In vivo Antigen-Beladung Antigen-präsentierender Zellen mit Hilfe

In vivo Antigen-Beladung
Antigen-präsentierender Zellen mit Hilfe
von rekombinanten
Fcy-Rezeptor-Antikörpern
Der naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Christian H.K. Lehmann
aus Neuhaus am Rennweg
http://d-nb.info/1053435290
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG
15
2
SUMMARY
17
3
EINLEITUNG
19
Dendritische Zellen
19
Dendritische Zellen und die Balance zwischen Toleranz und Immunität
T-Zellaktivierung durch Dendritische Zellen
19
22
3.1.2.1
Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-I-Präsentation
23
3.1.2.2
Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-Il-Präsentation
23
3.1.2.3
Die Antigenprozessierung in Dendritischen Zellen
24
3.1.2.4
Kreuzpräsentation - MHC-I-Präsentation extrazellulärer Proteine
24
3.1.2.5
Autophagie - Prozessierung zytosolischer Proteine für die MHC-IlPräsentation
25
3.1.2.6
Stimulation naiver T-Zeilen durch Dendritische Zellen
27
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
Weitere Mechanismen zur Steuerung der Immunantwort
27
3.1.4
Die Heterogenität Dendritischer Zellen und deren Entwicklung in der Maus
28
3.1.4.1
Subklassen Dendritischer Zellen
28
3.1.4.2
Die Entwicklung Dendritischer Zellen
30
Fcy-Rezeptoren
Fcy-Rezeptoren - Diversität und Funktionen
33
35
3.2.2
Fcy-Rezeptorexpressionsprofil
36
3.2.3
Dendritische Zellen und Fcy-Rezeptoren
37
3.2
3.2.1
3.3
Dendritische Zellen in der Medizin
38
3.3.1
Monozyten-gereifte Dendritische Zellen
39
3.3.2
Die in vivo Antigen-Beladung.
40
3.4
Zielsetzung
46
ERGEBNISSE
47
4.1
Fcy-Rezeptar-Expression auf DCs unter nicht inflammatorischen
Bedingungen
47
4.1.1
Knochenmarks-gereifte Dendritische Zellen
47
4.1.2
Lymphoide Organe
49
4.1.2.1
Milz und Lymphknoten
49
4.1.2.2
Knochenmark und Thymus
55
Nicht Lymphoide Organe
58
Lunge
58
4
4.1.3
4.1.3.1
4.2
Klonierung und Expression chimärer Fcy-Rezeptor-Antikörper
61
4.2.1
S'-Rapid Amplification ofcDNA ends (5'RACE)
61
4.2.2
4.2.3
Overlap-PCR
Antikörperproduktion und Bindungs-Test
63
64
4.3
In vivo Bindung, Endozytose von und DC-Aktivierung durch aFcyRezeptor-Antikörper
66
4.3.1
In vivo Bindung der rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörper
66
4.3.2
Endozytose von Chimären Fcy-Rezeptor-Antikörpern
68
XI
Inhaltsverzeichnis
4.3.3
4.4
Die Aktivierung Dendritischer Zellen durch Chimäre Antikörperkonjugate
70
In vivo Antigen-Beladung mit aFcy-Rezeptor-Antikörpern
73
4.4.1
CD4* und CD8* T-Zellantworten nach Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung
73
4.4.2
Rezeptorspezifität der Antigen-Beladung über FcyRIlB und FcyRIV
77
4.4.3
Antigen-Beladung nach Clodronat-Vesikel-Gabe
79
4.4.3.1
Clodronat-Vesikel depletiert Monozyten und CDllc*CDS* DCs
80
4.4.3.2
T-Zellantworten nach Clodronat-Vesikelgabe
84
Antigen-Beladung in CDllc-DTR-Mäusen nach Diphtherietoxin-Gabe
85
4.4.4.1
Diphtherie-Toxin depletiert CD11c*** Zellen in CDllc-DTR-Mäusen
85
4.4.4.2
T-Zellantworten nach Diphterietoxin-Gabe
87
4.4.4
4.4.5
4.4.5.1
T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pDC-depletierten
Tieren
'88
aPDCA-1 depletiert pDCs in C57BU6-Mäusen
88
4.4.5.2
4.4.6
T-Zellantworten nach pDC-Depletion
T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pMT-Mäusen
89
91
4.4.6.1
4.4.7
4.4.7.1
T-Zellantworten in B-Zell-freien Tieren
Antigen-Beladung von FcyRIV in Zelltyp-spezifischen knock out-Tieren
CDllc-Cre x FtyR/V*™"°*- und LysM-Cre x FcyRI\/kua°"-Mäuse
