Nachweis und Bestimmung eines Hyaluronat-Protein

414
H. GREILING, W. MOHR UND G. BENEKE
Nachweis und Bestimmung eines Hyaluronat-Protein-Komplexes
in der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach Injektion von Phytohämagglutinin
Occurence and Estimation of a Hyaluronate Protein Complex in the Peritoneal Fluid
of Rats after Injection of Phytohemagglutinin
H . G R E I L I N G , W . M O H R u n d G . BENEKE
Klinisch-Chemisches Institut der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
und Abteilung Pathologie II der Universität U l m
(Z. Naturforsch. 27 b, 414—419 [1972] ; eingegangen am 20. Dezember 1971)
In the peritoneal fluid of rats hyaluronate is produced after intraperitoneal injection of phytohemagglutinin.
The hyaluronate concentration was quantitated spectrophotometrically after enzymatic degradation by hyaluronatlyase and a maximum amount of 90 mg% hyaluronate was found after intraperitoneal injection. T h e production of hyaluronate after phytohemagglutinin injection is dependent on the time and concentration of the phytohemagglutinin. M a x i m u m hyaluronate synthesis
is about 48 h after phytohemagglutinin, after this time the hyaluronate concentration is decreased.
A f t e r phytohemagglutinin stimulation we isolated a hyaluronate protein complex from the
peritoneal fluid by cetylpyridinium chloride precipitation followed by chromatography on Biogel
P-150. T h e dominating amino acids were aspartic acid and glutamic acid.
MOHR und M i t a r b b . 1 - 3 beschrieben nach der
intraperitonealen Injektion von Phytohämagglutinin
bei der Ratte das Auftreten von Siegelringzellen im
Mesothelzellverband und in der Peritonealflüssigkeit. In den Siegelringzellen der Peritonealflüssigkeit konnte Alcian-blau anfärbbares Material nachgewiesen werden 1 . Die Peritonealflüssigkeit war
viskos und enthielt Hyaluronsäure 2 .
Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war
die Aufklärung der chemischen Zusammensetzung
und Struktur des in der Peritonealflüssigkeit auftretenden Glykosaminoglykans.
Material und Methode
Die Untersuchungen wurden an insgesamt 55 männlichen SIV-50-Ratten (S. Ivanovas, Kißlegg/Allgäu)
mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 70 g
durchgeführt. Drei Kontrolltiere blieben unbehandelt,
12 Versuchstiere erhielten intraperitoneal je 1,0 ml
einer 1-proz. Rinderserumalbuminlösung (Behringwerke AG, Marburg/Lahn, gelöst in physiologischer
Kochsalzlösung) injiziert. Durch die Applikation der
Rinderserumalbuminlösung, die zum Auftreten von
neutrophilen Granulozyten in der Peritonealflüssigkeit
führt, sollte ausgeschlossen werden, daß eine entzündliche Reaktion den alleinigen Stimulus zur Hyaluronsäureproduktion darstellt. 40 Versuchstieren wurde
intraperitoneal Phytohämagglutinin verabreicht (PHA-P,
Sonderdruckanforderungen an Priv.-Doz. Dr. H. GREILING,
Klinisch-Chem. Zentrallaboratorium d. M e d . Fakultät,
D-5100 Aachen, Goethestr. 2 7 - 2 9 .
Difco Laboratories, Detroit; der Inhalt einer Handelsflasche, entsprechend 50 mg PHA-P Trockensubstanz,
wurde mit 5,0 ml Aqua dest. rehydriert). Zu den gewählten Versuchszeiten (vgl. Tabn. 1 u. 2) wurden die
Tiere in Äthernarkose dekapitiert und Peritoneal- und
Pleuroflüssigkeit mit einer sterilen Pasteurpipette entnommen.
