SarahStengerDoktorarbeit

Prognostische Bedeutung des mittleren Abstandes
zwischen regulatorischen T-Zellen und Memory-T-Zellen
und deren Dichten beim Rektumkarzinom
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Sarah Stenger
aus
Seoul
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
PD Dr. L. Distel
Gutachter :
Prof. Dr. R. Fietkau
Tag der mündlichen Prüfung:
20. November 2013
Für meinen Sohn Samuel
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung....................................................................................................... 1
1.1.
Hintergrund und Ziele ..................................................................................... 1
1.2.
Methoden ........................................................................................................ 1
1.3.
Ergebnisse und Beobachtung .......................................................................... 2
1.4.
Praktische Schlussfolgerungen ....................................................................... 2
2.
Abstract ....................................................................................................................... 3
3.
Einleitung .................................................................................................................... 5
3.1.
Rektumkarzinom ............................................................................................. 5
3.1.1.
Epidemiologie ............................................................................................. 6
3.1.2.
Ätiologie ..................................................................................................... 6
3.1.3.
Prognose ...................................................................................................... 7
3.1.4.
Klinik .......................................................................................................... 7
3.1.5.
Prävention ................................................................................................... 7
3.1.6.
Lymphogene und hämatogene Metastasierung ........................................... 8
3.1.7.
Histologie .................................................................................................... 9
3.1.8.
TNM-Klassifikation .................................................................................. 10
3.1.9.
Regressionsgrade nach Dworak ................................................................ 15
3.1.10.
Therapie des Rektumkarzinoms ................................................................ 15
3.2.
T-Lymphozyten............................................................................................. 18
3.2.1.
Rolle der T-Lymphozyten in der adaptiven Immunantwort...................... 18
3.2.2.
Herkunft und Reifung der T-Lymphozyten .............................................. 18
3.2.3.
CD45RO positive Memory T-Zellen ........................................................ 18
3.2.4.
FoxP3 als Aktivitätsmarker der Regulatorischen T-Lymphozyten ........... 20
4.
5.
6.
Methoden .................................................................................................................. 21
4.1.
Patientenkollektiv.......................................................................................... 21
4.2.
Herstellung der Schnitte und Tissue Microarrays (TMAs) ........................... 24
4.3.
Immunhistologische Doppelfärbung ............................................................. 24
4.4.
Auswertung ................................................................................................... 25
4.5.
Statistik ......................................................................................................... 26
Ergebnisse ................................................................................................................. 27
5.1.
Dichte der Treg und Memory-Zellen ............................................................ 27
5.2.
Zellabstände .................................................................................................. 30
5.3.
Korrelationen ................................................................................................ 37
5.4.
Clusterung der T-Zellen ................................................................................ 44
Diskussion ................................................................................................................. 49
6.1.
Tumortherapie richtet sich nach dem Staging ............................................... 49
6.2.
Fokus auf die Zellverteilung ......................................................................... 50
6.3.
FoxP3+ regulatorische T-Zellen als Prognoseparameter .............................. 51
6.4.
Memory-T-Zellen als Prognoseparameter .................................................... 51
6.5.
Subgruppen der regulatorischen T-Zellen ..................................................... 52
6.6.
Subgruppen der Memory-T-Zellen ............................................................... 52
6.7.
Lokalisation und Verteilung der Tumorinfiltrierenden Lymphozyten .......... 53
6.8.
Prognostische Signifikanz der Zellabstände in der Invasionsfront ............... 53
6.9.
Abstand zwischen Treg im Tumorstroma als hochsignifikanter
Prognoseparameter ........................................................................................ 54
6.10.
Abstände zwischen Treg und Memory-T-Zellen im Tumorgewebe von
prognostischer Signifikanz ............................................................................ 55
6.11.
Immunmodulatorischer Ansatz zur Nutzung der Ergebnisse ........................ 56
6.12.
Problem der adjuvanten Therapie beim Rektumkarzinom ............................ 56
6.13.
Bestrahlung beeinflusst lokale Immunantwort im Rektumkarzinom nicht .. 57
6.14.
Systemische Wirkung des Immunsystems .................................................... 58
6.15.
Integration immunologischer Kriterien ins TNM-System ............................ 59
7.
Literaturverzeichnis .................................................................................................. 60
8.
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. 69
9.
Danksagung............................................................................................................... 70
1
1. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziele
Das Rektumkarzinom stellt Forscher und Therapeuten vor schwierige Aufgaben. In vielen
Studien wurden und werden Therapieregime zur Verbesserung des tumorfreien und des
allgemeinen Überlebens (disease-free survival = DFS und overall survival = OS)
untersucht. Während es bereits gute Erfolge in Bezug auf das DFS gegeben hat, ist das
OS unverändert. Dies hängt mit der hohen Rate systemischer Tumorrekurrenz zusammen.
Ein Lösungsansatz wäre die Verschärfung der systemischen Therapie. Dies hätte jedoch
ein erhebliches Maß an Nebenwirkungen zur Folge. Die Frage ist, ob ein Parameter
existiert, anhand dessen man jene Patientengruppe, die von einer weiteren Chemotherapie
profitieren würde, einheitlich charakterisieren kann.
Ein Faktor, der bei der Tumorkontrolle eine wichtige Rolle spielt und bereits mehrfach
prognostische Signifikanz bewiesen hat, ist die adaptive Immunantwort, vertreten durch
die Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL).
In dieser Arbeit wird das Verhalten der regulatorischen- (Treg) und der Memory-T-Zellen
im Rektumkarzinom vor und nach Radiochemotherapie sowie deren prognostische
Relevanz für diese Tumorentität analysiert. Zusätzlich wird nun der räumliche Abstand
zwischen den jeweiligen Zellen untersucht um Rückschlüsse auf das Infiltrationsmuster,
eine Clusterung oder eine Interaktion zwischen den Zellen machen zu können.
1.2. Methoden
Das Patientenkollektiv umfasste insgesamt 130 Patienten mit Rektumkarzinom in den
Stadien II bis IV, die in den Jahren 2006 bis 2010 in der Erlanger Strahlenklinik
behandelt wurden.
Es wurden jeweils ein Schnitt oder Tissue Microarray (TMA) aus der Biopsie und zwei
TMAs aus Tumorgewebe, Invasionsfront und Normalgewebe gefertigt und mit einer
immunhistochemischen Doppelfärbung durch Antikörper gegen FoxP3 und CD45RO
gefärbt. Von den Biopsien, aus denen nicht genug Material für eine Stanze gewonnen
werden konnte, wurden Schnitte angefertigt. Die Zählung der Zellen erfolgte
halbautomatisch mithilfe des Programms Biomas-Count (PD Dr. Distel, Erlangen).
Vorhandenes Tumorgewebe und Stroma wurden, falls vorhanden, getrennt behandelt.
2
1.3. Ergebnisse und Beobachtung
Sowohl im Stroma der Biopsie, als auch in den Tumorstanzen war eine hohe Dichte der
regulatorischen T-Zellen (Treg) mit einem besseren tumorfreien Überleben (DFS)
verbunden (p=0,032; p=0,005). In der Invasionsfront korrelierte eine hohe Memory-TZelldichte signifikant mit einem besseren DFS (p=0,046).
Um die Aussagekraft der Zellzählung zu erweitern wurden die Abstände zwischen den
Zellen gemessen und gemittelt. Hier ergab sich ein positiver Zusammenhang eines
niedrigeren Abstandes zwischen den Treg in der Invasionsfront und im Stroma des
Primärtumors mit einem besseren DFS (p=0,017; p=0,00035).
Intraepithelial im Tumor konnte außerdem beobachtet werden, dass sich ein niedrigerer
Abstand von Memory-T-Zellen zu Treg positiv auf das DFS auswirkte (p=0,001). Im
Stroma derselben Stanzen waren kürzere Abstände von Treg zu Memory-T-Zellen mit
einem besseren
DFS verknüpft (p=0,027). Im Stroma der Invasionsfront war ein
niedrigerer Abstand der Memory-T-Zellen untereinander mit einem längeren DFS
verbunden (p=0,051).
Die Abstände zwischen den Zellen alleine genügten nicht um Aussagen über ihr
Gruppierungsverhalten machen zu können. Korrelationsdiagramme zwischen Zelldichten
und Abständen ergaben, dass sowohl Memory-T-Zellen als auch Treg im Tumorgewebe
ungleichmäßig verteilt vorlagen. In den übrigen untersuchten Regionen lagen sie zufällig
und somit gleichmäßig verteilt vor. Außerdem wurden alle Daten miteinander korreliert
um Zusammenhänge zwischen den Regionen sichtbar zu machen. Demzufolge findet die
Immunantwort nicht nur lokal am Primärtumor statt.
1.4. Praktische Schlussfolgerungen
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl FoxP3+ Treg als auch CD45RO+
Memory-T-Zellen und sowohl deren Dichten als auch deren Abstände unter- und
zueinander im Rektumkarzinom prognostisch signifikant sind. Ein abskopaler Effekt der
Bestrahlung auf Treg oder Memory-T-Zellen konnte nicht beobachtet, aber auch nicht
sicher ausgeschlossen werden. Die Wirkung der adaptiven Immunantwort über den
Primärtumor hinaus konnte bestätigt werden. Treg und Memory-T-Zellen hängen in noch
nicht verstandener Weise zusammen. Ihr Zusammenspiel muss weiter untersucht werden,
was die weitere Analyse ihrer Lage zueinander beinhaltet.
3
2. Abstract
Concerning rectal cancer therapists are facing a difficult challenge. Many trials have been
trying to improve therapeutic strategies for a better disease-free- (DFS) and overall- (OS)
survival. The efforts were rewarded as to DFS, while the OS remains almost unchanged.
This unsatisfactory attribute of rectal cancer is due to a very high systemic rate of
recurrence in this type of tumor. Chances are that by an aggravated chemotherapy this can
be altered. Since an intensification of therapy is accompanied by a worsening of sideeffects, a criterion for further prediction of prognosis has to be found to discern the
patients who will benefit from additional therapy from those who most likely will not. In
many surveys the adaptive immune response, particularly the tumor infiltrating
lymphocytes (TIL), has proven significance with reference to prognosis. However the
details of immune response to tumors are not yet fully understood.
This survey analyses the role of two subgroups of TILs, regulatory T-cells (Treg) and
memory-T-cells, and their impact on prognosis.
A total of 130 patients with rectal cancer stages II to IV were comprised. All were treated
in the “Strahlenklinik Erlangen” in 2006 through 2010. The tissue under examination
came from biopsies, primary tumor site, invasive margin and normal tissue close to the
invasive margin. One tissue microarray (TMA) was taken from each biopsy and two
TMAs were obtained from the remaining regions respectively and double stained
immunohistologically by antibodies against Treg and memory-T-cells (FoxP3 and
CD45RO). Some biopsy blocks contained rare material, so samples could not be
performed and slices were drawn directly. The stained cells were counted semi
automatically supported by the software ”Biomas-Count” (PD Dr. Distel, Erlangen).
A high density of Treg in the stroma of the biopsy as well as in the primary tumor was
associated with a better prognosis (p=0,032; p=0,005). In the invasive margin a higher
density of memory-T-cells correlated with a better DFS (p=0,046).
To amplify the informative value the distances between the cells were quantified as well.
According to these results a lower distance between the Treg in the invasive margin and
the stromal compartment came along with a better DFS (p=0,017; p=0,00035). A lower
distance from memory-T-cell to Treg in the tumor epithelium was also associated with a
longer DFS (p=0,001), whereas in the stromal compartment a shorter distance from Treg
to memory-T-cell had a positive impact on DFS (p=0,027). In the stromal compartment
of the invasive margin a lower distance between the memory-T-cells involved a better
DFS (p=0,051). For further investigation of the spatial behavior of the cells the
4
distribution was observed and found to be irregular for both Treg and memory-T-cells in
the tumor tissue. Pre- and posttherapeutic results were compared but showed no abscopal
effect of radiotherapy treatment. Then all data were correlated to make a statement about
the relation between different tissues. This illustrated that the immune response was
visible beyond the primary tumor site.
In conclusion the density as well as the distribution of FoxP3+ Treg and CD45RO+
memory-T-cells have prognostic significance in rectal cancer. An abscopal effect of
radiation could neither be observed nor denied. It was shown that the immune response
was not locally restricted to the tumor site. The interaction of Treg and memory-T-cells
has to be investigated in future surveys.
5
3. Einleitung
3.1. Rektumkarzinom
Als Rektumkarzinom wird laut internationaler Definition jeder Tumor bezeichnet, dessen
aboraler Rand bei der Messung mit dem starren Rektoskop 16 cm oder weniger von der
Anocutanlinie entfernt ist (Preiß 2010). Es wird häufig im selben Atemzug mit dem
Kolonkarzinom genannt. Risikofaktoren, Klinik, Klassifikation und Diagnostik gleichen
einander. Bezüglich der Therapie und des Rezidivverhaltens jedoch ergeben sich
deutliche Unterschiede. An der Therapie des Rektumkarzinoms wird intensiv geforscht,
da sich hierfür noch kein zufrieden stellender internationaler Standard ergeben hat. Die
neoadjuvante Radiotherapie hat sich in den letzten Jahren besonders für das
Rektumkarzinom im UICC-Stadium III etabliert (Tumorzentrum 2009). In der
CAO/ARO/AIO-04-Studie der Erlanger Strahlenklinik wird derzeit der Nutzen einer
simultanen Oxaliplatin-haltigen Chemotherapie für den Patienten erforscht. Daten von 62
dieser Studienpatienten wurden in diese Studie integriert. Der Studientherapieplan sieht
eine aggravierte, 5-FU-basierte Chemotherapie mit Oxaliplatin und im adjuvanten Teil
der Therapie Folinsäure vor. Eine Skizze der Studie ist im Folgenden (Abbildung 1)
dargestellt:
Abbildung 1: Studienschema der CAO/ARO/AIO-04-Studie der Erlanger Strahlenklinik
(Rödel et al. 2003; Rödel et al. 2012; Sauer et al. 2012)
6
3.1.1. Epidemiologie
Die International Agency for Research on Cancer (IARC) veröffentlichte in der
GLOBOCAN 2008-Statistik die Inzidenzraten sowie die Mortalitätsraten aller
Karzinomentitäten. Insgesamt starben laut dieser im Jahr 2008 7,6 Millionen Menschen
weltweit an Krebs, 608.000 davon an kolorektalen Karzinomen (colorectal cancer =
CRC) (Ferlay et al. 2010). Die CRC, Karzinome des Dickdarms (Kolon) und des
Enddarms
(Rektums)
zusammengefasst,
stellten
2008
mit
1,24
Millionen
Neuerkrankungen die vierthäufigste Krebsdiagnose dar (Ferlay 2010).
