Skriptum Pharmazeuten 2011
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HYGIENE Skriptum für Studierende der Pharmazie WS 11 Mikrobiologie und Hygiene VU (3st) 652.202 (Mascher); 652.203 (Reinthaler) SS 12 Hygiene und Mikrobiologie VU (3st) 652.200 (Reinthaler); 652.201 (Mascher) Institut für Hygiene der Medizinischen Universität Universitätsplatz 4 8010 Graz Platzer S., G. Ruckenbauer, A. Melkes, F. Mascher, F.F. Reinthaler 1 Inhaltsverzeichnis 1. Kultivierung von Bakterien …………..…………………………………………... 3 2. Spezielle Identifikationsverfahren ………………………………………………. 4 3. Färbemethoden ……………………………………………………….................. 5 4. Schnelltests zur Keimidentifizierung …………………………………….……… 7 5. Physiologische Besiedelung des Menschen …………………………………... 14 Praktische Übung - Handabklatsch ………………………………….………. 14 Praktische Übung - Rachenabstrich …………………………………………. 15 Praktische Übung - Interdentalabstrich ……………………………...…….... 16 6. Lebensmittelmikrobiologie …………………………………………………….... 17 Praktische Übung - Nahrungsmitteluntersuchung ……………………….… 19 Praktische Übung - Umgebungsabstrich ……………………………………. 20 Praktische Übung - Umgebungsabklatsch ………………………………….. 20 7. Chemotherapeutika ………………………………………………………….…… 21 Praktische Übung - Agardiffusionstest ………………………...……………. 23 8. Harnwegsinfekt ……………………………………...………………………….… 24 Praktische Übung - HWI / Uricult …………………………………………..... 24 9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund ………………………..……............. 26 Chemische Analytik …………………………………………………………… 31 10. Blut ……………………………………………………………………………..…… 35 11. Ektoparasiten ……………………………………………………………………… 44 2 1. Kultivierung von Bakterien Definition: Bakterien außerhalb ihres natürlichen Standortes zur Vermehrung bringen. Inokulation: Verbringung bakterienhältigen Materials in ein Kulturmedium Inkubation: „Bebrütung“ der beimpften Kulturmedien Kultur: die durch Vermehrung entstandene Bakterienpopulation flüssige Kulturmedien: Nährbouillon (Fleischextrakt, Pepton, Glucose) feste Kulturmedien: Nährbouillon + 2% Agar (Polysaccharid aus Seetang) Minimalmedium: "Existenzminimum" Optimalmedium: komplexe Universalmedien, die das Wachstum vieler Bakterien fördern (Substrate im Überfluss) Selektivmedium: selektiv für einzelne Keimgruppen wachstumshemmend; zur Anreicherung „interessanter“ Keime, um sie von Begleitflora zu trennen Differentialmedium: enthalten Stoffe, welche von einzelnen Bakterienarten metabolisiert werden Stoffwechselprodukte werden zB durch Farbindikatoren angezeigt („Bunte Reihe“) Direkter Nachweis von Bakterien oder deren Produkten Mikroskop: nativ - Einfachfärbungen - Differentialfärbungen Form- und Größe der Zellen, Flagellen, Kapseln, Sporen usw.; Pseudozellverbände, Färbeverhalten Kultivierung: auf festen und flüssigen Nährmedien Makroskopisch-morphologische Merkmale der Kolonien Physiologische Merkmale Wachstumsbedingungen (t°, C, pH, pO2, pCO2, osmot.Druck, Nährstoffe, Mineralien) Stoffwechseleigenschaften (Verwertung von C- und N-Quellen, Nachweis von Stoffwechselprodukten und Enzymen) Chemische Merkmale (DNA-Struktur, Antigen-Struktur) 3 2. Spezielle Identifikationsverfahren Identifizierung von Bakterien heißt, sie mit so wenigen Eigenschaften wie möglich und so vielen wie notwendig zu bestimmen, um einer unbekannten Kultur ihren Platz in der Klassifikation zuzuordnen und damit auch benennen zu können. (zB Bestimmung morphologischer Merkmale wie Gramverhalten, Form, Größe oder physiologischer Merkmale wie zB den Nachweis verschiedener Enzyme wie Katalase oder Koagulase ...) Anlegen einer Kultur: In vielen Fällen sind in einer Untersuchungsprobe mehrere Bakterienarten enthalten. Da nur von einer Reinkultur einer Bakterienspezies eine entsprechende Identifizierung möglich ist, ist eine Trennung der unterschiedlichen Bakterienarten notwendig. Man entnimmt das zu identifizierende Material mit einer sterilen Öse und bringt es im oberen Drittel des Nährbodens auf. Danach wird die Platinöse ausgeglüht und abgekühlt. Mit der sterilen Öse wird nun das Material im Winkel von 90° auf das darunterliegende Drittel gebracht. Darauf folgt eine nochmalige Sterilisation der Öse. Das Material aus dem zweiten Drittel wird wiederum im Winkel von 90° über den Rest der noch unbeimpften Nährbodenfläche verteilt. Durch die Wahl eines entsprechenden Selektivnährmediums kann teilweise unerwünschtes Keimmaterial („Begleitflora“) im Wachstum unterdrückt werden. 4 3. Färbemethoden Methylenblaufärbung: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur) Präparat lufttrocknen Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen) 1-2 Minuten Methylenblau mit Wasser abspülen Lufttrocknen Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion) Gramfärbung: 1. 1 kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen 2. Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur) 3. Präparat lufttrocknen 4. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen) 5. 2 Minuten Gentiana(Kristallviolett-)lösung mit Wasser abspülen 6. 2 Minuten Lugol`sche Lösung mit Wasser abspülen 7. ca. 20 Sekunden 96% - Alkohol mit Wasser abspülen 8. 2 Minuten Karbolfuchsin mit Wasser abspülen 9. Lufttrocknen 10. Mikroskopieren (1000fach, Ölimmersion) Grampositiv: Gramnegativ: dunkelblau rot Neisserfärbung: 1. essigsaures Methylenblau (2 Teile) + Kristallviolett (1 Teil) - knapp vor Benützung mischen 2. 20 - 30 Sekunden auf hitzefixiertes Präparat auftragen 3. mit Wasser abspülen 4. 10 Sekunden Lugol´sche Lösung (mit 1% Milchsäure versetzt) 5. mit Wasser abspülen 6.. 5-7 Minuten Bismarckbraun 7. mit Wasser abspülen und lufttrocknen 8. Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion) Diphtherie: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen schwarzblau Lagerung oft V oder Y förmig apathogene Corynebakterien: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen wenige bis keine Lagerung, oft palisadenartig (////) 5 Ziehl-Neelsen-Färbung: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren 10 Minuten Isopropanol mit Wasser abspülen Karbolfuchsin auftragen und erhitzen bis Dämpfe aufsteigen und 10 Minuten belassen mit Wasser abspülen 10 Minuten mit HCl-Alkohol entfärben mit Wasser abspülen 10 Minuten wässriges Methylenblau mit Wasser abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion) säurefeste Stäbchen: rot übrige Strukturen: blau Kapseldarstellung: Kapseln oder Schleimhüllen von Bakterien sind im Lichtmikroskop nicht erkennbar, können durch eine „Negativdarstellung“ mit Tusche aber sichtbar gemacht werden. Die Tuschepartikel können nicht in die Schleimhülle oder Kapsel eindringen, wodurch diese Strukturelemente hell auf dunklem Tuschehintergrund erscheinen. Die Bakterienzelle selbst wird mit Methylenblau gefärbt. Durchführung und Auswertung: 1. eine Impföse mit Bakterien in 1 ml HCl suspendieren und mit 1 ml Tusche mischen 2. Gemisch mit Impföse auf entfetteten Objektträger aufbringen, mit Objektträger dünn ausstreichen und trocken lassen 3. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen) 4. 5 Minuten mit Methylenblaulösung bedecken 5. Methylenblau gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion) Schleimhüllen oder Kapseln erscheinen hell auf dunklem Hintergrund, Bakterienzellen blau Sporenfärbung: In gut sporulierenden Kulturen lassen sich die Sporen als stark lichtbrechende Körperchen innerhalb der Bakterienzelle bzw. als freie Sporen mit dem Phasenkontrastmikroskop feststellen (40er Objektiv oder 100er Objektiv mit Ölimmersion). Zur Einleitung der Sporulationsphase bei endosporenbildenden Bakterien werden diese Organismen auf Sporulationsagar kultiviert. Die Methode der Sporenfärbung beruht auf der Fähigkeit der Sporen, bestimmte Farbstoffe wesentlich stärker zu binden als das Cytoplasma. Durchführung und Auswertung: 1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren 2. Objektträger mit Malachitgrünlösung überschichten 3. Objektträger bis kurz vor Siedebeginn erhitzen, ca. 10 Minuten heiß halten, nicht eintrocknen lassen, eventuell Malachitgrünlösung nachgeben. 4. mit Wasser gut abspülen und zur Gegenfärbung 5 Minuten mit Safraninlösung bedecken 5. mit Wasser gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopisch auswerten (40er Objektiv, oder 100er Objektiv - Ölimmersion) Sporen sind grün, die übrigen Zellen rot gefärbt 6 4. Schnelltests zur Keimidentifizierung KOH-Lysis Test: Die Auflösung von Zellwand und zytoplasmatischer Membran von Bakterien durch 3%ige KOH liefert einen zuverlässigen Hinweis auf das Vorliegen von gramnegativen Organismen, die dabei mit dem Reagenz eine zähflüssige, fadenziehende Masse bilden. Dieser Test dient der Differenzierung grampositiver und gramnegativer Bakterien Durchführung: Reichlich Bakterienmasse von nicht-selektiven Festnährböden in 1 Tropfen KOH auf einem Objektträger einrühren; nach 15 Sekunden Impföse mehrmals um einige Zentimeter vom Tropfen abheben und auf die Bildung eines Fadens zwischen Tropfen und Öse achten. Im negativen Fall noch einige Male innerhalb 1 Minute auf Fadenbildung prüfen, dann Test abbrechen. Zur Kontrolle sollten je ein grampositiver und -negativer Stamm mitgeprüft werden. Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung entsorgen! Katalase: Die Katalase ist ein Atmungskettenenzym und wird in der Routinediagnostik vorwiegend zur Differenzialdiagnostik von Staphylokokken und Streptokokken Durchführung: Das zu untersuchende Keimmaterial wird mit der Öse auf einen Objektträger aufgebracht und danach mit 1 Tropfen H2O2 überschüttet. aufschäumen: kein Aufschäumen: Katalase positiv Katalase negativ Staphylokokken Streptokokken Achtung: Da diese Reaktion nur zur Unterscheidung zwischen Staphylokokken und Streptokokken dient, ist es notwendig sich vorher zu vergewissern, dass es auch wirklich grampositive Kokken sind. Auch andere Bakterien können Katalase-pos. bzw. -neg. sein!!! Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung entsorgen! Plasmakoagulase: Dieses extrazellulär von S. aureus gebildete Enzym führt zu einer Verklumpung von Plasma. Die Mechanismen sind denen der physiologischen Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident. Der Test dient der Unterscheidung von Koagulase positiven (S. aureus) und Koagulase negativen (S. epidermidis, S. saprophyticus, ...) Staphylokokken. Durchführung: Auf einem Objektträger wird 1 Tropfen Staphylokokkus aurex Kontrollreagenz (graue Kappe) aufgetragen. In dieses wird die zu untersuchende Bakterienkolonie mit einer Platinöse eingerührt und gleichmäßig verteilt. Danach wird der Objektträger etwa 30 Sekunden geschwenkt. (Falsch positive Keime verklumpen bereits!) Nachdem sich eine homogene Suspension gebildet hat, wird 1 Tropfen Testreagenz (gelbe Kappe) dazugetropft und neuerlich mit einer Platinöse gleichmäßig verteilt. Danach wird der Objektträger etwa 30 Sekunden geschwenkt. Tritt eine Verklumpung auf: Tritt keine Verklumpung auf: Koagulase positiv Koagulase negativ 7 = = Staphylokokkus aureus Staphylokokken Oxidasetest Der Oxidasetest weist das Vorhandensein von Cytochromen in der Atmung von Spezies nach, die Sauerstoff als endgültige Elektronenakzeptoren im Energiestoffwechsel verwenden. Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischem Sauerstoff in den Zellstoffwechsel, indem sie durch molekularen Sauerstoff oxidiert werden. Unter dem Einfluss von Enzymen werden sie durch oxidierbare Substanzen in der Zelle anschließend wieder reduziert. Beim Oxidasetest bewirken künstliche Substrate anstelle natürlicher Elektronen-Akzeptoren die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems. Solche Substrate sind je nach ihrem aktuellen Reduktions- oder Oxidasezustand farblos bzw. gefärbt. Die positive Oxidasereaktion ist gekennzeichnet durch ein gefärbtes Produkt. Durchführung: Auf das Cytochromoxidase-Testkärtchen wird mit der Platinöse Material aufgetragen. Kommt es nach spätestens 30 Sekunden zu einer Blauverfärbung ist das Ergebnis positiv. Blauverfärbung: keine Blauverfärbung: Oxidase positiv Oxidase negativ Pseudomonas sp. (aber auch Aeromonas u.a.) Enterobacteriacaeen u.a. Streptex (Seroagglutination nach Lancefield) Die Mehrheit der Spezies Streptokokkus besitzt gruppenspezifische Antigene, die im allgemeinen Kohlenhydratbestandteile der Zellwand sind. Lancefield zeigte, dass diese Antigene in löslicher Form extrahiert und durch Präzipitation mit homologen Antiseren nachgewiesen werden können. Im Streptex-System kommt eine einfache Enzymextraktion zur Anwendung. Testprinzip: Gruppenspezifische Antigene werden aus Streptokokken in einem einfachen Inkubationsschritt extrahiert. Die Antigene werden mit Latexpartikeln identifiziert, die mit gruppenspezifischen Antikörpern sensibilisiert sind. Diese Latexpartikel agglutinieren stark in Anwesenheit des homologen Antigens und bleiben in homogener Suspension, wenn kein Antigen vorhanden ist. Der Test dient zur Identifikation (Serotypisierung) der ß-hämolysierenden Streptokokken. Durchführung: In ein entsprechend beschriftetes Teströhrchen 0,4ml Extraktionsenzym pipettieren. Mit einer Platinöse Untersuchungsmaterial in das Teströhrchen einrühren. Liegt eine Mischkultur vor, wird empfohlen, Streptokokkenkolonien von einem Bereich mit möglichst wenig Fremdkeimen abzunehmen. Die Suspension mindestens 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubieren. Vor Gebrauch die Fläschchen der Latexsuspensionen kräftig schütteln. Die Tropfflasche senkrecht halten und je einen Tropfen (20µl) jeder Latexsuspension (A-G) auf die Kreise der Reaktionskarte (A-G) geben. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Tropfflaschen senkrecht gehalten werden und der Tropfen sich an der Spitze der Auslassdüse bildet. Tritt Feuchtigkeit außen an der Auslassdüse auf, entsteht ein inkorrektes Volumen um das Ende herum. In diesem Fall ist die Düse vor Gebrauch abzuwischen. Mit einer Pasteurpipette je einen Tropfen Testsubstrat auf jeden der sechs Kreise der Reaktionsplatte geben. Den Inhalt jedes Kreises der Reihe nach mit einem Rührstäbchen gut mischen um die gesamte Kreisfläche zu bedecken. Für jeden Kreis ein eigenes Stäbchen verwenden und anschließend in Desinfektionslösung entsorgen. Die Reaktionskarte maximal 1 Minute leicht schwenken und auf Agglutination überprüfen. Hinweis: Die Reaktionskarte sollte in einer normalen Lesedistanz (25-35cm) gehalten werden. Die erhaltenen Reaktionsbilder treten sehr deutlich auf und können unter normalen Lichtbedingungen leicht erkannt werden. 8 Die Reaktionskarte nach Desinfektion vernichten. Sicherstellen, dass die Reagenzien im mitgelieferten Aufbewahrungsgestell wieder in den Kühlschrank zurückgestellt werden. Ablesen der Ergebnisse: Eine positives Ergebnis wird durch eine Agglutination als deutlich sichtbares Verklumpen der Latexpartikel angezeigt. Eine schnelle und intensive Agglutination hängt von der Stärke des Antigenextrakts ab. Ein starker Extrakt liefert innerhalb weniger Sekunden nach Durchmischen große Latexpartikel-Klumpen, dagegen ein schwacher Extrakt eine verzögerte Reaktion mit kleinkörnigen Latexpartikel-Klumpen. Formen der Hämolyse α-Hämolyse: Vergrünung (gut erkennbar auf Kochblutagar); um die Kolonien findet man grüne Höfe von unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der Blutfarbstoff zum Methämoglobin umgewandelt ist, während die Erythrozytenmembran weitgehend erhalten ist. ß-Hämolyse: (gut erkennbar auf Blutagar) relativ große scharf begrenzte Hämolysezone um die Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodass eine klare Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht. Achtung: auch andere Keime (zB. Staphylokokken, aerobe Sporenbildner, E. coli, Neisserien) können eine ß-Hämolyse verursachen! Man muss wissen, dass Streptokokken vorliegen (Gramfärbung!). γ-Hämolyse: keine hämolytische Aktivität Anwendung: dient der Differenzierung von Streptokokken Bunte Reihe Mikroorganismen sind mit einem sehr differenzierten Enzymsystem ausgestattet, wobei ein Teil dieser Enzyme in der sog. „kleinen bunten Reihe“ nachgewiesen werden kann. Dabei werden dem Keim verschiedene Nährmedien angeboten, bei deren Verbrauch es zu einem Farbumschlag in den entsprechenden Nährmedien (durch Indikatoren) kommt. Bakterien unterscheiden sich vielfältig in ihrer Enzymausstattung und damit in ihren Fähigkeiten, organische und anorganische Verbindungen ab- oder umzubauen. In einem System aus verschiedenen festen und flüssigen Medien können solche Stoffwechselleistungen durch verschiedene Indikatorreaktionen sichtbar gemacht werden. Da bei dieser Testmethode mehrere Eigenschaften gleichzeitig in einer Reihe von Reaktionsansätzen überprüft werden, entsteht wegen der unterschiedlichen Farbreaktionen einzelner Indikatoren ein buntes Bild. Man spricht von einer „bunten Reihe“. Anwendung: dient zur Differenzierung gramnegativer Stäbchen Bunte Reihe - Erklärungen und Auswertung Kligler-Röhrchen (Zweizucker-Eisen-Harnstoff-Schrägagar) Der „Kligler“ ist ein kombinierter Nährboden, in dem folgende Reaktionen nebeneinander ablaufen: a.) Dextrose-Abbau (durch alle Enterobakterien) b.) Lactose-Abbau (durch die meisten „apathogenen“ Darmbakterien) c.) d.) H2S-Bildung (z.B. durch die meisten Salmonellen, Citrobacter, Proteus vulgaris & mirabilis) Gas-Bildung (durch alle Enterobacterien; Ausnahmen: Shigellen, Salmonella typhi, Proteus morganii & rettgeri) 9 Durch den Indikator (Phenolrot) ist der unbeimpfte Kligler rot. Die Beimpfung erfolgt im Stich und auf der Schrägfläche. a.) b.) c.) d.) Dextrose-Abbau: durch Dextrose-(Glucose)-Abbau entsteht Säure; der Indikator schlägt um nach gelb. Da der Kliger nur sehr wenig Dextrose enthält, ist dieser Zucker nach wenigen Stunden verbraucht. Danach kommt es durch den Sauerstoff der Luft auf der Schrägfläche zu einer Realkalisierung mit Farbrückschlag nach rot. Kligler nach 24 Stunden: rot/gelb Lactose-Abbau: durch Lactose-Spaltung entsteht Säure; der Indikator schlägt um nach gelb. Da im Kligler zehnmal so viel Laktose wie Dextrose enthalten ist, wird Lactose in 24 Stunden nicht ganz aufgebraucht. Es tritt also keine Realkalisierung der Schrägfläche auf. Kligler nach 24 Stunden: gelb/gelb H2S-(Schwefelwasserstoff)-Bildung aus schwefelhaltigen Aminosäuren oder anorganischen Sulfaten und Sulfiten erfolgt zB durch Salmonellen und Citrobacter. Die im positiven Fall entstehende Schwarzfärbung ergibt sich aus der Verbindung von H2S mit Eisensalzen (FeSO4). Gasbildung: entsteht beim Zucker-Abbau durch die meisten Enterobakteriaceaen (Ausnahmen s.o.) Zuckerspaltung Die meisten Bakterien sind in der Lage, durch Fermente (Carbohydrasen) verschiedene Zucker abzubauen. Zur Differenzierung der Enterobakterien eigenen sich besonders: 1.) 2.) 3.) Glucose (=Dextrose, Traubenzucker), ein Monosaccharid Lactose (=Milchzucker), ein Disaccharid aus einem GlucoseGalaktosemolekül Saccharose (=Rohrzucker), ein Disaccharid aus Glucose und Fructose und einem Bei der Zuckerspaltung entstehen saure Abbauprodukte, die den pH-Wert des Mediums herabsetzen, sodass der zugesetzte Indikator (Bromthymolblau) von blaugrün nach gelb umschlägt. Glucose positiv: alle Enterobakterien Lactose positiv: die meisten „apathogenen“ Enterobakterien Darüber hinaus entsteht beim Zucker-Abbau durch Enterobakterien Gas (Ausnahmen: Shigellen, Salmonella typhi, Proteus morganii & rettgeri). Die Prüfung der Gasbildung erfolgt am einfachsten mit DURHAM-Röhrchen, das sind kleine Eprouvetten von etwa 30 mm Länge und 8 mm Durchmesser, die im Dextrose-Röhrchen mit der Öffnung nach unten versenkt werden. Bei der Bebrütung gasbildender Keime bildet sich im Gärröhrchen eine mehr oder weniger große Gasblase. Hinweis: Bei anaerober Bebrütung können Indikatorfarben reduziert werden. Deshalb empfiehlt sich der Zusatz des Indikators erst nach abgeschlossener Bebrütung! Außerdem ist zu bedenken, dass fast alle Farbstoffe auf empfindliche Keime hemmend wirken können. Harnstoffspaltung Proteusstämme (außer Prot. inconstans = Providentia) produzieren das Ferment Urease. Urease hydrolisiert Harnstoff zu Ammoniumcarbonat: CO (NH2)2 + Urease und H2O (NH4)2CO3. Ammoniumcarbonat verschiebt den pH-Wert des Mediums in den alkalischen Bereich, was durch Zusatz eines geeigneten Indikators (Phenolphtalein) sichtbar gemacht werden kann: Rotfärbung. 