Bestimmung der Hyaluronsäurekonzentration in Abhängigkeit von der Zeit nach der
Phytohämagglutinin jektion und von der applizierten PhytohämagglutininM enge
a) Die unbehandelten Kontrolltiere wurden zu Versuchsbeginn getötet. Die Versuchstiere die i.p. Rinderserumalbumin-Lösung erhalten hatten, wurden 24 und
48 Stdn. nach der Injektion getötet.
Zur Ermittlung der Abhängigkeit der Hyaluronsäure-Konzentration in der Peritonealflüssigkeit von der
Zeit nach der Injektion erhielten 14 Versuchstiere jeweils 1,0 ml PHA-P. Diese Tiere wurden nach 24, 48,
72 und 120 Stdn. getötet. Die Abhängigkeit der Hyaluronsäurekonzentration in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit von der Menge des applizierten PHA-P
wurde an 10 Tieren untersucht. Die Tiere erhielten
intraperitoneal 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 mg
PHA-P injiziert und wurden nach 48 Stdn. getötet.
21 weitere Tiere erhielten jeweils 10 mg PHA-P
intraperitoneal injiziert. Die nach 48 Stdn. gewonnene
Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit wurde gepoolt und
zur chemischen Charakterisierung der Hyaluronsäure
verwandt.
b) Quantitative Bestimmung der Hyaluronsäure: Die
enzymatische Bestimmung der Hyaluronsäure wurde
mit Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.99.1) aus Streptokokken
durchgeführt, die Hyaluronsäure quantitativ in ein un-
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HYALURONAT-PROTEIN-KOMPLEXE IN DER PERITONEALFLÜSSIGKEIT VON RATTEN
gesättigtes Disaccharid abbaut. Dabei werden iV-Acetylglucosamin-Endgruppen freigesetzt. Mit der kolorimetrisdien Methode nadi MORGAN-ELSON wird die Bestimmung photometrisch bei 585 nm durchgeführt 4 . Die
spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der
Hyaluronsäure konnte wegsn störender UV-absorbierender Substanzen in der Peritonealflüssigkeit nicht
durchgeführt werden.
Isolierung des Hyaluronat-Protein-Komplexes
Peritonealflüssigkeit
aus
Der Hyaluronat-Protein-Komplex wurde nach folgenden zwei Verfahren präparativ isoliert:
a) Die Peritonealflüssigkeit wurde bei 2000 g (Temperatur 0 °C) abzentrifugiert und mit dem 3-fachen
Volumen Natriumacetat-gesättigten Alkohol gefällt.
Der mit Äthanol und Äther gewaschene Niederschlag
wurde getrocknet und anschließend in 6 ml H 2 0 gelöst.
Danach erfolgte 24 Stdn. bei 50 — 55 °C eine Proteolyse des Proteoglykans mit Papain (Verdauungspuffer:
0,005 M Cysteinhydrochlorid, 0,005 M Titriplex III,
0,1 N Natriumacetat pH 6 ) . Die Lösung wurde nach
der Proteolyse mit HCl auf einen pH von 1,3 eingestellt und die ausgefallenen Nukleotide bei 17000 g
abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem 6-fachen
Volumen Natriumacetat-gesättigten Alkohol versetzt
und der Niederschlag nach 12-stdg. Stehen bei 0 bis
4 °C bei 17000 g abzentrifugiert und zweimal mit
Äthanol gewaschen und getrocknet (Ausbeute: aus
14 ml Peritonealexsudat 61 m g ) . Anschließend erfolgte
eine Repräzipitation durch Auflösen des Niederschlages
in 16 ml H 2 0 , abzentrifugieren bei 20000 g, wiederum
Fällung mit der 3-fachen Menge Natriumacetat-gesättigten Alkohols und 3-faches Waschen mit Äthanol
(Ausbeute: 33 m g ) . Die Hyaluronsäure wurde in 15 ml
H 2 0 gelöst und an einer Biogel-P-150-Säule (H =
57 cm, D = 1,4 cm) chromatographiert. Die Elution
erfolgte mit 10-proz. Äthanol, der Nachweis der Hyaluronsäure enthaltenden Fraktionen wurde über die
Glucuronsäurebestimmung mit der Carbazolreaktion
durchgeführt.
b) Da der Hyaluronat-Protein-Komplex mit Cetylpyridiniumchlorid fällbar ist, wurde für die zweite
Darstellung 10 ml des vorher hochtourig (20000 g)
abzentrifugierten Peritoneal-Exsudates mit 1,5 ml einer
5-proz. Cetylpyridiniumchloridlösung (CPC) versetzt.
