Transienter Adenoviraler Gentransfer mit hCAP18/LL37 in infizierten
Werbung
Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum, Berufsgenossenschaftliche Universitätskliniken Bergmannsheil Prof. Dr. med. H.U. Steinau Transienter Adenoviraler Gentransfer mit hCAP18/LL37 in infizierten Verbrennungswunden. Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Vorgelegt von Dominik Mittler aus Köln 2007 Dekan: Prof. Dr. med. Gert Muhr 1. Referent: Professor Dr. med. Lars Steinsträßer 2. Referent: PD Dr. med. Oliver Wildner Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2008 Abstract: Hintergrund: Verbrennungswunden stellen aus medizinischer und finanzieller Sicht ein großes Problem für die intensivmedizinische Patientenversorgung dar. Während in den letzten Jahren gute Fortschritte bei der Bekämpfung der lebensbedrohlichen Schocksituation erzielt werden konnten, treten zunehmend Infektionen durch multiresistente Keime, wie z. B. Pseudomonas aeruginosa, bei denen die klassische Antibiotikatherapie immer häufiger versagt, auf. Eine vielversprechende Alternative zu den klassischen Antibiotika sind Host Defense Peptide (HDP) wie das einzige Cathelicidin des Menschen, LL37. Mittels Gentherapie können diese HPD durch körpereigene Zellen lokal synthetisiert werden und damit zu einer entscheidenden Verbesserung der Wundheilung und Infektionsbekämpfung beitragen. Methode: Die hier vorliegenden Ergebnisse wurden mittels eines infizierten Rattenverbrennungsmodells gewonnen. Bei diesem Modell werden bei männlichen Sprague Dawley Ratten zwei 8,75 cm2 große Verbrennungswunden an beiden Flanken gesetzt und mit 1 x 108 Pseudomonaden infiziert. An diesem Modell wurde die Wirkung von adenoviral transfiziertem hCAP18, mit synthetisch hergestelltem LL37, einer Negativ-Kontrolle und einer Leerviruskontrolle anhand so genannter „colony forming units“ (CFU) pro g Hautgewebe verglichen. Ergebnis: Es ist möglich hCAP18 transient in infizierte Verbrennungswunden der Ratte zu transfizieren und durch die anschließende Expression des Host Defense Peptids LL37 eine aktive Inhibition des Wachstums von Pseudomonas aeruginosa zu erreichen. Diskussion: Es konnte gezeigt werden, dass transienter Genetransfer in infizierten Verbrennungswunden möglich ist und zu einer deutlichen Inhibition des Wachstums von Pseudomonas führt. Inwieweit sich die Bakterieninhibition in eine aktive Reduktion steigern lässt und ob eine totale Beseitigung ohne zu ausgeprägte unerwünschte Nebenwirkungen möglich ist, müssen weitere Versuche zeigen. Für meine Eltern und meinen Bruder Inhaltsverzeichnis: VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN ............................................................................. 5 VERZEICHNIS DER TABELLEN .................................................................................... 8 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN .............................................................................. 9 A EINLEITUNG ................................................................................................ 10 1 PROBLEMATIK VERBRENNUNGEN ......................................................................... 10 2 IMMUNSYSTEM .................................................................................................... 13 2.1 HOST DEFENSE PEPTIDE (HDP) ....................................................................... 14 2.2 MIKROBIZIDE WIRKUNG VON HOST DEFENSE PEPTIDEN ...................................... 16 2.3 HOST DEFENSE PEPTIDE - THERAPIE BEI VERBRENNUNGEN ................................ 17 2.4 HERSTELLUNG UND KOMMERZIELLE ENTWICKLUNG VON HOST DEFENSE PEPTIDEN ............................................................................................................................ 18 3 GENTHERAPIE ALS ALTERNATIVE MEDIKAMENTENAPPLIKATION.............................. 20 3.1 GENTHERAPIE DER HAUT .................................................................................. 21 3.2 METHODEN DES GENTRANSFERS, VOR- UND NACHTEILE..................................... 22 3.3 VIRALE VEKTOREN ........................................................................................... 22 3.4 ADENOVIREN UND ADENOVIRALE VEKTOREN ...................................................... 23 4 DAS TRANSGEN HCAP18/LL37 .......................................................................... 26 4.1 STRUKTUR UND EXPRESSION DES HCAP18/LL37 .............................................. 27 4.2 WIRKUNG VON HCAP18/LL37 .......................................................................... 30 4.3 RESISTENZMECHANISMEN ................................................................................. 31 4.3 WEITERE EIGENSCHAFTEN VON HCAP18/LL37 ................................................. 32 5 AUFBAU DER STUDIE UND ZIEL DIESER ARBEIT ..................................................... 33 B MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 34 1 MATERIALIEN ..................................................................................................... 34 1.1 CHEMIKALIEN UND MEDIEN ............................................................................... 34 1.2 MEDIKAMENTE, DESINFEKTIONSMITTEL & VERBANDSMATERIALIEN ....................... 35 1.3 ZELLEN ........................................................................................................... 35 1.4 ADENOVIRALER VEKTOR ................................................................................... 35 1.5 BAKTERIEN ...................................................................................................... 36 1.6 TIERE ............................................................................................................. 36 1.7 SYNTHETISCHES HOST DEFENSE PEPTID LL37 .................................................. 36 1.8 AGARPLATTEN, MEDIENGEMISCHE, PUFFER-, TRÄGERLÖSUNGEN UND GRADIENTEN ............................................................................................................................ 36 1.9 BESTIMMUNGSKIDS UND ANTIKÖRPER................................................................ 38 2.0 ANDERE MATERIALIEN ...................................................................................... 38 2.1 GERÄTE .......................................................................................................... 39 2 ALLGEMEINE ARBEITSMETHODEN ........................................................................ 41 2.1 STERILISATION................................................................................................. 41 2.2 AGARPLATTENFERTIGUNG ................................................................................ 41 2.3 HAUTPROBENHOMOGENISATION ........................................................................ 41 2.4 ZELLKULTUREN ................................................................................................ 42 3 PRÄPARATION UND PURIFIKATION DES AD5-HCAP18 UND AD5-LACZ ................... 43 3.1 PURIFIKATION UND TITERUNG DER VERWENDETEN VIREN .................................... 43 4 RAT BURN INFECTION MODELL ............................................................................ 48 4.1 TIERHALTUNG UND VORBEREITUNG ................................................................... 48 4.2 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG .............................................................................. 48 4.3 NARKOSE ........................................................................................................ 49 4.4 ANALGESIE ...................................................................................................... 49 4.5 RASUR ............................................................................................................ 50 4.6 BAKTERIENKULTUR .......................................................................................... 50 4.7 KONTROLLAUSSTRICH ...................................................................................... 50 4.8 VERBRENNUNG & INFEKTION ............................................................................ 51 4.9 VERBAND ........................................................................................................ 52 4.10 APPLIKATION ................................................................................................. 52 4.11 PROBENGEWINNUNG ...................................................................................... 54 5 QUANTITATIVE MIKROBIOLOGISCHE ANALYSE ....................................................... 55 5.1 PROBENHOMOGENISATION................................................................................ 55 5.2 VERDÜNNUNGSREIHE ....................................................................................... 55 5.3 AUSPLATTIEREN .............................................................................................. 55 5.4 AUSZÄHLUNG .................................................................................................. 56 6 HISTOLOGISCHE ANALYSE .................................................................................. 57 6.1 ANFÄRBUNG VON GEWEBESCHNITTEN MIT HÄMATOXYLIN UND EOSIN ................... 57 2 6.2 NACHWEIS VON HCAP18/LL37 TRANSKRIPTEN DURCH NICHT RADIOAKTIVE IN SITU HYBRIDISIERUNG ................................................................................................... 57 7 SEMIQUANTITATIVER NACHWEIS VON LL37 TRANSKRIPTEN IN VERBRENNUNGSWUNDEN ....................................................................................... 60 7.1 ISOLATION DER GESAMT-RNA........................................................................... 60 7.2 REVERSE TRANSKRIPTION ................................................................................ 60 7.3 REAL-TIME PCR .............................................................................................. 60 8 STATISTISCHE AUSWERTUNG .............................................................................. 62 C ERGEBNISSE .............................................................................................. 63 1 VORBEREITUNG .................................................................................................. 63 1.1 VIRUSPRODUKTION UND TITERUNG .................................................................... 63 1.2 BAKTERIENVERMEHRUNG UND KONTROLLAUSSTRICHE ........................................ 63 1.3 VERSUCHSTIERE .............................................................................................. 64 2 DAS STANDARDISIERTE RATTEN-VERBRENNUNGS-INFEKTIONS-MODELL ................ 65 3 IN VIVO TRANSFEKTION VON AD5-HCAP18 .......................................................... 66 4 HISTOLOGISCHE & SEMIQUANTITATIVE ANALYSE .................................................. 69 4.1 HÄMATOXYLIN-EOSIN FÄRBUNG VON 2° VERBRANNTER HAUT .............................. 69 4.2 LOKALISATION VON HCAP18/LL37 TRANSKRIPTEN ............................................ 70 4.3 SEMI-QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON HCAP18/LL37 DURCH REAL-TIME RTPCR ............................................................................................................................ 71 D DISKUSSSION ............................................................................................. 72 1 VIRUSPROPAGATION ........................................................................................... 77 2 DAS STANDARDISIERTE UND REPRODUZIERBARE TIERMODELL ............................... 77 3 IN VIVO TRANSFEKTION VON AD5-HCAP18 .......................................................... 78 4 GENTHERAPIE .................................................................................................... 82 E ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 84 F LITERATUR .................................................................................................. 85 G ANHANG .................................................................................................... 101 3 DANKSAGUNG ..................................................................................................... 101 FINANZIELLE FÖRDERUNG .................................................................................... 102 LEBENSLAUF....................................................................................................... 103 LISTE DER VERÖFFENTLICHUNGEN UND VORTRÄGE ............................................... 104 4 Verzeichnis der Abkürzungen AAV Adeno-Assoziierte-Viren Ad Adenovirus Ad5 Adenovirus Serotyp 5 Bac-5 Bactenesin 5 CAM Cathionic antimicrobial peptid CFU Colony forming units cm Zentimeter cm2 Quadratzentimeter Cnlp Gen, das bei Mäusen für CRAMP kodiert CRAMP cathelin related antimicrobial peptide CsCl Cäsium Chlorid C/EBP CCAAT/enhancer-binding Protein DMEM Dulbeco´s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonuklein Acid EBV Ebstein-Barr-Virus FBS Fetal Bovine Serum FPRL–1 Formyl peptide receptor-like 1 g Gramm hBD-1 humanes ß-Defensin 1 hBD-2 humanes ß-Defensin 2 hBD-3 humanes ß-Defensin 3 HDP Host Defense Peptid hGH human growth hormone HSV Herpes Simplex Virus ifu infectious units IL-1 β Interleukin- 1beta IL-6 Interleukin-6 IP Infectious Particle ITR inverted terminal repeats kb Kilobasen kDa Kilodalton kg Kilogramm 5 KG Körpergewicht lacZ Reportergenkonstrukt lacZ, das für das Protein βGalaktosidase kodiert LL37 37 Aminosäuren langes humanes Cathelicidin LPS Lipopolysaccaride mg Milligramm M Molar MHC-I Major Histocompatibility complex I MIC Minimal inhibitory concentration Min Minute(n) ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol MOI Multiplicity of Infektion = Anzahl der Viren pro Zelle MRSA methicillin-resistenter Staphylokokkus aureus NF-κappa B Nuclear Faktor kappa B nm Nanometer NO Stickstoffoxid OD Optical density PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PIA Pseudomonas Isolationsagar PMAP porcine myeloid antimicrobial peptid PR Aminosäure Prolin P/S Penicillin/Streptomycin rh rhesus rpm rounds per minute RT Raumtemperatur Sek Sekunde s.c. sub cutan SSC Saline Sodium Citrat SMAP sheep myeloid antimicrobial peptide TBSA Total Body Surface Area TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-alpha 6 µg Mikrogramm µl Mikroliter °C Grad Celsius 7 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Einteilung der Verbrennungsgrade [http://www.ffw-markt-eschlkam.de/verbrennungen.htm] Stand 02.05.2007 Tabelle 2: Peptidprodukte in der kommerziellen Entwicklung aus Review Zhang & Falla [188] und modifiziert durch Hancock & Sahl [73] Tabelle 3: Aufstellung der einzelnen Testgruppen und applizierte Lösungen und Mengen Tabelle 4: Anzahl der eingesetzten Schafsblut- und Pseudomonas Isolations Agarplatten für jede Hautprobe Tabelle 5: Berechnung der CFU/g Gewebe am Beispiel der Hautprobe der Ratte 4 von der linken Flanke Tabelle 6: Titerergebnisse für die Propagation von Ad5-lacZ Viruschargen Tabelle 7: Titerergebnisse Viruschargen Tabelle 8: Ergebnisse der Kontrollausstriche von 250 µl Bakteriensuspension für 8 die Propagation von Ad5-hCAP18 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1: Verbrennungsgrade I – IV [http://www.professor-stock.de/verbrennungschirurgie/akutversorgung.html] Stand 17.03.2007 Abbildung 2: Regulation des adaptiven Immunsystems durch Defense Peptide aus Hancock Review 2006 [73]. Abbildung 3: Wirkungsmechanismen von Host Defense Host Peptiden [http://www.meducator.org/archive/20051129/02_peptides.html] Stand 02.05.2007 Abbildung 4: Schematische Darstellung des Processings von hCAP18/LL37. Abbildung 5: Sekundärstruktur hCAP18/LL37 Abbildung 6: Ratte im Isolierschlauch Abbildung 7: Intradermal und subkutane Applikation Abbildung 8: Präparation der Hautprobe Abbildung 9: Verbrennungsareale unmittelbar nach Exposition Abbildung 10: Auswertung der CFU/g Hautgewebe der drei Messgruppen (Ad5-hCAP18, pures Peptid LL37 und der Negativkontrolle) 48 Stunden nach Transfektion. Abbildung 11: Auswertung der CFU/g Hautgewebe der vier Messgruppen (Ad5-hCAP18, pures Peptid LL37, Negativkontrolle und Leerviruskontrolle) 7 Tage nach Transfektion. Abbildung 12: Hämatoxylin gefärbter Parafinschnitt zur Verifizierung der Verbrennungstiefe eines vertikalen Hautschnitts der Ratte bei 20facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop Abbildung 13: Lokalisation von hCAP18/LL37 durch nicht radioaktive in situ Hybridisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop am zweiten Messzeitpunkt (200fach). a. Vertikaler Schnitt (links): hCAP18/LL37 mRNA positive Zellen (weiße Pfeile) b. Horizontaler Schnitt (rechts): kein Nachweis von hCAP18/LL37 Transkripten Abbildung 14: Semi-Quantitative Transgendetektion in verbrannter und infizierter Haut der Ratte zum zweiten Messzeitpunkt. des 9 Human Host Defense Peptids A Die Einleitung moderne Medizin in Verbrennungskliniken und deren zugehörigen Intensivstationen sieht sich in zunehmendem Masse mit dem Problem konfrontiert, dass immer häufiger resistente Keime aus Verbrennungswunden isoliert werden, gegen die klassische Antibiotika zunehmenst versagen [4]. Die Patienten drohen trotz enormer Fortschritte bei der Behandlung des initialen Schocks eine Sepsis zu entwickeln und an dieser zu sterben. Deshalb ist es dringend notwendig „neue“ Alternativen zur klassischen Antibiotikatherapie zu entwickeln, anstatt nur neue Abkömmlinge bereits vorhandener Antibiotika einzusetzen, die seit Jahrzehnten im Einsatz sind. 1 Problematik Verbrennungen Mit einer Inzidenz von 5-8% stellen Verbrennungen ein großes medizinisches und sozioökonomisches Problem dar [4]. Verbrennungen werden nach Ausmaß der Schädigung und der Verbrennungstiefe in Grad I – IV eingeteilt, wobei diese vornehmlich durch die Einwirkzeit der jeweiligen Noxe, die Temperatur und die Leitfähigkeit des Gewebes bestimmt werden. Abbildung 1: Verbrennungsgrade I - IV 10 Zu den häufigsten verursachenden Noxen gehören Feuer, heiße Flüssigkeiten, Strahlung, Chemikalien, Explosionen, heiße Metalle oder Materialien und Stromunfälle. Energie wird als Wärme an das Körpergewebe abgegeben, wodurch es zu Schädigungen einzelner Zellen durch Membranveränderungen, Gerinnung des Zytoplasmas und Zerstörung des Zellkontaktes kommt. Bei größerer Wärmeeinwirkung denaturieren die Eiweißstrukturen und es kommt zur irreversiblen Schädigung, einer Nekrose. In diesen Bereichen sind die Kapillaren thrombosiert und wegen fehlender Durchblutung erliegt die Sauerstoffversorgung. Es kommt zur Freisetzung von Histamin mit Weitstellung der Gefäße, Rötung der Haut und Erhöhung der Gefäßpermeabilität. Zusätzlich kommt es durch den Austritt von Blutplasma zur Schwellung und Blasenbildung. Tabelle 1: Einteilung der Verbrennungsgrade Schweregrad Befund Pathophysiologie 1. Grad (»superficial«) Erythem, lokales Ödem, keine Narbenbildung Hyperämie, Vasodilatation Blasenbildung unter Epidermis Rötung wegdrückbar feuchter Wundgrund keine Narbenbildung vereinzelt Epithelnekrosen b) tiefe dermale Verbrennung Blasenbildung, Schädigung weit ins Korium reichend, Rötung nicht wegdrückbar, trockener Wundgrund, Nadelstiche schmerzhaft, Narbenbildung, spontane Regeneration möglich Denaturierung von Proteinen => weißliches Korium 3. Grad (»full thickness«) Nekrosen, Schorfbildung, keine Schmerzempfindlichkeit Narbenbildung fehlende Rekapilisierung häufig Kontrakturen und Keloidbildung Koagulationsnekrosen, Zerstörung der gesamten Haut und Hautanhangsgebilden 4. Grad Verkohlung des Gewebes 2. Grad (»partial thickness«) a) oberflächliche dermale Verbrennung Die Körperreaktionen auf Verbrennungen werden in systemische und lokale unterteilt. Erstere sind durch Hypovolämie, Elektrolyt- und Proteinverluste, Lungenödem, erhöhten Kalorienbedarf und eine unterdrückte Immunantwort charakterisiert. Letztere beinhalten Entzündung, Vasospasmen mit Flüssigkeitsansammlungen, Mikrozirkulationsstörungen, metabolische Azidose und 11 Elektrolytverschiebungen in Abhängigkeit vom Schweregrad der Verbrennung. Überleben die Patienten die kritischen ersten 48 Stunden der akuten Phase sind sie weiteren lebensbedrohlichen Faktoren, wie z.B. „Infektionen“ ausgesetzt [6]. Nicht selten enden derartige Infektionen in einer Sepsis, die mit Lethalitätsraten von 10-20% bei normalen Individuen und bis zu 30% bei immunsuppremierten Patienten assoziiert ist [43, 141]. Zu den häufigsten in Verbrennungswunden nachgewiesenen Keimen zählen mit etwa 50-60% die Pseudomonaden, von denen Pseudomonas aeruginosa in über 90% der Fälle resistent gegenüber Antibiotika wie Gentamicin, Carbenicillin, Cephalothin und Ceftazidime ist [48, 165]. Infektionen werden durch den Verlust der schützenden Hautoberfläche und tägliche Verbandswechsel begünstigt [37, 97, 120] und trotz moderner Intensivmedizin und potenter Antbiotika bleiben sie ein ernsthaftes Risiko für den Schwerbrandverletzten [37, 43, 164, 166]. Schwerverbrannten-Intensivstationen verzeichnen einen deutlichen Anstieg von Wundinfektion mit multiresistenten Bakterien und Pilzen, da die meisten der verwendeten Antibiotika seit 1960 unverändert eingesetzt werden [48, 64, 107, 127, 131, 144, 145, 164, 165]. Bakterielle Eigenschaften, wie schnelle Reproduktion und hohe genetische Variabilität, ermöglichen es den Mikroorganismen in enorm kurzer Zeit Resistenzen gegen Antibiotika zu entwickeln. Außerdem gab es in den letzten Jahrzehnten nur eine „echte“ neue Klasse von Antibiotika und neue Dritt- und Viertgenerationscephalosporine, Imipeneme und Fluorchinolone sind lediglich Derivate älterer Substanzen [12]. 12 2 Immunsystem Die geringe Inzidenz von Infektionen und inflammatorischen Komplikationen bei gesunden epithelialen Oberflächenstrukturen ist auf effiziente Abwehr- mechanismen des adaptiven und angeborenen Immunsystems, zu dem auch Host Defense Peptid gehören, zurückzuführen [103]. Der phylogenetisch ältere Teil ist das angeborene Immunsystem [103], das neben der ursprünglichen direkten Abwehrfunktion auch die Aufgabe hat, das adaptive Immunsystem zu regulieren [24, 49, 115, 117]. Wie effektiv der ältere Teil des menschlichen Immunsystems ist, wird deutlich, wenn man Organismen (Bakterien, Insekten, Planzen) betrachtet, die lediglich über ein „primitives“ Immunsystem verfügen, welches ohne B- und T-Lymphozyten auskommt, den Organismus aber wirkungsvoll schützt [33]. Dieses Abwehrsystem ist auch beim Menschen vorhanden und gehört zum angeborenen Immunsystem, der ersten Barriere gegen pathogene Einflüsse, die sowohl zeitlich wie auch räumlich vor dem adaptiven Immunsystem steht [116]. Ähnlich wie das adaptive Immunsystem, muss das angeborene Immunsystem selektiv Eindringlinge zerstören oder inaktivieren und das mit minimalem Schaden für den Wirt. Diese Unterscheidung zwischen „eigen“ und „fremd“ wird durch Rezeptor vermittelte Erkennung von gemeinsamen molekularen Eigenschaften, die Mikroorganismen von Wirtszellen (Glykane, Lipopolysaccharide) und eine konsequente selektive Versorgung mit mikrobiziden Effektormolekülen gegen Mikroorganismen erreicht. 13 Abbildung 2: Regulation des adaptiven Immunsystems durch Host Defense Peptide [73] Alternativ kann diese Differenzierung auch auf der Ebene der Toxizität, in Abhängigkeit von den ausgeprägten strukturellen Eigenschaften, erreicht werden [61]. Host Defense Peptide sind in unterschiedlichen Organismen, wie Pflanzen, Insekten, Bakterien und Wirbeltieren zu finden und weisen ein breites antimikrobielles Spektrum auf [25, 58, 90, 187]. 2.1 Host Defense Peptide (HDP) Die Präsentation einer phagozytotischen Theorie wurde erstmals 1883 durch Metchnikoff hervorgebracht [169]. Er schloss später daraus, dass mikrobizide Substanzen innerhalb von Phagozyten vorhanden sein müssen, die er als „ferments“ (Enzyme) bezeichnete. Erst 1922 entdeckte Flemming, dass in Flüssigkeitsfilmen epithelialer Oberflächen und in Phagozyten ein antimikrobielles und bakteriolytisches Enzyme, Lysozym, vorhanden war [60]. Seitdem wurden etliche weitere antimikrobielle Substanzen identifiziert, die von kleinen anorganischen Molekülen (Wasserstoffperoxid) bis zu großen Proteinkomplexen 14 der Komplement-Kaskade antimikrobiellen reichen Eigenschaften als [60]. Die zunächst Antimikrobielle aufgrund Peptide ihrer bezeichneten Eiweißketten wurden auf der Gorden Conference 2003 in Host Defense Peptide (HDP) umbenannt, da sie weitere Funktionen, wie Förderung der Neovaskularisation [91], Reepithelialisierung und Wundheilung [59], chemotaktische Eigenschaften, Bindung und Neutralisation von Endotoxin und proinflammatorischen mikrobiellen Oberflächenkomponenten [94, 95, 112, 153, 154, 189] und Stimulation der non-opsonized Phagozytose [157], besitzen. Über 800 Host Defense Peptide, die von allen Arten des Lebens produziert werden, sind bis heute isoliert worden [73, 90]. Sie haben zwei gemeinsame Eigenschaften, die für ihren Wirkungsmechanismus wichtig sind: Die Nettoladung ist aufgrund ihrer kationischen Aminosäuren (Arginin und Lysin) bei neutralem pH-Wert positiv und ihre dreidimensionale Struktur weist eine hydrophobe und eine hydrophile Seite auf [71]. Außerdem unterscheiden sie sich in der Länge ihrer Aminosäuresequenz und ihrer Sekundärstruktur [90]. Die streng regulierte Expression von Host Defense Peptide geschieht entweder wie beim humanen ßDefensin 1 (hBD-1) konstitutiv oder wird bei entsprechendem Kontakt mit mikrobiellen Produkten oder proinflammatorischen Mediatoren hochreguliert. Eine derartige Induktion konnte in vitro für hBD-2, hBD-3, LL37 und einige andere Host Defense Peptide nachgewiesen werden [90]. Bei Schwerbrandverletzten führt eine lokal reduzierte Expression von Host Defense Peptiden zu einer supprimierten Immunantwort und damit höheren Infektionsrate [5, 12, 120, 138]. Proformen der Host Defense Peptide werden teilweise in Leukozyten, Epithelzellen und Endothelzellen gespeichert, um bei entsprechendem Reiz sezerniert und durch extrazelluläre Proteasen aktiviert zu werden [60, 104, 161]. Das Wirkungsspektrum von Host Defense Peptiden ist breit und umfasst nicht nur gram-negative und gram-positive Bakterien, sondern auch Pilze [54, 162] und Viren mit Lipidhüllen [58, 71, 90]. 