10 Indolbildung Zur Prüfung der Indolbildung verwendet man durch Trypsinverdauung weitgehend aufgespaltene, tryptophanhältige, flüssige Eiweißsubstrate. Einige Bakterien (z.B. E.coli) bilden das Ferment Tryptophanase, das Tryptophan zu Indol abbaut. Tryptophan (+Tryptophanase) ⇒ Indol (+Indolreagenz = rot) Nachweis: Einfach und spezifisch ist der Nachweis mittels p-Dimethylaminobenzaldehyd in saurer Lösung. Etwa 5 ml der Kultur versetzt man mit 1 ml Indolreagenz. Schwenken, nicht schütteln! Im positiven Fall entsteht ein roter Ring. Citratausnutzung Auch Mikroorganismen benötigen zum Leben und Wachsen mindestens Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und verschiedene Salze. Sie können diese Grundsubstanzen dank ihres Fermentsystems aus verschiedenen organischen und anorganischen Verbindungen herauslösen und verwerten. Jedoch können z.B. nur bestimmte Bakterien, wie Salmonellen und Citrobacter, Kohlenstoff aus dem Citratmolekül heraus lösen: H2 – C – COOH HO –C – COOH H2 – C – COOH Andere Keime, wie E.coli, können in einem Nährmedium, das Citrat als einzige Kohlenstoffquelle enthält, nicht wachsen. Nachweis: Das Citratmedium nach Koser (klare Flüssigkeit) enthält folgende Bestandteile: als Kohlenstoffquelle: Citrat: C6H8O7 als Stickstoffquelle: Ammoniumphosphat: (NH4)2 HPO4) und Salze (MgSO4, K2HPO4) Positiv: Trübung (Wachstum) Negativ: Röhrchen bleibt klar Nitratreduktion Bilden Bakterien das Ferment Nitratreduktase, wird im Nährboden enthaltenes Nitrat zu Nitrit reduziert. Das entstandene Nitrit lässt sich mit einer Mischung aus Sulfanilsäure, α-Naphtylamin und Essigsäure nachweisen. Nachweis: 5ml eines Testsubstrats der folgenden Zusammensetzung KNO3 (nitritfrei) Pepton Aqua dest. 0,2g 5,0g 1000ml werden mit dem zu prüfenden Keim beimpft und 2-4 Tage bebrütet. Dann wird eine Mischung der folgenden Lösungen zu gleichen Teilen hergestellt: Lösung A: Sulfanilsäure Essigsäure (5N) 1,0g 125,0ml Lösung B: α- Naphtylamin Essigsäure(5N) 1,0g 200,0ml und davon der Bouillon 0,1 ml zugesetzt. Im positiven Fall tritt in wenigen Minuten kräftige Rotfärbung auf. 11 Bleibt die Rotfärbung aus, kann dies zwei Ursachen haben: 1.) Nitrat wurde nicht abgebaut. Beweis: durch Zusatz von etwas Zinkstaub zum Testsubstrat tritt Rotfärbung ein. 2.) Nitrat wurde zu Nitrit abgebaut, das Nitrit jedoch weiter reduziert zu Stickoxyd, Ammoniak oder elementarem (gasförmigem) Stickstoff. In diesem Fall bleibt die Rotfärbung nach Zusatz von Zinkstaub aus. Chemismus: NO3 → NO2 → (Nitrat) (Nitrit) NO → (Stickoxyd) NH2OH → NH3 (Ammoniak) N2O (Distickoxyd) → N2 (Stickstoff) Reduktionsvorgänge Auswerten der bunten Reihe: 1. Kligler (rot) ist ein kombinierter Nährboden (Schrägagar), in dem folgende Reaktionen nebeneinander ablaufen: Dextrose Abbau Indikator: Phenolrot reagiert auf Ansäuerung des Milieus mit einer Gelbfärbung H2S-Bildung positiv: schwarz Gasbildung 2. Lactose (grünlich) positiv: gelb negativ: grün 3. Trypsin (gelb) Zusatz: Indolreagenz positiv: roter Ring negativ: gelber Ring 4. Harnstoff (weiß) Zusatz: Phenolphtalein positiv: rot negativ: keine Farbveränderung 5. Citrat (grün) Indikator: Bromthymolblau reagiert auf Alkalisierung blau positv: blau negativ: grün 6. Nitrat (farblos) Zusatz: Jodzinktinktur + H2SO4 positiv: blau negativ: farblos 7. Beweglichkeitsagar: Wachstum nur beim Impfstrich: unbeweglich Nährmedium diffus (trüb) durchsetzt: beweglich 12 Röhrchen Nr. 1 2 3 4 5 6 7 Kligler Dextrose H2S Lactose Trypsin Harnstoff Citrat Nitrat Beweglichkeit + + + + + -+ + + + + + - + + + - + + + + -+ +++ + + + + + + + + + + + + + Escherichia coli + + + + + - Klebsiella pneumonie Klebsiella oxytoca Enterobacter sp. Citrobacter sp. Proteus vulgaris Proteus mirabilis Morganella morganii Salmonella sp. Pseudomonas sp. Acinetobacter sp. Serratia sp. + + + + - + API Das Testsystem beruht auf dem Prinzip der Bunten Reihe. In einem Teststreifen mit 20 Mikroröhrchen befinden sich verschiedene dehydrierte Testsubstanzen, die mit einer Bakteriensuspension in Aqua dest. befüllt werden. Der Test wird anschließend bei 37°C ca. 24 Std. bebrütet. Ein meist Indikator bedingter Farbumschlag zeigt an, ob die getesteten Substanzen von Bakterien umgesetzt wurden. Fällt die erste Reaktion einer Dreiergruppe positiv aus, so wird dies mit einer 1 protokolliert, fällt die zweite positiv aus, so wird dies mit einer 2 protokolliert, und ist die dritte Reaktion einer Dreiergruppe positiv, so protokolliert man eine 4. Im negativen Fall wird eine 0 protokolliert. Durch Addition der Zahlen jeder Dreiergruppe ergibt sich ein siebenstelliger Code, der zur Identifizierung der Keime führt. + + + QNPG ADH LDC 5 + + + ODC ‚CIT H2S URE TDA IND 1 4 VP + + + GEL GLU MAN IND SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX 4 5 Kodierungsprinzip des API-Systems z.B.: Escherichia coli 13 1 2 5. Physiologische Besiedelung des Menschen Haut und Schleimhäute des Menschen sind mit unzähligen Mikroorganismen besiedelt, die man als Normalflora bezeichnet. Dabei ist eine generelle Trennung der Erreger in apathogen und pathogen nicht möglich. Diese Mikroorganismen befinden sich im Gleichgewicht mit ihrem Wirt, sodass es unter normalen Lebensumständen zu keiner Infektion bzw. Infektionskrankheit kommt, es sei denn, die Keime werden aus ihrer angestammten Region in andere Körperregionen bzw. in primär sterile Organsysteme verschleppt. Die Zusammensetzung dieser Normalflora variiert und hängt von verschiedenen Faktoren, wie Allgemeinzustand, Alter und Geschlecht des Menschen, Ernährung, Schwangerschaft, Grunderkrankung etc., ab. 5.1. Haut Den wichtigsten Anteil der normalen Hautflora bilden Bakterien, die ein gewisses Haftvermögen für dieses Organ besitzen = Residentflora. Aus dem ständigen Kontakt mit der Umwelt resultiert die sog. Transientflora, Anflugkeime, die vorübergehend auf der Haut vorkommen, aber bei einem intakten Makroorganismus keine Möglichkeit der Besiedelung finden. Die Zusammensetzung der Residentflora wird auch durch äußere Einflüsse, wie starkes Schwitzen oder häufiges Waschen nicht verändert. Die bakterielle Normalbesiedelung findet sich vorwiegend in den äußeren Schichten der Haut (bis 10 6 Keime/ cm2). Keime der normalen Hautflora sind: Staphylococcus epidermidis und andere koagulasenegative Staphylokokken, Mikrokokken, apathogene Corynebakterien (aerobe und anaerobe), Streptokokken und Peptostreptokokken. Praktische ÜBUNG - HANDABKLATSCH Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“) 1.) Beschriftung der Blutagarplatte (B): auf der Unterseite der Agarplatte wird mit einem Filzstift in der Mitte ein Teilungsstrich gezogen und die beiden Hälften mit einem „V“ (= vorher) bzw. „N“ (= nachher) und dem Namen beschriftet. 2.) Auf die Oberfläche eines festen Nährbodens werden nun 3 Fingerspitzen einer Hand unter leichtem Druck auf die mit „V“ makierte Fläche aufgelegt 2.) Danach erfolgt eine hygienische Händedesinfektion: 1: Aus dem Desinfektionsmittelspender mittels Ellbogenbedienung ca. 3 ml alkoholisches Desinfektionsmittel entnehmen (die Menge entspricht etwa einer hohlen Hand, große Hände brauchen etwas mehr!) 2: Händedesinfektionsmittel über mind. 30 Sekunden gründlich auf den Händen verreiben (am besten, bis sie trocken sind) 3.) Anschließend werden wiederum 3 Finger leicht auf die mit „N“ markierte Agarfläche gelegt (Achtung: mit dieser Hand nichts angreifen!) 4.)Nach 24-stündiger Bebrütung bei 37° C das Resultat begutachten. 14 5.2. Mund/Rachen Die Mundhöhle bietet ein breites Spektrum verschiedenster Bakterien, Pilze und Protozoen. Äußere Einflüsse, wie zB Alter, Ernährung oder z.B. die Einnahme von Antibiotika führen zu einer dauernd wechselnden Transientflora. Aber auch die Residentflora ist vielgestaltig. Keime der normalen Mund/Rachenflora sind: vergrünende Streptokokken, apathogene Neisserien, diphtheroide Stäbchen, Bacteroides sp., Staphylococcus epidermidis. In geringer Menge als normal zu betrachten sind Hämophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae und Candida sp. Eine Sonderstellung im Mund/Rachenraum weisen ß-hämolysierende Streptokokken und Neisseria meningitidis auf. Diese Bakterien können sich zur Normalflora gesellen, ohne dass es zu einer Erkrankung kommt (asymptomatische Keimträger). Ebenfalls eine Sonderstellung im Nasen/Rachenraum nimmt Staphylococcus aureus ein, der im Gebiet von Nase bzw. Perineum (Damm) als Haftkeim vorkommen kann. Da S. aureus auch häufig bei nosokomialen Infektionen beteiligt ist, werden beim Auftreten nosokomialer Infektionen durch S. aureus bei Personal und Patienten Nasenabstriche durchgeführt, um Keimträger zu erfassen und gegebenenfalls zu sanieren. Praktische ÜBUNG - RACHENABSTRICH Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“) Kochblut-Agar (KB): festes Nährmedium zum Nachweis sehr empfindlicher Keime („schokoladenbraun“) 1.) Die Probenentnahme erfolgt unter Zuhilfenahme eines Spatels mit einem sterilen Abstrichtupfer durch eine drehende Bewegung am Ort der Infektion. Unbedingt notwendig ist eine gute Lichtquelle. Eine Kontamination durch andere Strukturen im Mund- Rachenraum sollte dabei vermieden werden. (Hinweis: vor der Probennahme sollte der Patient seinen Mund mit klarem Wasser spülen Reduktion der Begleitflora) 2.) Das entnommene Material wird mit dem Abstrichtupfer auf die Nährmedien Blutagar (B) und Kochblutagar (KB) übertragen, indem der Abstrichtupfer im oberen Drittel des Nährbodens über die gesamte Fläche gleichmäßig verteilt wird. Mit einer sterilen Öse wird aus diesem Areal Material in den unteren Anteil gebracht und in einer fortlaufenden Zick-Zack-Linie aufgetragen. Dadurch kommt es zu einer kontinuierlichen Verringerung der Keimzahl, sodass die Möglichkeit zur Bildung von Einzelkolonien nach der Bebrütung besteht. 