Identifizierung und Charakterisierung neuer Spleißvarianten des

Universitätsklinikum Ulm
Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Rolf Kreienberg
Identifizierung und Charakterisierung
neuer Spleißvarianten des
Tetraspanins CD9
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
von
Sonja Wolfahrt
aus
Ulm
2011
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth
1. Berichterstatter:
apl. Prof. Dr. rer. nat. Helmut Deißler
2. Berichterstatter:
apl. Prof. Dr. med. Jürgen Kampmeier
Tag der Promotion:
12.01.2017
In Liebe und Dankbarkeit für meine Eltern
Horst und Angelika Wolfahrt,
die genau und immer die richtigen
und besten Eltern für mich waren und sind.
Teile dieser Dissertation wurden bereits in folgendem Fachartikel
veröffentlicht:
Wolfahrt S, Herman S, Scholz CJ, Sauer G, Deissler H: Identification of alternative
transcripts of rat CD9 expressed by tumorigenic neural cell lines an in normal
tissues. Genet Mol Biol 36: 276-281 (2013)
Doi 10.1590/S1415-47572013000200019 ; Open-Artikel unter der Lizenz CC BY-NC 4.0,
https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/deed.en
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1.
2.
III
Einleitung
1.1
Die Proteinfamilie der Tetraspanine
1
1.2
Das Tetraspanin CD9
4
1.3
Veränderte CD9-Expression bei malignen Erkrankungen
5
1.4
Ziele dieser Arbeit
7
Materialien und Methoden
2.1
2.2
Zellbiologische Methoden
2.1.1 Zelllinien und ihre Kultivierung
8
2.1.2 Immunfluoreszenzfärbung
11
Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Isolierung von mRNA aus Säugerzellen
13
2.2.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung von
15
Nukleinsäurelösungen
2.3
2.2.3 Reverse Transkription
16
2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
17
2.2.5 „RACE“-Amplifikation des 5’-Endes einer cDNA
21
2.2.6 Agarose-Gelelektrophorese
23
2.2.7 Elution von DNA aus Agarosegelen
25
2.2.8 Klonierung in Plasmidvektoren
26
2.2.9 Transformation von Bakterien mit Plasmiden
29
2.2.10 Plasmidpräparation aus E.coli
32
2.2.11 Einfrieren und Auftauen von Bakteriensuspensionen
33
2.2.12 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
34
2.2.13 Transfektion von Säugerzellen
35
Proteinbiochemische Methoden
2.3.1 Zelllyse und Solubilisierung der Membranproteine
36
2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
37
2.3.3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-
38
Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.3.4 Western Blot-Analyse
39
2.3.5 Vorhersage der Transmembrantopologie
41
I
INHALTSVERZEICHNIS
3.
Ergebnisse
3.1
Charakterisierung neuer CD9-Varianten neuraler Rattenzelllinien
3.1.1 CD9-spezifische Immunfluoreszenz der BT-Zelllinien
43
3.1.2 Analyse des bekannten CD9-Transkripts (mRNA-A)
45
in BT-Zelllinien
3.1.3 Identifizierung der neuen Spleißvarianten
49
rCD9 mRNA-B und rCD9 mRNA-C durch RACE
3.1.4 Vergleich der Expression der verschiedenen
51
rCD9-mRNAs in malignen neuralen Rattenzelllinien
3.1.5 Expression von Fusionsproteinen mit C-terminalem
53
EGFP der rCD9-Spleißvarianten in BT4Ca-Zellen
3.1.6 Gewebespezifische Expression der Transkripte der
58
Spleißvarianten rCD9-A, rCD9-B und rCD9-C
3.1.7 Modellrechnungen zur Vorhersage der Transmembran-
58
topologie der Spleißvariante rCD9-C im Vergleich zu
rCD9-A
3.2
Identifizierung alternativer Transkripte des menschlichen CD9
3.2.1 EST-Sequenzen des menschlichen CD9
60
3.2.2 Expression von CD9-Spleißvarianten in
62
verschiedenen menschlichen Geweben
3.2.3 Bestätigung der Authentizität der nachgewiesenen
64
huCD9-Transkripte
3.2.4 Vorhersage der Transmembrantopologie der neu
76
identifizierten möglichen humanen CD9-Spleißvarianten
4.
Diskussion
4.1
Expression von alternativen CD9-Transkripten in malignen
82
neuralen Zellen und Organen der Ratte
4.2
Expression alternativer CD9-Transkripte beim Menschen
84
4.3
Alternatives Spleißen als möglicher Mechanismus der
88
Pathogenese und Progression maligner Erkrankungen
5.
Zusammenfassung
90
6.
Literaturverzeichnis
92
Danksagung
101
Lebenslauf
103
II
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
AS
Aminosäure
ATCC
„American Type Culture Collection“
BSA
„bovine serum albumin“, Rinderserumalbumin
bp
„base pair“, Basenpaar
°C
Grad Celcius
CDS
„coding sequence“,
für ein Protein kodierende Sequenz
cDNA
„complementary deoxyribonucleic acid“,
zur RNA komplementäre DNA
DAS
„dense alignment surface”, Algorithmus zur
Vorhersage der Membrantopologie von Proteinen
DMEM
„Dulbecco´s modified Eagle`s medium“
DNA
„deoxyribonucleic acid”, Desoxyribonukleinsäure
dNTPs
Desoxyribonukleosidtriphosphate
EC-X
extrazelluläre Domäne X
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGFP
„enhanced green fluorescent protein”,
verstärkt grün fluoreszierendes Protein
ERK
„extracellular signal-regulated kinase“,
durch extrazelluläre Signale regulierte Kinase
EST
„expressed sequence tag“, Abschnitt eines in
einem Gewebe vorkommenden Transkripts
EWI-Proteine
Proteine der Immunglobulin-Familie mit dem
Aminosäuremotiv Glu-Trp-Ile
FCS
„fetal calf serum“, fötales Kälberserum
GAPDH
Glyzerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase
GSP
genspezifischer Primer
h
Stunde
huCD9
CD9 des Menschen
Ig
Immunglobulin(e)
LB-Medium
Luria-Bertani-Medium
III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
min
Minuten
mRNA
„messenger RNA”, Boten-RNA
miRNA
„micro RNA“, Mikro-RNA
NCBI
„National Center for Biotechnology Information”
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR
„polymerase chain reaction“,
Polymerase-Kettenreaktion
PI-3/4K
PSG
Phosphatidylinositol-3/4-Kinase
pregnancy-specific-glycoprotein”,
schwangerschaftsspezifisches Glykoprotein
PVDF
Polyvinylidendifluorid
RACE
„Rapid Amplification of cDNA-Ends”
rCD9
CD9 der Ratte
RNA
„ribonucleic acid“, Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion
s
Sekunden
SDS
Natriumdodecylsulfat
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TM
Transmembrandomäne(n)
TMPRSS2
Transmembran-Serinprotease 2
TM4SF
Transmembran-4-Superfamilie
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tris-Cl
Tris-(hydroxymethyl)-methylammoniumchlorid
u
Unit, Einheit
upm
Umdrehungen pro Minute
UPM
Universal Primer Mix
V
Volt
Ø
Durchmesser
IV
EINLEITUNG
1.
Einleitung
Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen nimmt weltweit kontinuierlich zu.
Auch in Deutschland ist die Gesamtzahl der jährlichen Krebserkrankungen seit
1990 um fast 30% gestiegen (Bertz et al. 2010). Wesentlich für die klinische
Bewertung der verschiedenen Arten solider maligner Tumoren ist der Übergang zu
einem Stadium, in dem Tumorzellen die Fähigkeit zur Metastasierung erworben
haben. Voraussetzungen dafür sind, neben der unkontrollierten Proliferation von
Tumorzellen, ihre Migration und invasives Durchdringen des umliegenden
Gewebes. Bei der Regulation dieser Prozesse spielen Mitglieder der TetraspaninProteinfamilie direkt oder als Adaptorproteine in funktionellen Membranproteinkomplexen, zum Beispiel mit Adhäsionsmolekülen, eine wichtige Rolle
(Hemler 2005, Maecker et al. 1997). Dem entsprechend konnte für viele Typen
solider Tumoren eine Herunterregulierung der Expression von CD9 und anderen
Tetraspaninen im Verlauf der Tumorprogression zu maligneren Stadien gezeigt
werden (Higashiyama et al. 1995, Houle et al. 2002, Miyake et al. 1996, Miyamoto
et al. 2001, Sauer et al. 2003).
1.1
Die Proteinfamilie der Tetraspanine
Tetraspanine, auch als Transmembran-4-Superfamilie (TM4SF) bekannt, sind eine
Gruppe integraler Membranproteine, zu der mehr als 30 Mitglieder gezählt werden
(Hemler 2001, Levy und Shoham 2005b). Die Tetraspanine sind im Verlauf der
Evolution sehr stark konserviert geblieben und werden in einer Vielzahl
verschiedener Spezies zum Beispiel Drosophilafliege, Schistosomen, Maus, Ratte
und Mensch exprimiert (Hemler 2005, Todres et al. 2000). Viele Tetraspanine
kommen in einer Reihe verschiedener Geweben und Zelltypen vor (Maecker et al.
1997). Zu den wichtigsten Vertretern dieser Proteinfamilie zählen die auch als
Leukozytenantigene beschriebenen CD9, CD63, CD81, CD82 und CD151, wobei
das prototypische CD9 bisher am Besten untersucht wurde.
1
EINLEITUNG
Die 200 bis 350 Aminosäuren langen Tetraspanine sind strukturell durch vier
namensgebende Transmembrandomänen (TM) gekennzeichnet
(Levy und
Shoham 2005a; Abbildung 1). Die ersten beiden TM begrenzen eine kleinere
extrazelluläre Schleife mit einer Länge von 13 bis 31 Aminosäuren („extracellular
domain 1“, EC1); die letzten beiden eine größere extrazelluläre Schleife mit 69 bis
132 Aminosäuren („extracellular domain 2“, EC2). Die beiden mittleren
Transmembranregionen sind durch eine kurze intrazelluläre Schleife verbunden.
Die N- und C-terminalen Enden der Tetraspanine ragen beide in den
intrazellulären Raum und sind mit typischen 8 bis 21 Aminosäuren meist recht
kurz. Die große extrazelluläre Schleife (EC2) zwischen den TM 3 und TM 4,
bestimmt wesentlich die Unterschiede zwischen den verschiedenen Mitgliedern
der Tetraspanin-Familie. Trotz ihrer Variabilität enthält EC2 charakteristische
Motive wie zum Beispiel die Aminosäuresequenz Cystein-Cystein-Glycin, die über
die
Bildung von
Disulfidbrücken
die charakteristische
Tertiärstruktur
der
Tetraspanine stabilisiert (Seigneuret et al. 2001; Abbildung 1), oder das bei vielen
Tetraspaninen vorkommende Prolin-X-X-Cystein-Cystein-Motiv. Typischerweise
enthält die große Schleife neben einigen potentiellen Glykosylierungsstellen auch
konstante Abschnitte, die der Homodimerisation dienen, sowie eine Region
höchster Variabilität, die spezifische Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht
(Hemler 2003, Levy und Shoham 2005a/b). Sowohl der Carboxy- als auch der
Amino-Terminus des Proteins dienen als Verbindung zum Zytoskelett und können
intrazelluläre Signalvermittlung beeinflussen (Hemler 2005, Zhang et al. 2001).
Konservierte Cysteine in den zytoplasmatischen Domänen, welche durch
Palmitoylierung modifiziert sein können, spielen eine entscheidende Rolle bei der
Ausbildung
des
sogenannten
Tetraspanin-Netzes.
Diese
hochkomplexe
Assoziation von verschiedenen Tetraspaninen und anderen Proteinen in der
Membran ist unter anderem wichtig für die Bildung und Aufrechterhaltung von
Zell-Zell-Kontakten und bei Zellfusionen. Ein Verlust dieser Palmitoylierungsstellen
geht mit der Auflösung der weit reichenden Tetraspanin-Komplexe einher (Stipp et
al.
2003,
Yang
et
al.
2004).
Zu
den
wichtigsten
der
zahlreichen
Interaktionspartnern der Tetraspanine gehören Integrine, Membranproteine mit
Immunglobulin-Domänen,
Wachstumsfaktoren
und
deren
Rezeptoren,
Proteoglykane und die an der intrazellulären Signalweiterleitung beteiligten
Proteinkinase C und Phosphatidylinositol-3/4-Kinase (Boucheix und Rubinstein
2
EINLEITUNG
2001, Hemler 2005, Maecker et al. 1997, Powner et al. 2011, Stipp et al. 2003).
Die Bindung eines Tetraspanins an ein nicht auch dieser Proteinfamilie
angehörenden Partnermolekül wird als direkt oder primär bezeichnet. Diese
Komplexe sind sehr stabil und entstehen bereits früh während der Biosynthese im
Endoplasmatischen Retikulum (Hemler 2001). Eine Verbindung der primären
Tetraspanin-Partner-Komplexe untereinander wird sekundäre oder indirekte
Interaktion genannt. Diese ist von der Palmitoylierung der Tetraspaninmoleküle
abhängig und kann sich daher frühestens im Golgi-Apparat der Zelle ausbilden.
Durch Anlagerung weiterer Proteine und Fusionen entsteht das TetraspaninNetzwerk als großer, hochmolekularer Proteinkomplex, dessen Zusammensetzung die zelltyp-spezifischen Funktionen und deren Regulation wesentlich
mitbestimmt (Hemler 2001).
Abbildung 1:
Schematische Darstellung eines Tetraspanins (nach Levy und Shoham 2005a). Hervorgehoben
sind die vier Transmembrandomänen (TM), das hochkonservierte Cystein-Cystein-Glycin (CCG)Motiv und die typischen Cysteine im intrazellulären Bereich.
3
EINLEITUNG
1.2
Das Tetraspanin CD9
CD9 ist ein typisches Tetraspanin mit 228 Aminosäuren und kurzen intrazellulären
Enden, die von nur 11 bzw. 8 Aminosäuren gebildet werden. Im Gegensatz zu
anderen Tetraspaninen kann CD9 in der ersten extrazellulären Schleife bei der
Biosynthese glykosyliert und acyliert werden (Boucheix et al. 1991, Seehafer et al.
1988). Integriert in die Zellmembran interagiert es als Adaptorprotein mit anderen
Proteinen, darunter die ß-Untereinheiten der Integrine α1-7β1, α6β4 und αIIbβ3
(Berditchevski 2001), die Wachstumsfaktoren TGF-α (Imhof et al. 2008) und EGF
mit deren Tyrosinkinaserezeptoren (Nakamura et al. 2000), die EWI-Proteine
EWI-2 (Charrin et al. 2003) und EWI-F (Stipp et al. 2001) als Mitglieder der
Immunglobulinsuperfamilie und anderen Tetraspaninen wie z.B. CD81 (Levy und
Shoham 2005a/b). Durch solche Protein-Protein-Interaktionen kann insbesondere
die CD9-abhängige Motilität beeinflusst werden, die von der sequenziellen
Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI-3K; Powner et al. 2011) abhängt
und durch Inhibitoren dieser Kinase blockiert werden kann (Kotha et al. 2008).
CD9 ist nahezu ubiquitär im Organismus verbreitet und wird von einer Vielzahl von
Zelltypen, zum Beispiel Endothel- und Epithelzellen, glatten Muskelzellen und
Zellen des hämatopoetischen Systems wie Vorläufer-B-Zellen und Lymphozyten,
exprimiert (Boucheix et al. 1991, Hemler 2003, Maecker et al. 1997). Eine
mögliche Rolle von CD9 bei der Differenzierung neuraler Zellen wird vermutet, da
es im zentralen und peripheren Nervensystem von vielen Arten unreifer und reifer
Gliazellen
exprimiert
wird.
Besonders
starke
Expression
wurde
bei
Oligodendrozyten und Schwannzellen beobachtet (Deissler et al. 1996, Kaprielian
und Patterson 1993, Tole und Patterson 1993). Durch Schwannzellen exprimiert,
scheint CD9 eine wichtige Rolle bei der Myelinisierung zu spielen (Kagawa et al.
1997). Bei Aktivierung von B- und T-Lymphozyten wird die CD9-Expression
hochreguliert (Kobayashi et al. 2004, Zeleznik-Le und Metzgar 1989) und es ist
auch an der Thrombozytenaktivierung und -aggregation beteiligt (Boucheix et al.
1991). Eine sehr wichtige physiologische Funktion hat das CD9-Protein bei der
Fusion von Eizelle und Spermium (Jégou et al. 2011, Miyado et al. 2000,
Sulkowski et al. 2011, Sutovsky 2009). Desweiteren ist es zusammen mit dem
Schwangerschaftsglykoprotein
Fertilin
aus
der
ADAM-Proteinfamilie
von
4
EINLEITUNG
metallabhängigen Proteasen mit Disintegrindomäne an der Migration und
Zellfusion von Trophoblasten in das Endometrium während der Implantation
beteiligt (Xiang und MacLaren 2002).
Auf molekularer Ebene lassen sich die meisten Funktionen des CD9 auf die
Modulation von Zelladhäsion und -migration zurückführen. Der Bedeutung dieser
Prozesse für Kanzerogenese und Tumorprogression entsprechend, wurden
Veränderungen der Expression des CD9 bei vielen Arten maligner Zellen
gefunden, wodurch sich das besondere Interesse an diesem Tetraspanin ergibt.
1.3
Veränderte CD9-Expression bei malignen
Erkrankungen
Für viele Zelltypen gilt, dass die Expression von Tetraspaninen durch maligne
Konversion oft verändert wird. Bei soliden Brust-, Kolon-, Lungen-, Ovarial-,
Zervix- und Blasenkarzinomen korreliert die CD9-Expression invers mit der
Malignität der Zellen, Indikatoren der Tumorprogression wie dem Auftreten von
Metastasen und schlechter klinischer Prognose (Higashiyama et al. 1995,
Mhawech et al. 2003, Miyake et al. 1996, Mori et al. 1998, Sauer et al. 2003).
Neben CD9 besitzen auch andere Tetraspanine, zum Beispiel CD63 und CD82,
Bedeutung als Prognosefaktoren bei malignen Erkrankungen (Boucheix et al.
2001, Chao et al. 2006).
Der mechanistische Zusammenhang zwischen der Malignität von Tumorzellen und
Tetraspaninfunktionen wird vor allem durch die Modulation der Integrinfunktion
hergestellt:
Funktionelle
Komplexe
aus
Integrinuntereinheiten
und
den
Tetraspaninen CD9, CD63, CD81, CD82 und CD151 bestimmen wesentlich die
Interaktion der Zellen mit Komponenten der extrazellulären Matrix (Berditchevski
2001). Eine Veränderung dieser Komplexbildung beeinflusst daher direkt
Adhäsion und Migration der Zellen als Prozesse, die für Invasivität und
Metastasierungspotential der Tumorzellen wesentlich mitbestimmend sind.
5
EINLEITUNG
Eine sehr interessante Korrelation zwischen CD9-Expression und Malignität wurde
für das Zervixkarzinom beschrieben: Typisch ist bei diesem die verminderte
Expression des CD9 in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung, allerdings wird
es an Stellen transendothelialer Migration von Tumorzellen in Gefäße wieder
exprimiert. Eine solche lokale CD9-Reexpression korreliert mit histopathologisch
belegter Lymphangiogenese und kann daher als Indikator für Metastasenbildung
oder einem erhöhten Rezidivrisiko in Betracht kommen (Sauer et al. 2003). Auch
bei Gliomen ist die Entwicklung zu höherer Malignität häufig mit geringerer
Expression des CD9 verbunden. Eine interessante Ausnahme stellen die
Astrozytome dar, bei denen sogar eine positive Korrelation mit der festgestellten
CD9-Menge beschrieben wurde (Kawashima et al. 2002).
Angesichts der vielfach festgestellten Herunterregulierung des CD9 im Verlauf der
Tumorprogression
könnte
dieses
Tetraspanin
als
Tumorsuppressorgen
klassifiziert werden. Allerdings sind inaktivierende Mutationen bisher nicht als
Ursache einer Fehlfunktion von CD9 in Tumoren beschrieben worden. Lediglich
bei Prostatakrebs wurde eine Fusion des CD9-Gens mit dem androgenregulierten
Gen der transmembranen Serinprotease-2 (TMPRSS2) gefunden (Pflueger et al.
2011). Wegen der Beteiligung von CD9 an vielen bei malignen Zellen
fehlregulierten Prozessen, kommt dieses Tetraspanin auch als therapeutisches
Zielmolekül in Frage. Erste Studien bestätigen, dass Modulation der CD9-Funktion
für
bestimmte
Krebserkrankungen
tatsächlich
ein
aussichtsreiches
therapeutisches Konzept darstellen kann (Kohmo et al. 2010, Nakamoto et al.
2009, Yamazaki et al. 2011).
6
EINLEITUNG
1.4
Ziele dieser Arbeit
Diese Arbeit ist eingebettet in eine Reihe von Untersuchungen zu Veränderungen
der Expression und Funktion des CD9 im Verlauf der Kanzerogenese und
Progression solider Tumoren. Beobachtungen der eigenen Arbeitsgruppe und
Hinweise in publizierten Arbeiten führten zur Vermutung, dass funktionell relevante
Spleißvarianten des CD9 existieren könnten, obwohl solche noch nicht
beschrieben worden waren. So kann das bei gelelektrophoretischer Analyse
häufige Auftreten von CD9-immunreaktiven Doppel- und Mehrfachbanden nicht
völlig schlüssig alleine durch unterschiedliche posttranslationale Modifikation wie
Glykosylierung (Seehafer et al. 1984) erklärt werden. Auch eine früh beschriebene
Heterogenität des N-Terminus des CD9 deutete auf das Vorhandensein
verschiedener Varianten dieses Proteins (Deissler et al. 1996, Kaprielian und
Patterson 1993). Initiiert wurde die Suche nach solchen Varianten schließlich
durch die Beobachtung, dass die maligne neurale Rattenzelllinie BT8Ca (Laerum
und Rajewsky 1975) zwar als CD9-negativ betrachtet wurde (Deissler et al. 1996),
mit bestimmten anti-CD9-Antikörpern aber doch eine Immunreaktivität zeigte.
Tatsächlich führten erste Untersuchungen zur Identifizierung eines im 5’-Bereich
unterschiedlichen CD9-Transkripts, das von diesen Zellen anstelle der bekannten
mRNA transkribiert wird. Ausgehend von der weiteren Charakterisierung dieses
und weiterer alternativer Transkripte neuraler Rattenzellen wurde schließlich
systematisch auch nach in normalen menschlichen Geweben und malignen
Tumoren möglicherweise vorkommenden Spleißvarianten des CD9 gesucht.
Angesichts der Beteiligung des CD9 an fundamentalen physiologischen
Prozessen und ihrer Fehlsteuerung bei malignen und anderen wichtigen
Erkrankungen, ist der Nachweis alternativer CD9-Transkripte von grundsätzlicher
Bedeutung. Es ist zu erwarten, dass weitere durch diese Arbeit eingeleitete
Untersuchungen zu einer differenzierteren Sicht der CD9-Funktionen führen
werden.
7
MATERIAL UND METHODEN
2.
Materialien und Methoden
2.1
Zellbiologische Methoden
2.1.1
Zelllinien und ihre Kultivierung
Tabelle 1:
Für die Kultivierung von Säugerzellen verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Sterilwerkbank (Modell NSF 49)
Nunc, Wiesbaden
Zellkultur-Brutschrank (Modell 3862 S/N)
Labotect, Göttingen
Zentrifuge (Modell Multifuge 3 S-R)
Thermo Scientific (Heraeus), Hanau
Mikroskop (Modell IX50)
Olympus, Hamburg
75 cm2-Zellkulturflaschen
Becton Dickinson (Falcon),
Heidelberg
50 ml-Röhrchen (Typ 2070)
Becton Dickinson (Falcon),
Heidelberg
2 ml-Einfrierröhrchen
Greiner, Nürnberg
Einfrierbox
Nalgene, Hereford, England
Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Trypsin/EDTA-Fertiglösung
PAA Laboratories, Linz, Österreich
Einfriermedium „Opti-freeze“
ICN, Illkirch, Frankreich
Phosphatgepufferte Salzlösung,
Invitrogen (Gibco), Karlsruhe
ohne Kalzium und Magnesium (PBS)
Nährmedium für die Kultivierung der Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„Dulbecco´s modified Eagle´s medium“ (DMEM),
PAA Laboratories, Linz, Österreich
mit Phenolrot, 4,5 g/l Glukose, 584 mg/l L-Glutamin
8
MATERIAL UND METHODEN
Medienzusätze
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Fötales Kälberserum (FCS)
PAA Laboratories, Linz, Österreich
Gebrauchskonzentration: 10 % (v/v) in DMEM
Penicillin (10 000 u/ml) und Streptomycin
Invitrogen (Gibco), Karlsruhe
(10 000 µg/ml)-Stammlösung
Gebrauchskonzentration: 1 % (v/v) in DMEM
Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Maligne neurale Rattenzelllinien:
Zellbank des Instituts für Zellbiologie
BT4Ca, BT8Ca, BT12Ca und BT13Ca
der Universität Duisburg-Essen
Diese tumorigenen neuralen Rattenzelllinien wurden
durch Behandlung trächtiger Ratten mit dem Karzinogen
N-Ethylnitrosoharnstoff und anschließender Kultivierung
der embryonalen neuralen Zellen erzeugt (Laerum und
Rajewski 1975, Laerum et al. 1977).
Humane Mammakarzinomzelllinien:
Zellbank des Endokrinologischen
MDA-MB 157, MDA-MB 231, MDA-MB 361 und
und Onkologischen Labors der
MDA-MB 468
Universitätsfrauenklinik Ulm
Humane Mammakarzinomzelllinien:
„American Type Culture Collection“
HBL100, MCF7 und ZR-75-30
(ATCC), Rockville, USA
Humane Ovarialkarzinomzelllinien:
Zellbank des Endokrinologischen
OV-MZ 8, OV-MZ 16, OV-MZ 20 und
und Onkologischen Labors der
MDAH 2774
Universitätsfrauenklinik Ulm
Humane Glioblastomzelllinie:
„American Type Culture Collection“
U-373 MG
(ATCC), Rockville, USA
Durchführung
Alle in den Versuchen verwendeten Zelllinien wurden unter Einhaltung steriler
Arbeitsweise und Verwendung steriler Einmalzellkulturartikel bei 37°C in einer
Atmosphäre von 5% CO2 in zu 90% wassergesättigter Luft in einem Zellkulturbrutschrank kultiviert. Als Standardnährmedium diente DMEM mit allen oben
genannten Zusätzen.
9
MATERIAL UND METHODEN
Unter regelmäßiger mikroskopischer Begutachtung wurden die kultivierten Zellen
bei einer Konfluenz von etwa 90% passagiert. Dazu wurden die Zellen nach
Entfernen des Mediums im Kulturgefäß mit auf 37°C vorgewärmtem PBS
gewaschen und anschließend mit warmer Trypsin/EDTA-Fertiglösung bis zum
Ablösen der Zellen vom Gefäßboden bei 37°C inkubiert. Die Trypsinreaktion
wurde dann durch Zugabe des doppelten Volumens Medium mit FCS gestoppt.
Nach Resuspendierung konnte etwa ein Zehntel der Gesamtzellmenge zur
weiteren Kultivierung in eine neue 75 cm2-Zellkulturflasche überführt werden.
Zur langfristigen Aufbewahrung der Zelllinien in flüssigem Stickstoff wurden etwa
107 Zellen wie oben beschrieben vom Zellkulturgefäß abgelöst, in ein steriles
50 ml-Röhrchen überführt und 5 min bei 300 x g und Raumtemperatur (RT)
abzentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 1,5 ml
eiskaltem „Opti-freeze“-Einfriermedium resuspendiert und in ein 2 ml-Einfrierröhrchen überführt. Um ein langsames Herunterkühlen der Zellsuspension zu
gewährleisten, konnten die Röhrchen in einem speziell dafür vorgesehenen
Einfrierbehälter über Nacht in einen -80°C-Gefrierschrank gestellt werden. Die
Röhrchen wurden dann in Lagerbehälter mit flüssigem Stickstoff überführt.