Verhältnismäßig mehr Fälle von CRC wurden in den Industriestaaten verzeichnet, allen
voran Australien und Neuseeland (Jemal et al. 2008). Den größten Anteil an den CRC
machen mit fast 60% die Karzinome des Enddarms aus. Weitere 25% finden sich im
rektosigmoidalen Übergang oder im Sigma. Ist ein Patient an einem CRC erkrankt besteht
eine Wahrscheinlichkeit von 4%, dass er ein synchrones Karzinom in einem anderen
Darmabschnitt entwickelt. Polypen finden sich dann bei bis zu 35% der Patienten.
Epidemiologisch werden Kolon- und Rektumkarzinome fast immer zusammengefasst, da
sie sich bezüglich Ätiologie, Symptomen, Diagnostik, Stadiengruppierung („Staging“)
und Nachsorge gleichen. Die Prognose des Rektumkarzinoms ist jedoch für jedes
Stadium jeweils bis zu 10% schlechter als die des Kolonkarzinoms (Sauer 2010). Der
Grund hierfür ist die schnellere Rekurrenz des Rektumkarzinoms (Tumorzentrum 2009).
90% der CRC treten nach dem 50. Lebensjahr in Erscheinung. Ab dem 40. Lebensjahr
verdoppelt sich die Inzidenz alle 10 Jahre (Herold 2009).
3.1.2. Ätiologie
Wie für jedes Karzinom gelten auch für das Rektumkarzinom allgemeine Risikofaktoren
wie Bewegungsmangel, Fettleibigkeit, exzessiver Alkohol- und Nikotinkonsum.
Ungünstig wirken sich außerdem der Verzehr von viel rotem oder geräuchertem Fleisch,
ballaststoffarme Ernährung und hoher Fettkonsum aus (Herold 2009; Jemal 2008;
Kaatsch P. 2012).
Bei der Risikostratifizierung müssen auch genetische Faktoren berücksichtigt werden. Zu
diesen zählen die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) als obligate Präkanzerose und
das autosomal dominant vererbte hereditäre, nichtpolypöse Kolonkarzinom-Syndrom
(HNPCC) als fakultative Präkanzerose. Sie machen jeweils 1% und 5% aller CRC aus
(Herold 2009; Preiß 2010). Seltener sind das Gardner-Syndrom und das Peutz-JeghersSyndrom, bei denen in bis zu 20% der Fälle Malignome im Darmtrakt auftreten (Preiß
2010).
7
Außerdem besteht nach langjähriger Erkrankung an Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn
ein deutlich erhöhtes Risiko der malignen Entartung im Rahmen der chronischen
Entzündung (Herold 2009; Preiß 2010).
Ist ein Verwandter ersten Grades vor seinem 60. Lebensjahr an einem CRC erkrankt
beträgt das Erkrankungsrisiko etwa 30%. Das Risiko wird niedriger je älter dieser
Verwandte bei der Erstdiagnose war und liegt bei einem Erkrankungsalter über 60 Jahren
bei 10%. Generell gilt auch ein hohes Lebensalter (über 40 Jahre) als eigenständiger
Risikofaktor für ein CRC (Herold 2009). Hat der Patient bereits einen tubulären oder
villösen Polypen, so steigt dessen Entartungsrisiko mit zunehmender Größe (Preiß 2010).
3.1.3. Prognose
Die Prognose des Rektumkarzinoms ist stark vom Stadium der Krankheit abhängig.
Beträgt das 5-Jahresüberleben im UICC-Stadium I noch 80–95%, leben nach 5 Jahren nur
noch 35-67% der Patienten mit einem CRC im Stadium III (Sauer 2010). Zum
Diagnosezeitpunkt finden sich bereits bei 25% der CRC Metastasen in der Leber (Herold
2009).
3.1.4. Klinik
Die Ursache für das häufige Auftreten von Metastasen zum Diagnosezeitpunkt ist nicht
ein besonders schnelles oder aggressives Wachstum, sondern die späte Symptomatik. Das
Rektumkarzinom macht sich klinisch erst in fortgeschrittenen Stadien zum Beispiel durch
Blutbeimischungen im Stuhl, allgemeine Symptome wie Leistungsminderung und
Abgeschlagenheit, Schmerzen oder Stuhlunregelmäßigkeiten wie paradoxe Diarrhoe
bemerkbar (Sauer 2010). Als Spätsymptom kann ein Ileus auftreten (Herold 2009). 10%
der CRC sind digital tastbar.
Von großer Bedeutung für die Prognose ist daher das Screening zur Früherkennung.
3.1.5. Prävention
Es gibt verschiedene Methoden, die für die Screening-Untersuchung in Frage kommen.
Die kostengünstigste und einfachste Möglichkeit bietet der FOBT, der Guaiac-Test auf
okkultes Blut im Stuhl. Dieser besteht aus drei mit Guaiacharz imprägnierten
Testbriefchen mit je 2 Auftragefelder, die für drei konsekutive Stühle gedacht sind.
Befindet sich in der Probe Hämoglobin, verfärbt sich das Filterpapier nach Zugabe von
Wasserstoffperoxid blau und der Test ist positiv (W. Schmiegel 2008).
Im Rahmen der gesetzlichen Vorsorgeuntersuchung zur Krebsfrüherkennung können sich
Versicherte ab dem 50. Lebensjahr einem Guaiac-Test unterziehen (Kaatsch P. 2012).
8
Außerdem wird die digitale Untersuchung des Rektums ab diesem Alter in den
Krebsfrüherkennungsrichtlinien des Bundesausschusses der Ärzte und Krankenkassen
empfohlen. Ab dem 55. Lebensjahr besteht der Anspruch auf eine Koloskopie, die die
höchste Sensitivität und Spezifität für den Nachweis von Polypen und CRC aufweist und
daher als Goldstandard festgelegt wurde (W. Schmiegel 2008). Bei unauffälligem Befund
kann sie nach 10 Jahren wiederholt werden.
Ist die endoskopische Untersuchung nicht erwünscht, wird in den S3-Leitlinien eine
jährliche Durchführung des Guaiac-Tests empfohlen (W. Schmiegel 2008). Die
Richtlinien schlagen hier den Test im 2-Jahres-Rhythmus vor. Zeigt sich in einem der 6
Testfelder ein positiver Befund, sollte dieser in jedem Fall endoskopisch abgeklärt
werden (Kaatsch P. 2012; Krankenkassen 2008; W. Schmiegel 2008).
Gehören Personen einer Risikogruppe an, gelten je nach Erkrankung abweichende
Richtlinien
für
die
Vorsorge.
Ein
früher
Diagnosezeitpunkt
dank
dieser
deutschlandweiten allgemeinen Vorsorgeuntersuchung ist vielleicht der wichtigste Faktor
bei der Optimierung der Therapie des CRC. Der Guaiac-Test alleine senkte laut Studien
die Sterblichkeit an CRC um durchschnittlich 23% (W. Schmiegel 2008).
Er hat sich durch die eindeutige Datenlage als Standardtest durchgesetzt und ist somit
immunologischen oder molekularen Testverfahren überlegen, die außerhalb von Studien
nicht empfohlen werden.
3.1.6. Lymphogene und hämatogene Metastasierung
Die anatomische Einteilung des Rektums in Drittel ist von großer Bedeutung für die
Therapie, da sie die Metastasenstraßen berücksichtigt. Auch die Prognose hängt mit dem
Sitz des Karzinoms zusammen. Je tiefer ein Rektumkarzinom sitzt, desto besser ist die
Prognose. Die Einteilung erfolgt nach dem mit dem starren Rektoskop von der
Anokutanlinie aus gemessenen Abstand:
12-16 cm
oberes Rektumdrittel
6-12 cm
mittleres Rektumdrittel
< 6 cm
unteres Rektumdrittel
Jedes Drittel metastasiert in die paraaortalen Lymphknoten. Das obere Drittel hat nur
diese eine Metastasenstraße. Das mittlere Drittel metastasiert zusätzlich in die
Beckenwand. Ist das Karzinom weniger als 6cm von der Anokutanlinie entfernt, liegt es
9
im unteren Rektumdrittel und streut nicht nur in die paraaortalen Lymphknoten und die
Beckenwand, sondern auch in die inguinalen Lymphknoten. Dem venösen Abfluss des
Rektums folgend, finden sich hämatogene Metastasen zunächst in der Leber und dann in
der Lunge. Das distale Drittel kann über die Vena cava direkt in die Lunge streuen
(Herold 2009).
3.1.7. Histologie
Die Mehrzahl der CRC sind Adenokarzinome. Die etablierte Theorie zur Entstehung
dieser Tumorentität wird mit der Adenom-Karzinom-Sequenz beschrieben. Diese besagt,
dass CRC aus intraepithelialen Neoplasien entstehen, von denen 90% tubuläre, villöse
oder tubulärvillöse Adenome sind (Herold 2009; WHO 2000).
Eine Erweiterung dieses Models stellt das Tumorprogressionsmodel nach Vogelstein und
Fearon dar. Dieses macht die Kumulation mehrerer Genmutationen für die Entstehung
eines CRC verantwortlich. Es handelt sich jeweils um die Aktivierung von Onkogenen
oder die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen. In ihrem Model beschreiben Fearon,
Vogelstein et al. die Reihenfolge der Mutationen wie im Folgenden (Abbildung 2)
dargestellt:
Abbildung 2: Model der Tumorigenese nach Fearon und Vogelstein (Fearon et al. 1990)
Zunächst wird eine Mutation auf Chromosom 5q verantwortlich für den Verlust des FAPGens gemacht, der mit einer Hyperproliferation des Epithels einhergeht. Dieses
entwickelt sich weiter zu einem frühen Adenom. Nach einiger Zeit weist diese
geringgradige Dysplasie DNA-Hypomethylierungen auf und wird durch die Mutation im
k-ras-Onkogen zu einer mittelgradigen Dysplasie. Die Mutation zweier weiterer Genloci
auf den Chromosomen 18q und 17p führt durch den Verlust der dazugehörigen
Tumorsuppressorgene DDC und p53 zur hochgradigen Dysplasie, bzw. zum Karzinom.
Dieser letzte Kontrollverlust über das Wachstum wird als maligne Transformation
bezeichnet. Insgesamt rechnen Vogelstein et al. mit einer Zeitspanne von mindestens 10
10
Jahren bis sich aus Normalgewebe ein Karzinom entwickelt hat. Weitere Mutationen
können schließlich zur Metastasierung führen (Fearon and Vogelstein 1990; Herold
2009).
In 2-5% der Fälle findet sich neben dem Primärkarzinom ein Zweittumor. Daher sollte
sich der Diagnose eines Karzinoms immer eine komplette Koloskopie anschließen. Neben
dem Adenokarzinom können auch muzinöses Adenokarzinom, Siegelring-, kleinzelliges,
Plattenepithel-,
adenosquamöses,
medulläres
und
undifferenziertes
Karzinom
vorkommen. Histologisch werden die Karzinome nach dem Grad ihrer Differenzierung in
low-grade und high-grade eingeteilt:
low-grade:
G1 = gut differenziert
G2 = mäßig differenziert
high-grade:
G3 = schlecht differenziert
G4 = undifferenziert (Herold 2009)
3.1.8. TNM-Klassifikation
Die „Union Internationale Contre le Cancer“ (UICC) teilt alle Karzinome anhand ihrer
Eigenschaften in Stadien ein. Diese TNM-Klassifikation beinhaltet die Beurteilung von
Eindringtiefe (T), Lymphknotenbefall (N) und Fernmetastasierung (M). Sie ist
prognostisch hoch signifikant und dient international als Standard. Nach den TNMStadien
richtet
sich
die
Krebstherapie.
In
regelmäßigen
Abständen
finden
Aktualisierungen nach dem neuesten Stand der Erkenntnisse statt.
So gilt seit dem 01. Januar 2010 die 7. Auflage des TNM.
Der Großteil der hier involvierten Patienten wurde jedoch nach der 6. Auflage den
Stadien I bis IV zugeordnet.
Die Einteilung erfolgt für Kolon und Rektum gemeinsam. In der folgenden Darstellung
nach der 6. Auflage des TNM werden nur die für das Rektumkarzinom relevanten
Details aufgeführt. Die Neuerungen der 7. Auflage sind in Kursivschrift eingefügt:
T – Primärtumor
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
kein Anhalt für Primärtumor
11
Tis
Carcinoma in situ: intraepithelial oder Infiltration der Lamina propria
T1
Tumor infiltriert Submukosa
T2
Tumor infiltriert Muscularis propria
T3
Tumor infiltriert durch die Muscularis propria in die Subserosa oder in nichtperitonealisiertes perirektales Gewebe
T4
Tumor infiltriert direkt in andere Organe oder Strukturen und/oder perforiert das
viszerale Peritoneum
T4a
Tumor perforiert viszerales Peritoneum
T4b
Tumor infiltriert direkt in andere Organe oder Strukturen
Anmerkungen:
-
Tis liegt vor, wenn Tumorzellen innerhalb der Basalmembran der Drüsen
(intraepithelial) oder in der Lamina propria (intramukös) nachweisbar sind, ohne
dass eine Ausbreitung durch die Muscularis mucosae in die Submukosa
feststellbar ist.
-
Direkte Ausbreitung in T4 (T4b) schließt auch die Infiltration anderer Segmente
des Kolorektums auf dem Weg über die Serosa ein, z.B. die Infiltration des
Sigma durch ein Zäkalkarzinom und für Tumoren in retroperitonealer
Lokalisation die direkte Invasion anderer Organe oder Strukturen auf dem Wege
der Ausbreitung jenseits der Muscularis propria
-
Ein Tumor, der makroskopisch an anderen Organen oder Strukturen adhärent ist,
wird als T4 klassifiziert. Ist bei der histologischen Untersuchung in den
Adhäsionen kein Tumorgewebe nachweisbar, soll der Tumor als pT3 klassifiziert
werden/in Abhängigkeit von der Tiefe der Wandinfiltration als pT1-pT3
klassifiziert werden.
N – Regionäre Lymphknoten
Dies sind für das Rektum:
Lymphknoten an Aa. rectalis superior, media und inferior, mesenterica inferior, iliaca
interna, mesorektale (paraproktale), laterale sakrale und präsakrale Lymphknoten sowie
sakrale Lymphknoten am Promontorium (Gerota).