15 2.2 Mikrobizide Wirkung von Host Defense Peptiden Durch die bei physiologischem pH-Wert meist postiv geladenen Host Defense Peptiden kommt es mit relativer Spezifität an den negativ geladenen Oberflächen von Mikroorganismen zu ladungsabhängigen Interaktionen und Wechselwirkungen [12, 34, 181]. Der amphipathische Charakter der Host Defense Peptide ermöglicht es dann durch Einlagerung und Komplexbildung die Membran zu stören. Abbildung 3: Wirkungsmechanismen von Host Defense Peptide b1. „Barrel-stave“ Mechanismus: Initiale Bindung durch elektrostatische Wechselwirkungen und fassförmige Aggregation der amphipathischen Peptide mit Ausbildung transmembraner Poren. b2. „Aggregate channel model“: Bindung an die Phosphorlipid-Kopfgruppe, Einlagerung und Ausbildung unstrukturierter membranüberspannender Aggregate. Das Eindringen von Peptiden, die an intrazellulären Zielen (Rezeptoren) ihre bakterizide Wirkung entfalten, wird wahrscheinlich durch kurzzeitige Porenbildung ermöglicht. b3. „Carpet-like“ Mechanismus: Durch „teppichartiges“ Bedecken kollabiert die mikrobielle Zellmembran sobald sie mit Peptiden gesättigt ist. Die Lipidschicht biegt sich in sich selbst und bildet ringförmige Lipidschichten wodurch die Zelle lysiert wird. Diese Mechanismen führen zur Zerstörung der betroffenen Zelle, da entweder das lebenswichtige Membranpotential zusammenbricht oder wichtige Prozesse innerhalb des Mikroorganismus gestört werden [58, 176]. Obwohl die 16 antimikrobielle Wirksamkeit nicht so hoch ist wie die einiger konventioneller Antibiotika, liegen die minimal inhibitorischen Konzentrationen (MIC, minimal inhibitory concentration) gegen multiresistente Organismen mit ca. 1 bis 10 µg/ml im Bereich potenter Antibiotika [90]. Außerdem töten Host Defense Peptide Bakterien in nur wenigen Minuten und sind somit bakterizid [12]. 2.3 Host Defense Peptide - Therapie bei Verbrennungen Die normale Abwehrfunktion von Host Defense Peptiden ist durch eine reduzierte Expression in Verbrennungswunden, aber auch in nicht verbrannter Haut bei Verbrennungsopfern eingeschränkt, was zu höheren Infektionsraten führt [120]. Der therapeutische Einsatz von Host Defense Peptiden ist sehr schwierig, was sich schon bei Darreichungsform der zeigt. Wahl einer Sowohl effektiven orale, und nasale patientenfreundlichen wie auch pulmonale Applikationsformen benötigten hohe Dosen um therapeutische Spiegel zu erreichen, die zwar meist gut vertragen, jedoch nicht kosteneffektiv hergestellt werden können. Ein weiteres Problem ist die geringe metabolische Stabilität dieser Moleküle. Gemäß der Peptid-Chemikerin Jane Aldrich, von der Universität Maryland, Baltimore, werden endogene Peptide von verschiedenen Proteasen abgebaut, wodurch sie eine sehr kurze in vivo Halbwertszeit haben. Kleine lineare Peptide ohne strukturelle Modifikationen haben nur eine Halbwertszeit von ca. 2 bis 5 Minuten und größere Peptide/Proteine, insbesondere mit Disulfidbrücken, nur eine Halbwertszeit von ca. 1-2 Stunden [96]. Veränderungen, durch unnatürliche Aminosäuren zur Erhöhung der Stabilität, ohne die Differenzierungsfähigkeit und Zielgenauigkeit zu beeinflussen, sind schwierig und steigern das Risiko von Immunreaktionen oder schränken die chemischen Synthesemöglichkeiten ein. Im Rahmen dieser Problematik bietet die Gentherapie einen der vielversprechendsten Lösungsansätze. [186]. Hierdurch könnten Fremdgene direkt lokal expremiert werden, die durch anschließende Synthese kontinuierlich Proteine therapeutisch bereitstellen. [125, 128]. Dies würde nicht nur die Probleme bei der kostenintensiven Herstellung, den kurzen Halbwertszeiten von Host Defense Peptiden im aggressiven Wundmillieu, sondern auch bei den häufigen Verbandswechseln enorm verbessern. 17 2.4 Herstellung und kommerzielle Entwicklung von Host Defense Peptiden Die Peptidbiochemie und die Rekombinante-DNA-Technologie sind die beiden Hauptmethoden für die Entwicklung und Produktion von Peptiden [71]. Peptide können heutzutage in beliebiger Variabilität erzeugt und durch die kombinatorische Chemie und das High Throughput Screening auf ihre Eigenschaften und Wirksamkeit hin untersucht werden [96]. Durch die „solution-phase chemistry“ konnten die Produktionskosten deutlich gesenkt werden, aber 50 bis 100 US Dollar pro Gramm (entspricht ca. einer Tagesdosis) können nicht vernachlässigt werden [72]. Sehr kostengünstig ist auch die rekombinante Synthese, die derzeit allgemein am effektivsten in Bakterien als sogenannte Fusionsproteine gelingt [72], allerdings werden durch nachfolgende aufwendige Reinigungsverfahren zusätzliche Kosten verursacht [12]. Einzelne Substanzen sind in klinischen Studien der Phasen I bis III getestet worden und befinden sich in den USA zum Teil auf dem Weg der Arzneimittelzulassung [27, 73, 188]. Weltweit arbeiten über 100 Firmen an neuen PeptidProdukten, von denen sich viele in späten klinischen Versuchstadien befinden [96]. 18 Tabelle 2: Peptidprodukte in der kommerziellen Entwicklung aus Review Zhang & Falla [188] und modifiziert durch Hancock & Sahl [73]. Company (Location) Drug Stage of development Medical use AM-Pharma (Bilthoven, NL) hLF-1-11 (small peptide derived from human lactoferrin) Phase2 Allogeneic bone marrow stem cell transplantationassociated infections BioLineRx (Jerusalem) BL2060 (a synthetic compound comprising fatty acid and lysine copolymers) Lead optimization Anti-infective Ceragenix (Denver, USA) CSA-13 (cationic steroid (ceragenin) that mimics host-defense-peptides) Preclinical Anti-infective HB-50 (synthetic natural peptide mimetic of cecropin) Preclinical Anti-infective HB-107 (19-amino-acid fragment of cecropin B) Preclinical Wound healing Helix Biomedix (Bothell,Washington, USA) Inimex (Vancouver, BC, Canada) IMX942 (5-amino-acid peptide) Lead optimization Immunomodulation; treatment of fevers and neutropenia in chemotherapy patients Lytix Biopharma (Tromso, Norway) Not avaiable Discovery Anti-infective, antitumor Migenix (Vancouver, BC, Canada) Omiganan pentahydrocholoride/ CP-226/MX-226/CLS001 (12-mer analog of bactolysin) Phase 3b/phase 2 Prevention of catheterrelated infections; dermatology-related infections Novacta Biosystems Ltd. (Hatfield, England) Mersacidin (bacteriocin) Preclinical Gram-positive infections Novobiotics (Cambridge, MA, USA) Not avaiable Discovery Nail fungus; methicillinresistant S. aureus Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark) Plectasin (fungal defensin) Preclinical Systemic anti-Gram positive, especially pneumococcal and streptococcal infections Pacgen (Vancouver, BC, Canada) PAC113 (based on the active segment of histatin 5 protein found in human saliva) Investigational New Drug (IND) approval Oral candidiasis PepTx (St. Paul, MN, USA) PTX002 (33-mer peptide) PTX005 (12-mer peptide), PTX006 (Nacylated analog of PTX005) and PTX007 (a nonpeptidic structural analog of PTX005) Discovery Broad-spectrum antimicrobial antiendotoxin Polymedix (Philadelphia, PA, USA) Peptidomimetics (derived from the arylamide, calixarene, hydrazide and Discovery/preclinical salicylamide series) Anti-infectives; antimicrobial polymers and coating materials Zengen (Woodland Hills, CA, USA) CZEN-002 (synthetic 8-mer derived from α-melanocyte-stimulating hormone) Vulvovaginal candidiasis 19 Phase 2b 3 Gentherapie als alternative Medikamentenapplikation Die klassische Vorstellung von Gentherapie ist das krankheitsverursachende, „defekte“ Gen durch ein funktionelles „normales“ Gen zu ersetzen und so eine kausale und langfristige Therapie zu gewährleisten. Für diese Genkorrektur müsste das defekte Gen herausgeschnitten und durch ein gesundes Gen an gleicher Stelle im Chromosom ersetzt werden, was derzeit praktisch noch nicht möglich ist [158]. Die Gentherapie wird in zwei große Untergruppen, die Keimbahn- und somatische Gentherapie gegliedert. Die Keimbahntherapie ist wegen der Veränderung haploider Zellen und somit potentieller Weitergabe an Nachkommen beim Menschen im Gegensatz zur somatischen Gentherapie, bei der diploide Zellen verändert werden, verboten. Bei der aktuellen Sicht der Gentherapie soll durch das Einbringen von definiertem genetischem Material in Zellen oder Gewebe eines Patienten mit anschließender Expression des Transgens ein möglichst spezifisch therapeutischer Nutzen erlangt werden mit dem Ziel, Krankheiten vorzubeugen, zu lindern oder zu heilen [124]. Die konventionelle medikamentöse Therapie hingegen führt Wirkstoffe meist von außen zu, wodurch es zu einer relativ variablen Verteilung des Wirkstoffs im Körper kommt bis therapeutische Spiegel den gewünschten Wirkort erreicht haben. Bereits in den 60er Jahren prognostizierte der Nobelpreisträger Nirenberg im Editorial von Science: „My guess is that cells will be programmed with synthetic messages within 25 years“ [23]. Der erste erfolgreiche in vitro Gentransfer gelang mit einem Herpes simplex Vektor 1977 und zwei Jahre später die erste in vivo Transfektion [9, 180]. 1984 wurden die ersten adeno-assoziierten und Adenoviralen Vektoren beschrieben. Fünf Jahre danach wurde der erste humane Gentransfer von den National Institutes of Health, USA, mit einem retroviralen Vektor durchgeführt [171]. 1990 wurde erstmals der Versuch unternommen Menschen, die an einem angeborenen Adenosindesaminasemangel (ADA) leiden, durch Gentherapie zu behandeln. Hierzu wurden Leukozyten extrakorporal mittels eines retroviralen Vektors ein zusätzliches funktionierendes ADA-Gen appliziert und reinfundiert [22]. Den ersten derben Rückschlag erlebte die Gentherapie durch den Tod des 20 damals 18-jährigen Jesse Gelsinger, der bereits vier Tage nach intrahepatischem Adenoviralem Gentransfer am 17. September 1999 verstarb [113]. Auch die Arbeitsgruppe um Alain Fischer, die nach retroviralem Gentransfer bei Kindern mit SCID-X1 Immundefekt erstmal von Heilung sprach, wurde in ihrer Euphorie gebremst, da es in zwei Fällen zu therapieinduzierter Leukämie mit einem resultierenden Todesfall gekommen war [30, 31, 52]. 3.1 Gentherapie der Haut Die Haut bietet als oberflächlichstes Organ des Menschen optimale Voraussetzung was die Erreichbarkeit und Überwachung im Rahmen einer Therapie oder Studie anbelangt. Außerdem sind Zellkultur- und Transplantationsmethoden bereits klinisch etabliert und eine der Grundvoraussetzungen für die Langzeittherapie, das Vorhanden sein von Stammzellen, ist ebenfalls gegeben. Es gibt zwei Möglichkeiten des Gentransfers bei der Hautgentherapie für den klinischen Einsatz: Bei der „ex vivo“ Hautgentherapie verwendet man die seit Jahren zur Behandlung von Verbrennungen und Ulcera crurum in der Klinik etablierte Methode der ex-vivo Kultivierung von Keratinozyten mit anschließender Implantation als mehrschichtiges Häutchen. Im Rahmen der ex-vivo Gentherapie werden die Zellen nicht nur kultiviert, sondern gleichzeitig auch gentherapeutisch verändert. Die „in vivo“ Vorgehensweise hingegen transfiziert Keratinozyten direkt am Patienten. 1987 erwähnte Morgan erstmalig die Haut als Zielorgan für die Gentherapie. Seine Arbeitsgruppe übertrug mit Hilfe eines Retrovirus ein Fremdgen für das hGH (human growth hormone) auf kultivierte humane Keratinozyten und implantierte diese als Häutchen auf athymische Mäuse [119, 128]. Nach Einwachsen des Implantats konnte dann die Expression des Gens nachgewiesen werden. Für die Hautgentherapie kommen aber nicht nur Erkrankungen mit angeborenem Defekt in Frage, sondern auch temporäre Störungen können durch eine vorübergehende (transiente) Transfektion von Genen beeinflusst werden. Besonders Verletzungen wie Verbrennungen, größere traumatische Hautdefekte, aber auch chronische Wunden, die alle mit einer gestörten Wundheilung einhergehen, kommen in Betracht. Durch topische Applikationen von Wachstumsfaktoren und Zytokinen an Tiermodellen konnte bereits eine beschleunigte 21 Wundheilung nachgewiesen werden, aber durch das agressive Wundmilieu hatten diese Proteine eine nur sehr kurze Halbwertszeit, weshalb hohe Dosen benötigt wurden [23, 119]. 3.2 Methoden des Gentransfers, Vor- und Nachteile Gentransfermethoden werden allgemein in drei Gruppen, virale, chemische und physikalische Vektoren, eingeteilt. Virale Vektoren werden nochmals in Retro-, Adeno-assoziierte und Adenoviren unterteilt [23]. Zu den chemischen Methoden zählen Polykationen und Liposomen und zu den physikalischen Methoden DNAInjektionen und Gen-Gun. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, das teilchenvermittelter Gentransfer in thermisch geschädigter Haut möglich ist und die Wundheilung unterstützt [128]. Die direkte Überbringung von nackter DNA in Zellen gelang auf vielfältige Art und Weise, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Calcium Phosphat Prezipitation oder Mikropartikel Bombardement. Vektoren unterscheiden sich in ihrer Anwendungsmöglichkeit (in vivo und/oder ex vivo), der Kapazität (Größe des Transgens), ihrer Effizienz, der Expression (stabil oder transient) und den Risiken [23]. So haben chemische und physikalische Methoden eine fast unbegrenzte Kapazität und kaum Nebenwirkungen, aber ihre Effizienz ist eher mittel bis gering [93, 125]. Unter den viralen Vektoren ist vor allem die Einteilung in zwei Gruppen von Bedeutung: Retro- und Adenovirale Vektoren. Einige Viren integrieren ihr Genom in das zelluläre Chromatin des Wirtes (Oncoretro- und Lentiviren) und bei anderen verbleibt es im Zellkern vorwiegend als sogenanntes extrachromosomales „Episom“ (AAV, Adenoviren und Herpes Viren) [29, 106]. 3.3 Virale Vektoren Zu den am besten untersuchtesten Transportmitteln für DNA gehören die retroviralen Vektoren [147], die unterschiedlichste Gewebe verschiedenster Spezies infizieren können [23, 63]. Adenovirale Vektoren haben ähnliche Eigenschaften in Bezug auf das breite Wirtsspektrum und die Kapazität, aber sie haben zusätzlich den Vorteil, dass sie Zellen unabhängig vom Zellteilungsstatus sehr effektiv transfizieren [92, 125]. Im 22 Gegensatz zu den Retroviren wird das Virusgenom nicht stabil in das Wirtsgenom integriert, sondern verbleibt extrachromosomal im Zellkern, was das Risiko von Veränderungen oder Zerstörungen des zellulären Genoms vermindert [170, 183] und zum Verlust der genetischen Information nach einigen Zellteilungszyklen führt [84, 125, 147]. Allerdings ist ein limitierender Faktor, dass Adenoviren in vivo alle Gewebe inklusive der Keimzellen transfizieren, was sich wiederum auf nachfolgende Generationen auswirken könnte. Außerdem ist die derzeitige Generation von Adenoviralen Vektoren nach wie vor immunogen, was den Zeitraum für die Expression des Transgens reduziert und eine wiederholte Administration des Vektors schwierig gestaltet [20]. Weitere Vektoren sind Adeno-Assoziierte-Viren (AAV), Papovaviren (z.B. SV40) und Herpesviren (z.B. Herpes Simplex Virus (HSV) und Ebstein-Barr-Virus (EBV)), die wie die zuvor erwähnten Vektoren alle ihre Vor- und Nachteile als Gentransfervektoren besitzen [183] . 3.4 Adenoviren und Adenovirale Vektoren Adenoviren gehören zur Familie Adenoviridae und verursachen beim Menschen respiratorische [93, 174], gastrointestinale und Augeninfektionen (Konjunktivitis, Keratitis). Adenoviren gehören zu den gering pathogenen Viren des Menschen und sind nicht mit Malignomen assoziiert [175]. Adenoviren (Ad) sind große (35 kb), doppelsträngige DNA-Viren, die Zellen über rezeptorvermittelte Endozytose befallen, gefolgt von Zersetzung des Endosoms und der Migration des Adenoviralen Genoms in den Zellkern, wo es extrachromosomal bleibt. Es gibt über 50 Serotypen, von denen besonders Type 2 und 5 ausführlich in ihrer Struktur, ihrem Lebenszyklus, ihrer Genomorganisation und -Sequenz charakterisiert worden sind [133]. Adenoviren sind so genannte „non-enveloped“ Viruspartikel und haben die Form eines „Zwanzigflächers“ (Ikosaeder) mit einem Durchmesser von ca. 7090 nm. Das Kapsid dieser Viren setzt sich aus 252 Kapsomeren, 240 Hexonen und 12 Pentonen, die jeweils aus der Penton-Basis und einer Proteinfaser bestehen, zusammen [148]. Die Proteinfaser bestehen aus einer N-terminalen Region, über die sie mit der Pentonbase verbunden ist, einer verlängerten zentralen Schaftdomäne [11] und einer COOH-terminalen CAR-Bindungsdomäne (fiber knob). Adenoviren waren eine der ersten Viren, bei denen gezeigt werden konnte, dass bestimmte Zellrezeptoren für die Bindung und die Internalisation 23 dieser Viren verantwortlich sind [133]. Aber nicht alle Adenoviren benutzen den gleichen Mechanismus über CAR, Adenoviren der Subgruppe B (Ad3 und Ad7) oder Subgruppe D (Ad8 und Ad37) [105] benutzen andere Rezeptoren für diesen Zweck. Nach dem Bindungsschritt wird der Virus schnell in Clathrin überzogene Vesikel aufgenommen, wobei der genauere weitere Ablauf innerhalb der Zelle nur lückenhaft aufgeklärt ist [135]. Vermutet wird, dass Integrine eine Rolle bei der Zerstörung der Endosome und der Aktivierung der Cystein-Proteinase, einem Enzym, welches am „uncoating“ des Virus beteiligt ist, spielen [1]. Auch beim Eintritt in den Zellkern bleiben einige Fragen ungeklärt, da die bis heute bekannten Faktoren alleine nicht ausreichend sind, um die Adenovirale DNA in den Zellkern zu überführen. Die meisten Adenoviralen Vektoren der ersten Generation haben eine gemeinsame Grundkonstruktion, bei der die E1a und E1b und E3 Region deletiert ist, die dann durch ein anderes gewünschtes Gen ersetzt werden kann [118, 184]. Das Genom von Adenoviren wird funktionell in zwei Hauptgruppen E für „Early“ (E1a, E1b, E2a, E2b, E3 und E4) und L für „Late“ (L1L5) eingeteilt, basierend auf dem Zeitpunkt der Transkription dieser Regionen vor und nach der viralen DNA Replikation. Da aber die E1 Gene für die Replikation des Virus essentiell sind, können diese Viren nur in so genannten Helferzellen, wie z.B. 293-HEK Zellen (human embryonal kidney) oder 911-HER (human embryonal retinoblast) Zellen propagiert werden [10, 108]. Die Deletion im Bereich der E1 Region kann bis zu 3.2 kb groß sein, ohne die Vermehrungsfähigkeit des Viruses in 293 Zellen einzuschränken [46]. Im Bereich der E3 Region, die keinen Einfluss auf die Replikationsfähigkeit hat, kann ebenfalls fremde DNA eingebaut werden. Obwohl die E1 Region unmittelbar nach Eintritt des Virusgenoms im Zellkern des Wirtes aktiv ist und für Proteine kodiert, die andere early Funktionen beeinflussen, reicht die Deletion der E1 Region nicht aus, um die Expression anderer early und late Gene komplett zu verhindern [46, 179]. Bei der Infektion expremieren E1-deletierte Adenovirale Vektoren geringe Mengen viraler Antigene und führen besonders bei hoher MOI (Multiplicity of Infektion) zu niedrigen Leveln von replizierter DNA. Genprodukte der ersten Vektoren führen zu starken zellulären Immunreaktionen, die nach ca. zwei Wochen zum Verlust der Genexpression [55, 102] führten. Während Adenovirale Vektoren der 1. Generation nur Deletionen in E1 und E3 enthielten, haben Vektoren der 2. und 3. Generation zusätzliche Deletionen in E2 und/oder E4, um 24 die zelluläre Immunreaktion und die Toxizität zu senken [20]. Besonders die Deletion im Bereich der Region E2a führte zu einer Reduktion der zellulären Immunantwort, zu einer verlängerten Persistenz des transfizierten Genes und einer reduzierten Infiltration transfizierter Gewebe durch zytotoxische CD8 -THelferzellen [19, 118]. Eine weitere interessante Entdeckung war die natürliche Funktion der E3 Region, die für einige virale Proteine kodiert, die die Immunreaktion des Körpers auf infizierte Zellen vermindern [140]. Proteine aus dieser Region inhibieren die Aktivität von NF-κappa B durch TNF-α, die Fasinduzierte Zytolyse und den Transport von MHC-I – Proteinen (Major Histocompatibility complex I) an die Oberfläche, die für die Erkennung infizierten Zellen durch CD8--T-Helferzellen benötigt werden [121]. Da das Adenovirale Kapsid nur ca. 105% der Genommenge des Wildtyps aufnehmen kann, müssen Deletionen nicht nur wegen der immunogenen Wirkung, sondern auch um fremd DNA funktionsfähig in das Virusgenom integrieren zu können, durchgeführt werden [134]. In der Region E3 können so fremd DNA Abschnitte mit einer Größe von 4 bis 5 kb (und mehr) eingefügt und erfolgreich expremiert werden [123]. Die geringste immunogene Wirkung zeigen Adenoviren, bei denen alle viralen Sequenzen bis auf „inverted terminal repeats“ (ITR´s) und die „packaging signals“ entfernt wurden. Diese „helper-dependent“ oder „gutless“ genannten Vektoren benötigen die Hilfe eines anderen Viruses für den Packungsprozess in virale Partikel, die in trans durch den Helfervirus produziert werden. Das am weitesten verbreitete System, um den Helfervirus vom gewünschten Vektor zu trennen, ist das Cre/IoxP system von Graham et. al. [88, 100, 143, 170, 173]. Diese helperdependent Adenoviralen Vektoren zeigen im Gegensatz zu den E1-deletierten zwar eine reduzierte Immunogenität und verlängerte Transgen Expression [90, 182], sind deutlich aufwendiger in der Purifikation und zeigen eine schlechtere Transfektionseffizienz [93]. 25 4 Das Transgen hCAP18/LL37 Bisher sind ungefähr 35 Mitglieder der Cathelicidin-Familie von verschiedenen Säugetierspezies identifiziert worden. Cathelicidine besitzen eine gemeinsame hoch konservierte N-terminale Proregion, Cathelin-like Domäne genannt, die in ihrem Aufbau bei allen Cathelicidinen sehr konstant ist und eine sehr variable Cterminale Domäne, aus 12 bis 80 oder mehr Aminosäureresten, die den aktiven Teil darstellt [15]. Durch diese C-terminale Domäne unterscheiden sich die Cathelicidine untereinander sowohl in ihrer Struktur wie auch in ihren Eigenschaften. Cathelicidine wurden außer beim Menschen bisher bei Mäusen, Ratten, Schweinen [13], Rhesusaffen [68], Kaninchen [85], Schafen [15] und Kühen [36, 139, 152] nachgewiesen. Viele, aber nicht alle Cathelicidine, werden durch die neutrophilen Elastase (porcine und bovine) an spezifischen Erkennungssequenzen in ein aktives C-terminales Peptid und einen „Precursor“ gespalten [3, 14, 56]. Das einzige Cathelicidin des Menschen wird als hCAP18 (cDNA-Form), FALL39 (Gen-Form) oder auch LL37 (Peptid-Form), mit 37 Aminosäureresten, von denen die beiden N-terminalen Aminosäuren Leucine sind, bezeichnet. Es wurde bisher in Epithelzellen des Hodens, der Haut, des Gastrointestinal- und Respirationstrakts sowie in neutrophilen Granulozyten nachgewiesen. Der Nachweis gelang allerdings nur in verletzten, entzündeten oder infizierten Epithelien und nicht in gesunden. Im Respirations- und Gastrointestinaltrakt wird das hCAP18/LL37 in den gleichen Zelltypen produziert in denen auch ß-Defensine und andere Abwehrsubstanzen gebildet werden [146]. Das primäre Translationsprodukt ist ein Prä-Pro-Peptid dessen N-terminales Prä-Peptid beim Eintritt in das endoplasmatische Retikulum abgespalten wird. Der ProPeptidanteil wurde nach seiner Ähnlichkeit zum Cathelin, einem 12 kDa (kilo Dalton) Protein, das man aus neutrophilen Granulozyten von Schweinen isoliert hat, benannt. Eine eventuelle neutralisierende Wirkung auf die antimikrobielle Dömane, während des intrazellulären Transports und der Lagerung, ist Gegenstand der aktuellen Diskussion [3, 94]. Humanes CAP-18/LL37 wurde erstmals als cDNA beschrieben, die von mRNA aus menschlichem Rückenmark synthetisiert wurde und wenig später wurde das zugehörige Gen entschlüsselt [38, 66, 159]. Die von neutrophilen Granulozyten exprimierten Host Defense 26 Peptide und Proteine werden in phagozytotischen (primären, azurophilen) und wie beim hCAP18/LL37 in sekretorischen (sekundäre, spezifische) Granula gespeichert [161], was durch Antikörper gegen FALL-39 nachgewiesen wurde [66]. Bis zur Sekretion bzw. Degranulation der neutrophilen Granulozyten liegt es in der Pro-Peptidform vor, die erst während bzw. nach der Sekretion (bzw. Degranulation) durch die Proteinase 3 in das Pro-Peptid und das aktive LL37 gespalten wird [161]. Die Spaltung des hCAP18/LL37 zur Aktivierung geschieht zwischen den Aminosäuren Alanin 103 und Leucin 104 [160]. Humanes CAP18/LL37 konnte zwar auch innerhalb von Phagolysosomen nachgewiesen werden, allerdings fehlte in selbigen der Beweis einer Aktivierung [15, 67, 78, 83, 98, 142, 156]. Ob dieser Spaltungsmechanismus für alle hCAP18 expremierenden Zellen gilt und wie genau das posttranslationale Prozessing abläuft ist noch unbekannt. Im Plasma ist das Pro-Peptid des hCAP18/LL37 relativ zu der Konzentration in den spezifischen Granula 20fach höher konzentriert als andere Granulaproteine aus humanen neutrophilen Granulozyten, wobei der größte Teil an Apolipoprotein A-1 und B gebunden ist. Weniger als 1% ist nicht über das C-terminale Ende des Peptids an Lipoproteine gebunden und unterliegt deshalb der natürlichen Clearance der Niere. Über die mögliche Schutz- und/oder Reservoirfunktion des gebundenen hCAP18/LL37 herrscht derzeit noch Ungewissheit, allerdings inhibiert diese Bindung sowohl die antimikrobiellen wie auch zytotoxischen Eigenschaften des Peptids ohne dabei die chemotaktischen zu beeinflussen [159]. 