Bei Bedarf konnten die eingefrorenen Zelllinien wieder in Kultur genommen
werden, indem man die gefrorene Zellsuspension unter leichtem Schwenken in
einem Wasserbad bei 37°C auftaute und in ein 15 ml-Reaktionsgefäß überführte,
in welchem bereits 100 µl vorgewärmtes Kulturmedium vorgelegt worden waren.
Im Abstand von jeweils einer Minute erfolgte, unter Verdopplung des Volumens,
die weitere Zugabe von warmem Kulturmedium zur Suspension der aufgetauten
Zellen. Nach 5 min wurde die Zellsuspension auf ein Endvolumen von 10 ml mit
Kulturmedium aufgefüllt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (5 min,
300 x g, RT), in 25 ml warmem Medium resuspendiert und zur weiteren
Kultivierung in eine 75 cm2-Zellkulturflasche überführt.
10
MATERIAL UND METHODEN
2.1.2
Immunfluoreszenzfärbung
Tabelle 2:
Für die Immunfluoreszenzfärbung verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Fluoreszenzmikroskop (Modell BX51)
Olympus, Hamburg
Software AnalySIS (Version 5.1)
Soft Imaging Systems, Münster
Wasserbad (Modell TW 8)
Julabo, Seelbach
Feuchte Kammer
Werkstatt der Universität Ulm
Objektträger
Menzel, Braunschweig
Deckgläschen aus Glas, Ø 15 mm
Menzel, Braunschweig
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt
1 M Natronlauge
Merck, Darmstadt
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Fluoreszenz-Eindeckmedium „Vectashield“
Vector Laboratories, Burlingame,
USA
Phosphatgepufferte Salzlösung,
Invitrogen (Gibco), Karlsruhe
ohne Kalzium und Magnesium (PBS)
Hergestellte Lösungen
4% (w/v) Paraformaldehydlösung:
8 g Paraformaldehyd wurden mit 90 ml Wasser versetzt
und im Wasserbad bei 60°C unter Zugabe einiger
Tropfen Natronlauge (1 M) gelöst. Nach Abkühlung auf
RT
wurden
100
ml
2-fach
konzentriertes
PBS
hinzugefügt und mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die
Lösung konnte in Portionen bei -20°C dauerhaft
aufbewahrt werden. Unmittelbar vor der Färbung wurde
die
benötigte
Menge
Gebrauchslösung
bei
37°C
aufgetaut und auf Eis vorgekühlt.
BSA-Blockierlösung:
3% (w/v) BSA in PBS
11
MATERIAL UND METHODEN
Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Maligne neurale Rattenzelllinien:
siehe 2.1.1
BT4Ca, BT8Ca und BT12Ca
Primär- und Detektionsantikörper
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Monoklonaler Mausantikörper anti-rCD9
Zellbank des Instituts für Zellbiologie
(=anti-NCA1, IgG1: Deissler et al. 1996)
der Universität Duisburg-Essen
Verwendung des Hybridomüberstands: unverdünnt
Monoklonaler Mausantikörper anti-huCD9
Exbio, Prag, Tschechische Republik
(Klon MEM 61, IgG1)
Gebrauchskonzentration: 0,5 µg/ml in Blockierlösung
Maus IgG1-Kontrollantikörper
Southern Biotech, Aachen
(Klon 15H6)
Gebrauchskonzentration: 0,5 µg/ml in Blockierlösung
Detektionsantikörper Ziege-anti-Maus IgG,
Invitrogen (Molecular Probes), Leck,
konjugiert mit AlexaFluor 594, F(ab)2-Fragment (H+L),
Niederlande
Gebrauchskonzentration: 2,5 µg/ml in Blockierlösung
Durchführung
Zur Bestimmung der Lokalisation des Tetraspanins CD9 wurden die zu
untersuchenden Zellen auf sterilen Deckgläschen ausgesät und nach 48-stündiger
Kultivierung für die Immunfluoreszenzfärbung vorbereitet. Dazu wurden sie
zweimal mit PBS gewaschen, 10 min in 4%-iger Paraformaldehydlösung auf Eis
fixiert und zwei weitere Male mit eiskaltem PBS gewaschen. Zur Vermeidung
unspezifischer
Proteinbindung
folgte
eine
30-minütige
Inkubation
bei
Raumtemperatur mit Blockierlösung. Diese wurde danach ausgetauscht gegen
eine Blockierlösung, die eine experimentell als geeignet ermittelte Menge
Primärantikörper enthielt. Die Inkubation mit Primärantikörper erfolgte über Nacht
bei 4°C in einer feuchten Kammer. Nach Entfernen der Antikörperlösung und
fünfmaligem Waschen für je 30 s in PBS wurden die auf den Zellen gebundenen
Antikörper durch 1h Inkubation bei RT mit einer Lösung des an einen
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Detektionsantikörpers nachgewiesen. Die Zellen
auf den Deckgläsern wurden erneut fünfmal gewaschen (je 30 s in PBS), auf
Objektträgern mit Eindeckmedium überschichtet und luftdicht verschlossen. Die
12
MATERIAL UND METHODEN
Präparate
konnten
im
Fluoreszenzmikroskop
mit
40-
oder
100-facher
Vergrößerung und geeigneter Anregungswellenlänge betrachtet und die Bilder mit
Hilfe der Software AnalySIS als Grafikdateien abgespeichert werden.
2.2
Molekularbiologische Methoden
2.2.1
Isolierung von mRNA aus Säugerzellen
Tabelle 3:
Für die Isolierung von mRNA aus Säugerzellen verwendete Materialien.
Geräte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Thermomixer (Modell 5436)
Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge für Reaktionsgefäße (Modell 5415 C)
Eppendorf, Hamburg
Fertigpuffer
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Phosphatgepufferte Salzlösung,
Invitrogen (Gibco), Karlsruhe
ohne Kalzium und Magnesium (PBS)
Reagenzien-Kits
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„RNeasy Mini“ RNA-Isolierungs-Kit
Qiagen, Hilden
„Oligotex“ mRNA-Isolierungs-Kit
Qiagen, Hilden
„DNA-free“ DNase-Kit
Ambion, Darmstadt
Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Maligne neurale Zelllinien der Ratte:
siehe 2.1.1
BT4Ca, BT8Ca, BT12Ca und BT13 Ca
Humane Mammakarzinomzelllinien:
siehe 2.1.1
MDA-MB 157, MDA-MB 231, MDA-MB 361,
MDA-MB 468, HBL100, MCF7, ZR-75-30
Humane Ovarialkarzinomzelllinien:
siehe 2.1.1
OV-MZ 8, OV-MZ 16, OV-MZ 20, MDAH 2774
Humane Glioblastomzelllinie:
siehe 2.1.1
U-373 MG
13
MATERIAL UND METHODEN
Durchführung
2.2.1.1
Isolierung von Gesamt-RNA
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus Zelllinien wurden ca. 107 Zellen wie
beschrieben (siehe 2.1.1) von der Zellkulturflasche abgelöst, in PBS aufgenommen und in 5 min bei 300 x g pelletiert. Nach Entfernen des Überstandes
erfolgte eine Aufarbeitung des Zellpellets mit Hilfe des „RNeasy Mini Kits“ nach
Herstellerprotokoll. Abschließend konnte die Gesamt-RNA in RNAse-freiem
Wasser eluiert und ihre Konzentration (zur Messung 1:500 verdünnt in
RNAse-freiem Wasser) photometrisch (siehe 2.2.2) bestimmt werden.
2.2.1.2
DNAse-Behandlung isolierter Gesamt-RNA
Zur Entfernung möglicherweise noch vorhandener DNA-Reste in der isolierten
Gesamt-RNA wurde eine DNase-Behandlung der Probe mit dem „DNA-free Kit“
entsprechend
der
Herstelleranleitung
durchgeführt.
Aus
der
gereinigten
Gesamt-RNA wurde anschließend poly A+-mRNA isoliert.
2.2.1.3
mRNA-Isolierung
Unter Verwendung des „Oligotex mRNA Kits“ wurde aus der DNA-freien
Gesamt-RNA die poly A+-mRNA nach im Kit enthaltener Anleitung isoliert und ihre
Konzentration
(zur
Messung
1:70
verdünnt
in
RNAse-freiem
Wasser)
photometrisch (siehe 2.2.2) bestimmt.
14
MATERIAL UND METHODEN
2.2.2
Photometrische Konzentrationsbestimmung von
Nukleinsäurelösungen
Tabelle 4:
Für die photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäurelösungen
verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Photometer (Modell DU 640),
Beckman, Krefeld
genutzt mit 0,5 ml Quarzküvetten
Photometer Gene Quant,
Amersham Pharmacia Biotech,
für 0,07 ml Quarzküvetten
Freiburg
Quarzküvetten (Messvolumen 0,5 ml bzw. 0,07 ml)
Hellma, Müllheim
Proben zur Konzentrationsbestimmung
Hersteller bzw. Bezugsquelle
RNA-Lösungen
siehe 2.2.1
DNA-Lösungen
siehe 2.2.10
Durchführung
Entsprechend
dem
zu
erwartenden
Nukleinsäuregehalt
der
RNA-
oder
DNA-Lösungen wurden zur Messung Verdünnungen (1:70 - 1:500) in RNasefreiem Wasser hergestellt. Die photometrische Bestimmung der Extinktionen bei
260 nm (E260) und 280 nm (E280) erfolgte im Vergleich zu Wasser. Die
Nukleinsäurekonzentration wurde unter der Annahme berechnet, dass E260 = 1
einer Konzentration von 40 mg/ml einzelsträngiger RNA oder 50 mg/ml
doppelsträngiger DNA entspricht. Der Quotient aus E260 und E280
diente zur
Bestimmung des Reinheitsgrades der Probe, wobei Werte kleiner als 1,8 auf einen
zu hohen Anteil kontaminierender Proteine hindeuteten.
15
MATERIAL UND METHODEN
2.2.3
Reverse Transkription
Tabelle 5:
Für die Reverse Transkription verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
PCR-Gerät „MJ-Minithermocycler“
Biozym, Hessisch Oldendorf
500 µl-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„TaqMan Reverse Transcription Kit“
Applied Biosystems, Weiterstadt
mRNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Isoliert aus Zelllinien
siehe 2.2.1
Gesamt-RNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Gesamt-RNA aus Organen der Ratte:
BD Biosciences (Clontech),
Gehirn, Hoden, Leber, Mamma, Niere und Plazenta
Heidelberg
Gesamt-RNA aus Organen des Menschen:
BD Biosciences (Clontech),
Gehirn, Hinterstrangganglion, Mamma, Ovar, Plazenta
Heidelberg
und Uterus
Hergestellte Reaktionsansätze
Zur
reversen
Transkription
wurden
folgende
Komponenten des Kits bis zu den angegebenen
Endkonzentrationen zusammengefügt:
-
1x „TaqMan” RT-Puffer
-
5,5 mM MgCl2
-
je 500 µM Desoxyribonukleosidtriphosphate
(dNTPs)
-
2,5 µM Oligo(dT)-Primer
-
4 u RNAseinhibitor
-
12,5 u „Multiscribe”-Reverse Transkriptase
-
2 µg mRNA oder 1 µg Gesamt-RNA
-
RNAse-freies Wasser bis 100 µl
Gesamtvolumen
16
MATERIAL UND METHODEN
Durchführung
Unter Verwendung des „TaqMan Reverse Transcription Kits” wurde die
poly A+-mRNA mit Hilfe eines Oligo(dT)-Primers in eine komplementäre
einzelsträngige DNA (cDNA) umgeschrieben. Dazu wurde die oben beschriebene,
mRNA oder Gesamt-RNA enthaltende Reaktionsmischung unter Eiskühlung
hergestellt und dann 10 min bei 25°C, 30 min bei 48°C und 5 min bei 95°C in einer
PCR-Maschine inkubiert. Nach Abkühlen auf 4°C konnte die erhaltene cDNA
entweder sofort in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt oder
zunächst bei -80°C gelagert werden.
2.2.4
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Tabelle 6:
Für die Polymerase-Kettenreaktion verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
PCR-Gerät (Thermocycler PE 9600)
Applied Biosystems, Weiterstadt
500 µl-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien-Kits
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„Fast-Taq Start Polymerase-Kit”
Roche Applied Sciences, Mannheim
„Pwo Polymerase-Kit“
Peqlab, Erlangen
cDNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
aus Geweben und Zelllinien
siehe 2.2.3
DNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Plasmid-DNA
siehe 2.2.10
17
MATERIAL UND METHODEN
Hergestellte Reaktionsansätze
Für
den
PCR-Reaktionsansatz
wurden
folgende
Komponenten des Kits bis zu den angegebenen
Endkonzentrationen zusammengefügt:
-
1x PCR-Puffer mit 1,5 mM MgCl2
-
je 250 µM Desoxyribonukleosidtriphosphate
(dNTPs)
-
10 pmol Vorwärtsprimer
-
10 pmol Reversprimer
-
1 u „Fast-Taq-Start”-Polymerase oder
0,6 u „Pwo”-Polymerase
-
5 µl cDNA-Lösung oder 10 ng Plasmid-DNA
-
Wasser bis 25 µl Gesamtvolumen
Synthetische Oligonukleotide (PCR-Primer)
Alle aufgeführten synthetischen Oligonukleotide, die als PCR-Primer eingesetzt
wurden, wurden von der Firma Thermo-Fischer (Ulm) lyophilisiert bezogen und in
Wasser zu einer Stammlösung von 100 pmol/µl gelöst.
Tabelle 7:
Primer für die Polymerase-Kettenreaktion zum spezifischen Nachweis von
CD9-Transkripten.
Primer für CD9 der Ratte
rCD9-A-FNC
5’-TGG CAC TTT TTA AAA GTG GAG CCT C-3’
rCD9-A-F1
5’-TGT ACC ATG CCG GTC AAA GGA G-3’
rCD9-A-F2
5’-TCC TCT TGG TGA TAT TCG CCA TTG-3’
rCD9-A-F3
5’-ATG GCT GCG GTT CGA CTC TCA G-3’
rCD9-A-F4
5’-GGC CCT CAT GAT GCT AGT TGG TTT C-3’
rCD9-A-R1
5’-ACT CTA GAC CAT TTC TCG GCT CCT G-3’
rCD9-A-R2
5’-CTC CTG GAG TCT TTA ATC ACC TCG TC-3’
rCD9-A-R3
5’-CGC CAT ATG GAT GGC TTT GAG TG-3’
rCD9-A-R4
5’-CCA ATG GCA AGC ACT GCG ATG-3’
rCD9-A-R5
5’-TGA GAG TCG AAC CGC AGC CAT AG-3’
rCD9-A-RNC
5’-GTA TCA AAT TGT CTT CAA TAT AAC TTA CAA CC-3’
18
MATERIAL UND METHODEN
Primer für 5’-RACE der cDNA des Ratten-CD9
rCD9-5R-GSP1
5’-TTT CCC GCT GGG GCT CAT CCT TGT TCC-3’
rCD9-5R-nest
5’-GCG GCG ATC TCA ATG GCG AAT ATC AC-3’
Primer für neu identifizierte Varianten des Ratten-CD9
rCD9-B-F1
5’-GCC CAG ATC TGT GTC CTG CAC-3’
rCD9-B-F2
5’-GGG GAG CAG CAG GAA GGG TAG-3’
rCD9-B-R1
5’-GCT GCC CTA CCC TTC CTG CTG-3’
rCD9-B-R2
5’-GCT CCC CGT GCA GGA CAC AG-3’
rCD9-C-F1
5’-CTG AAC GAA ATG ATG CCG AAG TCC-3’
rCD9-C-F2
5’-GAA ATG ATG CCG AAG TCC TTT GTG-3’
rCD9-C-F3
5’-CCA GCG GTC AGA ACT AAC TGC G-3’
Primer für Klonierung mit dem „InFusion“-System
IF-rCD9-A-F3
5’-(GAA GTT ATC AGT CGA C) CTA TGG CTG CGG TTC
GAC TCT CA-3’
IF-rCD9-A-Stopp
5’-(ATG GTC TAG AAA GCT T) ACT CTA GAC CAT TTC
TCG GCT CCT G-3’
IF-rCD9-A-Fu3
5’-(ATG GTC TAG AAA GCT T) ACC ATT TCT CGG CTC
CTG CGG ATG-3’
IF-rCD9-B-F1
5’-(GAA GTT ATC AGT CGA C) GCC CAG ATC TGT GTC
CTG CAC-3’
IF-rCD9-C-F2
5’-(GAA GTT ATC AGT CGA C) GAA ATG ATG CCG AAG
TCC TTT GTG-3’
Primer für CD9 des Menschen
huCD9-Ex1-F1
5’-CTC ACC ATG CCG GTC AAA GGA G-3’
huCD9-Ex1-F2
5’-AGG CAC CAA GTG CAT CAA ATA CCT G-3’
huCD9-Ex2-F
5’-ATG GCT CCG ATT CGA CTC TCA G-3’
huCD9-Ex5-R
5’-GGC TCA TCC TTG GTT TTC AGC TTG-3’
huCD9-Ex6-R
5’-CAC GGT GAA GGT TTC GAG TAC GTC-3’
huCD9-Ex7-R
5’-CGA AGA CCT CTT TGA TGG CAT CAG-3’
19
MATERIAL UND METHODEN
Primer für neu identifizierte Varianten des menschlichen CD9
MV Ex1.5-F1
5’-GGT CAG CGG GAC TTT ATT TGG ATC-3’
MV Ex1.5-F2
5’-CAA CCA AAG CCT TGC AGA AAC AG-3’
MV Ex1.5-R1
5’-GGA TCC AAA TAA AGT CCC GCT GAC-3’
MV Ex1.5-R2
5’-CTG TTT CTG CAA GGC TTT GGT TG-3’
MV Ex1.5XX-F1
5’-TGT GGC TCT GGC TTC TTG GTT TAG-3’
MV Ex1.5XX-F2
5’-GAT GCA CTC ATG GTG TTG CGT G-3’
MV Ex1.5XX-R1
5’-GCT AAA CCA AGA AGC CAG AGC CAC-3’
MV Ex1.5XX-R2
5’-GCT ACA CGC AAC ACC ATG AGT GC-3’
MV Ex2.5-F1
5’-CAG GGT CCC AGA AGT TAG CCA GAG-3’
MV Ex2.5-F2
5’-GGA CCA GTT TGC ATT CCG AAT GTA G-3’
MV Ex2.5-R1
5’-GCT AAC TTC TGG GAC CCT GCC TTA C-3’
MV Ex2.5-R2
5’-TTC GGA ATG CAA ACT GGT CCA G-3’
MV Ex3.5-F1
5’-TGT TTC CCC CTT TTC TCG AGG AC-3’
MV Ex3.5-F2
5’-CCT TTT CTC GAG GAC CAC GTT TG-3’
MV Ex3.5-R1
5’-TCG AGA AAA GGG GGA AAC ATA GTC-3’
MV Ex3.5-R2
5’-GGA AAA AAA GCA AAC GTG GTC CTC-3’
MV Exmin1-F1
5’-AGC CTC CCA TCT GTC ATC CCA C-3’
MV Exmin1-F2
5’-CGA GCG AAG GTT TGC AAG GAG-3’
MV Exmin1-F3
5’-GGA AGA GTC TCC CAA AGC AGA ACG-3’
MV Ex3plus-F1
5’-GGA AGG TAC CCA AAG GGC ATG AG-3’
MV Ex3plus-F2
5’-CCC TCT TCC TTT CTG GAG CCT GTC-3’
MV Ex3plus-R1
5’-TCC ATC TGT TCT GTG GTC TGG GTC-3’
MV Ex3plus-R2
5’-GCT CAT GCC CTT TGG GTA CCT TC-3’
MV Ex6plus-F1
5’-TGC TCT GGA CAA ACC CTG CAA G-3’
MV Ex6plus-F2
5’-AGC AAG ACC CGT TCT GCC TGT G-3’
MV Ex6plus-R1
5’-CAT GCT TGC AGG GTT TGT CCA G-3’
MV Ex6plus-R2
5’-ACA GGC AGA ACG GGT CTT GCT G-3’
Primer zur Kontrolle der Qualität der RNAs
huGAPDH-F
5’-GGA GTC AAC GGA TTT GGT-3’
huGAPDH-R
5’-GTG ATG GGA TTT CCA TTG AT-3’
Primer für Kontroll-PCR und Sequenzierung hergestellter Plasmide
Dual-SF1
5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGA TC-3’
Dual-SR1
5’-ACC AGG ATC TCC TAG GCT AGT TG-3’
20
MATERIAL UND METHODEN
Durchführung
Zur Untersuchung der Expression verschiedener Gene auf mRNA-Ebene,
Gewinnung zu klonierender Sequenzabschnitte und zur Größenbestimmung
klonierter DNA-Sequenzen wurden (c)DNA-Bereiche durch sequenzspezifische
Oligonukleotide eingegrenzt und mittels PCR vervielfältigt. Dazu wurde der oben
beschriebene
Reaktionsansatz
in
einem
PCR-Reaktionsgefäß
auf
Eis
zusammengemischt und dann in einem „Thermocycler“ folgendem Temperaturprofil ausgesetzt: 3 min Initialdenaturierung bei 94°C, 35 Wiederholungen von
1 min Denaturierung bei 94°C, 1 min Primeranlagerung beim ermittelten
Temperaturoptimum des jeweiligen Primerpaars (typischerweise 56°C) und 1 min
DNA-Synthese
bei 72°C. Abschließend folgte
eine 7-minütige
terminale
DNA-Synthesephase bei 72°C und Abkühlung auf 4°C. Zum Ausschluß von
Kontamination durch DNA aus der Umgebung wurde pro PCR-Ansatz eine
entsprechende Reaktion ohne Zugabe einer (c)DNA-Vorlage durchgeführt.
Desweiteren erfolgte vor jeder RT-PCR eine Qualitätsprüfung der mRNA/cDNA
durch Amplifikation mit Primern, die spezifisch für die als stabil in Zellen exprimiert
geltende Glyzerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) waren. Nur aus
intakter RNA gewonnene cDNA, angezeigt durch ein GAPDH-Signal hoher
Intensität, wurde für die Versuche eingesetzt. Zur Analyse der erhaltenen
PCR-Produkte diente die Agarose-Gelelektrophorese (siehe 2.2.6), welche eine
Auftrennung unterschiedlich großer Nukleinsäuremoleküle erlaubt.
2.2.5
„RACE“-Amplifikation des 5’-Endes einer cDNA
Tabelle 8:
Für die „RACE“-Amplifikation des 5’-Endes einer cDNA verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Zentrifuge für Reaktionsgefäße (Modell 5415 C)
Eppendorf, Hamburg
500 µl-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„BD SMART RACE cDNA Amplification Kit”
Clontech, Heidelberg
21
MATERIAL UND METHODEN
mRNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Isoliert aus malignen neuralen Zelllinien der Ratte:
siehe 2.2.1
BT4Ca, BT8Ca und BT12Ca
Durchführung
Mit Hilfe der RACE-Methode („Rapid Amplification of cDNA-Ends“) konnte das
noch unbekannte 5’-Ende einer cDNA spezifisch amplifiziert werden. Dazu wurde
der „BD SMART RACE“-Kit verwendet, bei dem für die Erststrangsynthese
ausgehend von der poly A+-mRNA ein modifizierter „SMART“-Oligo(dT)-Primer
und eine „PowerScript“-Reverse Transkriptase vorgesehen sind. Das verwendete
Enzym fügte nach Erreichen des 5’-Endes der mRNA drei bis fünf desoxy-Cytidine
hinzu. Ein spezieller „SMART“-Primer, dessen 3’-Ende mit Oligo(dG) versehen ist,
konnte an diese Oligo(dC)-Erweiterung des neusynthetisierten ersten Strangs
binden und durch sein 5’-Ende eine Primerbindungsstelle anfügen. Die
nachfolgende
PCR
mit
einem
5’-Universalprimer
(UPM)
und
einem
genspezifischen 3’-Primer (rCD9-5R-GSP1, Tabelle 7) bestand aus 35 Zyklen bei
94°C/68°C/72°C für jeweils 30 Sekunden. Als Positivkontrolle diente eine im Kit
enthaltene
„RACE-Ready
cDNA“
aus
humaner
Plazenta
und
für
den
Transferrinrezeptor spezifische Primer. In einer entsprechenden PCR als
Negativkontrolle wurde jeweils nur einer der Primer eingesetzt. Um die
CD9-spezifischen von anderen Reaktionsprodukten abzugrenzen, wurde eine
kleine Menge der erhaltenen PCR-Produkte erneut in 25 Zyklen amplifiziert. Dafür
wurde ein weiter innen liegender CD9-spezifischen Primer (rCD9-5R-nest,
Tabelle 7) in Kombination mit dem Universalprimer bei einer auf 63°C reduzierten
Anlagerungstemperatur und sonst gleichen PCR-Bedingungen verwendet. Die
erhaltenen PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese (siehe 2.2.6)
analysiert.
Zur
Klonierung
der
DNA-Fragmente
in
den
Vektor
pPCR-Script Amp SK(+) mit dem „PCR-Script Amp Cloning Kit“ (siehe 2.2.8.1)
wurden diese aus dem Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction Kits“ isoliert
(siehe 2.2.7). Die Sequenzierung der in Plasmide integrierten cDNA-Enden in
beiden Richtungen mit vektorspezifischen Primern erfolgte durch die Firma Seqlab
(Göttingen).
22
MATERIAL UND METHODEN
2.2.6
Agarose-Gelelektrophorese
Tabelle 9:
Für die Agarose-Gelelektrophorese verwendete Materialien.
Geräte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Netzgerät „E-Gel Power Base“
Invitrogen, Leck, Niederlande
Elektrophoresekammer (Modell MUPID II)
Biozym, Hessisch Oldendorf
Geldokumentationssystem „Multilmage Light Cabinet“
Biozym, Hessisch Oldendorf
Mikrowellengerät
AEG, Berlin
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
2% Agarose-Fertiggele (E-Gele)
Invitrogen, Leck, Niederlande
Seakem LE Agarose
Biozym, Hessisch Oldendorf
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
Fluka, Buchs, Schweiz
Borsäure
Fluka, Buchs, Schweiz
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Serva, Heidelberg
Ficoll
Merck, Darmstadt
Bromphenolblau
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Xylencyanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
„Tracklt“ DNA-Längenmarker
Invitrogen, Leck, Niederlande
Ethidiumbromid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Gebrauchskonzentration: 0,5 µg/ml in 0,5x TBE-Puffer
Zu analysierende Proben
Hersteller bzw. Bezugsquelle
PCR-Produkte
siehe 2.2.4 und 2.2.5
DNA nach Elution aus Agarosegelen
siehe 2.2.7
Plasmid-DNA nach Spaltung mit
siehe 2.2.12
Restriktionsendonukleasen
Hergestellte Puffer und Lösungen
Agarosegel:
Seakem LE Agarose (1-2% (w/v), abhängig von der
Größe der PCR-Produkte, meist 2%) wurde mit
entsprechender Menge 1x TBE-Puffer gemischt und
unter Erhitzen gelöst. Nach Abkühlung auf etwa 60°C
wurde die Agarose in die dafür vorgesehenen Gelträger
gegossen. Die erstarrten Gele konnten anschließend mit
0,5x TBE-Puffer überschichtet und ggf. bis zum
Gebrauch bei 4°C gelagert werden.
23
MATERIAL UND METHODEN
1x Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE):
-
90 mM Tris
-
90 mM Borsäure
-
2,5 mM EDTA
-
pH 8,0
10x Ladepuffer:
-
15% (w/v) Ficoll
-
0,25% (w/v) Bromphenolblau
-
0,25% (w/v) Xylencyanol
Durchführung
PCR-Produkte und Plasmid-DNA nach Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
wurden
mittels
Agarose-Gelelektrophorese,
durch
die
verschieden
große
DNA-Stücke getrennt werden können, analysiert. Dafür konnte entweder ein
Agarosegel selbst hergestellt (s.o.) oder ein E-Fertiggel (s.o.) verwendet werden.