3.) Die beimpften Platten werden beschriftet (Plattenboden!) und für 24h bei 37°C inkubiert. Unterscheidung der verschiedenen Streptokokkenarten Die Differenzierung der verschiedenen Streptokokkenarten basiert auf a) Einteilung nach Lancefield (Einteilung nach antigenen Eigenschaften in der Zellmembran von Streptokokken) und b) Unterscheidung nach dem Hämolyseverhalten der Streptokokken auf Blut bzw. Kochblutagar. 15 Praktische ÜBUNG - INTERDENTALABSTRICH Der Interdentalabstrich wird unter Zuhilfenahme eines sterilen Zahnstochers durchgeführt. Das gewonnene Material wird auf einen Objektträger übertragen und eine Gramfärbung durchgeführt. Mikroskopisch lässt sich die Vielfalt einer normalen Rachen/Interdentalflora erkennen. Neben zellulären Elementen (Plattenepithelzellen, Leukocyten), sieht man die bereits bekannten Formen von Kokken- bzw. Stäbchenbakterien. Ebenfalls zu sehen sind aber auch spindelförmige, bzw. unregelmäßig geformte gramnegative Stäbchen (Fusobakterien, Bacteroides sp.), sowie auffällig gewellte Stäbchenbakterien (apathogene Spirochäten). Die Anzucht dieser Bakterien ist sehr langwierig und gelingt zT. nur auf Spezialnährböden, was den Rahmen dieses Praktikums sprengen würde. 5.3. Respirationstrakt Im vorderen Abschnitt der Nase finden sich hauptsächlich Keime der normalen Hautflora (koagulasenegative Staphylokokken, etc.). Durch die Verbindung mit der Mundhöhle können in der Nase aber auch Keime der normalen Rachenflora gefunden werden. Normalerweise steril sind die Nasennebenhöhlen, ebenso das Bronchialsystem und die Alveolen. Dafür zuständig sind sowohl strukturelle (Flimmerepithel), wie auch immunologische Faktoren. 5.4. Magen und Duodenum Durch die Wirkung des Magensaftes sind Magen und Duodenum keimarm bis keimfrei. Im Dünndarm findet man Enterokokken, sowie milchsäurebildende Bakterien (Laktobazillen), erst im unteren Dünndarm tritt E. coli auf. 5.5. Darm Die normale Darmflora ist das größte Keimreservoir des Körpers (bis 300 Arten). Die Zusammensetzung der Darmflora wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, wie Ernährung, Alter, Darmsekretion, therapeutische Eingriffe, etc. Antibiotika können zur Reduktion der Normalflora führen und gleichzeitig einen Anstieg antibiotikaresistenter Keime bewirken (zB Clostridium difficile). 95% der Keime im Darm sind Anaerobier (Bacteroides Arten, Lactobacillus sp., Fusobakterien, Clostridien und Peptostreptokokken). Von den aeroben bzw. fakultativ anaerob wachsenden Keimen sind die häufigsten Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus sp., Enterobacter sp., etc.), bzw. Enterokokken, transient Candida sp. und Pseudomonas sp. 5.6. Urogenitaltrakt Nierenbecken, Ureter und Harnblase sind normalerweise keimfrei, nur der äußere Teil der Harnröhre ist mit Keimen der umgebenden Haut bzw. transient mit Keimen des Darms besiedelt (S. epidermidis, E. coli, Enterokokken). 5.7. Vaginalflora Diese wechselt stark, je nach Entwicklungsstufe. Kindesalter: keimarm, wenige Kokken und Stäbchen, fast keine Laktobazillen Pubertät: reichlich Laktobazillen, daneben Streptokokken, Staphylokokken und E. coli Menopause: die Laktobazillen gehen stark zurück, es besteht eine Mischflora aus Kokken und Stäbchen. 16 6. Lebensmittel-Mikrobiologie 6.1. Lebensmittelvergiftungen Eine Lebensmittelvergiftung kann zahlreiche biologische und nicht biologische Ursachen haben. Dazu gehört die Vergiftung durch Arzneimittel oder wachstumsfördernde Substanzen im Fleisch und in Fleischprodukten nach zu später Absetzung vor der Schlachtung Pestizide, Schwermetalle, Chlorkohlenwasserstoffe und andere toxische Umweltstoffe, die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und Pflanze gelangen können nicht erlaubte Zusatzstoffe, die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und Pflanze gelangen können nicht erlaubte Zusatzstoffe zB zur Konservierung der Lebensmittel (Antibiotika, Natriumazid im Wein, Monobromessigsäure in Bier u.a.) Reinigungs- und Desinfektionsmittel physiologische Gifte von Pflanzen und Tieren Parasiten Mikroorganismen(Bakterien, Pilze und Viren) Ob ein Mikroorganismus eine Lebensmittelvergiftung verursachen kann, ist von zahlreichen Faktoren abhängig. Dazu gehört die Fähigkeit im Lebensmittel infektiös zu bleiben bzw. sich im Lebensmittel vermehren zu können, die Anwesenheit spezifischer Pathogenitätsfaktoren wie die Fähigkeit zur Bildung von Toxinen (Toxizität) und/oder die Fähigkeit zur Ausbreitung im Gewebe (Invasivität) sowie eine ausreichende Infektionsdosis. Beeinflusst wird die Erkrankung auch von der momentanen Abwehrlage des infizieren Menschen. Lebensmittelinfektionen werden von invasiven Mikroorganismen hervorgerufen, die in das menschliche Gewebe eindringen und sich dort ausbreiten können. Häufig können sich diese Mikroorganismen nicht im Lebensmittel vermehren, bleiben aber infektiös. Wichtige epidemiologische Transportmittel für derartige Infektionserreger sind die Rohmilch und das Wasser. Typische Mikroorganismen aus dieser Gruppe sind zB Mycobacterium tuberculosis, Brucella, A-Streptokokken, Leptospira, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Viren und Parasiten. Voraussetzung für die Invasivität ist die Anheftung (Adhäsion) der Erreger über unspezifische oder spezifische Strukturen der Mikroorganismenzelloberfläche (zB Fimbrien bei Escherichia coli) an die Zelloberfläche des Wirtes. Die Ausbreitung und Vermehrung im menschlichen Gewebe ist abhängig von der Resistenz der Mikroorganismen gegenüber den körpereigenen Abwehrmechanismen wie der Phagozytose und der Toxizität des Serums. Lebensmittelintoxikationen werden durch toxinbildende Mikroorganismen ausgelöst, die sich meistens im Lebensmittel vermehren können. Die Toxizität beruht auf der Bildung von Endooder Exotoxinen. 6.2. Hygicult Hygicult-TPC Hygicult-TPC wurde zur schnellen Überwachung der mikrobiologischen Hygiene in verschiedenen Materialien entwickelt. Es ist sowohl bei festen als auch bei flüssigen Materialien anwendbar. Feste Stoffe werden untersucht, indem man beide Seiten des Trägers fest gegen die Oberfläche drückt. Halbfeste oder flüssige Proben werden mit Hilfe eines sterilen Wattestäbchens beimpft. Flüssigkeiten werden am besten untersucht, indem man den Träger 3-4 Sekunden in die Probe taucht. Nach der Beimpfung wird der Träger sorgfältig in das Trägergefäß zurückgesteckt und bei 35-37°C einen Tag bebrütet. 17 18 Praktische ÜBUNG - NAHRUNGSMITTELUNTERSUCHUNG Hefeextrakt-Agar (YEAST): festes Universalmedium („farblos“) Rambach-Agar (RA): festes Selektivmedium für Salmonellen („zuckerlrosa“) Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“) Endo-Agar (E): festes Selektivmedium für gramnegative Stäbchen („hellrosa“) Nahrungsmittel homogenisieren (Stomacher) Probe zu 100ml Peptonwasser (37°C, 24 Std.) Hygicult-TPC (37°C, 24Std.) Rambach (37°C, 24Std.) Bebrütung 24Std. Blut (37°C, 24Std.) 19 0,1ml auf YEAST (37°C, 24Std.) Endo (37°C, 24Std.) Durchführung: Die mitgebrachten Proben (Lebensmittel, Pharmazeutische Produkte, etc.) werden in 100ml Peptonwasser (Glaskolben) mit Hilfe des STOMACHER’s (im Plastiksack) homogenisiert und die homogenisierte Probe in den Glaskolben geleert. 0,1ml werden mit Hilfe einer Pipette auf YEAST-Agar aufgetragen und ausgespachtelt. Parallel dazu wird ein HYGICULT-TPC 3-4 Sekunden in die homogenisierte Probe getaucht. Anschließend erfolgt eine Bebrütung aller drei Medien für 24h bei 37°C. Vom HYGICULT und YEAST-Agar wird die Gesamtkeimzahl bestimmt. Peptonwasser (Glaskolben) auf Blut- Endo- und Rambach-Agar überimpfen und 24h bei 37°C bebrüten. Makroskopische und mikroskopische Bestimmung und weitere Differenzierung Praktische ÜBUNG - UMGEBUNGSABSTRICH Thioglykolat: flüssiges Optimal-/ Anreicherungsmedium Die Probenentnahme erfolgt mit einem sterilen Abstrichtupfer von einer beliebigen Keimquelle (Fussboden, Schuhsohle, Toilette, Mülltonne, Kaffeeautomat… etc.). Der Abstrichtupfer wird anschließend in ein flüssiges Anreicherungsmedium (Thioglycolat) getaucht und für 24-48h bei 37°C bebrütet. Danach wird das Keimwachstum im Thioglykolat makroskopisch beurteilt. Wenn eine Trübung des Nährmediums zu beobachten ist erfolgt eine Überimpfung auf eine Blut- und eine Endoagarplatte. Die Agarplatten werden dann für 24h bei 37°C bebrütet. Ist keine Trübung vorhanden ist kein Keimwachstum erfolgt. Beurteilung des Keimwachstums auf der Blut- bzw. Endoagarplatte. Gramfärbung der makroskopisch unterscheidbaren Kolonien und weitere Differenzierung. Praktische ÜBUNG - UMGEBUNGSABKLATSCH Hygicult-TPC: festes Universalmedium („farblos“) Die Probenentnahme erfolgt von einem festen-, halbfesten- oder flüssigem Material mittels Hygicult-TPC von einer beliebigen Keimquelle (div. Oberflächen z.B.: von Maschinen, Reinigungsgeräte,… etc.). Der Hygicult-TPC wird am nächsten Tag für 24h bei 37°C bebrütet. Danach wird das Keimwachstum an den Agarflächen makroskopisch beurteilt. Wenn ein Wachstum zu beobachten ist erfolgt eine Überimpfung auf eine Blut- und eine Endoagarplatte. Die Agarplatten werden dann für 24h bei 37°C bebrütet. Gramfärbung der makroskopisch unterscheidbaren Kolonien und weitere Differenzierung. 