reveals
EBV-associated inhibition of MHC class I expression in nasopharyngeal carcinoma. Cancer
research 66(16): 7999-8006
Sica A, Schioppa T, Mantovani A, et al. (2006) Tumour-associated macrophages are a distinct
M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer
therapy. Eur J Cancer 42(6): 717-27
Siegler G, Meyer B, Dawson C, et al. (2004) Expression of tumor necrosis factor receptorassociated factor 1 in nasopharyngeal carcinoma: possible upregulation by Epstein-Barr virus
latent membrane protein 1. International journal of cancer Journal international du cancer
112(2): 265-72
Sinclair AJ, Palmero I, Peters G, et al. (1994) EBNA-2 and EBNA-LP cooperate to cause G0
to G1 transition during immortalization of resting human B lymphocytes by Epstein-Barr
virus. The EMBO journal 13(14): 3321-8
Skinnider BF, Mak TW (2002) The role of cytokines in classical Hodgkin lymphoma. Blood
99(12): 4283-97
Spano JP, Busson P, Atlan D, et al. (2003) Nasopharyngeal carcinomas: an update. Eur J
Cancer 39(15): 2121-35
5 Literatur
Seite 156
Staege MS, Lee SP, Frisan T, et al. (2002) MYC overexpression imposes a nonimmunogenic
phenotype on Epstein-Barr virus-infected B cells. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 99(7): 4550-5
Stam NJ, Spits H, Ploegh HL (1986) Monoclonal antibodies raised against denatured HLA-B
locus heavy chains permit biochemical characterization of certain HLA-C locus products. J
Immunol 137(7): 2299-306
Steidl C, Connors JM, Gascoyne RD (2011) Molecular pathogenesis of Hodgkin's lymphoma:
increasing evidence of the importance of the microenvironment. Journal of clinical oncology :
official journal of the American Society of Clinical Oncology 29(14): 1812-26
Steidl C, Lee T, Shah SP, et al. (2010) Tumor-associated macrophages and survival in classic
Hodgkin's lymphoma. The New England journal of medicine 362(10): 875-85
Stewart S, Dawson CW, Takada K, et al. (2004) Epstein-Barr virus-encoded LMP2A
regulates viral and cellular gene expression by modulation of the NF-kappaB transcription
factor pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101(44): 15730-5
Stout RD, Jiang C, Matta B, et al. (2005) Macrophages sequentially change their functional
phenotype in response to changes in microenvironmental influences. J Immunol 175(1): 342-9
Strobl H, Riedl E, Scheinecker C, et al. (1996) TGF-beta 1 promotes in vitro development of
dendritic cells from CD34+ hemopoietic progenitors. J Immunol 157(4): 1499-507
Sugden B, Warren N (1989) A promoter of Epstein-Barr virus that can function during latent
infection can be transactivated by EBNA-1, a viral protein required for viral DNA replication
during latent infection. Journal of virology 63(6): 2644-9
Svedmyr E, Jondal M (1975) Cytotoxic effector cells specific for B Cell lines transformed by
Epstein-Barr virus are present in patients with infectious mononucleosis. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 72(4): 1622-6
Tan KL, Scott DW, Hong F, et al. (2012) Tumor-associated macrophages predict inferior
outcomes in classic Hodgkin lymphoma: a correlative study from the E2496 Intergroup trial.
Blood 120(16): 3280-7
Teruya-Feldstein J, Tosato G, Jaffe ES (2000) The role of chemokines in Hodgkin's disease.