Eine Probe wurde mit 10x-Ladepuffer (1/9 des Gesamtvolumens) vermischt und in
eine der Probentaschen des Agarosegels pipettiert. Neben den zu analysierenden
Proben wurde ein DNA-Längenmarker, welcher DNA-Moleküle bekannter Größe
enthält, aufgetragen. Bei E-Gelen erfolgte die Elektrophorese ohne zusätzlichen
Laufpuffer bei einer Feldstärke von 7 V/cm in 30 min. Durch das im Gel bereits
enthaltene Ethidiumbromid konnten die DNA-Banden unter UV-Durchlicht bei 320
nm unmittelbar sichtbar gemacht werden. Selbst hergestellte Agarosegele wurden
unter 0,5x TBE-Puffer 30-60 min einer Feldstärke von 10 V/cm ausgesetzt und
dann 10 min in Ethidiumbromid-Lösung gefärbt. Im UV-Durchlicht sichtbare
Bandenmuster wurden mit Hilfe des Geldokumentationssystems als Bilddatei
gespeichert.
24
MATERIAL UND METHODEN
2.2.7
Elution von DNA aus Agarosegelen
Tabelle 10:
Für die Elution von DNA aus Agarosegelen verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Zentrifuge für Reaktionsgefäße (Modell 5415 C)
Eppendorf, Hamburg
UV-Leuchttisch
Alpha Innotech Corporation,
San Leandro, USA
Thermomixer (Modell 5436)
Eppendorf, Hamburg
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„Mass Ruler“ (Low Range),
Fermentas, St. Leon-Rot
DNA-Größen- und Mengenstandard
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„QiaQuick Gel Extraction Kit“
Qiagen, Hilden
Zu eluierende Proben
PCR-amplifizierte (c)DNA
siehe 2.2.4 und 2.2.5
Durchführung
Bestimmte
DNA-Stücke
enthaltende
Gelfragmente
wurden
zur
weiteren
Verwendung in Folgeprozessen aus dem Agarosegel (siehe 2.2.6) unter
UV-Durchlicht geschnitten, um daraus die DNA mit dem „QiaQuick Gel Extraction
Kit“ gemäß Herstellerprotokoll zu isolieren. Die Konzentration der erhaltenen
Nukleinsäurelösung
wurde
nach
einer
folgenden
analytischen
Agarose-
Gelelektrophorese durch visuellen Vergleich der Banden mit denen eines
DNA-Größen- und Mengenstandards abgeschätzt.
25
MATERIAL UND METHODEN
2.2.8
Klonierung in Plasmidvektoren
2.2.8.1
Klassische Klonierung
Tabelle 11:
Für die klassische Klonierung verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
PCR-Gerät „MJ-Minicycler“
Biozym, Hessisch Oldendorf
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
500 µl-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„PCR-Script Amp Cloning Kit”
Stratagene, Amsterdam, Niederlande
Zu klonierende DNA-Stücke (Inserts)
PCR-amplifizierte (c)DNA
siehe 2.2.4 und 2.2.5
Durchführung
Zur Klonierung von PCR-Produkten in den Vektor pPCR-Script Amp SK(+) wurde
das „PCR-Script Amp Cloning Kit“ verwendet. Zunächst wurde das zu klonierende
DNA-Stück (Insert) nach Agarose-Gelelektrophorese (siehe 2.2.6) aus dem Gel
isoliert (siehe 2.2.7). In einer Reaktion mit T4 DNA-Ligase konnte das Insert nach
Anleitung des Herstellers in den Vektor eingefügt werden. Zur Vermehrung der
rekombinanten Plasmide wurden kompetente Bakterien mit dem Ligationsansatz
transformiert (siehe 2.2.9). Anschließend erfolgte ausgehend von den erhaltenen
Klonen die Isolierung der Plasmid-DNA durch eine Mini-Plasmidpräparation (siehe
2.2.10) und deren photometrische Quantifizierung (siehe 2.2.2). Zur Identifizierung
von Plasmiden mit Insert diente entweder eine Restriktionsendonukleasespaltung
(siehe 2.2.12) oder eine Polymerase-Kettenreaktion mit vektor- und insertspezifischen
Primern
(siehe
2.2.4,
Tabelle
7).
Von
positiv
getesteten
Bakterienklonen wurden neben der isolierten Plasmid-DNA Glyzerinkulturen
eingefroren (siehe 2.2.11). Durch Sequenzierung der Plasmide (Firma Seqlab,
Göttingen)
mit
vektorspezifischen
Primern
konnte
die
Korrektheit
der
Insertsequenz überprüft werden.
26
MATERIAL UND METHODEN
2.2.8.2
Klonierung mit den „InFusion“- und „Creator“-Systemen
Tabelle 12:
Für die Klonierung mit den „InFusion“- und „Creator“-Systemen verwendete
Materialien.
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„InFusion“- und „Creator“-PCR-Kloniersysteme
Clontech, Heidelberg
Zu klonierende DNA-Stücke (Inserts)
Hersteller bzw. Bezugsquelle
PCR-amplifizierte (c)DNA
siehe 2.2.4
Hergestellte Reaktionsansätze
Für den „InFusion“-Reaktionsansatz wurden folgende
Komponenten des Kits bis zu den angegebenen
Endkonzentrationen zusammengefügt:
-
1x „InFusion”-Reaktionspuffer
-
1x BSA-Lösung
-
100 ng linearisierter Vektor pDNR Dual
-
100 ng PCR-amplifizierte (c)DNA
-
20 u „InFusion“-Rekombinase
-
Wasser bis 20 µl Gesamtvolumen
Für den „Creator“-Reaktionsansatz wurden folgende
Komponenten des Kits bis zu den angegebenen
Endkonzentrationen zusammengefügt:
-
1x „Cre”-Reaktionspuffer
-
1x BSA-Lösung
-
200 ng Donorvektor
-
200 ng Akzeptorvektor
-
100 ng „Cre“-Rekombinase
-
Wasser bis 20 µl Gesamtvolumen
Durchführung
Mit den auf Rekombinasereaktionen beruhenden „InFusion“- und „Creator“PCR-Kloniersystemen ist es möglich, eine DNA-Sequenz einfach in Zielvektoren
für verschiedene Anwendungen zu übertragen (Sauer 1994). Im Rahmen dieser
Arbeit wurden sie zur Herstellung von Plasmiden eingesetzt, die die Expression
27
MATERIAL UND METHODEN
eines Fusionsproteins mit N- oder C-terminalem EGFP („enhanced green
fluorescent protein“) in Säugerzellen erlauben. Die einzufügende Sequenz wurde
als PCR-Produkt gewonnen und zunächst mit Hilfe des „InFusion“-Enzyms in
einen Donorvektor kloniert, um anschließend durch die „Cre“-Rekombinase in die
verschiedenen Zielvektoren übertragen werden zu können.
Zur Klonierung mit Hilfe des „InFusion“-Systems in den Donorvektor pDNR-Dual
muss ein PCR-Produkt von Sequenzen begrenzt sein, die homolog zu den Enden
des linearisiert vorliegenden Plasmids sind. Daher wurde das zu klonierende
DNA-Stück mit sequenzspezifischen Primern, die um 16 Nukleotide aus der
Vektorsequenz verlängert waren, amplifiziert (siehe 2.2.4, Tabelle 7). Zur
Verknüpfung der homologen Bereiche von PCR-Produkt und Vektor wurde der die
„InFusion“-Rekombinase
enthaltende
Reaktionsansatz
(s.o.)
30
min
bei
Raumtemperatur inkubiert, bevor 1 µl davon zur Transformation von Bakterien des
Stammes E. coli XL1-Blue (siehe 2.2.9) verwendet wurde. Ein Teil des
Transformationsansatzes wurde auf Luria-Bertani (LB)-Agar-Platten mit 75 µg/ml
Ampicillin ausgestrichen und etwa 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur
Charakterisierung der erhaltenen Klone wurden 5 ml antibiotikumhaltiges
LB-Medium mit einer E.coli-Kolonie beimpft und über Nacht bei 37°C in einem
Schüttelinkubator bei 250 upm inkubiert. Anschließend erfolgte eine Präparation
der Plasmid-DNA (siehe 2.2.10), die dann in Polymerase-Kettenreaktionen mit
vektor- und/oder insertspezifischen Primern (siehe 2.2.4, Tabelle 7) eingesetzt
wurde. Von den Klonen, die zu den erwarteten PCR-Produkten führten, wurden
Glyzerinkulturen zur Langzeitlagerung angelegt (siehe 2.2.11). Ausgehend von der
isolierten Plasmid-DNA konnte durch Sequenzierung (Firma Seqlab, Göttingen)
mit den Primern Dual-SF1 und Dual-SR1 (Tabelle 7) für jeden Klon die Sequenz
des Inserts in der Klonierungsstelle des Vektors überprüft werden. Die fehlerfreien
Plasmide konnten dann zum Transfer des Inserts in verschiedene Zielvektoren
herangezogen werden.
Das Übertragen der in pDNR-Dual klonierten DNA-Stücke in verschiedene
Akzeptorvektoren erfolgte unter Verwendung des „Creator“-Systems in einer durch
die „Cre“-Rekombinase vermittelten Reaktion. Dabei wird der Bereich zwischen
den zwei loxP-Stellen in pDNR-Dual unter Beibehaltung der Orientierung komplett
28
MATERIAL UND METHODEN
in die loxP-Stelle eines Akzeptorvektors übertragen. Neben dem Insert wird dabei
auch das in pDNR-Dual promotorlose Chloramphenicol-Resistenzgen übertragen,
das im rekombinanten Akzeptorvektor dann durch einen prokaryotischen Promotor
exprimiert wird. Außerdem wird das Anwachsen von nur pDNR-Dual enthaltenden
Klonen durch Selektion mit Saccharose unterdrückt, da dieses Plasmid auch für
Saccharase kodiert, deren Reaktionsprodukte toxisch sind.
Die Expression eines Fusionsproteins mit N-terminalem EGFP in Säugerzellen
ermöglichte der Akzeptorvektor pLP-EGFP-C1; zur Expression eines Fusionsproteins
mit
C-terminalem
EGFP
der
pLPS-3’-EGFP.
Zur
Herstellung
rekombinanter Expressionsvektoren wurde der oben beschriebene Reaktionsansatz zunächst 15 min bei Raumtemperatur und anschließend (zur Inaktivierung
der Rekombinase) 5 min bei 70°C inkubiert, bevor davon 1 µl zur Transformation
von kompetenten Bakterien des Stammes E. coli XL1-Blue (siehe 2.2.9)
verwendet wurde.
Der
Transformationsansatz
wurde
auf
LB-Agar-Platten
mit
30
µg/ml
Chloramphenicol und 7% (w/v) Saccharose ausplattiert. Alle weiteren Prozesse
wie
Kultivierung
der
Bakterien
in
LB-Medium,
Plasmidpräparation,
Langzeitlagerung von Glyzerinkulturen und Überprüfung der Inserts durch
Polymerase-Kettenreaktion
und
Sequenzierung
erfolgten
wie
oben
für
„InFusion“-Klonierungen beschrieben. Die abschließend erhaltene Plasmid-DNA
konnte zur Transfektion in Säugerzellen (siehe 2.2.13) eingesetzt werden.
2.2.9
Transformation von Bakterien mit Plasmiden
Tabelle 13:
Für die Transformation von Bakterien mit Plasmiden verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Brutschrank (Typ B 6760)
Heraeus, Hanau
Schüttelinkubator (Modell Certomat R)
Braun, Melsungen
Plastikschalen, Ø 10 cm
Becton Dickinson, Heidelberg
14 ml-Bakterienröhrchen (Typ 2059)
Becton Dickinson, Heidelberg
29
MATERIAL UND METHODEN
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
LB (Luria-Bertani)-Broth (Fertigmischung)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
LB (Luria-Bertani)-Agar (Fertigmischung)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ampicillin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Chloramphenicol
Merck, Darmstadt
Saccharose
Merck, Darmstadt
Isopropyl-D-1-thiogalaktopyranosid (IPTG)
Fluka, Buchs, Schweiz
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid (X-Gal)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Dimethylformamid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
ß-Mercaptoethanol
Stratagene, Amsterdam, Niederlande
SOC-Medium
Invitrogen, Leck, Niederlande
Bakterien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Escherichia coli (E. coli) XL-1 Blue (superkompetent)
Stratagene, Amsterdam, Niederlande
Plasmid-DNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Plasmid-DNA
siehe 2.2.8
Hergestellte Lösungen und Agarplatten
Ampicillin:
Stammlösung von 25 mg/ml in sterilem Wasser
Chloramphenicol:
Stammlösung von 10 mg/ml in sterilem Wasser
X-Gal-Lösung:
40 mg/ml (w/v) in Dimethylformamid
IPTG-Lösung:
100 mM in destilliertem Wasser
LB-Agar-Platten mit Ampicillin:
Pro Liter wurden 35 g LB-Agar-Fertigmischung in
destilliertem Wasser suspendiert und autoklaviert (20
min, 121°C). Nach Abkühlung auf etwa 50°C wurde
Ampicillinlösung zu einer Endkonzentration von 75
µg/ml zugemischt, bevor die Lösung in Plastikschalen
gegossen
wurde.
Die
Lagerung
der
Platten
mit
erstarrtem Agar erfolgte bis zum Gebrauch bei 4°C.
30
MATERIAL UND METHODEN
LB-Agar-Platten mit Chloramphenicol und
Saccharose:
Nach Abkühlung des LB-Agars (siehe oben) auf etwa
50°C
wurden
Chloramphenicol-Lösung
zu
einer
Endkonzentration von 30 µg/ml zugemischt und 70 g/l
Saccharose gelöst, bevor die Lösung in Plastikschalen
gegossen
wurde.
Die
Lagerung
der
Platten
mit
erstarrtem Agar erfolgte bis zum Gebrauch bei 4°C.
Durchführung
Zur Transformation mit Plasmid-DNA wurden jeweils 40 µl hitzeschockkompetente
E. coli XL-1 Blue mit 0,7 µl ß-Mercaptoethanol in einem 14 ml-Röhrchen gemischt
und 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl eines Ligationsansatz (siehe
2.2.8.1) oder einer prozessierten Reaktionsmischung einer Rekombinasereaktion
(siehe 2.2.8.2) erfolgte erneut eine Inkubation für 30 min auf Eis. Anschließend
wurde das Röhrchen exakt 45 Sekunden lang in ein auf 42°C vorgeheiztes
Wasserbad gestellt und sofort wieder auf Eis gekühlt. Pro Ansatz wurden 0,9 ml
vorgewärmtes SOC-Medium zugegeben und das Röhrchen 1 Stunde bei 37°C
und 250 upm inkubiert. Anschließend konnten die Transformanten auf
LB-Agar-Platten mit den für die Vektoren geeigneten Selektionsmarkern
(Ampicillin bzw. Chloramphenicol und Saccharose) ausplattiert und über Nacht bei
37°C inkubiert werden. In den Fällen, in denen die Transformation Teil einer
Neuklonierung in die Galaktosidasesequenz war (Vektor pCR-Script Amp SK(+)),
waren zuvor auf den Platten jeweils 50 µl X-Gal-Lösung und 10 µl IPTG-Lösung
verteilt worden.
31
MATERIAL UND METHODEN
2.2.10
Plasmidpräparation aus E.coli
Tabelle 14:
Für die Plasmidpräparation aus E.coli verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Brutschrank (Typ B 6760)
Heraeus, Hanau
Schüttelinkubator (Modell Certomat R)
Braun, Melsungen
Zentrifuge (Modell Multifuge 3 S-R)
Heraeus, Hanau
Zentrifuge für Reaktionsgefäße (Modell 5415 C)
Eppendorf, Hamburg
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
14 ml-Bakterienröhrchen (Typ 2059)
Becton Dickinson, Heidelberg
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
LB (Luria-Bertani)-Broth (Fertigmischung)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ampicillin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Chloramphenicol
Merck, Darmstadt
Reagenzien-Kits
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„QiaPrep Spin Miniprep Kit”
Qiagen, Hilden
„EndoFree Plasmid Maxi Kit”
Qiagen, Hilden
Hergestellte Medien
LB-Medium mit Ampicillin oder Chloramphenicol:
Pro Liter Medium wurden 20 g der Fertigmischung in
destilliertem
Wasser
gelöst
und
anschließend
autoklaviert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C bis zum
Gebrauch, vor dem Ampicillin (Endkonzentration 75
µg/ml) oder Chloramphenicol (Endkonzentration 30
µg/ml) zugegeben wurde (Stammlösungen: siehe 2.2.9).
Durchführung
Zur „Mini“-Plasmidpräparation wurden 5 ml antibiotikumhaltiges LB-Medium mit
einer E.coli-Transformantenkolonie beimpft (siehe 2.2.9) und über Nacht bei 37°C
in einem Bakterienschüttler bei 250 upm inkubiert. Zur „Maxi“-Plasmidpräparation
wurde in gleicher Weise eine Vorkultur hergestellt, von der 1 ml in 100 ml frischem
antibiotikumhaltigem LB-Medium erneut über Nacht inkubiert wurden. Die
32
MATERIAL UND METHODEN
erhaltenen Bakteriensuspensionen (5 ml bzw. 100 ml) wurden bei 4°C zentrifugiert
(5 min bzw. 15 min bei 4000-6000 x g). Nach Entfernen des Überstandes konnte
die Plasmid-DNA unter Verwendung des „QiaPrep Spin Miniprep Kits“ oder des
„EndoFree Plasmid Maxi Kits“ nach Angaben des Herstellers aus den Pellets
isoliert werden. Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde photometrisch
bestimmt (siehe 2.2.2).
2.2.11
Einfrieren und Auftauen von Bakteriensuspensionen
Tabelle 15:
Zum Einfrieren und Auftauen von Bakteriensuspensionen verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Gefrierschrank, -80°C
Labotect, Göttingen
2 ml-Einfrierröhrchen
Greiner, Nürnberg
Chemikalien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Glyzerin
Merck, Darmstadt
Hergestellte Lösungen
Glyzerinlösung:
50% (v/v) in destilliertem Wasser, autoklaviert
Durchführung
Zur langfristigen Lagerung von E. coli-Klonen wurden 500 µl einer Übernachtkultur
(siehe 2.2.10) mit 500 µl Glyzerinlösung in einem Einfrierröhrchen auf Eis
gemischt und in einen -80°C-Gefrierschrank gestellt.
Bei Bedarf konnte ein kleines Stück der eingefrorenen Glyzerinkultur mit einer
sterilen Pipettenspitze abgekratzt, aufgetaut und auf einer LB-Agar-Platte mit
einem zur Selektion plasmidtragender Bakterien geeignetem Antibiotikum
ausgestrichen werden.
33
MATERIAL UND METHODEN
2.2.12
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Tabelle 16:
Für die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonuklasen verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Thermomixer (Modell 5436)
Eppendorf, Hamburg
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Reagenzien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Restriktionsenzyme (EcoRI und NotI)
New England Biolabs, Schwalbach
DNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Plasmid-DNA
siehe 2.2.10
Hergestellte Reaktionsansätze
Für
die
Spaltung
von
DNA
mit
Restriktions-
endonukleasen wurden folgende Komponenten bis zu
den
angegebenen
Endkonzentrationen
zusammen-
gefügt:
-
1x Reaktionspuffer
-
1x BSA-Lösung
-
1 µg Plasmid-DNA
-
1 u Restriktionsenzym Not I
-
1 u Restriktionsenzym EcoRI
-
Wasser bis 20 µl Gesamtvolumen
Durchführung
Die Charakterisierung von Inserts in Plasmidvektoren erfolgte entweder mittels
PCR (siehe 2.2.4) oder durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen. Dazu
wurde die oben beschriebene Reaktionsmischung hergestellt und 1 Stunde bei
37°C in einem Thermomixer inkubiert. Nach einer 20-minütigen Hitzeinaktivierung
der Enzyme bei 65°C wurden die erhaltenen Fragmente durch AgaroseGelelektrophorese (siehe 2.2.6) analysiert.
34
MATERIAL UND METHODEN
2.2.13
Transfektion von Säugerzellen
Tabelle 17:
Für die Transfektion von Säugerzellen verwendete Materialien.
Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
6-Loch-Zellkulturplatte
Becton Dickinson, Heidelberg
15 ml-Röhrchen (Typ 2096)
Becton Dickinson, Heidelberg
Reagenzien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Lipofectamin 2000
Invitrogen, Leck, Niederlande
Nährmedium für die Kultivierung der Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„Dulbecco´s modified Eagle´s medium” (DMEM),
PAA Laboratories, Linz, Österreich
mit Phenolrot, 4,5 g/l Glucose, 584 mg/l L-Glutamin
Medienzusätze
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Fötales Kälberserum (FCS)
PAA Laboratories, Linz, Österreich
Gebrauchskonzentration: 10 % (v/v) in DMEM
Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
BT4Ca
siehe 2.1.1
Plasmid-DNA
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Expressionskonstrukte
siehe 2.2.8.2
Durchführung
Zur Transfektion mit Lipofectamin 2000 wurden 106 Zellen in 2 ml DMEM mit FCS
pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät und im Brutschrank bis zu einer
Konfluenz der Zellen von 90% inkubiert. Für das Einbringen der DNA in
Lipidkomplexe wurden zunächst in zwei 15 ml-Röhrchen getrennt 5 µg
Plasmid-DNA aus einer Maxi-Plasmidpräparation (siehe 2.2.10) und 10 µl
Lipofectamin 2000 vorgelegt und jeweils mit 250 µl auf Raumtemperatur
vorgewärmtem DMEM (ohne Zusätze) vermengt. Nach einer Inkubationszeit von
5 Minuten wurden die beiden Vorverdünnungen vermischt und für weitere 20 min
35
MATERIAL UND METHODEN
bei Raumtemperatur inkubiert. Dann konnte das Transfektionsgemisch auf die
durch Absaugen vom Medium befreiten Zellen aufgetropft werden. Nach 12
Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde das den Transfektionskomplex
enthaltende Medium durch 2 ml DMEM mit FCS ersetzt. Bis zu ihrer Ernte wurden
die Zellen weitere 48 Stunden inkubiert.
2.3
Proteinbiochemische Methoden
2.3.1
Zelllyse und Solubilisierung der Membranproteine
Tabelle 18:
Für die Zelllyse und Solubilisierung der Membranproteine verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Zentrifuge für Reaktionsgefäße (Modell 5415 C)
Eppendorf, Hamburg
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
1 M Tris-Cl-Lösung, pH 7,4
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
5 M NaCl-Lösung
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
n-Octylglucosid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
„Complete Mini EDTA-free Proteaseinhibitor
Roche, München
Cocktail Tablets”
Zelllinien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
BT4Ca-Zellen nach Transfektion mit
siehe 2.2.13
Expressionskonstrukten
Hergestellte Puffer
Solubilisierungspuffer:
-
40 mM Tris-Cl, pH 7,4
-
150 mM NaCl
-
50 mM n-Octylglucosid
-
1 Tablette „Complete Mini EDTA-free Proteaseinhibitor“ pro 10 ml
36
MATERIAL UND METHODEN
Durchführung
Pro Ansatz wurden etwa 6x106 Zellen durch Trypsin/EDTA-Fertiglösung von den
Vertiefungen einer 6-Loch-Platte abgelöst (siehe 2.1.1), in PBS aufgenommen und
in 5 min bei 300 x g abzentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das
Zellpellet in 500 µl kaltem Solubilisierungspuffer resuspendiert und für eine
Stunde, unter gelegentlichem Resuspendieren ungelöster Anteile, auf Eis
inkubiert.
Anschließend
konnten
unlösliche
Zelltrümmer
durch
30
min
Zentrifugation bei 14 000 x g und 4°C abgetrennt werden. Der Überstand wurde in
ein neues Reaktionsgefäß überführt und entweder bis zum Gebrauch bei -80°C
gelagert oder direkt für Folgeprozesse verwendet.
2.3.2
Bestimmung der Proteinkonzentration
Tabelle 19:
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Mikrotiterplatten-Photometer (Modell MRX)
Dynatech Laboratories, Chantilly,
USA
Mikrotiterplatten
Becton Dickinson, Heidelberg
Reagenzien-Kit
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„BCA Protein Assay“-Kit
Perbio, Bonn
Proben zur Konzentrationsbestimmung
Hersteller bzw. Bezugsquelle
n-Octylglucosid-Solubilisate von BT4Ca-Zellen nach
siehe 2.3.1
Transfektion mit Expressionskonstrukten
Durchführung
Der BCA-Proteinassay wurde nach Herstellerangaben zur photometrischen
Messung
des
Gesamtproteingehalts
von
Zelllysaten
eingesetzt.
Mit
Rinderserumalbumin-Standardlösungen (Stammlösung im Kit enthalten) von
2000 µg/ml bis 25 µg/ml in Solubilisierungspuffer (siehe 2.3.1) wurde eine
Eichkurve zur Berechnung der Proteinkonzentration erstellt.
37
MATERIAL UND METHODEN
2.3.3
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE)
Tabelle 20:
Für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
verwendete Materialien.
Geräte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Spannungsgerät 0-400 V
Schrader, Göttingen
Gelelektrophoresekammer „Mini-Protean II“
BioRad, München
Chemikalien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Merck, Darmstadt
Glyzerin
Merck, Darmstadt
Bromphenolblau
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Reagenzien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
„Precise“-Proteinfertiggel,
Pierce, Bonn
mit Acrylamidpolymeranteilen von 8-16%
„PAGE-Ruler“ (11-170 kDa),
Fermentas, St. Leon-Rot
Molekulargewichtsmarker für Proteine
Tris-HEPES-SDS-Puffer für SDS-PAGE
Pierce, Bonn
Zu analysierende Zelllysate
Hersteller bzw. Bezugsquelle
n-Octylglucosid-Solubilisate von BT4Ca-Zellen nach
siehe 2.3.1
Transfektion mit Expressionskonstrukten
Hergestellte Puffer
5x PAGE-Ladepuffer (nicht reduzierend):
-
375 mM Tris-Cl, pH 6,8
-
30% (v/v) Glyzerin
-
15% (w/v) SDS
-
0,05% (w/v) Bromphenolblau
38
MATERIAL UND METHODEN
Durchführung
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese erlaubte die Trennung von Proteinen
annähernd
nach
ihrem
Molekulargewicht.
Durch
den
Einsatz
von
Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde die Eigenladung der Proteine überdeckt, so
dass alle Proteine gleichermaßen eine von ihrer Größe abhängende negative
Ladung aufwiesen. Das zu analysierende Zelllysat wurde mit dem vierfachen
Volumen 5x-PAGE-Ladepuffer (nicht reduzierend) vermischt und 3 min bei 95°C
inkubiert. Nach Abkühlen in einem Eisbad konnten die Proben und eine Mischung
farbstoffmarkierter
Proteine
(als
Größenstandard)
in
die
Taschen
der
„Precise“-Proteingradientengele aufgetragen werden. Die Elektrophorese in der
„Mini Protean II“-Kammer in Tris-HEPES-SDS-Puffer erfolgte nach 10 min Vorlauf
bei 5V/cm mit einer Feldstärke von 10V/cm bis die kleinsten Markerproteine den
unteren Rand des Gels erreichten.
2.3.4
Western Blot-Analyse
Tabelle 21:
Für die Western Blot-Analyse verwendete Materialien.
Geräte und Materialien
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Spannungsgerät 0-400 V
Schrader, Göttingen
Elektroblot-Apparatur
Peqlab, Erlangen
„Fluorotrans”-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran,
Pall, Portsmouth, England
(Porengröße 0,2 µm)
3 MM-Filterpapier
Whatman, Maidstone, England
Röntgenfilm „Hyperfilm“
Amersham Pharmacia, Freiburg
Chemikalien und Fertigprodukte
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Tris
USB, München
Methanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
6-Aminohexansäure
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
1 M Tris-Cl-Lösung, pH 7,4
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
5 M NaCl-Lösung
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tween-20
Merck, Darmstadt
Blockierpuffer „StartingBlock“
Pierce, Bonn
„Super Signal West Dura Extended Duration Substrat”
Pierce, Bonn
39
MATERIAL UND METHODEN
Primär- und Detektionsantikörper
Hersteller bzw. Bezugsquelle
anti-EGFP-Kaninchenantikörper
Abcam, Cambridge, UK
(ab 290, polyklonal)
Gebrauchsverdünnung: 1: 2000 in Blockierpuffer
Ziege-anti-Kaninchen-Ig-Antikörper,
Pierce, Bonn
gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP),
Gebrauchsverdünnung: 1: 30 000 in Blockierpuffer
Hergestellte Puffer
Blotpuffer I:
-
300 mM Tris, pH ~10,4
-
20% (v/v) Methanol
Blotpuffer II:
-
25 mM Tris, pH ~10,4
-
20% (v/v) Methanol
Blotpuffer III:
-
25 mM Tris, pH ~9,4
-
40 mM 6-Aminohexansäure
-
0,02% (v/v) SDS
-
20% (v/v) Methanol
TBS-Puffer:
-
40 mM Tris-Cl, pH 7,4
-
150 mM NaCl
TBST-Puffer:
-
TBS-Puffer
-
0,05% (v/v) Tween-20
Durchführung
Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine (siehe 2.3.3) wurden mit einem
„semi-dry“-Blotverfahren
auf
eine
PVDF-Membran
übertragen.