20 7. Chemotherapeutika Die Unwirksamkeit mancher Antibiotika auf gewisse Keime ist auf die Resistenzart zurückzuführen: 1) primäre Resistenz: 2) erworbene Resistenz: entspricht der natürlichen Resistenz a) Mutation (chromosomal) b) „infektiöse“ Resistenz (Plasmide) diese Resistenzen können, wenn der Druck des Antibiotikums ausbleibt, wieder verloren gehen. Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten von Stamm zu Stamm wechselt und das Resistenzverhalten nicht im vor hinein zu erkennen ist. Daraus ergibt sich die zwingende Notwendigkeit die Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung durchzuführen. Durch die Testung erfolgt der Ausschluss jener Substanzen, die schon in vitro nicht wirksam sind und damit für die klinische Anwendung nicht mehr in Frage kommen. Über die richtige Auswahl aus den wirksamen Substanzen entscheiden dann andere Parameter (Bioverfügbarkeit, Applikation, klinische Aspekte, etc.). Die antimikrobiellen Chemotherapeutika unterscheiden sich in ihrem Wirkungsmechanismus, bzw. Angriffsort: Angriffsort Wirkmechanismus Chemotherapeutikum Zellwand Muraminsäuresynthese Pyruvyl-Transferase Phospholipidsynthese Glucansynthese Betalaktam-Antibiotika Vancomycin Teicoplanin Fosfomycin Bacitracin Echinocandine Ribosomen Peptidyl-Transferase Ribosom A Translokation Peptidyl-Transferase Elongationsfaktor G Abbauende Enzyme Chloramphenicol Tetracycline Makrolide Clindamycin Fusidinsäure Aminoglykoside Nukleinsäure DNS-Gyrase RNS-Polymerase DNS-Stränge Gyrase-Hemmer Rifampicin Nitroimidazole Zellmembran Phospholipide Ergosterolsynthese Ergosterolsynthese Polymyxine Amphotericin B Azole Folatsynthese Pteroatsynthetase Sulfonamide Dihydrofolat-Reduktase Trimethoprim 21 Einteilung der Antibiotika (Chemotherapeutika) 22 Wirkungstypen der Antibiotika 1) Bakteriostase: Hemmung der Bakterienvermehrung (zB durch Sulfonamide, Chloramphenicol und Tetracycline), wobei die Keime nicht abgetötet werden. Die natürliche Absterberate ruhender Bakterien wird dabei nicht beeinflusst. 2) Bakterizidie: Abtötung der Bakterienzelle (zB infolge Verhinderung der Zellwandsynthese durch Penicillin). Penicilline und Cefalosporine wirken nur in der Vermehrungsphase der Bakterien bakterizid, Aminoglykoside auch in der Ruhephase. Nebenwirkungen: Toxische Reaktionen (zB Nephrotoxisch, Ototoxisch) Allergische Reaktionen Biologische Nebenwirkungen (Beeinflussung der Normalbesiedelung) Methoden der Resistenzbestimmung • Agardiffusion: wirkstoffgetränkte Filterpapierblättchen werden auf den mit dem Keim beimpften Agar aufgebracht. Die Hemmhöfe werden nach der Bebrütung abgelesen. • Bouillondilution: Keim wird in die Antibiotikaverdünnungsreihe eingebracht und der Wachstumsendpunkt ermittelt = MHK (Minimale Hemmkonzentration). Wird heute in Mikrotiterplatten oder Automaten gemacht. • Agardilution: Antibiotikaverdünnung wird mit festem Agar ausgegossen und dann mit Keim beimpft (MHK). Praktische ÜBUNG - AGARDIFFUSIONSTEST Müller-Hinton-Agar (MH): festes Nährmedium („farblos“) zur Durchführung des Agardiffusionstests (ANTIBIOGRAMM) 1.) Mit der Öse wird das zu untersuchende Keimmaterial (zB vom Uricult) abgenommen und in physiologischer NaCl-Lösung eingerührt, sodass eine leicht trübe Suspension entsteht. 2.) Die Keimsuspension wird mittels sterilem Wattetupfer flächendeckend auf einen Nährboden aufgetragen. 3.) Mit dem Dispenser, der die Antiobiotika-Testblättchen enthält, werden die Testblättchen auf den Agar gedrückt. 4.) Die Probe wird nun 24h bei 35-37°C bebrütet und dann ausgewertet. Die Chemotherapeutika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten Filterpapierplättchen in das Agargel und bewirken je nach Wirksamkeit eine Hemmung des Bakterienwachstums um das Testplättchen (Hemmhof). Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten Bakterienwachstum. Der Hemmhofdurchmesser ist ein Maß für die Empfindlichkeit eines Bakteriums gegen ein Antibiotikum Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse in "sensibel" (oder empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich) unterteilt. Die Interpretation der Ergebnisse basiert auf festgelegten Grenzwerten (siehe Tabelle). 23 empfindlich wenn > als Penicillin (P 10) Augmentin (AMC) Aminopenicillin (Am) Cefoxitin (Fox) Sulfonamid + Trimethoprim (SXT) Norfloxacin (Nor) mäßig empf. wenn von – bis resistent wenn < als 29 20 29 18 15-17 28 17 28 14 16 18 11-15 13-17 10 12 18-19 8. Harnwegsinfekt (HWI) Praktische ÜBUNG – HWI / Uricult Ziel der Übungen: Beurteilung der Keimzahl anhand einer Vergleichstabelle (siehe Seite 25) Identifizierung des Infektionserregers (MacConkey-Agar - Bunte Reihe) Erstellen eines Antibiogramms (MacConkey-Agar) Interpretation des Ergebnisses und Abgabe eines Therapievorschlags Durchführung: Jeder Arbeitsplatz bekommt aus dem bakteriologischen Routinelabor einen bereits bebrüteten und bearbeiteten URICULT zur Verfügung gestellt. Cled-Agar: durchgehende Agarfläche (Universalmedium) für aerobe Bakterien MacConkey-Agar: auf der unterteilten Rückseite oben: Selektivagar für gram-negative Bakterien Slanetz-Agar: auf der unterteilten Rückseite unten: Selektivagar für Enterokokken Die Beurteilung der Gesamtkeimzahl (Uricult-Cled-Agar): Mittelstrahlharn: Signifikanzgrenze: ≥105 Keime/ml Harn Katheterharn: die Signifikanzgrenze wird um den Faktor 10 tiefer angesetzt (≥104) Blasenpunktationsharn: jeder Keimnachweis gilt als signifikant 24 25 9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund: Interpretation und Maßnahmen Trinkwasser ist unser wichtigstes Lebensmittel und daher unersetzlich. Der heutige hohe Stand der Trinkwasserhygiene gehört zu den erfolgreichsten Umsetzungen hygienischer Erkenntnisse in wirksame Präventionsmaßnahmen. Hierdurch konnten vor allem Infektionskrankheiten wie Typhus, Paratyphus, Cholera, Shigellenruhr u.a. so nachhaltig bekämpft werden, dass diese Erkrankungen ihre epidemiologische Bedeutung in Mitteleuropa weitgehend verloren haben. Sofern es sich um öffentliche Wasserversorgungsanlagen handelt, sorgen das Lebensmittelsicherheits- und Verbraucherschutzgesetz sowie die Trinkwasserverordnung für die gesundheitliche Unbedenklichkeit von Trinkwasser. Anforderungen an ein Trinkwasser gemäß Österr. Lebensmittelbuch, IV. Auflage, Kapitel B1 „Trinkwasser“ (Auszug) „Trinkwasser ist Wasser, das in nativem Zustand oder nach Aufbereitung geeignet ist, vom Menschen ohne Gefährdung seiner Gesundheit verzehrt zu werden und das geruchlich, geschmacklich und dem Aussehen nach einwandfrei ist.“ „Grundsätzlich ist für den menschlichen Verzehr nativ einwandfreies Wasser einem aufbereiteten Wasser vorzuziehen, auch wenn die Erschließungs-, Schutz- und Transportkosten dadurch höher sind“ „Trinkwasser darf Bakterien, Viren und Parasiten, die durch Verschlucken eine Erkrankung des Menschen verursachen können, nicht in Anzahlen enthalten, die eine potentielle Gefährdung der menschlichen Gesundheit darstellen. Da deren umfassender Nachweis mit vertretbarem Aufwand nicht möglich ist, wird Trinkwasser routinemäßig auf das Vorhandensein von Indikatorbakterien untersucht, die auf eine Verunreinigung hinweisen. […] Stoffe jedweder Art dürfen im Trinkwasser nur in Konzentrationen enthalten sein, die die menschliche Gesundheit auch bei lebenslangem Verzehr des Trinkwassers nicht gefährden.“ Die Anforderungen des ÖLMB B1 gelten als erfüllt, wenn die nachstehend angeführten Indikatorparameterwerte und Parameterwerte eingehalten werden (nicht desinfiziertes Wasser): Mikrobiologische Indikatorparameterwerte (Richtwerte) KBE 22 (koloniebildende Einheiten bei 22°C Bebrütungstemperatur) KBE 37 (koloniebildende Einheiten bei 37°C Bebrütungstemperatur) 100/ml 20/ml Coliforme Bakterien Clostridium perfringens (einschließlich Sporen) 0/100ml 0/100ml Mikrobiologische Parameterwerte (Grenzwerte) Escherichia coli Enterokokken Pseudomonas aeruginosa 0/100ml 0/100ml 0/100ml 26 Kurze Charakterisierung Indikatorparameter: der mikrobiologischen Parameter bzw. Koloniezahl bei 22°C Bebrütungstemperatur: Die niedrige Bebrütungstemperatur begünstigt jene Mikroorganismen, die bei kühlerer Umgebungstemperatur gut gedeihen. Daher werden vor allem Bakterien, die im Wasser oder im Boden vorhanden sind, erfasst. Koloniezahl bei 37°C Bebrütungstemperatur: Die höhere Bebrütungstemperatur begünstigt jene Mikroorganismen, die sich an oder in lebenden warmblütigen Tieren oder Menschen vermehren. Escherichia coli (E.coli): Ist das bekannteste Bakterium aus der Gruppe der coliformen Bakterien. Es kommt im Darm von Mensch und Tier in hohen Konzentrationen vor (bis zu einer Milliarde Bakterien pro Gramm Stuhl oder Kot) und gilt aus diesem Grund als der bedeutendste Indikator für fäkale Verunreinigung. Coliforme Bakterien: gehören zu den Enterobakterien, die vor allem im Darm von Tieren und Menschen vorkommen. Coliforme Bakterien können sich aber auch in Böden, auf Pflanzen und in Oberflächengewässern vermehren. Enterokokken: Sind ebenfalls Darmbakterien von Mensch und Tier, die jedoch in etwas geringerer Konzentration im Stuhl bzw. Kot vorkommen. Da sie in der Umwelt eine längere Überlebensdauer besitzen als coliforme Bakterien, können diese auf länger zurück liegende Verunreinigungen hinweisen. Pseudomonas aeruginosa: Ist ein Bakterien, das in geringen Konzentrationen in allen natürlichen Wässern vorkommt. In nicht gut gewarteten Wasserversorgungsanlagen, speziell in nicht gepflegten Filteranlagen, in Leitungen oder Armaturen, in denen das Wasser längere Zeit steht, kann sich Pseudomonas aeruginosa so stark vermehren, dass dieses Bakterium ein Gesundheitsrisiko darstellt. Hier sind insbesondere Infektionen von Wunden und des äußeren Gehörganges zu nennen. Aufbereitetes und desinfiziertes Wasser wird auf diesen Parameter untersucht. Clostridium perfringens: Ist ein Darmbakterium, das nur in sauerstofffreier Umgebung überleben kann. Unter für dieses Bakterium ungünstigen Bedingungen bildet es widerstandsfähige Dauerformen (Sporen) und kann dadurch lange Zeit überleben. Durch diese Widerstandsfähigkeit eigenen sich die Sporen von Clostridum perfringens besonders gut zur Überprüfung der Wirksamkeit von Aufbereitungsverfahren und Desinfektionsmaßnahmen. Ein Beispiel nicht fäkaler Erreger mit dezentraler Vermehrung: Legionellen: sind Bakterien, die als natürlicher Bestandteil der Mikroorganismenflora in sämtlichen Süßwässern vorkommen. Sie gelangen in sehr geringen, mit den üblichen Verfahren der Trinkwassermikrobiologie nicht nachweisbaren Konzentrationen in wasserführende Systeme, wo sie ihre ökologischen Nischen und optimalen Vermehrungsbedingungen vorfinden. Sie können Hausinstallationssysteme besiedeln (v.a. Duschköpfe, Wasserauslässe, Stagnationszonen ...) aber auch in Luftbefeuchtern u.a., wobei ihr Temperaturoptimum im Bereich von 25°C bis 45°C liegt. Unter 20°C ist ihre Vermehrungsrate äußerst eingeschränkt, über 60°C werden Legionellen abgetötet. 