12
Metastasen in anderen als den angeführten Lymphknoten werden als Fernmetastasen
klassifiziert.
NX
regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
Keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1
Metastasen in 1-3 regionären Lymphknoten
N1a
Metastase in 1 regionären Lymphknoten
N1b
Metastasen in 2-3 regionären Lymphknoten
N1c
Tumorknötchen bzw. Satellit(en) im Fettgewebe der Subserosa oder im
nicht-peritonealisierten
perirektalen
Fettgewebe
ohne
regionäre
Lymphknotenmetastasen
N2
Metastasen in 4 oder mehr regionären Lymphknoten
N2a
Metastasen in 4-6 regionären Lymphknoten
N2b
Metastasen in 7 oder mehr regionären Lymphknoten
Anmerkungen:
-
Ein Tumorknötchen im perirektalen Fettgewebe ohne histologischen Anhalt für
Reste
eines
Lymphknotens
wird
in
der
pN-Kategorie
als
regionäre
Lymphknotenmetastase klassifiziert, wenn die Form und glatte Kontur eines
Lymphknotens vorliegt. Wenn das Tumorknötchen eine irreguläre Kontur
aufweist, soll es in der pT-Kategorie klassifiziert und auch als V1
(mikroskopische Veneninvasion) oder, falls es makroskopisch erkennbar ist, als
V2 verschlüsselt werden, weil es dann sehr wahrscheinlich ist, dass es eine
Veneninvasion darstellt.
-
„Tumordeposits“ (Satelliten) sind makroskopische oder mikroskopische Nester
oder Knötchen im perikolorektalen Fettgewebe des Lymphabflussgebietes des
Primärtumors ohne histologisch erkennbare Residuen eines Lymphknotens. Sie
können einer kontinuierlichen Ausbreitung, einer Veneninvasion (V1, V2) oder
komplett metastatisch durchsetzten Lymphknoten entsprechen. Wenn solche
Tumorknötchen bei Läsionen, die sonst als T1 oder T2 klassifiziert werden,
nachgewiesen werden, ändert sich die T-Klassifikation nicht, aber die Knötchen
werden als N1c/pN1c beurteilt.
13
M – Fernmetastasen
MX
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
M0
keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
M1a
Metastase(n) auf ein Organ beschränkt (Leber, Lunge, Ovar,
nichtregionäre Lymphknoten)
M1b
Metastasen in mehr als einem Organ oder im Peritoneum
pTNM: Pathologische Klassifikation
Die pT-, pN-, pM-Kategorien entsprechen den T-, N- und M-Kategorien.
pN0
Regionäre Lymphadenektomie und histologische Untersuchung üblicherweise
von 12 oder mehr Lymphknoten.
Wenn die untersuchten Lymphknoten tumorfrei sind, aber die Zahl der
üblicherweise untersuchten Lymphknoten nicht erreicht wird, soll pN0
klassifiziert werden.
pN1c
Wenn ein solches Tumorknötchen vom Pathologen als vollständig durch Tumor
ersetzter Lymphknoten (im Allgemeinen mit glatter äußerer Kontur) angesehen
wird, dann sollte es als Lymphknotenmetastase klassifiziert werden und jedes
Tumorknötchen sollte einzeln als Lymphknotenmetastase gezählt und in der
Klassifikation berücksichtigt werden.
Stadiengruppierung
Stadium 0
Tis
N0
M0
Stadium I
T1, T2
N0
M0
Stadium IIA
T3
N0
M0
Stadium IIB
T4
N0
M0
Neues Stadium IIB
T4a
N0
M0
14
Stadium IIC
T4b
N0
M0
Stadium III
jedes T
N1, N2
M0
Stadium IIIA
T1, T2
N1
M0
T1
N2a
M0
Stadium IIIB
T3, T4
N1
M0
Neues Stadium IIIB
T3, T4a
N1
M0
T2, T3
N2a
M0
T1, T2
N2b
M0
Stadium IIIC
jedes T
N2
M0
Neues Stadium IIIC
T4a
N2a
M0
T3, T4a
N2b
M0
T4b
N1, N2
M0
Stadium IV
jedes T
jedes N
M1
Stadium IVA
jedes T
jedes N
M1a
Stadium IVB
jedes T
jedes N
M1b
Die Klassifikation dient nur der Einteilung von Karzinomen. Sie kann zunächst klinisch
oder mittels Bildgebung erfolgen, muss jedoch in jedem Fall histologisch gesichert
werden. Anhand von vorangestellten Kleinbuchstaben können Informationen zu Art und
Zeitpunkt der Klassifizierung verschlüsselt werden:
p
pathologisch
c
klinisch
r
Rezidiv
u
mittels Ultraschall
y
nach neoadjuvanter Therapie
a
bei Autopsie
(Wittekind 2002, 2010)
15
3.1.9. Regressionsgrade nach Dworak
Dworak et al. legten 1997 die heute gebräuchlichen
Regressionsgrade 0-4 nach
Bestrahlung fest. Dabei wurden Tumormasse, Ausmaß des fibrotischen Umbaus,
strahlenbedingte Vaskulopathie und Entzündungsreaktion in der Umgebung des Tumors
berücksichtigt.
Grad 0:
keine Regression
Grad 1:
Tumormasse dominiert, offensichtliche Fibrose und/oder Vaskulopathie
Grad 2:
fibrotische Veränderungen dominieren, wenige Tumorzellen/-zellnester
(einfach aufzufinden)
Grad 3:
sehr wenige (nur mikroskopisch sichtbare) Tumorzellen in fibrotischem
Gewebe mit oder ohne mukösem Material
Grad 4:
totale Regression, nur Fibrose ohne Tumorzellen
(Dworak et al. 1997)
3.1.10. Therapie des Rektumkarzinoms
Die Therapie des Rektumkarzinoms erfolgt multimodal. Das bedeutet, es werden
Radiotherapie,
Chemotherapie
und
operative
Verfahren
kombiniert.
Die
Therapieoptionen der einzelnen Stadien im Detail zu erörtern soll nicht Teil dieser Arbeit
sein. Vielmehr soll auf einige grundlegende Prinzipien hingewiesen werden, die in den
letzten Jahren als Antwort auf das Problem der schwer zu beherrschenden hohen
Rekurrenzraten des Rektumkarzinoms erarbeitet wurden. Die Ausschöpfung aller
therapeutischen Möglichkeiten und gleichzeitig die Vermeidung einer Übertherapie stellt
hier eine Herausforderung dar, denn die systemische Rezidivierung ist noch immer nicht
zu kontrollieren. Auch nach der Einführung neuester Therapieregime entwickeln 30% der
Patienten nach 10 Jahren Fernmetastasen (Sauer 2012). Die Lokalrezidivrate hingegen
konnte nicht zuletzt durch die Einführung der Radiotherapie (RT) in den
Behandlungsplan erfolgreich auf 5-8% gesenkt werden (Sautter-Bihl et al. 2013).
Es besteht Konsens darüber, dass die alleinige Operation keine adäquate Therapie des
lokal fortgeschrittenen Rektumkarzinoms darstellt (Koukourakis 2012). Jedoch ist die
Operation nach wie vor das Herzstück der Therapie (Fietkau 2010). Die Resektion im
16
Gesunden ohne mikroskopischen oder makroskopischen Nachweis von Tumorzellen (R0
laut UICC) ist nachgewiesenermaßen eine Grundvoraussetzung für die erfolgreiche
kurative Therapie (Hohenberger et al. 2009a). Die Qualität der Resektion selbst hängt
wiederum stark von der ausführenden Hand, also der des Chirurgen, und von der
angewandten Technik ab. Der britische Chirurg R.J. Heald postulierte bereits 1982, dass
die Entfernung des Tumors und des umliegenden Fettgewebes, das die lokalen
Lymphknoten beinhaltet, im Ganzen die Lokalrezidivrate senkt. Diese Totale
Mesorektale Exzision (TME) gilt heute als Standard in der Chirurgie des
Rektumkarzinoms (Enker 1997; Hohenberger et al. 2009b). Wie Heald selbst feststellte
ist eine chirurgische Technik erst dann erfolgreich wenn sie ausreichend einstudiert
wurde (Heald 2005). Im schwedischen TME-Projekt wurde dies deutlich: Durch ein
chirurgisches Training zur TME konnte die Lokalrezidivrate von etwa 20% auf 8%
gesenkt werden (Martling et al. 2005). Ein Sicherheitsabstand von 1 mm oder mehr senkt
ebenfalls das Lokalrezidiv- und das Metastasierungsrisiko (Nagtegaal et al. 2008).
Auch die Rolle der Bildgebung wächst mit dem Fortschritt der Technik, denn ein genaues
prätherapeutisches Staging ermöglicht neue Herangehensweisen an die Therapieplanung.
Bei der neoadjuvanten RT beispielsweise richtet sich das Bestrahlungsvolumen alleine
nach dem Bild, dessen Qualität und Analyse, und ist nicht in situ korrigierbar
(Hohenberger 2009a). Computertomografie, Magnetresonanztomografie (MRT) und
Endosonografie gelten derzeit als Standards für die Festlegung des Resektionsausmaßes.
Je nach Stadium ist jeweils die Computertomografie der MRT oder umgekehrt überlegen
(Mathur et al. 2003).
Bei der Festlegung eines perioperativen Therapiekonzeptes spielen viele Faktoren eine
Rolle. Hier stehen die Stadien II und III im Mittelpunkt. Das Stadium I kann laut
Leitlinien
ausschließlich
operativ
behandelt
werden,
während
im
Falle
der
Fernmetastasierung ein individueller Therapieplan erstellt werden muss. Hier schreiben
die Leitlinien kein Standardvorgehen vor (W. Schmiegel 2008).
Akute und chronische Toxizität der Therapeutika und der Radiotherapie müssen ebenso
berücksichtigt werden wie ihr eventueller Einfluss auf die Komplikationsrate während
und nach der Operation. In jedem Fall muss dem Allgemeinzustand des einzelnen
Patienten große Aufmerksamkeit geschenkt und die Therapie daran angepasst werden (W.
Schmiegel 2008).
17
Die
Ergebnisse
der
Erlanger
CAO/ARO/AIO-94-Studie
zeigen,
dass
beim
Rektumkarzinom im Stadium II und III die neoadjuvante RCT der adjuvanten RCT in
Bezug auf das Lokalrezidivrisiko und die Toxizität überlegen ist (Sauer et al. 2004).
Für diese Stadien wurde darauf folgend die Therapie deutschlandweit wie folgt
vereinheitlicht:

Neoadjuvante
RCT
mit
5-FU-basierter
CT
und
konventionell
fraktionierter RT bis 50,4 Gy

4-6 Wochen Pause

Operation mit TME

4-6 Wochen Pause

Adjuvante CT mit 5-FU (W. Schmiegel 2008)
Ein signifikanter Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten konnte auch in der
weiterführenden CAO/ARO/AIO-04-Studie nicht festgestellt werden (Sauer et al. 2004;
Sauer 2012).
Die adjuvante RCT ist nur in bestimmten Situationen indiziert, vornehmlich wenn keine
neoadjuvante RCT erfolgt ist. Einer neoadjuvanten RCT soll sich eine adjuvante alleinige
Chemotherapie mit 5-FU anschließen (W. Schmiegel 2008).
Durch diese Behandlungspläne konnten das tumorfreie Überleben (DFS), insbesondere
das Lokalrezidivrisiko, und die Toxizität der Therapie verbessert werden (Fietkau 2010;
Hohenberger 2009a; Rödel 2012; Rödel et al. 2005; Sauer 2012).
Ziel der aktuellen Forschung ist es, das Gesamtüberleben zu beeinflussen, das nun
vornehmlich durch die Fernmetastasierung limitiert ist (Rödel 2012). Dies könnte zum
Beispiel durch Aggravation der systemischen Therapie vor oder nach der Operation und
Modifikation des Therapiezeitpunktes möglich sein (Hohenberger 2009a).
Zu bedenken gilt, dass die kombinierte RCT mit Nebenwirkungen einhergeht, deren
Intensität mit steigender Dosis ebenfalls zunimmt. Dies ist unangenehm für den Patienten
und somit auch für die Therapeuten. Nun stellt sich die Frage nach einem Kriterium,
anhand dessen man Patienten selektieren kann, die mehr als andere dazu neigen, lokale
oder systemische Rezidive zu entwickeln.
18
Der immunologische Ansatz zu diesem Thema ist bereits bekannt und wird weiter
erforscht. Einigen tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte bereits prognostische
Signifikanz in diversen Tumorentitäten zugeschrieben werden.
3.2. T-Lymphozyten
In Mausmodellen wurde beobachtet, dass das Immunsystem auf solide Tumoren in
ähnlicher Weise reagiert, wie auf andere fremde Antigene. Eine Maus, deren
Immunsystem bereits mit einem bestimmten Tumor vertraut war, zeigte gegen genau
diesen Tumor eine Art Immunität (Janeway C.A. 1997). Auch beim menschlichen
Organismus weiß man heute, dass das Immunsystem einen wesentlichen Teil zur
Tumorkontrolle beiträgt.
Bei der Charakterisierung dieser Immunantwort auf Tumoren spielt die adaptive, zelluläre
Komponente des Immunsystems eine wesentliche Rolle.
3.2.1. Rolle der T-Lymphozyten in der adaptiven Immunantwort
Die adaptive Immunantwort ist gekennzeichnet durch zwei grundlegende Eigenschaften:
Spezifität und Merkfähigkeit. Ausführende Zellen sind Lymphozyten, Antigen
präsentierende Zellen und Effektorzellen. Lymphozyten sind in der Lage, spezifische
Antigene zu erkennen und zu unterscheiden. Die aus dem Thymus stammenden TLymphozyten regulieren die zelluläre Immunantwort.
3.2.2. Herkunft und Reifung der T-Lymphozyten
Wie alle Blutzellen, so stammen auch die Vorläufer der T-Zellen aus dem Knochenmark,
bzw. der fetalen Leber. Aus den hämatopoetischen Stammzellen entwickeln sich auf dem
Weg zum naiven T-Lymphozyten zunächst allgemeine lymphatische Vorläuferzellen. Ein
Teil davon wandert in den Thymus um dort zu reifen. Ihr Reifungsort hat den TLymphozyten ihren Namen gegeben. Während ihrer Entwicklung spielt die Expression
von Antigenrezeptor-Genen eine entscheidende Rolle. Die andauernde Neuordnung
dieser Gene stellt sicher, dass eine große Vielfalt an Antigenen erkannt werden kann.
