Die Rolle von Siglec-H und Si- glec
Werbung
Die Rolle von Siglec-H und Siglec-15 in Infektionen und Auto immunität Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. Vorgelegt von Heike Schmitt aus Erlangen http://d-nb.info/1077932103 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Die Siglec-Familie 1 1.2 Siglec-H 3 1.2.1 Aufbau von Siglec-H 3 1.2.2 Expression von Siglec-H 4 1.2.3 Ligandenbindung von Siglec-H 4 1.2.4 Entwicklung und Funktion von plasmazytoiden dendritischen Zellen 5 1.2.5 Die Rolle von Typ-I Interferon und plasmazytoiden dendritischen Zellen in Infektionen 6 1.2.5.1 Toll-like Rezeptoren 6 1.2.5.2 Typ-I Interferon Produktion nach viraler Infektion 8 1.2.5.3 Das Cytomegalovirus 9 1.2.5.4 Siglec-H als Regulator von Typ-I Interferon 10 1.2.6 Die Rolle von Typ-I Interferon und plasmazytoiden dendritischen Zellen in der Autoimmunität 11 1.2.7 Virale Infektionen als Auslöser der Produktion von Autoantikörpem 1.3 Siglec-15 13 14 1.3.1 Aufbau von Siglec-15 14 1.3.2 Die Erkennung von Liganden durch Siglec-15 14 1.3.3 Expression von Siglec-15 15 1.3.4 Die Rolle von Siglec-15 in der Osteoklastenentwicklung 15 1.3.5 Die Rolle von Osteoklasten in de Rheumatoiden Arthritis 17 2. Zielsetzung der Arbeit 20 3. Material 21 3.1 Antikörper und Konjugate 21 3.2 Antibiotika 22 3.3 Chemikalien 23 3.4 Puffer, Lösungen und Medien 25 3.5 Oligonukleotide 31 3.6 Reaktionssysteme (Kits) 32 3.7 Geräte und Software 33 3.8 Versuchstiere 33 Inhaltsverzeichnis 4. Methoden 4.1 35 Zellkultur 35 4.1.1 Lebendzellzahlbestimmung 35 4.1.2 Embryonale Fibroblastenzellen und embryonale Stammzellen 35 4.2 4.1.2.1 Kultivierung 35 4.1.2.2 Präparation embryonaler Fibroblasten 35 4.1.2.3 Wegfrieren von EMFIS und ES-Zellen 36 4.1.2.4 Autlauen von EMIFS und ES-Zellen 36 4.1.2.5 Passagieren und Kultivieren von ES-Zellen 37 4.1.2.6 Vorbereitung der ES-Zellen für die Blastozysteninjektion 37 4.1.2.7 Transfektion von ES-Zellen 37 4.1.2.8 Picken von ES-Zellen nach Selektion 38 Arbeiten mit DNA 39 4.2.1 Agarosegelelektrophorese 39 4.2.2 Gelextraktion 39 4.2.3 Restriktionsverdau von DNA 40 4.2.4 Sterilfällen von DNA 40 4.2.5 Gewinnung genomischer DNA 40 4.2.6 Southern Blot 41 4.3 4.4 4.5 4.2.6.1 Verdau genomischer DNA 41 4.2.6.2 Blotten des Agarosegels 41 4.2.6.3 Radioaktives Markieren der Sonde 42 4.2.6.4 Fixierung der DNA auf der Membran 42 4.2.6.5 Hybridisierung der Membran 43 4.2.6.6 Detekion 43 Genexpressionsanalysen 43 4.3.1 Isolierung von RNA 43 4.3.2 cDNA Synthese 43 4.3.3 Real-time-quantitative PCR 44 Präparation von murinen Zellen 45 4.4.1 Aufbereitung von Organen 4.4.2 Extrazelluläre Färbung von Oberflächenmarkern fOr die Durchflusszytometrie.. 45 4.4.3 Fixieren von Zellen 46 4.4.4 Blutentnahme bei Mäusen 46 Immunisierung von Mäusen 4.5.1 Thymus-unabhängige Immunisierung 45 46 46 Inhaltsverzeichnis 4.5.2 4.6 Thymus-abhängige Immunisierung In vitro Generierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen 46 47 4.6.1 Aussäen von Knochenmarkszellen 47 4.6.2 MACS Aufreinigung 47 4.6.3 Stimulation von in vitro generierten pDCs mit TLR Stimuli 48 4.7 Messung der Zytokinproduktion von in vitro stimulierten pDCs mittels ELISA. 