27 Kriterien für die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse: Grundsätzlich ist für die Gesamtbeurteilung einer Wasserversorgungsanlage ein Lokalaugenschein und eine chemische sowie eine bakteriologische Wasseranalyse erforderlich. Die seuchenhygienische Beurteilung einer Trinkwasserversorgungsanlage basiert auf die im Zuge des Lokalaugenscheines vorgefundenen Gegebenheiten und dem Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung. Da der bakteriologische Befund nur einen Momentanzustand erfasst, kann ein Vergleich mit den Ergebnissen der Vorbefunde aufschlussreiche Erkenntnisse ergeben. Auch die bei Beanstandungen zu treffenden Maßnahmen sind vom Ortsbefund und dem Ausmaß der festgestellten Verunreinigungen abhängig. So wird bei massiven Verunreinigungen, hervorgerufen durch eine Abwasserbeeinflussung eines Wasserspenders anders vorzugehen sein, als bei geringfügigen Kontaminationen eines Endstranges. Beurteilung: Sicher und für den menschlichen Verzehr geeignet: Lokalaugenschein und chemischbakteriologische Analysenergebnisse ergeben keinen Grund zu Beanstandungen. Den Indikatorparameterwerten nicht entsprechendes Wasser bzw. bei Beanstandungen aufgrund der Inspektion kann das Wasser bei umgehender Behebung der Mängel bzw. bei Umsetzung vorgeschlagener Maßnahmen als sicher und geeignet beurteilt werden. Bei massiven Überschreitungen der Indikatorparameterwerte bzw. bei gravierenden Mängeln ist jedoch zu prüfen, ob eine Beurteilung als nicht sicher und nicht geeignet erforderlich ist. Nicht sicher und für den menschlichen Verzehr nicht geeignet: Den Parameterwerten nicht entsprechendes Wasser. Es sind Maßnahmen zu ergreifen um spätestens nach 30 Tagen den Parameterwerten zu entsprechen. Der Erfolg der Maßnahmen ist durch Kontrolluntersuchungen nachzuweisen. Auf weitere Bestimmungen der Trinkwasserverordnung wird verwiesen. 28 Wasserbeschaffenheit- Bakteriologische Analysenverfahren Plattengussverfahren (KBE 22°C, KBE 37°C) Die Proben werden unter sterilen Bedingungen pipettiert, anschließend wird das entsprechende Nährmedium (Hefeextraktagar) zugegeben; unter vorsichtigem Schwenken werden Probe und Nährmedium vermischt. Die Platten werden unter Berücksichtigung der Bebrütungstemperatur in die jeweiligen Brutschränke gegeben. Auswertung: Auszählen der Koloniebildenden Einheiten KBE/1ml (Lupe!) Membranfiltrationsverfahren (E.coli, Coliforme Bakterien..) Die sterile Filtrationsanlage wird an ein Unterdruck erzeugendes Gerät angeschlossen. Sterile Membranfilter mit der Gitternetzseite nach oben auf die poröse Scheibe der Filterhalterung legen; dabei nur den äußeren Rand der Filtermembran (Porengröße 0,45µm) mit einer flachen, sterilen Pinzette anfassen. Den sterilen Filtrationsaufsatz sicher auf der Filterhalterung befestigen und ein entsprechendes Volumen (100ml) in den Filtrationsaufsatz gießen. Das Ventil zum Unterdruckerzeuger öffnen und Unterdruck anlegen, um das Wasser durch die Membran zu filtrieren. Den Filtrationsaufsatz entfernen (sicherstellen, dass der Verschlusshahn vorher geschlossen wurde) und die Membran auf eines der folgenden Medien übertragen, dabei sicherstellen, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Nährmedium eingeschlossen sind: Coliforme Bakterien (incl. E.coli) Enterokokken Pseudomonas aeruginosa Chromocult (37°C, 48h) Slanetz-Bartley (37°C, 48h) Cetrimid (37°C, 48h) Auswertung: Auf selektivem oder differenzierendem Nährmedium (z.B. Chromocult) nur die Kolonien, die ein für den gesuchten Organismus charakterisitisches Aussehen haben, zählen. Für eine genauere Charakterisierung sind Bestätigungstests notwendig. 29 Zählung durch Beimpfen von Flüssigmedium (E.coli, Coliforme Bakterien..) Untersuchungsvolumina einer Wasserprobe werden in flüssiges Medium eingeimpft um das Wachstum eines bestimmten Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen sicherzustellen. Die Anzahl der mit höchster Wahrscheinlichkeit (en: MPN: most probable number) in der Originalprobe vorhandenen Mikroorganismen und die Präzision der Berechnung können über statistische Verfahren auf der Basis der Anzahl positiver und negativer Testvolumina nach der Inkubationszeit berechnet werden. Colilert- 18 Testkit (MPN) Colilert-18 ist zum gleichzeitigen Nachweis von Gesamtcoliformen und E.coli im Wasser bestimmt. Testprinzip: Gesamtcoliforme, die den Nährstoff-Indikator ONPG metabolisieren, verfärben die Probe gelb. E.coli, die den Nährstoff-Indikator MUG metabolisieren, zeigen sich durch eine Fluoreszenz der Probe. Anwendung: Den Inhalt einer Packung (Colilert-Testkit) mit 100ml Wasserprobe mischen, in ein Behältnis (Quanti-Tray) überführen, versiegeln und inkubieren. Auswertung: Auf Gelbfärbung und Fluoreszenz prüfen, auszählen und die wahrscheinlichste Zahl (MPN) anhand der dem Testkit beiliegenden Tabelle ermitteln. 30 Chemische Analytik Bestimmung der Gesamthärte (Summe Ca, Mg) durch komplexometrische Titration Allgemeines: Ca und Mg-Ionen kommen in allen natürlichen Wässern vor und werden oft als Härtebildner bezeichnet. Als „Härte“ eines Wassers wird seine Eigenschaft bezeichnet, aus Seifenlösungen unlösliche Calcium- und Magnesiumsalze der höheren Fettsäuren auszufällen. Beurteilung der Gesamthärte : 0° 4° 8° 18,0° dH dH dH dH - 3,9 ° - 7,9 ° - 17,9 ° - 30 ° > 30 ° dH: dH: dH: dH: dH: sehr weich weich mittelhart hart sehr hart Reagenzien: Na-EDTA 0,05 mmol Triethanolamin Indikatorpuffertabletten (Eriochromschwarz T) Ammoniak-Lösung conc. Geräte: Vollpipette 50 ml Plastikbecher 100 ml Digitalbürette Brandt 25 ml Magnetrührer + Rührknochen Durchführung: 50 ml der titrierten Wasserprobe (Karbonathärte mit 0,1 N HCL) werden mit einer Indikatorpuffertablette sowie einigen Tropfen Triethanolamin und einem Milliliter Ammoniaklösung conc. versetzt. Nach ca. 10 min. Standzeit (bis sich die Indikatorpuffertablette gelöst hat) wird mit 0,05 mmol Na-EDTA bis zum Endpunkt titriert. (Farbumschlag von rot auf graugrün). Auswertung: Summe Erdalkalionen in mmol = axMx1000 V a: Verbrauch EDTA-Lösung in ml M: Molarität der EDTA-Lösung. (0,05 mmol) V: Probevolumen in ml (50 ml) Umrechnung in ° dH: ° dH = mmol Erdalkali x 5,6 Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben. (Festlegung: 1° dH ^ 10 mg ( Ca 0 und Mg 0) 31 Bestimmung der Karbonathärte (+m-Wert) durch Titration Allgemeines: Die Karbonathärte ist ein Teil der Gesamthärte. Sie entspricht dem Anteil der Erdalkaliionen, meist Ca und Mg-Ionen, der den im Wasser gelösten Hydrogencarbonat. (HCO -) und 3 Karbonationen (CO 2-) äquivalent ist. Das Verfahren ist für Trink-und Oberflächenwasser, bei 3 denen der pH-Wert größer als 4,3 ist, anwendbar. Reagenzien: HCl 0,1N Methylorange Geräte: Vollpipette 50 ml Plastikbecher 100 ml Digitalbürette Brandt 25 ml Magnetrührer + Rührknochen Durchführung: 50 ml Wasserprobe werden mit einer Vollpipette in einen 100 ml Plastikbecher überführt und mit 0,1 N HCL gegen Methylorange (3 Tropfen) bis zum Endpunkt titriert. Farbumschlag von gelb auf Zwiebelschalenfarben (entspricht pH 4,3). Auswertung: °dH KH = + m-Wert x 5,6 + m - Wert ist bezogen auf 50 ml Wasserprobe. Diese Berechnung gilt im pH-Bereich 4,3 - 8,3 Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben. Literatur: DEV H 7 ( Bestimmung der Säurekapazität ) Hütter S 247 ff, 307, 207, 71 32 Bestimmung des pH-Wertes im Trink- und Oberflächengewässer Allgemeines: Der pH-Wert ist der negativ dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen - Aktivität H+ (mol/l) und ist temperaturabhängig. pH = - log H + (gilt für Lösungen, in denen die H+ - Ionen 100 % dissoziiert vorliegen) In natürlichen Wässern liegen die pH-Werte meist zwischen 6,5 und 8,5. Reagenzien: Boratpufferlösung Phosphatpufferlösung KCl-Lösung 3 M pH 9,22 pH 6,88 Gerät: pH-Elektrode: Hamilton-Gelplast WTW pH 521 Magnetrührer + Rührknochen Plastikbecher 100 ml Durchführung: Die Routinemessung erfolgt mittels WTW pH 521 im Eichbereich 6,88-9,22 bei Raumtemperatur (20°C). Die Eichung ist routinemäßig 1 mal wöchentlich durchzuführen und täglich durch geeignete Kontrollen (Puffer) zu prüfen. Der pH-Wert der Probe muss im Eichbereich liegen, ansonsten ist ein anderer Bereich neu einzueichen (zB 2,00 - 6,88). 