Jeder Klon besitzt einen eigenen, einzigartigen Rezeptor für ein ihm zugeteiltes Antigen.
Die Antigenrezeptor-Gene kodieren gleichzeitig für Signale, die das Überleben von
Zellen mit brauchbaren Rezeptoren sicherstellen (Abbas A. K. 2007).
3.2.3. CD45RO positive Memory T-Zellen
Die reifen Memory-T-Zellen verlassen den Thymus und werden zu den naiven Zellen
gezählt bis sie Antigen-Kontakt haben. Sollte es innerhalb von 1 bis 3 Monaten zu
keinem Antigen-Kontakt kommen, gehen die Zellen in Apoptose. Es handelt sich ebenso
19
wie bei den bereits geprägten Memory-T-Zellen um inaktive, kleine (8-10 µm im
Durchmesser) Zellen, die sich in der G0-Phase, also der Ruhephase, des Zellzyklus
befinden. Die naiven T-Zellen gelangen über das Blut in lymphatisches Gewebe, wo sie
in Kontakt mit Antigenen treten. Dies ist das Signal für die Zellen, in die G1-Phase
einzutreten und sich zu teilen. Es kommt zur klonalen Expansion und zur
Ausdifferenzierung in Effektor- und Memory-T-Zellen. Die T-Gedächtniszellen begeben
sich wiederum in den Blutkreislauf und gelangen so in periphere Gewebe, wie unter
anderem die Darmmukosa, wo sie verweilen. Es handelt sich um sehr langlebige Zellen,
die eine große Rolle in der adaptiven Immunantwort spielen. Sie sorgen bei erneuter
Antigen-Exposition für eine schnellere Wiedererkennung des Antigens und eine stärkere
Immunantwort darauf als beim ersten Kontakt (Abbas A. K. 2007).
In der Literatur werden Memory T-Zellen zu den effektivsten Zellen der Immunantwort
auf einen Tumor gezählt. Die Gruppe der hier unter dem Begriff Memory-T-Zellen
zusammen gefassten Zellen ist heterogen und lässt sich zunächst in zwei Untergruppen
aufteilen: Die zentralen- und die Effektor-Memory-T-Zellen (Abbas A. K. 2007).
Zentrale Memory-T-Zellen bleiben fast ausschließlich in Blut, Milz und Lymphknoten,
während Effektor-Memory-T-Zellen das nicht-lymphatische Gewebe, also auch den
Tumor, infiltrieren (Wei et al. 2012).
Letztere sind hier von Interesse und lassen sich wiederum in reine Effektor- und reine
Memoryzellen aufteilen, die anhand der Expression des Chemokinrezeptors CCR7
unterschieden werden können. CCR7 negative Zellen haben alle Eigenschaften einer
Effektorzelle. CCR7 positive Zellen hingegen jene von Memoryzellen, können aber zu
CCR7 negativen Zellen ausdifferenzieren und somit zu Effektorzellen werden (Mackay
1999; Sallusto et al. 1999). Es handelt sich also im weitesten Sinne um Zellen der
gleichen Art, weshalb diese Unterscheidung hier nicht berücksichtigt wird.
Durch die Expression des Oberflächenmarkers CD45RO lassen sich Effektor-Memory-TZellen von den regulatorischen T-Zellen eindeutig unterscheiden, die diese Eigenschaft
nicht besitzen (Abbas A. K. 2007; Wei 2012). Im Anschluss wird diese Gruppe unter dem
abgekürzten Begriff der Memory-T-Zellen zusammengefasst werden. Da diese Studie das
Tumorgewebe und dessen nähere Umgebung untersucht und regulatorische- in Relation
zu Memory-T-Zellen untersucht, ist die Markierung der Zellen durch CD45RO hier
ausreichend.
20
3.2.4. FoxP3 als Aktivitätsmarker der Regulatorischen T-Lymphozyten
Bei den so genannten regulatorischen T-Zellen (Treg) handelt es sich um eine
Untergruppe der CD4+ T-Zellen. Eine Funktion, die ihnen bisher eindeutig zugewiesen
werden konnte ist die Unterdrückung von Immunantworten und somit auch das Wahren
der Toleranz gegenüber körpereigenen Antigenen (Abbas A. K. 2007; Fontenot et al.
2003).
Sakaguchi et al. beschrieben 1995 die Anwesenheit der Alphakette des hoch affinen IL-2Rezeptors (CD25) auf der Oberfläche einer immunsuppressiv wirkenden Untergruppe
von T-Lymphozyten (Sakaguchi et al. 1995). Dieser Oberflächenmarker galt gemeinsam
mit dem T-Zellmarker CD4 lange Zeit als Marker für Treg. In anschließenden Studien
konnte er jedoch nicht mit ihrer Funktion in Verbindung gebracht werden (Fontenot et al.
2005a).
Der Transkriptionsfaktor Forkhead box P3 (FoxP3) gehört der Familie der
forkhead/winged-helix Transkriptionsfaktoren an. Er ist essentiell für die Entwicklung
und die Funktionstüchtigkeit der Treg. 2001 zeigten Brunkow et al., dass für die
Autoimmunerkrankung Scurfy bei Mäusen ein FoxP3-Gendefekt verantwortlich ist .
Scurfy führt aufgrund einer Überaktivierung von CD4+ Zellen und somit der
übermäßigen Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine zum Tod der Tiere, die
homozygot für diese X-chromosomal rezessiv vererbte Mutation sind (Brunkow et al.
2001; Sakaguchi et al. 2008). Es existiert ein sehr seltenes humanes Pendant zu Scurfy
mit Namen
IPEX (Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-
chromosomales Syndrom) (Gambineri et al. 2003; Ochs et al. 2005).
FoxP3 ist also mit der Funktion der Treg in Verbindung zu bringen, was ihn als
Aktivitätsmarker auszeichnet (Fontenot 2005a; Khattri et al. 2003). Ihre bisher
beschriebenen immunsuppressiven Eigenschaften verleiten zu der Annahme, FoxP3+
Zellen hätten einen schlechten Einfluss auf die Prognose. Für einige Tumorentitäten
konnte dies auch nachgewiesen werden (Curiel et al. 2004; Hiraoka et al. 2006;
Kobayashi et al. 2007; Wolf et al. 2005). Im Analkarzinom konnte FoxP3+ Treg keine
Bedeutung im Zusammenhang mit der Prognose des Patienten zugeschrieben werden
(Grabenbauer et al. 2006).
Das kolorektale Karzinom stellt diesbezüglich eine Ausnahme dar. Hier wurde eine hohe
Dichte der FoxP3+ Treg bisher mit einem guten Einfluss auf die Prognose in Verbindung
gebracht (Lee et al. 2010; Nosho et al. 2010; Salama et al. 2009).
21
4. Methoden
4.1. Patientenkollektiv
Die ausgewerteten Daten stammen von Patienten, die in den Jahren 2006 bis 2010 in der
Strahlenklinik Erlangen neoadjuvant bestrahlt und simultan chemotherapiert wurden.
Anschließend wurde bei 125 Patienten der Primärtumor R0-reseziert, also ohne
mikroskopischen oder makroskopischen Nachweis von verbleibenden Tumorzellen am
Resektionsrand. Bei einem Patienten wurden hier mikroskopisch Tumorzellen
nachgewiesen (R1). Von 4 Patienten fehlten die Daten zum Resektionsausmaß. Es sollte
unter Anderem der Effekt der Strahlentherapie auf die Tumor infiltrierenden
Lymphozyten untersucht werden. Daher wurden ausschließlich Patienten ins Kollektiv
aufgenommen, deren Biopsiepräparate zur Verfügung gestellt werden konnten. Insgesamt
wurden 130 Patienten in die Gesamtliste aufgenommen. Unter diesen finden sich 62
Patienten, die an der CAO/ARO/AIO-Studie teilnahmen und daher nach dem oben bereits
vorgestellten Studienkonzept mit Oxaliplatin und 5-Fluorouracil behandelt wurden. In
Tabelle
1
sind
die
detaillierten
Tumoreigenschaften
des
Patientenkollektivs
zusammengefasst.
Tabelle 1: Details der 130 ausgewerteten Patienten
Anzahl
Charakteristikum
TNM-Klassifikation
Stadium
Patienten
Prozent
34
100
0
3
8,8
1
11
32,3
2
2
5,9
2a
18
52,9
2b
1
2,9
3
2
5,9
3a
4
11,8
3b
9
26,5
3c
6
17,6
4
19
55,9
Gesamtanzahl
Patienten
TNM-Klassifikation (UICC)
22
4a
0
0
126
100
cT1
0
0
cT2
12
9,5
cT3
101
80,2
cT4
13
10,3
125
100
cN0
19
15,2
cN+
64
51,2
cN1
22
17,6
cN2
20
20,8
114
100
cM0
93
81,6
cM1
21
18,4
124
100
G1
1
0,8
G2
92
74,2
G3
30
24,2
G4
1
0,8
127
100
ypT0
8
6,3
ypT1
5
3,9
ypT2
12
9,4
ypT2a
14
11
ypT2b
15
11,8
ypT3
1
0,8
ypT3a
21
16,5
ypT3b
26
20,5
cT-Stadium Gesamtanzahl Patienten
cT-Stadium
cN-Stadium Gesamtanzahl Patienten
cN-Stadium
cM-Stadium Gesamtanzahl Patienten
cM-Stadium
Grading Gesamtanzahl Patienten
Grading
ypT-Stadium Gesamtanzahl Patienten
ypT-Stadium
23
ypT3c
18
14,2
ypT4
4
3,1
ypT4a
3
2,4
124
100
ypN0
74
59,7
ypN1
33
26,6
ypN2
17
13,7
90
100
M0
60
66,7
M1
30
33,3
ypN-Stadium Gesamtanzahl Patienten
ypN-Stadium
M-Stadium Gesamtanzahl Patienten
M-Stadium
Lymphgefäßinvasion L Gesamtanzahl
Patienten
125
Lymphgefäßinvasion L
L0
105
84
L1
15
16
120
100
V0
115
95,8
V1
5
4,2
130
100
<54,4 Gy
8
6,2
54,4 Gy
118
90,8
>54,4 Gy
4
3,1
126
100
63
50
Oxaliplatin
61
48,4
Irinothekan
2
1,6
126
100
Blutgefäßinvasion
V
100
Gesamtanzahl
Patienten
Blutgefäßinvasion V
Radiatio Gesamtanzahl Patienten
Radiatio
Chemotherapie
Gesamtanzahl
Patienten
5-FU
Chemotherapie
5-FU
Resektionsausmaß
Gesamtanzahl
+
24
Patienten
Resektionsausmaß
R0
125
99,2
R1
1
0,8
Die Daten wurden dem Archiv der Erlanger Klinik entnommen. Da viele Patienten
auswärts diagnostiziert wurden, ist bei der Mehrzahl der Patienten das primäre Staging
nicht dokumentiert.
4.2. Herstellung der Schnitte und Tissue Microarrays (TMAs)
Von 111 Patienten konnten aus den Biopsien 41 histologische Schnitte sowie 70 Stanzen
in Tissue Microarrays (TMAs) aufgearbeitet werden. Durch die begrenzte Verfügbarkeit
der Biopsien wurde hier jeweils nur eine Stanze gewonnen.
In den Tumorpräparaten wurden von allen 130 Patienten TMAs angefertigt. Die
Vorgehensweise zur Herstellung der TMAs war Folgende: Von den in Paraffinblöcken
konservierten OP-Präparaten wurden HE-Schnitte angefertigt, auf denen Markierungen
für die folgenden TMA-Stanzen angezeichnet wurden. Es wurden pro Patient aus jeweils
einem Tumorblock und einem Normalgewebsblock insgesamt 6 TMAs aus folgenden
Regionen erstellt:
Primärtumorregion
Invasionsfront
Normalgewebe
Jeder Gewebeart wurden 2 TMA-Stanzen von 2 mm Durchmesser entnommen und in
einen Rezipientenblock eingesetzt.
4.3. Immunhistologische Doppelfärbung
Um eine Färbung zu ermöglichen mussten die Gewebeproben entparaffiniert werden.
Dies erfolgte durch 3-maliges Einlegen in Xylol für je 10 Minuten. Anschließend wurden
die Proben in einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 96 %, 70 % Alkohol) für jeweils 2
Minuten rehydratisiert. Zur Demaskierung der Antikörper wurden die Objektträger 5
Minuten lang in Zitronensäurepuffer (2,1g Zitronensäure auf 1000ml Aqua bidestilliert,
pH 6,0) bei 120°C im Dampfkochtopf gekocht.
25
Die abgekühlten Proben wurden mit Tris-Puffer gespült und 5 Minuten lang in der
„Blocking Solution“ inkubiert. Durch dieses Verfahren möchte man eine unspezifische
Primärantikörperbindung vermeiden und den Hintergrund reduzieren. Im Anschluss
wurde der Primärantikörper FoxP3 in einer Albumin-Lösung im Verhältnis 1:100
verdünnt und auf die Objektträger appliziert. Diese mussten dann bei Raumtemperatur
über Nacht inkubieren.
Am nächsten Tag wurde mit Tris-Puffer gespült und anschließend das „Post-Block
Reagent 2“ zur Signalverstärkung aufgetragen. Nach 20-minütiger Einwirkzeit wurde
dieses ebenfalls mit Tris-Puffer ausgewaschen. Anschließend wurde das „AP-Polymer“,
ein Gemisch aus Sekundärantikörper und alkalischer Phosphatase, 30 Minuten lang
inkubiert. In der Zwischenzeit wurde eine Fast/Red Lösung angesetzt, die nach erneuter
Spülung für 20 Minuten einwirken konnte. Diese Lösung erzeugte den gewollten
Farbniederschlag
überall
dort,
wo
eine
Bindung
zwischen
Primär-
und
Sekundärantikörper erfolgt war. Um die Färbung zu stoppen musste diese 2 Minuten lang
unter fließendem Leitungswasser ausgespült werden.
Die erste Färbung war somit abgeschlossen und die zweite Färbung wurde nach dem
gleichen Prinzip durchgeführt, beginnend mit der 5-minütigen Inkubation in der
„Blocking Solution“. Der nun verwendete zweite Primärantikörper war der CD45RO
(Clone UCHL1 1ml Best. Nr. M0742 von DAKO) in einer Albuminlösung im Verhältnis
1:200. Dieser wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gegenfärbung
erfolgte nun mit einer Fast/Blue Lösung.
