VerenaDorschDissertation

Methodische Untersuchung zum Nachweis von
zirkulierenden Tumorzellen im Blut
Strahlenklinik
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr.med.
vorgelegt
von
Verena Dorsch
aus
Bad Reichenhall
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2015
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h. c. J. Schüttler
Gutachter: PD Dr. med. Luitpold Distel
Prof. Dr. med. Rainer Fietk
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ................................................................................... 1
1.1 Hintergrund und Ziele ........................................................................... 1
1.2 Methoden ............................................................................................. 2
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen .......................................................... 2
1.4 Praktische Schlussfolgerungen ............................................................ 3
2. Summary.................................................................................................... 4
2.1 Background and objective .................................................................... 4
2.2 Methods................................................................................................ 4
2.3 Results and observations ..................................................................... 5
2.4 Conclusion............................................................................................ 5
3. Einleitung................................................................................................... 7
3.1 Metastasierung und zirkulierende Tumorzellen .................................... 7
4. Material und Methoden ........................................................................... 13
4.1 Prinzip ................................................................................................ 13
4.2 Vorbereitung Zellkultur ....................................................................... 14
4.3 Vorbereitung Blut ................................................................................ 15
4.3.1 Blutentnahme ............................................................................... 15
4.3.2 Erythrozyten-Lyse ........................................................................ 16
4.3.3 CD45-Depletion ........................................................................... 17
4.4 Antikörper-Färbung ............................................................................ 18
4.4.1 Antikörper und Farbstoffe ............................................................ 19
4.4.2 Isotypkontrolle .............................................................................. 20
4.4.3 Durchführung ............................................................................... 21
4.5 Durchflusszytometrie .......................................................................... 22
4.6 Auswertung ........................................................................................ 24
5. Ergebnisse............................................................................................... 27
5.1 Zellkultur ............................................................................................. 27
5.2 Punktate ............................................................................................. 29
5.3 Blut ..................................................................................................... 31
5.4 Fehleranalyse ..................................................................................... 34
5.4.1 Färbeverhalten ............................................................................. 34
5.4.2 Verdünnungsreihen...................................................................... 37
5.4.3 Verlustminimierung ...................................................................... 38
5.4.4 Isotypenkontrolle .......................................................................... 41
6. Diskussion ............................................................................................... 43
7. Literaturverzeichnis ................................................................................ 51
8. Abkürzungen ........................................................................................... 56
9. Danksagung ............................................................................................ 57
1. Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Das Ziel einer persönlichen individuellen Behandlung rückt immer mehr ins
Zentrum der Krebstherapie. Hoffnungen, dieses Ziel zu erreichen, werden dabei
in die Detektion und Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) aus
dem Blut von Patienten gesetzt. Diese vom Tumor in die Blutbahn gestreuten
Zellen sind wohl für die Bildung von Fernmetastasen verantwortlich und damit
auch für einen großen Anteil der durch Krebserkrankungen verursachten
Todesfälle.
Durch die Detektion erhofft man sich, eine Metastasierung frühzeitig zu
erkennen bzw. durch die Anzahl der CTCs einen Parameter für die Prognose
und den Therapieverlauf zu gewinnen. Durch weitere Analysen auf zellulärer,
aber auch auf molekularer Ebene soll der Tumor näher charakterisiert werden.
Auf diese Weise erhofft man sich eine wenig invasive Alternative zur Biopsie.
Allerdings kommen CTCs nur in sehr geringen Zahlen im Blut vor und auch die
Menge
an
Probenmaterial
ist
begrenzt.
Daher
ist
es
eine
große
Herausforderung zuverlässige Methoden zu entwickeln, die diese raren Zellen
detektieren.
Unterschiedliche
Ansätze,
bei
denen
sich
Differenzen
im
Phänotyp
hämatopoetischer Zellen und Tumorzellen, die epithelialen Ursprungs sind,
zunutze gemacht wurden, sind beschrieben. Auch gibt es schon Studien, die
einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer bestimmten Anzahl CTCs
und einem schlechteren Progressionsfreien- und Gesamtüberleben zeigen.
Dennoch konnte dieser Parameter noch nicht in den klinischen Alltag
übernommen werden, da die Methoden in Spezifität und Sensitivität noch zu
unzuverlässig sind.
Ziel dieser Arbeit war eine Methode zu etablieren, um CTCs bei Patienten mit
noch nicht metastasiertem Tumor und hier besonders bei Patienten mit
Rektumkarzinom zu detektieren.
-1-
1.2 Methoden
Zur Anreicherung der CTCs wurde die negative Selektion gewählt, bei der die
Erythrozyten und Leukozyten entfernt werden und die Tumorzellen übrig
bleiben sollen. Die CTCs werden dann mit Hilfe bestimmter, für Zellen
epithelialen Ursprungs typischen Antikörper angefärbt.
Gezählt und analysiert wurden die gefärbten Zellen im Durchflusszytometer. Die
Auswertung fand mittels des Computerprogramms Kaluza statt. Untersucht
wurden die Tumorzelllinien SW480 und BxPC3. Diese wurden auch für
Verdünnungsreihen in das Blut von gesunden Probanden gemischt. Außerdem
wurden Zellkulturen von Punktaten von Krebspatienten auf das Vorhandensein
von Tumorzellen überprüft. Des Weiteren wurden Patienten mit überwiegend
metastasierten Tumorleiden unterschiedlicher Entität untersucht.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Bei der Färbung der Zelllinien SW480 und BxPC3 konnten diese als
Tumorzellen eindeutig identifiziert werden. Auch bei den Verdünnungsreihen
konnten die zugemischten Tumorzellen aus dem Blut gesunder Probanden
detektiert werden. Allerdings fiel auf, dass im Bereich niedriger Zellzahlen ein
Nachweis nicht mehr möglich war. Die Wiedererkennungsraten lagen zwischen
0,4% und 10%. Durch die Miteinbeziehung EpCAM positiver (+) Zytokeratin
negativer (-) und EpCAM- Zytokeratin+ Zellen in die Definition der Tumorzelle
konnten diese Raten zwar auf 0,6% bis 50% gesteigert werden, aber dennoch
liegen diese Werte in einem sehr niedrigen Bereich.
Aus den Zellkulturen der Punktate konnte der mikroskopische Verdacht, dass
es sich bei einer Zelllinie um Tumorzellen handelt, durch diese Methode
bestätigt werden.
CTCs im Blut von Krebspatienten mit metastasierter Krankheit konnten in einem
von 19 Fällen detektiert werden. Allerdings wurde auch bei einer von 14
gesunden Kontrollblutproben eine EpCAM+ Zytokeratin+ CD45- Zelle gefunden.
Ein durchschnittlicher Zellverlust von 73% konnte durch die Verwendung von
Micro-Beats quantifiziert werden. Durch nähere Analyse konnte festgellt
werden, dass dieser Zellverlust hauptsächlich durch die Erythrozyten-Lyse
-2-
zustande kommt. Problematisch waren auch hohe Zahlen besonders EpCAM+
Zellen in den Isotypkontrollen.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Das Ziel, eine Methode zur Detektion von CTCs zu etablieren, wurde nicht
erreicht. Zwar ist zu erkennen, dass der Ansatz richtig ist und durch ihn
grundsätzlich Tumorzellen erkannt und gezählt werden können, wie die
Versuche mit den Tumorzelllinien zeigen. Aber um die sehr wenigen Zellen im
Blut zu finden, ist die Methode zu ungenau. Auch trotz der Versuche, den
enormen Zellverlust zu minimieren, konnten bis dato keine wesentlichen
Verbesserungen erzielt werden. Damit ergab sich auch nicht die Möglichkeit,
Patienten mit nicht metastasierten Krebserkrankungen zu untersuchen.
Diese Arbeit konnte also die vielversprechenden Ergebnisse, die es im Bereich
der Detektion von CTCs gibt, nicht bestätigen, sondern zeigt eher die Probleme
auf, die noch überwunden werden müssen, bevor die CTCs eine Rolle im
klinischen Alltag spielen können.
-3-
2. Summary
2.1 Background and objective
The aim of personalized medicine in the treatment of cancer patients becomes
more and more important in the last years. To reach this, scientists set their
hope on the detection and characterization of circulating tumor cells (CTCs)
from blood of cancer patients. These cells spread from primary tumor into the
circulation arguably are in charge of building metastasis and so also of the
majority of deaths caused by cancer.
With the detection of CTCs there is the hope to recognize metastasis very early
and to gain with the number of CTCs a new parameter for prognosis and
therapy regime. By analyzing the cells in cellular and molecular plane the tumor
should be characterized further. So there will be potentially a less invasive
alternative to a normal biopsy, a so called fluid biopsy.
Indeed CTCs are very rare. Only a small number of cells exist in the
bloodstream and also the sample materials are limited. Therefore it is a big
challenge to develop a reliable method to detect these rare cells.
Different approaches are described yet. All of them use the phenotypical
difference between cells of hematopoetic origin and the tumor cells, which are
of epithelial origin. There are also studies which describe a correlation between
a certain number of CTCs found in the blood and a worse progression- free and
overall survival. Nevertheless this parameter could not been assumed into the
clinical practice, because yet the methods are too unreliable, in specificity as
well as in sensitivity.
Objective of this work was to establish a method and to detect CTCs from the
blood of non-metastatic cancer patients especially from patients with colorectal
cancer.
2.2 Methods
For the enrichment of CTCs were used the method of negative selection. Here
the erythrocytes and leukocytes were detached and the tumor cells should
remain. Then the CTCs were stained by special antibodies typical for cells of
epithelial origin.
-4-
Counted and measured were the cells by means of Flow Cytometry. The
analysis was done with the computer program Kaluza.
The tumor cell lines SW480 and BxPC3 were inquired. These were also used
for spiking experiments in which the tumor cells were spiked into the blood of
healthy subjects.
Moreover cells of aspirates were cultured and then checked being tumor cells.
Furthermore blood of cancer patients with metastatic tumors was inquired.
2.3 Results and observations
The stained tumor cells of the cell lines SW480 and BxPC3 could be identified
definitely. Also the spiked tumor cells could be detected from blood of healthy
subjects. Though it was observed that in fields of small numbers of cells the
detection was not able. With higher numbers of cells there was a big loss of
cells visible. The recovery rate ranges between 0,4% and 10% , which could be
increased by including EpCAM+ Cytoceratin- and EpCAM- Cytoceratin+ cells to
0,6% -50%.
In the cell cultures of aspirates were cells which looked like tumor cells under
microscope. By staining these cells we could confirm this suspicion.
In the blood of patients with metastatic cancer diseases one CTC could be
detected in one of 19 samples. But also in one of 14 healthy subjects could be
identified one EpCAM+ Zytokeratin+ CD45- cell.
A high loss of cells in average of 73% was evaluated by using Micro- Beats. By
specified analysis could be determined that the majority of this loss caused of
the erythrocytes lysis.
Moreover there were problems with high numbers of false positive results in the
isotype.
2.4 Conclusion
The objective to establish a method for the detection of CTCs could not be
reached. Indeed it can be seen that the approach is the right one and that in
generally it is possible to detect and to count tumor cells, which show the
experiments with the cultured tumor cells and the spiking experiments. But for
-5-
detection of the very rare cells in the blood of cancer patients the method is too
unreliable yet.
Although the tries to minimize the loss of cells no critical improvements could be
reached. Thereby there was not the possibility to inquire the blood of patients
with non-metastatic cancer diseases.
So this work could not confirm the already existing promising results in this field
of investigation. Rather these experiments show the problems which still have
to be bear down before CTCs can play a role in clinical practice.
-6-
3. Einleitung
Krebserkrankungen sind nach Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste
Todesursache in Deutschland. Laut Statistischem Bundesamt für Gesundheit
starben im Jahr 2013 223`842 Menschen auf Grund einer Krebserkrankung.