50 - 80 ml werden in den Plastikbecker überführt. Die pH-Elektrode wird in die Probe eingetaucht (ca. 3-4 cm) und die Messung erfolgt unter langsamen Rühren , bis sich ein konstantes Messsignal eingestellt hat. Die Elektrode wird nach der Messung in 3 M KCl aufbewahrt. Angabe der Ergebnisse : Das Ergebnis wird auf 2 Stellen nach dem Komma angegeben. Die Bezugstemperatur ist Raumtemperatur (20°C). Bei vielen Untersuchungen (Badewässer, Oberflächenwässer) ist es notwendig, den pH-Wert vor Ort zu messen. Literatur: DEV, C 5 ÖNORM M 6244 ÖNORM M 6259/55 33 Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit Allgemeines: Die elektrische Leitfähigkeit ( LF ) ist der reziproke Wert des elektrischen Widerstandes ( R ). Die elektrische Leitfähigkeit von Wässern beruht ganz allgemein auf deren Gehalt an Ionen (abhängig von Konzentration und Dissoziationsgrad der Elektrolyte, Wertigkeit, Ionenbeweglichkeit in Feldrichtung und Temperatur). Im Wasser sind die Wertigkeit und die Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen konstant, daher ist bei konstanter Temperatur die elektrische Leitfähigkeit eine Funktion der Ionenkonzentration. Reagenzien: KCl 0,01 N ( ^ bei 25°C 1413 µS/cm) Geräte: Plastikbecher 100 ml Messzelle WTW LTA 1 (LF-Elektrode) Temperaturfühler WTW TFK 530 WTW LF 530 Magnetrührer + Rührknochen Durchführung: Vor jeder Messserie muss die Zellenkonstante mit einer 0,01 N KCL-Lösung (^1413 µS/cm) überprüft werden, wenn nötig, ist eine Korrektur der Zellkonstante erforderlich. In den Plastikbecher werden 60 - 80 ml Wasserprobe eingefüllt und mittels Elektrode und Temperaturfühler wird unter langsamen Rühren, bis sich ein konstantes Messsignal eingestellt hat, die elektrische Leitfähigkeit bestimmt. Auswertung: Angabe der Ergebnisse in µS/cm bei einer Bezugstemperatur von 25°C ohne Kommastelle. Der Wert erlaubt Rückschlüsse auf den Gesamtsalzgehalt und zur weiteren Kontrolle kann die Mindestleitfähigkeit aus ( Kappa ) dem + m-Wert berechnet werden. Kappa = + m-Wert . 80 (µS/cm) Bei technischen Untersuchungen muss die elektrische Leitfähigkeit vor Ort bestimmt werden. Literatur: DEV, C 8 ÖNORM M 6241 ÖNORM M 6259 Bedienungsanleitung des Geräteherstellers (WTW) 34 10. BLUT Differentialblutbild Zur Herstellung von brauchbaren Ausstrichpräparaten des Blutes ist die Verwendung exakt gereinigter Objektträger wesentlich. Ausgestrichen wird im Allgemeinen mit einem zweiten Objektträger. Es muss auf eine optimale Schichtdicke des Ausstrichs geachtet werden, da Ausstrichpräparate mit zu großer Schichtdicke grundsätzlich überfärbt werden und eine Analyse zellulärer Feinstrukturen dadurch unmöglich ist, während bei Ausstrichpräparaten mit zu geringer Schichtdicke mehr oder minder viele weiße Zellelemente in lädiertem Zustand gefunden werden. Die am häufigsten angewandte Färbung der Blutausstriche nach Pappenheim beginnt mit einer 3-5 minütigen Einwirkung der Farblösung nach May-Grünwald, wobei gleichzeitig eine Alkoholfixierung des Präparates stattfindet. Danach wird mit Aqua dest. abgespült. Hierauf erfolgt eine 15-20 minütige Färbung mit verdünnter Giemsa-Lösung. Entscheidend ist dabei der pH-Wert, der möglichst neutral sein sollte, wobei die Färbezeit bei gering saurem pH etwas verlängert, bei gering alkalischem pH etwas verkürzt wird. Anschließend wird das Präparat getrocknet. Physiologisches Differentialblutbild Stabkernige neutrophile Granulozyten Segmentkernige neutrophile Granulozyten Basophile Granulozyten Eosinophile Granulozyten Monozyten Lymphozyten 0 - 4% 50 - 70% 0 - 1% 1 - 4% 2 - 8% 25 - 45% Pathologisches Differentialblutbild • Bakterieller Infekt: Bei einer bakteriellen Infektion ist der prozentuelle Anteil der Granulozyten erhöht. Zusätzlich findet sich eine mehr oder minder ausgeprägte Vermehrung der Stabkernigen (=Linksverschiebung). Bei Abklingen der bakteriellen Infektion kann oft eine Zunahme der Eosinophilen (=eosinophile Morgenröte) beobachtet werden. • Viraler Infekt: Bei einer viralen Infektion kommt es zu einer reaktiven Vermehrung der Lymphozyten. • Infektiöse Mononukleose: Bei der infektiösen Mononukleose kommt es zum Auftreten von lymphatischen Reaktionsformen (Lymphoidzellen). Sowohl Kerngröße als auch Zytoplasmadurchmesser können mehr als das Doppelte eines normalen Lymphozyten erreichen. Besonders charakteristisch ist der weite Plasmasaum von unterschiedlich starker Basophilie. • Infektanämie: Bei schweren Infektionen kann man im Erythrozytenbild anämische Veränderungen beobachten. Dabei treten eine Anisozytose (=Größenunterschiede der Erythrozyten) und eine mehr oder minder stark ausgeprägte Poikilozytose (=Formunterschiede der Erythrozyten) auf. Viele Infektanämien sind lange normochrom, daher treten Anulozyten (=Ringformen der Erythrozyten) meist erst bei chronischen Infektionen auf. 35 Blutvolumen Beim erwachsenen Menschen beträgt das Blutvolumen etwa 6-8% des Körpergewichts. Das entspricht ca. 5-6 Litern Blut. Männer haben im Durchschnitt mehr Blut als Frauen. Funktionen des Blutes I. Transportfunktionen 1. Respiratorische Funktion: - Sauerstofftransport durch Erythrocyten, - Kohlendioxydtransport im Blutplasma 2. Ernährungsfunktion: Nährstoffe werden zu Organen transportiert 3. Entschlackung: Transport der Stoffwechselendprodukte zu Ausscheidungsorganen 4. Humorale Funktion: Transport von Hormonen zu Erfolgsorganen 5. Regulationsfunktion: Verteilung von Wasser und Salzen im Körper (osmotische Regulation) II. Wärmeregulation Eine mehr oder weniger starke Blutversorgung eines Körperteils führt zu einer mehr oder weniger starken Erwärmung. III. Eigenfunktion des Blutes 1. Pufferung: Säure-Basen-Gleichgewicht im Körper muss konstant gehalten werden. (Kohlensäure-Bicarbonat-Puffer, Hämoglobin) 2. Blutgerinnung: Fibrin und Thrombocyten 3. Abwehrfunktion: γ-Globuline, weiße Blutkörperchen Zusammensetzung des Blutes Blutplasma Das Blut setzt sich aus zu 55% aus flüssigen Bestandteilen (=Blutplasma) und zu 45% aus festen Bestandteilen (=Blutzellen) zusammen. Blutplasma besteht zu 90% aus Wasser und zu 10% aus darin befindlichen Substanzen wie gelösten Salzen und Eiweißkörpern. Bluteiweiße: Albumin α-Globuline β-Globuline µ-Globuline Fibrinogen Blutserum: Blutplasma ohne Fibrinogen Blutzellen 45% der Blutvolumens sind feste Bestandteile (=Blutzellen) Erythrocyten: rote Blutkörperchen: 4,5-5,5 Millionen / mm³ Leukocyten: weiße Blutkörperchen: 6.000-8.000 / mm³ Thrombocyten: Blutplättchen: 150.000-300.000 / mm³ 36 ERYTHROCYTEN Anzahl: 4,5-5,5 Millionen / mm³ Anzahl steigt bei dauernder vermehrter Muskelaktivität und bei längerem Aufenthalt in größen Höhen Lebensdauer: 110-130 Tage Regeneration erfolgt im roten Knochenmark Abbau erfolgt bereits im Blut, in der Milz und in der Leber Form: bikonkave, runde Scheiben, kernlos, sehr formellastisch; zentrale Eindellung dient der Oberflächenvergrößerung; die Gesamtoberfläche aller Erythrozyten eines Menschen beträgt 3.000-4.000 m². Funktion: Sauerstofftransport durch reversible Bindung an das zentrale Eisenatom des Hämoglobins. Kohlendioxid wird als Kohlensäure hauptsächlich im Blutplasma transportiert. LEUKOCYTEN Anzahl: 6.000-8.000 / mm³ Anzahl kann stark schwanken. Bei akuten Erkrankungen kommt es zu einer Vermehrung der Leukocytenanzahl (spez. neutrophile Granulocyten). Leukämie: bis zu 500.000 / mm³ Form: kernhältige Blutzellen, Zellen mit stark granuliertem Cytoplasma: Granulocyten: neutrophile Granulocyten: eosinophile Granulocyten: basophile Granulocyten: Lymphocyten: 20-35% Monocyten: 4-8% 56-75% 2-4% 0-1% Lebensdauer: Granulocyten: 1-10 Tage Lymphocyten: wenige Tage bis mehrere Jahre Bildung erfolgt im Knochenmark, Lymphocyten werden zusätzlich im Thymus, der Milz und den Mandeln gebildet. Abbau erfolgt teils im Blut, im Gewebe und der Milz. Eigenschaften: Granulocyten: amöboid beweglich, können ins Gewebe einwandern. Phagocytose von Bakterien und kleinen Fremdstoffen Lymphocyten: verschiedene Formen: B- und T-Lymphocyten wichtige Rolle bei humoraler Abwehr und spezifischer Immunantwort. Monocyten: "Freßzellen", Phagocytose GRANULOCYTEN Durchmesser : 9-12µm Neutrophile Granulocyten Zellkern: stabkernige Granulocyten: Jugendformen segmentkernige Granulocyten: stark gelappter Zellkern Granula: feine Granula im Cytoplasma, färbt sich blau an (Giemsa) 37 Eosinophile Granulocyten meist etwas größer als neutrophile Granulocyten Zellkern: besteht meist aus 2 Segmenten Granula: relativ große Granulation, färbt sich rot an (Giemsa) Basophile Granulocyten Zellkern: verhältnismäßig groß, meist kugelig Granula: große Granula, färbt sich blau an LYMPHOCYTEN Form: kugelige Zellen, nicht granuliert Zellkern: relativ großer Kern, mehr oder weniger kugelig aber nie segmentiert, färbt sich stark an MONOCYTEN Form: große vielgestaltige Zellen, Durchmesser: 12-20µm, Cytoplasma ist nicht granuliert Zellkern: grobmaschig strukturiert, meist nierenförmig 38 39 40 41 42 43 11. Ektoparasiten Parasiten, die Menschen und Haustiere befallen und sich von ihrem Blut ernähren. LÄUSE Läuse können den Kopf, die Kleidung und den Genitalbereich des Menschen befallen. Man unterscheidet Kopfläuse (2-3mm lang), Filzläuse (ca. 2mm, rundlich, flach) und Kleiderläuse (ca. 4mm lang). Die Eier der Läuse nennt man Nissen. Kleiderläuse Sitzen meist in den Falten und Nähten der Kleidung. Es kommt zu starkem Juckreiz und roten, durch die Läusebisse hervorgerufenen Pünktchen auf der Haut. Kleiderläuse kommen meist unter schlechten hygienischen Bedingungen vor. Da sie auch Überträger fiebriger Erkrankungen sein können, sollte ein Arzt aufgesucht werden. Filzläuse Filzläuse sitzen in den Scham-, Brust-, Achselhaaren oder an den Wimpern und werden durch intensiven Körperkontakt, z.B. beim Geschlechtsverkehr, übertragen. Es kommt zu Juckreiz, ekzemartigen Veränderungen und kleinen blauen Flecken an den Einstichstellen. Die Stiche jucken nicht immer. Manchmal können sie auch über Bettwäsche übertragen werden (können bis zu 4 Tage überleben). Kopfläuse Sitzen in den Kopfhaaren und kleben ihre weißlichen Nissen am Haaransatz nahe der Kopfhaut fest. Die Nissen lassen sich im Gegensatz zu Schuppen kaum abstreifen. Es kommt zu starkem Juckreiz auf der Kopfhaut. Läuse können nicht springen. Die Übertragung von Mensch zu Mensch erfolgt