Die fertig gefärbten Objektträger wurden in destilliertes Wasser gestellt und anschließend
mit Roti Mount Aqua (15ml B.Nr. 2848.1 von Roth) eingedeckt.
4.4. Auswertung
Die Objektträger mit den gefärbten TMAs und Schnitten wurden unter Verwendung eines
hochauflösenden
Scanners
(MIRAX-Scanner,
Zeiss,
Oberkochen,
Deutschland)
eingescannt und konnten so als komplette „Slides“ beurteilt und gespeichert werden.
Diese digitalen Objektträger mussten zur Weiterverarbeitung im Programm Pannoramic
Viewer (3D Histech, Budapest, Ungarn) geöffnet und in kleinere Annotations geschnitten
werden. Um eine Optimierung der Bildqualität zu gewährleisten wurden diese
Abschnitte, die nun jeweils eine Reihe von 6 Stanzen beinhalteten, im Adobe Photoshop
7.0 angesehen und gegebenenfalls in Kontrast und Helligkeit optimiert. Dann wurden die
Bilder von Photoshop aus überspeichert.
26
Die eigentliche Auswertung funktionierte halbautomatisch. Das hierzu verwendete
Programm war das Bildbearbeitungsprogramm Biomas - Count (PD Dr. Distel,
Strahlenklinik Erlangen). Die zwei Färbungen wurden als positiv (FoxP3) und negativ
(CD45RO) auszuwertendes Merkmal festgelegt und benannt. In jedem Bild wurden zwei
„Regions of interest“ (ROI1 und ROI2) bestimmt, in denen die Zellen gezählt wurden. Im
Tumorgewebe (ROI1) befindliche Zellen konnten so getrennt von den im Stroma (ROI2)
liegenden Zellen gezählt werden. Das Programm berechnete die Anzahl der Zellen pro
Fläche, sowie deren Abstände zueinander (FoxP3+ zu FoxP3+, CD45RO+ zu CD45RO+,
FoxP3+ zu CD45RO+ und CD45RO+ zu FoxP3+). Die Daten wurden direkt vom
Programm in Excel Dateien gespeichert. Es wurde jeweils eine Excel-Datei pro Patient
angelegt. Dadurch wurde sichergestellt, dass die Gewebe eines Patienten miteinander
verglichen und den richtigen Überlebensdaten zugeordnet werden konnten.
Die Qualität der gefärbten TMAs und Schnitte erlaubte das Auswerten der im Folgenden
aufgelisteten Proben:
97 Proben (Schnitte und TMAs zusammengefasst) aus den Biopsien
144 TMA- Stanzen aus dem Tumorgewebe, jeweils 2 pro Patient
121 TMA-Stanzen aus der Invasionsfront, jeweils 2 pro Patient
119 TMA-Stanzen aus dem Normalgewebe in der Nähe des Tumors, jeweils 2 pro Patient
4.5. Statistik
Die absolute Zellzahl wurde jeweils ins Verhältnis zur betrachteten Fläche gesetzt um so
die relative Zellzahl, also die Zelldichte, zu erhalten. Die Abstände der Zellen zueinander
wurden ebenfalls wie oben bereits beschrieben ermittelt und miteinander verglichen.
Anhand des Medians der Werte zum untersuchten Merkmal wurde das Patientenkollektiv
in zwei Gruppen eingeteilt. Gruppe „0“ wies jeweils einen geringen Wert des
untersuchten Merkmals auf, Gruppe „1“ jeweils einen hohen. Mittels log-rank-Test und
Kaplan-Meier-Kurve wurden diese Werte mit dem rezidivfreien und dem tumorfreien
(disease-free survival = DFS) Überleben korreliert. Außerdem wurde durch das Erstellen
von Korrelationsdiagrammen nach Übereinstimmungen zwischen den Werten der
Biopsien und der postoperativen Präparate und zwischen den verschiedenen Geweben
gesucht.
27
5. Ergebnisse
5.1. Dichte der Treg und Memory-Zellen
Es wurden zunächst, wie bereits von einigen Forschergruppen vorher durchgeführt, die
relativen Zellzahlen der FoxP3+ Treg und der CD45RO+ Memory-T-Zellen ermittelt. In
Kaplan-Meier-Kurven wurden diese mittels log-rank-Test ins Verhältnis zum tumorfreien
Überleben (disease-free survival = DFS) gesetzt. Zunächst wurden die Biopsien auf
relevante Ergebnisse bezüglich der Zelldichte untersucht. Patienten deren Biopsien eine
höhere Treg-Dichte im Stroma aufwiesen hatten ein 5-Jahres-Überleben (5-JÜL) von
66,7%, während jene mit einer niedrigen Treg-Dichte nur ein 5-JÜL von 48,6%
aufwiesen (p=0,032; Abbildung 3).
Abbildung 3:
Dichte der regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) im Stroma der Biopsien von 92
Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = hohe Dichte, blaue Linie = niedrige
Dichte.
28
Im Anschluss wurden die Zelldichten in den OP-Präparat-Stanzen aus Normalgewebe,
Invasionsfront und Tumorgewebe selbst analysiert. Im Normalgewebe konnte keine
relevante Beobachtung bezüglich Korrelation zwischen Zelldichte und DFS gemacht
werden. Die Memory-T-Zelldichte im Gewebe der Invasionsfront (intraepithelial und
stromal zusammen) hingegen erbrachte interessante Ergebnisse. 118 Patienten wurden
auf dieses Merkmal hin untersucht. Die 59 Patienten mit einer höheren Dichte an
CD45RO+ Zellen hatten ein 5-JÜL von 64,1%, die 59 Patienten mit einer niedrigeren
Dichte hatten ein 5-JÜL von 50,1% (p=0,046; Abbildung 4).
Abbildung 4:
Dichte der Memory-T-Zellen (CD45RO+) in der gesamten Invasionsfront von 118
Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = hohe Dichte, blaue Linie = niedrige
Dichte.
29
Die Dichte der regulatorischen T-Zellen im Primärtumor (Tumor- und Stromagewebe
zusammen) erwies sich ebenfalls als signifikanter Prädiktor für das Metastasierungsrisiko
(p=0,005). In der aus 60 Patienten bestehenden Gruppe mit hoher Treg-Zelldichte
überlebten 69,5% die 5 Jahre metastasenfrei, während es in der aus ebenfalls 60 Patienten
bestehenden Gruppe mit niedriger Treg-Zelldichte nur 46,2% waren (Abbildung 5).
Abbildung 5:
Dichte der regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) in Tumor und Stroma der
Tumorstanzen von 120 Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie =
hohe Dichte, blaue Linie = niedrige Dichte.
Dieses Ergebnis ist kongruent mit den Ergebnissen anderer Studiengruppen (Lee 2010;
Nosho 2010; Pages et al. 2005). Hier zeigte eine höhere Anzahl an Memory-T-Zellen
tendenziellen Zusammenhang mit besserem DFS.
30
5.2. Zellabstände
Es hat sich bereits in einigen Studien gezeigt, dass die Dichte der im Tumor vorhandenen
Immunzellen eine Aussagekraft über die Prognose eines Patienten haben kann. Jedoch
muss auch die Art und Weise, wie sich die Zellen im Raum verteilen berücksichtigt
werden. Einige Beobachtungen dazu ließen sich schon subjektiv machen und
wiederholten sich im Lauf der Auswertung. Es hatte den Anschein, dass Treg und
Memory-T-Zellen häufig nahe beieinander und gerne in Tumornähe lagen. Eine Treg
hatte meist eine Art Memory-Sozius bei sich. Subjektiv gesehen hielten sich die Treg
häufig an der Grenze zwischen Tumorepithel und –stroma auf und infiltrierten nur ganz
knapp das Tumorgewebe nicht. Im Tumorepithel selbst waren verhältnismäßig selten TIL
zu finden und wenn doch lagen diese scheinbar eher in Gruppen vor. Daraus ergeben sich
einige Fragen, die zum weiteren Verständnis des Verhaltens von TIL geklärt und
quantifiziert werden müssen: Liegen sie zufällig und somit gleichmäßig verteilt vor?
Gruppieren sie sich in irgendeiner Form um den Tumor oder bilden sie Zellnester?
Interagieren sie direkt über Zell-Zellkontakt? Diese Beobachtungen sind nicht neu,
wurden jedoch bisher nicht quantifiziert (Halama et al. 2012). Dies soll hier anhand der
Abstände zwischen den Zellen versucht werden. Hierfür wurden die jeweils kürzesten
Abstände von Treg zu Treg, von Memory-T-Zelle zu Memory-T-Zelle, von Treg zu
Memory-T-Zelle und von Memory-T-Zelle zu Treg herangezogen. Da der kürzeste
Abstand von einer bestimmten Zelle aus gesehen entscheidend ist, erklärt sich der
Unterschied zwischen letzteren zwei Gruppen. In den Biopsien war eine Tendenz zu
beobachten, die einem weiteren Abstand von regulatorischen T-Zellen zu Memory-TZellen im Tumorgewebe und Stroma zusammen gezählt ein besseres DFS zuschrieb
(Abbildung 6).
31
Abbildung 6:
Abstand von regulatorischen T-Zellen (FoxP3) zu den nächstgelegenen Memory-TZellen (CD45RO+) in Tumor- und Stromagewebe der Biopsien von 89 Patienten im
Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = lange Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
Auch die TILs in der Invasionsfront zeigten Zusammenhänge zum DFS: War in den
Proben Tumorgewebe vorhanden, so wurden die Zellen im gleichen Stil wie in den
Tumorstanzen gezählt. Im Stroma der Invasionsfront zeigten sich signifikante
Zusammenhänge sowohl eines geringeren Abstandes der regulatorischen T-Zellen
zueinander (Abbildung 7), als auch eines niedrigeren Abstandes von Memory-T-Zelle zu
Memory-T-Zelle (Abbildung 8), mit einem längeren DFS (p=0,017; p=0,051).
32
Abbildung 7:
Kürzester Abstand zwischen den regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) im Stroma der
Invasionsfront von 24 Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = lange
Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
Abbildung 8:
Kürzester Abstand zwischen den Memory-T-Zellen (CD45RO) im Stroma der
Invasionsfront von 38 Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = lange
Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
33
Im Normalgewebe konnte ebenfalls der tendenzielle Vorteil eines kürzeren Abstandes
zwischen den Memory-T-Zellen in Bezug auf das DFS beobachtet werden (Abbildung 9).
Abbildung 9:
Kürzester Abstand zwischen den Memory-T-Zellen (CD45RO) im Normalgewebe
von 111 Patienten im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = lange Abstände, blaue
Linie = kurze Abstände.
Bei der Auswertung der Tumorstanzen der OP-Präparate wurden intraepithelial insgesamt
weniger Zellen gezählt als im Stroma des Tumors. Im Stroma des Tumors wurde bei
einem weiteren Abstand zwischen den Treg ein 5-JÜL von nur 35,1% beobachtet,
während es bei niedrigerem Abstand 76,1% betrug. Der niedrige Abstand zwischen den
regulatorischen T-Zellen im Tumorstroma ist also ein signifikanter Prognoseparameter
für ein besseres DFS (p=0,00035; Abbildung 10). Im Vergleich dazu ließen sich anhand
der Abstände der Treg im Stroma der Biopsie keine Aussagen über die Prognose machen
(Abbildung 11).
34
Abbildung 10:
Kürzester Abstand der im Stroma des Tumors von 57 Patienten gelegenen
regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) zueinander im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie
= lange Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
Abbildung 11:
Kürzester Abstand der im Stroma der Biopsie von 92 Patienten gelegenen
regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) zueinander im Verhältnis zum DFS. Grüne Linie
= lange Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
35
Weiter ergab sich eine signifikante Bedeutung des intraepithelialen Abstandes von
Memory- zu regulatorischen T-Zellen. Je kleiner dieser Abstand war, desto besser war
das DFS (p=0,001; Abbildung 12).
Abbildung 12:
Kürzester Abstand der intraepithelial im Tumor von 31 Patienten gelegenen
Memory-T-Zellen (CD45RO+) zu den regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) im
Verhältnis zum DFS. Grüne Linie = lange Abstände, blaue Linie = kurze Abstände.
36
Im Stroma des Primärtumors zeigte sich außerdem ein positiver Zusammenhang eines
geringen Abstandes der regulatorischen - zu den Memory-T-Zellen mit einem besseren
DFS (p=0,027; Abbildung 13).
Abbildung 13:
Abstand der regulatorischen T-Zellen (FoxP3+) zu den nächstgelegenen Memory-TZellen (CD45RO+) im Stroma der Tumoren von 51 Patienten im Verhältnis zum
DFS. Grüne Linie = lange Abstände, blaue Linie = kurze Abstände
37
5.3. Korrelationen
Im Anschluss wurde nach Verknüpfungen der einzelnen Ergebnisse untereinander
gesucht. Besonderes Augenmerk richtete sich auf eventuelle Korrelationen zwischen den
Immunsettings in den Biopsien und in den postoperativen Präparaten.
Es fand sich hier eine hoch signifikante Korrelation der Treg-Abstände vor und nach RCT
und Operation (p<0,0001; Abbildung 14). Die Abstände der Memory-T-Zellen
korrelierten hier hingegen nicht miteinander.
Tumor Stroma Abstand FoxP3 - FoxP3
600
500
400
300
Datenreihen1
Linear (Datenreihen1)
200
p<0,0001
100
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Biopsie Intraepithelial Abstand FoxP3 - FoxP3
Abbildung 14:
Positive Kovarianz der mittleren Abstände zwischen den FoxP3+ Treg im Stroma
des Tumors (nach RCT und OP) und im Tumorepithel der Biopsie.
38
Es wurde weiterhin beobachtet, dass der Abstand zwischen den intraepithelialen
Memory-T-Zellen und den Treg in der Biopsie und in der Invasionsfront positiv
miteinander korrelierte (p<0,01; Abbildung 15). Die geringe Fallzahl lässt hier jedoch
keine Schlussfolgerungen zu. Sie ist bezeichnend für das seltene Vorkommen
insbesondere von Immunzellen beider untersuchter Arten gleichzeitig im Tumorepithel.
Invasionsfront intraepithelial CD45RO - FoxP3
900
800
Datenreihen1
700
Linear (Datenreihen1)
600
500
p<0,01
400
300
200
100
0
-100 0
100
200
300
400
500
600
Biopsie Intraepithelial CD45RO-FoxP3
Abbildung 15:
Positive Kovarianz der mittleren Abstände von CD45RO+ Memory-T-Zellen zu
FoxP3+ Treg im Tumorgewebe der Invasionsfront und der Biopsie.
