Transienter Adenoviraler Gentransfer mit hCAP18/LL37 in infizierten

Inhaltsverzeichnis:
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN ............................................................................. 5
VERZEICHNIS DER TABELLEN .................................................................................... 8
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN .............................................................................. 9
A EINLEITUNG ................................................................................................ 10
1 PROBLEMATIK VERBRENNUNGEN ......................................................................... 10
2 IMMUNSYSTEM .................................................................................................... 13
2.1 HOST DEFENSE PEPTIDE (HDP) ....................................................................... 14
2.2 MIKROBIZIDE WIRKUNG VON HOST DEFENSE PEPTIDEN ...................................... 16
2.3 HOST DEFENSE PEPTIDE - THERAPIE BEI VERBRENNUNGEN ................................ 17
2.4 HERSTELLUNG UND KOMMERZIELLE ENTWICKLUNG VON HOST DEFENSE PEPTIDEN
............................................................................................................................ 18
3 GENTHERAPIE ALS ALTERNATIVE MEDIKAMENTENAPPLIKATION.............................. 20
3.1 GENTHERAPIE DER HAUT .................................................................................. 21
3.2 METHODEN DES GENTRANSFERS, VOR- UND NACHTEILE..................................... 22
3.3 VIRALE VEKTOREN ........................................................................................... 22
3.4 ADENOVIREN UND ADENOVIRALE VEKTOREN ...................................................... 23
4 DAS TRANSGEN HCAP18/LL37 .......................................................................... 26
4.1 STRUKTUR UND EXPRESSION DES HCAP18/LL37 .............................................. 27
4.2 WIRKUNG VON HCAP18/LL37 .......................................................................... 30
4.3 RESISTENZMECHANISMEN ................................................................................. 31
4.3 WEITERE EIGENSCHAFTEN VON HCAP18/LL37 ................................................. 32
5 AUFBAU DER STUDIE UND ZIEL DIESER ARBEIT ..................................................... 33
B MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 34
1 MATERIALIEN ..................................................................................................... 34
1.1 CHEMIKALIEN UND MEDIEN ............................................................................... 34
1.2 MEDIKAMENTE, DESINFEKTIONSMITTEL & VERBANDSMATERIALIEN ....................... 35
1.3 ZELLEN ........................................................................................................... 35
1.4 ADENOVIRALER VEKTOR ................................................................................... 35
1.5 BAKTERIEN ...................................................................................................... 36
1.6 TIERE ............................................................................................................. 36
1.7 SYNTHETISCHES HOST DEFENSE PEPTID LL37 .................................................. 36
1.8 AGARPLATTEN, MEDIENGEMISCHE, PUFFER-, TRÄGERLÖSUNGEN UND GRADIENTEN
............................................................................................................................ 36
1.9 BESTIMMUNGSKIDS UND ANTIKÖRPER................................................................ 38
2.0 ANDERE MATERIALIEN ...................................................................................... 38
2.1 GERÄTE .......................................................................................................... 39
2 ALLGEMEINE ARBEITSMETHODEN ........................................................................ 41
2.1 STERILISATION................................................................................................. 41
2.2 AGARPLATTENFERTIGUNG ................................................................................ 41
2.3 HAUTPROBENHOMOGENISATION ........................................................................ 41
2.4 ZELLKULTUREN ................................................................................................ 42
3 PRÄPARATION UND PURIFIKATION DES AD5-HCAP18 UND AD5-LACZ ................... 43
3.1 PURIFIKATION UND TITERUNG DER VERWENDETEN VIREN .................................... 43
4 RAT BURN INFECTION MODELL ............................................................................ 48
4.1 TIERHALTUNG UND VORBEREITUNG ................................................................... 48
4.2 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG .............................................................................. 48
4.3 NARKOSE ........................................................................................................ 49
4.4 ANALGESIE ...................................................................................................... 49
4.5 RASUR ............................................................................................................ 50
4.6 BAKTERIENKULTUR .......................................................................................... 50
4.7 KONTROLLAUSSTRICH ...................................................................................... 50
4.8 VERBRENNUNG & INFEKTION ............................................................................ 51
4.9 VERBAND ........................................................................................................ 52
4.10 APPLIKATION ................................................................................................. 52
4.11 PROBENGEWINNUNG ...................................................................................... 54
5 QUANTITATIVE MIKROBIOLOGISCHE ANALYSE ....................................................... 55
5.1 PROBENHOMOGENISATION................................................................................ 55
5.2 VERDÜNNUNGSREIHE ....................................................................................... 55
5.3 AUSPLATTIEREN .............................................................................................. 55
5.4 AUSZÄHLUNG .................................................................................................. 56
6 HISTOLOGISCHE ANALYSE .................................................................................. 57
6.1 ANFÄRBUNG VON GEWEBESCHNITTEN MIT HÄMATOXYLIN UND EOSIN ................... 57
2
6.2 NACHWEIS VON HCAP18/LL37 TRANSKRIPTEN DURCH NICHT RADIOAKTIVE IN SITU
HYBRIDISIERUNG ................................................................................................... 57
7 SEMIQUANTITATIVER NACHWEIS VON LL37 TRANSKRIPTEN IN
VERBRENNUNGSWUNDEN ....................................................................................... 60
7.1 ISOLATION DER GESAMT-RNA........................................................................... 60
7.2 REVERSE TRANSKRIPTION ................................................................................ 60
7.3 REAL-TIME PCR .............................................................................................. 60
8 STATISTISCHE AUSWERTUNG .............................................................................. 62
C ERGEBNISSE .............................................................................................. 63
1 VORBEREITUNG .................................................................................................. 63
1.1 VIRUSPRODUKTION UND TITERUNG .................................................................... 63
1.2 BAKTERIENVERMEHRUNG UND KONTROLLAUSSTRICHE ........................................ 63
1.3 VERSUCHSTIERE .............................................................................................. 64
2 DAS STANDARDISIERTE RATTEN-VERBRENNUNGS-INFEKTIONS-MODELL ................ 65
3 IN VIVO TRANSFEKTION VON AD5-HCAP18 .......................................................... 66
4 HISTOLOGISCHE & SEMIQUANTITATIVE ANALYSE .................................................. 69
4.1 HÄMATOXYLIN-EOSIN FÄRBUNG VON 2° VERBRANNTER HAUT .............................. 69
4.2 LOKALISATION VON HCAP18/LL37 TRANSKRIPTEN ............................................ 70
4.3 SEMI-QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON HCAP18/LL37 DURCH REAL-TIME RTPCR
............................................................................................................................ 71
D DISKUSSSION ............................................................................................. 72
1 VIRUSPROPAGATION ........................................................................................... 77
2 DAS STANDARDISIERTE UND REPRODUZIERBARE TIERMODELL ............................... 77
3 IN VIVO TRANSFEKTION VON AD5-HCAP18 .......................................................... 78
4 GENTHERAPIE .................................................................................................... 82
E ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 84
F
LITERATUR .................................................................................................. 85
G
ANHANG .................................................................................................... 101
3
DANKSAGUNG ..................................................................................................... 101
FINANZIELLE FÖRDERUNG .................................................................................... 102
LEBENSLAUF....................................................................................................... 103
LISTE DER VERÖFFENTLICHUNGEN UND VORTRÄGE ............................................... 104
4