91
92
92
ctFcyRIV-Antigen-Beladung in zelltypspezifischen knock out-Mäusen
94
4.5
4.4.7.2
Ex vivo Analyse der verantwortlichen Zellpopulation
95
4.6
Antigen-Beladung Dendritischer Zellen unter inflammatorischen
Bedingungen
96
4.6.1
In vivo Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung unter inflammatorischen
Bedingungen
97
4.6.2
aCD40-Costimulation in Wildtyp- und Fcyx FcyRIlB'*'-Mäusen
100
4.6.3
Antigen-Beladung in Wildtyp- und FcyRUB,'-Tieren unter aCD40Costimulation
Antigen-Beladung in C57BU63- und pMT*-Tieren unter oCD40Costimulation
Anedyse der fehlenden Reaktion auf aCD40 in FcyRIlB^'-Mäusen
4.6.4
4.6.5
102
105
106
4.6.5.1
CD40-Expression in C57BU6J-, Fcy''- und FcyRIlB1'-Mäusen
107
4.6.5.2
In vivo Aktivierung von Immunzellen nach aCD40-Gabe
110
4.7
T-Zellantworten in naiven Mäusen
112
4.8
Ausblick
116
DISKUSSION
117
5
5.1
Fcy-Rezeptor Expression auf Dendritischen Zellen
117
5.2
Generierung neuer aFcy-Rezeptor-Antigenbeladungsantikörper
121
5.3
In vivo Bindung, Endozytose von und Aktivierung durch aFcy-RezeptorAntikörper
124
5.4
In vivo Antigen-Beladung mit aFcy-Rezeptor-Antikörper-AntigenKonjugaten
125
5.5
Ex vivo Analyse der Antigen-Präsentation durch verschiedene
Zellpopulationen
132
5.6
In vivo Antigen-Beladung mit aFcy-Rezeptor-Antikörpern unter
Costimulation
135
5.7
Untersuchungen zur Rolle des FcyRIlB für die aCD40-Costimulation
137
XII
Inhaltsverzeichnis
5.8
6
6.1
T-Zell-Antworten in naiven Mäusen
139
METHODEN
143
Zellkultur
143
Verwendete Zelllinien
143
6.1.2
Passagieren stabiler Zelllinien
143
6.1.3
Einfrieren und Auftauen von Dauerzellkulturen
144
6.1.4
Generation von DCs aus Knochenmarks-Monozyten
145
6.1.1
6.2
6.2.1
Klonierung
147
RNA-Präparation und Qualitätskontrolle
147
6.2.2
PCR
148
6.2.3
Agarose-Gelelektrophorese
150
6.2.4
Gelextraktion und PCR-Purification
150
6.2.5
RT-PCR und 5'RACE
151
6.2.6
Blunt- und TA-Klonierung von PCR-Produkten in Topoisomerasevektoren
154
6.2.7
Overtap-PCRs
155
6.2.8
Restriktionsverdaus
156
6.2.9
Ligation
156
6.2.10
Primer-Annealing
157
6.2.11
Kompetente Bakterien
158
6.2.12
Transformation
159
6.2.13
Mini-Präparationen von Plasmid-DNA
159
6.2.14
Maxi-Präparation von Plasmid-DNA
160
6.2.15
Bestimmung von DNA-Konzentrationen
162
Antikörper-Produktion
162
6.3.1
Antikörperproduktion in ISF-1 (Zellkulturflasche/Einweg-Membran
Bioreaktor)
162
6.3.2
Transiente CaClrTransfektion zur Antikörperproduktion
163
6.3.3
6.3.4
Ammoniumsulfatfällung und Dialyse
Antikörperaufreinigung über Protein-G-Beads
165
166
6.3.5
SDS-Gelelektrophorese
167
6.3.6
Coomassie-Fäftoung
169
6.3.7
Antikörperkonzentrationsbestimmung (Bradford-Assay)
169
6.3.8
LPS-Removal.
170
6.3.9
Endotoxin-Test
171
6.3.10
Antikörpermarkierung
171
6.3
6.4
Experimente in Mäusen
173
6.4.1
Präparation von Einzelzellsuspensionen
174
6.4.2
FACS-Färbung
175
6.4.3
In vivo Antikörperbindung
176
6.4.4
Endozytose-Assay
177
6.4.5
Ex vivo Proliferations-Assay
178
6.4.6
MACS-Anreicherung und -Abreicherung
179
6.4.7
FACS-Sortierung
181
XIII
Inhaltsverzeichnis
6.4.8
CFSE-Markierung
181
6.4.9
In vivo Proliferations-Assays
182
6.4.10
In vivo Zelldepletionen
183
6.4.10.1 Depletion durch Diphtenetoxin (DT)
183
6.4.10.2 ADCC
183
6.4.10.3 Clodronat-Vesikel
184
6.4.11
7
Restimulations-Assays
184
VERZEICHNISSE
187
Abkürzungsverzeichnis
187
7.2
Verwendete Antikörper
190
7.3
Literaturverzeichnis
198
7.4
Abbildungsverzeichnis
215
DANKSAGUNG
225
7.1
8
XIV