Der Abstand der Memory-T-Zellen in der Invasionsfront korrelierte mit dem Abstand
zwischen den Memory-T-Zellen im Tumorstroma (p<0,0001; Abbildung 16), dem
Abstand der intraepithelialen Memory- zu den regulatorischen T-Zellen im Tumor
(p<0,0001; Abbildung 17) und im Normalgewebe mit Abstand (p<0,01; Abbildung 18)
und Dichte (p<0,01; Abbildung 19) zwischen den Memory-T-Zellen. Je weiter der
jeweilige Abstand war, desto weiter war auch der Abstand der Zellen in der
Invasionsfront zueinander und je weniger dicht die Zellen im Normalgewebe lagen desto
weiter waren auch die Abstände der in der Invasionsfront gezählten Memory-T-Zellen
zueinander.
39
Invasionsfront intraepithelial CD45RO CD45RO
400
350
300
250
200
Datenreihen1
150
Linear (Datenreihen1)
100
p<0,0001
50
0
0
Abbildung 16:
100
200
300
400
500
Tumor Stroma Abstand CD45RO - CD45RO
600
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes zwischen den CD45RO+ Memory-TZellen in der Invasionsfront und im Stroma des Primärtumors.
400
Invasionsfront intraepithelial CD45RO CD45RO
350
300
250
200
Datenreihen1
150
Linear (Datenreihen1)
100
p<0,0001
50
0
0
Abbildung 17:
100
200
300
400
Tumor intraepithelial Abstand CD45RO - FoxP3
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes zwischen den CD45RO+ Memory-TZellen in der Invasionsfront und des mittleren intraepithelialen Abstandes von
CD45RO+ Memory-T-Zellen zu FoxP3+ Treg im Primärtumor.
40
Invasionsfront intraepithelial CD45RO - CD45RO
400
Datenreihen1
350
Linear (Datenreihen1)
300
p<0,01
250
200
150
100
50
0
0
100
200
300
400
500
Normalgewebe CD45RO - CD45RO
Abbildung 18:
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes zwischen den CD45RO+ Memory-TZellen in der Invasionsfront und im Normalgewebe.
Invasionsfront intraepithelial CD45RO - CD45RO
400
Datenreihen1
Linear (Datenreihen1)
350
300
p<0,01
250
200
150
100
50
0
0
100
200
300
400
Normalgewebe CD45RO/Fläche
Abbildung 19:
Negative Kovarianz des mittleren Abstandes zwischen den CD45RO+ Memory-TZellen in der Invasionsfront und der Dichte der CD45RO+ Memory-T-Zellen im
Normalgewebe.
41
Der Abstand von Memory- zu regulatorischen T-Zellen im Tumor und in der
Invasionsfront korrelierte positiv miteinander (p<0,0001; Abbildung 20).
Invasionsfront gesamt CD45RO - FoxP3
600
500
400
300
Datenreihen1
200
Linear (Datenreihen1)
100
p<0,0001
0
0
100
200
300
400
500
600
Tumor gesamt Abstand CD45RO - FoxP3
Abbildung 20
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes von CD45RO+ Memory-T-Zellen zu
FoxP3+ Treg in der Invasionsfront und des mittleren Abstandes der CD45RO+
Memory-T-Zellen zu den FoxP3+ Treg in der gesamten Tumorstanze.
42
Außerdem kann von dem gleichen Abstand in der Invasionsfront ein Rückschluss auf den
Abstand der Memory-T-Zellen im Normalgewebe gemacht werden (Abbildung 21).
Invasionsfront intraepithelial CD45RO - FoxP3
400
Datenreihen1
Linear (Datenreihen1)
350
300
p<0,01
250
200
150
100
50
0
0
100
200
300
400
Normalgewebe CD45RO - CD45RO
Abbildung 21:
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes von CD45RO+ Memory-T-Zellen zu
FoxP3+ Treg in der Invasionsfront und des mittleren Abstandes zwischen den
CD45RO+ Memory-T-Zellen im Normalgewebe.
43
Auch zwischen Tumor und Normalgewebe konnte eine aussagekräftige Übereinstimmung
gefunden werden. Die Abstände der Memory- zu den regulatorischen T-Zellen
korrelierten hier signifikant positiv miteinander (p<0,0001; Abbildung 22).
700
Normalgewebe CD45RO - FoxP3
600
500
400
300
Datenreihen1
200
Linear (Datenreihen1)
100
p<0,0001
0
0
100
200
300
400
500
600
Tumor Stroma Abstand CD45RO - FoxP3
Abbildung 22:
Positive Kovarianz des mittleren Abstandes von CD45RO+ Memory-T-Zellen zu
FoxP3+ Treg im Normalgewebe und im Tumorstroma.
44
5.4. Clusterung der T-Zellen
Da sich die Abstände zwischen den Zellen als prognostisch signifikant erwiesen haben,
alleine aber keinen Aufschluss über das Zellverteilungsmuster geben, wurde dieser Frage
nachgegangen. Zuvor wurde die Annahme gemacht, dass die untersuchten Immunzellen
sich in irgendeiner Art inhomogen um den Tumor gruppieren. Es wurde untersucht, ob
die Abstände dem Zufall gehorchten und somit gleichmäßig waren oder ob dies nicht der
Fall war. Dafür wurden die Datenpunkte mit folgender Formel angefittet, da der
Zusammenhang zwischen Zelldichte und Abstand der Zellen invers von der
Quadratwurzel abhängt. Dies gilt allerdings nur für idealisierte Zellen ohne Ausdehnung.
Daher wurden in der Gleichung zwei Offsetwerte für die X-Dimension (p1) und die YDimension (p2) eingeführt. In der Gleichung 1 ist „n“ ist die Häufigkeit pro Fläche und
„p0“ ist der Startpunkt.
Verteilen sich Zellen nicht nach stochastischen Regeln im Raum kann man davon
ausgehen, dass sich irgendwo Unregelmäßigkeiten bilden. Sei dies in Form von
Zellnestern oder am Rand des Tumors, was die subjektiven Beobachtungen bestätigen
würde.
Die Untersuchung der Verteilungsmuster ergab, dass sowohl Treg als auch Memory-TZellen im Tumorgewebe selber unregelmäßig verteilt waren (Abbildung 23).
45
400
distance (m)
FoxP3+ intraepithelial
CD45+ intraepithelial
300
200
100
0
0
100
200
300
2
400
Frequency (cells/mm )
Abbildung 23:
Im Tumorgewebe intraepithelial gelegene regulatorische T-Zellen (FoxP3+) und
Memory T-Zellen (CD45RO+) pro Fläche im Verhältnis zum jeweiligen Abstand der
Zellen zueinander. Rot gefüllte Punkte = FoxP3+ Treg; nicht gefüllte Punkte =
CD45RO+ Memory-T-Zellen.
46
Entgegen der Erwartung konnte diese Beobachtung im Tumorstroma nicht gemacht
werden. Hier erwies sich die Zellverteilung für beide untersuchten Zellarten als zufällig
(Abbildung 24).
400
distance (m)
FoxP3+ stromal
CD45+ stromal
300
200
100
0
0
100
200
300
2
400
Frequency (cells/mm )
Abbildung 24:
Im Tumorstroma gelegene regulatorische T-Zellen (FoxP3+) und Memory T-Zellen
(CD45RO+) pro Fläche im Verhältnis zum jeweiligen Abstand der Zellen
zueinander. Blau gefüllte Quadrate = FoxP3+ Treg; nicht gefüllte Quadrate =
CD45RO+ Memory-T-Zellen.
Für die Invasionsfront sind die Diagramme weniger eindeutig. Es lässt sich aber
intraepithelial der Trend in Richtung Verteilungsregelmäßigkeit erkennen (Abbildung
25). Der Verständlichkeit halber muss erwähnt werden, dass die Bezeichnung
„intraepithelial“ hier irreführend sein kann, da es sich um eine inhomogene Gruppe
handelt. Dies ergab sich beim Zählen der Zellen. Da die Invasionsfront selten
Tumorgewebe enthielt, wurde wenn kein Tumorgewebe vorhanden war die gesamte
Invasionsfront unter diesem Aspekt betrachtet. Daher entspricht diese Lokalisation am
ehesten dem Tumorstroma. Enthielten die Stanzen Tumorgewebe, entsprachen die
Lokalisationen „Epithel“ und „Stroma“ den gleichnamigen Regionen in den
Tumorstanzen. War dies der Fall, verteilten sich die Treg, nicht aber die Memory-TZellen im Stroma ungleichmäßig (Abbildung 26).
47
400
distance (m)
Invasionsfront intraepithelial CD45RO+
Invasionsfront intraepithelial FoxP3+
300
200
100
0
0
100
200
300
2
400
Frequency (cells/mm )
Abbildung 25:
In der Invasionsfront (falls vorhanden im Tumorgewebe intraepithelial) gelegene
regulatorische T-Zellen (FoxP3+) und Memory T-Zellen (CD45RO+) pro Fläche im
Verhältnis zum jeweiligen Abstand der Zellen zueinander. Grün gefüllte Dreiecke =
FoxP3+ Treg; nicht gefüllte Dreiecke = CD45RO+ Memory-T-Zellen.
400
distance (m)
Invasionsfront stromal CD45RO+
Invasionsfront stromal FoxP3+
300
200
100
0
0
100
200
300
2
400
Frequency (cells/mm )
Abbildung 26:
in der Invasionsfront falls Tumorgewebe vorhanden stromal gelegene regulatorische
T-Zellen (FoxP3+) und Memory T-Zellen (CD45RO+) pro Fläche im Verhältnis zum
jeweiligen Abstand der Zellen zueinander. Orange gefüllte Rauten = FoxP3+ Treg;
nicht gefüllte Rauten = CD45RO+ Memory-T-Zellen.
48
Im Normalgewebe zeigt sich am ehesten eine zufällige Verteilung (Abbildung 27).
400
distance (m)
Normalgewebe FoxP3+
Normalgewebe CD45RO+
300
200
100
0
0
100
200
300
2
400
Frequency (cells/mm )
Abbildung 27:
Im Normalgewebe gelegene regulatorische T-Zellen (FoxP3+) und Memory T-Zellen
(CD45RO+) pro Fläche im Verhältnis zum jeweiligen Abstand der Zellen
zueinander. Lila gefüllte Punkte = FoxP3+ Treg; nicht gefüllte Punkte = CD45RO+
Memory-T-Zellen.
49
6. Diskussion
6.1. Tumortherapie richtet sich nach dem Staging
Tumoren lassen sich auf unterschiedliche Weise charakterisieren. Die makroskopische
sowie die mikroskopische Beschreibung von Tumoren sind bereits sehr detailliert mithilfe
der TNM-Klassifikation möglich und anhand dieser international vereinheitlicht. Sie ist
der aktuelle Standard, nach dem sich die Tumortherapie momentan weltweit richtet.
Diese Therapie ist multimodal, beinhaltet also mehrere Therapieformen. Beim
Rektumkarzinom sind dies Radio-, Chemo- und operative Therapie. Ziel der
multimodalen Therapie ist die Vermeidung von lokalen und systemischen Rezidiven und
dadurch die Verlängerung von tumorfreiem (disease-free survival = DFS) und
Gesamtüberleben (overall survival = OS). Dies könnte zum Beispiel durch Aggravation
der systemischen Therapie vor oder nach der Operation (OP) und Modifikation des
Therapiezeitpunktes möglich sein (Hohenberger 2009a). Es gilt zu bedenken, dass die
kombinierte RCT mit Nebenwirkungen einher geht, deren Intensität mit steigender Dosis
ebenfalls zunimmt. Daher ist eine verschärfte Behandlung aller Patienten eines
bestimmten Stadiums problematisch, da auch jene Patienten vermehrten Nebenwirkungen
ausgesetzt wären, die nicht von der Therapie an sich profitieren (Fietkau 2010). Es ist
also von großem Interesse, die Entwicklung von Rezidiven so präzise wie möglich vorher
zu sagen um auch die Therapie so präzise wie möglich gestalten zu können und sowohl
Über- als auch Untertherapie zu vermeiden. Bisher bietet das TNM-System die einzige
Möglichkeit, die Kolorektalen Karzinome (colorectal cancer = CRC) einheitlich in
Stadien einzuteilen, nach denen sich die Therapie richten kann. Es hat sich jedoch
gezeigt, dass diese Stadien inhomogen bezüglich ihrer Prognose sind (Galon et al. 2006;
Lee 2010). Einige Patienten mit weniger fortgeschrittenen Tumoren entwickeln Rezidive
nach kurativer OP, während umgekehrt andere Patienten mit höher eingestufter
Erkrankung keine Rekurrenz erleiden. Das Stadium III wurde aufgrund dessen in der 7.
Auflage des TNM nach pT- und pN-Kriterien in Untergruppen unterteilt (Greene et al.
2002; Merkel et al. 2001). Nun stellt sich die Frage ob Parameter existieren, die gar nicht
vom TNM erfasst werden, jedoch starken Einfluss auf das tumorfreie und das
Gesamtüberleben haben und dieser Inhomogenität zugrunde liegen.
Einige Forschergruppen, darunter Galon et al., schreiben der adaptiven Immunantwort
diese bisher unbekannte Rolle zu. Viele Arbeiten haben in den letzten Jahren
aufschlussreiche Ergebnisse zur Rolle des Immunsystems bei Tumorerkrankungen
erbracht. Es wurde mehrfach postuliert, dass die Quantität und das Verhalten bestimmter
50
Tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) untereinander prognostischen Wert bezüglich
Rezidiv- und Metastasenentwicklung haben.
Galon et al. beobachteten, dass der körpereigene Abwehrmechanismus entscheidend für
die lokale und systemische Kontrolle des CRC nach kurativer OP sei. Die Bestimmung
immunologischer Kriterien sei denen des TNM überlegen (Galon et al. 2007). Daraus
entstanden ist der Ruf nach einem neuen Stagingsystem nach immunologischen Kriterien
(Bindea et al. 2011; Galon 2007).
Es scheint offenkundig, dass im Zuge der Individualisierung der Therapie der
Bestimmung des Immunstatus eine bedeutende Rolle zukommt.