4.1 Struktur und Expression des hCAP18/LL37 Das für hCAP18/LL37 kodierende Gen besteht aus 1963 bp (Basenpaare) enthält vier Exons und liegt auf dem Chromosom 3 [15, 56, 75]. Die Exons 1-3 kodieren für eine Signalsequenz und die Cathelin Region und Exon 4 enthält die Information für das reife Peptid [56, 75]. 27 Gen hCAP-18 Exon 1 2 3 Exon 4 mRNA 5´-UTR Pre-Pro-Peptid Funktion 3´-UTR Signal peptid Cathelin-like-domäne Antimicrobielledomäne (LL37) Inhibiert Proteasen Antimikrobielle Aktivität Antimikrobielle Aktivität LPS-Bindung & Neutralisation Chemotaktische Aktivität Degranulation von Mastzellen Regulation der Expression von Immunitäts gebundener Gene Angiogenetische Rolle Wichtige Rolle bei Entzündungen und Heilungsprozessen von Wunden Abbildung 4: Schematische Darstellung des Processings von hCAP18/LL37 Die genaue Aminosäurensequenz des Peptids LL37 lautet: Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-PheLys-Arg-Ile-Val-Gln-Arg-Ile-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu-Val-Pro-Arg-ThrGlu-Ser Die Sequenz des C-terminalen Endes des hCAP18/LL37 erlaubt dem Molekül unter physiologischen Gegebenheiten eine amphipatische α-Helix als Sekundärstruktur auszubilden [15]. 28 Abbildung 5: Sekundärstruktur des Human Host Defense Peptids hCAP18/LL37 Über die Regulation bei der Synthese des hCAP18/LL37 ist derzeit nur sehr wenig bekannt, aber eine bedarfsgesteuerte Hochregulation durch proinflammatorische Entzündungsmediatoren und die Mikroflora lässt auf eher komplexere Regulierung schließen [14]. Dies bestärken auch Sequenzanalysen der Promotorregion, die viele Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren wie "Nuclear Faktor kappa B“, IL-6, Entzündungsmediatoren, Aktivator Protein 4 und CCAAT/enhancer-binding Protein (C/EBP) nachgewiesen haben [137, 159]. Die genaue Funktion der potentiellen Bindungsstellen in der Promotorregion und dem Intron 2 konnten noch nicht geklärt werden. Die Expression von hCAP18/LL37 in entzündeten Hautpartien bei Erkrankungen wie Psoriasis, Subakutem Lupus erythematosus, Dermatitis herpetiformis und der Nickelkontaktallergie ist erhöht, während es im Gastrointestinaltrakt keine Korrelation zwischen IL-6 und der hCAP18/LL37 Expression gibt und in normaler Haut wird hCAP18/LL37 gar nicht expremiert [39]. Außer diesen zum größten Teil auf Sequenzanalysen basierenden Informationen ist nicht viel über die basale oder regulierte Expression von hCAP18/LL37 bekannt [173]. 29 4.2 Wirkung von hCAP18/LL37 Humanes CAP-18/LL37 zeigt schon in mikromolaren Konzentrationen Aktivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien. Auch synergistische Effekte mit chemischen Antibiotika oder körpereigenen Abwehrsubstanzen, wie Lysozym und Laktoferrin, konnten nachgewiesen werden [15, 83]. Die antimikrobielle Wirkung hängt vor allem mit der α-helikalen Konformation des Moleküls zusammen, wobei die Aktivität in Lösungen zusätzlich vom pH-Wert und der Elektrolytzusammensetzung abhängig ist [137]. Es besteht aber keine einfache Beziehung zwischen Ladung und Aktivität des hCAP18/LL37, da mit steigender positiver Gesamtladung die Bindung an negativ geladene Oberflächen von Mikroorganismen zwar zunimmt die Aktivität zur Ausbildung von transmembranen Poren aber gehemmt wird [90]. Bei niedrigen hCAP18/LL37 Salmonella antimikrobiell wirksam typhimurium, Staphylokokkus Escherichia epidermidis, gegen coli, Staphylokokkus Salzkonzentrationen Pseudomonas Listeria aureus ist aeruginosa, monocytogenes, (auch MRSA) und Vancomycin-resistente Enterokokken, aber auch bei höheren Konzentrationen verliert es genauso wie Protegrin-1 nicht seine Aktivität [137]. In Abhängigkeit von der Konzentration in wässriger Lösung kann hCAP18/LL37 als Mono-, Di-, Trimere [15] oder sogar als Tetramere vorliegen [176]. Humanes CAP18/LL37 scheint über den „carpet-like“ Prozess mit nachfolgendem „detergent-like“ Effekt seine antimikrobielle Aktivität zu entfalten, wobei es die äußere Membran als Oligomere verschiedener Größen erreicht und durch elektrostatische Interaktionen an selbige bindet. Durch direkte Interaktionen der Peptide [15, 83] kommt es zu lokalen Störungen der biophysischen Eigenschaften der äußeren Membran [109], wodurch einzelne Peptide als Monomere zur inneren Membran diffundieren können. Diese bedecken sie dann „teppichartig“ (Carpet-like) und zersetzen sie, sobald eine Schwellenkonzentration erreicht ist. Das Delta zwischen der zytotoxischen Konzentration auf Säugetierzellen und der bakterizid wirksamen Konzentration beträgt beim hCAP18/LL37 nur das Dreifache [68-70]. Auch hieraus kann auf die strenge Regulation oder andere Schutzmechanismen geschlossen werden, welchen hCAP18/LL37 unterliegen muss, um den Wirt zu schützen. 30 4.3 Resistenzmechanismen Bisher wurden Resistenzmechanismen beschrieben, die Veränderungen von Effluxpumpensystemen [130, 173], die Modifikation von Oberflächenbestandteilen der Mikroorganismen, wie Teichonsäuren, Lipid A und Phosphorlipiden [130, 142, 173], die Modifikationen der Lipopolysaccaride und die Expression von Membranproteasen beinhalten [21, 94, 126, 130, 154]. Shigella dysenteriae unterdrückt die Produktion von hCAP18/LL37 in Epithelzellen des Rektums wahrscheinlich mittels ihrer plasmid DNA, da erst nach Degradierung dieser der unterdrückende Effekt aufgehoben werden kann [2, 41, 42]. Hemophilus influenzae dekoriert durch einen intrinsischen „slip-slide“ Mechanismus mittels Choline-Phosphaten seine Lipopolysaccharide und senkt so die effektive negative Ladung der Membranoberfläche, was zur Reduktion der initialen Bindung und der lokalen Konzentration von hCAP18/LL37 führt [91]. Auch anhand dieser Beispiele wird wieder das komplexe Zusammenspiel zwischen Ladung, initialer Bindung und nachfolgender Interaktion aufgrund der kationischen Natur des hCAP18/LL37 und den negativ geladenen Komponenten der inneren und äußeren Bakterienmembran deutlich [76]. Bei Host Defense Peptiden wie dem hCAP18/LL37 scheint die für die antimikrobielle Aktivität verantwortliche α-helikale Struktur erst nach der initialen Bindung an negative bakterielle Oberflächenkomponenten zum Tragen zu kommen [99, 149, 172]. Dies zeigten indirekt auch Wirksamkeitsstudien von kationischen Peptiden gegenüber Spirochaetaceae und Leptospiraceae, bei denen die antimikrobielle Aktivität mit dem Vorhandensein von LPS zu korrelieren scheint. Allerdings kann LPS nicht essentiell für die Aktivität von hCAP18/LL37 sein, denn es zeigte sich nur eine reduzierte antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber den Spirochäten, Borrelia and Treponema Lipopolysaccharide besitzen. im Vergleich Wahrscheinlich zu Leptospirochäten, die ist die von Wirksamkeit Cathelicidinen gegenüber Borrelien und Treponemen auf die Fähigkeit, auch andere Lipoproteine zu binden, zurückzuführen [74, 151, 168]. 31 4.3 Weitere Eigenschaften von hCAP18/LL37 Neben der bakteriziden Wirkung bindet hCAP18/LL37 durch sein C-terminales Ende noch bakterielles Endotoxin (LPS) und inaktiviert es [76, 91]. In einer in vivo Studie konnten so die letalen Folgen einer intraperitonealen LPS-Applikation verhindert werden [45]. Diese protektive Wirkung des hCAP18/LL37 konnte ebenfalls an einem Tiermodell mit zystischer Fibrose und bei Mäusen mit Pneumonie und Endotoxic Schock Syndrom belegt werden [125]. Außerdem stimuliert hCAP18/LL37 die Freisetzung von Histamin durch Mastzellen und hat chemotaktische Eigenschaften, die zur Akkumulation von polymorphkernigen Leukozyten, neutrophilen Granulozyten, Monozyten und CD4 T-Lymphozyten im Bereich von Entzündungen oder Verletzungen führen [133]. Eine weitere sehr vielversprechende Eigenschaft ist die Förderung der Neovaskularisation, die wahrscheinlich ebenfalls von Interaktionen mit dem FPRL–1 (formyl peptide receptor-like 1) abhängig ist [62]. Beim sogenannten CAM (choriallantoic membrane) in vivo assay eines sich entwickelnden Hühnerembryos [32] und durch intramuskuläre Injektion an einem IschämieModell am Hinterlauf eines Kaninchens konnte ein signifikantes Gefäßwachstum durch hCAP18/LL37 nachgewiesen werden [32]. Der Reepithelialisierende Effekt des hCAP18/LL37 wurde indirekt bewiesen, da spezifische anti-LL37 Antikörper an einem ex vivo Modell von kultivierten Hautwunden selbigen inhibierten [6, 141]. Beim Vergleich von Wundflüssigkeit aus chronischen Ulcera und „normaler“ verwundeter Haut zeigten sich deutlich niedrigere Level an hCAP18/LL37, die für die höheren Infektionsraten und die gestörte Wundheilung bei Ulcera verantwortlich zu sein scheinen. 32 5 Aufbau der Studie und Ziel dieser Arbeit Angesicht der Resistenzentwicklung in Verbrennungszentren gegen klassische Antibiotika und dem wachsenden finanziellen und sozioökonomischen Druck wird immer deutlicher, dass neue kosteneffektive Therapiealternativen gefunden werden müssen [15]. Host Defense Peptide sind eine mögliche Therapiealternative, die derzeit wegen zu teueren Herstellungskosten und dem Fehlen einer geeigneten Applikationsform keine breite Anwendung finden. Die Hautgentherapie bietet vielversprechende Möglichkeiten um diese Probleme zu lösen. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, mit Hilfe eines Adenoviralen Vektors, das Transgen hCAP18/LL37 in infizierte Verbrennungswunden an einem Rattenmodell zu transfizieren, um durch die nachfolgende Expression des hCAP18/LL37 das Bakterienwachstum von Pseudomonas aeruginosa zu bekämpfen. Die antimikrobielle Wirkung sollte mindestens Pseudomonaden und Staphylokokken mit einschließen, da diese zu den häufigsten aus Verbrennungswunden isolierten Keimen gehören [124]. Der Grund für die in vivo Transfektion war der zeitliche Nachteil, den die ex vivo Methode für die Anzucht von Häutchen mit sich bringt, was besonders bei großflächigen Verbrennungen zu lange dauern würde, um Patienten rechtzeitig zu helfen. Die Wahl des Host Defense Peptids fiel auf das humane Cathelicidin hCAP18/LL37, das zum einen eine breite antimikrobielle Aktivität besitzt und zum anderen viele weitere Eigenschaften hat, die für Verbrennungsopfer von Vorteil sein könnten. 33 B Material und Methoden 1 Materialien 1.1 Chemikalien und Medien DMEM Dulbeco´s Modified Eagle Medium (Gibco, 21969-035, Paisley, Großbritannien) PBS Phosphate Buffered Saline (PAA Laboratories, Linz, Österreich) FBS Fetal Bovine Serum, Perbio, Bonn, Deutschland P/S Penicillin/Streptomycin, PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland BSA (Fraction V) Sigma, Steinheim, Deutschland CsCl Sigma, Steinheim, Deutschland Trypsin/EDTA Gibco, Paisley, Großbritannien Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland Einfriermedium 10% DMSO (Gibco, Paisley, Großbritannien) SSC-Lösung Saline Sodium Citrat TSA Plus Direkt-FITC NEN Life Science Produkts, Boston, USA Propidiumjodid unspezifischer DNA-Farbstoff Roche, Mannheim, Deutschland Entellan Merck, Darmstadt, Deutschland Formaldehyd Merck, Darmstadt, Deutschland Xylol AppliChem, Darmstadt, Deutschland Reinstwasser Forschungslabor Plastische Chirurgie, Bergmannsheil Haus X, Merck, Darmstadt Methanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande Natriumacetat Sigma, Steinheim, Deutschland Gel Star® Nucleic Acid Stain Biozym, Oldendorf, Deutschland Glycerin Sigma, Steinheim, Deutschland 34 1.2 Medikamente, Desinfektionsmittel & Verbandsmaterialien Ketamin Ratiopharm, Ulm, Deutschland Xylazin Rompun®, Bayer, Leverkusen, Deutschland Temgesic® Buprenorphinhydrochlorid, Essex Pharma, München, Deutschland Narcoren® Pentobarbital-Natrium, Athens, USA Softasept® Braun, Melsungen, Deutschland Gaze Johnson & Johnson, Garvrave, Großbritannien Tegaderm® 6 x 7 cm, 3M Health Care, Borken, Deutschland Peha-Haft® Hartmann, Heidenheim, Deutschland Visistat® Clips Weck Closure SystemsTM, North Carolina, USA 1.3 Zellen 911 (HER)-Zellen Neuere Helferzellinie, 911 (human embryonic retinoblasts)-Zellen, Crucell Holland B.V., Archimedesweg 4, 2333 CN Leiden, für die Produktion von Adenoviren und anderen E1 deletierten Viren. 1.4 Adenoviraler Vektor Die in dieser Arbeit verwendeten Viren wurden freundlicherweise von The Vector Core, Gene therapy program, division of Medical Genetics, Department of Medicine at the University of Pennsylvania, School of Medicine zur Verfügung gestellt. Ad5-hCAP18 Replikationsdefizienter ∆E1 Adenovirus vom Serotyp 5 mit CMV Promotor und human hCAP18/LL37 Transgen. Ad5-lacZ Replikations-defizienter ∆E1 Adenovirus vom Serotyp 5 mit CMV Promotor und Escherichia. coli lacZ Transgen 35 1.5 Bakterien Die für die Infektion verwendeten Bakterien werden aus glycerol stocks, bei Bedarf kurzfristig in Übernachtschüttelkulturen kultiviert. In dieser Arbeit wurde ausschließlich ein ATCC gelisteter Pseudomonas aeruginosa Stamm (ATCC 27853, Boston, USA) verwendet. 1.6 Tiere In dieser Studie wurden ausschließlich männliche Sprague Dawley Ratten von der Firma Charles River eingesetzt. Die Gruppen wurden mit n = 5 relativ groß gewählt um einen möglichen Ausfall von Tieren kompensieren zu können. 1.7 Synthetisches Host Defense Peptid LL37 Das Host Defense Peptid LL37 wurde durch Herrn Prof. Dr. Henklein (Charité Berlin) anhand der oben erwähnten Aminosäuren-Abfolge synthetisiert. 1.8 Agarplatten, Mediengemische, Puffer-, Trägerlösungen und Gradienten PIA DIFCO Pseudomonas Isolations Agar, ISO 9000 registered, Becton Dickinson & Spars Company, Maryland 21152 USA Mueller-Hinton Agar + 5% Schafsblut Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland 20 mM Tris HCl Puffer Sigma, Aldrich Chemie GmbH, München, pH 8.0 mit 2 mM MgCl2 Deutschland DMEM + 10% FBS + 1%P/S Debelco´s Modified Eagle Medium (Gibco, 21969-035, Paisley, UK) + 10% Fetal Bovine Serum + 1% einer Streptomycin/Penicillin Lösung LB-Medium Luria Bertani (LB) Broth medium; Roth, Karlsruhe, Deutschland) 36 Dialyse-Puffer 20 mM Tris/HCl (pH 8) 2 mM MgCl2 Lösung in Millipore Wasser DAB Working Solution 10 x DAB Substrate im Verhältnis 1:10 mit einfachem stabilen Peroxidase Puffer CsCl-Lösung 1,1 g/ml Caesium-Clorid-Lösung: 11,92 g CsCl + 88,18 ml H2O; danach mit Unterdruck steril filtiriert. CsCl-Lösung 1,3 g/ml Caesium-Clorid-Lösung 31,24 g CsCl + 68,76 ml H2O; danach mit Unterdruck steril filtiriert. CsCl-Lösung 1,4 g/ml Caesium-Clorid-Lösung 38,83 g CsCl + 61,17 ml H2O; danach mit Unterdruck steril filtiriert. Hybridisierungspuffer 50% deionisiertes Formamid; Natriumchlorid (0,3 M); Tris (10 mM, pH 7,5); NaHPO4 (1 mM, pH 6,8); EDTA (5 mM); 0,1 fach Dehnhardt´s (2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrolidone, 2% BSA); DTT (1 mM); Hefe-tRNA (0,25 mg/ml); Dextransulfat (12,5%); SalmonspermienDNA (0,5 mg/ml) in Aqua bidest (DEPC behandelt). Waschlösung 50% deionisiertes Formamid 2fach konzentrierte SSC-Lösung 1% β-Mercaptoethanol 37 1.9 Bestimmungskids und Antikörper Adeno-XTM rapid titer kit Becton Dickinson Bioscience, Heidelberg, Deutschland Detetektions AB Anti-Hexon Hexon Antikörper, Antibody; Mouse Anti- BD-Biosystems Clonetech Capture AB Rat Anti-Mouse-Antikörper, HRP Konjugate; Rat Anti-A-Mouse-Antibody; BD-Biosystems Clonetech 2.0 Andere Materialien Fertiginsulinspritzen Braun, Melsungen, Deutschland 12 Well Plates 12 Well Cell Culture Cluster, Corning Incorporated Costar® 3513, 2 175cm -Kulturflaschen Einweg sterile Kulturflaschen, Firma Greiner® Falcon® Röhrchen BD Falcon™ conical Röhrchen; 50 ml; Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Sterile Petrischalen Einweg sterile Petrischalen mit Noppen, Firma Greiner® Beckmann Zentrifugenröhrchen Zentrifugenröhrchen, (14 x 89 mm), Firma Beckmann Instruments, Inc., Pala Alto, CA 94304 Kapillarröhrchen Einmal Mikrobipetten mit 2 Ringmarken, Firma Blaubrand® intraMARK Flachbodenröhrchen 12 ml Platikreagenzgläser, TPP Berlin, Deutschland slide-alyser Pierce, Bonn, Deutschland drehbare Plattierhilfe Schütt Labortechnik GmbH, Göttingen, Deutschland Makrolonkäfig Makrolonkäfig vom Typ 4 mit hohem Deckel 38 Biopsy-Stempels 4mm Punchbiopsy, Stiefel, Offenbach a.M., Germany 2.1 Geräte Easypet Eppendorf, Hamburg, Deutschland -80°C Gefrierschrank Electrolux, Medical Refrigeration (Nürnberg , Deutschland) Inkubator “Function Line” Inkubator der Firma Heraeus Instruments; 5% CO2 und 37°C Sterilbank „Hera safe“ Sterile Arbeitsbank der Firma Heraeus Instruments; laminar flow; für Zellkultur und Virusanzucht Sterilbank Sterile Arbeitsbank der Firma Köttermann, Modell 8511; laminar flow; für Bakterienverarbeitung Arbeitshood Sicherheitsarbeitsbank Variolab, Mobilien mechanische der Firma W90; für Zerkleinerung die und Verarbeitung von Hautproben Magnetrührer IKA® Labortechnik, RH basic, Widmington, NC 28405, USA Vortex Vortex-Genie 2, Scientific Industries (Si), Bohemia, USA Pepittierhilfe Eppendorf Easypet, Deutschland Mikroskop Hamburg, „Zellkultur“ Axiovert 25, Firma Zeiss Biophotometer Eppendorf, Hamburg, Deutschland Autoklav VARIOKLAV, Zyclondampf, H&P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim, Deutschland Polytron Polytron PT 3100/PT6100, mechanische Zerkleinerung von Hautproben 39 Wasserbad Typ 1092, der Firma GFL (Gesellschaft für Labortechnik mbH), Burgwedel, Deutschland Zentrifuge (für Eppendorf Röhrchen) Centrifuge 5417 R, Firma Eppendorf, Deutschland Zentrifuge (für Falcon®-Röhrchen) Megafuge 1.0R, Firma Heraeus Sepatech Orbital Shaker + Inkubator Unimax 1010 + Inkubator 1000, Firma Heidolph Precisionswaage AJ 150, Firma Mettler, Deutschland Millipore-Wasserspender Milli-Q Plus, Ultra Pure Water System Swinging Buckets Rotor SW41Ti - C.D.F.G.H., 41.000 Firma R.P.M., Heraeus; Class Swining Units 102.1 Schlauchpumpe Pump P-1, Firma Pharmacia Biotech, Schlauchdurchmesser 2.1 mm, max. Pumpvolumen von 300 ml*h-1 Ultrazentrifuge Suprafuge 22, Heraeus, Kendro, Langenselbold, Deutschland CASY®-1 Schärfe-System, Reutlingen, Deutschland 37°C Wasserbad GFL 1092, GFL, Burgwedel, Deutschland 40 2 Allgemeine Arbeitsmethoden Alle erwähnten Abläufe dieser Arbeit wurden in einem S2 Sicherheitslabor durchgeführt und sind zuvor genehmigt worden (64-K-1.9/02; Haus X: 521-A1.14/95). Die einzelnen Arbeitsschritte wurden an den entsprechenden S2 Sterilund Sicherheitswerkbänken (Heraeus HS 12, Kendro, Langenselbold, Deutschland) und die Tierversuche wurden gemäß den Tierschutzrichtlinien der Bundesrepublik Deutschland sowie der Genehmigung des Versuchsvorhaben gemäß §8 Abs.1 Tierschutzgesetz 50.8735 Nr. 90.5 durchgeführt. 2.1 Sterilisation Alle hitzestabilen Lösungen, Gefäße und Werkzeuge wurden in einem Autoklav, VARIOKLAV®, mit einem Wasserdampfdruck von 2 bar bei 121°C 20 Min lang sterilisiert. Hitzelabile Substanzen wurden mit Hilfe einer Vakuumpumpe durch einen Filter mit einer Poren Größe von 0,1 µm sterilfiltriert. Nach der Auswertung bzw. der Benutzung wurden alle potentiell kontaminierten Verbrauchsmaterialien im Autoklaven sterilisiert und regelrecht entsorgt. 2.2 Agarplattenfertigung Die Schafsblutagar Platten wurden von der Firma Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland bezogen. Die Pseudomonas Isolationsagarplatten wurden gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers (DIFCO) selber hergestellt. Hierzu wurden 45g des Pseudomonas Isolationsagarpulvers mit 980 ml Millipore Wasser und 20 ml Glycerin gut gemischt in 1 L Glasflaschen bei 121°C für 20 Min autoklaviert. Die ca. 60°C heiße Lösung wurde dann in sterile Einweg-PetriSchalen pipettiert, wobei in jede Schale ca. 18 ml Lösung eingefüllt wurden. 2.3 Hautprobenhomogenisation Die Homogenisation der entnommenen Hautproben geschah mechanisch mit Hilfe eines rotierenden Stabhomogenisators, Polytron, da eine chemische und/oder enzymatische Zersetzung einerseits viel zu lange gedauert und andererseits auch die Bakterien zerstört hätte. 41 2.4 Zellkulturen Zur Virusanzucht wurde die Zelllinie 911 (HER) von der Firma Crucell verwendet. Die Zelllinie wurde in einem ersten Vermehrungsschritt hochgezogen und für zukünftige Versuche als Aliquots (Steril seeding stock) in flüssigen Stickstoff mit Einfriermedium eingefroren. 2.4.1 Anzucht Die für die Vermehrung benötigten Zellen (911) wurden jeweils zwei Wochen vor der Virusvermehrung nach Standartprotokollen aus „Steril seeding stocks“ hochgezogen. Nach dem Auftauen wurden die Zellen zunächst in zwei kleinen Kulturflaschen zu einer Konfluenzdichte von ca. 90% vermehrt (ca. 2 Tage, je nach Aktivität), bis sie in große Culture Flasks umgesetzt werden konnten. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen ausgesät und mit DMEM, 10% FBS und 1% einer Antibiotikalösung aus Penicillin und Streptomycin (P/S) versetzt. Die Kulturflasche wurde im CO2 Inkubator bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Alle zwei Tage wurde das Medium ausgewechselt bis die Zellen unter dem Mikroskop ungefähr 90-100% konfluent waren und passagiert oder am Ende für die Purifikation verwendet werden konnten. 2.4.2 Passagieren und Mediumwechsel Aus 90-100% konfluente Kulturflaschen wurde das Medium abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS gespült, dann Trypsiniert und das Ganze nach ca. 5 bis 6 Min durch Zugabe von FBS gestoppt. Die freischwimmenden Zellen wurden aus allen Kulturflaschen gesammelt und in sterile 50ml Falcon Röhrchen® überführt. Die Falcon Röhrchen® wurden dann bei 400 x g (1400 rpm), 4°C für 5 Min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in 10ml DMEM + 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin resuspendiert. Eine 1:10 Verdünnung wurde im CASY®-1 gezählt. Die Zellen wurden mit 2000 bis 3000 Zellen pro cm2 in neue sterile Zellkulturflaschen ausgesät und mit frischem Medium aufgefüllt. Alle zwei Tage wurde unter einer „laminar Flow“ Sterilbank ein Mediumwechsel mit sterilen Einweghandschuhen durchgeführt. 42 3 Präparation und Purifikation des Ad5-hCAP18 und Ad5-lacZ Die von uns eingesetzten Adenoviren vom Serotyp 5 mit einem CMV getriebenen Promoter sind ∆ E1 deletiert und besitzen im Bereich der ∆ E1 Deletion die entsprechenden Gene hCAP18 oder lacZ. Für die Etablierung der Virenproduktion benutzten wir zunächst die Standardzelllinie 293, die aber gegen die 911 Zelllinie ausgetauscht wurde, um höhere Konzentrationen unserer Vektoren zu erhalten. Alle Viren, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sind in 911 Zellen vermehrt worden. 3.1 Purifikation und Titerung der verwendeten Viren 3.1.1 Virusvermehrung und Ernte Am Tag vor der Transfektion sind die Helferzellen (911) mit einer Dichte von 100.000 Zellen/cm2 ausgesät worden. Aus den ca. 15 bis 20 175cm2 Kulturflaschen wurde am Tag der Transfektion das DMEM Medium mit 10% FBS und 1% Antibiotikalösung gegen DMEM Medium mit 2% FBS und 1% Antibiotikalösung ausgetauscht, um das Zellwachstum zu reduzieren. Die Zellen wurden mit einer MOI (Multiplicity Of Infection; Anzahl von Viren pro Zelle) von 5 bis 10 infiziert und im Inkubator für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen und die Viren wurden durch mehrmaliges Auf- und Abpepittieren mittels einer Pepittierhilfe in mehreren sterilen Falcon® Röhrchen gesammelt. Zusätzlich wurden alle Zellkulturflaschen noch mit der gleichen 50ml PBS Lösung gespült und dieses Volumen ebenfalls in die Falcon® Röhrchen überführt, um einen zu großen Virenverlust zu verhindern. Volle Röhrchen wurden auf Eis gelagert, um sie vor Erwärmung zu schützen. Nach der Zentrifugation der Röhrchen bei 880 x g für 10 Min bei 4°C wurde der Überstand verworfen und die Zellpeletts mit den darin enthaltenen Viren aller Röhrchen (nacheinander) mit der gleichen 30 ml PBS Lösung resuspendiert und in einem frischen sterilen Falcon© Röhrchen gesammelt. Mit weiteren 15 ml PBS wurden alle Röhrchen nacheinander erneut gespült, um die restlichen Zellen und Viren ebenfalls in das erste Falcon© Röhrchen zu überführen. 