Leukemia & lymphoma 38(3-4): 363-71
5 Literatur
Seite 157
Thorley-Lawson DA, Duca KA, Shapiro M (2008) Epstein-Barr virus: a paradigm for
persistent infection - for real and in virtual reality. Trends in immunology 29(4): 195-201
Thurnher M, Radmayr C, Ramoner R, et al. (1996) Human renal-cell carcinoma tissue
contains dendritic cells. International journal of cancer Journal international du cancer
68(1): 1-7
Tierney RJ, Steven N, Young LS, et al. (1994) Epstein-Barr virus latency in blood
mononuclear cells: analysis of viral gene transcription during primary infection and in the
carrier state. Journal of virology 68(11): 7374-85
Tomkinson B, Robertson E, Kieff E (1993) Epstein-Barr virus nuclear proteins EBNA-3A
and EBNA-3C are essential for B-lymphocyte growth transformation. Journal of virology
67(4): 2014-25
Tsao SW, Tramoutanis G, Dawson CW, et al. (2002) The significance of LMP1 expression in
nasopharyngeal carcinoma. Seminars in cancer biology 12(6): 473-87
Tsimbouri P, Drotar ME, Coy JL, et al. (2002) bcl-xL and RAG genes are induced and the
response to IL-2 enhanced in EmuEBNA-1 transgenic mouse lymphocytes. Oncogene 21(33):
5182-7
Tsutsui S, Yasuda K, Suzuki K, et al. (2005) Macrophage infiltration and its prognostic
implications in breast cancer: the relationship with VEGF expression and microvessel density.
Oncology reports 14(2): 425-31
Tudor CS, Dawson CW, Eckhardt J, et al. (2012) c-Myc and EBV-LMP1: two opposing
regulators of the HLA class I antigen presentation machinery in epithelial cells. British
journal of cancer 106(12): 1980-8
Tugizov SM, Herrera R, Palefsky JM (2013) Epstein-Barr virus transcytosis through polarized
oral epithelial cells. Journal of virology 87(14): 8179-94
Tzankov A, Meier C, Hirschmann P, et al. (2008) Correlation of high numbers of intratumoral
FOXP3+ regulatory T cells with improved survival in germinal center-like diffuse large Bcell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin's lymphoma. Haematologica
93(2): 193-200
Uchida J, Yasui T, Takaoka-Shichijo Y, et al. (1999) Mimicry of CD40 signals by EpsteinBarr virus LMP1 in B lymphocyte responses. Science 286(5438): 300-3
5 Literatur
Seite 158
Verreck FA, de Boer T, Langenberg DM, et al. (2004) Human IL-23-producing type 1
macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to
(myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101(13): 4560-5
Verreck FA, de Boer T, Langenberg DM, et al. (2006) Phenotypic and functional profiling of
human proinflammatory type-1 and anti-inflammatory type-2 macrophages in response to
microbial antigens and IFN-gamma- and CD40L-mediated costimulation. Journal of
leukocyte biology 79(2): 285-93
Versteeg R, Noordermeer IA, Kruse-Wolters M, et al. (1988) c-myc down-regulates class I
HLA expression in human melanomas. The EMBO journal 7(4): 1023-9
Vertuani S, Triulzi C, Roos AK, et al. (2009) HER-2/neu mediated down-regulation of MHC
class I antigen processing prevents CTL-mediated tumor recognition upon DNA vaccination
in HLA-A2 transgenic mice. Cancer immunology, immunotherapy : CII 58(5): 653-64
Wang D, Liebowitz D, Kieff E (1985) An EBV membrane protein expressed in immortalized
lymphocytes transforms established rodent cells. Cell 43(3 Pt 2): 831-40
Wang F, Gregory C, Sample C, et al. (1990) Epstein-Barr virus latent membrane protein
(LMP1) and nuclear proteins 2 and 3C are effectors of phenotypic changes in B lymphocytes:
EBNA-2 and LMP1 cooperatively induce CD23. Journal of virology 64(5): 2309-18
Watkins SK, Egilmez NK, Suttles J, et al. (2007) IL-12 rapidly alters the functional profile of
tumor-associated and tumor-infiltrating macrophages in vitro and in vivo. J Immunol 178(3):
1357-62
Wei MX, de Turenne-Tessier M, Decaussin G, et al. (1997) Establishment of a monkey
kidney epithelial cell line with the BARF1 open reading frame from Epstein-Barr virus.