(DESTATIS, statistisches Bundesamt)
Daher wird versucht durch neue Substanzen, veränderte Schemata oder
Kombinationen
aus
den
Hauptbehandlungsmöglichkeiten
-
Operation,
medikamentöse Therapie und Strahlentherapie - ein besseres Outcome zu
erzielen.
Die Studien, die dazu gemacht werden, vergleichen meist eine Gruppe, die sich
nach dem derzeit aktuell üblichen Therapieschema behandeln lässt und eine
Gruppe, bei der eine neue Komponente oder eine zusätzliche Therapieoption
eingesetzt wird, was häufig zu einer insgesamt aggressiveren Therapie führt.
Auch wenn bei der Versuchsgruppe zusätzliche Personen profitieren, darf nicht
vergessen werden, dass viele auch umsonst therapiert werden, da sie auch
ohne oder mit der „alten“ oder weniger aggressiven Therapie das gleiche
Outcome erreicht hätten. Daher gilt es nun, die Patienten mit einem erhöhten
Risiko für einen schlechten Krankheitsverlauf frühzeitig zu erkennen und von
denen mit besserer Prognose zu trennen, um so eine möglichst optimale
individuelle Therapie durchführen zu können.
Ein Ansatz könnte dabei sein, eine Methode zu finden, um zirkulierende
Tumorzellen im Blut der Patienten zu detektieren, bevor diese in der Bildgebung
sichtbare Metastasen bilden. Bei diesen Patienten könnte dann eventuell durch
gezielte Therapie eine Metastasierung verhindert werden.
3.1 Metastasierung und zirkulierende Tumorzellen
Krebs kann in allen Geweben epithelialen Ursprungs entstehen, wobei die
Karzinogenese sehr ähnlich ist und in drei Hauptschritte unterteilt werden kann:
erstens die Veränderung von normalem in hyperplastisches Gewebe, zweitens
die Entstehung eines in situ Karzinoms und drittens die Invasion in umliegendes
Gewebe und die Metastasierung. (Man et al. 2013)
-7-
Unter Metastasierung versteht man die Fähigkeit eines malignen Tumors, in
anderen Organen Sekundärtumore (Metastasen) zu bilden. Diese Fähigkeit
macht auch die Malignität von Krebs aus, denn ca. 90% der Krebsmortalität
sind durch die Bildung von Metastasen bedingt. (Gupta et al. 2006)
Man geht davon aus, dass sich Tumorzellen mit bestimmten Eigenschaften vom
Primärtumor lösen, ins Lymph- oder Blutgefäßsystem gelangen und sich dann
in anderen Organen absiedeln und neue Tumore bilden. Dabei werden folgende
Schritte durchlaufen: Entwicklung einer metastasierungsfähigen Krebszelle,
invasives Wachstum in die Umgebung, Vaskularisation des Primärtumors,
Intravasation
und
Transport,
und
Extravasation
und
Kolonisation
des
Zielorgans.
Entwicklung einer metastasierungsfähigen Krebszelle
Auf dem Weg in ein anderes Organ muss eine Tumorzelle viele Hindernisse
überwinden, die unser Organismus als Schutz aufgebaut hat. Dieses
Schutzsystem befindet sich sowohl innerhalb der Zelle als auch außerhalb in
deren Umgebung. Zu den intrinsischen Schutzmechanismen gehören unter
anderem der Apoptose-Signalweg, die Telomerverkürzung und die Expression
von wachstumshemmenden Faktoren.
Zu den extrinsischen Faktoren, die eine Progression des Tumors verhindern
können, zählen Komponenten der extrazellulären Matrix, die Basalmembran,
reaktiver Sauerstoff, die begrenzte Verfügbarkeit von Nährstoffen und
Sauerstoff und die Abwehr durch das Immunsystem.
Diese Barrieren werden wohl durch genomische Instabilität überwunden, die
durch DNA-Mutationen, chromosomale Neuordnungen und epigenetische
Veränderungen hervorgerufen wird. Denn es besteht ein Zusammenhang
zwischen Metastasierung und genetischer Instabilität. Dies belegt eine Studie,
in der Tumorzelllinien mit einer hohen Metastasierungsrate eine größere
genetische Instabilität aufweisen als nicht metastasierende Zelllinien desselben
Tumors. (Fidler et al. 2003, Cifone et al. 1981)
Dies führt zu der Annahme, dass sich metastasierungsfähige Tumorzellen
durch Selektion ähnlich eines evolutionären Prozesses entwickeln, wobei die
Heterogenität aus der genomischen Instabilität, und der Selektionsdruck aus
-8-
vielschichtigen
intrinsischen
und
extrinsischen
tumorsupprimierenden
Mechanismen besteht. (Gupta et al. 2006)
Invasives Wachstum
Um in ein anderes Organ zu gelangen, müssen Tumorzellen außerdem in der
Lage sein, invasiv in die Umgebung zu wachsen und somit auch die
Basalmembran, die das Epithel vom umliegenden Bindegewebe trennt, zu
durchbrechen.
Eine Voraussetzung dafür sind geringere interzelluläre Adhäsionskräfte. Diese
werden durch Veränderungen in Komponenten von Bindungsproteinen wie
Cadherine und Integrine verursacht. In vielen Fällen ist dafür der Verlust von ECadherin-vermittelten
Verbindungen
verantwortlich.
Mechanismen
wie
inaktivierende Mutationen, proteolytische Spaltung durch Metalloproteasen,
proteosomaler Abbau und Downregulation auf transkriptioneller Ebene konnten
bereits als Ursache für diesen Verlust nachgewiesen werden. (Cavallaro et al.
2004)
Nachdem sich nun die Tumorzellen aus dem Zellverbund lösen können,
müssen sie eine gewisse Motilität erlangen, um von einem Ort zum anderen
gelangen zu können. Dabei können sie als Zellverband oder als einzelne Zelle
ins Gewebe wandern. Grundsätzliche Mechanismen der einzelnen Zellen sind
die mesenchymale Invasion und die amöboide Invasion. Der mesenchymalen
Invasion geht eine Umwandlung der epithelialen Zelle voraus, die sogenannte
epitheliale-mesenchymale Transition. Die Zellen entwickeln hierbei eine
spindelförmige Gestalt mit einem oder mehreren Pseudopodien. Die Bewegung
wird durch diese Aktin-reichen Pseudopodien initiiert. (Brabek et al. 2010)
Bei der amöboiden Invasion sind die Zellen dagegen rundlich geformt und die
Bewegung entsteht durch Kontraktion und Ausdehnung des Zellkörpers, die
durch Aktin-Myosin Interaktionen ausgelöst werden. (Brabek et al. 2010)
Um nun ins Gewebe eindringen zu können, muss die Basalmembran
durchbrochen werden, die im Anfangsstadium von Tumoren die transformierten
Zellen noch daran hindert, ins darunter liegende Stroma zu gelangen. Zur
Durchbrechung dieses festen Netzwerks müssen Tumorzellen in der Lage sein,
dieses proteolytisch zu spalten. Dazu werden verschiedene Mechanismen
verwendet, um die streng kontrollierte Aktivität von extrazellulären Matrix-
-9-
Proteasen zu durchbrechen und gegen die Basalmembran zu nutzen, sodass
diese von den Tumorzellen durchdrungen werden kann. (Gupta et al. 2006)
Vaskularisation des Primärtumors
Im
umgebenden
Gewebe
angekommen
benötigen
die
Tumorzellen
Transportmittel, um in weitere, entfernte Organe zu gelangen. Als solche dienen
Lymph- und vor allem Blutgefäße, die Anschluss an den Primärtumor gefunden
haben. Diese Vaskularisation des Tumors nennt man „angiogenic switch“. Sie
ist notwendig, um den Nähr- und Sauerstoffbedarf des Tumors bei weiterem
Wachstum zu decken. Ab einer bestimmten Größe reicht die Versorgung mittels
Diffusion über bereits vorhandene Gefäße nicht mehr aus.
Hervorgerufen wird die Neubildung und Aussprossung neuer Gefäße durch die
Veränderung des Gleichgewichts zwischen Faktoren, die die Angiogenese
fördern bzw. hemmen. (Baeriswyl et al. 2009)
Dabei kann die Expression von Angiogenese steigernden Faktoren sowohl
durch Stressoren wie Hypoxie, Glukose- oder Eisenmangel, Bildung von
reaktivem Sauerstoff oder Azidose, als auch durch die Aktivierung von
Onkogenen bzw. die Deaktivierung von Tumorsuppressorgenen begünstigt
werden. Solche Vorgänge finden in den Tumorzellen selbst, aber auch in den
Tumor-infiltrierenden Entzündungszellen statt. (Baeriswyl et al. 2009)
Intravasation und Transport
Im nächsten Schritt müssen die Tumorzellen ins Gefäßsystem gelangen. Dies
wird
dadurch
erleichtert,
dass Tumorgefäße
nicht
normalen
Gefäßen
entsprechen, sondern eine erhöhte Permeabilität besitzen. Bei der Frage, auf
welche Weise die Intravasation stattfindet, gibt es sowohl Hinweise auf passive
als auch auf aktive Mechanismen. (Spano et al.2012)
Im Blutsystem angekommen können die Tumorzellen durch Zirkulation
theoretisch jedes Organ erreichen. Allerdings überlebt nur ein sehr kleiner Teil
der
zirkulierenden
Abwehrmechanismen
Tumorzellen
des
im
Blut.
Immunsystems
Diese
als
müssen
auch
sowohl
den
hämodynamischen
Scherkräften wiederstehen.
Hier spielen die Thrombozyten eine wichtige Rolle. Denn an Tumorzellen
gebunden dienen sie diesen als Schutzschild gegen natürliche Killerzellen.
- 10 -
Außerdem begünstigen die Thrombozyten wahrscheinlich auch die Adhäsion an
die Gefäßwand und ermöglichen durch Sekretion von Stoffen wie VEGF
(Vascular Endothelial Growth Factor), die die Gefäßwand durchlässiger
machen, die Extravasation. (Konstantopoulos et al. 2009)
Ein weiterer Mechanismus der Tumorzellen im Blut zu überleben ist, dem
programmierten Zelltod zu entgehen. Dieser wird durch den Verlust von ZellMatrix-Kontakt induziert (Anoikis). Diese Fähigkeit wurde bei Zellen, die den
neutrotrophen Tyrosinkinase Rezeptor exprimieren, beobachtet. (Douma et al.
2004)
Extravasation und Kolonisation des Zielorgans
Für die überlebenden zirkulierenden Tumorzellen gilt es nun in ihr Zielorgan zu
gelangen. Dies funktioniert nicht nach dem Zufallsprinzip, sondern jedem
Tumortyp kann ein spezifisches Metastasierungsmuster zugeordnet werden.
Dies postulierte schon 1889 Stephen Paget in seiner „seed and soil“ Theorie,
die besagt, dass disseminierte Tumorzellen (seeds) nur Organe besiedeln
können, deren Mikroumfeld (soil) für ihr Wachstumsverhalten förderlich ist.
(Gupta et al. 2006)
Um in ein Organ zu gelangen, müssen die Zellen als erstes das Gefäßsystem
verlassen. Dieser Schritt der so genannten Extravasation ist in den Kapillaren
von Leber und Knochenmark einfach, da diese fenestriert sind. Die Kapillaren
von Lunge und Gehirn dagegen sind nicht durchlässig. Um diese Organe
infiltrieren zu können, müssen die Zellen in der Lage sein, spezielle Faktoren
zur Extravasation zu exprimieren. (Irmisch et al. 2013)
Um nun aber das Organ besiedeln und Makrometastasen bilden zu können,
muss die Interaktion zwischen Krebszelle und fremdem Mikroumfeld stimmen.
Hier erleichtert ein für die Metastasierung vorbereitetes Gewebe die Invasion,
das Überleben und die Proliferation der infiltirierenden Tumorzellen. Diese so
genannte praemetastatische Nische entsteht durch systemische Signale, die
vom Primärtumor stammen.