6.2. Fokus auf die Zellverteilung
Der Fokus der meisten Forschergruppen liegt auf der Messung der Dichte aller
möglicherweise beteiligten Immunzellen. Diesem Vorgehen schließt sich diese Studie
zunächst an. Die beiden verwendeten Marker sind bereits mehrfach untersucht worden
und dadurch etabliert. Die Ergebnisse sind also vergleichbar. Die Zelldichten wurden von
einigen Untersuchern zueinander ins Verhältnis gesetzt und diese Immunscores mit
teilweise relevanten Ergebnissen in Bezug zum tumorfreien- und Gesamtüberleben
gesetzt (Galon 2006; Haas et al. 2009; Suzuki et al. 2010).
In dieser Untersuchung lag das Hauptaugenmerk nicht auf dem Verhältnis der Zelldichten
zueinander, sondern auf den räumlichen Verteilungsverhältnissen der Zellen, also deren
Abständen zueinander. Dadurch sollte der wichtigen Frage nachgegangen werden, ob
regulatorische T-Zellen (Treg) und Memory-T-Zellen vereinzelt oder in Clustern in und
um den Tumor verteilt liegen. Dies soll zu einem besseren Verständnis der Rolle der
beiden Zellarten in der adaptiven Immunantwort auf CRC beitragen.
Wichtig ist in jedem Fall die Berücksichtigung der verschiedenen Lokalisationen der
Zellen in und um den Tumor. Es hat sich gezeigt, dass beispielsweise Treg im
Normalgewebe einen negativen, im Tumorgewebe jedoch einen positiven Einfluss auf
das Überleben zu haben scheinen (Savage et al. 2013).
Hier wurden Stanzen aus drei verschiedenen Regionen gewonnen: Tumorgewebe,
Invasionsfront und nahe dem Tumor gelegenes Normalgewebe. War Tumorgewebe
vorhanden, wurden „Regions of interest“ (ROI) bestimmt und die jeweils in ROI1
(Tumorepithel) und ROI2 (Stroma) befindlichen Zellen getrennt voneinander
ausgewertet.
51
6.3. FoxP3+ regulatorische T-Zellen als Prognoseparameter
Bei der Untersuchung der FoxP3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) als potentiellem
Prognoseparameter wurden in den unterschiedlichen Tumorentitäten entgegengesetzte
signifikante Ergebnisse erzielt. Eine hohe Zahl an FoxP3+ T-Zellen korrelierte im
Ovarialkarzinom (Curiel 2004; Wolf 2005), im hepatozellulären Karzinom (Kobayashi
2007) und im duktalen Pankreaskarzinom (Hiraoka 2006) mit einer schlechteren
Prognose. Da die Treg eine immunsuppressive Funktion erfüllen, die vor Autoimmunität
schützt, liegt die Erklärung nahe, dass sie auch die Immunantwort auf den Tumor
unterdrücken. Sie wurden folglich verantwortlich für eine ungenügende Immunkontrolle
des Tumorwachstums gemacht (Fontenot et al. 2005b; Khattri 2003; Savage 2013; Yagi
et al. 2004).
Bei gleichen Untersuchungen im Kolonkarzinom wurden widersprüchliche Ergebnisse
erzielt. Zum Teil wurde eine hohe Treg-Dichte hier ebenfalls mit einer schlechteren
Prognose in Verbindung gebracht (Katz et al. 2013). Die Mehrzahl der Forscher berichten
jedoch davon, dass eine höhere Treg-Dichte mit einer besseren Prognose einherginge
(Bindea 2011; Lee 2010; Nosho 2010; Suzuki et al. 2013). In diesem Patientenkollektiv
hatten Patienten mit einer hohen FoxP3+ Treg-Dichte in der Biopsie ein tumorfreies
Überleben (DFS) von 66,7% und in der Tumorstanze von 69,5%. In denselben Proben
betrug das DFS bei Patienten mit niedrigen Treg-Dichten nur 48,6%, bzw. 46,2%
(p=0,032; p=0,005). Dieses Ergebnis deckt sich mit den zuletzt genannten
Beobachtungen anderer Gruppen. Die Treg-Dichte kann somit als signifikanter
Prognoseparameter herangezogen werden.
Auch im Kardiakarzinom des Magens wurde eine hohe Anzahl an FoxP3+ T-Zellen mit
einer besseren Prognose in Verbindung gebracht. Eine Erklärung dafür ist die Hemmung
der im Falle des Magenkarzinoms krebsfördernden Entzündung durch die Treg (Haas
2009). Diese These kann unter Umständen auch auf das CRC angewendet werden.
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen gehören seit langer Zeit zu den
Risikofaktoren für die maligne Entartung des intestinalen Epithels.
6.4. Memory-T-Zellen als Prognoseparameter
Auch der zweiten hier untersuchten Zellart, den Effektor-Memory-T-Zellen, ist bereits
eine Schlüsselrolle in der Tumorabwehr attestiert worden. Eine hohe Dichte CD45RO+
Zellen
wurde
mit
der
Abwesenheit
von
Zeichen
früher
Metastasierung,
Lymphknoteninvasion oder Fernmetastasen in Verbindung gebracht. Außerdem war sie
signifikant mit niedrigerem pathologischen Staging und einem längeren Überleben
52
verknüpft.
Die
Memory-T-Zelldichte
gilt
also
ebenfalls
als
potentieller
Prognoseparameter des CRC (Nosho 2010; Pages 2005; Pages et al. 2008). Diese
Erkenntnis wird von der hier präsentierten Studie unterstützt. Es wurde die Beobachtung
gemacht, dass die Patienten, die eine höhere Memory-T-Zelldichte in der Invasionsfront
aufwiesen verglichen mit einer niedrigeren Dichte ein längeres DFS aufwiesen (p=0,046).
Für die Biopsie ergaben sich keine signifikanten Ergebnisse bezüglich der Memory-TZelldichte.
6.5. Subgruppen der regulatorischen T-Zellen
Es muss erwähnt werden, dass es sich bei den beiden untersuchten T-Zellarten um
funktionelle Übergruppen handelt. Mittlerweile gilt es als erwiesen, dass sich im Detail
beide wiederum in funktionelle Untergruppen aufteilen lassen.
Das im Kern lokalisierte FoxP3 gilt als Marker für die suppressive Funktion von Treg
(Fontenot 2003; Hori et al. 2003; Khattri 2003). Suzuki et al. fanden, dass FoxP3+ Treg,
die den VEGF-Rezeptor 2 (VEGFR 2) exprimieren, eine stärkere suppressive Wirkung
haben als VEGFR-2-negative. Sie schlugen daher den VEGF-Rezeptor 2 als zusätzlichen
Marker vor, der sich in Zellmembran, -zytoplasma und –kern findet. Sie gingen davon
aus, dass nur Treg den VEGFR2 exprimieren (Suzuki 2013).
6.6. Subgruppen der Memory-T-Zellen
Die Färbung mit CD45RO fasst Effektor-Memory- und Memory-T-Zellen zusammen.
Anhand der Bestimmung des CCR7-Status lassen sich diese beiden Subgruppen
voneinander trennen. Die CCR7-negativen T-Zellen erfüllen die Effektorfunktion,
während die CCR7-positiven T-Zellen die Charakteristika der Memory-Zellen tragen.
Letztere können zu CCR7-negativen Zellen ausdifferenzieren und so zu Effektorzellen
konvertieren (Mackay 1999).
Es existieren weitere Marker und Markerkombinationen, zur genaueren funktionellen
Einteilung der Immunzellen. Tosolini et al. nähern sich dieser Fragestellung über die
Bestimmung einiger mit den jeweiligen Zellfunktionen assoziierter Gene. Es wurden
Genmuster bestimmten Zellarten zugeordnet und quantifiziert. Die Analyse ergab, dass
zwei Untergruppen von T-Helferzellen, die Th1- und die Th17-T-Zellen, mit
unterschiedlichen funktionellen Genclustern gegensätzliche Effekte auf das Überleben
haben (Tosolini et al. 2011). Die Genanalyse wird gerne als Mittel zur Charakterisierung
von Zellen herangezogen (Galon 2007; Nosho 2010).
Hierzu muss erwähnt werden, dass die genaue Markierung und Charakterisierung
einzelner Untergruppen wichtig für das Verständnis der Immunantwort auf Tumoren im
53
Detail ist. Bei der Suche nach einem als Standard denkbaren Marker wird aber die
prognostische Relevanz des Markers selbst in den Vordergrund gestellt. Erfasst dieser
mehrere Untergruppen einer Zellart muss dies keinen Einfluss auf seine prognostische
Relevanz haben, solange dieser reproduzierbar ist. Ein solcher Marker muss neben der
prognostischen Signifikanz auch andere Eigenschaften erfüllen. Dazu gehören eine
verhältnismäßig einfache Handhabung, technische Einfachheit und Finanzierbarkeit.
6.7. Lokalisation und Verteilung der Tumorinfiltrierenden Lymphozyten
Die Beschreibung der T-Zellen erfolgte in den oben genannten Studien im Wesentlichen
von der Zelle selbst aus gesehen, also von intern. Ein hier als extern bezeichnetes
Merkmal, das beim ersten Blick durch das Mikroskop auffällt, ist die inhomogene
Verteilung der Zellen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass unterschiedliche
Anordnungen von TIL in Tumoren eine Bedeutung für die Prognose haben (Haas 2009;
Suzuki 2013). In den gleichen Arbeiten wurde auch gezeigt, dass die TIL im
Tumorstroma eine höhere Bedeutung haben als die intraepithelial im Tumor gelegenen
(Haas 2009). Dies kann durch die hier vorgelegten Ergebnisse bestätigt werden. Mit
Ausnahme des Abstandes von Memory- zu regulatorischen T-Zellen im Tumorepithel
besitzt kein Wert zu den intraepithelial gelegenen T-Zellen prognostische Aussagekraft.
Die prognostisch relevanten Daten wurden sechsmal aus stromal gezählten Zellen
erhoben. Zweimal wurden die Zellen in der gesamten Stanze zur Erhebung eines
prognostisch signifikanten Ergebnisses gezählt. Ein aus den gesamten Stanzen
gewonnenes Ergebnis wies nur eine interessante Tendenz auf.
Die Unterscheidung von Tumorepithel und Stroma als mögliche Lokalisationen der TIL
zeigt bereits, dass die Zellen sich unterschiedlich verteilen und auch je nach Lage eine
andere prognostische Bedeutung haben oder eben nicht. Es ist nun wichtig zu
berücksichtigen, dass sie auch innerhalb dieser Regionen nicht homogen verteilt
vorliegen. Diese hier gemachte Beobachtung wurde im Rektumkarzinom schon von einer
Heidelberger Forschergruppe beschrieben, jedoch noch nicht quantifiziert (Halama 2012).
6.8. Prognostische Signifikanz der Zellabstände in der Invasionsfront
Daher ist nicht nur die Anzahl der TIL pro Fläche von Interesse, sondern auch der
Abstand zwischen den jeweils gezählten Zellen. Im gleichen Atemzug stellt sich die
Frage nach ihrer Verteilung im Gewebe.
Wie zuvor bei der Messung der Memory-T-Zelldichte auch, fiel bei der Abstandsmessung
die Invasionsfront mit klaren Ergebnissen sowohl zu Treg, als auch zu Memory-T-Zellen
auf. Hier waren die im Stroma ermittelten Abstände entscheidend. Dazu muss ergänzt
54
werden, dass nur bei Vorhandensein von Tumorgewebe in der Invasionsfront zwischen
den Regionen „Tumor“ und „Stroma“ unterschieden wurde. Das erklärt auch die geringen
Fallzahlen (24 und 38 Patienten). Ein niedrigerer Abstand der Treg (p=0,017; Abbildung
7) zueinander und der Memory-T-Zellen (p=0,051; Abbildung 8) zueinander war jeweils
mit einem besseren DFS verbunden. Die Verteilung der Treg im Stroma der
Invasionsfront gehorchte nicht dem Zufall (Abbildung 26). Die Zellen lagen also in einem
bestimmten Muster um den Tumor herum. Die aus der Beobachtung entstandene
Annahme, dass Treg tumornah liegen lässt sich aufgrund dieser Daten nicht genau
verifizieren. Die Ergebnisse schließen jedoch die Möglichkeit nicht aus. Eine weitere
denkbare Erklärung wäre die Gruppierung in Treg-Zellnestern, die eine inhomogene
Verteilung der Zellen bedingen könnte. Es ist also bei gleicher Dichte prognostisch
günstiger, wenn Treg in der Invasionsfront in irgendeiner Weise näher beieinander liegen.
Die Memory-T-Zellen lagen hingegen eher gleichmäßig verteilt (Abbildung 26). Die
Schlussfolgerung, dass sich hier vor allem eine größere Zahl pro Fläche positiv auswirkt,
wird von den eigenen Ergebnissen unterstützt. Eine höhere Dichte der Memory-T-Zellen
in der Invasionsfront wirkte sich positiv auf das DFS aus (p=0,046; Abbildung 4).
6.9. Abstand zwischen Treg im Tumorstroma als hochsignifikanter
Prognoseparameter
Im Stroma des Primärtumors konnte eine Beobachtung von hoher prognostischer
Signifikanz gemacht werden. Ein niedrigerer Abstand zwischen den Treg war hier mit
einem besseren DFS verbunden (p=0,00035; Abbildung 10). Zum Vergleich war der
Abstand zwischen den Treg vor der Therapie, sprich im Biopsiepräparat, nicht auffällig
(Abbildung 11).
Im Stroma des Primärtumors war die Treg-Zellverteilung wider Erwarten zufällig
(Abbildung 24). Das bedeutet, dass hier auch die Treg gleichmäßig im Gewebe verteilt
lagen. Man kann nun den Gedankenkreis schließen und die Ergebnisse rückversichern.
Von niedrigeren Abständen zwischen den Treg lässt sich auf eine höhere Dichte
schließen. Wie oben erwähnt, wirkte sich auch im gesamten Tumorgewebe eine höhere
T-Zelldichte positiv auf das Überleben aus (p=0,005; Abbildung 5).
55
6.10.
Abstände zwischen Treg und Memory-T-Zellen im Tumorgewebe
von prognostischer Signifikanz
Die im Folgenden beschriebenen Ergebnisse beziehen sich auf Abstandsmessungen
einmal von Treg zu Memory-T-Zellen und das andere Mal von Memory-T-Zellen zu
Treg. Es ist wichtig zu verstehen, dass es sich hier um unterschiedliche Abstände mit
möglicherweise unterschiedlicher Aussage handelt. Da immer der nächste Abstand
gemessen wird, ist unter Umständen der Abstand von Zelle A1 aus gesehen zu der
nächsten Zelle B1der kürzeste Abstand zu einer Zelle der Art B. Umgekehrt kann jedoch
von der Zelle B1 aus gesehen eine Zelle A2 näher liegen als A1. Es würde also einmal
der Abstand A1-B1 und einmal der Abstand B1-A2 gezählt werden.