43 3.1.2 Schockgefrieren und Auftauen Die Röhrchen wurden 3 Zyklen „Freeze and Thaw“, in flüssigem Stickstoff gefroren und in 37°C warmem Wasserbad aufgetaut, unterzogen. Aufgetaut wurden die Röhrchen nur bis das Eis geschmolzen war, um dann sofort wieder in flüssigen Stickstoff schockgefroren zu werden, damit sie sich auf keinen Fall auf 37°C erwärmten. Zwischen jedem Zyklus wurden die Röhrchen auf einem VortexGerät geschüttelt. Nach dem dritten Zyklus „Freeze and Thaw“ konnte die Viruszucht unterbrochen und nach erneutem Schockgefrieren im –80°C Kühlschrank bis zur Weiterführung des Protokolls aufbewahrt werden. Dieses Aufund Abtauen dient dazu die Zellen möglichst quantitativ aufzuschließen, um die Im Cytosol befindlichen Viren freizusetzen. Das Lysat wurde dann bei 3300 x g für 10 Min und 4°C zentrifugiert und der Überstand mit den frei schwebenden Viren gesammelt und das Zellpelett verworfen. 3.1.3 Auftrennung durch Ultrazentrifugation mit CsCl-Gradient Für den benötigten CsCl-Gradienten wurden die Lösungen wie unter Material beschrieben hergestellt und mit Hilfe einer regelbaren Schlauchpumpe vorsichtig in folgender Reihenfolge übereinander geschichtet. Nach Befüllen der Schlauchpumpe mit der 1,3 g/ml CsCl-Lösung wurden in 2 Min 4 ml (120ml/h) in jedes Röhrchen gepumpt, wobei nach einer Minute in Höhe des Flüssigkeitsspiegels eine horizontale Markierung mit wasserfestem Filzstift gesetzt wurd, um die spätere Orientierung zu erleichtern. Die Zeit wurde mit einer laborüblichen Stoppuhr gemessen. Diese Prozedur führte man bei 6 Zentrifugenröhrchen durch. Nach Entfernung der restlichen 1,3 g/ml CsCl Lösung aus der Pumpe wurde diese mit der 1,4 g/ml CsCl-Lösung befüllt und durch das sich am Ende der Schlauchpumpe befindende Capillarröhrchen wurden vorsichtig 2 ml der 1,4 g/ml CsCl-Lösung unter die bereits im Röhrchen vorhandene 1,3 g/ml CsClLösung gepumpt. Im Anschluss wurde jetzt vorsichtig die Virenlösung (maximal 6 ml), nachdem sie zuvor durch hinzufügen von CsCl auf ein Gewicht von 1,1 g/ml gebracht worden war, auf den Gradienten gepumpt. Der Gradient wurde bei 27.000 x g für 4h bei 20°C mit einem Schwingrotor in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. 44 3.1.4 Gewinnung des konzentrierten Viruses Während der Zentrifugation wurde der unter Materialien beschriebene DialysePuffer hergestellt, um das CsCl aus der Viruslösung herauszuverdünnen. Unter der Sterilbank wurden die Units dann vorsichtig aufgeschraubt und die Beckmann Röhrchen aus den Metallfassungen entnommen. Auf Höhe der 2 cm Markierung befand sich eine feine dünne weißlich schimmernde Bande, die nun vorsichtig mit der zuvor gründlich gereinigten Schlauchpumpe abgesaugt wurde, wobei meistens eine Absaugmenge zwischen 1,5 und 2 Millilitern pro Röhrchen ausreichend war. Dies ergab insgesamt 9 bis 12 ml Viruslösung, die in eine Slidealyser Dialysekammer gespritzt und dreimal mit 500 ml Dialyse-Puffer jeweils für 1 Stunde bei 4°C unter leichtem Rühren dialysiert wurde. Das anschließend in der Kammer noch vorhandene Volumen wurde vorsichtig aus der Kammer mit Hilfe einer Kanüle und einer Spritze abgezogen und, bis auf 60 µl für die Titration, mit 10% Glycerol versetzt und bei -80°C gelagert. 3.1.5 Virus Titerung Für die Titration einer Viruscharge benutzten wir zwei 12-well Plates, auf denen die einzelnen Wells mit 1 ml DMEM + 10% FBS und 1% P/S und 5 x 105 293 Zellen pro ml gefüllt waren. Von der zu titrierenden Viruscharge und einer Kontrollcharge mit bekanntem Titer wurden dann serielle Verdünnungen von 10-4 bis 10-7 mit DMEM + 10% FBS + 1% P/S hergestellt und jeweils 100 µl in drei Wells (dreifach Bestimmung) tropfenweise eingebracht. Der Ansatz wurde anschließend für 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Danach wurde vorsichtig das Medium aus jedem Well entfernt ohne den Zellrasen zu beschädigen und die Wells für ungefähr 5 Min unter der Sterilbank trocknen gelassen. Die leicht angetrockneten Zellen wurden dann mit je 1 ml eiskaltem 100%igem Methanol fixiert. Nach 10 Min Fixierung bei -20°C wurde das Methanol vorsichtig abgesaugt und die Zellen dreimal mit 1 ml PBS + 1% BSA (Fraction V) gewaschen. Als nächstes wurden die Zellen mit dem 1. Antikörper, der zuvor auf 1:1000 verdünnt wurde, für 1 Stunde bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. In der Zwischenzeit wurde eine zweite 1:500 Verdünnung mit dem Antikörper 2 und der PBS + 1% BSA Lösung hergestellt. Nach einer Stunde Inkubation wurde die Antikörperlösung 1 vorsichtig abgesaugt, jedes Well dreimal mit 1 ml PBS + 45 1% BSA gewaschen und die Zellen mit dem 2. Antikörper für eine Stunde bei 37°C auf einem Orbital Shaker inkubiert. Während dieser Inkubationsphase wurde eine DAB Working Solution hergestellt, wobei 500 µl pro Well benötigt wurden. Der zweite Antikörper wurde ebenfalls nach einer Stunde Inkubation abgesaut, die Wells dreifach gespült und mit 500 µl der DAB Working Solution für 10 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernung der DAB Solution und Auffüllen der Wells mit je 1 ml PBS wurden bei 20facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop minimum drei Gesichtsfelder pro Well ausgezählt und der Durchschnitt der positiven Zellen pro Gesichtsfeld errechnet. Hierbei wurden nur Verdünnungen ausgezählt, die 10% und weniger gefärbte (braune/schwarze) Zellen enthielten. Ein optimales Gesichtsfeld durfte zwischen 5 und 50 positive Zellen enthalten. Die „infectious units“ (ifu) / ml für jedes Well wurden wie folgt errechnet: (infizierte Zellen / Gesichtsfeld) x (Gesichtsfelder / Well) ——————————————————————————— Volumen des Virus (ml) x (Verdünnungsfaktor) Der Radius eines Standard 20fachen Objektivs beträgt 0,5 mm und die Fläche eines Kreises ist π * r2 was eine Fläche von 0,7853 mm2 = 7,853 x 10-3 cm2 pro Gesichtsfeld ergibt. Ein Well der Firma Costar #3513 hat eine Fläche von 3,8 cm2. Daraus folgt 3,8 cm2 / 7,853 x 10-3 cm2 = 484 Gesichtsfelder/Well. Jeweils 0,1 ml (100 µl) der einzelnen Virusverdünnung wurden pro Well eingesetzt. Rechnung: Bei der Verdünnungsstufe 10-6 wurden 21 positive Zellen im Durchschnitt pro Gesichtsfeld gezählt. (21) x (484) 10164 ——————— = ——— = 1 * 1011 Viren / ml 10-7 0,1 (ml) x 10-6 46 3.1.6 Preparation der Adenoviralen Vektoren für die in vivo Transfektion Für die Transfektion sind die beiden eingesetzten Viren mit PBS soweit verdünnt worden, dass 1* 108 Viren / 300 µl Lösung vorhanden waren. Diese 300 µl sind für jede Seite einer Ratte, die Viren erhalten hat, einzeln in Eppendorf Röhrchen abgefüllt und entsprechend beschriftet worden. 47 4 Rat Burn Infection Modell 4.1 Tierhaltung und Vorbereitung Alle Tiere wurden so bestellt, dass sie jeweils 2 Wochen vor Versuchsbeginn im Tierstall der BG-Kliniken eingestallt waren. Während dieser Zeit wurden sie täglich von den beteiligten Experimentatoren gesichtet, um sie an die Umgebung und die Personen zu gewöhnen. Vor den Versuchen wurden jeweils fünf Tiere in einem Makrolonkäfig untergebracht, was für die sozialen Tiere wichtig ist, aber aus Kontaminationsgründen ab dem Verbrennungstag nicht beibehalten werden konnte. Die Tiere befanden sich stets in einem 12 Stunden Tag – Nacht Rhythmus (künstliche Beleuchtung) und wurden bei konstanter Temperatur von 22°C und 65% Luftfeuchtigkeit gehalten. Außerdem hatten die Tiere während der gesamten Zeit freien Zugang zu unbegrenztem Futter und Wasser. Während der Einzelhaltung wurden die Tiere wöchentlich und bei mehreren Tieren zwei- bis dreimal pro Woche in gereinigte Käfige mit frischem Einstreu umgesetzt. Änderungen im sozialen Verhalten der Tiere (Fress- und Trinkgewohnheiten, Putzgewohnheiten und Schlaf) wurden engmaschig in Zusammenarbeit mit den Tierpflegern überwacht und konnten, bis auf eine allgemein reduzierte Aktivität während der Einzelhaltung, während dieser Studie nicht festgestellt werden. Die Tiere wurden mit einem Gewicht von ungefähr 85 g geliefert und erreichten bis zum Versuchsbeginn Gewichtsentwicklung ein der Gewicht Tiere von wurde ca. 220 während bis 260 der zweiwöchigen Eingewöhnungsphase alle 3 Tage kontrolliert. 4.2 Versuchsdurchführung Tag 1: Erste Narkose, Rasur und Enthaarung Tag 2: Narkose, Verbrennungstrauma und Infektion Tag 3: Vorbereitung Applikation Tag 4: Narkose, Applikation nach 2 oder 7 Tagen: Einschläferung der Tiere, Probenentnahme, Probenverarbeitung und Ausstrich. 18 h später: Auszählung der CFU 48 g. Die Das in dieser Arbeit verwendete Ratten-Verbrennungs-Infektion-Modell [163] ist eine Weiterentwicklung des Ratten-Verbrennungs-Modells [53]. 4.3 Narkose Am Tag 1 wurden alle Tiere vor Versuchsbeginn erneut gewogen, um die benötigte Menge an Anästhetika gemäß dem Standardprotokoll mit 100 mg/kg Körpergewicht (KG) Ketamin und 2 mg/kg KG Xylazin zu errechnen. In Abhängigkeit vom Gewicht der jeweiligen Ratte, wurde das benötigte Volumen in eine 1 ml Insulinspritze für jedes Tier einzeln aufgezogen, um eine Überdosierung oder Infektion zu vermeiden. Diese Narkose wurde bei allen Tieren intraperitoneal im gleichen Raum (BGFA Raum 7), in dem sie seit 2 Wochen eingestallt waren, durchgeführt. Hierzu wurden die Ratten im so genannten Drei-Finger-Griff fixiert und sofort nach der Applikation einzeln in Makrolonkäfige wieder losgelassen. Ratten, die durch die Initialdosis nicht einschliefen, erhielten nicht sofort eine weitere Dosis Narkotika, da vorherige Versuche zeigten, dass die hierfür benötigte Menge einer großen Varianz unterlag und Tiere dabei sehr schnell verstarben. Stattdessen wurden diese Tiere nach mindestens einer Stunde Wartezeit erneut mit einer normalen Initialdosis, narkotisiert. Diese Form der Narkose wurde unverändert bei allen Tieren, während der kompletten Versuchsreihe, beibehalten. 4.4 Analgesie In dieser Arbeit wurde ab dem Tag des Verbrennungstraumas besonderen Wert auf eine „adäquate“ Schmerztherapie gelegt. Deshalb sind wir von einer sehr niedrigen Toleranzgrenze für Schmerzen ausgegangen und haben die Schmerztherapie, über die in der Literatur beschriebenen üblichen Dosen hinaus, großzügig gewählt. Um dennoch etwaige Veränderungen frühzeitig zu bemerken wurden die Ratten engmaschig kontrolliert. Die Analgesie wurde mit 0,04 ml Temgesic® s.c. in eine Nackenfalte alle 12 Stunden ab dem Morgen des zweiten Tages (Verbrennungstag) für insgesamt vier Tage durchgeführt. 49 4.5 Rasur Am Tag 1 wurde den narkotisierten Ratten im OP mit einer Haarschneidemaschine das Fell auf dem Rücken vom Nacken bis über den Lendenwirbelbereich und seitlich entlang der Flanken auf 0,1 mm gekürzt. Durch anschließende Behandlung dieser Region mit Enthaarungscreme und 10 Min Einwirkzeit konnten die Haare unter fließendem warmem Wasser komplett entfernt werden. Die Tiere wurden nach dem vollständigen Erwachen wiederum zu je fünf Tieren pro Makrolonkäfig gehalten. 4.6 Bakterienkultur Einen Tag vor dem Setzen des Verbrennungstraumas wurde eine Übernachtschüttelkultur von Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) in 5 ml LBMedium angeimpft und bei 37°C und 250 rpm inkubiert. Am Morgen des Verbrennungstages wurde diese Übernachtschüttelkultur in 45 ml LB-Medium überführt und für weitere 2,5 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert um die Bakterien in die exponentielle Wachstumsphase zu bringen. Die Bakteriensuspension wurde danach für 5 Min bei 4000 rpm und 20°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Bakterienpellet wurde je nach Trübung der Schüttelkultur in 5 bis10 ml PBS resuspendiert und die OD600nm im BioPhotometer gemessen. Anschließend wurde die Bakterienmenge mit der folgenden Formel in CFU (colony forming units) pro ml PBS errechnet: CFU/ml = OD600nm x 2,5 * 108 (Bakterien) Die Bakteriensuspension wurde mit PBS bis auf 1 * 108 Bakterien in 250 µl PBS verdünnt, zu jeweils 250 µl in Eppendorf-Röhrchen aliquotiert und bis zum Gebrauch auf Eis gelagert, um das Wachstum zu stagnieren. 4.7 Kontrollausstrich Zur Kontrolle der gemessenen Bakterienkonzentration und der Vitalität der verwendeten Bakterien wurde die Supension seriell verdünnt und jeweils drei 50 Kontrollausstriche von den Verdünnungsstufen 1:100.000, 1:1.000.000 und 1:10.000.000 mit je 250 µl auf Pseudomonas Isolationsagar angefertigt. 4.8 Verbrennung & Infektion Zu Beginn des 2. Tages erhielten alle Tiere die oben erwähnte Analgesie. Frühestens eine Stunde später wurden die Tiere narkotisiert und mit einem wasserfesten Stift (Edding®) der Rücken in Quadranten unterteilt, um bei allen Tieren ein vergleichbares Areal zu lokalisieren. Gleichzeitig erhielten alle Tiere am Schwanzansatz und einem Ohr eine Nummer. Anschließend wurden die Tiere in einen speziell zugeschnittenen Isolierschlauch, der Aussparungen für die Gliedmaßen enthielt, so fixiert, dass auf dem Rücken zwei Areale durch Aussparungen Abbildung 6: Ratte im Isolierschlauch im Isolierschlauch freilagen. Diese Areale lagen ca. 1,5 cm lateral der Wirbelsäule und hatten eine Fläche von ca. 2,5 x 3,5 cm pro Seite. Die Tiere wurden im Isolationsschlauch für 20 Sek bei 60°C Wassertemperatur im Bereich der Aussparungen am Rücken verbrüht. Die dabei entstehende 2° Verbrennung machen nach der Formel von Meeh ungefähr zusammen 5% der gesamten Körperoberfläche der Tiere aus. Berechnung der Gesamtkörperoberfläche von Ratten nach Meeh [163]: k = TBSA (cm2 )/ W2/3 (gr.) k= Meeh Konstante = 9,46 für Sprague Dawley Ratten TBSA =Total Body Surface Area = Gesamtkörperoberfläche W = Weight = Gewicht (Durchschnitt 240 gr.) Die durchschnittliche Gesamtkörperoberfläche (=TBSA) der in diesem Versuch verwendeten Ratten ist somit: TBSA = 9,46 * 240 2/3 = 365 cm2 Für zwei Verbrennungsareale, a 2,5 cm * 3,5 cm = 8,75 cm2, ergibt sich also insgesamt ein Verbrennungsareal von 17,5 cm2, was ca. 5% einer Gesamtkörperoberfläche von 365 cm2 ausmacht. 51 Direkt nach dem Verbrühen wurden die Tiere aus dem Isolationsschlauch befreit, abgetrocknet, das Verbrennungsareal umrandet und der gesamte enthaarte Rücken mit Softasept ® gründlich desinfiziert. Nach dem Trocknen des Desinfektionsmittels bedeckten wir die verbrühten Areale mit steriler Gaze, die auf jeder Seite mit 1 x 108 CFU Pseudomonas aeruginosa in 250 µl Bakteriensuspension benetzt wurde [81, 82]. 4.9 Verband Im Rahmen des Verbrennungsmodells wurde ein standardisierter Okklusivverband entwickelt um etwaigen Manipulationen der behandelten Areale, durch Crosskontamination, Wundkratzung oder Verunreinigung durch die Tiere, weitestgehend vorzubeugen. Dieser Verband bestand aus den folgenden Komponenten: Die Verbrennungsareale wurden auf jeder Seite einzeln mit sterilen Gazestreifen abgedeckt, die außer der Schutzfunktion ebenfalls dazu diente die Bakteriensuspension am Verbrennungstag im Bereich des Verbrennungstraumas zu halten. Der behandelte Bereich inklusive der Gaze wurde als nächstes mit Tegaderm ® okklusiv abgeklebt und anschließend erhielten alle Tiere einen zweilagigen zirkulären Peha-Haft® Verband, um die Tiere am Beseitigen der Tegaderm® - Folie und der Gaze zu hindern. Dieser zirkuläre Verband musste zusätzlich mit jeweils zwei Visistat ® Clips, die mindestens 1 cm rechts und links von der Wirbelsäule platziert wurden, im Nacken- und Lendenbereich fixiert werden. 4.10 Applikation Alle applizierten Lösungen hatten ein Volumen von 300 µl, wovon 150 µl intradermal und 150 µl subcutan in die Mitte des markierten Areals gespritzt wurden. Die einzelnen Lösungen wurden jeweils vor dem Experiment am vierten Tag morgens vorbereitet und entsprechend der oben beschriebenen Zusammensetzungen für jedes Tier und jede Seite aliquotiert (s. Tabelle 3). 52 Tabelle 3: Aufstellung der einzelnen Testgruppen und applizierte Lösungen und Mengen. Gruppe: applizierte Lösung: Menge: Ad5-hCAP18 synthetisches Peptid LL37 in 300 µl PBS 1 x 108 IP Ad5-hCAP18 100 µg synthetisches Peptid in 300 µl 0,1%ig LL37 Essigsäure Leerviruskontrolle 1 x 108 IP Ad5-lacZ in 300 µl PBS Negativkotrolle Phosphate Buffered Saline 300 µl PBS Die Tiere wurden nacheinander narkotisiert und behandelt. Um eventuelle CrossKontaminationen zu verhindern, wurden die ersten Tiere immer den Kontrollgruppen und dann der eigentlichen Messgruppe mit dem Ad5-hCAP18 Virus zugeteilt. Vor der Applikation der einzelnen Substanzen wurde auf jeder Seite im Verbrennungsareal ein jeweils 1,5 x 1,5 cm großes Areal [57] mit einer Schablone eingezeichnet. Für die Applikation wurden Fertiginsulinspritzen verwendet, wobei für jede Seite eine eigene Spritze benutzt wurde. Nach Legung einer diagonalen Hautfalte durch das 1,5 x 1,5 cm Abbildung 7: intradermal und subkutane Applikation große Areal zwischen zwei Fingern wurde an einem Eckpunkt eingestochen und vorsichtig intracutan bis zur Mitte des Areals vorgeschoben, wobei der Schrägschliff der Nadel nach oben zeigte. In der Mitte des eingezeichneten Areals wurde die Hälfte des Spritzeninhalts (150 µl) appliziert und anschließend die Nadel vorsichtig bis ins letzte Drittel des Stichkanals zurückgezogen, von wo aus sie in einem Winkel von ungefähr 45 Grad ins subcutane Gewebe wieder bis in die Mitte des markierten Areals vorgeschoben wurde und die restlichen 150 µl appliziert wurden. Danach erhielten alle Tiere wieder den Standardverband. Dieses Procedere wurde bei jedem Tier mit neuen Einweghandschuhen durchgeführt, um eine Bakterien- oder Virenkontamination zu verhindern. 53 4.11 Probengewinnung Die Ratten wurden zur Probengewinnung an den beiden Messzeitpunkten, 48 Stunden oder 7 Tagen, durch die intraperitoneale Gabe einer Lethaldosis von 1 ml Narcoren ® und an- schließendem Genickbruch getötet. Das eingezeichnete 1,5 x 1,5 cm große Areal wurde entlang der Markierungen mit einem Einweg-Skalpell herausgetrennt Abbildung 8: Präparation der Hautprobe und in vortarierte Probenröhrchen überführt. Anschließend wurden alle Röhrchen erneut mit derselben Waage gewogen, um das Gewebegewicht zu bestimmen. Alle Proben wurden bei 4°C auf Eis gelagert und sofort im Labor weiterverarbeitet. 54 5 Quantitative mikrobiologische Analyse 5.1 Probenhomogenisation Die gewonnen Hautareale wurden mit 3 ml PBS aufgefüllt und mit dem Polytron ® PT3100 mechanisch bei 26.000 rpm unter kontinuierlicher Kühlung mit Eis durch gleichmäßige Auf und Abbewegungen homogenisiert. Um eine mögliche Kontamination der Proben zu verhindern, wurde das Messer nach jeder Homogenisation mechanisch gereinig, desinfiziert und in sterilem Wasser gespült. Nach dieser Prozedur wurden die Proben jeweils wieder bei 4°C auf Eis gelagert. 5.2 Verdünnungsreihe Für die Verdünnungsreihe wurden Eppendorf-Röhrchen mit der Nummer des jeweiligen Tieres, der Seite und der entsprechenden Verdünnung beschriftet. In jedem Röhrchen befanden sich 900 µl steriles PBS und durch Überführen von 100 µl des Homogenisats in die 1:10 Verdünnung - und so weiter - wurde eine serielle Verdünnungsreihe von 1:10 bis 1:1.000.000 angelegt. Dazwischen wurden die Röhrchen verschlossen und kurz auf einem Vortexer vermischt. 5.3 Ausplattieren Die Verdünnungen 1:1000 bis 1.000.000 wurden wie in Tabelle 4 beschrieben ausplattiert. Von jeder Verdünnungsstufe wurden 10 µl pro Agarplatte aufgebracht, mit einem Drigalski-Spatel und einer drehbaren Plattierhilfe verteilt und anschließend für 18 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Tabelle 4: Anzahl der eingesetzten Schafsblut- und Pseudomonas Isolations Agarplatten für jede Hautprobe. Probe/Verdünnung: Homogenisat Verdünnung 1:1000 Verdünnung 1:10000 Verdünnung 1:100000 Verdünnung 1:1 Mio. Gesamt: Schafsblutagar: 1x 1 55 PIA: 1x 3x 3x 3x 3x 13 5.4 Auszählung Die Platten wurden in derselben Reihenfolge ihrer Beimpfung nach 18 Stunden aus dem Brutschrank genommen und sofern sie nicht sofort ausgezählt werden konnten, bei 4°C im Kühlraum gelagert. Die Auszählung der einzelnen Platten geschah manuell durch punktförmige Markierung der gezählten Kolonien auf der Unterseite der Petri-Schale mit einem wasserfesten Filzstift. Verdünnungen, die wegen einer zu hohen Bakteriendichte keine klar abgrenzbaren Kolonien mehr zählen ließen, wurden als „n.a.“ (nicht auswertbar) klassifiziert. 56 6 Histologische Analyse Zusätzliche Hautprobe wurde in 5% Formalin asserviert und bei 4°C gelagert. Zum Einschluss in Paraffin wurden die ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm großen Hautblocke zur Entwässerung mit einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 70%, 90%, 100% Ethanol) behandelt. Als Alkohol entziehendes Intermedium wurde anschließend Xylol verwendet. Einschluss und Aushärtung in Paraffin erfolgte für 16 Stunden. Nach der Aushärtung wurden 4 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt und auf Objektträger aufgezogen. 6.1 Anfärbung von Gewebeschnitten mit Hämatoxylin und Eosin Die Gewebequerschnitte der in Paraffin gebeteten Hautproben der drei Gruppen des ersten Messzeitpunkts sind zunächst für 60 Min bei 70°C hitzefixiert und gründlich in Aqua dest gespült worden. Zur Rehydrierung wurden die Querschnitte einer absteigenden Alkoholreihe (100%, 96%, 70%, 50% Ethanol) unterzogen und anschließend für 10 Min in Hämatoxylin getaucht (0,1% Hämatoxylin, 0,2 mg/ml Natriumjodatin, 0,05 mg/ml Kalialaun in 1000ml Aqua dest). Im Anschluss wurden die Gewebeschnitte für 10 Min mit Aqua dest gespült und danach für 3 bis 5 Sek in eine 1:10 verdünnte Eosin Lösung (1g Eosin (w/v) in 100 ml Aqua dest) getaucht. Überschüssige Eosin Reste wurden zweimal mit Aqua dest abgespült, die Gewebeschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 80%, 90%,100% Ethanol) entwässert und für 3 Min mit Xylol behandelt. Dann wurden die Präparate mit Entellan eingedeckt. 6.2 Nachweis von hCAP18/LL37 Transkripten durch nicht radioaktive in situ Hybridisierung Zur Bestimmung der lokalen Expression der Host Defense Peptid Transkripte von hCAP18/LL37 wurde das entsprechende cDNA Fragment als Sonde eingesetzt. Das Fragment lag bereits als Insert in Klonierungsvektoren vor. Zunächst wurde das Fragment mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen aus den Vektoren enzymatisch herausgelöst. Zur Restriktion des hCAP18/LL37-Fragments wurden EcoRI und BamHI verwendet. Der Restriktionsverdau erfolgte für 2 h bei 37°C. Anschließend wurde das gesamte Volumen der Restriktionsansätze auf einem 57 1% Agarose-Gel bei 2,17 V/cm2 für 45 Min gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Bereiche mit den gewünschten DNA-Fragmenten wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels eines Qiaquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen nach den Angaben des Herstellers eluiert. Die Messung der DNA-Konzentration erfolgte im Eppendorf Biophotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm. Anschließend wurde die DNA mit 0,5 fachem Volumen Natriumacetat (1 M, pH 5,2) und 2,5 fachem Volumen Ethanol (100%) für 15 Min bei -80°C gefällt, für 5 Min bei 14.000 rpm (20.800 x g) zentrifugiert und die DNA zweimal mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen. Das luftgetrocknete Pellet wurde in entsprechendem Volumen sterilem Reinstwasser auf eine Konzentration von 1 µg DNA / 16 µl resuspendiert. Zur spezifischen Markierung der cDNA-Sonden wurde nach der random primed oligo labeling Technik [50] nicht-radioaktiv mit Digoxigenin-11-2´desoxy-uridin-5´-triphosphat (dUTP) mit Dig High Prime der Firma Roche nach den Anweisungen des Herstellers verfahren. Die Markierungsreaktion erfolgte über Nacht zur Hybridisierung der zellulären mRNA an die markierten cDNASonden wurden die 4 µm dicken, in Parafin eingebetteten, Gewebeschnitte einmal 20 Min und zweimal 15 Min in Xylol entparafiniert. Danach erfolgte die Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe (100%, 96%, 70%, 50% Ethanol) für je 10 Min und ein Spülgang in Reinstwasser. Die Präparate wurden in frisch angesetztem Paraformaldehyd (4%, pH 7,0) über 20 Min fixiert, in PBS (pH 7,4) gewaschen und in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 70%, 90%, 100% Ethanol) dehydriert. Nach Lufttrocknung erfolgte eine Behandlung der Schnitte durch sequentielle Inkubation in 0,2 M HCl für 20 Min, in Aqua bidest für 5 Min und in 0,125 mg/ml Pronase (8 DMC-Units/mg, Serva) in PBS für 10 Min. Anschließend wurden die Schnitte in Glycin (0,1 M) für 30 Sek gespült, zweimal 30 Sek in PBS gewaschen und in Essigsäureanhidrid (0,25%)/Triethanolamin (0,1 M) inkubiert und dehydriert. Alle Schritte wurden bei RT durchgeführt. Sämtliche Lösungen wurden mit DEPC vorbehandelt, um eine Kontamination mit RNasen zu vermeiden. Vor der Hybridisierung wurden die Präparate mit 300 µl Hybridisierungspuffer ohne cDNA-Sonde zur Absättigung unspezifischer Bindungen beschichtet und in einer feuchten Kammer über 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Anschließend wurden die markierten cDNA-Sonden mit Hybridisierungspuffer in einer Konzentration von 1 µg/ml gemischt, 10 Min bei 95°C denaturiert und dann rasch auf Eis abgekühlt. Überschüssiger Puffer wurde 58 von den Präparaten entfernt und 30 µl der Hybridisierungslösung wurde den Schnitten zugesetzt. Die Präparate wurden eingedeckt und über Nacht bei 42°C inkubiert. Nach erfolgter Hybridisierung wurden die Deckgläschen durch Spülen in 2fach konzentrierter SSC-Lösung entfernt. Die Präparate wurden zweimal 20 Min in Waschlösung bei 42°C gespült. Danach wurde stufenweise in 2fach konzentrierter SSC-Lösung und 0,1 fach konzentrierter SSC-Lösung für jeweils 20 Min bei 55°C inkubiert. Abschließend wurden die Präparate über 3 Min in PBS bei RT gespült. Endogene Peroxidase Aktivität wurde durch 30 Min Inkubation in 0,3% H2O2 in PBS inhibiert. Die Digoxigenin markierten Sonde für hCAP18/LL37 wurde mit einem HRP-konjugierten Schaf anti-Digoxigenin Antikörper, 1:100 in PBS verdünnt, lokalisiert. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde. Nach Waschen in PBS folgte die Inkubation mit TSA Plus Direkt-FITC gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zur Darstellung der Zellkerne wurden die Präparate mit jeweils 30 µl Propidiumjodid in PBS (500 ng/ml) über 5 Min gegengefärbt. Die Entfernung überschüssigen Propidiumjodids erfolgte durch einen weiteren Waschgang mit PBS, gefolgt von einer Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe. Nach Lufttrocknung wurden die Präparate mit Glycerol/PBS-Lösung eingedeckt. Als Systemkontrolle zur Überprüfung der Spezifität des FITC-Konjugats wurde die Hybridisierung ohne Digoxigenin-markierte cDNA-Sonde durchgeführt. Als Negativkontrolle wurden die Präparate vor der Hybridisierung mit der spezifischen cDNA-Sonde über 1 Stunde bei 37°C mit RNase A (100 µg/ml in 2fach konzentrierter SSC) behandelt. Die in situ Hybridisierung mit der cDNA-Sonde für hCAP18/LL37 wurden von Sabine Böhm und Kerstin Schmitz, BGFA, Abteilung für molekulare Zellbiologie, durchgeführt. Die Bestimmung der lokalen Expression von Kollagen Typ I und III Transkripten erfolgte ebenfalls nach dem Verfahren der nicht-radioaktiven in situ Hybridisierung nach der random primed oligo labeling Technik. Die Isolierung der Sonden für Kollagen Typ I (α1) und Typ III (α1) aus der gesamt-Plasmid-DNA erfolgte durch Restriktionsverdauung, Agarose- Gelelektrophorese und Gelelution und wurde von Sabine Böhm durchgeführt. Die in situ Hybridisierung erfolgte, wie oben beschrieben durch Sabine Böhm und Kerstin Schmitz mit cDNA-Sonden für Kollagen Typ I (α1) und Typ III (α1). 59 7 Semiquantitativer Nachweis von LL37 Transkripten in Verbrennungswunden 7.1 Isolation der gesamt-RNA Am zweiten Messzeitpunkt (7. Tag) wurde mittels eines 4 mm Biopsie-Stempels eine Biopsie aus dem transduzierten Hautareal entnommen und gewogen, um eine Gesamtmenge von 30 mg nicht zu überschreiten. Sämtliche Gewebeproben wurden bis zur weiteren Aufarbeitung in RNAlater, einer RNase-inhibierenden Reagenz, bei –80°C aufbewahrt. Die Isolation der gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Anleitung des Herstellers unter Verwendung des Protokolls zur Isolation von Hautgewebe inklusive DNA-Verdau (RNase-free DNase Set, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die RNA wurde in einem Endvolumen von 30 µl RNase-freiem Wasser eluiert und ihre Konzentration mittels des Eppendorf Biophotometers (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bestimmt. 7.2 Reverse Transkription 1 µg der gesamt-RNA wurde mittels SuperScriptTM First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) revers in cDNA transkribiert. Dabei wurde das Protokoll des Herstellers für die Verwendung von Random Hexameren verwendet. 7.3 Real-time PCR Die relative Quantifizierung der mRNA erfolgte durch eine zwei-Schritt real-time RT-PCR unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs SYBRGreenI (Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche, Mannheim, Deutschland) im Light Cycler (Roche, Mannheim, Deutschland). Im ersten Schritt wurde die RNA wie oben beschrieben in cDNA transkribiert, im zweiten Schritt erfolgte die Amplifikation des Transgens mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit spezifischen Primern für hCAP18/LL37 (sense: 5’ATCATTGCCCAGGTCCTCAG3’, antisense: 5’GTCCCCATACACCGCTTCAC3’, 251bp) und für 18S rRNA (sense: 5’GAAACTGCGAATGGCTCATTAAA3’, antisense: 5’CACAGTTATCCAAGTAGGAGAGG3’) als 60 nicht reguliertes Housekeeping Gene. Diese Primer-Paare wurden validiert, um ein spezifisches PCR-Produkt zu generieren. In jede PCR wurde eine Standardkurve für das Transgen hCAP18/LL37 integriert. Sämtliche Messungen wurden im Triplikat durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde mit 2 µl der cDNA als Template (Vorlage), 0.5 µM sense- und antisense-Primern, 3 mM MgCl2 und 2 µl des Fast Start SYBRGreen Reaction Mix in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Zunächst erfolgte eine einmalige Aktivierung der Hot Start Polymerase bei 95°C für 10 Min, gefolgt vom eigentlichen PCR-Programm (Denaturierung bei 94°C für 15 Sek, Annealing (Primer-Anlagerung) bei 60°C für 10 Sek, Extension bei 72°C für 10 Sek, insgesamt 40 Zyklen). Die Messung erfolgte nach jeder Extensionsphase. Im Anschluß wurde eine Schmelzpunktanalyse durchgeführt, um die Spezifität der Amplifikate zu überprüfen: nach dem letzten Zyklus wurde die Temperatur auf 95°C erhöht, auf 65°C erniedrigt und dann in 0.1°C-Schritten erneut auf 95°C erhöht. Zuletzt erfolgte ein Kühlschritt auf 40°C. Die PCR-Bedingungen für das Housekeeping Gene waren identisch. Sämtliche mRNA-Konzentrationen Konzentration der 18S rRNA normalisiert. 61 wurden auf die zugehörige 8 Statistische Auswertung Alle Versuchstiere wurden bis zum Applikationstag gleich behandelt und willkürlich durchnummeriert. Am Applikationstag selbst entschied die Reihenfolge des erfolgreichen Einschlafens nach Narkoseapplikation über die Zuteilung zu den einzelnen Messgruppen. Aus Cross-Kontaminationsgründen sind die ersten 5 Tiere immer erst der Negativkontrolle, die zweiten der Leerviruskontrolle, die dritten der synthetischen Peptidgruppe und die letzten der Ad5-hCAP18/LL37 Gruppe zugeteilt worden. Diese Reihenfolge wurde ebenfalls an den Entnahmetagen eingehalten. Für die Auswertung wurde jeweils die niedrigste Verdünnungsstufe ausgewählt, die bei allen Tieren einer Gruppe ein sinnvoll verwertbares Ergebnis zeigte. Die einzelnen Werte wurden entsprechend ihrer Verarbeitung umgerechnet und das Endergebnis auf CFU pro g Gewebe für jede Hautprobe wie in der nachfolgenden Beispielrechnung demonstriert, berechnet. Tabelle 5: Beispielrechnung der CFU/g Gewebe der Hautprobe der Ratte 4 linke Flanke. Die Hautprobe R4 linke Seite hat ein Gewicht von 0,375 g. Auszählung: Die 1:10.000 Verdünnung ergab folgende Werte: Platte: R4 li. 1:10.000 (1) – 51 Platte: R4 li. 1:10.000 (2) – 66 Mittelwert: 64 Platte: R4 li. 1:10.000 (3) – 75 Berechnung: CFU * 3000 (3 ml PBS) * 10.000 (Verdünnungsstufe). Ergebnis: 1,92 * 109 Dividiert durch Gewicht (0,375 g) ergibt 5,12 * 109 CFU / g Gewebe. Für die statistische Auswertung wurden die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen und Zeitpunkten mit der Analyse der Varianz (ANOVA) und dem unabhängigen Studenten-t-Test untersucht, wobei alle Tests zweiseitig durchgeführt wurden. Die statistische Signifikanz wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (p< 0,05) festgelegt. Die Auswertung erfolgte mittels SPSS 11.0 (SPSS GmbH Software, München, Deutschland) und Microsoft Excel (Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) Software. 62 C Ergebnisse 1 Vorbereitung 1.1 Virusproduktion und Titerung Die für diese Arbeit angezüchteten Viruschargen für die beiden rekombinationsdefekten Adenoviren vom Seotyp 5, Ad5-lacZ Tabelle 6: Titerergebnisse für die Propagation von Ad5-lacZ Viruschargen Charge: Titer (IP/ml) Gesamtvolumen Gesamtmenge Ad5-lacZ CH11 1,95 x 109 2 ml 3,9 x 109 Ad5-lacZ CH12 5 x 106 2 ml 1 x 107 Ad5-lacZ CH13 1,3 x 1010 2 ml 2,6 x 1010 Ad5-lacZ CH14 4,6 x 1010 3,2 ml 1,48 x 1011 und Ad5-hCAP18/LL37 nach der oben beschriebenen Methode ergaben folgende Titer. Tabelle 7: Titerergebnisse für die Propagation von Ad5-hCAP18 Viruschargen Charge: Titer (IP/ml) Gesamtvolumen Gesamtmenge Ad5-hCAP18 CH4 2,25 x 107 8 ml 1,8 x 108 Ad5-hCAP18 CH5 4 x 108 6,5 ml 2,6 x 109 Ad5-hCAP18 CH6 Ad5-hCAP18 CH7 1,1 x 1010 5,93 x 1010 6 ml 5,4 ml 6,6 x 1010 3,2 x 1011 Für diese Arbeit wurden die Charge Ad5-lacZ CH 14 und die Charge Ad5hCAP18 CH 7 verwendet. Die Auswahl einer einzigen Charge für jeden Vektor geschah, um etwaige qantitative oder qualitative Unterschiede der Viren weitestgehend auszuschließen. 1.2 Bakterienvermehrung und Kontrollausstriche Der für die in vivo Versuche angezüchtete Pseudomonas aeruginosa zeigte in der 1:10 Verdünnung bei der Messung der OD600 im Eppendorf Photometer Werte zwischen 0.85 und 1,25, so dass unter Verwendung der oben angeführten Formel Bakteriensuspensionen mit Konzentrationen von 2,125 x 109 bis 3,125 x 109 CFU/ml herauskamen, die für die Applikation entsprechend verdünnt wurden. Die 63 Kontrollausstriche, der bei den Tierversuchen eingesetzen Bakterien- suspensionen, ergaben folgende Werte: Tabelle 8: Ergebnisse der Kontrollausstriche von 250 µl Bakteriensuspension Kontrollausstrich: 48 Stunden Zeitpunkt 7 Tage Zeitpunkt Verdünnung: PlattenNr.: 1 : 100.000 1 1 : 100.000 2 1 : 100.000 3 1 : 1.000.000 1 1 : 1.000.000 2 1 : 1.000.000 3 1: 10.000.000 1 1: 10.000.000 2 Mittelwert der CFU der Verdünnungsstufe: Gesamt CFU / 250 µl Bakteriensuspension nicht auswertbar - 106,33 1,063 x 108 9,66 0,966 x 108 1: 10.000.000 3 1 : 100.000 1 : 100.000 1 2 nicht auswertbar - 1 : 100.000 1 : 1.000.000 1 : 1.000.000 3 1 2 108,66 1,086 x 108 1 : 1.000.000 1: 10.000.000 1: 10.000.000 3 1 2 8,66 0,86 x 108 1: 10.000.000 3 1.3 Versuchstiere Die in dieser Studie eingesetzten Ratten hatten alle ein Gewicht von 200 bis 260 g und ein Alter von ca. 4 bis 6 Wochen. Zu diesem Zeitpunkt war der Körper der Tiere groß genug, um auf dem Rücken der Tiere genug Platz für die beiden Verbrennungsareale zu bieten. Die Verbrennungsareale machten ungefähr 5% der Gesamtkörperoberfläche aus. 64 2 Das standardisierte Ratten-Verbrennungs-Infektions-Modell Mit Hilfe des oben beschriebenen standardisierten infizierten Verbrennungsmodells an der Ratte ist es gelungen, eine stabile und sogar leicht progressive Infektion zu erzeugen, die mindestens zwei Wochen anhielt, ohne Bakterien nachimpfen zu müssen. Nach Setzen des Verbrennungstraumas mittelbar eine blasse war un- ödematöse Schwellung im Bereich des betroffenen Areals zu sehen, die sich in den folgenden Minuten zu einer massiven Abbildung 9: Verbrennungsareale unmittelbar nach Exposition Rötung mit fortschreitender Schwellung entwickelte. Das Verbrennungstrauma und die nachfolgende Infektion bot makroskopisch bei allen Tieren bis zum Applikationstag ein sehr einheitliches Bild. Alle Verbrennungsareale waren zum Zeitpunkt der Applikation und 48 Stunden nach Behandlung deutlich infiziert (nass und purulent), wobei eine Ausbreitung der Infektion über das Verbrennungsareal hinaus makroskopisch nicht zu erkennen war. Am zweiten Messzeitpunkt (7. Tag) änderte sich das einheitliche Bild der Infektion. Jetzt konnte makroskopisch ein trockener Wundschorf bei den Wunden, die mit Ad5-hCAP18 behandelt worden waren, gegenüber allen anderen Gruppen (synthetisches LL37, Ad5-lacZ und PBS), die nach wie vor schleimig vereitert waren, unterschieden werden. 65 3 In vivo Transfektion von Ad5-hCAP18 Die Tiere wurden mit 2 x 108 Infectious Particles (IP) Ad5-hCAP18 transfiziert und einmal nach 48 Stunden und einmal nach sieben Tagen nach der Transfektion indirekt anhand der CFU, der Expression (Nachweis von mRNA) und Lokalisation (nicht radioaktive in situ Hybridisierung) ausgewertet. Bei der Auswertung der CFU zeigte sich bereits nach 48 Stunden ein signifikanter Unterschied zwischen der Ad5-hCAP18 und der Negativkontrolle (p = 0,001) von mehr als einer zehner Potenz. Bei der Ad5-hCAP18 Gruppe ergab sich nach 48 Stunden nur eine leichte Erhöhung um den Faktor 3,2 (inokkuliert: 1 x 108; nach 48 Stunden 3,2 x 108), dagegen zeigte die Negativkontrolle einen Anstieg auf über das 40fache (inokkuliert: 1 x 108; nach 48 Stunden 4 x 109) des Bakterienwachstums. Auch die Gruppe, die mit dem synthetischen LL37 behandelt wurde zeigte nach 48 Stunden ein signifikantes Ergebnis (p = 0,001) von 3,1 x 108 CFU pro g Hautgewebe. Der direkte Vergleich von Ad5-hCAP18 und synthetischem LL37 hingegen war mit einem p-Wert von 0,734 nicht signifikant. 5,0E+09 4,5E+09 CFU / g Gewebe 4,0E+09 3,5E+09 3,0E+09 2,5E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,0E+09 5,0E+08 * * 0,0E+00 Ad5-hCAP18 Peptid LL37 Negativkontrolle Abbildung 10: Auswertung der CFU / g Hautgewebe der drei Messgruppen (Ad5-hCAP18, pures Peptid LL37 und der Negativkontrolle) 48 Stunden nach Transfektion. Signifikanter Unterschied der Ad5-hCAP18 und Peptid LL37 Gruppe gegenüber der Negativkontrolle. * p = 0,001 vs. Negativkontrolle. 66 Nach 7 Tagen stieg das Bakterienwachstum bei der Negativkontrolle auf 4,5 x 1012 CFU / g Hautgewebe an, wobei die Ad5-hCAP18 Gruppe gerade um den Faktor 5,6 (inokkuliert 1 x 108; nach 7 Tagen: 5,59 x 108) gestiegen war. Zu diesem Zeitpunkt zeigte auch die mit dem synthetischen LL37 behandelte Gruppe einen massiven Anstieg der CFU / g Hautgewebe auf 1,9 x 1011. Somit zeigt sich nach 7 Tagen ein signifikanter Unterschied (p = 0,011) um mehr als das 8000fache zwischen der Ad5-hCAP18 und der Negativkontrolle. Der nicht signifikante Unterschied der CFU / g Hautgewebe nach 48 Stunden zwischen der Ad5-hCAP18 und der synthetischen LL37 Gruppe stieg nach 7 Tagen auf über das 300fache an und ist mit p < 0,001 eindeutig signifikant. Auch der direkte Vergleich der Negativkontrolle und der synthetischen LL37 Gruppe ist mit p = 0,013 signifikant. Um einen möglichen inhibierenden Effekt des viralen Konstrukts auf das Bakterienwachstum auszuschließen, wurde am zweiten Messzeitpunkt (7. Tag) eine Leerviruskontrolle zusätzlich untersucht. Zu diesem Zweck wurde das Reportergen Konstrukt Ad5-lacZ, dass das gleiche virale Rückrat wie der Ad5hCAP18, aber ein anderes Transgen enthält, als Leerviruskontrolle gewählt. Es gab keinen Nachweis dafür, dass der Ad5 von sich aus das Bakterienwachstum inhibieren kann, da kein Unterschied (p = 0,763) zur Negativkontrolle nachgewiesen werden konnte. 67 CFU / g Gewebe # 1,0E+13 1,0E+12 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 * + Ad5-hCAP18 Peptid LL37 Negativ-kontrolle Leervirus-kontrolle Abbildung 11: Auswertung der CFU / g Hautgewebe der vier Messgruppen (Ad5-hCAP18, pures Peptid LL37, Negativkontrolle und Leerviruskontrolle) 7 Tage nach Transfektion. Signifikanter Unterschied der Ad5-hCAP18 gegenüber der Peptid LL37 Gruppe (+ p < 0,001), Negativkontrolle (# p = 0,011) und Leerviruskontrolle * p ≤ 0,003. 68 4 Histologische & semiquantitative Analyse 4.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung von 2° verbrannter Haut Zur Verifizierung des Grads der Verbrennung wurden mehrere Paraffinschnitte mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Auf der repräsentativen Abbildung 12 ist deutlich zu sehen, dass es sich um eine zweitgradige Verbrennung handelt, da nur die Epidermis und die oberen Teile der Dermis geschädigt sind jedoch nicht die Subcutis. Abbildung 12: Hämatoxylin gefärbter Parafinschnitt zur Verifizierung der Verbrennungstiefe eines vertikalen Hautschnitts der Ratte bei 20facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop. Im oberen Teil des Bildes ist deutlich der Unterschied zwischem verbranntem und bereits nekrotischem Zellmaterial zu erkennen. Das die Dermis und die Subcutis nicht komplett verbrannt sind, ist ebenfalls an der intakten sich in der Mitte der Aufnahme befindenden Haarwurzel 69 zu erkennen. Die abgestorbenen Gewebsschichten sind in Abbildung 13 bereits abgestoßen und besitzen daher keine Verbindung mehr zu den darunterliegenden Schichten. Unterhalb des abgestoßenen Zellmaterials ist bereits die beginnende Reepithelialisierung zu erkennen, die einem breiten Band von Granulationsgewebe aufsitzt, das massiv mit Leukozyten durchsetzt ist. 4.2 Lokalisation von hCAP18/LL37 Transkripten Um hCAP18/LL37 formalinfixierte und expremierende in Paraffin Zellen gebettete sichtbar zu machen Gewebproben des wurden zweiten Messzeitpunkts der nicht radioaktiver in situ Hybridisierung unterzogen und die Zellkerne zur besseren Darstellung mit Propidiumjodid gegengefärbt. Abbildung 13 zeigt den Vergleich zwischen der mit Ad5-hCAP18 und der mit PBS (Negativkontrolle) behandelten Gruppen unter dem Flureszenzmikroskop. In der Verbrennung, die nur mit PBS behandelt wurde, sind eine reduzierte Epithelialisierung, eine niedrige Hintergrundfloreszenz, stark flureszierende Erythrozyten und ein paar Haarwurzeln mit flureszierendem Keratin sichtbar. Sowohl Dermis wie auch Epidermis zeigen hier keine spezifische grünliche Flureszenz (Abbildung 13b). Hingegen zeigt Abbildung 13a im Bereich der Dermis und der neugebildeten Epidermis, die mit Ad5-hCAP18 behandelt wurden vereinzelt Zellen, die positiv gefärbt wurden für hCAP18-mRNA (weiße Pfeile). Abbildung 13: Lokalisation von hCAP18/LL37 durch nicht radioaktive in situ Hybridisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop am zweiten Messzeitpunkt (200fach). a. Vertikaler Schnitt (links): hCAP18/LL37 mRNA positive Zellen (weiße Pfeile) b. Horizontaler Schnitt (rechts): kein Nachweis von hCAP18/LL37 Transkripten. 70 4.3 Semi-Quantitative Bestimmung von hCAP18/LL37 durch Real-time rtPCR Zur Verifizierung der CFU Auszählung wurden am zweiten Messzeitpunkt (7. Tag) zusätzliche Hautstempelbiopsien von je drei Ratten aus jeder Gruppe (LL37, Ad5-hCAP18 und Negativkontrolle) entnommen und die totale mRNA extrahiert. Für den Vergleich der relativen Transkriptionsmengen wurde 18S-RNA als sogenanntes „Housekeeping gene“ vervielfältigt, wobei linearisiertes plasmid mit der gleichen genetischen Information als Positivkontrolle diente. Abbildung 14 zeigt eindeutig, dass nur bei den Ratten der Ad5-hCAP18 Gruppe indirekt eine Expression des Transgens durch Nachweis der zugehörigen cDNA, die aus mRNA reverstranskribiert wurde, gezeigt werden konnte. Sowohl in der Gruppe synthetisches LL37, die nur das fertig Peptid appliziert bekommen hat, wie auch in der Negativkontrolle, die nur mit der Trägerlösung PBS behandelt wurde, war keine Genexpression von hCAP18/LL37 nachweisbar. Relative Korrelation LL37/18SrRNA 3,0E-04 2,5E-04 2,0E-04 1,5E-04 1,0E-04 5,0E-05 0,0E+00 Peptid LL37 Ad5-hCAP18 Negativkontrolle Abbildung 14: Semi-Quantitative Transgendetektion in verbrannter und infizierter Haut der Ratte zum zweiten Messzeitpunkt. Nur in der Ad5-hCAP18 Gruppe ist eine Transgenexpression nachweisbar. 71 D Diskusssion Der Anstieg an Infektionen mit multiresistenten Erregern und die hohen Kosten und Konsequenzen, die damit verbunden sind, bedürfen einer gesteigerten Aufmerksamkeit und geeigneter Lösungen, um auch in Zukunft eine adäquate Therapie sichern zu können. Besonders bei Schwerbrandverletzten wird diese Problematik schnell deutlich, da es aufgrund des Verlustes der schützenden Hautöberfläche sehr leicht ist für Bakterien, sich dort anzusiedeln. Ein weiterer Grund für diese rasante Resistenzentwicklung ist der viel zu häufig und verantwortungslose Einsatz von Antibiotika, wodurch Resistenzen praktisch gezüchtet werden. Die Stagnation bei der Entwicklung von Alternativen oder neuen Gruppen von Antibiotika begründet sich auch im sinkenden Profit den die Pharmaindustrie an den herkömmlichen Produkten erzielt, was aber gleichzeitig die Grundvoraussetztung für neue Forschungsgelder ist. Diese Problematik impliziert, dass neue Strategien entwickelt werden müssen, die eine effektivere Prävention und Eradikation multi-resistenter humanpathogener Keime ermöglicht. Historisch wurden Infektionen für einen Zeitraum von mehr als 30 Jahren als hauptsächlicher Grund für das Versterben von Schwerbrandverletzten gesehen. Heute wird dies wieder kontrovers diskutiert, da die Sepsis nicht mehr als Voraussetzung für die Entwicklung von SIR (Systemic inflammatory response) gesehen wird, sondern eher als ein Beispiel selbiger [26, 86, 87, 163]. Mit steigender Resistenzrate gegen klassische Antibiotika spielen Infektionen aber auch hier wieder vermehrt eine Rolle. Eine vielversprechende Alternative zu den klassischen Antibiotika sind Host Defense Peptide wie z.B. das einzige Cathelecidin des Menschen, hCAP18/LL37. Es besitzt vorteilhafte Eigenschaften wie antimikrobielle und wundheilungsfördernde Wirkungen, welche bei der Behandlung einer Verbrennungswunde zum Einsatz kommen könnten [77]. Aber alle bisherigen Versuche im Rahmen von topischen Applikationen von Medikamenten und therapeutischen Proteinen mit den unterschiedlichsten Ansätzen wie z.B. Antikörper gegen Endotoxine und TNF-α oder IL-1 Rezeptorantagonisten oder Applikation von Wachstumsfaktoren [47, 93, 143] zeigten, dass diese Applikationsformen einige Probleme aufweisen und stark limitiert sind. Aufgrund 72 von teueren Herstellungskosten wäre im Falle sparsamer Anwendungen ein Einsatz vielleicht noch denkbar, was allerdings wegen der sehr kurzen Halbwertszeit im agressiven Wundmillieu nicht darstellbar ist. Diese Instabilität fordert also eine permanente Zufuhr neuer Agenzien, wodurch enorme Mengen und häufige Manipulationen der Wunde nötig wären. Häufige Verbandswechsel steigern aber gleichzeitig wiederum das Risiko für Neuinfektionen [114]. Dies allein verdeutlicht sehr schnell wie eng die einzelnen Komponenten mit einander verknüpft sind und sich gegenseitig beeinflussen. Beim derzeitigen Stand der Forschung gibt es verschiedene Ansätze, diese Probleme anzugehen und ein Großteil der Bemühungen gilt der Prävention. Auch eine frühe Intervention bei der Versorgung von Wunden mit der Entfernung von abgestorbenem, verkohltem Gewebe (Debriment), das den Nährboden für Infektionen verringert, spielt eine wichtige Rolle im aktuellen klinischen Management von Verbrennungen. Außerdem wird in zahlreichen Studien und in bekannt gewordenen Einzelfällen/Untersuchungen die Hygiene immer wieder ausdrücklich betont. Aber trotz all dieser Bemühungen werden weder Infektionen noch Resistenzentwicklungen je zum Stillstand kommen, da es sich um evolutive Überlebensprozesse von Bakterien handelt [93, 114, 143]. Dennoch mindert das nicht die Anforderungen und die Verantwortung der einzelnen Bereiche, die zur Gewährleistung einer adäquaten Therapie dazugehören. Denn weder die praktizierenden Mediziner und Pflegekräfte in den Krankenhäusern noch die Forschung alleine sind in der Lage, dieses Problem individuell zu lösen. Damit die Forschung in Zukunft einen effektiven Beitrag zu der oben erwähnten Problematik leisten kann, ist es zunächst wichtig, standardisierte und reproduzierbare Versuchsmodelle zu etablieren, damit die unterschiedlichen Therapieansätze effektiv untereinander verglichen werden können. Eine vielversprechende Alternative zu diesen limitierenden Faktoren stellt die transiente Expression von Proteinen durch die körpereigenen Zellen dar, wie sie die Gentherapie ermöglicht. So zeigten Steinstraesser et al., dass allein durch einen Pratikel-vermittelten Gentransfer mittels einer Genkanone (Gen Gun) es zu einer Genexpression in Verbrennugswunden kommt [121]. Auch andere nonvirale Techniken, wie der liposomale Gentransfer [93, 125, 150] oder virale Übertragungstechniken mittels rekombinanter adeno-assoziierten Vektoren [89, 129] konnten eine Genexpression hervorrufen. Doch leider ließen sich die zum 73 Teil sehr guten Expressionsergebnisse aus den in vitro Studien in vivo nicht reproduzieren und führten häufig zu nicht ausreichenden Transfektionsraten in der Haut [29, 65, 124]. Gerade eine ausreichend hohe Transfektionsrate ist aber die Basis für mögliche therapeutische Verwendungen derartiger Methoden als Alternative zu herkömmlichen topischen Applikationen in der Zukunft. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen [93, 125, 132], dass die Verwendung von Adenoviralen Vektoren für die Genübertragung in der Haut derzeit zu den vorteilhaftesten Techniken gehört [35]. Diese Vektoren zeigen hohe Transfektionsraten in gesunder und verwundeter Haut ohne eine permanente Integration von viraler DNS in das Wirtsgenom, wie dies beim retroviralen Vektorsystem der Fall ist. [147]. Weiter ist die Eigenschaft der transienten Transfektion des Adenoviralen Vektors in Bezug auf Wunden und Wundinfektionen als temporäres Geschehen gegenüber retroviralen, lentiviralen, herpes-simplexviralen und mit Einschränkung auch den adeno-assoziierten Vektorsystemen vorteilhaft, da die Expression des Transgen zeitlich limitiert ist [18, 28, 184, 185]. Allerdings zeigen neuere Studien, dass replikationsdefiziente Adenovirale Vektoren mit einer Frequenz von 0,001 – 1% in das Wirtschromosom infizierter Zellen sehr wohl integriert werden [16, 35, 118, 183]. In wieweit diese Tatsache Einfluss auf den potentiellen Einsatz von Adenoviralen Vektoren hat oder haben wird, bleibt derzeit allerdings ungeklärt. Der wahrscheinlich wichtigste Vorteil der die Transfektionseffizienz massgeblich mit beeinflusst, ist die Eigenschaft des Adenoviralen Vektorsystems die Zielzelle unabhängig von Ihrem Zellzyklus zu transfizieren, was sowohl bei adenoassoziierten oder retroviralen Vektoren nicht der Fall ist [184]. Auch eine hohe Aufnahmekapazität für Fremdgene, hohe Titer beim Heranzüchten und die Tatsache, dass es nicht zu einer Vermehrung in der Zielzelle kommt, sprechen deutlich für das Adenovirale Vektorsystem [118, 184]. Adenovirale Vektoren infizieren verschiedenste kutane Zelltypen, wie Keratinozyten, Talgdrüsen, Fibroblasten und glatte Muskelzellen von unterschiedlichen Spezies, was verschiedene Studien in vitro, ex vivo und an Tiermodellen belegen [10, 108]. Darüberhinaus sprechen die Produktion einer genetisch stabilen Virenpopulation mit hohen Titern, die relativ einfache Herstellung Adenoviraler Vektoren und die Induktion hoher Level bei der Genexpression verschiedener viraler Konstrukte für dieses System [46]. Außer den Adenoviralen Vektoren gibt es nur noch den Parvovirus AAV (adeno-assoziierter 74 Virus), der die meisten dieser positiven Eigenschaften teilt, aber dennoch zwei vergleichsweise schwerwiegende Nachteile mit sich bringt. Erstens ist die Trennung zwischen dem rekombinanten AAV und dem für die Vermehrung des Vektors benötigten Helfervirus sehr schwierig und zweitens zeigt er in Gegenwart von Herpes-Simplex Viren oder Adenoviren, für beide ist die Verbreitung beim Menschen relativ groß [46, 179], lytische Aktivität in den Zellen [55, 102]. Aber auch das Adenovirale Vektorsystem zeigt einen nicht zu unterschätzenden Schwachpunkt in Form einer sehr ausgeprägten inflammatorischen Immunantwort des Körpers aufgrund der hohen Antigenität des Adenoviruses [123]. Diese Immunreaktion äußert sich durch das Auftreten von zytotoxischen THelferzellen und neutralisierenden Antikörper, die natürlich gegen das Virus, aber interessanterweise auch gegen das Transgen gerichtet sind [88, 136, 170]. Die zuerst eingesetzten rekombinanten Adenoviralen Vektoren, die lediglich eine Deletion in der E1 Region aufwiesen, führten besonders bei hohen MOI´s zu einer starken zellulären Immunreaktion [89, 185], die den Verlust der Genexpression nach ca. 2 Wochen nach sich zog [51, 177]. Im weiteren Verlauf wurden immer neue rekombinante mehrfach deletierte Adenovirale Vektoren entwickelt und erprobt, um die zelluläre Immunreaktion und die Toxizität zu senken [167]. Hiebei brachte besonders die Deletion im Bereich der Region E2a eine deutliche Verbesserung der zellulären Immunantwort mit sich, was gleichzeitig zu einer Verlängerung der Persistenz des transfizierten Genes führte. Dies äußerte sich unter anderem in einer Reduktion der Infiltration transfizierter Gewebe durch zytotoxische CD8--T-Helferzellen [110, 111]. Interessant war die Entdeckung, dass die E3 Region in ihrer natürlichen Funktion für einige virale Proteine kodiert, die ebenfalls darauf abzielen, die Immunreaktion des Körpers auf infizierte Zellen zu vermindern [44, 91]. Proteine aus dieser Region inhibieren die Aktivität von NF-κappa B durch TNF-α, die Fas-induzierte Zytolyse und den Transport von MHC-I – Proteinen (Major Histocompatibility complex I) an die Oberfläche, die für die Erkennung infizierter Zellen durch CD8--T-Helferzellen benötigt werden [7]. Den größten Erfolg bei der Verminderung der Immunantwort aller Vektoren zeigten die „helper-dependent“ oder „gutless“ genannten Vektoren, bei denen alle viralen Sequenzen bis auf „inverted terminal repeats“ (ITR´s) und die sog. „packaging signals“ entfernt wurden. Obwohl das Viruskapsid allein in der Lage 75 ist, eine adaptive Immunantwort hervorzurufen [155], zeigen die helperdependent Adenoviralen Vektoren der 3. Generation im Gegensatz zu älteren Vektoren eine reduzierte Immunogenität und verlängerte Transgen Expression [23]. Leider führten diese Deletionen nicht nur zu einer Reduktion der Immunogenität, sondern gleichzeitig auch einer geringeren Transfektionsfähigkeit in vitro und in vivo und einer deutlich erschwerten Propagation [178]. Welchen Effekt Adenovirale Infektionen auf lokale Wunden und die Wundheilung haben ist derzeit weitestgehend unbekannt [163]. Zwar zeigten Sylvester et al. bei Exzisionswunden, die zuvor mit einem E1a und E1b delitierten Adenoviralen Vektor behandelt worden waren eine deutliche Zunahme der Immunantwort, was aber nicht mit einem negativen Effekt für die Wundheilung einherging [40]. Diese Vorteile führten im Jahre 2000 zum Einsatz im Rahmen eines klinischen Phase-1 Versuchs, bei dem Margolis et al. die Effektivität von rekombinantem human platelet-derived growth factor (rhPDGF) auf chronische diabetische Ulcera beim Menschen erforschten. Hierbei wurde eine lokale Überproduktion dieses Wachstumsfaktors in den Ulcera nach Adenoviral-vermitteltem Gentransfer hervorgerufen, der ab der zwanzigsten Woche 35% mehr geheilte Ulcera und weniger Amputationen in der mit rhPDGF behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, die mit herkömmlicher Therapie versorgt wurde, zeigte [163]. Auch in dieser Studie scheint die lokale Immunantwort auf den Adenovirus eher von untergeordneter Bedeutung zu sein. Sowohl diese Ergebnisse, wie auch verschiedene Versuche unserer Arbeitsgruppe, die wichtige Basisdaten über die Transfektionseffizienz, die Wirkdauer und die Kinetik der Expression von verschiedenen Adenoviralen Vektorkonstrukten lieferten, waren die Grundvoraussetzung und Motivation für diese Arbeit. Die erlangten Erkenntnisse bilden die Basis für zukünftige Medikamentenapplikationen und sollten in einem ersten Schritt an einem standardisierten Ratten-Verbrennungs-Infektions-Modell unter therapeutischen Gesichtspunkten überprüft werden. Aufgrund der Kombination von thermischer Schädigung und Infektion fiel die Wahl des Transgens auf das einzige Cathelicidin des Menschen, hCAP18/LL37. Es besitzt außer seinen antimikrobiellen noch weitere Eigenschaften, wie die Endotoxinbindungskapazität, Förderung der Angiogenese, Beschleunigung der Wundheilung und Induktion von proinflammatorischen 76 Zytokinen [163], die zusätzliche Vorteile gegenüber anderen Medikamenten wie den klassischen Antibiotika für die Wundheilung haben. 1 Viruspropagation Nach einigen anfänglichen Schwierigkeiten erwies sich die von Andersen et al. neu beschriebene Methode zur Propagation von Adenoviralen Vektoren als konstante und praktikable Methode [122]. Die Titerergebnisse waren ausreichend hoch, um für alle in vivo Versuche die gleiche Charge des Ad5-hCAP18 einsetzen zu können und entsprachen den Ergebnissen der aktuellen Literatur [93, 143]. 2 Das standardisierte und reproduzierbare Tiermodell Das in dieser Arbeit vorgestellte und verwendete Ratten-VerbrennungsInfektions-Modell ist ein standardisiertes und gut reproduzierbares Tiermodell. Bei allen Tieren war während der gesamten Experimente schon makroskopisch eine deutliche Infektion zum Zeitpunkt der Transfektion zu sehen. Diese Infektion war ohne das Pseudomonas aeruginosa nachgegeben wurde über einen Zeitraum von mehr als 14 Tagen sichtbar. Weiterhin bietet das in unserem Labor etablierte infizierte Rattenverbrennungsmodell ein gutes Standardmodell, um auch andere Substanzen, Medikamente und Therapieansätze kostengünstig zu testen. Eine der wichtigsten und zugleich schwersten Herausforderungen bei diesem Modell war die Etablierung einer Infektion, die weder zu leicht war und zur spontanen Ausheilung führte noch zu gravierend war was zum Versterben der Tiere geführt hätte. Die Etablierung geeigneter und standardisierter Tierversuchsmodelle dient nicht allein der direkten Vergleichsmöglichkeit zweier unterschiedlicher Therapieansätze, sondern muss viel höheren Ansprüchen genügen. Diese Modelle sollen möglichst effizient human Krankheiten imitieren, um adäquate Verhältnisse für Versuche zu schaffen, damit die gewonnen Erkenntnisse immer besser auf die Menschen übertragen werden können [79, 80, 164-166]. Aus diesem Grund lag eine wesentliche Aufgabe dieser Studie darin, ein möglichst konstantes und reproduzierbares infiziertes Verbrennungsmodell zu etablieren. Als Grundlage hierfür diente das Modell von Walker und Mason [173], 77 das von Dr. Lars Steinsträsser zu einem standardisierten nicht infizierten Verbrennungsmodell an der Ratte modifiziert worden war [8, 17]. Mit diesem Modell als Vorlage galt es, eine Infektion in der Verbrennungswunde zu etablieren, die lange genug vorhielt damit die geplanten Versuche durchgeführt werden konnten. Diese Grundvoraussetzung für die Austestung unseres Therapieansatzes ist nachweislich gelungen, da die Infektion in den Verbrennungswunden der Tiere, die keine wirksame Substanz erhalten haben, sogar progredient war, ohne dass die Tiere dabei verstorben sind. 3 In vivo Transfektion von Ad5-hCAP18 Durch die Transfektion von sub- und intrakutan appliziertem Ad5-hCAP18 und nachfolgender Expression des Transgens konnte eine deutliche Inhibition des Bakterienwachstums von Pseudomonas aeruginosa erreicht werden. Die Auszählung der CFU pro g Hautgewebe zeigte diesen Effekt bereits nach 48 Stunden, der über einen Zeitraum von weiteren 5 Tagen relativ konstant blieb. Synthetisch hergestelltes LL37 zeigte nach zwei Tagen die stärkste Inhibition, was wahrscheinlich auf eine hohe Abtötungsrate gegenüber Pseudomonaden kurz nach der Applikation zurückzuführen ist, die aber im weiteren Verlauf durch das aggressive Wundmillieu deutlich nachlässt. Somit konnte zum einen die in vitro Versuchen gezeigte Wirksamkeit von hCAP18/LL37 gegenüber dem eingesetzten Pseudomonas Stamm verifiziert und zum anderen indirekt die hohe Transfektionseffezienz des Adenoviralen Vektors erneut unter Beweis gestellt werden. Beide Gruppen, Ad5-hCAP18 (p = 0,001) und synthetisches LL37 (p = 0,001), zeigten nach 48 Stunden eine vergleichbare signifikante Inhibition der Pseudomonaden gegenüber der Negativkontrolle. Trotz exponentieller Wachstumseigenschaften der Pseudomonaden ist es durch hCAP18/LL37, lokal expremiert oder synthetisch appliziert, lediglich zu einer ca. Verdreifachung von ursprünglich 1 x 108 inokkulierten auf 3,2 x 108 (Ad5-hCAP18) und 3,1 x 108 (synthetisches LL37) Bakterien gekommen. Wohingegen die gleichen Bakterien ohne hCAP18/LL37 mehr als 5 komplette Vermehrungszyklen durchlaufen haben (1 x 108 auf 4 x 109 CFU / g Hautgewebe). Mit einem p-Wert von 0,734 zeigt der 78 direkte Vergleich von Ad5-hCAP18 und synthetischem LL37 nach 48 Stunden keine Signifikanz. Am zweiten Messzeitpunkt zeigte auch die mit dem synthetischen LL37 behandelte Gruppe einen massiven Anstieg der CFU / g Hautgewebe auf 1,9 x 1011und verliert deutlich an Aktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa. Dies begründet sich in der natürlichen Instabilität des Moleküls, das schon bei physiologischem pH-Wert eine sehr kurze Halbwertszeit hat. Im aggressiven Wundmillieu zerfällt das Peptid noch schneller, was unter anderem den lokalen Einsatz dieser Peptide sehr ineffizient und kostenintensiv macht, da hierdurch enorme Mengen benötigt werden. Das Bakterienwachstum der Negativkontrolle zeigt am zweiten Messzeitpunkt mit 4,5 x 1012 CFU / g Hautgewebe eine ähnliche Größenordnung der Bakterienvermehrung wie auch die synthetische LL37 Gruppe (ca. Faktor 3000). Nur die Ad5-hCAP18 Gruppe zeigt mit 5,59 x 108 CFU / g Hautgewebe eine geringe Zunahme um den Faktor 5,6. Dieser Unterschied um mehr als das 8000fache zwischen der Ad5-hCAP18 Gruppe und der Negativkontrolle ist mit p = 0,011 signifikant. Der nicht signifikante Unterschied der CFU / g Hautgewebe nach 48 Stunden zwischen der Ad5-hCAP18 und der synthetischen LL37 Gruppe stieg zum zweiten Messzeitpunkt auf über das 300fache an und war dann mit p < 0,001 signifikant. Um einen möglichen inhibierenden Effekt des viralen Konstrukts auf das Bakterienwachstum auszuschließen, wurde am zweiten Messzeitpunkt zusätzlich eine Leerviruskontrolle untersucht, die anstelle des Transgens für hCAP18/LL37 ein für lacZ kodierendes Transgen enthält. Dieses Reportergen Konstrukt, Ad5lacZ, besitzt das gleiche virale Rückrat wie der Ad5-hCAP18 Vektor, allerdings ein anderes Transgen. Es gab keinen Nachweis dafür, dass der Ad5 von sich aus das Bakterienwachstum inhibieren kann, da kein Unterschied (p = 0,763) zur Negativkontrolle nachgewiesen werden konnte. Das eigentliche ursprüngliche Ziel einer aktiven Reduktion der Pseudomonaden konnte in dieser Versuchsreihe nicht erreicht werden, was vielleicht an der applizierten Menge des Vektors gelegen hat. Eventuell wären hier eine höhere Ausgangskonzentration oder doch mehrfache Applikationen nötig, weil die MIC für Pseudomonas durch hCAP18/LL37 in vitro mit 4,7 µg/ml relativ hoch ist. Dies wird durch andere Arbeiten unterstützt, die bereits gezeigt haben, dass das 79 aggressive Wundmillieu in vivo eine höhere Konzentration von hCAP18/LL37 voraussetzt [101]. Eine derartige Transfektion und Expression in infizierten Verbrennungswunden der Ratte mittels eines Adenoviralen Vektors mit dem Ziel eines therapeutischen Ansatzes für hCAP18/LL37 ist in der Literatur bisher nicht beschrieben. Allerdings gibt es verschiedene andere Versuchsansätze, die wichtige Zusatzinformationen für diesen Versuch liefern. So ist zum Beispiel die Expression nicht alleine von der Konzentration der applizierten Vektoren abhängig. Steinstraesser et al. zeigten mittels Genkanone ein umgekehrt proportionales Verhalten der Expression bei Verbrennungswunden der Ratte zum Verbrennungsgrad in nicht infizierten Wunden [163]. Andere in vivo Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe, die mittels des Reportergenkonstruktes Ad5-CMV-GFP durchgeführt wurden, zeigten wiederum die höhste Expression in Verbrennungsarealen bei 2° verbrannter Haut, was auf den ersten Blick wegen der geringeren Anzahl von transfektionsfähigen Zellen nicht logisch erscheint. Hierzu sei angemerkt das Steinstraesser et al zeigten, dass durch Verbrennung geschädigte Zellen im Vergleich zu gesunder Haut eine höhere metabolische Aktivität aufweisen [73] und das Moldawer et al. in entzündetem Gewebe sogar eine deutlich erhöhte Transfektion zeigen konnten. Um die Ergebnisse der CFU-Auszählung am zweiten Messzeitpunkt (7 Tage) zu verifizieren, wurden bei neun Ratten (drei pro Gruppe) zusätzlich Hautbiopsien entnommen und die totale mRNA extrahiert. Hierbei wurde 18SrRNA als sogenanntes Housekeeping Gene amplifiziert, um die relativen Transkriptmengen normalisieren und vergleichen zu können. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes LL37 verwendet (Peptid). Eine spezifische Transgenexpression für das Transgen konnte nur bei der Ad5-hCAP18 Gruppe nachgewiesen werden. Hingegen konnten weder in der Negativkontroll- noch in der synthetischen LL37 Gruppe eine Transgenexpression festgestellt werden. Die Methode der real-time RT-PCR wurde gewählt, um nicht nur eine qualitative sondern auch eine quantitative Aussage über die Genexpression treffen zu können. Bei einer semi-quantitativen, herkömmlichen RT-PCR ohne real-time imaging kommt es unabhängig von der Konzentration des Ausgangsmaterials zwangsläufig zu einer Sättigung des PCR-Amplifikats, so dass ein quantitativer Unterschied auf einem anschließenden Agarosegel nicht zu erkennen ist. 80 Bei der real-time RT-PCR wird SYBRGreen, ein Fluoreszenzfarbstoff, in das beim Cycling entstehende doppelsträngige DNA-Amplifikat eingebaut und vom Gerät gemessen. Die Auswertung erfolgt über den Crossing Point, den Punkt, an dem die Menge an Amplifikat einen bestimmten Schwellenwert, der für alle Proben automatisch gleich gesetzt wird, übersteigt und in die exponentielle Phase übergeht. Mittels Auswertungssoftware kann somit ein Rückschluß auf das originär vorhandene Ausgangsmaterial gezogen werden und unterschiedliche Proben nach Normalisierung auf das unregulierte, in der Zelle immer in gleicher Konzentration vorkommende Housekeeping Gene, miteinander verglichen werden. In diesem Fall spricht man von einer relativen Quantifizierung, da die Werte untereinander in Bezug gesetzt werden, allerdings keine absoluten Werte genannt werden können. Durch die nicht radioaktive in situ Hybridisierung konnten die Zellen, die das Transgen hCAP18/LL37 expremieren, zusätzlich in Formalin fixierten und in Paraffin gebetteten Gewebsstücken für den 7 Tage Zeitpunkt lokalisiert werden. Hier zeigt sich, dass nur in der Ad5-hCAP18 Gruppe die spezifische grünliche Fluoreszenz nachweisbar ist, die die hCAP18-mRNA positiven Zellen anfärbt. In den nur mit PDS behandelten Hautstücken konnten hingegen keine positiven Zellen detektiert werden. Aufgrund der mehrfach in der Literatur vorbeschriebenen und zu erwartenden transienten Transfektion und der in vitro und in vivo Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe liegt die Schlussfolgerung nahe, dass das Transgen erfolgreich transfeziert, expremiert und aktiviert wurde. Dies wiederum vorausgesetzt würde ebenfalls das Ergebnis der Ad5-hCAP18 Gruppe erklären. Somit konnte also einerseits die in der Literatur bereits veröffentlichte Aktivität von hCAP18/LL37 gegen Pseudomonaden belegt und anderseits zusätzlich gezeigt werden, dass lokal expremiertes hCAP18/LL37 funktionsfähig ist und über einen Zeitraum von mehreren Tagen expremiert und aktiviert wird. 81 4 Gentherapie Die Gentherapie ist im Allgemeinen eine sehr viel versprechende Methode, jedoch war der anfängliche Enthusiasmus durch einige Rückschläge schnell gedämpft und Kritiker schienen mit Argumenten wie Unkontrollierbarkeit und mangelndes Detailwissen über die komplexen Abläufe bei der Gentherapie Recht zu behalten. Dennoch sollten diese Ereignisse nicht zum Anlass genommen werden, die unzähligen Anwendungsmöglichkeiten der Gentherapie nicht weiter zu erforschen. Schon heute ist absehbar, dass einige Erkrankungen nicht mit herkömmlichen Methoden und Medikamenten kausal therapiert werden können, da sie zumindest zum Teil auf genetischen Defekten beruhen. Aber auch Erkrankungen die nicht auf einen Defekt zurückzuführen sind, sondern zu den Wohlstandserkrankungen oder Alterserkrankungen zählen, zeigen immer häufiger eine Korrelation mit einer genetischen Prädisposition und sind somit auch potentielle Ziele der Gentherapie. Für die Zukunft der Gentherapie ist es essentiell, die wissenschaftliche und ethische Basis von Gentherapieversuchen genau zu evaluieren. In Bezug darauf ist es aber ebenso wichtig, dass die Forscher selbst und die Presse die Ergebnisse solcher Versuche auf eine ausgewogene Art und Weise präsentieren und veröffentlichen. Obwohl die Gentherapie schon seit einigen Jahren fester Bestandteil der Forschung ist, steckt sie noch in den Kinderschuhen und wie bei allen neuen Verfahren müssen auch bei der Gentherapie die möglichen Risiken der Methode den möglichen Erfolgen gegenübergestellt werden. Bezieht man diesen Gesichtspunkt unterschiedliche auf die Dinge verschiedenen in Betracht viralen gezogen Vektoren, werden. so Eine müssen mögliche Kontamination durch replikationskompetente Viren beim retroviralen Vektormodell oder ein potentieller onkogener Einfluss einiger Adenoviraler Vektoren, was theoretisch zu einer Induktion bzw. Infektion mit folgendem Tumorwachstum führen könnte, müssen genauer untersucht werden. Aus diesem Grund sollten die eingesetzten Vektoren möglichst zielgerichtet sein, um nur am gewünschten Ort Veränderungen zu bewirken und es sollte eine bestmögliche Sicherheit bei der Kontrollierbarkeit gegeben sein. Zu den Gesichtspunkten der Sicherheit der humanen Gentherapie kommen aber 82 auch ethische Gesichtspunkte. Die Gentherapie bezog sich in der Vergangenheit meist ausschließlich auf Körperzellen (Somatische Gentherapie), da die Keimbahntherapie beim Menschen verboten ist. Allerdings ist es besonders die Keimzellgentherapie, die in den letzten Jahren in den Mittelpunkt des Interesses gerückt ist. Im Detail auf Gefahren der Keimbahngentherapie und die oft hervorgebrachten Argumente von Gegnern der Gentherapie einzugehen, würde den Rahmen dieser Arbeit sprengen. Auch die ethischen Gesichtspunkte, die mit diesen Fragen verbunden sind, können hier nicht im Detail diskutiert werden. Allerdings sei darauf hingewiesen, dass dem Aspekt der Sicherheit und der Vorbeugung von Missbrauch der Gentherapie, und hierbei speziell der Keimzellgentherapie, besondere Sorge gelten muss. Die Problematik im Zusammenhang mit der Gentherapie und einer futuristischen breiten Anwendung spiegelt sich aber auch schon auf anderen einfacheren Ebenen wieder. Es wird mit Sicherheit seine Zeit brauchen bis Patienten davon überzeugt werden können, das potentiell „infektiöses“ Material, also Adenoviren, zur Behandlung eingesetzt werden sollen, um ihnen zu helfen. Hoffentlich werden derart vielversprechende Möglichkeiten nicht durch Ängste in der Bevölkerung oder einzelnen Ethikkommissionen auf dem Weg zu einem „routinemäßigen“ Einsatz in den Kliniken gestoppt und damit die Adenovirale Gentherapie lediglich bei einigen hoffnungslosen Fällen, bei denen die Infektionsgefahr einem Versterben in den nächsten Tagen gegenübergestellt wird, eingesetzt. 83 E Zusammenfassung Host Defense Peptide sind eine vielversprechende Therapiealternative gegenüber gegenwärtig klinisch eingesetzten Antibiotika, da sie gleichzeitig gegen Bakterien, Pilz und Viren aktiv sind und darüberhinaus positive Eigenschaften für die Heilung von Verbrennungswunden haben. Damit Host Defense Peptide in Zukunft für einen breiten kommerziellen Einsatz zugänglich gemacht werden können, müssen ihre Eigenschaften, Wirkmechanismen und Risiken weiter erforscht und die aktuellen Probleme bei der Herstellung und Applikation gelöst werden. Die am standardisierten infizierten Verbrennungsmodell der Ratte gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass mittels der Gentherapie einige dieser Probleme gelöst werden können. Das Transgen hCAP18/LL37 konnte erfolgreich adenoviral transfiziert, das Propeptid offensichtlich durch Proteasen im Wundmillieue zum aktiven LL37 aktiviert und dadurch das Bakterienwachstum von Pseudomonas aeruginosa inhibiert werden. Synthetisch hergestelltes LL37 zeigte zwar bei einmaliger Applikation nach 48 Stunden ein ähnliches Ergebnis, konnte diesen Effekt aber nicht über den Zeitraum von 7 Tagen aufrechterhalten. Anders bei der Messgruppe mit dem Transgen hCAP18/LL37, die auch nach 7 Tagen noch eine deutliche Inhibierung zeigte. Auch die Leerviruskontrolle, in unserem Fall das antimikrobiell nicht wirksame Transgen lacZ, führte zu keiner vorteilhaften Veränderung für die infizierte Verbrennungswunde und zu annährend identischen Ergebnissen wie die Behandlung mit der reinen Trägerlösung PBS (Negativkontrolle). Zusätzlich wurde die Transfektion und Expression durch die Lokalisation mittels nicht-radioaktiver in situ Hybridisierung und einer quantitativen Bestimmung mittels real-time PCR belegt. Eine Reduktion oder etwaige komplette Beseitigung der Infektion konnte aber nicht bewiesen werden. Ob die Gentherapie als Applikationsmethode in dieser Form für das Host Defense Peptid hCAP18/LL37 durch Konzentrationsveränderungen oder Mehrfachapplikationen dieses Ziel erreichen kann und inwieweit andere Probleme, wie die Immunogenität oder die allgemeine Sicherheit des verwendeten Adenovirus, eine Rolle spielen, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. 