Um weiterwachsen und Makrometastasen bilden zu können, müssen
Tumorzellen mit dem organspezifischen Mikroumfeld interagieren können. Da
unterschiedliche Organe unterschiedliche Anforderungen an die Krebszelle
stellen, gibt es je nach Organ spezifische Mechanismen, die den letzten Schritt
- 11 -
in der Metastasierung, die Bildung einer Makrometastase, ermöglichen. (Gupta
et al.2006)
Vor dem Hintergrund der Genese von Metastasen lässt sich schlussfolgern,
dass die Detektion von CTCs mittels einer Blutentnahme beim Patienten die
einfachste und am wenigsten invasive Methode darstellt, um abzuschätzen, ob
eine systemische Ausbreitung der Krankheit bereits erfolgt ist und somit eine
schlechtere Prognose bzw. erhöhtes Risiko für den Patienten besteht.
Voraussetzung dafür ist aber eine Methode, die es ermöglicht, zirkulierende
Tumorzellen aus dem Blut von Patienten zu detektieren. Ziel dieser Arbeit war
es, eine solche Methode zu erproben.
- 12 -
4. Material und Methoden
4.1 Prinzip
Zur Detektion der zirkulierenden Tumorzellen macht man sich Unterschiede im
Phänotyp
zwischen
den
Zellen
epithelialen
Ursprungs
und
den
hämatopoetischen Zellen zu nutze. Einer dieser Unterschiede, welcher in dieser
Arbeit verwendet wurde, liegt in der Antigenexpression.
So exprimieren zirkulierende Tumorzellen epitheliale Antigene. Die am
häufigsten verwendeten sind epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) und die
Zytokeratine (CK) 7, 8, 18, 19 und 20.
EpCAM ist ein Adhäsionsmolekül, das eine Rolle bei der Signalübertragung,
Zellmigration, Differenzierung, Proliferation und Adhäsion spielt. Bei einer
Vielzahl von Tumoren ist EpCAM über exprimiert. Es kommt aber auch
physiologisch bei Embryonalzellen und einfachen normalen Epithelzellen vor.
(Trzpis et al. 2007)
Zytokeratine gehören zu den Intermediärfilamenten, bilden das Zytoskelett und
sind somit im Inneren der Zelle lokalisiert. Je nach Tumortyp werden
verschiedene Zytokeratine besonders häufig exprimiert.
Im Gegenzug kann auch das von Leukozyten, aber nicht von Tumorzellen
exprimierte CD45 verwendet werden, um diese voneinander zu trennen. CD45
ist ein Oberflächenrezeptor, der auf nahezu allen Zellen hämatopoetischen
Ursprungs außer reifen Erythrozyten und Thrombozyten vorkommt und daher
auch „leukocyte common antigen“ genannt wird. Eine wichtige Rolle spielt es
bei der Antigen- vermittelten Aktivierung von T -Lymphozyten. (Trowbridge et al.
1994)
Da im Vergleich zu den Blutzellen die Anzahl der zirkulierenden Tumorzellen
sehr gering ist, 1 Zelle auf 5x109 Erythrozyten und 107 Leukozyten pro Milliliter
Blut, müssen diese erst isoliert und angereichert werden. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde hierzu das Prinzip der negativen Selektion verwendet. Bei dieser
Methode werden zuerst möglichst alle Blutzellen entfernt, um dann die übrig
gebliebenen Zellen näher analysieren zu können. Dies erfolgt mittels einer
Färbung mit spezifischen Antikörpern und der Messung der Zellen im
Durchflusszytometer.
- 13 -
4.2 Vorbereitung Zellkultur
Um die Methode und das Material zu testen, wurde nicht sofort Patientenblut
verwendet, sondern erst Krebszellen aus einer Kultur. Dazu dienten die
Zelllinien BxPC3 und SW480. Die Zellen der Zelllinie BxPC3 stammen von
einem Pankreaskarzinom, die der Zelllinie SW480 von einem Rektumkarzinom.
Des Weiteren wurden Zellen untersucht, die von Pleura- und Aszites Punktaten
stammten. Um die angewachsenen Zellen zu lösen und zu vereinzeln, wurden
folgende Schritte durchgeführt:
Das Nährmedium (siehe Tabelle 1) aus der Zellkulturflasche wird abgesaugt
und die Flasche wird mit ca. 10ml PBS ausgewaschen. Danach werden die am
Boden festgewachsenen Zellen mit 2ml Trypsin benetzt und für 2 Minuten in
den Brutschrank bei 37°C gestellt. Zur Kontrolle, ob sich die Zellen abgelöst
haben, werden diese nach den 2 Minuten unter dem Mikroskop betrachtet. Sind
sie gelöst, wird die Reaktion durch Zugabe von 10ml Nährmedium gestoppt. Die
Zellen werden dann durch mehrfaches Ansaugen und Zurückspülen vereinzelt.
Die nun entstandene Zellsuspension wird in 50ml Zentrifugenröhrchen gegeben
und bei 173g und 20°C für 8 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird
verworfen und die Zellen mit 10ml Medium resuspendiert. Danach werden die
Zellen gezählt und die gewünschte Zellzahl in FACS Röhrchen pipettiert. Dazu
werden 4ml PBS+ (siehe Tabelle 1) gegeben, welches im nächsten Schritt bei
300g und 4°C für 8 Minuten abzentrifugiert wird. Der Überstand wird wieder
verworfen und das Pellet nach dem Vortexen in 100µl Staining buffer
resuspendiert. Danach sind die Zellen bereit für die Färbung. Pro Versuch
müssen dabei immer zwei FACS Röhrchen vorbereitet werden; eines für den
Versuch und eines für den Isotyp.
PBS+
2,5g BSA+ 50ml 1xPBS
Nährmedium
500ml RPMI Medium + 50ml FCS FB
Superior + 10ml Glutamin+ 5ml Pen Strep
Tab. 1: Übersicht verwendete Lösungen und Medien für Zellkultur
- 14 -
4.3 Vorbereitung Blut
4.3.1 Blutentnahme
Zur Detektion der Tumorzellen aus dem Blut wurde venöses Blut von
Krebspatienten verschiedener Tumorentitäten (siehe Tabelle 2) und von
gesunden Kontrollpersonen verwendet. Die Einwilligung der Patienten und
Kontrollpersonen wurde vorher eingeholt.
Patient
Geschlecht
Alter
Diagnose
CTC1
m
56
Lokalrezidiv
Rektumkarzinoms
Stadium
(wenn
Angabe vorhanden)
eines Initial:
pT2 pN1 M0
CTC2
w
74
CTC4
m
58
V.a. Bronchialkarzinom mit
Nebennierenmetastase u.
ossären Metastasen
Analkarzinom
pT2 NX MX G1
CTC5
m
62
Rektumkarzinom
CTC6
m
51
CTC8
m
81
CTC9
m
44
Rektumkarzinom , 10cm cT3 CN0 M0 G2
ab Anokutanlinie
Prostatakarzinom
Intra-, supra-, paraselläre
in den Sinus cavernosus
u. Clivus infiltrierende
Metastasen
Bronchialkarzinom
M1 (cer, oss,
CTC10
m
43
CTC11
m
63
CTC14
w
64
CTC15
m
52
CTC17
w
70
CTC18
w
90
CTC19
w
hep)
Rezidiv Urothelkarzinom Initial: pT3b pN0
nach Neoblasenanlage
L0 V0 R0 G2-3
Klarzelliges
M1
Nierenzellkarzinom
Kleinzelliges
Bronchialkarzinom
Kleinzelliges
Bronchialkarzinom
Kleinzelliges
Bronchialkarzinom
Eosinophil granuläres und
fokal
papilläres
Schilddrüsenkarzinom
Mammakarzinom
Tab. 2: Übersicht untersuchte Patienten
- 15 -
T3/4 N3 M1b
cT3 cN2 cM1b
cT3 N+ M1 (cer)
pT1 pNX cM1
M1
Da wie oben beschrieben das Oberflächenantigen EpCAM nicht nur auf
Tumorzellen
exprimiert
wird,
sondern
auch
auf
einfachen
normalen
Epithelzellen, d.h. auch auf Zellen der Haut, wurde bei der Blutentnahme das
erste Röhrchen verworfen. Dadurch sollte eine Kontamination des Blutes mit
EpCAM positiven Epithelzellen der Haut verhindert werden. Pro Patient bzw.
Kontrollperson wurden 9 bzw. 18ml Blut entnommen, wobei zur Antikoagulation
Heparin verwendet wurde. Das Blut wurde dann gekühlt und innerhalb der
nächsten vier Stunden weiterverarbeitet.
4.3.2 Erythrozyten-Lyse
Als erster Schritt muss das Blut von Erythrozyten befreit werden, was durch die
Lyse der Erythrozyten geschieht. Je 7,5ml Blut werden in ein 50ml
Zentrifugenröhrchen gegeben. Dazu kommen 45ml 1x Erythrozyten-Lyse
Buffer. (Siehe Tabelle 3)
Um später sehen zu können, wie viele Zellen bei den kommenden Schritten
verloren gehen, wird eine definierte Anzahl an fluoreszierenden Micro-Beats
zugegeben. Diese haben bei der Zentrifugation Eigenschaften wie Zellen,
interagieren aber nicht mit diesen und können am Ende im Durchflusszytometer
identifiziert, gemessen und gezählt werden. Je nach Verlust der Anzahl der
Micro-Beats kann auf den Zellverlust geschlossen werden. Pro 7,5ml Blut
werden hier 30µl Flow Count Fluorospheres dazugegeben. Dies entspricht
29.880 Micro-Beats. Die Micro-Beats wurden allerdings nicht von Anfang an,
sondern erst im Verlauf der Versuche eingesetzt.
Dieses Gemisch wird 5x invertiert, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert
und währenddessen immer wieder invertiert. Hierauf erfolgt eine Zentrifugation
bei 300g und 4°C für 8 Minuten. Der Überstand wird abgesaugt bzw.
abgeschüttet und das Pellet mit 50ml PBS+ + 2mM EDTA (siehe Tabelle 3)
resuspendiert
um die übrigen Erythrozyten heraus zu waschen. Die
Suspension wird erneut bei 300g und 4°C für 8 Minuten zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Nun sollte das Zellpellet weiß sein. Um dies zu erreichen,
müssen all diese Schritte einmal wiederholt werden.
- 16 -
Das weiße Zellpellet wird nun in vorher mit PBS+ beschichtete 5ml FACS
Röhrchen überführt. Dazu wird das Zellpellet in dem Zentrifugenröhrchen mit
4x1ml Staining Buffer (siehe Tabelle 3) ausgewaschen.
Die Suspension in den FACS Röhrchen wird wieder bei 300g und 4°C für 8
Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 1ml
Staining Buffer resuspendiert, wobei die Zellen durch mehrfaches Auf- und
Abpipettieren vereinzelt werden sollen, um so bereit zu sein für den nächsten
Schritt, die CD45-Depletion.
10x
Buffer
Erythrozyten-Lyse
41,3g NH4Cl+ 5,0g KHCO3+ 0,5ml 0,5M
EDTA+ 500ml destilliertes Wasser
1x Erythrozyten-Lyse Buffer
PBS+ 2mM EDTA
50ml 10x Erythrozyten-Lyse Buffer+ 450ml
destilliertes Wasser
2,5g BSA+ 50ml 1xPBS+ 200µl 0,5M EDTA
Staining Buffer
0,25g BSA+ 50ml 1xPBS+ 200µl 0,5M EDTA
0,5M EDTA
18, 61g EDTA +100ml destilliertes Wasser
Tab. 3: Übersicht verwendete Lösungen für Erythrozyten-Lyse
4.3.3 CD45-Depletion
Im nächsten Schritt werden die Leukozyten entfernt, so dass danach möglichst
nur noch die Tumorzellen übrig bleiben. Dieses Prinzip wird auch negative
Selektion genannt. Hierzu wurde ein System von STEMCELL verwendet, das
sich EasySep CD45-Depletion Kit nennt.