Der
elektrophoretische Transfer erfolgte mit einer Elektroblot-Apparatur, in der von
unten (Anode) nach oben (Kathode) folgende Komponenten übereinander
geschichtet wurden: Acht Filterpapiere getränkt in Blotpuffer I, vier Filterpapiere
getränkt in Blotpuffer II, PVDF-Membran, Polyacrylamidgel, acht Filterpapiere
40
MATERIAL UND METHODEN
getränkt in Blotpuffer III. Die PVDF-Membran wurde zuvor kurz in Methanol
geschwenkt und dann, ebenso wie das Polyacrylamidgel, kurz in Blotpuffer II. Der
Transfer der Proteine vom Polyacrylamidgel auf die PVDF-Membran erfolgte bei
1,5 V/cm2 Membranfläche in 60 min. Zur Detektion der transferierten Proteine
wurden zunächst die noch freien Proteinbindungsstellen der PVDF-Membran mit
Blockierpuffer während einer Inkubationszeit von 60 min abgesättigt. Danach
wurde eine zuvor ermittelte Menge an Primärantikörper, verdünnt in Blockierpuffer,
zugegeben und die Membran über Nacht bei 4°C geschwenkt. Die Entfernung von
ungebundenen Antikörpern erfolgte durch insgesamt fünf Waschritte von je 5 min:
2x TBS, 1x TBST, 2x TBS. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur mit
dem verdünnten Sekundärantikörperkonjugat und erneutem Waschen (s.o.)
wurden durch die Peroxidase der gebundenen Sekundärantikörper mit dem
„Super-Signal-Substrat“ (verwendet nach Herstellerangaben), Chemilumineszenzsignale erzeugt. Diese waren nach Entwicklung der im Dunkeln auf die Membran
gelegten Röntgenfilme als Schwärzung erkennbar.
2.3.5
Vorhersage der Transmembrantopologie
Membranproteine
weisen
mindestens
ein
bestimmtes
charakteristisches
Strukturelement auf, durch das sie in der Zellmembran verankert sind. Die
überwiegend hydrophobe Seitenketten tragenden Aminosäuren einer solchen
Transmembrandomäne bilden in der Regel eine alpha-Helix, die in die hydrophobe
Umgebung der Zellmembran integriert werden kann. Meist benachbarte hydrophile
Aminosäuren dagegen begünstigen Wechselwirkungen mit der hydrophilen
Oberfläche der Membran sowie mit der wässrigen Umgebung. Auf Grund der
Hydrophobizität und der charakteristischen Struktur des Membranankers ist es
möglich, von der Primärstruktur eine begründete Hypothese dazu abzuleiten,
welche Abschnitte eines Proteins in eine Membran eingebettet sein könnten. In
dieser Arbeit durchgeführte Berechnungen hierzu beruhten auf dem Algorithmus
von Kyte und Doolittle (Kyte und Doolittle 1982; www.expasy.org/cgi-bin/
protscale.pl), mit welchem für jede Aminosäure die Hydrophobizität in ihrer
jeweiligen Umgebung berechnet wird, oder dem „Dense Alignment Surface“
(DAS)–Algorithmus (Cserzö et al. 1997; www.sbc.su.se/~miklos/DAS), mit dem
41
MATERIAL UND METHODEN
Werte
bestimmt
werden,
die
die
Ähnlichkeit
mit
bereits
bekannten
Transmembrandomänen ausdrücken. Da die aus Rechnungen mit beiden
Verfahren
resultierenden
theoretischen
Transmembrantopologien
der
CD9-Varianten in allen Fällen identisch waren, wurden nur die DAS-Werte in Form
einer Graphik dargestellt. Desweiteren wurde die ermittelte mögliche Anordnung
der Transmembrandomänen in einer Zellmembran schematisch dargestellt.
42
ERGEBNISSE
3.
Ergebnisse
3.1
Charakterisierung neuer CD9-Varianten neuraler
Rattenzelllinien
Ausgangspunkt dieser Untersuchungen war die Beobachtung, dass das ubiquitär
vorkommende Tetraspanin CD9 von den tumorigenen neuralen Rattenzelllinien
BT8Ca und BT12Ca scheinbar nicht oder nur sehr schwach exprimiert wird. Dabei
wurde zunächt geprüft, ob die Ursache dieser Besonderheit in einer fehlenden
oder modifizierten Transkription der CD9-RNA liegt.
3.1.1
CD9-spezifische Immunfluoreszenz der BT-Zelllinien
Die tumorigenen neuroektodermalen Rattenzelllinien BT4Ca, BT8Ca und BT12Ca
wurden zunächst durch Immunfluoreszenzfärbung hinsichtlich der Expression des
Proteins CD9 untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene monoklonale
Primärantikörper verwendet: der nach Immunisierung mit Rattengehirnzellen
gewonnene anti-CD9-Antikörper NCA-1 (Deissler et al. 1996) und der gegen das
menschliche CD9 gerichtete kommerzielle Antikörper des Klons MEM-61. Unter
Verwendung des Antikörpers NCA-1 zeigte die Zelllinie BT4Ca eine starke
Plasmamembranfärbung, während bei den Zelllinien BT8Ca und BT12Ca keine
Fluoreszenzsignale sichtbar waren (Abbildung 2, linke Spalte). Dagegen ergab die
Immunfluoreszenzfärbung mit dem Antikörper MEM-61 bei den Zelllinien BT4Ca
und BT8Ca CD9-spezifische Signale nicht nur in der Plasmamembran, sondern
auch im intrazellulären Bereich, während bei der Zelllinie BT12Ca nur eine
intrazelluläre Anfärbung beobachtet werden konnte (Abbildung 2, rechte Spalte).
Offensichtlich exprimieren die Zelllinien BT8Ca und BT12Ca doch immunreaktive
Proteine, die aber nur von einem der beiden anti-CD9-Antikörper (MEM-61)
erkannt werden können. Diese möglichen CD9-Varianten wurden unter den
Bedingungen der Immunfluoreszenzfärbung vor allem im Inneren der Zellen
nachgewiesen.
43
ERGEBNISSE
Abbildung 2:
Rote Immunfluoreszenzfärbung der malignen neuroektodermalen Rattenzelllinien BT4Ca, BT8Ca
und BT12Ca mit den beiden monoklonalen anti-CD9 Antikörpern NCA-1 (linke Spalte) und
MEM-61 (rechte Spalte). Dargestellt sind mikroskopische Aufnahmen der Zellen in 400-facher
Vergrößerung.
44
ERGEBNISSE
3.1.2
Analyse des bekannten CD9-Transkripts (mRNA-A) in
BT-Zelllinien
Als erster Schritt zur Klärung der Ursache der Unterschiede zwischen den
BT-Zelllinien wurde
durch
Reverse
Transkription/Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) mit Oligonukleotiden aus der Datenbanksequenz des Ratten-CD9
(rCD9, Abbildung 3) ihre Expression des bereits bekannten CD9-Transkripts
(mRNA-A) untersucht. Die zur RT-PCR eingesetzten Primer wurden so gewählt,
dass die vollständige mRNA-Sequenz des CD9, die kodierende Sequenz (CDS)
und Teile dieser Bereiche amplifiziert werden konnten (Tabelle 7 und Abbildung
3).
rCD9 mRNA-A
1
61
1
121
◄-----------------------------EXON 1----------------------------rCD9-A-FNC
GTAAGGAGTG GCACTTTTTA AAAGTGGAGC CTCAGGCCAG CCCCTAGCCT CAGCGTGTCT
CATTCCTCAC CGTGAAAAAT TTTCACCTCG GAGTCCGGTC GGGGATCGGA GTCGCACAGA
------------------------------EXON 1----------------------------CAGTCGGTTG TCGAGTTCCT TCGGTCCCGG TCGTGCGTGC CTCTTGTCCC ACGCAAGTCC
GTCAGCCAAC AGCTCAAGGA AGCCAGGGCC AGCACGCACG GAGAACAGGG TGCGTTCAGG
------------------------------EXON 1----------------------------rCD9-A-F1
M P V
K G G S
K C I
K Y L
L F G F
AGCTTGTACC ATGCCGGTCA AAGGAGGTAG CAAGTGCATC AAATACCTGC TCTTTGGATT
TCGAACATGG TACGGCCAGT TTCCTCCATC GTTCACGTAG TTTATGGACG AGAAACCTAA
18
181
---------------►◄-------------EXON 2----------------------------N F I
F W L
A G I A
V L A
I G L
W L R F
TAACTTCATC TTCTGGCTCG CCGGCATCGC AGTGCTTGCC ATTGGACTAT GGCTGCGGTT
ATTGAAGTAG AAGACCGAGC GGCCGTAGCG TCACGAACGG TAACCTGATA CCGACGCCAA
38
241
------------------------------EXON 2--------------------------►◄D S Q
T K S
I F E Q
E T N
H S S
F Y T G
CGACTCTCAG ACCAAGAGCA TCTTCGAGCA AGAAACTAAT CATTCCAGCT TCTACACAGG
GCTGAGAGTC TGGTTCTCGT AGAAGCTCGT TCTTTGATTA GTAAGGTCGA AGATGTGTCC
58
301
------------------------------EXON 3----------------------------V Y I
L I G
A G A L
M M L
V G F
L G C C
AGTGTACATT CTGATTGGAG CTGGGGCCCT CATGATGCTA GTTGGTTTCC TGGGCTGCTG
TCACATGTAA GACTAACCTC GACCCCGGGA GTACTACGAT CAACCAAAGG ACCCGACGAC
78
361
------------------EXON 3---------------►◄-----------------------rCD9-A-F2
G A V
Q E S
Q C M L
G L F
F G F
L L V I
TGGAGCTGTA CAAGAGTCAC AGTGCATGCT GGGATTGTTC TTCGGATTCC TCTTGGTGAT
ACCTCGACAT GTTCTCAGTG TCACGTACGA CCCTAACAAG AAGCCTAAGG AGAACCACTA
45
ERGEBNISSE
98
421
------------------------------EXON 4--------------------►◄------F A I
E I A
A A V W
G Y T
H K D
E V I K
ATTCGCCATT GAGATCGCCG CAGCCGTCTG GGGCTATACC CACAAGGACG AGGTGATTAA
TAAGCGGTAA CTCTAGCGGC GTCGGCAGAC CCCGATATGG GTGTTCCTGC TCCACTAATT
rCD9-A-R2
118
481
------------------------------EXON 5----------------------------E L Q
E F Y
K D T Y
Q K L
R N K
D E P Q
AGAACTCCAG GAGTTTTACA AGGACACCTA CCAAAAGTTA AGGAACAAGG ATGAGCCCCA
TCTTGAGGTC CTCAAAATGT TCCTGTGGAT GGTTTTCAAT TCCTTGTTCC TACTCGGGGT
138
541
--------------EXON 5-------------►◄------------EXON 6-----------R E T
L K A
I H M A
L N C
C G I
A G G V
GCGGGAAACA CTCAAAGCCA TCCATATGGC GTTGAACTGC TGTGGCATAG CTGGTGGTGT
CGCCCTTTGT GAGTTTCGGT AGGTATACCG CAACTTGACG ACACCGTATC GACCACCACA
158
601
------------------------------EXON 6----------------------------E Q F
I S D
I C P K
K Q V
L E S
F Q V K
GGAGCAGTTT ATCTCGGACA TCTGCCCCAA AAAGCAGGTT CTGGAATCCT TCCAGGTTAA
CCTCGTCAAA TAGAGCCTGT AGACGGGGTT TTTCGTCCAA GACCTTAGGA AGGTCCAATT
178
661
►◄----------------------------EXON 7----------------------------S C P
D A I
D E V F
H S K
F H I
I G A V
GTCCTGCCCG GATGCCATCG ATGAGGTCTT CCACAGCAAG TTCCACATCA TTGGAGCAGT
CAGGACGGGC CTACGGTAGC TACTCCAGAA GGTGTCGTTC AAGGTGTAGT AACCTCGTCA
198
721
--------------------------►◄----------------EXON 8--------------G I G
I A V
V M I F
G M I
F S M
I L C C
GGGCATCGGT ATCGCCGTGG TGATGATCTT CGGTATGATT TTCAGCATGA TTCTGTGCTG
CCCGTAGCCA TAGCGGCACC ACTACTAGAA GCCATACTAA AAGTCGTACT AAGACACGAC
218
781
------------------------------EXON 8----------------------------A I R
R S R
E M V @
CGCCATCCGC AGGAGCCGAG AAATGGTCTA GAGTCTGACC CAACCCCGAG CAGGAACAGT
GCGGTAGGCG TCCTCGGCTC TTTACCAGAT CTCAGACTGG GTTGGGGCTC GTCCTTGTCA
rCD9-A-R1
841
------------------------------EXON 8----------------------------GGCTCTGAGG ACAGTCGGGC CATTTGTTTT TTTTGCCACT AATATTAGTA TTCATTACGC
CCGAGACTCC TGTCAGCCCG GTAAACAAAA AAAACGGTGA TTATAATCAT AAGTAATGCG
901
------------------------------EXON 8----------------------------ATTTCTAAAC AACAGTTATT CTGTGTTTGT CTTTTTAATG CTTTATTCAT TATTGACATT
TAAAGATTTG TTGTCAATAA GACACAAACA GAAAAATTAC GAAATAAGTA ATAACTGTAA
961
------------------------------EXON 8----------------------------TGTAGTAGAG GGATCCGGGG GTTCGGTTCA TTTTGATTTT TTTTTTTTTG GTTGTTTATT
ACATCATCTC CCTAGGCCCC CAAGCCAAGT AAAACTAAAA AAAAAAAAAC CAACAAATAA
------------------------------EXON 8----------------------------1021 TTTGCTTGTT ATGTTAAGCA AAAAATCCTG CAATGAAAGG TACTGTATTT GCCAGACTCT
AAACGAACAA TACAATTCGT TTTTTAGGAC GTTACTTTCC ATGACATAAA CGGTCTGAGA
------------------------------EXON 8----------------------------1081 AGACATAAGA TGTTGTACAT AAAGAGAATT TTTTTGCCTT TAAATAGATA AAAGTATCTA
TCTGTATTCT ACAACATGTA TTTCTCTTAA AAAAACGGAA ATTTATCTAT TTTCATAGAT
46
ERGEBNISSE
------------------------------EXON 8----------------------------1141 TCAGATAAAA TCAGGTTGTA AGTTATATTG AAGACAATTT GATACATAAT AAAAGATTAT
AGTCTATTTT AGTCCAACAT TCAATATAAC TTCTGTTAAA CTATGTATTA TTTTCTAATA
rCD9-A-RNC
------►
1201 AACAATG
TTGTTAC
Abbildung 3:
Dargestellt ist die Sequenz der zur rCD9 mRNA-A komplementären cDNA (Eintrag XM 342760 in
der Datenbank des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI)). Die für das Protein
CD9 codierende Sequenz (CDS, Aminosäuren 1-226) ist mit ihrer Übersetzung (von Methionin (M)
bis zum Ende der Translation (@)) durch Fettdruck hervorgehoben. Der Abbildung zu entnehmen
sind auch Sequenzen (grau unterlegt) und Namen von Oligonukleotiden, die als Primer in der
Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) eingesetzt wurden.
Unter Verwendung des Primerpaars rCD9-A-FNC/rCD9-A-RNC, mit dem der
gesamte kodierende und nichtkodierende Bereich der rCD9-cDNA amplifiziert
werden konnte, ergab die RT-PCR bei den Zelllinien BT4Ca und BT13Ca ein
Produkt der erwarteten Größe von ca. 1200 bp (Abbildung 4A). Hingegen war bei
den Zelllinien BT8Ca und BT12Ca keine bzw. eine nur sehr schwache
Amplifikation der Gesamtsequenz möglich. Wurde der Primer rCD9-A-FNC
zusammen mit rCD9-A-R2, welcher am Übergang von Exon 4 zu Exon 5 der
rCD9-Sequenz bindet, eingesetzt, war es möglich auch bei der Zelllinie BT12Ca
eine größere Menge eines den 5’-nichtkodierenden Bereich enthaltenden
RT-PCR-Produkts von ca. 490 bp darzustellen (Abbildung 4B). Bei einer
Begrenzung
des
Amplikons
auf
den
kodierenden
Bereich
der
rCD9 mRNA-A-Sequenz mit den Primern rCD9-A-F1 und rCD9-A-R2 wurde
ausgehend von mRNA aller Zelllinien außer BT8Ca (sehr schwaches Signal) eine
deutliche spezifische Bande (ca. 370 bp) detektiert (Abbildung 4C). Mit dem
Primerpaar rCD9-A-F2/rCD9-A-R1 aus dem 3’-Bereich der CD9-Sequenz führte
die RT-PCR bei allen Zelllinien, inklusive BT8Ca, zu einer intensiven Bande von
420 bp (Abbildung 4D). Diese ersten Untersuchungen zeigten, dass der die
aminoterminale Region von CD9 kodierende Sequenzbereich in Transkripten der
Zelllinie BT8Ca gegenüber der bekannten Sequenz verändert ist, was eine
genauere
Charakterisierung
des
5’-cDNA-Endes
mit
der
RACE-Methode
nahelegte.
47
ERGEBNISSE
Abbildung 4:
Analyse
von
Produkten
der
Reverse
Transkription/Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR-
Produkten) durch Agarose-Gelelektrophorese. Eingesetzt wurde RNA aus den Zelllinien BT4Ca,
BT8Ca, BT12Ca und BT13Ca mit verschiedenen Primerkombinationen.
A:
rCD9-A-FNC/rCD9-A-RNC; Amplifikation der gesamten bekannten Sequenz.
B:
rCD9-A-FNC/rCD9-A-R2; Amplifikation des vorderen Bereichs der bekannten Sequenz.
C:
rCD9-A-F1/rCD9-A-R2; Amplifikation des vorderen Bereichs der kodierenden Sequenz.
D:
rCD9-A-F2/rCD9-A-R1; Amplifikation des hinteren Bereichs der kodierenden Sequenz.
Neben den RT-PCR-Produkten wurden ein Längenstandard (M) und ein Kontrollansatz (-K) ohne
zur RNA komplementäre DNA (cDNA) aufgetragen.
48
ERGEBNISSE
3.1.3
Identifizierung der neuen Spleißvarianten rCD9 mRNA-B
und rCD9 mRNA-C durch RACE
Den Hinweisen auf Variabilität am 5’-Ende der rCD9-mRNA folgend, wurde
ausgehend von isolierter mRNA der Rattenzelllinien dieser Bereich mit Hilfe der
RACE-Methode („Rapid Amplification of cDNA-Ends“) spezifisch amplifiziert. Die
Analyse der mit weiter innen liegenden Primern (Tabelle 7) reamplifizierten
primären PCR-Produkte zeigte für die Rattenzelllinien BT4Ca und BT12Ca eine
Doppelbande bei 500 bp, während mRNA der Zelllinie BT8Ca eine deutlich
schneller migrierende Doppelbande ergab (keine Abbildung). Die erhaltenen
5’-cDNA-Stücke wurden nach Klonierung sequenziert und die DNA-Sequenzen mit
der
CD9-Referenzsequenz
verglichen
(Abbildung
3),
wodurch
zwei
von
BT8Ca-Zellen exprimierte bisher noch unbekannte Spleißvarianten des CD9
(rCD9 mRNA-B und rCD9 mRNA-C) der Ratte gefunden werden konnten. Die
mRNA-Sequenzen
dieser
Varianten
unterscheiden
sich
nur
in
ihren
aminoterminalen Regionen, die in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt sind.
Während Variante B ein alternatives, 65 bp großes Exon 1 enthält, das 18,6 kb vor
dem bekannten Exon 1 im Genom lokalisiert wurde (Abbildungen 5 und 7), liegt
bei Variante C ein um 112 bp verlängertes Exon 2 als Beginn des Transkripts vor
(Abbildungen 6 und 7). Die nach Klonieren der entsprechenden PCR-Produkte
ermittelten Sequenzen der neuen Spleißvarianten zeigten ansonsten eine
komplette Übereinstimmung mit der rCD9 mRNA-A-Sequenz. Die alternative
Sequenz in der rCD9-Variante B enthält kein Standard-Translationinitiationscodon
ATG (bzw. AUG), wogegen das verlängerte Exon 2 der Variante C (Abbildung 6)
mit einem potentiellen ATG-Startcodon beginnt und ein durchgehendes Leseraster
aufweist, das ein hypothetisches Protein mit 238 Aminosäuren kodiert. Würde das
in Exon 3 an Position 332 noch zusätzlich vorhandene potentielle Startcodon der
rCD9 mRNA-A-Sequenz (Abbildung 3) zur Initiation der Translation genutzt
werden, könnte ausgehend von der Spleißvariante rCD9 mRNA-B ein um 67
Aminosäuren verkürztes CD9-Protein mit 159 Aminosäuren translatiert werden.
49
ERGEBNISSE
rCD9 mRNA-B
1
61
◄----------------------ALTERNATIVES EXON 1----------------------rCD9-B-F1
A Q I
C V L H
G E Q
Q E G
@ G S P
L P R
GCCCAGATCT GTGTCCTGCA CGGGGAGCAG CAGGAAGGGT AGGGCAGCCC CCTCCCCAGG
CGGGTCTAGA CACAGGACGT GCCCCTCGTC GTCCTTCCCA TCCCGTCGGG GGAGGGGTCC
----►◄------------------------EXON 2----------------------------E Q L
A G I A
V L A
I G L
W L R F
D S Q
GAACAGCTCG CCGGCATCGC AGTGCTTGCC ATTGGACTAT GGCTGCGGTT CGACTCTCAG
CTTGTCGAGC GGCCGTAGCG TCACGAACGG TAACCTGATA CCGACGCCAA GCTGAGAGTC
Abbildung 5:
5’-Ende der Sequenz des varianten Transkripts rCD9 mRNA-B. An Stelle des bereits bekannten
Exon 1 der rCD9 mRNA-A-Sequenz befindet sich ein alternatives Exon 1 ohne potentielles
Translationinitiationscodon ATG. An Position 40-42 der mRNA-Sequenz befindet sich ein
Stopp-Codon der Translation (@). Das zum Nachweis verwendete Oligonukleotid rCD9-B-F1 ist
grau unterlegt.
rCD9 mRNA-C
1
1
◄----------------------VERLÄNGERTES EXON 2----------------------rCD9-C-F1
M M P
K S F
V S L L
G G V
C G V
GGCTGAACGA AATGATGCCG AAGTCCTTTG TGAGTCTCCT CGGGGGCGTT TGTGGAGTTT
CCGACTTGCT TTACTACGGC TTCAGGAAAC ACTCAGAGGA GCCCCCGCAA ACACCTCAAA
17
61
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 2--------------►◄------C Y P Q
R S E
L T A
V N A L
C L W
Q L A
GCTATCCCCA GCGGTCAGAA CTAACTGCGG TCAATGCGTT GTGTCTCTGG CAGCTCGCCG
CGATAGGGGT CGCCAGTCTT GATTGACGCC AGTTACGCAA CACAGAGACC GTCGAGCGGC
37
121
------------------------------EXON 2----------------------------G I A V
L A I
G L W
L R F D
S Q T
K S I
GCATCGCAGT GCTTGCCATT GGACTATGGC TGCGGTTCGA CTCTCAGACC AAGAGCATCT
CGTAGCGTCA CGAACGGTAA CCTGATACCG ACGCCAAGCT GAGAGTCTGG TTCTCGTAGA
Abbildung 6:
5’-Ende der mRNA-Sequenz des varianten Transkripts rCD9 mRNA-C. Diese Variante besitzt nicht
Exon 1 der bekannten rCD9 mRNA-A-Sequenz. Stattdessen findet sich ein verlängertes Exon 2,
welches ein potentielles Translationinitiationscodon ATG (kodierend für Methionin (M)) enthält. Das
damit beginnende durchgängige Leseraster wurde durch Fettdruck hervorgehoben. Das zum
Nachweis verwendete Oligonukleotid rCD9-C-F1 ist grau unterlegt.
50
ERGEBNISSE
Abbildung 7:
Lage der ersten vier Exone der verschiedenen rCD9-Varianten im Rattengenom. Die Variante
rCD9 mRNA-B enthält anstatt des bekannten Exon 1 der rCD9 mRNA-A-Sequenz ein alternatives
Exon 1 (blau), welches im Genom 18 618 bp vor diesem liegt. Variante rCD9 mRNA-C enthält ein
verlängertes Exon 2 (rot) mit einem potentiellen Translationinitiationscodon. Schraffiert sind die für
mögliche CD9-Proteine kodierenden, mit einem ATG-Startcodon beginnenden durchgängigen
Leseraster. Dargestellt ist ein Abschnitt des Genoms von 50 Kilobasenpaaren.
3.1.4
Vergleich der Expression der verschiedenen rCD9-mRNAs in
malignen neuralen Rattenzelllinien
Um zu untersuchen, welche der neu identifizierten Spleißvarianten in den
verschiedenen Rattenzelllinien neuralen Ursprungs exprimiert werden und ob
dennoch das bereits bekannte Transkript (mRNA-A) vorhanden ist, wurden die
Varianten mittels RT-PCR in der isolierten RNA nachgewiesen. Dabei wurden
verschiedene
Reversprimer
aus
dem
3’-Bereich
der
bekannten
rCD9 mRNA-A-Sequenz (rCD9-A-R1, -R2, -R3, -R5) in Kombination mit für die
jeweiligen Spleißvarianten spezifischen Vorwärtsprimern (rCD9-B-F1 und -F2 aus
dem alternativen Exon 1; rCD9-C-F1, -F2, -F3 aus dem verlängerten Exon 2;
rCD9-A-F1, -F2, -F3, -F4, -FNC aus dem normalen Exon 1) verwendet (Tabelle 7
und Abbildungen 3, 5 und 6). Die semiquantitative Analyse der RT-PCR-Produkte
nach
Agarose-Gelelektrophorese
zum
Vergleich
der
bereits
bekannten
51
ERGEBNISSE
CD9 mRNA-A mit den Varianten -B und -C wurde in Abbildung 8 exemplarisch für
eine
Primerkombination
dargestellt.
Die
alle
Primerkombinationen
berücksichtigenden Ergebnisse der RT-PCR-Analysen wurden in einer Übersicht
zusammengefasst (Tabelle 22). Es zeigte sich, dass die Zelllinien BT4Ca, BT12Ca
und BT13Ca deutliche Mengen des CD9-Transkripts mRNA-A exprimieren, dieses
in der Zelllinie BT8Ca jedoch kaum gebildet wird (Abbildungen 8A, 8B und Tabelle
22). Das für die Spleißvariante rCD9 mRNA-B spezifische RT-PCR-Produkt
konnte ausgehend von RNA der Zelllinien BT4Ca, BT8Ca und BT12Ca (geringere
Menge) nachgewiesen werden, allerdings nicht mit RNA aus BT13Ca-Zellen
(Abbildung 8A und Tabelle 22). Dagegen zeigte sich, dass in allen vier neuralen
Rattenzelllinien
die
Spleißvariante
rCD9
mRNA-C
vorkommt
mit
etwas
schwächerer Expression bei der Zelllinie BT8Ca (Abbildung 8B und Tabelle 22).
Abbildung 8:
mRNA-Expression der neu identifizierten rCD9 Spleißvarianten-B (Abbildung 8A) und -C
(Abbildung 8B) in neuralen Rattenzelllinien jeweils im Vergleich zu rCD9 mRNA-A. Dargestellt ist
die Analyse von Produkten der Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCRProdukten) ausgehend von der RNA der Zelllinien BT4Ca, BT8Ca, BT12Ca und BT13Ca durch
Agarose-Gelelektrophorese.