Im Stroma des Tumors stellte sich also der Abstand von Treg zu Memory-T-Zellen als
Prognoseparameter dar. Die Gruppe mit kürzeren Abständen von Treg zu Memory-TZellen wies ein längeres DFS auf als die Gruppe mit im Vergleich längeren Abständen
(p=0,027; Abbildung 13). Da im Stroma beide TIL gleichmäßig verteilt lagen (Abbildung
23) kann man annehmen, dass es sich positiv auswirkt wenn die Treg mindestens eine
nahe benachbarte Memory-T-Zelle bei sich haben. Die oben beschriebene subjektive
Beobachtung der Treg mit Memory-Sozius wird also bestätigt und mit besserem DFS in
Verbindung gebracht. Zur Interaktion der Zellen untereinander kann anhand dieses
Ergebnisses jedoch keine Aussage gemacht werden. Naheliegend wäre ein ZellZellkontakt, der sich jedoch mit der hier verwendeten Methode nicht nachweisen lässt.
Zumindest die Wahrscheinlichkeit für einen Oberflächenkontakt zwischen den Zellen ist
bei niedrigerem Abstand höher als bei weiterem Abstand.
Intraepithelial zeigte sich im Tumorgewebe ein kürzerer Abstand von Memory-T-Zellen
zu Treg als Indikator für ein besseres DFS (p=0,001; Abbildung 12). Hier liegen die
Memory-T-Zellen unregelmäßig verteilt vor, die Verteilung der Treg hingegen gehorcht
eher dem Zufall (Abbildung 23). Dies weist in Richtung der oben bereits erwähnten
Beobachtung von Zellgruppen im Tumorepithel. Die niedrige Fallzahl, in denen TIL
intraepithelial gezählt wurden, kann wiederum als Bestätigung der Aussage zu der relativ
seltenen Infiltration des Tumorepithels durch TIL herangezogen werden (Abbildung 12).
Anhand des zuletzt vorgestellten Ergebnisses kann man sagen, dass, falls es zu einer
Infiltration mit TIL kommt, es prognostisch günstiger ist, wenn eine Treg näher an einer
Memory-T-Zelle liegt. Es fehlt der Vergleich mit dem Fall, dass gar keine Treg im Spiel
ist. Daher lässt sich über die Qualität des jeweiligen Einflusses der Zellen aufeinander
keine Aussage machen. Es ist aber eine Tendenz zu einer gegenseitigen Beeinflussung
56
gegeben. Welche Zelle welche und inwieweit beeinflusst, muss noch weiter untersucht
werden.
6.11.
Immunmodulatorischer Ansatz zur Nutzung der Ergebnisse
Der signifikante Zusammenhang zwischen Prognose und Dichte von Immunzellen ist von
vielen Gruppen bestätigt worden. Dies hat bereits dazu verleitet, therapeutische Ansätze
zu formulieren, die eine direkte Modulation jener Zellen anstreben.
Im Hinblick auf die Erkenntnisse in anderen Tumorentitäten gibt es den Vorschlag durch
die Unterdrückung der FoxP3 positiven Treg die Tumorkontrolle durch das Immunsystem
und damit die Prognose zu verbessern. Dieser Ansatz muss jedoch aufgrund der hier
vorgetragenen Ergebnisse, die sich mit Aussagen anderer Forschergruppen zum
Rektumkarzinom decken, mit Vorsicht behandelt werden (deLeeuw et al. 2012; Scurr et
al. 2012). Erst wenn verstanden ist, warum sich eine hohe Treg-Dichte mal gut und mal
schlecht auf die Tumorprogression auswirkt, kann man in der Konsequenz therapeutische
Konzepte daraus entwickeln.
6.12.
Problem der adjuvanten Therapie beim Rektumkarzinom
Das Rektumkarzinom stellt Therapeuten vor schwierige Aufgaben, da es eine hohe Rate
an Rezidiven hat. Die lokale Rezidivrate konnte, wie bereits oben besprochen, auf unter
10% gesenkt werden. Die Rate an systemischen Rekurrenzen und somit auch das
Gesamtüberleben (overall survival = OS) blieb trotz aller Bemühungen bisher nahezu
unverändert.
Um dieser Situation Herr zu werden gilt die adjuvante Chemotherapie beim
Rektumkarzinom als Standard und wird in jedem Fall empfohlen. Das etablierte
Chemotherapeutikum ist 5-Fluorouracil (5-FU) alleine oder in Kombination mit
Folinsäure (W. Schmiegel 2008). Als ergänzende Substanz zur Aggravation der Therapie
wird derzeit Oxaliplatin in der CAO-ARO-AIO-04-Studie appliziert (Rödel 2012).
Jedoch hat sich gezeigt, dass nicht jeder Patient von der adjuvanten Therapie profitiert.
Optimaler Weise sollten nur solche Patienten auch adjuvant behandelt werden. Ein
Kriterium zur Unterscheidung solcher Patienten von denen, die nicht von einer
adjuvanten Therapie profitieren, ist jedoch noch nicht gefunden (Fietkau 2010). Fände
man den Schlüssel zu der prognostischen Inhomogenität der TNM-Stadien, hätte man
eben dieses fehlende Kriterium zur Hand. Die adaptive Immunantwort ist ein potentieller
Kandidat für diese Rolle. Sie spielt nachgewiesener Maßen eine Rolle bei der
Tumorkontrolle. Einige TIL haben sich in mehrfachen Studien als prognostisch
signifikant herausgestellt (Lee 2010; Nosho 2010; Pages et al. 2009). Ihre Quantifizierung
57
erfüllt die meisten Anforderungen an einen im klinischen Alltag brauchbaren Test, allen
voran die Reproduzierbarkeit. Andere Methoden wie beispielsweise genetische und
molekulare Untersuchungen scheiterten hier (Mlecnik et al. 2011).
Pagès et al. fordern die Reformation des Stagingsystems nach immunologischen
Gesichtspunkten. Sie postulieren, dass die Quantifizierung der adaptiven Immunantwort,
speziell der Memory- und der zytotoxischen T-Zellen, unabhängige und dem
pathologischen Staging überlegene Prognosefaktoren seien.
Es wird vorgeschlagen,
einen Immunscore, der Typ, Dichte und Lokalisation von Immunzellen beinhaltet, als
Ergänzung zum N-Stadium einzuführen (Pages et al. 2010; Pages 2009). Die hier
gezeigten Ergebnisse unterstützen die Forderung nach einer Integration der Erkenntnisse
zur immunologischen Komponente der Tumorprogression in das pathologische Staging.
6.13.
Bestrahlung beeinflusst lokale Immunantwort im Rektumkarzinom
nicht
Aus therapeutischer Sicht ist nicht nur der prognostische Wert der TIL selbst interessant.
Es stellt sich außerdem die Frage, ob es durch die Therapie zu Änderungen im
Immunsetting kommt. Wirkt sich die Radiotherapie in irgendeiner Weise auf die lokale
Immunreaktion auf den Tumor aus? Bei einer simultanen Radiochemotherapie (RCT) ist
die Chemotherapie die systemisch und die Radiotherapie die lokal wirksame
Komponente. Daher kann man davon ausgehen, dass lokale Änderungen an und um das
Tumorgewebe am ehesten durch die Bestrahlung entstanden sind. In Kopf-Hals-Tumoren
wurde bereits beobachtet, dass eine neoadjuvante RCT die Entzündung zu einem
Antitumor-Muster hin beeinflusst hat (Distel et al. 2012; Tabachnyk et al. 2012). Die
Bestrahlung wirkt auch in anderen Tumorentitäten nicht nur lokal auf die Tumorzellen,
sondern hat via Modulation der Immunzellen zu einem Antitumorsetting hin auch
systemischen Einfluss. Dieser Effekt kann durch Immunstimulatoren noch verstärkt
werden. Das beschriebene Phänomen wird als „abscopal effect“ bezeichnet (Rubner et al.
2012). In Mausmodellen zu Brust- und Darmkrebs zeigte sich, dass auch das
Fraktionierungsschema entscheidend für einen förderlichen Effekt der Bestrahlung ist
(Dewan et al. 2009). Eine Schlüsselrolle wird bisher den dendritischen Zellen
zugeschrieben (Rubner 2012).
Es hat sich gezeigt, dass Dichte und Abstände zwischen den Treg und Memory-T-Zellen
beim Rektumkarzinom prognostische Aussagekraft besitzen. Nun stellt sich die Frage ob
auch hier der „abscopal effect“ beobachtet werden kann und ob eine Beeinflussung der
Zellen in eine prognostisch gute oder schlechte Richtung hin stattfindet.
58
Es wurden dazu alle Ergebnisse miteinander korreliert. Demnach lässt sich von einem
niedrigen Abstand zwischen den Treg in der Biopsie auf einen niedrigen Abstand im
Tumorstroma schließen (p<0,0001; Abbildung14). Letzterer ist hoch signifikant mit
einem besseren DFS verbunden (p=0,00035; Abbildung 10). Dies deutet darauf hin, dass
die Therapie keinen Einfluss auf die Treg hatte. Da aber anhand des intraepithelialen
Abstandes zwischen den Treg in der Biopsie wiederum keine Aussage über das DFS
gemacht werden kann, ist dieses Ergebnis nicht eindeutig.
Eine weitere Übereinstimmung fand sich zwischen dem Abstand der Memory-T-Zellen
zu den Treg in der Biopsie und dem gleichen Abstand in der Invasionsfront. Diese wiesen
ebenfalls positive Kovarianz auf (p<0,01; Abbildung15). Aufgrund der kleinen Fallzahl
kann auch hier ein Einfluss der neoadjuvanten RCT nicht sicher ausgeschlossen werden.
Eine Tendenz ist jedoch gegeben. Zu den Memory-T-Zellen direkt ergab sich keine
Korrelation. Allerdings sind diese in der zuletzt genannten Abstandsmessung involviert.
Es kann über sie somit keine Aussage gemacht werden.
Der in anderen Tumoren beobachtete positive Einfluss der Bestrahlung auf die
Entzündungszellen lässt sich durch diese Daten für das Rektumkarzinom nicht sicher
ausschließen. Die hier gemachten Beobachtungen zu den Treg sprechen tendenziell
dagegen.
6.14.
Systemische Wirkung des Immunsystems
Die Aussage, dass die adaptive Immunantwort nicht lokal auf den Tumor selbst
beschränkt ist, kann durch weitere erstellte Korrelationsdiagramme bestätigt werden. Der
Abstand der Memory-T-Zellen in der Invasionsfront korrelierte mit Abstandsdaten aus
dem Tumorepithel, dem Tumorstroma und dem Normalgewebe (p<0,0001; p<0,0001;
p<0,01; p<0,01; Abbildungen 16-19). Auch der Abstand von Memory-T-Zellen zu Treg
in der Invasionsfront zeigte Zusammenhänge mit dem gleichen Abstand in Tumor und
mit dem Abstand zwischen den Memory-T-Zellen im Normalgewebe (p<0,0001, p<0,01,
Abbildungen 20 und 21). Eben dieser Abstand korrelierte auch beim Vergleich zwischen
Normalgewebe und Tumorstroma (p<0,0001; Abbildung 22). Die Immunantwort spielt
sich also wie erwartet nicht nur im Tumorgewebe selber ab, sondern erstreckt sich über
die Invasionsfront hinaus ins Normalgewebe.
59
6.15.
Integration immunologischer Kriterien ins TNM-System
Um das Zusammenspiel der einzelnen Immunzellen, das in der adaptiven Immunantwort
mündet, zu verstehen, bedarf es weiterer Studien. Interaktionen und Beeinflussungen
durch äußere Faktoren wie Therapie oder auch Risikofaktoren müssen näher untersucht
werden. Dies ist nötig um immunmodulatorische Therapieansätze weiter verfolgen zu
können. Unabhängig davon gelten Marker wie FoxP3 und CD45RO als signifikante
Prognoseparameter für das Rektumkarzinom, was hier bestätigt werden kann. Ein solcher
Prognoseparameter
an
dem
sich
insbesondere
die
adjuvante
Therapie
des
Rektumkarzinoms orientieren könnte, fehlt bisher. Daher wäre eine Integration
immunologischer Kriterien in das TNM-System durchaus sinnvoll.
60
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Selbmann,
S3-Leitlinie
Kolorektales
Karzinom
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8. Abkürzungsverzeichnis
Aa.
Arteriae
bzw.
beziehungsweise
CRC
colorectal carcinoma = Kolorektales
Karzinom
CT
Chemotherapie
DFS
disease-free
survival
=
tumorfreies
Überleben
et al.
et alii (lat.) = und Mitarbeiter
mm
Millimeter
MRT
Magnetresonanztomografie
OP
Operation
OS
overall survival = Gesamtüberleben
RCT
Radiochemotherapie
ROI
region of interest
RT
Radiotherapie
TIL
Tumorinfiltrierende Lymphozyten
Treg
regulatorische T-Zelle/n
z.B.
zum Beispiel
5-FU
5-Fluorouracil
5-JÜL
5-Jahres-Überleben
70
9. Danksagung
Mein Dank gilt allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
An erster Stelle danke ich Herrn Professor Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der
Universität Erlangen, der mir die Möglichkeit gab im Labor der Strahlenbiologie diese
Arbeit zu erstellen.
Mein besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn PD Dr. Distel, der immer ansprechbar
und offen für jede Frage war. Danke für die viele Zeit, die Tipps, Anregungen und
Hilfestellungen unter Anderem bei technischen Differenzen zwischen mir und dem
Computer. Nicht zuletzt wegen seiner Ermutigungen und motivierenden Unterstützung
habe ich während meiner Elternzeit schließlich diese Arbeit fertigstellen können.
Dem Team der Pathologie der FAU um Tilman Rau danke ich für die Unterstützung bei
dieser Arbeit.
Danke an meine Eltern und Schwiegereltern in spe für die Betreuung meines Sohnes
Samuel während meiner Arbeitszeit.
Von Herzen vielen Dank an Philipp, Samuels Vater, der mich immer, also auch beim
Unternehmen Dissertation, unterstützt und der in Allem hinter mir steht.
Meinem kleinen Samuel danke ich für seine Geduld, seinen guten Schlaf in den ersten
Monaten und sein sonniges Gemüt, das es mir ermöglicht hat, diese Arbeit fertig zu
stellen.