durch direkten Kontakt, durch ausgefallene, mit Nissen behaftete Haare oder durch gemeinsamen Gebrauch von Kämmen, Mützen etc. Oft sind Schul- oder Kindergartenkinder betroffen, da die Ansteckung dort sehr leicht von Kind zu Kind erfolgt. Kopfläuse haben nicht unbedingt etwas mit schlechten hygienischen Bedingungen zu tun. Biologie und Entwicklung der Kopflaus: Die Kopflaus (Pediculus capitis) ist ein spezifischer Ektoparasit des Menschen, der fast ausschließlich im Bereich des Kopfhaares lebt. Die 2,4-4,2 mm großen Weibchen legen nach der Begattung durch die Männchen (Körperlänge 2,0-3,0 mm) Eier (Nissen) an den Kopfhaaren, meist in Nähe des Haaransatzes, ab und werden dort mittels eines schnell härtenden und widerstandsfähigen Klebesekretes fest angekittet. Bei sehr starkem Befall können Nissen gelegentlich auch an anderen behaarten Stellen des Oberkörpers angetroffen werden, unter Umständen sogar an Stofffasern von Kopfbedeckungen, Halstüchern und Schals. Aus den Eiern schlüpfen nach etwa 8,5 Tagen Larven, die sich über 3 Larvenstadien innerhalb von 9-14 Tagen zu adulten Läusen entwickeln. Die erste Eiablage ist bereits 1-2 Tage nach Häutung des letzten Larvenstadiums möglich. Ein Weibchen kann bis zu 3 Wochen leben und in dieser Zeit täglich 2-9 (im Durchschnitt 4) Eier absetzen, so dass eine Gesamtzahl von maximal 90 Eiern zu erreichen ist. Die Generations-dauer beträgt mindestens 18 Tage. Sie ist von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit abhängig. Beide Geschlechter sowie die Larven saugen Blut, wobei die adulten Läuse mehrmals am Tage stechen. 44 Erkennen eines Befalls: In der Regel halten sich Kopfläuse in Nähe der Kopfhaut auf. Bei einer Überpopulation weichen sie auch auf das Deckhaar aus, so dass sie dann äußerlich sichtbar werden. Zu beachten ist, dass der durch den Stich hervorgerufene Juckreiz nicht bei jedem Befallenen zur Ausprägung kommt. Ein sicheres Befallzeichen sind die an den Kopfhaaren festgekitteten Läuseeier (Nissen). Nach ihnen ist bei einer Kontrolle systematisch zu suchen. Als bevorzugte Stellen der Eiablage kommen vor allem die Schläfen- und Ohrenregion, sowie der Nackenbereich und obere Haarwirbel in Betracht. Bei starkem Befall wird der gesamte behaarte Kopf erfasst. Um die Nissen zu finden, ist das Kopfhaar strähnchenweise auseinander zu kämmen. Eine Leselupe erleichtert das Erkennen. Die Eier fühlen sich wie kleine Sandkörnchen an und können nur schwer vom Haar abgestreift werden. Sie bleiben selbst als leere Eihüllen und auch nach einer Behandlung mit einem Läusemittel am Haarschaft haften. Allmählich wachsen sie mit den Haaren aus. Bei gewissenhafter Kontrolle und Zuhilfenahme einer Lupe lässt sich ein gewesener von einem frischen Befall unterscheiden. Intakte, lebensfähige Eier sind perlmuttglänzend, anfangs weißlich, später gelblich und dann bräunlich-gelblich. Der Inhalt ist durchscheinend und füllt mehr oder weniger das ganze Ei aus (Ei prall mit glatter Schale). Übertragung: Die Übertragung erfolgt durch direkten Kontakt von Mensch zu Mensch, oder indirekt über gemeinsam benutzte bzw. eng beieinander liegende und mit Läusen behaftete Kämme, Haarbürsten, Kopfbedeckungen, Schals, Handtücher, Kissen, Decken, Bettwäsche, textiles Spielzeug u.a. Maßnahmen: Ein Kopflausbefall muss unverzüglich behandelt werden. Um eine Weiterverbreitung möglichst zu unterbinden, sind Personen mit engem Kontakt zum Betroffenen (Familienangehörige, Kinder und Erwachsene in Einrichtungen des gemeinschaftlichen Zusammenlebens usw.) einer Kontrolle auf Kopflausbefall zu unterziehen und bei Feststellung von Läusen sofort zu behandeln. weitere Maßnahmen: • Wechsel von Handtüchern, Leib- und Bettwäsche • Handtücher, Leib- und Bettwäsche bei einer Mindesttemperatur von 60°C waschen. Unter Einhaltung dieser Temperatur sind 15 Min ausreichend. • Bei Oberbekleidung, Kopfbedeckungen und Schals ebenso verfahren oder sie in einem gut schließbaren Plastikbeutel bzw. -sack mindestens 3 Wochen aufbewahren (Zimmertemperatur, optimal wären Temperaturen > 24°C). • Läuse in Kleidungsstücken können auch mit feuchter Hitze (Dampf 50°C über 15 Min) oder trockener Hitze (Heißluft 45°C über 60 Min) abgetötet werden. • Ein Besprühen der Oberbekleidung mit läusetötenden Mitteln wäre eine weitere Variante. • Nicht waschbare textile Gegenstände (z.B. textiles Spielzeug) können auch in Kälteboxen eingebracht und bei Temperaturen unter -1°C eingefroren werden. Sie sollten dann mindestens 24 Stunden diesem Temperaturniveau ausgesetzt sein. • Matratzen, Rückenlehnen an Stühlen, Sofas und Sesseln sollten mit dem Staubsauger gründlich abgesaugt werden. Ggf. wäre auch ein Besprühen mit läusetötenden Mitteln denkbar. • Entwesen von Kämmen, Haar- und Kleiderbürsten durch Einlegen in mindestens 60°C heißes Seifenwasser über 15 Minuten. 45 FLÖHE Flöhe erkennt man leicht an ihrer seitlichen abgeplatteten Form. Tote Flöhe erwecken den Eindruck sie seien gewaltsam platt gedrückt worden. Lebende Flöhe bewegen sich sehr schnell mit ihren langen Sprungbeinen zwischen Haaren oder Federn. Die Bewegung wird ihnen dabei durch die Körperform erleichtert. Die kurzen, keulenförmigen Antennen können in seitlich am Kopf vorhandene Gruben gelegt werden. Ein Zurückrutschen wird durch die schräg nach hinten gerichtete Beborstung, vor allem durch die, aus Reihen dicker Borsten, gebildeter Kämme, verhindert. Im „freien Gelände“ kann sich der Floh durch große Sprünge fortbewegen, vor allem, wenn es um das Erreichen eines Wirtes geht. Vögelflöhe erreichen dabei bis zu 25 cm Weite; vom Menschenfloh, Pulex irritans, wurden Sprungweiten bis zu 35cm und Sprunghöhen bis zu 20cm beobachtet. Alle Flöhe sind flügellos; ihre Färbung ist gelbbraun bis schwarzbraun. Die Flöhe sind in beiden Geschlechtern Blutsauger an Warmblütern, an Vögeln (etwa 6%) und vor allem Säugetieren (etwa 94%). Sie sind wenig wirtsspezifisch. Der sog. Menschenfloh, Pulex irritans, saugt auch bei Haustieren (Hund, Schwein), Fuchs, Dachs und Mardern. Der sog. Hühnerfloh, Ceratophyllus gallinae, kommt in Wirklichkeit an zahlreichen Vogelarten vor und saugt auch am Menschen. Am Menschen oder in deren Wohnungen wurden bereits insgesamt 20 Säugerfloh- und Vogelfloharten angetroffen. Bei der Artbestimmung muss man daher sehr gründlich vorgehen und kann nicht einfach das Vorkommen bei einer Wirtsart für die „Namensgebung“ verwenden. Stichwirkung: Der Floh ist beim Blutsaugen leicht zu stören, sticht aber rasch wieder an einer anderen Stelle. Bei jedem erneuten Einstich jucken auch die früheren Stichstellen, so dass ein Floh den Eindruck erwecken kann, man habe es mit zahlreichen Flöhen zu tun. Flohstiche sind erkennbar als kleiner, dunkler, eventuell tagelang sichtbarer Punkt, umgeben von einem Hof geröteter und geschwollener Haut. Die Rötung geht im allgemeinen rasch zurück. Das Jucken hingegen kann tagelang anhalten. Im einzelnen sind die Reaktionen auf Flohstiche, wie bei allen Insektenstichen und allergischen Erscheinungen, individuell sehr verschieden. Bekämpfung: Die Bekämpfung der Flöhe und ihrer Brut erfolgt mit Insektiziden. Katzen, Hunde oder andere Kleintiere als Mitbewohner im Haus sind ideale Wirte für Flöhe. Man muss daher vor allem die Tiere entflohen, die Brut mittels Staubsauger aus Fugen und Ritzen entfernen, und anschließend Boden und Mobiliar (einschließlich der Schlafstellen der Tiere) mit einem unbedenklichen Sprüh- oder Nebelmittel (Naturpyrethrum) behandeln. Bewährte Mittel sind u.a. Streupuder, Waschshampoos und Sprays auf Pyrethrum-Basis. ZECKEN (Waldzecken: Ixodes ricinus = Holzbock) Der gewöhnliche Holzbock produziert zwar kein Gift, kann aber Überträger verschiedener Krankheitserreger sein. Einerseits können Zecken das FSME-Virus weitergeben, andererseits führen sie durch Übertragung des Bakteriums Borrelia burgdorferi zu der sogenannten ZeckenBorreliose. 46 Vorkommen/Verbreitung: Borrelien übertragende Zecken kommen überall in Mittel-, Ost-, und Nordeuropa, außerdem in Nordamerika und Australien vor. Für Zecken die eine Frühsommer-Meningoenzephalitis übertragen können sind sogenannte Endemiegebiete bekannt. Typische Lebensräume aller Zecken sind hohes Gras und lichte Wälder und Büsche, in denen sie auf Blättern und Zweigen sitzen. Sie lassen sich von Menschen und Tieren abstreifen und suchen an ihnen feuchtwarme Körperpartien auf. Typische Merkmale: Eiförmiger rot- bis hellbräunlicher Körper mit hartem Rückenschild von 1-2 mm Größe, in vollgesogenem Zustand bis zu 1 cm. Am kleinen dunkler gefärbten Kopf befinden sich Mundwerkzeuge, die speziell zum Stechen und Saugen ausgebildet sind. Bei Larven findet man drei Beinpaare, bei den etwas größeren Nymphen und Adulten jeweils vier. Zwischen den einzelnen Entwicklungsabschnitten muss eine Blutmahlzeit aufgenommen werden. Diese dauert bei den Larven zwei bis vier, bei weiter entwickelten Nymphen drei bis fünf Tage. Symptome: Zecken hinterlassen nach ihrer Blutmahlzeit eine kleine juckende Einstichstelle, die durch sekundäre Infektion mehr oder weniger stark gerötet und empfindlich sein kann. Etwa die Hälfte aller Zeckenbisse bleibt unbemerkt. Zecken sollten sofort aus der Haut entfernt werden. Nach Möglichkeit sollte dies mit einer speziellen Zeckenzange (aus der Apotheke) erfolgen. Die Zecke wird damit gefaßt und unter vorsichtigem Drehen entfernt. Quetschen ist bei der Entfernung unbedingt zu vermeiden. Keine Anwendung von Öl oder Klebstoff! Sorgfältige Wunddesinfektion! Bei Auftreten von Symptomen, die zur Frühsommer-Meningoenzephalitis oder Lyme-Borreliose passen, ist ein Arzt aufzusuchen. Vorbeugende Maßnahmen: Schutz vor Zeckenbissen durch geeignete Kleidung die möglichst viel Hautfläche bedeckt. Nach Waldspaziergängen den Körper nach Zecken absuchen. Anwendung von Repellent Produkten. 47