Zu der Suspension aus Zellen und Staining Buffer wird 50µl EasySep CD45
antibody cocktail dazu gegeben und zwei Mal auf- und ab pipettiert. In diesem
cocktail befinden sich tetramerische Antikörperkomplexe, die sowohl gegen
CD45, als auch gegen Dextran- beschichtete magnetische Partikel gerichtet
sind. Die gegen CD45 gerichtete Komponente soll an dieses von den
Leukozyten exprimierte Antigen binden. Um dies zu ermöglichen, folgt eine
Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach werden 100µl magnetic
Micro-Beads dazu pipettiert. Dies sind mit Dextran beschichtete magnetische
Partikel, die an die zweite Komponente des Antikörper Komplexes binden. Dazu
- 17 -
muss eine Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten eingehalten werden.
Danach wird der Inhalt mit 1,5ml Staining Buffer aufgefüllt und durch
dreimaliges Auf- und Abpipettieren durchmischt.
Nun wird das FACS Röhrchen für 10 Minuten in den EasySep Purple Magneten
gestellt. In dieser Zeit werden die CD45 exprimierenden Zellen, die an die
magnetischen Partikeln gebunden sind, in Richtung des Magneten zur
Röhrchenwand gezogen, während die nicht magnetisch markierten Zellen in der
Suspension bleiben.
Der Überstand mit den gelösten Zellen wird mit einer Pasteur Pipette abgesaugt
und in ein neues FACS Röhrchen gegeben, während die Zellen mit CD45
Antigen, also die Leukozyten, in dem Röhrchen im Magnet bleiben. Zu Beginn
der Versuche wurde hier die von Leukozyten befreite Fraktion auf zwei FACS
Röhrchen aufgeteilt; eines für die Färbung mit spezifischen Antikörpern und
eines für die Färbung mit dem jeweiligen Isotypantikörper. Im weiteren Verlauf
fand die Trennung von Beginn an statt, um die Zellzahl zu erhöhen. Mit den
gelösten Zellen, unter denen sich auch die zirkulierenden Tumorzellen
befinden, kann nun weitergearbeitet werden.
Der Staining Buffer, in dem die Zellen gelöst sind, wird bei 300g und 4°C für 8
Minuten abzentrifugiert. Danach wird das Pellet mit 100µl Staining Buffer
resuspendiert, wobei mehrmals auf- und abpipettiert wird, um die Zellen wieder
zu vereinzeln. Nun sind die Zellen vorbereitet für die Antikörperfärbung.
4.4 Antikörper-Färbung
Bei diesem Schritt wird jeweils ein Teil der Zellen mit den für Tumorzellen
spezifischen Antikörpern gegen EpCAM und Zytokeratin gefärbt und ein Teil mit
unspezifischen Antikörpern. Dieser bildet die so genannte Isotypkontrolle.
Alle Zellen werden mit Antikörpern gegen CD45 und Höchst 33342 gefärbt.
(Siehe Tabelle 4)
- 18 -
4.4.1 Antikörper und Farbstoffe
EpCAM-Färbung
Wie oben beschrieben ist EpCAM ein Oberflächenantigen, das von Tumorzellen
exprimiert wird.
Um diese sichtbar zu machen, werden sie mit Antikörpern gegen EpCAM, die
an Farbstoffe gekoppelt sind, gefärbt.
Diese Antikörper sind monoklonale Antikörper des Typs IgG und stammen von
der Maus. Als daran gekoppelte Farbstoffe werden im Verlauf der Versuche
zwei unterschiedliche verwendet. Der am häufigsten eingesetzte Farbstoff ist
Fluoresceinisothiocyanat
(FITC).
FITC
ist
ein
Fluorochrom
dessen
Absorptionsmaximum bei 494nm und das Emissionsmaximum bei 520nm liegt.
Das heißt, mit blauem Licht (496nm) angeregt wird grünes Licht (520-530nm)
emittiert.
Der zweite hier eingesetzte Farbstoff ist Allophycocyanin (APC). APC ist auch
ein Fluorochrom mit einem Absorptionsmaximum von 650nm und einem
Emissionsmaximum von 660nm. (BD Biosciences Absorption and Emission
Spectra)
Zytokeratin-Färbung
Zur Färbung der Zytokeratine werden Antikörper, die gegen die Zytokeratine 7
und 8 gerichtet sind, verwendet. Auch hier wechselten im Verlauf der Versuche
die daran gekoppelten Farbstoffe. Der eine Farbstoff ist das oben beschriebene
FITC. Der andere Farbstoff ist R-phycoerythrin (PE), ein in roten Algen
vorkommendes Pigment, dessen Absorptionsmaximum bei 496nm, das
Emissionsmaximum bei 578nm liegt. (BD Biosciences Absorption and Emission
Spectra)
CD 45-Färbung
Um noch vorhandene Leukozyten, die trotz CD45- Depletion übrig geblieben
sind, von den Tumorzellen unterscheiden zu können, wurden diese mit Hilfe
von Antikörpern gegen CD45 angefärbt. Die daran gekoppelten Farbstoffe
waren zu Beginn der Versuche V450 und Pacific Blue und später APC-Cy7.
V450 ist ein Cumarin Farbstoff mit ähnlichen Eigenschaften wie Pacific blue.
Sein Absorptionsmaximum liegt bei 404nm und sein Emissionsmaximum bei
- 19 -
448nm.
Pacific
Blue
basiert
auf
dem
Flurorochrom
6,8-
difluoro-7-
hydroxycoumarin. Es besitzt ein Absorptionsmaximum von 401nm und ein
Emissionsmaximum von 452nm.
APC-Cy7 ist eine Kombination aus APC und einem Cyanin Farbstoff (Cy7) mit
einem Absorptionsmaximum von 650nm und einem Emissionsmaximum von
785nm. (BD Biosciences Absorption and Emission Spectra)
Höchst- Färbung
Um sicher zu gehen, dass die angefärbten Elemente auch Zellen sind, wurde
eine DNA Färbung mit Höchst 33342 durchgeführt. Höchst 33342 ist ein bisbenzimid, das sich an die DNA anlagert. Der Fluoreszenzfarbstoff hat sein
Absorptionsmaximum bei 350nm und sein Emissionsmaximum bei 460nm.
4.4.2 Isotypkontrolle
Durch die Isotypenkontrolle kann das Ausmaß der unspezifischen Bindung von
Antikörpern an die Zellen und der dadurch entstehenden Hintergrundsignale
abgeschätzt werden. Dazu werden Antikörper verwendet, die vom Typ denen
der spezifischen Antikörper (Primärantikörper) entsprechen, aber unbekannter
Spezifität bzw. gegen ein Antigen gerichtet sind, das nicht auf den zu
untersuchenden Zellen exprimiert wird.
Auch diese Antikörper sind an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt. Dabei ist
wichtig, dass der Farbstoff exakt dem des an den Primärantikörper gekoppelten
entspricht. Hier werden also Isotypenantikörper gekoppelt an FITC bzw. APC
zur Kontrolle der EpCAM-Färbung und PE bzw. FITC zur Kontrolle der
Zytokeratin-Färbung verwendet.
Alle Antikörper und auch Höchst 33342 werden im Kühlschrank aufbewahrt.
- 20 -
Marker
Farbstoffe
Firma
Isotyp
EpCAM
FITC
BD
Maus IgG1λ
EpCAM
APC
BD
Maus IgG1λ
Zytokeratin
FITC
BD
Maus IgG2aκ
Zytokeratin
PE
BD
Maus IgG2aκ
CD45
Pacific blue
ExBio
Maus IgG1
CD45
V450
BD
Maus IgG1κ
CD45
APC-Cy7
BD
Maus IgG1κ
Tab. 4: Übersicht verwendete Antikörper
4.4.3 Durchführung
Die nach der CD45-Depletion in zwei FACS Röhrchen (ein Versuchsröhrchen
und ein Isotyp-Röhrchen) aufgeteilten Zellen sind in 100µl Staining Buffer (siehe
Tabelle 5) gelöst.
In das Versuchsröhrchen werden 5µl Anti-EpCAM APC bzw. 20µl Anti-EpCAM
FITC gegeben und mehrfach auf- und abpipettiert. Des Weiteren kommen in
dieses Röhrchen 4µl Anti-CD45 Pacific Blue bzw. 5µl Anti-CD45 APC-Cy7.
In das Isotyp-Röhrchen werden die entsprechenden Isotypantikörper pipettiert:
1µl Iso APC bzw. 20µl Iso FITC Antikörper und 4µl Iso Pacific Blue bzw. 5µl Iso
APC-Cy7 Antikörper. Danach muss eine Inkubationszeit von 15 Minuten im
Dunkeln und bei 4°C eingehalten werden.
Nach dem Inkubieren werden je 4ml PBS zugegeben und dann bei 300g und
4°C für 8 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wird abgeschüttet bzw.
abgesaugt und das Pellet durch Vortexen in 100µl Buffer A (Fixation
Buffer)(siehe Tabelle 5) resuspendiert. Diese Lösung muss wiederum 15
Minuten bei 4°C und Dunkelheit inkubieren. Danach wird wieder mit 4ml PBS
gewaschen und bei 300g und 4°C für 8 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wird verworfen und das Pelett mittels Vortexen und der Zugabe von 100µl
Buffer B (Permeabilization Buffer) (siehe Tabelle 5) resuspendiert.
Der Buffer B dient dazu, die Zellmembran durchlässiger zu machen, da die
Antigene, die nun angefärbt werden sollen im Innern der Zelle liegen.
- 21 -
Zu dieser Suspension wird nun ins Versuchsröhrchen durch mehrfaches Aufund Abpipettieren folgendes gegeben: 20µl Anti-Zytokeratin FITC bzw. 20µl
Anti-Z
Zytokeratin PE, sowie 2µl Höchst 33342.
In das Isotyp-Röhrchen kommen 5µl Iso FITC bzw. 20µl Iso PE und 2µl Höchst
33342. Höchst 33342 wurde allerdings nicht von Anfang an, sondern erst im
Verlauf eingesetzt. Um eine Bindung der Antikörper an die Antigene zu
gewährleisten, muss eine Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4°C und
Dunkelheit eingehalten werden. Danach wird wieder je 4ml PBS zugegeben
und bei 300g und 4°C für 8 Minuten abzentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und die Zellen in 200µl PBS resuspendiert. Um
die Zellen zu vereinzeln, wird das Pelett gevortext und das zugegebene PBS
mehrfach auf- und abpipettiert. Nach diesem Schritt erfolgt die Messung im
Durchflusszytometer, in dem die Zellen gezählt werden.
Buffer A
FIX & PERM ® Fixation Medium von ADG
Buffer B
FIX & PERM ® Permeabilization Medium von ADG
Staining Buffer
0,25g BSA+ 50ml 1xPBS+ 200µl 0,5M EDTA
Tab. 5: Übersicht verwendete Lösungen Antikörper-Färbung
4.5 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie dient der Zellzählung und der Charakterisierung der
Zellen nach bestimmten Eigenschaften. Die Zellen werden von dem Gerät
aufgesaugt und dann einzeln an einem Laserstrahl vorbei geführt. Dabei
entstehen Streulicht und Fluoreszenzemissionen, die von entsprechenden
Detektoren aufgefangen und ausgewertet werden. Diese Signale unterscheiden
sich in Abhängigkeit von Größe, Struktur und inneren Bestandteilen der Zelle,
sowie der spezifischen Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen.
Mittels des Vorwärtsstreulichts (forward scatter) in einem Winkel zwischen 3°
und 10° gestreutes Licht können Rückschlüsse auf die Größe der Zellen
gezogen werden. Das Seitwärtsstreulicht (sideward scatter) ist um circa 90°
- 22 -
reflektiertes Licht, das Auskunft über die Struktur der Zelle und die inneren
Bestandteile, wie z.B. die Granularität, gibt.
Auch die Fluoreszenzfarbstoffe werden durch diesen Laser erregt und senden
Licht in dem jeweils für den Farbstoff spezifischen Wellenlängenbereich aus.