(rCD9
mRNA-A),
Verwendet
wurden
rCD9-B-F1/rCD9-A-R1
(rCD9
die
Primerpaare
mRNA-B)
und
rCD9-A-F1/rCD9-A-R1
rCD9-C-F1/rCD9-A-R1
(rCD9-mRNA-C). M: DNA-Größenstandard.
52
ERGEBNISSE
Tabelle 22:
mRNA-Expression der Spleißvarianten rCD9-A, rCD9-B und rCD9-C verschiedener neuraler
Rattenzelllinien. Es wurden für jede Variante Analysen durch Reverse Transkription/PolymeraseKettenreaktion (RT-PCR) mit verschiedenen variantenspezifischen Vorwärtsprimern (rCD9-A-F1,
-F2, -F3, -F3, -F4; rCD9-B-F1, -F2, -F3) in Kombination mit mehreren Reversprimern (rCD9-A-R1,
-R2, -R3 oder -R5) durchgeführt. Die Mengen der Produkte der Polymerase-Kettenreaktion wurden
nach der Agarose-Gelelektrophorese visuell bewertet:
+++: sehr starke Expression; ++: starke Expression; +: deutliche Expression; (+): schwache
Expression; ((+)): sehr schwache bis keine Expression
rCD9 mRNA-A
rCD9 mRNA-B
rCD9 mRNA-C
BT4 Ca
+++
+++
+++
BT8 Ca
((+))
++
+
BT12 Ca
+++
(+)
++
BT13 Ca
+++
negativ
++
3.1.5
Expression von Fusionsproteinen mit C-terminalem EGFP der
rCD9-Spleißvarianten in BT4Ca-Zellen
Um durch Expression von EGFP-Fusionsproteinen zu untersuchen, ob die
Transkripte der beiden Spleißvarianten rCD9-B und rCD9-C translatiert werden
können, wurden mit dem „InFusion“-Kloniersystem (siehe 2.2.8.2) zunächst die für
diese Proteine kodierenden Sequenzen sowohl mit als auch ohne terminalem
Stopp-Codon in den Plasmidvektor pDNR-Dual kloniert. Aus den so entstandenen
Donorplasmiden wurden die für rCD9 mRNA-B/-C kodierenden Sequenzen durch
eine
„Cre“-Rekombinase-vermittelte
Reaktion
in
den
Akzeptorvektor
pLPS-3’-EGFP, welcher die Expression von Fusionsproteinen mit C-terminalem
EGFP
ermöglicht,
umkloniert.
prCD9-B-Stopp-EGFP
und
Daraus
resultierten
prCD9-C-Stopp-EGFP
die
Plasmidkonstrukte
(Kontrollplasmide
mit
Stopp-Codon zwischen CD9- und EGFP-Sequenzen) sowie prCD9-B-EGFP und
prCD9-C-EGFP mit durchgängigem Leseraster (Abbildungen 9C und 9D). Diese
Plasmide wurden, neben den Vektoren pLP-5’-EGFP-C1 (Positivkontrolle,
53
ERGEBNISSE
Abbildung 9A) und pLPS-3’-EGFP (Negativkontrolle, Abbildung 9B), in die
Rattenzelllinie BT4Ca transfiziert. Der Vektor pLP-5’-EGFP-C1 dient zur
Expression von Fusionsproteinen mit N-terminalem EGFP und besitzt daher ein
Translationinitiationscodon
ATG
für
EGFP,
wogegen
der
Akzeptorvektor
pLPS-3’-EGFP kein Startcodon für eine effiziente EGFP-Translation enthält. Um
ein Fusionsprotein mit C-terminalem EGFP zu erhalten, muss die eingefügte
kodierende Sequenz einen funktionellen Translationsstart mitbringen (Abbildung
9D). Dies erschien für die Variante rCD9-B (ohne ATG im alternativen Exon 1) im
Gegensatz
zu
unwahrscheinlich.
Variante
rCD9-C
Enthält
(mit
diese
ATG
kodierende
im
verlängerten
Sequenz
Exon
zusätzlich
2)
ein
terminierendes Stopp-Codon, kann sie zwar translatiert werden, nicht jedoch die
für das EGFP (Abbildung 9C).
Abbildung 9: Siehe Seite 55.
3.1.5.1
Nachweis der exprimierten Fusionsproteine durch
Fluoreszenzmikroskopie
Die nach Transfektion mit den hergestellten Konstrukten zwei bis drei Tage
kultivierten BT4Ca-Zellen wurden auf EGFP-Fluoreszenz hin mikroskopisch
untersucht. Transfektion der BT4Ca-Zellen mit dem Kontroll-Akzeptorvektor
pLP-5’-EGFP-C1 zeigte eine Transfektionseffizienz von etwa 40% (Abbildung
10A), während in Zellen mit pLPS-3’-EGFP-Plasmid keine EGFP-Fluoreszenz
nachgewiesen werden konnte (Abbildung 10B). Nach Transfektion mit einem
Plasmid zur Expression eines Fusionsproteins aus der Variante rCD9-C und
EGFP wurden ca. 30% fluoreszierende Zellen detektiert (Abbildung 10C),
wogegen nach Transfektion mit dem Kontrollplasmid, bei dem die Sequenzen für
rCD9-C und EGFP durch ein Stopp-Codon getrennt waren, kein Signal sichtbar
war (Abbildung 10D). Transfektion mit entsprechenden Plasmidkonstrukten (mit
und ohne Stopp-Codon) zur Untersuchung der Spleißvariante rCD9-B führte in
keinem Fall zu einem EGFP-Fluoreszenzsignal der Zellen (keine Abbildung).
Abbildung 10: Siehe Seite 56.
54
ERGEBNISSE
Abbildung 9:
Schematische Darstellung der relevanten Ausschnitte der hergestellten Plasmidkonstrukte.
A:
Akzeptorvektor pLP-5’-EGFP-C1 mit Translationinitiationscodon ATG in der für das
verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) kodierenden Sequenz.
B:
Akzeptorvektor pLPS-3’-EGFP ohne ATG-Startcodon.
C:
Konstrukt mit Stopp-Codon am Ende der insertierten Sequenz, erlaubt Expression einer
Variante, die einen Translationsstart mitbringt (wie z.B. ATG in der rCD9-Sequenz),
allerdings ohne fusioniertes EGFP.
D:
Konstrukt zur Expression eines fluoreszierenden C-terminalen EGFP-Fusionsproteins, für
die ein funktionelles Startcodon in der insertierten Sequenz erforderlich ist.
55
ERGEBNISSE
Abbildung 10:
Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis eines Fusionsproteins aus rCD9-C und dem verstärkt grün
fluoreszierenden Protein (EGFP) nach Transfektion von BT4Ca-Zellen.
A:
Zellen nach Transfektion mit pLP-5’-EGFP-C1 als Positivkontrolle.
B:
Zellen nach Transfektion mit pLPS-3’-EGFP als Negativkontrolle.
C:
Zellen nach Transfektion mit prCD9-C-EGFP, das für ein Fusionsprotein mit C-terminalem
EGFP kodiert.
D:
Zellen nach Kontrolltransfektion mit prCD9-C-Stopp-EGFP, bei dem das Leseraster durch
ein Stopp-Codon unterbrochen ist.
Leuchtend grüne Fluoreszenz zeigt die Expression von EGFP bzw. eines EGFP-Fusionsproteins
durch die in 100-facher Vergrößerung dargestellten Zellen.
56
ERGEBNISSE
3.1.5.2
Analyse der exprimierten Fusionsproteine durch Western Blot
mit einem anti-EGFP-Antikörper
Da durch EGFP-Fluoreszenz nur für eine der beiden neu identifizierten
rCD9-Varianten eine effiziente Translation nachgewiesen werden konnte, wurden
nach Transfektion mit den Expressionskonstrukten n-Octylglucosid-Solubilisate
der Zellen hergestellt und durch Western Blot analysiert. Nur in Lysaten von
BT4Ca-Zellen, die mit prCD9-C-EGFP transfiziert worden waren, konnte ein den
anti-EGFP-Antikörper bindendes Protein der für das rCD9-C-EGFP-Fusionsprotein
erwarteten Größe (Bande bei ca. 43 kDa) nachgewiesen werden (siehe Abbildung
11A). Das Fehlen einer auf Expression eines Fusionsproteins rCD9-B-EGFP
hindeutenden
Bande
nach
Transfektion
eines
entsprechenden
Plasmids
bestätigte, dass diese Variante ohne ATG nicht effizient translatiert werden kann.
Abbildung 11:
Western Blot-Nachweis des in BT4Ca-Zellen exprimierten Fusionsproteins aus rCD9-C und dem
verstärkt grün fluoreszierenden Protein (EGFP) mit einem anti-EGFP-Antikörper. N-OctylglucosidSolubilisate wurden nach Transfektion der Rattenzelllinie BT4Ca mit den verschiedenen
Expressionskonstrukten durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
analysiert.
A:
Darstellung der an einen anti-EGFP-Antikörper bindenden Proteine.
B:
Kontroll-Blot, der statt mit dem anti-EGFP-Antikörper mit einem Kontrollantikörper
gleichen Typs inkubiert worden war.
Spur 1:
Transfektion mit dem Kontroll-Akzeptorvektor pLP-5’-EGFP-C1.
Spur 2:
Transfektion mit dem Kontroll-Akzeptorvektor pLPS-3’-EGFP.
Spur 3:
Transfektion mit prCD9-C-Stopp-EGFP.
Spur 4:
Transfektion mit prCD9-C-EGFP.
M:
Proteinmarker mit farbstoffmarkierten Proteinen definierter Größe.
Neben unspezifischen Signalen bei ca. 55 kDa trat eine spezifische Bande bei der für das
rCD9-C-EGFP-Fusionsprotein erwarteten Größe (etwa 43 kDa) nur in Spur 4 (Pfeil) auf, nicht aber
in denen der drei Kontroll-Transfektionen.
57
ERGEBNISSE
3.1.6
Gewebespezifische Expression der Transkripte der
Spleißvarianten rCD9-A, rCD9-B, rCD9-C
Um zu klären, in welchen Geweben die in Zelllinien neu identifizierten
Spleißvarianten rCD9-B und -C vorkommen, wurde mRNA aus verschiedenen
Organen der Sprague-Dawley-Ratte (Gehirn, Leber, Lunge, Mamma, Niere und
Plazenta) mit RT-PCR untersucht. Dabei wurden für diese neuen Varianten und
für
rCD9-A
spezifische
Primer
(rCD9-A-F1,
rCD9-B-F1,
rCD9-C-F2)
in
Kombination mit Reversprimern aus der mRNA-A-Sequenz (rCD9-A-R1, -R2, -R3,
-R5: siehe Tabelle 7) eingesetzt. Die bereits bekannte Variante rCD9-A konnte in
allen untersuchten Organen nachgewiesen werden. Dagegen führte keine
Primerkombination auch nur bei einem Gewebe zu einem für die Spleißvariante
rCD9-B spezifischen Signal. In allen untersuchten Rattenorganen konnte
allerdings die möglicherweise funktionell relevante Spleißvariante rCD9-C
nachgewiesen werden.
3.1.7
Modellrechnungen zur Vorhersage der Transmembrantopologie
der Spleißvariante rCD9-C im Vergleich zu rCD9-A
Zur Vorhersage der Transmembrantopologie der neu identifizierten und in vielen
Geweben (zumindest als mRNA) nachgewiesenen Spleißvariante rCD9-C wurde
mit Hilfe des „Dense Alignment Surface“ (DAS)-Algorithmus“ (Cserzö et al. 1997;
siehe 2.3.5) eine Modellrechnung durchgeführt, bei der insbesondere die
Ähnlichkeit mit bereits bekannten Transmembrandomänen bewertet wurde.
Abbildung 12 zeigt die sich daraus ergebene potentielle Transmembrantopologie
von rCD9-C im Vergleich mit dem Ergebnis für die bekannte Variante rCD9-A. Die
in Abbildung 12A dargestellte Anordnung der vier Transmembrandomänen und die
daraus abgeleitete Topologie des Proteins rCD9-A ist typisch für Tetraspanine,
deren N- und C-Termini in den intrazellulären Raum der Zelle ragen. Die Analyse
der Aminosäurensequenz der neu identifizierten Spleißvariante rCD9-C zeigt
neben den bereits bekannten vier Membrandomänen eine fünfte stark hydrophobe
Domäne, die wahrscheinlich ebenfalls in die Plasmamembran integriert vorliegt.
Das N-terminale Ende des Proteins würde in diesem Fall in den extrazellulären
Bereich ragen (Abbildung 12B). Da die Spleißvariante rCD9-B ein alternatives
58
ERGEBNISSE
Exon 1 ohne Translationinitiationscodon enthält, würde diese bei Beginn der
Translation mit Startcodon ATG332 in Exon 3 (Abbildung 3) eine verkürzte CD9Variante mit nur noch zwei Transmembrandomänen darstellen (keine Abbildung).
„DAS“ - Wert
rCD9-A
1
2
3
4
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
A
Extrazellulärraum
„DAS“ - Wert
rCD9-C
1
2
3
4
5
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
B
Extrazellulärraum
Abbildung 12:
Berechnete Transmembrantopologien von rCD9-A (Teilabbildung A) und der neu identifizierten
Spleißvariante rCD9-C (Teilabbildung B). Jeweils im oberen Bild sind für die Positionen der
59
ERGEBNISSE
Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment Surface“ (DAS)-Werte dargestellt, die ein
Maß für die Ähnlichkeit mit bekannten Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung
zwischen Transmembran- und Nicht-Transmembranbregionen relevante Grenzbereich wird von
einer gestrichelten und einer durchgezogenen Linie begrenzt. In Abbildung 12A zeigt sich die
Variante rCD9-A als ein integrales Membranprotein mit vier Transmembrandomänen und beiden
Enden im intrazellulären Bereich. Die Spleißvariante rCD9-C enthält jedoch neben denselben vier
Transmembranhelices der Variante rCD9-A eine fünfte wahrscheinliche Membrandomäne
(Nummer 1 in Teil B der Abbildung), wodurch sich ein in den extrazellulären Raum ragendes
N-terminales Ende des Proteins ergibt.
3.2
Identifizierung alternativer Transkripte des
menschlichen CD9
3.2.1
EST-Sequenzen des menschlichen CD9
Um nach Identifizierung neuer CD9-Spleißvarianten bei der Ratte zu untersuchen,
ob solche oder ähnliche Varianten auch beim Menschen vorkommen, wurde
zunächst in der „Expressed Sequence Tags“ (EST)-Datenbank des „National
Center for Biotechnology Information“ (NCBI) nach entsprechenden Sequenzen
des CD9 gesucht. ESTs sind transkribierte Nukleotidsequenzen die gewöhnlich
durch Sequenzierung der Klone einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, um alle
exprimierten Gene eines Zelltyps zu erfassen. Von den gefundenen acht
EST-Klonen entsprachen zwei (2a/b = PT-1; 7a = PT-3) Sequenzen, die im
Schimpansen (Pan troglodytes) exprimiert werden. Eine dritte CD9-Variante des
Schimpansen (PT-2) wurde als weitere Kandidatensequenz in die Untersuchung
einbezogen (Abbildung 13). Als Referenzsequenz diente die bereits bekannte für
CD9 des Menschen (huCD9) kodierende mRNA.
60
ERGEBNISSE
Abbildung 13:
„Expressed Sequence Tags“ (EST)-Sequenzen mit Homologie zu der bereits bekannten huCD9
mRNA-Sequenz (Variante 1) und zusätzlichen alternativen oder verlängerten Exons. Die
Unterschiede zu huCD9 (Variante 1) sind rot hervorgehoben; die für ein Protein kodierenden
Bereiche wurden grau unterlegt. Hinter den Variantenbezeichnungen sind die Zugangsnummern
des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI) angegeben. Zusätzlich ist die beim
Schimpansen vorkommende Variante PT-2 dargestellt, obwohl ein entsprechender EST-Klon nicht
in der Datenbank enthalten war.
61
ERGEBNISSE
3.2.2
Expression von CD9-Spleißvarianten in verschiedenen
menschlichen Geweben
Die gefundenen EST-Sequenzen und die beim Schimpansen vorkommenden
Varianten wurden als mögliche CD9-Spleißvarianten betrachtet und ihre
Expression in menschlichen Geweben mittels RT-PCR untersucht. Für jede dieser
Sequenzen wurden dazu mehrere variantenspezifische Vorwärtsprimer in
Kombination
mit
Reversprimern
aus
dem
3’-Bereich
der
bekannten
CD9-Sequenz eingesetzt. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 23
zusammenfassend dargestellt.
Tabelle 23:
Expression von CD9-Spleißvarianten in verschiedenen menschlichen Geweben bzw. Zelllinien
analysiert durch die Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Untersuchte
Gewebe
und
Zelllinien:
Adultes
und
fötales
Gehirn,
Plazenta,
Hinterstrangganglion,
Glioblastomzelllinie U-373 MG, Uterus, Ovar, Mamma und Mammakarzinom- und Ovarialkarzinomzelllinien (Mamma Ca, Ovarial Ca).
In der linken Spalte sind die getesteten Varianten und die verwendeten Primerkombinationen
aufgelistet.
In
Kontrollreaktionen
wurde
die
Sequenz
der
Glyzerinaldehyd-3-phosphat-
dehydrogenase (GAPDH) und die CD9-Referenzsequenz nachgewiesen. Dargestellt sind die
Intensitäten der Banden der spezifischen RT-PCR-Produkten nach Agarose-Gelelektrophorese:
++: starke Expression; +: deutliche Expression; (+): schwache Expression; ((+)): sehr schwache bis
keine Expression
Ein Teil der erhaltenen RT-PCR-Produkte wurden hinsichtlich der tatsächlichen Übereinstimmung
mit den entsprechenden „Expressed Sequence Tags“ (EST)-Sequenzen durch Sequenzierung
überprüft. Die so verifizierten Produkte sind grün unterlegt. Manche Primerkombinationen mit
Vorwärtsprimern aus dem normalen Exon 1 führten nur zu Artefakten; solche durch Sequenzierung
nicht verifizierten Produkte sind grau schraffiert.
62
adultes
Gehirn
fötales
Gehirn
Plazenta
U-373 MG
Hinterstrangganglion
Uterus
Ovar
normal
Ovarial Ca
(Pool)
Mamma
normal
Mamma Ca
(Pool)
ERGEBNISSE
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
huCD9 VARIANTE 2
(Exon 3.5)
MV Ex3.5-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Ex3.5-F2 - huCD9-Ex6-R
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex3.5-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex3.5-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex3.5-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex3.5-R2
++
++
(+)
++
++
++
(+)
++
(+)
(+)
(+)
(+)
+
+
++
++
++
++
+
++
+
+
++
+
++
++
+
++
(+)
+
-
+
++
(+)
+
huCD9 VARIANTE PT2
(Exon 1.5)
MV Ex1.5-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Ex1.5-F2 - huCD9-Ex6-R
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex1.5-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex1.5-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex1.5-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex1.5-R2
++
+
-
+
-
+
-
++
+
-
++
+
-
+
-
++
+
-
++
+
-
+
-
+
+
-
huCD9 VARIANTE 4a
(1.5XX)
MV Ex1.5XX-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Ex1.5XX-F2 - huCD9-Ex6-R
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex1.5XX-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex1.5XX-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex1.5XX-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex1.5XX-R2
++
++
+
++
-
++
+
+
++
-
+
++
-
++
++
++
-
+
+
++
+
-
+
+
+
++
(+)
-
+
(+)
(+)
++
-
++
+
-
++
-
(+)
++
-
huCD9 VARIANTE 4b
(plus 6)
MV Ex6plus-F1 - huCD9-Ex7-R
MV Ex6plus-F2 - huCD9-Ex7-R
huCD9-Ex2-F - MV Ex6plus-R1
huCD9-Ex2-F - MV Ex6plus-R2
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex6plus-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex6plus-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex6plus-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex6plus-R2
+
+
+
+
+
++
+
(+)
(+)
+
(+)
(+)
+
(+)
-
+
+
+
+
+
+
(+)
(+)
(+)
(+)
+
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
((+))
(+)
(+)
(+)
+
+
+
+
(+)
(+)
(+)
+
+
+
+
(+)
-
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
++
(+)
+
+
((+))
(+)
+
+
+
-
+
-
(+)
(+)
(+)
+
+
+
+
+
+
+
((+))
+
-
(+)
(+)
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
(+)
++
((+))
+
-
(+)
+
(+)
+
(+)
+
(+)
+
(+)
+
-
(+)
+
GAPDH (Kontrollsequenz)
huGAPDH-F – huGAPDH-R
CD9 (Referenzsequenz)
huCD9-Ex1-F1 - huCD9-Ex6-R
huCD9 VARIANTE 5
(Ex 2.5)
MV Ex2.5-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Ex2.5-F2 - huCD9-Ex6-R
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex2.5-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex2.5-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex2.5-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex2.5-R2
huCD9 VARIANTE 7b/7c
(plus 3)
MV Ex3plus-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Ex3plus-F2 - huCD9-Ex6-R
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex3plus-R1
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex3plus-R1
huCD9-Ex1-F1 - MV Ex3plus-R2
huCD9-Ex1-F2 - MV Ex3plus-R2
63
ERGEBNISSE
huCD9 VARIANTE 3
(Exon1 kürzer + Exon -1)
MV Exmin1-F3 - huCD9-Ex6-R
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
huCD9 VARIANTE 6
(ohne Exon 1 + Exon -1)
MV Exmin1-F2 - huCD9-Ex6-R
MV Exmin1-F3 - huCD9-Ex6-R
+
+
+
+
+
-
+
-
++
++
++
++
++
++
++
++
-
((+))
-
+
(+)
+
-
(+)
-
(+)
(+)
++
(+)
++
-
++
(+)
++
(+)
-
(+)
-
huCD9 VARIANTE 7a
(Exon 1 etwas kürzer + Exon -1)
MV Exmin1-F1 - huCD9-Ex6-R
MV Exmin1-F2 - huCD9-Ex6-R
3.2.3
Bestätigung der Authentizität der nachgewiesenen
huCD9-Transkripte
Da alle durch RT-PCR nachgewiesenen huCD9-Transkripte im adulten Gehirn des
Menschen sehr stark exprimiert werden, wurden die ausgehend von dieser cDNA
gewonnenen PCR-Produkte zur Verifizierung durch Sequenzierung in einen
Plasmidvektor kloniert. Für die Analyse der Sequenzen der verschiedenen
menschlichen CD9-Spleißvarianten diente als Referenz die bereits bekannte
CD9-mRNA (Abbildung 14).
huCD9-mRNA, Variante 1 (Hauptform)
1
1
61
4
121
◄-----------------------------EXON 1----------------------------GACCAGCCTA CAGCCGCCTG CATCTGTATC CAGCGCCAGG TCCCGCCAGT CCCAGCTGCG
CTGGTCGGAT GTCGGCGGAC GTAGACATAG GTCGCGGTCC AGGGCGGTCA GGGTCGACGC
------------------------------EXON 1----------------------------huCD9-Ex1-F1
M P V
CGCGCCCCCC AGTCCCGCAC CCGTTCGGCC CAGGCTAAGT TAGCCCTCAC CATGCCGGTC
GCGCGGGGGG TCAGGGCGTG GGCAAGCCGG GTCCGATTCA ATCGGGAGTG GTACGGCCAG
------------------------------EXON 1-------------------------►◄-huCD9-Ex1-F2
K G G
T K C I
K Y L
L F G
F N F I
F W L
AAAGGAGGCA CCAAGTGCAT CAAATACCTG CTGTTCGGAT TTAACTTCAT CTTCTGGCTT
TTTCCTCCGT GGTTCACGTA GTTTATGGAC GACAAGCCTA AATTGAAGTA GAAGACCGAA
24
181
------------------------------EXON 2----------------------------A G I
A V L A
I G L
W L R
F D S Q
T K S
GCCGGGATTG CTGTCCTTGC CATTGGACTA TGGCTCCGAT TCGACTCTCA GACCAAGAGC
CGGCCCTAAC GACAGGAACG GTAACCTGAT ACCGAGGCTA AGCTGAGAGT CTGGTTCTCG
44
241
------------------------------EXON 2-------------►◄-------------I F E
Q E T N
N N N
S S F
Y T G V
Y I L
ATCTTCGAGC AAGAAACTAA TAATAATAAT TCCAGCTTCT ACACAGGAGT CTATATTCTG
TAGAAGCTCG TTCTTTGATT ATTATTATTA AGGTCGAAGA TGTGTCCTCA GATATAAGAC
64
ERGEBNISSE
64
301
------------------------------EXON 3----------------------------I G A
G A L M
M L V
G F L
G C C G
A V Q
ATCGGAGCCG GCGCCCTCAT GATGCTGGTG GGCTTCCTGG GCTGCTGCGG GGCTGTGCAG
TAGCCTCGGC CGCGGGAGTA CTACGACCAC CCGAAGGACC CGACGACGCC CCGACACGTC
84
361
-------------------------►◄----------------EXON 4---------------E S Q
C M L G
L F F
G F L
L V I F
A I E
GAGTCCCAGT GCATGCTGGG ACTGTTCTTC GGCTTCCTCT TGGTGATATT CGCCATTGAA
CTCAGGGTCA CGTACGACCC TGACAAGAAG CCGAAGGAGA ACCACTATAA GCGGTAACTT
104
421
------------------EXON 4-----------------►◄--------EXON 5-------I A A
A I W G
Y S H
K D E
V I K E
V Q E
ATAGCTGCGG CCATCTGGGG ATATTCCCAC AAGGATGAGG TGATTAAGGA AGTCCAGGAG
TATCGACGCC GGTAGACCCC TATAAGGGTG TTCCTACTCC ACTAATTCCT TCAGGTCCTC
124
481
------------------------------EXON 5----------------------------F Y K
D T Y N
K L K
T K D
E P Q R
E T L
TTTTACAAGG ACACCTACAA CAAGCTGAAA ACCAAGGATG AGCCCCAGCG GGAAACGCTG
AAAATGTTCC TGTGGATGTT GTTCGACTTT TGGTTCCTAC TCGGGGTCGC CCTTTGCGAC
144
541
-----EXON 5-------►◄----------EXON 6----------------------------K A I
H Y A L
N C C
G L A
G G V E
Q F I
AAAGCCATCC ACTATGCGTT GAACTGCTGT GGTTTGGCTG GGGGCGTGGA ACAGTTTATC
TTTCGGTAGG TGATACGCAA CTTGACGACA CCAAACCGAC CCCCGCACCT TGTCAAATAG
164
601
184
661
------------------------------EXON 6---------------►◄-----------S D I
C P K K
D V L
E T F
T V K S
C P D
TCAGACATCT GCCCCAAGAA GGACGTACTC GAAACCTTCA CCGTGAAGTC CTGTCCTGAT
AGTCTGTAGA CGGGGTTCTT CCTGCATGAG CTTTGGAAGT GGCACTTCAG GACAGGACTA
huCD9-Ex6-R
------------------------------EXON 7----------------------------A I K
E V F D
N K F
H I I
G A V G
I G I
GCCATCAAAG AGGTCTTCGA CAATAAATTC CACATCATCG GCGCAGTGGG CATCGGCATT
CGGTAGTTTC TCCAGAAGCT GTTATTTAAG GTGTAGTAGC CGCGTCACCC GTAGCCGTAA
huCD9-Ex7-R
204
721
------------►◄----------------EXON 8----------------------------A V V
M I F G
M I F
S M I
L C C A
I R R
GCCGTGGTCA TGATATTTGG CATGATCTTC AGTATGATCT TGTGCTGTGC TATCCGCAGG
CGGCACCAGT ACTATAAACC GTACTAGAAG TCATACTAGA ACACGACACG ATAGGCGTCC
224
781
------------------------------EXON 8----------------------------N R E
M V @
AACCGCGAGA TGGTCTAGAG TCAGCTTACA TCCCTGAGCA GGAAAGTTTA CCCATGAAGA
TTGGCGCTCT ACCAGATCTC AGTCGAATGT AGGGACTCGT CCTTTCAAAT GGGTACTTCT
841
------------------------------EXON 8----------------------------TTGGTGGGAT TTTTTGTTTG TTTGTTTTGT TTTGTTTGTT GTTTGTTGTT TGTTTTTTTG
AACCACCCTA AAAAACAAAC AAACAAAACA AAACAAACAA CAAACAACAA ACAAAAAAAC
901
------------------------------EXON 8----------------------------CCACTAATTT TAGTATTCAT TCTGCATTGC TAGATAAAAG CTGAAGTTAC TTTATGTTTG
GGTGATTAAA ATCATAAGTA AGACGTAACG ATCTATTTTC GACTTCAATG AAATACAAAC
961
------------------------------EXON 8----------------------------TCTTTTAATG CTTCATTCAA TATTGACATT TGTAGTTGAG CGGGGGGTTT GGTTTGCTTT
AGAAAATTAC GAAGTAAGTT ATAACTGTAA ACATCAACTC GCCCCCCAAA CCAAACGAAA
65
ERGEBNISSE
------------------------------EXON 8----------------------------1021 GGTTTATATT TTTTCAGTTG TTTGTTTTTG CTTGTTATAT TAAGCAGAAA TCCTGCAATG
CCAAATATAA AAAAGTCAAC AAACAAAAAC GAACAATATA ATTCGTCTTT AGGACGTTAC
------------------------------EXON 8----------------------------1081 AAAGGTACTA TATTTGCTAG ACTCTAGACA AGATATTGTA CATAAAAGAA TTTTTTTGTC
TTTCCATGAT ATAAACGATC TGAGATCTGT TCTATAACAT GTATTTTCTT AAAAAAACAG
------------------------------EXON 8----------------------------1141 TTTAAATAGA TACAAATGTC TATCAACTTT AATCAAGTTG TAACTTATAT TGAAGACAAT
AAATTTATCT ATGTTTACAG ATAGTTGAAA TTAGTTCAAC ATTGAATATA ACTTCTGTTA
------------------------------EXON 8-------------►
1201 TTGATACATA ATAAAAAATT ATGACAATGT CAAAAAAAAA AAAAAA
AACTATGTAT TATTTTTTAA TACTGTTACA GTTTTTTTTT TTTTTT
Abbildung 14:
Referenzsequenz der huCD9-mRNA (Eintrag NM_001769 in der Datenbank des „National Center
for Biotechnology Information“ (NCBI)). Die für das CD9-Protein kodierenden Sequenz (CDS, 228
Aminosäuren) beginnend mit der Aminosäure Methionin (M) bis zum Ende der Translation (@) ist
durch Fettdruck hervorgehoben. Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau
unterlegt)
und
Namen
von
Oligonukleotiden,
die
als
Primer
in
der
Reverse
Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) eingesetzt wurden. Dunkelgrau markiert ist die
überlappende Sequenz der beiden verwendeten Vorwärtsprimer im Exon 1.