48 4.7.1 Interferon-alpha ELISA 48 4.7.2 lnterleukin-12 ELISA 49 4.8 Infektion von Siglec-H Tieren mit murinem Cytomegalovirus 50 4.8.1 Intravenöse Infektion von Siglec-H Tieren 50 4.8.2 Aufbereitung der Organe zur Virenlastbestimmung mittels Luziferasetest 50 4.8.3 Serum IFN-alpha ELISA mCMV infizierter Siglec-H Tiere 51 4.8.4 In vitro Restimulation mCMV spezifischer T-Zellen 51 4.9 Infektion mit Leishmanium infantum 52 4.9.1 Intravenöse Infektion mit Leishmanium infantum 52 4.9.2 GrenzverdOnnungstest zur Feststellung der Parasitenlast 52 4.9.3 In vitro Restimulation von Milzzellen nach Infektion mit Leishmanium infantum. 53 4.9.4 Serum lnterleukin-12 ELISA nach Infektion mit Leishmanium infantum 4.10 Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) 54 54 4.10.1 Applizieren der EAE 54 4.10.2 Klinisches Bewerten der EAE 55 4.11 Kollagen induzierte Arthritis 4.11.1 Präparation der Chicken Typ II Kollagen Emulsion 4.11.2 Klinisches Bewerten der CIA Symptome 4.12 Untersuchungen zur Autoimmunität 55 55 56 56 4.12.1 Proteinurie 56 4.12.2 Nachweis von anti-nukleären Antikörpern auf HEp2-Zellen 56 4.12.3 BUN - Hamstoff-Stickstoffgehalt im Blut 57 4.12.4 Nierenhistologie 57 4.13 Immunhistologie 58 4.13.1 Einfrieren von Organen 58 4.13.2 Herstellung von Gefrierschnitten 58 4.13.3 Immunfluoreszenzfärbung von Gefrierschnjtten 58 4.14 ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay 59 4.14.1 Grundserumtiter ELISA 59 4.14.2 Serum ELISA nach thymus-unabhängiger Immunisierung 60 Inhaltsverzeichnis 4.14.3 Serum ELISA nach thymusabhängiger Immunisierung 60 4.14.4 Anti-dsDNA ELISA 60 4.14.5 Kotlagen ELISA 61 4.15 Reifung von Osteoklasten 61 4.15.1 Kultivierung und Differenzierung von Osteoklasten 61 4.15.2 TRAP (Tartrat-resistente alkalische Phosphatase) Färbung von Osteoklasten..62 5. Ergebnisse 63 5.1 Keine veränderten pOC Zellzahlen In Siglec-H defizienten Mäusen 5.2 Erhöhte IgGI und lgG2b natürliche Antikörperspiegel in Siglec-H ko Mäusen.. 66 5.3 Verringerte lgG3 anti-TNP spezifische Antikörperspiegel nach Immunisierung mit dem thymus-unabhängigen Antigen TNP-Ficoll 67 5.4 Unveränderte Immunantwort bei Siglec-H defizienten Immunisierung mit dem thymus-abhängigen Antigen NP-KLH 5.5 In vitro gereifte pDCs von Siglec-H ko Tieren produzieren mehr IFNa und IL-12 nach TLR Stimulation 71 5.6 Mäusen Die Rolle von Siglec-H während einer mCMV Infektion 63 nach 69 72 5.6.1 Siglec-H defiziente Tiere zeigen eine reduzierte Viruslast nach mCMV lnfektion73 5.6.2 Siglec-H defiziente Tiere produzieren mehr IFNa nach mCMV Infektion 5.6.3 Kein Unterschied der intrazellulären IFN-y Produktion nach in vitro Restimulation mit mCMV spezifischen Peptiden 77 5.7 76 Kein Unterschied in der Parasitenlast bei Siglec-H defizienten Mäusen nach einer Infektion mit Leishmanium infantum 79 5.7.1 Kein Unterschied in der Parasitenlast nach Infektion mit Leishmanium infantum in Siglec-H