Diese Signale werden durch Teilerspiegel und farbselektive Bandpassfilter in
Fluoreszenzspektren
aufgetrennt
und
von
photosensitiven
Detektoren
empfangen und ausgewertet. Die bestimmten Wellenlängen entsprechenden
Detektoren werden auch Fluoreszenzkanäle (FL) genannt. Auf diese Weise
können die Zellen je nach Auftreten eines Signals in einem Fluoreszenzkanal
sortiert werden.
Hier wird das Durchflusszytometer Gallios TM von Beckman Coulter verwendet.
Dieses Gerät besitzt drei Laser und zehn Fluoreszenzkanäle. Über den ersten
Laser (405nm) stehen zwei Kanäle für 450nm (FL1) und 550nm (FL2) zur
Verfügung. Über den zweiten Laser (488nm) werden fünf Kanäle für 525nm
(FL3), 575nm (FL4), 620nm (FL5), 675/695nm (FL6) und 755nm (FL7) bedient.
Über den dritten Laser werden weitere drei Kanäle für 660nm (FL8), 725nm
(FL9) und 755nm (FL10) zur Verfügung gestellt. Es können bis zu 10.000
Ereignisse pro Sekunde zuverlässig gemessen werden.
Vor der Messung muss darauf geachtet werden, dass alle benötigten
Fluoreszenzkanäle aktiviert sind. (Siehe Tabelle 6)
Verwendete
Fluoreszenzkanäle
Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe
FL 1
FITC
FL 2
PE
FL 6
APC
FL 8
APC-Cy 7
FL 9
V450, Pacific blue, Höchst 33342
Tab. 6: Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe und zugehörige Fluoreszenzkanäle
Pro Röhrchen dauert die Messung 380 Sekunden. Diese Zeitspanne wurde
vorher ermittelt, indem beobachtet wurde, wie lange es dauert, bis das
- 23 -
Röhrchen komplett ausgesaugt ist. Dadurch sollen bei der Messung möglichst
alle Zellen erfasst werden. Nach Abschluss der Messungen werden die Daten
gespeichert und mit Hilfe eines Programms ausgewertet.
4.6 Auswertung
Die Auswertung findet mit Hilfe des Analyseprogramms Kaluza statt. Die im
Durchflusszytometer gespeicherten Messdaten werden in das Programm
Kaluza übertragen. Hier werden verschiedene Diagramme erstellt und so
gegated, dass die gesuchten Tumorzellen übrig bleiben. In den ersten
Diagrammen wird der sideward scatter (SS) auf der Ordinate gegen den
forward scatter (FS) auf der Abszisse aufgetragen. Mit Hilfe dieser Darstellung
werden die lebenden Zellen bestimmt.
Von diesen lebenden Zellen ausgeschlossen sind die ganz zu Beginn
zugegebenen Micro-Beats. Diese werden im Kanal FL4 detektiert. So entsteht
im Diagramm mit der Anzahl der Beats in der Ordinate und der gemessenen
Signalstärke im FL4 in der Abszisse ein ausgeprägter Peak. Alle Signale in
diesem Bereich entsprechen Beats. In einer anderen Darstellung mit dem
sideward scatter in der Ordinate und der Signalstärke von FL4 in der Abszisse
sind die Beats als Wolke zu erkennen, wobei jeder Punkt einem gemessenen
Signal entspricht. Die Wolke ist in der rechten unteren Hälfte zu sehen. Diese
Signale werden als Beats bezeichnet und in den übrigen Diagrammen
ausgeschlossen.
In den nächsten Diagrammen steht wiederum die Signalstärke in den jeweiligen
Fluoreszenzkanälen (FL) in der Abszisse. Die Ordinate gibt die Anzahl der
gezählten Zellen an. Über diese Darstellung kann der Bereich ermittelt werden,
in dem sich für ein bestimmtes Antigen positive Zellen befinden. Dies erfolgt
über den Vergleich von Isotyp und Versuch. Beim Isotyp wird erwartet, dass nur
wenige Antikörper an die Zellen binden, so dass auch nur wenige Zellen mit
dem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Die Signalstärke sollte also im Kanal
des entsprechenden Farbstoffes gering sein, das heißt auf der Skala eher links
zu sehen sein. Dagegen sollen die spezifischen Antikörper an möglichst alle
Zellen mit dem entsprechenden Antigen binden. Es müssten also viele Zellen
mit dem Farbstoff markiert sein und so für eine hohe Signalstärke im
- 24 -
entsprechenden Kanal sorgen. Hier wird der Ausschlag im Diagramm also eher
im Bereich höherer Signale, das heißt eher rechts auf der Skala erwartet.
So kann dann der Bereich ermittelt werden, in dem kaum unspezifische Signale
auftreten und als für ein bestimmtes Antigen positiv festgelegt werden.
In den nächsten Diagrammen werden verschiedene Fluoreszenzkanäle
gegeneinander aufgetragen. Einmal der Fluoreszenzkanal, in dem CD45
positive Zellen auftauchen in der Ordinate gegen den Kanal, in dem EpCAM
positive Zellen erscheinen in der Abszisse. In diesem Diagramm entspricht
jeder Punkt einer Zelle und man sieht, in welcher Signalintensität sie in den
jeweiligen Kanälen leuchtet. Auf diese Weise entstehen Zellwolken. Eine Wolke
mit einer hohen Signalstärke für FL CD45 und niedrig für FL EpCAM. Diese
Zellen stellen wahrscheinlich noch übrig gebliebene Leukozyten dar und
werden als CD45+ bezeichnet. Eine andere Wolke zeigt eine niedrige
Signalstärke für FL CD45 und eine hohe für FL EpCAM. Der Bereich, in dem
diese Zellen liegen, wird als EpCAM positiv und CD45 negativ bezeichnet. Hier
müssen die Tumorzellen zu finden sein.
In einem weiteren Diagramm wird FL EpCAM in der Abszisse und FL
Zytokeratin in der Ordinate aufgetragen. In dieses Diagramm werden nun nur
die Zellen, die EpCAM positiv und CD45 negativ sind, übertragen. So kann man
sehen, wie viele dieser Zellen auch Zytokeratin positiv sind.
Die hier dargestellten Zellen sind aber nur die in den ersten Diagrammen als
Zellen und lebend und nicht Beats definierten. Zusätzlich zu diesen
Bedingungen kommt nun noch dazu, dass nur Höchst positive Zellen und Zellen
mit einer gewissen Flussgeschwindigkeit dargestellt werden.
Höchst 33342 wird im Fluoreszenzkanal 9 (FL9) sichtbar. Im Diagramm mit der
Anzahl der Zellen in der Ordinate und der Signalstärke von FL9 in der Abszisse
entstehen Peaks. Alle Zellen des ersten Peaks und rechts davon werden als
Höchst positiv festgelegt.
Um möglichst nur Einzelzellen in die Auswertung mit einzubeziehen, wird die
Flussgeschwindigkeit benutzt. Dabei geht man davon aus, dass Einzelzellen
eine geringere Time of flight (TOF) besitzen als Zellaggregate. Visualisiert wird
dies in einem Diagramm mit dem sideward scatter in der Ordinate und TOF in
der Abszisse. Alle Zellen ganz links in diesem Diagramm werden als in der
- 25 -
entsprechenden erwarteten Zeit am Laser vorbeigeflogen (TOF) gewertet und
in die Auswertung miteinbezogen.
In den oben beschriebenen Diagrammen, in denen Fluoreszenzkanäle
gegeneinander aufgetragen werden und die letztendlich zur Identifizierung der
Tumorzellen dienen sollen, werden also nur Zellen abgebildet, die leben, deren
Flussgeschwindigkeit auf Einzelzellen schließen lässt und die Höchst positiv
sind. Ausgeschlossen werden die Micro-Beats.
- 26 -
5. Ergebnisse
Ziel der Arbeit war es, mit der oben beschriebenen Methode Tumorzellen aus
dem Blut von Patienten zu detektieren, um sie auch an nicht metastasierten
Krebspatienten anwenden zu können. Als Tumorzellen definiert wurden EpCAM
positive, Zytokeratin positive und CD45 negative Zellen. Um die Methode zu
testen, wurden aber erst Tumorzellen der Zelllinien BxPC3 und SW480 gefärbt
und gemessen.
5.1 Zellkultur
Im ersten Versuch wurden je 100.000 Zellen der Zelllinie BxPC3 verarbeitet.
Dazu wurden die Antikörper Anti-EpCAM APC, Anti-Zytokeratin FITC, sowie
Anti-CD45 V450 und die jeweiligen Isotypen verwendet.
Die Tumorzellen konnten gut angefärbt und durch die Durchflusszytometrie
sichtbar gemacht werden. Auch die Isotypkontrollen fielen wie erwartet aus.
Im nächsten Versuch wurden je 100.000 Zellen der Zelllinie SW480 verwendet.
Diese wurden sowohl mit den Antikörpern des ersten Versuchs gefärbt, als
auch im Vergleich dazu mit neuen Antikörpern: Anti-EpCAM FITC, AntiZytokeratin PE, Anti-CD45 Pacific Blue. (Siehe Abbildung 1)
Auch hier ließen sich die Tumorzellen gut anfärben. Ein Unterschied zwischen
neuen und alten Antikörpern war nicht zu erkennen.
- 27 -
Abb.1: Zelllinie SW480 gefärbt mit Anit-EpCAM FITC, Anti-Zytokeratin PE und AntiCD45 Pacific blue; unten der dazugehörige Isotyp
Zur Kompensation, also um Signale von einem Kanal, die in einen anderen
streuen zu eliminieren, wurden BxPC3 Zellen jeweils nur mit Anti-EpCAM FITC
oder Anti-ZytokeratinPE bzw. Leukozyten nur mit Anti-CD45 Pacific Blue
gefärbt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.
- 28 -
FL 1
FL 1
FL 2
7
FL 9
2
FL 2
FL 9
3
0,7
0,5
0,3
Tab. 7: Kompensation
Nach diesen Versuchen konnte also davon ausgegangen werden, dass die
Färbung und Messung funktioniert. Die Diagramme zur Auswertung wurden
erstellt.
5.2 Punktate
Neben den Zelllinien BxPC3 und SW480 wurden auch Zellen eines Punktats
untersucht. Für diese Versuche wurden noch die im ersten Versuch
beschriebenen Antikörper verwendet.
Aus diesem Punktat wurden drei verschiedene Zellpopulationen getrennt
voneinander verarbeitet. Eine Zellpopulation bestand aus pflasterartig am
Boden der Zellkulturflasche angewachsenen Zellen (EZT3B). Auf Grund des
Wachstumsverhaltens und des Aussehens unter dem Lichtmikroskop wurde
erwartet, dass es sich hierbei um Tumorzellen handelt. Eine zweite am Boden
angewachsene Zellpopulation hatte ausgezogenes Zytoplasma (EZT3A). Diese
Zellen wurden für Fibroblasten gehalten. Die dritte Zellpopulation befand sich in
Lösung (EZT3 Susp.).
Von jeder Zellpopulation wurden je 100.000 Zellen mit den oben beschriebenen
spezifischen Antikörpern und den jeweiligen Isotypen gefärbt und gemessen.
Bei der Auswertung konnte bestätigt werden, dass die EZT3B Zellen
Tumorzellen sind, da sich hier sehr viele EpCAM+, Zytokeratin+ und CD45Zellen nachweisen ließen. (Siehe Abbildung 2)
EZT3A Zellen dagegen waren EpCAM- und nur Zytokeratin+, was der
Vermutung, dass es sich hier um Fibroblasten handelt, entspricht.
- 29 -
Dies wurde in einem weiteren Versuch bestätigt, bei dem mikroskopisch
identische Zellen aus einem anderen Punktat (EZT4) verarbeitet wurden und
das gleiche Färbeverhalten zeigten.
In der Zellsuspension (EZT3 Susp.) konnten unterschiedliche Zellpopulationen
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Färbung und
Messung funktioniert.