3.2.3.1
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 2
Die huCD9-Transkriptvariante 2 unterscheidet sich von der bekannten huCD9
mRNA-Sequenz durch einen Einschub von 69 Basenpaaren zwischen Exon 3 und
Exon 4 (Abbildung 15). Dabei handelt es sich um ein alternatives Exon 3.5, das im
CD9-Gen auf Chromosom 12 entsprechend zwischen Exon 3 und Exon 4
lokalisiert wurde. Das alternative Exon kodiert für 23 zusätzliche Aminosäuren
ohne das übliche Leseraster zu unterbrechen. Dadurch ergibt sich bei einer
Translation der mRNA ein verlängertes CD9-Protein mit 251 Aminosäuren. Eine
entsprechende
Variante
des Schimpansen
(Pan
troglodytes)
ist
in
der
NCBI-Datenbank enthalten, weshalb für sie auch die Bezeichnung PT-1
verwendet wird.
66
ERGEBNISSE
huCD9-mRNA, Variante 2 (PT-1)
64
301
------------------------------EXON 3----------------------------I G A
G A L M
M L V
G F L
G C C G
A V Q
ATCGGAGCCG GCGCCCTCAT GATGCTGGTG GGCTTCCTGG GCTGCTGCGG GGCTGTGCAG
TAGCCTCGGC CGCGGGAGTA CTACGACCAC CCGAAGGACC CGACGACGCC CCGACACGTC
84
361
----------EXON 3---------►◄--------ALTERNATIVES EXON 3.5--------MV Ex3.5-F1
E S Q
C M L G
L A T
K R T
M F P P
F L E
GAGTCCCAGT GCATGCTGGG ACTGGCAACT AAAAGGACTA TGTTTCCCCC TTTTCTCGAG
CTCAGGGTCA CGTACGACCC TGACCGTTGA TTTTCCTGAT ACAAAGGGGG AAAAGAGCTC
MV Ex3.5-R1
104
421
-------ALTERNATIVES EXON 3.5-------►◄-----------EXON 4----------MV Ex3.5-F2
D H V
C F F S
L N P
Q F F
G F L L
V I F
GACCACGTTT GCTTTTTTTC CCTGAATCCA CAGTTCTTCG GCTTCCTCTT GGTGATATTC
CTGGTGCAAA CGAAAAAAAG GGACTTAGGT GTCAAGAAGC CGAAGGAGAA CCACTATAAG
MV Ex3.5-R2
124
481
------------------------------EXON 4----------------------------A I E
I A A A
I W G
Y S H
K D E V
I K E
GCCATTGAAA TAGCTGCGGC CATCTGGGGA TATTCCCACA AGGATGAGGT GATTAAGGAA
CGGTAACTTT ATCGACGCCG GTAGACCCCT ATAAGGGTGT TCCTACTCCA CTAATTCCTT
Abbildung 15:
Ausschnitt der Sequenz der huCD9 mRNA-Sequenzvariante 2 (PT-1). Zwischen den beiden Exons
3 und 4 befindet sich ein alternatives Exon 3.5. Die durchgängige, für das veränderte CD9-Protein
kodierende Sequenz wurde fett gedruckt. Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen
(grau
unterlegt)
und
Namen
von
Oligonukleotiden,
die
als
Primer
in
der
Reverse
Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt
wurden. Dunkelgrau markiert ist die zwischen den Vorwärts- und Reversprimern überlappende
Sequenz.
3.2.3.2
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante PT-2
Die huCD9-Transkriptvariante PT-2 besitzt einen Einschub von 126 Basenpaaren
zwischen Exon 1 und Exon 2 der bereits bekannten huCD9 mRNA-Sequenz
(Abbildung 16). Dieses Exon 1.5 kodiert für 42 zusätzliche Aminosäuren im
gleichen Leseraster, durch die ein verlängertes CD9-Protein von 270 Aminosäuren
translatiert werden kann. Diese Variante wurde ebenfalls beim Schimpansen
beschrieben, wovon sich der Name PT-2 ableitet.
67
ERGEBNISSE
huCD9-mRNA, Variante PT-2
1
◄-----------------------------EXON 1----------------------------GACCAGCCTA CAGCCGCCTG CATCTGTATC CAGCGCCAGG TCCCGCCAGT CCCAGCTGCG
CTGGTCGGAT GTCGGCGGAC GTAGACATAG GTCGCGGTCC AGGGCGGTCA GGGTCGACGC
1
61
------------------------------EXON 1----------------------------M P V
CGCGCCCCCC AGTCCCGCAC CCGTTCGGCC CAGGCTAAGT TAGCCCTCAC CATGCCGGTC
GCGCGGGGGG TCAGGGCGTG GGCAAGCCGG GTCCGATTCA ATCGGGAGTG GTACGGCCAG
4
121
------------------------------EXON 1-------------------------►◄-K G G
T K C I
K Y L
L F G
F N F I
F W V
AAAGGAGGCA CCAAGTGCAT CAAATACCTG CTGTTCGGAT TTAACTTCAT CTTCTGGGTT
TTTCCTCCGT GGTTCACGTA GTTTATGGAC GACAAGCCTA AATTGAAGTA GAAGACCCAA
24
181
----------------------ALTERNATIVES EXON 1.5---------------------MV Ex1.5-F1
MV Ex1.5-F2
G V S
G T L F
G S T
T G L
F N Q S
L A E
GGGGTCAGCG GGACTTTATT TGGATCCACC ACAGGTCTTT TCAACCAAAG CCTTGCAGAA
CCCCAGTCGC CCTGAAATAA ACCTAGGTGG TGTCCAGAAA AGTTGGTTTC GGAACGTCTT
MV Ex1.5-R1
MV Ex1.5-R2
44
241
----------------------ALTERNATIVES EXON 1.5---------------------T G F
T P Y T
Q K S
N D F
L V K S
L K I
ACAGGCTTTA CCCCATACAC ACAGAAGAGC AACGACTTCC TTGTTAAGAG TCTGAAAATC
TGTCCGAAAT GGGGTATGTG TGTCTTCTCG TTGCTGAAGG AACAATTCTC AGACTTTTAG
64
301
--►◄--------------------------EXON 2----------------------------W L A
G I A V
L A I
G L W
L R F D
S Q T
TGGCTTGCCG GGATTGCTGT CCTTGCCATT GGACTATGGC TCCGATTCGA CTCTCAGACC
ACCGAACGGC CCTAACGACA GGAACGGTAA CCTGATACCG AGGCTAAGCT GAGAGTCTGG
Abbildung 16:
Ausschnitt der huCD9 mRNA-Sequenzvariante PT-2. Nach dem üblichen Exon 1 folgt ein
alternatives Exon 1.5 von 126 Basenpaaren, welches für 42 zusätzliche Aminosäuren kodiert. Die
Aminosäure Methionin (M) in Exon 1 wurde als Beginn der Translation grün markiert. Der
Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau unterlegt) und Namen von Oligonukleotiden,
die als Primer in der Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis
der Variante eingesetzt wurden. Der durchgängige kodierende Bereich ist durch Fettdruck
hervorgehoben.
3.2.3.3
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 4a
Klonierung und Sequenzierung der RT-PCR-Produkte der huCD9-Transkriptvariante 4a zeigten, dass zwei Subvarianten (4a-1 und 4a-2) vorkommen. Diese
enthalten anstelle des üblichen Exon 1 ein alternatives Exon 1.5XX, welches von
Exon 1.5 der Spleißvariante PT2 verschieden war (siehe 3.2.3.2). Im Leseraster
der
weiteren
CD9-Sequenz
ist
im
Exon
1.5XX
kein
ATG-Translation68
ERGEBNISSE
initiationscodon
vorhanden,
allerdings
mehrere
Stopp-Codons,
weshalb
ausgehend von diesem alternativen Exon eine Translation unwahrscheinlich
erscheint. Bei der Subvariante 4a-1 (Abbildung 17) folgt nach dem alternativen
Exon 1.5XX das übliche CD9-Exon 2 beginnend mit einem für Leucin kodierenden
Basentriplett
als
untypisches,
aber
mögliches
alternatives
Translation-
initiationscodon (Schwab et al. 2004, Touriol et al. 2003). Die Subvariante 4a-2
(Abbildung 18) besitzt, zusätzlich zu dem üblichen Exon 2, eine Verlängerung des
Exon 2, in der im CD9-Leseraster kein Translationsstart und mehrere
Stopp-Codons vorhanden sind.
huCD9-mRNA, Variante 4a-1
1
61
121
181
241
◄--------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------L Y H
L @ A H
V S V
@ L C
V H P #
T A @
CTTTATCATT TATAGGCACA TGTAAGCGTC TAGCTCTGTG TGCATCCCTA AACAGCATAG
GAAATAGTAA ATATCCGTGT ACATTCGCAG ATCGAGACAC ACGTAGGGAT TTGTCGTATC
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------MV Ex1.5XX-F1
R F #
L H G I
I L C
V C L
W L W L
L G L
CGTTTTTAAC TACATGGAAT CATATTGTGT GTGTGCCTGT GGCTCTGGCT TCTTGGTTTA
GCAAAAATTG ATGTACCTTA GTATAACACA CACACGGACA CCGAGACCGA AGAACCAAAT
MV Ex1.5XX-R1
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------MV Ex1.5XX-F2
A L &
D A L M
V L R
V A R
V T R F
H C C
GCATTGTGAG ATGCACTCAT GGTGTTGCGT GTAGCTAGAG TTACTCGTTT TCACTGCTGT
CGTAACACTC TACGTGAGTA CCACAACGCA CATCGATCTC AATGAGCAAA AGTGACGACA
MV Ex1.5XX-R2
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX-------►----EXON 2--I V F
C C L #
N T P
S A N
G R Q L
A G I
ATAGTGTTCT GTTGCCTATA AAATACCCCT TCAGCCAATG GGCGGCAGCT TGCCGGGATT
TATCACAAGA CAACGGATAT TTTATGGGGA AGTCGGTTAC CCGCCGTCGA ACGGCCCTAA
------------------------------EXON 2----------------------------A V L
A I G L
W L R
F D S
Q T K S
I F E
GCTGTCCTTG CCATTGGACT ATGGCTCCGA TTCGACTCTC AGACCAAGAG CATCTTCGAG
CGACAGGAAC GGTAACCTGA TACCGAGGCT AAGCTGAGAG TCTGGTTCTC GTAGAAGCTC
Abbildung 17:
Sequenz der huCD9 mRNA-Subvariante 4a-1. Anstelle des üblichen Exon 1 gibt es ein alternatives
Exon 1.5XX (rot markiert). Dieses enthält im CD9-Leserahmen zwei Stopp-Codons TGA und TAA
(grüne Sonderzeichen &,#). Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau unterlegt)
und Namen von Oligonukleotiden, die als Primer in der Reverse Transkription/PolymeraseKettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt wurden.
69
ERGEBNISSE
huCD9-mRNA, Variante 4a-2
1
61
121
181
241
301
361
421
◄--------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------L S F
I G T
C K R
L A L C
A S L
N S I
CTTTATCATT TATAGGCACA TGTAAGCGTC TAGCTCTGTG TGCATCCCTA AACAGCATAG
GAAATAGTAA ATATCCGTGT ACATTCGCAG ATCGAGACAC ACGTAGGGAT TTGTCGTATC
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------MV Ex1.5XX-F1
A F L T
T W N
H I V
C V P V
A L A
S W F
CGTTTTTAAC TACATGGAAT CATATTGTGT GTGTGCCTGT GGCTCTGGCT TCTTGGTTTA
GCAAAAATTG ATGTACCTTA GTATAACACA CACACGGACA CCGAGACCGA AGAACCAAAT
MV Ex1.5XX-R1
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX--------------------MV Ex1.5XX-F2
S I V R
C T H
G V A
C S @ S
Y S F
S L L
GCATTGTGAG ATGCACTCAT GGTGTTGCGT GTAGCTAGAG TTACTCGTTT TCACTGCTGT
CGTAACACTC TACGTGAGTA CCACAACGCA CATCGATCTC AATGAGCAAA AGTGACGACA
MV Ex1.5XX-R2
---------------------ALTERNATIVES EXON 1.5XX-------►◄-----------Y S V L
L P I
K Y P
F S Q W
A A G
R S L
ATAGTGTTCT GTTGCCTATA AAATACCCCT TCAGCCAATG GGCGGCAGGT AGGTCACTGT
TATCACAAGA CAACGGATAT TTTATGGGGA AGTCGGTTAC CCGCCGTCCA TCCAGTGACA
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 2----------------------F I P R
L L V
F L V
P A & I
K H T
P # W
TTATTCCTCG CTTGCTGGTA TTTTTAGTAC CTGCATGAAT CAAACACACC CCGTAATGGC
AATAAGGAGC GAACGACCAT AAAAATCATG GACGTACTTA GTTTGTGTGG GGCATTACCG
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 2----------------------H L Q L
P G V
Y E G
Q R P R
V V T
K S F
ATCTACAACT ACCAGGCGTA TATGAGGGGC AGAGACCAAG GGTGGTCACA AAGTCCTTTG
TAGATGTTGA TGGTCCGCAT ATACTCCCCG TCTCTGGTTC CCACCAGTGT TTCAGGAAAC
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 2----------------------A S L T
L K R
V G T
V L L L
A A R
I N A
CAAGTCTCAC CCTTAAGCGC GTGGGGACTG TGTTGTTGCT GGCAGCCAGA ATTAATGCTG
GTTCAGAGTG GGAATTCGCG CACCCCTGAC ACAACAACGA CCGTCGGTCT TAATTACGAC
--------------------►◄-------------------EXON 2-----------------D V L Y
V L Q
L A G
I A V L
A I G
L W L
ATGTCCTGTA TGTCTTGCAG CTTGCCGGGA TTGCTGTCCT TGCCATTGGA CTATGGCTCC
TACAGGACAT ACAGAACGTC GAACGGCCCT AACGACAGGA ACGGTAACCT GATACCGAGG
Abbildung 18:
Ausschnitt der huCD9 mRNA-Variante 4a-2. Die mRNA beginnt mit dem alternativen Exon 1.5XX
(rote Beschriftung), das ein Stopp-Codon TAG (grünes @) im CD9-Leseraster enthält. Das übliche
Exon 2 ist um 212 Basenpaare verlängert (blaue Beschriftung) und enthält ebenfalls Stopp-Codons
(grüne #, &). Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau unterlegt) und Namen von
Oligonukleotiden, die als Primer in der Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt wurden.
70
ERGEBNISSE
3.2.3.4
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 4b
Auch bei der Analyse von huCD9 mRNA-Spezies mit einem um 112 Basenpaare,
die für 37 Aminosäuren kodieren, verlängerten Exon 6 (Variante 4b) konnten zwei
Subvarianten identifiziert werden. Die mögliche Translation dieser CD9-Variante
wird am Ende des verlängerten Exon 6 durch ein Stopp-Codon beendet. Die
Subvariante 4b-1 besitzt ein durchgehendes Leseraster beginnend von Exon 1 bis
zum Ende der Verlängerung des Exon 6 (Abbildung 19), durch das ein trunkiertes
Protein mit verändertem C-Terminus von insgesamt 216 Aminosäuren kodiert
wird. Bei Subvariante 4b-2 fehlt Exon 2, wodurch das Leseraster im
darauffolgenden Exon 3 durch mehrere Stopp-Codons unterbrochen wird, so dass
davon ausgegangen werden kann, dass diese mRNA-Sequenz nicht zu einer
funktionellen CD9-Variante translatiert werden kann (Abbildung 20).
huCD9-mRNA, Variante 4b-1
164
601
------------------------------EXON 6---------------►◄-----------S D I
C P K K
D V L
E T F
T V K V
N S D
TCAGACATCT GCCCCAAGAA GGACGTACTC GAAACCTTCA CCGTGAAGGT AAACTCAGAC
AGTCTGTAGA CGGGGTTCTT CCTGCATGAG CTTTGGAAGT GGCACTTCCA TTTGAGTCTG
184
661
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 6----------------------MV Ex6plus-F1
Q D P
G V P A
P I A
L D K
P C K H
E S D
CAGGATCCTG GTGTCCCTGC CCCCATTGCT CTGGACAAAC CCTGCAAGCA TGAAAGTGAC
GTCCTAGGAC CACAGGGACG GGGGTAACGA GACCTGTTTG GGACGTTCGT ACTTTCACTG
MV Ex6plus-R1
204
721
------------VERLÄNGERTES EXON 6-----------►◄--------EXON 7------MV Ex6plus-F2
S S Q
V L L Q
Q D P
F C L
& K G P
R A P
AGCAGCCAAG TGCTGCTTCA GCAAGACCCG TTCTGCCTGT GAAAGGGCCC CAGGGCACCC
TCGTCGGTTC ACGACGAAGT CGTTCTGGGC AAGACGGACA CTTTCCCGGG GTCCCGTGGG
MV Ex6plus-R2
Abbildung 19:
Sequenz der huCD9 mRNA-Variante 4b-1. Bei dieser Variante ist das Exon 6 um 112
Basenpaaren verlängert (rot markiert). Es endet mit einem Stopp-Codon TGA (grünes &). Der
durchgängige kodierende Bereich ist durch Fettdruck hervorgehoben; die zum Nachweis der
Variante eingesetzten Oligonukleotide sind grau unterlegt. Ihre Namen sind ebenfalls der
Abbildung zu entnehmen.
71
ERGEBNISSE
huCD9-mRNA, Variante 4b-2
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
------------------------------EXON 1----------------------------R A P
Q S R T
R S A
Q A K
L A L T
M P V
CGCGCCCCCC AGTCCCGCAC CCGTTCGGCC CAGGCTAAGT TAGCCCTCAC CATGCCGGTC
GCGCGGGGGG TCAGGGCGTG GGCAAGCCGG GTCCGATTCA ATCGGGAGTG GTACGGCCAG
------------------------------EXON 1-------------------------►◄-K G G
T K C I
K Y L
L F G
F N F I
F W E
AAAGGAGGCA CCAAGTGCAT CAAATACCTG CTGTTCGGAT TTAACTTCAT CTTCTGGGAG
TTTCCTCCGT GGTTCACGTA GTTTATGGAC GACAAGCCTA AATTGAAGTA GAAGACCCTC
------------------------------EXON 3----------------------------S I F
& S E P
A P S
& C W
W A S W
A A A
TCTATATTCT GATCGGAGCC GGCGCCCTCA TGATGCTGGT GGGCTTCCTG GGCTGCTGCG
AGATATAAGA CTAGCCTCGG CCGCGGGAGT ACTACGACCA CCCGAAGGAC CCGACGACGC
----------------EXON 3---------------►◄----------EXON 4---------G L C
R S P S
A C W
D C S
S A S S
W & Y
GGGCTGTGCA GGAGTCCCAG TGCATGCTGG GACTGTTCTT CGGCTTCCTC TTGGTGATAT
CCCGACACGT CCTCAGGGTC ACGTACGACC CTGACAAGAA GCCGAAGGAG AACCACTATA
------------------------------EXON 4-----------------►◄--EXON 5-S P L
K @ L R
P S G
D I P
T R M R
& L R
TCGCCATTGA AATAGCTGCG GCCATCTGGG GATATTCCCA CAAGGATGAG GTGATTAAGG
AGCGGTAACT TTATCGACGC CGGTAGACCC CTATAAGGGT GTTCCTACTC CACTAATTCC
------------------------------EXON 5----------------------------K S R
S F T R
T P T
T S &
K P R M
S P S
AAGTCCAGGA GTTTTACAAG GACACCTACA ACAAGCTGAA AACCAAGGAT GAGCCCCAGC
TTCAGGTCCT CAAAATGTTC CTGTGGATGT TGTTCGACTT TTGGTTCCTA CTCGGGGTCG
------------EXON 5------------►◄-------------EXON 6-------------G K R
& K P S
T M R
& T A
V V W L
G A W
GGGAAACGCT GAAAGCCATC CACTATGCGT TGAACTGCTG TGGTTTGGCT GGGGGCGTGG
CCCTTTGCGA CTTTCGGTAG GTGATACGCA ACTTGACGAC ACCAAACCGA CCCCCGCACC
------------------------------EXON 6---------------------------►◄
N S L
S Q T S
A P R
R T Y
S K P S
P & R
AACAGTTTAT CTCAGACATC TGCCCCAAGA AGGACGTACT CGAAACCTTC ACCGTGAAGG
TTGTCAAATA GAGTCTGTAG ACGGGGTTCT TCCTGCATGA GCTTTGGAAG TGGCACTTCC
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 6----------------------MV Ex6plus-F1
# T Q
T R I L
V S L
P P L
L W T N
P A S
TAAACTCAGA CCAGGATCCT GGTGTCCCTG CCCCCATTGC TCTGGACAAA CCCTGCAAGC
ATTTGAGTCT GGTCCTAGGA CCACAGGGAC GGGGGTAACG AGACCTGTTT GGGACGTTCG
MV Ex6plus-R1
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 6-------------►◄-EXON 7MV Ex6plus-F2
M K V
T A A K
C C F
S K T
R S A C
E R A
ATGAAAGTGA CAGCAGCCAA GTGCTGCTTC AGCAAGACCC GTTCTGCCTG TGAAAGGGCC
TACTTTCACT GTCGTCGGTT CACGACGAAG TCGTTCTGGG CAAGACGGAC ACTTTCCCGG
MV Ex6plus-R2
Abbildung 20:
Sequenzausschnitt der huCD9 mRNA-Variante 4b-2. Diese Variante besitzt ein verlängertes Exon
6 (rote Beschriftung), aber kein Exon 2. Die ab Exon 3 im CD9-Leseraster auftretenden
Stopp-Codons (grüne Sonderzeichen &, @,
#)
verhindern eine Translation der folgenden
72
ERGEBNISSE
mRNA-Sequenz. Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau unterlegt) und Namen
von Oligonukleotiden, die als Primer in der Reverse Transkription/Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt wurden.
3.2.3.5
Die
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 5
huCD9-Variante
5
(Abbildung
21)
beginnt
mit
einem
alternativen
Exon 2.5 von 209 Basenpaaren, welches jedoch mehrere Stopp-Codons im
CD9-Leseraster beinhaltet. Aus dieser mRNA könnte nur ein trunkiertes
CD9-Protein durch Beginn der Translation an einem ATG-Initiationscodon in
Exon 3 (Position 319, Abbildung 14) entstehen.
huCD9-mRNA, Variante 5
1
61
121
181
◄---------------------ALTERNATIVES EXON 2.5---------------------MV Ex2.5-F1
S A L
T A S
S V R Q
G P R
S @ P
E C G R
ATCTGCTCTG ACAGCGTCCT CTGTAAGGCA GGGTCCCAGA AGTTAGCCAG AGTGTGGAAG
TAGACGAGAC TGTCGCAGGA GACATTCCGT CCCAGGGTCT TCAATCGGTC TCACACCTTC
MV Ex2.5-R1
----------------------ALTERNATIVES EXON 2.5---------------------Y M L
T S L
S G F I
L L E
R A D
R L D Q
GTATATGCTA ACTAGCTTGA GTGGATTCAT CTTGCTGGAA AGAGCTGACA GACTGGACCA
CATATACGAT TGATCGAACT CACCTAAGTA GAACGACCTT TCTCGACTGT CTGACCTGGT
----------------------ALTERNATIVES EXON 2.5---------------------MV Ex2.5-F2
F A F
R M @
G F P W
I F S
V L D
& G L M
GTTTGCATTC CGAATGTAGG GATTCCCGTG GATATTCTCT GTCCTGGATT GAGGGCTAAT
CAAACGTAAG GCTTACATCC CTAAGGGCAC CTATAAGAGA CAGGACCTAA CTCCCGATTA
MV Ex2.5-R2
----ALTERNATIVES EXON
G T F
Q K G
GGGCACCTTC CAGAAGGGCT
CCCGTGGAAG GTCTTCCCGA
2.5-----►◄--------------EXON 3------------& G # G
V Y I
L I G
A G A L
GAGGGTAAGG AGTCTATATT CTGATCGGAG CCGGCGCCCT
CTCCCATTCC TCAGATATAA GACTAGCCTC GGCCGCGGGA
Abbildung 21:
Ausschnitt der Sequenzierung der huCD9-Variante 5. Diese mRNA-Spezies beginnt mit einem
alternativen Exon 2.5 (rote Beschriftung). Die Sequenzabfolge weist im CD9-Leserahmen mehrere
Stopp-Codons auf (grüne @, #, &). Die zum Nachweis der Variante eingesetzten Primer sind grau
unterlegt. Ihre Namen sind ebenfalls der Abbildung zu entnehmen.
73
ERGEBNISSE
3.2.3.6
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 6
Wie in Abbildung 22 dargestellt, konnte bei Variante 6 des huCD9 kein Exon 1
gefunden werden, stattdessen aber ein alternatives Exon 1 (Exon min-1) mit einer
Länge
von
232
Basenpaaren.