84 F Literatur [1] (1990), The ADA human gene therapy clinical protocol, Hum Gene Ther, 1, (3), 327-62 [2] Agerberth, B., Charo, J., Werr, J., Olsson, B., Idali, F., Lindbom, L., Kiessling, R., Jornvall, H., Wigzell, H. and Gudmundsson, G. H., (2000), The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and alphadefensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations, Blood, 96, (9), 3086-93 [3] Agerberth, B., Gunne, H., Odeberg, J., Kogner, P., Boman, H. G. and Gudmundsson, G. H., (1995), FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, (1), 195-9 [4] Alekseev, A. A., Iakovlev, V. P. and Fedorov, V. D., (1999), [Infection in burn patients: the problems of pathogenesis, prevention and treatment], Khirurgiia (Mosk), (6), 4-9 [5] Alexander, J. W., (1990), Mechanism of immunologic suppression in burn injury, J Trauma, 30, (12 Suppl), S70-5 [6] Allgower, M., Schoenenberger, G. A. and Sparkes, B. G., (1995), Burning the largest immune organ, Burns, 21 Suppl 1, S7-47 [7] Anderson, R. D., Haskell, R. E., Xia, H., Roessler, B. J. and Davidson, B. L., (2000), A simple method for the rapid generation of recombinant adenovirus vectors, Gene Ther, 7, (12), 1034-8 [8] Anderson, W. F., (2001), Excitement in gene therapy!, Hum Gene Ther, 12, (12), 1483-4 [9] Anderson, W. F., Killos, L., Sanders-Haigh, L., Kretschmer, P. J. and Diacumakos, E. G., (1980), Replication and expression of thymidine kinase and human globin genes microinjected into mouse fibroblasts, Proc Natl Acad Sci U S A, 77, (9), 5399-403 [10] Andrews, J. L., Kadan, M. J., Gorziglia, M. I., Kaleko, M. and Connelly, S., (2001), Generation and characterization of E1/E2a/E3/E4-deficient adenoviral vectors encoding human factor VIII, Mol Ther, 3, (3), 329-36 [11] Arnberg, N., Edlund, K., Kidd, A. H. and Wadell, G., (2000), Adenovirus type 37 uses sialic acid as a cellular receptor., J Virol, 74, (1), 42-8 [12] Bals, R., (2000), [Antimicrobial peptides and peptide antibiotics], Med Klin (Munich), 95, (9), 496-502 85 [13] Bals, R., Lang, C., Weiner, D. J., Vogelmeier, C., Welsch, U. and Wilson, J. M., (2001), Rhesus monkey (Macaca mulatta) mucosal antimicrobial peptides are close homologues of human molecules, Clin Diagn Lab Immunol, 8, (2), 370-5 [14] Bals, R., Wang, X., Zasloff, M. and Wilson, J. M., (1998), The peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface, Proc Natl Acad Sci U S A, 95, (16), 9541-6 [15] Bals, R. and Wilson, J. M., (2003), Cathelicidins--a family of multifunctional antimicrobial peptides, Cell Mol Life Sci, 60, (4), 711-20 [16] Bangari, D. S. and Mittal, S. K., (2006), Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity, Curr Gene Ther, 6, (2), 215-26 [17] Beardsley, T., (2000), Gene therapy setback, Sci Am, 282, (2), 36-7 [18] Ben-Gary, H., McKinney, R. L., Rosengart, T., Lesser, M. L. and Crystal, R. G., (2002), Systemic interleukin-6 responses following administration of adenovirus gene transfer vectors to humans by different routes, Mol Ther, 6, (2), 287-97 [19] Bett, A. J., Haddara, W., Prevec, L. and Graham, F. L., (1994), An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, (19), 8802-6 [20] Bett, A. J., Prevec, L. and Graham, F. L., (1993), Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors, J Virol, 67, (10), 5911-21 [21] Beutler, B. and Cerami, A., (1988), Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator, Annu Rev Biochem, 57, 505-18 [22] Blaese, R. M., Culver, K. W., Miller, A. D., Carter, C. S., Fleisher, T., Clerici, M., Shearer, G., Chang, L., Chiang, Y., Tolstoshev, P. and et al., (1995), T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years, Science, 270, (5235), 475-80 [23] Blau, H. M. and Springer, M. L., (1995), Gene therapy--a novel form of drug delivery., N Engl J Med, 333, (18), 1204-7 [24] Boman, H. G., (1995), Peptide antibiotics and their role in innate immunity., Annu Rev Immunol, 13, 61-92 [25] Boman, H. G., (1991), Antibacterial peptides: key components needed in immunity, Cell, 65, (2), 205-7 86 [26] Braun-Falco, M. and Hallek, M., (1998), [Cutaneous gene therapy-perspectives of gene transfer in keratinocytes], Hautarzt, 49, (7), 536-44 [27] Breithaupt, H., (1999), The new antibiotics, Nat Biotechnol, 17, (12), 11659 [28] Burger, J. A., Baird, S. M., Powell, H. C., Sharma, S., Eling, D. J. and Kipps, T. J., (2000), Local and systemic effects after adenoviral transfer of the murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene into mice, Br J Haematol, 108, (3), 641-52 [29] Campbell, C., Hultman, S., Cairns, B., DeSerres, S. and Meyer, A., (2003), Green fluorescent protein-adenoviral construct as a model for transient gene therapy for human cultured keratinocytes in an athymic mouse model, J Trauma, 54, (1), 72-9; discussion 79-80 [30] Cavazzana-Calvo, M., Hacein-Bey, S., de Saint Basile, G., Gross, F., Yvon, E., Nusbaum, P., Selz, F., Hue, C., Certain, S., Casanova, J. L., Bousso, P., Deist, F. L. and Fischer, A., (2000), Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease, Science, 288, (5466), 669-72 [31] Cavazzana-Calvo, M., Hacein-Bey, S., de Saint-Basile, G., Le Deist, F. and Fischer, A., (2000), [Gene therapy of severe combined immunodeficiencies], Transfus Clin Biol, 7, (3), 259-60 [32] Chalekson, C. P., Neumeister, M. W. and Jaynes, J., (2003), Treatment of infected wounds with the antimicrobial peptide D2A21., J Trauma, 54, (4), 770-4 [33] Charlet, M., Chernysh, S., Philippe, H., Hetru, C., Hoffmann, J. A. and Bulet, P., (1996), Innate immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc, Mytilus edulis, J Biol Chem, 271, (36), 21808-13 [34] Chen, F. Y., Lee, M. T. and Huang, H. W., (2003), Evidence for membrane thinning effect as the mechanism for peptide-induced pore formation, Biophys J, 84, (6), 3751-8 [35] Chirmule, N., Propert, K., Magosin, S., Qian, Y., Qian, R. and Wilson, J., (1999), Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humans., Gene Ther, 6, (9), 1574-83 [36] Cole, A. M., Shi, J., Ceccarelli, A., Kim, Y. H., Park, A. and Ganz, T., (2001), Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds, Blood, 97, (1), 297-304 [37] Cook, N., (1998), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus versus the burn patient, Burns, 24, (2), 91-8 87 [38] Cowland, J. B., Johnsen, A. H. and Borregaard, N., (1995), hCAP-18, a cathelin/pro-bactenecin-like protein of human neutrophil specific granules, FEBS Lett, 368, (1), 173-6 [39] Dathe, M. and Wieprecht, T., (1999), Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells, Biochim Biophys Acta, 1462, (1-2), 71-87 [40] De Smet, K. and Contreras, R., (2005), Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins, Biotechnol Lett, 27, (18), 1337-47 [41] De, Y., Chen, Q., Schmidt, A. P., Anderson, G. M., Wang, J. M., Wooters, J., Oppenheim, J. J. and Chertov, O., (2000), LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells, J Exp Med, 192, (7), 1069-74 [42] Drexler, H. C., Risau, W. and Konerding, M. A., (2000), Inhibition of proteasome function induces programmed cell death in proliferating endothelial cells, Faseb J, 14, (1), 65-77 [43] Dunn, D. L., (1993), Use of novel therapeutic agents for the treatment of serious infection, Am J Surg, 166, (5), 449-55 [44] Elssner, A., Duncan, M., Gavrilin, M. and Wewers, M. D., (2004), A novel P2X7 receptor activator, the human cathelicidin-derived peptide LL37, induces IL-1 beta processing and release, J Immunol, 172, (8), 4987-94 [45] Enders, J. F., Bell, J. A., Dingle, J. H., Francis, T., Jr., Hilleman, M. R., Huebner, R. J. and Payne, A. M., (1956), Adenoviruses: group name proposed for new respiratory-tract viruses., Science, 124, (3212), 119-20 [46] Engelhardt, J. F., Ye, X., Doranz, B. and Wilson, J. M., (1994), Ablation of E2A in recombinant adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, (13), 6196-200 [47] Eriksson, E. and Velander, P., (2004), Gene transfer in wound healing, Br J Surg, 91, (9), 1093-4 [48] Estahbanati, H. K., Kashani, P. P. and Ghanaatpisheh, F., (2002), Frequency of Pseudomonas aeruginosa serotypes in burn wound infections and their resistance to antibiotics, Burns, 28, (4), 340-8 [49] Fearon, D. T. and Locksley, R. M., (1996), The instructive role of innate immunity in the acquired immune response., Science, 272, (5258), 50-3 [50] Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., (1983), A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity, Anal Biochem, 132, (1), 6-13 88 [51] Fenjves, E. S., (1994), Approaches to gene transfer in keratinocytes, J Invest Dermatol, 103, (5 Suppl), 70S-75S [52] Fischer, A., Hacein-Bey, S., Le Deist, F., Soudais, C., Di Santo, J. P., de Saint Basile, G. and Cavazzana-Calvo, M., (2000), Gene therapy of severe combined immunodeficiencies, Immunol Rev, 178, 13-20 [53] Fitzwater, J., Purdue, G. F., Hunt, J. L. and O'Keefe, G. E., (2003), The risk factors and time course of sepsis and organ dysfunction after burn trauma, J Trauma, 54, (5), 959-66 [54] Fortney, K., Totten, P. A., Lehrer, R. I. and Spinola, S. M., (1998), Haemophilus ducreyi is susceptible to protegrin, Antimicrob Agents Chemother, 42, (10), 2690-3 [55] Friedman, J. M. and Horwitz, M. S., (2002), Inhibition of tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappa B activation by the adenovirus E310.4/14.5K complex, J Virol, 76, (11), 5515-21 [56] Frohm, M., Agerberth, B., Ahangari, G., Stahle-Backdahl, M., Liden, S., Wigzell, H. and Gudmundsson, G. H., (1997), The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders, J Biol Chem, 272, (24), 15258-63 [57] Galeano, M., Deodato, B., Altavilla, D., Squadrito, G., Seminara, P., Marini, H., Stagno d'Alcontres, F., Colonna, M., Calo, M., Lo Cascio, P., Torre, V., Giacca, M., Venuti, F. S. and Squadrito, F., (2003), Effect of recombinant adeno-associated virus vector-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer on wound healing after burn injury, Crit Care Med, 31, (4), 1017-25 [58] Gallo, R. L. and Huttner, K. M., (1998), Antimicrobial peptides: an emerging concept in cutaneous biology, J Invest Dermatol, 111, (5), 73943 [59] Gallo, R. L., Ono, M., Povsic, T., Page, C., Eriksson, E., Klagsbrun, M. and Bernfield, M., (1994), Syndecans, cell surface heparan sulfate proteoglycans, are induced by a proline-rich antimicrobial peptide from wounds, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, (23), 11035-9 [60] Ganz, T. and Lehrer, R. I., (1999), Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications, Mol Med Today, 5, (7), 292-7 [61] Ganz, T. and Weiss, J., (1997), Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia, Semin Hematol, 34, (4), 343-54 [62] Gilpin, D. A., (1996), Calculation of a new Meeh constant and experimental determination of burn size., Burns, 22, (8), 607-11 89 [63] Ginsberg, H. S., Moldawer, L. L., Sehgal, P. B., Redington, M., Kilian, P. L., Chanock, R. M. and Prince, G. A., (1991), A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia, Proc Natl Acad Sci U S A, 88, (5), 1651-5 [64] Glauser, M. P., (2000), Pathophysiologic basis of sepsis: considerations for future strategies of intervention., Crit Care Med, 28, (9 Suppl), S4-8 [65] Gorecki, P., Schein, M., Rucinski, J. C. and Wise, L., (1999), Antibiotic administration in patients undergoing common surgical procedures in a community teaching hospital: the chaos continues, World J Surg, 23, (5), 429-32; discussion 433 [66] Gudmundsson, G. H., Agerberth, B., Odeberg, J., Bergman, T., Olsson, B. and Salcedo, R., (1996), The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes., Eur J Biochem, 238, (2), 325-32 [67] Gudmundsson, G. H., Magnusson, K. P., Chowdhary, B. P., Johansson, M., Andersson, L. and Boman, H. G., (1995), Structure of the gene for porcine peptide antibiotic PR-39, a cathelin gene family member: comparative mapping of the locus for the human peptide antibiotic FALL39, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, (15), 7085-9 [68] Gutsmann, T., Fix, M., Larrick, J. W. and Wiese, A., (2000), Mechanisms of action of rabbit CAP18 on monolayers and liposomes made from endotoxins or phospholipids, J Membr Biol, 176, (3), 223-36 [69] Gutsmann, T., Hagge, S. O., Larrick, J. W., Seydel, U. and Wiese, A., (2001), Interaction of CAP18-derived peptides with membranes made from endotoxins or phospholipids, Biophys J, 80, (6), 2935-45 [70] Gutsmann, T., Larrick, J. W., Seydel, U. and Wiese, A., (1999), Molecular mechanisms of interaction of rabbit CAP18 with outer membranes of gramnegative bacteria, Biochemistry, 38, (41), 13643-53 [71] Hancock, R. E., (1997), Peptide antibiotics, Lancet, 349, (9049), 418-22 [72] Hancock, R. E. and Lehrer, R., (1998), Cationic peptides: a new source of antibiotics, Trends Biotechnol, 16, (2), 82-8 [73] Hancock, R. E. and Sahl, H. G., (2006), Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies, Nat Biotechnol, 24, (12), 1551-7 [74] Hardy, P. H., Jr. and Levin, J., (1983), Lack of endotoxin in Borrelia hispanica and Treponema pallidum, Proc Soc Exp Biol Med, 174, (1), 4752 90 [75] Hase, K., Eckmann, L., Leopard, J. D., Varki, N. and Kagnoff, M. F., (2002), Cell differentiation is a key determinant of cathelicidin LL-37/human cationic antimicrobial protein 18 expression by human colon epithelium, Infect Immun, 70, (2), 953-63 [76] Heilborn, J. D., Nilsson, M. F., Kratz, G., Weber, G., Sorensen, O., Borregaard, N. and Stahle-Backdahl, M., (2003), The cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium, J Invest Dermatol, 120, (3), 379-89 [77] Hirsch, T., von Peter, S., Dubin, G., Mittler, D., Jacobsen, F., Lehnhardt, M., Eriksson, E., Steinau, H. U. and Steinstraesser, L., (2006), Adenoviral gene delivery to primary human cutaneous cells and burn wounds, Mol Med, 12, (9-10), 199-207 [78] Islam, D., Agerberth, bactericidal mechanism 180-5 [79] Jacobsen, F., Baraniskin, A., Mertens, J., Mittler, D., Mohammadi-Tabrisi, A., Schubert, S., Soltau, M., Lehnhardt, M., Behnke, B., Gatermann, S., Steinau, H. U. and Steinstraesser, L., (2005), Activity of histone H1.2 in infected burn wounds, J Antimicrob Chemother, 55, (5), 735-41 [80] Jacobsen, F., Hirsch, T., Mittler, D., Schulte, M., Lehnhardt, M., Druecke, D., Homann, H. H., Steinau, H. U. and Steinstraesser, L., (2005), Polybrene improves transfection efficacy of recombinant replicationdeficient adenovirus in cutaneous cells and burned skin, J Gene Med, [81] Jeschke, M. G., Barrow, R. E., Hawkins, H. K., Chrysopoulo, M. T., PerezPolo, J. R. and Herndon, D. N., (1999), Effect of multiple gene transfers of insulinlike growth factor I complementary DNA gene constructs in rats after thermal injury, Arch Surg, 134, (10), 1137-41 [82] Jeschke, M. G., Richter, G., Herndon, D. N., Geissler, E. K., Hartl, M., Hofstatter, F., Jauch, K. W. and Perez-Polo, J. R., (2001), Therapeutic success and efficacy of nonviral liposomal cDNA gene transfer to the skin in vivo is dose dependent, Gene Ther, 8, (23), 1777-84 [83] Johansson, J., Gudmundsson, G. H., Rottenberg, M. E., Berndt, K. D. and Agerberth, B., (1998), Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally occurring human peptide LL-37, J Biol Chem, 273, (6), 3718-24 [84] Jones, N. and Shenk, T., (1979), Isolation of adenovirus type 5 host range deletion mutants defective for transformation of rat embryo cells, Cell, 17, (3), 683-9 Bandholtz, L., Nilsson, J., Wigzell, H., Christensson, B., B. and Gudmundsson, G., (2001), Downregulation of peptides in enteric infections: a novel immune escape with bacterial DNA as a potential regulator, Nat Med, 7, (2), 91 [85] Kalfa, V. C., Jia, H. P., Kunkle, R. A., McCray, P. B., Jr., Tack, B. F. and Brogden, K. A., (2001), Congeners of SMAP29 kill ovine pathogens and induce ultrastructural damage in bacterial cells., Antimicrob Agents Chemother, 45, (11), 3256-61 [86] Khavari, P. A., (1997), Therapeutic gene delivery to the skin, Mol Med Today, 3, (12), 533-8 [87] Khavari, P. A. and Krueger, G. G., (1997), Cutaneous gene therapy, Dermatol Clin, 15, (1), 27-35 [88] Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K. and Chan, L., (2001), Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector, Proc Natl Acad Sci U S A, 98, (23), 13282-7 [89] Kochanek, S., Clemens, P. R., Mitani, K., Chen, H. H., Chan, S. and Caskey, C. T., (1996), A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both fulllength dystrophin and beta-galactosidase, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, (12), 5731-6 [90] Koczulla, A. R. and Bals, R., (2003), Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential, Drugs, 63, (4), 389-406 [91] Koczulla, R., von Degenfeld, G., Kupatt, C., Krotz, F., Zahler, S., Gloe, T., Issbrucker, K., Unterberger, P., Zaiou, M., Lebherz, C., Karl, A., Raake, P., Pfosser, A., Boekstegers, P., Welsch, U., Hiemstra, P. S., Vogelmeier, C., Gallo, R. L., Clauss, M. and Bals, R., (2003), An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18, J Clin Invest, 111, (11), 1665-72 [92] Kotin, R. M., Siniscalco, M., Samulski, R. J., Zhu, X. D., Hunter, L., Laughlin, C. A., McLaughlin, S., Muzyczka, N., Rocchi, M. and Berns, K. I., (1990), Site-specific integration by adeno-associated virus., Proc Natl Acad Sci U S A, 87, (6), 2211-5 [93] Lai, C. M., Lai, Y. K. and Rakoczy, P. E., (2002), Adenovirus and adenoassociated virus vectors, DNA Cell Biol, 21, (12), 895-913 [94] Larrick, J. W., Hirata, M., Balint, R. F., Lee, J., Zhong, J. and Wright, S. C., (1995), Human CAP18: a novel antimicrobial lipopolysaccharide-binding protein, Infect Immun, 63, (4), 1291-7 [95] Larrick, J. W., Hirata, M., Zheng, H., Zhong, J., Bolin, D., Cavaillon, J. M., Warren, H. S. and Wright, S. C., (1994), A novel granulocyte-derived peptide with lipopolysaccharide-neutralizing activity., J Immunol, 152, (1), 231-40 [96] Latham, P. W., (1999), Therapeutic peptides revisited, Nat Biotechnol, 17, (8), 755-7 92 [97] Lawrence, J. C., (1992), Burn bacteriology during the last 50 years, Burns, 18 Suppl 2, S23-9 [98] Lehrer, R., (2001), Shigellae control the Gates of LL, Nat Med, 7, (2), 1589 [99] Lehrer, R. I., Barton, A. and Ganz, T., (1988), Concurrent assessment of inner and outer membrane permeabilization and bacteriolysis in E. coli by multiple-wavelength spectrophotometry, J Immunol Methods, 108, (1-2), 153-8 [100] Lehrer, R. I. and Ganz, T., (1999), Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence, Curr Opin Immunol, 11, (1), 23-7 [101] Leiden, J. M., (1995), Gene therapy--promise, pitfalls, and prognosis, N Engl J Med, 333, (13), 871-3 [102] Lesokhin, A. M., Delgado-Lopez, F. and Horwitz, M. S., (2002), Inhibition of chemokine expression by adenovirus early region three (E3) genes., J Virol, 76, (16), 8236-43 [103] Levy, O., (2000), Antimicrobial proteins and peptides of blood: templates for novel antimicrobial agents, Blood, 96, (8), 2664-72 [104] Levy, O., (1996), Antibiotic proteins of polymorphonuclear leukocytes, Eur J Haematol, 56, (5), 263-77 [105] Li, E., Stupack, D. G., Brown, S. L., Klemke, R., Schlaepfer, D. D. and Nemerow, G. R., (2000), Association of p130CAS with phosphatidylinositol-3-OH kinase mediates adenovirus cell entry., J Biol Chem, 275, (19), 14729-35 [106] Li, Q., Guo, Y., Xuan, Y. T., Lowenstein, C. J., Stevenson, S. C., Prabhu, S. D., Wu, W. J., Zhu, Y. and Bolli, R., (2003), Gene therapy with inducible nitric oxide synthase protects against myocardial infarction via a cyclooxygenase-2-dependent mechanism, Circ Res, 92, (7), 741-8 [107] Lindberg, R. B., Moncrief, J. A., Switzer, W. E., Order, S. E. and Mills, W., Jr., (1965), The successful control of burn wound sepsis, J Trauma, 5, (5), 601-16 [108] Lusky, M., Christ, M., Rittner, K., Dieterle, A., Dreyer, D., Mourot, B., Schultz, H., Stoeckel, F., Pavirani, A. and Mehtali, M., (1998), In vitro and in vivo biology of recombinant adenovirus vectors with E1, E1/E2A, or E1/E4 deleted, J Virol, 72, (3), 2022-32 93 [109] Lysenko, E. S., Gould, J., Bals, R., Wilson, J. M. and Weiser, J. N., (2000), Bacterial phosphorylcholine decreases susceptibility to the antimicrobial peptide LL-37/hCAP18 expressed in the upper respiratory tract, Infect Immun, 68, (3), 1664-71 [110] Margolis, D. J., Bartus, C., Hoffstad, O., Malay, S. and Berlin, J. A., (2005), Effectiveness of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of diabetic neuropathic foot ulcers, Wound Repair Regen, 13, (6), 531-6 [111] Margolis, D. J., Crombleholme, T. and Herlyn, M., (2000), Clinical protocol: Phase I trial to evaluate the safety of H5.020CMV.PDGF-B for the treatment of a diabetic insensate foot ulcer, Wound Repair Regen, 8, (6), 480-93 [112] Marra, M. N., Wilde, C. G., Griffith, J. E., Snable, J. L. and Scott, R. W., (1990), Bactericidal/permeability-increasing protein has endotoxinneutralizing activity, J Immunol, 144, (2), 662-6 [113] Marshall, E., (1999), Gene therapy death prompts review of adenovirus vector, Science, 286, (5448), 2244-5 [114] McTaggart, S. and Al-Rubeai, M., (2002), Retroviral vectors for human gene delivery., Biotechnol Adv, 20, (1), 1-31 [115] Medzhitov, R. and Janeway, C., Jr., (2000), Innate immunity., N Engl J Med, 343, (5), 338-44 [116] Medzhitov, R. and Janeway, C. A., Jr., (1997), Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition, Cell, 91, (3), 295-8 [117] Medzhitov, R. and Janeway, C. A., Jr., (1998), An ancient system of host defense., Curr Opin Immunol, 10, (1), 12-5 [118] Michou, A. I., Santoro, L., Christ, M., Julliard, V., Pavirani, A. and Mehtali, M., (1997), Adenovirus-mediated gene transfer: influence of transgene, mouse strain and type of immune response on persistence of transgene expression, Gene Ther, 4, (5), 473-82 [119] Miller, A. D., (1992), Human gene therapy comes of age., Nature, 357, (6378), 455-60 [120] Milner, S. M. and Ortega, M. R., (1999), Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds., Burns, 25, (5), 411-3 [121] Mitani, K. and Kubo, S., (2002), Adenovirus as an integrating vector, Curr Gene Ther, 2, (2), 135-44 94 [122] Moldawer, L. L., Edwards, P. D., Josephs, M., Minter, R. M., Copeland, E. M., 3rd and MacKay, S. L., (1999), Application of gene therapy to acute inflammatory diseases, Shock, 12, (2), 83-101 [123] Molinier-Frenkel, V., Gahery-Segard, H., Mehtali, M., Le Boulaire, C., Ribault, S., Boulanger, P., Tursz, T., Guillet, J. G. and Farace, F., (2000), Immune response to recombinant adenovirus in humans: capsid components from viral input are targets for vector-specific cytotoxic T lymphocytes, J Virol, 74, (16), 7678-82 [124] Morgan, J. R., Barrandon, Y., Green, H. and Mulligan, R. C., (1987), Expression of an exogenous growth hormone gene by transplantable human epidermal cells, Science, 237, (4821), 1476-9 [125] Morgan, R. A. and Anderson, W. F., (1993), Human gene therapy., Annu Rev Biochem, 62, 191-217 [126] Morrison, D. C. and Ryan, J. L., (1987), Endotoxins and disease mechanisms, Annu Rev Med, 38, 417-32 [127] Mousa, H. A., (1997), Aerobic, anaerobic and fungal burn wound infections, J Hosp Infect, 37, (4), 317-23 [128] Mulligan, R. C., (1993), The basic science of gene therapy., Science, 260, (5110), 926-32 [129] Nadeau, I. and Kamen, A., (2003), Production of adenovirus vector for gene therapy, Biotechnol Adv, 20, (7-8), 475-89 [130] Nagaoka, I., Hirota, S., Niyonsaba, F., Hirata, M., Adachi, Y., Tamura, H., Tanaka, S. and Heumann, D., (2002), Augmentation of the lipopolysaccharide-neutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL37-derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues, Clin Diagn Lab Immunol, 9, (5), 972-82 [131] Nagoba, B. S., Gandhi, R. C., Wadher, B. J., Deshmukh, S. R. and Gandhi, S. P., (1998), Citric acid treatment of severe electric burns complicated by multiple antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa, Burns, 24, (5), 481-3 [132] Nasz, I. and Adam, E., (2001), Recombinant adenovirus vectors for gene therapy and clinical trials, Acta Microbiol Immunol Hung, 48, (3-4), 323-48 [133] Nemerow, G. R., (2000), Cell receptors involved in adenovirus entry, Virology, 274, (1), 1-4 [134] Ng, P., Beauchamp, C., Evelegh, C., Parks, R. and Graham, F. L., (2001), Development of a FLP/frt system for generating helper-dependent adenoviral vectors., Mol Ther, 3, (5 Pt 1), 809-15 95 [135] Nirenberg, M., (1967), Will Society Be Prepared?, Science, 157 New Series, (No. 3789), 633 [136] O'Neal, W. K., Zhou, H., Morral, N., Langston, C., Parks, R. J., Graham, F. L., Kochanek, S. and Beaudet, A. L., (2000), Toxicity associated with repeated administration of first-generation adenovirus vectors does not occur with a helper-dependent vector, Mol Med, 6, (3), 179-95 [137] Oren, Z., Lerman, J. C., Gudmundsson, G. H., Agerberth, B. and Shai, Y., (1999), Structure and organization of the human antimicrobial peptide LL37 in phospholipid membranes: relevance to the molecular basis for its non-cell-selective activity, Biochem J, 341 ( Pt 3), 501-13 [138] Ortega, M. R., Ganz, T. and Milner, S. M., (2000), Human beta defensin is absent in burn blister fluid, Burns, 26, (8), 724-6 [139] Panyutich, A., Shi, J., Boutz, P. L., Zhao, C. and Ganz, T., (1997), Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins, Infect Immun, 65, (3), 978-85 [140] Parks, R. J., Chen, L., Anton, M., Sankar, U., Rudnicki, M. A. and Graham, F. L., (1996), A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, (24), 13565-70 [141] Parrillo, J. E., (1993), Pathogenetic mechanisms of septic shock., N Engl J Med, 328, (20), 1471-7 [142] Peschel, A., (2002), How do bacteria resist human antimicrobial peptides?, Trends Microbiol, 10, (4), 179-86 [143] Petrie, N. C., Yao, F. and Eriksson, E., (2003), Gene therapy in wound healing, Surg Clin North Am, 83, (3), 597-616, vii [144] Prasanna, M. and Thomas, C., (1998), A profile of methicillin resistant Staphylococcus aureus infection in the burn center of the Sultanate of Oman, Burns, 24, (7), 631-6 [145] Pruitt, B. A., Jr., McManus, A. T., Kim, S. H. and Goodwin, C. W., (1998), Burn wound infections: current status, World J Surg, 22, (2), 135-45 [146] Ramanathan, B., Davis, E. G., Ross, C. R. and Blecha, F., (2002), Cathelicidins: microbicidal activity, mechanisms of action, and roles in innate immunity, Microbes Infect, 4, (3), 361-72 [147] Robbins, P. D. and Ghivizzani, S. C., (1998), Viral vectors for gene therapy., Pharmacol Ther, 80, (1), 35-47 96 [148] Roelvink, P. W., Mi Lee, G., Einfeld, D. A., Kovesdi, I. and Wickham, T. J., (1999), Identification of a conserved receptor-binding site on the fiber proteins of CAR-recognizing adenoviridae., Science, 286, (5444), 1568-71 [149] Saiman, L., Tabibi, S., Starner, T. D., San