Abb.2: EZT3B gefärbt mit Anti-EpCAM APC, Anti-Zytokeratin FITC und Anti-CD45
V450; unten der dazugehörige Isotyp
- 30 -
5.3 Blut
Im nächsten Schritt wurde Blut von gesunden Probanden verarbeitet, um zu
sehen, ob die CD45-Färbung und die CD45-Depletion mittels Magneten
funktionieren. Für diese Versuche wurden die oben als neu bezeichneten
Antikörper verwendet. Für die Testung der CD45-Färbung wurde eine kleine
Menge des lysierten Blutes ohne CD45-Depletion gefärbt. Ein eindeutiger
Ausschlag im Fluoreszenzkanal für CD45 war zwar sichtbar, allerdings war er
etwas weiter rechts erwartet worden. Daher wurde zur Kontrolle lysiertes Blut
ohne jegliche Färbung gemessen. Hier war ein Unterschied deutlich sichtbar,
was dafür spricht, dass die CD45-Färbung funktioniert.
Betrachtet man alle Blutproben, die mit dem Magnet behandelt wurden, so
konnte eine Reduktion der Gesamtzellzahl auf durchschnittlich 1.474 Zellen pro
8ml Blut, was 184 Zellen pro ml Blut entspricht, erreicht werden. (n=70, r =
994/ml) Extreme Ausreißer sowohl nach oben als auch nach unten wurden
dabei nicht berücksichtigt. Dieses Ergebnis spricht für eine gute Funktion des
Magneten.
Im nächsten Schritt wurden BxPC3 Zellen in das Blut von gesunden Probanden
gemischt. Auch hier konnten bei der Auswertung die BxPC3 Zellen im
erwarteten Bereich eindeutig nachgewiesen werden. (Siehe Abbildung 3)
- 31 -
Abb.3: Tumorzellen der Zelllinie BxPC3 gemischt in das Blut eines gesunden
Probanden gefärbt mit Anti-EpCAM FITC, Anti-Zytokeratin PE und Anti-CD45
Pcific blue; unten die dazugehörigen Isotypen
In den kommenden Versuchen wurde nun Blut von Patienten mit metastasierten
Karzinomen untersucht und als Kontrolle Blut von gesunden Probanden. Unter
der Voraussetzung, dass CTCs definiert sind als EpCAM+ Zytokeratin+ und
CD45- Zellen konnte nur bei einem von 19 Patienten eine Tumorzelle
nachgewiesen werden. Die Anzahl der CTCs war eins.
Allerdings wurde auch bei einer von 14 Kontrollblutproben eine EpCAM+
Zytokeratin+ und CD45- Zelle gefunden. EpCAM+ Zytokeratin- Zellen wurden
bei Krebspatienten in einem Fall gefunden. In der Kontrollgruppe konnten bei
- 32 -
zwei Proben diese Zellen nachgewiesen werden. Die Zahl der Zellen beim
Patienten war zwei, in der Kontrollgruppe lag die Anzahl bei jeweils einer Zelle.
Zytokeratin+, aber EpCAM- Zellen fanden sich sowohl im Patientenkollektiv als
auch bei gesunden Kontrollpersonen in jeweils zwei Proben. In der
Patientengruppe lag die Anzahl der Zellen bei drei und eins, in der
Kontrollgruppe bei acht und eins. Ein Unterschied zwischen Patienten und
Kontrollgruppe war also nicht zu sehen.
Nicht erwartet war das Ergebnis der Isotypkontrollen. Besonders auffallend war
hier die hohe Anzahl an EpCAM+ Zytokeratin-, aber auch an EpCAM–
Zytokeratin+ Zellen im Vergleich zu den Versuchen.
Grafik 1: Vergleich der durchschnittlich gefundenen Zellzahl zwischen Versuch und
Isotyp
Betrachtet man alle Messungen, so wurden in 17 von 33 Proben im Isotyp
EpCAM+ Zytokeratin- Zellen gefunden. Die Anzahl lag dabei im Mittel bei 8
Zellen. Dagegen wurden nur in acht von 33 Proben im Versuch diese Zellen
gefunden, wobei die durchschnittliche Zellzahl mit zwei deutlich niedriger war
als im Isotyp. EpCAM- Zytokeratin+ Zellen wurden in neun von 33 Isotyp
Proben gefunden. Hier lag der Mittelwert bei fünf Zellen. Im Versuch lag der
Mittelwert aus acht von 33 Proben dagegen bei zwei Zellen. (Siehe Grafik 1)
- 33 -
Da besonders die ersten Versuche mit Patientenblut nicht wie erhofft verliefen,
wurden im Verlauf immer wieder Details verändert und Versuche durchgeführt,
um mögliche Fehler zu identifizieren.
5.4 Fehleranalyse
Um zu sehen, ob die gemessenen Signale wirklich Zellen sind, wurde die
Höchst 33342 Färbung eingesetzt. Da Höchst 33342 im FL9 detektiert wird,
musste der CD45 Antikörper, der bislang an Pacific blue gebunden auch im FL9
zu finden war, durch Anti-CD45 APC-Cy7, dessen Signal im FL8 gemessen
wird, ersetzt werden.
Des Weiteren wurden Flow-Count Fluorospheres Micro-Beats eingesetzt, um
einen möglichen Zellverlust quantifizieren zu können.
5.4.1 Färbeverhalten
Da in den Versuchen mit Tumorzellzellkulturen gute Ergebnisse erzielt worden
waren, wurde untersucht, ob die CD45-Depletion mittels Magnet einen
negativen Einfluss auf das Färbeverhalten der Zellen hat, da diese in
Zellkulturversuchen nicht verwendet worden war.
Dazu wurde mit BxPC3 Zellen vor der Färbung die CD45-Depletion genauso
wie mit lysiertem Blut durchgeführt. Eine Veränderung des Färbeverhaltens
konnte dabei aber nicht festgestellt werden. (Siehe Abbildungen 4 und 5)
- 34 -
Abb. 4: BxPC3 Zellen gefärbt nach Behandlung mit Magnet; oben Versuch, unten
Isotyp
- 35 -
Abb.5: BxPC3 Zellen gefärbt ohne Behandlung mit Magnet; oben Versuch, unten
Isotyp
- 36 -
5.4.2 Verdünnungsreihen
In Verdünnungsreihen wurde jeweils eine bestimmte Anzahl Tumorzellen der
Zelllinie BxPC3 in das Blut von gesunden Probanden gemischt. Es wurden
32.500, 1.000, 500, 100, 50 und 10 Zellen hinzugegeben.
BxPC3 spiked
EpCAM+ CK-
EpCAM- CK+
EpCAM+ CK+
32.500
752
175
1.806
1.000
144
5
101
500
1
0
2
100
1
3
7
50
1
0
1
10
0
5
0
Tab. 8: Verdünnungsreihe mit BxPC.durchschnittlich wiedergefundene Anzahl an
Zellen (n=3)
Auffallend ist, dass auch hohe Zahlen an EpCAM+ Zytokeratin- und EpCAMund Zytokeratin+ Zellen gefunden wurden.(Siehe Tabelle 8) Definiert man eine
zirkulierende Tumorzelle demensprechend als EpCAM+ oder Zytokeratin+ oder
EpCAM+ und Zytokeratin+, so können die Wiedererkennungsraten in den
Verdünnungsreihen erhöht werden, bleiben aber dennoch in einem sehr
niedrigen Bereich. (Siehe Tabelle 9)
BxPC3
spiked
Durchschnittliche
Wiedererkennungsrate
EpCAM+ CK+
32 500
5,6%
Durchschnittliche
Wiedererkennungsrate
EpCAM+ CK+ und EpCAM+
CK- und EpCAM- CK+
8,4%
1 000
10%
25%
500
0,4%
0,6%
100
7%
11%
50
2%
4%
10
0%
50%
Tab. 9: Durchschnittliche Wiedererkennungsraten (n=3)
- 37 -
Die Tumorzellen können also in großer Anzahl gut nachgewiesen werden, aber
auch hier ist schon eindeutig ein Zellverlust festzustellen, was die insgesamt
sehr niedrigen Wiedererkennungsraten zeigen. Eine Möglichkeit die Methode
zu verbessern, besteht also wohl darin, den Verlust zu minimieren, um am Ende
mehr Zellen zur Verfügung zu haben.
5.4.3 Verlustminimierung
Um weniger Zellen bei der Verarbeitung zu verlieren, wurden einige Details im
Protokoll verändert.
Bisher wurde nach Zentrifugationen der Überstand durch Abschütten verworfen.
Hierin wurde ein potentieller Schritt gesehen, der für Zellverlust verantwortlich
ist. Eine Alternative zum Abschütten stellt das Absaugen dar. In einem
Vergleich dieser Methoden, die parallel am selben Tag mit denselben
Materialien durchgeführt wurden, sollte ein möglicher Vorteil herausgefunden
werden. Der Verlust wurde hier mit Hilfe von Micro-Beats erfasst. Dabei stellte
sich ein kleiner Vorteil für das Absaugen heraus, bei dem am Ende des
Versuchs 3,7% mehr Beats wiedererkannt wurden als beim Abschütten. Somit
wurde der Überstand nach Zentrifugation im Folgenden durch Absaugen
entfernt.
Einen weiteren Schritt zur Minimierung der Zellverluste stellte eine Veränderung
im Protokoll der Erythrozyten-Lyse dar. Hier wurden die ersten Schritte bis zum
Erhalt eines weißen Zellpellets um eine Zentrifugation gekürzt. Nach der ersten
Inkubationszeit
mit
Erythrozyten-Lyse
Buffer
und
der
anschließenden
Zentrifugation wurde das erste Waschen mit PBS+ + EDTA ausgelassen und
das Pellet dafür gleich wieder mit dem Lyse Buffer resuspendiert. Erst danach
wurde einmal mit PBS+ + EDTA gewaschen. So erhielt man ein weißes
Zellpellet und sparte sich eine Zentrifugation. Allerdings brachten diese
Veränderungen keine entscheidende Verbesserung.
Um zu überprüfen, bei welchen Schritten der größte Verlust entstand, wurde
nach jeder Zentrifugation die Anzahl der Beats durch Messung einer
bestimmten Menge an Blut bestimmt und mit der durch Berechnung erwarteten
- 38 -
Zahl verglichen. Die zu messende Menge sollte 2000 Beats enthalten und
konnte dadurch für jede Messung exakt errechnet werden.
Dabei stellte sich heraus, dass besonders bei der ersten und zweiten
Zentrifugation während der Erythrozyten-Lyse viele Beats verloren gegangen
waren. Danach kam es kaum noch zu Verlusten, nur wenige Beats gingen noch
durch die Färbung verloren. Nach der ersten Messung war ein Verlust von
durchschnittlich 61% und bei der zweiten Messung von durchschnittlich 48,4%
zu verzeichnen. Nach dem Waschschritt und der CD45-Depletion wurden keine
Verluste gemessen. Erst durch die komplette Färbung entstand nochmals ein
Verlust von durchschnittlich 22,7%. (Siehe Tabelle 10)
- 39 -
Beats errechnet
Beats gemessen
Verlust
Nach der ersten Zentrifugation
V1
2000
642
67,9%
V2
2000
600
70,0%
V3
2000
938
53,1%
V4
2000
933
53,0%
Nach der zweiten Zentrifguation
V1
2000
1101
45,0%
V2
2000
776
61,2%
V3
2000
1199
40,0%
V4
2000
1050
47,5%
Nach der dritten Zentrifugation
V1
2000
2659
0.0%
V2
2000
2550
0,0%
V3
2000
2786
0,0%
V4
2000
2070
0,0%
Nach CD45-Depletion
V1
2000
2534
0,0%
V2
2000
2915
0,0%
V3
2000
2050
0,0%
V4
2000
2100
0,0%
Nach Färbung
V1
77 946
85 251
0,0%
V2
49 439
30 509
38,0%
V3
134 664
93 221
30,0%
V4
114892
Tab. 10: Analyse des Zellverlusts durch Messungen nach Zentrifugationen, CD45
Depletion und Antikörper-Färbung
- 40 -
5.4.4 Isotypenkontrolle
Bei der Auswertung des Versuchs zur genaueren Bestimmung des Zellverlusts
war aufgefallen, dass sowohl im Versuch als auch in der Isotypkontrolle mehr
vermeintliche Zellen als sonst im Bereich der Tumorzellen zu finden waren und
diese an fast der identischen Stelle wie auch sonst die störenden Signale im
Isotyp lagen. Da eine vergleichsweise deutlich größere Anzahl an Micro-Beats
verwendet worden war, entstand die Vermutung, dass diese Signale keine
Zellen sondern Beats seien. Durch eine Vergrößerung des Bereichs Beats, der
ja vom Bereich der Tumorzellen ausgeschlossen ist, konnten diese eliminiert
werden. (Siehe Abbildung 6)
Durch die Übertragung dieser neuen Einstellungen auf vorherige Versuche
konnten zwar die EpCAM+, Zytokeratin+ und CD45 - Signale in Isotypkontrollen
und gesundem Blut reduziert, aber nicht ganz eliminiert werden.