defizienten Mäusen 79 5.7.2 Siglec-H defiziente Mäuse zeigen eine leicht erhöhte Serum IL-12 Produktion 32 Tage nach Infektion mit Leishmanium infantum 81 5.7.3 Kein Unterschied nach in vitro Restimulation von Milzzellen nach Infektion mit Leishmanium infantum 82 5.8 Siglec-H defiziente Mäuse zeigen einen höheren klinischen EAE score 5.9 Alternde Siglec-H defiziente Mäuse zeigen milde Anzeichen systemischer Autoimmunität 86 5.9.1 60 Wochen alte Siglec-H defiziente Mäuse zeigen erhöhte Autoantikörper 5.9.2 60 Wochen alte Proteinurie 5.10 84 87 naive Siglec-H defiziente Mäuse zeigen leicht erhöhte 89 MCMV infizierte Siglec-H ko Mäuse zeigen nach 26 Wochen Infektion eine starke Lupus-ähnliche Autoimmunerkrankung 92 5.10.1 MCMV infizierte Siglec-H ko Mäuse zeigen ab Woche 10 nach der Infektion stark erhöhte Autoantikörper 93 Inhaltsverzeichnis 5.10.2 MCMV infizierte Siglec-H ko Mause zeigen nach einigen Wochen stark erhöhte BUN Level, Proteinurie und eine stark geschadigte Nierenmorphologie 97 5.10.3 Erhöhte Typ-I Interferon Signatur 10 oder 26 Wochen nach einer mCMV ilnfektion von Siglec-H defizienten Mausen 103 5.10.4 Leichter Unterschied der intrazellulären IFNy Produktion nach in vitro Restimutation mit mMCV spezifischen Peptiden zehn Wochen nach mCMV Infektion 107 5.11 Generierung einer Siglec-15 defizienten Maus 109 5.11.1 Linearisierter Siglec-15 Targetvektor und Kreuzungsschema 110 5.11.2 Bestätigung positiver ES-Zeii Klone 111 5.11.3 Southern Blot Analyse der positiven ES-Zellklone 111 5.11.4 Injektion des bestätigten ES-Zellklons B-D1 in Blastozysten von C57BI/6 Mausen 114 5.12 Charakterisierung von Siglec-15 defizienten Mäusen 116 5.12.1 Siglec-15 defiziente Mäuse zeigen eine Defekt in der Osteoklastenentwicklung116 5.12.2 Siglec-15 defiziente Mäuse zeigen einen erhöhten klinischen Arthritis score in einer Kollagen-induzierten Arthritis 118 6. Diskussion 121 6.1 PDC Zellzahlen in Siglec-H defizienten Mäusen 6.2 Untersuchungen von natürlichen Antikörperspiegeln und nach Immunisierung mit einem thymus-abhängigen oder thymus-unabhängigen Antigen 123 121 6.3 Untersuchung der Zytokinproduktion von in vitro gereiften pDCs nach Stimulation mit TLR Liganden 124 6.4 Die Rolle von SIglec-H während einer Infektion mit mCMV 6.5 Die Rolle von Siglec-H während einer Infektion mit Leishmanium infantum.... 128 6.6 Der Einfluss von Siglec-H und pDCS auf den Verlauf einer EAE 6.7 Die Entstehung eines milden Lupus-ähnlichen Phänotyps in gealterten naiven Siglec-H ko Mäusen 131 6.8 Das Fehlen von Siglec-H als Auslöser eines starken Lupus-ähnlichen Phänotyps 26 Wochen nach einer einmaligen mCMV Infektion 133 6.9 Siglec-15 als wichtiger Faktor in der Osteoklastendifferenzierung 138 6.10 Die Rolle von Siglec-15 in einer Kollagen-induzierten Arthritis 139 126 129 7. Zusammenfassung 142 8. Summary 144 9. Literaturverzeichnis 146 Inhaltsverzeichnis 10. Anhang 10.1 160 Abkürzungsverzeichnis 160 10.2 Abbildungsverzeichnis 165 10.3 Tabellenverzeichnis 167 11. Danksagung 168 12. Eigene Publikationen 170