Oncogene 14(25): 3073-81
Weiss LM, Strickler JG, Warnke RA, et al. (1987) Epstein-Barr viral DNA in tissues of
Hodgkin's disease. The American journal of pathology 129(1): 86-91
Wilson JB, Bell JL, Levine AJ (1996) Expression of Epstein-Barr virus nuclear antigen-1
induces B cell neoplasia in transgenic mice. The EMBO journal 15(12): 3117-26
Wilson JB, Weinberg W, Johnson R, et al. (1990) Expression of the BNLF-1 oncogene of
Epstein-Barr virus in the skin of transgenic mice induces hyperplasia and aberrant expression
of keratin 6. Cell 61(7): 1315-27
5 Literatur
Seite 159
Wong HL, Wang X, Chang RC, et al. (2005) Stable expression of EBERs in immortalized
nasopharyngeal epithelial cells confers resistance to apoptotic stress. Molecular
carcinogenesis 44(2): 92-101
Wood VH, O'Neil JD, Wei W, et al. (2007) Epstein-Barr virus-encoded EBNA1 regulates
cellular gene transcription and modulates the STAT1 and TGFbeta signaling pathways.
Oncogene 26(28): 4135-47
Wu Y, Maruo S, Yajima M, et al. (2007) Epstein-Barr virus (EBV)-encoded RNA 2 (EBER2)
but not EBER1 plays a critical role in EBV-induced B-cell growth transformation. Journal of
virology 81(20): 11236-45
Wynn TA, Chawla A, Pollard JW (2013) Macrophage biology in development, homeostasis
and disease. Nature 496(7446): 445-55
Xia T, O'Hara A, Araujo I, et al. (2008) EBV microRNAs in primary lymphomas and
targeting of CXCL-11 by ebv-mir-BHRF1-3. Cancer research 68(5): 1436-42
Xing L, Kieff E (2007) Epstein-Barr virus BHRF1 micro- and stable RNAs during latency III
and after induction of replication. Journal of virology 81(18): 9967-75
Xu J, Ahmad A, D'Addario M, et al. (2000) Analysis and significance of anti-latent
membrane protein-1 antibodies in the sera of patients with EBV-associated diseases. J
Immunol 164(5): 2815-22
Yao Y, Minter HA, Chen X, et al. (2000) Heterogeneity of HLA and EBER expression in
Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma. International journal of cancer
Journal international du cancer 88(6): 949-55
Yoon DH, Koh YW, Kang HJ, et al. (2012) CD68 and CD163 as prognostic factors for
Korean patients with Hodgkin lymphoma. European journal of haematology 88(4): 292-305
Young JW, Szabolcs P, Moore MA (1995) Identification of dendritic cell colony-forming
units among normal human CD34+ bone marrow progenitors that are expanded by c-kitligand and yield pure dendritic cell colonies in the presence of granulocyte/macrophage
colony-stimulating factor and tumor necrosis factor alpha. The Journal of experimental
medicine 182(4): 1111-9
Young LS, Dawson CW, Clark D, et al. (1988) Epstein-Barr virus gene expression in
nasopharyngeal carcinoma. The Journal of general virology 69 ( Pt 5): 1051-65
5 Literatur
Seite 160
Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ, et al. (1998) CD40 and epithelial cells: across the
great divide. Immunology today 19(11): 502-6
Young LS, Murray PG (2003) Epstein-Barr virus and oncogenesis: from latent genes to
tumours. Oncogene 22(33): 5108-21
Young LS, Rickinson AB (2004) Epstein-Barr virus: 40 years on. Nature reviews Cancer
4(10): 757-68
Yu H, Pardoll D, Jove R (2009) STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role
for STAT3. Nature reviews Cancer 9(11): 798-809
Yu MC, Yuan JM (2002) Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Seminars in cancer
biology 12(6): 421-9
Zaki MA, Wada N, Ikeda J, et al. (2011) Prognostic implication of types of tumor-associated
macrophages in Hodgkin lymphoma. Virchows Archiv : an international journal of pathology
459(4): 361-6
Zech L, Haglund U, Nilsson K, et al. (1976) Characteristic chromosomal abnormalities in
biopsies and lymphoid-cell lines from patients with Burkitt and non-Burkitt lymphomas.