Dabei kommt es ebenfalls, wie bei der Hyaluronsäure
aus Nabelschnur, zu einem fädigen CPC-Hyaluronatniederschlag. Nach Waschen des Niederschlags mit
5-proz. CPC-Lösung und Abdekantieren der CPC-Lösung wurde der Niederschlag mit 8 ml Natriumchloridgesättigtem Alkohol versetzt und 48 Stdn. stehen gelassen. Nach erneutem Abzentrifugieren und Dekantieren
wurde der Niederschlag noch zweimal mit Äthanol und
Äther gewaschen. Die getrocknete Substanz wurde in
10 ml 0,05 N Natriumacetat gequollen (8 Stdn.),
dann homogenisiert und bei 20000 g zentrifugiert. Die
klare Lösung wurde anschließend an Biogel P-150 chromatographiert, wobei als Elutionsmittel 0,05 N Natriumacetat verwandt wurde. Das eluierte Hyaluronat
415
erschien in den gleichen Fraktionen wie gereinigte
Hyaluronsäure aus Nabelschnur. Die mit der Carbazolreaktion identifizierten Röhrcheninhalte wurden gepoolt, eingeengt und mit dem 3-fachen Volumen an
Natriumacetat-gesättigten Alkohol versetzt.
Nachweis des ungesättigten Disaccharids aus dem isolierten Hyaluronat-Protein-Komplex
nach Hyaluronatlyasebehandlung
Die nach den Verfahren a und b isolierten Hyaluronat-Protein-Komplexe wurden in 2,5 ml
Phosphatpuffer pH 6,4 gelöst. Es wurde vom Ungelösten abzentrifugiert und nach Zugabe von 0,5 ml 0,15 M NaCl-Lösung 0,1 ml Hyaluronatlyase aus Streptokokken zugegeben. Nach 5-stdg. Inkubation wurde der Ansatz mit
0,5 ml (ca. 20% w/v) Perchlorsäure versetzt und das
UV-Spektrum mit dem UV-Spektralphotometer DK 2
bestimmt 4 . Das durch Hyaluronatlyase aus Hyaluronsäure entstehende 4,5-ungesättigte Uronid konnte
ebenfalls aus einem Mikroansatz papierchromatographisch nach Anfärbung mit dem Morgan-Elson-Reagenz
und durch seine UV-Absorption nachgewiesen werden 5
und wurde mit reinem Disaccharid, das aus Nabelschnur-Hyaluronsäure nach Hyaluronatlyasebehandlung
gewonnen wurde, verglichen.
Sedimentationsversuche
(Phywe U 60 H)
der analytischen
Ultrazentrifuge
Die Peritonealflüssigkeit wurde für diese Versuche
unverdünnt, oder mit physiologischer Kochsalzlösung
1 : 2 verdünnt, verwendet. Die Sedimentation wurde im
50 000-UPM-Rotor bei 20 °C durchgeführt.
Bausteinanalysen
Komplexes
des isolierten
Hyaluronat-Protein-
Die quantitative Bestimmung der Hexosamine und
der Aminosäuren wurde mit einem Aminosäurenanalysator (Technicon) durchgeführt. Zur Hydrolyse wurden
etwa 5 mg des Hyaluronat-Protein-Komplexes in 2,5 ml
3 N HCl gelöst. Die Substanz wurde in Anlehnung an
das Verfahren von MOORE und STEIN 6 in
Bomben-
rohren durch zweimaliges Einfrieren und Auftauen im
Vakuum von Luftsauerstoff befreit und nach Abschmelzen der Bombenrohre im Vakuum 20 Stdn. bei 105 °C
hydrolysiert. Die Trennung zwischen Glucosamin und
Galaktosamin und den Aminosäuren erfolgte nach
einem bereits früher beschriebenen Verfahren 7 .