Abb.6: oben: vor Vergrößerung des Bereichs Beats
unten: nach Vergrößerung des Bereichs Beats; die Signale im EpCAM+ und
CD45- Bereich sind verschwunden
- 41 -
Betrachtet man nach dieser Veränderung im Gating die Isotypen erneut, so
konnte auch durch Verwendung der Höchst Färbung eine Verbesserung
festgestellt werden.
Bevor die Blutproben mit Höchst gefärbt worden waren, waren in 11 von 14
Isotypkontrollen
EpCAM+
Zytokeratin-
Zellen
vorhanden,
wobei
die
durchschnittliche Anzahl, wenn Zellen gemessen wurden, bei 11 lag.
Dagegen wurden in Isotypkontrollen, die mit Höchst gefärbt worden waren, nur
noch in sieben von 19 Fällen EpCAM+ Zytokeratin- Zellen gefunden. Auch die
Anzahl der entsprechenden Zellen in diesen Fällen war deutlich reduziert auf
durchschnittlich zwei Zellen.
Ähnliches gilt auch für EpCAM- Zytokeratin+ Zellen. Vor Verwendung der
Höchst Färbung wurden durchschnittlich sechs Zellen in sechs von 14 Proben
gefunden. Diese Zahl wurde auf durchschnittlich drei Zellen in drei von 19
Proben reduziert. (Siehe Graphik 2)
Eine EpCAM+ Zytokeratin+ Zelle konnte mit der Höchst Färbung nur noch in
einer von 19 Proben nachgewiesen werden, wohingegen davor in drei von 14
Proben eine solche Zelle vorhanden war.
Graphik 2: Durchschnittliche Zellzahl im Isotyp mit bzw. ohne Höchst Färbung
- 42 -
6. Diskussion
Man geht davon aus, dass Tumorzellen in einer sehr geringen Anzahl im Blut
von Krebspatienten vorkommen. In der Literatur finden sich Zahlen von einer
Tumorzelle pro 1 Billion normaler Blutzellen bei Patienten mit fortgeschrittenem
Tumorstadium. (Yu et al. 2011)
Durch eine begrenzte Menge an Probenmaterial (Blut) wird diese Anzahl
zusätzlich limitiert. Dadurch stellt die Detektion von zirkulierenden Tumorzellen
eine große Herausforderung dar, die mit Hilfe unterschiedlicher Methoden zu
überwinden versucht wird.
Die meisten bisher entwickelten Methoden beruhen auf zwei Hauptschritten:
erstens der Isolation und Anreicherung der Tumorzellen und zweitens der
Detektion. Bei der Isolation und Anreicherung werden Unterschiede zwischen
Tumorzellen und normalen Blutzellen genutzt. Dabei unterscheiden sich diese
Zellen
sowohl
in
physikalischen
Eigenschaften
als
auch
in
ihrer
Antigenexpression.
Den Dichtegradient macht sich die Zentrifugation mit Ficoll-Hypaque zu nutze.
Allerdings liegen hier die Tumorzellen zusammen mit anderen mononukleären
Zellen in einer Schicht. Dadurch werden die Entdeckungsrate und die Spezifität
dieser Methode stark beeinträchtigt. (Zhe et al. 2011) Als weiteres
Unterscheidungsmerkmal kann die Zellgröße verwendet werden. Tumorzellen
sind mit einem Durchmesser von 29,8-33,9 μm bei Brustkrebs (Meng et al.)
größer als die Mehrzahl der Blutzellen, die einen Durchmesser von 8-11 μm
messen. (Zhe et al. 2011)
Unterschiedliche Filtrationssysteme sind in der Literatur beschrieben. (Vona et
al. 2000, Mohamed et al. 2009, Tan et al. 2009) Ein Vorteil dieser
Anreicherungsmethode ist, dass die Zellen zytopathologisch weiter analysiert
werden können. (Paterlini-Brechot et al. 2007) Problematisch ist allerdings,
dass dennoch 2000 (Vona et al. 2000) bis 10.000 (Zabaglo et al. 2003)
Leukozyten pro Milliliter Blut übrig bleiben.
- 43 -
Am
häufigsten
werden
Methoden
verwendet,
die
die
Expression
tumorspezifischer oder epithelialer Antigene auf Tumorzellen nutzen. Dabei
kann zwischen positiver und negativer Selektion unterschieden werden.
Bei der positiven Selektion werden zumeist anti- EpCAM Antikörper benutzt, die
an magnetische Partikel gekoppelt sind. So können EpCAM exprimierende
Zellen mit Hilfe eines Magneten isoliert werden, wodurch der Begriff des
„immunomagnetic enrichment“ entsteht. Diese isolierten Zellen, von denen man
ausgeht, dass es die zirkulierenden Tumorzellen sind, können dann mit
unterschiedlichen Methoden weiter analysiert werden.
Dagegen werden bei der negativen Selektion anti-CD 45 Antikörper verwendet,
die an magnetische Partikel gekoppelt sind, um so die überflüssigen
Leukozyten zu entfernen. Dadurch erhofft man sich, auch die Tumorzellen zu
finden, bei denen die EpCAM Expression herunterreguliert ist. (Lianidou et al.
2011)
In dieser Arbeit wurde wie oben beschrieben die Methode der negativen
Selektion gewählt. Liu et al. konnten zeigen, dass bei dem Vergleich zwischen
positiver und negativer Selektion und der Kombination aus beiden die höchste
Wiederfindungsrate von Tumorzellen durch die negative Selektion erzielt
werden konnte. Eine Schwachstelle dieser auf Antigenexpression beruhenden
Methode ist allerdings, das Auftreten falsch positiver Ereignisse. Diese können
zum einen durch Kontamination mit epithelialen Zellen entstehen und zum
anderen durch spezifische, aber auch unspezifische Bindung an Leukozyten.
Die spezifische Bindung kann durch Fc Rezeptor tragende Leukozyten und
Monozyten oder eine falsche Antigenexpression auf diesen Zellen verursacht
sein. So erklärt sich der Prozentsatz von bis zu 20% Zytokeratin positiver Zellen
in normalen Kontrollen. (Fehm et al. 2005)
Auch bei dieser Arbeit ergab sich das Problem, dass bei einer gesunden
Kontrollperson epitheliale Antigene exprimierende Zellen gefunden wurden. Da
immer die ersten 5ml Blut verworfen wurden, kann eine Kontamination als eher
unwahrscheinlich angesehen werden.
Nicht maligne Epithelzellen konnten aber auch im Blut von Personen mit
benignen proliferativen Krankheiten, Entzündungen, Traumata von Geweben
oder
nach
chirurgischen
Eigriffen
gefunden
2000)(Paterlini-Brechot et al. 2007)
- 44 -
werden.
(Crisan
et
al.
Da unsere Kontrollpersonen aber wissentlich keine dieser Beschwerden
aufwiesen, ist es eher unwahrscheinlich, dass dadurch die falsch positiven
Ergebnisse entstanden sind. Am wahrscheinlichsten ist in diesem Fall also die
fälschliche
Bindung
der
Antikörper
an
Leukozyten
durch
die
oben
beschriebenen Mechanismen.
Zur Detektion der isolierten Tumorzellen gibt es auch unterschiedliche
methodische Ansätze.
Das einzige von der FDA (Food and Drug Administration) zugelassene
Verfahren zur Detektion von CTCs bei metastasierten Mamma-, Prostata- und
kolorektalen Karzinomen ist das sogenannte CellSearch System (Veridex LLC).
Es ist eine halbautomatische Methode und kann in zwei Komponenten
untergliedert werden: das CellTrack AutoPrep System und den CellTrack
Analyzer. Im AutoPrep System werden die CTCs mittels positiver Selektion
über EpCAM isoliert und mit fluoreszierenden Antikörpern gegen Zytokeratin 8,
18 und 19 und Antikörpern gegen das Leukozyten spezifische Antigen CD45
gefärbt. Der CellTrack Analyzer besteht aus einem semiautomatischen
Fluoreszenzmikroskop und einer Analyse Software und kann CTCs von
Leukozyten unterscheiden. Hierbei sind CTCs definiert als Zytokeratin positive
und CD 45 negative Zellen mit Zellkern, was durch eine positive Färbung mit
dem an DNA bindenden 4`, 6-diamino-2-phenylindol (DAPI) nachgewiesen wird.
(Ross et al. 2009; Allan et al. 2010)
Eine weitere Methode, die sich der Fluoreszenzmikroskopie bedient, ist der
CTC microchip. Auch hier werden die Tumorzellen mit Hilfe von sich auf dem
Chip befindenden Anti-EpCAM Antikörpern fixiert und mit fluoreszierenden AntiZytokeratin und Anti-CD45 Antikörpern sowie einem Marker für DNA gefärbt,
um dann unter dem Fluoreszenzmikroskop bewertet werden zu können. (Ross
et al. 2009; Allan et al. 2010)
Wir verwendeten zur Detektion die Durchflusszytometrie, deren Funktionsweise
unter dem Punkt Material und Methoden bereits ausführlich besprochen wurde.
Für
die
unterschiedlichen
Isolations-
und
Detektionssysteme
sind
unterschiedliche Wiedererkennungsraten von Tumorzellen, die aus Kultur ins
Blut gemischt wurden, publiziert. Beim CellSearch System liegen die
Wiedererkennungsraten bei 78,9% (Deng et al. 2008) bis 82%. (Riethdorf et al.
- 45 -
2007) Auch mit Hilfe des Microchips konnten Wiedererkennungsraten von >
60% erzielt werden. (Nagrath etal. 2007) Bei Spiking Experimenten mit
negativer Selektion mittels CD45-Depletion und anschließender Analyse durch
Durchflusszytometrie wurden 57-94% der Tumorzellen wiedererkannt. (Liu et al.
2011)
Diese hohen Raten der Wiedererkennung konnten wir leider nicht bestätigen.
Bei Versuchen mit Pankreastumor Zellen (BxPC3), von denen zwischen 10 und
32.500 Zellen in vitro ins Blut von gesunden Probanden gemischt wurden,
konnten nur zwischen 0,4% und 10% der Zellen wiedergefunden werden. Bei
sehr geringen Zellzahlen von 10 Zellen konnten gar keine Tumorzellen mehr
detektiert werden. Durch die Miteinbeziehung EpCAM+ Zytokeratin- und
EpCAM- Zytokeratin+ Zellen in die Definition der Tumorzelle konnten diese
Raten zwar auf 0,6% bis 50% gesteigert werden, aber dennoch liegen diese
Werte in einem sehr niedrigen Bereich. Möglicherweise kommen diese
Ergebnisse zustande, da es schwierig ist, so geringe Zellzahlen exakt zum Blut
hinzuzugegeben. Denn, da die BxPC3 Zellen in großer Anzahl und somit auch
Konzentration vorliegen, müssen sie stark verdünnt werden oder sehr geringe
Mengen der Zellsuspension zur Bestückung des Blutes verwendet werden,
wobei leicht Ungenauigkeiten in der tatsächlichen Zellzahl entstehen können.