Gabriel, P., Winokur, P. L., Jia, H. P., McCray, P. B., Jr. and Tack, B. F., (2001), Cathelicidin peptides inhibit multiply antibiotic-resistant pathogens from patients with cystic fibrosis, Antimicrob Agents Chemother, 45, (10), 2838-44 [150] Salyapongse, A. N., Billiar, T. R. and Edington, H., (1999), Gene therapy and tissue engineering, Clin Plast Surg, 26, (4), 663-76, x [151] Sambri, V., Marangoni, A., Giacani, L., Gennaro, R., Murgia, R., Cevenini, R. and Cinco, M., (2002), Comparative in vitro activity of five cathelicidinderived synthetic peptides against Leptospira, Borrelia and Treponema pallidum, J Antimicrob Chemother, 50, (6), 895-902 [152] Scocchi, M., Skerlavaj, B., Romeo, D. and Gennaro, R., (1992), Proteolytic cleavage by neutrophil elastase converts inactive storage proforms to antibacterial bactenecins, Eur J Biochem, 209, (2), 589-95 [153] Scott, M. G., Gold, M. R. and Hancock, R. E., (1999), Interaction of cationic peptides with lipoteichoic acid and gram-positive bacteria, Infect Immun, 67, (12), 6445-53 [154] Scott, M. G., Vreugdenhil, A. C., Buurman, W. A., Hancock, R. E. and Gold, M. R., (2000), Cutting edge: cationic antimicrobial peptides block the binding of lipopolysaccharide (LPS) to LPS binding protein, J Immunol, 164, (2), 549-53 [155] Setoguchi, Y., Jaffe, H. A., Danel, C. and Crystal, R. G., (1994), Ex vivo and in vivo gene transfer to the skin using replication-deficient recombinant adenovirus vectors, J Invest Dermatol, 102, (4), 415-21 [156] Shafer, W. M., Qu, X., Waring, A. J. and Lehrer, R. I., (1998), Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family, Proc Natl Acad Sci U S A, 95, (4), 1829-33 [157] Shi, J. and Ganz, T., (1998), The role of protegrins and other elastaseactivated polypeptides in the bactericidal properties of porcine inflammatory fluids, Infect Immun, 66, (8), 3611-7 [158] Singer, A. J. and Clark, R. A., (1999), Cutaneous wound healing, N Engl J Med, 341, (10), 738-46 [159] Sorensen, O., Arnljots, K., Cowland, J. B., Bainton, D. F. and Borregaard, N., (1997), The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils, Blood, 90, (7), 2796-803 97 [160] Sorensen, O., Bratt, T., Johnsen, A. H., Madsen, M. T. and Borregaard, N., (1999), The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is bound to lipoproteins in plasma, J Biol Chem, 274, (32), 22445-51 [161] Sorensen, O. E., Follin, P., Johnsen, A. H., Calafat, J., Tjabringa, G. S., Hiemstra, P. S. and Borregaard, N., (2001), Human cathelicidin, hCAP-18, is processed to the antimicrobial peptide LL-37 by extracellular cleavage with proteinase 3, Blood, 97, (12), 3951-9 [162] Steinberg, D. A., Hurst, M. A., Fujii, C. A., Kung, A. H., Ho, J. F., Cheng, F. C., Loury, D. J. and Fiddes, J. C., (1997), Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide with in vivo activity, Antimicrob Agents Chemother, 41, (8), 1738-42 [163] Steinstraesser, L., Fohn, M., Klein, R. D., Aminlari, A., Remick, D. G., Su, G. L. and Wang, S. C., (2001), Feasibility of biolistic gene therapy in burns, Shock, 15, (4), 272-7 [164] Steinstraesser, L., Klein, R. D., Aminlari, A., Fan, M. H., Khilanani, V., Remick, D. G., Su, G. L. and Wang, S. C., (2001), Protegrin-1 enhances bacterial killing in thermally injured skin, Crit Care Med, 29, (7), 1431-7 [165] Steinstraesser, L., Oezdogan, Y., Wang, S. C. and Steinau, H. U., (2004), Host defense peptides in burns, Burns, 30, (7), 619-27 [166] Steinstraesser, L., Tack, B. F., Waring, A. J., Hong, T., Boo, L. M., Fan, M. H., Remick, D. I., Su, G. L., Lehrer, R. I. and Wang, S. C., (2002), Activity of novispirin G10 against Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns, Antimicrob Agents Chemother, 46, (6), 1837-44 [167] Sylvester, K. G., Nesbit, M., Radu, A., Herlyn, M., Adzick, N. S. and Crombleholme, T. M., (2000), Adenoviral-mediated gene transfer in wound healing: acute inflammatory response in human skin in the SCID mouse model, Wound Repair Regen, 8, (1), 36-44 [168] Takayama, K., Rothenberg, R. J. and Barbour, A. G., (1987), Absence of lipopolysaccharide in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, Infect Immun, 55, (9), 2311-3 [169] Tauber, A. I. and Chernyak, L., (1989), The birth of immunology. II. Metchnikoff and his critics, Cell Immunol, 121, (2), 447-73 [170] Thomas, C. E., Ehrhardt, A. and Kay, M. A., (2003), Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy, Nat Rev Genet, 4, (5), 346-58 98 [171] Tratschin, J. D., West, M. H., Sandbank, T. and Carter, B. J., (1984), A human parvovirus, adeno-associated virus, as a eucaryotic vector: transient expression and encapsidation of the procaryotic gene for chloramphenicol acetyltransferase, Mol Cell Biol, 4, (10), 2072-81 [172] Travis, S. M., Anderson, N. N., Forsyth, W. R., Espiritu, C., Conway, B. D., Greenberg, E. P., McCray, P. B., Jr., Lehrer, R. I., Welsh, M. J. and Tack, B. F., (2000), Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides, Infect Immun, 68, (5), 2748-55 [173] Turner, J., Cho, Y., Dinh, N. N., Waring, A. J. and Lehrer, R. I., (1998), Activities of LL-37, a cathelin-associated antimicrobial peptide of human neutrophils, Antimicrob Agents Chemother, 42, (9), 2206-14 [174] Valentine, R. C. and Pereira, H. G., (2003), Antigens and structure of the adenovirus. Reprinted from J. Mol. Biol. 1965; 13: 13-20, Rev Med Virol, 13, (2), 71-82; discussion 80-3 [175] van Raaij, M. J., Mitraki, A., Lavigne, G. and Cusack, S., (1999), A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif for a fibrous protein., Nature, 401, (6756), 935-8 [176] van 't Hof, W., Veerman, E. C., Helmerhorst, E. J. and Amerongen, A. V., (2001), Antimicrobial peptides: properties and applicability., Biol Chem, 382, (4), 597-619 [177] Veelken, H., Jesuiter, H., Mackensen, A., Kulmburg, P., Schultze, J., Rosenthal, F., Mertelsmann, R. and Lindemann, A., (1994), Primary fibroblasts from human adults as target cells for ex vivo transfection and gene therapy, Hum Gene Ther, 5, (10), 1203-10 [178] Walker, H. L. and Mason, A. D., Jr., (1968), A standard animal burn, J Trauma, 8, (6), 1049-51 [179] Wen, S., Driscoll, R. M., Schneider, D. B. and Dichek, D. A., (2001), Inclusion of the E3 region in an adenoviral vector decreases inflammation and neointima formation after arterial gene transfer, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21, (11), 1777-82 [180] Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L. S., Pellicer, A., Cheng, Y. and Axel, R., (1977), Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells, Cell, 11, (1), 223-32 [181] Wu, M., Maier, E., Benz, R. and Hancock, R. E., (1999), Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli, Biochemistry, 38, (22), 7235-42 99 [182] Yang, D., Biragyn, A., Hoover, D. M., Lubkowski, J. and Oppenheim, J. J., (2004), Multiple Roles of Antimicrobial Defensins, Cathelicidins, and Eosinophil-Derived Neurotoxin in Host Defense.*, Annu Rev Immunol, 22, 181-215 [183] Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C. and Wilson, J. M., (1995), Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses, J Virol, 69, (4), 2004-15 [184] Yang, Y., Nunes, F. A., Berencsi, K., Furth, E. E., Gonczol, E. and Wilson, J. M., (1994), Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy., Proc Natl Acad Sci U S A, 91, (10), 440711 [185] Yant, S. R., Ehrhardt, A., Mikkelsen, J. G., Meuse, L., Pham, T. and Kay, M. A., (2002), Transposition from a gutless adeno-transposon vector stabilizes transgene expression in vivo, Nat Biotechnol, 20, (10), 999-1005 [186] Yao, F. and Eriksson, E., (2000), Gene therapy in wound repair and regeneration, Wound Repair Regen, 8, (6), 443-51 [187] Zasloff, M., (1992), Antibiotic peptides as mediators of innate immunity, Curr Opin Immunol, 4, (1), 3-7 [188] Zhang, L. and Falla, T. J., (2006), Antimicrobial peptides: therapeutic potential, Expert Opin Pharmacother, 7, (6), 653-63 [189] Zhang, L., Scott, M. G., Yan, H., Mayer, L. D. and Hancock, R. E., (2000), Interaction of polyphemusin I and structural analogs with bacterial membranes, lipopolysaccharide, and lipid monolayers, Biochemistry, 39, (47), 14504-14 100 G Anhang Danksagung Herrn Professor Dr. Lars Steinsträßer für seine hartnäckige und intensive Betreuung während sämtlicher Phasen dieser Arbeit und seine persönliche Unterstützung weit über die Grenzen des wissenschaftlichen Arbeitens hinaus. Herrn Professor Dr. H.-U. Steinau für das Vertrauen und die Möglichkeit an seiner Klinik wissenschaftlich Arbeiten zu können. Herrn Dr. Frank Jacobsen für seine Unterstützung mit fachlichem Rat und praktischer Hilfe während der theoretischen und praktischen Phasen dieser Arbeit. Herrn Dr. Tobias Hirsch für das geduldige Anlernen und die Weitergabe von Wissen in der Anfangszeit im Labor. Für sein Vertrauen, seine Zuverlässigkeit und die vielen unvergesslichen Stunden und die daraus resultierende Freundschaft. Frau Andrea Rittig danke ich besonders für Ihre kontinuierliche Unterstützung während des gesamten Projekts. Sie hat mir mit unermesslichem Fleiß bei großen und kleinen Problemen immer wieder weitergeholfen. Gesamte Arbeitsgruppe für Ihre Hilfe bei der Versuchsdurchführung. Frau Sabine Böhm und Kerstin Schmitz, BGFA, Abteilung für Zellbiologie für Ihre Hilfe bei der in situ Hybridisierung. Frau Nicole Stuyts für Ihre geduldige Unterstützung während der schriftlichen Niederlegung. Ich liebe Dich mein Schatz. Meinem Bruder Tobias Mittler für seine technische Unterstützung und seine unendliche Geduld mit mir, speziell bei Computerproblemen. 101 Mein ganz spezieller Dank gilt meinen Eltern, Rosemarie und Paul Mittler, für Ihr Vertrauen in mich, Ihre liebevolle und geduldige Begleitung durch alle Höhen und Tiefen der letzten Jahre und für die Möglichkeit mir meinen Wunsch, Arzt zu werden, erfüllen zu können. Ich danke Euch für Euere weitsichtige Einstellung, Euere Vorbildfunktion und dass Ihr immer an mich glaubt. Finanzielle Förderung Diese Arbeit wurde von folgenden Institutionen und Organisationen unterstützt: • Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG STE 1099), • Alma Vogelsang Stiftung, Bochum • Wissenschaftskommission der BG-Kliniken Bergmannsheil, Bochum 102 Lebenslauf Dominik Mittler * 04.07.1976 in Köln, Deutschland Schulische Ausbildung Juni 1996 Allgemeine Hochschulreife Montessori Schule Köln Bickendorf Studium Oktober 1997 bis Mai 2005 Studium der Humanmedizin an der Ruhr – Universität Bochum September 1999 Ärztliche Vorprüfung September 2000 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung März 2003 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung April 2005 Dritter Abschnitt der ärztlichen Brüfung Mai 2005 Approbation als Arzt Forschung und Promotion Seit März 2002 Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Professor Dr. med. Lars Steinsträßer. Berufserfahrung Seit Juni 2005 Assistenzarzt für Anästhesie und Intensivmedizin im Evangelischen Krankenhaus Hattingen Promotionsstipendium Stipendiat der Heinrich und Alma Vogelsang Stiftung 103 Liste der Veröffentlichungen und Vorträge Orginalarbeiten in Medline gelisteten Zeitschriften Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Hirsch T, Mittler D, Lehnhardt M, Adrien Daigeler, Kristensen HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimicrobial activity of Novispirin G10 in infected full thickness wounds of porcine skin. Journal of Antimicrobial Chemeotherapy, 2007 Mar;59(3):493-8. Epub 2007 Feb 8 Hirsch T, Peter v S, Dubin G, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Eriksson E, Steinau HU, Steinstraesser L: Adenoviral gene delivery in primary human cutaneous cells and burn wounds. Molecular Medicine Impact 2004: 3,576 Steinstraesser L, Vrancxx Y, Mohammadi-Tabrisi A, Jacobsen J, Mittler D, Lehnhard M, Kuhnen C, Steinau HU, Ericsson E: BO-Chamber® - Model to investigate infected cutaneous wounds in pigs. Comparative Medicine 2006 Aug;56(4):279-85 Jacobsen F, Hirsch T, Mittler D, Schulte M, Lehnhardt M, Druecke D, Homann HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Polybrene improves transfection efficacy of recombinant replication deficient adenovirus in cutaneous cells and burned skin, J Gene Med. 2006 Feb;8(2):138-46. 2005 Nov 16; Impact 2004: 3,224 Jacobsen F, Mittler D, Hirsch T, Gerhards A, Lehnhardt M, Steinau HU; Steinstraesser L: Transient cutaneous adenoviral gene therapy with hCAP18/ LL37 is effective for the treatment of burn wound infections. Gene Therapy. 12(20):1494-1502, October 2005. ISSN 0969-7128. Impact 2004: 4,977 Jacobsen F, Baraniskin A, Mertens J, Mittler D, Mohamadi-Tabresi A, Schubert S, Soltau M, Behnke B, Gatermann S, Steinau HU, Steinstraesser L: Activity of Histone H1.2 in infected burn wounds. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55(5):735-741, May 2005. ISSN: 0305-7453. Impact 2004: 3,611 104 Steinstraesser L, Hirsch T, Beller J, Mittler D, Sorkin M, Pazdierny G, Jacobsen F, Langer S, Eriksson E, and Steinau HU: Transient non-viral gene delivery in burn wounds. (J Gene Medicine, 2007, Aug 31) Gedruckte Abstracts in Medline-gelisteten Zeitschriften Hermann S, Steinstraesser L, May PS, Beller J, Mittler D, Hirsch T, Steinau HU, Druecke D: Biologisch abbaubare Implantate zur Auffüllung von Weichgewebsdefekten. Konressband 2003, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, ISBN 3540200029), 440-441 Steinstraesser L, Beller J, Hirsch T, Pazdzierny G, Mittler D, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Transient cutaneous gene transfer in burns with liposomes or „naked“ DNA, Langenbeck’s Archives of Surgery Vol 387 (5-6) Oct 2002, S265, A-148 Gedruckte Abstracts in nicht-Medline gelisteten Zeitschriften Sorkin M, Mittler D, Jacobsen F, Gerhards A, Mertens-Rill J, Steinau HU, Steinstraesser L: Cutaneous adenoviral gene therapy with human host defense peptide LL37 in infected burn wound of the rat. 51st Plastic Surgery Research Council, Dana Point CA, 17-20.5.2006 Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau, HU, Steinstraesser L: Feasibility of Adenoviral Gene Delivery in Unburned and Burned Skin. American Society of Plastic Surgery (ASPS), Philadelphia (USA) 9 - 13.10.2004 Jacobsen F, Baraniskin A, Mertens J, Mittler D, Mohammadi-Tabresi A, Schubert S, Soltau M, Behnke B, Gatermann S, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimikrobielle Aktivität von humanem Histon H1.2 im infizierten Verbrennungsmodell. 35. Jahrestagung der Vereinigung der Plastischen Chirurgen (VDPC), Düsseldorf, 22 - 25.10.2004 ISBN 3-937678-02-6 105 Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Schulte M, Druecke D, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Transienter adenoviraler Gentransfer in Verbrennungswunden –eine Studie am Tiermodell. 35. Jahrestagung der Vereinigung der Plastischen Chirurgen (VDPC), Düsseldorf, 22 - 25.10.2004 Steinstraesser L, Mittler D, Hirsch T, Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Lehnhardt M, Druecke D, Homann HH, Steinau HU: Adenoviral Delivery of Human Cathelicidin LL37 Reduces Bacterial Counts in Infected Burn Wounds. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Mittler D, Renoulet Y, Gerhards A, Lehnhardt M, Druecke D, Christensen HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Designer host defense peptide P-Novispirin G10 reduces bacterial counts in the infected porcine BO-chamber . 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Jacobsen F, Baraniskin A, Lehnhardt M, Druecke D, Mittler D, MohammadiTabrisi A, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Mohammadi-Tabrisi A, Jacobsen F, Mittler D, Renoulet Y, Druecke D, Ericsson E, Steinau HU, Steinstraesser L: BO-Chamber - infected titanium wound chamber model. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Jacobsen F, Hirsch T, Mittler D, von Peter S, Lehnhardt M, Drücke D, Homann HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Cationic Lipids Improve Transfection Efficacy of Recombinant Replication Deficient Adenovirus in Cutaneous Cells. 7th Annual Meeting American Society of Gene Therapy (ASGT), Minneapolis (USA), June 2 6, 2004 106 Branisikin A, Jacobsen F, Lehnhardt M, Mertens J, Mittler D, MohammadiTabresi A, Soltau A, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. Plastic Surgery Research Council, 49th Annual Meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, USA, 9 - 6.06.2004 Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau HU, Steinstraesser L: Feasibility of adenoviral gene delivery in unburned and burned skin. Plastic Surgery Research Council, 49th Annual Meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, USA, 9 - 6.06.2004 Jacobsen F, Mohammadi-Tabresi A, Mittler D, Renoulet Y, Lehnhardt M, Druecke D, Christensen HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Designer host defense peptide P-Novispirin G10 reduces bacterial counts in the infected BO chamber. Plastic Surgery Research Council, 49th Annual Meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, USA, 9 - 6.06.2004 Tabresi M, Jacobsen F, Mittler D, Druecke D, Setinau HU, Steinstraesser L: Titanium Wundkammermodell am Schwein. 34 Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) und 8. Jahrestagung der DGÄPC, Freiburg 30 Sept – 5 Okt 2003 Hirsch T, Jacobsen F, Mertens J, Mittler D, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Die adenovirale Transfektionseffizienz in kutanen Epithelzellen wird durch Zusatz von Liposomen gesteigert. 34 Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) und 8. Jahrestagung der DGÄPC, Freiburg 30 Sept. – 5 Okt 2003 Steinstraesser L, Hirsch T, Mittler D, Peter S, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Genetransfer in unburned and burned skin using different transfection agents or naked DNA. 10th Congress European Burn Association, Bergen, Norway, September 2003 107 Pazdzierny G, Steinstraesser L, May P, Beller J, Mittler D, Hirsch T, Steinau HU: Biologisch abbaubare Implantate zur Auffüllung von Weichgewebsdefekten. 120. Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4. - 2.5.2003 in München Hermann S, Steinstraesser L, May PS, Beller J, Mittler D, Hirsch T, Steinau HU, Druecke D: Biologisch abbaubare Implantate zur Auffüllung von Weichgewebsdefekten. 120. Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4. - 2.5.2003 in München Steinstraesser L, Beller J, Hirsch T, Pazdzierny G, Mittler D, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Transient cutaneous gene transfer in burns with liposomes or „naked“ DNA, 11. Chirurgische Forschungstage, 27 - 29.11.2002 Universität Köln Steinstraesser L, Beller J, Hirsch T, Pazdzierny G, Mittler D, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Kutaner Gentransfer in Verbrennungswunden mit Liposomen oder “Nackter” DNA 9. Jahrestagung der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Gentherapie, 7 - 9.11.2002 Schloss Reisensburg bei Günzburg Vorträge auf wissenschaftlichen Kongressen Sorkin, M; Mittler, D; Jacobsen, F; Gerhards, A; Mertens-Rill, J; Steinau, HU; Steinstraesser, L: Cutaneous adeniviral gene therapy with human host defense peptide LL37 in infected burn wounds of the rat. Plastic Surgery Research Council 51st Annual Meeting. Dana Point CA May 17 - 20, 2006 Jacobsen F, Baraniskin A, Mertens J, Mittler D, Mohammadi-Tabresi A, Schubert S, Soltau M, Behnke B, Gatermann S, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimikrobielle Aktivität von humanem Histon H1.2 im infizierten Verbrennungsmodell. 35. Jahrestagung der Vereinigung der Plastischen Chirurgen (VDPC), Düsseldorf, 22 - 25.10.2004 108 Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Schulte M, Druecke D, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Transienter adenoviraler Gentransfer in Verbrennungswunden –eine Studie am Tiermodell. 35. Jahrestagung der Vereinigung der Plastischen Chirurgen (VDPC), Düsseldorf, 22 - 25.10.2004 Steinstraesser L, Mittler D, Hirsch T, Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Lehnhardt M, Druecke D, Homann HH, Steinau HU: Adenoviral Delivery of Human Cathelicidin LL37 Reduces Bacterial Counts in Infected Burn Wounds. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Mittler D, Renoulet Y, Gerhards A, Lehnhardt M, Druecke D, Christensen HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Designer host defense peptide P-Novispirin G10 reduces bacterial counts in the infected porcine BO-chamber. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Jacobsen F, Baraniskin A, Lehnhardt M, Druecke D, Mittler D, MohammadiTabrisi A, Steinau HU, Steinstraesser L: Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Mohammadi-Tabrisi A, Jacobsen F, Mittler D, Renoulet Y, Druecke D, Ericsson E, Steinau HU, Steinstraesser L: BO-Chamber - infected titanium wound chamber model. 2nd World Union of Wound Healing Societies Meeting, Paris, 8 - 13 July 2004 Mittler D, Hirsch T, Jacobsen F, Mohammadi-Tabrisi A, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU; Steinstraesser L: Adenoviral Delivery of Human Cathelicidin LL37 Reduces Bacterial Counts In Infected Burn Wounds. 49. Jahrestagung der Plastic Surgery Research Council, Ann Arbor, Michigan, 6 - 12. Juni 2004 109 Jacobsen F, Hirsch T, Mittler D, von Peter S, Lehnhardt M, Drücke D, Homann HH, Steinau HU, Steinstraesser L: Cationic Lipids Improve Transfection Efficacy of Recombinant Replication Deficient Adenovirus in Cutaneous Cells. 7th Annual Meeting American Society of Gene Therapy (ASGT), Minneapolis (USA), June 2 6, 2004 von Peter S, Steinstraesser L, Mittler D, Mertens J, Druecke D, Steinau HU: Adenoviraler Gentransfer von Reportergenkonstrukten in humane Keratinozyten und Fibroblasten. 120 Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4 2.5.2003 in München Pazdzierny G, Steinstraesser L, May P, Beller J, Mittler D, Hirsch T, Steinau HU: Biologisch abbaubare Implantate zur Auffüllung von Weichgewebsdefekten. 120 Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4. - 2.5.2003 in München. Steinstraesser L, Beller J, Hirsch T, Pazdzierny G, Mittler D, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Transient cutaneous gene transfer in burns with liposomes or „naked“ DNA, 11. Chirurgische Forschungstage, 27 - 29.11.2002 Universität Köln Steinstraesser L, Beller J, Hirsch T, Pazdzierny G, Mittler D, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Kutaner Gentransfer in Verbrennungswunden mit Liposomen oder “Nackter” DNA 9. Jahrestagung der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Gentherapie, 7 - 9.11.2002 Schloss Reisensburg bei Günzburg Poster auf wissenschaftlichen Kongressen Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau, HU, Steinstraesser L: Feasibility of Adenoviral Gene Delivery in Unburned and Burned Skin. American Society of Plastic Surgery (ASPS), Philadelphia (USA) 9 - 13.10.2004 110 Mittler D, Hirsch T, Jacobsen F, Tabrisi A, Steinau HU, Steinstraesser L: Adenoviral delivery of human cathelicidin LL37 reduces bacterial counts in infected burn wounds. Plastic Surgery Research Council, Ann Arbor, Michigan (USA), June 9 - 12, 2004 A. Baraniskin, F. Jacobsen, J. Mertens, D. Mittler, A. Mohammadi-Tabrisi, S. Schubert, M. Soltau, B. Behnke, S. Gatermann, M. Lehnhardt, H. U. Steinau, L. Steinstraesser: Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. Plastic Surgery Research Council, Ann Arbor, Michigan (USA), June 9 - 12, 2004 Jacobsen F, Mohammadi-Tabresi A, Mittler D, Renoulet Y, Lehnhardt M, Druecke D, Christensen HH, Steinau HU: Designer host defense peptide PNovispirin G10 reduces bacterial counts in the infected porcine BO-chamber. Plastic Surgery Research Council, Ann Arbor, Michigan (USA), June 9 - 12, 2004 Baraniskin A, Jacobsen F, Lehnhardt M, Mertens J, Mittler D, Mohammadi Tabresi A, Soltau A, Steinau HU, Steinstraesser L: BO-Chamber - infected titanium wound chamber model. Plastic Surgery Research Council, Ann Arbor, Michigan (USA), June 9 - 12, 2004 Jacobsen F, Hirsch T, Mittler D, von Peter S, Steinau HU, Steinstraesser L: Cationic Lipids Improve Transfection Efficacy of Recombinant Replication Deficient Adenovirus in Cutaneous Cells. 7th Annual Meeting American Society of Gene Therapy (ASGT), Minneapolis (USA), June 2 - 6, 2004 Tabresi M, Jacobsen F, Mittler D, Druecke D, Setinau HU, Steinstraesser L: Titanium Wundkammermodell am Schwein. 34 Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC), Freiburg 30 Sept. – 5 Okt 2003 111 Hirsch T, Jacobsen F, mertens J, Mittler D, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L: Die adenovirale Transfektionseffizienz in kutanen Epithelzellen wird durch Zusatz von Liposomen gesteigert. 34 Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC), Freiburg 30 Sept. – 5 Okt 2003 Steinstraesser L, Hirsch T, Mittler D, Peter S, Lehnhardt M, Druecke D, Steinau HU: Genetransfer in unburned and burned skin using different transfection agents or naked DNA. 10th Congress European Burn Association, Bergen, Norway, September 2003 112