Ergebnisse
Quantitative
Bestimmung
der
Hyaluronsäure
Die Peritonealflüssigkeit unbehandelter Kontrolltiere und Versuchstiere 2 4 bzw. 4 8 Stdn. nach der
Rinderserumalbumininjektion enthält keine Hyaluronsäure
(Tab. 1 ) .
Nach
der
intraperitonealen
PHA-Injektion dagegen ließ sich schon nach 2 4 Stdn.
Hyaluronsäure nachweisen (Tab. 1 ) . Das Maximum
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416
Hyaluronsäure-Konzentration
24
48
Versuchstiere nach R S A i.p.
0
0
Versuchstiere nach P H A i.p.
55,1
Versuchszeit [Stunden]
120
72
75,1
(43,3-64,4)
[mg-%]
(61,5-91,0)
52,6
(21,3-83,9)
3,0
(0-6)
T a b . 1. Mittlere Hyaluronsäure-Konzentration in der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach i.p. Injektion von R S A
serumalbumin) bzw. P H A (Phytohämagglutinin) in A b h ä n g i g k e i t von der Versuchszeit.
Menge des injizierten P H A
1,0
4,0
2,0
6,0
(Rinder-
8,0
10,0
[mg]
Hyaluronsäurekonzentration
in d e r P e r i t o n e a l f l ü s s i g k e i t
0
Hyaluronsäurekonzentration
in d e r P l e u r a f l ü s s i g k e i t
T a b . 2.
52,7
(49,1-56,3)
27,9
(16,1-39,8)
20,9
49,7
( 4 9 , 5 -- 4 9 , 9 )
69,9
( 6 4 , 2 - -75,7)
56,0
41,5
43,8
(34,1-- 5 3 , 6 )
46,0
( 3 5 , 6 - -56,4)
63,3
52,5
A b h ä n g i g k e i t der Hyaluronsäurekonzentration [mg-%] in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit von der M e n g e des
intraperitoneal injizierten P H A (Phytohämagglutinin, 4 8 h p . i . ) .
der Hyaluronsäure-Konzentration war nach 4 8 Stdn.
2-desoxy-D-glucose)
erreicht.
charakteristisches U V - M a x i m u m bei 2 3 2 nm identi-
72 Stdn.
nach
der
Hyaluronsäure-Konzentration
Injektion
gering
war
die
abgesunken,
fiziert.
Ebenfalls
wurde
zeigt das
ebenfalls
durch
sein
Kondensationsprodukt
nach 1 2 0 Stdn. waren nur noch Spuren von Hyalu-
von Dimethylaminobenzaldehyd mit dem Disaccharid
ronsäure vorhanden (Tab. 1 ) .
aus Hyaluronsäure, das durch A b b a u von Perito-
Wie
aus Tab. 2 hervorgeht, ist
Hyaluronsäure
nach der intraperitonealen Injektion nicht nur in der
nealflüssigkeit
mit
Hyaluronatlyase
wrurde, zwrei Absorptionsmaxima
gewonnen
bei 5 4 4 nm und
Peritoneal-, sondern auch in der Pleuraflüssigkeit
585 nm, wenn die Reaktion nach LELOIR 8 ausge-
nachweisbar. Es findet sich dabei eine Abhängigkeit
führt wird.
Körper-
b ) Die Ergebnisse der Aminozuckeranalyse und
höhlen von der Menge des applizierten Phytohäm-
der Hyaluronsäure-Konzentration
der Aminosäurenanalyse der isolierten Hyaluronat-
agglutinins. Während sich nach der Injektion von
Protein-Komplexe aus dem Peritonealexsudat zeigt
1 mg Phytohämagglutinin
in den
nur in der
Peritoneal-
Tab. 3. Beide Substanzen weisen einen relativ hohen
flüssigkeit Hyaluronsäure nachweisen läßt, kommt es
Asparaginsäure- und Glutaminsäuregehalt auf. Die
von einer PHA-Menge von 2 mg an in beiden Kör-
nach Proteolyse mit Papain gewonnene Substanz hat
perhöhlen zum Auftreten von Hyaluronsäure. In der
einen doppelt so hohen Hyaluronsäuregehalt wie die
Pleuraflüssigkeit ist die Konzentration der Hyalu-
mit Cetylpyridiniumchlorid gefällte Substanz. Inter-
ronsäure etwas geringer als in der Peritonealflüssig-
essanterweise konnte in beiden Präparaten Galak-
keit. Die maximale Konzentration wurde in der Peri-
tosamin in Spuren nachgewiesen werden.
tonealflüssigkeit nach etwa 6 mg Phytohämagglutinin beobachtet.