Dieses
beginnt
zwar
mit
einem
Translationinitiationscodon ATG doch es folgt in Position 77 ein Stopp-Codon,
weshalb eine Translation des alternativen Exon min-1 nicht möglich erscheint,
allerdings könnte (wie bei Variante 4a) das Codon für Leucin (Schwab et al. 2004,
Touriol et al. 2003) am Beginn des folgenden Exon 2 zur Initiation genutzt werden.
huCD9-mRNA, Variante 6
1
61
121
181
◄--------------------ALTERNATIVES EXON min 1--------------------MV Exmin1-F2
M K S
M V S
E R R F
A R R
Q T R
A K L S
AATGAAAAGT ATGGTCAGCG AGCGAAGGTT TGCAAGGAGA CAGACGAGGG CGAAATTAAG
TTACTTTTCA TACCAGTCGC TCGCTTCCAA ACGTTCCTCT GTCTGCTCCC GCTTTAATTC
---------------------ALTERNATIVES EXON min 1--------------------Q A A
S L #
I L A K
Q K G
P S L
W Q Q A
CCAGGCGGCT TCCCTTTAAA TCCTCGCAAA GCAGAAGGGC CCCTCACTCT GGCAGCAGGC
GGTCCGCCGA AGGGAAATTT AGGAGCGTTT CGTCTTCCCG GGGAGTGAGA CCGTCGTCCG
---------------------ALTERNATIVES EXON min 1--------------------MV Exmin1-F3
L A K
G P L
A L T T
R G R
V S Q
S R T P
CTTGGCCAAG GGGCCTTTAG CCCTGACGAC CCGGGGAAGA GTCTCCCAAA GCAGAACGCC
GAACCGGTTC CCCGGAAATC GGGACTGCTG GGCCCCTTCT CAGAGGGTTT CGTCTTGCGG
---------------------ALTERNATIVES EXON min 1------------►◄-EXON 2
G P A
P R P
N A G E
P E G
R G L
H L A G
CGGTCCGGCG CCCAGACCAA ACGCGGGGGA ACCGGAAGGG CGAGGCCTCC ACCTTGCCGG
GCCAGGCCGC GGGTCTGGTT TGCGCCCCCT TGGCCTTCCC GCTCCGGAGG TGGAACGGCC
Abbildung 22:
Ausschnitt der huCD9 mRNA-Variante 6. Diese Variante enthält anstelle des üblichen Exon 1 ein
alternatives Exon min-1 (rote Beschriftung). Die Sequenz besitzt ein für die Translation
notwendiges Start-Codon ATG, kodierend für die Aminosäure Methionin (M, grün markiert),
welchem jedoch ein Stopp-Codon (grünes #) folgt. Der Abbildung zu entnehmen sind auch
Sequenzen (grau unterlegt) und Namen von Oligonukleotiden, die als Primer in der Reverse
Transkription/Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt
wurden.
74
ERGEBNISSE
3.2.3.7
Sequenz der huCD9-Transkriptvariante 7b/7c
Die huCD9-Variante 7b/7c beginnt mit einem durchgehenden Leseraster vom
Start-Codon ATG in Exon 1 (Abbildung 14) bis Exon 3, welches um 227
Basenpaaren verlängert ist (Abbildung 23). Nach 33 Basenpaaren tritt in diesem
prolongierten Exon 3 ein Stopp-Codon auf. Somit ist im Falle einer Translation von
einem trunkierten und im C-Terminus veränderten CD9-Protein von insgesamt 103
Aminosäuren auszugehen.
huCD9-mRNA, Variante 7b/7c
84
361
---------EXON 3----------►◄---------VERLÄNGERTES EXON 3---------E S Q
C M L G
L V S
I P S
A S P Q
P P &
GAGTCCCAGT GCATGCTGGG ACTGGTGAGT ATCCCCTCGG CATCCCCACA GCCACCCTGA
CTCAGGGTCA CGTACGACCC TGACCACTCA TAGGGGAGCC GTAGGGGTGT CGGTGGGACT
421
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 3----------------------L P P
T K T S
A G P
D P D
H R T D
G G G
CTCCCACCAA CAAAAACCTC AGCAGGCCCA GACCCAGACC ACAGAACAGA TGGAGGGGGA
GAGGGTGGTT GTTTTTGGAG TCGTCCGGGT CTGGGTCTGG TGTCTTGTCT ACCTCCCCCT
MV Ex3plus-R1
481
541
601
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 3----------------------MV Ex3plus-F1
W G Q
E G T Q
R A &
A V L
S L G P
S P M
TGGGGTCAGG AAGGTACCCA AAGGGCATGA GCTGTCCTCA GCCTGGGCCC CTCCCCGATG
ACCCCAGTCC TTCCATGGGT TTCCCGTACT CGACAGGAGT CGGACCCGGG GAGGGGCTAC
MV Ex3plus-R2
-----------------------VERLÄNGERTES EXON 3----------------------MV Ex3plus-F2
& G V
A P L P
F W S
L S Y
R F P @
A T K
TGAGGCGTCG CCCCTCTTCC TTTCTGGAGC CTGTCTTATC GCTTCCCCTA GGCAACTAAA
ACTCCGCAGC GGGGAGAAGG AAAGACCTCG GACAGAATAG CGAAGGGGAT CCGTTGATTT
-----------►
R T M
AGGACTATGT T
TCCTGATACA A
Abbildung 23:
Sequenzausschnitt der huCD9-Variante 7b/7c. Diese Variante enthält ein verlängertes Exon 3 (rote
Beschriftung), welches durch das Auftreten eines Stopp-Codons (grünes &) nur für 19 weitere
Aminosäuren kodiert. Der Abbildung zu entnehmen sind auch Sequenzen (grau unterlegt) und
Namen von Oligonukleotiden, die als Primer in der Reverse Transkription/PolymeraseKettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis der Variante eingesetzt wurden. Der kodierende Bereich
ist durch Fettdruck hervorgehoben.
75
ERGEBNISSE
3.2.4
Vorhersage der Transmembrantopologie der neu identifizierten
möglichen humanen CD9-Spleißvarianten
Von den neu identifizierten CD9 mRNA-Spezies enthalten die Spleißvarianten
huCD9-2, huCD9-PT-2, huCD9-4b-1 und huCD9-7b/7c ein durchgehendes
Leseraster, das nach Translation zu einem funktionellen Protein führen könnte.
Um auch bei diesen Varianten eine Vorstellung zu bekommen, wie ihre
Transmembrantopologie im Vergleich zur Struktur des charakterisierten CD9 sein
könnte, wurde für jede Aminosäurensequenz wie beschrieben (Cserzö et al. 1997;
siehe 2.3.5) mit Hilfe des „Dense Alignment Surface“ (DAS)-Algorithmus ein
DAS-Wert-Profil berechnet, das die Ähnlichkeit von Sequenzabschnitten mit
bekannten Transmembrandomänen zeigt. Die Modellrechnungen ergaben, dass
im Vergleich mit dem Ergebnis für die bekannte Variante huCD9-1 die alternative
CD9 Variante 2 tetraspanintypisch vier, die anderen CD9-Spleißvarianten nur zwei
(huCD9-7b/7c), drei (huCD9-4b-1) oder fünf (huCD9-PT-2) Transmembrandomänen ausbilden (siehe Abbildungen 24 bis 28). Weitere auffällige strukturelle
Besonderheiten sind bei zwei Varianten (huCD9-PT-2 und huCD9-4b-1) die
Verlagerung der N- bzw. C-terminalen Enden (siehe Abbildungen 26 und 27).
76
ERGEBNISSE
3.2.4.1
Transmembrantopologie des bereits charakterisierten
humanen CD9
Die
experimentell
bestätigte
Struktur
des
CD9
wird
durch
vier
Transmembrandomänen bestimmt, wobei die N- und C-terminalen Enden in den
Intrazellulärraum ragen (Abbildung 24). Diese Membrantopologie ist typisch für
Tetraspanine verschiedenster Spezies inklusive Ratte und Mensch.
„DAS“ - Wert
huCD9-mRNA, Variante 1 (Hauptform)
1
2
3
4
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
Extrazellulärraum
Abbildung 24:
Berechnete Transmembrantopologie des gut charakterisierten humanen CD9. Es ist ein integrales
Membranprotein mit vier Transmembrandomänen (oberes Bild, Nummerierung 1, 2, 3, 4), bei dem
die N- und C-terminalen Enden in den intrazellulären Bereich ragen (unteres Bild).
Im oberen Bild sind für die Positionen der Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment
Surface“
(DAS)-Werte
dargestellt,
die
ein
Maß
für
die
Ähnlichkeit
mit
bekannten
Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung zwischen Transmembran- und
Nicht-Transmembranregionen relevante Grenzbereich wird von einer gestrichelten und einer
durchgezogenen Linie begrenzt.
77
ERGEBNISSE
3.2.4.2
Vorhersage der Transmembrantopologie der
huCD9-Spleißvariante 2
Durch das alternative Exon 3.5 in der mRNA der huCD9-Variante 2 entsteht bei
einer Translation ein um 23 Aminosäuren längeres CD9-Protein mit insgesamt 251
Aminosäuren. Ihre berechnete Membrantopologie unterscheidet sich von der der
CD9-Hauptvariante (Abbildung 24) nur dadurch, dass die Transmembrandomänen
Nr. 2 und 3 in größerem Abstand voneinander in der Zellmembran verankert sind
und sich so die intrazelluläre Schleife verlängert (Abbildung 25).
„DAS“ - Wert
huCD9-mRNA, Variante 2
1
2
3
4
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
Extrazellulärraum
Abbildung 25:
Berechnte Transmembrantopologie der huCD9-Variante 2, die ebenfalls als ein integrales
Membranprotein mit vier Transmembrandomänen (Nummerierung 1, 2, 3, 4) erscheint. Der
Unterschied zur huCD9-Hauptvariante besteht in einem größeren Abstand zwischen den
Transmembrandomänen 2 und 3, wodurch eine längere intrazelluläre Schleife entsteht.
Im oberen Bild sind für die Positionen der Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment
Surface“
(DAS)-Werte
dargestellt,
die
ein
Maß
für
die
Ähnlichkeit
mit
bekannten
Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung zwischen Transmembran- und
Nicht-Transmembranregionen relevante Grenzbereich wird von einer gestrichelten und einer
durchgezogenen Linie begrenzt.
78
ERGEBNISSE
3.2.4.3
Vorhersage der Transmembrantopologie der
huCD9-Spleißvariante PT-2
Die neu identifizierte Spleißvariante PT-2 ist durch das zusätzliche alternative
Exon 1.5 um 42 auf insgesamt 270 Aminosäuren verlängert, wodurch eine fünfte
Transmembrandomäne entstehen könnte (Abbildung 26). Dadurch wäre das
N-terminale Ende – anders als bei typischen Tetraspaninen – im extrazellulären
Bereich.
In
dieser Hinsicht
ähnelt
diese
CD9-Form
der Rattenvariante
rCD9 mRNA-C (Abbildung 12).
„DAS“ - Wert
huCD9-mRNA, Variante PT-2
1
2
3
4
5
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
Extrazellulärraum
Abbildung 26:
Berechnete Transmembrantopologie der huCD9-Variante PT-2. Diese weist neben denselben vier
Transmembranhelices (oberes Bild, Nummerierung 2, 3, 4, 5) der Hauptform des humanen CD9
eine fünfte Transmembrandomäne auf (Nummer 1). Das N-terminale Ende des Proteins wäre dann
nicht intrazellulär, sondern in den Extrazellulärraum ragend (unteres Bild).
Im oberen Bild sind für die Positionen der Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment
Surface“
(DAS)-Werte
dargestellt,
die
ein
Maß
für
die
Ähnlichkeit
mit
bekannten
Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung zwischen Transmembran- und
Nicht-Transmembranregionen relevante Grenzbereich wird von einer gestrichelten und einer
durchgezogenen Linie begrenzt.
79
ERGEBNISSE
3.2.4.4
Vorhersage der Transmembrantopologie der
huCD9-Spleißvariante 4b-1
Durch das mit einem Stopp-Codon endende verlängerte Exon 6 ergibt sich ein
verkürztes Protein von 216 Aminosäuren mit nur drei Transmembrandomänen.
Dadurch entsteht ein relativ langes C-terminale Ende des Proteins, das – anders
als bei typischen Tetraspaninen – in den Extrazellulärraum ragt (Abbildung 27).
„DAS“ - Wert
huCD9-mRNA, Variante 4b-1
1
2
3
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
Extrazellulärraum
Abbildung 27:
Berechnete Transmembrantopologie der huCD9-Variante 4b-1. Diese Variante enthält nur drei
Transmembranhelices und einen relativ langen extrazellulären C-terminalen Bereich.
Im oberen Bild sind für die Positionen der Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment
Surface“
(DAS)-Werte
dargestellt,
die
ein
Maß
für
die
Ähnlichkeit
mit
bekannten
Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung zwischen Transmembran- und
Nicht-Transmembranregionen relevante Grenzbereich wird von einer gestrichelten und einer
durchgezogenen Linie begrenzt.
80
ERGEBNISSE
3.2.4.5
Vorhersage der Transmembrantopologie der
huCD9-Spleißvariante 7b/7c
Das verlängerte Exon 3 der Variante 7b/7c enthält ein Stopp-Codon, weshalb nur
ein kurzes Protein von 103 Aminosäuren translatiert werden kann. Die beiden
einzigen Transmembrandomänen begrenzen eine große extrazelluläre Schleife.
Die N- und C-terminalen Enden ragen in den Intrazellulärraum (Abbildung 28).
„DAS“ - Wert
huCD9-mRNA, Variante 7b/7c
1
2
Aminosäureposition
Intrazellulärraum
Extrazellulärraum
Abbildung 28:
Berechnete Transmembrantopologie der huCD9-Variante 7b/7c. Diese Variante kann mit 103
Aminosäuren nur noch zwei Transmembranhelices ausbilden (oberes Bild, Nummerierung 1, 2).
Beide Enden ragen in den intrazellulären Bereich (unteres Bild).
Im oberen Bild sind für die Positionen der Aminosäuresequenz die berechneten „Dense Alignment
Surface“
(DAS)-Werte
dargestellt,
die
ein
Maß
für
die
Ähnlichkeit
mit
bekannten
Transmembrandomänen sind. Der für eine Unterscheidung zwischen Transmembran- und
Nicht-Transmembranregionen relevante Grenzbereich wird von einer gestrichelten und einer
durchgezogenen Linie begrenzt.
81
DISKUSSION
4.
Das
Diskussion
in
sehr
vielen
Geweben
exprimierte
Tetraspanin
CD9
spielt
bei
fundamentalen Prozessen wie Zelladhäsion und -migration eine wichtige Rolle.
Invasivität und Metastasierungspotential maligner Zellen und damit auch die
klinische Prognose von Patienten mit soliden malignen Tumoren scheint von CD9
und
anderen
Tetraspaninen
wesentlich
mitbestimmt
zu
werden.
Dem
entsprechend ist die CD9-Expression maligner Zellen häufig verändert und
korreliert mit den Stadien einer Krebserkrankung. Obwohl es das bisher am
Besten untersuchte Mitglied der Familie der Tetraspanine ist, sind bislang weder in
gesundem Gewebe noch in malignen Tumoren alternative Spleißvarianten von
CD9 gefunden worden. Deshalb überraschte, dass im Rahmen dieser Arbeit
mehrere CD9-Spleißvarianten neu identifiziert und charakterisiert werden konnten.
Als Folge wird für alle künftigen Untersuchungen zu den Funktionen des CD9 die
Frage nach der relativen Bedeutung alternativer Transkripte zu stellen sein.
4.1
Expression von alternativen CD9-Transkripten in
malignen neuralen Zellen und Organen der Ratte
In
malignen
neuroektodermalen
Zellen
der
Ratte
wurden
die
beiden
Transkriptvarianten rCD9 mRNA-B und rCD9 mRNA-C gefunden. Beide Varianten
zeigen, im Vergleich zu der bereits bekannten rCD9 mRNA-A, Veränderungen im
vorderen Bereich, der im Falle einer Translation dem aminoterminalen Ende des
Proteins entspricht. Dass die Variante rCD9-C im Gegensatz zu rCD9-B im
Endbereich
durch
die
alternative
Sequenz
ein
potentielles
Translation-
initiationscodon enthält, führte zu der Vermutung, dass nur dieses Transkript auch
effizient translatiert werden kann. Diese Annahme wurde durch die Expression
eines Fusionsproteins dieser Variante mit C-terminalem EGFP bestätigt, so dass
eine funktionelle Relevanz insbesondere dieser Variante möglich erscheint.
82
DISKUSSION
Modellrechnungen auf Grundlage der alternativen Aminosäurensequenz ergaben
übereinstimmend, dass die Variante rCD9-C neben den bereits bekannten vier
Membrandomänen, einen fünften stark hydrophoben Bereich enthält, der als
weitere Membrandomäne zu einem in den extrazellulären Raum ragenden
N-Terminus des Proteins führen würde. Da die beiden Enden des Proteins eine
Mediatorfunktion bei der intrazellulären Signalvermittlung übernehmen (Hemler
2005, Levy und Shoham 2005a/b, Stipp et al. 2003, Zhang et al. 2001), könnte
durch die Verlagerung des N-Terminus die CD9-Funktion in dieser Hinsicht
verändert sein. Darüber hinaus ist bei rCD9-C auch EC1 im Übergang zur TM
verändert, wodurch die für Tetraspanine typische Protein-Protein-Interaktionen an
dieser Stelle andere Partnermoleküle betreffen könnten.
Im Gegensatz zu rCD9-C konnte rCD9-B nicht effizient als EGFP-Fusionsprotein
exprimiert werden, da das Translationinitiationscodon im 5’-Bereich der mRNA
ersatzlos fehlt und das potentielle Startcodon in Exon 3 nicht wirksam ist. Dennoch
könnte
dieses
vermutlich
nicht
translatierbare
Transkript
eine
Rolle
in
Genregulationsmechanismen spielen: entweder direkt durch kompetetive Bindung
relevanter RNA-bindender Proteine oder als Quelle für mikro-RNAs oder
endogene „short interfering RNAs“, die Stabilität bzw. Translation von Ziel-mRNAs
beeinflussen
können
(Costa
2007,
Röther
und
Meister
2011).
Über
DNA-Methyltransferasetranskripte könnten so sogar Mechanismen umfassender
epigenetischer Regulation beeinflusst werden (Veeck und Esteller 2010). Da die
CD9 mRNA-B in normalen Rattenorganen nicht nachgewiesen werden konnte,
wäre eine solche mögliche Wirkung aber höchstens für maligne Zellen relevant.
Interessant ist allerdings, dass in den malignen neuralen Zelllinien BT4Ca und
BT8Ca die Expression der Spleißvariante rCD9 mRNA-B sehr stark war und
insbesondere bei BT8Ca-Zellen diese fast ausschließlich exprimiert wurde,
während die bekannte rCD9 mRNA-A in sehr geringen Mengen oder überhaupt
nicht nachgewiesen werden konnte (Tabelle 22). Es könnte sich daher um eine für
maligne Zellen dieser Art typische oder sogar spezifische Spleißvariante handeln.
Als Hinweis auf eine mögliche physiologische Bedeutung der translatierbaren
Variante rCD9-C kann ihre Expression in verschiedenen normalen Rattenorganen
und allen getesteten Zelllinien gewertet werden. Sie scheint im Vergleich zur
83
DISKUSSION
Hauptvariante rCD9 mRNA-A lediglich in etwas geringeren Mengen gebildet zu
werden. Worin sich rCD9-C von rCD9-A hinsichtlich der vielfältigen Funktionen
des CD9 unterscheidet, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden.
Eingeleitet wird eine weitere Charakterisierung dieser interessanten neuen
CD9-Variante durch Gewinnung rCD9-C-spezifischer Antikörper, die den sicheren
Nachweis des varianten Proteins und seiner für Tetraspanine vermutlich
ungewöhnlichen Membrantopologie ermöglichen.
4.2
Expression alternativer CD9-Transkripte beim
Menschen
Die bei der Ratte identifizierten alternativen Exons konnten nicht direkt in
menschlichen Organen oder Karzinomzelllinien als Teil der CD9-mRNA
nachgewiesen werden, was auf Grund der eher geringen Homologie der
entsprechenden Bereiche des Genoms erwartet wurde. Allerdings erschien nach
Nachweis vermutlich funktionell relevanter alternativer Transkripte bei der Ratte
wahrscheinlich, dass auf Spleißvarianten beruhende Regulationsmechanismen
auch beim Menschen eine Rolle spielen.
Ausgangspunkt der Suche nach CD9-Spleißvarianten beim Menschen waren
systematische Recherchen in Sequenzdatenbanken mit dem Ziel, Hinweise auf
uncharakterisierte
CD9-Transkripte
zu
erhalten.
Neben
alternative
Exons
enthaltende CD9-mRNAs des Schimpansen wurde dabei eine Reihe auffälliger
EST-Sequenzen in Datenbanken gefunden, die analysiert und hinsichtlich ihrer
möglichen Expression beim Menschen untersucht wurden (Abbildung 13).
Bestätigt werden konnte dabei die Existenz von vier alternativen CD9-Transkripten
(huCD9-2, huCD9-PT-2, huCD9-4b-1 und huCD9-7b/7c), die ein durchgehendes
Leseraster enthalten, das nach Translation zu einem funktionellen Protein führen
könnte. Interessant sind die Unterschiede in der Expression dieser Varianten in
verschiedenen normalen Geweben und maligner Zellen (Tabelle 23).
84
DISKUSSION
Die in allen untersuchten Geweben vorkommende Variante 2 unterscheidet sich
von der CD9-Hauptvariante dadurch, dass, bedingt durch das alternative Exon
3.5, die Transmembrandomänen 2 und 3 des Proteins in größerem Abstand
voneinander in der Zellmembran verankert sind und sich so die intrazelluläre
Schleife deutlich verlängert (Abbildung 25). Dadurch ergeben sich möglicherweise
neue intrazelluläre Bindungsstellen für andere Proteine und es erscheint auch
möglich, dass das im Vergleich zur Hauptvariante (mit Cysteinen 9, 78, 79, 87,
218 und 219; Charrin et al. 2002) zusätzlich auftretende Cystein an
Aminosäureposition 107, als eine neue Palmitoylierungsstelle die Gesamtstruktur
und -funktion des Tetraspanin-Netzes beeinflusst. Anders als bei typischen
Tetraspaninen, besitzen die anderen alternativen CD9-Varianten nach den
Berechnungen zur Strukturvorhersage nur zwei (huCD9-7b/7c), drei (huCD9-4b-1)
oder fünf (huCD9-PT-2) Transmembrandomänen (Abbildung 26, 27 und 28).
Mit
fünf
Transmembrandomänen
ähnelt
die
Spleißvariante
PT-2
der
Rattenvariante rCD9-C. Durch das alternative Exon 1.5 ergibt sich eine
zusätzliche fünfte Transmembrandomäne, eine zusätzliche intrazelluläre Schleife
und eine Verlagerung des N-terminalen Endes in den extrazellulären Bereich
(Abbildung 26). Angesichts dieser grundsätzlichen strukturellen Unterschiede ist
davon auszugehen, dass ein Protein dieser Art sich von huCD9-1, hinsichtlich der
Bindung anderer Proteine und Auswirkung auf intrazelluläre Signalwege
wesentlich unterscheidet, wobei die Assoziation mit Partnermolekülen im Bereich
der erhaltenen EC2 und EC1 aber in ähnlicher Weise erfolgen könnte. Betroffen
wären dabei Protein-Interaktionspartner des variablen Bereichs der EC2 von CD9
wie z. B. adhäsionsvermittelnde ß1-Integrin-Untereinheiten (Berditchevski 2001),
der
mitogen
wirkende
Heparin-bindende
EGF-ähnliche
Wachstumsfaktor
(HB-EGF; Levy und Shoham 2005b, Nakamura et al. 2000), das EWI-2 Protein
der Immunglobulin-Familie (welches die Integrin-abhängige Zellmotilität moduliert:
Levy and Shoham 2005b) und die für die Oozyten-Spermium-Fusion notwendigen
schwangerschaftsspezifischen Glykoproteine (PSGs) 17 und 19 (Ha et al. 2008,
Sulkowski
et
al.
2011).
Der
konstante
Bereich
der
EC2
dient
zur
Heterodimerisierung des Tetraspanins CD9 mit z.B. CD81 (Levy und Shoham
2005a/b). Über mögliche Bindungspartner der kleinen extrazellulären Schleife von
CD9 ist derzeit jedoch noch relativ wenig bekannt, allerdings gibt es Hinweise
85
DISKUSSION
darauf, dass die EC1 wesentlich zur optimalen Ausbildung der EC2 beiträgt (Stipp
et al. 2003). Da die N- und C-Termini mit den Signaltransduktionsenzymen
Proteinkinase C und Phosphatidyl-3/4-Kinase interagieren, die an der Regulation
der
Integrin-vermittelten
Zelladhäsion
(über
den
ERK1/2/MAPK-Signal-
transduktionsweg), Proliferation und Apoptose von Zellen beteiligt sind (Hemler
2005, Kotha et al. 2008, Zhang et al. 2001), ist davon auszugehen, dass durch
eine deutliche Expression der huCD9-Spleißvariante PT-2 mit verlagertem
N-Terminus wichtige Signalübertragungsprozesse modifiziert werden. Bei dieser
Variante ist eine ausgeprägte gewebespezifische Expression in adultem Gehirn,
Ganglien des Rückenmarkhinterhorns und Ovargewebe beobachtet worden
(Tabelle 23), was auf spezielle Funktionen, die sich von denen des ubiquitär
vorkommenden huCD9-1 unterscheiden, schließen lässt. Diese Funktionen
scheinen erst bei der Differenzierung der neuralen Zellen an Bedeutung zu
gewinnen, da huCD9-PT-2 nicht schon in fötalem Gehirn exprimiert wird. Dieses
Expressionsmuster und die besondere Struktur dieser CD9-Variante lassen ihre
weitere Charakterisierung und Klärung ihrer funtionellen Bedeutung besonders
interessant erscheinen.
Von den für Tetraspanine typischen strukturellen Merkmalen ist bei den
Spleißvarianten huCD9-4b-1 und huCD9-7b/7c lediglich die im Falle des CD9 an
Aminosäureposition 52 glykosylier- und acylierbare EC1 erhalten (Boucheix et al.
1991, Seehafer et al. 1988). Bei diesen beiden Formen kommt es (durch
verlängertes Exon 6 bzw. Exon 3 mit relativ frühem Stopp-Codon) nicht zur
Ausbildung der zweiten extrazellulären Schleife (Abbildung 27 und 28), die als
Bindungsstelle verschiedener Proteine von grundlegender funktioneller Bedeutung
für die Hauptvariante des CD9 ist. Deshalb ist eine Bindung der Partner des
huCD9-1
nicht
möglich
und
es
erscheint
besonders
interessant,
in
Folgeuntersuchungen die an die vergrößerte EC1 (Variante 4b-1) bzw. den relativ
großen varianten extrazellulären C-Terminus bindenden Proteine zu identifizieren.
Möglich erscheint auch eine Beeinflussung der Gesamtstruktur des TetraspaninNetzes durch diese nicht die üblichen Partner bindenden Varianten des huCD9.
Dabei könnte eine Rolle spielen, dass diese Varianten zwei konservierte Cysteine,
die
normalerweise
durch
Palmitoylierung
modifiziert
sind,
in
den
zytoplasmatischen Domänen (AS-Position 218 und 219 des huCD9-1) nicht
86
DISKUSSION
enthalten, was zu einer Destabilisierung von funktionellen Tetraspanin-Komplexen
führen könnte (Charrin et al. 2002, Stipp et al. 2003, Yang et al. 2004). Durch
Kompetition mit der CD9-Hauptform könnte die von der Palmitoylierung abhängige
Heterodimerisierung zwischen den beiden Tetraspaninen CD9 und CD81, welche
unter anderem für die Fusion von Eizelle und Spermium wichtig ist, ebenfalls
negativ beeinflusst werden (Levy und Shoham 2005, Sulkowski et al. 2011,
Sutovsky 2009). Auffälligste strukturelle Besonderheiten dieser beiden Varianten
sind die langen C-terminalen Enden. Während der C-Terminus bei huCD9-7b/7c
tetraspanintypisch in den intrazellulären Raum ragt (Abbildung 28), müsste er bei
huCD9-4b-1 nach den Modellrechnungen extrazellulär lokalisiert sein (Abbildung
27). Obwohl noch ungeklärt ist, ob der zytoplasmatische C-Terminus des CD9 wie
der des nah verwandten Tetraspanins CD63 (Rous et al. 2002) die richtige
Verteilung des Proteins auf intrazelluläre vesikuläre Kompartimente bestimmt,
muss mit der Möglichkeit einer unterschiedlichen subzellulären Lokalisation der
neu identifizierten Varianten bei Folgeuntersuchungen gerechnet werden. Neueste
Untersuchungen
zeigen,
dass
experimentell
erzeugte
Mutationen
des
C-terminalen Endes von CD9 die molekulare Organisation von CD9-Komplexen
auf der Zelloberfläche beeinflussen können und es dadurch zu wesentlichen
Veränderungen der Zellfunktionen kommen kann: Hemmung der Bildung von
Zellfortsätzen und Verlust der Zell-Zell-Aggregation führt zu einer verstärkten
Migration der Zellen mit mutiertem C-Terminus (Wang et al. 2011). Interessant ist,
dass beide Varianten in den meisten der untersuchten menschlichen Geweben
vorkommen, nicht aber in Plazenta- und gesundem Brustgewebe (Tabelle 23).