Eine andere Möglichkeit ist der starke Zellverlust, der durch die Anzahl der
Beats abgeschätzt werden kann. Dieser betrug durchschnittlich 73% und war
damit sehr hoch, was die niedrigen Wiedererkennungsraten erklären könnte.
Allerdings wurden auch Versuche durchgeführt, bei denen die BxPC3 Zellen
separat bearbeitet wurden und erst direkt vor der Messung ins ebenfalls separat
vorbereitete Blut gegeben wurden. Die Wiedererkennungsraten bei diesen
Versuchen unterschieden sich nicht von denen, bei denen die Zellen direkt ins
Vollblut gegeben wurden. Der Zellverlust kann also auf keinen Fall die alleinige
Ursache dieser niedrigen Ergebnisse sein. Das Problem scheint also in der
Zellzugabe oder aber in der Messung selbst zu liegen.
Im Bereich der Detektion von Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten mit
Hilfe der oben beschriebenen Methoden gibt es bereits auch erfolgreiche
Studien.
- 46 -
So konnte mit Hilfe des CellSearch Systems bei 71,4% bzw. 65,1% der
untersuchten Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs mindestens eine
Tumorzelle gefunden werden. (Liu et al. 2011) Ähnliche Ergebnisse zeigten sich
bei Patienten mit metastasierten kolorektalen Karzinomen in einer Studie von
Cohen et al.. Bei 77% der Proben konnte hier mittels Durchflusszytometrie
mehr als eine Zelle detektiert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie war
in 62% der Proben mehr als eine Tumorzelle auffindbar. (Cohen et al. 2006)
In dieser Arbeit konnte nur bei einem von 19 der Patienten eine EpCAM und
Zytokeratin positive Zelle detektiert werden, dies entspricht 5%. Dies könnte
zum einen an den Patienten liegen, denn die Mehrzahl der untersuchten
Patienten war bereits systemisch vorbehandelt. Studien konnten zeigen, dass
sich die Zahl der zirkulierenden Tumorzellen im Blut nach Chemotherapie
verändert. Bei Brustkrebs scheint ein Abfall der Tumorzellzahl im Blut für ein
Ansprechen auf die Chemotherapie zu sprechen. (Hayes et al. 2004;
Pachmann et al. 2008; Pierga et al. 2008)
Die chemotherapeutische Vorbehandlung könnte also ein Grund für das Nichtvorhandensein von Tumorzellen darstellen. Allerdings wurde auch das Blut von
Patienten untersucht, die kein Ansprechen auf eine Chemotherapie zeigten und
Fernmetastasen
aufwiesen.
Bei
diesen
wurde
eigentlich
eine
hohe
Tumorzelllast im Blut erwartet, doch auch hier konnten keine Tumorzellen
gefunden werden.
Dies könnte auch am Zellverlust liegen. Möglicherweise gingen bei der
Verarbeitung so viele Zellen verloren, darunter auch die seltenen Tumorzellen,
dass am Ende zu wenige oder keine für eine sichere Detektion übrig waren. Der
mit Hilfe der Micro-Beats abgeschätzte Zellverlust betrug durchschnittlich 73%,
wobei bei genauerer Analyse festgestellt werden konnte, dass der Hauptverlust
durch die Erythrozyten-Lyse und die ersten Zentrifugationen verursacht wurde.
Allerdings wird auch bei anderen Methoden ein Zellverlust von bis zu 60%
beschrieben. (Goeminne et al. 2000)
Da viele untersuchte Patienten an einem Bronchialkarzinom litten, kann auch
der epitheliale-mesenchymale Übergang beim Eintritt der Tumorzellen in das
Blutgefäßsystem ein Grund für das nicht Auffinden dieser Zellen sein. Bei
diesem Mechanismus verlieren die Tumorzellen ihre epithelialen Eigenschaften.
Da unsere Methode auf diesen beruht, kann dadurch eine Detektion seitens der
- 47 -
Tumorzellen
verhindert
werden.
Dieses
Problem
scheint
besonders
Bronchialkarzinome zu treffen (Young et al. 2012), die übrigen untersuchten
Tumorentitäten dürften davon aber nicht betroffen sein.
Probleme bereitete uns auch die Isotypenkontrolle. Besonders EpCAM+
Zytokeratin- Zellen traten hier häufig und in großer Zahl auf. Dies konnte durch
den besseren Ausschluss von Beats und Verwendung der Höchst Färbung
verbessert werden. Beide Maßnahmen dienen dazu, Signale, die keine Zellen
sind, zu eliminieren. Da die Anzahl der Fälle, in denen EpCAM+ ZytokeratinZellen um 57% und EpCAM- Zytokeratin+ Zellen um 63% durch den
Ausschluss Höchst negativer Signale gesenkt werden konnte, und auch der
erweiterte Ausschluss von Micro-Beats diese Tendenz unterstützte, ist davon
auszugehen, dass die vielen Signale zu Beginn durch Partikel ausgelöst
wurden, die keine Zellen waren.
Allerdings war insgesamt auch in 78% der Fälle die Anzahl EpCAM+
Zytokeratin- Signale im Isotyp höher als im Versuch. Bei EpCAM- Zytkeratin+
Zellen war dies in 39% und bei EpCAM +Zytokeratin+ Zellen in 13% der Fall.
Wodurch dieser Unterschied zustande kam, lässt sich durch oben genannte
Vermutung
nicht
erklären.
Dennoch
konnte
dadurch
auch
hier
eine
Verbesserung auf 37% für EpCAM+ Zytokeratin- und auf 15,7% für EpCAMZytokeratin+ erzielt werden. Die Anzahl EpCAM+Zytokeratin+ Signale war
sogar kein einziges Mal mehr höher als im Versuch. Dennoch wird auch
dadurch deutlich, dass die Methode noch zu ungenau ist.
Insgesamt konnten wir also die bereits viel versprechenden Ergebnisse bei der
Detektion von zirkulierenden Tumorzellen nicht bestätigen. Im Gegenteil
wurden hier eher die Grenzen und Probleme in diesem Bereich der Forschung
deutlich.
Weitere Forschung auf diesem Themengebiet ist aber unbedingt notwendig,
denn die Anzahl der zirkulierenden Tumorzellen scheint eine klinische Relevanz
aufzuweisen.
Besonders
bei
metastasierten
Mamma-,
Prostata-
und
kolorektalen
Karzinomen, aber auch beim Melanom konnte eine Korrelation zwischen der
Anzahl bzw. dem Auftreten von CTCs und einem schlechteren Outcome
- 48 -
nachgewiesen werden. Dabei könnte der Nutzen des Nachweises von CTCs
vor allem darin bestehen, die Effektivität einer Therapie zu überprüfen und die
Prognose eines Patienten besser abschätzen zu können.
So konnte Cristofanilli et al. in einer Multicenterstudie mit Patientinnen mit
metastasiertem Mammakarzinom zeigen, dass solche mit mehr als fünf CTCs in
7,5
ml
Blut
vor
der
Therapie
eine
statistisch
gesehen
geringere
Gesamtüberlebenszeit und ein kürzeres progressionsfreies Intervall aufwiesen.
Des Weiteren bedeutete auch eine CTC Anzahl über fünf nach einer Therapie
ein
schlechteres
Outcome
in
Bezug
auf
Gesamtüberleben
und
progressionsfreiem Intervall im Vergleich zu den Patientinnen deren CTC Zahl
unter Therapie unter fünf sank. (Cristofanilli et al. 2004)
Auch in Studien von de Bono et al. mit Patienten mit metastasiertem Prostatakarzinom wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen einer Zahl von über
fünf CTCs und einer geringeren Überlebenszeit und progressionsfreiem
Intervall gezeigt. (de Bono et al. 2008)
Ähnliche Ergebnisse lieferten auch Studien mit Patienten, die an kolorektalen
Karzinomen erkrankt waren. Allerdings wurde hier die Anzahl der kritischen
Tumorzellen auf drei gesenkt. (Cohen et al. 2008)
Einen weiteren Nutzen erhofft man sich für Patienten in einem frühen Stadium
der Krebserkrankung bzw. in der Krebsnachsorge durch das Erkennen der
Erkrankung, bevor diese in der Bildgebung sichtbar oder klinisch manifest wird.
So konnte in Studien mit Patienten mit nicht metastasiertem kolorektalem
Karzinom ein Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von zirkulierenden
Tumorzellen nach der OP und einem verringerten progressionsfreiem bzw.
rezidivfreiem Intervall nachgewiesen werden. (Thorsteinsson et al. 2011)
Auch
für
Brustkrebspatientinnen
ohne
Metastasen
konnte
dieser
Zusammenhang zwischen dem Auftreten von zirkulierenden Tumorzellen und
vermindertem progressionsfreiem Intervall dargestellt werden. (Lucci et al.
2012)
Es gibt also begründete Hoffnungen, dass die zirkulierenden Tumorzellen ein
hilfreicher Parameter für die Prognoseabschätzung, aber auch für die
Therapieplanung und die Erkennung minimaler Erkrankungen werden könnte.
Durch die nähere Analyse dieser Zellen erhofft man sich außerdem den
- 49 -
Prozess der Metastasierung besser verstehen zu können. Am Ende könnte eine
einfache Blutabnahme zu einer Art „liquid biopsy“ werden und eine
individuellere Behandlung gewährleisten.
Allerdings sind die unterschiedlichen Detektionsmethoden noch zu wenig
ausgereift und Spezifität und Sensitivität noch zu gering, als dass die
Bestimmung der zirkulierenden Tumorzellen den Weg in den klinischen Alltag
bereits geschafft hätte.
Gerade diese Probleme, die es noch zu überwinden gilt, zeigte diese Arbeit.
Besonders die Problematik der begrenzten Anzahl an CTCs, die durch den
Verlust während der Verarbeitung verstärkt wird und das Problem falsch
positiver Ergebnisse sowohl bei gesunden Kontrollpersonen als auch in der
Isotypkontrolle wurden deutlich. Daher ist es aber unbedingt notwendig, in
diesem Gebiet weiter zu forschen, um so die optimale Methode zu finden.
- 50 -
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8. Abkürzungen
BSA
Bovine Serum Albumin
CTC
Circulating tumor cells
CK
Cytoceratine
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EpCAM
Epithelial cell adhesion molecule
FACS
Fluorescence-activated cell sorting
FCS
Fetal Calf Serum
Pen Strep
Penicillin Streptomycin
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9. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Rainer Fietkau, Direktor der
Strahlenklinik der Universität Erlangen Nürnberg, dafür bedanken, dass er mir
die Möglichkeit eröffnete, diese Arbeit im strahlenbiologischen Labor der
Strahlenklinik auszuführen.
Bei meinem Betreuer PD Dr. Luitpold Distel möchte ich mich sehr herzlich für
die hervorragende Unterstützung bedanken. Seine eigene Begeisterung an der
Forschung steckte mich an und wirkte sehr motivierend. Bei Problemen und
Fragen war er immer erreichbar und konnte mit wertvollen Tipps sowohl bei der
Laborarbeit als auch beim Auswerten der Ergebnisse weiterhelfen. Dadurch hat
er für das Gelingen der Arbeit einen großen Teil beigetragen. Vielen Dank!
Ein großer Dank gilt allen Mitarbeitern des strahlenbiologischen Labors, die
mich sowohl praktisch als auch durch das hervorragende Arbeitsklima
unterstützten. Ein besonderer Dank gilt hierbei Frau Elisabeth Müller und Frau
Doris Mehler, die mich in die Laborarbeit einführten und die ganze Zeit mit viel
Geduld alle Fragen und Probleme mit mir zusammen besprachen und lösten.
Einen ganz besonderen Dank möchte ich zuletzt meiner Familie aussprechen,
ohne deren Unterstützung mein Studium und diese Arbeit nicht möglich
gewesen wäre.
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