Identifizierung
des
Hyaluronat-Protein-Komplexes
in der Peritonealflüssigkeit
nach
Phytohämaggluti-
nin-Stimulation
a)
Das
Die Aminosäurenzusammensetzung
Ähnlichkeit
isolierte
mit
aus humaner
dem
weist
große
Hyaluronat-Protein-Komplex
Synovialflüssigkeit
Substanz hat einen relativ hohen
auf. Auch
diese
Asparaginsäure-
und Glutaminsäuregehalt 9 .
c) In der nativen Peritonealflüssigkeit wurde nach
Proteohyaluronat
wird
durch
der
Phytohämagglutinin-Applikation
ein
spitzer
Hyaluronatlyase zu einem ungesättigten Uronid ab-
Extragradient bei der analytischen Ultrazentrifugen-
gebaut, welches papierchromatographisch nachgewie-
untersuchung ( 5 0 0 0 0 g ) nachgewiesen. Dieser spitze
sen werden kann und identisch ist mit dem Disaccha-
Extragradient verschwindet, wenn man die Perito-
rid, welches aus Nabelschnurhyaluronsäure isoliert
nealflüssigkeit mit Hyaluronatglykanohydrolase be-
werden kann. Diese 4,5-ungesättigte Uronid (D-zJ-4-
handelt. Dabei wird die Hyaluronsäure zu nieder-
Glucopyranosyluronsäure-/3-[l —v 3 ] - 2 - a c e t a m i d o -
polymeren Oligosacchariden abgebaut.
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HYALURONAT-PROTEIN-KOMPLEXE IN DER PERITONEALFLÜSSIGKEIT VON RATTEN
Asparaginsäure, Threonin und Serin enthält. Ein-
Hyal uronat-Protein-Komplex
Asparaginsäure
Threonin
Serin
Glutaminsäure
Prolin
Glycin
Aianin
Valln
Cystin
Methionin
Isoleucin
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin
Ornithin
Lysin
Tryptophan
Histidin
Arginin
N H
3
die Proliferation von Lymphozyten in vitro, die erst-
//Mol/
100 m g
rel.
Mol. %
/(Mol./
100 m g
rel.
Mol.%
69,7
19,5
19,2
70,1
19,8
19,1
38,4
12,9
6,9
3,7
8,3
35,0
13,9
17,6
0.6
42,8
16,58
4,64
4,57
16,68
4,71
4,54
9,14
3,07
1,64
0,88
1,97
8,33
3,31
4,19
0,14
10,18
44,5
23,3
23,8
51,0
23,6
29,3
31,6
17,2
7,1
6,2
8,7
30,7
15,7
18,3
0,7
28,7
11,47
6.00
6,13
13,14
6,08
7,55
8,14
4,43
1,83
1,60
2,24
7,91
4,05
4,72
0,18
7,40
kubation mit Phytohämagglutinin bestehen in einem
—
—
—
diskutiert werden:
8,1
14,7
38,8
31,8
0,5
Glucosamin
Galaktosamin
gehend untersucht sind die Wirkungen des P H A auf
II
I
417
—
1,93
3,50
—
—
—
2,78
4,35
10,8
16,9
30,6
15,3
1,7
—
—
mals von NOWELL 15 beschrieben wurden. Die initialen Veränderungen der Lymphozyten nach der Ingesteigerten
3 H-Uridin-Einbau
nach wenigen Stdn.
in die zytoplasmatische R N S und einem gesteigerten
14 C-Leucin-Einbau 16
sowie einer gesteigerten Aktivi-
tät an DNS gebundener und löslicher
merase
17.