Dagegen konnten sie bei Mammakarzinom-abgeleiteten Zelllinien nachgewiesen
werden, wobei allerdings noch geklärt werden muss, wie viele und welche
Zelllinien die beiden Varianten exprimieren, da für die initiale Untersuchung
lediglich eine Mischung aus RNAs verschiedener Linien verwendet wurde.
Möglicherweise beeinflusst die Expression dieser Varianten in malignen Zellen die
Menge des huCD9-1, dessen gegenüber dem entsprechenden Normalgewebe
verminderte Expression dann wieder typisch für Tetraspanine wäre.
87
DISKUSSION
4.3
Alternatives Spleißen als möglicher Mechanismus der
Pathogenese und Progression maligner Erkrankungen
Alternatives
Spleißen
ist
einer
der
fundamentalen
Mechanismen
der
Genregulation. Die dadurch erzeugte Variabilität führt zu einer enormen Vielfalt
der in einer Zelle hergestellten RNA-Moleküle und davon translatierter Proteine. In
malignen Tumoren ist das alternative Spleißen häufig fehlreguliert und in manchen
Fällen wird die Veränderung des Profils alternativer Spleißvarianten sogar als
wesentlich für den Übergang von benignen Neoplasien zu malignen Tumoren
angesehen. Unterschiedliche Varianten eines Transkripts des gleichen Gens
können
dabei
in
bestimmten
Fällen
gegensätzlich
onkogen
oder
tumorsupprimierend wirken (Körner und Miller 2009, Pajares et al. 2007, Srebrow
und Kornblihtt 2006). Eine der am Besten untersuchten Korrelationen zwischen
der Bildung alternativer Spleißprodukte und Malignität von Tumorzellen ist die
Erhöhung
des
CD44-Varianten.
Metastasierungspotentials
Von
diesem
mit
durch
Expression
Signaltransduktion
und
bestimmter
interzellulärer
Kommunikation verknüpften Zelladhäsionsmolekül werden durch alternatives
Spleißen Isoformen mit 10 varianten Exons (CD44V1-CD44V10), von denen
manche bevorzugt in fortgeschrittenen Stadien maligner Erkrankungen zu finden
sind, gebildet (Goodison et al. 1999, Naor et al. 1997). So korrelieren z.B. die
Expression der CD44V8-10-Isoformen oder der CD44V6-Isoform mit der
Tumorprogression des Blasenkarzinoms (Miyake et al. 2002) bzw. des
Zervixkarzinoms
(Speiser
et
al.
1997).
Dem
entsprechend
werden
CD44-Isoformen als möglicherweise informative Biomarker zur Detektion von
Karzinomen und Verlaufskontrolle bei deren Therapie betrachtet (Brinkman 2004,
Faustino und Cooper 2003).
Es ist zu früh, den neu identifizierten CD9-Formen eine solche weitreichende
Bedeutung
vorherzusagen,
allerdings
erscheint
plausibel,
dass
die
grundsätzlichen Veränderungen von Adhäsion und Migration maligner Zellen, die
durch CD9 wesentlich mitbestimmt werden, auch in unterschiedlichen Anteilen der
verschiedenen
Varianten
zum
Ausdruck
kommt.
Im
Rahmen
weiterer
Untersuchungen erscheint die Beteiligung der verschiedenen Varianten an den
88
DISKUSSION
CD9-abhängigen Signalwegen zur Regulation von Migration und Adhäsion
(Hemler 2005, Powner et al. 2011) besonders interessant.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Identifikation und initiale Charakterisierung
von neuen CD9-Varianten und stellt damit eine wichtige Grundlage zur weiteren
Erforschung des Tetraspanins CD9 dar. Die fundamentale physiologische
Bedeutung und die für viele maligne Erkrankungen beschriebene Fehlexpression
bzw. -funktion dieses Tetraspanins müssen künftig unter Berücksichtigung der
Existenz unterschiedlicher CD9-Varianten differenzierter betrachtet werden. Durch
variantenspezifische Diagnostik könnte CD9 als prognostischer Marker bei
Tumorerkrankungen und als therapeutisches Zielmolekül weiter an Bedeutung
gewinnen.
89
ZUSAMMENFASSUNG
5.
Zusammenfassung
Diese Arbeit beschreibt die Identifikation und initiale Charakterisierung von bisher
unbekannten
alternativen
Transkripten
des
Tetraspanins
CD9,
das
als
Adaptorprotein in der Zellmembran an der Regulation fundamentaler Prozesse wie
Zellproliferation, -migration und -adhäsion beteiligt ist und auch den Phänotyp
maligner Zellen verschiedener Art wesentlich mitbestimmt. Obwohl keine
Spleißvarianten des sehr gut untersuchten CD9 beschrieben worden waren, gab
es einige Hinweise auf eine Heterogentität des Proteins, die Ausgangspunkt der
Untersuchungen waren. Erste Arbeiten an malignen neuralen Rattenzelllinien, die
CD9-Immunreaktivität nicht mit allen anti-CD9-Antikörpern zeigten, führten zur
Identifizierung zweier CD9-Transkripte (rCD9 mRNA-B und -C), die anstelle der
bekannten mRNA (rCD9 mRNA-A) transkribiert werden. Beide Transkripte
enthalten im Vergleich zur rCD9 mRNA-A ein alternatives Exon 1, aber nur die
Variante rCD9-C besitzt durch die alternative Sequenz ein
Translationinitiationscodon,
dessen
Funktionalität
durch
potentielles
Expression
eines
Fusionsproteins mit verstärkt grün fluoreszierendem Protein (EGFP) am
C-terminalen Ende experimentell bestätigt werden konnte. Als weiterer Hinweis
auf eine mögliche physiologische Bedeutung der translatierbaren Variante rCD9-C
kann der Nachweis ihrer Expression in verschiedenen normalen Rattenorganen
gewertet werden. Modellrechnungen ergaben, dass diese Variante neben den für
Tetraspanine typischen vier Membrandomänen vermutlich eine weitere enthält,
wodurch sich eine besondere Struktur mit einem in den extrazellulären Raum
ragenden N-Terminus ergibt.
Um auch von menschlichen Zellen exprimierte alternative CD9-Transkripte zu
identifizieren, erfolgte eine systematische Suche in Sequenzdatenbanken nach
auffälligen „Expressed Sequence Tags“ (EST)-Sequenzen. Ausgehend von neun
Kandidatensequenzen konnte schließlich die Existenz von vier alternativen
CD9-Transkripten (huCD9-2, huCD9-PT-2, huCD9 4b-1 und huCD-7b/7c) bestätigt
werden. Diese enthalten ein durchgehendes Leseraster, das nach Translation zu
einem funktionellen Protein führen könnte. Berechnungen zur Membrantopologie
der Varianten ergaben, dass die alternative CD9 Variante-2 tetraspanintypisch
90
ZUSAMMENFASSUNG
vier, die anderen CD9-Spleißvarianten nur zwei (huCD9-7b/7c), drei (huCD9-4b-1)
oder
fünf
(huCD9-PT-2)
Transmembrandomänen
(TM)
besitzen
sollten.
Besonderheit der in allen untersuchten Geweben vorkommenden Variante 2 ist
eine durch das alternative Exon 3.5 verlängerte intrazelluläre Schleife zwischen
TM2 und TM3. Mit fünf Transmembrandomänen ähnelt die Variante PT-2 der
Rattenvariante rCD9-C. Das alternative Exon 1.5 führt bei dieser Variante zu einer
zusätzlichen intrazellulären Schleife und einer Verlagerung des N-Terminus in den
extrazellulären Raum. Interessant ist die ausgeprägte gewebespezifische
Expression dieser Variante in adultem Gehirn, Hinterstrangganglien und Ovar,
was spezielle Funktionen vermuten lässt. Bei den Varianten huCD9-4b-1 und
huCD9-7b/7c kommt es durch ein verlängertes Exon 6 bzw. Exon 3 mit frühem
Stopp-Codon nicht zur Ausbildung der zweiten extrazellulären Schleife. Ihre
auffälligsten strukturellen Besonderheiten sind die langen C-terminalen Enden.
Während
der
C-Terminus
des
huCD9-7b/7c
tetraspanintypisch
in
den
intrazellulären Raum ragt, müsste er bei huCD9-4b-1 nach den Modellrechnungen
extrazellulär lokalisiert sein. Diese beiden Varianten kommen in den meisten der
untersuchten
menschlichen
Geweben
und
Mammakarzinom-abgeleiteten
Zelllinien vor, nicht aber in Plazenta- und gesundem Brustgewebe.
Angesichts der grundsätzlichen strukturellen Unterschiede der neu identifizierten
CD9-Varianten ist davon auszugehen, dass Proteine dieser Art sich von der bisher
bekannten CD9-Form hinsichtlich der Assoziation mit Partnermolekülen sowie der
Beeinflussung intrazellulärer Signalwege wesentlich unterscheiden. Obwohl ein
experimenteller Nachweis noch aussteht, erscheint plausibel, dass die durch CD9
wesentlich mitbestimmte veränderte Adhäsion und Migration maligner Zellen auch
in unterschiedlichen Anteilen der verschiedenen Varianten zum Ausdruck kommt.
Es ist zu erwarten, dass die weitere Charakterisierung der neu identifizierten
CD9-Transkripte zu einer differenzierteren und möglicherweise erweiterten Sicht
der durch CD9 mitregulierten fundamentalen physiologischen Prozesse und ihrer
Fehlsteuerung bei malignen und anderen wichtigen Erkrankungen führt.
91
LITERATURVERZEICHNIS
6.
Literaturverzeichnis
1)
Brinkman BM: Splice variants as cancer biomarkers. Clin Biochem 37:
584-594 (2004)
2)
Berditchevski F: Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets
the eye. J Cell Sci 114: 4143-4151 (2001)
3)
Bertz J, Dahm S, Haberland J, Kraywinkel K, Kurth BM, Wolf U: Verbreitung
von Krebserkrankungen in Deutschland. Entwicklungen der Prävalenzen
zwischen 1990 und 2010. Robert-Koch-Institut (Hrsg). Beiträge zur
Gesundheitsberichterstattung des Bundes. RKI, Berlin: 156 (2010)
4)
Boucheix C, Benoit P, Frachet P, Billard M, Worthington RE, Gagnon J,
Uzan G: Molecular clonig of the CD9 antigen. A new family of cell surface
proteins. J Biol Chem 266: 117-122 (1991)
5)
Boucheix C, Duc GH, Jasmin C, Rubinstein E: Tetraspanins and
malignancy. Expert Rev Mol Med: 1-17 (2001)
6)
Boucheix
C,
Rubinstein
E:
Tetraspanins.
Cell
Mol
Life
Sci
58:
1189-1205 (2001)
7)
Chao A, Wang TH, Lee YS, Hsueh S, Chao AS, Chang TC, Kung WH,
Huang SL, Chao FY, Wei ML, Lai CH: Molecular characterization of
adenocarcinoma and squamous carcinoma of the uterine cervix using
microarray analysis of gene expression. Int J Cancer 119: 91-98 (2006)
8)
Charrin S, Manié S, Qualid M, Billard M, Boucheix C, Rubinstein E:
Differential
stability
of
tetraspanin/tetraspanin
interactions:
role
of
palmitoylation. FEBS Lett 516: 139-144 (2002)
92
LITERATURVERZEICHNIS
9)
Charrin S, Le Naour F, Labas V, Billard M, Le Caer JP, Emile JF, Petit MA,
Boucheix C, Rubinstein E: EWI-2 is a new component of the tetraspanin
web in hepatocytes and lymphoid cells. Biochem J 373: 409-421 (2003)
10)
Costa FF: Non-coding RNAs: lost in translation? Gene 386: 1-10 (2007)
11)
Cserzö M, Wallin E, Simon I, von Heijne G, Elofsson A: Prediction of
transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense
alignment surface method. Protein Eng 10: 673-676 (1997)
12)
Deissler H, Blass-Kampmann S, Kindler-Röhrborn A, Meyer HE, Rajewsky
MF: Characterization of rat NCA/CD9 cell surface antigen and its
expression by normal and malignant neural cells. J Neurosci Res 43:
664-674 (1996)
13)
Faustino NA, Cooper TA: Pre-mRNA splicing and human disease. Genes
Dev 17: 419-437 (2003)
14)
Goodison S, Urquidi V, Tarin D: CD44 cell adhesion molecules. Mol Pathol
52: 189-196 (1999)
15)
Ha CT, Waterhouse R, Warren J, Zimmermann W, Dveksler GS:
N-glycosylation is required for binding of murine pregnancy-specific
glycoproteins 17 and 19 to the receptor CD9. Am J Reprod Immunol 59:
251-258 (2008)
16)
Hemler
ME:
Specific
tetraspanin
functions.
J
Cell
Biol
155:
1103-1107 (2001)
17)
Hemler ME: Tetraspanin proteins mediate cellular penetration, invasion,
and fusion events and define a novel type of membrane microdomain. Annu
Rev Cell Dev Biol 19: 397-422 (2003)
93
LITERATURVERZEICHNIS
18)
Hemler ME: Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat Rev
Mol Cell Biol 6: 801-811 (2005)
19)
Higashiyama M, Taki T, Ieki Y, Adachi M, Huang CL, Koh T, Kodama K,
Doi O, Miyake M: Reduced motility related protein-1 (MRP-1/CD9) gene
expression as a factor of poor prognosis in non-small cell lung cancer.
Cancer Res 55: 6040-6044 (1995)
20)
Houle CD, Ding XY, Foley JF, Afshari CA, Barrett JC, Davis BJ: Loss of
expression and altered localization of KAI1 and CD9 protein are associated
with epithelial ovarian cancer progression. Gynecol Oncol 86: 69-78 (2002)
21)
Imhof I, Gasper WJ, Derynck R: Association of tetraspanin CD9 with
transmembrane TGF{alpha} confers alterations in cell-surface presentation
of
TGF{alpha}
and
cytoskeletal
organization.
J
Cell
Sci
121:
2265-2274 (2008)
22)
Jégou A, Ziyyat A, Barraud-Lange V, Perez E, Wolf JP, Pincet F, Gourier C:
CD9 tetraspanin generates fusion competent sites on the egg membrane
for mammalian fertilization. Proc Natl Acad Sci 108: 10946-10951 (2011)
23)
Kagawa T, Mekada E, Shishido Y, Ikenaka K: Immune system-related CD9
is expressed in mouse central nervous system myelin at a very late stage of
myelination. J Neurosci Res 50: 312-320 (1997)
24)
Kaprielian Z, Patterson PH: Surface and cytoskeletal markers of
rostrocaudal position in the mammalian nervous system. J Neurosci 13:
2495-2508 (1993)
25)
Kawashima M, Doh-ura K, Mekada E, Fukui M, Iwaki T: CD9 expression in
solid
non-neuroepithelial
tumors
and
infiltrative
astrocytic
tumors.
J Histochem Cytochem 50: 1195-1203 (2002)
94
LITERATURVERZEICHNIS
26)
Kobayashi H, Hosono O, Iwata S, Kawasaki H, Kuwana M, Tanaka H, Dang
NH, Morimoto C: The tetraspanin CD9 is preferentially expressed on the
human CD4(+)CD45RA+ naive T cell population and is involved in T cell
activation. Clin Exp Immunol 137: 101-108 (2004)
27)
Körner M, Miller LJ: Alternative splicing of pre-mRNA in cancer: focus on G
protein-coupled peptide hormone receptors. Am J Pathol 175: 461-472
(2009)
28)
Kohmo S, Kijima T, Otani Y, Mori M, Minami T, Takahashi R, Nagatomo I,
Takeda Y, Kida H, Goya S, Yoshida M, Kumagai T, Tachibana I, Yokota S,
Kawase I: Cell surface tetraspanin CD9 mediates chemoresistance in small
cell lung cancer. Cancer Res 70: 8025-8035 (2010)
29)
Kotha J, Longhurst C, Appling W, Jennings LK: Tetraspanin CD9 regulates
beta 1 integrin activation and enhances cell motility to fibronectin via a PI-3
kinase dependent pathway. Exp Cell Res 314: 1811-1822 (2008)
30)
Kyte J, Doolittle RF: A simple method for displaying the hydropathic
character of a protein. J Mol Biol 157: 105-132 (1982)
31)
Laerum OD, Rajewsky MF: Neoplastic transformation of fetal rat brain cells
in culture after exposure to ethylnitrosourea in vivo. J Natl Cancer Inst 55:
1177-1187 (1975)
32)
Laerum OD, Rajewsky MF, Schachner M, Stavrou D, Haglid KG, Haugen A:
Phenotypic properties of neoplastic cell lines developed from fetal rat brain
cells in culture after exposure to ethylnitrosourea in vivo. Z Krebsforsch Klin
Onkol Cancer Res Clin Oncol 89: 273-295 (1977)
33)
Levy S, Shoham T: Protein-protein interactions in the tetraspanin web.
Physiology 20: 218-224 (2005a)
95
LITERATURVERZEICHNIS
34)
Levy S, Shoham T: The tetraspanin web modulates immune-signalling
complexes. Nat Rev Immunol 5: 136-148 (2005b)
35)
Maecker HT, Todd SC, Levy S: The tetraspanin superfamily: molecular
facilitators. FASEB J 11: 428-442 (1997)
36)
Mhawech P, Herrmann F, Coassin M, Guillou L, Iselin CE: Motility-related
protein 1 (MRP-1/CD9) expression in urothelial bladder carcinoma and its
relation to tumor recurrence and progression. Cancer 98: 1649-1657 (2003)
37)
Miyado K, Yamada G, Yamada S, Hasuwa H, Nakamura Y, Ryu F,
Suzuki K, Kosai K, Inoue K, Ogura A, Okabe M, Mekada E: Requirement of
CD9 on the egg plasma membrane for fertilization. Science 287: 321-324
(2000)
38)
Miyake H, Eto H, Arakawa S, Kamidono S, Hara I: Over expression of
CD44V8-10 in urinary exfoliated cells as an independent prognostic
predictor in patients with urothelial cancer. J Urol 167: 1282-1287 (2002)
39)
Miyake M, Nakano K, Itoi SI, Koh T, Taki T: Motility-related protein-1
(MRP-1/CD9) reduction as a factor of poor prognosis in breast cancer.
Cancer Res 56: 1244-1249 (1996)
40)
Miyamoto S, Maruyama A, Okugawa K, Akazawa K, Baba H, Maehara Y,
Mekada E: Loss of motility-related protein 1 (MRP1/CD9) and integrin
alpha3 expression in endometrial cancers. Cancer 92: 542-548 (2001)
41)
Mori M, Mimori K, Shiraishi T, Haraguchi M, Ueo H, Barnard GF, Akiyoshi T:
Motility related protein 1 (MRP/CD9) expression in colon cancer. Clin
Cancer Res 4: 1507-1510 (1998)
96
LITERATURVERZEICHNIS
42)
Nakamoto T, Murayama Y, Oritani K, Boucheix C, Rubinstein E, Nishida M,
Katsube F, Watabe K, Kiso S, Tsutsui S, Tamura S, Shinomura Y, Hayashi
N: A novel therapeutic strategy with anti-CD9 antibody in gastric cancers.
J Gastroenterol 44: 889-896 (2009)
43)
Nakamura K, Mitamura T, Takahashi T, Kobayashi T, Mekada E:
Importance of the major extracellular domain of CD9 and the epidermal
growth factor (EGF)-like domain of heparin-binding EGF-like growth factor
for
up-regulation
of
binding
and
activity.
J
Biol
Chem
275:
18284-18290 (2000)
44)
Naor D, Sionov RV, Ish-Shalom D: CD44: structure, function, and
association
with
the
malignant
process.
Adv
Cancer
Res
71:
241-319 (1997)
45)
Pajares MJ, Ezponda T, Catena R, Calvo A, Pio R, Montuenga LM:
Alternative splicing: an emerging topic in molecular und clinical oncology.
Lancet Oncol 8: 349-357 (2007)
46)
Pflueger D, Terry S, Sboner A, Habegger L, Esgueva R, Lin PC,
Svensson MA, Kitabayashi N, Moss BJ, MacDonald TY, Cao X, Barrette T,
Tewari AK, Chee MS, Chinnaiyan AM, Rickman DS, Demichelis F, Gerstein
MB, Rubin MA: Discovery of non-ETS gene fusions in human prostate
cancer using next-generation RNA sequencing. Genome Res 21: 56-67
(2011)
47)
Powner D, Kopp PM, Monkley SJ, Critchley DR, Berditchevski F:
Tetraspanin CD9 in cell migration. Biochem Soc Trans 39: 563-567 (2011)
48)
Röther S, Meister G: Small RNAs derived from longer non-coding RNAs.
Biochimie 93: 1905-1915 (2011)
97
LITERATURVERZEICHNIS
49)
Rous BA, Reaves BJ, Ihrke G, Briggs JA, Gray SR, Stephens DJ, Banting
G, Luzio JP: Role of adaptor complex AP-3 in targeting wild-type and
mutated CD63 to lysosomes. Mol Biol Cell 13: 1071-1082 (2002)
50)
Sauer B: Site-specific recombination: developments and applications.
Curr Opin Biotechnol 5: 521-527 (1994)
51)
Sauer G, Windisch J, Kurzeder C, Heilmann V, Kreienberg R, Deissler H:
Progression of cervical carcinomas is associated with down-regulation of
CD9 but strong local re-expression at sites of transendothelial invasion.
Clin Cancer Res 9: 6426-6431 (2003)
52)
Schwab SR, Shugart JA, Horng T, Malarkannan S, Shastri N: Unanticipated
antigens: translation initiation at CUG with Leucine. PLoS Biol 2:
1774-1784 (2004)
55)
Seigneuret M, Delaguillaumie A, Lagaudrière-Gesbert C, Conjeaud H:
Structure of the tetraspanin main extracellular domain. A partially conserved
fold with a structurally variable domain insertion. J Biol Chem 276:
40055-40064 (2001)
56)
Speiser
P,
Wanner
C,
Tempfer
C,
Mittelböck
M,
Hanzal
E,
Bancher-Todesca D, Gitsch G, Reinthaller A, Kainz C: CD44 is an
independent prognostic factor in early-stage cervical cancer. Int J Cancer
74: 185-188 (1997)
98
LITERATURVERZEICHNIS
57)
Srebrow A, Kornblihtt AR: The connection between splicing and cancer.
J Cell Sci 119: 2635-2641 (2006)
58)
Stipp CS, Kolesnikova TV, Hemler ME: EWI-2 is a major CD9 and CD81
partner and member of a novel Ig protein subfamily. J Biol Chem 276:
40545-40554 (2001)
59)
Stipp CS, Kolesnikova TV, Hemler ME: Functional domains in tetraspanin
proteins. Trends Biochem Sci 28: 106-112 (2003)
60)
Sulkowski GN, Warren J, Ha CT, Dveksler GS: Characterization of
receptors for murine pregnancy specific glycoproteins 17 and 23. Placenta
32: 603-610 (2011)
61)
Sutovsky P: Sperm-egg adhesion and fusion in mammals. Expert Rev Mol
Med 11: e11 (2009)
62)
Todres E, Nardi JB, Robertson HM: The tetraspanin superfamily in insects.
Insect Mol Biol 9: 581-590 (2000)
63)
Tole S, Patterson PH: Distribution of CD9 in the developing and mature rat
nervous system. Dev Dyn 197: 94-106 (1993)
64)
Touriol C, Bornes S, Bonnal S, Audigier S, Prats H, Prats AC, Vagner S:
Generation of protein isoform diversity by alternative initiation of translation
at non-AUG codons. Biol Cell 95: 169-178 (2003)
65)
Veeck J, Esteller M: Breast cancer epigenetics: from DNA methylation to
microRNAs. J Mammary Gland Biol Neoplasia 15: 5-17 (2010)
66)
Wang HX, Kolesnikova TV, Denison C, Gygi SP, Hemler ME: The
C-terminal tail of tetraspanin protein CD9 contributes to its function and
molecular organization. J Cell Sci 124: 2702-2710 (2011)
99
LITERATURVERZEICHNIS
67)
Xiang W, MacLaren LA: Expression of fertilin and CD9 in bovine trophoblast
and endometrium during implantation. Biol Reprod 66: 1790-1796 (2002)
68)
Yamazaki H, Xu CW, Naito M, Nishida H, Okamoto T, Ghani FI, Iwata S,
Inukai T, Sugita K, Morimoto C: Regulation of cancer stem cell properties by
CD9 in human B-acute lymphoblastic leukemia. Biochem Biophys Res
Commun 409: 14-21 (2011)
69)
Yang X, Kovalenko OV, Tang W, Claas C, Stipp CS, Hemler ME:
Palmitoylation supports assembly and function of integrin-tetraspanin
complexes. J Cell Biol 167: 1231-1240 (2004)
70)
Zeleznik–Le NJ, Metzgar RS: Expression of CD9 antigen on normal
activated human B cells. Cell Immunol 123: 70-82 (1989)
71)
Zhang XA, Bontrager AL, Hemler ME: Transmembrane-4 superfamily
proteins associate with activated protein kinase C (PKC) and link PKC to
specific beta(1) integrins. J Biol Chem 276: 25005-25013 (2001)
100
DANKSAGUNG
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich auf diesem
beruflichen Bildungsweg unterstützt und zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben:
In besonderem Maße möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Helmut Deißler
für die Themenstellung und die hervorragende Betreuung dieser Arbeit bedanken.
Er stand mir mit seinem Fachwissen stets zur Seite und opferte für mich viele
Arbeitsstunden. Ohne ihn, seiner ständigen Hilfsbereitschaft und seinen wertvollen
Ratschlägen zu jeder Zeit wäre die Erstellung dieser Arbeit nicht möglich
gewesen.
Herrn Prof. Dr. med. Rolf Kreienberg danke ich nicht nur für die Möglichkeit, im
Labor der Universitätsfrauenklinik Ulm diese Arbeit zu erstellen, sondern auch für
die großzügige Unterstützung mit einer Anstellung als Teilzeitkraft mein Studium
finanzieren zu können.
Herrn Prof. Dr. Dr. med. habil. Winfried Rossmanith, Chefarzt des Diakonissenkrankenhauses Karlsruhe-Rüppurr, danke ich sehr herzlich dafür, dass er mich
während
meiner
früheren
Berufstätigkeit
als
Medizinisch-technische-
Laboratoriumsassistentin in seiner Arbeitsgruppe weit über das normale Maß
hinaus forderte, mich für die medizinische Forschung begeisterte und zu der
Entscheidung, Humanmedizin zu studieren, animierte.
Mein Dank gilt allen Mitarbeitern des Endokrinologischen und Onkologischen
Labors der Frauenklinik Ulm: im Besonderen Frau Jasmin Windisch, Frau Sandra
Herman, Frau Antje Merkle und Frau Christine Stehle, die in jeder Situation mit
ihrer Hilfsbereitschaft eine Stütze waren und durch ihre humorvolle Art immer für
eine angenehme Arbeitsatmosphäre sorgten. Dadurch ist diese Arbeit mit schönen
Erinnerungen verbunden auf die ich immer mit voller Freude zurückblicken werde.
Ein ganz besonderes herzliches Dankeschön gilt meiner gesamten lieben Familie
für ihren nicht zu ersetztenden Anteil an diesem beruflichen Bildungsweg. Sie alle
haben mich stets, sei es bereits schon im Rahmen des nebenberuflichen Erwerbs
101
DANKSAGUNG
der allgemeinen Hochschulreife, während des Medizinstudiums oder der
Erstellung dieser Dissertation unermüdlich mit voller Kraft und liebevoll unterstützt.
102
LEBENSLAUF
Lebenslauf
Der Lebenslauf wurde aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
103
LEBENSLAUF
Der Lebenslauf wurde aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
104
LEBENSLAUF
Der Lebenslauf wurde aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
105
LEBENSLAUF
Der Lebenslauf wurde aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
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