International journal of cancer Journal international du cancer 17(1): 47-56
Zeidler R, Eissner G, Meissner P, et al. (1997) Downregulation of TAP1 in B lymphocytes by
cellular and Epstein-Barr virus-encoded interleukin-10. Blood 90(6): 2390-7
Zheng H, Li LL, Hu DS, et al. (2007) Role of Epstein-Barr virus encoded latent membrane
protein 1 in the carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Cellular & molecular
immunology 4(3): 185-96
Zhou LJ, Tedder TF (1995) Human blood dendritic cells selectively express CD83, a member
of the immunoglobulin superfamily. J Immunol 154(8): 3821-35
Zhou W, Feng X, Ren C, et al. (2013) Over-expression of BCAT1, a c-Myc target gene,
induces cell proliferation, migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma. Molecular
cancer 12: 53
6 Anhang
Seite 161
6 Anhang
Publikationen und Präsentationen
Publikationen
Buettner, M., A. Lang, C. S. Tudor, B. Meyer, A. Cruchley, M. H. M. Barros, P. J. Farrell, H.
- M. Jack, W. Schuh, and G. Niedobitek. "Lytic Epstein-Barr virus infection in epithelial cells
but not in B-lymphocytes is dependent on Blimp1." Journal of General Virology, 2012,
93:1059-1064.
C.S. Tudor, C. W. Dawson, J. Eckhardt, G. Niedobitek, A. C. Büttner, B. Seliger, A.
Hartmann, and M. Buettner. "c-Myc and EBV–LMP1: two opposing regulators of the HLA
class I antigen presentation machinery in epithelial cells." British Journal of Cancer, 2012,
106:1980-1988.
Christiane S. Tudor, MD Luitpold V. Distel, Jenny Eckhardt, Prof. MD Arndt Hartmann, Prof.
MD Gerald Niedobitek, and MD Maike Buettner. "B cells in classical Hodgkin lymphoma are
important actors rather than bystanders in the local immune reaction." Human Pathology,
2013, 44:2475-86.
Christiane S. Tudor, Heiko Bruns, Christoph Daniel, Luitpold Distel, Arndt Hartmann, Armin
Gerbitz, and MD Maike Buettner. “Macrophages and dendritic cells as actors in the immune
reaction of classical Hodgkin lymphoma.” In preparation.
Vorträge
23.04.2010:
8th GRK1071 Retreat - Schlaifhausen
Regulation of the HLA class I machinery by EBV-LMP1 in NPC
14.09.2010:
9th GRK1071 Retreat - New England Primate Research Center, Harvard
Medical School, Boston, Massachusetts, USA
LMP1 induced up-regulation of HLA I machinery - a contradiction with
immunescape?
6 Anhang
23.05.2011:
Seite 162
10th GRK1071 Retreat - Schlaifhausen
Does STAT3-P oppose the up-regulation of the HLA-I APM by LMP1 via cMyc?
16.06.2011:
95. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pathologie e.V. - Leipzig
NPC: LMP1 induzierte Expression der HLA I APM - Widerspruch zur
Immunevasion?
02.03.2012:
11th GRK1071 Retreat - Schlaifhausen
Antigen presenting cells in classical Hodgkin Lymphoma: Mediators of
immune evasion?
Poster
06.09.2010:
14th EBV Congress – Birmingham, UK
LMP1 induced up-regulation of HLA I machinery - a contradiction with
immunescape?
16-10-2010: 3rd International GK Symposium: Regulators of Adaptive Immunity - Erlangen
LMP1 induced up-regulation of HLA I machinery - a contradiction with
immunescape?
14.06.2012:
40 years of Virology at the FAU - Erlangen
c-Myc and LMP1: two opposing regulators of the HLA class I antigen
presentation machinery.