RNA-Poly-
Frühzeitig ist die Glucoseutilisation der
L y m p h o z y t e n e r h ö h t 1 8 . V o n HAUSEN u n d STEIN
wurde die Induktion einer Uridinkinase
19
beschrie-
ben. FISHER und MUELLER 2 0 fanden einen erhöhten
Phosphatidylinosit-Umsatz. Für die Biosynthese der
in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit nachgewiesenen Hyaluronsäure müssen mehrere
Mechanismen
1. Phytohämagglutinin
induziert eine de
Hyaluronsäure-Synthese.
novo-
—
HAYDEN und Mitarbb.
Tab. 3. Aminosäurenanalysen und Hexosamingehalt von
zwei Hyaluronat-Protein-Komplexen aus der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach P H A i.p.
gesteigerten Einbau von Glucosamin-l- 1 4 C.
Gleich-
zeitig war damit ein vermehrter Einbau von Leucin14 C
Diskussion
fanden in Lymphozyten,
21
die in Gegenwart von P H A kultiviert wurden, einen
in die Proteine und von
3 H-Thymidin
in die
DNS 2 4 Stdn. nach der PHA-Zugabe verbunden. Das
Die Produktion von Hyaluronsäure ist sowohl in
Glucosamin-l- 1 fC wird hauptsächlich ( 8 4 % ) in die
vivo als auch in vitro eine typische Funktion junger
U D P - N - Acetylglucosaminfraktion
Fibroblasten 1 0 . A u d i Synoviazellen, die sich mor-
UDP-/V-Acetylglucosamin für die Synthese der Hya-
phologisch von Fibroblasten abgrenzen lassen, pro-
luronsäure als aktivierte Vorstufe benötigt wird, wäre
duzieren in vivo und in vitro Hyaluronsäure. Als
vorstellbar, daß in den Mesothelzellen
Syntheseort
der
Zellen
der
Golgi-Apparat
Hyaluronsäure
werden
n»12.
konnte
in
wahrscheinlich
eingebaut.
Da
(von denen
diesen
zu vermuten ist, daß sie die Hyaluronsäure syntheti-
gemacht
sieren) durch das Phytohämagglutinin eine Aktivie-
Aus Untersuchungen von CASTOR und
rung der Biosynthese von UDP-V-Acetylglucosamin
NAYLOR 13 ist bekannt, daß auch Zellen aus Pleura-
stattfindet und damit das Reaktionsgi eidige wicht zur
und Pericardexsudaten in vitro Hyaluronsäure pro-
Hyaluronsäuresynthese verschoben wird.
duzieren können.
In den vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt wrerden, daß Phytohämagglutinin zu einer starken Stimulation der Hyaluronsäuresynthese in peritonealen bzw. pleuralen Zellen führt. Eine ähnliche
Wirkung von P H A
ist auch aus in vitro
Unter-
2. Phytohämagglutinin
führt
Hyaluronsäuresynthese
siologischen
zu einer
in Zellen
Bedingungen
gesteigerten
die unter
Hyaluronsäure
physynthe-
tisieren.
Experimentelle Beweise, daß die gefundene Hya-
suchungen an Zellkulturen bekannt. Nach der Zu-
luronsäure
gabe von Phytohämagglutinin zu Fibroblasten-Kul-
fehlen jedoch, da in unseren Versuchen die enzyma-
turen fanden YARON und CASTOR 14 eine gering ge-
tisch
steigerte Hyaluronsäuresynthese.
grenze bei etwa 1 mg-% aufweist. Es ist daher nicht
Phytohämagglutinin
ein V-Acetylglucosamin
Glykoprotein,
(aus phaseolus vulgaris) ist
und Hexose
das als dominierende
enthaltendes
Aminosäuren
durch eine de novo-Synthese
angewandte
Methode
eine
entsteht,
Empfindlichkeits-
auszuschließen, daß auch Mesothelzellen unter physiologischen Bedingungen eine sehr geringe
Hya-
luronsäureproduktion aufweisen. Für diese Annahme
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H. GREILING, W. MOHR UND G. BENEKE
418
sprechen insbesondere histochemische Untersuchun-
geführt
gen, da in Mesothelzellen Alcianblau-positive Gra-
Grundsubstanz des submesothelialen
nula
vorhanden
sind22.
Das
Vorkommen
einer
in
die
wird,
könnten
auch
Peritonealflüssigkeit
Abbauprodukte
der
Bindegewebes
übertreten.
Das
ver-
hohen Hyaluronsäurekonzentration in Ergußflüssig-
mehrte Auftreten von lysosomalen
keiten von Mesothelionen
abbauenden Enzymen würde jedoch letzten Endes
23_25,
güssen unterschiedlicher Genese
aber auch bei Er26,
Hyaluronsäure-
spricht ebenfalls
auch zu einem A b b a u der in der Peritonealflüssig-
für die Fähigkeit der Mesothelzellen, unter bestimm-
keit vorhandenen Hyaluronsäure führen. Hyaluron-
ten Bedingungen vermehrt Hyaluronsäure zu produ-
säure sollte demnach in der Peritonealflüssigkeit in
zieren. Demnach kann vermutet werden, daß unter
kurzer Zeit nicht mehr nachweisbar sein. Für diese
physiologischen Bedingungen eine geringe Hyaluron-
Möglichkeit spricht zumindest die Tatsache, daß 120
säureproduktion stattfindet, die jedoch unter experimentellen Bedingungen stimuliert werden kann. Es
könnte
dabei
sowohl
in
den
maligne
entarteten
Mesothelzellen als auch in den Mesothelzellen nach
der
PHA-Applikation
normalerweise
die
zu
einer
Aufhebung
Hyaluronsäuresynthese
eines
gering
haltenden Repressors kommen.
3. Lysosomale
Enzyme
Stunden nach der PHA-Injektion in der Peritonealflüssigkeit
Die chemischen Analysen sprechen für das Auftreten
verstärkten
eines
in
Hyaluronsäure-Protein-Komplexes
der Peritonealflüssigkeit nach der i. p. PHA-Applikation.
führen zu einem
nur noch Spuren von Hyaluronsäure vor-
handen sind.
Hyaluronsäure-Protein-Komplexe
wurden
bereits in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit
rheumatoider Arthritis zuerst von HAMERMAN 3 4 be-
Hyaluronsäure-Abbau.
schrieben. W i r konnten ebenfalls aus der SynovialAus
Untersuchungen
von
ALLISON
LUCCI 27 ist bekannt, daß die in vitro
von Lymphozyten
einer
in Kulturmedien
Labilisierung
der
und
MAL-
Inkubation
mit P H A
zu
Lymphozytenmembranen
führt. In den Mesothelzellen der Ratte, die bei unbehandelten
Kontrolltieren
Enzyme enthalten 2 8 '
Applikation
29,
keine
hydrolytischen
kommt es nach der PHA-
zum Auftreten von
saurer
Phospha-
tase 3 0 . Es wäre nun vorstellbar, daß hydrolytische
Enzyme der Mesothelzellen und der Makrophagen
im submesothelialen Bindegewebe
(Alveolarmakro-
phagen enthalten Hyaluronidase 3 1 )
die Grundsub-
stanz abbauen. In gleicher Weise, wie das Erscheinen eines durch Hyaluronat-glykanohydrolase
ab-
baubarenGlykosaminoglykans im Serum von Patienten mit malignen Tumoren
32 ' 3 3 ,
(Neuroblastomen
flüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis
und auch aus der Nabelschnur
Proteohyaluronate
isolieren, bei denen ein Peptid kovalent am Polysaccharid gebunden ist 3 5 . Das vorliegende isolierte
Proteohyaluronat
aus der Peritonealflüssigkeit ist
ein weiterer Hinweis für die Existenz von Hyaluronsäure-Protein-Komplexen
in
Körperflüssigkeiten.
Die bisher isolierten Mengen sind jedoch noch zu
gering um den Beweis für eine kovalente Bindung
des Proteinanteils zur Polysaccharidkette der Hyaluronsäure zu erbringen. Der Galaktosaminanteil in
dem Hyaluronat-Protein-Komplex könnte darauf hinweisen, daß das isolierte Proteoglykan noch Chondroitinsulfat oder ein Galaktosamin-haltiges Glykoprotein enthält. Der hohe Anteil an Asparaginsäure
auf den verstärkten Abbau
und Glutaminsäure könnte dafür sprechen, daß diese
der Bindegewebsgrundsubstanz in der Wachstums-
Aminosäuren an der Bindung der Polysaccharidkette
front des infiltrierend wachsenden Tumors zurück-
zum Proteinanteil beteiligt sind.
Reticulumzellsarkom
1
W.
MOHR,
G.
33)
BENEKE U. L .
MURR,
Experientia
[Basel]
7
2
W.
MOHR,
G . BENEKE U. L . M U R R , B e i t r . P a t h . 1 4 2 ,
8
J . L . REISSIG, J . L . S T R O H M I N G E R U. L . F . L E L O I R , J . b i o l .
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Philadelphia, Pennsylvania
(Z. Naturforsch. 27 b , 419—423 [1972] ; received November 2, 1971)
Experiments were undertaken to study the effect of introducing isolated mammalian cell mito
chondria into tissue culture cells. T h e D N A of isolated mitochondria was labeled in vitro with 3 H thymidine. Incorporation of 3 H-thymidine into mitochondrial D N A was increased tenfold by the
addition of bovine serum albumin and sucrose to the assay.
Labeled H e L a cell mitochondria were fused with W I 3 8 (human fibroblast) and I-T-22 (Bromodeoxyuridine resistant mouse cell line) cells in the presence of Sendai virus and autoradiographs were
made. T h e results indicated that isolated mitochondria may have been introduced into the cells
b y the fusion process.
Fusion of mitochondria isolated f r o m mouse tumor cell lines with isogenic primary mouse
e m b r y o fibroblasts i n d u c e d permanent growth of these cells in tissue culture, whereas isolated
mitochondria of mouse e m b r y o fibroblasts or allogenic tumor cells did not have this effect.
Recent investigations have studied intensively the
structure and mode of function of
mitochondrial
DNA-, R N A - and protein synthesizing
systems1-3.
These reports stress consistently the partial indepen-
cells might cast some light on this problem. LETTRE
and WRBA
Ehrlich
dence of the mitochondrial systems f r o m those di-
Ehrlich
rected b y the n u c l e u s 4 ' 5 . Whether
tively.
mitochondrial
D N A contributes to the genetic determination
of
8
a n d NASS
9
w e r e the first to r e p o r t
possibility of uptake of
isolated mitochondria
ascites tumors
and
chicken
liver
the
of
by
ascites tumor cells and L-cells, respec-
W e attempted in pilot experiments to introduce
mammalian cells, however, and if so, in what way,
isolated
continues to be an enigma 6- 7 . Investigations into the
means of the fusion factor of Sendai virus. Our
mitochondria
into
heterogeneic
cells
by
effect of an uptake of isolated mitochondria by intact
results showed that isolated mitochondria may have
Requests for reprints should b e sent of to Dr. K . RADSAK,
H y g i e n e Institute, Univ. of D-3550 Marburg,
Pilgrimstein 2, W . Germany.
* This investigation was supported in part b y P u b l i c Health
Service Research Grants R 0 1 - C A 0 4 5 3 4 and R 0 1 - C A 10815
f r o m the National Cancer Institute.
* * Fellow of Deutsche Forschungsgemeinschaft at the Wistar
Institute. Present address: Hygiene Inst., Univ. D - 3 5 5 0
Marburg, Pilgrimstein 2, W . Germany.
* * * Fellow of the Wistar Institute from the Department of
Histology and Embryology, A c a d e m y of M e d i c i n e , Warsaw,
Poland. — Present a d r e s s : Department of Histology and
Embryology, A c a d e m y of M e d i c i n e , ul. Chalubinskiego 5,
Warsaw, Poland.
Unauthenticated
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